Γ. Σταµατάκης Υποψήφιος ιδάκτορας, Κ.Α. ηµόπουλος Καθηγητής

Transcript

1 Φροντιστήριο λι οειδών Εργαστηρίου Βιοχηµείας ΙΙ Γ. Σταµατάκης Υποψήφιος ιδάκτορας, Κ.Α. ηµόπουλος Καθηγητής

2 Λιποειδή (Ι) Ορισµός Λιποειδή ονοµάζονται τα µόρια τα οποία διαλύονται σε οργανικούς µη πολικούς διαλύτες (χλωροφόρµιο, αιθέρες) ή λιγότερο πολικούς (µεθανόλη,, ακετόνη) και τα µείγµατα αυτών Αναφερόµαστε σε µια πολύ ετερογενήκαι πολυπληθήοµάδα οµάδα µορίων µε εντελώς διαφορετικές χηµικές και βιολογικέςδράσεις και ιδιότητες Θα µπορούσε λοιπόν κάποιος να ισχυριστεί ότι λιποειδές είναι οποιοδήποτεοργανικό οργανικό µόριο το οποίο δεν είναισάκχαρο, πρωτεΐνη ή νουκλεϊκό οξύ

3 Λιποειδή (ΙΙ) Χαρακτηριστικά των λιποειδών: Μεταβολικά: Όλα τα λιποειδή βιοσυντίθενταικαι αποδοµούνταιµέσω µέσω του ενεργοποιηµένου οξικού οξέος (ακέτυλο-coa) οµικά συστατικά των µεµβρανών,, ενώ συµµετέχουν και στις διάφορες διεργασίες τους (διαπερατότητα, ρευστότητα, αναγνώριση κυττάρων) Προστατευτικός µανδύαςτων οργανισµών και των οργάνων δρώντας ως µονωτικά για θερµότητα και ηλεκτρισµό Ενεργειακές κυψέλες των κυττάρων, καθώς αποτελούν τα ενεργειακά αποδοτικότερα βιοµόρια (Ενέργεια/ Μάζα) Πολλαπλές βιολογικές δράσεις: Συµπαράγοντες ενζύµων-πρωτεϊνών, βιταµίνες, ορµόνες, µηνυµατοφόρα µόρια, αντιοξειδωτικά-µεταφορείς ηλεκτρονίων

4 Κατάταξη λιποειδών

5 Απλά λιποειδή (Ουδέτερα) Ι Τερπένια Τα τερπένια όπως προδίδει το όνοµά τους είναι µόρια τα οποία προσφέρουν τέρψη. Τα πρώτα µέλη της οικογένειας των τερπενίων που αποµονώθηκαν ήταν φυτικά αιθέρια έλαια,, ύστερα από συναπόσταξη φυτικών ιστών και καρπών µε υδρατµούς. Ενδεικτικά αναφέρονται το λεµονένιο (λεµόνι), γερανιόλη (γεράνι), µυρκένιο (δάφνη), καρβόνη (δυόσµος), πατσουλική αλκοόλη (πατσουλί) Στην οικογένεια προστέθηκαν και άλλα φυσικά προιόντα όπως το φυσικό ελαστικό (καουτσούκ), η ρητίνη του πεύκου (πολυµερές α και β πινενίου), τα καροτενοειδή (α,β,γ καροτένειο και λυκοπένιο) Τέλος µέλη της οικογένειας είναι οι ουβικινόνες και πλαστικινόνες (συνένζυµα), οι βιταµίνες A, D, E, K

6 Α λά λι οειδή (Ουδέτερα) ΙΙ

7 Απλά λιποειδή (Ουδέτερα) ΙΙΙ Στερόλες Οι στερόλεςρυθµίζουν ρυθµίζουν τη ρευστότητακαι σταθερότητατων των κυτταρικών µεµβρανών Οι κυριότερες όµως λειτουργίες τους είναι σαν ορµόνες- µεταγωγείςσήµατος ιαχωρίζονται στις γενετικέςκαι και τις αδρενοκορτικέςορµόνες. ορµόνες. Οι γενετικές χωρίζονται µε τη σειρά τους στα ανδρογόνα (τεστοστερόνη) και τα οιστρογόνα (οιστραδιόλη) Οι αδρενοκορτικέςορµόνες ορµόνες εκκρίνονται από τα επινεφρίδια. ιαχωρίζονται στα µεταλλοκορτικοειδή (αλδοστερόνη: ρύθµιση ισορροπίας Να +, Κ +) και τα γλύκοκορτικοειδή (υδροκορτιζόνη:: ρύθµιση µεταβολισµού γλυκόζης και φλεγµονώδους αντίδρασης)

8 Απλά λιποειδή (Ουδέτερα) IV

9 Απλά λιποειδή (Ουδέτερα) V Τόσο τα τερπένια όσο και οι στερόλες θεωρούνται παράγωγα του ισοπρενίου και διαχωρίζονται µε βάση το πόσα µόρια ισοπρενίουχρειάζονται για να σχηµατιστεί το µόριο σε µόνο, δι, τρι, και τέτρα τερπένια,, αν περιέχουν δύο, τέσσερις, έξι ή οχτώ µονάδες ισοπρενίου αντίστοιχα Έτσι το λεµονένιοθεωρείται ένα µόνοτερπένιο, οι στερόλεςκαι το πρόδροµο µόριό τους το σκουαλένιοείναι τριτερπένια, ενώ τα καροτένια είναι τέτρατερπένια

