ΧΡΩΜΑΤΙΚΑ ΠΡΟΤΥΠΑ ΣΤΑ ΦΥΛΛΑ: ΠΙΘΑΝΟΙ ΟΙΚΟ-ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΡΟΛΟΙ ΤΩΝ ΑΝΘΟΚΥΑΝΙΝΩΝ ΓΙΑΤΙ ΤΑ ΦΥΛΛΑ ΓΙΝΟΝΤΑΙ ΠΑΡΟ ΙΚΑ ΚΟΚΚΙΝΑ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΦΥΤΩΝ ΧΡΩΜΑΤΙΚΑ ΠΡΟΤΥΠΑ ΣΤΑ ΦΥΛΛΑ: ΠΙΘΑΝΟΙ ΟΙΚΟ-ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΡΟΛΟΙ ΤΩΝ ΑΝΘΟΚΥΑΝΙΝΩΝ Ή ΓΙΑΤΙ ΤΑ ΦΥΛΛΑ ΓΙΝΟΝΤΑΙ ΠΑΡΟ ΙΚΑ ΚΟΚΚΙΝΑ Παναγιώτα Καραγεώργου ιδακτορική ιατριβή Πάτρα 2006

2

3 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΦΥΤΩΝ ΧΡΩΜΑΤΙΚΑ ΠΡΟΤΥΠΑ ΣΤΑ ΦΥΛΛΑ: ΠΙΘΑΝΟΙ ΟΙΚΟ-ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΡΟΛΟΙ ΤΩΝ ΑΝΘΟΚΥΑΝΙΝΩΝ Ή ΓΙΑΤΙ ΤΑ ΦΥΛΛΑ ΓΙΝΟΝΤΑΙ ΠΑΡΟ ΙΚΑ ΚΟΚΚΙΝΑ Παναγιώτα Καραγεώργου ιδακτορική ιατριβή Πάτρα 2006

4

5 στην οικογένειά µου, στους φίλους, σ εκείνους που βιαστήκανε να φύγουν

6

7 Πρόλογος Η µελέτη αυτή πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Φυσιολογίας Φυτών, του Τµήµατος Βιολογίας του Πανεπιστηµίου Πατρών, κατά το χρονικό διάστηµα Με αφορµή την ολοκλήρωσή της, θα ήθελα να ευχαριστήσω κατ αρχάς τον Καθηγητή µου Γ. Μανέτα, για την ουσιαστική του καθοδήγηση σε όλη την πορεία των τεσσάρων αυτών χρόνων. Επίσης, για τη διάθεσή του να µε ξεναγεί στο µαγικό κόσµο της γνώσης και των µικρών και µεγάλων ερωτηµάτων, αλλά και για την εµπιστοσύνη, την υποµονή και τη στήριξή του όποτε τα χρειάστηκα. Τέλος, για το αίσθηµα εµπιστοσύνης που µου δηµιουργούσαν η συνέπειά και η διαθεσιµότητα του όλο αυτό τον καιρό. Τον Καθηγητή Γ. Ψαρά για τις συµβουλές του και την βοήθειά του στις µικροσκοπικές παρατηρήσεις. Τους Επίκουρους Καθηγητές Γ. Γραµµατικόπουλο και Γ. Πετροπούλου γιατί, ανεξάρτητα από τις όποιες υποχρεώσεις τους, πάντα έβρισκαν χρόνο για να συζητήσουν µαζί µου και να µε βοηθήσουν. Επίσης, γιατί από την αρχή µε τη συµπεριφορά τους µε έκαναν να νιώθω µέλος της µικρής κοινότητας του εργαστηρίου και µε το χιούµορ και την καλή τους διάθεση συνέβαλαν ώστε η κάθε µέρα στον εργαστηριακό χώρο να είναι ευχάριστη. Τα µέλη εξεταστικής µου επιτροπής, Καθηγητή Θ. Γεωργιάδη. Καθηγητή Γ. Ψαρά, Αν. Καθηγητή Γ. Καραµπουρνιώτη, Επ. Καθηγητή Α. Κυπαρίσση, Επ. Καθηγητή Γ. Γραµµατικόπουλο και την Επ. Καθηγήτρια Γ. Πετροπούλου, για την παρουσία τους, την καλή τους διάθεση και τα σχόλιά τους. Τα νεότερα µέλη του εργαστηρίου και κυρίως τον Β. Κυτρίδη που υπήρξε πάντα καλή παρέα σε θέµατα δουλειάς και όχι µόνο, στις κοινές µας ώρες στο χώρο του εργαστηρίου. Την οικογένειά µου, γιατί έτσι κι αλλιώς τίποτα δεν θα είχε γίνει χωρίς αυτούς. Ιδιαίτερα τη µητέρα µου, καθώς πάντα διακριτική και πάντα σεβόµενη τις επιλογές µου ήταν κοντά µου, ακόµα και όταν οι χιλιοµετρικές αποστάσεις το έκαναν δύσκολο. Και την αδελφή µου, αφού νοµίζω τελικά ότι η δική της αγάπη για τη γνώση και τη βιολογία λειτούργησε καταλυτικά σε πολλές επιλογές µου. Τους φίλους, παλιούς και νέους, που βρέθηκαν δίπλα µου και έδιναν µε το δικό τους τρόπο νόηµα στην εντός και εκτός εργαστηρίου καθηµερινότητα. Με τη συνδροµή όλων αυτών των ανθρώπων, τα τέσσερα χρόνια που χρειάστηκαν για να ολοκληρωθεί αυτή η διδακτορική διατριβή, αλλά και τα τρία προηγούµενα κατά τη διάρκεια των µεταπτυχιακών µου σπουδών, πέρασαν πραγµατικά όµορφα και δηµιουργικά. Χωρίς οι οποιεσδήποτε υποχρεώσεις και δουλειές να φτάσουν ποτέ να γίνουν περισσότερο πιεστικές ή κουραστικές απ ότι τους αναλογούσε. Και κυρίως, νοµίζω ότι όλα αυτά τα χρόνια άφησαν τελικά γνωριµίες και σχέσεις που διεκδικούν τη συνέχειά τους στο µέλλον. Τέλος, ευχαριστώ το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταµείο (ESF), το πρόγραµµα Εκπαίδευσης και Επαγγελµατικής Κατάρτισης (ΕΠΕΑΕΚ ΙΙ) και ιδιαιτέρως το πρόγραµµα Ηράκλειτος, για την οικονοµική ενίσχυση της διδακτορικής αυτής διατριβής. Πάτρα 2006 Παναγιώτα Καραγεώργου

8

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 1 ΚΟΚΚΙΝΕΣ ΧΡΩΣΤΙΚΕΣ ΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ... 1 ΑΠΟ ΠΑΛΙΑ...2 ΟΜΗ ΚΑΙ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΤΩΝ ΑΝΘΟΚΥΑΝΙΝΩΝ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΤΟΥΣ ΣΤΑ ΦΥΛΛΑ... 3 ΠΟΤΕ ΤΑ ΦΥΛΛΑ ΓΙΝΟΝΤΑΙ ΚΟΚΚΙΝΑ ΠΙΘΑΝΟΙ ΡΟΛΟΙ ΤΩΝ ΑΝΘΟΚΥΑΝΙΝΩΝ... 7 ΟΠΤΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΑΝΘΟΚΥΑΝΙΚΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΚΑΙ ΦΩΤΟΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΘΟΚΥΑΝΙΝΕΣ ΚΑΙ ΦΩΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑ Φωτοαναστολή Φωτοπροστατευτικοί Μηχανισµοί των Φυτών Μη φωτοχηµική απόσβεση της ενέργειας διέγερσης Κύκλος των ξανθοφυλλών Άλλες συνιστώσες του NPQ Άλλες προστατευτικές διαδικασίες Φωτοπροστατευτικός Ρόλος των Ανθοκυανινών Φυτά που αναπτύσσονται στον υποόροφο δασών Νεαρά φύλλα Γηράσκοντα φύλλα Ώριµα φύλλα Καρποί Μεταλλάξεις του Arabidopsis thaliana Αντιοξειδωτικός Ρόλος Ανθοκυανινών ΑΝΘΟΚΥΑΝΙΝΕΣ ΚΑΙ ΥΠΕΡΙΩ ΗΣ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ ΑΝΘΟΚΥΑΝΙΝΕΣ ΚΑΙ ΦΥΤΟΦΑΓΙΑ Φυτά και Έντοµα Αµυντικοί µηχανισµοί των φυτών Φαινολικές ουσίες Αναζήτηση και επιλογή των φυτών από τα φυτοφάγα έντοµα Αλληλεπιδράσεις και των τριών τροφικών επιπέδων Ανθοκυανίνες και Έντοµα Επαγωγή σύνθεσης ανθοκυανινών µετά από προσβολή από έντοµα Πιθανή εµπλοκή των ανθοκυανινών στις επιλογές των φυτοφάγων εντόµων Νεαρά φύλλα που εµφανίζουν καθυστερηµένο πρασίνισµα Γηράσκοντα φύλλα Γενικότερες θεωρίες για το χρωµατισµό των φύλλων Συνοψίζοντας ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΧΛΩΡΟΦΥΛΛΗΣ Μετρήσεις φθορισµού στο Q. coccifera Μετρήσεις φθορισµού στο C. creticus Φωτοχηµική απόδοση του PSII Μη-φωτοχηµική απόδοση... 67

10 ΦΑΣΜΑΤΙΚΗ ΑΝΑΚΛΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑ ΓΙΑ ΦΑΙΝΟΛΙΚΑ ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΚΑΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΘΟΚΥΑΝΙΝΩΝ ΚΑΙ ΟΛΙΚΩΝ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΚΑΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΧΡΩΣΤΙΚΩΝ ΣΤΟ C. creticus ΈΝΤΑΣΗ ΤΗΣ ΦΥΤΟΦΑΓΙΑΣ ΣΤΟ Q. coccifera ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΕΜΦΑΝΙΣΗΣ ΚΟΚΚΙΝΩΝ ΦΑΙΝΟΤΥΠΩΝ ΤΟΥ C. creticus ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΥΝΑΜΙΚΟΥ ΝΕΡΟΥ στο C. creticus ΜΕΤΡΗΣΗ ΠΑΧΟΥΣ ΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΤΟΥ C. creticus ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΤΟΥ Quercus coccifera ΚΑΙ ΤΟΥ Cistus creticus ΚΟΚΚΙΝΟΙ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΙ ΤΟΥ C. creticus ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΟ ΑΖΙΜΟΥΘΙΟ ΦΩΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΠΟ ΟΣΗ ΤΟΥ PSΙΙ ΠΡΑΣΙΝΩΝ ΚΑΙ ΚΟΚΚΙΝΩΝ ΝΕΑΡΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΤΟΥ Q. coccifera ΣΤΟ ΠΕ ΙΟ ΦΩΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΠΟ ΟΣΗ ΤΟΥ PSII ΠΡΑΣΙΝΩΝ ΚΑΙ ΚΟΚΚΙΝΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΤΟΥ C. creticus ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΟΥ ΚΥΚΛΟΥ ΤΩΝ ΞΑΝΘΟΦΥΛΛΩΝ ΚΑΙ ΜΗ-ΦΩΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΠΟ ΟΣΗ ΤΟΥ PSII ΣΤΟ C. creticus ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΧΛΩΡΟΦΥΛΛΩΝ ΚΑΙ ΠΑΧΟΣ ΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΤΟΥ C. creticus ΥΝΑΜΙΚΟΥ ΝΕΡΟΥ ΣΤΟ C. creticus ΦΥΤΟΦΑΓΙΑ ΚΑΙ ΦΑΙΝΟΛΙΚΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΟΠΤΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΤΟΥ Quercus coccifera ΚΑΙ ΤΟΥ Cistus creticus ΑΝΘΟΚΥΑΝΙΝΕΣ - ΦΩΤΟΑΝΑΣΤΟΛΗ ΚΑΙ ΦΩΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑ Φωτοσυνθετική και φωτοπροστατευτική ικανότητα των φύλλων του Q. coccifera και του C. creticus Οι οπτικές ιδιότητες των ανθοκυανινών σε σχέση µε την φωτοαναστολή και την φωτοπροστασία ΑΝΘΟΚΥΑΝΙΝΕΣ ΚΑΙ ΦΥΤΟΦΑΓΙΑ Τα νεαρά φύλλα των κόκκινων φαινοτύπων του Q. coccifera είχαν δεχτεί λιγότερες επισκέψεις Τα κόκκινα φύλλα είχαν δεχτεί κάποιες επισκέψεις αλλά είχαν µικρότερες απώλειες ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

11 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΟΚΚΙΝΕΣ ΧΡΩΣΤΙΚΕΣ ΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ Οι πιο κοινές χρωστικές των φυτών είναι οι χλωροφύλλες, τα καροτενοειδή, οι ανθοκυανίνες και οι µπεταλαΐνες. Ενώ οι δύο πρώτες κατηγορίες βρίσκονται σε εξειδικευµένα οργανίδια (χλωροπλάστες), οι υδρόφιλες ανθοκυανίνες και µπεταλαΐνες συσσωρεύονται στο χυµοτόπιο και προσδίδουν χαρακτηριστικούς ροζ, κόκκινους, µοβ και µπλε χρωµατισµούς στα πέταλα ανθέων, στα φρούτα, στα βράκτια και ορισµένες φορές και στα φύλλα. Παρά τη φαινοµενική τους οµοιότητα, οι δυο οµάδες χρωστικών διαφέρουν πολύ στη χηµική τους δοµή. Οι µπεταλαΐνες είναι µεταβολίτες που περιέχουν άζωτο στο µόριό τους και χωρίζονται σε δύο υποοµάδες, τις κόκκινες-βιολετί µπετακυανίνες και τις κίτρινες µπεταξανθίνες (Strack et al. 2003). O πιο χαρακτηριστικός αντιπρόσωπός τους είναι η µπετανίνη (betanidin 5-O-β-glucoside) στους κονδύλους των τεύτλων (Beta vulgaris ssp.) (Stintzing & Carle 2004). Οι ανθοκυανίνες (γλυκοζίτες των ανθοκυανιδινών) είναι φλαβονοειδή µε βασικό σκελετό C 6 -C 3 -C 6, όπου µια σειρά τροποποιήσεων στη δοµή τους µετατοπίζει το µέγιστο απορρόφησης στο ορατό τµήµα του φάσµατος. Ενώ οι ανθοκυανίνες συµµετέχουν στο χρωµατισµό σχεδόν όλων των µελών των Αγγειοσπέρµων, οι µπεταλαΐνες περιορίζονται στα Caryophyllales, µε εξαίρεση τις οικογένειες Caryophyllaceae και Molluginaceae που συσσωρεύουν ανθοκυανίνες (Clements & Mabry 1996, Strack et al. 2003). Γενικά, φαίνεται να υπάρχει αµοιβαίος αποκλεισµός των δύο αυτών οµάδων χρωστικών, καθώς, έως τώρα, δεν έχουν βρεθεί µαζί σε κανένα φυτό (Stafford 1994). Οι µπεταλαΐνες έχουν επίσης εντοπιστεί και σε κάποιους ανώτερους µύκητες όπως η Amanita muscaria (Strack et al. 2003). Στις οικογένειες των Caryophyllales που περιέχουν µπεταλαΐνες αντί για ανθοκυανίνες, συνυπάρχουν άλλα φλαβονοειδή, συµπεριλαµβανοµένων των προανθοκυανιδινών (Stafford 1994). Τέλος, µια άλλη περίπτωση κόκκινων χρωστικών που συσσωρεύουν συγκεκριµένα φυτικά είδη όπως η Aloe vera, είναι τα κόκκινα καροτενοειδή ((retro)-carotenoids) όπως η ροδοξανθίνη, τα οποία είναι λιπόφιλα µόρια και βρίσκονται στους χλωροπλάστες (Hormaetxe et al. 2005). Επειδή οι µπεταλαΐνες αντικαθιστούν τις ανθοκυανίνες σε κάποιες συγκεκριµένες οικογένειες φυτών, είναι πιθανόν να έχουν και ανάλογες µε αυτές λειτουργίες είτε στα αναπαραγωγικά είτε στα υπόλοιπα όργανα (Stintzing & Carle 2004). Λόγω των διαφορετικών χηµικών τους χαρακτηριστικών, µπορεί σε όλες τις περιπτώσεις η πιθανή κοινή λειτουργία τους να συνδέεται µε το χρώµα τους, καθώς και την ικανότητα τους να απορροφούν σε µήκη κύµατος εντός του ορατού φάσµατος (Steyn et al. 2002). Επίσης, επειδή η συσσώρευση των κόκκινων καροτενοειδών στα φύλλα επάγεται από φωτοανασταλτικές συνθήκες όπως και των ανθοκυανινών, πολλές φορές τους αποδίδονται κάποιες κοινές λειτουργίες. Όµως, η θέση των ρετρο-καροτενειδών µέσα στους χλωροπλάστες και η βιοσυνθετική σχέση τους µε τις χρωστικές

12 2 ΕΙΣΑΓΩΓΗ του κύκλου των ξανθοφυλλών, πιθανόν να υποδηλώνει έναν πιο δυναµικό φυσιολογικό ρόλο (Hormaetxe et al. 2005). ΑΠΟ ΠΑΛΙΑ Μπορεί κανείς να διαπιστώσει ότι υπήρχε ενδιαφέρον για το κόκκινο χρώµα των φύλλων και άλλων τµηµάτων των φυτών από την αρχή της δυτικής επιστήµης. Ο Αριστοτέλης, στο σύγγραµµά του για τη θεωρία του χρώµατος, είχε παρατηρήσει και σηµειώσει τον κόκκινο χρωµατισµό ορισµένων φύλλων. Πολλοί ερευνητές περιέγραψαν το κόκκινο χρώµα διαφόρων φυτικών οργάνων και ο Marquat (1835, όπως αναφέρεται στους Lee & Gould 2002) επινόησε τη λέξη ανθοκυανίνη, συνθέτοντας τις δύο ελληνικές λέξεις (άνθος + κυανός). Από αυτές τις πρώιµες παρατηρήσεις προέκυψαν διάφορες εσφαλµένες υποθέσεις, όπως για παράδειγµα όταν ο Von Mohl (1837) υποστήριξε, βασιζόµενος στο χρωµατισµό των φθινοπωρινών φύλλων, ότι οι ανθοκυανίνες προέρχονται από την αποικοδόµηση της χλωροφύλλης (Lee & Gould 2002). Ήδη από τα τέλη του 19 ου αιώνα πολλοί ερευνητές είχαν προτείνει ότι οι ανθοκυανίνες σκιάζοντας τη φωτοσυνθετική µηχανή, την προστατεύουν από την περίσσεια φωτός. Ο Haberlantd (1884) συνοψίζοντας τη µέχρι τότε βιβλιογραφία αναφέρει πως όταν ο χρωµατισµός αυτός έχει κάποια φυσιολογική σηµασία, αυτή συνδέεται σχεδόν πάντα κατά κάποιο τρόπο, µε τη σχέση του φυτού µε το φως και η έγχρωµη επιδερµίδα σε πολλές περιπτώσεις φαίνεται να λειτουργεί ως προστατευτικό των υποκείµενων ιστών έναντι της έντονης ακτινοβολίας και των δευτερογενών επιπτώσεών της, όπως η καταστροφή της χλωροφύλλης (σύµφωνα µε τον Wiesner) ή η υπερβολική αναπνοή (σύµφωνα µε τον Pringsheim). Ο Von Mohl (όπως αναφέρεται στον Haberlandt 1884) είχε επισηµάνει τη συχνή παρουσία κόκκινου χρωµατισµού σε νεαρούς βλαστούς και αρτίβλαστα, στα οποία η χλωροφύλλη µόλις αρχίζει να δηµιουργείται και διατρέχει κίνδυνο να καταστραφεί από το έντονο φως. Επίσης για την περίπτωση πολλών αείφυλλων που αποκτούν κόκκινο χρώµα κατά τη διάρκεια του χειµώνα, υποστήριζε ότι οι ανθοκυανίνες παρέχουν την πρόσθετη προστασία που χρειάζονται αυτή την περίοδο οι χλωροπλάστες, καθώς δεν µπορεί να υπάρξει ικανοποιητική αναγέννηση της χλωροφύλλης στις χαµηλές θερµοκρασίες που επικρατούν αυτήν την εποχή. Παρότι φαίνεται από αυτές τις αναφορές ότι θεωρείται πιθανός ο φωτοπροστατευτικός ρόλος των ανθοκυανινών, παράλληλα αναφέρεται ότι κάποια διαφορετική εξήγηση πρέπει να δοθεί για τις περιπτώσεις των φυτών που αναπτύσσονται σε σκιερά µέρη και παρουσιάζουν κόκκινη την κάτω επιφάνεια των φύλλων τους (Haberlandt 1884). Σκεπτικισµό επίσης προκαλούσε η παρουσία των ανθοκυανινών σε κάποια φυτά, όχι στην επιδερµίδα, αλλά στο φωτοσυνθετικό ιστό (Haberlandt 1884). Ο Kny (επίσης όπως αναφέρεται στον Haberlandt 1884) ήταν ο πρώτος που εξέτασε τον πιθανό φωτοπροστατευτικό ρόλο των ανθοκυανινών πειραµατικά και έδειξε πως όταν αλκοολικό διάλυµα χλωροφύλλης εκτεθεί σε φως, αποχρωµατίζεται πιο αργά αν σκιαστεί από διάλυµα ανθοκυανινών.

13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 3 Καθώς οι ανθοκυανίνες απορροφούν ακτινοβολία σε µήκη κύµατος διαφορετικά από τη χλωροφύλλη, ορισµένοι επιστήµονες υποστήριξαν ότι µπορεί οι χρωστικές αυτές να επηρεάζουν τη θερµοκρασία του φύλλου. Η άποψη αυτή βασίστηκε στην υπόθεση ότι τα κόκκινα φύλλα θα έπρεπε να έχουν µεγαλύτερη απορροφητικότητα από τα πράσινα κι εποµένως να είναι θερµότερα. Ο Stahl, για παράδειγµα, (επίσης όπως αναφέρεται στον Haberlandt 1884) υποστήριξε ότι οι ανθοκυανίνες απορροφούν ακτινοβολία, µε αποτέλεσµα να αυξάνεται η θερµοκρασία των φύλλων και εποµένως να αυξάνεται ο ρυθµός αναπνοής και µεταβολισµού. Παρόµοιος προβληµατισµός, όπως και µε τη φωτοπροστασία, υπήρξε και γι αυτήν τη θεωρία και αφορούσε τις περιπτώσεις των κόκκινων φύλλων που αναπτύσσονται σε σκιερά µέρη. Η απορρόφηση από τις ανθοκυανίνες του διάχυτου φωτισµού χαµηλής έντασης που υπάρχει στις σκιερές περιοχές, δεν θα µπορούσε να προκαλέσει σηµαντική αύξηση της θερµοκρασίας του φύλλου. Μία από τις πρώτες πειραµατικές προσεγγίσεις για να εξηγηθεί η παρουσία των ανθοκυανινών στα νεαρά φύλλα των δέντρων στα τροπικά δάση, σχετιζόταν µε τη θερµοκρασία. Πραγµατοποιήθηκε από τον Smith (1909, όπως αναφέρεται στους Lee et al. 2003), ο οποίος µετρώντας µε τη βοήθεια θερµοζεύγους, έδειξε ότι η θερµοκρασία των κόκκινων φύλλων ήταν αρκετούς βαθµούς υψηλότερη σε σχέση µε των ώριµων (πράσινων). Πιθανολόγησε λοιπόν ο Smith, ότι τα ανθοκυανικά φύλλα µπορεί να αναπτύσσονται και πιο γρήγορα. Σε µεταγενέστερες όµως προσεγγίσεις, η άποψη αυτή αµφισβητήθηκε. Οι Lee et al. (1987) συγκρίνοντας ώριµα (πράσινα) και νεαρά κόκκινα φύλλα των φυτών Theobroma cacao και Mangifera indica, βρήκαν ότι τα πρώτα είχαν µεγαλύτερη απορροφητικότητα και οι θερµοκρασιακές διαφορές µεταξύ τους, σε ανέφελες ή συννεφιασµένες µέρες, ήταν πολύ µικρές. Επίσης, δεν βρέθηκε διαφορά στη θερµοκρασία µεταξύ κόκκινων και κίτρινων γηρασκόντων φύλλων των Quercus rubra και Vaccinium corymbosum (Lee et al. 2003). ΟΜΗ ΚΑΙ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΤΩΝ ΑΝΘΟΚΥΑΝΙΝΩΝ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΤΟΥΣ ΣΤΑ ΦΥΛΛΑ Οι φαινολικές ουσίες είναι υδροξυβενζολικά παράγωγα, µε το υδροξύλιο (ένα ή περισσότερα) ενωµένο µε τον αρωµατικό δακτύλιο. Αποτελούν µια µεγάλη και ποικίλη οµάδα χηµικών ενώσεων, που περιλαµβάνει από τα απλά φαινολικά οξέα (όπως το κινναµικό και το φερουλικό οξύ), µέχρι σύνθετα πολυµερή (όπως οι ταννίνες και η λιγνίνη). Ορισµένες οµάδες φαινολικών (όπως οι ακετοφαινόνες, οι χρωµόνες κ.ά.) προέρχονται από τη βιοχηµική οδό του µαλονικού οξέος (από το ακέτυλο-coα), άλλες (όπως οι υδρολυόµενες ταννίνες και η λιγνίνη) από τη βιοχηµική οδό του σικιµικού οξέος, ενώ για τη βιοσύνθεση των φλαβονοειδών και όλων των συναφών και παράγωγων µορίων, συνεργάζονται οι δύο βιοσυνθετικές οδοί (µαλονικού και σικιµικού οξέος) (Σχήµα 2). Η βιοσυνθετική οδός του σικιµικού οξέος, έχει κεντρικό ρόλο στη σύνθεση πολλών προϊόντων του βασικού και του δευτερογενούς µεταβολισµού και ουσιαστικά µετατρέπει απλά ενδιάµεσα µόρια υδατανθράκων της Σχήµα 1: Σκελετός φλαβάνης. γλυκόλυσης και του κύκλου των φωσφοπεντοζών, σε

14 4 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ισοφλαβόνες ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΗ Ο ΟΣ ΤΩΝ ΦΩΣΦΟΠΕΝΤΟΖΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΗ Ο ΟΣ ΤΟΥ ΣΙΚΙΜΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ φαινυλανανίνη ΓΛΥΚΟΛΥΣΗ 4 φωσφοερυθρόζη φωσφοενολοπυροσταφυλικό οξύ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΗ Ο ΟΣ ΜΑΛΟΝΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ακέτυλο-coa 3 x µαλονυλ-coa ιάφορα φαινολικά IFS φλαβόνες FS1/FS2 PAL κινναµικό οξύ p-κουµαρικό οξύ 4-κουµάρυλο-CoA CHS χαλκόνη της ναριγκενίνης CHI ναριγκενίνη (φλαβανόνη) DFR γαλλικό οξύ υδρολυόµενες ταννίνες φερουλικό οξύ λιγνίνη F3H (F3 H, F3 5 H) 3-OH-φλαβανόνες (διυδροφλαβονόλες) αρωµατικά αµινοξέα (φαινυλανανίνη, τυροσίνη και τρυπτοφάνη). Ξεκινά µε τη συµπύκνωση δύο βασικών πρωτογενών µεταβολιτών, του φωσφοενολοπυροσταφυλικού οξέος και της 4- φωσφοερυθρόζης (Herrmann 1995). Η βιοσύνθεση των περισσότερων φαινολικών οξέων, αρχίζει µε την απα- µίνωση της φαινυλανανίνης προς κινναµικό οξύ, σε µια αντίδραση που καταλύεται από το ένζυµο αµµώνιολυάση της φαινυλανανανίνης (PAL). Ο βασικός σκελετός των φλαβαν-3,4-διόλες φλαβονοειδών είναι η (λευκοανθοκυανιδίνες) προανθοκυανιδίνες ANS φλαβάνη (Σχήµα 1). (συµπυκνωµένες φλαβονόλες ταννίνες) Υπάρχουν περίπου 12 αναγνωρισµένες οµάδες ανθοκυανιδίνες φλαβονοειδών, οι οποίες 3GT R: H, OH διαχωρίζονται από το R : H, OH, OCH 5GT 3 Glc: γλυκοσίδιο ACT MAT διαφορετικό βαθµό οξείδωσης του ετεροκυκλικού δακτυλίου C και στις οποίες περιλαµβάνονται οι ανθοκυανίνες ανθοκυανιδίνες, οι φλαβόνες, Σχήµα 2: Σχηµατική απεικόνιση της βιοσύνθεσης φαινολικών, φλαβονοειδών και ανθοκυανινών. ANS: συνθάση της ανθοκυανιδίνης (anthocyanidin synthase), ACT: οι φλαβανόνες, οι φλαβονόλες ακυλτρανσφεράση της ανθοκυανίνης (anthocyanin acyltransferase), CHI: ισοµεράση της και οι φλαβανόλες (Shirley χαλκόνης (chalcone isomerase), CHS: συνθάση της χαλκόνης (chalcone synthase), DFR: 4-ρεδουκτάση της διυδροφλαβονόλης (didydroflavonol 4-redouctase), F3,5 H: 3,5 υδροξυλάση 1996, Winkel-Shirley 2001). της φλαβανόνης (flavanone 3,5 -hydroxylase), F3 H: 3 -υδροξυλάση της Οι δακτύλιοι B και C φλαβανόνης (flavanone 3 -hydroxylase), F3H: 3-υδροξυλάση της φλαβανόνης (flavanone 3-hydroxylase), FLS: συνθάση της φλαβονόλης (flavonol synthase), FS1/FS2: συνθάση προέρχονται από τη βιοχηµική της φλαβόνης (flavone synthase), IFS: συνθάση της ισοφλαβόνης (isoflavone synthase), MAT: µαλονυλτρασφεράση (malonyltransferase), PAL: αµµώνιο-λυάση της φαινυλανανανίνης (phenylalanine ammonia lyase), 3GT και 5GT: 3- και 5- γλυκοσυλτρανσφεράση (glucosyltrasferase). οδό του σικιµικού οξέος, από τη φαινυλανανίνη και το p- κουµαρικό οξύ. Ο δακτύλιος Α προέρχεται από τρία µόρια του µαλονυλ-coa. Από τη συµπύκνωση ενός µορίου p-κουµάρυλο-coa µε τρία µόρια µαλονυλ- CoA σχηµατίζεται η χαλκόνη της ναριγκενίνης (θεωρείται η πρόδροµη ένωση όλων των FLS

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 5 φλαβονοειδών), που γρήγορα µετατρέπεται σε ναριγκενίνη (φλαβανόνη) και από την οποία τελικά µε διαδοχικές ενζυµικές αντιδράσεις, παράγονται τα υπόλοιπα φλαβονοειδή (Σχήµα 2). Συνήθως είναι γλυκοσυλιωµένα και η µετατροπή αυτή τα καθιστά περισσότερο υδατοδιαλυτά ώστε να είναι δυνατή η αποθήκευσή τους στο χυµοτόπιο. Τις περισσότερες φορές συµµετέχει στη δηµιουργία του γλυκοσιδίου η γλυκόζη, αλλά έχουν αναφερθεί και τα σάκχαρα γαλακτόζη, ραµνόζη, ξυλόζη, γαλακτόζη, αραβινόζη και φρουκτόζη (Rice-Evans et al. 1997, Wang et al. 1997). Σε υποκυτταρικό επίπεδο, η βιοσύνθεση των φλαβονοειδών γενικά -και των ανθοκυανινών ειδικότερα- πιστεύεται ότι πραγµατοποιείται στο κυτταρόπλασµα, στο αδρό ενδοπλασµατικό δίκτυο (Hrazdina et al. 1978, Hrazdina & Wagner 1985). Άλλωστε, αν και συχνά απαντώνται στο χυµοτόπιο, ήταν γνωστό πως δεν µπορεί η βιοσύνθεσή τους να γίνεται εκεί, αφού το βέλτιστο ph για τη λειτουργία των ενζύµων που εµπλέκονται είναι 7 ή περισσότερο (Hrazdina et al. 1978). Επίσης, εδώ και αρκετά χρόνια υπήρχε η αντίληψη ότι τα ένζυµα του µονοπατιού των φαινυλπροπανοειδών και φλαβονοειδών, είναι πιθανόν να λειτουργούν ως πολυενζυµικό σύµπλοκο, ώστε να διευκολύνεται η άµεση µεταφορά των ενδιάµεσων προϊόντων µεταξύ των ενεργών θέσεων. Επιπρόσθετα, οι λόγοι που ενισχύουν την άποψη αυτή είναι ότι υπάρχει ανταγωνισµός ανάµεσα στις επιµέρους βιοσυνθετικές οδούς για κοινά υποστρώµατα, ότι τα ενδιάµεσα προϊόντα είναι πιθανόν ασταθή ή τοξικά, και ότι η συγκέντρωσή τους φαίνεται να είναι ιδιαίτερα χαµηλή. Επιπλέον, είναι απαραίτητο τα βιοσυνθετικά αυτά µονοπάτια να ανταποκρίνονται γρήγορα σε εξωτερικά ή εσωτερικά ερεθίσµατα, ώστε να τροποποιείται η ποσότητα και/ή ο τύπος των προϊόντων που παράγονται (Winkel-Shirley 2001). οκιµές in vitro έδωσαν στοιχεία για την ύπαρξη συµπλόκου διαδοχικά τοποθετηµένων ενζύµων, µε χαλαρή σύνδεση µεταξύ τους και µε τη µεµβράνη του ενδοπλασµατικού δικτύου (Hrazdina & Wagner 1985). Μεταγενέστερες µελέτες, τροποποιώντας το µοντέλο αυτό, αναφέρουν ότι τα ένζυµα που καταλύουν τη σύνθεση των φλαβονοειδών σχηµατίζουν ένα σφαιρικό σύµπλοκο και δεν βρίσκονται σε απόλυτη γραµµική διάταξη (Burbulis & Winkel-Shirley 1999, Saslowsky & Winkel-Shirley 2001), καθώς και ότι η οργάνωση τους πιθανόν να µεταβάλλεται αποκρινόµενη σε εξωτερικά ή εσωτερικά ερεθίσµατα (Saslowsky & Winkel-Shirley 2001). Η βιοσύνθεση των φλαβονοειδών περιλαµβάνεται στις διαδικασίες της κανονικής αύξησης και ανάπτυξης των φυτών, αλλά µπορεί να γίνει και επαγωγή της σύνθεσής τους από διάφορες βιοτικές ή αβιοτικές καταπονήσεις, όπως προσβολή από έντοµα ή παθογόνα, αυξηµένη UV-Β ακτινοβολία, υψηλές εντάσεις φωτός, χαµηλές θερµοκρασίες και ανεπάρκεια θρεπτικών (Shirley 1996). Η απορρόφηση των φλαβονοειδών µετατοπίζεται σε υψηλότερα µήκη κύµατος, όσο αυξάνονται οι υποκαταστάτες και µειώνεται ο βαθµός κορεσµού των 3 βασικών δακτυλίων. Τα φλαβονοειδή µε τις περισσότερες τροποποιήσεις στο µόριό τους είναι οι ανθοκυανίνες (γλυκοζίτες των ανθοκυανιδινών µε το σάκχαρο ενωµένο συνήθως στις θέσεις 3 ή 3,5), που παρουσιάζουν µέγιστα απορρόφησης στο ορατό τµήµα του φάσµατος (Shirley 1996, Wang et al. 1997). Συνολικά εµπλέκονται τουλάχιστον 9 ένζυµα στη βιοσύνθεση των ανθοκυανινών από τις πρόδροµες ενώσεις p-κουµάρυλο-coa και µηλόνυλο-coa (Saito et al. 1999, Saito & Yamasaki

16 6 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2002, Winkel-Shirley 2002). Έχουν αναφερθεί 18 διαφορετικές βασικές δοµές ανθοκυανιδινών (Harborne & Williams 2001). Μεταξύ αυτών οι 6 είναι περισσότερο διαδεδοµένες: η πελαργονιδίνη, η κυανιδίνη, η δελφινιδίνη, η πεονιδίνη, η πετουνιδίνη και η µαλβιδίνη (Πίνακας 1). ιαφέρουν µεταξύ τους όσον αφορά στο πρότυπο υδροξυλίωσης και µεθυλίωσης, µε αποτέλεσµα να παράγονται διαφορετικές αποχρώσεις από πορτοκαλί-κόκκινο (πελαργονιδίνη), µέχρι βιολετί-µπλε (δελφινιδίνη) σε τιµές ph γύρω στο 1. Ο κυριότερος παράγοντας που καθορίζει το χρώµα των ανθοκυανινών είναι το πρότυπο υδροξυλίωσης του δακτυλίου Β (Winkel-Shirley 2001). Γενικά, η υδροξυλίωση προκαλεί βαθυχρωµική µετατόπιση του µέγιστου απορρόφησης, ενώ η µεθυλίωση των υδροξυλικών λ Ανθοκυανίνη R 3 R 3 R max 5 οµάδων αναστρέφει αυτή την [nm] Πελαργονιδίνη H H H 520 τάση (Stintzing & Carle 2004). Κυανιδίνη H OH H 535 Ωστόσο, στα φυτά σπάνια ελφινιδίνη H OH OH 546 Πεονιδίνη H OCH 3 H 532 απαντώνται οι άγλυκες µορφές, Πετουνιδίνη H OCH 3 OH 543 ενώ η γλυκοσυλίωση εκτός από Μαλβιδίνη H OCH 3 OCH Πελαργονιδίνη 3-γλυκοσίδιο Glc H H 516 µείωση του µέγιστου µήκους Κυανιδίνη 3-γλυκοσίδιο Glc OH H 530 κύµατος απορρόφησης, ελφινιδίνη 3-γλυκοσίδιο Glc OH OH 543 προσδίδει στο µόριο υψηλότερη Πεονιδίνη 3-γλυκοσίδιο Glc OCH 3 H 536 Πετουνιδίνη 3-γλυκοσίδιο Glc OCH 3 OH 546 σταθερότητα και αυξηµένη Μαλβιδίνη 3-γλυκοσίδιο Glc OCH 3 OCH διαλυτότητα (Stintzing & Carle Πίνακας 1: Βασικές δοµές των ανθοκυανινών και το µέγιστο 2004). Το χρώµα επηρεάζεται απορρόφησής τους σε διάλυµα οξινισµένης µεθανόλης. Glc: γλυκοσίδιο (Stintzing & Carle 2004). επίσης από το είδος του σακχάρου, καθώς και από τη θέση γλυκοσυλίωσης (Giusti et al. 1999). Επιπρόσθετη ακυλίωση µε αλειφατικά και/ή αρωµατικά οξέα, οδηγεί στο σχηµατισµό µεγάλου αριθµού διαφορετικών δοµών ανθοκυανινών. Μέχρι σήµερα έχουν βρεθεί στη φύση περισσότερες από 400 (Kong et al. 2003). Η ακυλίωση των ανθοκυανινών εικάζεται ότι εξυπηρετεί µια σειρά από λειτουργίες, όπως τη σταθεροποίηση της δοµής τους ώστε να ενισχύεται το µπλε χρώµα, την αύξηση της υδατοδιαλυτότητάς τους, την προστασία τους έναντι των γλυκοσιδασών και τη µεταφορά τους στα χυµοτόπια (Saito & Yamasaki 2002). Ενώ οι ανθοκυανίνες είναι γνωστό ότι χάνουν το χρώµα τους σε τιµές ph µεγαλύτερες από 2, η ακυλίωση µε υδροξυ-κινναµικά οξέα επιτρέπει τη σταθεροποίηση των µορίων µέχρι και σχεδόν ουδέτερες τιµές του ph (Stintzing & Carle 2004). Το χρώµα των ανθοκυανινών επηρεάζεται και από την παρουσία άλλων φλαβονοειδών, όπως οι φλαβόνες και οι φλαβονόλες (Saito & Yamasaki 2002). Για παράδειγµα, το µπλε χρώµα στα άνθη, που συναντάται µόνο στις πιο εξελιγµένες οικογένειες φυτών, οφείλεται στην παρουσία µιας ανθοκυανίνης που βασίζεται στην δελφινιδίνη. Τα περισσότερα, όµως, γλυκοσίδια της δελφινιδίνης είµαι µοβ και για να µετατοπιστεί το µέγιστο απορρόφησης στην µπλε περιοχή, συνήθως δηµιουργείται σύµπλοκο µεταξύ της ανθοκυανίνης αυτής και µιας συγκεκριµένης

17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 7 φλαβόνης, ενώ σε ορισµένες περιπτώσεις απαιτείται και η συµµετοχή ενός ή περισσότερων µετάλλων (Harborne & Williams 2000). Η µεταφορά από τη θέση βιοσύνθεσης των ανθοκυανινών στο κυτταρόπλασµα, προς τον τελικό προορισµό τους στο χυµοτόπιο, όπου και σταθεροποιείται το χρώµα τους, πιστεύεται ότι γίνεται ενεργά, µέσω συγκεκριµένων µεµβρανικών πρωτεϊνικών µεταφορέων (Alfenito et al. 1998, Saito & Yamasaki 2002). Παρά τη µεγάλη ποικιλία ανθοκυανινών που υπάρχει στα Αγγειόσπερµα, στα φύλλα τους έχει αποµονωθεί τις περισσότερες φορές η κόκκινη κυανιδίνη 3-γλυκοσίδιο (cyanidin-3-glycoside) (Harborne 1976). Γενικά, τα φλαβονοειδή στα φύλλα εντοπίζονται συνήθως στα χυµοτόπια των επιδερµικών κυττάρων ως υδατοδιαλυτά γλυκοσίδια, αλλά λιγότερο συχνά συναντώνται και στα επιεφυµενιδικά κεριά στην άνω επιφάνεια του φύλλου, όπου συνήθως δεν είναι γλυκοσυλιωµένα, αλλά είναι Ο-µεθυλιωµένα και είναι λιπόφιλα (Harborne & Williams 2000). Επίσης, βρίσκονται και στις τρίχες των φύλλων (Karabourniotis et al. 1992, 1995, Skaltsa et al. 1994). Η φυσική θέση των ανθοκυανινών εντός του φύλλου ποικίλει, καθώς µπορεί να εντοπίζονται στα τριχώµατα (Skaltsa et al 1994), στην επιδερµίδα (Krol et al. 1995, Burger & Edwards 1996), στο µεσόφυλλο (Gould et al 2000, Dodd et al. 1998, Woodall et al. 1998) ή στο κατώτερο µεσόφυλλο ή/και στην κάτω επιδερµίδα (Lee et al. 1987). Επίσης, η συσσώρευση των ανθοκυανινών µπορεί να περιορίζεται σε ένα τύπο κυττάρου του φύλλου, αλλά έχει παρατηρηθεί και σχεδόν σε όλους τους δυνατούς συνδυασµούς διαφορετικών ιστών του φύλλου (Lee & Collins 2001). ΠΟΤΕ ΤΑ ΦΥΛΛΑ ΓΙΝΟΝΤΑΙ ΚΟΚΚΙΝΑ ΠΙΘΑΝΟΙ ΡΟΛΟΙ ΤΩΝ ΑΝΘΟΚΥΑΝΙΝΩΝ Η παρουσία των ανθοκυανινών είναι συνήθως παροδική και σχετίζεται µε συγκεκριµένα στάδια ανάπτυξης, όπως είναι τα νεαρά αναπτυσσόµενα φύλλα που είναι κόκκινα, αλλά γίνονται πράσινα κατά την ενηλικίωσή τους ή τα γηράσκοντα φύλλα των φυλλοβόλων δέντρων που ήταν πράσινα κατά τη διάρκεια της ωριµότητάς τους. Υπάρχουν, όµως, και περιπτώσεις φυτών µε µονίµως ερυθρά φύλλα σε όλη τη διάρκεια της ζωής τους, όπου η παρουσία των ανθοκυανινών πιθανόν να οφείλεται στην επιλογή τους από τον άνθρωπο για αισθητικούς λόγους (Gould et al. 2000, Styen et al. 2002). Οι ανθοκυανίνες µπορεί επίσης να συσσωρεύονται και να παραµένουν για κάποιο διάστηµα µετά από την επίδραση βιοτικών ή αβιοτικών καταπονήσεων, όπως προσβολή από έντοµα (Costa-Arbulú et al. 2001, Stone et al. 2001) ή παθογόνα (Hipskind et al. 1996) και υψηλές εντάσεις φωτός, ιδιαίτερα σε συνδυασµό µε χαµηλές θερµοκρασίες (Christie et al. 1994, Krol el al. 1995, Close et al. 2002). Η UV-B ακτινοβολία, επίσης, έχει διαπιστωθεί ότι επάγει τη βιοσύνθεση ανθοκυανινών (την ερυθρότητα) στα φύλλα (Lindoo & Caldwell 1978, Mendez et al. 1999), ενώ η συσσώρευση τους αποτελεί τυπικό σύµπτωµα της τροφοπενίας φωσφόρου, αν και υπάρχει περίπτωση να προκληθεί και από έλλειψη αζώτου (Kumar & Sharma 1999, Close et al. 2000).

18 8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο ρόλος των ανθοκυανινών έχει εξεταστεί αρκετές φορές σε φυτικά είδη των τροπικών δασών, τα νεαρά φύλλα των οποίων ακολουθούν ένα πρότυπο έκπτυξης που αναφέρεται ως αργοπορηµένο πρασίνισµα ( delayed greening ). Ο όρος αυτός περιγράφει νεαρά φύλλα που διατηρούν χαµηλή συγκέντρωση χλωροφυλλών και φωτοσυνθετική δραστηριότητα µέχρι λίγο µετά την πλήρη έκπτυξή τους, και τα διαχωρίζει από τα νεαρά φύλλα άλλων φυτικών ειδών, που πριν πάρουν το τελικό τους µέγεθος, ο ρυθµός φωτοσύνθεσης φτάνει στο µέγιστο και σταµατά η συσσώρευση χλωροφύλλης (Choinski et al. 2003). Οφείλεται σε καθυστέρηση, είτε στη σύνθεση της χλωροφύλλης, είτε στην ανάπτυξη (σε αριθµό ή/και µέγεθος) των ίδιων των χλωροπλαστών (Whatley 1992, Kursar & Coley 1992a). Το χρώµα των φύλλων µπορεί να είναι λευκό, ανοιχτό πράσινο ή σε διάφορες αποχρώσεις του κόκκινου µέχρι και µπλε, λόγω της συσσώρευσης ανθοκυανινών. Φυτά των οποίων τα νεαρά φύλλα ακολουθούν το πρότυπο αυτό ανάπτυξης απαντώνται κυρίως στις τροπικές και υποτροπικές περιοχές (Kursar & Coley 1992a, b, Woodall et al. 1998, Dominy et al. 2002, Numata et al. 2004, Cai et al. 2005), αλλά και στην Αφρικανική σαβάνα (Choinski & Johnson 1993), όπως και σε δάση εύκρατων περιοχών (Miyazawa et al. 1998). Στην περίπτωση των δέντρων στα τροπικά δάση, φαίνεται πως το αργοπορηµένο πρασίνισµα χωρίς την ταυτόχρονη παρουσία ανθοκυανινών είναι µάλλον η εξαίρεση (Dominy et al. 2002). Η παροδική, όµως, παρουσία των ανθοκυανινών στα νεαρά φύλλα φυτών διαφορετικών οικοσυστηµάτων, δεν σηµαίνει απαραίτητα ότι τα φύλλα αυτά ακολουθούν το πρότυπο ανάπτυξης µε αργοπορηµένο πρασίνισµα (Choinski & Wise 1999, Choinski et al. 2003). Τα φυτά στα δάση των τροπικών, µπορούν να χωριστούν µε βάση τις απαιτήσεις τους σε φως ως δενδρύλλια σε δύο κατηγορίες, αυτά που χρειάζονται υψηλές εντάσεις φωτός (light demanders - pioneers) κι εκείνα που ανέχονται µικρές εντάσεις ακτινοβολίας (shade tolerant persistent) (Coley 1983a). Αν και, αρχικά, πιστευόταν ότι στα φυτά των τροπικών δασών που παρουσιάζουν αργοπορηµένο πρασίνισµα στα νεαρά τους φύλλα, ανήκουν κυρίως εκείνα που ανέχονται µικρές εντάσεις ακτινοβολίας κατά την εγκατάστασή τους (Kursar & Coley 1992a, b), έχει διαπιστωθεί από τη βιβλιογραφία ότι δεν µπορούν να γίνουν εύκολα τέτοιες γενικεύσεις. Σε εκτενή καταγραφή πολλών ειδών, δεν βρέθηκε διαφορά στην ύπαρξη νεαρών κόκκινων φύλλων, µεταξύ των φυτών που χρειάζονται υψηλές εντάσεις φωτός κατά την εγκατάστασή τους και εκείνων που ανέχονται χαµηλές, ή µεταξύ των φυτών που βρίσκονται στον υποόροφο του τροπικού δάσους και αυτών που συνιστούν την κόµη (Dominy 2002, Dominy et al. 2002). Τέλος, έχει διαπιστωθεί ότι υπάρχει ποικιλότητα τόσο σε επίπεδο οικογένειας όσο και γένους, όσον αφορά στο αργοπορηµένο πρασίνισµα στα νεαρά φύλλα (µε ταυτόχρονη παρουσία ανθοκυανινών). Για παράδειγµα, είδη που ανήκουν στην ίδια οικογένεια, ανεξάρτητα από τις απαιτήσεις τους σε φως, µπορεί να έχουν ή όχι νεαρά κόκκινα φύλλα (Dominy 2002). Επίσης, στο γένος Shorea υπάρχουν είδη που τα νεαρά τους φύλλα είναι ανθοκυανικά και παρουσιάζουν αργοπορηµένο πρασίνισµα, ενώ σε άλλα είδη του ίδιου γένους ακολουθείται το κανονικό πρότυπο έκπτυξης (Numata et al. 2004). Όµοια και στο γένος Sygygium (Woodall et al. 1998). O ακριβής ρόλος των ανθοκυανινών στα φύλλα παραµένει ακόµα ασαφής, και ενδεικτικό αυτού είναι ο µεγάλος αριθµός υποθέσεων σχετικών µε τη λειτουργία τους, που έχουν αναφερθεί στη

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 9 βιβλιογραφία, µε κυριότερες την προστασία από φωτοαναστολή, την εξουδετέρωση ενεργών µορφών οξυγόνου (active oxygen species, AOS) σε καταπονητικές συνθήκες, την προστασία από την υπεριώδη ακτινοβολία, την προστασία από φυτοφάγα ή τα παθογόνα και την οσµωρύθµιση (Chalker-Scott 1999, 2002, Hoch et al. 2001, Steyn et al. 2002, Lee & Gould 2002, Close and Beadle 2003, Gould 2004, Manetas 2006). Πάντως, κανένας από τους προτεινόµενους αυτούς ρόλους δεν αποδίδεται αποκλειστικά στις ανθοκυανίνες, καθώς άλλα συστατικά των φύλλων µπορούν να εκτελέσουν αποτελεσµατικά τις ίδιες λειτουργίες (Gould et al. 2000). Η παροδική, όµως, παρουσία των ανθοκυανινών, µπορεί να αποτελεί ένα µηχανισµό άµυνας µικρής χρονικά κλίµακας, ώστε ν αποφεύγονται οι βλάβες και να µπορούν τα φυτά να ανταπεξέρθουν στις καταπονήσεις, κατά τη διάρκεια αναπτυξιακών ή περιβαλλοντικών µεταβολών (Steyn et al. 2002). Από τις διάφορες θεωρίες που προσπαθούν να δώσουν µια εξήγηση για την παρουσία των ανθοκυανινών στα φύλλα, η πιο δηµοφιλής, κυρίως µεταξύ των φυσιολόγων φυτών, αναφέρεται στον πιθανό φωτοπροστατευτικό ρόλο αυτών των χρωστικών. Μάλιστα, η παρουσία τους στα φύλλα έχει συσχετιστεί µε τη φωτοπροστασία και µε τους δύο µηχανισµούς που χρησιµοποιούν τα φυτά, δηλαδή µε την αποφυγή της δηµιουργίας AOS και µε την εξουδετέρωση τους (βλέπε: Φωτοπροστατευτικοί µηχανισµοί των φυτών ). Στην πρώτη περίπτωση, οι ανθοκυανίνες µπορεί να συµβάλουν λειτουργώντας ως φίλτρο το οποίο µειώνει την ένταση του φωτός που φτάνει στις φωτοσυνθετικές χρωστικές, ενώ στη δεύτερη µέσω της αντιοξειδωτικής τους δράσης. Οι δύο αυτές περιπτώσεις, σε συνδυασµό µε τα αποτελέσµατα των µέχρι τώρα πειραµατικών προσεγγίσεων θα σχολιαστούν σε επόµενα κεφάλαια. Η πιθανή σχέση των ανθοκυανινών µε τη φωτοπροστασία, υποδεικνύεται και από το γεγονός ότι, πολλές φορές τα επίπεδα τους σε φυτά ή σε µεµονωµένα φύλλα ενός ατόµου ή ακόµα και σε διαφορετικούς ιστούς των φύλλων, µπορεί να εξαρτώνται από την έκθεσή τους σε διαφορετικές εντάσεις φωτός. Σε σύγκριση των εκτεθειµένων στον ήλιο ή όχι φύλλων του Vacillium myrtillus, διαπιστώθηκε, ότι η αυξηµένη ένταση ηλιακής ακτινοβολίας στα πρώτα, είχε ως αποτέλεσµα την ενεργοποίηση της βιοσυνθετικής οδού των φλαβονοειδών και την αύξηση της συγκέντρωσης των µεταβολικών προϊόντων της (και των ανθοκυανινών), καθώς και µεταβολή της σχετικής συγκέντρωσης των φλαβονοειδών, ώστε να ανταποκρίνονται καλύτερα σε πιθανό φωτοπροστατευτικό ρόλο (Jaakola et al. 2004). Στο Cornus stolonifera, µόνο τα εκτεθειµένα στο ήλιο γηράσκοντα φύλλα συσσωρεύουν ανθοκυανίνες στο πασαλώδες παρέγχυµα, ενώ τα υπόλοιπα είναι κίτρινα. Αν στις αρχές φθινοπώρου αφαιρεθούν βλαστοί που σκιάζουν κάποιους άλλους, τότε κοκκινίζουν τα φύλλα των υποκείµενων βλαστών, που κανονικά θα είχαν κίτρινο χρώµα κατά τη γήρανση. Επίσης, αν αλλάξει ο προσανατολισµός ορισµένων φύλλων, συσσωρεύονται ανθοκυανίνες στα κύτταρα του σπογγώδους παρεγχύµατος, ενώ παραµένει χαµηλή η συγκέντρωση αυτών των χρωστικών στο πασαλώδες (Feild et al. 2001). Σε µια ποικιλία του Zea mays που έχει την ικανότητα να παράγει ανθοκυανίνες, τα συστατικά αυτά συσσωρεύονται συνήθως στην άνω επιδερµίδα, η οποία εκτίθεται στο άπλετο φως. Μπορεί ωστόσο να συσσωρευτούν, υπό τις ίδιες κατά τα άλλα συνθήκες και στην κάτω επιδερµίδα, αν

20 10 ΕΙΣΑΓΩΓΗ το φύλλο αναστραφεί κι εξαναγκαστεί να παραµείνει στραµµένο προς το φως (Pietrini et al. 2002). Ωστόσο σε άλλες περιπτώσεις, η συγκέντρωσή τους στα πλήρως εκτεθειµένα στο φως φύλλα, είναι εξίσου χαµηλή µε εκείνων που αναπτύσσονται σε µόνιµα σκιασµένο περιβάλλον (όπως π.χ. στο δενδρώδες είδος Quintinia serrata, τα φύλλα του οποίου παρουσιάζουν µεγάλη ποικιλοµορφία όσον αφορά στη συσσώρευση ανθοκυανινών) (Gould et al. 2000). Ένας λόγος που οι ανθοκυανίνες συνδέθηκαν µε την προστασία από τη φωτοαναστολή, είναι και ότι η συσσώρευσή τους επάγεται από τους ίδιους παράγοντες καταπόνησης που αυξάνουν την πιθανότητα δηµιουργίας ελευθέρων ριζών στα κύτταρα (Dixon & Paiva 1995, Chalker-Scott 1999). Επίσης, η συγκέντρωση τους στα φύλλα µπορεί να µεταβάλλεται εποχιακά και να αυξάνεται σε περιόδους που συµπίπτουν οι χαµηλές θερµοκρασίες µε υψηλές εντάσεις φωτός, όταν δηλαδή ο κίνδυνος για οξειδωτικές βλάβες είναι σοβαρός (Nozzolillo et al. 1990, Grace et al. 1998, Close et al. 2001). Οι χαµηλές θερµοκρασίες προκαλούν πολλές φορές αύξηση της δραστικότητας του ενζύµου PAL και συσσώρευση φαινυλπροπανοειδών (και ανθοκυανινών). Η παρουσία του φωτός στη διαδικασία αυτή είναι απαραίτητη και συνεπώς είναι πιθανό να υπάρχει και συνεργιστική δράση των δύο αυτών παραγόντων (Christie et al. 1994, Leyva et al. 1995, Solesca et al. 1999, Solesca & Kacperska 2003). Οι θερµοκρασίες, πάντως, που επάγουν αποτελεσµατικά τη σύνθεση των ανθοκυανινών µπορεί να ποικίλουν µεταξύ διαφορετικών ειδών, ποικιλιών, ιστών, αλλά και µεταξύ αναπτυξιακών σταδίων και περιβαλλοντικών συνθηκών ανάπτυξης των φυτών (Steyn et al. 2002). Η παρουσία των ανθοκυανινών στα νεαρά και τα γηράσκοντα φύλλα, µπορεί επίσης να αποδοθεί στον αυξηµένο κίνδυνο φωτοαναστολής που αυτά αντιµετωπίζουν (βλέπε: Ανθοκυανίνες και φωτοπροστασία ). Η ερυθρότητα των φύλλων συµπίπτει πολλές φορές και µε περιβαλλοντικές συνθήκες που προκαλούν άµεσα ή έµµεσα υδατική καταπόνηση στα φυτά, όπως η ξηρασία, η αλατότητα και οι πολύ χαµηλές θερµοκρασίες, γεγονός που οδήγησε σε συνολικότερη σύνδεσή τους µε την οσµωρύθµιση. Προτάθηκε δηλαδή, ότι µέσω της συσσώρευσής των ανθοκυανινών, µειώνεται το οσµωτικό δυναµικό των φύλλων κι εποµένως αυξάνεται η ανθεκτικότητα των φυτών ουν σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης (Chalker-Scott 1999, Chalker-Scott 2002). Επαγωγή της βιοσύνθεσης των ανθοκυανινών έχει παρατηρηθεί και κατά τον εγκλιµατισµό ορισµένων φυτών σε χαµηλές θερµοκρασίες. Πολλά φυτικά είδη, ακόµα και από εύκρατες περιοχές, µπορούν να αυξήσουν την ανθεκτικότητά τους στον παγετό (freezing temperatures), εάν προηγουµένως εκτεθούν σε ήπια χαµηλές θερµοκρασίες για κάποιο διάστηµα, µέσω µιας διαδικασίας, η οποία ονοµάζεται εγκλιµατισµός στο κρύο (cold acclimation). Έχει διαπιστωθεί ότι η διαδικασία αυτή περιλαµβάνει αλλαγές στη σύνθεση των λιπιδίων, των πρωτεϊνών και των υδατανθράκων των φυτικών ιστών. Η ενεργοποίηση της βιοσυνθετικής οδού των φαινυλπροπανοειδών, έχει συνδεθεί µε τον εγκλιµατισµό που προαναφέρθηκε και πιστεύεται ότι συνεισφέρουν µέσω της ισχυροποίησης των κυτταρικών τοιχωµάτων, ώστε να είναι περισσότερο ανθεκτικά στη µηχανικές βλάβες από το πάγωµα του εξωκυτταρικού νερού, αλλά και µέσω της αντιοξειδωτικής δράσης των υδροξυκινναµικών οξέων των χυµοτοπίων (Leyva et al. 1995, Solecka & Kacperska 2003). Η συσσώρευση των ανθοκυανινών και η πιθανή

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 11 συνεισφορά τους στην ωσµορυθµιστική ικανότητα του φυτού, έχει επίσης συνδεθεί µε τον εγκλιµατισµό στο κρύο, αν και στο Arabidopsis βρέθηκε ότι η παρουσία τους, πιθανόν να µην είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας (Leyva et al. 1995). Μπορεί, όµως, στις συνθήκες αυτές οι ανθοκυανίνες να λειτουργούν προστατευτικά έναντι της περίσσειας φωτός, µέσω της ρύθµισης της έντασης της ακτινοβολίας που είναι διαθέσιµη στους χλωροπλάστες ή/και µέσω της αντιοξειδωτικής τους ικανότητας (Steyn et al. 2002). Η υπεριώδης ακτινοβολία, όπως προαναφέρθηκε, επάγει τη σύνθεση των ανθοκυανινών, όπως και των άλλων φαινολικών και φλαβονοειδών (Lindoo & Caldwell 1978, Mendez et al. 1999). Επίσης, εξ αιτίας της ικανότητας των φλαβονοειδών και ιδιαίτερα των φλαβονών και φλαβονολών, να απορροφούν ισχυρά στην υπεριώδη-β (UV-B) περιοχή του φάσµατος και παράλληλα να επιτρέπουν τη διέλευση της φωτοσυνθετικά ενεργής ακτινοβολίας, τους αποδίδεται ανάµεσα στους άλλους ρόλους και αυτός του φίλτρου της UV-B ακτινοβολίας (Caldwell et al. 1983). Οι ανθοκυανίνες, λοιπόν, έχουν συµπεριληφθεί µαζί µε τα άλλα φλαβονοειδή σε αυτό τον προστατευτικό ρόλο έναντι της υπεριώδους ακτινοβολίας (βλέπε: Ανθοκυανίνες και Υπεριώδης Ακτινοβολία ). Οι ανθοκυανίνες, τέλος, έχουν συσχετιστεί και µε την προσβολή των φύλλων από τα φυτοφάγα έντοµα και κυρίως µε το ρόλο που πιθανά έχουν, όταν πρόκειται τα έντοµα να επιλέξουν κάποιο φυτικό ιστό για να τραφούν ή για να τοποθετήσουν τα αυγά τους. Τα τελευταία χρόνια έχουν διατυπωθεί αρκετές θεωρίες που αναφέρονται γενικότερα στην πιθανή εµπλοκή του χρώµατος των φύλλων στη σχέση των φυτών µε τα φυλλοβόρα έντοµα. Υπάρχουν, όµως, πολύ λίγα πειραµατικά αποτελέσµατα που να ενισχύουν ή να απορρίπτουν αυτές τις θεωρητικές προσεγγίσεις. Το θέµα αυτό θα συζητηθεί αναλυτικά στο κεφάλαιο Ανθοκυανίνες και Έντοµα. ΟΠΤΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΑΝΘΟΚΥΑΝΙΚΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΚΑΙ ΦΩΤΟΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Οι ανθοκυανίνες επηρεάζουν σηµαντικά την ποσότητα και ποιότητα του φωτός που απορροφάται από τα φύλλα. ιαφέρουν από τα περισσότερα φλαβονοειδή στο γεγονός ότι απορροφούν και στην ορατή περιοχή του φάσµατος. Σε καθαρή µορφή και σε οξινισµένο διάλυµα µεθανόλης, η απορρόφησή τους παρουσιάζει µέγιστο ανάµεσα στα 500 και 550 nm. In vivo στα φύλλα απορροφούν µεταξύ των 500 και 600 nm, έντονα στην πράσινη και ελαφρώς στη µπλε και κίτρινη περιοχή του ορατού φάσµατος (Pietrini & Massacci 1998, Neill & Gould 1999, Gitelson et al. 2001, Havaux & Kloppstech 2001). Τα φύλλα φαίνονται κόκκινα επειδή οι χρωµατικές αυτές περιοχές του φάσµατος αφαιρούνται από το ανακλώµενο φως, κι όχι επειδή αυτό περιέχει περισσότερο κόκκινο φως σε απόλυτες τιµές. Η περιεκτικότητα, δηλαδή, των φύλλων σε ανθοκυανίνες δεν φαίνεται να συσχετίζεται µε αυξηµένη ανακλαστικότητα στην κόκκινη περιοχή του φάσµατος, αλλά µε αυξηµένη απορρόφηση και µειωµένη ανακλαστικότητα στην πράσινη-κίτρινη περιοχή (Neill & Gould 1999). Επίσης, συγκρίνοντας ανθοκυανικά και µη-ανθοκυανικά φύλλα µε όµοια περιεκτικότητα σε χλωροφύλλη, η ανακλαστικότητα τους δεν διαφέρει στην κόκκινη και µπλε περιοχή του φάσµατος, αλλά παρουσιάζει τη µέγιστη διαφορά

22 12 ΕΙΣΑΓΩΓΗ στα 550 nm (Neill & Gould 1999, Gitelson et al. 2001). Αυτό είναι και το µήκος κύµατος που το ανθρώπινο µάτι παρουσιάζει µέγιστη ευαισθησία, µε αποτέλεσµα µικρές µειώσεις στην ανάκλαση του πράσινου φωτός, να γίνονται αντιληπτές ως µεγάλες αυξήσεις του κόκκινου χρωµατισµού (Neill & Gould 1999). Τελικά, η ανακλαστικότητα των φύλλων στην κόκκινη περιοχή, καθορίζεται κυρίως από τη µορφολογία του φύλλου και την ποσότητα και κατανοµή της χλωροφύλλης (Gould 2004). Οι ανθοκυανίνες, λοιπόν, αν και τροποποιούν ποιοτικά και ποσοτικά τις οπτικές ιδιότητες των φύλλων, η συνεισφορά τους σε αυτές είναι δύσκολο γενικά να εκτιµηθεί. Όσον αφορά στην ολική απορροφητικότητα του φύλλου, δεν είναι εύκολο να προσδιοριστεί το ποσοστό της απορροφούµενης από ένα κόκκινο φύλλο ενέργειας που οφείλεται στις ανθοκυανίνες. Σηµαντικότερο ρόλο φαίνεται να παίζει η συγκέντρωσή τους, και όχι η φυσική τους θέση στους διάφορους ιστούς του φύλλου. Οι Pietrini & Massacci (1998) υπολόγισαν έµµεσα σε ποικιλία φυτών Zea mays µε υψηλές συγκεντρώσεις ανθοκυανινών στα φύλλα της, ότι το 43% της απορροφούµενης από το φύλο ενέργειας οφείλεται στις ανθοκυανίνες. Τα κόκκινα φύλλα του Quintinia serrata, ανεξάρτητα από τη θέση των ανθοκυανινών (καθώς µπορούν να βρίσκονται σε πολλούς διαφορετικούς ιστούς και συνδυασµούς ιστών), έχουν µεγαλύτερη απορροφητικότητα στην πράσινη-κίτρινη περιοχή του φάσµατος ( nm) σε σχέση µε τα αντίστοιχα πράσινα, και η µεταβολή αυτή συσχετίζεται περισσότερο µε τη συγκέντρωση των ανθοκυανινών, παρά µε την ιστολογική τους κατανοµή (Neill & Gould 1999). Επίσης, σε φύλλα φυτών Zea mays διαφορετικών γονότυπων που αναπτύχθηκαν σε ποικίλες συνθήκες, διαπιστώθηκε πειραµατικά, ότι η απορροφητικότητα µεταξύ 400 και 600 nm συνδέεται γραµµικά µε τη συγκέντρωση των ανθοκυανινών (Pietrini & Massacci 1998). Αν και η απορρόφηση των κόκκινων φύλλων, σε σχέση µε όµοια πράσινα, είναι µεγαλύτερη στα µήκη κύµατος που απορροφούν οι ανθοκυανίνες, ο φωτοσυνθετικός ιστός δέχεται λιγότερα φωτόνια, αφού η ενέργεια απορροφάται στα χυµοτόπια και δεν µπορεί να µεταφερθεί στους χλωροπλάστες (Gould et al. 2002b). Στο κατά πόσο µπορούν, όµως, οι ανθοκυανίνες να ανταγωνιστούν τις φωτοσυνθετικές χρωστικές στην απορρόφηση του φωτός, πιθανόν να εξαρτάται και από την ιστολογική τους κατανοµή, δηλαδή αν βρίσκονται σε µία ή περισσότερες στρώσεις κυττάρων και αν βρίσκονται στην επιδερµίδα, στο µεσόφυλλο ή και στα δύο (Steyn et al. 2002). Ενδεχοµένως Επίσης, όταν τα κόκκινα φύλλα αναπτύσσονται στη σκιά άλλων φυτών, ίσως η παρουσία των ανθοκυανινών να είναι περισσότερο περιοριστική για τη φωτοσύνθεση σε συνθήκες σκίασης όπου τα φωτεινό περιβάλλον είναι εµπλουτισµένο στην πράσινη περιοχή (Burger & Edwards 1996). Τροποποιώντας, λοιπόν, οι ανθοκυανίνες ποιοτικά και ποσοτικά το φως στο εσωτερικό του φύλλου, είναι πιθανό να επηρεάζουν και το ρυθµό φωτοσύνθεσης. Σε ορισµένες περιπτώσεις έχει διαπιστωθεί αρνητική επίδραση στη φωτοσύνθεση λόγω της παρουσίας των ανθοκυανινών όπως στο Brachestegia spiciformis, όπου η φωτοσυνθετική δραστηριότητα στα αναπτυσσόµενα φύλλα σχετίζεται αρνητικά µε τη συγκέντρωσή τους σε ανθοκυανίνες, οι οποίες πιθανόν µειώνουν το ποσό της διαθέσιµης φωτοσυνθετικά ενεργής ακτινοβολίας (Choinski & Johnson

23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ). Η ταχύτητα της φωτοσύνθεσης κόκκινων ποικιλιών Coleus είναι µικρότερη σε σχέση µε πράσινες του ίδιου γένους, αλλά µόνο στις χαµηλές εντάσεις φωτός, ενώ ο µέγιστος ρυθµός φωτοσύνθεσης δεν διαφέρει. Αναµένεται, εποµένως η απορρόφηση του φωτός από τις ανθοκυανίνες να έχει ως αποτέλεσµα τη µειωµένη αφοµοίωση άνθρακα σε συνθήκες ανεπαρκούς φωτισµού (Burger & Edwards 1996). Επίσης, η αφοµοίωση CO 2 υπό κορεσµένες εντάσεις φωτός των κόκκινων φύλλων του δέντρου Quintinia serrata, ήταν σηµαντικά µικρότερη έναντι αυτής των πράσινων φύλλων (Gould et al. 2002b). Έχουν, όµως, αναφερθεί και αποκλίσεις από την αναµενόµενη αυτή επίδραση των ανθοκυανινών στη φωτοσύνθεση, όπως στους κόκκινους φαινοτύπους των Begonia pavonina και Triolena hursuta, των οποίων η κάτω επιφάνεια είναι κόκκινη λόγω της παρουσίας ανθοκυανινών και ο µέγιστος ρυθµός φωτοσύνθεσης είναι µεγαλύτερος σε σχέση µε πράσινους φαινοτύπους των ίδιων ειδών (Gould et al. 1995). Σε άλλες περιπτώσεις, η παρουσία των ανθοκυανινών δεν φαίνεται να επηρεάζει τη φωτοσυνθετική απόδοση. Η αφοµοίωση του CO 2 δεν διέφερε µεταξύ πράσινων και κόκκινων φύλλων από αντίστοιχες ποικιλίες Zea mays, καθώς φαίνεται πως η µικρότερη ένταση φωτός που έφτανε στους χλωροπλάστες των ανθοκυανικών φύλλων, αντισταθµιζόταν από υψηλότερη απόδοση του φωτοσυστήµατος ΙΙ (PSII) (Pietrini et al. 2002). ΑΝΘΟΚΥΑΝΙΝΕΣ ΚΑΙ ΦΩΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑ Φωτοαναστολή Τα φύλλα αποτελούν όργανα των οποίων η δοµή, η φυσιολογία και ο βιοχηµικός εξοπλισµός αποβλέπουν στη βελτιστοποίηση της φωτοσυνθετικής αφοµοίωσης του CO 2. Η ηλιακή ακτινοβολία παρότι αποτελεί την κινητήρια δύναµη της φωτοσύνθεσης και εποµένως αποτελεί την απόλυτη προϋπόθεση για την αυτότροφη ανάπτυξη των φωτοσυνθετικών οργανισµών, µπορεί σε υψηλές εντάσεις να αποβεί καταστροφική για τη φωτοσυνθετική µηχανή. Το φαινόµενο αυτό ονοµάζεται φωτοαναστολή και υποδηλώνει την ελάττωση της φωτοσυνθετικής δραστηριότητας, όταν τα φυτά εκτίθενται σε ακτινοβολία υψηλότερη αυτής που επαρκεί για τον κορεσµό της φωτοσύνθεσης. Ακόµα και ταχυαυξή φυτά µε πολύ υψηλούς ρυθµούς αφοµοίωσης CO 2, δεν αξιοποιούν περισσότερο από το µισό του άπλετου φωτισµού, ενώ άλλα φυτικά είδη µπορεί να χρησιµοποιούν µόλις το 10% (Close & McArthur 2002). Το πλεόνασµα ενέργειας που δηµιουργείται, µπορεί να προκαλέσει βλάβες στη φωτοσυνθετική συσκευή και οξειδώσεις λιπιδίων, πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων, λόγω της παραγωγής ενεργών µορφών οξυγόνου (active oxygen species, AOS). Η απορρόφηση φωτονίων από τα µόρια της χλωροφύλλης (Chl) είναι µια φωτοχηµική διαδικασία που δεν υπόκειται σε βιολογικό έλεγχο, µε αποτέλεσµα καθώς αυξάνεται η ένταση της φωτεινής ακτινοβολίας, να υπάρχει υπερτροφοδότηση της φωτοσυνθετικής συσκευής µε ενέργεια, η οποία υπερβαίνει αυτή που µπορεί να χρησιµοποιηθεί από τις ενζυµικές αντιδράσεις του κύκλου του Calvin. Από τη διαφορά µεταξύ της φωτεινής ενέργειας που απορροφάται και αυτής που χρησιµοποιείται για την αναγωγή του CO 2 προς υδατάνθρακες, προκύπτει αυτό που

24 14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ονοµάζεται περίσσεια φωτός. Οι περιβαλλοντικοί παράγοντες που αυξάνουν αυτήν τη διαφορά, καταστέλλοντας τους βιοχηµικούς µηχανισµούς της φωτοσύνθεσης, αυξάνουν και το ενδεχόµενο φωτοαναστολής. Για παράδειγµα οι χαµηλές θερµοκρασίες, που αναστέλλουν την ενζυµική δραστηριότητα του κύκλου του Calvin. Επίσης, η έλλειψη νερού που οδηγεί σε κλείσιµο των στοµάτων και εποµένως µείωση της διαθεσιµότητας του CO 2 (Long & Humphries 1994). Γενικά, η µείωση της φωτοσυνθετικής απόδοσης σε φωτοανασταλτικές συνθήκες οφείλεται σε βλάβες των κέντρων αντίδρασης του PSII, καθώς και στην επαγωγή φωτοπροστατευτικών µηχανισµών για τη διοχέτευση της πλεονάζουσας ενέργειας µε εκποµπή θερµότητας (thermal dissipation) (Foyer et al. 1994). Η απορρόφηση φωτονίων σε περίσσεια, µπορεί να προκαλέσει συσσώρευση ενέργειας στη φωτοσυνθετική συσκευή και εποµένως παράταση της διάρκειας ζωής της χλωροφύλλης σε κατάσταση απλότητας (singlet Chl, 1 Chl). Η διεγερµένη αυτή Chl µπορεί, είτε να θέσει σε κίνηση τη φωτοσυνθετική ροή ηλεκτρονίων, είτε να επανέλθει στη βασική κατάσταση εκπέµποντας ακτινοβολία (φθορισµός), είτε να µετατραπεί σε χλωροφύλλη σε κατάσταση τριπλότητας (triplet Chl, 3 Chl), που δεν είναι ικανή να θέσει σε κίνηση τη φωτοσυνθετική ροή ηλεκτρονίων. Παρότι η 3 Chl δεν µπορεί να προκαλέσει βλάβες, µπορεί να αλληλεπιδράσει µε το µοριακό οξυγόνο, το οποίο σε κανονικές συνθήκες βρίσκεται σε κατάσταση τριπλότητας ( 3 O 2 ), και µε µεταφορά ενέργειας να το µετατρέψει σε οξυγόνο απλότητας (singlet oxygen, 1 O 2 ) που είναι µια εξαιρετικά AOS, η οποία µπορεί άµεσα να προκαλέσει βλάβες σε πρωτεΐνες, χρωστικές και λιπίδια της φωτοσυνθετικής συσκευής (Niyogi 2000, Krieger-Liszkay 2005). Εναλλακτικά, µπορεί µε µεταφορά ηλεκτρονίου στο 3 O 2 να προκαλέσει τη σταδιακή αναγωγή του, µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία των AOS ρίζα υπεροξειδίου (superoxide, O - 2 ), υπεροξείδιο του υδρογόνου (hydrogen peroxide, H 2 O 2 ) και ρίζα υδροξυλίου (hydroxyl radical, OH. ), που αντιδρούν άµεσα µε βιοµόρια (Niyogi 2000, Krieger-Liszkay 2005). Ακόµα και σε άριστες συνθήκες, το 10% της ενέργειας του φωτός που απορροφάται από το PSII, χάνεται λόγω της δηµιουργίας 3 Chl (Baroli & Niyogi 2000). Οι µεµβρανικές πρωτεΐνες D 1 και D 2 σχηµατίζουν το φωτοχηµικό κέντρο αντίδρασης του PSII, όπου γίνεται ο πρωτογενής διαχωρισµός φορτίου. Αποτελούν ένα διµερές που δεσµεύει µια σειρά παραγόντων που συµµετέχουν στη ροή ηλεκτρονίων, όπως για παράδειγµα, τον πρωτογενή δότη ηλεκτρονίων P 680 (χλωροφύλλη a στο φωτοχηµικό κέντρο του PSII), τον πρωτογενή δέκτη ηλεκτρονίων φαιοφυτίνη (Pheo a) και τις πλαστοκινόνες Q A και Q B. Σε συνθήκες περίσσειας φωτός, ο πλέον ευάλωτος στόχος στο PSII είναι η πρωτεΐνη D 1, η οποία αποικοδοµείται και αποσπάται από τη µεµβράνη του θυλακοειδούς. Για να µπορέσει να αποκατασταθεί η βλάβη στο κέντρο αντίδρασης του PSII, πρέπει να γίνει de novo σύνθεση νέου λειτουργικού πεπτιδίου, εισαγωγή του στη µεµβράνη του θυλακοειδούς και ανασυγκρότηση του διµερούς D 1 /D 2, ώστε να υπάρξει ροή ηλεκτρονίων. Η αποικοδόµηση της D 1 µπορεί να προκαλείται από τη δράση ριζών υδροξυλίου ή το 1 O 2, αλλά επίσης εµπλέκεται και η ενεργοποίηση µιας συγκεκριµένης πρωτεάσης (Aro et al. 1992, Foyer & Noctor, 2000). Αυτός ο κύκλος βλάβης-επιδιόρθωσης του PSII θεωρείται πολύ σηµαντικός για τη λειτουργία της

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 15 φωτοσύνθεσης, ενώ η σχετική ταχύτητα των δύο αυτών διαδικασιών καθορίζει το αν θα υπάρξει επίδραση στην παραγωγικότητα της φωτοσυνθετικής συσκευής (Aro et al. 1992, Melis 1999). Σε κανονικές συνθήκες οι διαδικασίες βλάβης και επιδιόρθωσης της D1 προχωρούν παράλληλα, έτσι ώστε να παραµένει αµείωτος ο ρυθµός της φωτοσύνθεσης. Η αποικοδόµηση της D1 λοιπόν, δεν αποτελεί από µόνη της µια αρνητική διαδικασία, αλλά µπορεί να θεωρηθεί ως τµήµα του φυσιολογικού αµυντικού συστήµατος, ώστε να αποτρέπεται η µη ελεγχόµενη βλάβη του PSII, καθώς εξουδετερώνεται µε αυτό τον τρόπο το 1 O 2 και µάλιστα στη θέση δηµιουργίας του, δηλαδή το σηµείο που συνδέεται η P 680 µε την D1, στο κέντρο αντίδρασης (Trebst 2003). Όταν υπάρχει περίσσεια φωτός, όµως, µπορεί ο ρυθµός των βλαβών να υπερτερήσει εκείνου των επιδιορθώσεων, µε επακόλουθο την ελάττωση της απόδοσης της φωτοσύνθεσης, µια κατάσταση που ονοµάζεται φωτοαναστολή και οδηγεί στη µείωση της ανάπτυξης του φυτού (Aro et al. 1992, Melis 1999). Φωτοπροστατευτικοί Μηχανισµοί των Φυτών Τα φυτά για να αποφεύγουν τις οξειδωτικές βλάβες διαθέτουν διάφορους µορφολογικούς και βιοχηµικούς µηχανισµούς, ώστε να εξισορροπούν την απορρόφηση της ενέργειας µε την κατανάλωσή της για την παραγωγή φωτοχηµικού έργου και µε την απόσβεση της περίσσειας της, ενώ διαθέτουν µια σειρά από ενζυµικά και µη ενζυµικά συστήµατα που συµβάλλουν στην πρόληψη της δηµιουργίας AOS, καθώς και στην εξουδετέρωσή τους (Niyogi 2000). Όταν οι µηχανισµοί αυτοί επαρκούν, τότε αποφεύγονται οι µόνιµες βλάβες στο φυτό, η µείωση της φωτοσυνθετικής απόδοσης είναι αντιστρεπτή και έχει προστατευτικό ρόλο (δυναµική φωτοαναστολή). Όταν, όµως, οι αµυντικοί µηχανισµοί αδυνατούν να ανταποκριθούν πλήρως υπό τις συγκεκριµένες συνθήκες που αντιµετωπίζει, τότε οι AOS που δηµιουργούνται παραµένουν και δηµιουργούν µόνιµες βλάβες (µόνιµη φωτοαναστολή). Γενικά, πάντως, η φωτοσυνθετική συσκευή είναι εξαιρετικά δυναµική και ικανή να αντιδρά σε περιβαλλοντικά ερεθίσµατα, συµπεριλαµβανοµένων των αλλαγών στην ποιότητα και την ποσότητα της προσπίπτουσας ακτινοβολίας (Szabó et al. 2005). Κατ αρχάς, έχουν διαπιστωθεί διάφοροι µηχανισµοί αποφυγής, µε τους οποίους προσπαθούν τα φυτά να περιορίσουν το φως που προσπίπτει στους φωτοσυνθετικούς ιστούς και εποµένως να µειώσουν το φως που τελικά απορροφάται από τις φωτοσυνθετικές χρωστικές. Αυτό µπορεί να πραγµατοποιηθεί µε διάφορους τρόπους, όπως µε την αύξηση της ανακλαστικότητας των φύλλων, για παράδειγµα µέσω της ανάπτυξης τριχώµατος (Bisba et al. 1997, Ntefidou & Manetas 1996, Karabourniotis & Bornman 1999) ή εναπόθεσης επιεφυµενιδικών κεριών (Barker et al. 1997). Ορισµένα φυτά µεταβάλλουν τη γωνία έκθεσης των φύλλων τους στον ήλιο και την προσαρµόζουν, έτσι ώστε να βελτιστοποιούν την απορρόφηση του φωτός ανάλογα µε τις ανάγκες τους (He et al. 1996, Pastenes et al. 2004). Ένας άλλος µορφολογικός µηχανισµός προστασίας που έχει αναφερθεί, είναι ο κυλινδρισµός των φύλλων (leaf folding ή rolling), που έχει ως αποτέλεσµα τη µείωση της επιφάνειας του φύλλου που είναι εκτεθειµένη στον ήλιο, και την παράλληλη αύξηση της έκθεσης της κάτω επιφάνειας, η οποία έχει διαθέτει συνήθως υψηλότερη ανακλαστικότητα (Kyparissis & Manetas 1993a, Sherwin & Farrant 1998). Μείωση