Isolation and Detection of Alloiococcus Otitidis in Children with Otitis Media with Effusion Using Culture and PCR Methods

Transcript

1 Isolation and Detection of Alloiococcus Otitidis in Children with Otitis Media with Effusion Using Culture and PCR Methods Farzaneh Gharibpour 1, Seyed Sajjad Khoramrooz 2, Akbar Mirsalehian 3, Mohammad Emaneini 3, Fereshteh Jabalameli 3, Davood Darban-Sarokhalil 4, Asghar Sharifi 1, Mehdi Mirzaii 5 1 School of veterinary Mrdicine, Shiraz University, Shiraz, Iran 2 Medicinal Plants Research Center, Yasuj University of Medical Sciences, Yasuj, Iran 3 Department of Microbiology, School of Medicine, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran 4 Department of Microbiology, School of Medicine, Alborz University of Medical Sciences, Karaj, Iran 5 Faculty of Medicine, Shahroud University of Medical Sciences, Shahroud, Iran (Received January 22, 2013 ; Accepted May 5, 2013) Abstract Background and purpose: Otitis media with effusion (OME) is one of the major childhood diseases. Alloiococcus otitidis as an agent of OME is a fastidious organism. The aim of this study was to determine the prevalence of A. Otitidis in children with OME using culture and PCR methods. Materials and methods: A total of 65 specimens of middle ear effusions were obtained from 50 children diagnosed with OME under general anesthesia in operation room. PCR and bacterial culture methods were used for detection and isolation of A. otitidis. Antimicrobial susceptibility of bacterial isolates was determined by disk agar diffusion (DAD) method. Results: The patients included 45 male and five female. A. otitidis were isolated from 15 (23.07%) cases using culture and 26 (40%) patients through PCR. All the isolates were susceptible to amoxicillin and amoxicillin/ clavulanate. Whereas most of the isolates were resistant to Macrolides such as Erythromycins and Azithromycin. Conclusion: A. otitidis is one of the most important bacterial agents of OME in Iranian children. Considering the antibiogram susceptibility pattern, we can propose these antibiotics as the drugs of choice for the treatment of OME patients. Also, this study showed that PCR is more sensitive than culture method for identification of this bacterium. Keywords: Otitis media with effusion (OME), Alloiococcus otitidis, culture, PCR J Mazand Univ Med Sci 2013; 23(100): (Persian). 51

2 پژوهشي مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران دوره بيست و سوم شماره 100 ارديبهشت سال (52-60) 1392 جداسازي و شناسايي آلويوكوكوس اوتيتيديس در كودكان مبتلا به عفونت گوش مياني همراه با ترشحات با روش كشت و PCR چكيده 1 فرزانه غريب پور 2 سيد سجاد خرم روز 3 اكبر ميرصالحيان 3 محمد ايمان عيني 3 فرشته جبل عاملي 4 داود دربان ساروخليل 2 اصغر شريفي 5 مهدي ميرزايي سابقه و هدف : التهاب گوش مياني همراه با ترشحات (OME) Otitis media with effusion يكي از مهمترين بيماريهاي دوران كودكي است. از آنجا كه آلويوكوكوس اوتيتيديس به عنوان يكي از عوامل باكتريايي اين عفونت به علت سخت رشد بودن به ميزان كمي شناسايي شده است. هدف از اين مطالعه بررسي ميزان شيوع اين باكتري كودكان مبتلا به (OME) با روش كشت و PCR بود. مواد و روشها: 65 نمونه كلينيكي ترشحات گوش مياني از 50 كودك مبتلا به عفونت گوش مياني همراه با ترشحات (OME) جمع آوري شد. نمونه ترشحات گوش مياني در اتاق عمل توسط پزشك متخصص جمعآوري و سپس بخشي از نمونهها درآزمايشگاه در محيط كشت جهت رشد باكتريها تلقيح و بر روي بخشي ديگر از نمونهها واكنش زنجيره اي پليمراز PCR انجام شد. باكتريهاي جداشده نيز از لحاظ الگوي مقاومت آنتي بيوتيكي بررسي شدند. يافتهها: از 50 بيمار مبتلا به OME 45 نفر پسر و 5 نفر دختر بودند. آلويوكوكوس اوتيتيديس با روش كشت در 15 مورد (23/07 درصد) و با روش PCR در 26 مورد( 40 درصد) از 65 نمونه ترشحات گوش مياني شناسايي شد. الگوي حساسيت آنتيبيوتيكي نشان داد كه تمام ايزوله ها به آموكسي سيلين آموكسي سيلين/ كلاونات حساس هستند در حاليكه اغلب ايزوله ها (86/6 درصد) به ماكروليدها مثل اريترومايسين و آزيترومايسين مقاوم بودند. استنتاج: آلويوكوكوس اوتيتيديس يكي از عوامل مهم باكتريايي جدا شده از ترشحات گوش مياني در ايران است و با توجه به الگوي حساسيت ميكروبي ميتوان پيشنهاد كرد كه آموكسي سيلين و آموكسي سيلين/ كلاولانات در درمان مورد استفاده قرار بگيرد. همچنين روش PCR در مقايسه با كشت حساسيت بالاتر در شناسايي باكتري دارد. واژه هاي كليدي: عفونت گوش مياني با ترشحات آلويوكوكوس اوتيتيديس كشت PCR مقدمه التهاب گوش مياني به عنوان يكي از مهمترين بيماريهاي دوران كودكي سبب افزايش مراجعه كودكان به پزشك و مصرف زياد آنتيبيوتيكها در اين سنين ميشود. التهاب گوش مياني Otitis Media به دو مو لف مسي ول: سيدسجاد خرم روز- ياسوج: خيابان دكتر قربانعلي جليل جنب بيمارستان امام سجاد دانشكده پزشكي Khoramrooz@gmail.com 1. دانشكده دامپزشكي دانشگاه شيراز شيراز ايران 2. مركز تحقيقات گياهان دارويي دانشگاه علوم پزشكي ياسوج ياسوج ايران 3. گروه ميكروب شناسي دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي تهران تهران ايران 4. گروه ميكروب شناسي دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي البرز كرج ايران 5. دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي شاهرود شاهرود ايران تاريخ دريافت : 1391/11/3 تاريخ ارجاع جهت اصلاحات : 1392/1/18 تاريخ تصويب : 1392/2/15 52 مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران

3 ه ب پژوهشي فرزانه غريب پور و همكاران زير گروه اصلي التهاب حاد گوش مياني (AOM) Acute otitis media و التهاب گوش مياني همراه با ترشحات (OME) Otitis media with effusion تقسيم ميشود. AOM عنوان عفونت گوش مياني مطرح است كه با نشانه ها و علاي م التهاب حاد گوش مياني همراه است( 1 ). درموارد OME ترشحات به مدت 3 ماه يا بيشتر پايدار مي ماند كه التهاب گوش مياني مزمن يا التهاب گوش مياني همراه با ترشحات ناميده ميشود( 2 ). بيش از درصدكودكان در سنين 3-5 سالگي حداقل يك بار به التهاب حاد گوش مياني مبتلا ميشوند. موارد عود التهاب گوش مياني در 40 درصد از كودكان مبتلا ديده ميشود و در نهايت 20 درصد ازكودكان دچار عود عفونت پايداري ترشحات در گوش مياني را تجربه ميكنند( 3 ). به طور طبيعي فضاي گوش مياني داراي مقدار كمي فشار هواي منفي نسبت به قسمت محيط بيروني است و اين فشار منفي به صورت دورهاي با باز كردن شيپور استاش در طي خميازه كشيدن و جويدن كاهش مييابد. نقص در عملكرد شيپور استاش به عنوان يكي از مكانيسمهاي اوليه در پيدايش التهاب گوش مياني است( 4 ). به علت كوتاهتر بودن شيپور استاش بچههاي جوان محتويات نازوفارنكس بيشتر دچار رفلاكس ميشوند. اختلال در عملكرد شيپور استاش در طي عفونتهاي فوقاني تنفسي در بچههاي كمتر از 2 سال در مقايسه با بچههاي بزرگتر بسيار شديدتر است و بچههاي سنين پاي ينتر به عنوان افراد مستعد AOM در طي عفونتهاي دستگاه تنفسي فوقاني محسوب ميگردند. فشار منفي در فضاي گوش مياني اين امكان را به وجود ميآورد كه محتويات نازوفارنكس در طي باز شدن موقتي شيپور استاش به درون گوش مياني وارد شوند( 3 ). درصد مثبت كشت باكتريايي نمونههاي گوش مياني به روش مطالعه نحوه نمونهگيري و همچنين حساسيت تكنيكهاي ميكروبي در تشخيص باكتريها بستگي دارد. در اغلب مطالعات باكتريهاي پاتوژن شايع جدا شده از گوش مياني شامل استرپتوكوك پنوموني هموفيلوس انفلوانزا غير قابل تيپ بندي و موراكسلا كاتاراليس هستند( 5 ). يكي ديگر از باكتريهاي عامل عفونتهاي گوش مياني آلويوكوكوس اوتيتيديس است و اطلاعات موجود در ارتباط با اين باكتري اندك است به طوريكه اين باكتري نخستين بار در سال 1989 به وسيله Faden و همكاران شناسايي شد( 6 ). فادن و همكاران در سال 1989 با مطالعه بر روي 200 كودك مبتلا به التهاب گوش مياني يك باكتري منحصر به فرد را در مايع گوش مياني آنها جداسازي كرد كه اغلب اين بچهها بين 10 ماه تا 34 ماه سن داشتند. اين ارگانيسم منحصر به فرد در روي محيط كشت جامد بعد از 48 ساعت انكوباسيون در دماي 37 درجه سانتيگراد رشد آرامي داشت. بر روي محيط كشت تريپتيكاز سوي آگار همراه با خون گوسفند كلنيهاي كوچك آلفا هموليتيك توليد ميكرد. در كشت مجدد ايزولهها نيز خصوصيات مشابهي يافت شد. در رنگآميزي گرم ارگانيسمها به صورت كوكسيهاي گرم مثبت و درشت بودند و اغلب به صورت دوتايي يا چهارتايي در زير ميكروسكوپ ديده ميشدند. ارگانيسم در دماي 45 درجه سانتيگراد يا در محيطهاي بيهوازي قادر به رشد نيست. اين باكتريها به طور يكسان كاتالاز مثبت و اكسيداز منفي بودند. بر اساس توالي باكتريها و همچنين به دليل تمايز فنوتيپي و فيلوژنتيكي ارگانيسم ناشناخته پيشنهاد شد كه اين ارگانيسم در درون يك جنس جديد به نام آلويوكوكوس (Alloiococcus) و به عنوان Alloiococcus otitis در نظر گرفته شود( 7 ). گونه آلويوكوكس اوتيتيس Collins و Aguirre كه به وسيله (Alloiococcus otitis) نامگذاري شد به گونه آلويوكوكوس اوتيتيديس otitidis) (Alloiococcus تغيير نام پيدا كرد( 7 8 ). بدين ترتيب نام جديد آلويوكوكوس اوتيتيديس به وسيله Greveitz بر اساس كد باكتري شناسي پيشنهاد و تا ييد شد( 9 ). آلويوكوكوس اوتيتيديس براي نخستين بار با روش كشت از مايع گوش مياني (MEE) كودكان مبتلا به OME جداسازي شد. اين باكتري از مايع گوش مياني 53 مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران

4 آلويوكوكوس اوتيتيديس و التهاب گوش مياني 3-5 درصد از كودكان جداسازي شد( 6 ). با استفاده از روش مولكولي PCR ميزان شيوع اين باكتري خيلي بيشتر و بالاتر بود به طوريكه در درصد از مايع گوش مياني بچهها اين باكتري با روش PCR شناسايي شد( 10 11). مطالعات نشان دادند كه آلويوكوكوس اوتيتيديس سبب القاء تحريك لنفوسيت T مهاركننده + CD8 سايتوتوكسيك ميشود و در شرايط آزمايشگاهي سبب القاء IL-8 و IL-12 ميگردد( ). ميزان بالاي شيوع آلويوكوكوس اوتيتيديس در مايع گوش مياني افراد مبتلا به OME و همچنين توانايي تحريك كنندگي سيستم ايمني آن بيانگر خاصيت بيماريزايي اين باكتري در گوش مياني است( 7 ). آلويوكوس اوتيتيديس يك باكتري سخت رشد است و براي جداسازي آن با روش كشت از نمونههاي كلينيكي بيماران به زمان زيادي بين 7-14 روز نياز است بر اين اساس اغلب مطالعات قبلي فقط با روش مولكولي PCR ميزان شيوع باكتري را بررسي كردهاند و يا اينكه با روش كشت قادر به جداسازي باكتري نبوده اند و به همين علت در اغلب اين مطالعات تست حساسيت آنتي بيوتيكي انجام نشده است( ). مطالعاتكمي در رابطه با بررسي شيوع آلويوكوكوس اوتيتيديس در عفونت گوش مياني با ترشحات OME با روشPCR وكشت صورتگرفته است( ). با توجه به اينكه مطالعات انجام شده در اين زمينه محدود است هدف از اين مطالعه بررسي ميزان شيوع آلويوكوكوس اوتيتيديس در كودكان مبتلا به عفونتهاي گوش مياني همراه با ترشحات (OME) با روش كشت و PCR است و به علاوه بررسي الگوي حساسيت آنتيبيوتيكي باكتريهاي جدا شده از بيماران ميباشد. مواد و روشها اين مطالعه يك مطالعه توصيفي sectional) (Cross ميباشد. نمونههاي باليني مورد استفاده در اين مطالعه از بيماران مراجعه كننده به اتاق عمل گروه گوش حلق و بيني بيمارستان هاي امام خميني و امير اعلم ) دو تا از بيمارستانهاي آموزشي تابعه دانشگاه علوم پزشكي تهران) در فواصل سال جمعآوري شدند. اين مطالعه بر روي 50 بيمار مبتلا به عفونت گوش مياني كه بين 6 ماه تا 12 سال سن دارند صورت گرفت تشخيص عفونت گوش مياني و التهاب گوش مياني همراه با ترشحات OME با توجه به علايم باليني و مشخصات توسط پزشك متخصص گوش حلق و بيني انجام شد. ابتدا كانال گوش خارجي بيماران با بتادين ضد عفوني گرديد و سپس با مقدار فراوان نرمال سالين شست و شو داده شد. در هنگام عمل جراحي و بر روي پرده صماخ توسط پزشك برش كوچكي صورت گرفت و در صورت وجود مايع گوش مياني نمونهگيري انجام شد اين فرآيند توسط پزشك متخصص و با استفاده از وسيله Tyms-Tab صورت گرفت. سپس نمونهها طي 2 ساعت به بخش ميكروب شناسي دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي تهران منتقل شد و بلافاصله كشت گرديدند. اطلاعات مورد نياز هر فرد بر اساس پرونده بيمار و يافته هاي باليني در پرسشنامه جداگانه وارد گرديد. نيمي از حجم مايع گوش مياني جهت كشت و تشخيص ميكروبشناسي به كار رفت. و نيمي ديگر جهت انجام كارهاي مولكولي در فريزر 20- سانتيگراد نگهداري شد. براي جداسازي اوليه آلويوكوكوس اوتيتيديس از محيط كشت آگار خوندار (خون گوسفند) 5 درصد با پايه مولرهينتون آگار استفاده شد. بعد از كشت دادن نمونه باليني به روش جداسازي در روي محيط كشت مورد نظر گرمخانه گذاري آنها در دماي 37 درجه سانتيگراد و شرايط 5 درصد دي اكسيد كربن انجام شد در صورت عدم رشد باكتريها در طي 72 ساعت محيطهاي كشت به مدت 10 روز نگهداري شدند و روزانه اين محيطهاي كشت جهت بررسي رشد باكتريها مطالعه ميشدند. در صورت مشاهده رشد كلنيهاي مورد نظر كشت مجدد داده ميشدند و مطالعات فنوتيپي زير انجام شد. 54 مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران

5 پژوهشي فرزانه غريب پور و همكاران 1- رنگآميزي گرم براي مشاهده مرفولوژي باكتريها: آلويوكوكوس اوتيتيديس به صورت كوكسي درشت گرم مثبت به صورت تك تك دوتايي و چند تايي مشاهده شدند. 2- تست توليد اسيد از گليسرول: اين تست توانايي توليد اسيد از گليسرول را در حضور اريترومايسين نشان ميدهد. محيط پايه در اين تست حاوي تركيبات آمونيوم دي هيدروژن سولفات 1 گرم پتاسيم كلرايد 0/2 گرم منيزيم سولفات 0/2 گرم عصاره مخمر 2 گرم گليسرول 10 ميلي ليتر برم كروزل ارغواني 04/ گرم و آب مقطر 1 ليتر است. محيط كشت پايه پس از استريليزاسيون تا درجه خنك ميشود و سپس 1 ميلي ليتر اريترومايسين اضافه ميشد. نحوه تهيه محلول اريترومايسين به اين صورت است كه 4 ميليگرم پودر اريترومايسين در 0/5 ميليليتر اتانول 95 درصد حل ميشود و سپس با آب دو بار تقطير به حجم 10 ميليليتر ميرسد و سپس با فيلتراسيون استريل ميشد و در نهايت 1 ميلي ليتر از محلول نهايي اريترومايسين به يك ليتر از محيط پايه ساخته شده اضافه ميگيرد. به هر لوله استريل حدود 7-10 سيسي محيط كشت اضافه ميشود و پس از تلقيح چند كلني باكتري در محيط كشت انكوباسيون به مدت 5-8 روز در دماي 37 درجه صورت ميگيرد. تست مثبت با تغيير رنگ ارغواني اوليه محيط كشت به رنگ زرد صورت ميگيرد. 3- روش مولكولي: باكتريهاي مشكوك به آلويوكوكوس اوتيتيديس با استفاده از روش مولكولي مورد تا ييد نهايي واقع شدند ابتدا با استفاده از روش جوشاندن DNA باكتري استخراج شد و سپس با استفاده از پرايمر اختصاصي ژن 16srRNA با روش PCR رديابي گرديد. در صورت مشاهده محصولات PCR به اندازه 284 جفت باز احتمال حضور آلويوكوكوس اوتيتيديس در نظر گرفته ميشد و در نهايت محصول PCR جهت تا ييد نهايي تعيين توالي گرديد. واكنشهاي 50 ميكروليتري PCR اين ژنها آماده شد و سپس محصولات واكنشهاي PCR همراه با پرايمرهاي اختصاصي براي انجام سكانسينگ هر دورشته پيرو و پيشرو بهكشوركره و شركت Korea) Macrogen (Seoul,South ارسال شد. در مرحله بعد توالي هاي ذكر شده در پايگاه NCBI بلاست شد و براساس سويههاي كنترل در بانك ژن تشخيص قطعي باكتري صورتگرفت. استخراج DNA از ترشحات گوش مياني و انجام :PCR استخراج DNA از مايع گوش مياني با استفاده از كيت Germany) (Invitek GmbH, Berlin, and RTP Bacteria DNA Mini Kit و براساس دستورالعمل شركت سازنده آن انجام شد. جهت بررسي حضور آلويوكوكوس اوتيتيديس در نمونه ترشحات گوش مياني روش PCR بر روي DNA استخراج شده از نمونههاي باليني صورت گرفت. براي انجام واكنش PCR از سويه آلويوكوكوس اوتيتيديس جدا شده از نمونههاي باليني مطالعه حاضر به عنوان كنترل مثبت استفاده شد كه با روش تعيين توالي تا ييد شده بودند. براي اين منظور از پرايمرهاي ژن هدف 16SrRNA باكتريهاي ذكر شده كه قبلا طراحي شده بودند استفاده گرديد( 14 ). براي به دست آوردن مقادير مناسب تركيبات مورد استفاده در واكنش زنجيرهاي پلي مراز گراديانتي از تركيبات مختلف قرار داده شد. پس از به دست آمدن مقادير مناسب مستر ميكس براي هر واكنش تهيه و استفاده شد. سيكل دمايي و همچنين مقادير مورد نياز براي هر واكنش PCR در جداول شماره 1 و 2 اراي ه شده است. جهت انجام الكتروفورز از آگارز 1 درصد ساخته شده با بافر 0/5 X,TBE استفاده شد. 10 ميكروليتر از محصول تكثير شده PCR با 2 ميكروليتر Lodding dye مخلوط گرديد و داخل چاهك ژل قرار گرفت. براي الكتروفورز از ولتاژ 100 ميلي ولت استفاده گرديد و مدت زمان آن يكساعت بود. بعد از اتمام الكتروفورز ژل به مدت 30 دقيقه در اتيديوم برومايد با غلظت 10μg/ml قرارگرفت و مشاهده باندها با استفاده از دستگاه Gel Documentation صورت گرفت. اين مطالعه به وسيله كميته اخلاقي دانشگاه علوم پزشكي تهران تا ييد شده است. 55 مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران

6 آلويوكوكوس اوتيتيديس و التهاب گوش مياني جدول شماره 1: سيكل دمايي واكنش PCR براي شناسايي ژن 16SrRNA باكتري آلويوكوكوس Time (s) Temperature(c ) First Denaturation Denaturation Annealing Extension Final Extension Loop: 30 جدول شماره 2: مقادير مناسب تركيبات مورد استفاده براي يك واكنش PCR مواد غلظت و حجم حجم غلظت 5 μl 1 X PCR Buffer 10X 0/2 μl 1/ 5 Taq Pol 5 u/μl 5μL 2/5 μm MgCl 25 mm 1 μl 0/2 μm dntp Mix 10mM 1 μl 0/5 μm A. otitidis R 1 μl 0/5 μm A. otitidis F 8μL 15 μg/ml DNA 28/8 μm - dh2o 50 μl - Final volume يافتهها از 50 بيمار مبتلا به التهاب گوش مياني همراه با ترشحات 45 پسر بچه و 5 دختر بچه بودند. محدوده سني افراد مراجعه كننده بين 19 ماه تا 12 سال با ميانگين سني 6/4 سال بود از مجموع كل بيماران 39 بيمار از بيمارستان امير اعلم و 11 بيمار از بيمارستان امام خميني بودند. به مطالعه باليني بيماران نشان داد كه تمام افراد شركت كننده در مطالعه بيش از 3 ماه پايداري ترشحات در گوش مياني داشتهاند و تمام افراد مستعد اوتيت گوش مياني بودند. فراوانترين نوع ترشحات گوش در بيماران ترشحات موكوسي (21 نفر) ترشحات سروزي- موكوسي (12 نفر) ترشحات سروزي (10 نفر) و ترشحات موكوسي چسبنده (7 نفر) بودند. كليه بيماران تا دو هفته قبل از نمونهگيري هيچگونه سابقه مصرف آنتيبيوتيك نداشتند. همچنين هيچكدام از بيماران آدنوي يدوكتومي يا تيمپانوكتومي قبلي نداشتند. تعداد كل نمونههاي باليني مايع گوش مياني 65 نمونه بود كه 35 بيمار داري ترشحات يكطرفه (ترشح در يكي از گوشها) و 15 بيمار داراي ترشحات دو طرفه بودند. ميزان جداسازي آلويوكوكوس اوتيتيديس با روش كشت 15 مورد (23/07 درصد) بود كه تمام سويههاي جدا شده بعد از تشخيص فنوتيپي با روش PCR مورد ارزيابي قرار گرفته و بعد با تعيين توالي محصولات PCR عنوان آلويوكوكوس اوتيتيديس تا ييد شدند. با استفاده از روش مولكولي PCR حضور باكتريها در مايع گوش مياني بررسي شد كه آلويوكوكوس اوتيتيديس در 26 مورد (40 درصد) از 65 نمونه ترشحات گوش شناسايي شد (تصوير شماره 1). M bp 264bp ستون DNA M: ماركر ستون 1 كنترل مثبت ستون 3: كنترل منفي تصوير شماره 1: تصوير ژل الكتروفورز محصولات PCR ژن 16SrRNA باكتري آلويوكوكوس اوتيتيديس 56 مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران

7 پژوهشي فرزانه غريب پور و همكاران الگوي حساسيت آنتي بيوتيكي 15 سويه آلويوكوكوس اوتيتيديس نسبت به آنتي بيوتيك هاي پني سيلين آموكسي سيلين آموكسي سيلين/كلاونات اريترومايسين كلاريترومايسين آزيترومايسين كليندامايسين كوتريموكسازول سيپروفلوكساسين لووفلوكساسين و سفترياكسون نشان داد كه تمام ايزولهها به آموكسي سيلين آموكسي سيلين/كلاونات سيپروفلوكساسين لووفلوكساسين و سفترياكسون حساس بودند در حاليكه 13 ايزوله (86 درصد) به اريترومايسين آزيترومايسين و كلاريترومايسين مقاوم بودند. بحث از ميان 50 بيمار مراجعه كننده به بيمارستانهاي اميراعلم و امام خميني غالب بيماران مربوط به بيمارستان اميراعلم بودند كه به علت اينكه اين بيمارستان مركز مهم گوش حلق و بيني در تهران است طبيعي است و از طرف ديگر بيماران پسر مراجعه كننده در مقايسه با دختربچه ها بيشتر بودند كه نشان دهنده شيوع بيشتر اين بيماري در پسربچه هاست كه شايد به نوعي نشان دهنده تفاوت در وضعيت پوشش و مراقبت بيش تر دختربچهها توسط والدين باشد. در ارتباط با حضور باكتري در گوش بيماران بر اساس نوع ترشحات گوش مياني مثل ترشحات موكوسي ترشحات سروزي- موكوسي ترشحات سروزي و ترشحات موكوسي چسبنده اختلاف معني داري مشاهده نشد. در مطالعه حاضر آلويوكوكوس اوتيتيديس در 15 مورد از 65 نمونه گوش مياني (23/07 درصد) از ترشحات گوش مياني با روش كشت جداسازي شد. اين ميزان شيوع از گزارشات اراي ه شده در استراليا (40 درصد) و اسپانيا (48/2 درصد) كمتر بوده( ) در حاليكه در مقايسه با ايالات متحده (5 4/7 درصد) بيشتر است( 18 6 ). گزارشي در ارتباط با جداسازي آلويوكوكوس اوتيتيديس از كشورهاي همسايه و همچنين در قاره آسيا براي مقايسه ميزان شيوع وجود ندارد. با استفاده از روش PCR بر روي 65 نمونه باليني از ترشحات گوش مياني 50 بيمار مورد مطالعه مشخص شد كه آلويوكوكوس اوتيتيديس در 26 مورد (40 درصد) شناسايي شده است كه اين نتيجه مشابه گزارشي از كشور فنلاند( 10 ) است در حاليكه بيشتر از ميزان شيوع 18/5 درصد تا 28/1 درصد در كشورهاي تركيه فنلاند ژاپن و استراليا و كمتر از شيوع گزارش شده از كشور انگلستان (50) درصد و ژاپن (60/5) درصد است( ). اين تفاوت در ميزان جداسازي با كشت و شناسايي اين باكتري با PCR در بين اين كشورها ممكن است بيانگر تفاوتهاي منطقهاي كشورهاي مذكور و نقش آن در ميزان شيوع اين باكتري باشد. در مجموع با روش كشت و PCR اين باكتري در 26 مورد (40 درصد) شناسايي شد به طوريكه تمام 15 مورد كشت مثبت PCR آنها هم نتيجه مثبت نشان داد و 11 مورد ديگر فقط در تست مولكولي نتيجه مثبت را نشان دادند كه نشان دهنده اين است كه روش مولكولي مثل PCR در شناسايي ارگانيسم حساسيت بالاتري نسبت به كشت دارد. به نظر ميرسد آلويوكوكوس اوتيتيديس نقش مهمي در اتيولوژي عفونتهاي گوش مياني به همراه ترشحات دارد و ميزان شيوع آنها در نقاط مختلف متفاوت ميباشد. ممكن است تفاوت هاي مشاهده شده در مطالعات مختلف ناشي از تفاوت در برنامههاي بهداشتي و سلامتي فرايندهاي كنترل و درمان عفونتهاي گوش مياني و همچنين تفاوتهاي جغرافيايي باشد. پراكنش آلويوكوكوس اوتيتيديس در همراهي با خصوصيات باليني بيماران (نوع ترشحات: سروزي موكوسي سروزي موكوسي) بررسي و آناليز شد و اختلاف معنيداري در جداسازي باكتري از بيماران با علايم كلينيكي متفاوت يافت نشد. در حال حاضر يكي از مشكلات اساسي در بيماران مبتلا به التهاب گوش مياني همراه ترشحات انتخاب 57 مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران

8 آلويوكوكوس اوتيتيديس و التهاب گوش مياني الگوي مناسبي از آنتيبيوتيكهاست كه بتوانند عليه باكتريهاي غالب كه در پاتوژنز اين بيماري نقش دارند مو ثر باشند. مهمترين داروهايي كه در درمان عفونتهاي گوش مياني به عنوان داروي انتخاب اول يا انتخاب دوم كاربرد دارند شامل بتالاكتامهاي خوراكي مانند آموكسيسيلين و آموكسيسيلين/كلاولانات و همچنين سفالوسپورينها ميباشد( 20 ). ساير داروهاي مورد استفاده شامل آزيترومايسين كلاريترومايسين و تري متوپريم/ سولفامتوكسازول هستند( 21 ). فلوروكينولونها ممكن است در آينده نقشي را در درمان پاتوژنهاي مقاوم به چند دارو داشته باشد البته تا زماني كه شواهدي مبني بر ايمن بودن مصرف اين داروها در كودكان اراي ه نشود مورد استفاده قرار نميگيرند( 22 ). تصميمگيري در مورد استفاده از داروهاي ضد ميكروبي براي انتخاب يك داروي خاص بايد بر مبناي سن بيماران شدت عفونت مصرف قبلي آنتيبيوتيك داشتن اطلاعات اختصاصي در ارتباط با پراكنش پاتوژنها در مناطق خاص و همچنين دانستن الگوي مقاومت آنها به آنتي بيوتيك هاي مختلف است. از اين رو در اين مطالعه حساسيت آلويوكوكوس اوتيتيديس به آنتيبيوتيك هاي انتخابي با روش ديسك آگار ديفيوژن بررسي شد. بر اساس مطالعات انجام شده تاكنون گزارشات اندكي در ارتباط با بررسي حساسيت ضد ميكروبي آلويوكوكوس اوتيتيديس انجام شده است. به وسيله (Bosley) و همكاران با استفاده از دستورالعمل CLSI براي باكتري استرپتوكوكوس پنومونيه الگوي حساسيت اين باكتري را بررسي كردند و نشان دادند كه اين باكتري مقاومت بسيار زيادي به تري متوپريم- سولفامتوكسازول و اريترومايسين دارد( 18 ). اما مارتينز و همكاران نشان دادند كه تمام ايزولهها به آموكسي سيلين تتراسايكلين و كوتريموكسازول حساس هستند( 17 ). آشورت اسميت (Ashhurst-Smith) و همكاران مشاهده كردند كه تمام ايزوله هاي آلويوكوكس به پني سيلين حساس هستند اما به ميزان زيادي به اريترومايسين مقاوم هستند( 15 ). در همراهي با مطالعات انجام شده نتيجه آنتي بيوگرام روي ايزولههاي مطالعه حاضر نشان داد كه تمام ايزوله ها به ونكومايسين آموكسي سيلين آموكسي سيلين/ كلاولانات حساس هستند در حاليكه اغلب ايزولهها (86/6 درصد) به ماكروليدها مثل اريترومايسين و آزيترومايسين مقاوم هستند. در پايان ميتوان نتيجه گيري كرد كه باكتري آلويوكوكوس اوتيتيديس به عنوان يكي از عوامل مهم باكتريايي جدا شده از ترشحات گوش مياني در بيماران مبتلا به التهاب گوش مياني همراه با ترشحات OME در ايران است و بررسي الگوي حساسيت ميكروبي نشان داد كه اغلب ايزولهها به آموكسي سيلين/ كلاولانات و فلوروكينولون ها حساس بودند ولي ميزان مقاومت نسبت به ماكروليدها زياد بود و ميتوان پيشنهاد كرد كه آموكسي سيلين و آموكسي سيلين/ كلاولانات در درمان عفونتهاي گوش مياني قابل استفاده مي باشد. همچنين با توجه به اينكه روش مولكولي در مقايسه با كشت موارد بيشتري از باكتري را شناسايي كرد حساسيت بالاتر روش PCR را نشان ميدهد. در نهايت پيشنهاد ميشود كه در صورت امكان از آنتيبيوتيك هاي آموكسي سيلين و آموكسي سيلين/ كلاولانات در درمان بيماران مبتلا به OME استفاده شود و همچنين در مطالعات آينده نقش ساير باكتريهاي پاتوژن در التهاب گوش مياني بررسي گردد. سپاسگزاري اين مطالعه با همكاري گروه ميكروب شناسي و گروه گوش حلق و بيني دانشگاه علوم پزشكي تهران انجام شده است و لازم ميدانيم از دستياران محترم تخصصي گروه آموزشي گوش حلق وبيني بيمارستانهاي امام خميني و امير اعلم تشكر به عمل آيد. ضمنا هزينه اين پژوهش از طرح تحقيقاتي مصوب معاونت پژوهشي دانشگاه علوم پزشكي تهران به شماره تا مين شده است. 58 مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران

9 پژوهشي فرزانه غريب پور و همكاران References 1. American Academy of Pediatrics. Subcommittee on anagement of Acute Otitis Media. Diagnosis and management of acute otitis media. Pediatrics. 2004; 113(5): Rovers MM, Schilder AG, Zielhuis GA, Rosenfeld RM. Otitis media. Lancet 2004; 363(9407): Gould JM, Matz PS. Otitis media. Pediatr Rev 2010; 31(3): Bluestone CD, Klein JO. Otitis Media in Infants and Children. 4 th ed. Ontario, Canada Hamilton: BC Decker, Inc; Vergison A. Microbiology of otitis media: a moving target. Vaccine 2008; 26(Supp 7): G Faden H, Dryja D. Recovery of a unique bacterial organism in human middle ear fluid and its possible role in chronic otitis media. J Clin Microbiol 1989; 27(11): Aguirre M, Collins MD. Phylogenetic analysis of Alloiococcus otitis gen. nov., sp. nov., an organism from human middle ear fluid. Int J Syst Bacteriol 1992; 42(1): Aguirre M, Collins MD. Development of a polymerase chain reaction-probe test for identification of Alloiococcus otitis. J Clin Microbiol 1992; 30(8): Von Graevenitz A. Revised Nomenclature of Alloiococcus otitis. J Clin Microbiol 1993; 31(2): Hendolin PH, Kärkkäinen U, Himi T, Markkanen A, Ylikoski J. High incidence of Alloiococcus otitis in otitis media with effusion. Pediatr Infect Dis J. 1999; 18(10): Hendolin PH, Paulin L, Ylikoski J. Clinically applicable multiplex PCR for four middle ear pathogens. J Clin Microbiol 2000; 38(1): Harimaya A, Fujii N, Himi T. Preliminary study of proinflammatory cytokines and chemokines in the middle ear of acute otitis media due to Alloiococcus otitidis. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2009; 73(5): Himi T, Kita H, Mitsuzawa H, Harimaya A, Tarkkanen J, Hendolin P, et al. Effect of Alloiococcus otitidis and three pathogens of otitis media in production of interleukin-12 by human monocyte cell line. FEMS Immunol Med Microbiol 2000; 29(2): Hendolin PH, Markkanen A, Ylikoski J, Wahlfors JJ. Use of multiplex PCR for simultaneous detection of four bacterial species in middle ear effusions. J Clin Microbiol 1997; 35(11): Harimaya A, Takada R, Somekawa Y, Fujii N, Himi T. High frequency of Alloiococcus otitidis in the nasopharynx and in the middle ear cavity of otitis-prone children. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2006; 70(6): Leskinen K, Hendolin P, Virolainen- Julkunen A, Ylikoski J, Jero J.The clinical role of Alloiococcus otitidis in otitis media with effusion. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2002; 66(1): Ashhurst-Smith C, Hall ST, Walker P, Stuart J, Hansbro PM, Blackwell CC, et al. Isolation of Alloiococcus otitidis from Indigenous and non-indigenous Australian children with chronic otitis media with effusion. FEMS Immunol Med Microbiol 2007; 51(1): Martınez MI, Macıas AR. Serous Otitis Media in Children: Implication of Alloiococcus otitidis. Otol Neurotol 2008; 29(4): مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران دوره بيست و سوم شماره 100 ارديبهشت 1392

10 آلويوكوكوس اوتيتيديس و التهاب گوش مياني 19. Bosley GS, Whitney AM, Pruckler JM, Moss CW, Daneshvar M, Sih T, et al. Characterization of ear fluid isolates of Alloiococcus otitidis from patients with recurrent otitis media. J Clin Microbiol 1995; 33(11): Guvenc MG, Midilli K, Inci E, Kuskucu M, Tahamiler R, Ozergil E, et al. Lack of Chlamydophila pneumoniae and predominance of Alloiococcus otitidis in middle ear fluids of children with otitis media with effusion. Auris Nasus Larynx. 2010; 37(3): Barkai G, Greenberg D, Givon-Lavi N, Dreifuss E, Vardy D, Dagan R. Community prescribing and resistant Streptococcus pneumoniae. Emerg Infect Dis 2005; 11(6): Dagan R, Arguedas A, Schaad UB. Potential role of fluoroquinolone therapy in childhood otitis media. Pediatr Infect Dis J 2004; 23(5): دوره بيست و سوم شماره 100 ارديبهشت مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران