ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΒΑΜΒΑΚΟΣΠΟΡΟΥ ΣΤΗ ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ, ΤΟ ΠΡΟΦΙΛ ΤΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ ΚΑΙ ΤΟ CLA ΠΡΟΒΕΙΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ: ΕΠΙΣΤΗΜΗ ΖΩΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΒΑΜΒΑΚΟΣΠΟΡΟΥ ΣΤΗ ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ, ΤΟ ΠΡΟΦΙΛ ΤΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ ΚΑΙ ΤΟ CLA ΠΡΟΒΕΙΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΓΑΛΛΙΟΥ ΓΕΩΡΓΙΑ ΓΕΩΠΟΝΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΡΑΛΑΖΟΣ ΑΠΟΣΤΟΛΟΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2010

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ: ΕΠΙΣΤΗΜΗ ΖΩΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΒΑΜΒΑΚΟΣΠΟΡΟΥ ΣΤΗ ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ, ΤΟ ΠΡΟΦΙΛ ΤΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ ΚΑΙ ΤΟ CLA ΠΡΟΒΕΙΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΓΑΛΛΙΟΥ ΓΕΩΡΓΙΑ ΓΕΩΠΟΝΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΡΑΛΑΖΟΣ ΑΠΟΣΤΟΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΑΡΑΛΑΖΟΣ ΑΠΟΣΤΟΛΟΣ MΠΑΛΙΟΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΝΗΤΑΣ ΔΗΜΟΣΘΕΝΗΣ Καθηγητής Α.Π.Θ. Καθηγητής Α.Π.Θ. Καθηγητής Α.ΤΕΙ.Θ. ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2010

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ ΑΝΤΙ ΠΡΟΛΟΓΟΥ...6 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ.7 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΛΙΠΑΡΑ ΟΞΕΑ Κατηγοριοποίηση των Λιπαρών Οξέων σε σχέση με τους απλούς και διπλούς δεσμούς Κορεσμένα Λιπαρά Οξέα Ακόρεστα Λιπαρά Οξέα Επίδραση των λιπαρών οξέων των τροφίμων στην υγεία του ανθρώπου ΣΥΖΥΓΕΣ ΛΙΝΕΛΑΪΚΟ ΟΞΥ (CONJUGATED LINOLEIC ACID, CLA) Ιστορική Αναδρομή Ορισμός των CLAs ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ CLA ΣΤΑ ΜΗΡΥΚΑΣΤΙΚΑ ΖΩΑ Υδρογόνωση στη μεγάλη κοιλία Ενδογενής σύνθεση CLA Διατροφικές Πηγές CLA ΔΙΑΤΡΟΦΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΤΟΥ CLA ΣΤΟ ΓΑΛΑ Έλαια και ελαιούχοι καρποί Θερμικά Επεξεργασμένοι Καρποί Ιχθυέλαια και ο Συνδυασμός τους με Ελαιούχους Καρπούς Χόρτο Βοσκής Χορήγηση Συνθετικού CLA Λοιποί Διατροφικοί και Φυσιολογικοί Παράγοντες Η ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΟΥ CLA ΣΤΗ ΔΙΑΤΡΟΦΗ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Ο ΒΑΜΒΑΚΟΣΠΟΡΟΣ ΣΤΗ ΔΙΑΤΡΟΦΗ ΤΩΝ ΜΗΡΥΚΑΣΤΙΚΩΝ Επίδραση του βαμβακόσπορου στο προφίλ των λιπαρών οξέων του γάλακτος...27

4 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Ανάλυση λιπαρών οξέων στο λίπος του γάλακτος και των ζωοτροφών Στατιστική ανάλυση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Παραγωγικά χαρακτηριστικά Λιπαρά οξέα του λίπους του γάλακτος Δείκτες αθηρωμάτωσης, θρομβογένεσης και Δ 9 -αφυδρογονάσης ΣΧΟΛΙΑΣΜΟΣ Παραγωγικά χαρακτηριστικά Λιπαρά οξέα του γάλακτος Trans-βασσενικό οξύ και συζυγές λινελαϊκό οξύ Δείκτες αθηρωμάτωσης και θρομβογένεσης ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 49

5 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ ΑΝΤΙ ΠΡΟΛΟΓΟΥ Για την ολοκλήρωση του εγχειρήματος αυτού, οφείλω να ευχαριστήσω τους καθηγητές μου κατά τη διάρκεια του προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών και ιδιαιτέρως τον επιβλέποντα Καθηγητή της Μεταπτυχιακής Διατριβής μου κ. Απόστολο Καραλάζο για την σημαντική επιστημονική καθοδήγηση καθ όλη τη διάρκεια της έρευνας και της συγγραφής της παρούσας διατριβής. Στον Καθηγητή του Τμήματος Ζωικής Παραγωγής του Α.ΤΕΙ.Θ. κ. Δημοσθένη Νήτα εκφράζω τις θερμές ευχαριστίες μου για τις πολύτιμες συμβουλές και την επιστημονική καθοδήγηση κατά τη διάρκεια του πειράματος. Θερμές επίσης ευχαριστίες στον Αναπληρωτή Καθηγητή του Τομέα Ζωικής Παραγωγής της Γεωπονικής Σχολής ΑΠΘ κ. Ευθύμιο Σινάπη για το ενδιαφέρον του καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος και τις αναλύσεις των δειγμάτων. Στον Αναπληρωτή Καθηγητή του ΤΕΦΑΑ κ. Βασίλη Μούγιο, τη Διδάκτορα του ΤΕΦΑΑ κα. Ανατολή Πετρίδου και τη Διδάκτορα Gayane Marmaryan εκφράζω τις ευχαριστίες μου για την πολύτιμη βοήθεια τους στην ανάλυση των λιπαρών οξέων στο λίπος του γάλακτος και των ζωοτροφών. Επίσης θερμότατα ευχαριστώ τους συναδέλφους μου Γεωπόνους-Ζωοτέχνες κ. Γιάννη Ελευθεριάδη και κ. Λουκά Παπαλουκά για την αμέριστη βοήθεια και συμπαράστασή τους σε όλη τη διάρκεια της έρευνας. Εξίσου δε σημαντική στην παρούσα προσπάθεια υπήρξε και η συμβολή του Διδάκτορα κ. Χρυσόστομου Μήλιου και του υποψήφιου Διδάκτορα κ. Κωνσταντίνου Ζαγοράκη οι οποίοι βοήθησαν στις χημικές αναλύσεις των ζωοτροφών. Τέλος οφείλω να ευχαριστήσω τον κ. Ιωάννη Τσιόκα, Προϊστάμενο του Πρότυπου Κέντρου Κτηνοτροφίας και Εκπαίδευσης Βλάστης για τη συμπαράσταση και βοήθειά του στη διεξαγωγή των πειραμάτων καθώς και όλους τους εργαζόμενους στο Πρότυπο Κέντρο Βλάστης για την φιλοξενία, την κατανόηση και την πολύτιμη βοήθεια τους στους απαιτούμενους χειρισμούς των ζώων. Σε κάθε περίπτωση ωστόσο οφείλω τις μεγαλύτερες ευχαριστίες στους γονείς μου, των οποίων η συμπαράσταση, καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου ήταν αναμφίβολα ανεκτίμητη. 6

6 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΕΑΕΟ = Ελεύθερες Αζώτου Εκχυλισματικές Ουσίες ΖΒ = Ζων Βάρος ΙΟ = Ινώδεις Ουσίες ΜΕ = Μεταβολίσιμη Ενέργεια ΞΟ = Ξηρή Ουσία ΟΕ = Ολική Ενέργεια ADF = Acid Detergent Fibres (ινώδεις ουσίες αδιάλυτες σε όξινο διάλυμα απορρυπαντικών ουσιών) AI = Atherogenicity Index (δείκτης αθηρωμάτωσης) ANOVA = Analysis of Variance (ανάλυση διακύμανσης) CLA = Conjugated Linoleic Acid (συζυγές λινελαϊκό οξύ) DI = Desaturase Index (δείκτης αφυδρογονάσης) DHA = Docosahexaenoic acid (εικοσιδυαεξαενοϊκό οξύ) ECM = Energy Corrected Milk (διορθωμένη ως προς την ενέργεια γαλακτοπαραγωγή) EPA = Ecosapentaenoic acid (εικοσαπενταενοϊκό οξύ) FCM = Fat Corrected Milk (διορθωμένη ως προς τη λιποπεριεκτικότητα 6% γαλακτοπαραγωγή) g = γραμμάριο HDL = High density Lipoproteins (λιποπρωτεΐνες υψηλής πυκνότητας) kg = χιλιόγραμμο LDL = Low Density Lipoproteins (λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας) mg = χιλιοστογραμμάριο Mj = μεγκα-τζάουλ ml = χιλιοστόλιτρο MUFA = Monounsaturated Fatty acids (μονοακόρεστα λιπαρά οξέα) NDF =Neutral Detergent Fibres (ινώδεις ουσίες αδιάλυτες σε ουδέτερο διάλυμα απορρυπαντικών ουσιών) P = επίπεδο σημαντικότητας 7

7 PUFA SNF SPSS TI TMR TVA = Polyunsaturated Fatty acids (πολυακόρεστα λιπαρά οξέα) = Solids Non Fat (στερεό υπόλειμμα άνευ λίπους, ΣΥΑΛ) = Statistical Package for Social Sciences (στατιστικό λογισμικό πακέτο) = Thrombogenicity Index (δείκτης θρομβογένεσης) = Total Mixed Radio (ολικό σιτηρέσιο) = trans Vaccenic Acid (trans βασσενικό οξύ) 8

8 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το γάλα ως τρόφιμο παρά την υψηλή διατροφική του αξία τόσο σε πρωτεΐνες όσο και σε ανόργανα στοιχεία, χαρακτηρίζεται από τη σχετικά μεγάλη περιεκτικότητα του λίπους του σε κορεσμένα λιπαρά οξέα, αφενός ως αποτέλεσμα των εκτεταμένων υδρογονώσεων των λιπαρών οξέων στη μεγάλη κοιλία των μηρυκαστικών (Harfoot & Hazlewood, 1988) και αφετέρου λόγω της μειωμένης ικανότητας μεταφοράς στο μαστικό αδένα και ενσωμάτωσης στο λίπος του γάλακτος σημαντικών λιπαρών οξέων πολύ μεγάλης ανθρακικής αλυσίδας όπως του EPA και του DHA (Lock & Bauman, 2004). Το λίπος, ωστόσο, είναι το πιο ευμετάβλητο συστατικό του γάλακτος και επηρεάζεται από αλλαγές στη διατροφή των ζώων, τόσο όσον αφορά τη συγκέντρωσή του στο γάλα, όσο και τη σύστασή του σε λιπαρά οξέα (Bauman et al, 2006, Jenkins & McGuire, 2006). Ακριβώς γι αυτό το λόγο, η έρευνα γύρω από την προσπάθεια αλλαγής του προφίλ των λιπαρών οξέων του λίπους του γάλακτος των μηρυκαστικών, ώστε αυτό να καθίσταται πιο υγιεινό από διατροφικής άποψης, επικεντρώθηκε σε διατροφικές επεμβάσεις και κυρίως μέσω της χορήγησης στα ζώα διαφόρων ζωοτροφών πλούσιων σε λιπαρές ουσίες, όπως, για παράδειγμα, οι ελαιούχοι καρποί και τα φυτικής και ζωικής προέλευσης έλαια (Palmquist et al., 2005). Βέβαια τα αποτελέσματα που συλλέγονται από τις υπάρχουσες βιβλιογραφικές πηγές αφορούν κατά κύριο λόγο τις γαλακτοπαραγωγές αγελάδες και δευτερευόντως τις αίγες, ενώ οι πληροφορίες που συλλέγονται για τις προβατίνες είναι ακόμα πιο πολύ περιορισμένες (Gómez-Cortés et al., 2008). Σκοπός λοιπόν της παρούσας εργασίας ήταν να διερευνηθεί η ενδεχόμενη επίδραση βαμβακόσπορου στη γαλακτοπαραγωγή προβάτων και τη χημική σύσταση του γάλακτος αυτών, καθώς και στην αναλογία (προφίλ) των λιπαρών οξέων στο λίπος του γάλακτος αυτών και ιδιαίτερα του συζυγούς λινελαϊκού οξέος (Conjugated Linoleic Acid, CLA). Για τη διενέργεια αυτής της εργασίας χρησιμοποιήθηκαν 24 προβατίνες της εγχώριας ορεινής φυλής σε πειραματική διάταξη πλήρως τυχαιοποιημένου πειράματος με επαναλαμβανόμενες μετρήσεις στις διαδοχικές εβδομάδες του ελέγχου (complete randomized design). 9

9 2. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 2.1 ΛΙΠΑΡΑ ΟΞΕΑ Τα λιπαρά οξέα έχουν ορισμένα κοινά χαρακτηριστικά: πρόκειται για μονοκαρβονικά οξέα συχνά με μια μη διακλαδισμένη αλειφατική αλυσίδα μονάδων CH 2 (λιπαρά οξέα με διακλαδώσεις είναι σπάνια), συνήθως με άρτιο αριθμό ατόμων άνθρακα (επειδή στη βιοσύνθεσή τους εμπλέκεται το ακέτυλο-coa, ένα ένζυμο που μεταφέρει μια ομάδα από δύο άτομα άνθρακα ), κορεσμένα ή ακόρεστα, με έναν ή περισσότερους διπλούς δεσμούς είτε σε cis είτε σε trans γεωμετρική ισομέρεια. Κάθε λοιπόν λιπαρό οξύ αποτελείται από μια αλυσίδα ατόμων άνθρακα, μικρή ή μεγάλη που είναι ισχυρά μη πολική (ονομάζεται ουρά) και μια πολική καρβοξυλική ομάδα (Διαμαντίδης, 1994). Οι φυσικές ιδιότητες των λιπαρών οξέων, καθώς και των εστέρων τους με αλκοόλες, εξαρτώνται από το μέγεθος της αλειφατικής τους αλυσίδας και τον αριθμό των διπλών δεσμών που φέρουν. Η αρίθμηση των ατόμων άνθρακα των λιπαρών οξέων γίνεται από τον άνθρακα του καρβοξυλίου (άνθρακας 1) προς την τελική ομάδα CH 3 (άνθρακας n). Ο διπλός δεσμός δείχνεται με το γράμμα Δ που συνοδεύεται από το νούμερο του πρώτου ατόμου άνθρακα που συμμετέχει στο δεσμό. 2.2 Κατηγοριοποίηση των Λιπαρών Οξέων (ΛΟ) σε σχέση με τους απλούς και τους διπλούς δεσμούς Κορεσμένα Λιπαρά Οξέα Τα κορεσμένα ΛΟ δεν περιέχουν κανένα διπλό δεσμό ή άλλες λειτουργικές ομάδες κατά μήκος της αλυσίδας τους. Ο όρος «κορεσμένα» αναφέρεται στο υδρογόνο, δεδομένου ότι όλοι οι άνθρακες, εκτός από την καρβοξυλική ομάδα (- COOH) περιέχουν όσο το δυνατόν περισσότερα υδρογόνα. Με άλλα λόγια, το ωμέγα άκρο (n) περιέχει 3 υδρογόνα (-CH 3 ) και κάθε άνθρακας στην αλυσίδα περιέχει 2 υδρογόνα. Μερικά από τα κυριότερα κορεσμένα λιπαρά είναι το μυριστικό (14:0), το παλμιτικό (16:0), το στεατικό (18:0), το αραχιδικό (20:0). 10

10 2.2.2 Ακόρεστα Λιπαρά Οξέα Τα ακόρεστα ΛΟ είναι παρόμοιας μορφής, εκτός από το ότι μια ή περισσότερες αλκενυλικές λειτουργικές ομάδες υπάρχουν κατά μήκος της ανθρακικής αλυσίδας, με το κάθε αλκένιο να αντικαθιστά τον απλό δεσμό του «-CH2-CH2-» με διπλό δεσμό σε«-ch=ch-» (δηλαδή ένας άνθρακας διπλά συνδεδεμένος με έναν άλλο άνθρακα). Τα επόμενα δύο άτομα του άνθρακα εκατέρωθεν των συνδεδεμένων με διπλό δεσμό ατόμων άνθρακα στην αλυσίδα μπορούν να εμφανιστούν με γεωμετρική ισομέρεια cis ή trans. Διακρίνονται σε μονοακόρεστα και πολυακόρεστα. Τα μονοακόρεστα λιπαρά οξέα έχουν έναν διπλό δεσμό ανθράκων στην αλυσίδα, με όλους τους άλλους άνθρακες να είναι απλά συνδεδεμένοι. Μερικά από τα κυριότερα μονοακόρεστα ΛΟ είναι το παλμιτελαϊκό οξύ (16:1n7) και το ελαϊκό οξύ (18:1n9). Αντιθέτως με τα μονοακόρεστα λιπαρά οξέα, τα πολυακόρεστα έχουν περισσότερους από έναν διπλούς δεσμούς ανθράκων στην αλυσίδα τους. Μερικά από τα κυριότερα πολυακόρεστα ΛΟ είναι το λινελαϊκό (18:2n6c), το α-λινολενικό (18:3n3), το αραχιδονικό ( 20:4n6) (Διαμαντίδης, 1994). 2.3 Επίδραση των λιπαρών οξέων των τροφίμων στην υγεία του ανθρώπου Η επίδραση των διαφόρων λιπαρών οξέων στην υγεία του ανθρώπου έχει σχέση κυρίως με την επίδραση στα λιπίδια του αίματος και εξαρτάται σε μεγάλο ποσοστό από το μήκος της ανθρακικής τους αλυσίδας και την ύπαρξη διπλών δεσμών. Έτσι, σε γενικές γραμμές τα κορεσμένα λιπαρά οξέα προκαλούν την αύξηση της ολικής χοληστερόλης του αίματος και ταυτόχρονα την αύξηση της αναλογίας LDL/HDL και επομένως ευνοούν τις συνθήκες εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων (Ascherio & Willet, 1995). Αντιθέτως, τα ακόρεστα λιπαρά οξέα προκαλούν τη μείωση της παραπάνω αναλογίας των λιπιδίων του αίματος. Σύμφωνα, όμως, με τους Ulbricht & Southgate (1991) η αναλογία κορεσμένων/ακόρεστων λιπαρών οξέων ενός τροφίμου δεν αρκεί από μόνη της για να προσδιορίσει το βαθμό επικινδυνότητας πρόκλησης καρδιαγγειακών νοσημάτων ως αποτέλεσμα της κατανάλωσης αυτού του τροφίμου. Αυτό γιατί λιπαρά οξέα της ίδιας κατηγορίας (π.χ. κορεσμένα ΛΟ) μπορεί να έχουν διαφορετική επίδραση στα λιπίδια του αίματος. Για παράδειγμα, ενώ τα κορεσμένα λιπαρά οξέα λαυρικό (12:0), μυριστικό (C14:0) και παλμιτικό (C16:0) αυξάνουν τα επίπεδα των LDL στο αίμα, το 11

11 στεατικό (C18:0) έχει ουδέτερη επίδραση σε αυτά. Επιπλέον, ενώ μονοακόρεστα λιπαρά οξέα όπως το ελαϊκό (cis-9 C18:1) μειώνουν τα επίπεδα των LDL στο αίμα, τα περισσότερα trans C18:1 ΛΟ (π.χ. το ελαϊδικό οξύ, trans-9 C18:1) έχουν την ακριβώς αντίθετη επίδραση (Kris-Etherton & Yu, 1997). Γι αυτό το λόγο οι Ulbricht & Southgate (1991) προκειμένου να συνοψίσουν τις διαφορετικές επιδράσεις των κυριότερων λιπαρών οξέων των τροφίμων πρότειναν τον υπολογισμό των δεικτών αθηρωμάτωσης (atherogenicity index, AI) και θρομβογένεσης (thrombogenicity index, TI). Οι παραπάνω δείκτες υπολογίζονται με τους εξής τύπους. ΑΙ = [C12:0+(4 x C14:0)+ C16:0) (MUFA + PUFA), και ΤΙ = (C14:0+C16:0+C18:0) [(0,5 x MUFA)+(0,5 x n-6)+(3 x n-3)+(n-3/n-6)] Σύμφωνα με τους παραπάνω ερευνητές, όσο μεγαλύτεροι είναι οι παραπάνω δείκτες ενός τροφίμου, τόσο περισσότερο αυξάνει και η πιθανότητα εμφάνισης στον άνθρωπο αθηρωματικών αλλοιώσεων και θρόμβων στα αγγεία του κυκλοφορικού συστήματος. Επιπλέον, τα n-3 (π.χ. EPA, DHA, α-λινολενικό οξύ) και τα n-6 (π.χ. αραχιδονικό οξύ, λινελαϊκό οξύ) λιπαρά οξέα θεωρούνται απαραίτητα για τον ανθρώπινο οργανισμό καθώς συμμετέχουν σε σημαντικές μεταβολικές διεργασίες και δεν μπορούν να συντεθούν από αυτόν, αλλά πρέπει να προσληφθούν με τη διατροφή (Simopoulos, 1999). Εκτός αυτού, τα συζυγή λινελαϊκά οξέα (CLAs) έχουν δυνητικές ευεργετικές επιδράσεις στην υγεία του ανθρώπου, όπως προκύπτει από διάφορα πειράματα in vitro και in vivo κυρίως σε πειραματόζωα (Ip et al., 1994, Lee et al., 1994, Miller et al., 1994, Park et al., 1997, Sugano et al., 1998, Ostrowska et al., 1999, Kritchevsky et al., 2000, Pariza et al., 2001, Tricon et al., 2004). Την κύρια φυσική πηγή των CLAs αποτελούν τα τρόφιμα που προέρχονται από μηρυκαστικά ζώα και κυρίως το γάλα και τα προϊόντα του (Chin et al., 1992). 12

12 2.4 ΣΥΖΥΓΕΣ ΛΙΝΕΛΑΪΚΟ ΟΞΥ ( CONJUGATED LINOLEIC ACID, CLA ) Ιστορική Αναδρομή Η πρώτη αναφορά στην παρουσία των συζυγών ακόρεστων λιπαρών οξέων στο λίπος του γάλακτος έγινε από τους Booth et al. (1935), οι οποίοι παρατήρησαν ότι το λίπος του γάλακτος που προερχόταν από αγελάδες που τρέφονταν σε βοσκές κατά την περίοδο του καλοκαιριού, παρουσίαζε υψηλή απορροφησιμότητα στην υπεριώδη περιοχή (230nm) σε σύγκριση με το λίπος του γάλακτος που παράγονταν από τις ίδιες αγελάδες κατά τους μήνες του χειμώνα. Σαράντα χρόνια αργότερα, ο Parodi (1977) απομόνωσε από το λίπος του γάλακτος το cis-9, trans-11 CLA ισομερές και υποστήριξε ότι τα συζυγή λιπαρά οξέα εμφανίζονται στο γάλα των μηρυκαστικών ως αποτέλεσμα της υδρογόνωσης των λιπαρών οξέων στη μεγάλη κοιλία. Δέκα χρόνια αργότερα οι Ha et al. (1987) απομόνωσαν CLA από βοδινό κρέας και έδειξαν ότι το συνθετικό CLA εμπόδιζε την καρκινογένεση στο δέρμα των ποντικιών που προκαλούνταν από το 7,12-dimethylbenz[a]anthracene. Από τότε, έχουν γίνει πάρα πολλές έρευνες σε μια προσπάθεια να κατανοηθεί η σύνθεση του CLA, ο μηχανισμός δράσης του και η συγκέντρωσή του στις διάφορες φυσικές τροφές Ορισμός των CLAs Συζυγή λιπαρά οξέα είναι εκείνα τα οποία φέρουν συζυγείς διπλούς δεσμούς, δηλαδή μεταξύ δύο διπλών δεσμών να υπάρχει στην ανθρακική τους αλυσίδα μόνο ένας απλός δεσμός. Οι συζυγείς διπλοί δεσμοί αλληλεπιδρούν και είναι ικανοί να σχηματίσουν και να δημιουργήσουν χημικές μετατροπές στο μόριο του λιπαρού οξέος. Εάν η απόσταση μεταξύ διπλών δεσμών είναι μεγάλη σε ένα λιπαρό οξύ, τότε γίνεται λόγος για «απομονωμένους διπλούς δεσμούς» και η πιθανότητα αλληλεπίδρασης μεταξύ των διπλών δεσμών είναι αμελητέα. Τα τελευταία χρόνια είναι πολύ αυξημένο το ενδιαφέρον των επιστημόνων για τα συζυγή λινελαϊκά οξέα (CLAs), λόγω των πιθανών θετικών επιδράσεων στην υγεία του ανθρώπου. 13

13 O γενικός όρος συζυγές λινελαϊκό οξύ (CLA) είναι ένας συλλογικός όρος που περιλαμβάνει όλα τα οξέα της μορφής C18:2 με ένα συζυγές σύστημα διπλών δεσμών στις θέσεις 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, και και με cis/cis, cis/trans, trans/cis και trans/trans γεωμετρική ισομέρεια. Το ισομερές cis-9, trans-11 CLA (ρουμενικό οξύ) απαντάται στο λίπος του γάλακτος και κατέχει κορυφαία θέση μεταξύ των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (PUFAs) (Χατζηπαναγιώτου, 1996). 2.5 ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ CLA ΣΤΑ ΜΗΡΥΚΑΣΤΙΚΑ ΖΩΑ Το CLA που αναφέρεται ως ένα μίγμα ισομερών (γεωμετρικής ισομέρειας και ισομέρειας θέσης) του λινελαϊκού οξέος (cis-9, cis-12 C18:2, LA) με δύο συζυγείς ακόρεστους δεσμούς, σχηματίζεται ως ενδιάμεσο προϊόν κατά τη διαδικασία της υδρογόνωσης του λινελαϊκού οξέος σε στεατικό οξύ από βακτήρια κυρίως του γένους Butyrivibrio fibrisolvens (Kepler et al., 1966) στη μεγάλη κοιλία ή από ενδογενή μετατροπή του trans-11 C18:1 (trans-βασσενικό οξύ, TVA) από το ένζυμο Δ 9 - αφυδρογονάση στο μαστικό αδένα (Griinari and Bauman, 1999; Corl et al., 2001). Το πιο ενεργό βιολογικά CLA ισομερές είναι το cis- 9, trans-11-οκταδεκαδιενικό οξύ, το οποίο και αποτελεί το 82% του ολικού CLA στα γαλακτοκομικά προϊόντα. Α Λινελαϊκό οξύ (c-9, c-12) οκταδεκαδιενικό οξύ Β Συζυγές λινελαϊκό οξύ c-9, t-11 ισομερές 14

14 Γ. Συζυγές λινελαϊκό οξύ t-10, c-12 ισομερές Σχήμα 1: Η χημική δομή του λινελαϊκού οξέος και δυο ισομερών του συζυγούς λινελαϊκού οξέος (Khanal & Dhiman, 2004). Η παρουσία λιπαρών οξέων με συζυγείς διπλούς δεσμούς, είχε εντοπιστεί το 1935, στο λίπος του γάλακτος αγελάδων που έβοσκαν σε λιβάδια, την εποχή της άνοιξης (Booth et al., 1935). Παρόμοια έρευνα από τον Parodi (1977) έδειξε ότι το κύριο ισομερές που εμφανιζόταν ήταν το cis-9, trans-11 CLA. Καθώς οι αναλυτικές τεχνικές βελτιώνονταν, έγινε φανερό ότι το λίπος των μηρυκαστικών περιείχε πολλά CLA ισομερή (Sehat et al., 1998; Yurawecz et al., 1998) από τα οποία, το cis-9, trans-11 CLA ήταν το κυρίαρχο CLA ισομερές με ποσοστό % του ολικού CLA στο λίπος των μηρυκαστικών και ακολουθούσε το trans-7, cis- 9 CLA ισομερές το οποίο αντιπροσώπευε το 3-6%. Τις δεκαετίες 70 και 80, εκτεταμένες πειραματικές εργασίες είχαν ερευνήσει την υδρογόνωση των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (PUFAs) στη μεγάλη κοιλία των μηρυκαστικών (Keeney,1970; Harfoot & Hazlewood,1988). Οι παραπάνω εργασίες έδειξαν ότι τα λίπη που τα μηρυκαστικά λαμβάνουν με την τροφή υφίστανται σημαντικές μετατροπές στη μεγάλη κοιλία ως αποτέλεσμα της επίδρασης των μικροοργανισμών της. Η πρώτη μετατροπή που λαμβάνει χώρα είναι η υδρόλυση των εστερικών δεσμών των τριγλυκεριδίων από λιπάσες της μεγάλης κοιλίας με αποτέλεσμα την παραγωγή ελεύθερων λιπαρών οξέων. Η δεύτερη μετατροπή που πραγματοποιείται είναι η υδρογόνωση των PUFAs με αποτέλεσμα τη μετατροπή τους στα αντίστοιχα μονοακόρεστα και κορεσμένα λιπαρά οξέα. Τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα που κυρίως απαντώνται στα σιτηρέσια των μηρυκαστικών είναι το λινελαϊκό (C18:2n-6) και το α-λινολενικό οξύ (C18:3n-3). Η σύνθεση του CLA μπορεί να επιτευχθεί με υδρογόνωση των PUFAs στη μεγάλη κοιλία και ενδογενώς μέσα στο μαστικό αδένα. 15

15 2.5.1 Υδρογόνωση στη μεγάλη κοιλία Το μεγαλύτερο ποσοστό της υδρογόνωσης (>80%) διαδραματίζεται στα μικρά τεμάχια της τροφής. Ο βαθμός υδρογόνωσης εξαρτάται από εξωκυτταρικά ένζυμα των βακτηρίων και από το είδος της τροφής (Harfoot & Hazlewood, 1988). Τα κύρια υποστρώματα της υδρογόνωσης είναι το λινελαϊκό και το λινολενικό οξύ (C18:2 και C18:3, αντίστοιχα) και ο ρυθμός υδρογόνωσης των λιπαρών οξέων στη μεγάλη κοιλία μεγαλώνει καθώς αυξάνεται ο βαθμός κορεσμού τους. Στα περισσότερα σιτηρέσια, το λινελαϊκό και το λινολενικό οξύ υδρογονώνονται σε ποσοστό περίπου % και %, αντίστοιχα (Doreau & Ferlay, 1994; Beam et al., 2000). Η εκτεταμένη αυτή υδρογόνωση μειώνεται όταν καταναλωθούν σιτηρέσια με αυξημένη περιεκτικότητα σε συμπυκνωμένες τροφές. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στην αναστολή της λιπόλυσης εξαιτίας του χαμηλού ph που παρουσιάζεται στη μεγάλη κοιλία ως αποτέλεσμα της παρουσίας των συμπυκνωμένων τροφών (Van Nevel & Demeyer, 1995). Δύο από τα ενδιάμεσα προϊόντα της διαδικασίας υδρογόνωσης είναι το trans- 11 C 18:1 (trans-βασσενικό οξύ, TVA) λιπαρό οξύ, το οποίο μπορεί να σχηματίζεται από την υδρογόνωση τόσο του λινελαϊκού όσο και του λινολενικού οξέος και το cis- 9, trans-11 συζυγές λινελαϊκό οξύ το οποίο σχηματίζεται από την υδρογόνωση του λινελαϊκού οξέος. Αυτά τα ενδιάμεσα μεταβολικά προϊόντα, βρίσκονται σε αξιόλογη συγκέντρωση στο λίπος των μηρυκαστικών, σε αναλογία περίπου 3:1. Πολλά είναι τα ενδιάμεσα προϊόντα που σχηματίζονται κατά τη διαδικασία της υδρογόνωσης των PUFAs. Αυτά τα ενδιάμεσα προϊόντα απορροφώνται από το λεπτό έντερο και ενσωματώνονται στο λίπος των μηρυκαστικών και ακολούθως στο γάλα και το κρέας Ενδογενής σύνθεση CLA Αρχικά, είχε θεωρηθεί από τον επιστημονικό κόσμο ότι η μεγάλη κοιλία είναι η κύρια πηγή του cis-9,trans-11 CLA του γάλακτος. Ενώ είχε γίνει αποδεκτό ότι το CLA προέρχονταν από την υδρογόνωση κατά κύριο λόγο του λινελαϊκού οξέος (μέσω κυρίως των βακτηρίων του είδους Butyrivibrio fibrisolvens), το γεγονός αυτό δεν ίσχυε για τη συνολική ποσότητα του CLA που βρισκόταν στο λίπος του γάλακτος ή του κρέατος. Οι Griinari & Bauman (1999) κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι το CLA που συνθέτονταν στη μεγάλη κοιλία αποτελούσε ένα τμήμα μόνο του συνολικού CLA του λίπος του γάλακτος ή του κρέατος και ότι η υδρογόνωση του 16

16 λινελαϊκού οξέος στο επίπεδο της μεγάλης κοιλίας δεν ήταν η μόνη πηγή του, αλλά έπρεπε να μελετηθεί και η ύπαρξη άλλης πιθανής πηγής παραγωγής του. Με βάση τις παρατηρήσεις των Holman & Mahfouz (1981) και Pollard et al. (1980) οι οποίοι περιέγραψαν την μετατροπή των trans μονοακόρεστων λιπαρών οξέων σε cis, trans διακόρεστα λιπαρά οξέα, είχε προταθεί ότι το CLA μπορεί να συντεθεί ενδογενώς από το trans βασσενικό οξύ (TVA) μέσω του ενζύμου Δ 9 - αφυδρογονάση (Parodi, 1994). Νωρίτερα οι Bartlett & Chapman (1961) έδειξαν μια στενή γραμμική σχέση μεταξύ των trans-c18:1 και των συζυγών διακόρεστων λιπαρών οξέων σε δείγματα βουτύρου. Οι Griinari & Bauman (1999) πρότειναν ότι ένα πολύ μεγάλο ποσοστό του CLA στα λιπίδια των ιστών και του γάλακτος, προερχόταν από ενδογενή σύνθεση μέσω του ενζύμου Δ 9 - αφυδρογονάση, διεργασία που επιτελείται σε πολύ μεγάλο βαθμό στο μαστικό αδένα. Οι Griinari et al. (2000) έδειξαν επίσης ότι η συνεισφορά του ενδογενώς συντιθέμενου CLA στο μαστικό αδένα, ανέρχεται περίπου στο 64% της συνολικής περιεκτικότητας του λίπους του γάλακτος σε CLA. ΜΕΓΑΛΗ ΚΟΙΛΙΑ ΙΣΤΟΙ λινελαϊκό cis-9, cis-12 C18:2 cis-9, cis-12 C18:2 cis-9, trans-11 C18:2 (CLA) cis-9, trans-11c18:2 (CLA) Δ 9 -αφυδρογονάση trans-11 C18:1 (βασσενικό οξύ) trans-11 C18 :1 Δ 9 -αφυδρογονάση C18:0 (στεατικό οξύ) C18:0 cis-9 C18:1 Σχήμα 2: Ρόλος της υδρογόνωσης στους προστομάχους και της δράσης της Δ9 αφυδρογονάσης στην παραγωγή του cis-9, trans-11 CLA στο λίπος των μηρυκαστικών ( Bauman et al., 1999). 17

17 2.6 Διατροφικές Πηγές CLA Τα γαλακτοκομικά προϊόντα είναι η κύρια διατροφική πηγή CLA (βούτυρο, γάλα, τυρί) αν και μπορεί να βρεθεί και σε κρέας προερχόμενο από μηρυκαστικά. Παρ όλα αυτά στην πλειονότητα των μελετών που έχουν γίνει σε ανθρώπους χρησιμοποιήθηκαν τα διαθέσιμα στο εμπόριο διατροφικά συμπληρώματα. Αυτά τα συμπληρώματα αποτελούνται από μείγματα 2 ή 4 από τα κυριότερα ισομερή (trans-8, cis-10 CLA, cis-9, trans-11 CLA, trans-10, cis-12 CLA και cis-11, trans13 CLA). Στις φυσικές τροφές, όμως, το cis-9, trans-11 CLA (ρουμενικό οξύ) αντιπροσωπεύει το 75% με 90% του συνολικού CLA (Moutsioulis et. al, 2008). Η συγκέντρωση του CLA στο λίπος αγελαδινού γάλακτος βρέθηκε ότι είναι ~0,6% των συνολικών λιπαρών οξέων του γάλακτος, με το ρουμενικό οξύ να αντιπροσωπεύει το ~80% αυτού του ποσοστού (ενώ οι Aldai et al., 2005 αναφέρουν ποσοστά της τάξεως του ~90%). Το υπόλοιπο 20% περιλαμβάνει διάφορα ήσσονος σημασίας ισομερή, όπως το trans-7 cis-9 (Yurawecz et al., 1998) και το trans-11 cis- 13 C18:2 (Sehat et al., 1998). Όσον αφορά στη συγκέντρωση του CLA στο γάλα των προβατινών, μετά από ανάλυση πολλών δειγμάτων βρέθηκε να είναι ~1% των συνολικών ΛΟ του γάλακτος και το ~80% αυτού του ποσοστού κατέχει το ρουμενικό οξύ. (Jahreis et al., Prandini et al., Barbosa et al., 2003). Η συγκέντρωση του CLA συνήθως εκφράζεται σε mg CLA /g λίπους. Τα περισσότερα γαλακτοκομικά προϊόντα περιέχουν περίπου 3,5-6 mg CLA /g λίπους. Η μέση κατανάλωση CLA διαφέρει από χώρα σε χώρα λόγω διαφορετικών διατροφικών συνηθειών. Για παράδειγμα στην Αγγλία η κατανάλωση είναι mg/ημέρα. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η κατανάλωση στις γυναίκες είναι χαμηλότερη σε σύγκριση με τους άνδρες λόγω πιθανώς της κατανάλωσης γαλακτοκομικών προϊόντων με χαμηλότερα λιπαρά (Klaus et. al., 2004). 18

18 2.7 ΔΙΑΤΡΟΦΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΤΟΥ CLA ΣΤΟ ΓΑΛΑ Πολλές μελέτες έδειξαν μια αύξηση της περιεκτικότητας του γάλακτος σε CLA σε μηρυκαστικά των οποίων η διατροφή βασιζόταν στη βόσκηση (Dhiman et al., 1999a, Loor et al., 2002, Kay et al., 2004) αλλά και σε μηρυκαστικά που τους χορηγήθηκε πλήρες σιτηρέσιο (Total Mixed Ration, TMR) που αποτελούνταν κατά 50% από χονδροειδή τροφή και 50% από συμπυκνωμένη τροφή με φυτικά έλαια ή ελαιούχους σπόρους (Lock & Garnsworthy, 2002, Madron et al., 2002, Khanal et al., 2005), ή περιείχαν ιχθυέλαια (Abu-Ghazaleh et al., 2003, Donovan et al., 2000). Η αύξηση της συγκέντρωσης του CLA στα προϊόντα των μηρυκαστικών μέσω των κατάλληλων διατροφικών χειρισμών είναι εδώ και μερικά χρόνια στο επίκεντρο διαφόρων ερευνών (Jiang et al., 1996, Jahries et al., 1997, Lawless et al., 1998, Dhiman et al., 2000) και θα συνεχίσει να είναι με σκοπό την ενίσχυση της περιεκτικότητας του γάλακτος σε CLA (Griswold et al., 2003, Sackman et al., 2003, Watkins et al., 2003, Kay et al., 2004, Khanal et al., 2005). Η διαχείριση της διατροφής των μηρυκαστικών αφορά κυρίως τη χορήγηση λινελαϊκού οξέος (cis-9, cis-12 C18:2 LA) ή α-λινολενικού οξέος (cis-9, cis-12, cis-15 C18:3, LNA) ως υποστρώματα για υδρογόνωση στη μεγάλη κοιλία. Τα έλαια των φυτών ή οι ελαιούχοι καρποί περιέχουν ως κύρια λιπαρά οξέα το λινελαϊκό ή/και το α-λινολενικό οξύ, ενώ στη χλωρή βοσκήσιμη ύλη το κύριο λιπαρό οξύ είναι το α-λινολενικό. Στα ιχθυέλαια τα λιπαρά οξέα που δεσπόζουν είναι αυτά που αποτελούνται από 20 ή 22 άτομα άνθρακα. Ένα ποσοστό των CLAs και TVA που σχηματίζονται ως ενδιάμεσα προϊόντα της υδρογόνωσης των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων, διαφεύγουν της περαιτέρω υδρογόνωσης στη μεγάλη κοιλία και απορροφώνται από τον πεπτικό σωλήνα. Τότε το TVA μετατρέπεται ενδογενώς στο μαστικό αδένα (Griinari & Bauman, 1999) και πιθανόν στα λιποκύτταρα (Gillis et al., 2003) σε cis-9, trans-11 CLA μέσω της δράσης του ενζύμου Δ 9 - αφυδρογονάση. Η χορήγηση συνθετικών ισομερών CLAs έχει επίσης διερευνηθεί, με στόχο την ενίσχυση της λιποπεριεκτικότητας του γάλακτος σε CLAs. 19

19 Πίνακας 1. Κύρια λιπαρά οξέα (%) διατροφικών συστατικών που χρησιμοποιούνται αύξηση της περιεκτικότητας του γάλακτος σε CLA για Ζωοτροφές C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 Βαμβακόσπορος/έλαιο - 23,4 2,2 16,5 57,4 - Εξωθημένος σογιόσπορος/ Σογιέλαιο - 14,5 3,8 19,5 53,2 9,1 Σιναπόσπορος/έλαιο - 4,9 1,5 57,2 21,4 11,4 Λιναρόσπορος/έλαιο - 5,6 3,7 17,7 15,4 57,2 Σπόροι ηλίανθου/ ηλιέλαιο - High oleic 0,1 4,6 2,3 79,3 13,2 0,4 - High linoleic - 6,3 3,7 22,8 67,0 - Σπόρος/έλαιο ατραχτηλίδας 0,1 5,9 2,4 15,2 76,0 0,3 Σπόρος canola/ έλαιο canola 4,1 1,8-58,9 22,0 13,2 Φοινικέλαιο 1,5 43,6 3,2 45,7 2,2 0,2 Ελαιόλαδο - 13,0 2,5 74,0 9,0 - Φιστικέλαιο/σπόρος φιστικιού - 12,3 3,2 51,5 33,2 - Αραβοσιτέλαιο - 10,6 2,0 27,3 57,5 1,0 Ιχθυέλαιο 14,0 26,0 2,0 2,0 3,0 2,0 Ζωικό λίπος 3,2 26,6 20,0 44,0 3,5 - Βοσκήσιμη ύλη : Χόρτο βοσκής 0,6 21,0 1,8 2,1 21,1 53,4 Χόρτο μηδικής 20,7 35,8 3,3 3,4 15,3 21,5 Ενσίρωμα καλαμποκιού 6,9 16,7 1,9 16,8 54,9 2,7 Πηγές : Dhiman et al. (1999) Lock and Garnsworthy (2002) Loor and Herbein (2003) Delbicchi et al. (2001) Bremmer et al. (1998) Loor et al. (2002) Kelly et al. (1998a). Duckett et al. (2002) Ward et al. (2003). Beam et al. (2000) Έλαια και ελαιούχοι καρποί Τα λίπη, τα έλαια και οι ελαιούχοι καρποί διαφέρουν ως προς τη σύστασή τους σε λιπαρά οξέα (πίνακας 1). Για το λόγο αυτό είναι αναμενόμενο να έχουν διαφορετική επίδραση στην περιεκτικότητα του λίπους του γάλακτος σε CLA. Έλαια και ελαιούχοι καρποί που είναι πλούσιοι σε λινελαϊκό οξύ, είναι πολύ αποτελεσματικοί στο να αυξάνουν την περιεκτικότητα του λίπους του γάλακτος σε CLA σε αγελάδες που διατρέφονται με πλήρη σιτηρέσια που αποτελούνται από 50% χονδροειδείς τροφές και 50% συμπυκνωμένες τροφές (Dhiman et al., 2000, Ward et al., 2003, Whitlock et al., 2003). Έτσι, όπως είναι αναμενόμενο, έλαια ή καρποί 20

20 σόγιας, ηλίανθου, βάμβακος, αυξάνουν την περιεκτικότητα του λίπους του γάλακτος σε CLA όταν αυτά χορηγούνται σε πλήρη μίγματα σιτηρεσίων. Ομοίως, τα έλαια ή οι καρποί από λινάρι που είναι πλούσιοι σε λινολενικό οξύ και ο καρπός σιναπιού που είναι πλούσιος σε ελαϊκό οξύ, που επίσης περιέχει μικρές ποσότητες λινολενικού και λινελαϊκού οξέος, έδειξαν ότι αυξάνουν την περιεκτικότητα του λίπους του γάλακτος σε CLA (Dhiman et al., 2000, Loor et al. 2002). Όταν εξετάστηκε η επίδραση των διαφόρων ελαίων των πιο πάνω ζωοτροφών στη λιποπεριεκτικότητα του γάλακτος, βρέθηκε ότι ο ηλίανθος αύξανε την περιεκτικότητα του λίπους του γάλακτος σε CLA περισσότερο από ό,τι οι άλλοι καρποί (Kelly et al., 1998). Παρόμοια αποτελέσματα διαπιστώνονται και κατά τη χορήγηση αλάτων ασβεστίου των λιπαρών οξέων φυτικών ελαίων σε αγελάδες γαλακτοπαραγωγής, το οποίο οφείλεται στο γεγονός ότι τα άλατα ασβεστίου των λιπαρών οξέων διασπώνται στη μεγάλη κοιλία επιτρέποντας έτσι την υδρογόνωσή τους (Chouinard et al., 2001). Από την άλλη, χορήγηση συμπυκνωμένων ζωοτροφών σε αγελάδες των οποίων η διατροφή βασίζεται στη βόσκηση ή στο ενσίρωμα αραβοσίτου μειώνει την περιεκτικότητα του CLA στο λίπος του γάλακτος (Dhiman et al.,1999, Chouinard et al., 1998, Jahreis et al., 1997). Αυτό οφείλεται στην πτώση του ph της μεγάλης κοιλίας ως αποτέλεσμα της προσθήκης των καρπών η οποία προκαλεί μείωση του πληθυσμού των κυτταρινολυτικών βακτηρίων και άλλων μικροοργανισμών στους οποίους οφείλεται η υδρογόνωση των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων και επομένως ο σχηματισμός των CLAs και του TVA (Harfoot & Hazelwood, 1988, Jiang et al.,1996, Martin et al.,2002) Θερμικά Επεξεργασμένοι Καρποί Η χορήγηση ψημένων ή εξωθημένων καρπών φαίνεται να έχει μεγαλύτερη επίδραση στην περιεκτικότητα του λίπους του γάλακτος σε CLA απ ό,τι η χορήγηση μη επεξεργασμένων καρπών (Νήτας κ.ά., 2007). Αυτό κατά πάσα πιθανότητα οφείλεται στη μικρότερη διαθεσιμότητα του ελαίου των μη επεξεργασμένων καρπών στη μεγάλη κοιλία σε σύγκριση με εκείνη των θερμικά επεξεργασμένων με αποτέλεσμα τη βραδεία απελευθέρωση των ελαίων τους που τελικά οδηγεί στην πλήρη υδρογόνωση του λινελαϊκού οξέος σε στεατικό οξύ και άρα στο σχηματισμό μικρότερων ποσοτήτων των ενδιάμεσων προϊόντων της υδρογόνωσης CLAs και TVA (Dhiman et al., 2000, Chouinard et al., 2001). 21

21 Οι Chouinard et al. (2001) χορήγησαν σε αγελάδες καρπούς σόγιας που είχαν προηγουμένως υποστεί κυλινδρισμό, μικροϊονισμό, ψήσιμο ή εξώθηση. Η εξώθηση, ο μικροϊονισμός ή το ψήσιμο των καρπών της σόγιας είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση των CLAs στο λίπος του γάλακτος κατά δύο έως τρεις φορές σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο καρπό σόγιας. Φαίνεται ότι τα λιπαρά οξέα ήταν περισσότερο προσβάσιμα στους μικροοργανισμούς όταν οι καρποί σόγιας υπόκειντο σε θερμική επεξεργασία Ιχθυέλαια και ο Συνδυασμός τους με Ελαιούχους Καρπούς Τα ιχθυέλαια είναι εξίσου ή ακόμη πιο αποτελεσματικά από τα φυτικά έλαια στο να αυξάνουν την περιεκτικότητα του λίπους του γάλακτος σε CLA (Donovan et al., 2000, Chouinard et al., 2001, Whitlock et al., 2002). Η χορήγηση ιχθυελαίων έχει αποδείξει ότι αυξάνει το επίπεδο του CLA και TVA στο λίπος του γάλακτος, αλλά μειώνει το ολικό λίπος του γάλακτος (Donovan et al., 2000, Baer et al., 2001, Ramaswamy et al., 2001). Παρ όλα αυτά, μια αύξηση της περιεκτικότητας του σιτηρεσίου με ιχθυέλαιο σε ποσοστό 3%, δεν επέφερε περαιτέρω αύξηση των επιπέδων των CLAs και TVA στο λίπος του γάλακτος (Donovan et al., 2000). Ερευνητές έχουν επίσης επιχειρήσει να αυξήσουν τα επίπεδα του CLA στο λίπος του γάλακτος, χορηγώντας μίγματα ιχθυελαίων και σόγιας. Πειράματα έχουν δείξει ότι η χορήγηση ιχθυελαίου είναι περισσότερο αποτελεσματική στην αύξηση του επιπέδου των CLAs και TVA στο λίπος του γάλακτος απ ό,τι η χορήγηση παρόμοιων ποσοτήτων σογιέλαιου ή μίγματος των δύο αυτών ζωοτροφών (Ramaswamy et al., 2001, Abu-Ghazaleh et al., 2002, Whitlock et al., 2002). Τα ιχθυέλαια είναι τροφές πλούσιες σε μακράς αλυσίδας πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFAs). Τα n-3 PUFAs που περιέχονται στα ιχθυέλαια είναι κυρίως τα C20:5 (14%), C22:6 (10%), C18:3 (1.0%) στο σύνολο των λιπαρών οξέων τους (The British Nutrition Foundation, 1992). Η αύξηση του CLA του λίπους του γάλακτος ως αποτέλεσμα τη προσθήκης ιχθυελαίων οφείλεται κατά κύριο λόγο στην ανασταλτική επίδραση που ασκούν τα πολυακόρεστα λιπαρά τους οξέα στην υδρογόνωση του TVA ώστε τελικά μεγαλύτερες ποσότητές του να απορροφώνται από τον πεπτικό σωλήνα και να χρησιμοποιούνται ως υπόστρωμα για την ενδογενή σύνθεση CLA στο μαστικό αδένα (Chilliard et al., 1999). 22

22 2.7.4 Χόρτο Βοσκής Η κατανάλωση από μέρους των μηρυκαστικών χλωρού χόρτου φαίνεται να οδηγεί στην παραγωγή γάλακτος με ιδιαίτερα υψηλή περιεκτικότητα σε CLA (Kelly et al., 1998, Chouinard et al., 2001). Αυτό οφείλεται στην υψηλή περιεκτικότητα των χόρτων και ιδιαίτερα των χλωρών σε α-λινολενικό οξύ, από το οποίο σχηματίζεται TVA ως ενδιάμεσο προϊόν της υδρογόνωσής του στη μεγάλη κοιλία (Bauman et al., 1999). Η ωριμότητα του χόρτου βοσκής αλλά και ο τρόπος συντήρησής του είναι σημαντικοί παράγοντες που επηρεάζουν τα επίπεδα του CLA στο γάλα των μηρυκαστικών ζώων. Αυτό γιατί η περιεκτικότητα των φυτών σε α-λινολενικό οξύ μειώνεται κατά την ωρίμανσή τους (Jahreis et al., 1997, Chilliard et al., 2000). Έτσι, θερίζοντας το χόρτο στο στάδιο του σανού, η περιεκτικότητα του λινολενικού και των άλλων λιπαρών οξέων μειώνεται, ενώ με τη διαδικασία της ενσίρωσης της βοσκήσιμης ύλης και με την προϋπόθεση ότι αυτή διεξάγεται σωστά δεν παρατηρείται καμία μεταβολή (Doreau & Poncet, 2000). Η περιεκτικότητα της βοσκήσιμης ύλης σε λινολενικό οξύ μπορεί να μειωθεί αν το χόρτο αφεθεί να μαραθεί προτού υποστεί τη διαδικασία της ενσίρωσης (Lough & Anderson, 1973). Σ αυτή ακριβώς τη μείωση της περιεκτικότητας των φυτών σε λινολενικό οξύ κατά την ωρίμανσή τους οφείλεται και η εποχιακή διακύμανση της συγκέντρωσης του CLA στο λίπος του γάλακτος των προβατινών (Nuda et al., 2005a, Mangia et al., 2007) και των αγελάδων (Ward et al., 2003, Kay et al., 2004) των οποίων η διατροφή βασίζεται στην ελεύθερη βόσκηση, καθώς αυτή μειώνεται όσο προχωρά η ωρίμανση των φυτών του βοσκότοπου Χορήγηση Συνθετικού CLA Το συνθετικό CLA μπορεί να χρησιμοποιηθεί προκειμένου να αυξηθούν τα επίπεδα του CLA στο λίπος του γάλακτος με την προϋπόθεση να χορηγηθεί σε προστατευμένη μορφή ώστε να μην υδρογονωθεί στη μεγάλη κοιλία. Το συνθετικό CLA που χρησιμοποιείται αποτελεί συνήθως μίγμα διαφόρων ισομερών CLAs. Τέτοια μίγματα βρέθηκε ότι έχουν παρεμποδιστική δράση στη λιποσύνθεση του γάλακτος (Loor & Herbein, 1998). Τη δράση αυτή φαίνεται να ασκεί το trans-10, cis- 12 CLA (Baumgard et al., 2000). Η μείωση της δραστηριότητας της ακετυλο-coa καρβοξυλάσης των λιπαρών οξέων είναι ο βασικός παράγοντας της πτώσης του λίπους του γάλακτος (Piperova et al., 2000). 23

23 2.7.6 Λοιποί Διατροφικοί και Φυσιολογικοί Παράγοντες Ένας παράγοντας ο οποίος φαίνεται να επηρεάζει τη συγκέντρωση του CLA τόσο στο λίπος του γάλακτος όσο και στο λιπώδη ιστό, είναι ο χαλκός. Ο χαλκός αλλάζει το μεταβολισμό των λιπών, πιθανότατα αυξάνοντας την υδρογόνωση των λιπαρών οξέων στη μεγάλη κοιλία ή περιορίζοντας τον αποκορεσμό του C18:0 στο λιπώδη ιστό και το μαστικό αδένα (Corl et al.,1999). Μάλιστα, έχει βρεθεί ότι η μείωση της ποσότητας του χαλκού που προσλαμβάνεται με την τροφή έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της συγκέντρωσης του CLA στο λίπος του γάλακτος (Morales et al., 2000). Τέλος, εκτός από την διατροφή, φυσιολογικοί παράγοντες όπως η φυλή, το είδος του ζώου, η ηλικία, το στάδιο της γαλακτικής περιόδου και ο αριθμός των τοκετών επιδρούν και αυτοί στο σχηματισμό CLA (Kelly et al., 1998, Secchiari et al., 2001, White et al., 2001, Lock & Garnworthy, 2002). Έτσι, έρευνα που έγινε σε διάφορες φυλές προβάτων γαλακτοπαραγωγής έδειξε ότι η συγκέντρωση του CLA στο λίπος του γάλακτος της Φρισλανδικής φυλής έναντι των φυλών Χίου, Awassi και Lacaune ήταν χαμηλότερη κατά 30% περίπου, χωρίς σημαντικές διαφορές μεταξύ των υπόλοιπων φυλών. Στην ίδια ερευνητική εργασία, βρέθηκε επίσης ότι η συγκέντρωση του CLA στο λίπος του γάλακτος ήταν υψηλότερη στην αρχή της γαλακτικής περιόδου και παρουσίασε σταδιακή μείωση με την εξέλιξή της, χωρίς, όμως, να επηρεάζεται από την παραγόμενη ποσότητα γάλακτος και τον αριθμό των τοκετών, ενώ είχε αρνητική συσχέτιση με την λιποπεριεκτικότητα χωρίς αυτή όμως να είναι στατιστικώς σημαντική (Τσιπλάκου κ.α., 2005). Οι κύριοι διατροφικοί παράγοντες που επιδρούν στη συγκέντρωση του CLA στο λίπος του γάλακτος των μηρυκαστικών, συνοψίζονται στον παρακάτω πίνακα. 24

24 Πίνακας 2. Διατροφικοί παράγοντες που επηρεάζουν την συγκέντρωση των CLAs στο γάλα και στο κρέας και ο τρόπος δράσης τους (θετικός ή αρνητικός) (Khanal & Olson, 2004). Παράγοντες Πράσινο χλωρό χόρτο βοσκής Χόρτο βοσκής + εξωθημένοι καρποί σόγιας Χόρτο βοσκής + σογιέλαιο Χόρτο βοσκής + ιχθυέλαιο Ώριμο χόρτο βοσκής Φρεσκοκομμένο χόρτο βοσκής Μη επεξεργασμένοι καρποί Ψημένα σπέρματα Εξωθημένα σπέρματα Φυτικά έλαια Άλευρα/ έλαια ιχθύων Άλατα ασβεστίου των λιπαρών οξέων Θαλάσσια φύκη Συμπληρώματα CLA Επίδραση στο CLA Πολύ θετική Καμία επίδραση Καμία επίδραση Θετική Αρνητική Θετική (μεγαλύτερη σε σύγκριση με εκείνη του ενσιρώματος) Ελάχιστα θετική Θετική Θετική, (μεγαλύτερη σε σύγκριση με εκείνη των ψημένων σπερμάτων ) Θετική, (μεγαλύτερη σε σύγκριση με εκείνη των επεξεργασμένων σπερμάτων ) Θετική, (μεγαλύτερη σε σύγκριση με εκείνη των σπερμάτων και φυτικών ελαίων) Θετική Θετική Θετική 2.8 Η ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΟΥ CLA ΣΤΗ ΔΙΑΤΡΟΦΗ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Το επιστημονικό ενδιαφέρον για την επίδραση του CLA στην υγεία του ανθρώπου ουσιαστικά ξεκίνησε όταν οι Ha et al. (1987) απέδειξαν ότι το CLA ήταν αποτελεσματικό στην παρεμπόδιση της επιδερμικής νεοπλασίας στα ποντίκια. Μερικές από τις δυνητικές ευεργετικές επιδράσεις του CLA, οι οποίες ανακαλύφθηκαν μετά από μελέτες σε ζώα αλλά και ανθρώπους είναι: παρεμποδίζει την καρκινογένεση (Ip et al., 1994, Pariza et al., 2001) αποτρέπει την αύξηση της «κακής» (LDL) χοληστερόλης (Tricon et al., 2004) παρεμποδίζει την ανάπτυξη αρτηριοσκλήρωσης (Lee et al., 1994, Kritchevsky et al., 2000) μειώνει τη συσσώρευση του σωματικού λίπους (Park et al., 1997, Ostrowska et al., 1999) 25

25 ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα (Miller et al., 1994, Sugano et al., 1998) Το κύριο ισομερές CLA που βρέθηκε ότι σχετίζεται με αυτές τις ευεργετικές δράσεις στην υγεία του ανθρώπου είναι κυρίως το cis-9, trans-11, ενώ το trans-10, cis-12 CLA σχετίζεται με τη μείωση του σωματικού λίπους. 2.9 Ο ΒΑΜΒΑΚΟΣΠΟΡΟΣ ΣΤΗ ΔΙΑΤΡΟΦΗ ΤΩΝ ΜΗΡΥΚΑΣΤΙΚΩΝ Ο βαμβακόσπορος προέρχεται από τα διάφορα καλλιεργούμενα είδη βαμβακιού. Στην Ελλάδα η καλλιέργεια βαμβακιού είναι αρκετά διαδεδομένη με κύριο σκοπό την παραγωγή των ινών των σπερμάτων του οι οποίες χρησιμοποιούνται στη νηματουργία. Μετά την αφαίρεση των ινών αυτών (εκκόκκιση) τα καθαρά σπέρματα του βαμβακιού μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη διατροφή των αγροτικών ζώων. Τα σπέρματα, όμως αυτά περιέχουν σε σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις γκοσυπόλη η οποία από χημικής άποψης είναι μια πολυφαινολική διναφθυλαλδεΰδη (Noftsger et al., 2000, Prieto et al., 2003). Η γκοσυπόλη μπορεί να δρα τοξικά στα μονογαστρικά ζώα και στα νεαρά μηρυκαστικά των οποίων οι προστόμαχοι δεν έχουν αναπτυχθεί πλήρως, αλλά τα μηρυκαστικά των οποίων οι προστόμαχοι έχουν αναπτυχθεί πλήρως μπορούν να την ανέχονται σε σχετικά μεγάλες ποσότητες καθώς η τοξική της δράση εξουδετερώνεται σε μεγάλο ποσοστό από τους μικροοργανισμούς της μεγάλης κοιλίας (Noftsger et al., 2000, Prieto et al., 2003). Κατά συνέπεια, η χρήση του βαμβακόσπορου ως ζωοτροφής πρακτικά περιορίζεται μόνο στη διατροφή των μηρυκαστικών. Ο βαμβακόσπορος ουσιαστικά αποτελεί παραπροϊόν της καλλιέργειας βαμβακιού που προορίζεται για τη νηματουργία και ακριβώς γι αυτό το λόγο χρησιμοποιείται κυρίως στις χώρες που η καλλιέργεια αυτή είναι διαδεδομένη. Παρ όλα αυτά, πρόκειται για ζωοτροφή με ιδιαίτερη θρεπτική αξία. Αυτό γιατί ως συμπυκνωμένη ζωοτροφή έχει υψηλές συγκεντρώσεις πρωτεϊνών και λιπαρών ουσιών (έλαια), αλλά σε ένα ποσοστό έχει και χαρακτηριστικά χονδροειδούς ζωοτροφής καθώς παρουσιάζει μεγάλη συγκέντρωση κυτταρινών και ADF (Reveneau et al., 2005). Το έλαιό του αποτελείται κυρίως από λινελαϊκό, παλμιτικό και ελαϊκό οξύ. 26

26 2.10 Επίδραση του βαμβακόσπορου στο προφίλ των λιπαρών οξέων του γάλακτος Σύμφωνα με πλήθος ερευνών που έχουν γίνει σε γαλακτοπαραγωγές αγελάδες, η χορήγηση βαμβακόσπορου ακατέργαστου ή κατεργασμένου ή με τη μορφή του ελεύθερου ελαίου του (βαμβακέλαιου) μπορεί να προκαλέσει σημαντικές αλλαγές στο προφίλ των λιπαρών οξέων του γάλακτος. Πιο συγκεκριμένα, προκαλεί τη μείωση της συγκέντρωσης στο λίπος του γάλακτος των λιπαρών οξέων C6:0 ως C16:0 και αντίθετα την αύξηση των C18:0 και C18:1, ενώ επίσης έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του trans-11 βασσενικού οξέος και του cis-9, trans-11 CLA. (Miller et al. 2009, Dhiman et al., 1999). Τα παραπάνω αποτελέσματα συμφωνούν και με τα αποτελέσματα της εργασίας των Νήτα κ.ά. (2009) που πραγματοποιήθηκε σε πρόβατα. Τα αποτελέσματα αυτά είναι πιο εμφανή με τη χορήγηση εξωθημένου ή πελετοποιημένου βαμβακόσπορου καθώς και βαμβακέλαιου σε σχέση με την προσθήκη ακατέργαστου βαμβακόσπορου (Arieli, 1998, Reveneau et al., 2005, Zhαng et al., 2006). Η χορήγηση, όμως, κατεργασμένου βαμβακόσπορου (Liu et al., 2008) και ακόμα περισσότερο βαμβακέλαιου (Zhαng et al., 2006) μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα και την πτώση της λιποπεριεκτικότητας του γάλακτος, κάτι το οποίο είναι γενικά ανεπιθύμητο για τη γαλακτοβιομηχανία. Από την άλλη, η προσθήκη ακατέργαστου βαμβακόσπορου δεν προκαλεί σημαντικές αλλαγές στη συγκέντρωση του λίπους του γάλακτος (DePeters et al., 1985) και επομένως προσφέρεται περισσότερο για αλλαγές στη σύσταση του λίπους του γάλακτος σε λιπαρά οξέα χωρίς ταυτόχρονες αλλαγές στη συγκέντρωσή του στο γάλα. Στις αίγες, αντιθέτως, από τα φτωχά βιβλιογραφικά δεδομένα που υπάρχουν ως τώρα, φαίνεται πως η χορήγηση βαμβακόσπορου με την τροφή δεν επηρεάζει σημαντικά τα λιπαρά οξέα του γάλακτος ούτε και τη συγκέντρωση των transβασσενικού και cis-9, trans-11 CLA (Nuda et al., 2005b). 27

27 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Στο πλαίσιο της εργασίας αυτής διενεργήθηκε ένα πείραμα με 24 προβατίνες της εγχώριας ορεινής φυλής προβάτων. Οι προβατίνες χωρίστηκαν σε τρεις ισοδύναμες ως προς τη γαλακτοπαραγωγή ομάδες σε πειραματική διάταξη πλήρως τυχαιοποιημένου σχεδίου (complete randomized design) με επαναλαμβανόμενες μετρήσεις στις διαδοχικές εβδομάδες του ελέγχου. Κατά την ημέρα εισόδου των προβατινών στο πείραμα έγινε η πρώτη τους ζύγιση η οποία επαναλήφθηκε αμέσως μετά την τελευταία δειγματοληψία ώστε να γίνει καταγραφή του αρχικού και τελικού βάρους των προβατινών καθώς και της μεταβολής του κατά τη διάρκεια του πειράματος. Οι προβατίνες διατράφηκαν με 3 ισοαζωτούχα σιτηρέσια Α, Β και Γ. Το σιτηρέσιο Α (μάρτυρας) αποτελούνταν από καρπό αραβοσίτου, καρπό κριθής, σογιάλευρο, ξηρό χόρτο μηδικής, άχυρο σίτου και μίγμα ανόργανων αλάτων και βιταμινών. Στα δύο άλλα σιτηρέσια Β και Γ (επεμβάσεις) μέρος του σογιάλευρου και του καρπού κριθής αντικαταστάθηκαν από βαμβακόσπορο (whole-raw cottonseed) ώστε ο τελευταίος να αποτελεί το 14% και 28% του σιτηρεσίου, αντίστοιχα. Η σύνθεση και η χημική σύσταση των σιτηρεσίων φαίνονται στους πίνακες 3 και 4, αντίστοιχα. Το πείραμα διενεργήθηκε στις εγκαταστάσεις του Πρότυπου Κέντρου Κτηνοτροφίας και Εκπαίδευσης Βλάστης Κοζάνης. Τη φροντίδα και περιποίηση των ζώων είχε το προσωπικό του Πρότυπου Κέντρου. Πίνακας 3. Σύνθεση σιτηρεσίων (% με βάση την ξηρά ουσία). Συστατικά Σιτηρέσιο A Β Γ Ολόκληρος βαμβακόσπορος - 14,00 28,00 Ξηρό χόρτο μηδικής 10,00 10,00 10,00 Άχυρο σίτου 30,00 30,00 30,00 Καρπός αραβοσίτου 10,00 10,00 10,00 Καρπός κριθής 37,70 29,20 20,70 Σογιάλευρο 11,00 5,50 - Μαγειρικό άλας 1,00 1,00 1,00 Βιταμίνες και ιχνοστοιχεία 0,30 0,30 0,30 Τα σιτηρέσια παραθέτονταν δύο φορές την ημέρα στις 07:00 και 19:00 σε κάθε διαμέρισμα των 4 προβατινών. Η ποσότητα της τροφής κάλυπτε τις ημερήσιες ανάγκες των ζώων για συντήρηση και γαλακτοπαραγωγή (NRC, 1985). Σε 28

28 καθημερινή βάση, εφόσον δεν καταναλώνονταν το σύνολο της παρατιθέμενης τροφής από τις προβατίνες, υπολείμματα αυτής ζυγίζονταν και καταγράφονταν. Η διάρκεια του πειράματος ήταν 6 περίοδοι των 2 εβδομάδων. Η γαλακτομέτρηση και η συλλογή δειγμάτων γάλακτος για αναλύσεις γινόταν στις δύο τελευταίες ημέρες κάθε περιόδου στις 6:00 και 18:00. Ένα μέρος των χημικών αναλύσεων των ζωοτροφών έγινε στα εργαστήρια του Κέντρου Ελέγχου και Πιστοποίησης Πολλαπλασιαστικού Υλικού και Ελέγχου Λιπασμάτων (ΚΕΠΠΥΕΛ) Θεσσαλονίκης. Η ολική ενέργεια των ζωοτροφών προσδιορίστηκε με θερμιδόμετρο Parr Στα ίδια δείγματα προσδιορίστηκαν η ξηρή ουσία, η τέφρα, το λίπος, οι αζωτούχες ουσίες (Νx6,25) και οι ινώδεις ουσίες, με βάση τις μεθόδους AOAC (1990), ενώ οι προσδιορισμοί για NDF, ADF, κυτταρίνη, ημικυτταρίνες και λιγνίνη έγιναν με βάση τις μεθόδους Goering Van Soest (1970). Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα προσδιορίστηκε η χημική σύσταση των σιτηρεσίων. Πίνακας 4. Χημική σύσταση (% της ΞΟ), ολική ενέργεια και μεταβολίσιμη ενέργεια (Mj/kg Ξ.Ο.) των σιτηρεσίων. Στοιχεία Σιτηρέσιο A Β Γ Ξηρή ουσία 87,26 87,63 88,01 Οργανική ουσία 92,78 92,77 92,76 Τέφρα 7,22 7,23 7,24 Αζωτούχες ουσίες 17,39 17,09 16,78 Λιπαρές ουσίες 1,78 4,39 7,01 Ινώδεις ουσίες 13,29 16,84 20,39 Ελεύθερες αζώτου εκχυλ. ουσίες (EAEO) 60,32 54,45 48,58 NDF 34,93 40,35 45,76 ADF 18,66 22,45 26,24 Ημικυτταρίνες 16,26 17,89 19,51 Κυτταρίνη 14,72 17,12 19,51 Λιγνίνη 3,93 5,33 6,72 Ολική ενέργεια (ΟΕ) 17,88 18,52 19,16 Μεταβολίσιμη ενέργεια (ΜΕ) 1 10,90 11,12 11,34 1 NRC (1985) Κατά τη διάρκεια των δύο τελευταίων ημερών κάθε πειραματικής περιόδου, που γινόταν γαλακτομέτρηση λαμβάνονταν από το γάλα κάθε προβατίνας δύο αντιπροσωπευτικά δείγματα γάλακτος κατά την απογευματινή άμελξη και δύο κατά τη διαδοχική πρωινή. Σε ένα απογευματινό και ένα πρωινό δείγμα γινόταν προσδιορισμός του λίπους, της λακτόζης, των στερεών χωρίς λίπος (SNF) και της πρωτεΐνης και τα αποτελέσματα καταγράφονταν ατομικά ως ενιαίο δείγμα με βάση την ατομική απόδοση σε γάλα σε κάθε μία από τις δύο παραπάνω αμέλξεις. Επίσης 29

29 έγινε εκτίμηση της ποσότητας του γάλακτος διορθωμένη με βάση την ενέργεια (Energy Corrected Milk, ECM) και την περιεκτικότητα σε λίπος 6% (Fat Corrected Milk 6%, FCM) σύμφωνα με τις παρακάτω εξισώσεις: ECM (ml/ημέρα) = Ποσότητα γάλακτος (ml/ημ.) x [0,071 x λίπος (%)+0,043 x πρωτεΐνη (%)+0,2224] (Bocquier et al., 1993), και FCM 6% (ml/ημέρα) = Ποσότητα γάλακτος (ml/ημ.) x [0,28+0,12 x λίπος (%)] (Kalaisakis et al., 1982) Τα άλλα δύο δείγματα γάλακτος αποθηκεύονταν στους C μέχρι την ανάλυσή τους για τον προσδιορισμό των λιπαρών οξέων. 3.1 Ανάλυση λιπαρών οξέων στο λίπος του γάλακτος και των ζωοτροφών Η σύσταση του λίπους του γάλακτος σε λιπαρά οξέα προσδιορίστηκε με την τεχνική της αέριας χρωματογραφίας. Αρχικά έγινε η προετοιμασία των δειγμάτων γάλακτος που περιλάμβανε την απόψυξή τους και την ανάμιξη των ατομικών δειγμάτων από τη βραδινή και αντίστοιχη πρωινή άμελξη κατ αναλογία με την ατομική απόδοση σε γάλα σε κάθε μία από τις δύο αυτές αμέλξεις ώστε να προκύψει ένα ατομικό δείγμα για κάθε δειγματοληψία. Στη συνέχεια το λίπος εκχυλίστηκε από δείγματα γάλακτος (50 μl) με χλωροφόρμιο/μεθανόλη (2:1, κατ όγκο) σύμφωνα με τους Folch et al. (1957) μετά από την προσθήκη μεθυλεστέρα του εικοσιενοϊκού οξέος (από Supelco, Bellefonte, PA, USA) ως εσωτερικό πρότυπο. Οι μεθυλεστέρες των λιπαρών οξέων παρασκευάστηκαν με καταλυόμενη από άλκαλι μεθανόλυση του λίπους του γάλακτος (2N KOH σε μεθανόλη) σύμφωνα με τη μέθοδο ISO (2002). Οι μεθυλεστέρες που παράχθηκαν με αυτό τον τρόπο διαχωρίστηκαν σε χρωματογράφο Hewlett-Packard 5890 Series II (Waldbronn, Γερμανία) εφοδιασμένο με τριχοειδή στήλη DB23 της εταιρείας J & W Scientific (Folsom, CA, USA) μήκους 60 m και ανιχνευτή ιοντισμού φλόγας. Η θερμοκρασία της στήλης προγραμματίστηκε από τους 50 ο C στους 200 ο C με ρυθμό 5 ο C/min, στη συνέχεια στους 210 C με ρυθμό 1 C/min, στη συνέχεια στους 240 C με ρυθμό 4 C/min και διατήρηση στους 240 C για 10 min. Το φέρον αέριο ήταν ήλιο με ροή 0,93 ml/min (στους 50 ο C). Οι μεθυλεστέρες των επιμέρους λιπαρών οξέων εντοπίζονταν στα χρωματογραφήματα μέσω της σύγκρισης των χρόνων κατακράτησής τους με εκείνους καθαρών μεθυλεστέρων από τη Supelco και τη Sigma (St. Louis, MO, USA) και 30

30 ποσοτικοποιούνταν μέσω της σύγκρισης του εμβαδού κάτω από τις αιχμές τους με εκείνο του μεθυλεστέρα του εικοσιενοϊκού οξέος (εσωτερικό πρότυπο) με τη βοήθεια του λογισμικού HP 3365 ChemStation της Hewlett-Packard. Η σύσταση του λίπους του βαμβακόσπορου (πίνακας 5) και των υπόλοιπων ζωοτροφών σε λιπαρά οξέα προσδιορίστηκε επίσης με αέρια χρωματογραφία και με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα υπολογίστηκε η συγκέντρωση των κυριότερων λιπαρών οξέων στο λίπος καθενός από τα τρία σιτηρέσια (πίνακας 6). Πίνακας 5. Περιεκτικότητα (mg/g) του λίπους των ζωοτροφών στα κυριότερα λιπαρά οξέα. Λιπαρά οξέα Άχυρο Σίτου Ξηρό χόρτο μηδικής Σογιάλευρο Βαμβακόσπορος Καρπός κριθής Καρπός αραβοσίτου 14:0 μυριστικό 66,8 10,8 3,1 7,2 4,2 1,0 16:0 παλμιτικό 328,8 335,6 191,1 247,6 124,9 107,4 18:0 στεατικό 96,8 62,5 61,2 27,0 47,0 56,3 18:1n9c ελαϊκό 112,1 60,1 154,9 164,1 265,8 232,4 18:1n7c cisβασσενικό 9,5 3,8 16,2 6,9 7,5 11,2 18:2n6c λινελαϊκό 145,7 224,2 471,7 528,0 493,8 513,7 18:3n3 α- λινολενικό 42,6 231,3 69,7 1,6 8,2 59,5 Άλλα 197,7 71,7 32,1 17,6 48,6 18,5 Πίνακας 6. Περιεκτικότητα (mg/g) του λίπους των σιτηρεσίων στα κυριότερα λιπαρά οξέα. Λιπαρά οξέα Σιτηρέσιο A Β Γ 12:0 λαυρικό 1,8 0,5 0,3 14:0 μυριστικό 11,0 8,2 7,9 16:0 παλμιτικό 262,4 253,7 252,5 18:0 στεατικό 53,5 32,5 29,6 18:1n9c ελαϊκό 145,9 158,6 160,4 18:1n7c cis-βασσενικό 7,6 6,9 6,8 18:2n6c λινελαϊκό 355,8 488,2 506,2 18:3n3 α-λινολενικό 105,3 25,1 14,2 Άλλα 56,7 26,3 22,1 31

31 Πίνακας 6α: Ποσότητα των κυριότερων λιπαρών οξέων στα σιτηρέσια (g) Λιπαρά οξέα Σιτηρέσιο A Β Γ 12:0 λαυρικό 0,06 0,04 0,04 14:0 μυριστικό 0,39 0,72 1,11 16:0 παλμιτικό 9,34 22,27 35,40 18:0 στεατικό 1,90 2,85 4,15 18:1n9c ελαϊκό 5,19 13,93 22,49 18:1n7c cis-βασσενικό 0,27 0,61 0,95 18:2n6c λινελαϊκό 12,67 42,86 70,97 18:3n3 α-λινολενικό 3,75 2,20 1,99 Άλλα 2,02 2,31 3,10 Οι δείκτες αθηρωμάτωσης (Atherogenicity Index, AI) και θρομβογένεσης (Thrombogenicity Index, TI) του γάλακτος υπολογίστηκαν με βάση τις σχέσεις των Ulbricht & Southgate (1991): ΑΙ = [C12:0+(4 x C14:0)+ C16:0) (MUFA + PUFA), και ΤΙ = (C14:0+C16:0+C18:0) [(0,5 x MUFA)+(0,5 x n-6)+(3 x n-3)+(n-3/n-6)] Σύμφωνα με τους παραπάνω ερευνητές, όσο μεγαλύτερος είναι κάθε ένας από τους παραπάνω δείκτες για ένα τρόφιμο, τόσο μεγαλύτερες είναι οι πιθανότητες πρόκλησης στον άνθρωπο καρδιαγγειακών νοσημάτων ως αποτέλεσμα της κατανάλωσης μεγάλων ποσοτήτων αυτού του τροφίμου. Ο Δείκτης της Δ 9 -αφυδρογονάσης (Desaturase Index, DI) υπολογίστηκε ξεχωριστά για κάθε ένα από τα ζεύγη λιπαρών οξέων C14:0/C14:1n5, C16:0/C16:1n7, C18:0/C18:1n9cis και trans-11 C18:1/cis-9,trans-11 CLA σύμφωνα με την παρακάτω σχέση των Kelsey et al., (2003): DI=(Προϊόν της Δ 9 -αφυδρογονάσης) (προϊόν της Δ 9 -αφυδρογονάσης + το υπόστρωμά της) Για παράδειγμα για το ζεύγος C14:0/C14:1n5 η παραπάνω σχέση γίνεται: DI=C14:1n5 (C14:1n5+C14:0) 32