Απομόνωση Βιοτεχνολογικών προϊόντων

Transcript

1 Απομόνωση Βιοτεχνολογικών προϊόντων

2 Τα βιοτεχνολογικά προϊόντα περιέχονται σ' ένα πολύπλοκο ρευστό σύστημα (κύτταρα, υπόστρωμα, διαλυτές μεταβολικές ουσίες κ.ά.) Είναι συνήθως ευαίσθητες ουσίες. Η δομή και η ενεργότητα τους διατηρείται κάτω από τις αυστηρές συνθήκες Η ανάκτηση των προϊόντων αυτών είναι πολύπλοκη διαδικασία που εξαρτάται από ορισμένες ιδιότητες του προϊόντος όπως : Σταθερότητα, συγκέντρωση, διαλυτότητα, μέγεθος και φορτίο του μορίου, προδιαγραφές του τελικού προϊόντος (υγρό, σκόνη, κρυσταλλικό προϊόν, κλπ.) Οι διεργασίες ανάκτησης των προϊόντων περιλαμβάνουν τη : Προκατεργασία, διαχωρισμό, συγκέντρωση, απομόνωση

3 1. ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ Αναφέρεται στην ελευθέρωση των βιομορίων από τα κύτταρα Περιλαμβάνει τη : Λύση (θραύση) των κυττάρων Διαχωρισμό των προϊόντων 1. ΛΥΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Γίνεται με δύο μεθόδους : Μηχανικές Μη μηχανικές α. Μηχανικές Μέθοδοι Χρησιμοποιούν δυνάμεις διάτμησης και συσκευές όπως σφαιρόμυλοι, ομογενοποιητές και υπερήχων. Στους σφαιρόμυλους, μικρά σφαιρίδια που υπάρχουν στο χώρο του σφαιρόμυλου λόγω ισχυρής ανατάραξης από την περιστροφή του μύλου θραύουν τα κύτταρα απελευθερώνοντας βιομόρια. Η κινητική της απελευθέρωσης των βιομόριων με τη μέθοδο αυτή είναι πρώτου βαθμού

4 Ομογενοποιητές Χρησιμοποιούν μεγάλη πίεση (μέχρι 1500 bar) που ακολουθείται από στιγμιαία εκτόνωση καθώς το αιώρημα κυττάρων διέρχεται από ειδικό στόμιο. Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται για την απελευθέρωση εσωκυτταρικών ενζύμων

5 Συσκευές υπερήχων Οι συσκευές υπερήχων χρησιμοποιούνται σε εργαστηριακό επίπεδο για τη λύση κυττάρων με κυτταρικά τοιχώματα λιγότερο σκληρά. Η αρχή λειτουργίας τους στηρίζεται στη δημιουργία "κοιλοτήτων" στο αιώρημα των κυττάρων

6 β. Μη Μηχανικές Μέθοδοι Περιλαμβάνουν φυσικές, χημικές και ενζυμικές διεργασίες Φυσική διεργασία είναι η ξήρανση. Δρα στα κυτταρικά τοιχώματα με τρόπο που διευκολύνει την έξοδο των βιομορίων από τα κύτταρα Χημική διεργασία είναι η χημική λύση των κυττάρων. Χρησιμοποιεί ειδικές ουσίες για το σκοπό αυτό. Π.χ. επιφανειακά ενεργές ουσίες (Triton X-100) δημιουργούν ανοίγματα στην κυτταρική μεμβράνη Ενζυμική διεργασία είναι η βιοχημική λύση των κυττάρων. Γίνεται είτε με παρεμπόδιση της βιοσύνθεσης των κυτταρικών τοιχωμάτων είτε με χρήση ειδικών ενζύμων που τα διασπούν. Π.χ. το ένζυμο λυσοζύμη διασπά το κυτταρικό τοίχωμα των θετικά κατά Gram βακτηρίων

7 2. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ Η βιοτεχνολογία χρησιμοποιεί διεργασίες (π.χ. ζυμώσεις), ειδικές πηγές προϊόντων (π.χ. κύτταρα) και παράγει ασυνήθιστα προϊόντα (π.χ. ένζυμα, ορμόνες) Οι διαδικασίες διαχωρισμού λαμβάνουν υπ' όψη τις ιδιαιτερότητες αυτές χρησιμοποιώντας ορισμένες φυσικές διεργασίες Ο διαχωρισμός κυττάρων ή βιοτεχνολογικών ουσιών βασίζεται στις διαφορετικές ιδιότητες τους από εκείνες από τις οποίες πρόκειται να διαχωριστούν. Οι ιδιότητες αυτές είναι: μέγεθος, βάρος, διαλυτότητα, ηλεκτροστατικά και μαγνητικά χαρακτηριστικά, πρόσδεση σε ορισμένες ουσίες, κ.ά.

8 Οι κυριότερες μέθοδοι διαχωρισμού βιοτεχνολογικών προϊόντων είναι οι εξής: Μηχανικές Μέθοδοι Χρησιμοποιούν ορισμένα φυσικά φαινόμενα όπως η πίεση και η φυγόκεντρος δύναμη 1. ΔΙΗΘΗΣΗ Γίνεται διαχωρισμός στερεών από υγρά ή μορίων από μόρια με διαφορετικό μέγεθος Στην πρώτη περίπτωση, χρησιμοποιούνται πορώδη υλικά (υφάσματα, χαρτί, γη διατόμων, κ.ά). Στη δεύτερη, ειδικές μεμβράνες α. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΣΤΕΡΕΩΝ ΑΠΟ ΥΓΡΑ Ανάλογα με τον τρόπο διαχωρισμού, η διήθηση που χρησιμοποιείται είναι επιφανειακή, βάθους και τύπου-κόσκινου

9 Επιφανειακή διήθηση Τεμαχίδια παραμένουν στην επιφάνεια του φίλτρου σχηματίζοντας μια ζώνη ενώ η υγρή φάση διέρχεται από το φίλτρο Αιώρημα Φίλτρο Η ταχύτητα διόδου μέσα από τη ζώνη του φίλτρου εξαρτάται από τη διαφορά πίεσης, την επιφάνεια του φίλτρου και την αντίσταση ροής μέσα από το φίλτρο Η οικονομικότητα της διεργασίας αυτής απαιτεί συγκέντρωση αδιάλυτων στερεών 3-5% Oι πιο κοινές διηθήσεις είναι εκείνες που χρησιμοποιούν φίλτρα υπό μορφή πλαισίων ή περιστρεφόμενα φίλτρα τύμπανου λειτουργούντα υπό κενό Διήθημα

10 Διηθητικό μέσο Διήθηση βάθους Ο διαχωρισμός γίνεται μέσα από τη μάζα του υλικού διήθησης και εφαρμόζεται στη διαύγαση διαλυμάτων μικρού βαθμού θολώματος Διήθηση τύπου-κόσκινου Ο διαχωρισμός γίνεται σύμφωνα με το μέγεθος των πόρων του μέσου διήθησης. Προϋπόθεση λειτουργίας αυτής της μεθόδου είναι η συνεχής αφαίρεση των στερεών σωμάτων. Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό μεγάλου μεγέθους κυττάρων και σωματιδίων Αιώρημα

11 β. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΜΟΡΙΩΝ ΑΠΟ ΜΟΡΙΑ Διήθηση μέσω μεμβρανών Ορισμένα σωματίδια διέρχονται, υπό την επίδραση υδροστατικής πίεσης, μέσα από τους πόρους της μεμβράνης ενώ άλλα συγκρατούνται επάνω στη μεμβράνη Διακρίνεται σε υπερδιήθηση (ΥΔ) και αντίστροφη ώσμωση (ΑΟ) ΥΔ (MB> 1000) ΑΟ (MB< 1000)

12 Κριτήρια Διάκρισης μεταξύ ΥΔ και ΑΟ ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΥΔ ΑΟ Μέγεθος διαλυμένου μορίου που συγκρατείται ΜΒ > 1000 MB < 1000 Ωσμωτική πίεση Αμελητέα Σημαντική (< 10 3 Ν/cm 2 ) Λειτουργική πίεση < 10Ν/cm 2 < 1.5Ν/cm 2

13 Η ωσμωτική πίεση επηρεάζει τη ΥΔ και ΑΟ. Μειώνεται όταν αυξάνεται το μέγεθος των μορίων γεγονός που επιτρέπει την ποσοτική διαφοροποίηση μεταξύ ΥΔ και ΑΟ Πλεονεκτήματα της ΥΔ Σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες (θερμοευαίσθητα μόρια) Χαμηλές υδροστατικές πιέσεις Δεν απαιτείται αλλαγή φάσεως όπως κατάψυξη ή εξάτμιση (ήπιες συνθήκες, εξοικονόμηση ενέργειας) Ταυτόχρονη συγκέντρωση και διαχωρισμό ουσιών Οικονομική διεργασία για τη συγκέντρωση και διαχωρισμό βιοτεχνολογικών προϊόντων Ιδιαίτερα χρήσιμη για τη συγκέντρωση και διαχωρισμό ενζύμων λόγω των ήπιων συνθηκών λειτουργίας της

14 Υπερδιήθηση: αρχή λειτουργίας (1) feed-retentate reservoir, (2) feed pump, (3) pressure gauge, (4) Minitan cell, (5) membrane, (6) needle valve, (7) flowmeter, (8) analytical balance, (9) computer, (10) thermostatic bath

15 ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ

16 Αντίστροφη όσμωση: αρχή λειτουργίας Νερό Ώσμωση Ωσμωτική πίεση Συγκεντρωμένο διάλυμα Αντίστροφη Ώσμωση Εξωτερική πίεση Ημιδιαπερατή μεμβράνη Νερό Θαλασσινό νερό

17 Η αντίστροφη ώσμωση γίνεται με διάχυση μέσω δύο ειδών μεμβρανών 1. Ομογενείς μεμβράνες Διαλύτες και οι διαλυμένες ουσίες μεταφέρονται με μοριακή διάχυση κάτω από τη δράση μίας βαθμίδωσης συγκέντρωσης Η διάχυση εξαρτάται από τη : Διάμετρο του διαχεόμενου μορίου Θερμοκρασία Μέγεθος πόρων μεμβράνης Αντίδραση μεμβράνης διαχεόμενου μορίου 2. Ανισότροπες μεμβράνες Λεπτές (0,1-0,5 μm), διπλού στρώματος. Έχουν μεγάλες ροές. Η διήθηση ακολουθεί το νόμο του Fick Είδη μεμβρανών : Επίπεδες μεμβράνες Τριχοειδών κοίλων ινών Σωληνοειδών μεμβρανών Εφαρμογή: Διαχωρισμός αιθανόλης, αλάτων, νερού, κ.ά.

18 Βιοαντιδραστήρας με διήθηση μεμβρανών (MBR) Αποστειρωμένο υπόστρωμα Φίλτρο αποστείρωσης Βιοαντιδραστήρας Προϊόν

19 2. ΦΥΓΟΚΕΝΤΡΗΣΗ Μηχανική διεργασία διαχωρισμού κυττάρων, οργανιδίων και σχετικά μεγάλου μεγέθους μορίων, στηριζόμενη στη φυγόκεντρο δύναμη

20 Επιτάχυνση σωματιδίων : U C = d 2 (ρ p - ρ L )b/18η Φυγόκεντρος επιτάχυνση: b = rω 2 = (d a - d i )n 2 η/3600 όπου: d = διάμετρος σωματιδίου ρ p = πυκνότητα σωματιδίου ρ L = πυκνότητα υγρού η = ιξώδες μέσου διασπορά ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΣΩΜΑΤΙΔΙΟΥ b = φυγόκεντρος επιτάχυνση r = ακτίνα φυγοκεντρικού τύμπανου ω = γωνιακή ταχύτητα d a = εξωτερική διάμετρος τύμπανου d i = εσωτερική διάμετρος τύμπανου n = αριθμός στροφών ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΜΕΣΟΥ ΔΙΑΣΠΟΡΑΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΦΥΓΟΚΕΝΤΡΟΥ Συντελεστής επιτάχυνσης : Ζ = b/g = dn 2 /1800 Έκταση διαύγασης : όπου: Σ = F/Z F = επιφάνεια κεφαλής φυγοκέντρου

21 Συσκευές φυγοκέντρησης 3 Είδη : Σ Ε 1. Διηθητικές φυγόκεντροι Φυγοκέντρηση μέσα από ζώνη διήθησης Υ 2. Φυγόκεντροι τύπου - κόσκινου Φυγοκέντρηση μέσα από τους πόρους του κόσκινου Ε 3. Φυγοκεντρικοί διαχωριστήρες τύπου ποτηριού Πλέον κοινοί. Ευρεία χρήση Διαχωρισμός ανάλογα με το μοριακό βάρος Συνεχής τροφοδοσία της φυγοκέντρου Η αραιά φάση ρέει πάνω στο τύμπανο Η στερεά φάση συλλέγεται στα τοιχώματα του τυμπάνου Ε Υ Υ Σ Σ Σ

22 Βασίζονται σε 2 φυσικές διεργασίες : 1. ΠΡΟΣΡΟΦΗΣΗ 2. ΕΚΧΥΛΙΣΗ 1. ΠΡΟΣΡΟΦΗΣΗ Εναπόθεση σωματιδίων ουσιών σε επιφάνειες υπό τη δράση επιφανειακών δυνάμεων. Επηρεάζεται από τις εξής ιδιότητες των σωματιδίων : Χημική σύσταση Διάμετρο Φορτίο Ειδική επιφάνεια Κυριότερες προσροφητικές ουσίες: Ιοντοανταλλάκτες Ειδικά πολυμερή Ενεργός άνθρακας Μέθοδοι Αντίδρασης Υγρών Στερεών Αερίων

23 α. Ιοντοανταλλάκτες β. Ειδικά πολυμερή Προσροφούν ουσίες με μη στοιχειομετρική σχέση Χημική σύσταση Πολικές (αμίνες, σουλφοξείδια) Ημιπολικές (ακρυλικοί εστέρες) Μη πολικές (διβινυλοβενζοστυρένιο) Φυσικές ιδιότητες (πόρων) Διάμετρος Όγκος πόρων Εσωτερική επιφάνεια γ. Ενεργός άνθρακας Τεράστιο πορώδες (επιφάνεια 1500 m 2 / g) Παράγεται με εξανθράκωση του οργανικού άνθρακα (π.χ. ξύλο) Είναι δυνατή η αναγέννηση Μεγάλη εφαρμογή (αποχρωματισμός, απόσμιση, κ.ά.)

24 2. ΕΚΧΥΛΙΣΗ Εξαρτάται από την: Διαλυτότητα ουσιών Ικανότητα διαλυτών να αντιδρούν με στερεά υλικά και να ελευθερώνουν διαλυτές ουσίες Χρησιμοποιείται κυρίως η εκχύλιση : α. ΥΓΡΗΣ ΥΓΡΗΣ ΦΑΣΗΣ Γ/2 = (β-logs)/k Μεταφορά της μίας διαλυτής φάσης στην άλλη σε σύστημα μη αναμιγνυόμενων υγρών α1. Κλασμάτωση με ανόργανα άλατα Προσθήκη (NH 4 )SO 4 ή Na 2 SO 4 για την απομόνωση με καθίζηση βιομορίων λόγω αύξησης της ιοντικής ισχύος logs = βκγ/2 S = Διαλυτότητα πρωτεΐνης Γ = Ιοντικός δεσμός β, Κ = σταθερές α2. Κλασμάτωση με οργανικούς διαλύτες Προσθήκη ακετόνης ή αιθανόλης για την απομόνωση με καθίζηση βιομορίων λόγω ελάττωσης της διηλεκτρικής σταθεράς Δημιουργία ιζήματος

25 α3. Χρωματογραφία Εισαγωγή στη Χρωματογραφία Το πρωτεϊνικό διάλυμα εισάγεται σε μία στήλη Πρωτεϊνικό δείγμα (κινητή φάση) Ρητίνη (στατική φάση) Έκλουση πρωτεϊνών Πρωτεΐνες Στήλη= στερεή πορώδης μήτρα (στατική φάση) + υγρό (κινητή φάση) Οι πρωτεΐνες απομονώνονται λόγω των διαφορετικών αλληλεπιδράσεων με τη στατική και την κινητή φάση Οι συνθήκες της κινητής φάσης μπορούν να μεταβληθούν για να αυξήσουν και να μειώσουν τη συγγένεια μιας πρωτεΐνης για τη στατική φάση (διαβάθμιση gradient)

26 Απομόνωση πρωτεϊνών Πανίσχυρο πειραματικό εργαλείο Απλοποιεί το σύστημα στο οποίο κάνουμε μια ερώτηση Επιβεβαιώνουμε μια υπόθεση η οποία έχει αναπτυχθεί μέσα σε ένα πολύπλοκο σύστημα Don't waste clean thinking on dirty enzymes Arthur Kornberg (Nobel Prize in Physiology or Medicine, 1959)

27 Χρησιμότητα απομονωμένων πρωτεϊνών Βιοχημικός και λειτουργικός χαρακτηρισμός Δέσμευση DNA, ενζυμική ενεργότητα, σταθερότητα, κτλ., Δομικές αναλύσεις NMR, κρυσταλλογραφία, κυκλικός διχροϊσμός Μελέτη αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνηςπρωτεΐνης ή πρωτεΐνης-dna Ανάπτυξη αντισωμάτων

28 Απαιτούμενη καθαρότητα πρωτεϊνών Εφαρμογή Θεραπευτική χρήση, μελέτες in vivo Βιοχημικά assays, κρυσταλλογραφία X-ray N-τελική αλληλούχιση, αντιγόνα για την παραγωγή αντισωμάτων, NMR, χαρακτηρισμός ενζύμων Απαιτούμενη καθαρότητα Εξαιρετικά υψηλή > 99% Υψηλή 95-99% Μέτρια υψηλή < 95%

29 Στρατηγικές απομόνωσης πρωτεϊνών Εκμεταλλευόμενοι τη χημεία των πρωτεϊνών Μέγεθος/Μάζα Φορτίο Υδροφοβικότητα Συγγένεια αντισωμάτων Πρωτεϊνικά Tags Συνδυαστική χρήση Υδροφοβικό τμήμα Τυχαία πρωτεΐνη

30 Στρατηγικές απομόνωσης πρωτεϊνών Καθαρότητα Επίτευξη υψηλού επιπέδου καθαρότητα Απομακρύνει γενικές ακαθαρσίες Απομόνωση, συμπύκνωση και σταθεροποίηση Αναφορά: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences , Edition AC

31 Παραγωγή πρωτεΐνης, συγκομιδή/εκχύλιση, απομόνωση Καθαρότητα Κυτταρική αύξηση, υπερέκφραση πρωτεϊνών Λύση κυττάρων Απομάκρυνση κυτταρικών θραυσμάτων Επίτευξη υψηλού επιπέδου καθαρότητα Απομακρύνει γενικές ακαθαρσίες Απομόνωση, συμπύκνωση και σταθεροποίηση

32 Παραγωγή πρωτεΐνης, συγκομιδή/εκχύλιση, απομόνωση Καθαρότητα Αντιστρεπτή καθίζηση με άλατα ή οργανικούς διαλύτες Υπερδιήθηση Επίτευξη υψηλού επιπέδου καθαρότητα Απομακρύνει γενικές ακαθαρσίες Απομόνωση, συμπύκνωση και σταθεροποίηση

33 Κλασματική καθίζηση πρωτεϊνών Πρωτεΐνη ενδιαφέροντος Πρωτεΐνη με παρόμοια διαλυτότητα Καθίζηση ακαθαρσιών Απόρριψη ιζήματος Προσθήκη άλατος, φυγοκέντρηση Προσθήκη άλατος, φυγοκέντρηση, απόρριψη υπερκείμενου, επαναιώρηση πρωτεΐνης Χρωματογραφία Καθίζηση πρωτεΐνης ενδιαφέροντος Απόρριψη υπερκείμενου, επαναιώρηση πρωτεΐνης Χρήση αυξανόμενης συγκέντρωσης Θειικού αμμωνίου

34 Αλλαγή ρυθμιστικού διαλύματος: Διαπίδυση Ανάγκη για πορώδης μεμβράνες με συγκεκριμένο cutoff μοριακό βάρος Στην αρχή της διαπίδυσης Στην ισορροπία αποκοπής (cutoff MWCO) Οι πρωτεΐνες παραμένουν μέσα στη μεμβράνη Μεμβράνη διαπίδυσης Διαλύτης Συμπυκνούμενο διάλυμα Μόρια με μικρότερο μέγεθος από το MWCO είναι ελεύθερα να διασχίσουν τη μεμβράνη εξισορρόπηση Χρειάζονται τρία δίωρα βήματα Εμπειρικός νόμος: ο όγκος του διαλύματος που θα αλλάξουμε > 100x του όγκου του πρωτεϊνικού διαλύματος

35 Αλλαγή ρυθμιστικού και συμπύκνωση: υπερδιήθηση Αναδευόμενο κελί της Millipore Η συσκευή πιέζεται για να αναγκάσει το υγρό να διέλθει μέσω της μεμβράνης (MWCO), δεσμεύοντας και συγκεντρώνοντας τα μακρομόρια Η αφαλάτωση επιτυγχάνεται μέσω της διεργασίας όπου το υγρό αντικαθίσταται και το σύστημα επαναπρεσάρεται Τα μόρια με μέγεθος μικρότερο του MWCO διασχίζουν ελεύθερα τις μεμβράνες

36 Ενδιάμεση απομόνωση Καθαρότητα Υγρή Χρωματογραφία (χαμηλή ανάλυση και κόστος) Επίτευξη υψηλού επιπέδου καθαρότητα Απομακρύνει γενικές ακαθαρσίες Απομόνωση, συμπύκνωση και σταθεροποίηση

37 Βήματα Polishing Καθαρότητα Επίτευξη υψηλού επιπέδου καθαρότητα Απομακρύνει γενικές ακαθαρσίες Απομόνωση, συμπύκνωση και σταθεροποίηση Υγρή χρωματογραφία (υψηλή ανάλυση και κόστος) From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences , Edition AC

38 Τύποι Υγρής Χρωματογραφίας Χρωματογραφία προσρόφησης Οι πρωτεΐνες δεσμεύονται στη στατική φάση Οι πρωτεΐνες εκλούονται με τη μεταβολή της κινητής φάσης Περιλαμβάνεται: συγγένειας, υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις, ιοντικής ανταλλαγής και χρωματοεστίαση Χρωματογραφία διαλυτής φάσης Οι πρωτεΐνες δε δεσμεύονται στη στατική φάση Η πρόοδος των πρωτεϊνών δια μέσω της στήλης παρεμποδίζεται από τη μήτρα της στατικής φάσης Περιλαμβάνεται: χρωματογραφία διήθησης ή μοριακού αποκλεισμού σε πηκτή

39 Κλασμάτωση κατά διάρκεια της χρωματογραφίας Οι πρωτεΐνες που διαχωρίζονται με χρωματογραφία συλλέγονται σε κλάσματα - έτσι επιτυγχάνεται διαχωρισμός

40 Χρωματογραφία μοριακής διήθησης Διαχωρίζει πρωτεϊνικά μόρια με βάση το μοριακό τους μέγεθος. Το διάλυμα εισέρχεται στο πάνω μέρος μιας ειδικής στήλης. Η στήλη αποτελείται από ειδικά πορώδη σφαιρίδια. Τα μικρά πρωτεϊνικά μόρια εισέρχονται στα σφαιρίδια ενώ τα μεγάλα μόρια δε μπορούν και παραμένουν στο διάστημα μεταξύ των σφαιριδίων. Επομένως, τα μεγάλα μόρια ρέουν πιο γρήγορα δια μέσω της στήλης και εκλούονται πρώτα από την έξοδο της στήλης Πλεονέκτημα: μεγάλες ποσότητες πρωτεϊνών μπορούν να διαχωριστούν Μειονέκτημα: Χαμηλή διακριτική ικανότητα. 40

41 Χρωματογραφία μοριακής διήθησης Διαχωρίζει βάση του μεγέθους των μακρομορίων Ξεπλένοντας με ρυθμιστικό δ/μα: Τα μικρά μόρια εισέρχονται στα σφαιρίδια Τα μεγάλα μετακινούνται μεταξύ των σφαιριδίων Μικρότερες πρωτεΐνες Η χρωματογραφία μοριακής διήθησης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον υπολογισμό των μοριακών βαρών Πορώδη πολυμερή Το πρωτεϊνικό μίγμα προστίθεται στη ρητίνη Οι μεγάλες πρωτεΐνες παρουσιάζονται στα πρώτα κλάσματα Μεγαλύτερες πρωτεΐνες

42 Χρωματογραφία μοριακής διήθησης Σφαιρίδια Μήτρα Σφαιρίδια Μικρά μόρια Μεγάλα μόρια Σχηματικό διάγραμμα που απεικονίζει το διαχωρισμό διαφορετικών πρωτεϊνών με χρωματογραφία μοριακής διήθησης

43 Χρωματογραφία Ιοντικής Ανταλλαγής Απομονώνει πρωτεϊνικά μόρια με βάση το μοριακό τους φορτίο. Σε αυτή την τεχνική, τα σφαιρίδια της στήλης διαθέτουν ένα συγκεκριμένο φορτίο. Το φορτίο είναι το αποτέλεσμα μορίων που είναι συνδεδεμένα στα σφαιρίδια αυτά. Τα σφαιρίδια μπορεί να είναι +ve φορτισμένα με τη σύνδεση DEAE (diethylaminoethyl) κυτταρίνης ή ve φορτισμένα με τη σύνδεση καρβοξυμεθυλο κυτταρίνης. Τα σφαιρίδια της στήλης εξαρτώνται από την πρωτεΐνη που θέλουμε να απομονώσουμε. Αν η πρωτεΐνη είναι ve φορτισμένη τότε πρέπει να χρησιμοποιήσουμε θετικά φορτισμένα σφαιρίδια και αντίστροφα.

44 Χρωματογραφία Ιοντικής Ανταλλαγής Πως δουλεύει? Για παράδειγμα, εάν η πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος είναι αρνητικά φορτισμένη, τότε θα χρησιμοποιήσουμε DEAEκυτταρίνη/Q-Sepharose στήλη. Η πρωτεΐνη θα δεσμευτεί στα θετικά φορτισμένα σφαιρίδια. Η πρωτεΐνη που δεσμεύτηκε στα σφαιρίδια μπορεί να ελευθερωθεί με χρήση αυξανόμενης συγκέντρωσης NaCl (ή άλλων αλάτων). Τα ιόντα Cl - (ή άλλων ανιόντων) θα συναγωνιστούν για να δεσμευτούν στα σφαιρίδια της στήλης αντί για την πρωτεΐνη. Οι πρωτεΐνες που είναι περισσότερο θετικά φορτισμένες θα εκλουστούν πρώτες διότι απωθούνται από τα σφαιρίδια.

45 Τα φορτία των πρωτεϊνών Οι διαφορετικές πρωτεΐνες έχουν διαφορετικά φυσικά φορτία. Το συνολικό φορτίο μιας πρωτεΐνης εξαρτάται από: την αλληλουχία Από το ph

46 Καθορισμός του pi μιας πρωτεΐνης Μπορεί να το προβλέψουμε από τη διαφορά μεταξύ του συνόλου των όξινων πλευρικών αλυσίδων (Asp + Glu) και του συνόλου των άλκαλι πλευρικών αλυσίδων (Lys + Arg + His). Καθορίζεται πειραματικά με τεχνικές όπως η ισοηλεκτρική εστίαση. Η πρωτεΐνη τοποθετείται σε διαβαθμισμένη περιοχή ph και υποβάλλεται σε ηλεκτρικό πεδίο. Η πρωτεΐνη μετακινείται στο ισοηλεκτρικό της σημείο (pi).

47 Ισοηλεκτρική εστίαση

48 Υπολογίζοντας το φορτίο μιας πρωτεΐνης Αυτό που θέλουμε να γνωρίζουμε είναι το φορτίο της πρωτεΐνης σε ένα συγκεκριμένο ph, όπως πχ το 5. Πως μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε το pi για να προβλέψουμε τη φόρτιση της πρωτεΐνης; Τα όξινα κατάλοιπα μειώνουν το pi. Τα αλκαλικά κατάλοιπα αυξάνουν το pi.

49 Υπολογίζοντας το φορτίο μιας πρωτεΐνης [H+] [OH-] pi ~5 [H+] [OH-] Η πρωτεΐνη γίνεται αυξανόμενα +ve Η πρωτεΐνη γίνεται αυξανόμενα -ve

50 Υπολογίζοντας το φορτίο μιας πρωτεΐνης Στο ph 3 η πρωτεΐνη θα έχει +ve [H+] [OH-] ph ~3 pi ~5 [H+] [OH-] Η πρωτεΐνη γίνεται αυξανόμενα +ve Η πρωτεΐνη γίνεται αυξανόμενα -ve

51 Υπολογίζοντας το φορτίο μιας πρωτεΐνης Στο ph 7 η πρωτεΐνη θα έχει -ve [H+] [OH-] pi ~5 ph ~7 [H+] [OH-] Η πρωτεΐνη γίνεται αυξανόμενα +ve Η πρωτεΐνη γίνεται αυξανόμενα -ve

52 Χρωματογραφία Ιοντικής Ανταλλαγής Αν η στήλη είναι θετικά φορτισμένη πχ DEAE τότε. Οι πρωτεΐνες με pis < από το ph του ρυθμιστικού διαλύματος θα είναι αρνητικά φορτισμένες και θα δεσμευτούν στην στήλη. Οι πρωτεΐνες με pis > από το ph του ρυθμιστικού διαλύματος θα είναι θετικά φορτισμένες και δε θα δεσμευτούν στη στήλη αλλά θα εκλουστούν

53 Χρωματογραφία Ιοντικής Ανταλλαγής Αν η στήλη είναι αρνητικά φορτισμένη πχ carboxymethyl τότε. Οι πρωτεΐνες με pis < από το ph του ρυθμιστικού διαλύματος θα είναι αρνητικά φορτισμένες και δε θα δεσμευτούν από τη στήλη αλλά θα εκλουστούν. Οι πρωτεΐνες με pis > από το ph του ρυθμιστικού διαλύματος θα είναι θετικά φορτισμένες και θα δεσμευτούν στη στήλη.

54 Χρωματογραφία Ιοντικής Ανταλλαγής Ισχυρά θετικά φορτισμένες Θετικά φορτισμένες Αρνητικά φορτισμένες Ισχυρά αρνητικά φορτισμένες Τα πολυμερικά σφαιρίδια με αρνητικά φορτισμένες λειτουργικές ομάδες Έκλουση πρωτεϊνών Αύξηση αλάτων ή ph για την έκλουση της πρωτεΐνης του ενδιαφέροντος Το πρωτεϊνικό μίγμα προστίθεται στη στήλη που περιέχει κατιονικούς ανταλλάκτες Οι πρωτεΐνες κινούνται δια μέσω της στήλης με ταχύτητες καθοριζόμενες από το φορτίο και το ph που χρησιμοποιείται. Με κατιονικούς ανταλλάκτες, οι πρωτεΐνες με περισσότερο αρνητικό φορτίο κινούνται γρηγορότερα και εκλούονται νωρίτερα

55 Τύποι χρωματογραφίας ιοντικής ανταλλαγής Ανιονικής ανταλλαγής χρωματογραφία (DEAE ή Q) Κατιονικής ανταλλαγής χρωματογραφία (CM ή SP) (DEAE) (CM)

56 Χαμηλής συγκ. άλας για έκλουση Υψηλής συγκ. άλας για έκλουση Πρωτεϊνικό μίγμα Στήλη χρωματογραφίας Σχηματικό διάγραμμα διαχωρισμού διαφορετικών πρωτεϊνών με χρωματογραφία ιοντικής ανταλλαγής χρησιμοποιώντας διαβάθμιση σε βήματα συγκέντρωση άλατος

57 Χρωματογράφημα απομόνωσης πρωτεϊνών Γραφική διαβάθμιση Πλύσιμο στήλης Σύσταση ρυθμιστικού (κόκκινο) Αυξανόμενη παράμετρος Εξισορρόπηση Φόρτωση Πλύσιμο με αρχικό δ/μα UV απορρόφηση (μπλε) Κλάσματα (πράσινο) Όγκος ρυθμιστικού δ/τος

58 Χρωματογραφία υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων Οδηγούσα δύναμη για την υδροφοβική προσρόφηση: ΕΝΤΡΟΠΙΑ Τα μόρια νερού περιβάλλουν την πρωτεΐνη και την επιφάνεια δέσμευσης. Όταν η υδροφοβική περιοχή του βιοπολυμερούς δεσμεύεται στην επιφάνεια μίας ήπιας υδροφοβικής στατικής φάσης, τα υδρόφιλα μόρια του νερού αποδοτικά απελευθερώνονται από τις περιβάλλουσες περιοχές δημιουργώντας μια θερμοδυναμικά ευνοϊκή μεταβολή στην εντροπία. Η Θερμοκρασία παίζει σημαντικό ρόλο! Θειικό αμμώνιο, λόγω των καλών ιδιοτήτων εξαλάτωσης και της υψηλής διαλυτότητας στο νερό χρησιμοποιείται ως διάλυμα έκλουσης (μέχρι 2.4 M / γραμμική μείωση στα 0 M). Υδροφοβική περιοχή (Christian G. Huber, Biopolymer Chromatography, Encylcopedia in analytical chemistry, 2000)

59 Χρωματογραφία υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων Υδροφοβική ομάδα στην πρωτεΐνη Πρωτεΐνη Φαινολική ομάδα Οι πρωτεΐνες περιέχουν υδρόφοβες πλευρικές αλυσίδες αμινοξέων, μερικές από τις οποίες εκτίθενται στην επιφάνεια της πρωτεΐνης. Συνεπώς, οι πρωτεΐνες θα δεσμεύονται συχνά σε άλλα υδρόφοβα μόρια. Οι στήλες υδροφοβικής αλληλεπίδρασης παράγονται με ομοιοπολική σύνδεση υδρόφοβων μορίων όπως αλυσίδων ακυλο ή φαινυλομάδων σε αδιάλυτες ρητίνες υδατανθράκων.

60 Χρωματογραφία συγγένειας Η πιο κοινά χρησιμοποιούμενη τεχνική χρωματογραφίας Μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε πρωτεΐνες με φυσικές ενώσεις συναρμογής (ligands) Συχνά περιλαμβάνει ομοιοπολική σύνδεση ετικέτας συγγένειας στην πρωτεΐνη (tag) Εξαιτίας του μοναδικού tag, παρέχεται γρήγορος και εξειδικευμένος καθαρισμός σε ένα μόνο χρωματογραφικό βήμα Επιτρέπει την αυτοματοποίηση στην απομόνωση πρωτεϊνών

61 Χρωματογραφία συγγένειας Επιφανειακή σύνδεση με εποξυ, αλδεϋδο ή άρυλο εστερικές ομάδες Χρωματογραφία αλληλεπίδρασης μετάλλου Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) Επιφανειακή σύνδεση με Iminodiacetic acid + Ni 2+ /Zn 2+ /Co 2+ (Christian G. Huber, Biopolymer Chromatography, Encylcopedia in analytical chemistry, 2000)

62 Χρωματογραφία συγγένειας Πρωτεΐνη Μίγμα πρωτεϊνών Το πρωτεϊνικό μίγμα προστίθεται στη στήλη η οποία περιέχει ένα ligand συνδεδεμένο στη ρητίνη με εξειδίκευση με την πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος Άσχετες πρωτεΐνες ξεπλένονται μέσω της στήλης Διάλυμα του ligand Διαχωρισμός με εξειδίκευση Έκλουση: Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες εκλούονται με την προσθήκη υψηλών συγκεντρώσεων ligand Η πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος εκλούεται με το δ/μα του ligand

63 Τεχνικές υγρής χρωματογραφίας πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα Τύπος χρωματογραφίας Συγγένειας Υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων Ιοντικής ανταλλαγής Ισοηλεκτρική εστίαση Μοριακής διήθησης Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα Ανάλυση Γρήγορη και εξειδικευμένη Μπορεί να χρησιμοποιηθεί απευθείας μετά από καταβύθιση με θειικό αμμώνιο Πολλές επιλογές ρητινων Υψηλή ανάλυση Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ανάλυση ή για αλλαγή του ρυθμιστικού διαλύματος Ακριβές ρητίνες και ligands Σχετικά μικρή ανάλυση και χωρητικότητα πρόσδεσης Το πρωτεϊνικό διάλυμα πρέπει να έχει χαμηλή αλατότητα Η διαβάθμιση του ph μπορεί να αποβεί μοιραία για την πρωτεΐνη Μεγάλοι χρόνοι Μικρή προς μέτρια Μικρή προς μέτρια Μέτρια προς υψηλή Υψηλή Μικρή προς υψηλή

64 Τελικά βήματα καθαρισμού Έλεγχος καθαρότητας με μεθόδους ανίχνευσης Έλεγχος για παρεμβατικές προσμίξεις Νουκλεάσες Πρωτεάσες Τοξίνες Συμπύκνωση της πρωτεΐνης Καθίζηση Υπερδιήθηση Μικρή στήλη με μεγάλη χωρητικότητα πρόσδεσης Επιλογή ρυθμιστικού διαλύματος και συνθηκών αποθήκευσης Εξέταση της προβλεπόμενης χρήσης της πρωτεΐνης Σταθεροποιητικά πρόσθετα Απότομη (flash) κατάψυξη της πρωτεΐνης και αποθήκευση στους -80 o C Επιβεβαίωση της ταυτότητας της απομονωμένης πρωτεΐνης Φασματοσκοπία μαζών Αμινοτελική αλληλούχιση Αναλυτικά assays