10 Απλά λιποειδή (Ουδέτερα) VI Λιπαρά οξέα Τα λιπαρά οξέα είναι µια ευρύτατη οµάδα µορίων. Όντας οξέα έχουν τουλάχιστον µία καρβοξυλική οµάδα, η οποία σχεδόν πάντα βρίσκεται σε εστερικό ή αµιδικό δεσµό Το µεγαλύτερο ποσοστό τους είναι ευθύγραµµες ανθρακικές αλυσίδες, ως επί το πλείστον αρτίου αριθµού ανθράκων, κορεσµένες ή ακόρεστες µε ένα ή περισσότερουςδιπλούς δεσµούς. Τα ακόρεστα λιπαρά οξέα απαντώνται κυρίως στη cis µορφή τους. Στη συνέχεια αποµονώθηκαν λιπαρά οξέα από µικροοργανισµούς, µε περιττό αριθµόανθράκων ανθράκων αλλά και κυκλικάκαι και διακλαδισµένα ανάλογά τους. Ακόµη βρέθηκαν υδρόξυ, επόξυ, και φουρανικάλιπαρά οξέα ακόµη και σε ανώτερους οργανισµούς. Πολύ πρόσφατες µελέτες ανέδειξαν την ύπαρξη νιτροζυλιοµένων λιπαρών οξέωνστο αίµα ανθρώπων. Η ύπαρξη αυτών των µορίων πιθανότατα να οφείλεται στην οξείδωση των λιποειδών από την ρίζα. ΝΟ 2.Τα εν λόγο λιπαρά οξέα φαίνεται να δρουν σαν αντιφλεγµονώδη αναστέλλοντας τη παραγωγή κυτταροκινών

11 Απλά λιποειδή (Ουδέτερα) VII Εικοσανοειδή Ειδική οµάδα των λιπαρών οξέων αποτελούν τα εικοσανοειδή,, τα οποία είναι τα παράγωγα του αραχιδονικού οξέος. Μέλη της οµάδας είναι οι προσταγλανδίνες, οι οποίες ελέγχουν τη φλεγµονή,, τη ρύθµιση των ορµονών, τη συσσώρευση των αιµοπεταλίων και τη κυτταρική ανάπτυξη Τα θροµβοξάνια,, τα οποία πήραν το όνοµά τους από τα θροµβοκύτταρα (αιµοπετάλια), και ρυθµίζουν τη συσσώρευση των αιµοπεταλίων Τα λευκοτριένια που ρυθµίζουν τη φλεγµονώδη απόκριση Τα ενδοκανναβινοειδήτα οποία ρυθµίζουν λειτουργίες όπως η όρεξη, η διάθεση, η µνήµη και η αίσθηση πόνου Τέλος τα ισοπροστάνια,, τα οποία είναι ένας δείκτης του οξειδωτικού στρες (ποσοτικοποίηση των ανεξέλεγκτων χηµικών και ενζυµικών οξειδώσεων στον οργανισµό)

12 Απλά λιποειδή (Ουδέτερα) VIII

13 Απλά λιποειδή (Ουδέτερα) IX Ακυλο-γλυκερόλες (Ακυλο-γλυκερίδια) Οι ακυλο γλυκερόλεςαποτελούν εστέρες γλυκερόλης µε λιπαρά οξέα. Στην οµάδα ανήκουν και τα γλυκαριναιθερικάκαι και τα γλυκερο-βινυλαιθερικά ανάλογα,, τα οποία στη πρώτη θέση έχουν αιθερικόαντί αντί του εστερικού δεσµού Αν τα ακραία λιπαρά οξέα είναι διαφορετικάµεταξύ τους τότε ο µεσαίος άνθρακαςτης γλυκερόληςαποτελεί στερεογονικό κέντρο.. Στη φύση τα λιποειδή µε σκελετό γλυκερόληςπάντα βρίσκονται στη δοµή L, δηλαδή όταν γραφούν οι υποκαταστάτεςτου του στερεογονικούάνθρακα σε προβολή Fischer, το υδροξύλιο ή ο εστέρας θα βρίσκονται αριστερά (sn- stereospecific numbering).

14 Απλά λιποειδή (Ουδέτερα) X Λιπαρές αλκοόλες-κηροί Εκτός από τις αλκοόλες που ήδη αναφέρθηκαν (οι στερόλες), στην κατηγορία ανήκουν και οι λιπαρές αλκοόλες µε περισσότερα από 10 άτοµα άνθρακα Οι κηροίείναι οι εστέρεςανώτερων λιπαρών οξέωνµε ανώτερες λιπαρές αλκοόλες.. Οι κηροί βρίσκονται στην επιφάνεια των φύλλων και των φρούτων δηµιουργώντας προστατευτικές επιφάνειες. Σε κάποια είδη ψαριών δρουν σαν αποθήκες ενέργειας

15 Κατάταξη λιποειδών

16 Σύνθετα λιποειδή (Πολικά) Ι Τα πολικά λιποειδή είναι τα λιποειδήτα οποία κυρίως απαρτίζουν τις κυτταρικές µεµβράνες Ανάλογα µε την πολική οµάδα που βρίσκεται στο µόριο τους διακρίνονται σε φωσφολιποειδήκαι γλυκολιποειδή.

17 Σύνθετα λιποειδή (Πολικά) ΙΙ Γλυκερινούχαφωσφολιποειδή Φωσφολιποειδή Θεωρούνται παράγωγα του φωσφατιδικού οξέος.. Μια πολική οµάδα (βάση) είναι συνδεδεµένη µε φωσφοδιεστερικόδεσµό δεσµό µε τη φωσφορική οµάδα. Η βάσηείναι αυτή που ονοµατίζει το λιποειδές Σηµαντικά µέλη της οµάδας είναι τα γλυκεριναιθερικάκαι και τα γλυκεροβινυλαιθερικά φωσφολιποειδή (πλασµαλογόνα), τα οποία εµφανίζουν πάρα πολλές βιολογικές δράσεις Ο κυριότερος εκπρόσωπος τους είναι ο Παράγοντας Ενεργοποίησης Αιµοπεταλίων (PAF) PAF). Αποτελεί το δραστικότερο µέχρι σήµερα φλεγµονώδη παράγοντα, ο οποίος εµπλέκεται σε πολλές παθοφυσιολογικές καταστάσεις Τα φωσφολιποειδήµε ελεύθερο το υδροξύλιο της sn 2 θέσης ονοµάζονται λυσο-φωσφολιποειδή ή λύσο ανάλογα,, γιατί προκαλούν λύση των κυτταρικών µεµβρανών Μια ξεχωριστή κατηγορία των φωσφολιποειδώνείναι είναι τα φωσφόνο- λιποειδήστα οποία η φωσφορική οµάδα είναι απευθείας συνδεδεµένηµε µε άνθρακα

18 Σύνθετα λιποειδή (Πολικά) III

19 Σύνθετα λιποειδή (Πολικά) IV Φωσφολιποειδή Γλυκερινούχαφωσφολιποειδή Τα φώσφολιποειδήείναι είναι επαµφοτερίζοντα µόριακαθώς το µόριο τους απαρτίζεται από ένα οξύ (φωσφορικό) και µία βάση συνδεδεµένη σε αυτό Η ιονική µορφή τους παίζει σηµαντικότατο ρόλο τόσο στις αντιδράσεις τουςαλλά και στη χρωµατογραφική συµπεριφορά τους Έτσι η PC είναι ουδέτερη σε p 1-12, 12, η PE είναι ουδέτερη σε p 2-7 και αρνητικά φορτισµένη σε p 7-10, η PS είναι ουδέτερη σε p<4,5και αρνητικά φορτισµένη σε p 7, ενώ η PI και τα φωσφορυλιωµέναανάλογά ανάλογά της είναι πάντα αρνητικά φορτισµένη

20 Σύνθετα λιποειδή (Πολικά) V Φωσφολιποειδή Σφιγγοσινούχα φωσφολιποειδή Τα φώσφολιποειδήαυτά αντί για σκελετό γλυκερόλης έχουν σκελετό αµιναλκοόληςµε µε 16 έως 20 άτοµα άνθρακα Τα κυριότερα µόρια είναι η σφιγγοσίνηκαι η διυδροσφιγγοσίνηστα στα θηλαστικά και η φυτοσφιγγοσίνηκαι η διυδρο-φυτοσφιγγοσίνηστα στα φυτά. Η αµινοµάδατων σφιγγοσινώνβρίσκεται σχεδόν πάντα συνδεδεµένη µέσω αµιδικούδεσµού δεσµού µε ένα λιπαρό οξύσχηµατίζοντας ένα κηραµίδιο Εάν το ακραίο υδροξύλιο των κηραµιδίωνείναι εστεροποιηµένοµε µε φωσφοχολίνητότε ονοµάζονται σφιγγοµυελίνες,, από τα µυελινικά έλυτρατων των νεύρων όπου αυτά απαντώνται

21 Σύνθετα λιποειδή (Πολικά) VI

22 Σύνθετα λιποειδή (Πολικά) VII Γλυκολιποειδή Γλυκερινούχαγλυκολιποειδή: Είναι οι 1,2 διακυλο-γλυκερόλες,, οι οποίες στην sn 3θέση είναι υποκατεστηµένες µε ένα µόνο ή ολιγο-σακχαρίτη.. Απαντώνται κυρίως στα βακτήρια αλλά έχουν βρεθεί σε θηλαστικά και φυτά Σφιγγοσινούχα γλυκολιποειδή: Παράγωγα των κηραµιδίων: κερεβροζίτες (αν είναι υποκατεστηµένο µε ένα σάκχαρο), γαγγλιο-(δι,τρι,τετρα δι,τρι,τετρα-) οζυλο-κηραµίδια: : τα κηραµίδιατα οποία είναι συνδεδεµένα µε δι, τριή τετρα -σακχαρίτη αντίστοιχα Γαλακτοκερεβροζίτες: Κερεβροζίτεςυποκατεστηµένοι µε γαλακτόζη ή οποία στην 3 θέση της είναι εστεροποιηµένη µε θειικό οξύ (θειόλες). Αποτελούν το 20% των κερεβροζιτών της λευκής ουσίας του εγκεφάλου Γαγγλιοζίτες: Κηραµίδιασυνδεδεµένα µε ένα ολιγο- σακχαρίτη (1-2 µόρια γλυκόζης και γαλακτόζης), 1 µόριο Ν- ακετυλο-γαλακτοζαµίνης και 1-3 µόρια Ν-ακετυλο- νευραµινικού οξέος (σιαλικό οξύ).

23 Σύνθετα λιποειδή (Πολικά) VIII Γλυκολιποειδές ελαιολάδου µε αντι-paf δράση C S 2 C 3 CC 3 2 S 2 S 2 S C 3 NCC 3 C 3 NCC 3 C 3 NCC 3 NCC 3 Γλυκολιποειδές αποβλήτων ελαιουργίας µε αντι-paf δράση C 3 γαλακτοκερεβροζίτης 3 C C 3 C 3 C 3 S C 3 C 3

24 Πειραµατική µελέτη λιποειδών ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΣΤΑ ΙΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΟΙΟΤΙΚΟΙ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΙ Χηµικές, φυσικοχηµικές και ενζυµικές µέθοδοι ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ

25 Αποµόνωση (Εκχύλιση) Το πρώτο βήµαγια τη µελέτη των λιποειδών είναι η εκχύλισή τουςαπό το βιολογικό δείγµα (ιστός φυτικός ή ζωικός, κύτταρα) Με την εκχύλιση θα πρέπει a) Να παραληφθούν ποσοτικά τα περιεχόµενα λιποειδή b) Να µη διασπαστούν, υδρολυθούν,οξειδωθούν, οξειδωθούν, αποδοµηθούν γενικότερα c) Να αποφευχθούν οι προσµίξειςαπό άλλα βιοµόρια,, τα οποία µπορεί να επηρεάσουν τη µελέτη αλλά και τη βιολογική δραστικότητα των δειγµάτων Εκτός από τα παραπάνω χαρακτηριστικά η µέθοδος εκχύλισης θα πρέπει να ξεπερνά κάποια προβλήµατα που ανακύπτουν κατά την εκχύλιση των λιποειδών

