ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΑΜΥΛΟΥ ΑΠΟ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗ ΑΜΥΛΑΣΗ ΚΑΙ ΥΓΡΟ ΑΠΟΡΡΥΠΑΝΤΙΚΟ

Transcript

1 !Unexpected End of Formula l ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΑΜΥΛΟΥ ΑΠΟ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗ ΑΜΥΛΑΣΗ ΚΑΙ ΥΓΡΟ ΑΠΟΡΡΥΠΑΝΤΙΚΟ ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Γκέκας Γιώργος Δημητριάδου Άννα Τζελέπη Λαμπρινή

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος Περίληψη... 4 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Εισαγωγή Περί ενζύμων Ιστορική αναδρομή Ονομασία και κατηγορίες των ενζύμων Δομή των ενζύμων Μετουσίωση Ιδιότητες των ενζύμων Η εξειδίκευση των ενζύμων Η καταλυτική ισχύς των ενζύμων Πώς δουλεύουν τα ένζυμα Κινητική των ενζυμικών αντιδράσεων Επίδραση του ph στην ταχύτητα των ενζυμικών αντιδράσεων Επίδραση της θερμοκρασίας στην ταχύτητα των ενζυμικών αντιδράσεων Επίδραση της συγκεντρώσεως του ενζύμου στην ταχύτητα των ενζυμικών αντιδράσεων Επίδραση της συγκεντρώσεως του υποστρώματος στην ταχύτητα των ενζυμικών αντιδράσεων Ενζυμομηχανική Ένζυμα με βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον

3 Θερμοάντοχα ένζυμα Ένζυμα σε μη συμβατά μέσα Τα ένζυμα στα απορρυπαντικά Εισαγωγή Ασφάλεια και υγιεινή Ενθυλάκωση των ενζύμων Παγκόσμια αγορά Ένζυμα που υπάρχουν στα απορρυπαντικά Πρωτεάσες Αμυλάση Κυτταρινάσες Λιπάση Υπεροξειδάση

4 Πρόλογος Η παρούσα εργασία με τίτλο «Το πείραμα στη διδασκαλία της Χημείας- Τα ένζυμα στα απορρυπαντικά» εκπονήθηκε στα πλαίσια του μεταπτυχιακού προγράμματος «Διδακτική της Χημείας και Νέες Εκπαιδευτικές Τεχνολογίες» (ΔιΧηΝΕΤ), στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης και κατά τα έτη Σκοπός της εργασίας είναι η πειραματική διδασκαλία της Πράσινης Χημείας μέσω απλών πειραμάτων στα οποία προτείνεται η χρήση πιο φιλικών προς το περιβάλλον ενώσεων, οι οποίες αντικαθιστούν τις ήδη υπάρχουσες σε διάφορα χρηστικά αντικείμενα της καθημερινής μας ζωής, όπως π.χ. τα απορρυπαντικά. Στόχος επίσης είναι η παραγωγή εκπαιδευτικού υλικού για την δευτεροβάθμια ή τριτοβάθμια εκπαίδευση μετά από κατάλληλη επιλογή υλικού, καθοριζόμενο από τη βαθμίδα εκπαίδευσης στην οποία θα απευθύνεται. Θέλουμε να ευχαριστήσουμε τον Αναπλ. Καθ. κ. Μαρούλη Α., καθώς και την Επικ. Καθ. κα Χατζηαντωνίου- Μαρούλη Κ. για την επιλογή του θέματος, τη συνεχή παρακολούθηση καθόλη τη διάρκεια εκπόνησης της εργασίας, για τις πληροφορίες υποδείξεις και παρατηρήσεις τους καθώς και για την πολλαπλή και σχολαστική διόρθωση των κειμένων. Θεσσαλονίκη, Ιούνιος

5 Περίληψη Τα τελευταία πενήντα χρόνια τα απορρυπαντικά καθιερώθηκαν στη ζωή µας ως αναγκαιότητα. Η υπερκατανάλωση τους, όµως, είχε ως συνέπεια τη ρύπανση του περιβάλλοντος. Η χρήση τους είχε επιπτώσεις στην υγεία του ανθρώπου, συνετέλεσε στη µείωση των µη ανανεωσίµων πρώτων υλών και οδήγησε σε σπατάλη ενέργειας. Διέξοδος στα παραπάνω προβλήματα επιχειρήθηκε με τη σύνθεση και τη χρήση νέων απορρυπαντικών, φιλικών προς το περιβάλλον και τον άνθρωπο. Μία από τις λύσεις που έχει προτείνει η Πράσινη Χημεία στα σημερινά αδιέξοδα είναι η χρήση των ενζύμων στα προϊόντα καθαρισμού. Τα ένζυμα χρησιμοποιούνται ως εναλλακτική λύση κυρίως για τις σουλφονικές, τασενεργές ενώσεις που αποτελούν κύριο συστατικό των απορρυπαντικών, καθόσον προσφέρουν το πλεονέκτημα της μείωσης της θερμοκρασίας του πλυσίματος κατά 20 ο C αλλά και την ελάττωση της ποσότητας του απορρυπαντικού που απαιτείται για κάθε πλύση. Μερικές από τις πιο δηµοφιλείς κατηγορίες ενζύµων που χρησιµοποιούνται στην αγορά των ενζυµικών απορρυπαντικών είναι οι λιπάσες, οι πρωτεάσες, οι αµυλάσες και οι κυτταρινάσες. Η εργασία περιλαµβάνει µία σειρά πειραµάτων επιδείξεως καθώς και ένα πείραµα που θα εκτελείται από µαθητές-φοιτητές ώστε να κατανοηθεί η σηµασία των ενζύµων στα προϊόντα καθαρισµού. Το πρώτο πείραμα επιδείξεως αφορά στην υδρόλυση πρωτεϊνών από πρωτεάσες. Τα αντιδραστήρια- υλικά που απαιτούνται είναι: ένα απορρυπαντικό που περιέχει πρωτεάσες, η αλβουμίνη του αυγού και το 4

6 αντιδραστήριο της διουρίας. Το αντιδραστήριο της διουρίας δίνει χαρακτηριστικό μπλε- μωβ χρώμα κατά την αντίδρασή του με πρωτεΐνες. Το δεύτερο πείραμα επιδείξεως αφορά στην υδρόλυση των λιπών από το ένζυμο λιπάση. Τα αντιδραστήρια- υλικά που απαιτούνται είναι: ένα απορρυπαντικό που περιέχει λιπάση, ελαιόλαδο, καυστικό νάτριο και δείκτης φαινολοφθαλεΐνης. Το τρίτο πείραμα επιδείξεως αφορά στη διάσπαση του υπεροξειδίου του υδρογόνου από το ένζυμο καταλάση. Τα αντιδραστήρια- υλικά που απαιτούνται είναι υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% (οξυζενέ), μία πατάτα και νερό. Στο πείραμα για τους μαθητές- φοιτητές μελετάται η υδρόλυση του αμύλου από βακτηριακή αμυλάση. Πιο συγκεκριμένα εξετάζεται ποιοτικά η επίδραση του ph, της θερμοκρασίας και της συγκεντρώσεως της αμυλάσης στην ενζυματική δράση και κατ επέκταση στην ταχύτητα διάσπασης του αμύλου. Η αποτίμηση της υδρολύσεως γίνεται με το τεστ ιωδίου και το τεστ Benedict. Το τεστ ιωδίου ανιχνεύει την παρουσία αμύλου, ενώ το τεστ Benedict ανιχνεύει την παρουσία σακχάρου, πιστοποιώντας έτσι την υδρόλυση του προϊόντος. Τα αντιδραστήρια- υλικά που απαιτούνται είναι: διάλυμα βακτηριακής αμυλάσης, υδατοδιαλυτό άμυλο, διάλυμα ιωδίου, αντιδραστήριο Benedict, υδροχλωρικό οξύ και ρυθμιστικά διαλύματα. Στην εργασία περιλαμβάνεται επίσης πείραμα όπου αντικαταστάθηκε το διάλυμα της αμυλάσης από υγρό απορρυπαντικό του εμπορίου που περιέχει αμυλάση και διερευνήθηκε η δραστικότητά του. 5

7 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εισαγωγή H παγκόσμια αποδοχή των στόχων και των αρχών της Πράσινης Χημείας ως βασικών παραγόντων της Βιώσιμης Ανάπτυξης οδήγησαν τους χημικούς να σχεδιάσουν μη τοξικά προϊόντα μέσω διεργασιών που δε δημιουργούν απόβλητα και να προχωρήσούν σε λύσεις που αφορούν σε πολλούς τομείς της καθημερινής μας ζωής. Έτσι στο χώρο των απορρυπαντικών προτάθηκε η χρήση των ενζύμων. Τα ένζυμα πράγματι δίνουν πράσινες λύσεις στα τεράστια προβλήματα που δημιουργούνται στο περιβάλλον από τα συνήθη απορρυπαντικά. Η Πράσινη Χημεία είναι κεντρική επιστήμη αλλά η πραγματοποίηση των στόχων της απαιτεί διαπανεπιστημιακή προσέγγιση και στήριξη από την πολιτεία, τη βιομηχανία και την κοινωνία γενικότερα. 6

