ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΗΣ ΜΑΥΡΗΣ ΣΤΑΦΙΔΑΣ ΜΕΣΣΗΝΙΑΣ. Καθ. Λέανδρος Α. Σκαλτσούνης

Transcript

1 ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΗΣ ΜΑΥΡΗΣ ΣΤΑΦΙΔΑΣ ΜΕΣΣΗΝΙΑΣ Καθ. Λέανδρος Α. Σκαλτσούνης

2 Κατά τον 19ο αιώνα η μαύρη σταφίδα αποτελούσε το 9% των εξαγωγών της Ελλάδας στην Ευρώπη. η σταφίδα για την Ελλάδα ήταν «ό,τι και ο καφές για τη Βραζιλία». 2 tn 95% εξαγωγικό προϊόν.8-.9 Ετήσια παραγωγή

3 Βιβλιογραφική ανασκόπηση για την φαρμακολογική δράση Βιβλιογραφική ανασκόπηση για την χημική σύσταση της σταφίδας Φρουκτόζη Ιχνοστοιχεία: Κάλιο, μαγνήσιο, σίδηρο. Πολυφαινόλες

4 Βιβλιογραφική ανασκόπηση για την φαρμακολογική δράση της σταφίδας Βιολογικές δράσεις Ισχυρή αντιοξειδωτική δράση Καρδιοπροστατευτική Κυτταροπροστατευτική δράση Αντιφλεγμονώδης Αντιμικροβιακή Αντιιική Αντιαλλεργική

5 Ανάπτυξη πρωτόκολλων εκχύλισης για την παραλαβή των πτητικών & μη πτητικών συστατικών Α. Πτητικά συστατικά Υδραπόσταξη σε μικροκύματα δείγματος της κορινθιακής σταφίδας Μεσσηνίας (τελικό προϊόν) και συλλογή του αρωματικού ύδατος (Hydrosol). Εκχύλιση του αρωματικού ύδατος με CH2Cl2 GC-MS Eκχύλιση δείγματος της σταφίδας με n-pentane GC-MS λιπαρά οξέα. Β. Λιπόφιλα συστατικά Εκχύλιση (x2) με διχλωρομεθάνιο Γ. Φαινολικά συστατικά και σάκχαρα Διαδοχική εκχύλιση (x2) με διχλωρομεθάνιο (CH2Cl2) & αιθανόλη (Et) Καθαρισμός σε σύστημα SPE C-18 για απομάκρυνση των σακχάρων και παραλαβή των φαινολών Πραγματοποιήθηκαν εκχυλίσεις σε κομμένες και άκοπες σταφίδες, οι οποίες δεν έδειξαν ιδιαίτερη διαφορά στην ποσότητα του εκχυλίσματος. Όλες οι εκχυλίσεις (με CH2Cl2 και Et) πραγματοποιήθηκαν 3 φορές για το κάθε δείγμα σταφίδας (αξιολόγηση της ακρίβειας των αποτελεσμάτων).

6 Ανάλυση των πτητικών συστατικών GC-MS Αρωματικό ύδωρ (Hydrosol): Furfural (3,67min), 2E-Heptanal (6,34min), Hexanoic acid (6.9min), Benzene acetaldehyde (9.24), ctanoid acid (14.66min), Nonanoic acid (19.2min), γ-nonalactone (22.78min) Πτητικό κλάσμα (Volatile fraction): Ethyl hexadecanoate, 8-ctadecenoic acid, Methyl linoleate, 9-ctadecenoic acid (Z)-ethyl ester, Ethyl octadecanoate, Dotriacontane, Pentacosane, Eicosane, 1-Eicosanol, Hexadecanal, 1-Hexacosanal A b u n d a n c e 2 2 T I C : T S 3. D T im e - - >

7 Εκχυλίσεις δειγμάτων * με CH 2 Cl 2 Ποσότητα (mg) Κορινθιακή Σουλτανίνα Καλιφόρνια εκχυλίσματος Α Υλη 19 /22 / /22 / Τελικό 52 /5 / /37 / /54/ * Για όλες τις εκχυλίσεις χρησιμοποιήθηκαν 1g δείγματος. Καλή επαναληψιμότητα της εκχυλιστικής διαδικασίας Η απόδοση του άπολου κλάσματος είναι μεγαλύτερη στο τελικό προϊόν σε σύγκριση με την πρώτη ύλη Μεγαλύτερη απόδοση στο δείγμα του τελικού Καλιφόρνιας (.54 %) και μικρότερη σε αυτό της α -ύλης Σουλτανίνας (.2 %)