26 Προβλήµατα Εκχύλισης Προβλήµατα εκχύλισης Σύνδεση λιποειδών µε οµοιοπολικούς/ µη οµοιοπολικούς δεσµούςµε µε πρωτεΐνες και υδατάνθρακες Τρόπος αντιµετώπισης Εκχύλιση µε πολικούς διαλύτες (αλκοόλες) οι οποίοι αποδιατάσσουν τις πρωτεΐνεςκαι διασπούν τους δεσµούς υδρογόνου. Για τη διάσπαση των οµοιοπολικών δεσµών χρησιµοποιείται είτε οξύ ή άλκαλι Παραλαβή µη λιποειδικών ενώσεων (αµινοξέα, σάκχαρα) στους οργανικούς διαλύτες εκχύλισης, λόγο ιονικών αλληλεπιδράσεων µε τα πολικά λιποειδή Οξείδωσηπολυακόρεστων λιπαρών οξέων (αυτοξείδωση, κατάλυση από µέταλλα µεταπτώσεως) ηµιουργία σταθερών γαλακτωµάτων από το ενυπάρχον νερό ιαφορετική πολικότητα-διαλυτότητα λιποειδών Κάποιοι ιστοί περιέχουν υδρολυτικά ένζυµατα οποία είναι σταθεράκαι δραστικά ακόµα και σε οργανικούς διαλύτες Έκπλυση οργανικής φάσης µε την υδατική φάσηή καθαρισµός µε χρωµατογραφικές τεχνικές Εκχύλιση και αποθήκευση σε ατµόσφαιρα Ν 2, χαµηλές θερµοκρασίεςαποθήκευσης, αποθήκευσης, σε σκουρόχρωµες φιάλες,, χρήση αντιοξειδωτικών Αφυδάτωση του ιστούπριν την εκχύλιση. Πιθανότητα µη αντιστρεπτής δέσµευσης λιποειδών Χρήση διαλυτώνδιαφορετικής διαφορετικής πολικότητας ή/και µείγµατα πολικών και ουδετέρων Βρασµός του ιστού,, για αποδιάταξη πρωτεϊνών

27 Μέθοδοι εκχύλισης λιποειδών Μέθοδος Bloor (1928): Μείγµα αιθανόλης/ διαιθυλαιθέρα 1:3 (v/v), βρασµόςµε µε επαναρροή (θ: ο C) για την εκχύλιση λιποειδών αίµατος. Η µέθοδος είχε µικρή ανάκτησηλιποειδών µε ταυτόχρονη διάσπαση και οξείδωσήτους χηµικώς και ενζυµικώς Μέθοδος Folch (1957): Οµογενοποίησητου ιστού µε µείγµα χλωροφορµίου(c) C)/ µεθανόλης(m) 2:1 (v/v), αποµάκρυνση αδιάλυτων µε φυγοκέντρηση. Στη συνέχεια προστίθενται 0,2 V NaCl 0,9%, σχηµατισµός διφασικού και παραλαβή της κάτω φάσης Μέθοδος Bligh-Dyer (1959): Παραλλαγή της Folchστην οποία υπολογίζεται το νερό(w) (W)που υπάρχει στο δείγµα και προστίθεταικατάλληλη ποσότητα διαλυτών έως αναλογίας C/M/W: 1:2:0,8 (v/vv), στη συνέχεια µετατροπή σε διφασικό µε προσθήκη C,W για C/M/W: 1:1:0, :0,9

28 Μέθοδοι διαχωρισµού λιποειδών Μετά την εκχύλιση των λιποειδών ακολουθεί διαχωρισµόςτους σε τάξεις (Ουδέτερα, Πολικά λιποειδή), στη συνέχεια κατά είδη (π.χ. φωσφατιδυλοχολίνη, φωσφατιδυλοαιθανολαµίνη) ενώ µπορούν να ακολουθήσουν διαχωρισµοί έως την ανάκτησητων προς ανάλυση λιποειδών όσο το δυνατόν καθαρότερων. Οι µέθοδοι διαχωρισµού των λιποειδών είναι: A. Κλασµάτωση µε διαλύτες Καταβύθιση µε ακετόνη Κατανοµή κατ άντιρροή B. Χρωµατογραφικές µέθοδοι Χρωµατογραφία στήλης Χρωµατογραφία χάρτου Χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας Υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης (PLC) Αέρια χρωµατογραφία (GC)

29 Κλασµάτωσηµε µε διαλύτες Καταβύθιση µε ακετόνη Η προσθήκη ακετόνης σε δείγµα ολικών λιποειδών (Total Lipids, TL) διαλυτοποιεί τα Ουδέτερα Λιποειδή (Neutral Lipids, NL), ενώ τα Πολικά Λιποειδή (Polar lipids, PL) καταβυθίζονταικαι και µπορούν να διαχωριστούν µε µια απλή φυγοκέντρηση.. Στο ίζηµαπεριέχεται το 95% του ολικού φωσφόρου Κατανοµή κατ αντιρροή Το µείγµα κατανέµεται µεταξύ δύο µη αναµιγνυοµένων φάσεων, µίας πολικήςκαι και µιας άπολης.. Έχουν χρησιµοποιηθεί διάφορα διφασικά συστήµατα.στο εργαστήριο χρησιµοποιείται το σύστηµα PE-EtEt 87%,µε την τεχνική του λουτρού,, όπου µόνο µια από της 2 φάσεις ανανεώνεται. Οι µέθοδοι αυτοί είναι για αρχικούς χόνδρο-διαχωρισµούςδιαχωρισµούς (παρασκευαστικούς), και πρέπει να ακολουθήσει µια χρωµατογραφική µέθοδος διαχωρισµού

30 ΧρωµατογραφικέςΜέθοδοιΙ Χρωµατογραφία στήλης Χρησιµοποιείται για το διαχωρισµό σε παρασκευαστική κλίµακα (>250mg) Η στατική φάση που χρησιµοποιείται καθορίζει το φυσικοχηµικό φαινόµενο στο οποίο βασίζεται ο διαχωρισµός, το οποίο µπορεί να είναι: Προσρόφηση Ιοντανταλλαγή Κατανοµή Μοριακή διήθηση

31 ΧρωµατογραφικέςΜέθοδοιΙΙ Α) Προσρόφηση Η στατική φάσηείναι κάποιο προσροφητικό υλικόκαι και οι ενώσεις διαχωρίζονται µε βάση τη σχετική πολικότητά τους Προσροφητικά υλικάείναι: Al 3, Mg, Mg 3 Siκαι το πυριτικό οξύ ([Si x () 4-2x 2x] n ), το οποίο φαίνεται να είναι το δραστικότερο Το πυριτικό οξύεµφανίζει και φαινόµενα ιοντανταλλαγής (τα όξινα PL εκλούνται πρώτααν αν και πολικότερα) Η έκλουσητης στήλης γίνεται µε αυξανοµένης πολικότητας διαλύτεςοπότε εκλούονταιπρώτα τα µη πολικάκαι και στη συνέχεια τα πολικά

32 ΧρωµατογραφικέςΜέθοδοιΙΙΙ Β) Ιοντανταλλαγή Ο Ο διαχωρισµός βασίζεται στη διαφορετική συγγένειαφορτισµένων ιόντων ή µορίων µε αδρανείς φορτισµένες στατικές φάσεις Χρησιµοποιούνται κυρίως ασθενείς ανιοναταλλακτικές ρητίνεςπου έχουν πολυσακχαρικόσκελετό σκελετό ύστερα από επεξεργασία των υδροξυλίων τους Η ιονανταλλαγή χρησιµοποιείταικυρίως για το διαχωρισµό των PLσε τάξεις

33 ΧρωµατογραφικέςΜέθοδοι IV Γ) Μοριακή διήθηση Ο διαχωρισµός βασίζεται στο διαφορετικό στερεοχηµικό µέγεθος των µορίων Οι στατικές φάσεις που χρησιµοποιούνται είναι: το διακλαδισµένο πολυστυρένιοκαι η hydroxypropyl- Sephadex ) Ανίχνευση Η ανίχνευση των ενώσεων µπορεί να γίνει µε συλλογή κλασµάτωνκαι και χηµικούς προσδιορισµούς, είτε µε ανιχνευτή UV ή δείκτη διάθλασηςενωµένο µε την έξοδο της στήλης

34 ΧρωµατογραφικέςΜέθοδοι V Εφαρµογές της χρωµατογραφίας στήλης Στήλη πυριτικού οξέος ιαχωρισµός των TL σε NL, GL, PL, µε διαδοχική έκλουσητης στήλης µε χλωροφόρµιο, ακετόνη, µεθανόλη.. Η σειρά έκλουσης είναι: C>Wax>St.E>TG> >TG>F.Alc>F.A>St>DG>MG> >F.A>St>DG>MG>Cereb>GL>PE>L- PE>PC>SM>L-PCPC ιαχωρισµός NLσε τάξειςµε συστήµατα έκλουσης αυξανοµένης αναλογίας διαιθυλαιθέρα σε πετρελαϊκό αιθέρα ιαχωρισµός PLσε τάξειςµε συστήµατα έκλουσης αυξανοµένης αναλογίας µεθανόλης σε χλωροφόρµιο

35 ΧρωµατογραφικέςΜέθοδοι VI Στήλη Al 3 ιαχωρισµός χολινούχωναπό µη χολινούχα PL. Τα επαµφοτερίζοντα (PC) PC)δεν συγκρατούνται, ενώ τα όξινα απορροφώνται ισχυρά.. Σειρά έκλουσης PC> L-PC> SM>PE>L-PE Στήλη ιονοανταλλαγής ιαχωρισµόςόξινων όξινων γλυκοσφιγγολιποειδών (γαγγλιοζίτες, σουλφατίδια) ) από ουδέτερα (κηραµίδια)) σε στήλη

36 ΧρωµατογραφικέςΜέθοδοι VII Εκχύλιση στερεάς φάσης Ταυτόχρονη εκχύλιση, κλασµάτωσηκαι και διαχωρισµός λιποειδών,, έτσι τείνει να αντικαταστήσει της κλασσικές τεχνικές Πλεονεκτήµατα: 1) ευέλικτη,, 2) αυξηµένη ανάκτηση λιποειδών,, 3) αυξηµένη διαχωριστική ικανότητα για ειδικές περιπτώσεις, 4)µειωµένος χρόνος ανάλυσης,, 5)µε κατάλληλη συσκευή κενού διαχωρίζονται πολλά δείγµατα µαζί Μειονεκτήµατα: 1) µικρότερες ποσότητες δείγµατος, 2) προσµίξειςαπό το πλαστικό της σύριγγας,, 3)ατελής συνολική διαχωριστική ικανότητα

37 ΧρωµατογραφικέςΜέθοδοι VIII Χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας Η ευρύτερα διαδεδοµένη χρωµατογραφική τεχνικήκαι και µέθοδος ρουτίνας για το διαχωρισµό και ποιοτικό προσδιορισµό µίγµατος λιποειδών Εύκολη µέθοδος,, γρήγορη, πολύ καλή διαχωριστική ικανότητα και φτηνή Συνήθως χρησιµοποιούνται τα ίδια υλικά µε τη χρωµατογρ.. στήλης Σε αυτά τα προσροφητικά υλικά µπορεί να ενσωµατωθούνκαι άλλα συστατικά τα οποία επιτρέπουν συγκεκριµένους διαχωρισµούς όπως: Α) Argentation chromatography: Η στατική φάση περιέχει 5-10% AgN 3 οπότε σχηµατίζονται κατά την ανάπτυξη σύµπλοκατων ακόρεστων δεσµών µε τα ιόντα Ag+, δηλαδή διαχωρίζονται µε βάση την ακορεστότητα τους Β) Βορικό οξύ: : Σχηµατίζονται σύµπλοκαµεταξύ µεταξύ των πολύ-υδροξυ - λιποειδώνκαι της στατικής φάσης, δηλαδή µπορούν να διαχωριστούν τα MG, DGκαι GL Εκτός από το φαινόµενο της προσρόφησης εµφανίζεται και κατανοµή καθώς υπάρχει ένα λεπτό στρώµα διαλυτών προσροφηµένο στη στέρεα φάση

38 ΧρωµατογραφικέςΜέθοδοι IX Χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας Τεχνικές/ Συστήµατα έκλουσης Υπάρχουν ουδέτερα, όξινα και βασικά συστήµατα έκλουσης Στα NL χρησιµοποιούνται άπολοι διαλύτεςµίγµατα PE/Ether/Ac, ενώ για τα PLχρησιµοποιούνται µείγµατα πιο πολικών διαλυτών όπως C/M/W ύο διαστάσεων TLC (2D):Τα TL µπορούν αρχικά να αναπτυχθούν (κατά την µία διάσταση) σε πολικό σύστηµα και να διαχωριστούν τα PL, ενώ τα NLθα πάνε στο µέτωπο. Η ίδια πλάκα στη συνέχεια µπορεί να αναπτυχθεί (κατά την άλλη διάσταση) µε ένα άπολο σύστηµακαι να διαχωριστούν τα NLενώ τα PL να παραµείνουν στη θέση τους Οι αναλυτικές TLC έχουν πάχος 0,25mmκαι διαχωρίζουν 1-2mg λιποειδών ενώ οι παρασκευαστικές έχουν πάχος 1-2mm mmκαι διαχωρίζουν έως και 50mg λιποειδών Τα διαχωρισµένα λιποειδή µπορούν να παραληφθούν µε απόξεση του πυριτικού οξέος και εκχύλισης του κατά Bligh-Dyer

39 Χρωµατογραφικές Μέθοδοι X PE/Ether/Ac (80:20:1) C FAME TG C/M/W (65:25:4) 1) C/M/N3 (65/35/4) 2) But/Ac/W (60/20/20) NL CL PA F.A R Chol 1,3DG 1,2DG MG PS PE PI PC SM LPC

40 Χρωµατογραφικές Μέθοδοι XI Ανίχνευση λιποειδών στη TLC Είτε από το χρώµα των λιποειδώνή από το φθορισµότους σε λάµπα UV Ψεκασµός µε αντιδραστήριοκαι εµφάνιση του χρώµατος που προκύπτει. Τα αντιδραστήρια µπορεί να είναι καταστροφικά ή µη και γενικά ή ειδικά για συγκεκριµένα λιποειδή Γενικά αντιδραστήρια εµφάνισης Αντίδραση 2 S 4 50%, Θ Απανθράκωση λιποειδων Ατµοί Ι 2 Ειδικά αντιδραστήρια εµφάνισης Μολυβδαινικό αµµώνιο 2,7- dichlorofluoresc ein Νινυδρίνη Dragendorff Κυρίως τα ακόρεστα Επίδραση στα λιποειδή Καταστροφική Μη καταστροφική Αντίδραση µε P, PL Καταστροφική Κάτω απο UV Κίτρινα τα NL Αµινολιποειδή, αντιδρά µε αµινοµάδες Μη καταστροφική Καταστροφική PL, µε χολίνη Καταστροφική Α-ναφθόλη, ναφθόλη,θ GL µπλε-ιώδες,, PL κίτρινα,, Chol κόκκινο Καταστροφική

41 Χρωµατογραφικές Μέθοδοι XΙI Υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης (PLC) Μεγάλη διαχωριστική ικανότητα Η αρχή µεθόδου του διαχωρισµού είναιίδια ίδια µε τις υπόλοιπες χρωµατογραφίες Θα πρέπει να έχει γίνει ένας πρώτος διαχωρισµόςτου δείγµατος πριν την ανάλυσητου µε PLC Οι στήλες πυριτικού οξέος και τα παράγωγά τους χρησιµοποιούνται για το διαχωρισµό των NL και PL Οι στήλες ανάστροφης φάσηςδιαχωρίζουν τις διάφορες τάξειςµορίων σε µοριακά είδη Ανίχνευση µε UV ( nm) nm),όπου απορροφούν οι ακόρεστοι δεσµοί.

42 Χρωµατογραφικές Μέθοδοι XΙΙI

43 Χρωµατογραφικές Μέθοδοι XΙV Αέρια-Υγρή Χρωµατογραφία GLC ή GC ιαχωρίζονται πτητικές ενώσεις,, λόγο της διαφορετικής κατανοµής ή προσρόφησήςτους µεταξύ µιας υγρής φάσης ακινητοποιηµένηςσε αδρανές στερεό υπόστρωµα και µιας κινητής αέριας φάσης Στατικές φάσεις: Χρησιµοποιούνται τριχοειδείς στήλεςαπό γυαλί ή µέταλλο,, πάνω στις οποίες είναι ακινητοποιηµένοι Cή ή πολυεστέρες χαµηλής ή υψηλής πυκνότητας. Οι στήλες φτάνουν σε µήκος ακόµα και τα 50m αυξάνοντας δραµατικά τη διαχωριστική ικανότητα τους Ανιχνευτές: Θερµικής αγωγιµότητας (Μη καταστροφικός)και και FID, ο οποίος είναι ο πιο διαδεδοµένος (Καταστροφική) Στην GC είναι απαραίτητη η προσθήκη εσωτερικού προτύπου Εφαρµογές Προσδιορισµός των FAσαν FAME (µετεστεροποίηση) Προσδιορισµός R, RCύστερα από µετατροπή τους σε πτητικά παράγωγα Μετατροπή των σακχάρων σε TMS παράγωγα Η ταυτοποίηση µιας ένωσης γίνεται αποτελεσµατικότερη µε συνδυασµό GC-MS

44 Χρωµατογραφικές Μέθοδοι XV

45 ΠΟΙΟΤΙΚΟΙ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΙ Ι Μετά το καθαρισµό-αποµόνωσητων λιποειδών ακολουθούν οι αναλύσεις για την αποσαφήνιση της δοµής τους Ο προσδιορισµός της δοµήςαλλά και ο ποσοτικός προσδιορισµόςενός λιποειδούς γίνεται µε τρείς κυρίως τρόπους: Α) Με τις προαναφερθείσες χρωµατογραφικές τεχνικές Β) Χηµικούς/Ενζυµικούς προσδιορισµούςοι οι οποίοι βασίζονται κυρίως στη διάσπαση των λιποειδώνστα δοµικά συστατικάτους τους και ανάλυση αυτών Γ) Φυσικοχηµικές τεχνικές (UV-Vis, Vis, IR, NMR, MS) Για να χαρακτηριστεί πλήρωςένα λιποειδές συνήθως χρειάζεται συνδυασµός των παραπάνω µεθόδων

46 Β) Χηµικοί προσδιορισµοί (Ι) Ξηρό βάρος: Λόγο αδυναµίας υπολογισµού του ΜΒπολλών λιποειδών τις περισσότερες φορές εκφράζονται σαν w/wαρχικού εκχυλίσµατος. Προβλήµατα λόγω συγκράτησης νερού ή διάσπασης. Προσδιορισµοί P: Το λιποειδές καίγεται µε CI 4 οπότε ο «οργανικός» φώσφορος µετατρέπεται σε «ανόργανο» (φωσφορικό ιόν, P 3-4 ) 3ΝΗ ΜοΟ P (N 4 ) 3 PMo ANSA Κυανούν του φωσφοµολυβδαινίου (Α:820nm)

47 Β) Χηµικοί προσδιορισµοί (ΙΙ) Προσδιορισµός εστέρων R R R ΝΗ 2 ΟΗ, ΟΗ C, 1min R N Υδροξαµικό οξύ Fe(Cl 4 ) 3, Cl C, 1min (RCN 2 ) 3 Fe A: 530nm Άλλοι προσδιορισµοί: αζώτου, θείου, σακχάρων, αµινοµάδων, χολίνης, γλυκεριναιθέρων, πλασµαλογόνων, χοληστερόλης, ακορεστότητας, γλυκερόλης, αριθµός I 2

48 Β) Χηµικοί προσδιορισµοί (ΙΙΙ) Υδρολύσεις Είδη δεσµών: Εστερικοί Αµιδικοί Αιθερικοί Βινυλαιθερικοί Φωσφοεστερικοί Γλυκοζιτικοί Οι δεσµοί αυτοί υδρολύονταιείτε χηµικά ή ενζυµικά Α) Χηµικές Ήπια αλκαλική και όξινη Ισχυρή αλκαλική και όξινη Β) Ενζυµικές Λιπάσες Φώσφολιπάσες

49 Χηµικοί προσδιορισµοί (IV) Ήπια αλκαλική υδρόλυση ιάσπαση εστερικών δεσµών µε αλκοολικό διάλυµα αλκαλίων Όχι πολύ υψηλές Θ R 1 Τριακυλο-γλυκερόλες Κηροί R R R ΚΟΗ 0.5Ν 30min 100 o C ΚΟΗ R 2Ν 2 R 1 60min 100 o C P X - K + + Γλυκερινούχα φωσφολιποειδή R 1 + R - K + + Οργ. R Υδ. R 2 Οργ. R Οργ. R 2 Υδ. R 1 - K + R 2 P X ΚΟΗ 0,02Ν min o C P X ΟΗ - + R + - K + Υδ. P X P X P ΟΗ - X P X

50 Χηµικοί προσδιορισµοί (V) Ήπια αλκαλική υδρόλυση R 1 R 2 Υδατική + R - K + P X P X P X R R 1 1 R 1 R 2 ΟΗ - P X P X R 3 R 3 R 3 R 1 N R 2 N R 2 + N R 2 P X P X P X P X

51 Χηµικοί προσδιορισµοί (VI) Ισχυρή αλκαλική υδρόλυση R R R Οργ Βα(ΟΗ) 2 N R h 100 o C P X N 2 + P X (RC) 2 Ba Υδατ. N 2 P X (RC) 2 Ba 2 2Ν Cl 4h R R P X 100 o C N R λίγο N 2 P X

52 Χηµικοί προσδιορισµοί (VII) R 1 R 2 P X Cl 6N 4h 100 o C R 1 + ή P X + P X R 1 P + X Όξινη υδρόλυση C C R 1 R 2 0,25mM gcl 2 Cl 0,5N, 1h C C 2 R 1 R 2 R 2 + R 1 C 2 C P X P X P X R 1 R 2 I 6N 8h 100 o C + R 1 I P+ X + + R 2 C P X R R R Οργα. N R 2 + N R 2 + Sugar N P R 2 X Sugar Υδατ. Sugar

53 Ενζυµικέςυδρολύσεις υδρολύσεις (Ι) Η ενζυµικήδιάσπαση των λιποειδών γίνεται σε συγκεκριµένους δεσµούςκαι θέσειςτων λιποειδών, αποτελεί δηλαδή ένα χρησιµότατο εργαλείοστην ανάλυσή τους Λιπάσες: : Παραλαµβάνονται από φυτά (σπόροι σιταριού) ή ζωικές (παγκρεατική λιπάση). Υδρολύουναρχικά τα ακραία FA των TG. Επιδρά σε γαλακτώµατα και απαιτεί ασβέστιο Φωσφολιπάσες: Φωσφοδιεστεράσεςοι οι τέσσερεις κυριότερες είναι: Α 1, Α 2, C, DΗ PLBείναι µίγµα των Α 1 και Α 2. Η PLA 2 απαντάται σε δηλητήρια φιδιών και µελισσών. Υδρολύειτα FAτης sn-2 θέσης,, λειτουργεί σε γαλακτώµατα, ενώ η προσθήκη αιθέρα βελτιώνει τη δράση της Η PLC ( Bacillus cereus) καταλύει την υδρόλυση του εστερικούδεσµού µεταξύ της φωσφορικής οµάδας και της γλυκερόλης. Υπάρχουν διαφορετικές PLC για τις διαφορετικές πολικές κεφαλές. Η PLD έχει δύο δράσεις: 1) ράση φωσφοδιεστεράσης: : Χρησιµοποιείται για δοµικές αναλύσεις, 2)τρανσφωσφατιδυλίωση τρανσφωσφατιδυλίωση: : ανταλλαγή βάσης µε αλκοόλες

54 UV-Vis Vis ΙR NMR MS Φυσικοχηµικές Τεχνικές Ι Κυρίως χρησιµοποιείται στους ανιχνευτές Απορροφούν οι δ.δ,, οι καρβονυλικές ενώσεις και το ΝΟ 2 Χαρακτηριστικές απορροφήσεις σε cm - 1 : (µεγάλη C 2, C 3 ) καρβονυλικές οµάδες 3620 C- από χοληστερόλη 1710 C=, από καρβοξυλοµάδα F.A 1640 N-C, από σφιγγολιποειδή 3020 C=C P=, φωσφολιποειδή 970 χολίνη Εύρεση δοµής από τη διάσχιση των κορυφών, ενώ µε την ολοκλήρωσή τους ποσοτικοποιούνται τα αποτελέσµατα Μη καταστροφική µέθοδος Μελέτη αλληλεπιδράσεων των λιποειδών µε τα υπόλοιπα βιοµόρια Τα µόρια ιονίζονται µε την εκάστοτε χρησιµοποιούµενη µέθοδο, ενώ στη συνέχεια τα ιόντα οδηγούνται σε ένα ηλεκτροµαγνητικό πεδίο όπου τα ιόντα διαχωρίζονται βάση του λόγου: µάζα/φορτίο (m/z) Ευρείες εφαρµογές όταν συνδυάζεται µε GCκαι PLC, και τη µέθοδο του Single Ion Monitoring

55 Φυσικοχηµικές Τεχνικές ΙΙ Φασµατοφωτοµετρία IR NMR

56 Τα λιποειδή της Tetrahymena pyriformis Ι ιακρίνονται σε δοµικά λιποειδή των µεµβρανών (δηλαδή κυρίως PL)και απόθετα λιποειδή (κυρίως NL)τα οποία συσσωρεύονται µε τη µορφή σταγονιδίων στο οξύ άκρο του πρωτοζώου Τα λιποειδή αποτελούν το 8-24% του ξηρού βάρους.. Η διακύµανση αυτή καθώς και η σύσταση των λιποειδών εξαρτάται από την ηλικία της καλλιέργειας.. Τα λιποειδή αυξάνονται στη λογαριθµική φάση και τη πρώιµη στάσιµη, ενώ µειώνονται στη συνέχεια Τα λιποειδή της Tetrahymenaεκτός από την ηλικία, επηρεάζονται και από τις περιβαλλοντικές συνθήκες, η µείωση της θερµοκρασίας οδηγεί σε αύξηση των φωσφονο- λιποειδών, µείωση της PEαλλά και αύξηση των ακόρεστων F.A

57 Τα λιποειδή της Tetrahymena pyriformis ΙΙ Το συνολικό λιποειδικό εκχύλισµα της Tetrahymena pyriformisστη λογαριθµική φάση από 30% NLκαι 70% PL Ουδέτερα λιποειδή: : Το 90% των λιποειδών είναι TG. Ακολουθούν οι ουβικινόνες, άλλα λιγότερο συνηθισµένα λιποειδή, όπως η τετραϋµανόλη, µία στερόλη µοναδική στο πρωτόζωο Η στερόλη βρίσκεται κυρίως στις βλεφαρίδες και τα µιτοχόνδρια, σταθεροποιώντας τα Λιπαρά οξέα: : Τα ακόρεστα FAαποτελούν πάνω από το 50% τους µε κυριότερα (ελαϊκό, λινελαϊκό, γ-λινολενικό), τα οποία βρίσκονται κυρίως στα PL. Τα κυριότερα κορεσµένα είναι το µυριστικό και το παλµιτικό) Πολικά λιποειδή: Φωσφατιδυλοχολίνη (30%), φωσφατιδυλοαιθανολαµίνη (38%), αµινοαιθυλοφωσφονο-γλυκερίδια (23%), καρδιολοπίνη (3,5%), αµινοαιθυλοφωσφονο-κηραµίδια (5%) Τα φωσφονο-λιποειδή ανακαλύφθηκαν πρώτα στη Tetrahymena pyriformis και απαντώνται κυρίως γύρω από τις βλεφαρίδες

58 Εργαστηριακή άσκηση (Ι) Καλλιέργεια Tetrahymena pyriformis 200mL 500 xg 15 min Έκπλυση κυττάρων 200 ml Φ.Ο 500 xg 15 min Αναδιασπορά 20 ml Φ.Ο 45 ml εξάτµιση µέχρι ξηρού (flash evaporator) 5 ml θα φυλαχθούν για TLC ΕΙΓΜΑ TL Αραίωση στα 50 ml Bligh-Dyer ιφασικό σύστηµα, Παραλαβή χλωροφορµικής φάσης

59 Εργαστηριακή άσκηση (ΙΙ) TL (από flash evaporator) Κατανοµή κατ αντιρροή PL (25mL) NL (10mL) TLC (2mL) Χηµική Υδρόλυση (21,9mL) Προσδιορισµός P (0,1 και 1 ml) Ενζυµική Υδρόλυση TLC (2mL) Ενζυµική Υδρόλυση (8mL) Υδατική φάση (25 ml) Οργανική φάση (25 ml) TLC Προσδιορισµός P (0,1 και 1 ml) TLC (3mL) Προσδιορισµός P (0,1 και 1 ml)

60 Βιβλιογραφία Βασική Βιοχηµεία, ηµόπουλος, Κ.Α., Αντωνοπούλου, Σ., 2 η Έκδοση, Αθήνα, 2009 The lipid handbook, Editors: Gunstone, F.D., arwood, J.L., Dijkstra, A.L., 3 rd Edition, CRC press, London New York, USA Πειραµατική Βιοχηµεία, Clark, J.M., Switzer, R.L., Μετάφραση: Παπαδόπουλος, Γ., Παπαδόπουλος, Μ., Πανεπιστηµιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο 1992

61 ιαδικτυακοί τό οι Lipid Library: Lipid Maps: Ιστοσελίδα Τµήµατος Χηµείας: