ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΟΣΤΩΝ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΟΣΤΩΝ Δ Ι Δ Α Κ Τ Ο Ρ Ι Κ Η Δ Ι Α Τ Ρ Ι Β Η ΥΠΟΒΛΗΘΕΙΣΑ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ υπό ΚΑΡΑΜΠΑ Α. ΙΩΑΝΝΗ ΧΗΜΙΚΟΣ ΜΗΧΑΝΙΚΟΣ ΠΑΤΡΑ, ΜΑΪΟΣ 2011

2

3

4

5

6

7

8

9 αφιερωμένο στην οικογένειά μου

10

11 Οι άνθρωποι που πάνε μπροστά σ αυτόν τον κόσμο, είναι αυτοί που σηκώνονται, αναζητούν τις συνθήκες που θέλουν, κι αν δεν τις βρουν, τις διαμορφώνουν μόνοι τους. Τζωρτζ Μπέρναρντ Σω [ ] Βρετανός συγγραφέας Νόμπελ Λογοτεχνίας 1925

12

13 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος xx Περίληψη xxii Summary xxvi Κεφάλαιο 1 ο Σύσταση και δομή του οστέινου ιστού 1.1 Εισαγωγή Δομικά συστατικά του οστού Σύσταση και δομή της ανόργανης φάσης Σύσταση και δομή της οργανικής φάσης Κολλαγόνο Μη κολλαγονούχες πρωτεΐνες Κύτταρα Μυελός Νερό Ιεραρχική δομή του οστού Ινίδια Ίνες Οστεόνες Ανατομικά χαρακτηριστικά οστών Συμπαγές και σπογγώδες οστό Τμήματα μακρών οστών 25 Κεφάλαιο 2 ο Τεχνικές διάγνωσης παθολογικών καταστάσεων και εκτίμησης της ποιότητας των οστών 2.1 Εισαγωγή Το πρόβλημα της οστεοπόρωσης Ορισμός Χαρακτηριστικά οστεοπορωμένου οστού 28

14 Παθοφυσιολογικά αίτια Διάγνωση Τεχνικές διάγνωσης οστεοπόρωσης Απορροφησιομετρία ακτίνων Χ μονής δέσμης (SXΑ) Απορροφησιομετρία ακτίνων Χ διπλής δέσμης (DEXΑ) Ποσοτική υπολογιστική τομογραφία (QCT) Ποσοτικοί υπέρηχοι (QUS) Βιοχημικοί δείκτες Ποιότητα οστού Επίδραση των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών του οστού στις μηχανικές του ιδιότητες Ο ρόλος της σύστασης του οστού σε διάφορες ασθένειες Οστεομαλακία Ατελής οστεογένεση Εκτίμηση της ποιότητας του οστού με φασματοσκοπικές τεχνικές ΣΚΟΠΟΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ 50 Κεφάλαιο 3ο Χρησιμοποιούμενες τεχνικές χαρακτηρισμού 3.1 Εισαγωγή Φασματοσκοπία Raman (RS) Θεωρητικό υπόβαθρο Μαθηματική προσέγγιση Οργανολογία Φασματοσκοπία Υπερύθρου (FTIR) Θεωρητικό υπόβαθρο Οργανολογία Περιθλασιμετρία ακτίνων Χ (XRD) Θεωρητικό υπόβαθρο Οργανολογία Φασματοσκοπία ατομικής απορρόφησης (AAS) Αρχές λειτουργίας Οργανολογία Θερμοσταθμική ανάλυση (TGA) Αρχή λειτουργίας Οργανολογία 64

15 3.7 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) Θεωρητικές αρχές Οργανολογία 67 Κεφάλαιο 4ο Συλλογή υλικών και πρωτόκολλα χειρισμού τους 4.1 Συλλογή και κατεργασία δειγμάτων Απομάκρυνση μυελού λιπιδίων Απομόνωση κολλαγόνου Απομόνωση βιοαπατίτη 73 Κεφάλαιο 5ο Επίδραση πρωτοκόλλων απομάκρυνσης λιπιδίων και κολλαγόνου στην κρυσταλλική δομή του βιοαπατίτη 5.1 Εισαγωγή Μελέτη της επίδρασης των πρωτοκόλλων απομάκρυνσης λιπιδίων και κολλαγόνου στην κρυσταλλική δομή του βιοαπατίτη Πειραματική διαδικασία Συλλογή και κατεργασία δειγμάτων Χαρακτηρισμός δειγμάτων Αποτελέσματα μετρήσεων XRD Έλεγχος για μετατροπή νέων φάσεων Μεταβολές κρυσταλλικότητας και μεγέθους κρυσταλλιτών Προσδιορισμός μεγέθους κρυσταλλιτών Συνεισφορά θερμοκρασίας και υδραζίνης στην αύξηση της κρυσταλλικότητας Διερεύνηση του μηχανισμού αύξησης της κρυσταλλικότητας Πειραματική διαδικασία Χειρισμός οστών Παρασκευή απατιτών Χαρακτηρισμός δειγμάτων Μεταβολές περιεκτικότητας των δειγμάτων οστών σε ΗΡΟ 2-4 και CO Παρακολούθηση της ποσότητας των όξινων φωσφορικών Παρακολούθηση της ποσότητας των ανθρακικών 98

16 5.3.3 Επίδραση υδραζίνης σε απατίτες Μεταβολή της περιεκτικότητας σε CO Μεταβολή κρυσταλλικότητας Ανάλυση αποτελεσμάτων Συμπεράσματα 111 Κεφάλαιο 6ο Ανάπτυξη μοντέλων για την ποσοτική ανάλυση μιγμάτων βιοαπατίτη κολλαγόνου 6.1 Εισαγωγή Ανάπτυξη μοντέλων με χρήση μεμονωμένων κορυφών Αρχές ποσοτικής ανάλυση με φασματοσκοπία Raman Επιλογή κορυφών Επίδραση πρωτοκόλλου αποπρωτεϊνοποίησης Κατάστρωση εξισώσεων Παρασκευή μιγμάτων γνωστών αναλογιών Λήψη φασμάτων πρότυπων δειγμάτων Κατασκευή καμπυλών βαθμονόμησης Χρήση λόγου κορυφών 960 cm 1 /1667 cm Χρήση λόγου κορυφών 960 cm 1 /2941 cm Επιλογή βέλτιστου μοντέλου Καθορισμός κριτηρίων επιλογής Περιγραφή διαδικασίας επιλογής βέλτιστου μοντέλου Ανάπτυξη μοντέλου με χρήση της μεθόδου PLS Επιλογή δεδομένων και θεωρητικές αρχές μεθόδου Επιλογή δεδομένων Ο αλγόριθμος PLS Επαναληπτικές διαδικασίες Cross Validation και PRESS Κατασκευή αρχικού μοντέλου Εφαρμογή φασματικών φίλτρων Ανάπτυξη μοντέλου με χρήση του φίλτρου MSC Ανάπτυξη μοντέλου με χρήση του φίλτρου SNV Ανάπτυξη μοντέλου με χρήση δευτέρας παραγώγου Επιλογή βέλτιστου μοντέλου 168

17 Κεφάλαιο 7ο Υπολογισμός περιεκτικότητας σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο πραγματικών δειγμάτων 7.1 Εισαγωγή Αξιολόγηση της προβλεπτικής ικανότητας των μοντέλων Προετοιμασία δειγμάτων και λήψη φασμάτων Αποτελέσματα από την ανάλυση με λόγο υψών Αποτελέσματα με βάση το PLS μοντέλο Μετρήσεις με φασματομετρία ατομικής απορρόφησης Μεθοδολογία Αποτελέσματα ανάλυσης με AAS Μετρήσεις θερμοσταθμικής ανάλυσης Μεθοδολογία Αποτελέσματα ανάλυσης με TGA Ανάλυση αποτελεσμάτων από όλες τις τεχνικές Επίδραση μεγέθους σωματιδίων Ανάπτυξη μοντέλου με χρήση δονήσεων των αμινοξέων Επιλογή κορυφών Κατάστρωση εξισώσεων Κατασκευή ευθειών βαθμονόμησης Αξιολόγηση του νέου μοντέλου βαθμονόμησης Ανάλυση αποτελεσμάτων 197 Κεφάλαιο 8ο Συμπεράσματα Μελλοντικές εφαρμογές 199 Παράρτημα Α 205 Παράρτημα Β 208 Παράρτημα Γ 212 Παράρτημα Δ 223 Βιβλιογραφικές αναφορές 234

18 Ευρετήριο όρων 260 Ευρετήριο εικόνων 261 Ευρετήριο πινάκων 263 Ευρετήριο σχημάτων 265 Συμβολισμοί 269 Βιογραφικό 271

19

20 xxi ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Ενόργανης Ανάλυσης του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, κατά το χρονικό διάστημα από τον Οκτώβριο του 2007 ως τον Φεβρουάριο του Στην επιτυχή της ολοκλήρωση αρκετά ήταν τα άτομα που συνεισέφεραν, με τον ένα ή τον άλλο τρόπο και ως εκ τούτου αισθάνομαι την υποχρέωση να τα αναφέρω. Οι λέξεις είναι φτωχές προκειμένου να εκφράσουν τις ευχαριστίες μου προς το πρόσωπο του επιβλέποντα τις διατριβής κ. Κοντογιάννη Χρήστο, καθηγητή του τμήματος Φαρμακευτικής. Η παροιμιώδης εμπιστοσύνη την οποία επέδειξε προς το πρόσωπό μου σε συνδυασμό με την άρτια επιστημονική του καθοδήγηση, αποτέλεσαν για μένα πηγή έμπνευσης και εντατικοποίησης των προσπαθειών μου. Όμως, πέρα από τον επιστήμονα κ. Κοντογιάννη θρέφω βαθύτατα αισθήματα εκτίμησης και για τον άνθρωπο κ. Κοντογιάννη, ο οποίος ποτέ δεν αρνήθηκε τη στήριξή του στις όποιες δύσκολες καταστάσεις αντιμετώπισα. Ιδιαίτερα ευγνώμων είμαι και προς τη λέκτορα του τμήματος Φαρμακευτικής και μέλος της εφταμελούς επιτροπής, κ. Όρκουλα Μαλβίνα της οποίας οι ιδέες και οι προτάσεις υπήρξαν καίριες στην προσπάθεια επίλυσης διαφόρων προβλημάτων που αντιμετώπισα κατά τη διάρκεια της διατριβής. Θερμές ευχαριστίες θα ήθελα επίσης να εκφράσω στα μέλη της τριμελούς επιτροπής κ. Κουτσούκο Πέτρο, καθηγητή του τμήματος Χημικών Μηχανικών και κ. Κλεπετσάνη Παύλο, επίκουρο καθηγητή του τμήματος Φαρμακευτικής για τις εύστοχες παρατηρήσεις τους στο κείμενο της διατριβής. Επίσης, στον κ. Κουτσούκο θα ήθελα να εκφράσω ιδιαίτερες ευχαριστίες και για την απρόσκοπτη πρόσβαση που παρείχε στα όργανα του εργαστηρίου του. Ακόμα, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους κ. Παναγιωτόπουλο Ηλία, καθηγητή του τμήματος Ιατρικής, Τοπούζη Σταύρο, επίκουρο καθηγητή του τμήματος Φαρμκευτικής και Μπουρόπουλο Νικόλαο, επίκουρο καθηγητή του τμήματος Επιστήμης των Υλικών για την αποδοχή της πρόσκλησης συμμετοχής τους στην επταμελή επιτροπή. Παράληψη θα ήταν επίσης η μη αναφορά στο Ερευνητικό Ινστιτούτο Χημικής Μηχανικής και Χημικών Διεργασιών Υψηλής Θερμοκρασίας (ΕΙΧΗΜΥΘ). Η οικονομική

21 xxii ενίσχυση που μου παρείχε για σημαντικό χρονικό διάστημα της διδακτορικής μου έρευνας συνεισέφερε στην ανεμπόδιστη αφοσίωση στα ερευνητικά μου καθήκοντα. Τέλος, δε θα ήταν δυνατό να μην ευχαριστήσω όλους τους συναδέλφους φίλους με τους οποίους βρεθήκαμε μαζί στον ίδιο εργαστηριακό χώρο αυτά τα χρόνια, με μερικούς για μεγάλο και με άλλους για μικρότερο χρονικό διάστημα αλλά και τους εκτός εργαστηρίου φίλους οι οποίοι αποτέλεσαν ψυχολογικό στήριγμα στη δύσκολη και χρονοβόρα αυτή προσπάθεια. Πάνω απ όλα όμως, ένα τεράστιο ευχαριστώ στην οικογένειά μου για την υπομονή, την ανοχή και τη στήριξη. Καραμπάς Α. Ιωάννης Χημικός Μηχανικός, MSc

22 iii ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το οστό αποτελεί ένα σύνθετο υλικό, χαρακτηριζόμενο από μια πολύπλοκη ιεραρχική δομή. Συνίσταται από τρεις φάσεις, μια ανόργανη, μια οργανική και μια υδατική. Το ανόργανο μέρος του, το οποίο αντιστοιχεί περίπου σε 60 65% της κατά βάρος περιεκτικότητάς του, αποτελείται από ένα χημικό και δομικό ανάλογο του φωσφορικού άλατος υδροξυαπατίτης [Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ], το οποίο γι αυτό το λόγο καλείται βιοαπατίτης ή βιολογικός απατίτης. Το οργανικό μέρος αποτελεί περίπου το 30% της κ.β. περιεκτικότητάς του και κυριαρχείται από την παρουσία της πρωτεΐνης κολλαγόνο (τύπου Ι), το ποσοστό της οποίας ανέρχεται σε 90% περίπου της οργανικής φάσης. Το υπόλοιπο τμήμα αυτής καταλαμβάνεται από ένα πλήθος άλλων πρωτεϊνών, οργανικών ενώσεων και κυττάρων. Το εναπομένον 5 10% της μάζας του οστού αποτελείται από νερό. Η σύσταση του οστού και πιο συγκεκριμένα η περιεκτικότητά του σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο (των οποίων η συνολική % κ.β. περιεκτικότητα ανέρχεται σε πάνω από 95% επί ξηρού οστού) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στις μηχανικές ιδιότητές του, όπως είναι η αντοχή σε θραύση, η ακαμψία και η ελαστικότητα. Οι μεταβολές των μηχανικών ιδιοτήτων σχετίζονται με παθολογικές καταστάσεις των οστών κατά τις οποίες είναι πολύ πιθανή η εμφάνιση κατάγματος, όπως είναι η οστεοπόρωση από την οποία πάσχει ένα σημαντικό μέρος του πληθυσμού αλλά και άλλες λιγότερο συνηθισμένες παθήσεις όπως η οστεομαλακία και η ατελής οστεογένεση. Οι παραπάνω ασθένειες και κυρίως η οστεοπόρωση, διαγιγνώσκονται μέχρι σήμερα με μέτρηση της οστικής πυκνότητας (Bone Mineral Density, BMD). Η συγκεκριμένη όμως παράμετρος υστερεί στην αξιόπιστη πρόβλεψη του κινδύνου εμφάνισης καταγμάτων. Για το λόγο αυτό, η νέα προσέγγιση στο συγκεκριμένο ζήτημα απαιτεί ως διαγνωστικό εργαλείο τη γνώση παραμέτρων που σχετίζονται άμεσα με τις μηχανικές ιδιότητες, ανάγοντας έτσι και τη σύσταση των οστών ως ένα πιθανό αξιόπιστο παράγοντα εκτίμησης του κινδύνου εμφάνισης κατάγματος. Αν και η σύσταση του οστού μπορεί να υπολογιστεί με διάφορες αναλυτικές τεχνικές, η χρήση της φασματοσκοπίας Raman (RS) αποτελεί μια προσέγγιση στο συγκεκριμένο ζήτημα η οποία παρουσιάζει σημαντικά πλεονεκτήματα, όπως είναι η δυνατότητα ταυτόχρονου προσδιορισμού της περιεκτικότητας σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο, η ελάχιστη επεξεργασία του προς ανάλυση δείγματος ενώ ήδη έχουν αρχίσει να γίνονται προσπάθειες και για την ανάπτυξη μεθόδου για την in vivo

23 xxiv ανάλυση των οστών. Λαμβάνοντας επομένως υπόψη τα σημαντικά πλεονεκτήματά της φασματοσκοπίας Raman και τη σπουδαιότητα της σύστασης στον καθορισμό της ποιότητας του οστού, επιχειρήθηκε η ανάπτυξη μεθοδολογίας για την ποσοτική ανάλυση της περιεκτικότητας των οστών σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο με τη βοήθεια της φασματοσκοπίας Raman. Για το σκοπό αυτό, συλλέχθηκαν δείγματα βόειων οστών (από το συμπαγές και το σπογγώδες τμήμα) και αφού πραγματοποιήθηκε χημικός καθαρισμός τους από ξένες οργανικές ενώσεις (λιπίδια, μυελός, κύτταρα), ορισμένα δοκίμια χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση του κολλαγόνου κατόπιν διάλυσης του βιοαπατίτη με EDTA ενώ κάποια άλλα δοκίμια χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση του βιοαπατίτη με διάλυση του κολλαγόνου σε υδραζίνη. Στα πλαίσια χαρακτηρισμού των δοκιμίων, μελετήθηκαν οι επιδράσεις που επάγουν η διαδικασία του χημικού καθαρισμού και το πρωτόκολλο απομόνωσης κολλαγόνου στην κρυσταλλική δομή του βιοαπατίτη. Μετρήσεις με τη βοήθεια της περίθλασης ακτίνων Χ (XRD), αποκάλυψαν ότι ενώ ο χημικός καθαρισμός δεν επηρεάζει τη δομή των δοκιμίων ωστόσο, το πρωτόκολλο απομάκρυνσης του κολλαγόνου με υδραζίνη έχει ως συνέπεια την αύξηση της κρυσταλλικότητας και του μεγέθους των κρυσταλλιτών του βιοαπατίτη σε σημαντικό βαθμό. Επιπλέον, από μελέτες με φασματοσκοπία υπερύθρου και XRD προέκυψε ότι η μεταβολή των παραπάνω παραμέτρων οφείλεται στην απομάκρυνση των ιόντων CO 2 3 και HPO 2 4 από τους κρυσταλλίτες του βιοαπατίτη, η οποία προκαλείται από χρήση της υδραζίνης. Μάλιστα προέκυψε ότι όσο μεγαλύτερη είναι η θερμοκρασία της χρησιμοποιούμενης υδραζίνης τόσο μεγαλύτερη είναι η κινητική των μεταβολών που επάγονται στις κρυσταλλογραφικές παραμέτρους του βιοαπατίτη. Αναμιγνύοντας καθορισμένες ποσότητες βιοαπατίτη και κολλαγόνου, παρασκευάστηκαν πρότυπα μίγματα που χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή ευθειών αναφοράς, για τον προσδιορισμό της σύστασης του οστού ως προς αυτά τα συστατικά. Από τα φάσματα Raman του οστού επιλέχθηκε η ν 1 δόνηση των ΡΟ 3 4 του βιοαπατίτη που εμφανίζεται ως μια κορυφή στα 960 cm 1 ως δείκτης της ποσότητάς του ενώ για το κολλαγόνο δοκιμάστηκαν δύο κορυφές, μια στα 1667 cm 1 που ανήκει στη δόνηση του αμιδίου Ι και άλλη μια στα 2941 cm 1 που αποδίδεται στην C H 2 δόνηση. Κατά την ανάλυση που ακολούθησε, χρησιμοποιήθηκαν τόσο τα ύψη όσο και τα εμβαδά κάτω από τις αντίστοιχες κορυφές. Οι λόγοι εντάσεων (εκφραζόμενές από τα ύψη ή τα εμβαδά των κορυφών) των δονήσεων 960 cm 1 /1667 cm 1 και

24 xxv 960 cm 1 /2941 cm 1 είναι ανάλογοι του λόγου περιεκτικοτήτων σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο. Προέκυψαν επομένως τέσσερεις ευθείες αναφοράς. Από αξιολόγηση των συγκεκριμένων ευθειών αναφοράς προέκυψε ότι μεγαλύτερη ακρίβεια στον υπολογισμό του λόγου περιεκτικοτήτων βιοαπατίτη και κολλαγόνου παρουσιάζει αυτή που χρησιμοποιεί το λόγο υψών των κορυφών 960 cm 1 /1667 cm 1. Επιπλέον, επιχειρήθηκε η ανάπτυξη ενός νέου μοντέλου βαθμονόμησης με τη χρήση χημειομετρικών μεθόδων και πιο συγκεκριμένα εφαρμόζοντας τον αλγόριθμο PLS, ο οποίος έχει εφαρμοστεί με σημαντική επιτυχία τα τελευταία χρόνια στην ανάλυση φασματοσκοπικών δεδομένων. Επειδή για την ανάπτυξη του νέου μοντέλου χρησιμοποιήθηκε μια μεγάλη περιοχή του φάσματος (από 366 cm 1 ως 1800 cm 1 ) και όχι μεμονωμένες δονήσεις, αναμένετο μεγαλύτερη ακρίβεια στον υπολογισμό της σύστασης των αγνώστων δειγμάτων. Από τους διάφορους τρόπους κατασκευής μοντέλων ποσοτικής ανάλυσης βιοαπατίτη και κολλαγόνου που αναπτύχθηκαν, αυτό που επέδειξε τα καλύτερα χαρακτηριστικά ήταν εκείνο που τα πειραματικά δεδομένα, πριν την επεξεργασία τους με τον αλγόριθμο PLS, υποβλήθηκαν στον SNV (Standard Normal Variate) μετασχηματισμό. Μετά την επιλογή των βέλτιστων για κάθε μέθοδο μοντέλων, ακολούθησε η αξιολόγησή τους με άλλες τεχνικές. Αρχικά, ποσοτικοποιήθηκε η περιεκτικότητά σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο μεγάλου αριθμού δοκιμίων οστών, με τις παραπάνω μεθόδους που βασίζονται στη φασματοσκοπία Raman. Ακολούθως, τα ίδια οστά αναλύθηκαν με τις τεχνικές της φασματομετρίας ατομικής απορρόφησης (AAS) και της θερμοσταθμικής ανάλυσης (TGA) ως προς την περιεκτικότητά τους σε ανόργανη και οργανική φάση. Σύγκριση των αποτελεσμάτων από αυτές τις τεχνικές με τα αντίστοιχα που προέκυψαν από την ανάλυση με φασματοσκοπία Raman, κατέδειξαν μειωμένη ικανότητα πρόβλεψης της περιεκτικότητας σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο και για τα δύο μοντέλα που είχαν αναπτυχθεί με βάση τη φασματοσκοπία Raman. Θεωρώντας ως ένα από τους λόγους αποτυχίας των παραπάνω μοντέλων ποσοτικής ανάλυσης την επιλογή της δόνησης του αμιδίου Ι στα 1667 cm 1 ως δείκτη της ποσότητας του κολλαγόνου, επιχειρήθηκε η κατασκευή ενός νέου μοντέλου ποσοτικής ανάλυσης, με την επιλογή διαφορετικών δονήσεων για την ποσοτικοποίηση του κολλαγόνου. Οι κορυφές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αυτές στα 855 και 878 cm 1 οι οποίες ανήκουν σε δονήσεις των αμινοξέων προλίνη και υδροξυπρολίνη αντίστοιχα ενώ, για το βιοαπατίτη χρησιμοποιήθηκε και η κορυφή στα 960 cm 1. Και πάλι αναπτύχθηκαν μοντέλα λαμβάνοντας υπόψη τα ύψη και τα εμβαδά

25 xxvi των παραπάνω κορυφών. Τελικά, προέκυψε ότι το βέλτιστο μοντέλο ήταν αυτό στο οποίο ως δείκτης της ποσότητας του κολλαγόνου χρησιμοποιήθηκε το άθροισμα των υψών των κορυφών στα 855 και 878 cm 1. Αξιολόγηση του συγκεκριμένου μοντέλου μέσω της σύγκρισης με τα αποτελέσματα που εξήχθησαν από τις ποσοτικές αναλύσεις με την ατομική απορρόφηση και τη θερμοσταθμική ανάλυση, κατέδειξε ιδιαίτερα ικανοποιητική σύγκλιση των τιμών περιεκτικότητας σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο από τις τρεις τεχνικές. Ως εκ τούτου, κατέστη δυνατή η δημιουργία ενός μοντέλου ακριβούς πρόβλεψης της σύστασης των οστών ως προς την ανόργανη και την οργανική φάση. Η εξίσωση της καμπύλης αναφοράς που προτείνεται για το σκοπό αυτό είναι η: 960 H X B = 4, 107( ± 0, 070) 0, 177( ± 0, 283) H + H X C όπου: Η i είναι το ύψος της κορυφής του φάσματος Raman στον κυματάριθμο i και Χ Β, Χ C οι % κ.β. περιεκτικότητες των οστών σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο αντίστοιχα

26 xxvii SUMMARY Bone is a composite material characterized by a complicated hierarchical structure. It consists of three phases: inorganic, organic and aqueous. The inorganic is the dominant part accounting 60 65% w/w of bone and is a chemical and structural analogue of the mineral hydroxyapatite [Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ]. It is exactly for this reason that it is called bioapatite or biological apatite. The organic part constitutes about 30% of the weight of bone and its principal component is collagen (type I), which accounts for more than 90% of the weight of the organic phase. Non collagenous proteins, lipids, cells and other organic substances are also included in the organic part of bone. The remaining 5 10% w/w of bone is water. The composition of bone and particularly the concentrations of bioapatite and collagen (which together exceed 95% w/w of dry bone) play a crucial role in its mechanical properties, including resistance to fracture, stiffness and elasticity. These properties relate to various pathological situations of bone which may cause fractures like osteoporosis the most frequent metabolic bone disease osteomalacia, osteogenesis imperfecta and others. For the diagnosis of the above diseases and especially of osteoporosis, measurements of BMD (Bone Mineral Density) is the gold standard. However, nowadays it is a common belief that BMD alone cannot reliably predict the risk of bone fracture. For this reason, a new approach is followed according to which the study of factors that influence the mechanical properties of bone is suggested for diagnostic purposes. Inarguably, the composition of bone appears to be a key factor for the evaluation of risk fracture. Despite the fact that composition of bone has been determined by various analytical techniques, the use of Raman spectroscopy (RS) for this purpose, has been inadequately exploited. The simultaneous analysis of inorganic and organic phase, the minimal or even none requirements for sample preparation and the promising ongoing efforts for the in vivo analysis of tissues, rendered this technique a powerful tool for the study of bones. Taking into account the important advantages of RS and the role of bone composition as a diagnostic parameter, it was attempted to develop a method, based on RS, of quantitative analysis of the composition of bioapatite and collagen in bone.

27 xxviii A large number of bovine bone specimens (cortical and trabecular) was collected. Lipids, marrow and the non collagenous proteins were removed by chemical methods. Some of the specimens were treated with EDTA solutions for the separation of collagen. A second batch of bone specimens was subjected to the removal of organic phase by hydrazine. Afterwards, the effect of chemical purification and of hydrazine treatment on the crystal structure of bioapatite was investigated. X Ray Diffraction (XRD) measurements revealed that although chemical purification does not have any significant effect, hydrazine treatment induces noteworthy changes of the crystal size and crystallinity of the mineral phase. Further XRD measurements and investigation of bone specimens with infrared spectroscopy unveiled that the observed changes were temperature depended and were due to the removal of CO 2 3 and HPO 2 4 ions from the crystal lattice of bioapatite, caused by hydrazine. A series of standard mixtures was prepared by mixing carefully weighted amounts of the purified bone components and the corresponding calibration curves were constructed. These calibration lines could be used for the quantitative analysis of bone specimens with respect to its content in bioapatite and collagen. The peak at 960 cm 1 of the Raman spectrum of bone was selected as marker of bioapatite (ν 1 vibration of ΡΟ 3 4 ). For collagen two peaks were tested, at 1667 cm 1 (vibration of amide I) and at 2941 cm 1 (vibration of C H 2 ). For these two peaks both, the height and the integrated areas were used for the construction of the respective calibration curves. Height and area ratios of 960 cm 1 /1667 cm 1 and 960 cm 1 /2941 cm 1 peaks are proportional to the ratio of mass fraction of bioapatite to collagen. For the models developed, the most accurate was proved to be this one that used the height ratio of 960 cm 1 /1667 cm 1 peaks. For comparison reasons, new models were developed based on chemometrics and in particular by using the PLS algorithm. PLS has been proved a powerful method for the analysis of multivariate problems and during the last years there is a growing number of applications in spectroscopy. A broad region of the Raman spectrum was used from

28 xxix 366 cm 1 to 1800 cm 1 and various spectral filters were tested. The best results were obtained for the SNV spectral filter. Following the selection of the optimum model for each of the two different methods of calibration, they were evaluated with the results from other analytical techniques. Various bone specimens were quantified for bioapatite and collagen with the implementation of the developed models and their results were compared with the corresponding results of two other analytical techniques, Atomic Absorption Spectroscopy (AAS) and Thermogravimetric Analysis (TGA). Although analytical results showed good agreement between AAS and TGA, the consensus of the results obtained by RS and that of AAS and TGA was poor. This indicates that the developed methods based on RS were inappropriate. A possible reason for the failure of the above models, which based on RS, could be the selection of amide I vibration for the quantification of collagen. Thus, additional models were constructed using different peaks as collagen markers. The peaks at 855 and 878 cm 1 were selected, which are attributed to vibrations of the amino acids proline and hydroxyproline, respectively. For bioapatite the peak at 960 cm 1 was used. The quantitative analysis was developed using heights and integrated areas of the selected peaks. Comparison between the models showed that the best results were obtained by the model that takes into account the sum of the heights at 855 cm 1 and 878 cm 1. Comparison of this model with the results obtained from AAS and TGA showed excellent agreement with respect to the content of bone specimens in bioapatite and collagen. The calibration equation derived for this model is: 960 H X B = 4, 107( ± 0, 070) 0, 177( ± 0, 283) H + H X C where: H i is the height of the peak at the i wavenumber of the Raman spectrum and Χ Β, Χ C are the % mass content of bioapatite and collagen in the bone specimens respectively

29

30

31 1 Κεφάλαιο 1 ο Σύσταση και δομή του οστέινου ιστού 1.1 Εισαγωγή Το οστό αποτελεί ένα ζωτικής σημασίας συνδετικό ιστό (οστέινος ή οστίτης ιστός) που απαντάται σε όλα τα θηλαστικά, και όχι μόνο. Πρόκειται για ένα αρκετά άκαμπτο, ανισοτροπικό υλικό το οποίο επιτελεί σημαντικές λειτουργίες του οργανισμού. Εξασφαλίζει τη μηχανική στήριξη του σκελετού ενώ αποτελεί και το σημείο πρόσδεσης των μυών και των τενόντων. Η σκληρότητά του και η αντοχή του σε μηχανικές καταπονήσεις λειτουργεί προστατευτικά για τα όργανα της κρανιακής και θωρακικής κοιλότητας. Επιπλέον, ο μυελός που φιλοξενείται στα διάκενα του οστού συμβάλλει στην αιμοποιητική λειτουργία. Τέλος, ο οστέινος ιστός επιτελεί και σημαντική ομοιοστατική λειτουργία καθώς αποτελεί μια δεξαμενή στοιχείων και ιόντων τα οποία «προσφέρει» σε διάφορα άλλα όργανα του οργανισμού που τα έχουν ανάγκη, μέσω της κυκλοφορίας του αίματος. Ιδιαίτερα για το ασβέστιο και το φώσφορο είναι γνωστό ότι όταν μειώνεται η συγκέντρωσή τους στο πλάσμα του αίματος «θυσιάζεται» οστό ώστε να προσφέρει Ca 2+ και ΡΟ 3-4 και να αντισταθμίσει αυτή τη μείωση. 1.2 Δομικά συστατικά του οστού Το οστό είναι ένα σύνθετο υλικό το οποίο αποτελείται από μια οργανική και μια ανόργανη φάση, οι οποίες δημιουργούν ένα σύμπλεγμα μέσω της ασβεστοποίησης της οργανικής φάσης. Το ανόργανο τμήμα είναι αυτό που υπερτερεί κατά βάρος μια και αποτελεί περίπου το 60-70% της μάζας του οστού. Η οργανική φάση συνιστά το 20-30% της μάζας του ενώ το υπόλοιπο ποσοστό αποτελείται από νερό [1]. Μετατρέποντας τις % κ.β. περιεκτικότητες σε % κ.ο. τα κατά προσέγγιση ποσοστά είναι 40%, 25% και 35% για ανόργανη, οργανική και υδατική φάση αντίστοιχα. Το ανόργανο τμήμα

32 2 Σύσταση και δομή οστέινου ιστού συνίσταται από ένα άλας του φωσφορικού το οποίο προσομοιάζει εξαιρετικά τόσο χημικά όσο και δομικά το γεωλογικό υδροξυαπατίτη [Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2, ΗΑΡ] και γι αυτό το λόγο ονομάζεται συνήθως ως βιοαπατίτης (BioApatite, BAP). Από την άλλη, η συντριπτική πλειοψηφία της οργανικής φάσης αποτελείται από κολλαγόνο τύπου Ι (98% κ.β. περίπου). Το εναπομένον 2% συνίσταται από ένα σύνολο μη κολλαγονούχων πρωτεϊνών, κυττάρων και μυελού [1] Σύσταση και δομή της ανόργανης φάσης Το υλικό από το οποίο αποτελείται το ανόργανο τμήμα του οστού, όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, είναι ένα χημικό και δομικό ανάλογο ενός γεωλογικού, φυσικά σχηματιζόμενου πετρώματος που ονομάζεται υδροξυαπατίτης [2-4]. Το ίδιο υλικό απαντάται επίσης στην οδοντίνη και στην αδαμαντίνη (σμάλτο) των δοντιών [5]. Ο ΗΑΡ ανήκει σε μια μεγάλη οικογένεια υλικών που ονομάζονται απατίτες. Σύμφωνα με κάποιους ερευνητές ο όρος «απατίτης» προέρχεται από την ελληνική λέξη «απατώ» (κοροϊδεύω) [6]. Ο χαρακτηρισμός αυτός οφείλεται στο γεγονός ότι τα συγκεκριμένα υλικά παρουσιάζουν περίεργη χημική σύσταση, μια και είναι πολύ συνηθισμένες χημικές αντικαταστάσεις των ιοντικών ειδών τους, που καθιστούν δύσκολη την ταυτοποίηση της χημικής τους σύστασης και μπορεί να οδηγήσουν σε παρερμηνείες. Στην περίπτωση του βιολογικού απατίτη, η κύρια χημική αντικατάσταση που λαμβάνει χώρα είναι η αντικατάσταση μέρους των φωσφορικών ιόντων (PO 3-4 ) και των ΟΗ - του ΗΑΡ από ανθρακικά ιόντα (CO 2-3 ) [7,8]. Πρόκειται για την πιο σημαντική αντικατάσταση χημικών ειδών μια και η κ.β. περιεκτικότητα των ανθρακικών στον απατίτη των οστών ανέρχεται περίπου στο 7%. Εξαιτίας της σημαντικής ποσότητας των CO 2-3, ο βιοαπατίτης του οστού θεωρείται ως ένας τύπος ανθρακικού απατίτη. Από κει και πέρα, έχει βρεθεί ότι στο κρυσταλλικό πλέγμα του ενσωματώνονται διάφορα άλλα ιόντα, σε μικρές όμως ποσότητες, όπως Νa +, Mg 2+ και K + στις θέσεις των Ca 2+, και F -, Cl - αντί ΟΗ - [8-10]. Οι ιοντικές αντικαταστάσεις παρουσιάζονται αναλυτικά στον πίνακα 1.1. Επίσης, διχογνωμία επικρατεί και σχετικά με την περιεκτικότητα του ΒΑΡ σε ΟΗ -. Έχει προταθεί ότι δεν περιέχει καθόλου υδροξύλια [11] ενώ άλλοι ερευνητές εκφράζουν διαφορετική άποψη υποστηρίζοντας ότι ο βιοαπατίτης περιέχει το 20% της περιεκτικότητας του υδροξυαπατίτη σε υδροξύλια [12]. Γίνεται κατανοητό λοιπόν από τα παραπάνω πόσο δύσκολη είναι η ακριβής γνώση της χημικής σύστασης του ΒΑΡ από τη στιγμή που εμπλέκονται τόσες πολλές ιοντικές αντικαταστάσεις.

33 Κεφάλαιο 1 ο λ 3 Πίνακας 1.1: Χημική σύσταση του βιοαπατίτη του οστού. Παρουσιάζεται συγκριτικά και η χημική σύσταση του υδροξυαπατίτη [9] Σύσταση Βιοαπατίτης Υδροξυαπατίτης Ca (%κ.β.) 34,8 39,6 P (%κ.β.) 15,2 15,8 Ca/P (λόγος μορίων) 1,71 1,67 Na (%κ.β.) 0,90 Mg (%κ.β.) 0,72 K (%κ.β.) 0,03 CO 3 2 (%κ.β.) 7,40 F (%κ.β.) 0,03 Cl (%κ.β.) 0,13 P 2 O 4 7 (%κ.β.) 0,07 Ο de Jong [13] ήταν ο πρώτος που ήδη από το 1926 είχε διαπιστώσει ότι το οργανικό τμήμα του οστού έχει παρόμοια δομή με αυτή του υδροξυαπατίτη και τα αποτελέσματά του έκτοτε επιβεβαιώθηκαν από πάμπολλους ερευνητές. Παρ όλα αυτά, αποκαλύφθηκε στη συνέχεια ότι τα δύο υλικά χαρακτηρίζονται και από σημαντικές διαφορές τόσο από μικροσκοπικής όσο και από κρυσταλλογραφικής απόψεως. Μια πολύ σημαντική ιδιότητα του βιοαπατίτη η οποία τον διαφοροποιεί από το συνθετικό ΗΑΡ, είναι το γεγονός ότι οι κρυσταλλίτες του έχουν διαστάσεις νανομέτρων σε αντίθεση με τον υδροξυαπατίτη του οποίου οι κρύσταλλοι είναι περίπου 1 τάξη μεγέθους μεγαλύτεροι. Έχουν σχήμα πλακοειδές (plate-like) με διαστάσεις περίπου nm όπου η πλευρά με το μεγαλύτερο μήκος αντιστοιχεί στην c-κρυσταλλογραφική διεύθυνση και η άλλη στην a και εξαιρετικά μικρό πάχος που κυμαίνεται γύρω στα 2-4 nm [14-16]. Κατά τη διεύθυνση του πάχους δηλαδή, ο κρύσταλλος αποτελείται από μερικές μόνο στοιχειώδεις κυψελίδες (unit cells)! Ένα ακόμα στοιχείο διαφοροποίησης μεταξύ βιοαπατίτη και υδροξυαπατίτη αποτελεί η ύπαρξη ατελειών στους κρυσταλλίτες του ΒΑΡ. Η εκτεταμένη αντικατάσταση των βασικών ιόντων του ΒΑΡ (Ca 2+, PO 3-4 ) από άλλα ιόντα, όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, προκαλεί απώλεια της συμμετρίας του κρυσταλλίτη. Επίσης, ο ΒΑΡ είναι γνωστό ότι χαρακτηρίζεται από παραμόρφωση (strain) των κρυσταλλιτών του [17], φαινόμενο το οποίο όπως και οι χημικές αντικαταστάσεις, είτε δεν παρατηρείται ή εμφανίζεται σε μικρότερο εύρος στην περίπτωση του ΗΑΡ. Πάντως, οι κρυσταλλίτες του βιοαπατίτη βρίσκονται σε μια δυναμική κατάσταση όπου κατά τη

34 4 Σύσταση και δομή οστέινου ιστού διάρκεια της ζωής υπόκεινται σε μεταβολές των κρυσταλλογραφικών τους παραμέτρων, βιώνοντας μια διαδικασία «ωρίμανσης» (maturation) η οποία σταδιακά τους οδηγεί σε μια κατάσταση με μεγαλύτερη χημική και δομική συγγένεια με τους κρυσταλλίτες του ΗΑΡ [18-21]. Ένα επίσης σημαντικό θέμα που σχετίζεται με το βιοαπατίτη των οστών και αποτελεί σημείο επιστημονικής αντιπαράθεσης, είναι η διαδικασία σχηματισμού του. Το 1965 ο Eanes [22] διαπίστωσε ότι κατά την in vitro διαδικασία καταβύθισης του υδροξυαπατίτη, μεσολαβούσε αρχικά ο σχηματισμός άμορφου φωσφορικού ασβεστίου (ACP) το οποίο στη συνέχεια μετατρεπόταν σε υδροξυαπατίτη. Λίγο αργότερα ο Brown πρότεινε ως πρόδρομη φάση σχηματισμού του υδροξυαπατίτη και το φωσφορικό οκτασβέστιο [Ca 8 H 2 (PO 4 ). 6 5H 2 O, OCP] [23]. Επίσης, άλλες ενώσεις οι οποίες θεωρήθηκαν ως πρόδρομες φάσεις του υδροξυαπατίτη είναι το διένυδρο φωσφορικό διασβέστιο (CaHPO. 4 2H 2 O, DCPD) [24,25] και το βήτα φωσφορικό τριασβέστιο [β-ca 3 (PO 4 ) 2, β-tcp] [26]. Τα παραπάνω υλικά έχει βρεθεί ότι μπορούν να συνυπάρχουν ακόμα και σε περιπτώσεις παθολογικής ασβεστοποίησης συγκεκριμένων οργάνων [27-30]. Όλα τα παραπάνω οδήγησαν στην ανάπτυξη της θεωρίας των πρόδρομων φάσεων σύμφωνα με την οποία, αφού ο σχηματισμός του ΗΑΡ ο οποίος χαρακτηρίζεται από εξαιρετική χημική και δομική συγγένεια με το βιοαπατίτη περιλαμβάνει την παρουσία άλλων μετασταθών φωσφορικών ασβεστίων τα ίδια αυτά υλικά θα αποτελούν και πρόδρομες φάσεις στο σχηματισμό του ΒΑΡ. Παρά το γεγονός ότι η συγκεκριμένη θεωρία έχει βρει αρκετούς υποστηριχτές ωστόσο, δεν είχε καταστεί δυνατό μέχρι στιγμής να διαπιστωθεί η ύπαρξη αυτών των πρόδρομων φάσεων στα αρχικά στάδια της ασβεστοποίησης των οστών, παρέχοντας επιχειρήματα στους πολέμιούς της. Προσφάτως όμως, ο Crane χρησιμοποιώντας μικροσκοπία Raman διαπίστωσε την ύπαρξη OCP και πιθανώς και ACP στα αρχικά στάδια ασβεστοποίησης του κρανίου ποντικιών [31]. Αυτή η παρατήρηση θεωρείται σήμερα ως η πιο απτή απόδειξη για την ισχύ της θεωρίας των πρόδρομων φάσεων [32]. Από την άλλη, υπάρχει μια άλλη ομάδα ερευνητών οι οποίοι αντιτίθενται στη συγκεκριμένη προσέγγιση, υποστηρίζοντας ότι ο ΒΑΡ είναι η μοναδική φάση που κρυσταλλώνεται στο οστό, χωρίς να περιλαμβάνονται άλλες πρόδρομες φάσεις [33-35]. Υποστηρίζεται ότι η παρατηρούμενη αύξηση της κρυσταλλικότητας του ΒΑΡ με αύξηση της ηλικίας δεν οφείλεται στη μετατροπή του ACP προς ΒΑΡ αλλά στην αύξηση του μεγέθους των κρυσταλλιτών του ΒΑΡ. Αυτό το συμπέρασμα εδράζεται

35 Κεφάλαιο 1 ο λ 5 κυρίως στην αδυναμία να εντοπιστούν οι προτεινόμενες πρόδρομες φάσεις σε πραγματικά δείγματα [36,37]. Επίσης, η ύπαρξη μη απατιτικών ιόντων, όπως τα όξινα φωσφορικά, που εντοπίζονται στο νεοσχηματισθέν οστό [38] και τα οποία μειώνονται αυξανομένης της ηλικίας, θεωρήθηκε ότι δεν αποτελούν ένδειξη ύπαρξης DCPD ή OCP αλλά, περιέχονται στην ένυδρη στοιβάδα που περιβάλει τους νανοκρυστάλλους του ΒΑΡ. Στο σημαντικό αριθμό όξινων φωσφορικών ιόντων αυτής της στοιβάδας κατά τα πρώτα στάδια σχηματισμού του οστού αποδόθηκαν και τα αποτελέσματα του Crane [33]. Άσχετα πάντως με το ποια από τις δύο θεωρίες ευσταθεί, η ύπαρξη αυτής της ένυδρης στοιβάδας γύρω από τους κρυστάλλους τόσο του βιοαπατίτη όσο και του συνθετικού υδροξυαπατίτη, αποτελεί ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό αυτών των υλικών [39,40]. Πρόκειται για μια στοιβάδα η οποία υπολογίζεται ότι έχει πάχος μόλις 1 nm και αποτελείται από μια άμορφη φάση που περιέχει κυρίως δεσμευμένα μόρια νερού καθώς επίσης και σημαντικές ποσότητες από διάφορα ιόντα όπως Ca 2+, CO 2-3, HPO 2-4, Mg 2+ κ.α. (βλ. εικόνα 1.1). Η προέλευση αυτής της υπερκείμενης φάσης δεν έχει ακόμα προσδιοριστεί μια και μελέτες με διάφορες τεχνικές δίνουν αντιφατικά αποτελέσματα. Αρκετές πληροφορίες σχετικά με τις προσπάθειες χαρακτηρισμού αυτής της στοιβάδα δίνονται στο άρθρο που πρόσφατα δημοσίευσε ο Rey [41]. Πάντως, η ύπαρξή της δίνει πολύ ιδιαίτερα χαρακτηριστικά στα απατιτικά υλικά και κάνει δυνατή την κατανόηση του ρόλου που διαδραματίζουν στην ομοιόσταση. Η στοιβάδα αυτή αποτελεί μια δεξαμενή ιόντων, η οποία έχει διαφορετική σύσταση από το χημικό περιβάλλον του περιβάλλει τον οστέινο ιστό και τα οποία ιόντα μπορεί ο οργανισμός να τα χρησιμοποιήσει όπου απαιτείται ανάγκη. Εικόνα 1.1: Κρυσταλλίτης απατίτη μαζί με την ένυδρη στοιβάδα που τον περιβάλλει [42]

36 6 Σύσταση και δομή οστέινου ιστού Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα παραπάνω, γίνεται όλο και πιο κατανοητός ο λόγος στον οποίο οφείλεται η προέλευση του ονόματος απατίτης. Αν και ο βιοαπατίτης είναι ένα ανόργανο άλας του φωσφορικού ασβεστίου ωστόσο, η ιδιαίτερα ευμετάβλητη σύστασή του και η περιπλοκότητα της δομής του, του προσάπτουν μοναδικές ιδιότητες οι οποίες ακόμα και μετά από σχεδόν ένα αιώνα έρευνας, δεν έχουν ακόμα εξερευνηθεί πλήρως Σύσταση και δομή της οργανικής φάσης Κολλαγόνο Η οργανική φάση διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο στις μηχανικές και βιοχημικές ιδιότητες του οστού. Αυτές οι λειτουργίες οφείλονται σε ένα πλήθος από πρωτεΐνες που περιέχει και κυρίως στο κολλαγόνο τύπου Ι που αποτελεί το κυρίαρχο μέλος της οργανικής φάσης. Το κολλαγόνο αποτελεί την πιο διαδεδομένη πρωτεΐνη στον οργανισμό των θηλαστικών μια και συνιστά πάνω από το 50% των πρωτεϊνών του οργανισμού, το μεγαλύτερο μέρος της οποίας απαντάται στον οστέινο ιστό. Η σύνθεση του κολλαγόνου πραγματοποιείται στο εσωτερικό των κυττάρων, με τη μορφή ενός μορίου που ονομάζεται προκολλαγόνο. Ακολούθως, το προκολλαγόνο οδηγείται εκτός κυττάρου, υπόκειται σε υδρόλυση ενώ μειώνεται και το μήκος του με την απομάκρυνση κάποιων αμινοξέων του από τα άκρα και έτσι μετατρέπεται σε κολλαγόνο (το οποίο ονομάζεται και τροποκολλαγόνο) [43]. Οι πρωτοπόρες μελέτες για την αποσαφήνιση της δομής του μορίου του κολλαγόνου έλαβαν χώρα στη δεκαετία του Διαπιστώθηκε λοιπόν ότι πρόκειται για μια πρωτεΐνη σχετικά μεγάλου μεγέθους (300 kda) με μήκος που φθάνει περίπου τα 300 nm και πλάτος 1,5 nm [44]. Λίγο αργότερα αποκαλύφθηκε ότι το μόριο του κολλαγόνου δεν αποτελείται από μία αλλά από τρεις μακρομοριακές αλυσίδες [45]. Οι δύο από αυτές είναι όμοιες (α1 (Ι) chains) ενώ η τρίτη διαφέρει (α2 (Ι) chain). Το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό τους όμως είναι το γεγονός ότι οι τρεις αλυσίδες σχηματίζουν μια ελικοειδή δεξιόστροφη δομή (εικ. 1.2) [46,47] και ενώνονται μεταξύ τους με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ του αμινοξέους υδροξυπρολίνη και άλλων φορτισμένων καταλοίπων (residues) [48]. Κάθε μια από τις τρεις αλυσίδες του κολλαγόνου συνίσταται από ένα κύριο σκελετό από 1014 αμινοξέα ενώ υπάρχουν επίσης πλευρικά τμήματα μικρού μήκους, αποτελούμενα από 20 περίπου αμινοξέα, ευρισκόμενα σε αμινοτελικά και καρβοξυλικά άκρα τα οποία ονομάζονται τελοπεπτίδια. Τα αμινοξέα του κολλαγόνου και η αναλογία

37 Κεφάλαιο 1 ο λ 7 τους δίνονται στον πίνακα 1.2. Ένα χαρακτηριστικό της ακολουθίας των αμινοξέων του κύριου σκελετού είναι το γεγονός ότι η γλυκίνη (Gly), η οποία είναι και το συνηθέστερο αμινοξύ του κολλαγόνου, επαναλαμβάνεται μετά από κάθε τρία αμινοξέα. Η σειρά διαδοχής δηλαδή είναι Gly-X-Y, όπου Χ και Υ είναι άλλα αμινοξέα. Στα 1014 επομένως αμινοξέα του κύριου σκελετού, το συγκεκριμένο μοτίβο διαδοχής επαναλαμβάνεται 338 φορές [49]. Συνήθως, στη θέση του Χ βρίσκεται η προλίνη (Pro) και του Υ η υδροξυπρολίνη (Ηyp), τα οποία είναι μετά τη γλυκίνη τα μεγαλύτερα σε αφθονία αμινοξέα. Υπάρχουν ακόμα 20 διαφορετικές τριάδες, όπου στις θέσεις Χ και Υ δεν είναι Pro και Hyp, οι οποίες εμφανίζονται με συχνότητα 1% και άλλες 70 τριάδες που δεν εμφανίζονται παραπάνω από 1-3 φορές [50]. Εικόνα 1.2: Ελικοειδής δομή του κολλαγόνου Μία ακόμα σημαντική παράμετρος της δομής του κολλαγόνου είναι η συμμετοχή στις μακρομοριακές αλυσίδες μορίων νερού [51,52]. Η τριπλή έλικα του κολλαγόνου διαθέτει ισχυρά συνδεδεμένα μόρια νερού και τα πειραματικά δεδομένα καταδεικνύουν ότι δεν πρόκειται απλά για μεμονωμένα μόρια αλλά για ένα ολόκληρο δίκτυο [53,54]. Τα μόρια του νερού έχει προκύψει ότι ενώνονται τόσο μεταξύ τους όσο και με συγκεκριμένα άτομα από τη δομή της τριπλής έλικας [55]. Γενικότερα, είναι γνωστό ότι ένας παράγοντας σταθεροποίησης της δομής των πρωτεϊνών είναι η συμμετοχή του καρβονυλίου και της αμιδικής ομάδας στη δημιουργία δεσμών του τύπου NH. C=O [56]. Στην περίπτωση όμως του κολλαγόνου παρατηρείται σημαντική έλλειψη αυτών των δεσμών, οι οποίοι είναι αρκετά λιγότεροι από όσους θα αναμένονταν. Από την άλλη, σε κάθε τριπλέτα αμινοξέων του μοτίβου Gly-Χ-Υ η αμιδική ομάδα της γλυκίνης σχηματίζει δεσμό υδρογόνου με το καρβονύλιο του αμινοξέους στη θέση Χ της γειτονικής αλυσίδας. Από αυτό το γεγονός προκύπτει ότι τα καρβονύλια της γλυκίνης και του αμινοξέος στη θέση Υ μένουν χωρίς διαθέσιμη αμιδική ομάδα ώστε να σχηματίσουν με τη σειρά τους δεσμούς υδρογόνου. Επιπλέον,

38 8 Σύσταση και δομή οστέινου ιστού επειδή το υδροξύλιο της υδροξυπρολίνης βρίσκεται σε απομακρυσμένη θέση σε σχέση με τον κύριο σκελετό της τριπλή έλικας, δεν έχει την κατάλληλη απόσταση ώστε να σχηματίσει αυτό δεσμούς υδρογόνου με τα διαθέσιμα καρβονύλια. Τις λύσεις σε αυτές τις φαινομενικές ασυμβατότητες δίνει η ύπαρξη των μορίων του νερού. Το νερό λοιπόν, καλύπτει όλες τις διαθέσιμες θέσεις για τη δημιουργία δεσμών υδρογόνου και έτσι σταθεροποιεί την τριπλή έλικα [57,58]. Πίνακας 1.2: Αμινοξέα κολλαγόνου από διάφορους οργανισμούς και όργανα και η % w/w αναλογία τους [59] Αμινοξέα Κολλαγόνο ανθρώπινου οστού Σύσταση (% w/w) Κολλαγόνο ανθρώπινου τένοντα Κολλαγόνο βόειου οστού Αλανίνη 10,9 10,3 10,7 Γλυκίνη 25,8 25,4 25,7 Βαλίνη 2,97 3,10 2,90 Λευκίνη 3,60 3,57 3,69 Ισολευκίνη 1,88 1,53 1,25 Προλίνη 15,3 15,2 14,7 Φαινυλαλανίνη 2,49 2,46 2,83 Τυροσίνη 0,86 0,60 0,78 Σερίνη 4,06 4,05 4,37 Θρεονίνη 2,35 2,30 2,56 Κυστεΐνη Μεθιονίνη 0,84 0,90 1,05 Αργινίνη 8,80 8,90 9,50 Ιστιδίνη 0,96 0,87 0,84 Λυσίνη 4,40 3,29 3,84 Θρυπτοφάνη Ασπαργανικό οξύ 6,7 6,7 7,0 Γλουταμινικό οξύ 11,4 11,1 11,5 Υδροξυπρολίνη 14,1 12,6 13,0 Υδροξυλυσίνη 0,62 1,50 1,39 Σημαντικό ρόλο σ αυτή τη δομή διαδραματίζει η υδροξυπρολίνη. Αναφέρθηκε και παραπάνω ότι το υδροξύλιό της μπορεί να συμμετάσχει στη δημιουργία δεσμών υδρογόνου με τα καρβονύλια των άλλων αμινοξέων. Ουσιαστικά δηλαδή, η

39 Κεφάλαιο 1 ο λ 9 υδροξυπρολίνη λειτουργεί ως δότης θέσεων για την πραγματοποίηση δεσμών υδρογόνου. Αυτό το χαρακτηριστικό του συγκεκριμένου αμινοξέος το ανάγει σε σημαντικό παράγοντα της σταθερότητας της ελικοειδής δομής του κολλαγόνου Μη κολλαγονούχες πρωτεΐνες Εκτός από το κολλαγόνο στην οργανική φάση του οστού συμμετέχουν 200 ή και περισσότερες μη κολλαγονούχες πρωτεΐνες, οι οποίες όμως συνιστούν ένα πολύ μικρό μέρος της [60,61]. Ένα από τα πιο σημαντικά μέλη αυτής της κατηγορίας είναι η οστεοκαλσίνη, οποία αποτελεί περίπου το 10-20% της κ.β. αναλογίας των μη κολλαγονούχων πρωτεϊνών. Πρόκειται για μια μικρού μεγέθους πρωτεΐνη (5,8 kda) το κύριο χαρακτηριστικό της οποίας αποτελεί το γεγονός ότι τρία κατάλοιπα γλουταμινικού οξέος καρβοξυλιώνονται, ως αποτέλεσμα μιας διαδικασία μετάφρασης εξαρτώμενη από τη βιταμίνη Κ. Η συγκεκριμένη καρβοξυλίωση προσδίδει στην οστεοκαλσίνη την ικανότητα πρόσδεσης σ αυτή ασβεστίου, ανάγοντάς την έτσι σε ένα σημαντικό παράγοντα της ασβεστοποίησης του κολλαγόνου. Πιστεύεται ότι λειτουργεί ως αναστολέας του σχηματισμού νέου οστού ενώ έχει βρεθεί ότι επηρεάζει διάφορα ποιοτικά χαρακτηριστικά του βιοαπατίτη όπως είναι το μέγεθος των κρυσταλλιτών του και η ποσότητα των ανθρακικών ιόντων του [62]. Εκτός από την οστεοκαλσίνη υπάρχουν και άλλες πρωτεΐνες οι οποίες θεωρείται ότι σχετίζονται με τη σύνθεση και τις λειτουργίες της ανόργανης φάσης όπως είναι η κρυστάλλωση και η κρυσταλλική ανάπτυξη. Επίσης, σημαντικός αριθμός πρωτεϊνών του οστού όπως είναι οι οστεοποντίνη, οστική σιαλοπρωτεΐνη, οστική όξινη γλυκοπρωτεΐνη, θρομβοσποντίνη και φιμπρονεκτίνη, περιέχουν σε σημαντικό βαθμό την ακολουθία αμινοξέων αργινίνη-γλυκίνη-ασπαρτικό οξύ η οποία είναι χαρακτηριστική μιας οικογένειας πρωτεϊνών που δεσμεύονται στην κυτταρική μεμβράνη, των ιντεγκρινών. Οι ιντεγκρίνες έχουν την ικανότητα να ανοίγουν την κυτταρική μεμβράνη και να συνδέουν το εξωκυττάριο περιβάλλον με τον κυτταροσκελετό. Στην περίπτωση οστικών κυττάρων δηλαδή των οστεοβλαστών και των οστεοκλαστών, ανοίγουν την κυτταρική τους μεμβράνη και προκαλούν την έκφραση του φαινότυπού τους [63] οδηγώντας με αυτό τον τρόπο στη σύνθεση και καταστροφή του οστού, όπως θα εξηγηθεί στη συνέχεια. Επιπλέον, στο οστό υπάρχουν σε πολύ μικρά ποσοστά και άλλες πρωτεΐνες και οργανικές ενώσεις όπως είναι η οστεοπρωτογενίνη (OPG), η ινερφερόνη-γ, οι ιντερλευκίνες, οι μορφογενετικές πρωτεΐνες του οστού (ΒΜP), οι κυτταροκίνες και οι

40 10 Σύσταση και δομή οστέινου ιστού αυξητικοί παράγοντες TGF και IGF. Οι παραπάνω ουσίες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση διαφόρων λειτουργιών του οστέινου σκελετού όπως η διαίρεση, η αύξηση και η λειτουργικότητα των κυττάρων ενώ οι αυξητικοί παράγοντες συντελούν στις διαδικασίες σχηματισμού και ανάπτυξης του οστού [48]. Τέλος, στον οστέινο ιστό βρίσκεται και ένα μικρό ποσοστό λιπιδίων τα οποία πιστεύεται ότι παίζουν κάποιο ρόλο στην κρυστάλλωση του βιοαπατίτη [64] Κύτταρα Εκτός από τα βασικά δομικά συστατικά του (βιοαπατίτης-κολλαγόνο) στο οστό υπάρχει και ένας σημαντικός αριθμός κυττάρων. Τα κύτταρα αυτά είναι τριών ειδών, οι οστεοβλάστες, οι οστεοκλάστες και τα οστεοκύτταρα και η κύρια λειτουργία τους είναι η ρύθμιση του μεταβολισμού του οστού. Αυτοί οι τρεις τύποι κυττάρων προέρχονται από δυο διαφορετικές γενεαλογίες βλαστικών κυττάρων, τα μεσοδερματικά και τα αιμοποιητικά, υπογραμμίζοντας τη μοναδικότητα της διαδικασίας ομοιόστασης του οστού και της στενής σχέσης που το συνδέει με το ανοσοποιητικό σύστημα. Οστεοβλάστες: Πρόκειται για κύτταρα μεγέθους γύρω στα μm τα οποία είναι υπεύθυνα για την απόθεση της οργανικής εξωκυττάριας μήτρας και της ασβεστοποίησής της. Γι αυτό το λόγο παρατηρούνται συνήθως σε περιοχές που συμβαίνει ασβεστοποίηση. Χαρακτηρίζονται από δομή που περιλαμβάνει εκτεταμένο ενδοπλασματικό δίκτυο και άλλα κυτταρικά χαρακτηριστικά τα οποία είναι σύμφωνα με το ρόλο τους ως κύτταρα πρωτεϊνικής σύνθεσης και έκκρισης πρωτεϊνών. Οστεοκλάστες: Προέρχονται από αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα και δημιουργούνται από τη διαίρεση ενός μονοπυρηνικού πρόγονου κυττάρου. Τα μορφολογικά τους χαρακτηριστικά είναι παρόμοια με αυτά άλλων φαγωτικών κυττάρων. Είναι σχετικά μεγάλου μεγέθους (όγκου πάνω από μm 3 ) ενώ διαθέτουν πάνω από 100 πυρήνες. Ο ρόλος τους είναι η απορρόφηση (αποικοδόμηση) του ήδη σχηματισμένου οστού. Αυτό επιτυγχάνεται με την έκκριση ινωδών πρωτεϊνών οι οποίες προκαλούν την αποικοδόμηση του οστού. Οστεοκύτταρα: Τα οστεοκύτταρα είναι ουσιαστικά απόγονοι των οστεοβλαστών. Πρόκειται για οστεοβλάστες οι οποίοι μετά τη διαδικασία σχηματισμού του οστού

41 Κεφάλαιο 1 ο λ 11 παρέμειναν σε κοιλότητες του νεοσχηματισθέντος οστού. Είναι δηλαδή, αποτέλεσμα μιας διαδικασίας «αυτό-ενταφιασμού» των οστεοβλαστών εξαιτίας της ίδιας της λειτουργίας, της έκκρισης οργανικής μήτρας, που επιτελούν. Ο κύριος ρόλος τους είναι να συντελούν στη μεταφορά υλικών από το υγρό περιβάλλον του ιστού στο οστό και αντιστρόφως. Αναφέρθηκε παραπάνω ότι οι οστεοβλάστες είναι υπεύθυνοι για το σχηματισμό των οστών ενώ οι οστεοκλάστες για την καταστροφή τους. Αυτή είναι μια διαδικασία μοναδική για τον οργανισμό καθώς ο οστέινος είναι ο μόνος ιστός ο οποίος οικοδομείται και αποικοδομείται συνεχώς κατά τη διάρκεια της ζωής του. Μάλιστα το συγκεκριμένο φαινόμενο δεν παρατηρείται ούτε καν στους άλλους ασβεστοποιημένους ιστούς (δόντια, τένοντες) και ονομάζεται οστική ανακατασκευή (bone remodeling). Η οστική ανακατασκευή είναι ένα περιοδικό φαινόμενο το οποίο χαρακτηρίζεται από μια περίοδο 3-6 μηνών και βασίζεται στη συνδυασμένη λειτουργία οστεοβλαστών και οστεοκλαστών. Κατά τη συγκεκριμένη διαδικασία, οι οστεοκλάστες συγκεντρώνονται στην υπό αποικοδόμηση περιοχή και εκκρίνουν Η +, πιθανότατα υπό τη μορφή γαλακτικού οξέως, έτσι ώστε να δημιουργήσουν όξινο περιβάλλον και πρωτεάσες όπως είναι η πρωτεογλυκανάση και η κολλαγενάση [65]. Αυτό το όξινο περιβάλλον μαζί με την παρουσία των συγκεκριμένων ενζύμων προκαλούν τόσο τη διάλυση του βιοαπατίτη όσο και την αποσύνθεση των πρωτεϊνών του οστού. Μετά την αποικοδόμηση της συγκεκριμένης περιοχής οι οστεοκλάστες εξαφανίζονται και σ αυτή την περιοχή εμφανίζονται οι οστεοβλάστες ώστε να ξεκινήσουν τη διαδικασία σύνθεσης του νέου οστού. Αρχικά, αποθέτουν την εξωκυτταρική μήτρα (κολλαγόνο Ι) και στη συνέχεια ελέγχουν την ασβεστοποίησή της εκκρίνοντας αυξητικούς παράγοντες [66]. Μια κρίσιμη παράμετρος όμως της οστικής ανακατασκευής είναι η σύζευξη (coupling) οστεοβλαστών και οστεοκλαστών. Με τον όρο σύζευξη εννοείται η συνεργασία αυτών των κυττάρων για τη επίτευξη της οστικής ανακατασκευής. Απαραίτητη προϋπόθεση για την εύρυθμη λειτουργία της διαδικασίας είναι η μάζα του οστού που αποικοδομείται να είναι ισόποση με αυτή που σχηματίζεται. Σε διαφορετική περίπτωση έχουμε την εμφάνιση μεταβολικών ασθενειών (οστεοπόρωση, οστεοπέτρωση, οστεομαλακία κ.α.). Επομένως, απαιτείται εύρυθμη συνεργασία μεταξύ των κυττάρων. Ο τρόπος με τον οποίο επιτυγχάνεται αυτό είναι μέσω της έκφρασης από τους οστεοβλάστες των κυτταροκινών που ρυθμίζουν την κυτταρική διαίρεση των οστεοκλαστών, όπως είναι οι κυτταροκίνες M-CSF, RANKL και OPG [67].

42 12 Σύσταση και δομή οστέινου ιστού Η όλη διαδικασία της οστικής ανακατασκευής μπορεί να χωριστεί σε 5 φάσεις (εικ 1.3). Το πρώτο στάδιο περιλαμβάνει την ενεργοποίηση (activation) της διαδικασίας. Στο στάδιο αυτό δίνεται σήμα στους οστεοκλάστες να μεταβούν στο σημείο το οποίο πρόκειται να υποστεί ανακατασκευή. Στη συνέχεια ακολουθεί το στάδιο της απορρόφησης όπου αρχίζει η αποικοδόμηση της οργανικής και της ανόργανης φάσης από τους οστεοκλάστες. Μετά την ολοκλήρωση της αποικοδόμησης η διαδικασία αντιστρέφεται, συνιστώντας το στάδιο της αντιστροφής (reversal) κατά το οποίο κολλαγόνο εναποτίθεται στην αποικοδομημένη περιοχή από τους οστεοβλάστες. Στο στάδιο του σχηματισμού (formation) που ακολουθεί, πραγματοποιείται η ασβεστοποίηση του κολλαγόνου και η ολοκλήρωση της διαδικασίας σχηματισμού νέου οστού. Ακολουθεί τέλος, το στάδιο της ηρεμίας (quiescence) όπου το οστό παραμένει σε ανενεργή φάση [68] Μυελός Είναι ένας μαλακός πολτώδης ιστός ο οποίος αποτελείται από ένα αραιό στρώμα ελεύθερων αιμοκυττάρων και αγγεία που συμπληρώνουν τα διάκενά του. Η σύνθεση του διαφέρει στα διάφορα οστά και στις διάφορες ηλικίες και εμφανίζεται σε δύο μορφές, τον ωχρό ή λιπώδη και στον ερυθρό μυελό. Κατά την εμβρυακή ηλικία σ όλο τον σκελετό υπάρχει ερυθρός μυελός του οποίου η χροιά οφείλεται στην αφθονία των αγγείων και των ερυθροκυττάρων. Μετά το πέμπτο έτος περίπου της ηλικίας του ανθρώπου ο ερυθρός μυελός αντικαθίσταται σταδιακά από τον ανενεργό, σε σχέση με την αιμοποίηση, ωχρό μυελό. Από το εικοστό έως το εικοστό πέμπτο έτος της ηλικίας του ανθρώπου, ο ερυθρός μυελός παραμένει μόνο στους σπονδύλους, το στέρνο, τα πλευρά, στα οστά του ισχίου, του κρανίου και στο άνω άκρο του μηριαίου και του βραχιόνιου οστού. Στα υπόλοιπα τμήματα του σκελετού κυριαρχεί ο ωχρός (υποκίτρινος) ή λιπώδης μυελός, η χρωματική χροιά του οποίου οφείλεται στην παρουσία των πολυπληθών λιπωδών κυττάρων που αποτελούν το κύριο συστατικό του. Μέρος των αγγείων του είναι τριχοειδούς μεγέθους το τοίχωμα των οποίων επιτρέπει την ελεύθερη δίοδο κυττάρων του ιστού μέσα στο αίμα.

43 Κεφάλαιο 1 ο λ 13 Εικόνα 1.3: Τα στάδια της οστικής ανακατασκευής [69] Νερό Μετά το βιοαπατίτη και το κολλαγόνο το νερό αποτελεί το τρίτο σε κ.β. αναλογία συστατικό του οστού. Αναφέρθηκε και παραπάνω ότι απαντάται τόσο στη στοιβάδα που βρίσκεται στην επιφάνεια των κρυσταλλιτών του βιοαπατίτη όσο και στη

44 14 Σύσταση και δομή οστέινου ιστού δομή της τριπλής έλικας του μορίου του κολλαγόνου. Μελέτες έχουν δείξει ότι το νερό ενώνεται με το κολλαγόνο σε δύο επίπεδα: με τις υδροφιλικές ομάδες του μορίου του κολλαγόνου (γλυκίνη, υδροξυλυσίνη, καρβοξύλια) αλλά και μέσω δεσμών υδρογόνου μεταξύ νερού και του υδροξυλίου της υδροξυπρολίνης [70,71]. Επίσης, νερό βρίσκεται και ανάμεσα στα άλλα συστατικά της οργανικής φάσης, όπως στο μυελό των οστών και ανάμεσα στους πόρους των ασβεστοποιημένων ινών κολλαγόνου. Αυτά τα μόρια νερού φαίνεται να είναι υπεύθυνα για την ιξωδοελαστική συμπεριφορά του οστού μια και το ξηρό οστό έχει φανεί ότι χάνει αυτή τη συμπεριφορά. Τέλος, το νερό του μυελού πιστεύεται ότι παίζει ένα ακόμα σημαντικό ρόλο μια και λειτουργεί ως μέσο για τη διέλευση όλων των απαραίτητων ιόντων για τη διατήρηση της ομοιοστασίας του οστού [72]. 1.3 Ιεραρχική δομή του οστού Αναφέρθηκε παραπάνω ότι τα βασικά δομικά συστατικά του οστού είναι ο βιοαπατίτης και το κολλαγόνο. Το οστό όμως είναι ένα σύνθετο υλικό με ιδιαίτερο χαρακτηριστικό την περίπλοκη δομή του. Είναι πραγματικά άξιος θαυμασμού ο τρόπος με τον οποίο διατάσσονται αυτά τα δύο υλικά έτσι ώστε να σχηματίσουν ένα τόσο πολύπλοκο ιστό. Βιοαπατίτης και κολλαγόνο δεν ενώνονται απλά για να συνθέσουν το οστό αλλά σχηματίζουν ιεραρχικές δομές που ξεκινούν από τα συγκεκριμένα μόρια και δημιουργουν ένα σύνθετο όργανο Ινίδια Το κατώτερο επίπεδο δομής περιλαμβάνει το σχηματισμό από το κολλαγόνο των ινιδίων (fibrils). Όπως έχει ήδη περιγραφεί, το μόριο του κολλαγόνου σχηματίζει μια ελικοειδή δομή αποτελούμενη από τρεις μακρομοριακές αλυσίδες. Τα μόριά του όμως έχουν την ιδιότητα να στοιχίζονται παράλληλα το ένα με το άλλο και να δημιουργούν έτσι ένα ραβδόμορφο σχηματισμό που ονομάζεται ινίδιο. Η μετάβαση της δομής από τις μακρομοριακές αλυσίδες στα ινίδια παρουσιάζεται στην εικόνα 1.4. Τα ινίδια χαρακτηρίζονται από διαμέτρους που κυμαίνονται μεταξύ nm [60] ενώ όσον αφορά τα μήκη τους είναι δεν υπάρχει σαφή εικόνα μια και συμβαίνει αλληλεπικάλυψη με τα γειτονικά ινίδια και αυτό το γεγονός δυσχεραίνει κατά πολύ τον προσδιορισμό του μήκους τους.