8 Ποιοτικός έλεγχος (TLC) Α Β Χρωματογραφήματα λεπτής στιβάδας: (Α) εμφάνιση με αντιδραστήριο θειϊκής βαννιλίνης και παρατήρηση στο ορατό (Β) παρατήρηση στα 254 nm Παρουσία τερπενοειδών Παρόμοια ποιοτική σύσταση Μικρότερη περιεκτικότητα μη πτητικών συστατικών στο δείγμα Καλιφόρνιας

9 Απομόνωση και ταυτοποίηση τερπενοειδών Υγρή χρωματογραφία στήλης (Στατική φάση: Γέλη πυριτίου κανονικής φάσεως, Κινητή φάση: Μίγμα διαλυτών CH 2 Cl 2 :Me αυξανόμενης πολικότητας) Χρωματογραφήματα λεπτής στιβάδας: (Α) εμφάνιση με αντιδραστήριο θειϊκής βαννιλίνης και παρατήρηση στο ορατό (Β) παρατήρηση στα 254 nm

10 ΙΙ. Κλάσμα 1-15: Ολεανολικό οξύ (~ 2% του άπολου κλάσματος) H H H H

11 H H H H Ολεανολικό οξύ Eχει ισχυρή ηπατοπροστατευτική, αντιφλεγμονώδη και αντικαρκινική δράση

12 Εκχυλίσεις δειγμάτων * με Et Ποσότητα (g) εκχυλίσματος Κορινθιακή Σουλτανίνα Καλιφόρνια Α Υλη 15.5 /15 / /6 / Τελικό 2 /2.5 / /6.4 / /12/ * Για όλες τις εκχυλίσεις χρησιμοποιήθηκαν 1g δείγματος. Η απόδοση στα δείγματα της Κορινθιακής ήταν μεγαλύτερη από την απόδοση στα δείγματα της Καλιφόρνιας και της Σουλτανίνας Στην Κορινθιακή η απόδοση ήταν σχεδόν ίδια στο δείγμα της πρώτης ύλης και το δείγμα του τελικού προϊόντος Μεγάλη περιεκτικότητα σε σάκχαρα

13 Ανάκτηση φαινολών από το Et εκχύλισμα με SPE Ποσότητα (mg) Α Υλη Τελικό Κορινθιακή Σουλτανίνα Καλιφόρνια * Για όλες τις ανακτήσεις χρησιμοποιήθηκαν 5 mg αρχικό εκχύλισμα Η Κορινθιακή δίνει το μεγαλύτερο ποσοστό (2.4%) φαινολικού κλάσματος σε σύγκριση με τη Σουλτανίνα (.4-.8%) και τη Καλιφόρνια (.6%)

14 Comparative chromatograms for the three species RT: 1,27-21, SM: 7B 14, 8,99 9,26 11,99 8,68 6,19 1,94 1,52 2,71 5,69 6,61 15,54 16,24 18,42 9,26 12,5 13,11 19, Time (min) 2,92 13,44 2,92 14,1 3,85 7,52 11,68 19,62 1,48 4,12 6,2 16,3 17,17 19,21 14, 12,1 2,94 13,11 9,26 8,68 9,82 3,87 7,5 1,37 5,49 16,29 16,54 19,17 19,63 NL: 1,21E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS Callifornia_open NL: 1,65E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS stafida_meoh_c18_ open NL: 2,34E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS sultanina_teliko_ope n California Corinthian Sultanina

15 Intensity RT: 1,27-21, SM: 7B 14, 8,99 9,26 11,99 8,68 6,19 1,94 1,52 2,71 5,69 6,61 15,54 16,24 18,42 9,26 12,5 13,11 19, Time (min) 2,92 13,44 2,92 14,1 3,85 7,52 11,68 19,62 1,48 4,12 6,2 16,3 17,17 19,21 14, 12,1 2,94 13,11 9,26 8,68 9,82 3,87 7,5 1,37 5,49 16,29 * 16,54 Flavonols region 19,17 19,63 NL: 1,21E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS Callifornia_open NL: 1,65E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS stafida_meoh_c18_ open NL: 2,34E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS sultanina_teliko_ope n California Corinthian Sultanas * Rt 14.min: azelaic acid Sultanina has intense flavonol peaks Corinthian has the most intense flavonol peaks: bigger range of flavonol structures and higher relative quantity (in comparison to the other groups) California contains the least flavonol structures.

16 Intensity RT: 7,74-17,49 SM: 7B ,68 8,99 9,26 11,99 13,1 14, 14, Time (min) 16,24 13,11 12,5 9,26 13,44 8,7 14,1 9,8 11,68 17,17 8,68 9,26 9,82 11,64 8,55 9,52 8,9 11,36 12,1 11,62 11,84 12,99 14, 14,4 16,29 16,54 16,15 16,99 9,42 1,28 12,3 13,31 16,18 17,9 13,11 7,99 8,72 1,43 11,71 13,43 15,41 16,97 California Corinthian Sultanina Quercetin rutinoside (Rutin) Quercetin glucoside Kaempferol glucoside Comparison with authentic standards from our Chemical library H H H Rutinose Glucose Glucose

17 Relative Abundance Intensity Insight in the Flavonols region RT: 9,94-17,85 SM: 7B ,5 13,11 13,44 14,1 12,74 1,89 11,68 15,18 15,95 16,3 17,17 12,1 13,11 14, Corinthian Sultanina Rt 13.44min Isorhamnetin hexoside H CH 3 Hexose ,64 1,98 12,71 15,33 16,29 16, Time (min) 17,81 Rt 16.54min Quercetin H Rt 12.5min H Glucose Quercetin 3--glucoside Rt 13.11min H Glucose Kaempferol 3--glucoside Rt 14. min H Azelaic acid Compound produced during stress -Antimicrobial - Anti-inflamatory - Tyrosinase inhibitor

18 Azelaic acid: έχει ισχυρή αντιφλεγμονώδη και αντιμικροβιακή δράση Χρησιμοποιείται στην θεραπεία της ακμής Αναστολέας τυροσινάσης, μετριάζει την σύνθεση μελανίνης και έχει λευκαντική δράση στο δέρμα

19 Relative Abundance Intensity Insight in the Flavonols region RT: 9,94-17,85 SM: 7B ,5 13,11 13,44 14,1 12,74 1,89 11,68 15,18 15,95 16,3 17,17 12,1 13,11 14, Corinthian Sultanas Rt 12.88min Dimmer of Vanillic acid H CH , ,64 1,98 12,71 15,33 16, Time (min) 17,81 Rt 11.68min Rt 12.71min Rt min H H H Rutinose Quercetin 3--rutinoside Rutinose Kaempferol -rutinoside Hexose Kaempferol hexoside

20 Η παρουσία φλαβονοειδών στα φρούτα και τα λαχανικά θεωρείται ότι επεξηγεί τις ευεργετικές ιδιότητες της κατανάλωσής τους. Επιδηµιολογικές µελέτες δείχνουν ότι η διαιτητική πρόσληψη των φλαβονοειδών είναι αντιστρόφως ανάλογη της θνητότητας από καρδιαγγειακά Μελετάται η επίδρασή τους στην πρόληψη του καρκίνου και των καρδιαγγειακών νοσηµάτων

21 Η ρουτίνη αναστέλλει τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων, μειώνει την διαπερατότητα των τριχοειδών βελτιώνοντας την κυκλοφορία, έχει αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες (θεραπεία αιμορροΐδων, κιρσών και μικροαγγειοπάθειας), έχει αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες.

22 Κεμπφερόλη: αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδης, αντιμικροβιακή, οιστρογονική δράση Κερκετίνη: ισχυρή αντιοξειδωτική δράση

23 Fatty acids region RT: 1,27-21, SM: 7B 14, 8,99 9,26 11,99 8,68 6,19 1,94 1,52 2,71 5,69 6,61 15,54 16,24 18,42 9,26 12,5 13,11 19, Time (min) 2,92 13,44 2,92 14,1 3,85 7,52 11,68 19,62 1,48 4,12 6,2 16,3 17,17 19,21 14, 12,1 2,94 13,11 9,26 8,68 9,82 3,87 7,5 1,37 5,49 16,29 16,54 19,17 19,63 NL: 1,21E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS Callifornia_open NL: 1,65E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS stafida_meoh_c18_ open NL: 2,34E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS sultanina_teliko_ope n California Corinthian Sultanina C-18 unsaturated fatty acids

24 Intensity Benzoic acids region RT: 1,1-11,63 SM: 7B 8,99 9,26 4 8,68 8,51 9,84 1,94 6,19 2 1,52 2,2 3,8 5,36 5,69 6,61 8,1 9,97 NL: 5,87E5 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS callifornia_open California ,26 1,27 7,52 3,85 8,7 1,48 8,1 9,8 3,61 4,12 1,89 6,2 6,59 NL: 9,34E5 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS stafida_meoh_c18_o pen Corinthian ,87 1,37 2,5 3,28 4,86 5,49 6,38 8,68 7,5 8,1 9,26 9,82 11,33 NL: 8,49E5 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS Sultanina_Teliko_ope n Sultanina Small bicarboxylic acids Time (min) Small phenolic acids are absent from California raisin/ only p-hydroxybenzoic acid present. Also they are absent from the initial material of Soultanina currents. It can be found in initial material of Korinthiaki in small amounts. They are major constituents of Korinthiaki final product and protocatechuic acid glucoside in sultanina (final product).

25 Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance The Benzoic acids region / small bicarboxylic acids RT: 1,17-6,77 SM: 7B 6, ,52 2,22,36 3,83,16 3,52 4,894,965,485,69 6, ,27 1 1, ,85 1,48 3,61 4,12 1,89 2,62,85 5,45,24 5,976,26,59 3,87 5,49 1,371,8 2,52,783,1 4,644,86 5,72 6, Time (min) California Corinthian Sultanina Rt 1.27 & 1.48 min Succinic acid, Malic acid H H nly present in Corinthian Rt 3.61min Rt 3.85min Rt 4.12 min CH 3 Rt 6.19min H Protocatechuic acid H Protocatechuic acid hexoside Hexose Hexose H Vanillic acid hexoside H p-hydroxybenzoic acid

26 Protocatechuic acid: Eχει ισχυρή αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση, επάγει την απόπτωση in vitro H p-hydroxybenzoic acid: αντιοξειδωτικό H

27 Hydroxycinnamic acids/ Catechins/???Unidetified category RT: 1,27-21, SM: 7B 14, 8,99 9,26 11,99 8,68 6,19 1,94 1,52 2,71 5,69 6,61 15,54 16,24 18,42 9,26 12,5 13,11 19, Time (min) 2,92 13,44 2,92 14,1 3,85 7,52 11,68 19,62 1,48 4,12 6,2 16,3 17,17 19,21 14, 12,1 2,94 13,11 9,26 8,68 9,82 3,87 7,5 1,37 5,49 16,29 16,54 19,17 19,63 NL: 1,21E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS Callifornia_open NL: 1,65E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS stafida_meoh_c18_ open NL: 2,34E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS sultanina_teliko_ope n California Corinthian Sultanina

28 Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance Hydroxycinnamic acids/ Catechins RT: 6,54-11,72 SM: 7B ,99 9,26 8,68 8,51 9,84 1,94 6,61 7,7 7,8 8,1 9,97 1,6 11,71 9,26 7,52 8,7 8,1 9,8 1,89 11,68 6,59 7,18 1, 11,4 9,26 9,82 8,68 11,64 7,5 11,33 8,1 1,98 8,43 6,74 6,98 1, Time (min) California Corinthian Sultanas Some peaks of this region remain unidentified (Rts 8.7, 8.99 & 9.26 min) Rt 7.52min H Rt 8.1min Rt 9.3 min CH 3 Rt 1.94min Hexose Catechin H p-coumaric acid hexoside H Ferulic acid H p-coumaric acid

29 Κατεχίνες: αντιοξειδωτικά παράγωγα με αντιμεταλλαξιογόνο δράση Σε φρούτα, λαχανικά, στο πράσινο τσάι και τον καφέ

30 Ferulic acid p-coumaric acid Φαινολικές ενώσεις με ισχυρή αντιοξειδωτική δράση, είναι παράγωγα υδροξυκινναμικών οξέων. Εξουδετερώνουν τις βλαπτικές δράσεις των ελευθέρων ριζών (δραστικές μορφές οξυγόνου) που είναι μια από τις σημαντικότερες αιτίες της γήρανσης των κυττάρων: καταστρέφουν το κολλαγόνο και την ελαστίνη του στηρικτικού ιστού

31 Intensity Ειδικές εκχυλίσεις για ανάκτηση χρωστικών (ανθοκυανίνες) Eκχύλιση με όξινη Me (HCl.1% v/v) Καθαρισμός σε SPE DSC-18 με χρήση H 2 και Μe (HCl,3% v/v). Απόδοση.56% (2.8mg κλάσματος χρωστικών από 5mg ποσότητας εκχυλίσματος) HPLC-HRMS/MS, positive mode- Comparison with standard compounds RT: 8,64-16,98 SM: 7B ,11 1,51 11,5 13,15 11,72 12,61 12,55 13,23 13,36 15,72 16,29 14,94 9,84 11,24 11,4 13,28 13,5 15,29 16,47 13,2 H H glucose Delphinidin 3--glucoside ,15 9,9 1,94 11,96 12,66 13,74 15,27 13,31 15,91 16,47 glucose Cyanidin 3--glucoside H CH 3 1,46 11,59 12,47 13,74 14,59 15,48 16, Time (min) glucose Petulidin 3--glucoside

32 Aνθοκυανιδίνες: φυσικές χρωστικές με ισχυρή αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη, καρδιοπροστατευτική και χημειοπροστατευτική δράση

33 Συμπεράσματα Το φυτοχημικό προφίλ της μαύρης σταφίδας Μεσσηνίας είναι πλουσιότερο σε σύγκριση με τα ανταγωνιστικά προϊόντα Τα κύρια συαστατικά του άπολου κλάσματος των μεταβολιτών είναι τριτερπενικά παράγωγα Το φαινολικό φορτίο της μαύρης σταφίδας Μεσσηνίας είναι 3-4 φορές μεγαλύτερο σε σύγκριση με τα ανταγωνιστικά προϊόντα Τα κύρια συστατικά του φαινολικού κλάσματος είναι φλαβονοειδικοί γλυκοσίδες καιμπφερόλης & κερκετίνης, φαινολικά οξέα και γλυκοσίδες τους & ανθοκυανίνες

34 Αντιοξειδωτική δράση: προστασία της LDL από οξείδωση ελάττωση αποτιθέμενης χοληστερόλης στους ιστούς μείωση αθηρωματικής πλάκας μείωση κινδύνου καρδιοπαθειών Αντικαρκινική δράση (στο παχύ έντερο, απόπτωση καρκινικών κυττάρων) Αντιμικροβιακή και αντιβακτηριδιακή δράση Αγγειοδιασταλτική δράση διαμέσου της παραγωγής ενδοκυτταρικού ΝΟ Προστασία του DNA από ενδοκυτταρικές προσβολές Η μαύρη σταφίδα αποτελεί αναμφισβήτητα μία από τις σημαντικότερες Ελληνικές υπερτροφές (superfoods). ένταξη της κορινθιακής σταφίδας στην καθημερινή διατροφή

35 Προοπτικές Βελτιστοποίηση πρωτόκολλου παραλαβής ανθοκυανινών Συγκριτική μελέτη των δειγμάτων ως προς τις περιεχόμενες χρωστικές Ποσοτικοποίηση και ταυτοποίηση όλων των συστατικών Σύγκριση με άλλα αντίστοιχα προϊόντα «berries Παραγωγή βιοδραστικών εκχυλισμάτων από υποπροϊόντα της σταφίδας.

36 Acknowledgements: CAPTAIN VASSILIS FUNDATIN & PAPADIMITRIU S.A. for the financial support of the project