8 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1 Περί ενζύµων 1.1 Ιστορική Αναδροµή Διεργασίες που σήμερα γνωρίζουμε ότι οφείλονται σε ένζυμα ήταν γνωστές από τους αρχαίους χρόνους ακόμα. Η παρασκευή τυρού και άρτου, η δημιουργία κρασιού και ξυδιού ήταν γνωστά από την αρχαιότητα. Το 1783 ο Spallanzani παρατήρησε ότι το κρέας ρευστοποιείται από το γαστρικό υγρό του γερακιού, ενώ το 1787 ο Fabroni όρισε τη ζύμωση ως αποικοδόμηση μιας ουσίας από μία άλλη ουσία. Το 1814 ο Kirchhoff παρατήρησε ότι μια ουσία του σιταριού μπορεί να μετατρέπει το άμυλο σε σάκχαρο και δεξτρίνες. Η πρώτη περίπτωση ενζυμικής αντιδράσεως που δημοσιεύτηκε ήταν η διάσπαση του αμύλου από την αμυλάση. Το 1833 οι Payen και Persoz δημοσίευσαν ότι προσθέτωντας αλκοόλη σ ένα εκχύλισμα βύνης, έπαιρναν ένα άμορφο ίζημα, που όταν το διέλυαν ξανά ήταν σε θέση να διασπά το άμυλο. Τη δραστική ουσία του παρασκευάσματος, που σήμερα γνωρίζουμε ότι είναι η αμυλάση, οι δύο πιο πάνω ερευνητές την ονόμασαν διάσταση. Το 1836 ο Schwans παρασκεύασε πεψίνη από το στομάχι χοίρων και στα αμέσως επόμενα χρόνια μεγάλα ονόματα της Χημείας και Φυσιολογίας, όπως οι Wöhler, Liebig, Berthelot και Claude Bernard, ασχολήθηκαν με τη μελέτη ουσιών βιολογικής προελεύσεως οι οποίες όταν επιδρούσαν σε άλλες ενώσεις, πάλι βιολογικής προέλευσης, τις μετέτρεπαν προς διαφορετικές ενώσεις. 7

9 Η διαίσθηση του Berzelius ήταν εκείνη που έβαλε την ενζυμολογία στο σωστό δρόμο. Το 1837 o Berzelius δημοσίευσε ότι στους ζωντανούς οργανισμούς γίνονταν χιλιάδες καταλυτικές διεργασίες, που είχαν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία πολλών χημικών ενώσεων. Το 1871, ο Pasteur έδειξε ότι η ζύμη, που από το 1837 κιόλας είχε αποδειχθεί από τους Gagniard- Latour, Schwann και Kunzig ότι ήταν ζωντανός οργανισμός, ήταν απαραίτητη για την αλκοολική ζύμωση. Ο Pasteur μάλιστα ονόμασε τη ζύμη, καθώς και τα βακτήρια που παράγουν γαλακτικό οξύ «οργανωμένα φυράματα». Τα «οργανωμένα φυράματα», κατά τον Pasteur, δεν μπορούσαν να δράσουν έξω από τους οργανισμούς που τα δημιουργούσαν. Ο όρος ένζυμο προτάθηκε το 1878 από τον Kuhne που έτσι ήθελε να δηλώσει ότι η ουσία που προκαλεί ζύμωση βρίσκεται «εν ζύμη». Το 1894 ο Emil Fischer άρχισε σειρά ερευνών που οδήγησαν στην ανακάλυψη της εξειδίκευσης των ενζύμων. Το 1897, ο Bertrand ανακάλυψε ότι προκειμένου να δράσουν ορισμένα ένζυμα, απαιτούσαν την παρουσία ενώσεων χαμηλού μοριακού βάρους, που μπορούσαν να απομακρυνθούν από το παρασκεύασμα με διαπίδυση και τα ονόμασε «συνένζυμα». Η άποψη για την ύπαρξη του συμπλόκου ενζύμου- υποστρώματος προτάθηκε για πρώτη φορά το 1902 από τον Brown και τoν Henri και εδραιώθηκε θεωρητικά το από τους Michaelis και Menten το1913. Οι Briggs και Haldane το 1924 επέκτειναν και γενίκευσαν τη θεωρία Michaelis- Menten. To ο Monod και Jacod προσδιόρισαν τους γενετικούς μηχανισμούς σύνθεσης των πρωτεϊνών και εξήγησαν με μαθηματικές εξισώσεις το αλλοστερικό φαινόμενο (παράρτημα, σελ 72). Το 1966 επιτυγχάνεται η ακινητοποίηση ενζύμων από τους Ιάπωνες Chibota και Tonabe. Το 1968 ανακαλύπτονται τα ένζυμα περιορισμού που έδωσαν τόσο μεγάλη ώθηση στη Μοριακή Βιολογία και Βιοτεχνολογία. Το 1969 επετεύχθη η πρώτη σύνθεση ενζύμου. Στις αρχές του 1980 ο Sindey Altman και ο Thomas Cech ανακάλυψαν την ύπαρξη του μορίων RNA με καταλυτικές ιδιότητες. Έτσι καταρρίφθηκε ακόμα ένα δόγμα, ότι δηλαδή οι βιοκαταλύτες είναι πρωτεΐνες. Συνεπώς με τον 8

10 όρο ένζυμο εννοούμε τα βιολογικά μακρομόρια που παρουσιάζουν καταλυτική δράση. Η επιστήμη της Ενζυμολογίας, έχει κάνει εκπληκτικές προόδους τα τελευταία 50 χρόνια, κυρίως λόγω της εφαρμογής κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ στη διερεύνηση δομών αλλά και λόγω της αναπτύξεως διαφόρων τύπων φασματοφωτομετρίας για τη μελέτη κινητικών παραμέτρων. Μεγάλη ώθηση στη μελέτη της δομής και της κινητικής των ενζυμικών αντιδράσεων δόθηκε επίσης από την άμεση διάθεση στο εμπόριο καταλλήλως επισημασμένων ενώσεων και υποστρωμάτων. Η γνώση μας σχετικά με τους μηχανισμούς των ενζυμικών αντιδράσεων αυξάνει καθημερινά. Τα ένζυμα αποτέλεσαν μοχλούς ανάπτυξης νέων επιστημονικών κλάδων, όπως η γενετική του DNA, η πρωτεϊνική μηχανική, η ενζυμομηχανική και η μεταβολική μηχανική. Η συνεχιζόμενη μελέτη των ενζύμων ίσως οδηγήσει στην ανάπτυξη υπερκαταλυτών για την βιομηχανία, στην απομάκρυνση τοξικών ουσιών από ρυπογόνα απόβλητα, σε φάρμακα για την θεραπεία ασθενών κ.α. Πολλές αρρώστιες είναι αποτέλεσμα έλλειψης ενζύμων ή παρουσίας ελαττωματικών ενζύμων. Η έρευνα στην περιοχή αυτή σύντομα θα δώσει τη δυνατότητα διόρθωσης ανωμαλιών ή ακόμα και δημιουργίας υποκατάστατων αυτών των τόσο χρησίμων μορίων. 1.2 Ονοµασία και κατηγορίες των ενζύµων Στα ένζυμα δίδονται ονόματα που μας επιτρέπουν να τα ταξινομούμε. Η επιστημονική εταιρεία που είναι υπεύθυνη για την ονοματολογία και κατάταξη των ενζύμων είναι Διεθνής Ένωση Βιομηχανίας. Σύμφωνα με την Επιτροπή αυτήν υπάρχουν τρεις αποδεκτοί τρόποι για να αναφερθεί κάποιος σε ένα ένζυμο: ο κωδικός αριθμός EC, το συστηματικό όνομα και το κοινό όνομα. Σε μας περισσότερο γνωστά είναι τα συστηματικά ονόματα. Τα συστηματικά ονόματα αποτελούνται από δύο μέρη. Το ένα είναι το όνομα του υποστρώματος, και στην περίπτωση διμοριακών αντιδράσεων τα ονόματα των υποστρωμάτων με ένα δίστιγμο μεταξύ τους. Το άλλο μέρος που καταλήγει σε 9

11 άση, αναφέρεται στη φύση της αντίδρασης που καταλύεται από το ένζυμο. Τα κοινά ονόματα μοιάζουν πολύ με τα συστηματικά αλλά περιέχουν πολύ λιγότερη λεπτομέρεια και τις απολύτως απαραίτητες πληροφορίες, ώστε να είναι εφικτή η συνεννόηση. Ορισμένα πρωτεολυτικά ένζυμα κρατούν την κατάληξη ίνη αντί της ασης για καθαρά ιστορικούς λόγους. Σε όλες τις άλλες περιπτώσεις, όπως είπαμε η κατάληξη άση ακολουθεί την ονομασία της αντιδράσεως που καταλύει το ένζυμο. Όσον αφορά στην κατάταξη των ενζύμων η αρμόδια επιτροπή της Διεθνούς Ένωσης Βιομηχανίας κατέταξε τα ένζυμα σε έξι μεγάλες κατηγορίες. Κάθε κατηγορία υποδιαιρείται σε ομάδες και κάθε ομάδα σε υποομάδες. Οι κατηγορίες των ενζύμων είναι: 1. Οξειδορεδουκτάσες (Δευδρογονάσες, Οξειδάσες, Υπεροξειδάσες, Υδροξυλάσες,) 2. Τρανσφεράσες Καταλύουν τη μεταφορά ομάδων από μία ουσία σε μία άλλη 3. Υδρολάσες (εστεράσες, φωσφατάσες, γλυκοσιδάσες, πεπτιδάσες) Υδρολύουν εστέρες, αμίδια, πεπτίδια, κτλ 4. Λυάσες (αλδολάσες, αποκαρβοξυλάσες, υδρολυάσες, κετοξυλυάσες κ.α.) Διασπούν τους δεσμούς C - C, C - N, C - O όχι υδρολυτικά. 5.Ισομεράσες (ρακεμάσες, επιμεράσες κ.α) Διευκολύνουν τη μετατόπιση ατόμων ή ομάδων 6.Λιγάσες Καταλύουν το σχηματισμό C - C, C - N, C - O δεσμών. 10

12 1.3 Δοµή των ενζύµων Τα ένζυμα είναι πρωτεΐνες, δηλαδή βιολογικά μακρομόρια (πολυπεπτίδια) των οποίων η δομική μονάδα είναι τα αμινοξέα. Αν υδρολύσουμε μία οποιαδήποτε πρωτεΐνη θα δούμε ότι το υδρόλυμα αποτελείται από το πολύ 20 διαφορετικά αμινοξέα. Αυτό οφείλεται στο μηχανισμό συνθέσεως των πρωτεϊνών, ο οποίος δεν έχει τη δυνατότητα ενσωματώσεως στις πρωτεΐνες άλλων αμινοξέων εκτός από αυτά τα συγκεκριμένα 20. Τα αμινοξέα που δομούν τις πρωτεΐνες, είναι οργανικά οξέα με μία τουλάχιστον αμινομάδα. Η καρβοξυλική ομάδα και η αμινομάδα είναι συνδεδεμένες με το ίδιο άτομο άνθρακα. Εξαίρεση αποτελεί η προλίνη, η οποία αντί για αμινομάδα έχει ιμινομάδα. Σχήμα 2.1: Η γενική δομή των αμινοξέων Τα αμινοξέα συνδέονται μεταξύ τους με πεπτιδικό δεσμό, που προκύπτει από την σύνδεση της αμινομάδας ενός αμινοξέος με την καρβοξυλομάδα ενός δεύτερου αμινοξέος. Οι πρωτεΐνες και κατ επέκταση και τα ένζυμα οργανώνονται στα ακόλουθα δομικά επίπεδα: 1. Πρωτοταγής δομή Η αλληλουχία των αμινοξέων σε μία αλυσίδα καθορίζει την πρωτοταγή διαμόρφωσή της. Ο δεσμός που σταθεροποιεί τη δομή αυτή είναι ο πεπτιδικός. Πρωτεΐνες με ομοιότητες ως προς την πρωτοταγή τους δομή, παρουσιάζουν και ομοιότητες ως προς την τρισδιάστατη αρχιτεκτονική τους, αλλά συνήθως και ως προς τη λειτουργία τους. Όταν δύο ή περισσότερα ένζυμα και γενικά πρωτεΐνες μοιάζουν σημαντικά ως προς την πρωτοταγή τους δομή λέμε ότι είναι ομόλογα. 11

13 Σχήμα 2.2: Πρωτοταγής δομή αιμογλοβίνης 2. Δευτεροταγής δομή Το επόμενο επίπεδο οργάνωσης είναι η δευτεροταγής δομή. Αυτή η διαμόρφωση αναφέρεται κυρίως στη διάταξη στο χώρο των ατόμων που απαρτίζουν τον πεπτιδικό δεσμό και σταθεροποιείται κυρίως με δεσμούς υδρογόνου. Ο δεσμός αυτός αναπτύσσεται μεταξύ του υδρογόνου και άλλων πιο ηλεκτραρνητικών ατόμων, όπως του αζώτου και του οξυγόνου και είναι πολύ ασθενής δεσμός. Συγκρινόμενος προς τους κοινούς ομοιοπολικούς δεσμούς, ο δεσμός υδρογόνου είναι φορές πιο ασθενής. Ο πιο σημαντικός δεσμός υδρογόνου αναπτύσσεται στην περιοχή των πεπτιδικών δεσμών. Επειδή υπάρχει μεγάλος αριθμός τέτοιων δεσμών στις πρωτεΐνες είναι φανερό ότι οι δεσμοί υδρογόνου αν και ασθενείς, αποτελούν στο σύνολό τους ένα σημαντικό στοιχείο σταθεροποίησης της δευτεροταγούς δομής. Ανάλογα με τον τρόπο με τον οποίο αναπτύσσονται οι δεσμοί υδρογόνου συναντούμε τις εξής βασικές δομές: α- έλικα και β- πτυχωτό φύλλο. Σχήμα 2.3: Η δομή της α- έλικας και του β- πτυχωτού φύλλου 12

14 3. Τριτοταγής δομή Το αμέσως επόμενο επίπεδο διαμορφώσεως είναι η τριτοταγής δομή που αναφέρεται στην αναδίπλωση της πεπτιδικής αλυσίδας πάνω στον εαυτό της καθορίζοντας με αυτόν τον τρόπο το τελικό σχήμα που θα πάρει στο χώρο. Στην τριτοταγή διαμόρφωση σημαντικό ρόλο παίζουν οι ομάδες R των αμινοξέων. Ανάμεσα στις ομάδες αυτές μπορούν να αναπτυχθούν τόσο ομοιοπολικοί όσο και δευτερεύοντες δεσμοί. Οι ομοιοπολικοί είναι δισουλφιδικοί δεσμοί που λέγονται γέφυρες θείου και είναι πιο ισχυροί από τους ομοιοπολικούς. Οι δευτερεύοντες δεσμοί είναι δύο ειδών: πολικοί και μη πολικοί. Πολικοί είναι οι ηλεκτροστατικοί και οι υδρογονικοί και μη πολικοί οι υδρόφοβοι δεσμοί. Σχήμα 2.4: Τριτοταγής δομή 4. Τεταρτοταγής δομή Πολλές πρωτεΐνες όπως η αιμοσφαιρίνη, ένας σημαντικός αριθμός ενζύμων κ.α, αποτελούνται από περισσότερες της μίας αλυσίδες. Η διάταξη των αλυσίδων αυτών και οι ανατομικές σχέσεις της μιας ως προς τις άλλες δεν είναι τυχαίες αλλά σαφώς καθορισμένες και επαναλαμβάνονται πιστά από μόριο σε μόριο. Αυτές οι σχέσεις στο χώρο των διαφόρων πεπτιδικών αλυσίδων ενός πρωτεϊνικού μορίου αποτελούν την τεταρτοταγή διαμόρφωση του μορίου. Στη διαμόρφωση αυτή δε συμμετέχουν ομοιοπολικοί δεσμοί αλλά μόνο δευτερεύοντες του τύπου που αναφέρθηκαν για την τριτοταγή δομή, δηλαδή υδρόφοβοι, υδρογονικοί και ιονικοί. 13

15 Σχήμα 2.5: Τεταρτοταγής δομή Συνοπτικά τα διάφορα επίπεδα οργάνωσης των πρωτεϊνών, φαίνονται στο παρακάτω σχήμα Σχήμα 2.6: Οι δομές των πρωτεϊνών 14

16 1.4 Μετουσίωση Τα διάφορα επίπεδα οργάνωσης της δομής των πρωτεϊνών δεν είναι τυχαία γεγονότα, αλλά απαραίτητη προϋπόθεση της έκφρασης της λειτουργικότητας των πρωτεϊνών. Για παράδειγμα, στην αιμοσφαιρίνη, μικρές μόνο μετακινήσεις ορισμένων ομάδων, της τάξης των λίγων Angstrom δίνουν τη δυνατότητα στο μόριο να δεσμεύει ή να μη δεσμεύει οξυγόνο. Τέτοιες όμως μεταβολές στη διαμόρφωση γίνονται κάτω από την επίδραση του φυσιολογικού περιβάλλοντος των πρωτεϊνών και είναι απαραίτητες για την εμφάνιση της βιολογικής δράσεως των πρωτεϊνών. Αν καταστρέψουμε με τεχνητούς τρόπους τις δομές των πρωτεϊνών, όπως π.χ. με θέρμανση, με ακραίες τιμές ph, με μεγάλες συγκεντρώσεις ουρίας (6-8Μ) κ.α., τότε παρατηρούμε δραματικές επιπτώσεις τόσο στις φυσικοχημικές όσο και στις βιολογικές ιδιότητες των πρωτεϊνών. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται με μία λέξη μετουσίωση. Κατά τη μετουσίωση: ελαττώνεται η διαλυτότητα της πρωτεΐνης καταστρέφονται οι δεσμοί υδρογόνου και οι ιονικοί δεσμοί γεγονός που έχει ως αποτέλεσμα το μόριο, από ένα οργανωμένο σύνολο που ήταν, να μετατρέπεται σε μεμονωμένες αλυσίδες, εφόσον περιείχε αρχικά περισσότερες από μία, οι δε αλυσίδες να παίρνουν τυχαία διαμόρφωση και να χάνουν τις ανώτερες διαμορφώσεις τους χάνονται οι λειτουργικές ιδιότητες της πρωτεΐνης, δηλαδή το ένζυμο χάνει την καταλυτική του δράση Σχήμα 2.7: Η αντιστρεπτή μετουσίωση των πρωτεϊνών 15

17 1.5 Ιδιότητες των ενζύµων Ελάχιστες αντιδράσεις σε ζωντανούς οργανισμούς γίνονται χωρίς την παρεμβολή κάποιου ενζύμου. Από την απλή μετακίνηση κάποιου ιόντος, μέχρι την σύνδεση της πιο πολύπλοκης οργανικής ενώσεως, συμμετέχουν ένζυμα. Ας δούμε όμως ποιες είναι οι ιδιότητες που πρέπει να έχει μια πρωτεΐνη για να την χαρακτηρίσουμε ως ένζυμο και πως μπορούμε να προσδιορίσουμε ποσοτικά την ενζυμική δράση. Πίνακας 2.1: Ιδιότητες των ενζύμων 1 η Προσθήκη της ουσίας που υποπτευόμαστε ότι έχει Ιδιότητα καταλυτικές ιδιότητες αυξάνει την ταχύτητα της αντίδρασης 2 η Ο καταλύτης είναι δραστικός σε πολύ μικρές Ιδιότητα συγκεντρώσεις. 3 η Ιδιότητα 4 η Ιδιότητα 5 η Ιδιότητα Ο καταλύτης δεν καταναλώνεται κατά την διάρκεια της αντίδρασης αλλά παραμένει αμετάβλητος και μετά το τέλος της. Ένας καταλύτης παρουσιάζει εξειδίκευση αναφορικά με την αντίδραση που καταλύει. Τούτο αληθεύει κυρίως για τα ένζυμα. Μικρά ποσά ξένων ουσιών μπορούν να δηλητηριάσουν τον καταλύτη. 16

18 1.5 Η εξειδίκευση των ενζύµων Δύο είναι τα θεμελιώδη χαρακτηριστικά των ενζύμων: η εξειδίκευση και η καταλυτική τους ισχύς. Με τον όρο εξειδίκευση εννοούμε την ικανότητα ενός ενζύμου να καταλύει μία καθορισμένη ενζυμική αντίδραση και να διακρίνει μεταξύ πολλών ανταγωνιστικών υποστρωμάτων για το ενεργό του κέντρο. Η ιδιότητα της εξειδίκευσης των ενζύμων οφείλεται στο ενεργό κέντρο και στη δυνατότητα δημιουργίας συμπλόκου ενζύμου- υποστρώματος. Στα τέλη του περασμένου αιώνα ο Emil Fischer πρότεινε τη θεωρία «του κλειδιού και της κλειδαριάς» για να ερμηνεύσει την εξειδίκευση των ενζύμων. Θεώρησε δηλαδή το ένζυμο ως μια άκαμπτη, λίγο πολύ, μήτρα, όπως είναι η κλειδαριά, που μια επίσης άκαμπτη ένωση το υπόστρωμα, πρέπει να προσαρμοσθεί επάνω του προκειμένου να μπορέσει να προχωρήσει η αντίδραση. Η θεωρία αυτή ίσχυσε για 60 χρόνια αλλά όσο προχωρούσε η μελέτη των ενζύμων, τόσο και ανακαλύπτονταν περιπτώσεις που η θεωρία του Fischer δεν μπορούσε να τις ερμηνεύσει. Μπορούμε εύκολα να κατανοήσουμε, με βάση τη θεωρία του Fischer, γιατί μια ουσία που είναι μεγαλύτερη από το υπόστρωμα, παρόλο ότι έχει όλες τις ομάδες που είναι απαραίτητες για την κατάλυση, δεν θα ενεργοποιηθεί από το ένζυμο (ένα μεγαλύτερο κλειδί δεν μπαίνει στην κλειδαριά). Είναι λιγότερο όμως εύκολο να καταλάβουμε γιατί ένα μικρότερο υπόστρωμα όχι μόνο δε θα ενεργοποιηθεί αλλά μπορεί να δράσει ακόμα και σαν ισχυρός αναστολέας. Έτσι το 1959 ο Koshland πρότεινε τη θεωρία της «επαγώγιμης προσαρμογής». Σύμφωνα με αυτήν την άποψη, δέσμευση του υποστρώματος με το ένζυμο επάγει ή προκαλεί μεταβολή στη διαμόρφωση του ενεργού κέντρου, τέτοια που να μπορέσει να προχωρήσει η αντίδραση. Χωρίς το υπόστρωμα το ένζυμο δεν έχει την κατάλληλη διαμόρφωση. Λίγα χρόνια αργότερα ο Koshland επέκτεινε την υπόθεση της επαγώγιμης προσαρμογής και στα αλλοστερικά ένζυμα με συνεργιστικές ιδιότητες. 17

19 Σχήμα 2.8: Η καταλυτική δράση των ενζύμων Την εξειδίκευση των ενζύμων μπορούμε να τη διακρίνουμε σε απόλυτη, υψηλή και χαμηλή. Ένζυμα με απόλυτη εξειδίκευση είναι εκείνα που δρουν αποκλειστικά σε ένα μόνο υπόστρωμα. Για παράδειγμα η ουρεάση ( ) είναι σε θέση να υδρολύει την ουρία και καμία άλλη ουσία. Ένζυμα με υψηλή εξειδίκευση αλληλεπιδρούν με ένα μικρό αριθμό υποστρωμάτων. Η 2- μονοοξυγοναση της φαινόλης ( ) λ.χ. οξειδώνει όχι μόνο τη φαινόλη αλλά και τη ρεσορκίνη και την ο- κρεσόλη. Ένζυμα τέλος με χαμηλή εξειδίκευση είναι διάφορες φωσφατάσες, εστεράσες κ.λπ. που μπορούν να υδρολύσουν μια μεγάλη ποικιλία φωσφορικών και καρβοξυλικών εστέρων. Υπάρχουν και ένζυμα που καταλύουν διμοριακές αντιδράσεις που μπορεί να δείχνουν απόλυτη εξειδίκευση απέναντι σε ένα υπόστρωμα, αλλά χαμηλή σε ένα άλλο. Η αλκοολική δεϋδρογονάση π.χ. δείχνει απόλυτη εξειδίκευση στο συνένζυμο (NAD) αλλά χαμηλή απέναντι της αλκοόλης μιας και μπορεί να οξειδώσει οποιοδήποτε πρωτοταγή ή δευτεροταγή αλκοόλη ή ακόμα και ημιακετάλη. Κατά κανόνα οι δεϋδρογονάσεις, οι κινάσες και οι λιγάσες είναι ένζυμα με μεγάλη εξειδίκευση τόσο απέναντι στα υποστρώματα όσο και απέναντι στα συνένζυμα. Αντίθετα, διάφορες κατηγορίες υδρολασών είναι γενικά ένζυμα με χαμηλή εξειδίκευση, 18

20 όπως αναφέραμε πιο πάνω για τις φωσφατάσες. Κι εδώ όμως απαντούμε εξαιρέσεις όπως είναι λ.χ. οι φωσφατάση του 2,3- διφωσφογλυκερικού οξέος που υδρολύει το υπόστρωμα προς 3- φωσφογλυκερινικό οξύ. Υπάρχουν και σπάνιες περιπτώσεις που ένα ένζυμο μπορεί να καταλύει δύο διαφορετικές αντιδράσεις στο ίδιο υπόστρωμα ή ακόμα και σε δύο διαφορετικά υποστρώματα. Παράδειγμα της πρώτης περιπτώσεως είναι η ισοκιτρική δεϋδρογονάση ( ) που όχι μόνο οξειδώνει το ισοκιτρικό οξύ σε οξαλοηλεκτρικό, αλλά και το αποκαρβοξυλιώνει σε α- και το γλουταρικό. Παράδειγμα της δεύτερης περίπτωσης είναι η ασπαρτοκινάση ( ). Το ένζυμο αυτό φωσφορυλιώνει το L- ασπαραγινικό οξύ με δότη φωσφορικών ΑΤΡ, αλλά συγχρόνως μπορεί να οξειδώσει την ομοσερίνη με συνένζυμο το ΝΑD. Η ασπαρτοκινάση αποτελείται από 4 πανομοιότυπες υπομονάδες, που σημαίνει ότι τα κέντρα και για τις δύο άσχετες μεταξύ τους αντιδράσεις, βρίσκονται στην ίδια πεπτιδική αλυσίδα. Πράγματι με κατάλληλη ανάλυση βρέθηκε ότι η μεν φωσφορυλιωτική δράση βρίσκεται προς το Ν- τελικό άκρο του μορίου, η δε οξειδωτική προς το C- τελικό. Ένζυμα όπως το πιο πάνω που καταλύουν διαφορετικές αντιδράσεις σε άσχετα μεταξύ τους υποστρώματα ονομάζονται πολυλειτουργικά ένζυμα και πιστεύεται ότι εξελίχθηκαν από σύντηξη γονιδίων. Αν εξαιρέσουμε τα ένζυμα που δείχνουν απόλυτη εξειδίκευση, όπως την περιγράψαμε πιο πάνω, τα υπόλοιπα καταλύουν τη χημική μεταβολή υποστρωμάτων που ο αριθμός τους μπορεί να κυμαίνεται από 2-3 μέχρι μερικές δεκάδες. Στην πράξη όταν θέλουμε να καθορίσουμε την εξειδίκευση ενός ενζύμου, συνήθως μελετούμε το ρυθμό παραγωγής προϊόντων όταν το ένζυμο αφεθεί να δράσει σε ένα αριθμό υποστρωμάτων σταθερής συγκεντρώσεως για ένα ορισμένο χρονικό διάστημα. 19

21 1.6 Η καταλυτική ισχύς των ενζύµων Πώς δουλεύουν τα ένζυμα Από την κλασική χημεία γνωρίζουμε ότι πολλές αντιδράσεις δεν γίνονται από μόνες τους σε θερμοκρασία δωματίου παρόλο ότι θα είχαμε απελευθέρωση ενέργειας. Η έλλειψη δραστικότητας ερμηνεύεται σήμερα από την θεωρία της μεταβατικής κατάστασης που καθορίζει ότι πριν αντιδράσουν δύο ενώσεις Α και Β για να δημιουργήσουν το προϊόν Χ, πρέπει πρώτα να υπερβούν ένα ενεργειακό φράγμα και να μεταπέσουν σε μια μεταβατική κατάσταση όπου δημιουργούν ένα ενεργοποιημένο σύμπλοκο (Α Β). Το σύμπλοκο αυτό στη συνέχεια είναι εκείνο που δίνει το προϊόν. Χαρακτηριστικό του συμπλόκου αυτού είναι ότι έχει μεγαλύτερη ενέργεια από ότι έχουν συνήθως οι ενώσεις Α και Β μαζί και έτσι πρέπει το σύστημα να αποκτήσει την επιπλέον ενέργεια, που ονομάζεται ενέργεια ενεργοποίησης, παρόλο που τελικά η αντίδραση θα αποδώσει μεγαλύτερο ποσό ενέργειας. Ένα μικρό ποσοστό μορίων που έχουν ήδη υψηλή θερμική ενέργεια έχει τη δυνατότητα να δημιουργήσει με συγκρούσεις τη μεταβατική κατάσταση. Όσο πιο μεγάλο είναι το ποσοστό των μορίων, τόσο πιο γρήγορα γίνεται και η αντίδραση. Προκειμένου όμως να φτάσουν δύο μόρια στη μεταβατική κατάσταση χρειάζεται επιπλέον η σύγκρουση να γίνει με κατάλληλο προσανατολισμό. Σε διαλύματα ένας μεγάλος αριθμός συγκρούσεων είναι αναποτελεσματικός ακριβώς διότι γίνονται χωρίς τον κατάλληλο προσανατολισμό. Προκειμένου τώρα να δημιουργηθεί ένα μεταβατικό σύμπλοκο του τύπου (Α Β) θα πρέπει ή να ελαττωθούν οι απαιτήσεις του συστήματος σε ενέργεια ενεργοποίησης ή να δώσουμε ενέργεια στο σύστημα, π.χ. με τη μορφή θερμότητας, ή να αυξηθεί το ποσοστό των μορίων που παίρνουν τον κατάλληλο προσανατολισμό ή ακόμα καλύτερα να συνδυαστεί η ελάττωση των απαιτήσεων σε ενέργεια με τον κατάλληλο προσανατολισμό των μορίων. Πιστεύεται λοιπόν 20

22 πως τα ένζυμα κάνουν ακριβώς αυτήν τη δουλειά. Αντί δηλαδή τα προϊόντα της αντιδράσεως να δημιουργούνται από τα σώματα που αντιδρούν σε ένα και μοναδικό στάδιο με υψηλή ενέργεια ενεργοποίησης, στις ενζυμικές αντιδράσεις τα προϊόντα δημιουργούνται μετά από έναν αριθμό αντιδράσεων που όλες τους έχουν μικρότερη ενέργεια ενεργοποίησης. Αυτό γίνεται δυνατό λόγω της δημιουργίας των συμπλοκών ενζύμου- υποστρώματος. Πριν από την εμφάνιση των προϊόντων μπορεί να δημιουργηθούν όχι μόνο ένα, όπως στις απλούστερες περιπτώσεις, αλλά και δύο και τρία ή περισσότερα ενδιάμεσα σύμπλοκα. Το παρακάτω σχήμα δείχνει σχηματικά την επίδραση των ενζύμων στην ενέργεια ενεργοποίησης. Η δεύτερη συμβολή των ενζύμων στην επιτάχυνση των αντιδράσεων είναι και ο σωστός προσανατολισμός των υποστρωμάτων. Αυτό λαμβάνει χώρα βέβαια στο ενεργό κέντρο. Με τον τρόπο αυτό αυξάνονται σημαντικά οι πιθανότητες αποδοτικών συγκρούσεων μεταξύ υποστρωμάτων προκειμένου να δημιουργηθούν τα ενεργοποιημένα μεταβατικά σύμπλοκα. Σχήμα 2.9: Η ενέργεια ενεργοποίησης μιας αντίδρασης ελαττώνεται με τον καταλύτη 21

23 Τα ένζυμα επιταχύνουν την ταχύτητα της αντιδράσεως από 10 3 έως φορές. Μερικά ένζυμα, όπως η καρβονική ανυδράση, θεωρούνται ως τέλειοι καταλύτες επειδή η ταχύτητα της αντιδράσεως περιορίζεται μόνον από την ταχύτητα με την οποία το υπόστρωμα διαχέεται μέσω του νερού για να προχωρήσει η κατάλυση. Τα ένζυμα για να ελαττώσουν την ενέργεια ενεργοποίησης χρησιμοποιούν διάφορες στρατηγικές, όπως για παράδειγμα σταθεροποίηση της μεταβατικής καταστάσεως. Η περισσότερο ενδιαφέρουσα άποψη της ενζυμικής κατάλυσης είναι η ικανότητα του ενζύμου να σταθεροποιεί την μεταβατική κατάσταση της αντιδράσεως και επομένως να χαμηλώνει την ενέργεια ενεργοποίησης της αντιδράσεως. Τα ένζυμα είναι ικανά να συνδέονται επιλεκτικά με το υπόστρωμα κατά την μεταβατική τους κατάσταση περισσότερο ισχυρά, από ότι όταν βρίσκονται στην κανονική τους κατάσταση. Το ενεργό κέντρο του ενζύμου στη μεταβατική κατάσταση θα είναι δομικά περισσότερο συμπληρωματικό με τα αντιδρώντα μόρια, από ότι στην κανονική του μορφή. Είναι παραδεκτό ότι τα ένζυμα τροποποιούμενα δομικά συνδέονται στη μεταβατική κατάσταση με το υπόστρωμα και επομένως χαμηλώνουν την απαραίτητη ενέργεια ενεργοποίησης. Τα ένζυμα μπορεί να είναι συμπληρωματικά στην μεταβατική κατάσταση σε μέγεθος, σχήμα, και κατανομή φορτίου ως προς το υπόστρωμα. Η μεταβατική κατάσταση του ενζύμου δείχνεται με τον σχηματισμό του συμπλόκου ενζύμου υποστρώματος όπως το κλειδί στην κλειδαριά. Για αποτελεσματική κατάλυση, πάντως το ένζυμο χρειάζεται να ανακυκλώνεται (turnover, να συμπληρώνει ένα κύκλο αντίδρασης) όσο γίνεται πιο γρήγορα, μια και με τον τρόπο αυτό το ένζυμο δεν θα συνδέεται πολύ ισχυρά με το προϊόν. 22

24 1.7 Κινητική των ενζυµικών αντιδράσεων Τέσσερις είναι οι παράγοντες που επηρεάζουν την ταχύτητα των ενζυμικών αντιδράσεων: 1. Το ph 2. Η θερμοκρασία 3. Η συγκέντρωση του ενζύμου 4. Η συγκέντρωση του υποστρώματος Επίδραση του ph στην ταχύτητα των ενζυμικών αντιδράσεων Εάν προσδιορίσουμε την ταχύτητα αντίδρασης ενός συγκεκριμένου ενζύμου με όλες τις παραμέτρους σταθερές εκτός από το ph, θα παρατηρήσουμε ότι η ταχύτητα εξαρτάται από τη συγκέντρωση των ιόντων υδρογόνου (Η + ). Στο σχήμα όπου φαίνεται μια τυπική καμπύλη ph παρατηρούμε ότι υπάρχει κάποια συγκέντρωση υδρογονοκατιόντων που η ταχύτητα της αντιδράσεως είναι η μέγιστη. Για τη συντριπτική πλειοψηφία των ενζύμων αυτό συμβαίνει μεταξύ ph 5 και 9. Το ph δρα μέσω του ιονισμού των ομάδων πάνω στο ενζυμικό σύστημα, δηλαδή στο ένζυμο, στο υπόστρωμα και στο σύμπλοκο ενζύμου- υποστρώματος. Εξάλλου ακραίες τιμές ph μπορεί να έχουν άμεσες επιπτώσεις στις ανώτερες δομές του ενζύμου (τριτοταγής, τεταρτοταγής) και έτσι μπορούν να επηρεάζουν την ταχύτητα της αντιδράσεως (π.χ. το ποσό των προϊόντων που δημιουργούνται σε κάθε λεπτό) με μερική ή ολική καταστροφή του ίδιου του ενζύμου. Σχήμα 2.10: Η επίδραση του ph στην ταχύτητα της αντίδρασης 23

25 2.8.2 Επίδραση της θερμοκρασίας στην ταχύτητα των ενζυμικών αντιδράσεων Εάν προσδιορίσουμε την ταχύτητα μιας ενζυμικής αντιδράσεως σε συνάρτηση με τη θερμοκρασία θα πάρουμε μια καμπύλη όπως του σχήματος. Βλέπουμε δηλαδή ότι καθώς αυξάνουμε την θερμοκρασία, αυξάνεται και η ταχύτητα της αντιδράσεως, αλλά μέχρι μιας ορισμένης θερμοκρασίας, γνωστής ως βέλτιστη, και στη συνέχεια η ταχύτητα αρχίζει και πέφτει. Ερμηνεία σε αυτό το φαινόμενο μπορεί να δοθεί αν δεχθούμε ότι η αύξηση της θερμοκρασίας επηρεάζει δύο ανεξάρτητες διεργασίες και συγκεκριμένα την καταλυόμενη αντίδραση από την μια και την θερμική μετουσίωση του ενζύμου από την άλλη. Σε χαμηλές θερμοκρασίες, μέχρι 30 ο C ας πούμε, η μετουσίωση των περισσοτέρων ενζύμων γίνεται πολύ αργά, και έτσι στην πράξη δεν επιδρά στην ταχύτητα της αντιδράσεως. Για αυτό και σε χαμηλές θερμοκρασίες οι ενζυμικές αντιδράσεις επηρεάζονται από την αύξηση της θερμοκρασίας κατά τον ίδιο τρόπο όπως και οι συνηθισμένες χημικές αντιδράσεις. Τόσο η δημιουργία του συμπλόκου ενζύμου- υποστρώματος όσο και η διάστασή του σε ένζυμο και προϊόντα επηρεάζεται από σταθερές που η σχέση τους με την θερμοκρασία δίνεται από τον νόμο του Arrhenius: k= Αe - E/RT όπου k είναι η κινητική σταθερά. Α: η σταθερά του Arrhenius (παράγοντας συχνότητας) E: η ενέργεια ενεργοποίησης R: η σταθερά των αερίων και Τ: η θερμοκρασία. 24

26 Όσο μεγαλώνει η θερμοκρασία, τόσο πιο μεγάλη γίνεται η συμμετοχή της μετουσίωσης του ενζύμου μια και στην ουσία πέφτει η συγκέντρωση του ενζύμου. Πάνω από τους 60 ο C με 70 ο C για τα περισσότερα ένζυμα ο ρυθμός μετουσίωσης είναι πολύ μεγαλύτερος από το ρυθμό της ίδιας της αντίδρασης που για πρακτικούς λόγους ουσιαστικά μηδενίζεται. Το σχήμα δείχνει τις επιπτώσεις της θερμοκρασίας στην κινητική μιας ενζυμικής αντίδρασης. Σχήμα 2.11: Η επίδραση της θερμοκρασίας στην ταχύτητα της αντιδράσεως Επίδραση της συγκεντρώσεως του ενζύμου στην ταχύτητα των ενζυμικών αντιδράσεων Το ποσό του υποστρώματος που μεταβάλλεται στα αρχικά στάδια μιας ενζυμικής αντίδρασης είναι ευθέως ανάλογο με την συγκέντρωση του ενζύμου, αλλά μόνο μέχρις ενός ορισμένου σημείου πέρα από το οποίο η ανταπόκριση δεν είναι γραμμική για τον συγκεκριμένο χρόνο. Ο σημαντικότερος λόγος για τον οποίο παύει η γραμμικότητα είναι η κατανάλωση του υποστρώματος που έχει ως αποτέλεσμα τον μη συνεχή ορισμό του ενζύμου. Για αυτό και όταν θέλουμε να προσδιορίζουμε ποσοτικά το ένζυμο πρέπει να βεβαιωνόμαστε ότι κατά την αντίδραση καταναλώνεται υπόστρωμα της τάξεως του 5% περίπου. Επίσης για κάθε ένζυμο πρέπει να προσδιορίζουμε το εύρος των μονάδων που μπορούμε να συμπεριλαμβάνουμε στην αντίδραση μας για τις συγκεκριμένες συνθήκες του πειράματος. 25

27 Σχήμα 2.12: Η επίδραση της συγκεντρώσεως του ενζύμου στην ταχύτητα της αντιδράσεως Επίδραση της συγκεντρώσεως του υποστρώματος στην ταχύτητα των ενζυμικών αντιδράσεων Εάν κάνουμε μια σειρά προσδιορισμών με ένα συγκεκριμένο ένζυμο, που στον καθένα η συγκέντρωση του ενζύμου, το pη, η θερμοκρασία και ο χρόνος αντίδρασης θα είναι σταθερά, αλλά θα διαφέρει μόνο η συγκέντρωση του υποστρώματος, κι εκφράσουμε τα αποτελέσματα μας με την μορφή κάποιας καμπύλης κατά τέτοιο τρόπο ώστε στην τεταγμένη να βάλουμε την ταχύτητα της ενζυμικής αντιδράσεως και στην τετμημένη τη συγκέντρωση του υποστρώματος, θα πάρουμε μια καμπύλη όπως στο σχήμα: 26

28 Σχήμα 2.13: Η εξάρτηση της ταχύτητας από τη συγκέντρωση του υποστρώματος Στην καμπύλη παρατηρούμε ότι όσο αυξάνεται η συγκέντρωση του υποστρώματος, τόσο αυξάνεται και η ταχύτητα της αντιδράσεως. Στην αρχή ο ρυθμός αύξησης είναι πολύ μεγάλος, στη συνέχεια όμως και όσο αυξάνουμε τη συγκέντρωση του υποστρώματος ελαττώνεται και τείνει προς μηδέν. Μετά από κάποια τιμή συγκεντρώσεως η ταχύτητα της αντίδρασης παραμένει σταθερή, όσο κα αν αυξήσουμε τη συγκέντρωση του υποστρώματος. 1.7 Ενζυµοµηχανική Ένας από τους πιο σημαντικούς τομείς της πρωτεϊνικής μηχανικής είναι αυτός που ασχολείται με τα ένζυμα, δηλαδή η ενζυμομηχανική. Η σπουδαιότητα της έγκειται ότι τα ένζυμα είναι καταλύτες οι οποίοι, συγκριτικά με τους συνήθεις ανόργανους καταλύτες, παρουσιάζουν μεγάλη εξειδίκευση για την αντίδραση που καταλύουν και λειτουργούν κάτω από πολύ πιο ήπιες συνθήκες και σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιούνται ως βιοκαταλύτες σε διάφορες βιομηχανικές διεργασίες, όπως σε χημικές βιομηχανίες (απορρυπαντικά), βιομηχανίες τροφίμων και φαρμακοβιομηχανίες. Οι κυριότεροι στόχοι της ενζυμομηχανικής είναι: 1. Η βελτίωση της καταλυτικής δράσης και της εξειδίκευσης ενός ενζύμου ως προς το υπόστρωμα. 2. Η τροποποίηση της εξειδίκευσης απέναντι στο υπόστρωμα, δημιουργώντας έτσι ένα ένζυμο από προϋπάρχοντα (π.χ. δημιουργώντας ένζυμα που δεν βρίσκονται στη φύση και καταλύουν νέες αντιδράσεις). 3. Η τροποποίηση της δραστικότητας του ενζύμου σε συνάρτηση με το ph. Με αυτόν τον τρόπο μπορεί να αποκτήσει ένα ένζυμο διαφορετικό βέλτιστο ph ή ακόμα και να μπορεί να δράσει σε ακραίες τιμές ph 4. Η αύξηση της αντοχής του ενζύμου σε οξειδωτικά αντιδραστήρια. 27

29 5. Η αύξηση της αντοχής του ενζύμου σε υψηλές θερμοκρασίες. 6. Η αύξηση της αντοχής του ενζύμου σε πρωτεόλυση. 7. Η σταθερότητα του ενζύμου και η διατήρηση της καταλυτικής του δράσεως σε μη υδατικά διαλύματα. 8. Η μείωση των αλλοστερικών κέντρων του ενζύμου που δεσμεύουν παρεμποδιστές της δράσεως του και ιδιαίτερα εκείνων που αλληλεπιδρούν με το προϊόν της αντιδράσεως με αποτέλεσμα την εμφάνιση του μηχανισμού ανάδρασης. 9. Η ενσωμάτωση ενζύμων σε μια πρωτεΐνη με πολλαπλά ενεργά κέντρα, έτσι ώστε μια βιομηχανική οδός, η οποία απαιτεί ένα σύστημα πολλών ενζύμων να γίνεται με μια μόνο πρωτεΐνη. 10. Η παραγωγή καταλυτικών αντισωμάτων, δηλαδή αντισωμάτων με ενζυμικές ιδιότητες ή αντινοηματικών (antisense) μορίων RNA για την παρεμπόδιση έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων. 1.8 Ένζυµα µε βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον Θερμοάντοχα ένζυμα Τα τελευταία χρόνια έχουν ανακαλυφθεί μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται σε θερμοκρασίες γύρω ή και ψηλότερα των 100 ο C. Οι υπερθερμόφιλοι αυτοί οργανισμοί ζουν σε θαλάσσιες περιοχές και θεωρούνται ως οι πιο αρχέγονοι οργανισμοί. Για την ανάπτυξη τους απαιτούν αναερόβιες συνθήκες και εξαρτώνται από την αναγωγή του S o σε Η2S. Οι μικροοργανισμοί αυτοί θεωρούνται ως πολύ καλές πηγές ενζύμου μια και τα ένζυμα που περιέχουν είναι θερμοάντοχα και μπορούν να καταλύουν αντιδράσεις σε υψηλές θερμοκρασίες. Σήμερα περισσότερα από 30 τέτοια ένζυμα έχουν απομονωθεί και έχουν χαρακτηριστεί. Όλα τα ένζυμα έχουν υψηλή βέλτιστη θερμοκρασία κατάλυσης και παρουσιάζουν χρόνο ημισείας ζωής πολλές μέρες. 28

30 Ένζυμα σε μη συμβατά μέσα Οι ζωντανοί οργανισμοί συνθέτουν μια μεγάλη σειρά ενζύμων, τα οποία καταλύουν πάρα πολλές αντιδράσεις μέσα και έξω από το κύτταρο. Το περιβάλλον των ενζύμων εκτός των μεμβρανών είναι υδατικό για τον λόγο αυτό οι παραδοσιακή κατάλυση γίνεται σε υδατικά διαλύματα, και δεν είναι παράξενο όταν οι περισσότερες μέθοδοι που αναπτύχθηκαν για την μελέτη των ενζύμων βασίζονται σε υδατικά μέσα. Πρόσφατα όμως, το ενδιαφέρον έχει εστιαστεί στη χρησιμοποίηση ενζύμων σε οργανικούς διαλύτες. Οι βιομηχανικές ενζυμικές διεργασίες προσφέρουν το πλεονέκτημα των ηπίων συνθηκών αντιδράσεως που είναι άκρως επιλεκτικές και περιβαλλοντικά αποδεκτές. Εάν ένα ένζυμο μπορεί να λειτουργήσει σε έναν οργανικό διαλύτη, θα έχει ως αποτέλεσμα την εύκολη ανάκτηση των προϊόντων, αυξημένη διαλυτότητα των υδρόφοβων αντιδρώντων και ελαττωμένη πιθανότητα μόλυνσης από βακτήρια, ιδιότητες που έχουν ευρεία εφαρμογή. Η αλλαγή του διαλύτη από τον νερό σε ένα οργανικό περιβάλλον προκαλεί πολύ μεγάλες αλλαγές στη λειτουργία του ενζύμου επιτρέποντας τον σχεδιασμό του μέσω της «μηχανικής του διαλύτη». 29

31 2 Τα ένζυµα στα απορρυπαντικά 2.1 Εισαγωγή Τα ένζυμα συνέβαλλαν σημαντικά στην ανάπτυξη και βελτιστοποίηση των καινούριων καθαριστικών προϊόντων, διότι προσέφεραν σοβαρά πλεονεκτήματα σε σχέση με τα μη ενζυμικά απορρυπαντικά. Μερικά από τα πλεονεκτήματα των ενζυμικών απορρυπαντικών είναι ότι: Απαιτείται λιγότερος χρόνος πλυσίματος Έχουν μεγάλη καθαριστική δράση Μειώνεται σημαντικά η ενεργειακή κατανάλωση λόγω των χαμηλότερων θερμοκρασιών που χρησιμοποιούνται Μειώνεται η κατανάλωση νερού λόγω της μεγαλύτερης δραστικότητας Ελαττώνονται οι αρνητικές επιδράσεις στο περιβάλλον αφού είναι βιοδιασπάσιμα Βοηθούν στην συντήρηση των βαμβακερών υφασμάτων (κυτταρινάσες) Προέρχονται από ανανεώσιμες πηγές Η χρήση τους στα καθαριστικά προϊόντα άρχισε τη δεκαετία του 1920 όταν ιδρύθηκε το πρώτο εργοστάσιο παραγωγής μίγματος ενζύμων στη Γερμανία από τον Otto Röhm. Το εργοστάσιο αυτό απομόνωνε ένζυμα από το πάγκρεας ζώων όπως πρωτεάσες, καρβοξυπεπτιδάσες, αμυλάσες, λακτάσες και λιπάσες. 30

32 Τα πλέον χρησιμοποιούμενα ένζυμα είναι οι πρωτεάσες, οι αμυλάσες, οι λιπάσες και οι κυτταρινάσες. Όλα τα παραπάνω ένζυμα ταξινομούνται στην κατηγορία υδρολάσες γιατί έχουν την ικανότητα να υδρολύουν τα μόρια των πρωτεϊνών, του αμύλου, των λιπιδίων και της κυτταρίνης αντίστοιχα. Αυτά τα ένζυμα με εξαίρεση την κυτταρινάση βοηθούν στην απορρύπανση ενώ η τελευταία έχει επιπλέον την ικανότητα να συντηρεί τις βαμβακερές ίνες μέσω μιας εκλεκτικής αντιδράσεως. Πίνακας 3.1: Δράση διαφόρων ενζύμων Πρωτεάσες Αμυλάσες Λιπάσες Κυτταρινάσες Υδρολύουν τις πρωτεΐνες Υδρολύουν το άμυλο Διασπούν τους λιπαρούς ρύπους Δρουν στα βαμβακερά υφάσματα απομακρύνοντας τις μικροΐνες που κάνουν το ύφασμα να είναι σκληρό και θαμπό Η απορρύπανση αποτελεί ένα πολύπλοκο φυσικοχημικό φαινόμενο που για τη λειτουργία του απαιτείται η παρουσία ενζύμων, τασενεργών ενώσεων και προσθέτων. Οι πρωτεάσες, οι αμυλάσες και οι λιπάσες υδρολύουν και διαλυτοποιούν τους ρύπους που βρίσκονται προσκολλημένοι είτε στις ίνες είτε στις σκληρές επιφάνειες. Οι κυτταρινάσες καθαρίζουν έμμεσα υδρολύοντας τους γλυκοζιτικούς δεσμούς της κυτταρίνης. Με αυτόν τον τρόπο οι ρύποι απομακρύνονται αλλά κυρίως βελτιώνεται το χρώμα των βαμβακερών υφασμάτων καθώς και η υφή τους. Οι κυτταρινάσες χρησιμοποιούνται κυρίως στα υφάσματα τύπου jean. Οι βιομηχανίες υφασμάτων άρχισαν να χρησιμοποιούν τα ένζυμα από το 1987, όταν βρέθηκε ότι έχουν την ικανότητα να κάνουν το ύφασμα να φαίνεται ελαφρώς χρησιμοποιημένο (used). 31

33 Τα ενζυμικά προϊόντα που κυκλοφορούν στο εμπόριο περιέχουν τουλάχιστον δύο είδη ενζύμων έτσι ώστε να καθίσταται αποτελεσματική η απορρύπανση ακόμα και σε χαμηλή θερμοκρασία. Η χρήση των ενζύμων όμως, δεν περιορίζεται μόνο στα απορρυπαντικά των ρούχων ή των πιάτων. Πολλές εταιρείες παραγωγής οδοντόκρεμας και στοματικών διαλυμάτων περιέχουν γλυκοαμυλάση και οξειδάση της γλυκόζης. Τα ένζυμα αυτά έχουν θετικό αποτέλεσμα στην πρόληψη της οδοντικής πλάκας ακόμα κι αν ο χρόνος πλυσίματος διαρκεί λίγα μόνο λεπτά. Επίσης, οι τεχνητές οδοντοστοιχίες καθαρίζονται με προϊόντα που περιέχουν πρωτεάσες για καλύτερα αποτελέσματα σε λιγότερο χρόνο. Τέλος, τα ένζυμα χρησιμοποιούνται στο καθάρισμα των φακών επαφής. Οι φακοί καθαρίζονται συνήθως με διαλύματα τα οποία περιέχουν πρωτεάσες ή λιπάσες ή συνδυασμό των δύο. Τα ένζυμα συνέβαλλαν στη μη επιβάρυνση του περιβάλλοντος κατά τη διάρκεια του πλυσίματος και του καθαρισμού. Επειδή είναι βιοαποικοδομούμενα μπορούν να αντικαταστήσουν τις επικίνδυνες προς το περιβάλλον και τον άνθρωπο χημικές ουσίες και να μειώσουν τη θερμοκρασία της πλύσεως. Παρόλα αυτά η διαδικασία καθαρισμού των ρούχων και των πιάτων απαιτεί προς το παρόν μεγάλες ποσότητες χημικών ενώσεων, ενέργειας και νερού. Στο μέλλον εκτιμάται ότι θα αναπτυχθούν καθαριστικά προϊόντα που δε θα παρουσιάζουν τα παραπάνω μειονεκτήματα. Η συνεχής ανάπτυξη της βιοτεχνολογίας μπορεί να οδηγήσει σε καινούρια ενζυμικά προϊόντα με βελτιωμένα καθαριστικά αποτελέσματα ακόμα και σε χαμηλές θερμοκρασίες, με χαμηλότερο κόστος και χαμηλότερη κατανάλωση ενέργειας. 32

34 2.2 Ασφάλεια και υγιεινή Οι πρωτεΐνες υπάρχουν σε αφθονία στη φύση και αρκετές από αυτές είναι δυνατό να προκαλέσουν αλλεργίες, όπως για παράδειγμα η γύρη των λουλουδιών, το τρίχωμα των ζώων και τα διάφορα τρόφιμα. Όπως όλες οι ξένες προς τον ανθρώπινο οργανισμό πρωτεΐνες, έτσι και τα ένζυμα είναι πιθανό να είναι αλλεργιογόνα κατά την εισπνοή. Η εισπνοή σκόνης ενζύμου ακόμα και σε μικρή ποσότητα μπορεί να διεγείρει το ανοσοποιητικό σύστημα στο να παράγει αντισώματα. Σε κάποιες περιπτώσεις, οι αυξημένες ποσότητες αντισωμάτων προκαλούν την έκκριση της ουσίας ισταμίνης. Αυτή η ουσία μπορεί να προκαλέσει συμπτώματα στον ανθρώπινο οργανισμό όπως καταρροή και ερεθισμό του λαιμού. Στη βιομηχανία όπου χρησιμοποιούνται καθημερινά μεγάλες ποσότητες ενζύμων υπάρχουν ειδικά όργανα ελέγχου της συγκεντρώσεως των αιωρουμένων ενζύμων έτσι ώστε να μην υπάρχει κίνδυνος πρόκλησης αλλεργικής αντιδράσεως. Η βιομηχανία η οποία χειρίζεται με μεγαλύτερη προσοχή και ασφάλεια τα ένζυμα είναι η βιομηχανία των απορρυπαντικών. Από το 1960, όπου είχαν αναφερθεί αλλεργίες που προκλήθηκαν από τα ένζυμα, οι διάφορες βιομηχανίες λάβανε ορισμένα μέτρα όπως τη μικροενθυλάκωση των ενζύμων, την άριστη υγιεινή του χώρου εργασίας και το σωστό χειρισμό τους από τους εργαζομένους. Πρέπει βέβαια να τονιστεί ότι οι αλλεργίες που προκαλούνται από τα ένζυμα αφορούν μόνο τους εργαζομένους σε χώρους όπου χρησιμοποιούνται τα ένζυμα και όχι τον καταναλωτή. Σε μία έρευνα του National Research Council (NRC) αναφέρεται ότι δεν έχει αναφερθεί ποτέ αλλεργική αντίδραση σε χρήστες ενζυμικών απορρυπαντικών. Περαιτέρω μελέτες επιβεβαιώνουν ότι τα ενζυμικά απορρυπαντικά είναι ασφαλή για τον καταναλωτή. 33

35 2.3 Ενθυλάκωση των ενζύµων Η ενθυλάκωση των ενζύμων αποτελεί ένα από τα πρώτα μέτρα που έλαβαν οι βιομηχανίες για την αποφυγή έκθεσης των εργαζομένων στην ενζυμική σκόνη. Τα πρώτα χρόνια παρασκευής των ενζυμικών προϊόντων, τα ένζυμα εισάγονταν στο προϊόν με τη μορφή λεπτής σκόνης με αποτέλεσμα να αιωρούνται και να δημιουργούν αναπνευστικά προβλήματα αλλά και αλλεργίες στους εργαζομένους. Για αν αποφύγουν λοιπόν τα αιωρούμενα σωματιδίων οι κατασκευαστές πρότειναν την ενθυλάκωση των ενζύμων. Η πρώτη μέθοδος που εφαρμόστηκε ήταν η «ένωση» του ενζύμου στην επιφάνεια του τριπολυφωσφορικού νατρίου το οποίο στη συνέχεια ψεκαζόταν με ένα κολλώδες μη ιονικό απορρυπαντικό. Τα τελευταία χρόνια η μέθοδος ενθυλάκωσης των ενζύμων βελτιώθηκε με τη χρήση πιο ανθεκτικών επικαλυπτικών επιφανειών. Σήμερα, τα ένζυμα εσωκλείονται σε ένα υδατοδιαλυτό πολυμερές όπως για παράδειγμα η πολυαιθυλενική γλυκόλη. Το ένζυμο εισάγεται σε ένα πυρήνα ο οποίος καλύπτεται από μία ανθεκτική επιφάνεια. Το μέσο μέγεθος του κόκκου που προκύπτει είναι μm. Το μέγεθος των αναπνεύσιμων σωματιδίων κυμαίνεται είναι <7μm ενώ τα εισπνεύσιμα <185μm. Αυτό δείχνει ότι οι κόκκοι είναι απίθανο να εισέλθουν στο αναπνευστικό σύστημα. Από μελέτες βρέθηκε ότι είναι πιθανό να προκληθούν αλλεργίες και αναπνευστικά προβλήματα στους εργαζομένους που έρχονται σε επαφή με τα ενθυλακωμένα ένζυμα λόγω της πιθανής καταστροφής του στρώματος επικαλύψεως του κόκκου. 34

36 2.4 Παγκόσµια αγορά Σχήμα 3.1: Η χρήση των ενζύμων στην παγκόσμια αγορά Αναμφισβήτητα, τα ένζυμα παίζουν σημαντικό ρόλο στις βιομηχανίες. Όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα για το έτος 1999 το 63% των ενζύμων χρησιμοποιήθηκε για τεχνικούς λόγους, ακολούθησε η βιομηχανία των τροφίμων με 31% και τέλος η βιομηχανία παρασκευής τροφής για ζώα με ποσοστό 6%. Η παγκόσμια αγορά για τα ένζυμα που χρησιμοποιήθηκαν το 1999 έφτανε το ύψος του 1,5 δισεκατομμυρίου ευρώ. 35

37 3 Ένζυµα που υπάρχουν στα απορρυπαντικά 3.1 Πρωτεάσες Δομή Οι πρωτεάσες είναι πρωτεΐνες που έχουν την ικανότητα να δρουν ως ένζυµα (πρωτεολυτικά ένζυµα). Ανήκουν στη γενική κατηγορία των υδρολασών. Ενδεικτική δοµή µιας πρωτεάσης φαίνεται στο παρακάτω σχήµα. Σχήµα 4.1: Η δοµή µιας πρωτεάσης 36

38 Δράση Ο βιολογικός ρόλος των πρωτεασών είναι η διάσπαση των πρωτεϊνών αρχικά προς πεπτίδια και στη συνέχεια προς αµινοξέα. Συγκεκριµένα, οι πρωτεάσες υδρολύουν τους αµιδικούς δεσµούς των πρωτεϊνών. Σχήµα 4.2: Ο αµιδικός δεσµός Από πρωτεΐνες αποτελούνται πολλοί ρύποι της καθηµερινής ζωής που προέρχονται από φαγητά, όπως οι λεκέδες από γάλα, από κρέας, από αυγό κ.α. καθώς επίσης και λεκέδες από αίµα, αλλά και υπολείµµατα της επιδερµίδας του σώµατος. 37

39 Οι πρωτεάσες στα απορρυπαντικά Οι πρωτεάσες αποτελούν µία από τις πιο σηµαντικές οµάδες βιοµηχανικών ενζύµων, αφού κατέχουν το ένα τέταρτο της παγκόσµιας παραγωγής ενζύµων. Πολλές από αυτές χρησιµοποιούνται στις βιοµηχανίες επεξεργασίας δερµάτων, στις βιοµηχανίες απορρυπαντικών και τροφίµων. Επίσης βρίσκουν εφαρµογή σε βιοφαρµακευτικά προϊόντα, π.χ. ως καθαριστικά φακών επαφής. Μία βιοµηχανικά πολύ σηµαντική αλκαλική πρωτεάση, που αποµονώθηκε από το γένος Bacillus είναι η subtilisin. Η subtilisin αποδείχτηκε ένας πολύ χρήσιµος καταλύτης για τη διάσπαση διακλαδισµένων αλυσίδων αµινοξέων. Αυτό το ένζυµο, το οποίο είναι µία σερινοπρωτεάση, χρησιµοποιείται ευρέως ως πρόσθετο στα απορρυπαντικά. Ο µικροοργανισµός Bacillus subillis είναι ένας αερόβιος µικροοργανισµός, ο οποίος βρίσκεται στο χώµα. Από αυτόν παράγεται η subtilisin, η οποία στο ενεργό κέντρο της, εκτός των άλλων αµινοξέων, περιέχει και το αµινοξύ σερίνη. Το ένζυµο αυτό εµφανίζει χαµηλή εξειδίκευση και µπορεί να υδρολύσει ένα µεγάλο πλήθος πεπτιδικών δεσµών. Το ένζυµο βρίσκεται µικροενθυλακωµένο στα απορρυπαντικά σκόνης και µε τη µορφή διαλύµατος στα υγρά απορρυπαντικά. Η πρωτεάση δρα συνεργιστικά µε τις τασενεργές ενώσεις και διασπά τις πρωτεΐνες προς υδατοδιαλυτά πεπτίδια και αµινοξέα που είναι εύκολο να αποµακρυνθούν. Η subtilisin χρησιµοποιείται επίσης και ως συνεργιστικός παράγοντας στο στεγνό καθάρισµα µε υπερκρίσιµο διοξείδιο του άνθρακα, για την αποτελεσµατικότερη αποµάκρυνση των λεκέδων από φαγητό, γρασίδι, αίµα, µπογιά και µελάνι. Μελέτες έχουν αποδείξει ότι το ένζυµο είναι σταθερό στις υπερκρίσιµες συνθήκες και επειδή το υπερκρίσιµο διοξείδιο του άνθρακα δεν αναµιγνύεται µε αυτό, είναι εύκολος ο διαχωρισµός και η ανάκτησή του. Τα πλεονεκτήµατα αυτά προωθούν τη χρήση του υπερκρίσιµου διοξειδίου του άνθρακα ως υποκατάστατο του τετραχλωροαιθυλενίου στο στεγνό καθάρισµα. 38

40 Παρόλο όµως που χρησιµοποιείται ευρέως στα απορρυπαντικά, η subtilisin παρουσιάζει ορισµένα βασικά µειονεκτήµατα. Αδρανοποιείται µε την παρουσία λευκαντικών, λόγω οξείδωσης του αµινοξέος µεθειονίνη που βρίσκεται στο ενεργό της κέντρο. Σχήµα 4.3: Η δοµή της µεθειονίνης Επιπλέον δεν εµφανίζει την επιθυµητή σταθερότητα όταν βρίσκεται σε επαφή µε κάποιες από τις τασενεργές ενώσεις του εµπορίου. Πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι ένα εκχύλισµα από το λεπιδόπτερο Spilosoma obliqua θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί ως πρόσθετο στα απορρυπαντικά στη θέση της subtilisin. Η πρωτεάση από αυτό το λεπιδόπτερο, είναι πολύ αλκαλική (δρα καλύτερα σε ph από 10 µέχρι 12) και εµφανίζει αξιοσηµείωτη σταθερότητα παρουσία κατιονικών και µη ιονικών τασενεργών. Επίσης δρα ακόµα και απουσία τασενεργών. Ένα ακόµα πλεονέκτηµα που εµφανίζει η συγκεκριµένη πρωτεάση είναι ότι η παραλαβή της είναι σχετικά πιο οικονοµική σε σύγκριση µε την παραλαβή των κοινών βακτηριακών πρωτεασών. Γενικά οι πρωτεάσες στα απορρυπαντικά εµφανίζουν και το µειονέκτηµα ότι µπορούν να υδρολυθούν µεταξύ τους. Αυτή η «κανιβαλιστική» συµπεριφορά ονοµάζεται αυτοπρωτόλυση. Επίσης, οι πρωτεάσες µπορούν να αποικοδοµήσουν και όλα τα άλλα ένζυµα που είναι παρόντα σε ένα απορρυπαντικό. Στην περίπτωση των απορρυπαντικών σε σκόνη, η αυτοπρωτόλυση είναι µηδαµινή, όσον αφορά τη 39

41 σταθερότητα κατά την αποθήκευση, στα υγρά απορρυπαντικά όµως, όπου είναι παρόν και το νερό, οι πρωτεάσες έρχονται άµεσα σε επαφή. Είναι λοιπόν φανερή η ανάγκη της σταθεροποίησης των πρωτεασών µε την προσθήκη παρεµποδιστών ή άλλων ενώσεων. Σχήµα 4.4: Δοµή πρωτεάσης µε παρεµποδιστή Για το λόγο αυτό χρησιµοποιείται ένας συνδυασµός βορικής και προπυλικής γλυκόλης. Τελευταία έχει δοκιµαστεί ένας νέος σταθεροποιητής που ονοµάζεται 4- φορµιλοβορονικό οξύ, ο οποίος ενσωµατώνεται µε την πρωτεάση κατά την παρασκευή της και την καθιστά ιδιαίτερα σταθερή. Το 4- φορµιλοβορονικό οξύ αντικαθιστά την προπυλική γλυκόλη, η οποία παρεπιπτόντως είναι µία πολύ ακριβή ένωση. 40

42 Η επίδραση του ph και της θερµοκρασίας Μελέτες έχουν δείξει ότι η πρωτεάση subtilisin είναι σταθερή σε τιμές ph από 5,5 μέχρι 10. Κάτω από ph 5,5 αρχίζει γρήγορα η μετουσίωση της πρωτεάσης, η οποία ολοκληρώνεται σε ph 4,5. Η βέλτιστη θερμοκρασία δράσης της (διάσπαση πρωτεϊνών) είναι οι 50 ο C. Η επίδραση στην υγεία Η subtilisin είναι ερεθιστική για το αναπνευστικό σύστημα του ανθρώπου και για το δέρμα. Με την κατάποση μπορεί να προκαλέσει ευαισθησία. 3.2 Αµυλάση Δοµή Η αµυλάση είναι ένα µεγάλου µοριακού βάρους πρωτεϊνικό µόριο, το οποίο έχει την ιδιότητα να δρα ως ένζυµο. Ανάµεσα στις αλυσίδες της αµυλάσης υπάρχουν δισουλφιδικοί δεσµοί. Σχήµα 4.5: Η δοµή της αµυλάσης 41

43 Δράση Η αµυλάση διασπά το άµυλο. Το άµυλο είναι ένας πολυσακχαρίτης, δηλαδή ένα βιολογικό πολυµερές, του οποίου η δοµική µονάδα είναι ένα σάκχαρο, η γλυκόζη. Το άµυλο αποτελείται από αµυλόζη και αµηλοπηκτίνη. Η αµυλόζη είναι ένα γραµµικό πολυµερές στο οποίο τα µόρια της γλυκόζης ενώνονται µε α,1-4 γλυκοζιτικό δεσµό. Η αµυλοπηκτίνη είναι ένα διακλαδισµένο πολυµερές, στο οποίο τα µόρια της γλυκόζης είναι ενωµένα µε α,1-6 γλυκοζιτικό δεσµό. Σχήμα 4.6: Η δομή της αμυλόζης και της αμυλοπηκτίνης Η αµυλάση διασπά το άµυλο, υδρολύωντας τους γλυκοζιτικούς δεσµούς του, αρχικά προς έναν δισακχαρίτη, τη µαλτόζη και στη συνέχεια προς γλυκόζη. Σχήµα 4.7: Δοµή της µαλτόζης και της γλυκόζης 42