ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΖΩΟΛΟΓΙΑΣ, ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2005

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΖΩΟΛΟΓΙΑΣ, ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2005 ΕΥΡΙΔΙΚΗ ΜΠΟΥΚΟΥΒΑΛΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΠΥΡΗΝΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΠΟΥ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΑΠΟ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΤΕΣ ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΙΟΣΩΜΑΤΩΝ (PEROXISOME PROLIFERATOR-ACTIVATED RECEPTORS -PPARs) ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΟΥΜΕΝΑ ΕΙΔΗ ΙΧΘΥΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2005

2 Μετά από πέντε χρόνια ολοκληρώθηκε αυτή η ιδιαίτερα δημιουργική, κουραστική, αλλά και ταυτόχρονα ευχάριστη δοκιμασία. Φτάνοντας λοιπόν σε αυτό το τελικό στάδιο της διδακτορικής μου διατριβής θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον κ. Κρέη Γρηγόρη για τις πολύτιμες γνώσεις που μου πρόσφερε και την προσπάθεια του να με μυήσει στον επιστημονικό και ερευνητικό τρόπο σκέψης. Ακόμη θα ήθελα να τον ευχαριστήσω για την άψογη συνεργασία που είχαμε όλο αυτό το χρονικό διάστημα, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε, αλλά και την αμέριστη υποστήριξη του κατά τη διάρκεια του πειραματικού μέρους της εργασίας μου, αλλά και κατά τη συγγραφή και προετοιμασία της παρουσίασης της διατριβής μου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Παπαδόπουλο Αθανάσιο, τον επιβλέποντα καθηγητή μου στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο, για την ηθική υποστήριξη και την αρχική ώθηση που μου έδωσε για να αποφασίσω να μετακομίσω στη Ν. Πέραμο και να ασχοληθώ με το συγκεκριμένο θέμα στο Ινστιτούτο Αλιευτικής Έρευνας. Επιπλέον τον ευχαριστώ για τις διορθώσεις που έκανε στο κείμενο μου και για τη βοήθεια του στην προετοιμασία της προφορικής παρουσίασης της διατριβής μου. Ευχαριστώ ιδιαίτερα και την κ. Χατζοπούλου Μαργαρίτα, μέλος της τριμελούς μου επιτροπής, για τα εποικοδομητικά σχόλια και τις διορθώσεις της τόσο στο κείμενο που τις παρέδωσα, όσο και στην προετοιμασία της παρουσίασης μου. Θα ήθελα να την ευχαριστήσω και για την υποστήριξη και το κουράγιο που μου έδωσε στις στιγμές που κυριαρχούσε το άγχος μου. Βεβαίως, θα ήθελα να και τα υπόλοιπα μέλη της επταμελούς μου επιτροπής, την κ. Λάζου Αντιγόνη, τον κ. Μόσσιαλο Γιώργο, τον κ. Αρσενάκη Μηνά, την κ. Καλογιάννη Μάρθα και τον κ. Σκούρα Ζαχαρία για την προσοχή τους, τις εύστοχες παρατηρήσεις και ερωτήσεις τους κατά την παρουσίασή μου, καθώς και για τη συμπάθεια που μου έδειξαν. Το θεωρώ υποχρέωση μου να ευχαριστήσω την κ Laurance Favre-Κρέη για την πολύτιμη βοήθεια που μου προσέφερε στο ξεκίνημα της διδακτορικής μου διατριβής εκπαιδεύοντας με στις τεχνικές της μοριακής βιολογίας, αλλά και για τη φιλία και την υποστήριξή της που διευκόλυνε πολύ την εργασία μου και την προσαρμογή μου στο εντελώς καινούριο και διαφορετικό περιβάλλον. Την ευχαριστώ ιδιαίτερα και για την ανεκτίμητη βοήθεια της στη μελέτη του προτύπου ιστοειδικής έκφρασης των PPARs με τη μέθοδο RNAse protection, την οποία είχε στήσει στο εργαστήριο και δε θα ήταν δυνατή η πραγματοποίησή της χωρίς τις πολύτιμες συμβουλές της.

3 Ακόμη θα ήθελα να ευχαριστήσω την κ Αντωνοπούλου Ευθυμία με την οποία συνεργαστήκαμε στα δυο πρώτα χρόνια του ερευνητικού προγράμματος στο εργαστήριο της Μοριακής Βιολογίας του Ινστιτούτου Αλιευτικής Έρευνας για την ενίσχυση και κλωνοποίηση των γονιδίων του PPARα και των cdnas των τριών τύπων PPAR από την τσιπούρα και το λαβράκι. Θεωρώ πολύτιμη τη φιλική σχέση που αναπτύχθηκε μεταξύ μας και η οποία με βοήθησε πάρα πολύ να προσαρμοστώ στις καινούριες συνθήκες ζωής που προέκυψαν με τη μετακόμιση και διαμονή μου στη Ν.Πέραμο. Θα ήθελα να ευχαριστήσω και κάποιους άλλους συναδέλφους από το Ινστιτούτο Αλιευτικής Έρευνας, τον κ. Σταμάτη Νίκο, την κ. Στεργίου Δέσποινα και τον κ. Φλωρά Μάκη, οι οποίοι με δέχτηκαν εγκάρδια, μου πρόσφεραν απλόχερα τη φιλία τους και με βοήθησαν σε δύσκολες στιγμές που πέρασα αυτά τα πέντε χρόνια. Ένα μεγάλο ευχαριστώ χρωστάω στην πολύ κοντινή μου φίλη Γιώτα, για την ανεκτίμητη φιλία της που μου χαρίζει εδώ και 23 χρόνια. Την ευχαριστώ που στάθηκε δίπλα μου και σε αυτή τη δύσκολη και κρίσιμη φάση της ζωής μου, στηρίζοντάς με και δίνοντας μου κουράγιο όταν περνούσα δύσκολες καταστάσεις και χαίροντας μαζί μου στις ευχάριστες στιγμές. Ευχαριστώ τη φίλη μου Αγάπη, αλλά και όλους τους υπόλοιπους φίλους μου οι οποίοι δεν με ξέχασαν και ανέχτηκαν την απουσία μου αυτά τα χρόνια. Τέλος ιδιαίτερη ευγνωμοσύνη οφείλω στην οικογένειά μου, τη μητέρα μου, τα δυο μου αδέλφια Νίκο και Στέφανο και τη νύφη μου Σούλα, οι οποίοι με στήριξαν από το ξεκίνημα αυτής της δοκιμασίας και της απόφασής μου να ξεκινήσω διδακτορικό σε κάποια άλλη πόλη. Τους ευχαριστώ που ήταν δίπλα μου όποτε τους χρειαζόμουν, μου έδιναν κουράγιο και ανεχόταν την απουσία μου σε αρκετές σημαντικές οικογενειακές περιστάσεις λόγω των υποχρεώσεών μου στο εργαστήριο.

4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ

5 Η παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια ευρωπαϊκού προγράμματος με στόχο τη μελέτη του μεταγραφικού ελέγχου του μεταβολισμού των λιπιδίων σε καλλιεργούμενα είδη ψαριών, όπως στην τσιπούρα (Sparus aurata), στο λαβράκι (Dicentrarchus labrax), στο σολομό (Salmo salar) και στο φασί του Ατλαντικού (Pleuronectes platessa). Για το σκοπό πραγματοποιήθηκε αρχικά κλωνοποίηση και ανάλυση των PPARs που αποτελούν μεταγραφικούς παράγοντες της υπεροικογένειας των πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων και ενεργοποιούνται από λιπαρά οξέα και φαρμακευτικές ουσίες με υπολιπιδαιμική δράση. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μελέτη του προτύπου έκφρασης και μελέτη των ιδιοτήτων των δυο βασικότερων περιοχών, DBD (DNA binding domain) και LBD (Ligand binding domain) των υποδοχέων. Αρχικά, επιτεύχθηκε η κλωνοποίηση τμημάτων των γονιδίων των τριών τύπων PPAR α, β και γ, από την τσιπούρα και το λαβράκι, καθώς και τμήμα του γονιδίου της δεύτερης ισομορφής του PPARα από την τσιπούρα. Διαπιστώθηκε σημαντική ομοιότητα της αλληλουχίας και της οργάνωσης των γονιδίων των PPARs των ψαριών με τα ομόλογα γονίδια των θηλαστικών και των αμφιβίων. Στη συνέχεια, προχωρήσαμε σε κλωνοποίηση και των cdnas των PPARs από τα συγκεκριμένα είδη, ώστε να διαπιστωθεί εάν οι συγκεκριμένες γενωμικές ακολουθίες αποτελούν λειτουργικά γονίδια των ψαριών. Με RT-PCR ενισχύθηκαν οι κωδικοποιούμενες περιοχές και τμήματα των 3 και 5 αμετάφραστων άκρων των PPARs από την τσιπούρα και το λαβράκι. Και στην περίπτωση αυτή διαπιστώθηκαν πολύ υψηλά ποσοστά ομοιότητας μεταξύ των αμινοξικών αλληλουχιών των PPARs των ψαριών με τους ομόλογους τύπους των θηλαστικών και των αμφιβίων. Η μελέτη του προτύπου της ιστοειδικής έκφρασης των PPARs στην τσιπούρα και στο λαβράκι, με τη μέθοδο RNase protection, έδειξε ότι η έκφρασή τους παρουσιάζει αρκετές ομοιότητες αλλά και σημαντικές διαφορές με αυτή των θηλαστικών, υποδηλώνοντας διαφοροποιήσεις στη φυσιολογία τους. Με τη μέθοδο της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας των συμπλόκων DNAπρωτεϊνών (EMSA-Electrophoretic Mobility Shift Assay) μελετήθηκε η ικανότητα των PPARs από την τσιπούρα, το λαβράκι, το φασί του Ατλαντικού και το σολομό, να προσδένονται ως ετεροδιμερή με τους υποδοχείς RXR σε ακολουθίες που αποτελούν γνωστά ή υποτιθέμενα αποκρινόμενα στοιχεία των PPARs. Οι υποδοχείς και από τα τέσσερα είδη ψαριών σχημάτισαν ετεροδιμερή με τους υποδοχείς RXR και αναγνώρισαν τις ακολουθίες των αποκρινόμενων στοιχείων του τύπου DR-1 που

6 εξετάστηκαν, αποδεικνύοντας τη συντήρηση των ιδιοτήτων τόσο της DBD περιοχής όσο και της LBD περιοχής και σε κατώτερα εξελικτικά σπονδυλωτά. Με τη μέθοδο CARLA (CoActivator-Dependent Receptor Ligand Assay) τέλος εντοπίστηκαν ουσίες που μπορούν να αποτελέσουν προσδέτες των PPARs των ψαριών. Διαπιστώθηκε ότι οι LBD περιοχές των PPAR α και β των ψαριών εκτός του σολομού, παρουσιάζουν παρόμοιες ιδιότητες με αυτές των θηλαστικών, αναγνωρίζοντας αρκετές από τις ουσίες που εξετάστηκαν, ενώ η αντίστοιχη περιοχή του PPARγ παρουσιάζει χαμηλή ή και καθόλου συγγένεια για τις συγκεκριμένες ουσίες. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας, οι PPARs των ψαριών είναι δομικά ομόλογοι με τους PPARs των θηλαστικών και πιθανότατα συμμετέχουν σε ανάλογες λειτουργίες ρυθμίζοντας την έκφραση των αντίστοιχων γονιδίων.

7 SUMMARY

8 My thesis was part of a European research project which intention was the study of transcription control of lipid metabolism in farmed fish and especially in sea bream (Sparus aurata), sea bass (Dicentrarchus labrax), salmon (Salmo salar) and plaice (Pleuronectes platessa). For this purpose we initially performed the cloning and analysis of PPARs in these species. PPARs are ligand-inducible transcription factors belonging to the nuclear hormone superfamily. We also studied PPARs tissue expression profile and the properties of their two basic domains DBD and LBD. At the beginning, we isolated and cloned parts of the three PPAR isotypes genes, α, β and γ from both species and part of the second isoform of sea bream PPARα gene. Sequence analysis of these genomic fragments revealed significant homology with the mammalian PPAR genes. To confirm that these isolated genomic fragments constitute parts of functional genes we also isolated and cloned the cdnas of sea bream and sea bass PPARs. We amplified with RT-PCR their coding regions as well as parts of the 3 and 5 untranslated regions. The amino acid sequences of fish PPARs also revealed high homology with mammalian and amphibian homologs. The expression profile of PPARs was determined by the RNase protection assay. The results demonstrate that sea bream and sea bass PPARs present similarities and differences with the mammalian PPARs pattern. This maybe indicates the physiological variations between fish and mammals. Using the Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) we studied the abilities of sea bream, sea bass, plaice and salmon PPARs to form heterodimers with RXR and recognize and bind to well-characterized or potential PPAR response elements. The fish PPARs were able to form heterodimers with RXR and bind to DR-1 response elements we tested. Thus, the properties of PPARs DBD and LBD domains are conserved in lower evolutionally vertebrates. Finally, through CoActivator-Dependent Receptor Ligand Assay (CARLA) we identified compounds that can act as ligands of fish PPARs. The results suggest that fish, except salmon, PPAR α and β demonstrate similar properties with the mammalian counterparts, sharing common ligands. In contrast, the fish PPARγ exhibit low or no affinity for any of the compounds tested. According to the results presented here, the fish PPARs are structurally homologs with their mammalian counterparts and possibly they are involved in similar functions controlling the expression of relevant genes.

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

10 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΓΕΝΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 1. ΠΥΡΗΝΙΚΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ 2 1.α) Δομή των πυρηνικών υποδοχέων β) Ταξινόμηση των πυρηνικών υποδοχέων PPARs (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors) Οι υποδοχείς που ενεργοποιούνται από πολλαπλασιαστές υπεροξειδιοσωμάτων α) Εξέλιξη των PPARs β) Δομή των γονιδίων των PPARs γ) Δομή των πρωτεϊνών των PPARs γ.i) Η DBD περιοχή των PPAR γ.ii) Δομή της LBD περιοχής των PPARs Συνενεργοποιητές- Συνκαταστολείς Συνενεργοποιητές α) Συνενεργοποιητές των PPARs α1) SRC α2) PGC Συνκαταστολείς Μεταγραφική δραστικότητα των PPARs Προσδέτες των PPARs α) Φυσικοί προσδέτες των PPARs β) Συνθετικοί προσδέτες των PPARs 33 Συνθετικοί προσδέτες του PPARα Συνθετικοί προσδέτες του PPARγ Συνθετικοί προσδέτες του PPARβ Φωσφορυλίωση α) Φωσφορυλίωση του PPARα β) Φωσφορυλίωση του PPARγ Έκφραση και λειτουργίες των τριών τύπων PPARs PPARα α) PPARα και υπεροξειδιοσωματική β-οξείδωση β) PPARα και μιτοχονδριακή β-οξείδωση γ) PPARα και μικροσωμική ω-οξείδωση δ) PPARα και μεταβολισμός των αμινοξέων PPARβ PPARγ a. Οι PPARs στα ψάρια ΣΤΟΧΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Μελέτη των PPARs σε καλλιεργούμενα είδη ψαριών 54-56

11 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Πειραματόζωα Απομόνωση των γονιδίων των PPARs από την τσιπούρα και το λαβράκι Κλωνοποίηση 59 Απομόνωση των ανασυνδυσμένων πλασμιδίων Γενωμικοί κλώνοι των PPARs της τσιπούρας α) PPARα β)PPARα γ)PPARβ δ)PPARγ Γενωμικοί κλώνοι των PPARs του λαβρακιού α) PPARα β)PPARβ γ)PPARγ Απομόνωση των cdna κλώνων των PPARs από τα ψάρια 66 RNeasy Mini kit (QIAGEN) cdna κλώνοι των PPARs της τσιπούρας α) PPARα β) PPARβ γ) PPARγ δ) PPARα cdna κλώνοι των PPARs από το λαβράκι α) PPARα β) PPARβ γ) PPARγ cdna κλώνοι των PPARs από το Hippoglossus 72 hippoglossus 2.4. Μελέτη προτύπου ιστοειδικής έκφρασης των PPARs της 74 τσιπούρας και του λαβρακιού RNase protection kit Μελέτη της έκφρασης των PPARs στην τσιπούρα με χρήση RNA ανιχνευτών Μελέτη της έκφρασης των PPARs στο λαβράκι με χρήση RNA ανιχνευτών 2.5. Μελέτη των ιδιοτήτων της DBD περιοχής των PPARs των ψαριών με τη μέθοδο προσδιορισμού της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας των συμπλόκων DNAπρωτεϊνών 77 (Electrophoretic Mobility Shift Assay: EMSA) TNT Coupled Reticulocyte Lysate Systems (Promega) Αποκρινόμενα στοιχεία ραδιενεργά σημασμένοι ανιχνευτές 78 Προετοιμασία των ραδιενεργά σημασμένων ανιχνευτών Μελέτη των ιδιοτήτων της LBD περιοχής των PPARs των ψαριών με τη μέθοδο αναγνώρισης των προσδετών μέσω 80-81

12 των συνενεργοποιητών, CARLA (CoActivator - Dependent Receptor Ligand Assay) Η διαδικασία της μεθόδου CARLA Οι ουσίες που μελετήθηκαν με τη μέθοδο CARLA 82-83

13 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. Γονίδια των PPARs στα ψάρια Γονίδια των PPARs στην τσιπούρα α) Γονίδιο του PPARα από την τσιπούρας β) Γονίδιο του PPARβ από τη τσιπούρα γ) Γονίδιο του PPARγ από τη τσιπούρα δ) Γονίδιο του PPARα2 από τη τσιπούρα Γονίδια των PPARs στο λαβράκι α) Γονίδιο του PPARα από το λαβράκι β) Γονίδιο του PPARβ από το λαβράκι γ) Γονίδιο του PPARγ από το λαβράκι cdnas των PPARs στα ψάρια cdnas των PPARs στην τσιπούρα α) cdna του PPARα της τσιπούρας β) cdna του PPARβ της τσιπούρας γ) cdna του PPARγ της τσιπούρας δ) cdna του PPARα2 της τσιπούρας cdnas των PPARs του λαβρακιού α) cdna του PPARα του λαβρακιού β) cdna του PPARβ του λαβρακιού γ) cdna του PPARγ του λαβρακιού cdnas των PPARs στην ιππόγλωσσα α) cdna του PPARα της ιππόγλωσσας β) cdna του PPARβ της ιππόγλωσσας γ) cdna του PPARγ της ιππόγλωσσας Ομοπαραθέσεις των αμινοξικών ακολουθιών των τριών τύπων PPAR των ψαριών Αμινοξική αλληλουχία του PPARα2 της τσιπούρας Ιστοειδική έκφραση των PPARs στην τσιπούρα και το λαβράκι 3.5. Οι PPARs από την τσιπούρα, το λαβράκι, το σολομό και το φασί του Ατλαντικού δημιουργούν σύμπλοκα με τον RXR σε αποκρινόμενα στοιχεία του τύπου DR Μελέτη των ιδιοτήτων της LBD περιοχής των PPARs των ψαριών με τη μέθοδο αναγνώρισης των προσδετών μέσω των συνενεργοποιητών CARLA (CoActivator - Dependent Receptor Ligand Assay)

14 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1. Γονίδια των PPARs στη τσιπούρα και στο λαβράκι cdnas και αμινοξικές ακολουθίες των PPARs στα ψάρια Έκφραση των PPARs στη τσιπούρα και στο λαβράκι Ιδιότητες της DBD περιοχής των PPARs των ψαριών Ιδιότητες της LBD περιοχής των PPARs των ψαριών ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

15 ΠΙΝΑΚΕΣ Πίνακα 1. Η υπεροικογένεια των πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων 10 Πίνακας των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση των γονιδίων PPAR από την τσιπούρα και το λαβράκι. (ονόματα, αλληλουχία και περιοχή του 65 υποδοχέα στην οποία σχεδιάστηκαν) Πίνακας των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση των cdna κλώνων των PPARs από την τσιπούρα, το λαβράκι και την ιππόγλωσσα. (ονόματα, αλληλουχία και για την ενίσχυση ποιας περιοχής του υποδοχέα 73 σχεδιάστηκαν). Πίνακας με τις ακολουθίες των ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιήθηκαν στη σύνθεση των ραδιενεργά σημασμένων ανιχνευτών-αποκρινόμενων στοιχείων, που 79 μελετήθηκαν με τη μέθοδο EMSA. Πίνακας 2. Οι αλληλουχίες των PPREs που χρησιμοποιήθηκαν μαζί με τις πλευρικές ακολουθίες τους. Πίνακας 3. Στατιστική επεξεργασία τουλάχιστον τριών πειραμάτων CARLA, για την ανεύρεση των ουσιών που αποτελούν προσδέτες για τους PPARs α και β από 178 το λαβράκι και PPARγ από το φασί του Ατλαντικού Πίνακας 4.Στατιστική επεξεργασία τουλάχιστον τριών πειραμάτων CARLA, για την ανεύρεση των ουσιών που αποτελούν προσδέτες για τους τρεις τύπους 178 PPAR από το σολομό

16 ΕΙΚΟΝΕΣ Εικόνα 1. Σχηματική απεικόνιση της δομικής και λειτουργικής οργάνωσης των πυρηνικών υποδοχέων 7 Εικόνα 2. Σχηματική απεικόνιση της αλληλεπίδρασης των πυρηνικών υποδοχέων με συνενεργοποιητές και το βασικό σύμπλοκο της μεταγραφής (Carlberg, 2004) 7 Τρισδιάστατη δομή των LBD περιοχών των PPARs 23 Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας απομόνωσης γενωμικού DNA από ιστούς 58 με το DNeasy kit Σχηματική απεικόνιση της μεθόδου κλωνοποίησης PCR-Script TM Amp 59 Σχηματική απεικόνιση των γονιδίων των υποδοχέων PPAR και των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυσή τους από την τσιπούρα, Sparus aurata 62 Σχηματική απεικόνιση των γονιδίων των υποδοχέων PPAR και των εκκινητών 64 που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυσή τους από το λαβράκι, D.labrax Σχηματική απεικόνιση της θέσης των εκκινητών, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση των cdna κλώνων των PPARs της τσιπούρας 69 Σχηματική απεικόνιση της θέσης των εκκινητών, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση των cdna κλώνων των PPAR στο λαβράκι 71 Χάρτης του φορέα PCR-Script TM SK(+) και αλληλουχία του σημείου με τις 84 πολλαπλές δυνατότητες για κλωνοποίηση DNA τμημάτων (polylinker). Χάρτης του pbluescriptks(+) πλασμιδίου. 85 Χάρτης των φορέων σύντηξης με την γλουταθειόνη S-τρανσφεράση, όπου 86 διακρίνονται τα βασικά χαρακτηριστικά τους και τα αναγνωστικά πλαίσια. Εικόνα 3Α. Μερική αλληλουχία του γονιδίου του υποδοχέα PPARα από την τσιπούρα Εικόνα 3Β. Σχηματική απεικόνιση της δομής του γονιδίου του υποδοχέα PPARα της τσιπούρας 90 Εικόνα 4Α. Μερική αλληλουχία του γονιδίου του υποδοχέα PPARβ από την τσιπούρα Εικόνα 4Β. Σχηματική απεικόνιση της δομής του γονιδίου του υποδοχέα PPARβ της τσιπούρας 94 Εικόνα 5Α.Αλληλουχία τμήματος του γονιδίου του υποδοχέα PPARγ από την 96 τσιπούρα, συγκεκριμένα του ιντρονίου που συνδέει το εξώνιο της Α/Β περιοχής με το εξώνιο του πρώτου δάκτυλου ψευδαργύρου. Εικόνα 5Β. Μερική αλληλουχία της LBD περιοχής του υποδοχέα PPARγ της τσιπούρας 97 Εικόνα 5Γ. Σχηματική απεικόνιση της δομής του γονιδίου του υποδοχέα PPARγ της τσιπούρας 98 Εικόνα 6Α. Αλληλουχία τμήματος της LBD περιοχής του γονιδίου του υποδοχέα PPARα2 από τη τσιπούρα 100 Εικόνα 6Β. Σχηματική απεικόνιση της δομής του γονιδίου του υποδοχέα PPARα2 της τσιπούρας 101 Εικόνα 7Α. Μερική αλληλουχία του γονιδίου του υποδοχέα PPARα από το λαβράκι 103 Εικόνα 7Β. Σχηματική απεικόνιση της δομής του γονιδίου του υποδοχέα PPARα του λαβρακιού 104 Εικόνα 8Α. Μερική αλληλουχία του γονιδίου του υποδοχέα PPARβ από το λαβράκι Εικόνα 8B. Σχηματική απεικόνιση της δομής του γονιδίου του υποδοχέα PPARβ του λαβρακιού 108 Εικόνα 9Α. Αλληλουχία τμήματος του γονιδίου του υποδοχέα PPARγ από το 110 λαβράκι, συγκεκριμένα του ιντρονίου που συνδέει το εξώνιο της Α/Β περιοχής με το εξώνιο του πρώτου δακτυλίου ψευδαργύρου Εικόνα 9Β. Αλληλουχία ενός άλλου τμήματος του γονιδίου του υποδοχέα 111 PPARγ από το λαβράκι, συγκεκριμένα του ιντρονίου που συνδέει το πρώτο με

17 το δεύτερο εξώνιο της LBD περιοχής Εικόνα 9Γ. Σχηματική απεικόνιση της δομής του γονιδίου του υποδοχέα PPARγ του λαβρακιού 112 Εικόνα 10Α. Μερική νουκλεοτιδική ακολουθία του υποδοχέα PPARα από την τσιπούρα 114 Εικόνα 10Β. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARα της τσιπούρας 115 Εικόνα 11Α. Μερική νουκλεοτιδική ακολουθία του υποδοχέα PPARβ από την τσιπούρα 117 Εικόνα 11B. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARβ της τσιπούρας 118 Εικόνα 12Α. Μερική νουκλεοτιδική ακολουθία του υποδοχέα PPARγ από την τσιπούρα 120 Εικόνα 12B. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARγ της 121 τσιπούρας Εικόνα 13Α. Μερική νουκλεοτιδική ακολουθία της κωδικοποιούμενης περιοχής του υποδοχέα PPARα2 από τη τσιπούρα 123 Εικόνα 13B. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARα2 της τσιπούρας 124 Εικόνα 14Α. Μερική νουκλεοτιδική ακολουθία της κωδικοποιημένης περιοχής του υποδοχέα PPARα από το λαβράκι 126 Εικόνα 14B. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARα του λαβρακιού 127 Εικόνα 15Α. Νουκλεοτιδική ακολουθία του υποδοχέα PPARβ από το λαβράκι 129 Εικόνα 15B. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARβ του λαβρακιού 130 Εικόνα 16Α. Η νουκλεοτιδική ακολουθία της κωδικοποιημένης περιοχής του υποδοχέα PPARγ από το λαβράκι 132 Εικόνα 16Β.Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARγ του λαβρακιού 133 Εικόνα 17Α. Η νουκλεοτιδική ακολουθία της κωδικοποιούμενης περιοχής του 135 υποδοχέα PPARα της ιππόγλωσσας Εικόνα 17Β. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARα της 136 ιππόγλωσσας Εικόνα 18Α. Η νουκλεοτιδική ακολουθία της κωδικοποιούμενης περιοχής του 138 υποδοχέα PPARβ από την ιππόγλωσσα Εικόνα 18Β. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARβ της 139 ιππόγλωσσας Εικόνα 19Α. Μερική νουκλεοτιδική ακολουθία της κωδικοποιούμενης περιοχής 141 του υποδοχέα PPARγ της ιππόγλωσσας Εικόνα 19Β. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARγ της 142 ιππόγλωσσας Εικόνα 20. Ομοπαράθεση των υποδοχέων PPARα από το λαβράκι (D. labrax), την ιππόγλωσσα (H. hippoglossus), το φασί του Ατλαντικού (P.platessa), την τσιπούρας (S.aurata) και το σολoμό (S.salar) 145 Εικόνα 21. Ομοπαράθεση των υποδοχέων PPARβ από το λαβράκι (D. labrax), την ιππόγλωσσα (H. hippoglossus), το φασί του Ατλαντικού (P.platessa), την τσιπούρα (S.aurata) και το σολoμό (S.salar) 146 Εικόνα 22. Ομοπαράθεση των υποδοχέων PPARγ από το λαβράκι (D. labrax), την ιππόγλωσσα (H. hippoglossus), το φασί του Ατλαντικού (P.platessa), τη τσιπούρα (S.aurata) και το σολoμό (S.salar) 147 Εικόνα 23.Οι αμινοξικές ακολουθίες των τριών τύπων PPAR από το λαβράκι (D.labrax) και την τσιπούρα (S.aurata) Εικόνα 24. Σύγκριση των τριών τύπων PPAR σε διάφορα είδη 150

18 Εικόνα 25. Ομοπαράθεση της αμινοξικής αλληλουχίας της LBD περιοχής του PPARα2 από το λαβράκι (D.labrax), το F.rubripes, τη τσιπούρα (S.aurata) και το T.nigroviridis Εικόνα 26. Ομοπαράθεση της αμινοξικής αλληλουχίας της LBD περιοχής του PPARα2 της τσιπούρας (S.aurata) με του σολομού (S.salar) Εικόνα 27. Πρότυπο ιστοειδικής έκφρασης των τριών τύπων PPARs στην τσιπούρα, με τη μέθοδο RNase protection Εικόνα 28. Πρότυπο ιστοειδικής έκφρασης των τριών τύπων PPARs στο λαβράκι, με τη μέθοδο RNase protection Εικόνα 29. Διαχωρισμός σε πηκτή πολυακρυλαμίδης SDS PAGE των in vitro μεταφρασμένων και σημασμένων ραδιενεργά με 35 S πρωτεϊνών των PPARs των ψαριών και των RXRs από θηλαστικά που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα EMSA. Εικόνα 30. Σχηματιζόμενα σύμπλοκα των PPARs των ψαριών με τους hrxrα και mrxrβ στους ραδιενεργά σημασμένους ανιχνευτές ACO και GSTA1.1 Εικόνα 31. Εντοπισμός των αποκρινόμενων στοιχείων των PPARs της τσιπούρας με τη μέθοδο EMSA Εικόνα 32. Εντοπισμός των αποκρινόμενων στοιχείων των PPARs από το φασί του Ατλαντικού με τη μέθοδο EMSA Εικόνα 33. Εντοπισμός των αποκρινόμενων στοιχείων των PPARs από το σολομό με τη μέθοδο EMSA Εικόνα 34. Εντοπισμός των αποκρινόμενων στοιχείων των PPAR β και γ του λαβρακιού με τη μέθοδο EMSA Εικόνα 35. Ανταγωνισμός των σχηματιζόμενων συμπλόκων του PPARγ της τσιπούρας και του PPARα από το φασί του Ατλαντικού με τον mrxrβ στους ραδιενεργά σημασμένους ανιχνευτές GSTA1.2 και ACO, αντίστοιχα Εικόνα 36. Επιβεβαίωση της παρουσίας του PPARγ στα ετεροδιμερή PPAR:RXR με την προσθήκη του ειδικού αντισώματος για τον PPARγ των ψαριών στις αντιδράσεις Εικόνα 37. Τα ειδικά σύμπλοκα που σχηματίζουν οι PPARs των τεσσάρων υπό εξέταση ειδών ψαριών με τον RXRα από το φασί του Ατλαντικού στους ραδιενεργά σημασμένους ανιχνευτές Εικόνα 38. Σχηματική απεικόνιση της μεθόδου CARLA, που χρησιμοποιήθηκε για την αναγνώριση ουσιών που αποτελούν προσδέτες για τους PPARs των ψαριών (Devchand et al., 1999). Εικόνα 39. Έκφραση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών της LBD περιοχής των PPARs των ψαριών, με την πρωτεΐνη της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST) Εικόνα 40. Έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης του SRC-1 με την πρωτεΐνη της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST) Εικόνα 41. Εφαρμογή της μεθόδου CARLA στην LBD περιοχή του PPARα του λαβρακιού Εικόνα 42. Εφαρμογή της μεθόδου CARLA στην LBD περιοχή του PPARβ του λαβρακιού Εικόνα 43. Εφαρμογή της μεθόδου CARLA στην LBD περιοχή του PPARγ από το φασί του Ατλαντικού Εικόνα 44. Εφαρμογή της μεθόδου CARLA στην LBD περιοχή του PPARα του σολομού Εικόνα 45. Εφαρμογή της μεθόδου CARLA στην LBD περιοχή του PPARβ του σολομού Εικόνα 46. Εφαρμογή της μεθόδου CARLA στην LBD περιοχή του PPARγ του σολομού Εικόνα 47. Φυλογενετικό δέντρο της LBD περιοχής των PPARs από διάφορα είδη (από τους Leaver et al., 2005)

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

20 ΓΕΝΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κατά την εξέλιξη των οργανισμών επεκράτησαν εκείνοι οι οποίοι μπόρεσαν να αναπτύξουν μηχανισμούς ρύθμισης της μεταγραφής γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες εμπλεκόμενες στις διαδικασίες μεταβολισμού, όπως σύνθεση υδατανθράκων, σύνθεση ή αποικοδόμηση πρωτεϊνών, μεταφορά αμινοξέων. Αυτή η ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων ήταν στην ουσία ένα πρωτόγονο ορμονικό σύστημα ελέγχου (μεταγωγής σημάτων), που λειτουργούσε με σκοπό την ανάπτυξη και την επιβίωση των οργανισμών. Καθώς οι μονοκύτταροι οργανισμοί εξελίχθηκαν σε πολυκύτταρες και πολύπλοκες μορφές ζωής, τα διαθέσιμα θρεπτικά συστατικά συνέχισαν να παίζουν ρυθμιστικό ρόλο αποτελώντας παράγοντες-μηνύματα, στη έκφραση γονιδίων του μεταβολισμού (Clarke et al., 1999). Για παράδειγμα τα λιπαρά οξέα αποτελούν ένα συστατικό της διατροφής που επιδρά στην ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και το μεταβολισμό των κυττάρων ρυθμίζοντας τις κυτταρικές λειτουργίες είτε μέσω της σύστασης της κυτταρικής μεμβράνης όπου συμμετέχουν (Gasperikova et al., 1997), είτε απευθείας με ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης (Jump et al., 1996). Κατά συνέπεια ο τύπος και το ποσοστό των λιπαρών οξέων στη διατροφή επηρεάζουν τη φυσιολογία των οργανισμών. Για παράδειγμα, διατροφή που περιέχει υψηλό ποσοστό κορεσμένων λιπαρών οξέων οδηγεί στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας στην ινσουλίνη, ενώ η κατανάλωση η-3 πολυακόρεστων λιπαρών οξέων αυξάνει την ευαισθησία στην ινσουλίνη (Storlien et al., 1987).

21 1. ΠΥΡΗΝΙΚΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ Οι περισσότερες φυσιολογικές λειτουργίες των θηλαστικών βρίσκονται υπό τον έλεγχο των ορμονών. Οι ορμόνες είναι χημικοί μηνύτορες που μεταβιβάζουν το σήμα τους στα κύτταρα μέσω ειδικών μεμβρανικών και πυρηνικών υποδοχέων. Οι πυρηνικοί υποδοχείς είναι εξελικτικά νεώτεροι από τους μεμβρανικούς, γιατί περιορίζονται στα μετάζωα. Οι μεμβρανικοί υποδοχείς δρουν μέσω πολύπλοκων μηχανισμών μεταγωγής σήματος που συμπεριλαμβάνουν G-πρωτεΐνες, μόρια που αποτελούν δεύτερους μηνύτορες ή/και αρκετές κινάσες (Calberg, 2004). Αντίθετα οι πυρηνικοί υποδοχείς ρυθμίζουν τη μεταγραφή γονιδίων λειτουργώντας ως μεταγραφικοί παράγοντες, που ενεργοποιούνται στις περισσότερες περιπτώσεις από προσδέτες και συνιστούν μια από τις μεγαλύτερες οικογένειες μεταγραφικών παραγόντων, την επονομαζόμενη υπεροικογένεια των πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων (NHR - Nuclear Hormone Receptors), στην οποία συμπεριλαμβάνονται υποδοχείς όπως οι κλασσικοί ενδοκρινείς. Όπως και άλλοι μεταγραφικοί παράγοντες έχουν ενεργό ρόλο στην αναδιάταξη της χρωματίνης και λειτουργούν είτε μόνοι τους, είτε σε συνεργασία με συνενεργοποιητές και συνκαταστολείς για την ενεργοποίηση ή την καταστολή της έκφρασης γονιδίων, αντίστοιχα. Αρκετές ορμόνες, βιοενεργά λιπίδια και άλλα μικρά φυσικά ή συνθετικά οργανικά μόρια μπορούν να αποτελέσουν προσδέτες αυτών των υποδοχέων (Glass and Rosenfeld, 2000). Υπάρχουν δυο κατηγορίες πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων σε σχέση με τη θέση που βρίσκονται μέσα στο κύτταρο. Υπάρχουν οι πυρηνικοί υποδοχείς των οποίων η μετατόπιση στον πυρήνα προϋποθέτει την παρουσία προσδετών και αυτοί οι οποίοι είναι μόνιμα τοποθετημένοι στον πυρήνα, ανεξάρτητα από την παρουσία προσδετών. 1.1.α) Δομή των πυρηνικών υποδοχέων Οι πυρηνικοί ορμονικοί υποδοχείς απαρτίζονται από κοινές λειτουργικές περιοχές, που τους έχουν δοθεί οι ονομασίες από A έως F (Σχήμα 1). Η περιοχή Α/Β καταλαμβάνει το αμινοτελικό τους άκρο και είναι η λιγότερη συντηρημένη περιοχή ανάμεσα στα μέλη της υπεροικογένειας, με ποικίλο μέγεθος και με μια αυτόνομη περιοχή ενεργοποίησης, την AF-1 (Activation-Function 1). Η περιοχή Α/Β αποτελεί συχνά αντικείμενο εναλλακτικής «συρραφής» (splicing) και εναλλακτικής χρησιμοποίησης των προαγωγέων. Ακόμα πολλές φορές διαφοροποιείται με

22 μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις, όπως φωσφορυλίωση, η οποία φαίνεται να διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο για τη μεταγραφική δραστικότητα της AF-1 περιοχής (Shao and Lazar, 1999). Η δέσμευση των πυρηνικών υποδοχέων στο DNA πραγματοποιείται από τις δύο εξελικτικά συντηρημένες περιοχές τους, που λειτουργούν ανεξάρτητα για να ρυθμίσουν τις αλληλεπιδράσεις DNA-πρωτεΐνης και τις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνηςπρωτεΐνης. Οι αλληλεπιδράσεις DNA-πρωτεΐνης ρυθμίζονται από την C ή DBD (DNA-binding domain) περιοχή. Οι αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, απαραίτητες για το σχηματισμό ομοδιμερών ή /και ετεροδιμερών, ρυθμίζονται από μια εκτεταμένη καρβοξυτελική επιφάνεια διμερισμού που περιέχεται στην Ε ή LBD (Ligand-Binding Domain) περιοχή. Η συντηρημένη DBD περιοχή, είναι η περιοχή, όπως προαναφέρθηκε, με την οποία προσδένονται οι υποδοχείς στο DNA. Κατευθύνει τους υποδοχείς προς το αποκρινόμενο στοιχείο τους. Το αποκρινόμενο στοιχείο των ορμονών (HRE- Hormone Response Element) είναι μια ειδική ακολουθία DNA στον προαγωγέα των γονιδίων που αναγνωρίζουν οι πυρηνικοί ορμονικοί υποδοχείς. Υπάρχουν τρεις τύποι σύνδεσης της DBD περιοχής των υποδοχέων στα αποκρινόμενα στοιχεία των γονιδίων στόχων τους, αναλόγως με το αν οι αλληλεπιδράσεις τους γίνονται ως μονομερή, ομοδιμερή ή ετεροδιμερή. Αποκρινόμενα στοιχεία που αναγνωρίζονται από υποδοχείς που δεσμεύονται ως ομοδιμερή ή ετεροδιμερή τυπικά αποτελούνται από δυο ακολουθίες αναγνώρισης που επιτρέπουν τις βέλτιστες αλληλεπιδράσεις DNA-πρωτεΐνης και πρωτεΐνης- πρωτεΐνης. Βασιζόμενοι στους τρεις διαφορετικούς τύπους σύνδεσης στο DNA προκύπτουν και τρία χαρακτηριστικά των αποκρινόμενων στοιχείων που καθορίζουν την εξειδικευμένη αναγνώριση από συγκεκριμένη ομάδα των πυρηνικών υποδοχέων : 1) η ακριβής ακολουθία του μοτίβου αναγνώρισης, 2) ο προσανατολισμός της μιας ακολουθίας του μοτίβου σε σχέση με την άλλη (π.χ. απευθείας επανάληψη, παλίνδρομη επανάληψη ή ανεστραμμένη επανάληψη) και 3) ο αριθμός των νουκλεοτιδίων που διαχωρίζει τα δυο μοτίβα (Glass, 1994). Έτσι οι υποδοχείς VDR (Vitamin D Receptor), RAR (Retinoid Acid Receptor) και TR (Thyroid hormone Receptor) δεσμεύονται ως ομοδιμερή σε αποκρινόμενα στοιχεία με παλίνδρομη ακολουθία, ενώ ως ετεροδιμερή με τους RXR (Retinoid X Receptor) σε αποκρινόμενα στοιχεία απευθείας επανάληψης. Οι RXR καταλαμβάνουν πάντα το 5 άκρο της ακολουθίας στα συγκεκριμένα ετεροδιμερή. Τα απευθείας επανάληψης

23 αποκρινόμενα στοιχεία αντιπροσωπεύουν τα μεγαλύτερης συγγένειας σημεία δέσμευσης των ετεροδιμερών των RXR, γιατί η DBD περιοχή των υποδοχέων VDR, RAR και TR προτιμά να περιστρέφεται διατηρώντας σταθερή την καρβοξυτελική περιοχή διμερισμού (Kurokawa et al, 1993). Ο RXR μπορεί να προσδένεται σε αποκρινόμενα στοιχεία του και ως ομοδιμερές (Zhang et al., 1992). Μελέτες όμως έδειξαν ότι μπορεί να σχηματίζει και σταθερά τετραμερή (Chen and Privalsky, 1995; Kersten et al., 1995). Αυτό παρατηρήθηκε σε γονίδια στόχους του RXR, όπως το γονίδιο της CRBPII (Cellular Retinol-Binding Protein II), το οποίο περιέχει αρκετά μισά μοτίβα αναγνώρισης που συνεργάζονται στη στρατολόγηση μονομερών του RXRα, ώστε να σχηματίσουν ένα λειτουργικό τετραμερές (Chen and Privalsky, 1995). Η δυνατότητα του σχηματισμού τετραμερών φαίνεται ότι εξαρτάται από την ισομορφή του υποδοχέα, καθώς ο RXRβ δε μπορεί να σχηματίσει τα συγκεκριμένα σύμπλοκα. Η δέσμευση του προσδέτη έχει σαν αποτέλεσμα το διαχωρισμό του τετραμερούς σε διμερή ή μονομερή, τα οποία θα είναι διαθέσιμα για το σχηματισμό ομοδιμερών ή ετεροδιμερών (Kersten et al., 1997; Dong and Noy, 1998; Chen et al., 1998), υπονοώντας ότι τα τετραμερή αντιπροσωπεύουν απλώς μια αποθηκευτική εκδοχή του RXR. Η DBD περιοχή συνίσταται από δυο δακτύλους ψευδαργύρου, του τύπου των τεσσάρων κυστεϊνών. Μελέτες της δομή και της λειτουργίας της DBD περιοχής αρκετών μελών της υπεροικογένειας οδήγησαν στην αναγνώριση κάποιων ακολουθιών που ονομάστηκαν P-, D-, T- και Α- boxes. Το P box αντιστοιχεί στις ακολουθίες της καρβοξυτελικής άρθρωσης του πρώτου δακτύλου ψευδαργύρου και καθορίζει τις ειδικές συνδέσεις των πυρηνικών υποδοχέων με το DNA (Mader et al., 1989; Umesono and Evans, 1989; Luisi et al., 1991). Το D box συνίσταται από τα αμινοξέα της πρώτης άρθρωσης του δευτέρου δακτύλου ψευδαργύρου και αποτελεί μια επιφάνεια διμερισμού που εμπλέκεται στην αναγνώριση του ενός μοτίβου αναγνώρισης (Hirst et al., 1992). Τα Τ box και Α box εντοπίζονται αμέσως παρακάτω από το δεύτερο δάκτυλο ψευδαργύρου και έχουν αναγνωριστεί στους υποδοχείς RXR και NGFI-B (Nerve Growth Factor Induced clone-b), αντίστοιχα. Το Τ box συνεισφέρει στον ομοδιμερισμό του RXR (Wilson et al., 1992; Lee et al., 1993), και το Α box είναι απαραίτητο για τη δέσμευση του NGFI-B ως μονομερές στο αποκρινόμενο στοιχείο του (Wilson et al., 1992). Η D περιοχή, είναι λιγότερο εξελικτικά συντηρημένη από τις γειτονικές περιοχές DBD και LBD και λειτουργεί ως συνδετικός κρίκος τους. Περιέχει ένα σήμα για την

24 πυρηνική τοποθέτηση των υποδοχέων (NLS-nuclear localization signal) ή τουλάχιστον κάποια στοιχεία του λειτουργικού NLS (Guiochon-Mantel et al., 1994). Η LBD περιοχή αποτελεί το βασικό γνώρισμα των πυρηνικών υποδοχέων. Είναι υπεύθυνη για πολλές και διαφορετικές λειτουργίες, οι περισσότερες από τις οποίες πραγματοποιούνται εξαρτώμενες από την παρουσία προσδέτη. Έτσι στην LBD περιοχή αποδίδεται η μεταγραφική δραστικότητα των υποδοχέων που εξαρτάται από τους προσδέτες (AF-2, Activation Function-2) και εντοπίζεται μια πολύ βασική επιφάνεια διμερισμού (Gronemeyer and Laudet, 1995; Chambon, 1996; Moras and Gronemeyer,1998). Λεπτομερή μοριακά δεδομένα της σχέσης δομής λειτουργίας και της μετάδοσης μηνύματος από τους πυρηνικούς υποδοχείς αποκτήθηκαν μετά από την κρυσταλλογραφία της LBD περιοχής μόνη της ή παρουσία αγωνιστών, ανταγωνιστών και συνενεργοποιητών. Οι υποδοχείς στους οποίους δεν υπάρχουν συνδεδεμένοι προσδέτες συνήθως αναφέρονται ως απο- μορφές των υποδοχέων, ενώ όταν έχουν συνδεθεί προσδέτες ονομάζονται ολο- μορφές. Η γενική διαμόρφωση της LBD περιοχής των πυρηνικών υποδοχέων αποτελείται από ένα τρισδιάστατο «σάντουιτς» 12 α-ελίκων (H1-H12). Η αρίθμηση των ελίκων ξεκινά από το αμινοτελικό άκρο. Οι έλικες Η3, Η5, Η10 και Η11 δημιουργούν μια κοιλότητα από υδρόφοβα αμινοξέα, στην οποία θα φιλοξενηθεί ο υδρόφοβος προσδέτης. Όταν ο προσδέτης πάρει την τελική του θέση στην κοιλότητα, η Η12 σφραγίζει την «τσέπη» της LBD περιοχής και επιπλέον σταθεροποιεί τη σύνδεση του προσδέτη συνεισφέροντας στο υδρόφοβο περιβάλλον ή / και ερχόμενη σε επαφή και με τον ίδιο τον προσδέτη. Η έλικα Η12 ονομάζεται και περιοχή ενεργοποίησης (AD- Activating Domain) της AF-2 λειτουργίας (Gronemeyer and Laudet, 1995; Chambon, 1996). Όταν η Η12 πλησιάζει στην υπόλοιπη LBD, δημιουργεί μια υδρόφοβη σχισμή μαζί με άλλα αμινοξέα που βρίσκονται εκτεθειμένα στην επιφάνεια της LBD και σχηματίζουν το NR box (Nuclear Receptor box) των συνενεργοποιητών (Heery et al.,1997; Voegel et al., 1998). Μελέτες κρυσταλλογραφίας έδειξαν συγκεκριμένα τις αλληλεπιδράσεις του μοτίβου LXXLL του NR box, αποδίδοντάς του ένα πολύ βασικό ρόλο στη συγκρότηση των συμπλόκων των συνενεργοποιητών των πυρηνικών υποδοχέων (Nolte et al., 1998). Μερικοί πυρηνικοί υποδοχείς μπορούν να λειτουργήσουν και ως καταστολείς της μεταγραφής γονιδίων, όταν είναι συνδεδεμένοι στο DNA. Αυτό το φαινόμενο συμβαίνει κατά την απουσία αγωνιστών των υποδοχέων. Μπορεί να επάγεται από την παρουσία ανταγωνιστών και σχετίζεται με τη στρατολόγηση των πρωτεϊνών

25 συνκαταστολέων. Οι συνκαταστολείς συνδέονται πάντα στην επιφάνεια της LBD περιοχής των υποδοχέων, όταν δεν υπάρχει συνδεδεμένος προσδέτης, με παρόμοιο τρόπο με αυτό των συνενεργοποιητών, αναγνωρίζοντας ένα μοτίβο το CoRNR box (CoRepressor Nuclear Receptor box) (Hu and Lazar, 1999; Nagy et al., 1999). Με τη δέσμευση του προσδέτη αλλάζει η στερεοδιαμόρφωση της LBD περιοχής, απομακρύνονται οι συνκαταστολείς και στρατολογούνται οι συνενεργοποιητές. Ξεκινούν αλληλεπιδράσεις με μια σειρά μεταγραφικών παραγόντων, μέσω των οποίων μεταβιβάζεται το σήμα στο βασικό σύμπλοκο της μεταγραφής, επάγοντας τη μεταγραφή του γονιδίου (Σχήμα 2). Η κατασταλτική μεταγραφική δραστικότητα των πυρηνικών υποδοχέων μπορεί ακόμη να οφείλεται στον ανταγωνισμό μεταξύ πυρηνικών υποδοχέων τόσο για τη δέσμευση σε αποκρινόμενα στοιχεία στο DNA (Towers et al., 1998; Towers et al., 1999), όσο και για πρωτεΐνες είτε των υποδοχέων που χρησιμοποιούν για να σχηματίσουν ετεροδιμερή όπως τον RXR, είτε των κοινών συνενεργοποιητών όπως ο SRC-1 (Steroid Receptor CoActivator-1) (Polly et al., 1997). Μερικοί υποδοχείς διαθέτουν στο καρβοξυτελικό άκρο της LBD περιοχής τους μια επιπλέον περιοχή, την F, η οποία διαφοροποιείται ανάμεσα στους υποδοχείς και δεν παρουσιάζει ιδιαίτερα δομικά χαρακτηριστικά, ούτε κάποια γνωστή λειτουργία. Μερικοί υποθέτουν ότι μπορεί να συμμετέχει στη στρατολόγηση των συνενεργοποιητών στην LBD περιοχή. Η F περιοχή απουσιάζει από αρκετούς υποδοχείς, όπως από τους PR (Progesterone Receptor), PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor), RAR και RXR (Robyr et al., 2000). Όπως η Α/Β περιοχή, οι LBD και F περιοχές είναι επίσης στόχοι μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων, γεγονός το οποίο προσθέτει ακόμη ένα επίπεδο πολυπλοκότητας στη μεταγωγή μηνυμάτων από τους πυρηνικούς υποδοχείς, εφόσον τέτοιες διαδικασίες μπορούν να επηρεάσουν τις ιδιότητές τους. (Laudet and Gronemeyer, 2002, The Nuclear Receptor, Facts Book).

26 Έλικα Η12 A/B C D E AD F Ligand binding domain AF-1 DNA binding NLS -nuclear Δέσμευση του προσδέτη (Activation Function-1) domain localization signal AF-2 Μεταγραφική ενεργοποίηση Δέσμευση στο Πυρηνική (Activation Function-2) DNA τοποθέτηση των Μεταγραφική ενεργοποίηση υποδοχέων εξαρτώμενη από τον προσδέτη Διμερισμός Εικόνα 1. Σχηματική απεικόνιση της δομικής και λειτουργικής οργάνωσης των πυρηνικών υποδοχέων. Οι πυρηνικοί υποδοχείς συνθέτονται από τις συγκεκριμένες περιοχές, εξαίρεση αποτελεί η F περιοχή η οποία απουσιάζει από κάποια μέλη της υπεροικογένειας. ADautonomous domain είναι η αυτόνομη περιοχή ενεργοποίησης, στην οποία εντοπίζεται η συμμετοχή της Η12 στη μεταγραφική ενεργοποίηση της AF-2. Figure 1. Schematic illustration of the structural and functional organization of nuclear receptors. The nuclear receptors are consisted of these domains. The F domain is absent in some members of the superfamily. In the AD- autonomous domain is localized the participation of the helix H12 in the AF-2. Εικόνα 2. Σχηματική απεικόνιση της αλληλεπίδρασης των πυρηνικών υποδοχέων με συνενεργοποιητές και το βασικό σύμπλοκο της μεταγραφής (Carlberg, 2004). Figure 2. Schematic representation of the interaction of the nuclear hormone receptors with coactivators and the basal transcription machinery (Carlberg, 2004).

27 1.1.β) Ταξινόμηση των πυρηνικών υποδοχέων Ο αριθμός των γονιδίων που κωδικοποιούν τα διάφορα μέλη της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων διαφοροποιείται από είδος σε είδος. Έχουν εντοπιστεί πάνω από 270 γονίδια στο C. elegans, 21 στη Drosophila, 68 στο Fugu, 49 στο ποντικό και 48 στον άνθρωπο (Maglich et al., 2003). Ο αριθμός των γονιδίων που κωδικοποιούν τους πυρηνικούς υποδοχείς αντανακλά εν μέρει μόνο την πολυπλοκότητα τους, η οποία αυξάνει εξαιτίας της διαφοροποίησής τους σε πρωτεϊνικό επίπεδο μέσω μεταφραστικών και μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων. Έχοντας υπόψη τους διαφορετικούς τύπους του κάθε υποδοχέα και τις διαφοροποιήσεις στους προσδέτες που τους ενεργοποιούν, οι 28 διαφορετικές υποομάδες πυρηνικών υποδοχέων του ανθρώπου μπορούν να διαχωριστούν (εξελικτικά) σε 6 υποοικογένειες, από την NR0 (Nuclear Receptor 0) έως την NR5 (Nuclear Receptor 5) (Πίνακας 1). Οκτώ είναι οι κλασσικοί ενδοκρινείς υποδοχείς της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων. Είναι οι υποδοχείς των ορμονών, 3,5,3 - τριϊωδιοθυρονίνης (Τ 3 R), όλων των trans-ρετινοϊκών οξέων (RAR), της 1α,25(ΟΗ) 2 D 3 βιταμίνης (VDR), της 17β-εστραδιόλης (ER), των γλυκοκορτικοειδών (GR), της αλδοστερόνης (MR), την προγεστερόνης (PR) και της διϋδροτεστοστερόνης (AR). Οι ορμόνες - προσδέτες προσδένονται στη θέση δέσμευσης, «τσέπη», της LBD περιοχής του αντίστοιχου κάθε φορά υποδοχέα, με πολύ μεγάλη συγγένεια (Κd 1nΜ ή χαμηλότερη) (Chawla et al., 2001). Οι υπόλοιποι 20 υποδοχείς ονομάστηκαν «ορφανοί» γιατί μέχρι τη στιγμή της κλωνοποίησής τους, στηριζόμενοι στην ομοιότητα που παρουσίασαν με τους κλασσικούς υποδοχείς, δεν είχε βρεθεί κάποιος προσδέτης τους. Στη συνέχεια, διαχωρίστηκαν στους «υιοθετημένους ορφανούς» για τους οποίους αναγνωρίστηκαν αργότερα οι προσδέτες τους και στους παραμείναντες «ορφανούς». Οι «υιοθετημένοι ορφανοί» υποδοχείς δεσμεύουν μικρά λιπόφιλα μόρια που βρίσκονται στον οργανισμό ή στο περιβάλλον (Chawla et al., 2001). Αντίθετα από τις κλασσικές ενδοκρινείς ορμόνες όλοι οι φυσικοί προσδέτες των συγκεκριμένων πυρηνικών υποδοχέων παρουσιάζουν σχετικά χαμηλή συγγένεια (Κd συχνότερα περίπου 1μΜ), γιατί καταλαμβάνουν λιγότερο από τη μισό της «τσέπης» της LBD περιοχής των υποδοχέων. Παραδείγματα αυτών των υποδοχέων αποτελούν οι PPARs που ενεργοποιούνται από ένα ευρύ φάσμα λιπαρών οξέων και μεταβολιτών τους (Desvergne and Wahli, 1999), οι LXRs (Liver X Receptors) που ενεργοποιούνται από φυσικές οξυστερόλες (Mi et al., 2003) και οι PXR (Pregnane X Receptor), οι CAR

28 (Constitutive Androstane Receptor), και ERR (Estrogen Related Receptor) που ενεργοποιούνται από συνθετικά φάρμακα και γι αυτό οι συγκεκριμένοι πυρηνικοί υποδοχείς θεωρούνται ως αισθητήρες των ξενοβιοτικών ουσιών. Τέλος βρέθηκε ότι οι υποδοχείς ROR (Retinoid Orphan Receptor) και HNF-4 (Hepatocyte Nuclear Factor- 4) μπορούν να συνδέονται με χαμηλή συγγένεια στο στεαρικό οξύ, στο παλμιτικό οξύ και στη χοληστερόλη (Li et al., 2003). Ο RXR υποδοχέας είναι ένα ξεχωριστό μέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων. Ήταν ο πρώτος «ορφανός» υποδοχέας για τον οποίο αναγνωρίστηκε ο φυσικός προσδέτης του, το 9-cis ρετινοϊκό οξύ (Levin et al., 1992) και είναι ο μόνος που έχει τη δυνατότητα να ετεροδιμερίζεται με αρκετά μέλη της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων, όπως τους T 3 R, RAR, VDR, PPAR, LXR, FXR (Farnesoid X activated Receptor), PXR και CAR. Συντηρείται εξελικτικά σε όλα τα μετάζωα, εφόσον οι RXRs έχουν βρεθεί σε οργανισμούς όπως το C.elegans και τη Drosophila. Η LBD περιοχή των υποδοχέων RXRs ήταν η πρώτη που κρυσταλλώθηκε και φαίνεται ότι αποτελεί τη μόνη εξαίρεση όπου η απο- μορφή είναι σταθερή (Bourguet et al., 1995). Για 11 μέλη της υπεροικογένειας, μέχρι σήμερα δεν έχει αναγνωριστεί κανένας φυσικός ή συνθετικός προσδέτης τους. Η φυλογενετική ανάλυση της υπεροικογένειας δείχνει ότι οι πρώτοι πυρηνικοί υποδοχείς ήταν «ορφανοί» (Escriva et al., 2000).

29 Τύπος υποδοχέα Όνομα υποδοχέα Προσδέτης Ενδοκρινείς υποδοχείς «Υιοθετημένοι» ορφανοί υποδοχείς Ορφανοί υποδοχείς T3Rα, β (NR1A1, NR1A2) T3 Ετερο RARα, β, γ (NR1B1, Όλα τα trans Ετερο NR1B2, NR1B3) ρετινοίκά οξέα VDR (NR1I1) 1α,25(ΟΗ) 2 D 3 Ετερο ERα, β (NR3A1,NR3A2) 17β-εστραδϊόλη Ομο GR (NR3C1) Κορτιζόλη Ομο MR (NR3C2) Αλδοστερόνη Ομο PR (NR3C3) Προγεστερόνη Ομο AR (NR3C4) Διϋδροτεστοστερόνη Ομο PPARα, β, γ (NR1C1, Διάφορα πολυακόρεστα NR1C2, NR1C3) λιπαρά Ετερο οξέα LXRα, β (NR1H2, Οξυστερόλες Ετερο NR1H3) FXR (NR1H4) Χολικά οξέα Ετερο PXR (NR1I2) Πρεγνανεδιόνη, Ετερο ξενοβιοτικές ουσίες CAR (NR1I3) Ανδροστανόλη, Ετερο ξενοβιοτικές ουσίες RORα,β, γ (NR1F1, Στεαρικό οξύ, Μονο NR1F2, NR1F3) χοληστερόλη? RXRα,β,γ (NR2B1, 9-cis ρετινοϊκό οξύ Ομο NR2B2, NR2B3) HNF-4 α, γ (NR2A1, Παλμιτικό οξύ? Ομο NR2A2) ERRα,β,γ (NR3B1, Αντι-οιστρογόνα Ομο NR3B2, NR3B3) DAX (NR0B1) Ετερο SHP (NR0B2) Ετερο Rev-ErbAα,β (NR1D1, Ομο NR1D2) TR2α, β (NR2C1, NR2C2) Ομο TLX (NR2E1) Μονο PNR (NR2E3) Μονο COUPα,β, γ (ΝR2F1, Άγνωστοι Ομο NR2F2, NR2F3) NGFI-Bα, β, γ (NR4A1, Μονο NR4A2, NR4A3) SF1 (NR5A1) Μονο LRH (NR5A2) Μονο GcNF (NR6A1) Ομο Τύπος δέσμευσης στο DNA Πίνακα 1. Η υπεροικογένεια των πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων. Οι 48 πυρηνικοί υποδοχείς του ανθρώπου διαχωρίζονται σε τρεις ομάδες: τους ενδοκρινείς υποδοχείς, τους «υιοθετημένους ορφανούς» υποδοχείς και τους «ορφανούς» υποδοχείς (Carlberg 2004). Οι χαρακτηρισμοί των υποδοχέων ως Μονο, Ομο, και Ετερο αντιστοιχούν στον τρόπο δέσμευσης των υποδοχέων στους προαγωγείς των γονιδίων στόχων τους ως μονομερή, ομοδιμερή και ετεροδιμερή, αντίστοιχα. Table 1. The nuclear receptor superfamily. The 48 human nuclear receptors distinct 28 subsets, which can be sorted into the three groups of endocrine receptors, adopted orphan receptors and orphan receptors (Carlberg 2004).

30 1.1. PPARs (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors) Οι υποδοχείς που ενεργοποιούνται από πολλαπλασιαστές υπεροξειδιοσωμάτων Τα υπεροξειδιοσώματα είναι κυτταροπλασματικά οργανίδια διαμέτρου 0.2 έως 1 μμ, τα οποία περιβάλλονται από μια μεμβράνη, που τα διαχωρίζει από το εξωτερικό τους περιβάλλον και περιέχουν κυρίως υπεροξειδιοσωματικά ένζυμα. Τα ένζυμα αυτά σχετίζονται με καταβολικά και αναβολικά μονοπάτια κυρίως του μεταβολισμού των λιπιδίων, όπως η διάσπαση των λιπαρών οξέων και των παραγώγων τους μέσω της β- οξείδωσης και της σύνθεσης λιπιδίων ή χοληστερόλης. Υποστρώματα για τη β- οξείδωση στα υπεροξειδιοσώματα αποτελούν τα λιπαρά οξέα (μέχρι 20 άτομα άνθρακα), τα δικαρβοξυλικά λιπαρά οξέα, οι προσταγλανδίνες, ξενοβιοτικές ουσίες κ.α. Στα υπεροξειδιοσώματα πέρα από τη βασική λειτουργία τους που είναι η απενεργοποίηση των ανιόντων του υπεροξειδίου με το ένζυμο καταλάση και το σχηματισμό του υπεροξειδίου του υδρογόνου, επιτελείται και η οξειδωτική διάσπαση των πολυαμινών, των πουρινών, των D-αμινοξέων και των 2-L-υδροξυ-οξέων (Mannaerts and Veldhoven, 1993; Osmundsen et al., 1991). Στα τρωκτικά, μετά την έκθεση σε μια ποικιλία ουσιών, όπως υπολιπιδαιμικά φάρμακα, που ονομάζονται πολλαπλασιαστές υπεροξειδιοσωμάτων παρατηρείται δραματική αύξηση στο μέγεθος και τον αριθμό των υπεροξειδιοσωμάτων στο ήπαρ και σε μικρότερο βαθμό στην καρδιά και στα νεφρά. Ο πολλαπλασιασμός των υπεροξειδιοσωμάτων στα τρωκτικά, συνοδεύεται από ηπατομεγαλία και από αύξηση της μεταγραφής των γονιδίων που σχετίζονται με τη μικροσωμική και υπεροξειδιοσωματική β-οξείδωση των λιπαρών οξέων, καθώς και από τροποποιήσεις του μεταβολισμού των λιπιδίων, όπως η ελάττωση των επιπέδων των τριγλυκεριδίων και της χοληστερόλης στον ορό (Lazarow and deduve, 1976; Rao and Reddy, 1987). Υπό φυσιολογικές συνθήκες η β-οξείδωση στα υπεροξειδιοσώματα αντιπροσωπεύει μόνο ένα μικρό τμήμα του καταβολισμού των λιπαρών οξέων σε σχέση με τη μιτοχονδριακή β-οξείδωση. Η β-οξείδωση στα υπεροξειδιοσώματα χρησιμοποιείται στα τρωκτικά κυρίως σε περιόδους που παρουσιάζεται συσσώρευση λιπιδίων (διατροφή πλούσια σε λίπη, ή μεταβολικές διαταραχές όπως στέρηση της τροφής και διαβήτης). Το φαινόμενο του πολλαπλασιασμού των υπεροξειδιοσωμάτων δε

31 συμβαίνει στους ανθρώπους και σε άλλα είδη, παρόλο που τα υπεροξειδιοσώματα είναι σημαντικά οργανίδια (Vamecq and Draye, 1989). Η μοριακή βάση αυτής της διαφοροποίησης ανάμεσα στα είδη δεν είναι γνωστή. Επειδή ο πολλαπλασιασμός των υπεροξειδιοσωμάτων, όπως προαναφέρθηκε, συνδέεται με την επαγωγή της μεταγραφής γονιδίων που σχετίζονται με τη μικροσωμική και υπεροξειδιοσωματική β-οξείδωση, λογική ήταν η υπόθεση της ύπαρξης κάποιου μεταγραφικού παράγοντα που στηρίζει το συγκεκριμένο φαινόμενο. Οι Isseman και Green (1990) ανέφεραν την κλωνοποίηση και το χαρακτηρισμό ενός καινούριου πυρηνικού υποδοχέα από τον ποντικό, που ενεργοποιούνταν από αρκετούς από τους γνωστούς πολλαπλασιαστές των υπεροξειδιοσωμάτων. Αυτός ο καινούριος υποδοχέας ονομάστηκε υποδοχέας που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστές υπεροξειδιοσωμάτων (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor - PPAR) και σήμερα είναι γνωστό ότι αναφέρονταν συγκεκριμένα στον τύπο PPARα (NR1C1). Το 1992 στο εργαστήριο του W.Wahli κλωνοποιήθηκε από τον Xenopus laevis ο PPARα, όπως και άλλοι δυο τύποι υποδοχέων οι οποίοι ονομάστηκαν PPARβ (NR1C2) και PPARγ (NR1C3) που παρουσίασαν μεγάλη ομοιότητα με τον PPARα και κωδικοποιούνταν από δυο διαφορετικά γονίδια (Dreyer et al., 1992). Στη συνέχεια πολλές ομάδες ανέφεραν την απομόνωση και κλωνοποίηση των τριών τύπων PPAR από θηλαστικά, όπως τον ποντικό, τον αρουραίο, το χάμστερ και τον άνθρωπο (Gottlicher et al., 1992; Schmidt et al., 1992; Chen et al., 1993; Sher et al., 1993; Zhu et al., 1993; Kliewer et al., 1994; Amri et al., 1995; Aperlo et al., 1995; Greene et al., 1995; Xing et al., 1995) Οι PPARα και PPARγ είναι αρκετά συντηρημένοι ανάμεσα στα είδη, ενώ ο τρίτος τύπος PPAR παρουσιάζει αρκετές διαφοροποιήσεις ανάμεσα στα θηλαστικά και στον Xenopus laevis. Λόγω αυτής της απόκλισης, του δόθηκε η ονομασία PPARδ στα θηλαστικά (Kliewer et al., 1994). Η κλωνοποίηση όμως του PPARβ από το κοτόπουλο έδωσε τη δυνατότητα της κατασκευής ενός εξελικτικού δέντρου, στο οποίο είναι φανερό ότι ο PPARβ από τον Xenopus laevis και ο PPARδ των θηλαστικών είναι ομόλογοι τύποι (Takada et al., 2000). Στο εξής θα αναφέρεται ο συγκεκριμένος τύπος ως PPARβ. 1.1.α) Εξέλιξη των PPARs Μελέτες πάνω στην εξέλιξη της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων έδειξαν ότι τα γονίδια των PPARs ανήκουν στην πρώτη υποοικογένεια των πυρηνικών

32 ορμονικών υποδοχέων μαζί με τους υποδοχείς της θυροειδικής ορμόνης, του ρετινοϊκού οξέως (RA), της βιταμίνης D, της εκδυσόνης και τους «ορφανούς» υποδοχείς Rev-ErbAα (ear1; NR1D1) και E75 (NR1D3 από τη Drosophila) (Laudet et al., 1992). Αναγνωρίζονται δυο διαφορετικές περίοδοι στην εξέλιξη αυτής της υποοικογένειας. Η πρώτη περίοδος προηγείται χρονολογικά του διαχωρισμού των αρθροπόδων από τα θηλαστικά, περίπου πριν 500 εκατομμύρια χρόνια (Knoll, 1992) και αντιπροσωπεύει την εμφάνιση διαφόρων ομάδων γονιδίων, όπως των TRs, των RARs, των PPARs κ.α. Ο κοινός πρόγονος αυτών των υποδοχέων υποστηρίζεται από την πρόσφατη περιγραφή ενός υποδοχέα του ρετινοϊκού οξέως στους σπόγγους, οι οποίοι αποτελούν μια ομάδα των μεταζώων που διαχωρίστηκαν τουλάχιστον πριν από 540 εκατομμύρια χρόνια. Η δεύτερη περίοδος αντιπροσωπεύει το διαχωρισμό των αρχέγονων γονιδίων των υποδοχέων π.χ. το διπλασιασμό του αρχέγονου γονιδίου του υποδοχέα της θυροειδικής ορμόνης (TR) σε δυο γονίδια, τα TRα (NR1A1) και TRβ (NR1A2) και του υποδοχέα του ρετινοϊκού οξέως (RAR) σε τρία γονίδια τα RARα (NR1B1), RARβ (NR1B2), και RARγ (NR1B3). Οι τρεις γονιδιακοί τόποι των PPARs, α, β και γ εμφανίστηκαν κατά τη διάρκεια αυτής της δεύτερης περιόδου (Laudet et al., 1992). Η σύγκριση της αμινοξικής ακολουθίας των ομόλογων γονιδίων των τριών υποδοχέων του Xenopus laevis και των θηλαστικών, έδειξε ότι οι PPARs έχουν εξελιχτεί 2-3 φορές ταχύτερα από τα γονίδια των RARs και TRs. (Desvergne and Wahli, 1999). Δεν είναι γνωστό αν οι διαδικασίες του διπλασιασμού των γονιδίων των συγκεκριμένων υποδοχέων πραγματοποιήθηκαν ταυτόχρονα, όμως αρκετά στοιχεία, όπως η θέση των γονιδίων των υποδοχέων TRs, RARs και PPARs στα χρωμοσώματα δείχνουν ότι αυτό είναι πολύ πιθανόν. Η χρονολόγηση του διπλασιασμού των γονιδίων δεν είναι εφικτή προς το παρόν, αν και θα ήταν ενδιαφέρουσα η εκδοχή να συμπίπτει με την εμφάνιση των πρώτων σπονδυλωτών (Dreyer et al., 1993). Όπως προαναφέρθηκε υπάρχουν δυο κατηγορίες πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων σε σχέση με τη θέση τους μέσα στο κύτταρο. Οι PPARs ανήκουν στην κατηγορία των μόνιμα τοποθετημένων στον πυρήνα υποδοχέων, όπως φάνηκε από τα πειράματα στους PPARα και β του Xenopus laevis, οι οποίοι εντοπίστηκαν στον πυρήνα ανεξάρτητα από την παρουσία εξωγενών ενεργοποιητών τους (Dreyer et al.,1993). Το γεγονός αυτό ενισχύεται με την κατηγοριοποίηση των PPARs εξελικτικά στην ίδια ομάδα με τους TRs και οι RARs, που εντοπίζονται μόνιμα στον πυρήνα (Dreyer et al.,1993).

33 1.1.β) Δομή των γονιδίων των PPARs Ο βαθμός συγγένειας των γονιδίων που αποτελούν μέλη της ίδιας οικογένειας ή υπεροικογένειας καθορίζεται από το βαθμό ομοιότητας που παρουσιάζουν στην οργάνωση της δομής τους, εφόσον η θέση και ο αριθμός των ιντρονίων σε κάποιο γονίδιο είναι σημαντικοί δείκτες της εξέλιξης τους στα πλαίσια της οικογένειας που ανήκουν (Laudet et al., 1992). Έχουν περιγραφεί το γονίδιο του PPARβ από τον Xenopus laevis και τα γονίδια των τριών τύπων PPAR από τον ποντικό και τον άνθρωπο (Krey et al., 1993; Zhu et al., 1993; Gearing et al., 1994; Zhu et al., 1995; Fajas et al., 1997). Στη δομή των πρώτων γονιδίων των PPARs που μελετήθηκαν, βρέθηκαν οκτώ εξώνια στο γονίδιο του PPARα του ποντικού (mpparα), με δυο μη κωδικοποιούμενα εξώνια που περιλαμβάνουν το μεγαλύτερο τμήμα της 5 αμετάφραστης περιοχής (Gearing et al., 1994). Η κωδικοποιούμενη περιοχή του γονιδίου, όπως και του γονιδίου του PPARβ του Xenopus laevis (Krey et al., 1993), αποτελείται από έξι εξώνια. Το πρώτο ιντρόνιο της κωδικοποιημένης περιοχής διαχωρίζει την αμινοτελική περιοχή Α/Β από τον πρώτο δάκτυλο ψευδαργύρου. Η θέση του είναι αντίστοιχη με αυτή που έχει βρεθεί στο γονίδιο του RARγ (Lehmann et al., 1991). Το δεύτερο ιντρόνιο διαχωρίζει τους δύο δακτύλους ψευδαργύρου. Στην ίδια θέση, δηλαδή ένα αμινοξύ μετά την τελευταία κυστεΐνη του πρώτου δακτύλου ψευδαργύρου, υπάρχει ένα ιντρόνιο και στα γονίδια των Rev-ErbAa/ TR/RAR (Laudet et al., 1991; Lazar et al., 1989; Lehmann et al., 1991; Miyajima et al., 1989; Shi et al., 1992). Η θέση συντηρείται και στον PPARβ του Xenopus laevis (xpparβ). Το εξώνιο που κωδικοποιεί το δεύτερο δακτύλιο ψευδαργύρου τελειώνει σε θέση που συντηρείται σε όλους τους πυρηνικούς υποδοχείς, επτά αμινοξέα μετά την τελευταία κυστεΐνη. Παρόμοια, όπως και σε όλα τα γονίδια των άλλων μελών της υπεροικογένειας, η D περιοχή κωδικοποιείται από ένα εξώνιο. Η LBD περιοχή των PPARs στα θηλαστικά, κωδικοποιείται από μόνο δυο εξώνια. Η παρουσία ενός μόνο ιντρονίου στην LBD περιοχή των PPARs των θηλαστικών, τους διαφοροποιεί από το κοντινότερο εξελικτικά υποδοχέα, τον Rev- ErbAα, ο οποίος διαθέτει ακόμα ένα ιντρόνιο στη συγκεκριμένη περιοχή. Το συγκεκριμένο χαρακτηριστικό τοποθετεί δομικά τους PPARs των θηλαστικών ανάμεσα σε δύο κοντινούς εξελικτικά υποδοχείς, τον Ε75 της Drosophila που δεν έχει καθόλου ιντρόνια σε αυτήν την περιοχή (Segraves and Hogness, 1990) και τον Rev- ErbAα του ανθρώπου, που έχει δυο ιντρόνια (Lazar et al., 1989; Miyajima et al., 1989).

34 Από τα παραπάνω φαίνεται ότι η δομή των γονιδίων των PPARs είναι μοναδική, αλλά οι κοντινότεροι εξελικτικά υποδοχείς, σύμφωνα με τις θέσεις εξωνίων /ιντρονίων είναι οι E75, Rev-ErbAα, TR και RAR. Η 5 αμετάφραστη περιοχή του PPARα του ποντικού είναι παρόμοια με άλλων γονιδίων των πυρηνικών υποδοχέων, όπως με τους προαγωγείς των γονιδίων των υποδοχέων των ανδρογόνων, της θυροειδικής ορμόνης, των γλυκοκορτικοστεροειδών, του ρετινοϊκού οξέος και της προγεστερόνης. Δεν υπάρχουν τα στοιχεία TATA και CCAAT κοντά στα σημεία έναρξης της μεταγραφής, αλλά υπάρχουν επτά σημεία δέσμευσης, τα Sp1 ή GC boxes, ενώ όλη η 5 αμετάφραστη περιοχή είναι πλούσια σε GC (Gearing et al., 1994). Σχετικά με τον PPARγ, που κλωνοποιήθηκε από διάφορα είδη θηλαστικών, βρέθηκαν δυο ισομορφές του, οι PPARγ1 και PPARγ2, να εκφράζονται σε πρωτεϊνικό επίπεδο στον ποντικό (Zhu et al., 1995) και στον άνθρωπο (Elbrecht et al., 1996). Διαφοροποιούνται μεταξύ τους ως προς την προσθήκη 30 αμινοξέων στο αμινοτελικό άκρου του δεύτερου, λόγω διαφορετικής χρησιμοποίησης του προαγωγέα του ίδιου γονιδίου και συνακόλουθη εναλλακτική διαδικασία στην παραγωγή του RNA. 1.1.γ) Δομή των πρωτεϊνών των PPARs Η δομή των πρωτεϊνών των PPARs είναι παρόμοια με των υπολοίπων μελών της υπεροικογένειας των πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων αποτελούμενη από τις τέσσερις λειτουργικές περιοχές, Α/Β, DBD, D και LBD. Παρακάτω θα αναφερθώ με λεπτομέρεια στα χαρακτηριστικά και τη λειτουργικότητα των περιοχών DBD και LBD. 1.1.γ.i) Η DBD περιοχή των PPAR Η DBD περιοχή, όπως προαναφέρθηκε είναι η περισσότερο συντηρημένη εξελικτικά περιοχή ανάμεσα στα μέλη της υπεροικογένειας των πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων και αποτελείται από δυο δακτύλους ψευδαργύρου. Δομικές και λειτουργικές αναλύσεις αυτής της περιοχής οδήγησαν στην αναγνώριση των ακολουθιών του P box και D box στους PPARs. To D box αποτελεί ένα σημείο διαφοροποίησης των PPARs από τα υπόλοιπα μέλη της υπεροικογένειας, καθώς συνίσταται από μόνο τρία αμινοξέα ενώ σχεδόν σε όλους τους υπόλοιπους υποδοχείς

35 αποτελείται από πέντε αμινοξέα (Desvergne and Wahli, 1995). Σε αντίθεση η πρωτοταγής δομή του P box στους PPARs είναι η ίδια με αυτή των υποδοχέων TR, VDR και RAR, αποτελούμενη από την ακολουθία CEGCKG (Desvergne and Wahli, 1995). Έτσι ήταν αναμενόμενο οι PPARs να αναγνωρίζουν στους προαγωγείς των γονιδίων στόχων τους ένα αποκρινόμενο στοιχείο που το μισό τμήμα του να αποτελεί το εξανουκλεοτίδιο AGGTCA (Dreyer et al., 1992). Το αποκρινόμενο στοιχείο των PPARs, που χαρακτηρίζεται ως PPRE (PPAR Response Element), ορίστηκε ως η απευθείας επανάληψη δυο μοτίβων αναγνώρισης AGGTCA που διαχωρίζονται από ένα νουκλεοτίδιο και γι αυτό ονομάστηκε αποκρινόμενο στοιχείο του τύπου DR-1. Tο πρώτο φυσικό PPRE βρέθηκε στον προαγωγέα του γονιδίου της ακυλ-coa οξειδάσης (Tugwood et al., 1992) και όλα τα PPREs που αναγνωρίστηκαν αργότερα τηρούσαν αυτά τα κριτήρια του DR-1, τα οποία επιτρέπουν τη διαφοροποίησή τους από τα υπόλοιπα αποκρινόμενα στοιχεία απευθείας επανάληψης της κλάσης των υποδοχέων TR/RAR, όπως του υποδοχέα της βιταμίνης D που είναι του τύπου DR-3, του υποδοχέα TR που είναι του τύπου DR-4 και του υποδοχέα RAR που είναι είτε του τύπου DR-2 είτε DR-5. Η λεπτομερής ανάλυση των αποκρινόμενων στοιχείων των γονιδίων του CYP4A6 και του μαλικού ενζύμου μαζί με τη σύγκριση αλληλουχιών άλλων 16 PPREs, ανέδειξαν και άλλα στοιχεία που καθορίζουν τα PPREs. Έτσι προστέθηκαν ακόμα τρεις ιδιότητες στον αρχικό ορισμό των PPREs ως αποκρινόμενα στοιχεία του τύπου DR-1: ένα προεξέχων 5 άκρο (5 flanking region), μια ατελής επανάληψη του μοτίβου και την αδενοσίνη ως το νουκλεοτίδιο που διαχωρίζει τα δυο εξανουκλεοτίδια, δίνοντας τελικά την εξής μορφή στην ομόφωνη ακολουθία των PPREs: 5 -AACT AGGNCA A AGGTCA- 3. (Palmer et al., 1995; Ijpenberg et al., 1997) Τα τέσσερα νουκλεοτίδια του προεξέχοντος 5 άκρου του μοτίβου του DR-1 είναι απαραίτητα για την λειτουργικότητα του αποκρινόμενου στοιχείου Ζ, του γονιδίου της Ρ450 4Α6, για τη δέσμευση του ετεροδιμερούς PPAR:RXR. Η συμμετοχή αυτής της προέκτασης της ακολουθίας δέσμευσης στο 5 είναι λιγότερο εμφανής όταν τα ετεροδιμερή PPAR:RXR δεσμεύονται σε τέλειες ακολουθίες του τύπου AGGTCA, ενώ διευκολύνουν πολύ τη δέσμευσή τους όταν υπάρχουν διαφοροποιήσεις από τη συγκεκριμένη ομόφωνη ακολουθία (Hsu et al., 1998). Αυτές οι ιδιαιτερότητες των PPREs συμβάλλουν στη προτίμηση της δέσμευσης των ετεροδιμερών PPAR:RXR σε σχέση με τη δέσμευση ομοδιμερών ή ετεροδιμερών που

36 δημιουργούν άλλα μέλη της υπεροικογένειας τα οποία επίσης αναγνωρίζουν αποκρινόμενα στοιχεία του τύπου DR-1 (Desvergne and Wahli, 1999). Το γεγονός ότι οι PPARs δεσμεύονται στα αποκρινόμενα στοιχεία τους ως ετεροδιμερή με τους RXR διαπιστώθηκε μέσω μιας σειράς πειραμάτων με τη μέθοδο της μεταβολής της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι in vitro μεταφρασμένες πρωτεΐνες των PPARs δε δεσμεύονται σε αποκρινόμενα στοιχεία τύπου DR-1, σε αντίθεση με τις παρατηρήσεις από in cellulo πειράματα. Προσθήκη ενεργοποιητών των PPARs στις αντιδράσεις, όπως Wy ή ETYA, δεν οδήγησαν στη δέσμευση των PPARs στα PPREs. Τα συγκεκριμένα αποτελέσματα οδήγησαν στην υπόθεση ότι οι PPARs πιθανόν να αλληλεπιδρούν με άλλους πυρηνικούς υποδοχείς για την πραγματοποίηση της δέσμευσής τους στα αποκρινόμενα στοιχεία (Kliewer et al., 1992; Keller et al., 1993). Μελέτες απέδειξαν ότι ο PPARα από το Xenopus laevis, τον ποντικό και τον αρουραίο δημιουργούν ετεροδιμερή με τον RXR και ότι η in vitro και η in cellulo επαγωγή του γονιδίου της ακυλ-coa οξειδάσης ήταν μεγαλύτερη όταν καλλιέργειες κυττάρων επιμολύνθηκαν και με τους δύο υποδοχείς παρουσία αντίστοιχων ενεργοποιητών (Kliewer et al, 1992; Gearing et al, 1993; Keller et al, 1993). Πειράματα χαρτογράφησης των περιοχών διαφόρων μελών της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων, όπως οι RAR, TR και οι υποδοχείς της βιταμίνης D, έδειξαν ότι οι DBD περιοχές τους ετεροδιμερίζονται με τη DBD του RXR στις γνωστές ομόφωνες ακολουθίες τους (Mader et al., 1993; Perlmann et al., 1993; Zechel et al., 1994; Zechel et al., 1994b). Ανάλογα πειράματα στους PPARs έδειξαν ότι η DBD περιοχή τους μπορεί να συνδέεται ως μονομερές στα αποκρινόμενα στοιχεία που περιέχουν απευθείας επανάληψη της ακολουθίας (A/G)GGTCA, χωρίς να ετεροδιμερίζεται με τη DBD περιοχή του RXR. Αυτά τα αποτελέσματα μπορεί να σημαίνουν ότι δεν υπάρχει πολύ σημαντική συμμετοχή των περιοχών DBD στον ετεροδιμερισμό PPARs:RXRs και ότι αυτές οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις απαιτούν τη συμμετοχή κι άλλων περιοχών, όπως η περιοχή διμερισμού που εντοπίζεται στις LBD περιοχές των συγκεκριμένων υποδοχέων (Zhang et al., 1994; Bourguet et al., 1995). Η δέσμευση της DBD περιοχής των PPARs στο ένα μοτίβο αναγνώρισης απαιτεί το 5 προεξέχων άκρο. Αυτό το εύρημα υποστηρίζει την υπόθεση ότι τα PPREs είναι τριμερή στοιχεία που αποτελούνται από τις επαναλαμβανόμενες ακολουθίες και με

37 μια προεξοχή στο 5 πλούσια σε ΑΤ, παρόμοια με αυτές όπου δεσμεύονται μονομερή «ορφανών» υποδοχέων, όπως οι RevErbA και RORα. Τα καρβοξυτελικά άκρα της DBD περιοχής των PPARs παρουσιάζουν μεγάλη ομολογία με τα αντίστοιχα των υποδοχέων RevErbA και RORα, που δεσμεύονται σε ένα μόνο μοτίβο αναγνώρισης και έχουν παρόμοιες προεκτάσεις ακολουθιών στα 5 άκρα (Mangelsdorf and Evans, 1995). Αντικατάσταση του καρβοξυτελικού άκρου της DBD περιοχής του RXR με αυτή του PPARα δημιουργεί μια χίμαιρα που δεσμεύεται ισχυρά στο μονό μοτίβο αναγνώρισης μαζί με το 5 άκρο. Έτσι είναι πιθανό τα καρβοξυτελικά άκρα της DBD περιοχής των PPARs να αλληλεπιδρούν με την 5 προέκταση του μοτίβου του DR-1. Αυτή η δέσμευση της DBD των PPARs στο 5 άκρο της ακολουθίας ενισχύει την πεποίθηση ότι οι PPARs δεσμεύονται στο 5 άκρο της ομόφωνης ακολουθίας κι ο RXR στο 3 άκρο (Ijpenberg et al., 1997). Στην εργασία των Hsu et al., (1998), φαίνεται ότι η πρωτεΐνη που συνίσταται από τις περιοχές DBD, D και LBD, είναι ικανή για ετεροδιμερισμό με τον RXR, δέσμευση στο DNA και μεταγραφική δραστηριότητα μετά από ενεργοποίηση από προσδέτη, δηλαδή είναι λειτουργικά ισάξια με την πρωτεΐνη ολόκληρου του υποδοχέα. Η δέσμευση της συγκεκριμένης πρωτεΐνης στο PPRE απουσία του RXR, υποδεικνύει ότι η Α/Β περιοχή επιδρά στην αναγνώριση του σημείου δέσμευσης και περιορίζει την ικανότητα των PPARs να λειτουργούν ως υποδοχείς που δεσμεύονται ως μονομερείς στα αποκρινόμενα στοιχεία. Η κάλυψη αυτή της δέσμευσης στο DNA από το αμινοτελικό άκρο, μπορεί να αντιπροσωπεύει κάποια εξελικτική διαδικασία, που επέτρεψε την εξειδίκευση / διαφοροποίηση των PPARs από τους ομόλογους υποδοχείς που δρουν ως μονομερείς. 1.1.γ.ii) Δομή της LBD περιοχής των PPARs Οι πρώτες μελέτες της LBD περιοχής των PPARs έδειξαν ότι οι ουσίες που προκαλούν το φαινόμενο του πολλαπλασιασμού των υπεροξειδιοσωμάτων ήταν ικανές να τους ενεργοποιήσουν (Issemann and Green, 1990; Dreyer et al., 1992). Μετέπειτα μελέτες απέδειξαν ότι οι PPARs ενεργοποιούνται και από διάφορα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα σε μικρομοριακές συγκεντρώσεις (Gottlicher et al., 1992; Keller et al., 1993) και από μικρά συνθετικά μόρια, όπως η θειαζολιδινεδιόνη και τα ανάλογα της L-τυροσίνης σε νανομοριακές συγκεντρώσεις (Debril et al., 2001). Η μεγάλη δομική ποικιλία των προσδετών των PPARs οδήγησε στο συλλογισμό ότι

38 αντανακλά κάποιες ασυνήθιστες ιδιότητες της LBD περιοχής τους. Μελέτες κρυσταλλογραφίας των PPARs, παρουσία ή απουσία προσδετών, έδωσαν αρκετά δεδομένα για τις ασυνήθιστες αυτές ιδιότητες της LBD περιοχής τους. Η δομή της LBD περιοχής των PPARs αποτελείται από 13 α έλικες και ένα μικρό β έλασμα, που περιελίσσονται σχηματίζοντας ένα helical sandwich (Notle et al., 1998; Uppenberg et al., 1998; Xu et al., 1999; Gampe et al., 2000). Η τριτοταγής δομή της LBD περιοχής των PPARs είναι όμοια με των άλλων πυρηνικών υποδοχέων από την έλικα 3 μέχρι το καρβοξυτελικό άκρο. Όμως οι PPARs είναι μοναδικοί γιατί διαθέτουν μια επιπλέον έλικα, που ονομάζεται έλικα 2, η οποία βρίσκεται ανάμεσα στις έλικες 2 και 3. Μια άλλη ιδιαιτερότητα στη δομή της LBD περιοχής των PPARs είναι ο πολύ μεγάλος όγκος της υδρόφοβης κοιλότητας ή «τσέπης» που σχηματίζουν οι 13 α έλικες και το β έλασμα. Οι κοιλότητες που δεσμεύονται οι προσδέτες στους PPARs, είναι τρεις φορές μεγαλύτερες από των άλλων πυρηνικών υποδοχέων που έχει καθοριστεί η δομή τους (Wagner et al., 1995). Ο μεγάλος όγκος οφείλεται κατά κύριο λόγο στην παρουσία της έλικας 2 και στη θέση της έλικας 2, η οποία διευρύνει αποτελεσματικά την «τσέπη» της LBD περιοχής. Η τοποθέτηση αυτών των ελίκων οδηγεί και στη δημιουργία ενός καναλιού 100Å 2, μέσω του οποίου οι προσδέτες φτάνουν στην «τσέπη». Η παρουσία ενός πολύ εύκαμπτου βρόχου μεταξύ των ελίκων 2 και 3 δείχνει ότι το άνοιγμα του καναλιού έχει τη δυνατότητα να είναι ακόμη μεγαλύτερο. Αυτός ο τρόπος εισόδου των προσδετών είναι μοναδικός στους PPARs. Οι δομές άλλων πυρηνικών υποδοχέων, των οποίων έχει μελετηθεί η δομή, περιλαμβανομένων των υποδοχέων των στεροειδών, ρετινοειδών και θυροειδικών ορμονών, έδειξαν ότι ο προσδέτης εισέρχεται στην κοιλότητα πρόσδεσης από την άλλη πλευρά της πρωτεΐνης μέσω ενός καναλιού που σχηματίζεται από τις έλικες 3, 4 και 10 και καλύπτεται από την AF-2 έλικα ( mouse trap ). Η δομή της LBD περιοχής του PPARγ μελετήθηκε παρουσία προσδέτη του (το αντιδιαβητικό φάρμακο GI ), την LBD περιοχή του RXRα και τον προσδέτη του RXRα το 9-cis ρετινοϊκό οξύ και δυο τμήματα της πρωτεΐνης SRC-1 (Gampe et al., 2000). Το σύμπλοκο έχει τη μορφή της πεταλούδας, με τους PPARγ και RXRα να υιοθετούν το σχηματισμό του «σάντουιτς» των ελίκων, το οποίο είναι συντηρημένο ανάμεσα στους υποδοχείς. Η επιφάνεια ετεροδιμερισμού των PPARγ / RXRα συντίθεται από ένα περίπλοκο δίκτυο από υδρόφοβες και πολικές αλληλεπιδράσεις, που ρυθμίζονται από τις έλικες 7, 9 και 10 και από το βρόχο που σχηματίζεται

39 ανάμεσα στις έλικες 8 και 9 από κάθε υποδοχέα. Οι ακολουθίες του PPARγ που εμπλέκονται σε αυτές τις αλληλεπιδράσεις συντηρούνται και σε άλλους πυρηνικούς υποδοχείς που ετεροδιμερίζονται με τον RXRα. Η επιφάνεια ετεροδιμερισμού των PPARγ/ RXRα είναι ασύμμετρη, με κάθε LBD περιοχή να παρεκκλίνει 10 από τον C2 άξονα συμμετρίας. Αυτή η ασυμμετρία έχει σαν αποτέλεσμα επιπρόσθετες, μη αναμενόμενες αλληλεπιδράσεις μεταξύ του PPARγ και του RXRα, περιλαμβάνοντας το πακετάρισμα της αρνητικά φορτισμένης επιφάνειας του PPARγ που αποτελείται από το τέλος της AF-2 έλικας και του βρόχου που σχηματίζεται ανάμεσα στις έλικες 8 και 9, και της θετικά φορτισμένης περιοχής της έλικας 7 του RXRα. Αυτές οι επιπλέον αλληλεπιδράσεις αυξάνουν την ολική επιφάνεια ετεροδιμερισμού από 500 Å 2 σε 550 Å 2, γεγονός που κατά ένα μεγάλο βαθμό είναι υπεύθυνο για την προτίμηση των PPARs και RXRs να σχηματίζουν ετεροδιμερή, αντί για ομοδιμερή. Το αντιδιαβητικό φάρμακο GI προσδένεται στη μεγάλη υδρόφοβη τσέπη του PPARγ, με μια διαμόρφωση σχήματος U γύρω από την έλικα 3. Εκεί σταθεροποιείται από αρκετές υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις που συμβαίνουν ανάμεσα στο λιπόφιλο τμήμα του μορίου και της «τσέπης» της LBD περιοχής. Επίσης το καρβοξυλικό οξύ του GI και το τμήμα της θειαζολιδινεδιόνης δημιουργούν δεσμούς υδρογόνου με αλληλουχίες του PPARγ, περιλαμβάνοντας τη τυροσίνη Υ473 στην AF-2 έλικα και τις ιστιδίνες Η323 και Η449 στις έλικες 5 και 10, αντίστοιχα. Αυτός ο σχηματισμός των δεσμών υδρογόνου σταθεροποιεί πολύ αποτελεσματικά την AF-2 περιοχή του PPARγ σε μια διαμόρφωση η οποία κάνει επιτρεπτή την αλληλεπίδραση με τον SRC-1. Τα τμήματα των πεπτιδίων του SRC-1, που το καθένα περιέχει ένα μοτίβο LXXLL, υιοθετούν μια διαμόρφωση α-έλικας όταν συνδέονται στην LBD περιοχή του PPARγ. Οι λευκίνες του μοτίβου LXXLL πακετάρονται σε μια υδρόφοβη αύλακα που σχηματίζεται από τις έλικες 3, 4 και AF-2 της LBD περιοχής του PPARγ, με τα άκρα των ελίκων να σταθεροποιούνται από γέφυρες αλάτων με το γλουταμινικό οξύ Ε471 της έλικας AF-2 και τη λυσίνη Κ301 της έλικας 3. Οι ακολουθίες που συνθέτουν αυτή την αύλακα και τα αμινοξέα Ε471 και Κ301, είναι πολύ συντηρημένα ανάμεσα στα μέλη της υπεροικογένειας των πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων, υποδεικνύοντας ένα κοινό μηχανισμό της στρατολόγησης των συνενεργοποιητών που ενεργοποιείται από την παρουσία προσδετών. Οι προσδέτες του RXR έχουν αρκετές κοινές βιολογικές δράσεις με τους προσδέτες του PPARγ, περιλαμβάνοντας τις επιδράσεις στην ελάττωση των λιπιδίων και της γλυκόζης σε μοντέλα τρωκτικών για το διαβήτη τύπου ΙΙ (Mukherjee et al., 1998). Οι

40 ασύμμετρες αλληλεπιδράσεις μεταξύ της AF-2 έλικας του PPARγ και των ελίκων 7 και 10 του RXRα στο ετεροδιμερές, υποδηλώνουν την ικανότητα ενεργοποίησης του συμπλόκου από τους προσδέτες του RXRα. Ο ρόλος των συγκεκριμένων αλληλεπιδράσεων, μπορεί να είναι η σταθεροποίηση της AF-2 έλικας σε μια θέση ημιδιαθέσιμη που επιτρέπει τις αλληλεπιδράσεις με τους συνενεργοποιητές, ακόμα και κατά την απουσία αγωνιστή του PPARγ. Υποθέτοντας ότι οι δυο εσωτερικές επιφάνειες του συνενεργοποιητή είναι απαραίτητες για τη σταθεροποίηση των αλληλεπιδράσεων υποδοχέα-συνενεργοποιητή και για τη μεταγραφική ενεργοποίηση, η δέσμευση ενός αγωνιστή του RXRα, μπορεί να είναι αρκετή για την πραγματοποίηση του σχηματισμού της δεύτερης εσωτερικής επιφάνειας και την ενεργοποίηση του συμπλόκου. Η προσθήκη ενός αγωνιστή του PPARγ αναμένεται ότι θα αυξήσει ακόμη περισσότερο τη σταθερότητα του ενεργοποιημένου συμπλόκου. Έτσι η ασύμμετρη φύση της κοινής επιφάνειας ετεροδιμερισμού του συμπλόκου PPARγ/RXRα, μπορεί να επεξηγεί και τις συνεργετικές δράσεις των προσδετών των PPARγ και RXRα. Η σύγκριση των δομών της LBD περιοχής των πυρηνικών υποδοχέων οδήγησε στο συμπέρασμα ότι με τη σύνδεση των προσδετών αλλάζει η δομή τους. Το καρβοξυτελικό άκρο της AF-2 έλικας περιελίσσεται γύρω από το σώμα του υποδοχέα ακόμα και όταν δεν υπάρχει συνδεδεμένος προσδέτης. Το ετεροδιμερές PPARγ/RXRα δείχνει ότι ακόμα και σε αυτή την κατάσταση, η AF-2 έλικα σταθεροποιείται στη θέση ενεργοποίησης από τις αλληλεπιδράσεις με τον RXRα. Στον PPARγ, η δομή της LBD περιοχής όταν έχει συνδεθεί προσδέτης, δείχνει ότι ο προσδέτης παίζει σημαντικό ρόλο στη σταθεροποίηση της AF-2 έλικας στην ενεργή θέση, μέσω ενός δεσμού υδρογόνου που σχηματίζεται μεταξύ του όξινου προσδέτη και της τυροσίνης στη θέση 473 (Tyr473) της AF-2 έλικας. Αυτή η τυροσίνη συντηρείται και στους άλλους δύο τύπους PPAR, α και β. Η κρυσταλλική δομή της LBD περιοχής του PPARα μελετήθηκε ως σύμπλοκο με το ανάλογο της L-τυροσίνης GW και ενός πεπτιδικού μοτίβου του τύπου LXXLL που προήλθε από τον SRC-1 (Xu et al., 2001). Με τη δέσμευση του στην «τσέπη» του υποδοχέα, ο προσδέτης υιοθετεί μια διαμόρφωση που επιτρέπει την όξινη περιοχή του να σχηματίσει δεσμούς υδρογόνου με την τυροσίνη Tyr-314 στην έλικα 5 και την τυροσίνη Tyr-464 στην AF-2 έλικα. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις σταθεροποιούν την AF-2 έλικα σε μια διαμόρφωση που δημιουργεί ένα φορτισμένο σύνδεσμο μεταξύ του γλουταμινικού οξέος Glu-462 και της λυσίνης Lys-292, ο

41 οποίος με τη σειρά του κατευθύνει τη δέσμευση του πεπτιδίου LXXLL στην υδρόφοβη σχισμή της επιφάνειας του υποδοχέα. Έτσι οι δεσμοί υδρογόνου μεταξύ του καρβοξυλίου του GW και της πρωτεΐνης του PPARα φαίνεται ότι λειτουργούν ως μοριακός «διακόπτης» για την ενεργοποίηση της μεταγραφικής δραστικότητας του υποδοχέα (Xu et al., 2001). Οι «τσέπες» δέσμευσης των προσδετών των PPARs α και γ παρουσιάζουν μεγαλύτερη ομοιότητα σε μέγεθος και μορφή σε σχέση με του PPARβ. Το βασικό γνώρισμα της εξειδίκευσης ανάμεσα στους δυο υποδοχείς είναι η αντικατάσταση της τυροσίνης Tyr-314 του PPARα με την ιστιδίνη His-323 στον PPARγ. Τα συγκεκριμένα αμινοξέα δημιουργούν τμήμα του δικτύου των ακολουθιών που συνδέονται με δεσμούς υδρογόνου και εμπλέκονται στην ενεργοποίηση του υποδοχέα από όξινους προσδέτες. Από τις κρυσταλλικές δομές των PPARα και PPARγ αποκαλύπτεται ότι ο μεγάλος όγκος της πλευρικής αλυσίδας της Tyr-314 του PPARα εξαναγκάζει τον υψηλής συγγένειας προσδέτη GW να αποκλίνει 1,5 Å από τη θέση του. Ένας άλλος προσδέτης δομικά ανάλογος του GW409544, το faglitazar είναι ανίκανο να πραγματοποιήσει αυτήν την απόκλιση λόγω της αλληλεπίδρασής του με τη φαινυλαλανίνη Phe-273 του PPARα. Ως αποτέλεσμα παρουσιάζει 1000 φορές αυξημένη επιλεκτικότητα για τον PPARγ, σε σχέση με τον PPARα (Xu et al., 2001). Σύμφωνα με τα παραπάνω διακρίνεται η καθοριστική σημασία της διαφοροποίησης ενός μόνο αμινοξέος της «τσέπης» της LBD περιοχής των PPARs στην εξειδίκευση των προσδετών τους, το οποίο είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρον καθώς η «τσέπη» των PPARs αποτελείται πάνω από 25 αμινοξέα. Η δομή της LBD περιοχής του PPARβ μελετήθηκε χρησιμοποιώντας ως προσδέτη το εικοσαπεντανοϊκό οξύ (ΕΡΑ) (Xu et al., 1999). Το καρβοξύλιο του ΕΡΑ αλληλεπιδρά απευθείας με την έλικα του καρβοξυτελικού άκρου του υποδοχέα, όπου αποδίδεται και η λειτουργία της μεταγραφικής ενεργοποίησης. Η υδρόφοβη ουρά του ΕΡΑ μπορεί να δημιουργήσει δυο διαφορετικούς σχηματισμούς μέσα στην κοιλότητα και ο κάθε ένας σταθεροποιείται με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με την LBD περιοχή του υποδοχέα. Παρόλα αυτά η «τσέπη» της LBD περιοχής του PPARβ είναι σχετικά στενή στην περιοχή της AF-2 έλικας, πράγμα που δυσχεραίνει την δέσμευση ορισμένων προσδετών ιδιαίτερα αυτών που συνδέονται μέσω της τυροσίνης Υ473, παίζοντας έτσι σημαντικό ρόλο στη δημιουργία του προτύπου της LBD περιοχής του συγκεκριμένου υποδοχέα. Το γεγονός αυτό εξηγεί και γιατί δεσμεύονται στους PPARs λιπαρά οξέα με ορισμένο μέγεθος αλυσίδας: Λιπαρά οξέα μικρής αλυσίδας

42 (C<14) δε δημιουργούν τις απαραίτητες υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις για τη σταθερή δέσμευση των προσδετών, ενώ σε αντίθεση λιπαρά οξέα μακράς αλυσίδας (C>20) δεν μπορούν να ταιριάξουν στη «τσέπη» ή στο τρόπο σύνδεσης και εκτίθενται σε αποσταθεροποιητικές δράσεις του μικροπεριβάλλοντος (Kliewer et al., 2001). Τρισδιάστατη δομή των LBD περιοχών των PPARs. Σύγκριση των δομών του PPARα (κόκκινο σπιράλ), PPARγ (κίτρινο σπιράλ) και του PPARβ/δ (πράσινο σπιράλ). Στους PPAR α και γ φαίνεται το χαρακτηριστικό πεπτιδικό μοτίβο LXXLL αλληλεπίδρασης με τους συνενεργοποιητές (μοβ σπιράλ). Για κάθε τύπο PPAR η «τσέπη» της LBD περιοχής φαίνεται ως άσπρη επιφάνεια (Xu et al., 2001). Three-dimensional structure of ligand binding domains of PPARs. A comparison of the X-ray crystal structures of PPARα (red worm), PPARγ (yellow worm) and PPARβ/δ (green worm) is shown. PPARα and PPARγ are shown associated to LXXLL peptides (purple worm), the signature motif of the receptor coactivators. For each PPAR, the solvent-accessible ligand binding pocket is displayed as an off-white surface (Xu et al., 2001).

43 Συνενεργοποιητές- Συνκαταστολείς Έχουν αναγνωριστεί ένας αριθμός πρωτεϊνών, οι οποίες ονομάζονται συνενεργοποιητές και συνκαταστολείς και ρυθμίζουν την ικανότητα των πυρηνικών υποδοχέων να ενεργοποιούν ή να αναστέλλουν αντίστοιχα, τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων τους Συνενεργοποιητές Ένας πραγματικός συνενεργοποιητής πρέπει να πληροί κάποιες προϋποθέσεις: i) πρέπει, εξαρτώμενος από την παρουσία αγωνιστή του υποδοχέα, να αλληλεπιδρά άμεσα με την περιοχή ενεργοποίησης του υποδοχέα, οδηγώντας στην ενεργοποίηση της μεταγραφικής του λειτουργίας, ii) πρέπει να αλληλεπιδρά και με παράγοντες του βασικού συμπλόκου της μεταγραφής και iii) δεν πρέπει να επάγει τη βασική μεταγραφική ενεργοποίηση από μόνος του, αν και οι συνενεργοποιητές διαθέτουν μια αυτόνομη περιοχή ενεργοποίησης (Hong et al., 1996; Kalkhoven et al., 1998). Πράγματι, απουσία πυρηνικού υποδοχέα οι πραγματικοί συνενεργοποιητές δεν μπορούν να στρατολογηθούν στους προαγωγείς των γονιδίων και έτσι δεν μπορούν να βοηθήσουν στην ενεργοποίηση της μεταγραφής τους (Robyr et al., 2000). Υπάρχουν δυο κατηγορίες συνενεργοποιητών, η πρώτη κατηγορία στην οποία ανήκουν ο p300/cbp και η οικογένεια του SRC-1, διαθέτουν δραστικότητα ακετυλτρανσφεράσης των ιστονών και συμμετέχουν στην αναδιάταξη της χρωματίνης. Στη δεύτερη κατηγορία οι συνενεργοποιητές χρησιμεύουν ώστε να διευκολύνεται η σύνδεση του συμπλόκου του υποδοχέα με το βασικό σύμπλοκο της μεταγραφής. Ο λόγος ύπαρξης πολλών συνενεργοποιητών είναι ακόμα υπό εξέταση. Μια πιθανότητα είναι ότι διαφορετικοί συνενεργοποιητές συμμετέχουν στη μεταγραφή διαφορετικών γονιδίων στόχων. Ακόμα είναι πιθανό κάθε πυρηνικός υποδοχέας να χρησιμοποιεί μόνο μια συγκεκριμένη ομάδα συνενεργοποιητών για τη βέλτιστη μεταγραφική δραστικότητά του (Zhu et al., 2000).

44 α) Συνενεργοποιητές των PPARs Οι PPARs δημιουργούν ετεροδιμερή με τους RXR, παρουσία προσδετών τους, τα οποία συνδέονται στα PPREs, ώστε να ενεργοποιήσουν τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων τους. Η δέσμευση εξειδικευμένων προσδετών στους πυρηνικούς υποδοχείς επάγει και τη στρατολόγηση ενός αρχικού συμπλόκου συνενεργοποιητών που αποτελείται από μέλη των οικογενειών SRC-1/p160 και CBP/p300 (camp response element-binding protein-binding protein), οι οποίοι διαθέτουν δραστικότητα ακετυλάσης των ιστονών (ΗΑΤ δραστικότητα) (Yang et al., 1996; Ogryzko et al., 1996; Spencer et al., 1997). Στη συνέχεια, πιθανότατα σε συνεργασία με μια άλλη ομάδα συνενεργοποιητών δημιουργείται ένα σύμπλοκο, το οποίο ονομάζεται TRAP / DRIP / ARC / Mediator complex και το οποίο διευκολύνει τις αλληλεπιδράσεις με το βασικό σύμπλοκο της μεταγραφής της RNA πολυμεράσης ΙΙ (Zhu et al., 1997). Παρακάτω θα αναφερθούν μερικά στοιχεία για δυο βασικούς συνενεργοποιητές των PPARs, τον SRC-1 και τον PGC-1(PPARγ Coactivator-1) α1) SRC-1 Ο SRC-1 του ανθρώπου χαρακτηρίστηκε αρχικά ως η πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα της προγεστερόνης παρουσία προσδέτη του υποδοχέα (Onate et al., 1995). Έχουν περιγραφεί αρκετές ισομορφές του SRC-1 που οφείλονται σε εναλλακτική συρραφή π.χ. SRC-1a, -b, -c, -d και e (Kamei et al., 1996). Όλες οι ισομορφές περιέχουν τρία μοτίβα αναγνώρισης των πυρηνικών υποδοχέων (LXXLL), που βρίσκονται σε πολλούς συνενεργοποιητές (Heery et al., 1997). Ο SRC-1a διαθέτει και ένα τέταρτο μοτίβο στο καρβοξυτελικό του άκρο (Kalkhoven et al., 1998), του οποίου η λειτουργία δεν είναι ξεκάθαρη εφόσον μετάλλαξή του δεν επηρεάζει τη μεταγραφή. Ο SRC-1 διαθέτει δυο ξεχωριστές περιοχές ενεργοποίησης. Η πρώτη περιοχή αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη σύνδεσης CBP/p300, ενώ η δεύτερη περιοχή ενεργοποιεί τη μεταγραφή ανεξάρτητα από την CBP/p300, χωρίς να είναι γνωστός ποιος είναι ο παράγοντας στόχος της. Κρυσταλλογραφία του συμπλόκου του PPARγ LBD (ομοδιμερές) και μιας ποσότητας του SRC-1 από τον άνθρωπο έδειξε ότι κάθε μέρος του διμερούς του υποδοχέα αλληλεπιδρά με ένα και διαφορετικό μοτίβο LXXLL του ίδιου μορίου του SRC-1. Η υδρόφοβη φάση της έλικας του LXXLL πακετάρεται σε μια υδρόφοβη «τσέπη», που σχηματίζεται από τις έλικες 3, 4, 5 και 13 (Η12 για τους άλλους υποδοχείς) του

45 PPARγ. Οι πυρηνικοί υποδοχείς εμπεριέχουν παρόμοια LXXLL μοτίβα μέσα στη δική τους AF-2. Η κρυσταλλική δομή του ομοδιμερούς του PPARγ στον οποίο δεν είναι συνδεδεμένος κάποιος προσδέτης, δείχνει ότι η AF-2 έλικα του ενός υποδοχέα μπορεί να αλληλεπιδρά με την LBD περιοχή ενός άλλου υποδοχέα (Nolte et al., 1998). Αυτό πιθανόν δείχνει ότι η ενεργοποίηση ενός υποδοχέα από κάποιον προσδέτη του, οδηγεί στην αποδέσμευση της AF-2 έλικας του από την LBD του άλλου υποδοχέα, προτιμώντας την αλληλεπίδραση με το μοτίβο LXXLL του SRC-1. O SRC-1 έχει τη δυνατότητα να αλληλεπιδρά και με τις δυο περιοχές Α/Β και D/E των υποδοχέων PR και ER, μέσω πολλών σημείων αλληλεπίδρασης (Onate et al., 1998). Επίσης έχει παρατηρηθεί ότι η σύνδεση του SRC-1 στους στεροειδικούς υποδοχείς είναι πιο αποτελεσματική όταν υπάρχουν και οι δυο περιοχές AF-1 και AF- 2. Αυτό πιθανόν να εξηγεί την μεταγραφική συνεργεία που παρατηρείται ανάμεσα στις AF-1 και AF-2 (Tora et al., 1989). Η αλληλεπίδραση του SRC-1 με τους πυρηνικούς υποδοχείς παρουσία προσδετών έχει καθιερωθεί, ο τρόπος όμως που μεταβιβάζεται το σήμα της μεταγραφικής ενεργοποίησης στο βασικό σύμπλοκο της μεταγραφής παραμένει ασαφής. Μια πιθανότητα είναι η απευθείας δέσμευση του SRC-1 με το βασικό σύμπλοκο της μεταγραφής μέσω του TFIIB ή της TATA-binding protein (TBP). Μια άλλη πιθανότητα είναι ο SRC-1 να αποτελεί μέρος ενός μεγάλου συμπλόκου συνενεργοποιητών. Έτσι π.χ. ο ER παρουσία οιστρογόνου, αρχίζει να αλληλεπιδρά με ένα αριθμό πρωτεϊνών, όπως τον SRC-1 και την p300 μαζί με πρωτεΐνες 140 (ERAP140), 100, 90 και 30 kda (Hanstein et al., 1996), οι οποίες δεν είναι εξακριβωμένο αν όλες αποτελούν τμήμα του ίδιου συμπλόκου. Ο SRC-1 αλληλεπιδρά απευθείας με μια συντηρημένη περιοχή του καρβοξυτελικού άκρου της p300 και την ομόλογή της CBP (Kamei et al., 1996; Yao et al., 1996). Η CBP/ p300 είναι ένας συνενεργοποιητής που συνδέεται στους πυρηνικούς ορμονικούς υποδοχείς παρουσία προσδετών (Chakravarti et al., 1996) και επάγει τη μεταγραφή σε συνεργασία με τον SRC-1 (Smith et al., 1996). Ακόμα η CBP/ p300 αλληλεπιδρά με ένα μεγάλο αριθμό παραγόντων που αλληλεπιδρούν με το DNA, καθώς και με παράγοντες του βασικού συμπλόκου της μεταγραφής. Μελέτες έχουν δείξει ότι η CBP/ p300 και η p/cip μαζί με τον SRC-1 είναι απαραίτητοι για την πλήρη ενεργοποίηση της μεταγραφής γονιδίων, μετά την επαγωγή από την παρουσία προσδετών, σε αρκετές κυτταρικές σειρές (Torchia et al., 1997).

46 Επίσης η p/cip και ο SRC-1 μπορούν να συνδεθούν με την P/CAF (Korzus et al., 1998). Οι P/CAF, CBP/p300 και ο SRC-1 διαθέτουν, όπως προαναφέρθηκε, HAT δραστικότητα (Yang et al., 1996; Ogryzko et al., 1996; Spencer et al., 1997). Εφόσον για την ενεργοποίηση των προαγωγέων απαιτείται η ακετυλίωση των ιστονών, τότε τα όσα προαναφέρονται προσφέρουν μία εξήγηση για τον τρόπο με τον οποίο αυτοί οι συνπαράγοντες αυξάνουν τη μεταγραφική ενεργοποίηση μέσω των πυρηνικών υποδοχέων. Ο λόγος της παρουσίας όλων αυτών των ΗΑΤs οφείλεται στην επιλεκτικότητα για την ειδική ΗΑΤ δραστικότητα σε κάθε διαφορετική κλάση των μεταγραφικών παραγόντων. Επιπλέον, υπάρχει εξειδίκευση ως προς τις ιστόνες που μπορεί να ακετυλιώσει ο κάθε συνενεργοποιηρτής, π.χ. η P/CAF ακετυλιώνει την ιστόνη Η3, ενώ η CBP/p300 όλες τις ιστόνες και ο SRC-1 παρουσιάζει μια εξειδίκευση για τις Η3 και Η4 (Bannister et al., 1996; Chen et al., 1997). Οι P/CAF και CBP/p300 μπορούν να ακετυλιώνουν και μη ιστονικές πρωτεΐνες όπως οι TFIIEβ, TFIIF, EKLF, GATA-1 και p53 (Gu and Roeder, 1997; Imhof et al., 1997; Boyes et al., 1998). Παρόλες τις πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των συνενεργοποιητών που περιγράφηκαν, υπάρχουν μερικά μόνο στοιχεία για την ύπαρξη τέτοιων συμπλόκων in vivo. Το πιθανότερο είναι όμως αυτοί οι συνπαράγοντες να υπάρχουν σε διάφορα σταθερά υποσύμπλοκα α2) PGC-1 Έχουν περιγραφεί και άλλοι συνενεργοποιητές των PPARs, όπως ο PGC-1, ο οποίος αποτέλεσε μια σημαντική ανακάλυψη στο πεδίο των συνενεργοποιητών των πυρηνικών υποδοχέων, λόγω της συσχέτισής του στη ρύθμιση συγκεκριμένης φυσιολογικής διαδικασίας, της προσαρμόσιμης θερμογένεσης. Ο PGC-1 διαπιστώθηκε ότι αλληλεπιδρά με αρκετά μέλη της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων (Puigserver et al., 1998). Επίσης αποτελεί συνενεργοποιητή του PPARγ και του TR στoν προαγωγέα της UCP-1 (uncoupling protein-1), επάγοντας την έκφραση της μιτοχονδριακής αυτής πρωτεΐνης που σχετίζεται με την παραγωγή θερμότητας στα φαιά κύτταρα του λιπώδους ιστού. Γι αυτό και η έκφραση του PGC- 1 αυξάνεται στους μυς και στα φαιά κύτταρα του λιπώδους ιστού μετά από έκθεση σε χαμηλές θερμοκρασίες. Επιπλέον μελέτες έδειξαν ότι ο PGC-1 ενεργοποιεί τη μιτοχονδριακή βιογένεση και την κατανάλωση του οξυγόνου στα μυϊκά κύτταρα μέσω της επαγωγής της UCP-2 και τη ρύθμιση των NRFs (nuclear respiratory

47 factors), οι οποίοι είναι μεταγραφικοί παράγοντες που ρυθμίζουν τη μεταγραφή γονιδίων που σχετίζονται με την αντιγραφή και μεταγραφή του μιτοχονδριακού DNA (Wu et al., 1999). Οι τελευταίες μελέτες ασχολούνται με τη συσχέτιση των λειτουργιών του PGC-1 με τον SRC-1 (Puigserver et al., 1999). Ο SRC-1, όπως και ο CBP/p300 αλληλεπιδρά με τον PGC-1 in vitro και in vivo. Ακόμα η έκφραση του PPARγ ή του NRF-1 επάγει την δραστικότητα του PGC-1, ενώ η ταυτόχρονη επιμόλυνση του PPARγ με τον PGC-1 αυξάνει τις αλληλεπιδράσεις του PGC-1 με τον SRC-1 ή τον CBP/p300 τόσο in vitro όσο και in vivo. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν ένα μοντέλο ενεργοποίησης του PGC-1, στο οποίο η αλληλεπίδραση ενός μεταγραφικού παράγοντα, όπως ο PPARγ διεγείρει τη δραστικότητα του PGC-1 επάγοντας τη στρατολόγηση του SRC-1 (Puigserver et al., 1999). Αυτή η στρατολόγηση πιθανόν είναι αποτέλεσμα τροποποιήσεων στη διαμόρφωση του PGC- 1 που συμβαίνουν μετά τη σύνδεση του μεταγραφικού παράγοντα. Ο PGC-1 διαθέτει κάποια μοναδικά χαρακτηριστικά ως συνενεργοποιητής των πυρηνικών υποδοχέων. Σε αντίθεση με τους περισσότερους συνενεργοποιητές παρουσιάζει ένα πολύ περιορισμένο πρότυπο ιστοειδικής έκφρασης, η έκφρασή του επάγεται από φυσιολογικά ερεθίσματα, π.χ. η δραματική αύξηση της έκφρασής του στους σκελετικούς μυς και στο φαιό λιπώδη ιστό κατά την έκθεση σε χαμηλή θερμοκρασία (δηλαδή σε ιστούς που σχετίζονται με την παραγωγή θερμότητας), επαγωγή της έκφρασής του στην καρδιά μετά από νηστεία (Puigserver et al., 1998). Κατά συνέπεια φαίνεται ότι ο PGC-1 μεταφέρει εξωκυτταρικά μηνύματα που συμμετέχουν και επηρεάζουν το μεταγραφικό έλεγχο γονιδίων που σχετίζονται με τον ενεργειακό μεταβολισμό στα κύτταρα. Επίσης, σε αντίθεση με τους περισσότερους συνενεργοποιητές των πυρηνικών υποδοχέων, ο PGC-1 φαίνεται ότι αλληλεπιδρά με τον PPARγ ανεξάρτητα από τη παρουσία προσδέτη του. Ακόμα ο PGC-1 δεν περιέχει ΗΑΤ δραστικότητα. Περιέχει μόνο ένα μοτίβο LXXLL με το οποίο δεσμεύεται στους πυρηνικούς υποδοχείς, οπότε δεν μπορεί να αλληλεπιδράσει με άλλους συνενεργοποιητές, όπως ο CBP/p300, που διαθέτουν ΗΑΤ δραστικότητα. Ο μηχανισμός μέσω του οποίου καταφέρνει να πραγματοποιήσει τη μεταγραφική ενεργοποίηση δεν είναι γνωστός, το πιθανότερο σενάριο είναι ότι ανήκει σε κάποια από τα σύμπλοκα συνπαραγόντων που συνεργάζονται για τη ενεργοποίηση της μεταγραφής γονιδίων. Η παρατήρηση ότι η έκφραση του PGC-1 ενεργοποιείται από τη νηστεία και από έκθεση σε χαμηλή θερμοκρασία, συνθήκες που αυξάνουν τη χρησιμοποίηση των

48 λιπιδίων των κυττάρων, δείχνουν ότι ο PGC-1 μπορεί να λειτουργεί ως ρυθμιστής της μιτοχονδριακής β-οξείδωσης. Αυτό μπορεί να σημαίνει ότι είναι συνενεργοποιητής του PPARα, ο οποίος είναι βασικός μεταγραφικός παράγοντας που ελέγχει την οξείδωση των λιπαρών οξέων στα μιτοχόνδρια (Lee et al., 1995). Τα αποτελέσματα της εργασίας των Vega et al., (2000), δείχνουν ότι ο PGC-1 μπορεί να επάγει τη μεταγραφική ενεργοποίηση του PPARα. Μάλιστα υπάρχουν αρκετές διαφορές στη φύση της αλληλεπίδρασης του PGC-1 με τον PPARα σε σχέση με αυτή που παρατηρείται με τον PPARγ. Σε αντίθεση με τον PPARγ που η αλληλεπίδραση του με τον PGC-1 δεν επάγεται από την παρουσία προσδέτη, στον PPARα φαίνεται ότι ο προσδέτης επηρεάζει την αλληλεπίδραση με τον PGC-1. Πειράματα έδειξαν ότι η AF-2 περιοχή του PPARα είναι αυτή που αλληλεπιδρά με το LXXLL μοτίβο του PGC Συνκαταστολείς Οι πυρηνικοί υποδοχείς μπορούν και να καταστέλλουν τη μεταγραφή γονιδίων. Το φαινόμενο αυτό κυρίως συμβαίνει απουσία προσδέτη του υποδοχέα ή όταν ένας ανταγωνιστής του φυσικού προσδέτη συνδέεται στον υποδοχέα, αποτρέποντας τη μεταγραφική ενεργοποίηση. Υπάρχουν διάφοροι μηχανισμοί μέσω των οποίων μπορεί να πραγματοποιηθεί η καταστολή. Π.χ. η απευθείας δέσμευση ενός καταστολέα στο DNA, οδηγώντας σε ανταγωνισμό για το ίδιο αποκρινόμενο στοιχείο, η παρεμβολή του καταστολέα στη δράση του ενεργοποιητή, η απευθείας αλληλεπίδραση του καταστολέα με το βασικό σύμπλοκο της μεταγραφής και η στρατολόγηση κάποιου συνκαταστολέα στον προαγωγέα. Ένας «πραγματικός» συνκαταστολέας, όπως προαναφέρθηκε και για τους συνενεργοποιητές, πρέπει να διαθέτει κάποιες συγκεκριμένες ιδιότητες. Πρέπει να αλληλεπιδρά άμεσα με τον υποδοχέα στον οποίο δεν υπάρχει συνδεδεμένος κάποιος προσδέτης. Ακόμη πρέπει να αλληλεπιδρά με κάποια συστατικά του βασικού συμπλόκου μεταγραφής και να διαθέτει μια αυτόνομη περιοχή καταστολής. Έχουν αναγνωριστεί τρεις τέτοιοι συνκαταστολείς, ο SMRT (Silencing Mediator of Retinoid and Thyroid hormone receptor) (Chen and Evans,1995), ο N-CoR (Nuclear Receptor Corepressor) (Kurokawa et al., 1995) και ο SUN-CoR (Small Ubiquitous Nuclear CoRepressor), (Zamir et al., 1997). Αυτές οι πρωτεΐνες μπορούν να αλληλεπιδρούν με τα ετεροδιμερή των υποδοχέων TR και RAR με τον RXR, όταν

49 είναι συνδεδεμένα με το DNA και απουσία προσδετών τους. Ο N-CoR αλληλεπιδρά μέσω του καρβοξυτελικού του άκρου, με τη D περιοχή και τμήμα της LBD περιοχής των TR και RAR (Harlein et al., 1995). Αυτή η περιοχή αλληλεπίδρασης (CoR box) είναι συντηρημένη ανάμεσα στους TR, RAR και v-erba, αλλά όχι στους υποδοχείς που δε σχετίζονται φυσιολογικά με τον N-CoR, όπως ο ER (DiRenzo et al., 1997; Zamir et al., 1997). Η καταστολή ανατρέπεται με την αποδέσμευση του συνκαταστολέα από τον υποδοχέα, παρουσία κάποιου προσδέτη του υποδοχέα. Έτσι π.χ. με τη δέσμευση της ορμόνης αποδεσμεύεται ο SMRT από τον TR με την αλλαγή της διαμόρφωσης της LBD περιοχής του και συγκεκριμένα της έλικας 12 (Lin et al., 1997). Σχετικά με τις αλληλεπιδράσεις των PPARs με συνκαταστολείς, μελέτες στον PPARγ έδειξαν ότι μπορεί να αλληλεπιδρά με τους συνκαταστολείς N-CoR και SMRT, αλλά όχι όταν έχει προσδεθεί ως ετεροδιμερές με τον RXR στο PPRE του γονιδίου στόχου του (DiRenzo et al., 1997; Zamir et al., 1997), σε αντίθεση με τους υποδοχείς TR και RAR. Μελέτες αποκάλυψαν ότι οι N-CoR και SMRT ανήκουν σε ένα κυτταρικό σύμπλοκο που περιέχει τις πρωτεΐνες Sin3A/B και τις από-ακετυλάσες των ιστονών (Alland et al., 1997; Heinzel et al., 1997). Η αμινοτελική περιοχή καταστολής του SMRT αλληλεπιδρά με τη Sin3A/B, που με τη σειρά της αλληλεπιδρά με την από-ακετυλάση των ιστονών HDAC-1 μέσω μιας από τις δυο περιοχές της καταστολής (Wong and Privalsky, 1998). Δεν υπάρχουν στοιχεία που υποστηρίζουν την άμεση αλληλεπίδραση του SMRT με τη HDAC-1, γεγονός που υποδεικνύει ότι η Sin3 δρα ως γέφυρα του SMRT με το σύμπλοκο των αποακετυλασών. Εκτός από τις από-ακετυλάσες που συνεργούν στην καταστολή της μεταγραφής των γονιδίων υπάρχουν και εναλλακτικά μονοπάτια μεταγραφικής καταστολής ανεξάρτητα από τη στρατολόγηση των από-ακετυλασών. Έτσι η καταστολή του TR ρυθμίζεται με την απευθείας αλληλεπίδραση με το βασικό μεταγραφικό παράγοντα TFIIB (Baniahmad et al., 1993). Επιπρόσθετα βρέθηκε ότι ο TFIIB μπορεί να αλληλεπιδράσει με τον N-CoR και τον SMRT, καθώς και με τη Sin3 (Wong and Privalsky, 1998). Οι παραπάνω συνκαταστολείς παρεμβαίνουν απευθείας στη διαδικασία της μεταγραφικής ενεργοποίησης. Η καταστολή, όμως μπορεί να επιτευχθεί παρεμποδίζοντας και τη δέσμευση του πυρηνικού υποδοχέα στο DNA. Οι TRUP και calreticulin ανήκουν σε αυτές τις πρωτεΐνες που συνδέονται είτε στη D περιοχή των

50 TR και RAR (TRUP), είτε στη DBD των AR, GR και RAR (calreticulin) (Burns et al., 1994; Burris et al., 1995). Πάντως αυτές οι πρωτεΐνες δεν πρέπει να θεωρούνται ως πραγματικοί συνκαταστολείς σύμφωνα με τον ορισμό που δόθηκε παραπάνω, γιατί μπορεί να καταστέλλουν τη μεταγραφική ενεργοποίηση παρεμποδίζοντας τη δέσμευση του υποδοχέα στο DNA, αλλά όχι επάγοντας τη βασική μεταγραφική καταστολή Μεταγραφική δραστικότητα των PPARs Η μεταγραφική ενεργοποίηση των PPARs, όπως προαναφέρθηκε εξαρτάται από την παρουσία και τη σύνδεση προσδετών στην LBD περιοχής τους, που οδηγεί στην αποδέσμευση των συνκαταστολέων και τη στρατολόγηση των συνενεργοποιητών. Εναλλακτικό μονοπάτι για την ενεργοποίηση της μεταγραφικής δραστικότητας των PPARs αποτελεί η φωσφορυλίωσή τους, που επάγεται από ορμόνες και αναπτυξιακούς παράγοντες. Παρακάτω παρουσιάζονται πληροφορίες σχετικά με τους δυο αυτούς τρόπους της ενεργοποίησης της μεταγραφικής δραστικότητας των PPARs και συγκεκριμένα τις ουσίες που αποτελούν προσδέτες των PPARs και τη φωσφορυλίωση των PPAR α και γ από διάφορους παράγοντες Προσδέτες των PPARs Διάφορες μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί για την αναγνώριση των προσδετών των PPARs. Οι πρώτοι προσδέτες των PPAR α και γ αναγνωρίστηκαν με την κλασσική μέθοδο του ανταγωνισμού (competition assays), στην οποία χρησιμοποιήθηκαν ραδιενεργά σημασμένοι προσδέτες (Lehman et al., 1995; Kliewer et al., 1995; Forman et al., 1995 Devchand et al., 1996; Kliewer et al., 1997; Keller et al., 1997). Αργότερα αναπτύχθηκαν άλλες τεχνικές, που επέτρεπαν τη δοκιμασία πολλών περισσότερων ουσιών. Τέτοιες είναι, η μέθοδος SPA (Scintillation Proximity Assay) που χρησιμοποιεί το σπινθηρισμό για τη μέτρηση της αλληλεπίδρασης ενός μορίου, που είναι συνδεδεμένο σε ένα φθορίζον μικροσφαιρίδιο, με μια ραδιενεργά σημασμένη ουσία (Bosworth and Towers, 1989). Η μέτρηση αυτής της αλληλεπίδρασης υποδηλώνει ποια ουσία αποτελεί προσδέτη των PPARs. Η DPSA (Differential Protease Sensitivity Assay), η οποία στηρίζεται στην ελάττωση της ευαισθησίας των PPARs στην ενζυμική πρωτεόλυση, όταν συνδεθεί κάποια ουσία που είναι προσδέτης τους (Dowell et al., 1997). Η μέθοδος LIC (Ligand Induced

51 Complex), που ανιχνεύει την εξαρτώμενη από την παρουσία προσδέτη δέσμευση, περιορισμένης ποσότητας του ετεροδιμερούς PPAR:RXR σε κάποιο PPRE (Forman et al., 1997). Επίσης στηριζόμενοι στην υπόθεση ότι η δέσμευση ενός προσδέτη στους PPARs θα ενεργοποιούσε την αλληλεπίδραση των υποδοχέων με συνενεργοποιητές, οι Krey et al. (1997), ανέπτυξαν τη μέθοδο CARLA (Coactivator Dependnet Receptor Ligand Assay). Στη συγκεκριμένη μέθοδο μετράται η ικανότητα κάποιας ουσίας να επάγει την αλληλεπίδραση των PPAR/SRC-1. Βέβαια και άλλοι συνενεργοποιητές που συνδέονται ισχυρά με τους PPARs, όπως η p300/cbp μπορεί να χρησιμοποιηθούν στην CARLA (Berger et al., 1999) α) Φυσικοί προσδέτες των PPARs Αν και αρκετές πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργία των PPARs αποκτήθηκαν από την εύρεση των συνθετικών ουσιών που αποτελούν προσδέτες γι αυτούς, για την πλήρη κατανόηση της φυσιολογίας τους είναι απαραίτητη η εύρεση των φυσικών προσδετών τους. Το εργαστήριο του Gustafsson ήταν το πρώτο που έδειξε ότι ο PPARα ενεργοποιείται από μικρομοριακές συγκεντρώσεις πολλών λιπαρών οξέων, που διαφοροποιούνται στο μέγεθος της αλυσίδας και το βαθμό του κορεσμού (Gottlicher et al., 1992). Η αναζήτηση για φυσικούς προσδέτες του PPARα στον ανθρώπινο ορό, οδήγησε στην αναγνώριση του παλμιτικού οξέος, του ολεϊκού οξέος, του λινολεϊκού οξέος και του αραχιδονικού οξέος, ως αγωνιστές του (Banner et al., 1993). Μετέπειτα εργασίες έδειξαν ότι και οι PPAR β και γ ενεργοποιούνται από λιπαρά οξέα. Οι τρεις τύποι PPAR ενεργοποιούνται από διαφορετικά λιπαρά οξέα. Ο PPARα παρουσιάζει το πιο ευρύ φάσμα, αλληλεπιδρώντας και με κορεσμένα και ακόρεστα λιπαρά οξέα. Το γεγονός ότι μόνο ο PPARα μπορεί να δεσμεύει τόσο ευρύ φάσμα κορεσμένων λιπαρών οξέων (Xu et al., 1999), οφείλεται στην πιο υδρόφοβη «τσέπη» της LBD περιοχής του. Το κανάλι εισόδου των προσδετών στον PPARα σφραγίζεται εν μέρει από την Tyr-334. Επιπρόσθετα, αρκετές από τις υδρόφιλες ακολουθίες του PPARγ που έρχονται σε επαφή με τον προσδέτη, στον PPARα μετατρέπονται σε πιο υδρόφοβες ακολουθίες (Xu et al., 2001). Γι αυτό ίσως δεν μπορεί να δεσμεύσει κάποια υδροξυλιωμένα λιπαρά οξέα, τα οποία αποτελούν καλούς προσδέτες για τον PPARγ (Kliewer et al., 1997). Ο PPARγ είναι ο πιο επιλεκτικός τύπος αλληλεπιδρώντας με μια ορισμένη ομάδα πολυακόρεστων λιπαρών οξέων, περιλαμβάνοντας το ΕΡΑ (εικοσαπεντανοϊκό οξύ)

52 και το αραχιδονικό οξύ. Κορεσμένα και ακόρεστα λιπαρά οξέα αποτελούν προσδέτες και του PPARβ, παρουσιάζοντας όμως μικρότερη συγγένεια σε σχέση με τον PPARα. Εκτός από τα λιπαρά οξέα και αρκετοί οξειδωμένοι μεταβολίτες των λιπαρών οξέων λειτουργούν ως προσδέτες των PPARs in vitro. Δυο από αυτά τα εικοσανοειδή, η 15- δεοξυ-δ 12,14 προσταγλανδίνη J 2 (15d-PGJ 2 ) και το 8(S)-υδροξυεικοσατερανοϊκό οξύ (8(S)-ΗΕΤΕ) βρέθηκε ότι αποτελούν πιο αποτελεσματικοί προσδέτες των PPARs από ότι τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (Forman et al., 1995; Kliewer et al., 1995; Yu et al., 1995). Τα αποτελέσματα αυτά ήταν απρόσμενα γνωρίζοντας ότι τα εικοσανοειδή ρυθμίζουν τις περισσότερες από τις βιολογικές δράσεις τους μέσω αλληλεπιδράσεων με τις πρωτεΐνες G που συνδέονται στις κυτταρικές μεμβράνες. Η 15d-PGJ 2 είναι προσδέτης του PPARγ, ενώ το 8(S)-HETE του PPARα. Πρόσφατα προέκυψαν στοιχεία ότι συνδέονται και ενεργοποιούν τον PPARα και τον PPARγ τα προϊόντα της λιποξυγενάσης HODE, 13-HODE και 15-HETE, τα οποία είναι προϊόντα τις οξείδωσης των LDL (Nagy et al., 1998; Huang et al., 1999; Delerive et al., 2000). Πιθανόν η ρυθμιζόμενη μετατροπή των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων σε εικοσανοειδή μέσω των μονοπατιών της κυκλοοξυγενάσης ή της λιποξυγενάσης, να αποτελεί ένα μηχανισμό που ρυθμίζει τις ενεργοποιήσεις ενός ή περισσοτέρων τύπων PPAR β) Συνθετικοί προσδέτες των PPARs Συνθετικοί προσδέτες του PPARα Οι συνθετικοί αγωνιστές του PPARα μπορούν να διαχωριστούν σε τρεις βασικές ομάδες σύμφωνα με τη χημική τους δομή, τις βιολογικές επιδράσεις τους στους ανθρώπους και στα τρωκτικά και τη συγγένεια και εξειδίκευση που δείχνουν για τον PPARα. Η πρώτη ομάδα είναι τα fibrates υπολιπιδαιμικά φάρμακα, τα περισσότερα από τα οποία αποτελούν εξειδικευμένους αγωνιστές του PPARα και η βιολογική τους δράση ρυθμίζεται μέσω του PPARα. Η δεύτερη ομάδα των συνθετικών αγωνιστών του PPARα είναι η προσταγλανδίνη Ι2 και τα ανάλογα του λευκοτριαίνιου Β4. Η τρίτη ομάδα συντίθεται από διάφορες ουσίες, όπως το ανάλογο του αραχιδονικού οξέος ΕΤΥΑ (εικοσατετρανοϊκό οξύ), καθώς και διάφορα ζιζανιοκτόνα, εντομοκτόνα και διάφορες ξενοβιοτικές ουσίες που κατασκευάζονται από τον άνθρωπο (Kersten and Wahli, 2000). Fibrates

53 Τα fibrates είναι υπολιπιδαιμικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία της υπερλιπιδαιμίας. Τα περισσότερα fibrates δεσμεύονται στον PPARα με μέτρια επίπεδα χημικής συγγένειας, εκτός από το Wy το οποίο ενεργοποιεί τον PPARα ακόμα και σε συγκέντρωση της νανομοριακής κλίμακας (Lin et al., 1999). Τα περισσότερα fibrates είναι ειδικά για τον PPARα με εξαίρεση το bezafibrate το οποίο τουλάχιστον στον Xenopus laevis είναι πιθανός αγωνιστής του PPARβ και το cipofibrate το οποίο δεσμεύεται εξίσου καλά και στον PPARγ του Xenopus laevis (Krey et al., 1997). Στους ανθρώπους η θεραπεία με τα fibrates έχει δυο βασικές επιδράσεις στην ελάττωση των λιπιδίων, οι οποίες είναι και οι δυο ευεργετικές για την αντιμετώπιση των υπερλιπιδαιμικών ασθενειών. Πρώτον ελαττώνουν τη συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων στο πλάσμα και δεύτερον αυξάνουν τη συγκέντρωση της HDL στο πλάσμα (Staels et al., 1998). Η τελευταία δράση τους πιστεύεται ότι συμβαίνει με την ενεργοποίηση της οξείδωσης των λιπαρών οξέων στο ήπαρ μέσω της ενεργοποίησης του PPARα, αποτρέποντας την εστεροποίηση των λιπαρών οξέων και την επακόλουθη έκκριση ως VLDL. Επιπρόσθετα ενεργοποιώντας τον PPARα, τα fibrates αναστέλλουν την παραγωγή της apociii από το ήπαρ, η οποία αποτελεί πιθανό αναστολέα της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης (Staels et al., 1998). Προσταγλανδίνη Ι2 και ανάλογα του λευκοτριαίνιου Β4 Τα ανάλογα της προσταγλανδίνης 12 χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία καρδιοαγγειακών παθήσεων και πιστεύεται ότι αυτό το επιτυγχάνουν μιμούμενα τις προστακυκλίνες και ενεργοποιώντας τον PPARα (Hertz et al., 1996). Οι Devchand et al., (1996), έδειξαν ότι το λευκοτριαίνιο Β4 όπως και ανάλογά του ενεργοποιούν τον PPARα. Μάλιστα η μελέτη των Forman et al. (1997), έδειξε ότι η καρβαπροστακυκλίνη ενεργοποιεί τον PPARα με την ίδια ένταση που μπορεί και το Wy Συνθετικοί προσδέτες του PPARγ Ο PPARγ εμπλέκεται σε αρκετές παθήσεις, όπως η αρτηριοσκλήρωση, ο διαβήτης, η παχυσαρκία και ο καρκίνος. Γι αυτό γίνεται μεγάλη προσπάθεια στην ανάπτυξη ειδικών αγωνιστών και ανταγωνιστών του. Οι αγωνιστές του μπορούν να χωριστούν σε δυο ομάδες. Η πρώτη ομάδα των αγωνιστών του PPARγ αποτελούνται από τις θειαζολιδενιόνες (TZDsthiazolideniones) (Lehmann et al., 1995). Η δεύτερη ομάδα των αγωνιστών του είναι

54 τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα, τα οποία είναι χαμηλής συγγένειας αγωνιστές και του PPARγ και του PPARα και των οποίων η βασική βιολογική δράση δε ρυθμίζεται από τους PPARs. Τα TZDs δεσμεύονται στον PPARγ με μια συγγένεια της τάξης των 40nM (Lehmann et al., 1995). Αποτελούν πιθανούς ενεργοποιητές της δημιουργίας των κυττάρων του λιπώδους ιστού (Forman et al., 1995) και ενεργοποιούν την έκφραση γονιδίων στόχων του PPARγ, όπως η λιποπρωτεϊνική λιπάση και η μεταφοράση των λιπαρών οξέων (Schoojans et al., 1996; Motojima et al., 1998). Τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα αποτελούνται από μια ομάδα διαφορετικών χημικών ουσιών, που μπορούν να θεραπεύουν μια ποικιλία από παθήσεις, όπως οι πονοκέφαλοι, ο πυρετός, η θρόμβωση. Οι περισσότερες από τις φαρμακολογικές επιδράσεις τους μπορούν να αποδοθούν στην αναστολή των κυκλοοξυγενασών 1 και 2. Κάποια από αυτά μπορούν να ενεργοποιήσουν τους PPAR α και γ σε σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις. Συνθετικοί προσδέτες του PPARβ Σε αντίθεση με τους PPAR α και γ δεν έχουν αναγνωριστεί φάρμακα που δρουν μέσω του PPARβ. Επιπλέον οι συνθετικοί προσδέτες του PPARβ που έχουν αναφερθεί μέχρι σήμερα στερούνται ισχύ ή εξειδίκευση ή ακόμα και τα δύο. Ψάχνοντας τα ανάλογα των fibrates αναγνωρίστηκαν διάφορες ουσίες που ενεργοποιούν τον PPARβ του ανθρώπου (Brown et al., 1998). Το GW2433 αποτελούσε τον πιο πιθανό ενεργοποιητή του PPARβ σε αυτή τη σειρά των χημικών ουσιών, αν και παρουσίαζε μόνο μια μικρή επιλεκτικότητα έναντι του PPARα. Μελέτες έδειξαν ότι ο ανταγωνιστής των λευκοτριαινίων L ενεργοποιεί τον PPARβ (Berger et al., 1999) και ελαττώνει τα επίπεδα της χοληστερόλης σε διαβητικά ποντίκια. Αν και αυτή η ουσία δεν είναι ιδιαίτερη επιλεκτική στον PPARβ των ποντικών, έναντι του PPARγ, αυτή η επίδραση αποδόθηκε στην μεταγραφική δραστικότητα του PPARβ, εφόσον ούτε τα επίπεδα της γλυκόζης στον ορό, ούτε τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων ελαττώθηκαν στην ίδια δόση. Αυτά τα δεδομένα ενισχύουν την υπόθεση ότι και ο PPARβ, όπως και οι PPARs α και γ, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό των λιπιδίων.

55 Φωσφορυλίωση Οι PPARs α και γ, όπως και άλλα μέλη της υπεροικογένειας των πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων είναι φωσφοπρωτεΐνες. Η μεταγραφική τους ενεργοποίηση δηλαδή, μπορεί να ρυθμιστεί εκτός από την παρουσία των προσδετών τους και μέσω φωσφορυλίωσης α) Φωσφορυλίωση του PPARα Η έκφραση του γονιδίου του PPARα, όπως και η μεταγραφική του δραστικότητα ελέγχεται από μια ποικιλία ορμονών που δρουν σε πολλά επίπεδα μέσω διαφορετικών μηχανισμών. Έτσι π.χ. τα γλυκοκορτικοστεροειδή, όπως προαναφέρθηκε επάγουν την έκφραση της πρωτεΐνης του PPARα, ενώ η αναπτυξιακή ορμόνη (GH) την αναστέλλει. Η GH έχει ποικίλες επιδράσεις τόσο στο μεταβολισμό, όσο και στην ανάπτυξη, όπου είτε έμμεσα μέσω του IGF-1, αλλά κυρίως άμεσα επηρεάζει την έκφραση των γονιδίων. Συγκεκριμένα η GH, όπως και πολλές κυτοκίνες και αναπτυξιακοί παράγοντες ενεργοποιούν άμεσα τα μονοπάτια μεταγωγής σημάτων JAK-STAT (Zhou and Waxman, 1999). H GH συνδέεται με το μεμβρανικό υποδοχέα της (GHR) με μια διαδικασία που οδηγεί στην JAK2 κινάση που καταλύει τη φωσφορυλίωση της τυροσίνης των STAT πρωτεϊνών. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα το διμερισμό των STAT πρωτεϊνών και την μετατόπισή τους στον πυρήνα, όπου συνδέονται με ειδικά αποκρινόμενα στοιχεία του DNA και τελικά ενεργοποιούν την έκφραση των γονιδίων στόχων. Από επτά STAT πρωτεΐνες που υπάρχουν στα θηλαστικά, μόνο τέσσερις μορφές (STAT1, 3, 5α και 5β) μπορούν να ενεργοποιηθούν από την GH και μάλιστα η STAT5β είναι η μορφή που ανταποκρίνεται κυρίως στο σήμα της. Στην μελέτη του Zhou and Waxman (1999), μελετήθηκε η επίδραση της GH στον πολλαπλασιασμό των υπεροξειδιοσωμάτων σε COS-1 κύτταρα που επιμολύνθηκαν, ώστε να εκφράζουν και το GHR/JAK/STAT μονοπάτι και τον PPARα. Η GH αναστέλλει την έκφραση και την μεταγραφική λειτουργία του PPARα μέσω του GHR/JAK/STAT μονοπατιού. Πειράματα απέδειξαν ότι κάθε στοιχείο αυτού του μονοπατιού είναι απαραίτητο για την επίτευξη της ανασταλτικής δράσης της GH στον PPARα. Η GH ενεργοποιεί την MEK1 που φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την ERK1 και ERK2. Αποτελέσματα μελετών έδειξαν ότι η GH μπορεί να αναστείλει την έκφραση και τη μεταγραφική δραστικότητα του PPARα ανεξάρτητα από την παρουσία ή όχι

56 κάποιου ειδικού αναστολέα της ΜΕΚ1/2, που σημαίνει προφανώς ότι οι ERK1/2 MAPΚ δεν είναι εμπλεκόμενες στην αναστολή του PPARα από την GH. Πιθανόν οι ΜΑΡΚ να ασκούν μια επιπλέον αρνητική ρύθμιση στην δράση του PPARα αλλά με έναν τρόπο ανεξάρτητο από την έκφραση του GHR και της πρωτείνης STAT5β, ή τη χορήγηση GΗ (Zhou and Waxman, 1999). Υπάρχουν διάφορες υποθέσεις για τους μηχανισμούς οι οποίοι πιθανόν να ευθύνονται για την αναστολή του PPARα από την STAT5β και την GH. Μια περίπτωση αποτελεί η STAT5β να παρεμποδίζει κατά κάποιον τρόπο την έκφραση της πρωτεΐνης του PPARα, ή να ανταγωνίζεται τον PPARα στην σύνδεσή του στο PPRE. Ακόμη η STAT5β μπορεί να αναστέλλει τον PPARα με έναν έμμεσο μηχανισμό. Π.χ. η STAT5β μπορεί να ανταγωνίζεται τον PPARα σε ένα σημαντικό συνενεργοποιητή, όπως ο SRC-1 ή ο CBP/p300, είτε να εμποδίζει τη σύνδεση του PPARα με άλλες πρωτεΐνες, όπως ο RXR. Στην προσπάθεια απάντησης αυτών των ερωτημάτων έγιναν μια σειρά πειραμάτων (Juge-Aubry,1998), τα οποία δεν οδήγησαν σε μια συγκεκριμένη εξήγηση του μηχανισμού μέσω του οποίου επιτυγχάνεται η αναστολή του PPARα από τη STAT5β και την GH. Σε αντίθεση με την GH, η χορήγηση ινσουλίνης για 24 ώρες φαίνεται ότι αυξάνει τη βασική μεταγραφική δραστικότητα του PPARα του ανθρώπου κατά τέσσερις φορές (Juge-Aubry et al., 1999). Ανάλυση της πρωτοταγούς δομής της AF-1 περιοχής του PPARα του ανθρώπου έδειξε ότι διαθέτει αλληλουχίες του τύπου PXnSP, οι οποίες αναγνωρίζονται από τις ΜΑΡΚs (Juge-Aubry et al., 1999) και οι οποίες φωσφορυλιώνονται παρουσία ινσουλίνης. Τρεις από αυτές τις θέσεις είναι πολύ συντηρημένες, η σερίνη 12, η σερίνη 21 και η σερίνη 77. Μεταλλάσσοντας και τις τρεις φάνηκε ότι η ινσουλίνη ενεργοποιεί την AF-1 περιοχή του PPARα μέσω φωσφορυλίωσης των σερινών 12 και 21 από τις ΜΑΡΚs. Υπάρχουν μερικές υποθέσεις για τον τρόπο που η φωσφορυλίωση των σερινών 12 και 21 ενεργοποιούν τη μεταγραφική δραστικότητα του PPARα. Μια από αυτές είναι ότι στρατολογούν ή διώχνουν κάποιους συνενεργοποιητές ή συνκαταστολείς, αντίστοιχα. Στην εργασία των Juge-Aubry et al. (1999), φαίνεται ότι η φωσφορυλίωση έχει σαν αποτέλεσμα τη διακοπή της σύνδεσης των συνκαταστολέων, όπως ο NCoR και ο SMRT, οπότε και την ενεργοποίηση της μεταγραφής. Το γεγονός ότι ο υποδοχέας PPARα με μεταλλαγμένες τις σερίνες 12 και 21, εξακολουθεί να διαθέτει κάποια ικανότητα απόκρισης στην ινσουλίνη, μπορεί να σημαίνει ότι η ινσουλίνη είτε μπορεί να αλληλεπιδρά και με άλλες περιοχές του

57 υποδοχέα, είτε μπορεί να αλληλεπιδρά με κάποιους συνενεργοποιητές αυτού του μονοπατιού. Η παρατήρηση ότι η χορήγηση ινσουλίνης σε πρώιμα ηπατοκύτταρα για τρεις μέρες, προκαλεί ελάττωση της έκφρασης του PPARα, υποδηλώνει το σημαντικό ρόλο που διαδραματίζει ο χρόνος έκθεσης των κυττάρων σε αυτή. Έτσι μόνο μικρής διάρκειας έκθεση σε ινσουλίνη οδηγεί σε επαγωγή της μεταγραφικής δραστικότητας του PPARα, ενώ μεγαλύτερης διάρκειας έκθεση στην ινσουλίνη οδηγεί στα αντίθετα αποτελέσματα (Juge-Aubry et al.,1999) β) Φωσφορυλίωση του PPARγ Ο PPARγ, όπως προαναφέρθηκε παίζει σημαντικό ρόλο στη δημιουργία και διαφοροποίηση των κυττάρων του λιπώδους ιστού. Επειδή η ινσουλίνη προάγει τη συσσώρευση λίπους in vitro και έχει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση αυτών των κυττάρων μαζί με τον IGF-1 παράγοντα, εμπλέκεται δηλαδή στις ίδιες λειτουργίες με τον PPARγ, εξετάστηκε η πιθανότητα να υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο διαφορετικών μονοπατιών μεταγωγής σήματος (Zhang et al., 1996). Η ινσουλίνη δρα μέσω ενεργοποίησης του υποδοχέα της, που είναι κινάση της τυροσίνης και έχει σαν αποτέλεσμα την φωσφορυλίωση των σχετικών υποστρωμάτων της. Θεωρήθηκε ότι αυτό συμβαίνει με τη βοήθεια αρκετών μονοπατιών ενεργοποίησης, όπως μέσω των ΜΑΡΚs που εμπλέκουν την ενεργοποίηση της p21ras, που με τη σειρά της ενεργοποιεί τη Raf-1, οδηγώντας σε ενεργοποίηση της ΜΑΡ κινάσης κινάσης (ΜΚΚ) που τελικά ενεργοποιεί τις p44μαρκ (ERK1) και p42μαρκ (ERK2) φωσφορυλιώνοντάς τες στις αλληλουχίες τυροσινών / θρεονινών. Ακολουθεί η μετατόπιση τους στον πυρήνα, όπου ενεργοποιούν μια σειρά μεταγραφικών παραγόντων όπως η C/EBPβ και C/EBPδ και επάγουν την έκφραση της C/EBPα και του PPARγ. Το τελικό στάδιο της διαφοροποίησης των πρώιμων κυττάρων του λιπώδους ιστού σε ώριμα κύτταρα σχετίζεται με τη συνδυασμένη δράση των μεταγραφικών παραγόντων C/EBPα και PPARγ, που ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων όπως αυτών που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που είναι υπεύθυνες για την ευαισθησία στην ινσουλίνη (Prusty et al., 2002). Εξέταση της πρωτοταγούς δομής του PPARγ του ποντικού έδειξε την ύπαρξη μιας πιθανής θέσης φωσφορυλίωσης (PASP) από τις ΜΑΡΚs στη σερίνη 112. Θεωρήθηκε λοιπόν, ότι πιθανόν η ινσουλίνη να ενεργοποιεί τη φωσφορυλίωση του PPARγ μέσω

58 των ΜΑΡΚ και κατά συνέπεια και τη μεταγραφική δραστικότητα του, ανεξάρτητα από την παρουσία προσδέτη του (Zhang et al.,1996). Μελέτες όμως στις οποίες χρησιμοποιήθηκε ο PPARγ με μεταλλαγμένη τη σερίνη 112, έδειξαν ότι ο υποδοχέας εξακολουθεί να ενεργοποιείται από την ινσουλίνη με ένα τρόπο παρόμοιο με την μη μεταλλαγμένη μορφή. Επιπλέον το γεγονός ότι η ινσουλίνη μπορεί να ενεργοποιεί και τους άλλους δυο τύπους PPAR που δεν έχουν τη συγκεκριμένη ακολουθία αναγνώρισης για τις ΜΑΡΚs, υποδεικνύουν ότι οι ΜΑΡΚs τελικά ρυθμίζουν τους PPARs μέσω έμμεσων μηχανισμών (Zhang et al.,1996). Ενώ η ινσουλίνη και ο IGF-1 συμβάλλουν στη διαφοροποίηση των κυττάρων του λιπώδους ιστού επάγοντας τη μεταγραφική δραστικότητα του PPARγ, οι αυξητικοί παράγοντες, όπως ο επιδερμικός παράγοντας αύξησης (EGF) και ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων PDGF, αναστέλλουν τη διαφοροποίηση των κυττάρων του λιπώδους ιστού. Ο PDGF φάνηκε ότι μπορεί να ελαττώνει τόσο της βασική, όσο και την επαγόμενη από προσδέτες μεταγραφική δραστικότητα του PPARγ (Camp and Tafuri, 1997). Αυτό πιστεύεται ότι οφείλεται στη φωσφορυλίωση του PPARγ από τις MAPKs. Οι Camp and Tafuri (1997), αναλύοντας την αλληλουχία των αμινοξέων του PPARγ, θεώρησαν ότι η μια άλλη σερίνη στη θέση 82 και τα γειτονικά της αμινοξέα συμφωνούν με την αλληλουχία αναγνώρισης από τις ΜΑΡΚs, όπως ορίστηκε από τους Gonzalez et al. (1991). Αυτή η θέση είναι απόλυτα συντηρημένη μεταξύ ανθρώπου και ποντικού στον PPARγ1. Η μετάλλαξη της σερίνης 82 σε αλανίνη εμπόδισε τη φωσφορυλίωση του PPARγ από την ΜΑΡΚ και αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η συγκεκριμένη σερίνη είναι η μόνη θέση φωσφορυλίωσης (Camp and Tafuri, 1997). Ακόμα έχει αποδειχθεί ότι και οι JNKs (c-jun N-terminal kinases) φωσφορυλιώνουν τον PPARγ1 στη ίδια θέση, στη σερίνη 82, σε καταστάσεις σοκ, όπως μετά από έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία, σε υψηλή ωσμωτική πίεση και υψηλή θερμοκρασία (Camp et al., 1999). Φωσφορυλίωση του PPARγ1 από τις JNKs, οδηγεί επίσης σε ελάττωση της μεταγραφικής του δραστικότητας που εξαρτάται από την παρουσία προσδέτη, ενώ η βασική μεταγραφική του δραστικότητα παραμένει σταθερή. Συνήθως η φωσφορυλίωση των υποδοχέων επάγει τη μεταγραφική τους δραστικότητα. Η φυσιολογική σημασία της αναστολής της μεταγραφικής δραστικότητας του PPARγ και της διαφοροποίηση των κυττάρων του λιπώδους ιστού από τους αυξητικούς παράγοντες μέσω φωσφορυλίωσης, δεν είναι γνωστή. Λογικό είναι ότι η δημιουργία και η ωρίμανση των κυττάρων του λιπώδους ιστού δεν

59 μπορούν να συμβαίνουν ταυτόχρονα, οπότε πιθανόν να υπάρχουν παράγοντες της μιας διαδικασίας που παρεμποδίζουν την άλλη. Όπως προαναφέρθηκε καθοριστικός παράγοντας της μεταγραφικής δραστικότητας των PPARs αποτελεί η παρουσία των προσδετών και η σύνδεση τους με συνενεργοποιητές. Εφόσον η χορήγηση του προσδέτη στα κύτταρα ελαττώνει τη φωσφορυλίωση του υποδοχέα, πιθανολογείται ότι η φωσφορυλίωση πιθανώς, είτε «κρύβοντας» την LBD περιοχή, είτε παρεμποδίζοντας τις αλλαγές στη στερεοδιάταξη του υποδοχέα, παίζει ρόλο στην εξειδίκευση ή / και στη συγγένεια του PPARγ με τους συνενεργοποιητές (Camp and Tafuri, 1997). Γεγονός αποτελεί πάντως ότι η χορήγηση κάποιων παραγόντων προκαλεί τη φωσφορυλίωση των PPAR α και γ από τις ΜΑΡΚs, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση ή την αναστολή της μεταγραφικής δραστηριότητας τους. Η διαφοροποίηση των παραγόντων και των διαδικασιών που οδηγούν στη φωσφορυλίωση των PPAR α και γ, σε συνδυασμό με το διαφορετικό φάσμα των προσδετών τους, προβάλλει την ύπαρξη ενός ακόμη μηχανισμού που ρυθμίζει τις ειδικές αποκρίσεις του κάθε τύπου PPAR Έκφραση και λειτουργίες των τριών τύπων PPARs PPARα Ο PPARα στον Xenopus laevis εκφράζεται σε μέτρια επίπεδα κατά την ωογένεση. Στα ενήλικα άτομα εκφράζεται σε όλους τους ιστούς που έχουν εξεταστεί π.χ. ήπαρ, νεφρά, μυς, λίπος. Στους ποντικούς και τους αρουραίους, ο PPARα εμφανίζεται σχετικά αργά κατά την ανάπτυξη (Ε13.5) και συγκεκριμένα στους ίδιους ιστούς που εμφανίζεται και στα ενήλικα άτομα, δηλαδή ήπαρ, νεφρά, καρδιά, φαιό λιπώδη ιστό, βλεννογόνο του στομάχου και δωδεκαδάκτυλο (Braissant et al., 1996). Σε σχετικά σημαντικά επίπεδα εκφράζεται και στον αμφιβληστροειδή, στους σκελετικούς μυς και στις παγκρεατικές νησίδες (Lemberger et al., 1996). Στον άνθρωπο τα επίπεδα έκφρασης του PPARα στο ήπαρ είναι χαμηλότερα από τα αντίστοιχα στα τρωκτικά (Palmer et al., 1998), αν και είναι αρκετά υψηλά στην καρδιά, τα νεφρά, τους σκελετικούς μυς και το παχύ έντερο (Auboeuf et al., 1997).

60 Γενικά φαίνεται ότι η έκφραση του PPARα, ανεξάρτητα από το είδος, σχετίζεται με τους ιστούς που παρουσιάζουν υψηλή δραστικότητα της μιτοχονδριακής και υπεροξειδιοσωματικής β-οξείδωσης, όπως τα καρδιομυοκύτταρα και τα νεφρικά κύτταρα, τα οποία χρησιμοποιούν τα λιπαρά οξέα ως πηγή ενέργειας (Desvergne and Wahli, 1999). Στο ήπαρ των αρουραίων, η έκφραση του PPARα υπόκειται σε αρνητική και θετική ρύθμιση από την ινσουλίνη και τα γλουκοκορτικοστεροειδή, αντίστοιχα (Steineger et al., 1994, Lemberger et al., 1994). Τα επίπεδα του mrna και της πρωτεΐνης του PPARα είναι ανάλογα με αυτά των γλουκοκορτικοστεροειδών που κυκλοφορούν στο αίμα. Καταστάσεις στρες, όπως η νηστεία, που επάγουν τα επίπεδα των γλουκοκορτικοστεροειδών, οδηγούν και σε αύξηση της σύνθεσης του PPARα στα ηπατοκύτταρα (Lemberger et al., 1996; Kersten et al., 1999). Αντίθετα, έκθεση των ηπατοκυττάρων του αρουραίου σε GH για μερικές μέρες, προκαλεί μείωση στα επίπεδα έκφρασης του PPARα κατά 50%, μέσω της φωσφορυλίωσης του όπως προαναφέρθηκε α) PPARα και υπεροξειδιοσωματική β-οξείδωση Ο πολλαπλασιασμός των υπεροξειδιοσωμάτων που παρατηρείται στα τρωκτικά αλλά όχι στους ανθρώπους, οφείλεται σε αύξηση του όγκου των υπεροξειδιοσωμάτων καθώς και της δραστικότητας της υπεροξειδιοσωματικής β-οξείδωσης των λιπαρών οξέων. Αυτή η δραστικότητα επάγεται από ερεθίσματα όπως η έκθεση σε χαμηλή θερμοκρασία, η δίαιτα με υψηλά ποσοστά λίπους, η θυροειδική ορμόνη, αλλά και από μια μεγάλη ποικιλία ουσιών που ονομάζονται πολλαπλασιαστές υπεροξειδιοσωμάτων, στους οποίους περιλαμβάνονται κάποια υπολιπιδαιμικά φάρμακα (Lock et al., 1989). Όπως προαναφέρθηκε, το όνομα των PPARs δόθηκε από την ανακάλυψη των πρώτων αγωνιστών του PPARα, οι οποίοι ανήκαν σε αυτή την κλάση των ουσιών (Issemann and Green, 1990). Το γεγονός ότι σε knock-out ποντίκια για τον PPARα, δεν εμφανιζόταν το φαινόμενο του πολλαπλασιασμού των υπεροξειδιοσωμάτων μετά την έκθεση σε κλασσικούς πολλαπλασιαστές υπεροξειδιοσωμάτων, όπως το clofibrate και το Wy14643, αποδεικνύει ότι ο PPARα είναι ο βασικός ρυθμιστής των πλειοτροπικών δράσεων των συγκεκριμένων ουσιών (Lee et al., 1995). Κατά συνέπεια τα πρώτα γονίδια που χαρακτηρίστηκαν ως στόχοι των PPARs κωδικοποιούσαν ένζυμα των υπεροξειδιοσωμάτων και συγκεκριμένα αυτά που σχετίζονται με το μονοπάτι της β-οξείδωσης. Τα γονίδια που κωδικοποιούν

61 την ακυλ-coa οξειδάση (ACO), την ενοϋλ-coa υδρατάση/ διϋδρογονάση (HD) και την κετο-ακυλ-coa θειολάση, είναι στόχοι του PPARα (Dreyer et al., 1992; Tugwood et al., 1992; Marcus et al., 1993; Zhang et al., 1992). Σε αντίθεση, ούτε η καταλάση, ούτε το γονίδιο της οξειδάσης του εστέρα του ουρικού οξέος, τα οποία ελέγχουν την διάθεση του H 2 O 2 που παράγεται από την οξείδωση των λιπαρών οξέων, ρυθμίζονται από τον PPARα. Ο PPARα ως ρυθμιστής του πολλαπλασιασμού των υπεροξειδιοσωμάτων και της επαγωγής της β-οξείδωσης, από τη μια πλευρά βοηθάει προμηθεύοντας υποστρώματα των λιπαρών οξέων που μπορούν να εισέλθουν στο μιτοχόνδριο ή να χρησιμοποιηθούν στη σύνθεση των μεμβρανών και από την άλλη πλευρά συνεισφέρει στην αποτοξίνωση από ενδογενή και εξωγενή ενεργά μόρια, μερικά από τα οποία μπορεί να αποτελούν προσδέτες του β) PPARα και μιτοχονδριακή β-οξείδωση Η μιτοχονδριακή β-οξείδωση συνεισφέρει σημαντικά στην παραγωγή ενέργειας μέσω της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης που παράγει ΑΤΡ. Ο ρόλος του PPARα στην ενεργειακή ομοιόσταση συσχετίζεται άμεσα με το ποσοστό της εμπλοκής του σε αυτό το μονοπάτι. Το πρώτο περιοριστικό βήμα στη μιτοχονδριακή β-οξείδωση είναι η είσοδος των λιπαρών οξέων στα μιτοχόνδρια, το οποίο ελέγχεται από ένα σύστημα μεταφοράς που εξαρτάται από την καρνιτίνη. Αυτός ο έλεγχος δεν είναι μόνο ποσοτικός αλλά και ποιοτικός, εφόσον αποκλείει την είσοδο σε λιπαρά οξέα πολύ μακράς αλυσίδας (C>20). Ένα από τα βασικά συστατικά της συγκεκριμένης διαδικασίας, η παλμιτόϋλ τρανσφεράση της καρνιτίνης Ι (CPT I) καταλύει το σχηματισμό της λιπο-ακυλ καρνιτίνης που βοηθάει στη μετατόπιση των λιπαρών οξέων στην εσωτερική μεμβράνη του μιτοχονδρίου. Αυτό το ένζυμο επάγεται από πολλαπλασιαστές υπεροξειδιοσωμάτων και λιπαρά οξέα (Brady et al., 1989; Foxworthy et al., 1990). Επίσης έχει χαρακτηριστεί ένα λειτουργικό PPRE στον προαγωγέα του γονιδίου της CPT I από τους μυς (Yu et al., 1998; Mascaro et al., 1998; Brandt et al., 1998). O PPARα ελέγχει τη μιτοχονδριακή β-οξείδωση ρυθμίζοντας και την έκφραση του γονιδίου της μέσης αλυσίδας ακυλ-coa δεϋδρογονάσης (MCAD) (Gulick et al., 1994). PPARα και προσαρμογή στη νηστεία και στο στρες Η νηστεία και το στρες αντιπροσωπεύουν τυπικές καταστάσεις στις οποίες στο ήπαρ επάγεται η έκφραση και η μεταγραφική δραστικότητα του PPARα έχοντας σαν

62 αποτέλεσμα την επαγωγή της αποικοδόμησης των λιπαρών οξέων σε μονάδες υψηλής ενέργειας. Εν τω μεταξύ, η έκφραση του PPARα ενεργοποιείται απευθείας και από τα ανεβασμένα επίπεδα των γλουκοκορτικοστεροειδών (Lemberger et al., 1994), την ίδια στιγμή που τα επίπεδα της ινσουλίνης ελαττώνονται (Steineger et al., 1994). Η νηστεία συνδέεται και με την γρήγορη κατανάλωση του αποθηκευμένου γλουκαγόνου και την αύξηση του ρυθμού της γλουκονεογένεσης. Τα knock-out ποντίκια για τον PPARα διαθέτουν πολύ μικρά αποθέματα γλουκαγόνου και σε κατάσταση νηστείας παρουσιάζουν σοβαρή υπογλυκαιμία και υποθερμία (Kersten et al., 1999). Αυτές οι καταστάσεις συνοδεύονται και από αυξημένη συσσώρευση λίπους στο ήπαρ, χωρίς αύξηση στην παραγωγή των κετονοσωμάτων, τα οποία υποδηλώνουν δραματική ελάττωση στην οξείδωση των λιπαρών οξέων (Kersten et al., 1999; Leone et al., 1999) γ) PPARα και μικροσωμική ω-οξείδωση Το σύστημα της μονοξυγενάσης του κυτοχρώματος παίζει σημαντικό ρόλο στην οξείδωση μιας μεγάλης πληθώρας ενδογενών και εξωγενών ουσιών. Τα ένζυμα CYP4A, συμμετέχουν σε αυτό το σύστημα σαν μια ξεχωριστή ομάδα της υπεροικογένειας του κυτοχρώματος Ρ450, καταλύουν την ω-υδροξυλίωση των λιπαρών οξέων και των εικοσανοειδών και επάγονται από fibrates και άλλους πολλαπλασιαστές υπεροξειδιοσωμάτων στο ήπαρ και στα νεφρά. Η ω-υδροξυλίωση αποτελεί το πρώτο βήμα π.χ. στην εξουδετέρωση του λευκοτριαίνιου Β4 (LTB4), ο οποίος είναι προσδέτης του PPARα, και ο οποίος διασπάται πλήρως μέσω της β- οξείδωσης στα υπεροξειδιοσώματα (Jedlitschky et al., 1993). Τουλάχιστον δυο γονίδια του CYP4A, το CYP4A1 και το CYP4A6, περιλαμβάνουν ένα λειτουργικό PPRE στον προαγωγέα τους και ανταποκρίνονται in vivo και στις κυτταροκαλλιέργειες σε ενεργοποιητές του PPARα (Krey et al., 1993; Muerhoff et al., 1992; Aldridge et al., 1995). Η συμμετοχή των PPARs σε μια άλλη λειτουργία των οργανισμών και συγκεκριμένα στην αντίδραση της φλεγμονής φάνηκε από το γεγονός ότι ο παράγοντας της φλεγμονής, LTB4, (εικοσανοειδές με πιθανή χημειοτακτική δράση) δεσμεύεται από τον PPARα ο οποίος στη συνέχεια επάγει τη μεταγραφή γονιδίων της ω- και β- οξείδωσης, που μπορούν να εξουδετερώσουν και να διασπάσουν τον συγκεκριμένο παράγοντα (Devchand et al., 1996).

63 δ) PPARα και μεταβολισμός των αμινοξέων Οι Kersten et al., 2001, χρησιμοποιώντας την τεχνική των μικροσυστοιχιών (microarrays) και αποτύπωση κατά Northern έδειξαν ότι ο PPARα επηρεάζει τη έκφραση αρκετών γονιδίων που εμπλέκονται σε βασικά μονοπάτια του μεταβολισμού των αμινοξέων. Αυτά περιλαμβάνουν τη τρανσαμίνωση, την απαμίνωση, τον κύκλο της ουρίας, την οξείδωση των α-κετοξέων και τη σύνθεση προϊόντων που προέρχονται από τα αμινοξέα. Ο PPARα ελαττώνει την έκφραση των ενζύμων που συμμετέχουν σε αυτές τις λειτουργίες, με αποτέλεσμα την ολική ελάττωση της αποικοδόμησης των αμινοξέων. Σε αντίθεση με την κοινή πεποίθηση, η οξείδωση των αμινοξέων συνεισφέρει σημαντικά στην παραγωγή ενέργειας από αρκετά όργανα, όπως το ήπαρ και το έντερο (Jungas et al., 1992). Η οξείδωση των αμινοξέων αυξάνεται δραματικά σε καταστάσεις όπως η σήψη και η καχεξία, καθώς και μετά από σοβαρά τραύματα και εγκαύματα. Αυτές οι καταστάσεις χαρακτηρίζονται από μαζική αποικοδόμηση των πρωτεϊνών του σώματος και οδηγούν σε αρνητικό ισοζύγιο του αζώτου. Παρά τη μεγάλη κλινική σημασία του μεταβολισμού των αμινοξέων λίγα είναι γνωστά για τη ρύθμισή του σε γενετικό επίπεδο. Έχει δειχθεί ότι τα γλουκοκορτικοστεροειδή και το γλουκαγόνο αυξάνουν την έκφραση των ενζύμων του κύκλου της ουρίας (Haggerty et al., 1983; Morris et al., 1987). Οι Kimura et al., (1998) έδειξαν το σημαντικό ρόλο του μεταγραφικού παράγοντα C/EBPα στη ρύθμιση της σύνθεσης της ουρίας, ο οποίος C/EBPα επάγει την έκφραση των ενζύμων που συμμετέχουν σε αυτήν. Η εργασία των Kersten et al., (2001), φανέρωσε ακόμα ένα μεταγραφικό ρυθμιστή του κύκλου της ουρίας, τον PPARα, ο οποίος έχει εντελώς αντίθετη επίδραση από τον C/EBPα, αναστέλλοντας την έκφραση των ενζύμων που συμμετέχουν στην τρανσαμίνωση, την απαμίνωση και τον κύκλο της ουρίας. Σύμφωνες με αυτές τις παρατηρήσεις είναι και τα αυξημένα επίπεδα της ουρίας στο πλάσμα σε νηστικά knock-out για τον PPARα ποντίκια, σε σχέση με του άγριου τύπου. Η αύξηση στη συγκέντρωση των κετονοσωμάτων και η ελάττωση της συγκέντρωσης της ουρίας κατά τη διάρκεια νηστείας στα ποντίκια, οφείλονται σε ένα μόνο παράγοντα τον PPARα, ο οποίος μπορεί να ισορροπεί τις ανάγκες των δύο μονοπατιών, αλλάζοντας την έκφραση των γονιδίων που συμμετέχουν σε αυτά. Εκτός από το μεταβολισμό των λιπαρών οξέων και των αμινοξέων, υπάρχουν δεδομένα που εμπλέκουν τον PPARα στη ρύθμιση του μεταβολισμού των υδατανθράκων. Χρησιμοποιώντας τα microarrays φάνηκε ότι ο PPARα επάγει την

64 έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την γλουκονεογένεση. Έτσι, φαίνεται ότι ο PPARα λειτουργεί ως γενικός ρυθμιστής του ενεργειακού μεταβολισμού στο ήπαρ, ο οποίος συντονίζει τους ρυθμούς της χρησιμοποίησης των διαφόρων ενεργειακών υποστρωμάτων ανάλογα με τη διαθεσιμότητα της τροφής (Kersten et al., 2001) PPARβ Ο PPARβ εκφράζεται σε όλους τους ιστούς, όντας και ο κυρίαρχος τύπος PPAR σε αρκετούς από αυτούς. Το ευρύ ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του PPARβ του αρουραίου δεν προσέφερε πληροφορίες για τους ρόλους που μπορεί να διαδραματίζει στον οργανισμό. Γι αυτό το λόγο μελετήθηκε η έκφραση του σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια, με σκοπό την εύρεση στοιχείων που θα ενέπλεκαν τον PPARβ σε κάποιες συγκεκριμένες λειτουργίες. Παρόμοιες μελέτες στον Xenopus laevis και στους ποντικούς έδειξαν ότι ο PPARβ εκφράζεται από νωρίς κατά την ανάπτυξη (Dreyer et al., 1992; Kliewer et al., 1994). Στον αρουραίο, χρησιμοποιώντας την in situ υβριδοποίηση, μελετήθηκε από τους Braissant and Wahli, (1998), η έκφραση των τριών τύπων PPAR κατά τις εμβρυακές ημέρες (Ε) Ε8.5, Ε11.5, Ε15.5 και Ε18.5. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι PPAR α και γ εμφανίζονται αργά κατά την ανάπτυξη (Ε13.5) και κυρίως στους ιστούς που θα εκφράζονται και στα ενήλικα άτομα. Σε αντίθεση με την περιορισμένη έκφραση των PPAR α και γ, ο PPARβ εκφράζεται παντού και πολύ νωρίς κατά την εμβρυογένεση, με μέγιστο βαθμό έκφρασης στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα στην Ε13.5. Αργά κατά την ανάπτυξη (Ε18.5), τα επίπεδα της έκφρασης του PPARβ μειώνονται σε εκείνα που θα παραμείνουν και στους ενήλικους ιστούς. Αυτή η έντονη έκφραση του PPARβ κατά τα διάφορα στάδια της ανάπτυξης, προκάλεσε το ενδιαφέρον των ερευνητών και έτσι αποδείχτηκε ότι ο συγκεκριμένος τύπος PPAR είναι πολύ σημαντικός για την ανάπτυξη του οργανισμού ελέγχοντας σημαντικά μεταβολικά μονοπάτια, όπως αυτά που σχετίζονται με τη σύνθεση των μεμβρανών, την αναστροφή (turnover) και τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Αυτό επιβεβαιώνεται από το γεγονός ότι knock-out μοντέλο για τον PPARβ είναι πολύ δύσκολο να δημιουργηθεί λόγω της μεγάλης θνησιμότητας που παρατηρείται στα πειραματόζωα. Πρόσφατες μελέτες που χρησιμοποίησαν ένα συνθετικό αγωνιστή του PPARβ, έδειξαν ότι μπορεί να επάγει την αντίστροφη μεταφορά της χοληστερόλης και να διορθώσει τα πρότυπα των λιποπρωτεϊνών και των επιπέδων των τριγλυκεριδίων σε παχύσαρκους Rhesus πιθήκους (Oliver et al.,

65 2001). Πιο πιθανό είναι ο PPARβ να παίζει κάποιο ρόλο στη διαφοροποίηση των κυττάρων του λιπώδους ιστού (Bastie et al., 1999). Επιπλέον η έκφραση του στο έντερο και μάλιστα ως τον κυρίαρχο τύπο PPAR, υποδεικνύει πως παίζει σημαντικό ρόλο και στη πρόσληψη τροφής καθώς και στο μεταβολισμό των λιπιδίων. Ο βλεννογόνος του λεπτού εντέρου απορροφά λιπίδια που εμπεριέχονται στην τροφή, τα οποία μεταφέρονται μέσω κυτοπλασματικών πρωτεϊνών που δεσμεύουν λιπαρά οξέα στο ενδοπλασματικό δίκτυο για τη σύνθεση λιπιδίων και τριγλυκεριδίων (Schmidt 1983). Μελέτη στην οποία χρησιμοποιήθηκε ο ειδικός προσδέτης του PPARβ GW2433, σε knock-out ποντίκια για τον PPARα, έδειξε ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης του PPARβ στο λεπτό έντερο ήταν ικανά να ενεργοποιήσουν το γονίδιο της πρωτεΐνης που δεσμεύει τα λιπαρά οξέα (fatty-acid-binding protein FABP) στο ήπαρ, το οποίο αποτελεί στόχο του PPARα (Poirier et al., 2001). Έτσι ο PPARβ μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση κι άλλων γονιδίων στόχων των PPARs στο έντερο, που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των λιπιδίων και τα οποία στο παρελθόν είχαν μελετηθεί μέσω της ενεργοποίησής τους στο ήπαρ από τον PPARα. Οι Wang et al (2003), έδειξαν ότι ο PPARβ είναι βασικός μεταγραφικός ρυθμιστής της καύσης του λίπους στο λιπώδη ιστό, καθώς ενεργοποιεί τα ένζυμα που σχετίζονται με τη β-οξείδωση των λιπαρών οξέων μακράς αλυσίδας. Ακόμη από τη μελέτη των Wang et al.(2004), αποδείχτηκε ότι ο PPARβ μπορεί να ρυθμίζει τη μετατροπή των τύπων των μυϊκών ινών, επιτρέποντας τη δημιουργία ενός ποντικού με φαινότυπο «μαραθωνοδρόμου». Οι μυϊκές ίνες διαχωρίζονται στους τύπους Ι και ΙΙ. Οι ίνες του τύπου Ι είναι πλούσιες σε μιτοχόνδρια και χρησιμοποιούν κυρίως τον οξειδωτικό μεταβολισμό για την παραγωγή ενέργειας, η οποία προσφέρει μια σταθερή και μεγάλης διάρκειας παροχή ΑΤΡ. Αυτό τις επιτρέπει να είναι ανθεκτικές στη σωματική κούραση. Οι ίνες του τύπου ΙΙ διαχωρίζονται σε τρεις υποτύπους, τους ΙΙa, IIx και IIb. Οι ίνες του τύπου IIb διαθέτουν τα χαμηλότερα επίπεδα μιτοχονδρίων και οξειδωτικών ενζύμων και στηρίζονται στο γλυκολυτικό μεταβολισμό ως τη βασική πηγή ενέργειας και κατά συνέπεια είναι επιρρεπείς στην κούραση. Οι ίνες του τύπου ΙΙa και IIx διαθέτουν ενδιάμεσες ιδιότητες από τις ίνες του τύπου Ι και ΙΙb (Booth and Thomason 1991; Berchtold et al., 2000; Olson and Williams 2000). Στους ενήλικες οι σκελετικοί μυς διαθέτουν πλαστικότητα και μπορούν να εναλλάσσουν τύπους των μυϊκών ινών ως απόκριση στη σωματική άσκηση (Booth and Thomason 1991; Jarvis et al., 1996; Pette, 1998; Olson and Williams 2000; Hood 2001). Αυτή η μετατροπή των μυϊκών ινών από τον τύπο ΙΙb

66 στον τύπο ΙΙa και στον τύπο Ι είναι πιθανόν ότι ελέγχεται από ένα μονοπάτι μεταγωγής σημάτων που σχετίζεται με το ασβέστιο και εμπλέκει την καλσινευρίνη, την κινάση που εξαρτάται από την καλμοδουλίνη και το μεταγραφικό παράγοντα PGC-1α (Naya et al., 2000; Olson and Williams 2000; Lin et al., 2002; Wu et al., 2002). Η ενεργοποιημένη μορφή του PPARβ, όπως φαίνεται από την εργασία των Wang et al. (2004), οδηγεί σε μια έντονη και συντονισμένη αύξηση της έκφρασης των οξειδωτικών ενζύμων, της μιτοχονδριακής βιογένεσης και της παραγωγής των ειδικών συσταλτικών πρωτεϊνών των μυϊκών ινών του τύπου Ι, δηλαδή των τριών βασικών στοιχείων για την εναλλαγή του τύπου των μυϊκών ινών. Ενώ η επαγωγή της έκφρασης των οξειδωτικών ενζύμων των μυών από τον PPARβ έχει αποδειχτεί in vitro και in vivo ( Muoio et al., 2002; Dressel et al., 2003; Luquet et al., 2003; Tanaka et al., 2003; Wang et al., 2003), οι επιδράσεις που φαίνονται στη συγκεκριμένη εργασία στην εναλλαγή του τύπου των μυϊκών ινών ήταν μη αναμενόμενες. Η προοδευτική αλλαγή στην οξειδωτική δυνατότητα σε συνδυασμό με την τελική μετατροπή σε μυϊκές ίνες του τύπου Ι, οδήγησαν σε ένα δραματικά βελτιωμένο προφίλ στη φυσική άσκηση και στην προστασία έναντι της παχυσαρκίας. Αυτό δεν εξαρτάται μόνο από την επίτευξη της αλλαγής του τύπου των μυϊκών ινών, αλλά απαιτεί και όλες τις συσχετιζόμενες αλλαγές στο νευρικό σύστημα και στο μεταβολισμό, ώστε να μπορέσει να δημιουργηθεί μια καινούρια φυσιολογική απόκριση. Οι φαινότυποι των ποντικών που παρουσιάζονται στη συγκεκριμένη εργασία είναι παρόμοιοι με των διαγονιδιακών ποντικών που εκφράζουν την καλσινευρίνη, την κινάση που εξαρτάται από την καλμοδουλίνη, ή τον PGC-1α (Naya et al., 2000; Lin et al., 2002; Wu et al., 2002), υποδεικνύοντας ότι πιθανόν ο PPARβ μπορεί να είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας του συγκεκριμένου μονοπατιού. Από τις μελέτες των διαγονιδιακών πειραματοζώων προκύπτει ότι η ενεργοποίηση του PPARβ είναι απαραίτητη για την εναλλαγή των μυϊκών ινών. Η μελέτη των Luquet et al. (2003), έδειξε ότι η αυξημένη έκφραση του PPARβ δεν είναι αρκετή για να προάγει την εναλλαγή των μυϊκών ινών, ή την αντίσταση στην παχυσαρκία. Οπότε η ενεργοποίηση του PPARβ και όχι απλώς η αύξηση των επιπέδων έκφρασής του είναι απαραίτητη για τη μετατροπή των μυϊκών ινών. Πώς ο ενδογενής PPARβ μπορεί να ενεργοποιηθεί από την εκγύμναση; Πρώτον είναι πιθανόν ότι η φυσική άσκηση να δημιουργεί ή να αυξάνει ενδογενείς προσδέτες του

67 PPARβ, καθώς αυξάνεται στους ιστούς η καύση των λιπαρών οξέων. Δεύτερον η άσκηση μπορεί να επάγει την έκφραση του PGC-1α (Gotto et al., 2000) και συνακόλουθα να ενεργοποιείται και ο PPARβ. Αυτό έρχεται σε συμφωνία με προηγούμενη δουλειά των Wang et al. (2003), οι οποίοι έδειξαν ότι ο PGC-1α αλληλεπιδρά με τον PPARβ στο μυϊκό ιστό και μπορεί να τον ενεργοποιήσει ακόμη και απουσία προσδετών. Η ικανότητα του PPARβ να ενεργοποιεί τη μιτοχονδριακή βιογένεση και τη λειτουργία της οξείδωσης υποδεικνύει ότι ο PPARβ μπορεί να είναι σημαντικός για τον έλεγχο της αντίστασης στην ινσουλίνη. Τα συγκεκριμένα στοιχεία δείχνουν ότι ο PPARβ και οι προσδέτες του αποτελούν ένα βασικό μοριακό «διακόπτη» για τη ρύθμιση της εξειδίκευσης των μυϊκών ινών, την αντίσταση στην παχυσαρκία, την ευαισθησία στην ινσουλίνη και στη φυσική κατάσταση. Πέρα όμως από τη συμμετοχή στο μεταβολισμό, με βάση τα πρότυπα ιστοειδικής έκφρασής του και το γεγονός ότι η διαδικασία απαιτεί τους φυσικούς αγωνιστές του PPARβ PGI 2 και cpgi (Forman et al., 1997), προτάθηκε ότι ο PPARβ είναι ο βασικότερος ρυθμιστής της διαδικασίας εμφύτευσης των εμβρύων και της διάταξης του πλακούντα (Lim et al., 1999). Ακόμη στον PPARβ αποδόθηκε και ογκογονική λειτουργία μετά την αναγνώρισή του ως απευθείας στόχος της β-κατενίνης και ως ανασταλτικός στόχος του μη στερεοειδούς αντιφλεγμονώδους φαρμάκου sulindac, ο οποίος είναι ένας πιθανός αναστολέας των όγκων του εντέρου (He, et al., 1999). Επίσης υπήρχε η υπόνοια ότι ο PPARβ μπορεί να λειτουργεί και ως μεταγραφικός καταστολέας των PPAR α και γ. Οι Shi et al., (2002), επιβεβαιώνουν αυτή τη λειτουργία του PPARβ, καθώς βρήκαν ότι αλληλεπιδρά με τους συνκαταστολείς των πυρηνικών υποδοχέων SMRT, SHARP και HDACs. Αλληλεπιδρώντας με αυτούς ο PPARβ, υιοθετεί τη δραστικότητα της αποακετυλίωσης των ιστονών. Ο SMRT συνδέεται στην LBD του PPARβ. Μετάλλαξη αυτής της περιοχής αποτρέπει αυτή τη σύνδεση και συνακόλουθα την κατασταλτική δράση του PPARβ, ενισχύοντας την πεποίθηση ότι η στρατολόγηση συνκαταστολέων είναι απαραίτητη για την κατασταλτική δραστικότητα του PPARβ. Μελέτες της μεταβολής της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας συμπλόκων DNA-πρωτεϊνών έδειξαν ότι μόνο ο PPARβ μπορεί να αλληλεπιδράσει με συνκαταστολείς (SMRT), επιβεβαιώνοντας και παλιότερες παρατηρήσεις ότι οι PPAR α και γ, όταν είναι συνδεδεμένοι στο DNA, δεν αλληλεπιδρούν με συνκαταστολείς (Zamir et al., 1997; Heinzel et al., 1997). Επειδή και οι τρεις τύποι PPAR δεσμεύονται σε παρόμοια αποκρινόμενα στοιχεία,

68 είναι πιθανόν η στρατολόγηση των συνκαταστολέων στα PPREs να ευθύνεται για την κατασταλτική δράση του PPARβ. Το γεγονός ότι ένας μεταλλαγμένος PPARβ, που έχει χάσει την ικανότητα δέσμευσης στο DNA δεν μπορεί να καταστείλει την ενεργοποίηση των PPAR α και γ, δείχνει ότι ένας από τους μηχανισμούς μέσω της οποίας επιτυγχάνεται η κατασταλτική δράση του PPARβ είναι ο ανταγωνισμός για τη δέσμευση στο DNA. Πολύ ενδιαφέρον αποτελεί το γεγονός ότι ο PPARβ καταστέλλει και τους δυο άλλους τύπους PPAR. Γνωρίζοντας το ευρύ πρότυπο ιστοειδικής έκφρασης του PPARβ και τα περιορισμένα των PPAR α και γ, καθώς και τις διαφοροποιήσεις στην έκφραση των τριών τύπων κατά την ανάπτυξη, ο PPARβ μπορεί να λειτουργεί ως ειδικός μεταγραφικός ρυθμιστής, ανάλογα με το στάδιο της ανάπτυξης και τον ιστό PPARγ Ο PPARγ εκφράζεται κυρίως στο λιπώδη ιστό και σε πολύ μικρότερο βαθμό σε ορισμένα τμήματα του ανοσοποιητικού συστήματος, στον αμφιβληστροειδή χιτώνα, στο παχύ έντερο, στους σκελετικούς μυς και στο ήπαρ (Braissant and Wahli, 1998). Όταν ανακαλύφθηκε ο PPARγ, το σημαντικότερο χαρακτηριστικό του, ήταν τα υψηλά επίπεδα έκφρασής του στο λιπώδη ιστό (Dreyer et al., 1992). Τότε αποδόθηκε ένας βασικός ρόλος στον PPARγ όσον αφορά τη δημιουργία των κυττάρων του λιπώδους ιστού. Επιπλέον, ενεργοποιητές του PPARγ, όπως τα φάρμακα θειαζολιδενεδιόνες (TZDs), μπορούν να προάγουν την ωρίμανση των πρώιμων κυττάρων του λιπώδους ιστού σύμφωνα με τα αποτελέσματα αρκετών μελετών (Lehmann et al., 1995; Kletzien et al., 1992). Η φαινοτυπική μεταβολή των ινοβλαστών ή των πολυδύναμων κυττάρων (stem cells) σε λιπώδη κύτταρα συνοδεύεται από την επαγωγή αρκετών γονιδίων που χαρακτηρίζουν τα λιπώδη κύτταρα. Αρκετά από αυτά τα γονίδια ενεργοποιούνται από τον PPARγ και κωδικοποιούν ένζυμα, όπως η λιποπρωτεϊνική λιπάση (Schoonjans et al., 1996), η οποία εκκρίνεται από τα κύτταρα του λιπώδους ιστού και ενεργοποιεί την απελευθέρωση των λιπαρών οξέων από τα τριγλυκερίδια στον εξωκυτταρικό χώρο. Ακόμη η απορρόφηση των λιπαρών οξέων μακράς αλυσίδας στα λιπώδη κύτταρα διευκολύνεται από μεταφορικές πρωτεΐνες, όπως οι FAT και FATP, οι οποίες επάγονται από ενεργοποιητές των PPAR α και γ (Frohnert et al., 1999). Τα γονίδια της αρ 2 (πρωτεΐνης που δεσμεύει λιπαρά οξέα στα λιπώδη κύτταρα) και της ακυλ- CoA συνθετάσης περιέχουν στον προαγωγέα τους λειτουργικά PPREs και μπορούν

69 να ενεργοποιηθούν από τον PPARγ στα διαφοροποιημένα κύτταρα του λιπώδους ιστού (Tontonoz et al., 1994; Schoonjans et al., 1995). Η σύνθεση των λιπαρών οξέων και των τριγλυκεριδίων επάγεται από τον PPARγ μέσω της μεταγραφικής ενεργοποίησης του μαλικού ενζύμου (Castelein et al., 1994; Ijpenberg et al., 1997). Το γονίδιο που κωδικοποιεί το μεταφορέα της γλυκόζης που εξαρτάται από την ινσουλίνη (GLUT4) και το οποίο διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης της γλυκόζης, επάγεται από τον PPARγ και τους ενεργοποιητές του τα φάρμακα TZDs (Wu et al., 1998). Αυτές οι επιδράσεις του PPARγ στο λιπώδη ιστό θεωρούνται ότι αποτελούν το βασικό μηχανισμό με τον οποίο τα TZDs βελτιώνουν την ευαισθησία στην ινσουλίνη σε ασθενείς που πάσχουν από διαβήτη του τύπου 2. Αν και όπως προαναφέρθηκε ο PPARγ ρυθμίζει την ευαισθησία στην ινσουλίνη, παραμένει παράδοξο το γεγονός πως ο πυρηνικός υποδοχέας που εκφράζεται βασικά στο λιπώδη ιστό, ευαισθητοποιεί το ήπαρ και τους σκελετικούς μυς στις δράσεις της ινσουλίνης. Στην προσπάθεια κατανόησης των μηχανισμών που σχετίζονται με τις αντιδιαβητικές δράσεις των προσδετών του PPARγ, σε πειραματόζωα για τον διαβήτη τύπου 2, μελετήθηκε η επίδρασης τους σε γονίδια-στόχους ιστών που είναι ευαίσθητοι στις δράσεις της ινσουλίνης. Το πρότυπο της έκφρασης των γονιδίων που μελετήθηκαν σε αυτά τα ζώα, δείχνουν ότι οι αγωνιστές του PPARγ επάγουν την είσοδο λιπαρών οξέων στο λιπώδη ιστό, απομακρύνοντάς τα από τους σκελετικούς μυς και το ήπαρ. Ο μειωμένος μεταβολισμός των λιπαρών οξέων στους μυς πιθανότατα να ευθύνεται για την αυξημένη χρησιμοποίηση της γλυκόζης μέσω του κύκλου του Randle. Ταυτόχρονα η ελάττωση των επιπέδων των λιπαρών οξέων στο ήπαρ, μπορεί να ευθύνεται για τη μείωση της παραγωγής της γλυκόζης. Τα αποτελέσματα της εργασίας των Kliewer et al. (2001), δείχνουν ότι οι αντιδιαβητικές δράσεις των αγωνιστών του PPARγ είναι η συνέπεια της συντονισμένης ρύθμισης της έκφρασης των γονιδίων σε αρκετούς ιστούς που είναι ευαίσθητοι στη δράση της ινσουλίνης. Πιθανόν είναι οι επιδράσεις των αγωνιστών του PPARγ στους σκελετικούς μυς και το ήπαρ να οφείλονται και στην άμεση δράση του ενεργοποιημένου υποδοχέα στους συγκεκριμένους ιστούς και στην έμμεση δράση του στα κύτταρα του λιπώδους ιστού. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι και ο PPARγ επηρεάζει σημαντικά την αντίδραση της φλεγμονής, εφόσον έκθεση των μακροφάγων σε υψηλές δόσεις του προσδέτη του PPARγ 15-δεοξυ-Δ12,14-PGJ2 αναστέλλουν του παραγωγή του νιτρικού οξειδίου και της γελατινάσης Β (Ricote et al., 1998). Αυτή η αναστολή οφείλεται στην

70 ανταγωνιστική δράση του PPARγ έναντι των μεταγραφικών παραγόντων AP-1, STAT και NF-κΒ, οι οποίοι ελέγχουν την έκφραση των κυτοκινών. 1.1.α) Οι PPARs στα ψάρια Οι μελέτες σχετικά με τα γονίδια και τις πρωτεΐνες των PPARs λόγω του φανερού ιατρικού και φαρμακολογικού ενδιαφέροντος έχουν επικεντρωθεί στα θηλαστικά, με ελάχιστες εργασίες πάνω σε άλλα σπονδυλωτά. Όσο αναφορά τα ψάρια, οι Ruyter et al. (1997), ανέφεραν για πρώτη φορά την ύπαρξη των PPARs σε ψάρια και συγκεκριμένα στο σολομό (Salmo salar). Απομόνωσαν, με PCR, ένα τμήμα DNA 627bp (209 αμινοξέα) χρησιμοποιώντας ως μήτρα cdna από το ήπαρ του σολομού και εκκινητές που σχεδιάστηκαν βασιζόμενοι σε συντηρημένες εξελικτικά ακολουθίες των γνωστών PPARs. Οι αμινοξικές ακολουθίες των DBD και LBD περιοχών του σολομού ήταν ομόλογες με άλλων μελών της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων. Ακόμη το cdna που απομονώθηκε από τον σολομό είχε μόνο τρία αμινοξέα ανάμεσα στις δυο κυστεΐνες του D box του δεύτερου δακτυλίου ψευδαργύρου, το οποίο όπως προαναφέρθηκε είναι χαρακτηριστικό των PPARs. Αυτός ο τύπος PPAR που απομονώθηκε, χαρακτηρίστηκε ως PPARγ μετά από τη σύγκριση της αλληλουχίας του με άλλους PPARγ άλλων ειδών. Οι Andersen et al. (2000), μπόρεσαν και απομόνωσαν ολόκληρη την αλληλουχία του cdna από τον PPARγ του σολομού (Salmo salar). Βρήκαν ότι ο PPARγ του σολομού από το ήπαρ κωδικοποιείται όπως φαίνεται από τουλάχιστον δυο μεταγραφήματα, που διαφοροποιούνται στο μήκος της 3 αμετάφραστης περιοχής, λόγω της εναλλακτικής χρησιμοποίησης των πολλαπλών πολυαδενυλιωμένων σημείων. Βασιζόμενοι στην ύπαρξη πολλών πυρηνικών υποδοχέων τόσο στα αρθρόποδα, όσο και στα σπονδυλωτά, οι Laudet et al. (1992), υπέθεσαν ότι αυτή η αρχαία υπεροικογένεια διαχωρίστηκε πριν από τον διαχωρισμό αυτών των δυο κλάσεων, δηλαδή περίπου πριν από 500 εκατομμύρια χρόνια. Ο PPARγ του σολομού όμως παρουσιάζει μόνο 16% ομοιότητα με τον RXR (Jones et al., 1995), τον RAR (Joore et al., 1994) και τον TR από το Danio rerio. Ακόμη, αν και η DBD περιοχή είναι η πιο συντηρημένη εξελικτικά περιοχή των πυρηνικών υποδοχέων, η DBD της σμύραινας

71 (Escriva et al., 1997) και του σολομού παρουσιάζουν μόνο 53% ομολογία. Αυτό μπορεί να υποδηλώνει ότι οι ιδιότητες της δέσμευσης των PPARs στο DNA δεν σταθεροποιήθηκαν κατά την εξέλιξη των αρχέγονων ψαριών. Η δέσμευση των PPARs σε συγκεκριμένα αποκρινόμενα στοιχεία των προαγωγέων των γονιδίων φαίνεται ότι σταθεροποιήθηκε μετά την εμφάνιση των τελεόστεων, περίπου πριν 200 εκατομμύρια χρόνια και συντηρήθηκε, όπως δείχνει και η μεγάλη ομολογία των αλληλουχιών της DBD περιοχής του PPARγ ανάμεσα στο σολομό και τον άνθρωπο. Ένα ακόμη χαρακτηριστικό του PPARγ του σολομού αποτελεί η ένθεση 9 αμινοξέων σε ένα βρόχο της LBD περιοχής. Κρυσταλλογραφία του PPARγ του ανθρώπου έδειξε ότι ο συγκεκριμένος βρόχος είναι το πιο ευέλικτο τμήμα του μορίου και πλησιάζει στον προσδέτη μετά τη σύνδεσή του στο μόριο (Nolte et al., 1998; Uppenberg et al., 1998). Αυτή η ένθεση των 9 αμινοξέων στον PPARγ του σολομού είναι κοντά στην επιπλέον έλικα Η2 του PPARγ, η οποία θεωρείται ότι συνεισφέρει σημαντικά στην ικανότητα δέσμευσης πολλών προσδετών, καθώς επεκτείνει την «τσέπη» της LBD περιοχής (Nolte et al., 1998). Οπότε τα παραπάνω οδηγούν στην πεποίθηση ότι αυτή η ένθεση των αμινοξέων επηρεάζει τη δέσμευση των προσδετών. Μέχρι σήμερα βέβαια δεν υπήρχαν πληροφορίες για προσδέτες των PPARs των ψαριών. Μελέτες σχετικά με την έκφραση του PPARγ στο σολομό έδειξαν σύμφωνα με τους Ruyter et al. (1997), ότι εκφράζεται στο ήπαρ και στο λιπώδη ιστό σε υψηλά επίπεδα σε αντίθεση με αρκετά είδη θηλαστικών στα οποία ο PPARγ εκφράζεται κυρίως στο λιπώδη ιστό. Οι Lambe and Tugwood (1996), βρήκαν αξιοσημείωτα επίπεδα έκφρασης του PPARγ του ανθρώπου εκτός από το λιπώδη ιστό και στον πνεύμονα, στον πλακούντα και στις ωοθήκες. Θεώρησαν ότι αυτό το γεγονός οφείλονταν στην υψηλή περιεκτικότητα σε λίπος των συγκεκριμένων ιστών. Αντίστοιχα, θεωρήθηκε ότι η αυξημένη έκφραση του PPARγ στο ήπαρ του σολομού οφείλεται στο υψηλό ποσοστό λίπους που περιέχει το συγκεκριμένο όργανο. Ακόμη, οι Andersen et al. (2000), βρήκαν το ένα μεταγράφημα του PPARγ του σολομού που περιέγραψαν να εκφράζεται σε ένα ευρύ φάσμα ιστών, όπως είχε παρατηρηθεί και στην έκφραση του PPARγ1 των θηλαστικών (Vidal-Puig et al., 1996). Όσον αφορά το πρώτο γονίδιο PPAR που κλωνοποιήθηκε από τα ψάρια ήταν του PPARγ από το φασί του Ατλαντικού (Pleuronectes platessa) (Leaver et al., 1998). Η αμινοξική αλληλουχία του PPAR που απομονώθηκε από το φασί του Ατλαντικού διέθετε όλα τα ιδιαίτερα δομικά χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών των PPARs, που είχαν ήδη περιγραφεί στα θηλαστικά και στα αμφίβια. Η σύγκριση της αμινοξικής

72 ακολουθίας του PPARγ από το φασί του Ατλαντικού με τις αμινοξικές ακολουθίες των τριών τύπων PPAR από τον Xenopus laevis και τα θηλαστικά έδειξε 71% ομοιότητα με τον PPARγ, 64% ομοιότητα με τον PPARα και 60% με τον PPARβ. Τα τελευταία χρόνια παρουσιάστηκαν και άλλες αναφορές σχετικά με τους PPARs στα ψάρια. Συγκεκριμένα με την ανάγνωση του γονιδιώματος του τελεόστεου ψαριού Fugu rubripes (Maglich et al., 2003), αναγνωρίστηκαν και οι πυρηνικοί του υποδοχείς. Έτσι βρέθηκε ότι διαθέτει από μια ισομορφή για τους PPARγ και PPARβ, ομόλογες με αυτές του ανθρώπου και δυο για τον PPARα. Η μελέτη της έκφρασης των τεσσάρων γονιδίων PPARs του Fugu rubripes, έδειξε ότι όλοι οι τύποι εκφράζονται σε ένα ευρύ φάσμα ιστών, σε αντίθεση με το πρότυπο που παρατηρείται στα θηλαστικά (Braissant and Wahli, 1998). Οι PPARs των θηλαστικών διαθέτουν, όπως προαναφέρθηκε τρία πολύ συντηρημένα αμινοξέα, (Υ473, Η323 και Η499) τα οποία δημιουργούν δεσμούς υδρογόνου με την οξική ομάδα των λιπαρών οξέων που αποτελούν προσδέτες τους (Willson et al., 2000). Ο PPARα του Fugu rubripes έχει ακριβώς τα ίδια αμινοξέα στις συγκεκριμένες θέσεις με τον PPARα του ανθρώπου. Ο PPARβ από το Fugu rubripes διατηρεί δύο από τα τρία αμινοξέα όμοια με τον PPARβ του ανθρώπου, διαθέτοντας στη θέση 449 μια ασπαραγίνη, αντί για ιστιδίνη που έχει ο PPARβ του ανθρώπου. Αυτή η αλλαγή του αμινοξέος πιθανόν, επιτρέπει τη δέσμευση των όξινων προσδετών. Ο PPARγ όμως από το Fugu rubripes διαφοροποιείται σε δυο από τα τρία αμινοξέα, η Η323 αντικαθίσταται από ισολευκίνη και η Υ473 από μεθειονίνη, οι οποίες πιθανότατα εμποδίζουν τη δέσμευση όξινων προσδετών. Αυτές οι αλλαγές δεν εμφανίζονται μόνο στο Fugu rubripes αλλά και στον PPARγ από το σολομό (Andersen et al., 2000) και το φασί του Ατλαντικού (Leaver et al., 1998). Επίσης πρόσφατα αναφέρθηκε η κλωνοποίηση δυο τμημάτων cdnas από το Danio rerio, που παρουσιάζουν υψηλό ποσοστό ομοιότητας με τον PPARβ των θηλαστικών (Robinson-Rechavi et al., 2001). Τέλος, εξετάζοντας το γονιδίωμα του Tetraodon nigroviridis διαπιστώσαμε δυο ισομορφές του PPARα, οι οποίες παρουσιάζουν πολύ μεγάλη ομοιότητα με τις δυο ισομορφές του PPARα του Fugu rubripes (Maglich et al., 2003).

73 1.2. ΣΤΟΧΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Μελέτη των PPARs σε καλλιεργούμενα είδη ψαριών Το θέμα της διδακτορικής διατριβής εντάσσεται στα πλαίσια του ευρωπαϊκού προγράμματος Cloning and functional analysis of fish peroxisome proliferatoractivated receptors: The transcriptional control of lipid metabolism in farmed fish (EU 5FP Q5RS ). Ο στόχος του προγράμματος ήταν η ενίσχυση και η κλωνοποίηση των γονιδίων και των cdnas των PPARs καθώς και η μελέτη των ιδιοτήτων τους, από την τσιπούρα (Sparus aurata), το λαβράκι (Dicentrarchus labrax), το σολομό (Salmo salar) και το φασί του Ατλαντικού (Pleuronectes platessa), είδη με ιδιαίτερα βαρύνουσα σημασία για τις ιχθυοκαλλιέργειες στην Ευρώπη. Αρχικά μελετήθηκαν οι ιδιότητες των DBD και LBD περιοχών των υποδοχέων, η μεταγραφική δραστικότητά τους και τα πρότυπα της ιστοειδικής έκφρασής τους. Στη συνέχεια αναπτύχθηκαν in vitro μέθοδοι για τη διαπίστωση του ρόλου των PPARs στο μεταβολισμό των λιπιδίων στα ψάρια. Τελικά διερευνήθηκε η in vivo επίδραση της επαγόμενης έκφρασης των PPARs, μέσω της μεταγραφικής τους δραστικότητας, στη συσσώρευση του λίπους και στη σύσταση των λιπιδίων στους ιστούς των ψαριών. Στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής ασχολήθηκα αρχικά με την κλωνοποίηση των γονιδίων των PPARs από την τσιπούρα και το λαβράκι. Έτσι από την τσιπούρα και το λαβράκι απομονώθηκε τμήμα του γονιδίου του PPARα το οποίο περιελάμβανε τμήμα της DBD περιοχής μέχρι και το τέλος της LBD περιοχής, αποτελούμενο από πέντε εξώνια. Από την τσιπούρα απομονώθηκε η LBD περιοχή και της δεύτερης ισομορφής του PPARα, η οποία σε αντίθεση με την πρώτη κωδικοποιείται από δυο εξώνια αντί τριών. Το γονίδιο του PPARβ απομονώθηκε και από τα δυο είδη, από την Α/Β περιοχή έως την LBD περιοχή και αποτελείται από επτά εξώνια. Για το γονίδιο PPARγ εφικτή ήταν η απομόνωση μόνο τμημάτων του εξαιτίας της δυσκολίας που παρουσιάστηκε στην ενίσχυσή του. Από την τσιπούρα κλωνοποιήθηκαν τα εξώνια της Α/Β περιοχής και του δεύτερου δακτύλου ψευδαργύρου, το ιντρόνιο που συνδέει τα εξώνια της Α/Β περιοχής με τον πρώτο δάκτυλο ψευδαργύρου και η ιδιαίτερα σημαντική, για τη σύγκριση μεταξύ αμφιβίων και θηλαστικών με τα ψάρια, LBD περιοχή, που απαρτίζεται από τέσσερα εξώνια. Από το λαβράκι ενισχύθηκαν τα εξώνια της Α/Β

74 περιοχής, του πρώτου και του δεύτερου δακτύλου ψευδαργύρου, το ιντρόνιο που συνδέει τα εξώνια της Α/Β περιοχής με τον πρώτο δάκτυλο ψευδαργύρου και το ιντρόνιο που συνδέει τα δυο πρώτα εξώνια της LBD περιοχής. Στη συνέχεια, με βάση τις ακολουθίες των αντίστοιχων γονιδίων ενισχύθηκαν και κλωνοποιήθηκαν, από τα cdnas της τσιπούρας και του λαβρακιού, οι κωδικοποιούμενες περιοχές και για τους τρεις τύπους PPAR. Επιπλέον ενισχύθηκε η κωδικοποιούμενη περιοχή της δεύτερης ισομορφής του PPARα της τσιπούρας, με βάση τις αντίστοιχες ακολουθίες από άλλα είδη ψαριών (Tetraodon nigroviridis και Fugu rubripes). Επίσης με βάση τις ακολουθίες από την τσιπούρα και το φασί του Ατλαντικού, απομονώθηκαν οι κωδικοποιούμενες ακολουθίες των τριών τύπων PPAR από το cdna της ιππόγλωσσας (Hippoglossus hippoglossus), ενός ακόμη είδους καλλιεργούμενου ψαριού. Πολύ υψηλά ποσοστά ομοιότητας διαπιστώθηκαν μεταξύ των αμινοξικών αλληλουχιών των PPARs των ψαριών με τους ομόλογους τύπους των θηλαστικών και των αμφιβίων, γεγονός που έπαιξε καθοριστικό ρόλο στο σχεδιασμό της περαιτέρω πειραματικής διαδικασίας. Με τη μέθοδο RNase protection μελετήθηκε το πρότυπο της ιστοειδικής έκφρασης των PPARs στην τσιπούρα και στο λαβράκι. Ολικό RNA απομονώθηκε από δέκα διαφορετικούς ιστούς κάθε είδους, (ήπαρ, νεφρά, έντερο, βράγχια, καρδιά, σπλήνα, λευκό μυ, ερυθρό μυ, εγκέφαλο και λιπώδη ιστό). Η περιοχή D από κάθε τύπο PPAR, χρησιμοποιήθηκε ως ραδιενεργά σημασμένος ανιχνευτής. Τα πρότυπα έκφρασης των PPARs των συγκεκριμένων ψαριών παρουσιάζουν αρκετές ομοιότητες αλλά και διαφορές με αυτά των θηλαστικών, κάτι που έχει παρατηρηθεί και σε άλλα είδη ψαριών και πιθανότατα αντανακλούν κάποιες διαφοροποιήσεις στη φυσιολογία τους. Στη συνέχεια με τη μέθοδο της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας των συμπλόκων DNA-πρωτεϊνών (EMSA-Electrophoretic Mobility Shift Assay) μελετήθηκε η ικανότητα των PPARs από την τσιπούρα, το λαβράκι, το φασί του Ατλαντικού και το σολομό, να προσδένονται ως ετεροδιμερή με τους υποδοχείς RXR σε ακολουθίες που αποτελούν γνωστά αποκρινόμενα στοιχεία των προαγωγέων γονιδίων των θηλαστικών, όπως της ακυλ-coa οξειδάσης και του z PPRE του γονιδίου Cyp4A6 και υποτιθέμενων PPREs του προαγωγέα του γονιδίου της GSTA1 από το φασί του Ατλαντικού. Οι PPARs και των τεσσάρων ειδών ψαριών σχημάτισαν ετεροδιμερή με τους υποδοχείς RXR (θηλαστικών και ψαριών) και αναγνώρισαν τις ακολουθίες των

75 αποκρινόμενων στοιχείων του τύπου DR-1 που εξετάστηκαν, αποδεικνύοντας τη συντήρηση των ιδιοτήτων της DBD περιοχής και σε κατώτερα εξελικτικά σπονδυλωτά. Η ειδική δέσμευση στις συγκεκριμένες ακολουθίες αποδείχτηκε με πειράματα ανταγωνισμού. Επίσης η παρουσία του PPARγ στα ετεροδιμερή PPAR:RXR που σχηματίστηκαν, επιβεβαιώθηκε με τη προσθήκη ειδικού αντισώματος που προήρθε από τον Dr Jose Bautista, Τμήμα Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας του Πανεπιστημίου της Μαδρίτης. Τέλος για την αναγνώριση των προσδετών των PPARs των ψαριών χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος CARLA (CoActivator-Dependent Receptor Ligand Assay). Ποσοτικοποιήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις των LBD περιοχών των PPAR α και β από το λαβράκι, του PPARγ από το φασί του Ατλαντικού και των τριών τύπων PPAR από το σολομό, με την πρωτεΐνη του SRC-1, παρουσία δεκατεσσάρων χημικών ουσιών, που αποτελούν γνωστούς προσδέτες των PPARs των θηλαστικών. Οι LBD περιοχές των PPARs των ψαριών απομονώθηκαν από τους αντίστοιχους cdna κλώνους και κλωνοποιήθηκαν στο πλασμίδιο pgex-2tk, ώστε να εκφράζονται ως ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες με την πρωτεΐνη της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι LBD περιοχές των PPAR α και β των ψαριών εκτός του σολομού, παρουσιάζουν παρόμοιες ιδιότητες με αυτές των θηλαστικών, αναγνωρίζοντας αρκετές από τις ουσίες που εξετάστηκαν, ενώ ο PPARγ των ψαριών παρουσιάζει χαμηλή ή καθόλου συγγένεια για τις συγκεκριμένες ουσίες. Θα πρέπει να αναφερθεί η συνεργασία, κατά τα αρχικά στάδια της εργασίας και συγκεκριμένα στην ενίσχυση και κλωνοποίηση των γονιδίων του PPARα και των cdnas των τριών τύπων PPAR από την τσιπούρα και το λαβράκι, με την δρ. Αντωνοπούλου Ευθυμία, η οποία αποτελούσε μέλος του εργαστηρίου στο ΙΝ.ΑΛ.Ε. Επίσης πρέπει να αναφερθεί και η ιδιαίτερα σημαντική συνεισφορά της κας Laurance Favre Krey, μέλους του εργαστηρίου του ΙΝ.ΑΛ.Ε. στη μελέτη του προτύπου ιστοειδικής έκφρασης των υποδοχέων στα εξεταζόμενα είδη ψαριών.

76 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

77 2.1. Πειραματόζωα Τα πειραματόζωα που χρησιμοποιήθηκαν, τσιπούρες (Sparus aurata) και λαβράκια (Dicentrarchus labrax), συλλέχθηκαν από ιχθυοκαλλιέργειες της περιοχής της Καβάλας. Μετά την αιχμαλωσία τους διατηρήθηκαν σε δεξαμενές με ανακυκλούμενο θαλασσινό νερό όπου εκτράφηκαν κανονικά, εκτός εάν ήταν απαραίτητη μια διαφορετική δίαιτα. Τα ψάρια θυσιάστηκαν με αποκεφαλισμό μετά από αναισθητοποίηση Απομόνωση των γονιδίων των PPARs από την τσιπούρα και το λαβράκι Γενωμικό DNA της τσιπούρας και του λαβρακιού απομονώθηκε από μυϊκό ιστό με τη βοήθεια του DNeasy Tissue kit (QIAGEN), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η μεθοδολογία του DNeasy Tissue kit στηρίζεται στην προηγμένη τεχνολογία της ειδικής μεμβράνης πυριτίου (silica-gel-membrane), η οποία προσφέρει τη δυνατότητα γρήγορης και αποτελεσματικής απομόνωσης γενωμικού DNA, χωρίς να είναι απαραίτητη η εκχύλιση με οργανικές ενώσεις και η κατακρήμνιση με αιθανόλη. Τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται προκαλούν την άμεση λύση των κυττάρων και διευκολύνουν την επιλεκτική δέσμευση του DNA στη μεμβράνη. Το DNA που προέρχεται με τη βοήθεια του DNeasy έχει αναλογία Α 260 /Α 280 μεταξύ 1,7 και 1,9 και το μέγεθός του μπορεί να φτάσει στις 50kb, με τα τμήματα των 30kb να επικρατούν. Βέβαια, με αυτήν τη διαδικασία είναι δυνατόν να ανακτηθούν ακόμα και μικρά τμήματα DNA έως και 100bp.

78 Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας απομόνωσης γενωμικού DNA από ιστούς με το DNeasy kit. Schematization of the Dneasy Tissue Procedure for the isolation of genomic DNA from tissues. Κλώνοι μερικών τμημάτων των γονιδίων των PPARs απομονώθηκαν με απευθείας ενίσχυσή τους από το γενωμικό DNA της τσιπούρας και του λαβρακιού με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR). Στις αντιδράσεις αυτές χρησιμοποιήθηκε η θερμοανθεκτική DNA πολυμεράση υψηλής πιστότητας (Expand High Fidelity PCR system: Roche Applied Science). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σχεδιάστηκαν με βάση τις υψηλά συντηρημένες, εξελικτικά, περιοχές των PPARs από άλλα φύλα ή/και από τo φασί του Ατλαντικού (Pleuronectes platessa). Όλα τα απομονωμένα τμήματα των γονιδίων των PPARs κλωνοποιήθηκαν στο πλασμίδιο ppcr Script vector (PCR-Script TM Amp kit, Stratagene) και μετασχηματίστηκαν στο στέλεχος XL-10 GOLD του E.coli. Μετά την εξαγωγή τους από τα βακτηριακά κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε υγρό

79 θρεπτικό υλικό, έγινε ανάλυση της αλληλουχίας των βάσεων των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων. Κλωνοποίηση Η κλωνοποίηση όλων των ενισχυμένων με PCR τμημάτων των γονιδίων και των cdnas των PPARs, όπως προαναφέρθηκε, πραγματοποιήθηκε με το PCR-Script TM Amp kit της εταιρίας Stratagene. Το συγκεκριμένο kit επιτρέπει την κλωνοποίηση ενισχυμένων με PCR τμημάτων DNA, σε χρονικό διάστημα μιας ώρας. Τα αποτελέσματα της κλωνοποίησης PCR τμημάτων είναι πολύ ικανοποιητικά και με πολύ χαμηλό ποσοστό ψευδώς θετικών αποικιών. Η αντίδραση της κλωνοποίησης περιλαμβάνει το προϊόν της PCR που επωάζεται με το φορέα ppcr-script TM Amp SK(+), ο οποίος έχει ήδη υποστεί πέψη με την ενδονουκλεάση περιορισμού Srf1 και την Τ4 DNA λιγάση. Η προσθήκη της ενδονουκλεάσης περιορισμού στην αντίδρασης της λιγάσης, έχει σαν αποτέλεσμα τη διατήρηση μιας σταθερής, σε υψηλά επίπεδα, συγκέντρωσης του ενζυμικά επεξεργασμένου φορέα και επιτρέπει τη χρησιμοποίηση των μη φωσφορυλιωμένων και τροποποιημένων εκκινητών. Το Srf1 είναι ένα ένζυμο περιορισμού, το οποίο αναγνωρίζει τη σπάνια αλληλουχία 5 -GCCC GGGC-3. Χάρτης του συγκεκριμένου πλασμιδίου δίδεται στο τέλος του κεφαλαίου αυτού. Σχηματική απεικόνιση της μεθόδου κλωνοποίησης PCR-Script TM Amp. Το απομονωμένο PCR τμήμα του DNA, προστίθεται στην αντίδραση της λιγάσης μαζί με τον ήδη επεξεργασμένο ενζυμικά, με την ενδονουκλεάση περιρισμού Srf1, φορέα. Στην αντίδραση εκτός από την Τ4 DNA λιγάση προστίθεται και μια ποσότητα της ενδονουκλεάσης περιορισμού Srf1. Schematization of the PCR-Script TM Amp cloning method. The PCR product is added to the ligation reaction containing the Srf1-digested ppcr-script Amp SK(+) cloning vector. In the reaction besides the T4 DNA ligase an amount of the Srf1enzyme is added too.

80 Απομόνωση των ανασυνδυσμένων πλασμιδίων Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια με τις ακολουθίες των PPARs, απομονώθηκαν από τις υγρές καλλιέργειες των βακτηρίων E.coli με τη βοήθεια των kits της QIAGEN, Mini και Midi prep. Η διαδικασία απομόνωσης των πλασμιδίων, σύμφωνα με τους κατασκευαστές της συγκεκριμένης εταιρίας, βασίζεται στη λύση των βακτηριακών κυττάρων με αλκαλικές ουσίες και την πρόσδεση του πλασμιδιακού DNA στις ειδικές μεμβράνες παρουσία ρυθμιστικών διαλυμάτων με υψηλή συγκέντρωση άλατος Γενωμικοί κλώνοι των PPARs της τσιπούρας α) PPARα Χρησιμοποιώντας ως μήτρα το γενωμικό DNA της τσιπούρας, ενισχύθηκε με αντίδραση PCR τμήμα του γονιδίου του PPARα. Το τμήμα αυτό του γονιδίου περιλάμβανε το εξώνιο του δεύτερου δάκτυλου ψευδαργύρου της DBD περιοχής, έως και το τελευταίο εξώνιο της LBD περιοχής. Στην αντίδραση της PCR χρησιμοποιήθηκε το ζευγάρι των εκκινητών : 5 -CCA AAA GAA GAA CCG CAA CAA G-3 (az2f) και 5 -TTG CAG GAG CGG GTG CAA CGA CG-3 (albdr) β)PPARα2 Η LBD περιοχή του PPARα2 από τη τσιπούρα απομονώθηκε με απευθείας ενίσχυσή της από το γενωμικό DNA, με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR). Στις αντιδράσεις αυτές χρησιμοποιήθηκε η θερμοανθεκτική DNA πολυμεράση υψηλής πιστότητας Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (FINNZYMES). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν, σχεδιάστηκαν βάση των αλληλουχιών των γονιδίων του PPARα2 από άλλα είδη ψαριών, όπως το λαβράκι (emb.aj880087), το Tetraodon nigroviridis (emb.scaf13731) και το Fugu rubripes (fr και fr074673). Οι ακολουθίες των συγκεκριμένων εκκινητών είναι: 5 -GCT CAG (AC)(AG)G GAA C(AG)C TGA AGG ACA G-3 (a2e1f) 5 -CTG CAT TCG CTC GAT GTG CGC CAC ATT C-3 (ae3rsa2)

81 2.2.1.γ)PPARβ Με παρόμοιο τρόπο ενισχύθηκε με αντίδραση PCR από το γενωμικό DNA της τσιπούρας, το γονίδιο του υποδοχέα PPARβ. Συγκεκριμένα ενισχύθηκε το τμήμα του γονιδίου από την Α/Β περιοχή έως την LBD περιοχή του, με τη βοήθεια των εκκινητών: 5 -ATG GAA TGG TTT CAG GAA ACT G-3 (babf-sa) και 5 -CTA ATA CAT GTC TTT GTA GAT CTC CTG-3 (be3r) (υπογραμμισμένα είναι τα κωδικόνια έναρξης και λήξης) δ)PPARγ Επίσης με απευθείας ενίσχυση από το γενωμικό DNA της τσιπούρας, απομονώθηκαν με PCR τμήματα του γονιδίου του PPARγ. Συγκεκριμένα το πρώτο εξώνιο του γονιδίου του υποδοχέα, δηλαδή η Α/Β περιοχή του απομονώθηκε χρησιμοποιώντας τους εκκινητές : 5 -GTC GAC ATG GTG GAC AC-3 (gabf) και 5 -TGT AAT CCA TGT TCG TCA GG-3 (gabr) Παρόμοια, το δεύτερο εξώνιο της DBD περιοχής (ο δεύτερος δάκτυλος ψευδαργύρου), ενισχύθηκε με τη βοήθεια του ζευγαριού των εκκινητών: 5 -GCT GCA AGG GTT TCT TCA G (gz2f) και 5 -CGT TGT GTG ACA TGC CG-3 (gz2r) Ακόμη για την απομόνωση του ιντρονίου που συνδέει το πρώτο εξώνιο, Α/Β περιοχή, και το δεύτερο (πρώτος δάκτυλος ψευδαργύρου) χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές: 5 -CAC TCC CTT GAC ATG AAG C-3 (gabf2) και 5 -CGT ATC GTC CTG GTG CTT GGA G-3 (gz1r2) Τέλος επιτεύχθηκε η ενίσχυση όλης της LBD περιοχής του γονιδίου του υποδοχέα PPARγ με τη χρησιμοποίηση των εκκινητών : 5 -GGG AGC AGT TTA TTA ATT GCA AGC AGC-3 (glbde1f) και 5 -AAT CTC CGT CTT CTT CAG CAG CTG GAT G-3 (glbde3rsa).

82 A/B Zn1 Zn2 D E1 E2 PPARα az2f albdr PPARα2 a2e1f ae3rsa2 PPARβ babfsa be3r PPARγ gabf gabr gz2f gz2r gabf2 gz1r2 glbde1f glbde3rsa Σχηματική απεικόνιση των γονιδίων των υποδοχέων PPAR και των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυσή τους από την τσιπούρα, Sparus aurata. Diagrammatic representation of the PPAR genes and the primers that were used for their amplification from sea bream, Sparus aurata.

83 Γενωμικοί κλώνοι των PPARs του λαβρακιού α) PPARα Όπως και με την τσιπούρα, χρησιμοποιώντας ως μήτρα το γενωμικό DNA του λαβρακιού ενισχύθηκε με PCR τμήμα του γονιδίου του PPARα και συγκεκριμένα από το δεύτερο εξώνιο της DBD περιοχής (δεύτερος δάκτυλος ψευδαργύρου) μέχρι το τελευταίο εξώνιο της LBD περιοχής. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην αντίδραση της PCR ήταν οι ίδιοι που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του αντίστοιχου τμήματος του γονιδίου από τον PPARα της τσιπούρας: 5 -CCA AAA GAA GAA CCG CAA CAA G-3 (az2f) και 5 -TTG CAG GAG CCG GTG CAA CGA CG-3 (albdr) β)PPARβ Με απευθείας ενίσχυση πάνω στο γενωμικό DNA του λαβρακιού, απομονώθηκε το γονίδιο του υποδοχέα PPARβ, από την Α/Β περιοχή μέχρι το τελευταίο εξώνιο της LBD περιοχής του, με τη βοήθεια του ζευγαριού των εκκινητών: 5 -ATG GAA GGG TTT CAA CAA ACT G-3 (babf-dl) και 5 -CTA ATA CAT GTC TTT GTA GAT CTC CTG-3 (be3r) (υπογραμμισμένα είναι τα κωδικόνια έναρξης και λήξης) γ)PPARγ Με παρόμοιο τρόπο ενισχύθηκαν από το γενωμικό DNA τμήματα του PPARγ του λαβρακιού. Συγκεκριμένα απομονώθηκε το εξώνιο που κωδικοποιεί την Α/Β περιοχή του με τη χρησιμοποίηση των παρακάτω εκκινητών στην αντίδραση της PCR: 5 -GTC GAC ATG GTG GAC AC-3 (gabf) και 5 -TGT AAT CCA TGT TCG TCA GG-3 (gabr) Επιπλέον ενισχύθηκε το πρώτο εξώνιο της DBD περιοχής του (πρώτος δάκτυλος ψευδαργύρου) με τους εκκινητές : 5 -TTC AAT CAA GAT GGA GCC-3 (gz1f) και 5 -TCA CAG GCA TGG ACG CC-3 (gz1r) Επίσης, με τη χρησιμοποίηση του παρακάτω ζευγαριού των εκκινητών στην αντίδραση της PCR απομονώθηκε από το γενωμικό DNA και το δεύτερο εξώνιο της DBD περιοχής του (δεύτερος δάκτυλος ψευδαργύρου).

84 5 -GCT GCA AGG GTT TCT TCA G-3 (gz2f) και 5 -CGT TGT GTG ACA TGC CG-3 (gz2r) Η ενίσχυση του ιντρονίου που διαχωρίζει το εξώνιο της Α/Β περιοχής, με το εξώνιο που κωδικοποιεί τον πρώτο δάκτυλο ψευδαργύρου πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια των εκκινητών : 5 -CAC TCC CTT GAC ATG AAG C-3 (gabf2) και 5 -CGT ATC GTC CTG GTG CTT GGA G-3 (gz1r2) Τέλος, ενισχύθηκε το ιντρόνιο που διαχωρίζει τα δυο πρώτα εξώνια της LBD περιοχής του PPARγ του λαβρακιού με τους εκκινητές : 5 -GGG AGC AGT TTA TTA ATT GCA AGC AGC-3 (glbde1f) και 5 -GAA ACG CAG CTC CAC AGC GTC C-3 (glbde1r). A/B Zn1 Zn2 D E1 E2 PPARα az2f albdr PPARβ babfdl be3r PPARγ gabf gabr gz1fgz1r gz2f gz2r gabf2 gz1r2 glbde1f glbde 1R Σχηματική απεικόνιση των γονιδίων των υποδοχέων PPAR και των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυσή τους από το λαβράκι, D.labrax. Diagrammatic representation of the PPAR genes and the primers that were used for their amplification from sea bass, D.labrax.

85 Τύπος Ονομασία Αλληλουχία εκκινητών Περιοχή του PPAR εκκινητών υποδοχέα α az2f 5 -CCA AAA GAA GAA CCG CAA CAA G-3 C α albdr 5 -TTG CAG GAG CCG GTG CAA CGA CG-3 LBD β babfsa 5 -ATG GAA TGG TTT CAG GAA ACT G-3 A/B β babfdl 5 -ATG GAA GGG TTT CAA CAA ACT G-3 A/B β be3r 5 -CTA ATA CAT GTC TTT GTA GAT CTC CTG-3 LBD γ gabf 5 -GTC GAC ATG GTG GAC AC-3 A/B γ gabf2 5 -CAC TCC CTT GAC ATG AAG C-3 A/B γ gabr 5 -TGT AAT CCA TGT TCG TCA GG-3 A/B γ gz1f 5 -TTC AAT CAA GAT GGA GCC-3 C γ gz1r 5 -TCA CAG GCA TGG ACG CC-3 C γ gz1r2 5 -CGT ATC GTC CTG GTG CTT GGA G-3 C γ gz2f 5 -GCT GCA AGG GTT TCT TCA G-3 C γ gz2r 5 -CGT TGT GTG ACA TGC CG-3 C γ glbde1f 5 -GGG AGC AGT TTA TTA ATT GCA AGC AGC-3 LBD γ glbde1r 5 -GAA ACG CAG CTC CAC AGC GTC C-3 LBD γ glbde3rsa 5 -AAT CTC CGT CTT CTT CAG CAG CTG GAT G-3 LBD α2 a2e1f 5 -GCT CAG (AC)(AG)G GAA C(AG)C TGA AGG ACA G-3 LBD α2 ae3rsa2 5 -CTG CAT TCG CTC GAT GTG CGC CAC ATT C-3 LBD Πίνακας των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση των γονιδίων PPAR από την τσιπούρα και το λαβράκι. (ονόματα, αλληλουχία και περιοχή του υποδοχέα στην οποία σχεδιάστηκαν). List of the primers that were used for the amplification of PPARs genes from sea bream and sea bass (names, sequences and the PPAR region that they were designed upon).

86 2.3. Απομόνωση των cdna κλώνων των PPARs από τα ψάρια Δημιουργήθηκε το συμπληρωματικό DNA (cdna) από την τσιπούρα και το λαβράκι μετά από την απομόνωση ολικού RNA από το ήπαρ των δύο ειδών ψαριών. Η απομόνωση του ολικού RNA έγινε με τη βοήθεια του RNeasy Mini kit (QIAGEN). RNeasy Mini kit (QIAGEN) Η διαδικασία RNeasy αντιπροσωπεύει μια καινούρια τεχνολογία απομόνωσης RNA η οποία συνδυάζει την ικανότητα πρόσδεσης του μορίου στην ειδική μεμβράνη πυριτίου (silica-gel-membrane) και στη χρησιμοποίηση της μικροφυγοκέντρου. Χρήση συγκεκριμένων ρυθμιστικών διαλυμάτων υψηλής αλατότητας επιτρέπει τη δέσμευση στις μεμβράνες μέχρι και 100μg τμημάτων RNA, μεγαλύτερων από 200b. Τα δείγματα των ιστών αρχικά λύονται και ομογενοποιούνται με διάλυμα υψηλής ικανότητας αποδιάταξης, που περιέχει ισοκυανιούχο γουανιδίνη (GITC), το οποίο αναστέλλει τη δράση των RNases, ώστε να παραμείνει άθικτο το RNA. Στη συνέχεια προστίθεται η αιθανόλη για να παρέχει τις κατάλληλες συνθήκες πρόσδεσης του ολικού RNA στη μεμβράνη, ενώ όλες οι υπόλοιπες ουσίες απομακρύνονται κατά το στάδιο του πλυσίματος της μεμβράνης. Η διαδικασία του RNeasy Mini kit οδηγεί στην απομόνωση όλων των μορίων RNA που είναι μεγαλύτερα σε μέγεθος από 200 νουκλεοτίδια. Τα μικρά μόρια RNA όπως τα 5.8S RNA, 5SRNA και trnas, μεγέθους περίπου 160, 120 και νουκλεοτιδίων αντίστοιχα, δε δεσμεύονται κατά το μεγαλύτερο ποσοστό στη μεμβράνη κάτω από τις συνθήκες που χρησιμοποιείται. Η αρχή της πειραματικής διαδικασίας που ακολουθείται είναι παρόμοια με αυτήν του DNeasy kit

87 cdna κλώνοι των PPARs της τσιπούρας Το ολικό RNA από το ήπαρ της τσιπούρας υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή με τη βοήθεια της αντίστροφης μεταγραφάσης (Expand Reverse Transcriptase:Roche Applied Science). Το cdna που προέκυψε χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για την ενίσχυση των 3 και 5 αμετάφραστων άκρων των υποδοχέων PPAR. Η ενίσχυσή τους πραγματοποιήθηκε είτε με το SMART RACE kit (Clonetech), είτε με το 5 /3 RACE kit (Roche). Οι ακολουθίες των εξειδικευμένων εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για κάθε τύπο PPAR στηρίχθηκαν στην αλληλουχία των αντίστοιχων απομονωμένων γενωμικών κλώνων. Η ενίσχυση ολόκληρων των κωδικοποιημένων περιοχών των τριών τύπων PPAR της τσιπούρας πραγματοποιήθηκε επίσης με RT-PCR (Expand Reverse Transcriptase, Roche) σε ολικό RNA από ήπαρ. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν και στις συγκεκριμένες αντιδράσεις PCR, σχεδιάστηκαν με βάση στις ακολουθίες των γενωμικών κλώνων και επιπλέον περιελάμβαναν τα κωδικόνια έναρξης και λήξης των υποδοχέων. Όλες οι ενισχυμένες ακολουθίες των cdnas των PPARs κλωνοποιήθηκαν στο πλασμίδιο ppcr Script vector (Stratagene) και έγινε η ανάλυση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων τους α) PPARα Το 5 αμετάφραστο άκρο του PPARα της τσιπούρας ενισχύθηκε με RACE PCR, χρησιμοποιώντας τον εκκινητή: 5 -GCC ACC TCT TTC TCC ACC A-3 (adr2), ο οποίος σχεδιάστηκε με βάση την ακολουθία της D περιοχής του υποδοχέα. Το 3 αμετάφραστο άκρο του υποδοχέα απομονώθηκε με τη βοήθεια του εκκινητή: 5 -GAG CAT TGT GCA GGT GCT ACA G-3 (ae3f), του οποίου η ακολουθία εντοπίζεται στο τρίτο εξώνιο της LBD περιοχής του PPARα. Η ενίσχυση ολόκληρης της κωδικοποιούμενης περιοχής του PPARα επιτεύχθηκε με PCR, χρησιμοποιώντας ως μήτρα το cdna της τσιπούρας και το ζευγάρι των εκκινητών (υπογραμμισμένα είναι τα κωδικόνια λήξης και έναρξης): 5 -CAT TCC ATG TCT GCC TTG ATC-3 (a1f2sa) και 5 -TCA GTA CAT GTC CCT GTA GAT TTC TTG C-3 (TaR1)

88 2.3.1.β) PPARβ Παρόμοια, ενισχύθηκε το 5 αμετάφραστο άκρο του PPARβ της τσιπούρας χρησιμοποιώντας τον εκκινητή: 5 -CGG CCC TCT TCT TGG TCA T-3 (bdr), ο οποίος είναι σχεδιασμένος βάση της αλληλουχίας της D περιοχής του υποδοχέα. Η απομόνωση της κωδικοποιούμενης περιοχής του PPARβ επιτεύχθηκε με PCR στο cdna της τσιπούρας, με τη βοήθεια των εκκινητών (υπογραμμισμένα είναι τα κωδικόνια λήξης και έναρξης): 5 -ATG GAA TGG TTT CAG GAA ACT G-3 (babfsa) και 5 -CTA ATA CAT GTC TTT GTA GAT CTC CTG-3 (be3r) γ) PPARγ Το 5 αμετάφραστο άκρο του PPARγ της τσιπούρας ενισχύθηκε, χρησιμοποιώντας την ίδια μεθοδολογία που εφαρμόστηκε και στους άλλους δυο τύπους PPAR, με τη βοήθεια του εκκινητή: 5 -CGA CAG TGA AGA TCA CAG TGA TC-3 (gz2r3), που σχεδιάστηκε με βάση της αλληλουχίας του δεύτερου δακτύλου ψευδαργύρου της DBD περιοχής του υποδοχέα. Η κωδικοποιούμενη περιοχή του PPARγ από την τσιπούρα ενισχύθηκε επίσης από το cdna, χρησιμοποιώντας το ακόλουθο ζευγάρι των εκκινητών (υπογραμμισμένα είναι τα κωδικόνια λήξης και έναρξης): 5 -GTC GAC ATG GTG GAC AC-3 (gabf) και 5 -TAC TCT TGT TAA AGG CTA ATA CAA GTC-3 (gsa3 R) δ) PPARα2 Το ολικό RNA από το ήπαρ της τσιπούρας μεταγράφηκε αντίστροφα με τη βοήθεια της αντίστροφης μεταγραφάσης Expand Reverse Transcriptase (Applied Science Roche). Το παραγόμενο cdna χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για την ενίσχυση της κωδικοποιούμενης περιοχής του PPARα2 με αντιδράσεις PCR. Στις αντιδράσεις αυτές χρησιμοποιήθηκε η θερμοανθεκτική DNA πολυμεράση υψηλής πιστότητας Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (FINNZYMES) και το ζευγάρι των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκε ήταν (υπογραμμισμένο είναι το κωδικόνιο έναρξης): 5 -CAT TCC ATG TCT GCC TTG ATC-3 (a1f2sa) και 5 -CTG CAT TCG CTC GAT GTG CGC CAC ATT C-3 (ae3rsa2)

89 Α/Β C D LBD PPARα α1f2 αdr2 TαR1 PPARα2 α1f2 ae3rsa2 PPARβ babf-sa be3r bdr PPARβ gabf gz2r3 glbdf2 gsa3 R Σχηματική απεικόνιση της θέσης των εκκινητών, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση των cdna κλώνων των PPARs της τσιπούρας. Diagrammatic representation of the location of the primers that were used for the isolation of the three PPAR subtypes cdnas in sea bream.

90 cdna κλώνοι των PPARs από το λαβράκι Παρόμοια με την τσιπούρα, το ολικό RNA που απομονώθηκε από το ήπαρ του λαβρακιού μεταγράφηκε αντίστροφα με την αντίστροφη μεταγραφάση (Expand Reverse Transcriptase, Roche). Το cdna που προέκυψε, χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για RACE PCR (χρησιμοποιώντας την ίδια μεθοδολογία με αυτή που χρησιμοποιήθηκε στην τσιπούρα), ώστε να ενισχυθούν τα 5 αμετάφραστα άκρα των υποδοχέων PPAR α και β. Η απομόνωση ολόκληρων των κωδικοποιημένων ακολουθιών των τριών ισομορφών PPAR πραγματοποιήθηκε επίσης με RT-PCR (Expand Reverse Transcriptase; Roche) σε ολικό RNA από ήπαρ του λαβρακιού. Όλοι οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σχεδιάστηκαν με βάση τις αλληλουχίες των αντίστοιχων γενωμικών κλώνων των PPARs του λαβρακιού. Όλες οι ακολουθίες των cdnas των PPARs που ενισχύθηκαν, κλωνοποιήθηκαν στο πλασμίδιο ppcr Script vector (Stratagene) και ακολούθησε η ανάλυση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων τους α) PPARα Με RACE PCR ενισχύθηκε το 5 αμετάφραστο άκρο του PPARα, χρησιμοποιώντας τον ίδιο εκκινητή που χρησιμοποιήθηκε και στη τσιπούρα: 5 -GCC ACC TCT TTC TCC ACC A-3 (adr2). Τμήμα της κωδικοποιούμενης περιοχής του PPARα του λαβρακιού ενισχύθηκε από το cdna με τη βοήθεια των εκκινητών (υπογραμμισμένο είναι το κωδικόνιο λήξης): 5 -ACG CGG GTG GTA TTT ATC TTC T-3 (aabfdl) και 5 -TCA GTA CAT GTC CCT GTA GAT TTC TTG C-3 (TaR1) β) PPARβ Με παρόμοιο τρόπο ενισχύθηκε το 5 αμετάφραστο άκρο του PPARβ, με τη βοήθεια και σε αυτήν την περίπτωση του ίδιου εκκινητή που είχε χρησιμοποιηθεί και στην τσιπούρα: 5 -CGG CCC TCT TCT TGG TCA T-3 (bdr). Η κωδικοποιούμενη περιοχή του ενισχύθηκε με το ζευγάρι των εκκινητών (υπογραμμισμένα είναι τα κωδικόνια λήξης και έναρξης): 5 -ATG GAA GGG TTT CAA CAA ACT G-3 (babfdl) και 5 -CTA ATA CAT GTC TTT GTA GAT CTC CTG-3 (be3r).

91 2.3.2.γ) PPARγ Η ενίσχυση της κωδικοποιούμενης περιοχής του PPARγ του λαβρακιού πραγματοποιήθηκε με την ίδια μεθοδολογία, χρησιμοποιώντας τους εκκινητές (υπογραμμισμένα είναι τα κωδικόνια έναρξης και λήξης): 5 -GTC GAC ATG GTG GAC AC-3 (gabf) και 5 -CTA ATA CAA GTC TTT CAT GAT CTC-3 (g3 R). Α/Β C D LBD PPARα αabdl αdr2 TαR1 PPARβ babf-dl be3r bdr PPARβ gabf g3 R Σχηματική απεικόνιση της θέσης των εκκινητών, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση των cdna κλώνων των PPAR στο λαβράκι. Diagrammatic representation of the location of the primers that were used for the isolation of the three PPAR subtypes cdnas in sea bass.

92 cdna κλώνοι των PPARs από το Hippoglossus hippoglossus Επιτεύχθηκε η απομόνωση των κωδικοποιημένων ακολουθιών των τριών ισομορφών των υποδοχέων PPAR από ένα ακόμη είδος καλλιεργούμενου ψαριού, της ιππόγλωσσας (Hippoglossus hippoglossus). Ιστός (ήπαρ) του συγκεκριμένου είδους προήλθε από ψάρια των ιχθυοκαλλιεργειών της Νορβηγίας. Αφού απομονώθηκε ολικό RNA από το ήπαρ, με RT-PCR (Expand Reverse Transcriptase; Roche) ενισχύθηκαν οι cdna κλώνοι των PPARs. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν βασισμένοι στις αντίστοιχες ακολουθίες από το φασί του Ατλαντικού (P.platessa) και την τσιπούρα (S.aurata) (Leaver et al., 2005). Στις αντιδράσεις PCR χρησιμοποιήθηκε η υψηλής πιστότητας DNA πολυμεράση Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (FINNZYMES). Οι cdna αλληλουχίες που ενισχύθηκαν, κλωνοποιήθηκαν στο πλασμίδιο pcr Script vector (Stratagene) και αναλύθηκαν οι αλληλουχίες των νουκλεοτιδίων τους. Η ενίσχυση του PPARα πραγματοποιήθηκε με τους εκκινητές : 5 -ATG GCA GGG GAC CTC TAC AG-3 (aabf) και 5 -TCA GTA CAT GTC TCT GTA GAT TTC TTG CAA GAG CGG GTG CAG -3 (TaR1+LBDR). Η ενίσχυση του PPARβ πραγματοποιήθηκε με το ζευγάρι των εκκινητών : 5 -ATG GAA GGG GTT CAG CCT AC-3 (babf) και 5 -CTA ATA CAT GTC TTT GTA GAT CTC CTG-3 (be3r). Τέλος η ενίσχυση του PPARγ (χωρίς να είναι ολόκληρο το 3 άκρο του υποδοχέα) επιτεύχθηκε με τη χρήση των εκκινητών: 5 -ATG GTG GAC ACC CAG CAG CTC C-3 (gabf3) και 5 -AAT CTC CGT CTT CTT CAG CAG CTG GAT G-3 (glbde3rsa). (υπογραμμισμένα είναι τα κωδικόνια έναρξης και λήξης)

93 Τύπος Ονομασία Αλληλουχία εκκινητών Περιοχή ενίσχυσης PPAR εκκινητών του υποδοχέα α adr2 5 -GCC ACC TCT TTC TCC ACC A-3 5 αμεταφρ. άκρο α ae3f 5 -GAG CAT TGT GCA GGT GCT ACA G-3 3 αμεταφρ. άκρο β bdr 5 -CGG CCC TCT TCT TGG TCA T-3 5 αμεταφρ. άκρο γ gz2r3 5 -CGA CAG TGA AGA TCA CAG TGA TC- 3 α a1f2sa 5 -CAT TCC ATG TCT GCC TTG ATC-3 cdna α aabfdl 5 -ACG CGG GTG GTA TTT ATC TTC T-3 cdna α aabf 5 -ATG GCA GGG GAC CTC TAC AG-3 cdna α TaR1 5 -TCA GTA CAT GTC CCT GTA GAT TTC TTG C-3 α TaR1+LBDR 5 TCA GTA CAT GTC TCT GTA GAT TTC TTG CAA GAG CGG GTG CAG-3 5 αμεταφρ. άκρο cdna cdna β babfsa 5 -ATG GAA TGG TTT CAG GAA ACT G-3 cdna β babfdl 5 -ATG GAA GGG TTT CAA CAA ACT G-3 cdna β babf 5 -ATG GAA GGG GTT CAG CCT AC-3 cdna β be3r 5 -CTA ATA CAT GTC TTT GTA GAT CTC cdna CTG-3 γ gabf 5 -GTC GAC ATG GTG GAC AC-3 cdna γ gabf3 5 -ATG GTG GAC ACC CAG CAG CTC C-3 cdna γ gsa3 R 5 -TAC TCT TGT TAA AGG CTA ATA CAA cdna GTC-3 γ g3 R 5 -CTA ATA CAA GTC TTT CAT GAT CTC- 3 γ glbde3rsa 5 -AAT CTC CGT CTT CTT CAG CAG CTG GAT G-3 α2 a2e1f 5 -GCT CAG (AC)(AG)G GAA C(AG)C TGA AGG ACA G-3 α2 ae3rsa2 5 -CTG CAT TCG CTC GAT GTG CGC CAC ATT C-3 cdna cdna cdna cdna Πίνακας των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση των cdna κλώνων των PPARs από την τσιπούρα, το λαβράκι και την ιππόγλωσσα. (ονόματα, αλληλουχία και για την ενίσχυση ποιας περιοχής του υποδοχέα σχεδιάστηκαν). List of the primers that were used for the amplification of PPARs cdnas from sea bream, sea bass and halibut (names, sequences and the PPAR region that they were designed upon).

94 2.4. Μελέτη προτύπου ιστοειδικής έκφρασης των PPARs της τσιπούρας και του λαβρακιού RNase protection kit Η αρχή της συγκεκριμένης μεθόδου στηρίζεται στον υβριδισμό του ραδιενεργά σημασμένου ανιχνευτή με αντίθετο προσανατολισμό (antisense), και του απομονωμένου RNA που εξετάζεται. Εφόσον υβριδιστούν οι συμπληρωματικές ακολουθίες αυτών, όλες οι μονόκλωνες ακολουθίες πέπτονται με τις ριβονουκλεάσες (RNases) Α και Τ1, ενώ παραμένουν άθικτες οι δίκλωνες περιοχές. Ο διαχωρισμός των προϊόντων αυτής της αντίδρασης σε αποδιατακτική πηκτή πολυακρυλαμίδης δείχνει το μέγεθος του «προστατευμένου» τμήματος RNA. Η μέθοδος αυτή πλεονεκτεί των άλλων, γιατί είναι πολύ πιο ευαίσθητη (μπορεί να ανιχνεύσει μέχρι και 0.1pg από το mrna), χρησιμοποιεί μονόκλωνους ανιχνευτές (οι οποίοι μπορούν να υβριδιστούν μόνο με το συμπληρωματικό κλώνο), η πέψη των υβριδίων RNA:RNA με RNAses οδηγεί σε λιγότερο ψευδή αποτελέσματα (artifacts) από τα υβρίδια RNA:DNA και τέλος λόγω του μεγέθους του ανιχνευτή που είναι κατά πολύ μικρότερος από το RNA στόχο, μειώνεται η εμφάνιση μη ειδικών ραδιενεργών σημάτων στο υπόβαθρο Μελέτη της έκφρασης των PPARs στην τσιπούρα με χρήση RNA ανιχνευτών Η μελέτη της έκφρασης του mrna των PPARs πραγματοποιήθηκε σε δέκα ιστούς της τσιπούρας με τη μέθοδο RNase protection, χρησιμοποιώντας το RNase protection kit (Roche). Ολικό RNA απομονώθηκε από το ήπαρ, τα νεφρά, το έντερο (κοντά στο τυφλό), τα βράγχια, την καρδιά, τη σπλήνα, το λευκό μυ, τον ερυθρό μυ, τον εγκέφαλο και το λιπώδη ιστό (μεσεντέριο λίπος), με τη βοήθεια του RNeasy tissue kit (QIAGEN). Οι ανιχνευτές που χρησιμοποιήθηκαν αποτελούσαν τη D περιοχή του κάθε τύπου PPAR. Οι αλληλουχίες τους ενισχύθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας ως μήτρα τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια ppcr Script με τα cdnas των PPARs. Για τον PPARα ενισχύθηκε ένα τμήμα του cdna 152bp (nt του cdna) με τους εκκινητές 5 -TTG GAT CCG CCA TTC GGT TTG GTC-3 και 5 -AGA ATT CGC TGA AGT

95 TCT TCA T-3. Τμήμα 177bp (nt του cdna) του PPARβ ενισχύθηκε με τη βοήθεια των εκκινητών 5 -TTG GAT CCG CGA TCC GAT ACG GAC-3 και 5 - AGA ATT CGA TGC TGC GGG CCC T-3. Τέλος με τους εκκινητές 5 -TTG GAT CCG CTA TTC GTT TTG G-3 και 5 -AGA ATT CCG CGT TAT CTC CGG T-3 ενισχύθηκαν 202bp (nt του cdna) του PPARγ. Για την εύκολη κλωνοποίηση των συγκεκριμένων προϊόντων PCR στο φορέα pbluescript KS vector (Stratagene) (βλέπε χάρτη του πλασμιδίου στο τέλος αυτής της ενότητας), όλοι οι upstream εκκινητές περιείχαν το σημείο αναγνώρισης από την περιοριστική ενδονουκλεάση BamHI, ενώ όλοι οι downstream εκκινητές περιείχαν την ακολουθία αναγνώρισης από την περιοριστική ενδονουκλεάση EcoRI. (οι θέσεις αναγνώρισης από τα ένζυμα περιορισμού είναι υπογραμμισμένα στην ακολουθία κάθε εκκινητή). Οι αντίθετου προσανατολισμού RNA ανιχνευτές των PPARs μεταγράφηκαν με τη βοήθεια της Τ3 RNA πολυμεράσης (Promega), μετά από την πέψη των πλασμιδίων με την ενδονουκλεάση περιορισμού BamHI. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε η β-ακτίνη. Ένα τμήμα 203 ζευγών βάσεων από το cdna της (nt Genbank AY148350), ενισχύθηκε με RT-PCR από ολικό RNA από το ήπαρ της τσιπούρας με τη βοήθεια των εκκινητών 5 -GAC CAA CTG GGA TGA CAT GG-3 και 5 -GCA TAC AGG GAC AGC ACA GC-3 και κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο pcr Script vector (Stratagene). Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο με το cdna της β-ακτίνης υπέστη πέψη με το ένζυμο περιορισμού NotI και ο αντίθετου προσανατολισμού RNA ανιχνευτής σχηματίστηκε μετά από τη μεταγραφή με τη Τ7 RNA πολυμεράση (Promega) του επεξεργασμένου ενζυμικά πλασμιδίου. Όλοι οι ριβονουκλεοανιχνευτές σημάνθηκαν ραδιενεργά με [α- 32 Ρ]CTP (800 Ci/mmol, Amersham Biotech) και η ειδική τους δραστικότητα υπολογίστηκε με βάση το εγχειρίδιο του RNase protection kit (QIAGEN). Από κάθε ιστό 8μg ολικού RNA υβριδοποιήθηκαν ταυτόχρονα και με τους τρεις εξειδικευμένους ανιχνευτές, των τριών τύπων PPAR, (περίπου 3fmoles από τον καθένα), πριν από την έκθεση του στις RNases. Για την έκφραση της β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκαν 5μg ολικού RNA και περίπου cpm του ριβονουκλεοανιχνευτή. Τα «προστατευμένα», δίκλωνα RNA διαχωρίστηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμίδης 6%, που περιείχε και 7Μ ουρίας.

96 Μελέτη της έκφρασης των PPARs στο λαβράκι με χρήση RNA ανιχνευτών Η μελέτη της έκφρασης του mrna των PPARs πραγματοποιήθηκε με τη ίδια μέθοδο και στο λαβράκι, δηλαδή τη RNase protection, χρησιμοποιώντας το RNase protection kit (Roche), στους ίδιους ιστούς. Για τη σύνθεση ειδικού RNA ανιχνευτή για κάθε τύπο PPAR, το ίδιο τμήμα του υποδοχέα που κωδικοποιεί την περιοχή D, ενισχύθηκε με PCR. Έτσι για τον PPARα χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές 5 -TTG GAT CCG CCA TTC GGT TTG GTC-3 και 5 -AGA ATT CCT TGC TTG TCT TTC C-3 για την ενίσχυση ενός τμήματος 197 ζεύγη βάσεων ( νουκλεοτίδια από το cdna). Για τον PPARβ, οι εκκινητές 5 -TTG GAT CCG CGA TCC GAT ACG GAC-3 και 5 -AGA ATT CGA TGC TGC GGG CCC T-3 χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του αντίστοιχου τμήματος με μέγεθος 175 ζεύγη βάσεων ( νουκλεοτίδια από το cdna). Τέλος για τον PPARγ, 201 ζεύγη βάσεων ( νουκλεοτίδια από το cdna), ενισχύθηκαν με το ζευγάρι των εκκινητών 5 -TTG GAT CCG CTA TTC GTT TTG G-3 και 5 -AGA ATT CCG CGT TAT CTC CGG T-3. Για την κλωνοποίηση και των παραπάνω PCR προϊόντων από το λαβράκι στο φορέα pbluescript KS vector (Stratagene), όλοι οι upstream εκκινητές περιείχαν το σημείο αναγνώρισης από την περιοριστική ενδονουκλεάση BamHI, ενώ όλοι οι downstream εκκινητές περιείχαν την ακολουθία αναγνώρισης από την περιοριστική ενδονουκλεάση EcoRI (οι θέσεις αναγνώρισης από τα ένζυμα περιορισμού είναι υπογραμμισμένες στην ακολουθία κάθε εκκινητή). Οι αντίθετου προσανατολισμού RNA ανιχνευτές των PPARs του λαβρακιού, μεταγράφηκαν και αυτοί με τη βοήθεια της Τ3 RNA πολυμεράσης (Promega), μετά από την πέψη των πλασμιδίων με την ενδονουκλεάση περιορισμού BamHI. Η β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας και στη μελέτη του προτύπου ιστοειδικής έκφρασης των PPARs του λαβρακιού. Ένα τμήμα 203 ζευγών βάσεων από το cdna της (nt Genbank AY148350), ενισχύθηκε με RT-PCR από ολικό RNA ήπατος του λαβρακιού με τη βοήθεια των ίδιων εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν και στην τσιπούρα και το οποίο κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο pcr Script vector (Stratagene). Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο με το cdna της β-ακτίνης υπέστη την ίδια διαδικασία, ώστε να ετοιμαστεί ο αντίθετου προσανατολισμού RNA ανιχνευτής.

97 Όλοι οι ριβονουκλεοανιχνευτές επίσης σημάνθηκαν ραδιενεργά με [α- 32 Ρ]CTP (800 Ci/mmol, Amersham Biotech). Ακόμη χρησιμοποιήθηκαν οι ίδιες ποσότητες τόσο του ολικού RNA (8μg για τη μελέτη της έκφρασης των PPARs και 5μg για τη β- ακτίνη), όσο και των εξειδικευμένων ανιχνευτών (περίπου 3fmoles από τον καθένα), για τον υβριδισμό τους, πριν από την έκθεση του στις RNases. Τα «προστατευμένα», δίκλωνα RNA του λαβρακιού διαχωρίστηκαν κι αυτά σε πηκτή πολυακρυλαμίδης 6%, που περιείχε και 7Μ ουρίας Μελέτη των ιδιοτήτων της DBD περιοχής των PPARs των ψαριών με τη μέθοδο προσδιορισμού της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας των συμπλόκων DNA-πρωτεϊνών (Electrophoretic Mobility Shift Assay: EMSA) Οι πρωτεΐνες των PPARs και από τα τέσσερα είδη ψαριών (τσιπούρα, λαβράκι, φασί του Ατλαντικού και σολομό) καθώς και των υποδοχέων RXRα του ανθρώπου, RXRα από το φασί του Ατλαντικού και RXRβ του ποντικού προέκυψαν μετά από in vitro μεταγραφή και μετάφραση χρησιμοποιώντας το σύστημα TNT coupled reticulate lysate system (Promega). Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια που περιείχαν τις αλληλουχίες των PPARs από το φασί του Ατλαντικού και το σολομό καθώς και τον υποδοχέα RXRα από το φασί του Ατλαντικού, προήλθαν από τον Dr Mike Leaver (Sterling University, Institute of Aquaculture). Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια που περιείχαν τις αλληλουχίες των υποδοχέων RXRβ του ποντικού και RXRα του ανθρώπου προήλθαν από τον Dr Walter Wahli (Institut de Biologie Animale, Universite de Lausanne). TNT Coupled Reticulocyte Lysate Systems (Promega) Το ΤΝΤ σύστημα της in vitro μεταγραφής και μετάφρασης μπορεί να απλοποιήσει αυτές τις διαδικασίες και να ελαττώσει το χρόνο που απαιτείται για την απόκτηση των τελικών προϊόντων. Έτσι σε μια μόνο αντίδραση υπάρχει συζευγμένο το σύστημα μεταγραφής/μετάφρασης. Οι αντιδράσεις περιλαμβάνουν τα εξής : το προϊόν της λύσης των δικτυοκυττάρων από κουνέλι

98 το ρυθμιστικό διάλυμα ΤΝΤ, που παρέχεται από το kit μείγμα αποτελούμενο είτε από όλα τα αμινοξέα, εφόσον δε χρησιμοποιείται ραδιενεργά σημασμένη πρωτεΐνη, είτε από όλα τα αμινοξέα εκτός από τη μεθειονίνη, εφόσον προστίθεται σημασμένη με 35 S στην αντίδραση ραδιενεργά σημασμένη μεθειονίνη με 35 S (>1000Ci/mmol) αναστολείς των ριβονουκλεασών η μήτρα DNA (πιο αποτελεσματική είναι η χρήση πλασμιδίων, 1-1.2μg) RNA πολυμεράση Τ7 ή Τ3 Η 2 Ο χωρίς νουκλεάσες Τα προϊόντα της αντίδρασης εφόσον ήταν σημασμένα με ραδιενέργεια, ελέγχθηκαν μετά το διαχωρισμό τους σε πηκτή πολυακρυλαμίδης SDS PAGE (10%) με αυτοραδιογραφία. Αποκρινόμενα στοιχεία ραδιενεργά σημασμένοι ανιχνευτές Ελέγξαμε εάν οι ακολουθίες των καθιερωμένων αποκρινόμενων στοιχείων από τους προαγωγείς των γονιδίων της ακυλ-coa οξειδάσης (Tugwood et al,1992) και το z PPRE του γονιδίου Cyp4A6 (Keller et al., 1993), καθώς και οι ακολουθίες υποτιθέμενων PPREs από τον προαγωγέα του γονιδίου της GSTA1 από το φασί του Ατλαντικού (Leaver et al, 1997), αποτελούν αποκρινόμενα στοιχεία των PPARs και για τα είδη των ψαριών που μελετήθηκαν. Οι ακολουθίες των τριών υποτιθέμενων αποκρινόμενων στοιχείων των PPARs, GSTA1.1-3 εντοπίζονται στις εξής θέσεις νουκλεοτιδίων: 3713 έως 3734 (GSTA1.1), 3718 έως 3740 (GSTA1.2) και 3771 έως 3793 (GSTA1.3) σύμφωνα με την καταχώρηση στη βάση δεδομένων Genbank, με τον αριθμό X Όλες οι ακολουθίες είναι του τύπου DR-1. Προετοιμασία των ραδιενεργά σημασμένων ανιχνευτών Οι ραδιενεργά σημασμένοι ανιχνευτές σχηματίστηκαν με τον υβριδισμό των συμπληρωματικών ολιγονουκλεοτιδίων που δίδονται στον παρακάτω πίνακα.. Από το καθένα από τα συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια (π.χ. GSTA1.1 & GSTA1.2) επωάστηκαν 5μg στους 65 0 C για 5 λεπτά, παρουσία ρυθμιστικού διαλύματος (50mM

99 Tris-pH 7.5, 5mM MgCl 2, 5mM DTT, 1mMEDTA) ενώ στη συνέχεια για περίπου 30 λεπτά αφέθηκε να μειωθεί αργά η θερμοκρασία επώασής τους μέχρι τους 35 0 C, ώστε να υβριδοποιηθούν. Στη συνέχεια τα σχηματιζόμενα κολλώδη άκρα τους συμπληρώθηκαν με μείγμα των T, G και C δεοξυριβονουκλεοτιδίων και τη ραδιενεργά σημασμένη δεοξυτριφωσφορική αδενοσίνη (α-datp 32 P, Amersham) με τη βοήθεια του ενζύμου Klenow (Minotech). Οι ραδιενεργά σημασμένοι ανιχνευτές που δημιουργήθηκαν καθαρίστηκαν με μείγμα φαινόλης-χλωροφορμίου-ισοαμυλικής αλκοόλης (25:24:1) και κατακρημνίστηκαν με οξικό νάτριο και 100% αλκοόλη. Όνομα ολιγονουκλεοτιδίου ACO-BH1 ACO-BH2 GSTΑ1.1 GSTΑ1.2 GSTΑ2.1 Ακολουθία ολιγονουκλεοτιδίου 5 -GAT CGA CCA GGA CAA AGG TCA-3 5 -AGC TTG ACC TTT GTC CTG GTC-3 5 -GAT CAG TAT TGG TCA AGG GTC AAA GGT CGG-3 5 -GAT CCC GAC CTT TGA CCC TTG ACC AAT ACT-3 5 -GAT CGG TCA AGG GTC AAA GGT CAA GGT CGG-3 Όνομα αποκρινόμενου στοιχείου ACO.A GSTA1.1 GSTA1.2 GSTΑ2.2 GSTΑ3.1 GSTΑ3.2 Cyp4A6-Z.1 Cyp4A6-Z.2 5 -GAT CCC GAC CTT GAC CTT TGA CCC TTG ACC-3 5 -GAT CTT TGA GTG GTC AAG GAT CAC AGG CGG-3 5 -GAT CCC GCC TGT GAT CCT TGA CCA CTC AAA-3 5 -GAT CCC TCA ACT TTG CCC TAG TTC AGT GT-3 5 -GAT CAC ACT GAA CTA GGG CAA AGT TCA GG-3 GSTA1.3 Cyp4A6z Πίνακας με τις ακολουθίες των ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιήθηκαν στη σύνθεση των ραδιενεργά σημασμένων ανιχνευτών-αποκρινόμενων στοιχείων, που μελετήθηκαν με τη μέθοδο EMSA. List with the sequences of the oligonucleotides that were used for the synthesis of the radiolabed probes for the EMSA experiments.

100 Οι αντιδράσεις του EMSA έγιναν σύμφωνα με την εργασία του Keller (Keller et al, 1993) και περιλαμβάνουν : ρυθμιστικό διάλυμα (40mM Tris-Cl, ph-8, 160mM KCl, 4mM DTT, 20% glycerol, 0.2% Nonident P-40) μη ειδικό DNA (3.5μg) [poly (di-dc) poly (di-dc) ή DNA από θύμο αδένα βοδιού] για την αποφυγή σχηματισμού μη ειδικών συμπλόκων. τις in vitro μεταφρασμένες πρωτεΐνες (PPAR και RXR) τον ραδιενεργά σημασμένο ανιχνευτή (70.000cpm/αντίδραση) Στη μελέτη της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας των υπερσυμπλόκων που σχηματίζονται με την προσθήκη ειδικών αντισωμάτων, χρησιμοποιήθηκαν 2μl από το αντίσωμα ή τον ορό στην αντίδραση μαζί με τις in vitro μεταφρασμένες πρωτεΐνες και τον ανιχνευτή (το αντίσωμα έναντι του PPARγ δημιουργήθηκε με βάση τις αμινοξικές ακολουθίες του υποδοχέα από την τσιπούρα και το φασί του Ατλαντικού, από την ομάδα του Dr Jose Bautista: Τμήμα Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας του Πανεπιστημίου της Μαδρίτης). Για την επιβεβαίωση της εξειδίκευσης κατά το σχηματισμό των συμπλόκων (για την τσιπούρα) PPARγ/ mrxrβ/ GSTA1.2 και (για το φασί του Ατλαντικού) PPARα/ mrxrβ/aco, πραγματοποιήθηκαν πειράματα με προσθήκη «ψυχρών» μορίων ACO, GSTA1.2 και GSTA1.3, ως ανταγωνιστές σε συγκεντρώσεις 10Χ, 20Χ και 50X. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν στους 27 0 C (για λεπτά) και τα σύμπλοκα διαχωρίστηκαν με μη αποδιατακτική πηκτή πολυακρυλαμίδης 5% στους 4 0 C Μελέτη των ιδιοτήτων της LBD περιοχής των PPARs των ψαριών με τη μέθοδο αναγνώρισης των προσδετών μέσω των συνενεργοποιητών, CARLA (CoActivator - Dependent Receptor Ligand Assay) Δοκιμάστηκαν δεκατέσσερις ουσίες με τη μέθοδο CARLA (Krey et al., 1997), με σκοπό να διαπιστωθεί αν αυτές αποτελούν προσδέτες των PPARs των ψαριών. Γι αυτή τη μέθοδο έπρεπε να δημιουργηθούν ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες (fusion

101 proteins) της περιοχής LBD των PPARs των ψαριών με την πρωτεΐνη της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης και να εκφραστούν σε βακτηριακά κύτταρα Escherichia coli. Έτσι οι ακολουθίες που κωδικοποιούν τις περιοχές D και LBD των υποδοχέων PPARs των ψαριών ενισχύθηκαν με PCR και κλωνοποιήθηκαν στο φορέα-πλασμίδιο pgex-2tk vector (Amersham Biotech). Για την έκφραση των GST-PPAR ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε υψηλά επίπεδα, τα παραπάνω πλασμίδια μετασχηματίστηκαν στο στέλεχος BL21-pLysS (Stratagene) του Escherichia coli. Επειδή τα επίπεδα έκφρασης των ανασυνδυσμένων πρωτεϊνών των τριών τύπων PPAR από την τσιπούρα και του PPARγ από το λαβράκι με την GST δεν ήταν ικανοποιητικά, θεωρήσαμε αξιόπιστα τα αποτελέσματα που προέκυψαν για τους PPARα και PPARβ του λαβρακιού, τον PPARγ από το φασί του Ατλαντικού και τους τρεις τύπους PPAR από το σολομό. Συγκεκριμένα ενισχύθηκαν με PCR από τους cdna κλώνους του λαβρακιού οι ακολουθίες, nt και nt για τον PPAR α και β, αντίστοιχα. Επίσης από το cdna κλώνο του PPARγ από το φασί του Ατλαντικού ενισχύθηκε η ακολουθία nt και από τους cdna κλώνους των PPAR α, β και γ του σολομού οι ακολουθίες nt , nt και nt , αντίστοιχα. Η διαδικασία της μεθόδου CARLA περιλαμβάνει τα εξής στάδια : Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια pgex2τκ με τις ακολουθίες των PPAR, μετασχηματισμένα στα κύτταρα Escherichia coli BL21, καλλιεργούνται σε υγρό θρεπτικό υλικό για 16 ώρες στους 37 0 C. Από αυτήν την καλλιέργεια των βακτηρίων αποσπάται μια ποσότητα, με την οποία εμβολιάζεται υγρό θρεπτικό υλικό και συνεχίζεται η καλλιέργεια στους 37 0 C, παρακολουθώντας φωτομετρικά την ανάπτυξη (με 1ml εμβολιάζονται 50ml θρεπτικού διαλύματος). Όταν επιτευχθεί η λογαριθμική φάση της ανάπτυξης (Α 600 =0.6), προστίθεται 0.1mM IPTG και συνεχίζεται η καλλιέργεια για άλλες τρεις ώρες στους 30 0 C. Στη συνέχεια συλλέγονται τα βακτήρια με φυγοκέντρηση, x g για 15 λεπτά στους 4 0 C.

102 Τα βακτήρια επαναιωρούνται με το ρυθμιστικό διάλυμα ΝΕΤΝ (20mM Tris- HCl, ph 8.0, 100mM NaCl, 1mM EDTA, +0.1% ΝΡ-40, 1mM PMSF, 1mM DTT, 2,5% αποξηραμένο άπαχο γάλα και μείγμα από αναστολείς πρωτεασών ρυθμιστικό διάλυμα Α), σε 1/20 του όγκου του θρεπτικού διαλύματός τους. Στη συνέχεια τα κύτταρα λύονται με υπέρηχους και φυγοκεντρούνται (10000 x g) για 15 λεπτά στους 4 0 C. Το υπερκείμενο της λύσης τοποθετείται σε στήλες σεφαρόζης 4Β (Sepharose 4B, Amersham), εξισορροπημένες με το ρυθμιστικό διάλυμα Α, όπου υπάρχει προσδεμένη ανηγμένη γλουταθειόνη. Για την αύξηση της πρόσδεσης των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών στις στήλες, χρησιμοποιείται συνεχής ανακίνηση των στηλών για μία ώρα στους 4 0 C. Οι στήλες ξεπλένονται τρεις φορές με το ρυθμιστικό διάλυμα Α χωρίς την προσθήκη γάλατος (ρυθμιστικό διάλυμα Β). Στη συνέχεια στις στήλες, με τις προσδεμένες GST-PPAR-LBD πρωτεΐνες, προστίθενται και οι υπό εξέταση χημικές ουσίες, καθώς και η in vitro μεταφρασμένη και σημασμένη με 35 S πρωτεΐνη SRC-1. Ακολουθεί μια επώαση αυτών με συνεχή ανακίνηση για 2 ώρες στους 4 0 C. Οι στήλες ξεπλένονται για δύο φορές με το ρυθμιστικό διάλυμα Β και τελικά στεγνώνονται υπό κενό. Τα δείγματα ελέγχονται με το διαχωρισμό τους σε πηκτή πολυακρυλαμίδης 10% SDS PAGE. Τα ραδιενεργά σήματα ποσοτικοποιήθηκαν, είτε με φωσφοανάλυση (Molecular Imager FX system; Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), είτε με ποσοτικοποίηση των ραδιενεργών σημάτων στα φιλμ με το πρόγραμμα, Gel-Pro, Image Processing Solutions. Οι στατιστικές αναλύσεις των δεδομένων (ANOVA) έγιναν με τη βοήθεια του προγράμματος Statgraphics plus, Version 5. Οι ουσίες που μελετήθηκαν με τη μέθοδο CARLA ήταν : Τρία ισομερή του συζευγμένου λινολεϊκού οξέος και το μείγμα αυτών:

103 1. Συζευγμένο λινολεϊκό οξύ (9Ε,11Ε): 9,11-οκταδεκαδιενοϊκό οξύ, ή ισολινολεϊκό οξύ (C 18 H 32 O 2 ) (CLA 9Ε,11Ε). 2. Συζευγμένο λινολεϊκό οξύ (10Ε,12Ζ) : 10Ε,12Ζ- οκταδεκαδιενοϊκό οξύ (C 18 H 32 O 2 ). 3. Συζευγμένο λινολεϊκό οξύ (9Ζ,11Ε) : 9Ζ,11Ε- οκταδεκαδιενοϊκό οξύ (C 18 H 32 O 2 ) 4. Το μείγμα των τριών προαναφερθέντων ισομερών του συζευγμένο λινολεϊκού οξέος. Λινολεϊκό οξύ : 9,12- οκταδεκαδιενοϊκό οξύ (C 18 H 32 O 2 ). Λινολενικό οξύ : 9,12,15-οκταδεκατριενοϊκό οξύ (C 18 H 30 O 2 ). Φυτανικό οξύ : εξαδεκανοϊκό οξύ, 3,7,11,15-τετραμέθυλ-(C 20 H 40 O2). Το φυτανικό οξύ είναι ένα κορεσμένο λιπαρό οξύ με 20 άνθρακες σε διακλαδισμένη αλυσίδα. Δοκοσαεξανοϊκό οξύ : 4,7,10,13,16,19- Δοκοσαεξανοϊκό οξύ ή DHA(C 22 H 32 O 2 ). 15-δεοξυ-Δ 12,14 -Προσταγλανδίνη J 2 : 11-οξο-προστα-5Z,9,12E,14Z-τετραεν-1- οϊκό οξύ-(c 20 H 28 O 3 ). Εικοσαπεντανοϊκό οξύ : 5,8,11,14,17-εικοσαπεντανοϊκό οξύ, ΕΡΑ, (C 20 H 30 O 2 ). Αραχιδονικό οξύ : 5,8,11,14-εικοσατετραενοϊκό οξύ (C 20 H 32 O 2 ) Το εικοσανοειδές 8(S)-HETE : 8S-υδροξυλ-5Ζ,9 Ε,11Ζ,14Ζ-εικοσατετρανοϊκό οξύ (C 20 H 32 O 3 ). Εικοσατετραϊνοϊκό οξύ : 5,8,11,14- εικοσατετραϊνοϊκό οξύ, ETYA (C 20 H 24 O 2 ). Το ETYA είναι ένα δομικό ανάλογο του αραχιδονικού οξέος στο οποίο κάθε ένας από τους cis-διπλούς δεσμούς έχει αντικατασταθεί με μια ακετυλενομάδα. Πυρηνιξικό οξύ - Wy : 4 χλωρο 6 - (2, 3 -ξυλιδινο) 2 - πυριμιδινυλθειοακετικό οξύ (C 14 H 14 ClN 3 Ο 2 S) Τα πλασμίδια, pgex2tk και psg5-src-1 ήταν προσφορά του W.Wahli και του M.G.Parker. Η συγκέντρωση όλων των ουσιών που εξετάστηκαν ήταν 10-4 Μ. Όλες οι ουσίες αγοράστηκαν από την Cayman Chemical (SPI-BIO; Massy, France) εκτός από την Wy και τα ισομερή του συζευγμένου λινολεϊκού οξέος (Sigma Aldrich).

104 Χάρτης του φορέα PCR-Script TM SK(+) και αλληλουχία του σημείου με τις πολλαπλές δυνατότητες για κλωνοποίηση DNA τμημάτων (polylinker). Circular map and polylinker sequence of the ppcr-script Amp SK(+) cloning vector.

105 Χάρτης του pbluescriptks(+) πλασμιδίου. pbluescriptks(+) vector map.

106 Χάρτης των φορέων σύντηξης με την γλουταθειόνη S-τρανσφεράση, όπου διακρίνονται τα βασικά χαρακτηριστικά τους και τα αναγνωστικά πλαίσια. Map of the glutathione S-transferases fusion vectors showing the reading frames and main features.

107 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

108 3.1. Γονίδια των PPARs στα ψάρια Στα αρχικά στάδια της παρούσας διατριβής καταβλήθηκε προσπάθεια ώστε να ενισχυθούν και να κλωνοποιηθούν τα γονίδια των PPARs από την τσιπούρα και το λαβράκι. Με την ολοκλήρωση του σταδίου αυτού προχωρήσαμε σε συγκρίσεις των αλληλουχιών και της οργάνωσης της δομής των γονιδίων με τους ομόλογους τύπους των PPARs από τα θηλαστικά. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την ύπαρξη και των τριών τύπων των συγκεκριμένων υποδοχέων στα ψάρια Γονίδια των PPARs στην τσιπούρα α) Γονίδιο του PPARα από την τσιπούρας Με τη βοήθεια ενός συγκεκριμένου ζεύγους εκκινητών σχεδιασμένων με βάση την αλληλουχία του δεύτερου δακτύλου ψευδαργύρου της DBD περιοχής και του 3 άκρου της LBD περιοχής του PPARα των θηλαστικών, επιτεύχθηκε η ενίσχυση τμήματος DNA μεγέθους 3105bp (Εικόνα 3Α). Μετά την ανάλυση της αλληλουχίας το συγκεκριμένο τμήμα DNA της τσιπούρας συγκρίθηκε με τις νουκλεοτιδικές αλληλουχίες του PPARα από τα θηλαστικά (Gearing et al., 1994). Η αλληλουχία αλλά και τα όρια εξωνίων/ιντρονίων και ιντρονίων/εξωνίων παρουσίασαν πολύ μεγάλη ομοιότητα Συγκεκριμένα ενισχύθηκαν: -74bp (νουκλεοτίδια 1-74 της αλληλουχίας, Εικόνα 3Α) που κωδικοποιούν τμήμα του εξωνίου του δεύτερου δάκτυλου ψευδαργύρου της DBD περιοχής, -201bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 3Α) που κωδικοποιούν το εξώνιο της περιοχής D και -η LBD περιοχή που συνίσταται από τρία εξώνια στην τσιπούρα και όχι δύο όπως συμβαίνει στα θηλαστικά. Το πρώτο εξώνιο της LBD περιοχής αποτελείται από 267bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 3Α), το δεύτερο από 243bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 3Α) και από το τρίτο ενισχύθηκε τμήμα 222bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 3Α). Σχηματική απεικόνιση του τμήματος του γονιδίου του PPARα της τσιπούρας που ενισχύθηκε δίδεται στην Εικόνα 3Β.

109 Εικόνα 3Α. Μερική αλληλουχία του γονιδίου του υποδοχέα PPARα από την τσιπούρα. Υπογραμμισμένες και με έντονα γράμματα είναι οι ακολουθίες που σηματοδοτούν τα όρια ιντρονίων/εξωνιών. Νουκλεοτίδια 1-74: εξώνιο (τμήμα του δεύτερου δάκτυλου ψευδαργύρου-zn2), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, νουκλεοτίδια : εξώνιο (περιοχή D), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, νουκλεοτίδια : εξώνιο (το πρώτο της LBD περιοχής), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, νουκλεοτίδια : εξώνιο (το δεύτερο της LBD περιοχής), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο και τέλος τα νουκλεοτίδια : εξώνιο (το τρίτο της LBD περιοχής). Figure 3A. Partial genomic sequence from sea bream PPARα. Underlined and bold are the residues showing the exon / intron boundaries. Nt 1-74: exon (part of the second zinc finger- Zn2), nt : intron, nt : exon (D domain), nt : intron, nt : exon (the first of the LBD domain), nt : intron, nt : exon (the second of the LBD domain), nt : intron and nt : exon (the third and last of the LBD domain).

110 CCAAAAGAAG AACCGCAACA AGTGCCAGTA CTGCCGATTC CACAAGTGCC TCTCTGTGGG 60 CATGTCCCAC AACGGTACGG CCTGAAACCT CCCAAGTACA CTACTCAAAA TGAGTTAGGG 120 TTATTTTGGG ATATTTTAGT GTTCCACTTG ATTATTTATT CTCTGACATT TCTGAATGTT 180 TATTTTGTAT TTTTTGGTCC TAAAAAAAGA ATGTGACACA TTACACTTGA CTTTTATTAC 240 ATATTCTTGT TGAATTTTCC GCTCAGAAAA ATGTCTAAAT AGAGCTGTAC TGGCTCACAG 300 TCATCAGTCA GTTTGCTAAT TTGTTTATGC TAACTTCTGG TGACACACAG TGCGTACATG 360 TCTGTCCGAC ATCTACCACA AAAGTAAAAC ATCTTAAACA AACTCGAGGC ATATTTGGCT 420 AGCTATGTAG AAAAGAGGCG TCTTTAGCAG CCAAACCACT GAGTGTACTA ATTTGAGCAT 480 GAGTATGTTT TACTGCTTCT GAGTTTAACT ATTAATTATA TTCCTAGGAG ATTAAAAACT 540 AAATTGAATA ACTATGATTT TGACATTGTT AATAACATGT GATGTGATGA GTTGTGATGT 600 TGAGGTTCCA TACACTTTCC AAAATACAGT AAATGTTGAT GTTTGCTCCA TTTCTTTATA 660 CTGATTGTTA AAAAAAAAAA ATACCTACAG TGCACTTGTA CAGTGCTTTG CCATTACTGT 720 ATTTAGTTAT TTGGTTATGC TAATGCAAAA AAAAATAATT TTAATTTTAA TTAGAATTTA 780 CTCAAAATTA TAGGCTGGTG GGTCTAAAGT TTATGTGGCC TCTGAAGTGG TGCATGTCGG 840 AAGTCCTGAA ATGTCCATTG ACTAACTTTT ATAGGAAGGA GATAAACTGC AGCAAGCATG 900 TAGTTACGTA AGGTACATGA AATTCTACTC AGAAGGTCCT CAGCCGACAT CATGGTATAT 960 GTTCTTTACA GCAACAGCAC AATTCCTTCT GTGATTTGGC TCCACTCAAC GTGCTTTACA 1020 TTGACGGGGT TTTTATAGAG CAATGTCCTG CCGGAGCCTG CTTGACACTG AGAAAACACA 1080 GGCTCTTATA GCTCCACATC TGGCCTGTCA TCTGCACCGA CTGCTGAGGG GTCATTGGGT 1140 TTGTTACGAT GGCCTCCCAC TGCAGACAGA ACAGTGTAGG AAACCTGAGA GGAAGACGAC 1200 ATGTTGCCCT CAGAAGAGAG GAAAGAATTC TGAATGTGGG TGAATGTTTT TGTGTCTGCA 1260 CGCATGCATG TTTTCCTGGA ACAGGATATG TCTGATGTTT CTGTATGTGT TCAAATGTAA 1320 CGTGTAAAAT AAGACACCCT ACCGGTTGAA AACTCCTCTA GCTGCTCTAA CGCTGAATGT 1380 TTCTGTGCCC CAGCCATCCG GTTTGGTCGG ATGCCTCAGG CGGAGAAACT AAAGCTCAAA 1440 GCAGAACGAA AGGTGGTGGA GAAAGAGGTG GCGGGCCCCA TGCTGGCCGA CCACAAGATT 1500 CTGGTGAGGG AGATCCACGG AGCCTACATG AAGAACTTCA GCATGAACAA GGCTAAGGCG 1560 CGGCTCATAC TCACCGGAAA GACTAGCAAG CAGGTAAAGG AAAAGATAAC GCATTGAACA 1620 GAGGTTTGGG AATATTGTTT ATCTATATCC TTACCTTCCA ACATCCTCTC TGTCGTCTTC 1680 TTCCCCAGCA GCCTTTCATC ATTCATGATA TGGAGACGTT CCAGCTGGCA GAGAAGACGT 1740 TAGCGGCCCA CATGGTAAAC GGTGACAATC AGGAGCCCGA GAGCGGCCTT CAAGCTGGGG 1800 AGCTGGTTCC GGCTGTGGGT TGTGGGGAGC TCCAGCAGAG GGAGGCTGAA GCCAGGCTCT 1860 TCCACTGCTG CCAGAGTACG TCGGTGGAGA CGGTCACGGA GCTGACGGAG TTCGCCAAGG 1920 CGGTGCCGGG TTTCCAGAGC CTGGATCTGA ATGATCAGGT GGGTTTAAGA GGATGCCACA 1980 TGGAAGATTG TGTTTAAAGG AGAAGTTCAC CTAAACATTC AAATTCAGTC ATTATCTACT 2040 CAGCCTCATG CCAATGGAAA GTATGGTGGA CAACAGCAAC AAAATATAAA ATGGCTCCAT 2100 GCAGCTCATG TGGTGTAATG CAGGCCACCA GAAGSCCCGA GATCCCAAAT TGATTTGAAA 2160 AGGCTGTATT TAGAACCTTT TATTTCAATT TTAGGATCTC TGGCTTCTAA AGACTTGGAT 2220 TACACGGACG AGCTGTATTT AGACTTTTTA TTTAGTTTTT TGGTTGTTTT TTAAGTTTAC 2280 AACAAATCCC ATCTAACATG CTGGACTTGG GAGAATGCTA CAACCCTGTA GTGATTTGAA 2340 GCTCAGATAT CTCATGTGGA CTACTAAAAT TACCTGSCCT CCATTGSCAT GGGGGTGGGT 2400 GGGTAGCGAC TGAATTCTCA TTTTTGTGTG AACTCATCCT TTAACTTGAA TTCAATACGA 2460 TGTGATTTTA TTGGAATTTT GTGAGAAAAA GCAGTCGGAG ACTAAAAAAC AAACATATTT 2520 GAGTCATTCG GCTGCCTTCC TCCCTGCCTG TTCAGGTGAC TCTCTTGAAG TATGGTGTTT 2580 ATGAAGCCCT CTTCACCCTC CTGGCCTCCT GCATGAACAA AGACGGCCTC CTGGTGGCCC 2640 GCGGCGGAGG CTTCATCACC CGGGAGTTCC TCAAGAGCCT CCGACGGCCA TTTAGTGACA 2700 TGATGGAGCC CAAATTCCAG TTCGCCACGC GCTTCAACTC CCTGGAGCTA GACGACAGTG 2760 ACCTGGCCCT TTTCGTGGCT GCCATTATCT GCTGCGGAGG TAACTGAACA TTATATTTAA 2820 TTTGAACTAA AAACGCATAA GAGACTGAAT TTCATTCCCC TTCTGCGCGA TCCCTTCCCT 2880 CCAGATCGCC CAGGCCTGGT GGATGTGCCT TTGGTGGAGC AGCTGCAAGA AAGCATCGTT 2940 CAGGTACTAC GGCTCCACCT GCTGGCCAAC CACCCCGACG ACACCTTCCT TTTCCCCAGA 3000 CTGCTGCAGA AACTGGCTGA CCTCCGGGAG CTGGTCACGG AGCATGCTCA GCTGGTGCAG 3060 GAAATCAAGA CGACGGAGGA CACGTCGCTG CACCCGCTCC TGCAA 3105

111 100bp Zn2 D E1 E2 E3 Εικόνα 3Β. Σχηματική απεικόνιση της δομής του γονιδίου του υποδοχέα PPARα της τσιπούρας. Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένο σύμφωνα με την κλίμακα των 100bp που δίνεται. Τα παραλληλόγραμμα αντιπροσωπεύουν τα εξώνια, σύμφωνα με την ακολουθία των περιοχών των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν. Οι γραμμές αντιπροσωπεύουν τα ιντρόνια. Figure 3Β. Schematic representation of the sea bream PPARα gene structure. The diagram is drawn approximately in scale of 100bp that is given. The black boxes represent the exons, the lines represent the introns.

112 3.1.1.β) Γονίδιο του PPARβ από τη τσιπούρα Με την μεθοδολογία που περιγράφεται στο κεφάλαιο ΥΛΙΚΑ και ΜΕΘΟΔΟΙ επιτεύχθηκε η ενίσχυση τμήματος του γονιδίου του PPARβ της τσιπούρας μεγέθους 3195bp (Εικόνα 4Α). Τα αποτελέσματα των συγκρίσεων της αλληλουχίας του συγκεκριμένου κλώνου με τις αντίστοιχες ακολουθίες των αμφιβίων και θηλαστικών (Krey et al., 1993; Kliewer et al., 1994), έδειξαν ότι ενισχύθηκε όλη η κωδικοποιούμενη περιοχή του υποδοχέα. Αναλυτικότερα, ενισχύθηκαν: - 328bp που κωδικοποιούν το εξώνιο της Α/Β περιοχής (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 4Α), -152bp που κωδικοποιούν το εξώνιο του πρώτου δάκτυλου ψευδαργύρου της DBD περιοχής (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 4Α), -139bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 4Α) που κωδικοποιούν το δεύτερο δάκτυλο ψευδαργύρου της DBD περιοχής και -203bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 4Α) που κωδικοποιούν την D περιοχή. Και στον PPARβ της τσιπούρας η δομή της LBD περιοχής διαφοροποιείται από αυτή των θηλαστικών και των αμφιβίων, καθώς συνίσταται από τρία εξώνια (Εικόνα 4Β). Τα μεγέθη των εξωνίων της LBD περιοχής κατά σειρά είναι: - 207bp το πρώτο (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 4Α), -243bp το δεύτερο (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 4Α) και -248bp το τρίτο (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 4Α).

113 Εικόνα 4Α. Μερική αλληλουχία του γονιδίου του υποδοχέα PPARβ από την τσιπούρα. Υπογραμμισμένες και με έντονα γράμματα είναι οι ακολουθίες που σηματοδοτούν τα όρια ιντρονίων/εξωνίων. Νουκλεοτίδια 1-328: εξώνιο (Α/Β περιοχή), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, νουκλεοτίδια : εξώνιο (ο πρώτος δάκτυλος ψευδαργύρου- Zn1), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, νουκλεοτίδια : εξώνιο (ο δεύτερος δάκτυλος ψευδαργύρου- Zn2), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, νουκλεοτίδια : εξώνιο (περιοχή D), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, νουκλεοτίδια : εξώνιο (το πρώτο της LBD περιοχής), τα νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, νουκλεοτίδια : εξώνιο (το δεύτερο της LBD περιοχής), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο και νουκλεοτίδια : εξώνιο (το τρίτο της LBD περιοχής). Figure 4A. Partial genomic sequence from sea bream PPARβ. Underlined and bold are the residues showing the exon / intron boundaries. Nt : exon (the A/B domain), nt : intron, : exon (the first zinc finger- Zn1), nt : intron, nt : exon (the second zinc finger-zn2), nt : intron, nt : exon (D domain), nt : intron, nt : exon (the first of the LBD domain), nt : intron, nt : exon (the second of the LBD domain), nt : intron and nt : exon (the third and last of the LBD domain).

114 ATGGAATGGT TTCAGGAAAC TGCTACAGAG CAGCACGACA GGGTGAACGG CTACTGCAAC 60 CCCAAATCAC CCCAGGACAC AGCCGATGTC AGGTGGACCC CACCGGAGGG AGAGTCTGGA 120 GGATCAGACA GCTGCGGGGG GACAAGTGTG TCAGAGCTGA CGGACGTGCA AGAGTTAAAG 180 GCGAGGGAGA GTGAGGATGA GGAGGACAAG GAGGAGAAGG AGGTGGTTCC TGCCTCTAAA 240 GGCCTGAAAG GGGACCAGGC CAAAAAAGAG AAGGAGAGTC CGGAGGAGAA AAATAAGCAG 300 AACAGCAGTG CAGCAACAAG CTACACAGGT AAGATTTTTA TTTCAAATTC TCGTGACTCA 360 CTTGATAATT GGTGAGCCTT AATATTCTTT TCTTTTTTTT TTGCAGACCT GTCACAAACA 420 TCGTCACCCT CGCTTTCAGA ACAGCTGCGT CTTGGCCGAG AAGACAACGC GGGGGCTGGG 480 ATCAGCGTGG AGTGTAAGGT CTGTGGGGAC AAGGCCTCTG GCTTCCACTA TGGTGTGCAT 540 GCCTGTGAGG GGTGCAAGGT AATGAATACA GTGTGTCTAT CACAGCAGAA TAGCTATATG 600 ACATCCAAAT TTTATGTCCA ATATGAGTTG TTGAACCAGT TTCATTGTTT CTCACTCAGG 660 GCTTTTTCCG GCGAACGGTG CGTATGAAAC TGGAATATGA TCGCTGTGAG CGTTCCTGCA 720 AAATTCAGAA GAAGAATCGT AACAAGTGCC AATATTGCCG CTTCCAGAAG TGCCTGTCTT 780 TGGGAATGTC CCATGATGGT GAGATGGAAA TATTTTAAAT ATGTATTTAA ATAAATGTCA 840 AATAAATAAA GCCATGTTAT TAATTATAAA TAATTAAGCA CATTCTTTTT ACAGATCTAA 900 TGTTTCAATG GAAATTAAAT TTAATGAGTT GAGTTTAACT TATCAGTCAT CTGATTTGAG 960 TAACAAACCT GCKAATATAT TTCAGTGCCT TTCTAATCTC CTTTGAAGGT TTTTTTTTGT 1020 CTGTTTGGGA GGTGGAGAAC GTGATTTTCA AGGCTACCTA TATATAGCCT GACATTTTTC 1080 TGAAGTCTCA TTACATTTTT AAACATGCAG TGTCTCTGGG TATTTTGCTA ACTTGGAAAC 1140 TGTTAACAAA ACAAAAGTAG GTATCAAAAC CCAGTCATGG TACTGACAAA GTGATTTACT 1200 CCTAAATTCT TCTCTCAAAA TAAGACCAGC ATCTGTGTGT GTTTGTGCAG CGATCCGATA 1260 TGGACGTATG CCTGAGGCGG AGAGGAAAAA GCTGGTGGCA GGTCTGCTTG CAGAGGAGCA 1320 AAACCACGGC AAACCAGGTG GCTCAGACCT GAAGACCTTG GCCAAACAAG TCAACACAGC 1380 CTACCTGAAG AACCTCAGTA TGACCAAGAA GAGGGCCCGC AGCATCCTTA TGGGCAAAAC 1440 TGCCAGCACC TCGGTAAGTT CAACTTTTAG AATGACTTCA AATTTTGTCT TGTTCAGAAG 1500 TTAAAACATA GTATATTGTT TAATATCATT AGAAAATATG TAGAGTACCG AAACGTACCT 1560 GTTCCTCAAC ACCCTACGAT TCAATAACAA TGATAATAAT TAAAAAAAAA GTAGTTATAG 1620 GAATATTTTA TTTCTGAGTC TTTGAAATTA TAGATGGTAA TTCAAGTGAA ATTATATTTC 1680 TCCTCCATTT AGCCGTTTGT GATCTACGAT GTGGACACAC TCTGGAAGGC AGAAAGTGGT 1740 TTAGTATGGA GCCAGTTAGT CCCAGGTGCA CCCCTGACCA AGGAGATTGG GGTCCATGTT 1800 TTCTATCGCT GCCAATGCAC CACGGTTGAG ACCGTGCGAG AGCTCACCGA GTTCGCCAAG 1860 TGCATTCCAG GGTTTGTGGA TCTCTTCCTC AATGACCAGG TGAGTCACTG TCCACTCAGT 1920 GTGCTGCACA GCAATATGAT CTGTGTGTTG CTTTTTCAGA TTATGGAACA CTTGTCTGTG 1980 TGCTTTCTGC AGGTGACTTT GCTGAAGTAT GGCGTACATG AGGCTATTTT TGCCATGCTG 2040 CCCTCTCTCA TGAACAAAGA TGGTCTGTTG GTCGCCAATG GTAAAGGCTT TGTGACCAGG 2100 GAGTTCCTGC GCAGCTTAAG AAAGCCCTTT AGTGAAATCA TGGAGCCCAA GTTTGAGTTT 2160 GCGGTCAAGT TCAATGCTCT GGAGCTGGAT GACAGCGACC TGGCCCTGTT TGTTGCTGCC 2220 ATCATTCTCT GTGGAGTSGA ACAAAACAGA AGTGCTTGTC TGATAGAGCC CTTAAAAAGC 2280 ATTGAATYCA CTTGTCATAA ATAGATGATT GTWAAGCACT GCTGGTAAAT ACTAAAAAAA 2340 TGTGATGTGA TACAATAAAT AATTATAGCC CATATCATCC CTACTGGTTT TCCATCACAT 2400 TTTTATACTC TGGTAAATAT GATTGTGTTA AACTGTAGAG TGATTTACTG GATGAAGACC 2460 GTTTGTTTAA AGCCTGTCAT TAAGCGCTAT TACCCCCCTT CCTTCTGCTA TCTGCATCTA 2520 CTGTCTTCAA ATTCCCCATT GGGACATGAA ACAACAACAA CGTTCAAGCT AGCAACCTAC 2580 ACTCTGAAAA TGACAACTTA CAAGAACACT AACCTGCTTG CTAGGGACCT TAACTTACAC 2640 TAGCTTTCAG CTCCTGCATT GTCTTTTGGG GGGATTTAGC CATTTTATTT TGCATCCATT 2700 GTTGCATTCT TGGGTAAAAA CATGCAAACA AGCAGCTTTT TACCCTATAC AAGAATGACA 2760 ATTGGTGCAG CTAGACTATT CTCCAATGCT GACATACACC TGTGGAAATA GGTCTGACAA 2820 TGGGAGGCCA GATCTAGTCA GCATTAAAAA AAGGTCCTCA AATCTTAAAC TGAACTTGGT 2880 AAATCCTGCA TTAACTCAAA TTATGACTTA TCATAAGGTG TTGTTGTTTG CTTCCTTGTT 2940 CTCCCAGATC GTCCCGGGCT AATGAACGTG AAGCAGGTGG AGCAGAGTCA GGACAGCATC 3000 CTCCAGGCCC TGGACCTCCA CCTACAAGCA AACCACTCTG ACTCAGTCTA CCTCTTTCCC 3060 AAGCTGCTGC AAAAGATGGC CGACCTCCGT CAGCTGGTTA CTGAGAACGT TCACCTAGTC 3120 CAAAAGATCA AAAAGACTGA GTCGGAGACC TCGCTCCACC CTCTACTACA GGAGATCTAC 3180 AAAGACATGT ATTAG 3195

115 100bp A/B Zn1 Zn2 D E1 E2 E3 Εικόνα 4Β. Σχηματική απεικόνιση της δομής του γονιδίου του υποδοχέα PPARβ της τσιπούρας. Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένο σύμφωνα με την κλίμακα των 100bp που δίνεται. Τα παραλληλόγραμμα αντιπροσωπεύουν τα εξώνια και οι γραμμές αντιπροσωπεύουν τα ιντρόνια. Figure 4Β. Schematic representation of the sea bream PPARβ gene structure. The diagram is drawn approximately in scale of 100bp that is given. The black boxes represent the exons and the lines represent the introns.

116 3.1.1.γ) Γονίδιο του PPARγ από τη τσιπούρα Ενισχύθηκαν τμήματα του γονιδίου του PPARγ της τσιπούρας και συγκεκριμένα, νουκλεοτιδική αλληλουχία μεγέθους 253bp που κωδικοποιεί τμήμα του εξωνίου της Α/Β περιοχής και 136bp που κωδικοποιούν το εξώνιο του δεύτερου δακτύλου ψευδαργύρου. Η σύγκριση των γενωμικών ακολουθιών της τσιπούρας με τις αντίστοιχες αλληλουχίες από τα αμφίβια και τα θηλαστικά (Dreyer et al., 1992; Greene et al., 1995) παρουσίασαν μεγάλη ομοιότητα. Στη συνέχεια με βάση την αλληλουχία του εξωνίου της Α/Β περιοχής που ενισχύθηκε και την αλληλουχία του PPARγ από το φασί του Ατλαντικού (Leaver et al., 1997), κατασκευάστηκαν εκκινητές που βοήθησαν στην ενίσχυση ενός τμήματος του γονιδίου 521bp (Εικόνα 5Α), το οποίο περιείχε: - τμήμα του εξωνίου της Α/Β περιοχής μεγέθους 207bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 5Α), -το ιντρόνιο μεγέθους 237bp που συνδέει την Α/Β περιοχή με το εξώνιο του πρώτου δακτύλου ψευδαργύρου της DBD περιοχής και -τμήμα του εξωνίου του πρώτου δακτύλου ψευδαργύρου αποτελούμενο από 76bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 5Α). Επίσης με εκκινητές που στηρίχτηκαν στην αλληλουχία του γονιδίου του PPARγ από το φασί του Ατλαντικού, ενισχύθηκε η LBD περιοχή του γονιδίου του PPARγ από την τσιπούρα μεγέθους 2685bp (Εικόνα 5Β), που φαίνεται να κωδικοποιείται από τέσσερα εξώνια, σε αντίθεση με τα αμφίβια και τα θηλαστικά, καθώς και τους άλλους τύπους των PPARs. Συγκεκριμένα ενισχύθηκαν: -81bp (νουκλεοτίδια 1-81 της αλληλουχίας, Εικόνα 5Β) που κωδικοποιούν τμήμα του πρώτου εξωνίου της LBD περιοχής - 162bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 5Β) που κωδικοποιούν το δεύτερο εξώνιο - 244bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 5Β) που αποτελούν το τρίτο εξώνιο και - 197bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 5Β) που αποτελούν τμήμα του τέταρτου εξωνίου της LBD περιοχής, χωρίς το 3 άκρο της περιοχής. Σχηματική απεικόνιση του γονιδίου του PPARγ της τσιπούρας δίδεται στην Εικόνα 5Γ.

117 Εικόνα 5Α.Αλληλουχία τμήματος του γονιδίου του υποδοχέα PPARγ από την τσιπούρα, συγκεκριμένα του ιντρονίου που συνδέει το εξώνιο της Α/Β περιοχής με το εξώνιο του πρώτου δάκτυλου ψευδαργύρου. Υπογραμμισμένες και με έντονα γράμματα είναι οι ακολουθίες που σηματοδοτούν τα όρια ιντρονίων/εξωνίων. Νουκλεοτίδια 1-207: εξώνιο (τμήμα της Α/Β περιοχής), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο και νουκλεοτίδια : εξώνιο (τμήμα του πρώτου δακτυλίου ψευδαργύρου). Figure 5A. Partial genomic sequence of sea bream PPARγ. Underlined and bold are the residues showing the exon / intron boundaries. Nt 1-207: exon (part of the A/B domain), nt : intron and nt : exon (part of the first zinc finger). ACTCCCTTGA CATGAAGCAT TTGTCCACGT TGGACTACAG CTCCATCTCC TCCTCCTCCA 60 TCCATTCCTC GCTGTCTCCC TCGGTCATAC CCTGCATGTC CCCCGCCGGC GTGGCCTATG 120 ACCCCAGTCC ACCGCAGGGT GAAGAACACC TGACCAACAT GGACTACACA AACATGCACA 180 GCTACAGGAC GGAGCTGGAC ACACACΑGTA AGTCCAGTCT GTGGAATTGG TGGCTAAACA 240 GAGCGAAATC CGTTTTCTTT ATGCTGATTA TGTGCACGTA CACCAGGCTT TAAAGCTTAA 300 TTCTTCTGCT GGGGTGGAAA TTGAATCATT TGCAACTTGT TTGCAGTCCG TCAAGTCTTT 360 GCACGAGAGA ACTTTGATGC AAAAGTAAGA AGTAAGAAAG TTCTGCCTAC TCAGTATCCT 420 GCCTGATGAC GTTTCTTTTA TCAGACATGA TCAAAAGGGA GCCGGAGTCA CCTCCACAGC 480 TCTCCGACAG TCCTGTGTTC TCCAAGCACC AGGACGATAC G 521

118 Εικόνα 5Β. Μερική αλληλουχία της LBD περιοχής του υποδοχέα PPARγ της τσιπούρας. Υπογραμμισμένες και με έντονα γράμματα είναι οι ακολουθίες που σηματοδοτούν τα όρια ιντρονίων/εξωνίων. Νουκλεοτίδια 1-81: εξώνιο (τμήμα του πρώτου εξωνίου της LBD περιοχής), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, νουκλεοτίδια : εξώνιο (το δεύτερο της LBD περιοχής), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, : εξώνιο (το τρίτο της LBD περιοχής), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο και νουκλεοτίδια : εξώνιο (το τέταρτο της περιοχής). Figure 5B. Partial genomic sequence of sea bream PPARγ LBD domain. Underlined and bold are the residues showing the exon / intron boundaries. nt 1-81 : exon (part of the first exon of the LBD domain), nt : intron, nt : exon (the second exon of the LBD domain), nt : intron, nt : exon (the third exon of the LBD domain), nt : intron and nt : exon (part of the fourth exon of the LBD domain). GGGAGCAGTT TATTAATTGC AAGCAGCTAC CCAACCAGGA GCACCAACCA CAAACATCCG 60 CTCTGACATT CGGACATGGA GGTTAGAAGT GCATAATACT CTTTGTCATG ATTTCTGTTT 120 TTGCATCATT TTCTTTCCAT CATTCTATTT ATCAATCCTT TAATATGAGC TGATAATCAA 180 GCTGTCATTT TGTTTCATAC CATTATTCAC TATTTAAATC CCTGAAAAGC AAGTCTAGCT 240 ACTGTAACTC AGGATGTTTT TAGATGTTAC TTGGTGATTT GATGGAGTCA AAGTCACAAA 300 TTCAAAAACA TATATTTGTT CTCTTTATGT AAAATCAACA TTGCATCTCA CAAAGTTCCC 360 TTCCTCGTTG AATCGGCTTT AAGTTTCCGA AGATACTTGA AACAATACAC ACAGCTGGTC 420 TAGTTGTTAA TCCTGCGACT GAACTGCCTC ACTGGGAATG TTAAGTTTTT TCTTTGCATG 480 TCTCATCTGA TTTCAGGTGT CACAGGAGCT TACCTGGGAT TGGAGCATAG CGGTATGGAC 540 GCTGTGGAGC TGCGTTTCTT CCAAAGCTGT CAGTCACGTT CAGCCGAAGC GGTGAGAGAA 600 GTGACCGAGT TCGCCAAGAG TATCCCAGGA TTCATCGATC TGGATCTCAA TGATCAGGTG 660 AGAGGCATGA ATACTGCTGC TGGATTTACA ATTGTTCACT CCACTTTTGA ATTTTTTATT 720 TTAATCAGCA TCAGCTCCTC ACCTCAACCC TCAACCCTTT TCACAGGTAA CTTTGTTGAA 780 GTACGGCGTG ATTGAAGTCT TAATCATCAT GATGGCACCT CTGATGAACA AAGACGGGAC 840 CCTCATCTCC TACGGACAGA TCTTCATGAC GCGAGAGTTC CTCAAGAGTC TCAGGAAACC 900 CTTCTGTCAA ATGATGGAGC CAAAGTTTGA ATTCTCGGTC AAGTTCAACG TGCTGGAGCT 960 GGACGACAGC GACATGGCAC TGTTTCTGGC TGTCATTATC CTCAGCGGGG GTGAGTGTTG 1020 TAGGTTGTGT TACAGATATT ATAGATCATA GTAGCTAAGG AGGAGTCTTC ATAAAGATGC 1080 TATTTGATAC CACGCAAATG TTAAATATAA AGCTGCAGCC GTGTGGGAGT AAGCTAAGGT 1140 TAGCGTTGAG AGTGGACACA GGGAAACGCC ATCCAATAAA CTGGCACAAA ACCACCCAAC 1200 AAAACTTCAA CTTGTCATTT ATACTCTGTA CGATCTAAAC GAACAATGTA TATACAAGCA 1260 AACATGTTAG TGCGCTAAGT AAATTTGTCT TTAAATTTAG TCTTTTTCGG TGTTTGTGCT 1320 AATAATATAA CCATCTCTTG GGTTCATCTT CTAAATGAAA GGAAACTTTG AGCGTGGTAT 1380 AGACTTCCCC CTTTTCCAGG AAAGCACAAA CAAGAGCTGA AAGAATGAAC CCTCAAACTC 1440 AGCGATGACT TTTTTTTTTT TTAAATGAGT ATTTGGGTAG ATGCCTGAAA GAAGGTGTTG 1500 AGTTAACAGA GGCTTAAATG ATTTTTACGT TTCATTTGTC AATCAATACC CCATTTTACG 1560 TGTCTTAAAG AAGGCGGATG CTATTAAGTG GCTGAATGAG ACTACAGGGG TGGTAGGCGA 1620 CATTAAACGT TGTCACAGAA GCTTGGTCTA CTCACTGACA GACATTTTCC TACTTGTAGA 1680 TTTACCAATT GATTGTAACT TATGTATTTT ACAGTCTAGC AGGAGGGTTA GTGATGGTGA 1740 CGTTGAAGTC ATGGGACCAT GGTGTAGTTT GTTTATAGCC TAACATTTGC TTTTTACATC 1800 TGGCGATTGC ATAAAAATGT TAAAGTTGTG TCTGTGGAGA TTATCTGAGC AAGATGTGCC 1860 TCATGAACTT TTATTTACTA CAGAGCTTTT TAAATTTTTT TCTTTTTACA ATAATCCAAA 1920 ATCTAATGAA AAAAATGACA TTGTCTCGCT ATATGTAAAA CTCTTCAGTG CAGAATGATA 1980 TGCAGCAAGC TATCAAGGCT CTTAAATTTC ACAAACGTCA TGATATTTCT TACAGACATG 2040 TTGGATCAGT TCACGGTGAG TATGATGTGT TGTCAGGTGG CTATATATGG CCTACCTTGA 2100 CCCATTTATC AGTTTTGCTG GAGGCACACG ATGTAATCGC TGACGCATTT TTCTCTCTCA 2160 CGCACTCCAG AATAAAAATC CAAACTTTGT GTCTAATATT GCCGGTTTGC ATGTGGCTAC 2220 TTGATAAAAG TCTGGCCTTG ACCTGATGAT GGTTCAGATC AGACATTTAA GTCAATAATT 2280 AACCTGAAAT GACTGAGATT ACAGCTTGAA ACGAAGATAA GAAAGCTTTT GTAAATAGCA 2340 ATATTACAGC TTGGTTTGGT CATAAAGGAC GACTAAATTA GGGGATTTCA GCCAATGAAT 2400 ATTAAATGTG TAGTTGATGT CAGCTCTCAC TCACATTTTC ACATCCTGTG TCGCTGATTT 2460 TTCCTCCCTG TCTCTGTCAC TCATCCAGAC CGTCCAGGCC TGATGAACGT GAAGCCCATC 2520 GAGCAGCTTC AGGAGACGGT GCTTCACTCT CTGGAGCTGC AGCTGAAGCT AAACCACCCA 2580 GACTCTCTGC AGCTGTTCGC CAAGCTGCTC CAGAAAATGA CGGACCTGCG TCAGATCGTC 2640 ACCGACCACG TCCACCTCAT CCAGCTGCTG AAGAAGACGG AGATT 2685

119 100bp A/B Zn1 Zn2 D E1 E2 E3 E4 Εικόνα 5Γ. Σχηματική απεικόνιση της δομής του γονιδίου του υποδοχέα PPARγ της τσιπούρας. Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένο σύμφωνα με την κλίμακα των 100bp που δίνεται. Τα παραλληλόγραμμα αντιπροσωπεύουν τα εξώνια, σύμφωνα με την ακολουθία των περιοχών των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν. Οι γραμμές αντιπροσωπεύουν τα ιντρόνια, ενώ οι δυο παράλληλες γραμμές πάνω στις οριζόντιες γραμμές δείχνουν τις ακολουθίες των ιντρονίων που δεν έχουν απομονωθεί. Figure 5Γ. Schematic representation of the sea bream PPARγ gene structure. The diagram is drawn approximately in scale of 100bp that is given. The black boxes represent the exons, the lines represent the introns and the horizontal lines along with the two vertical lines represent the sequences of the introns that haven t been isolated so far.

120 3.1.1.δ) Γονίδιο του PPARα2 από τη τσιπούρα Με βάση τις αλληλουχίες από το Tetraοdon nigroviridis και Fugu rubribes σχεδιάστηκαν εκκινητές με την βοήθεια των οποίων ενισχύθηκε ένα τμήμα DNA 604bp (Εικόνα 6Α). Η αλληλουχία αυτού του τμήματος παρουσίασε πολύ μεγάλη ομοιότητα με τις ακολουθίες της LBD περιοχής του PPARα2 των άλλων ειδών ψαριών. Επίσης η σύγκριση του με την αντίστοιχη αλληλουχία της πρώτης ισομορφής του PPARα της τσιπούρας εμφάνισε τις χαρακτηριστικές διαφοροποιήσεις που παρατηρούνται μεταξύ των ισομορφών του υποδοχέα και στα άλλα είδη. Η δομή της LBD περιοχής της δεύτερης ισομορφής του PPARα διαπιστώθηκε πως είναι παρόμοια με αυτή των δυο άλλων ειδών ψαριών, (Tetraodon nigroviridis και Fugu rubripes) και των θηλαστικών αποτελούμενη από δυο εξώνια (Εικόνα 6Β). Συγκεκριμένα, η αλληλουχία που ενισχύθηκε αποτελεί τμήμα του πρώτου εξωνίου της LBD περιοχής μεγέθους 374bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 6Α) και τμήμα του δεύτερου εξωνίου της μεγέθους 44bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 6Α).

121 Εικόνα 6Α. Αλληλουχία τμήματος της LBD περιοχής του γονιδίου του υποδοχέα PPARα2 από τη τσιπούρα. Υπογραμμισμένες και με έντονα γράμματα είναι οι ακολουθίες που σηματοδοτούν τα όρια ιντρονίων/εξωνίων. Νουκλεοτίδια 1-374: τμήμα του πρώτου εξωνίου της LBD περιοχής, νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, και νουκλεοτίδια : το δεύτερο εξώνιο της LBD περιοχής του υποδοχέα. Figure 6A. Partial genomic sequence of sea bream PPARα2. Underlined and bold are the residues showing the exon / intron boundaries. Nt 1-374: part of the first exon of the LBD domain, nt : intron and nt : the second exon of the LBD domain. ACTGAAGGAC AGGGAGGCGG AAGTTCGCAT TTTCCACTGC TGCCAGTGCA CGTCGGTGGA 60 AACGGTGACA GAGCTCACGG AGTTCGCGAA GTCCGTCCCC GGCTTCTCGA GCCTGGACCT 120 CAACGATCAG GTGACTCTTT TGAAATACGG CGTGTACGAG GCCCTCTTCG CCTTGCTCGC 180 CTCCAGCATG AACAAGGACG GGCTCCTCGT GGCGTACGGC TCAGGCTTCA TCACCCGGGA 240 ATTCCTCAAG AGCCTGCGGC GGCCGTTCAG TGATATGATG GAGCCAAAGT TCCAGTTTGC 300 AATGAAGTTC AACGGGCTGG AGCTGGACGA CAGTGACCTG GCTCTGTTTG TGGCTGCTAT 360 CATCTGCTGT GGAGGTGAGG TTTTTACAGT TGAACTGTTA ATTTGCTGCA CAATTATTAT 420 ATTTTTCTTT GTCTTTTACA CTAAATTTAA AAAACTGTTA AGGCAATCTG TTACTGCCTT 480 CCTCTTGAAC GCTTTATTCA AGCAGGAGAT TTACGGTCAA GGAGTCTGAC TTAAGTTTGT 540 TTTGTTTTCT CTGTGATCAG ACCGACCCGG CCTGGTGAAT GTGGCGCACA TCGAGCGAAT 600 GCAG 604

122 100bp A/B Zn1 Zn2 D E1 E2 Εικόνα 6Β. Σχηματική απεικόνιση της δομής του γονιδίου του υποδοχέα PPARα2 της τσιπούρας. Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένο σύμφωνα με την κλίμακα των 100bp που δίνεται. Τα παραλληλόγραμμα αντιπροσωπεύουν τα εξώνια σύμφωνα και με την ακολουθία της πρώτης ισομορφής του PPARα από τη τσιπούρα και το λαβράκι, λαμβάνοντας υπόψη το υψηλό ποσοστό ομολογίας τους με τον PPARα2. Οι γραμμές αντιπροσωπεύουν τα ιντρόνια, ενώ οι δυο παράλληλες γραμμές πάνω στις οριζόντιες γραμμές δείχνουν τις ακολουθίες των ιντρονίων που δεν έχουν απομονωθεί. Figure 6Β. Schematic representation of the sea bream PPARα2 gene structure. The diagram is drawn approximately in scale of 100bp that is given. The black boxes represent the exons according also to the PPARα sequences of sea bream and sea bass considering the high sequence homology with the PPARα2, the lines represent the introns and the horizontal lines along with the two vertical lines represent the sequences of the introns that haven t been isolated so far.

123 Γονίδια των PPARs στο λαβράκι α) Γονίδιο του PPARα από το λαβράκι Η κλωνοποίηση του γονιδίου του υποδοχέα PPARα από το λαβράκι πραγματοποιήθηκε με παρόμοιο τρόπο με την τσιπούρα. Επιτεύχθηκε η ενίσχυση ενός τμήματος DNA μεγέθους 2104bp (Εικόνα 7Α). Η σύγκριση της αλληλουχίας και της δομής του συγκεκριμένου κλώνου του λαβρακιού με τις αλληλουχίες του PPARα από τα θηλαστικά (Gearing et al., 1994) και την τσιπούρα έδειξαν μεγάλη ομοιότητα. Αναλυτικότερα, ο συγκεκριμένος κλώνος περιείχε: - τμήμα του εξωνίου που κωδικοποιεί το δεύτερο δάκτυλο ψευδαργύρου της DBD περιοχής μεγέθους 73bp (νουκλεοτίδια 1-73 της αλληλουχίας, Εικόνα 7Α), -το εξώνιο της περιοχής D, μεγέθους 200bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 7Α) και - τα εξώνια της LBD περιοχής. Η δομή της LBD περιοχής του PPARα του λαβρακιού, όπως και της τσιπούρας διαφοροποιείται από αυτή των θηλαστικών αποτελούμενη από τρία εξώνια. Το πρώτο εξώνιο της LBD περιοχής αποτελείται από 267bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 7Α), το δεύτερο εξώνιο έχει μέγεθος 244bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 7Α) και το τμήμα του τρίτου εξωνίου της LBD περιοχής που ενισχύθηκε αποτελείται από 206bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 7Α). Σχηματική απεικόνιση του τμήματος του γονιδίου του PPARα του λαβρακιού που ενισχύθηκε δίδεται στην Εικόνα 7Β.

124 Εικόνα 7Α. Μερική αλληλουχία του γονιδίου του υποδοχέα PPARα από το λαβράκι. Υπογραμμισμένες και με έντονα γράμματα είναι οι ακολουθίες που σηματοδοτούν τα όρια ιντρονίων/εξωνίων. Νουκλεοτίδια 1-73: εξώνιο (τμήμα του δεύτερου δάκτυλου ψευδαργύρου), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, νουκλεοτίδια : εξώνιο (περιοχή D), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, νουκλεοτίδια : εξώνιο (το πρώτο της LBD περιοχής), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, νουκλεοτίδια : εξώνιο (το δεύτερο της LBD περιοχής), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο και τέλος τα νουκλεοτίδια : αντιπροσωπεύουν εξώνιο (το τρίτο της LBD περιοχής του υποδοχέα). Figure 7A. Partial genomic sequence of sea bass PPARα. Underlined and bold are the residues showing the exon / intron boundaries. Nt 1-73 : exon (part of the second zinc finger), nt : intron, nt : exon (D domain), nt : intron, nt : exon (the first of the LBD domain), nt : intron, nt : exon (the second of the LBD domain), nt : intron and nt : exon (the third and last of the LBD domain). CAAAAGAAGA ACCGCAACAA GTGCCAGTAC TGCCGATTCC ACAAGTGCCT CTCTGTGGGC 60 ATGTCCCACA ATGGTAAGGC CAGCCACCTC CAAATGTAGT GTAACAGTAG TACAAGCAGA 120 GAAGAGTCAT AAAGTCAGTT ACACAGCACT GGCTAATATT AGCCACAATA AACTACCAGG 180 CCAAGTTAGC AGCAAAATCA CTGAGTGTAC TAATTTGAGC AAGAGTGTGT TTTATTGCTT 240 ACTTTCAGTT AAATGTGTTA GATTATTTTT CTAAAAAAGT TTATACTGCC TATCGCTGTC 300 AATTACTGAA ATCGTAATGT CCGGTGAAAC ACTTTTATAG CAGTGAAAAA AACTTGCAAG 360 TAAGCATGCA GTTACATAAA ACGTCCTCAG CCGACATTAC AGTATGTGTT CTGTACAGCA 420 ACAGCAGGAG TCCCTCTGTG ATTTGGCTCC AGTTCAGTCT GCTTTACATT GACTGGGTTT 480 TTATAGAACA GTGTACTGGT GGAGCCTGCT TGACACTGAG AGAACACAGG CCCATATAGC 540 TCCACATCTG GCCTGTCATC TGCACTGACT GCTGAGGGGT CATTGGGTTT GTTACGATGG 600 CCTCCCACTG CAGACAGAAC AGTGTAAGAA ACCTGAGAGG CAGACGACAT GTTGTCCTCT 660 GAGGAGGGGA AGGAATGTCG AATGTGGGTG AATGTTTGTG TGTGTTTTTC TGCACACGCA 720 TGCATGTTTG CTCTGGCCGT AAATATGTCT CTGTATGTAG TTTCACTGTA AAATAAGACC 780 AATTGAAAAC TGTTGTAGCT GCCGCTAATG ATGAATGTTT CTATGCACCA GCTATCCGGT 840 TTGGTCGGAT GCCTCAGGCG GAGAAGCTAA AGCTGAAGGC AGAGAGCAAG ATGGTGGAGA 900 AAGAGGTGGC AAGCCCCATG CTGGACGACC ACAAGATTCT GGTCAGGCAG ATCCATGAAG 960 CCTACATGAA GAACTTCAAC ATGAACAAGG CGAAAGCTCG GCTCATACTC ACCGGAAAGA 1020 CAAGCAAGCC GGTAAAGGGA AAAAAAAAAA AGCTTAGAAC AAAACGTATT CTTTATTCTG 1080 TATCTTCACC TGACAGCATC CTCCGCTCTG TCTTTCCCCA GCAGCCTTTC ATCATTCACG 1140 ACATGGAGAC GTTCCAGCTG GCAGAGAGGA CGCTAGCGGC CCATATGGTA AATGGTGACT 1200 ATCCGGAGCC CGAGAGCGGC CTTCAAGGTG GGGAGGTGGT TCCGGCTGGG GGGTGTGTGG 1260 AGCTCCAGCA GAGGAAGGCT GAAGCCAGGC TCTTCCACTG CTGCCAGAGT ACCTCGGTGG 1320 AGACGGTCAC TGAGCTGACG GAGTTCGCCA AGGCGGTGCC AGGTTTCCAG AGCCTGGATC 1380 TGAATGACCA GGTGGGTTCA GAGCTGTTGT GTCTGTCATT TGCCCTCCTG TCAGCCCATG 1440 TGATAAGTGC GGCTTTTACT TAAATGTGAA AAAGGAGTTA GAGACACAAA AAACACACAT 1500 CTGACCACAT GCTCCTGGCC TTCCTACCTG CCCGTTTAGG TGACTCTCTT GAAGTACGGC 1560 GTTTACGAAG CCCTCTTCAC CCTCCTGGCT TCCTGCATGA ACAAAGATGG CCTCCTGGTG 1620 GCCCGTGGTG GAGGCTTCAT CACCCGAGAG TTTCTCAAGA GCCTCCGGCG GCCATTTAGC 1680 GACATGATGG AGCCCAAATT CCAGTTTGCC ACACGCTTCA ACTCCCTGGA GCTGGATGAC 1740 AGTGACCTGG CCCTTTTTGT GGCTGCCATT ATCTGCTGTG GAGGTAACTG ACATCATGTG 1800 GGGATTTATG TTTAATTCTG TTCAAAAATG TGTAAAAAAT GAATCCCCCC TTTTCTCACC 1860 CTTCTTCTTT CTCCCTCTAT TTGATACCTT CCCTCCAGAT CGCCCAGGCC TGGTGGACGT 1920 GCCTCTAGTG GAACAGCTGC AGGAAAGCCT CGTTCAGGCA CTACGGCTCC ACCTGCTGGC 1980 CAACCACCCG GACGAAAACT TCCTCTTCCC CAGACTGCTG CAGAAACTGG CCGACCTCCG 2040 GGAGCTGGTC ACCGAGCATG CTCAGTTGGT GCAGGAAATC AAGACAACAG AGGACACGTC 2100 GTTG 2104

125 100bp Zn2 D E1 E2 E3 Εικόνα 7Β. Σχηματική απεικόνιση της δομής του γονιδίου του υποδοχέα PPARα του λαβρακιού. Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένο σύμφωνα με την κλίμακα των 100bp που δίνεται. Τα παραλληλόγραμμα αντιπροσωπεύουν τα εξώνια, σύμφωνα με την ακολουθία των περιοχών των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν. Οι γραμμές αντιπροσωπεύουν τα ιντρόνια. Figure 7Β. Schematic representation of the sea bass PPARα gene structure. The diagram is drawn approximately in scale of 100bp that is given. The black boxes represent the exons, the lines represent the introns.

126 3.1.2.β) Γονίδιο του PPARβ από το λαβράκι Τμήμα του γονιδίου του PPARβ του λαβρακιού μεγέθους 3142bp (Εικόνα 8Α), ενισχύθηκε από το γενωμικό DNA του. Η σύγκριση της αλληλουχίας του συγκεκριμένου κλώνου με τις αντίστοιχες ακολουθίες των αμφιβίων και θηλαστικών (Krey et al., 1993; Kliewer et al., 1994), αλλά και της τσιπούρας έδειξε ότι περιέχει όλη την κωδικοποιούμενη περιοχή του υποδοχέα. Επίσης οι συνδέσεις εξωνίων/ιντρονίων και ιντρονίων/εξωνίων είναι παρόμοιες με των θηλαστικών, με εξαίρεση την LBD περιοχή η οποία κωδικοποιείται από τρία εξώνια στο λαβράκι, όπως και στην τσιπούρα. Συνολικά επτά εξώνια κωδικοποιούν τον PPARβ του λαβρακιού (Εικόνα 8Β). Αναλυτικότερα, το πρώτο εξώνιο μεγέθους 340bp κωδικοποιεί την Α/Β περιοχή (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 8Α), το δεύτερο εξώνιο μεγέθους 152bp, κωδικοποιεί τον πρώτο δάκτυλο ψευδαργύρου της DBD περιοχής (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 8Α), το τρίτο εξώνιο μεγέθους 139bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 8Α) κωδικοποιεί το δεύτερο δάκτυλο ψευδαργύρου της DBD περιοχής. Το τέταρτο εξώνιο μεγέθους 203bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 8Α)κωδικοποιεί την D περιοχή. Η LBD περιοχή κωδικοποιείται από τρία εξώνια, όπως προαναφέρθηκε που τα μεγέθη τους κατά σειρά είναι 207bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 8Α), 244bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 8Α) και 248bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας, Εικόνα 8Α).

127 Εικόνα 8Α. Μερική αλληλουχία του γονιδίου του υποδοχέα PPARβ από το λαβράκι. Υπογραμμισμένες και με έντονα γράμματα είναι οι ακολουθίες που σηματοδοτούν τα σύνορα ιντρονίων/εξωνίων. Νουκλεοτίδια 1-340: εξώνιο (Α/Β περιοχή), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, νουκλεοτίδια : εξώνιο (ο πρώτος δάκτυλος ψευδαργύρου-zn1), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, νουκλεοτίδια : εξώνιο (ο δεύτερος δάκτυλος ψευδαργύρου-zn2), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, νουκλεοτίδια : εξώνιο (περιοχή D), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, νουκλεοτίδια : εξώνιο (το πρώτο της LBD περιοχής), τα νουκλεοτίδια : ιντρόνιο, νουκλεοτίδια : εξώνιο (το δεύτερο της LBD περιοχής), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο και νουκλεοτίδια : εξώνιο (το τρίτο της LBD περιοχής). Figure 8A. Partial genomic sequence of sea bass PPARβ. Underlined and bold are the residues showing the exon / intron boundaries. Nt : exon (the A/B domain), nt : intron, : exon (the first zinc finger- Zn1), nt : intron, nt : exon (the second zinc finger-zn2), nt : intron, nt : exon (D domain), nt : intron, nt : exon (the first of the LBD domain), nt : intron, nt : exon (the second of the LBD domain), nt : intron and nt : exon (the third and last of the LBD domain).

128 ATGGAAGGGT TTCAACAAAC TGCTACAGAG CAGCACGACA GGGTGAATGG CTACTGCGAG 60 CCCAAATCTC CCCAGGACGT GGCTGATGTC AGGTGGACGC CGCCAGAGGG AGAGTCTGGA 120 GGCTCAGACA GCTGTGGGGG GACGAGTGTG TCGGAGCTGA CGGACCTGCA AGAGTTGAAG 180 GCCAGGGAAA GCGAAGATGA GGAGGACAAG GAGGACAAGG AGAGGGATGT AGTTCCTGCT 240 TCTAAAGGCC TGAAAGGGGA CCAGAAGAAA AAAGAGAAGG AGAGTTTGGA TCAGGAGGAG 300 AACAGCAAGA AAAACAGCAG TGCAGCAACC AGCTACACAG GTAAGACTTT TATCTATGAG 360 ATATTTAGAT GGCAGATAAT TCTTGAGTCT CAATATTCAT GCCTTTTTTT TTATGCAGAC 420 CTGTCACATA CCTCGTCGCC CTCGCTGTCA GAACAGCTGC GTCTAGGGCG AGAAGACAGC 480 ACAGGGTCTG GGATCAGCGT GGAGTGTAAG GTCTGTGGGG ACAAGGCCTC TGGCTTCCAC 540 TATGGCGTCC ACGCCTGCGA GGGTTGCAAG GTAATACAGT GTGTGCAGAA CAGTAGCTAA 600 ATAAAATGAC AATGTTTGAT CACAGCTATT TTGTTGCTCT CTTGAGTTGC TGAACCGGTT 660 GTGTTGTTTC TTACTCAGGG CTTTTTCCGG CGAACCGTGC GGATGAAACT GGAATATGAT 720 CGCTGTGAGC GTTCCTGCAA GATTCAGAAG AAGAAYCGTA ACAAGTGCCA ATATTGTCGC 780 TTCCAGAAGT GCCTGTCTTT GGGAATGTCC CATGATGGTG AGATGGAAAT ATTTTAAATA 840 TGTATTTAAA TAAATGTCAA ATAAATAAAG CCATGTTATT AATTATAAAT AATTAAGCAC 900 ATTCTTTTTA CAGATCTAAT GTTTCAATGG AAATTAAATT TAATGAGTTG AGTTTAACTT 960 ATCAGTCATC TGATTTGAGT AACAAACCTG CTAATATATT TCAGTGCCTT TCTAATCTCC 1020 TTTGAAGGTT TTTTTTTGTC TGTTTGGGAG GTGGAGAACG TGATTTTCAA GGCTACCTAT 1080 ATATAGCCTG ACATTTTTCT GAAGTCTCAT TACATTTTTA AACATGCAGT GTCTCTGGGT 1140 ATTTTGCTAA CTTGGAAACT GTTAACAAAA CAAAAGTAGG TATCAAAACC CAGTCATGGT 1200 ACTGACAAAG TGATTTACTC CTAAATTCTT CTCTCAAAAT AAGACCAGCA TCTGTGTGTG 1260 TTTGTGCAGC GATCCGATAT GGACGTATGC CTGAGGCGGA GAGGAAAAAG CTGGTGGCAG 1320 GTCTGCTTGC AGAGGAGCAA AACCACGGCA AACCAGGTGG CTCAGACCTG AAGACCTTGG 1380 CCAAACAAGT CAACACAGCC TACCTGAAGA ACCTCAGTAT GACCAAGAAG AGGGCCCGCA 1440 GCATCCTGAT GGGCAAAACT GCCAGCACCT CGGTACTTTC AACTTTTAGA ATGGCTTCAA 1500 ATTTTGTCTC GTTCAGAAGT TAAAACATAG TATATTATTT AATGTCATCA GAAAATATGT 1560 TAGAGTAACA CAACATACCT GTTCCTGAAC ACCCTATGAT TCAAAAATGT AATTATAGGA 1620 ATATTTTATT TCTGAGTCTT TGAGGTTATG GATGGTAATT CATGTGAAAT TTATATTTCT 1680 CCTCCATTTA GCCGTTTGTK ATCTACGATG TGGACACACT CTGGAAGGCA GAAAGTGGTT 1740 TAGTATGGAG CCAGTTAGTC CCAGGTGCAC CCCTGACCAA GGAGATTGGG GTCCACGTTT 1800 TCTATCGCTG CCAATGCACC ACGGTTGAGA CCGTGCGAGA GCTCACCGAG TTCGCCAAGT 1860 GCATTCCAGG GTTTGTGGAC CTCTTCCTCA ATGACCAGGT GAGTCACGGT CTACTCAGCA 1920 TGTTGCACAG CAATATGATC TGTGTGTTGC TTTTTCAGAT TATTGTACAC TTGTCTGTGT 1980 GCTTTTTGCA GGTGACTTTG CTGAAGTACG GTGTACATGA GGCTATTTTT GCCATGCTGC 2040 CCTCTCTCAT GAACAAAGAT GGTCTGTTGG TCGCCAATGG TAAAGGCTTC GTSACCAGGG 2100 AGTTCCTGCG CAGTTTAAGA MAGCCCTTCA GTGAGATCAT GGAGCCCAAG TTTGAGTTTG 2160 CYGTCAAGTT TAATGCTCTG GAGTTGGATG ACAGCGACCT GGCCCTGTTT GTTGCTGCCA 2220 TTATTCTCTG TGGAGGTGAG ACAGAAGGGT TTGAATAATG TCATATTTGA TTGTTGTTTT 2280 AGGGTATCTG CAGGTCTTGA AAAGTCTTAC AAAGAATTGA ATTTTACAGA AGTATTAAAT 2340 ATTTCCTCTT AATTAAGTCA GTAATTTCAT CCATAAAATG TTTTGGTATC TGTTTACAGT 2400 TGGGAGACAC TCTAATAGAC TAAAGTGGGA TTCTTTTATC TGGATTGTGT ATACAGAGTC 2460 TGTTCGATAC TTTTCAGTCA GCACTGTCCG ACCTGTAGCA AACACAGCTC TTGCATGGMA 2520 ACTCAAATTG ACATAATGGG GCAAATGTCC ATTTTAAAGC TAGACACATT AACATAAATT 2580 AATTAATTAT TTTTATTGGT TAATCAATCC ATTCATTTCA TGTAACTTCT ACTAGGTCCA 2640 GGTCATATTT ATTCAAATAT GTGATTTAAT AATAAATAAT AATTCTAGGC CATATCATCT 2700 CTACTGGTTT TCCATCCTAC TTTCTACCGT CATGTATGAT TGTCAGACAG GAATTAAACT 2760 ATTCTATTTG GCTTTGAAAA TGTCTTGAAA AAAACTTAAG CTTAACTTGA ACGCCGCAGA 2820 AACTTTATAC GTTTGCTCAG AGTGAATTGT GACTTATTGT ATGGTGTCCC TTGGTGCTCT 2880 GTTGTTCCAC CCAGATCGCC CCGGGCTAAT TAATGTTAAG CAGGTGGAGC AGAGTCAGGA 2940 CAGCATCCTC CAGGCCCTGG ACCTCCATCT ACAAGCAAAC CACTCTGACT CAGTCTACCT 3000 CTTCCCCAAG CTGCTGCAGA AGATGGCCGA CCTCCGTCAG CTGGTTACAG AGAACGTTCA 3060 CCTTGTCCAA AAGATGAAAA AGACTGAGTC GGAGACCTCG CTCCACCCTC TACTACAGGA 3120 GATCTACAAA GACATGTATT AG 3142

129 100bp A/B Zn1 Zn2 D E1 E2 E3 Εικόνα 8B. Σχηματική απεικόνιση της δομής του γονιδίου του υποδοχέα PPARβ του λαβρακιού. Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένο σύμφωνα με την κλίμακα των 100bp που δίνεται. Τα παραλληλόγραμμα αντιπροσωπεύουν τα εξώνια και οι γραμμές αντιπροσωπεύουν τα ιντρόνια. Figure 8B. Schematic representation of the sea bass PPARβ gene structure. The diagram is drawn approximately in scale of 100bp that is given. The black boxes represent the exons and the lines represent the introns.

130 3.1.2.γ) Γονίδιο του PPARγ από το λαβράκι Παρόμοια με τον PPARγ από την τσιπούρα, ενισχύθηκαν τμήματα του γονιδίου του PPARγ του λαβρακιού με τη χρησιμοποίηση των ίδιων εκκινητών, που σχεδιάστηκαν με βάση τις συντηρημένες αλληλουχίες των γονιδίων του PPARγ των θηλαστικών. Η σύγκριση των ενισχυμένων τμημάτων του γενωμικού DNA του λαβρακιού με τις αντίστοιχες αλληλουχίες από τα άλλα είδη παρουσίασε μεγάλα ποσοστά ομοιότητας. Αρχικά ενισχύθηκαν, τμήμα του εξωνίου της Α/Β περιοχής μεγέθους 253bp και το εξώνιο του δεύτερου δακτύλου ψευδαργύρου που αποτελείται από 136bp. Με τη χρησιμοποίηση εκκινητών που στηρίχτηκαν και στην αλληλουχία του PPARγ από το φασί του Ατλαντικού (Leaver et al., 1997) ήταν δυνατή η ενίσχυση τμήματος του γονιδίου μεγέθους 1507bp (Εικόνα 9Α), το οποίο περιείχε τμήμα του εξωνίου της Α/Β περιοχής μεγέθους 208bp, (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας), το ιντρόνιο μεγέθους 1222bp που συνδέει την Α/Β περιοχή με το εξώνιο του πρώτου δακτύλου ψευδαργύρου της DBD περιοχής και τμήμα του εξωνίου του πρώτου δακτύλου ψευδαργύρου αποτελούμενο από 76bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας). Εφικτή ήταν η ενίσχυση μόνο τμήματος της LBD περιοχής του γονιδίου του PPARγ του λαβρακιού μεγέθους 411bp (Εικόνα 9Β). Το ενισχυμένο αυτό τμήμα του γονιδίου περιέχει τμήμα του πρώτου εξωνίου της LBD περιοχής μεγέθους 81bp (νουκλεοτίδια 1-81 της αλληλουχίας) και τμήμα του δεύτερου εξωνίου μεγέθους 62bp (νουκλεοτίδια της αλληλουχίας). Η αλληλουχία και η θέση που παρεμβάλλεται το συγκεκριμένο ιντρόνιο στην κωδικοποιούμενη περιοχή είναι ίδια με αυτή που παρατηρείται στην τσιπούρα και στο φασί του Ατλαντικού (Leaver et al., 2005). Με βάση τα αποτελέσματά μας διαπιστώνεται ότι η δομή της LBD περιοχής του PPARγ του λαβρακιού είναι παρόμοια με αυτή των δύο άλλων ειδών, δηλαδή κωδικοποιείται από τέσσερα εξώνια (Εικόνα 9Γ).

131 Εικόνα 9Α. Αλληλουχία τμήματος του γονιδίου του υποδοχέα PPARγ από το λαβράκι, συγκεκριμένα του ιντρονίου που συνδέει το εξώνιο της Α/Β περιοχής με το εξώνιο του πρώτου δακτυλίου ψευδαργύρου. Υπογραμμισμένες και με έντονα γράμματα είναι οι ακολουθίες που σηματοδοτούν τα όρια ιντρονίων/εξωνίων. Νουκλεοτίδια 1-208: εξώνιο (τμήμα της Α/Β περιοχής), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο και νουκλεοτίδια : εξώνιο (τμήμα του πρώτου δακτυλίου ψευδαργύρου). Figure 9A. Partial genomic sequence of sea bass PPARγ. Underlined and bold are the residues showing the exon / intron boundaries. Nt 1-208: exon (part of the A/B domain), nt : intron and nt : exon (part of the first zinc finger). CACTCCCTTG ACATGAAGCA TTTGTCCACG TTGGACTACG CCTCCATCTC CTCGTCCTCC 60 ATCCCGTCTT CCTTGTCTCC CTCGCTTGTA TCCTGCATCT CCCCTGCTGG TGTGGCCTAT 120 GACCCCAGCC CAACGCAGAG CGAAGAACAC CTGACCAACA TGGACTACAC CAACATGCAC 180 AGCTACAGGA TGGAGCAGGA CACGCACAGT AAGTCCAGTC TGTACAATGG GTTAAGCAGA 240 GCTAAAACAT GTTATCTAGT TTCTTTACAC CAATTATTTG CGCACCAAGC TTTGCAGCTA 300 AATTCACTCG CAGGGGGGTA GACACAGAAT TACGCAACTT GTTTGAAGTG GCTCAAGTCA 360 TAAAAGCATA AAAGATTGAT TCTACCTGGC ACGCACGCCT GCATTGCATT GTAGCTGTGA 420 CACAGCCACC AGAGCTGACC GTGTCCGTTG TAGACTATGC TAGTGATTCC ACCAGACGCG 480 TCCCAGTTCT CCACTCTGCT CTGCTTAAAA TGCACATAGT TTTTTTTTTG ACAGAAGCCA 540 CATCAAGGTG CACTGAGCAG ATGAAGCTGG GCAGAAAGTC AAACCCCGAA TGGCATGGAG 600 CATCCGGTTC ATTTTTCAAA ATGAAACCCC CTGTGCAGAC TAAATAACAA TAAGATAAAA 660 TTACTTTATT TGTATAGCAC TCTATTAAAA ACAATGTTTG CAAAGTGCTT TACATACACT 720 CAAAAACAGC AGCAGTAAAG AATATGCAAT ATATGAGAAA ATATATAAAG TAAACCAAAA 780 CAACCCAAAA CACACAGACA GAGATACTAT TAAGAACAGA CAAACACTTA ACATAAATAT 840 GTATACAAAA AAAAATCACA GGGACACAAA GGAAATATTA TTTAAATTTG ATAAAAGCCT 900 GTTCTCTGTT GAGATACTGA GTGTGTTTTT AGAAGGGATT TAAAAGATGA ACCCAATTTA 960 GCTTGTCTAA TTTCCTCAGG CAGGCCAATT GAAAGTACAG GCGTCCTAAT ATAGAAAGCA 1020 CAGTCTCCAA CAAGTAGACA CTCCTATGGA AAAATGACCA AATCAACTAA ATCTGGCAGG 1080 CAAAACGCGC TTCTGAAACA ATCCTGGTAG TGTATGAAGC CACGTAGAGG GTGGAACAAA 1140 ACAGCATTGC AGACGCACTA TTATAGAGTC ATGTCCAGTG GAATCAAGGC ATTAGCTTTA 1200 ATGAGAAAAT GCATCAAGTA TACCATGTTT AGAGGAGAGT TGGTCAAGAT ATTGATTAGT 1260 ACTTGTGCTG AAAACATGAG AGTTGTGCAT TACAGGATAC AAAACCAGGT CAAACCTGGT 1320 TAACCAACAA CCTTAAAATT TATGTAAGAG GTGAAATAAG AAAGTTTTAG CTTTTTGTAT 1380 CTCCCCGTGC TTGGTGTTTC CTACCTGCCT GATAATGTTT TTTCCTGTTA GACTCAATCA 1440 AGCTGGAGCC GGAGTCGCCT CCACAGTTTT CTGACTGTCC CGTGTTCTCC AAGCACCAGG 1500 ACGATAC 1507

132 Εικόνα 9Β. Αλληλουχία ενός άλλου τμήματος του γονιδίου του υποδοχέα PPARγ από το λαβράκι, συγκεκριμένα του ιντρονίου που συνδέει το πρώτο με το δεύτερο εξώνιο της Ε περιοχής. Υπογραμμισμένες και με έντονα γράμματα είναι οι ακολουθίες που σηματοδοτούν τα όρια ιντρονίων/εξωνίων. Νουκλεοτίδια 1-83: εξώνιο (τμήμα του πρώτου εξωνίου της LBD περιοχής), νουκλεοτίδια : ιντρόνιο και νουκλεοτίδια : εξώνιο (τμήμα του δευτέρου εξωνίου της LBD περιοχής). Figure 9B. Partial genomic sequence of sea bass PPARγ LBD domain. Underlined and bold are the residues showing the exon / intron boundaries. nt 1-83: exon (part of the first exon of the LBD domain), nt : intron and nt : exon (part of the second exon of the LBD domain). GGGAGCAGTT TATTAATTGC AAGCAGCTAC CCACCCAGGA GCACCAGCCG CAGACGTCTG 60 CCCTATCAGT CGGACATGGA GGTAAGAAGC ACAAAGTACT GTTTGTCATG ATGTTTAATT 120 TTTTTATTTG TCATTTCATT TGTCAACCAA CTGATATAAC GGCATAGTGT TTCGAGCACA 180 ATGTTGTTAT ATCAGTCACC AATAAAGAAA CACATTTTTA TTCTCCTTTT AAAATTAGGC 240 ACTTGCATGT CATGCTTGTT GTCATGTCAT AATGTTATCT TCCTTCCTTA CCTTACTTGA 300 ACTGCCTCAC CACGTATGTT TTTTCTATAC ACATCCCATC TGATTTCAGG TCTCATGGGA 360 GCTCACCTGG GGTCAGAGTG TAACATTTTG GACGCTGTGG AGCTGCGTTT C 411

133 100bp A/B Zn1 Zn2 D E1 E2 E3 (+Ε3?) (or E4) Εικόνα 9Γ. Σχηματική απεικόνιση της δομής του γονιδίου του υποδοχέα PPARγ του λαβρακιού. Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένο σύμφωνα με την κλίμακα των 100bp που δίνεται. Τα παραλληλόγραμμα αντιπροσωπεύουν τα εξώνια, σύμφωνα με την ακολουθία των περιοχών των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν. Οι γραμμές αντιπροσωπεύουν τα ιντρόνια, ενώ οι δυο παράλληλες γραμμές πάνω στις οριζόντιες γραμμές δείχνουν τις ακολουθίες των ιντρονίων που δεν έχουν απομονωθεί. Figure 9Γ. Schematic representation of the sea bass PPARγ gene structure. The diagram is drawn approximately in scale of 100bp that is given. The black boxes represent the exons, the lines represent the introns and the horizontal lines along with the two vertical lines represent the sequences of the introns that haven t been isolated so far.

134 3.2. cdnas των PPARs στα ψάρια Μετά την επιβεβαίωση της ύπαρξης των γονιδίων των υποδοχέων PPARs στο γονιδίωμα του λαβρακιού και της τσιπούρας, προχωρήσαμε στην ενίσχυση και των cdnas των τριών τύπων PPAR, ώστε να εξακριβωθεί αν οι συγκεκριμένες αλληλουχίες που εντοπίστηκαν στο γονιδίωμα τους μπορούν να αποτελέσουν λειτουργικά γονίδια και στα ψάρια cdnas των PPARs στην τσιπούρα α) cdna του PPARα της τσιπούρας Η αλληλουχία του cdna που ενισχύθηκε παρουσίασε 100% ομοιότητα με τις αλληλουχίες των εξωνίων του γονιδίου του PPARα της τσιπούρας και σημαντική ομοιότητα με τις αλληλουχίες του PPARα από το φασί του Ατλαντικού και τα θηλαστικά. Οι ακολουθίες των 5 και 3 άκρων της κωδικοποιούμενης περιοχής του υποδοχέα διορθώθηκαν μετά από την ενίσχυση τμημάτων των 5 και 3 αμετάφραστων άκρων του υποδοχέα. Αυτό πραγματοποιήθηκε με RACE PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που σχεδιάστηκαν με βάση τις περιοχές D και LBD της ενισχυμένης ακολουθίας και οδήγησαν στην ενίσχυση της κωδικοποιούμενης περιοχής του PPARα της τσιπούρας μεγέθους 1434bp (Εικόνα 10Α). Το συνολικό τμήμα cdna του PPARα που ενισχύθηκε μεγέθους 1543bp παρουσιάζεται στην Εικόνα 10Α. Τα όρια κάθε περιοχής του cdna κλώνου του PPARα της τσιπούρας καθορίστηκαν βάση της δομής του γονιδίου του PPARα που ενισχύθηκε από την τσιπούρα και τη δομή των γονιδίων του PPARα από τα θηλαστικά και το φασί του Ατλαντικού. Έτσι η Α/Β περιοχή κωδικοποιείται από 183bp, η DBD περιοχή από 294bp, η D περιοχή από 201bp και η LBD περιοχή από 756bp (Εικόνα 10Β).

135 Εικόνα 10Α. Μερική νουκλεοτιδική ακολουθία του υποδοχέα PPARα από την τσιπούρα. Με έντονα γράμματα δίνεται η ακολουθία της κωδικοποιημένης περιοχής και με κανονικά του 5 αμετάφραστου άκρου. Figure 10A. Partial sequence of sea bream PPARα. The coding sequence is given in bold letters and in normal letters the sequence of the 5 untranslated region. CCCCAGTGAC GGCGCGGGGA AATGCTCCGG ATAGCAGCCT GTGAGTCTTG TGAGTGAGGG 60 GTTGTTCATT CCATGTCTGC CTTGATCTCC ACCATGGCGG GGGATCTCTT CAGCCCACCA 120 TCCCCACTGG GGGATTCCCT GCTGGACAGT CCGCTGTGTG GAGACCTGAT GGAGGATCCC 180 CGTGACATCT CCCAGTCCAT AGGAGACGAC ACGCTGGGAT TTGATTTCCC ACAGTATCAG 240 AGTACTGGCT CGGGGTCTGA GAGCTCCATC GCACTGGACA CGTTGACCCC AGCCTCCAGT 300 CCGTCTTCAG GGGTGTGTGG AGCCACACAG GGCCCAGAAG AGACCTCCAC CCCCCTCAAC 360 CTGGAGTGCC GCATATGCTC TGACAAGGCT TCAGGCTTCC ACTACGGCGT GCATGCCTGT 420 GAGGGCTGCA AGGGTTTCTT CAGGAGGACC ATCAGACTAA GGCTGGAGTA CGACAAGTGT 480 GAACGCAACT GCAAGATCCA AAAGAAGAAC CGCAACAAGT GCCAGTACTG CCGATTCCAC 540 AAGTGCCTCT CTGTGGGCAT GTCCCACAAC GCCATCCGGT TTGGTCGGAT GCCTCAGGCG 600 GAGAAACTAA AGCTCAAAGC AGAACGAAAG GTGGTGGAGA AAGAGGTGGC GGGCCCCATG 660 CTGGCCGACC ACAAGATTCT GGTGAGGGAG ATCCACGGAG CCTACATGAA GAACTTCAGC 720 ATGAACAAGG CTAAGGCGCG GCTCATACTC ACCGGAAAGA CCAGCAAGCA GCCTTTCATC 780 ATTCATGATA TGGAGACGTT CCAGCTGGCA GAGAAGACGT TAGCGGCCCA CATGGTAAAC 840 GGTGACAATC AGGAGCCCGA GAGCGGCCTT CAAGCTGGGG AGCTGGTTCC GGCTGTGGGT 900 TGTGGGGAGC TCCAGCAGAG GGAGGCTGAA GCCAGGCTCT TCCACTGCTG CCAGAGTACG 960 TCGGTGGAGA CGGTCACGGA GCTGACGGAG TTCGCCAAGG CGGTGCCGGG TTTCCAGAGC 1020 CTGGATCTGA ATGATCAGGT GACTCTCTTG AAGTATGGTG TTTATGAAGC CCTCTTCACC 1080 CTCCTGGCCT CCTGCATGAA CAAAGACGGC CTCCTGGTGG CCCGCGGCGG AGGCTTCATC 1140 ACCCGGGAGT TCCTCAAGAG CCTCCGACGG CCATTTAGTG ACATGATGGA GCCCAAATTC 1200 CAGTTCGCCA CGCGCTTCAA CTCCCTGGAG CTAGACGACA GTGACCTGGC CCTTTTCGTG 1260 GCTGCCATTA TCTGCTGCGG AGATCGCCCA GGCCTGGTGG ATGTGCCTTT GGTGGAGCAG 1320 CTGCAAGAAA GCATCGTTCA GGTACTACGG CTCCACCTGC TGGCCAACCA CCCCGACGAC 1380 ACCTTCCTTT TCCCCAGACT GCTGCAGAAA CTGGCTGACC TCCGGGAGCT GGTCACGGAG 1440 CATGCTCAGC TGGTGCAGGA AATCAAGACG ACGGAGGACA CGTCGCTGCA CCCGCTCCTG 1500 CAAGAAATCT ACAGGGACAT GTACTGAGGG CTAGAGCGGC CGC 1543

136 100bp A/B C D LBD Zn1 Zn2 E1 E2 E3 5 3 Εικόνα 10Β. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARα της τσιπούρας. Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένο σύμφωνα με την κλίμακα των 100bp που δίνεται. Οι διακεκομμένες γραμμές αναπαριστούν τις ακολουθίες των 5 και 3 αμετάφραστων άκρων. Οι συνεχόμενες γραμμές τις ακολουθίες των κωδικοποιούμενων περιοχών. Στο σχήμα διακρίνονται και τα μεγέθη των περιοχών του υποδοχέα και των εξωνίων, όπως βρέθηκαν από τη μελέτη των γενωμικών ακολουθιών τους. Figure 10Β. Schematic representation of the sea bream PPARα cdna clone. The diagram is drawn approximately in scale of 100bp that is given. The square dots represent the 5 and 3 untranslated regions and the lines represent the coding sequences. The figure is also showing the size of the functional domains and the exons size according to the genomic sequences.

137 3.2.1.β) cdna του PPARβ της τσιπούρας Τμήμα του cdna του PPARβ της τσιπούρας μεγέθους 1521bp (Εικόνα 11Α) ενισχύθηκε με RT-PCR, με τη βοήθεια των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν και στην ενίσχυση του γονιδίου του PPARβ της τσιπούρας. Η αλληλουχία του cdna κλώνου ήταν πανομοιότυπη με την αλληλουχία του γονιδίου του PPARβ της τσιπούρας. Σύμφωνα με τη δομή του γονιδίου του έγινε ο διαχωρισμός της κωδικοποιούμενης περιοχής του υποδοχέα, όπως φαίνεται και στην Εικόνα 11Β, όπου η Α/Β περιοχή κωδικοποιείται από 327bp, η DBD περιοχή από 291bp, η D περιοχή από 204bp και η LBD περιοχή από 699bp. Με RACE PCR στο οποίο χρησιμοποιήθηκε εκκινητής που σχεδιάστηκε με βάση την ακολουθία της D περιοχής του υποδοχέα, ενισχύθηκε τμήμα 196bp του 5 αμετάφραστου άκρου του PPARβ της τσιπούρας, επιβεβαιώνοντας την αλληλουχία του 5 άκρου που βρέθηκε από την ενίσχυση της κωδικοποιούμενης περιοχής του. Έτσι το συνολικό μέγεθος του τμήματος του cdna του PPARβ που ενισχύθηκε από την τσιπούρα έχει μέγεθος 1717bp (Εικόνα 11Α).

138 Εικόνα 11Α. Μερική νουκλεοτιδική ακολουθία του υποδοχέα PPARβ από την τσιπούρα. Με έντονα γράμματα δίνεται η ακολουθία της κωδικοποιημένης περιοχής και με κανονικά του 5 αμετάφραστου άκρου. Figure 11A. Partial sequence of sea bream PPARβ. The coding sequence is given in bold letters and in normal letters the sequence of the 5 untranslated region. GTGACTTCAA ACGACTTGTC AACAGCCGAT CGATCGTGTT CGGGATTCGG GACTCTCCTC 60 GACACTTGCT TATTTTATCC TCTCGACAAT TTCACGCAGG GTAAACATCT TCCCCACCAG 120 CAGCACTATT TGGAGAGTGG GGCTATGATG GCAACGTGAC AGGAGGGGAG CCGCTGAGTC 180 AGCTTCAACA GGAACCATGG AATGGTTTCA GGAAACTGCT ACAGAGCAGC ACGACAGGGT 240 GAACGGCTAC TGCAACCCCA AATCACCCCA GGACACAGCC GATGTCAGGT GGACCCCACC 300 GGAGGGAGAG TCTGGAGGAT CAGACAGCTG CGGGGGGACA AGTGTGTCAG AGCTGACGGA 360 CGTGCAAGAG TTAAAGGCGA GGGAGAGTGA GGATGAGGAG GACAAGGAGG AGAAGGAGGT 420 GGTTCCTGCC TCTAAAGGCC TGAAAGGGGA CCAGGCCAAA AAAGAGAAGG AGAGTCCGGA 480 GGAGAAAAAT AAGCAGAACA GCAGTGCAGC AACAAGCTAC ACAGACCTGT CACAAACATC 540 GTCACCCTCG CTTTCAGAAC AGCTGCGTCT TGGCCGAGAA GACAACGCGG GGGCTGGGAT 600 CAGCGTGGAG TGTAAGGTCT GTGGGGACAA GGCCTCTGGC TTCCACTATG GTGTGCATGC 660 CTGTGAGGGG TGCAAGGGCT TTTTCCGGCG AACGGTGCGT ATGAAACTGG AATATGATCG 720 CTGTGAGCGT TCCTGCAAAA TTCAGAAGAA GAATCGTAAC AAGTGCCAAT ATTGCCGCTT 780 CCAGAAGTGC CTGTCTTTGG GAATGTCCCA TGATGCGATC CGATATGGAC GCATGCCTGA 840 GGCGGAGAGG AAGAAACTTG TGGCAGGTCT GCTTGCAGAG GAGCTGAACG TCGGTAAACC 900 AGGTGGCTCA GACCTGAAGA CCTTGGCCAA ACAAGTCTAC ACAGCCTATC TGAAGAACCT 960 CAGTATGACC AAGAAGAGGG CCCGCAGCAT CCTTATGGGC AAAACTGCCA GCACCTCGCC 1020 GTTTGTGATC TACGATGTGG ACACACTCTG GAAGGCAGAA AGTGGTTTAG TATGGAGCCA 1080 GTTAGTCCCA GGTGCACCCC TGACCAAGGA GATTGGGGTC CATGTTTTCT ATCGCTGCCA 1140 ATGCACCACG GTTGAGACCG TGCGAGAGCT CACCGAGTTC GCCAAGTGCA TTCCAGGGTT 1200 TGTGGATCTC TTCCTCAATG ACCAGGTGAC TTTGCTGAAG TATGGTGTAC ATGAGGCTAT 1260 TTTTGCCATG CTGCCCTCTC TCATGAACAA AGATGGTCTG TTGGTCGCCA ATGGTAAAGG 1320 CTTTGTGACC AGGGAGTTCC TGCGCAGCTT AAGAAAGCCC TTTAGTGAAA TCATGGAGCC 1380 CAAGTTTGAG TTTGCGGTCA AGTTCAATGC TCTGGAGCTG GATGACAGCG ACCTGGCCCT 1440 GTTTGTTGCT GCCATCATTC TCTGTGGAGA TCGTCCCGGG CTAATGAACG TGAAGCAGGT 1500 GGAGCAGAGT CAGGACAGCA TCCTCCAGGC CCTGGACCTC CACCTACAAG CAAACCACTC 1560 TGACTCAGTC TACCTCTTTC CCAAGCTGCT GCAAAAGATG GCCGACCTCC GTCAGCTGGT 1620 TACTGAGAAC GTTCACCTAG TCCAAAAGAT CAAAAAGACT GAGTCGGAGA CCTCGCTCCA 1680 CCCTCTACTA CAGGAGATCT ACAAAGACAT GTATTAG 1717

139 100bp 5 A/B C D LBD Zn1 Zn2 E1 E2 E3 3 Εικόνα 11B. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARβ της τσιπούρας. Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένο σύμφωνα με την κλίμακα των 100bp που δίνεται. Οι διακεκομμένες γραμμές αναπαριστούν την ακολουθία του 5 αμετάφραστου άκρου. Οι συνεχόμενες γραμμές τις ακολουθίες των κωδικοποιούμενων περιοχών. Στο σχήμα διακρίνονται και τα μεγέθη των περιοχών του υποδοχέα και των εξωνίων, όπως βρέθηκαν από τη μελέτη των γενωμικών ακολουθιών τους. Figure 11B. Schematic representation of the sea bream PPARβ cdna clone. The diagram is drawn approximately in scale of 100bp that is given. The square dots represent the 5 untranslated region and the lines represent the coding sequences. The figure is also showing the size of the functional domains and the exons size according to the genomic sequences.

140 3.2.1.γ) cdna του PPARγ της τσιπούρας Με παρόμοιο τρόπο με τους άλλους δυο τύπους PPAR, ενισχύθηκε τμήμα του cdna του PPARγ της τσιπούρας μεγέθους 1569bp (Εικόνα 12Α). Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν βασίζονταν στην αλληλουχία του PPARγ από το φασί του Ατλαντικού (Leaver et al., 1997). Η αλληλουχία του ενισχυμένου cdna κλώνου ήταν πανομοιότυπη με τα τμήματα των αλληλουχιών του γονιδίου του PPARγ της τσιπούρας και σε μεγάλο βαθμό όμοια με τις αλληλουχίες του PPARγ από το φασί του Ατλαντικού και τα θηλαστικά. Οι συγκρίσεις με τον PPARγ των άλλων ειδών και τα δεδομένα από τα τμήματα του γονιδίου του PPARγ της τσιπούρας, επέτρεψαν τον καθορισμό των ορίων των περιοχών του υποδοχέα. Η Α/Β περιοχή του PPARγ της τσιπούρας κωδικοποιείται από 290bp, η DBD περιοχή από 307bp, η D περιοχή από 201bp και η LBD περιοχή από 771bp (Εικόνα 12Β) Με εκκινητές που στηρίχτηκαν στην αλληλουχία των περιοχών DBD και LBD του PPARγ της τσιπούρας, ενισχύθηκαν με RACE PCR τμήματα των 5 και 3 αμετάφραστων άκρων του υποδοχέα, επαληθεύοντας τα δυο άκρα της αλληλουχίας της κωδικοποιούμενης περιοχής. Έτσι συνολικά το τμήμα του cdna του PPARγ της τσιπούρας που ενισχύθηκε έχει μέγεθος 1829bp, όπως φαίνεται και στην Εικόνα 12Α.

141 Εικόνα 12Α. Μερική νουκλεοτιδική ακολουθία του υποδοχέα PPARγ από την τσιπούρα. Με έντονα γράμματα δίνεται η ακολουθία της κωδικοποιημένης περιοχής, και με κανονικά η ακολουθία των 5 και 3 αμετάφραστων άκρων. Figure 12A. Partial sequence of sea bream PPARγ. The coding sequence is given in bold letters and in normal letters the sequence of the 5 and 3 untranslated regions. CAGCCAGCAG GCACCGACCT CAGCAGCGGC AGCAGCATGA CCAGAAACCT CCACAGCAAA 60 ACAGACCTGA CCACTGTGAC ACTGCAGCTC CTGTGGAAGT GAGACACGCC ACGGCTTTTT 120 GAGGCTGACA CTTTTGTCAG ATTTGCATAA ACCCGGAGAG AGAAGCAAGA ACAAGAACGA 180 CAACAAAAAA CAAAAGCTCC AGCGGGCTCC GTCTGCTCCG CGCTTCAAAA CCCTGATCAG 240 CAGACATGGT GGACACCCAG CAGCTCCTCG CCTGGCCTGT CGGATTCAGT CTCAACGCCG 300 TGGACCTGTC AGAGCTGGAC GACAGCTCCC ACTCCCTTGA CATGAAGCAT TTGTCCACGT 360 TGGACTACAC CTCCATCTCC TCCTCCTCCA TCCATTCCTC GCTGTCTCCC TCGGTCGTAT 420 CCTGCATGTC CCCCGCCGGC GTGGCCTATG ACCCCAGTCC ACCGCAGGGT GAAGAACACC 480 TGACCAACAT GGACTACACA AACATGCACA GCTACAGGAC GGAGCTGGAC ACACACAACA 540 TGATCAAAAG GGAGCCGGAG TCACCTCCAC AGCTCTCCGA CAGTCCTGTG TTCTCCAAGC 600 TCCAGGATGA TACTCCGGCA TCAGCCCTGA ACATCGAGTG TCGTGTGTGT GGAGACAAAG 660 CCTCAGGGTT TCACTACGGC GTCCATGCCT GCGAGGGCTG TAAGGGTTTC TTCAGACGCA 720 CAATCAGGTT AAAGTTGGTG TACGATCACT GTGATCTTCA CTGTCGCATT CACAAGAAGT 780 CCCGCAACAA GTGCCAATAC TGTCGCTTCC AGAAGTGCCT CAATGTCGGC ATGTCACACA 840 ACGCCATTCG TTTTGGCCGG ATGCCCCAGG CGGAGAAGGA GAAACTGCTG GCTGAGTTCT 900 CGTCCGACAT GGAGCACATG CACCCCGAGG CAGCAGATCT GAGAGCTCTG TCCCGGCATC 960 TGTACGAGGC CTATCTGAAA TACTTCCCCC TCACCAAGGC CAAGGCCAGG GCCATCCTCT 1020 CTGGGAAGAC CGGAGATAAC GCGCCCTTTG TCATCCACGA CATGAAGTCT CTGATGGAAG 1080 GGGAGCAGTT TATTAATTGC AAGCAGCTAC CCAACCAGGA GCACCAACCA CAAACATCCG 1140 CTCTGACATT CGGACATGGA GGTGTCACAG GAGCTTACCT GGGATTGGAG CATAGCGGTA 1200 TGGACGCTGT GGAGCTGCGT TTCTTCCAAA GCTGTCAGTC ACGTTCAGCC GAAGCGGTGA 1260 GAGAAGTGAC CGAGTTCGCC AAGAGTATCC CAGGATTCAT CGATCTGGAT CTCAATGATC 1320 AGGTAACTTT GTTGAAGTAC GGCGTGATTG AAGTCTTAAT CATCATGATG GCACCTCTGA 1380 TGAACAAAGA CGGGACCCTC ATCTCTTACG GACAGATCTT CATGACGCGA GAGTTCCTCA 1440 AGAGTCTCAG GAAACCCTTC TGTCAAATGA TGGAGCCAAA GTTTGAATTC TCGGTCAAGT 1500 TCAACGTGCC GGAGCTGGAC GACAGCGACA TGGCACTGTT TCTGGCTGTC ATTATCCTCA 1560 GCGGGGACCG TCCAGGCCTG ATGAACGTGA AGCCCATCGA GCAGCTTCAG GAGACGGTGC 1620 TTCACTCTCT GGAGCTGCAG CTGAAGCTAA ACCACCCAGA CTCTCTGCAG CTGTTCGCCA 1680 AGCTGCTCCA GAAAATGACG GGCCTGCGTC AGATCGTCAC CGACCACGTC CACCTCATCC 1740 AGCTGCTGAA GAAGACGGAG ATTGACATGT GCTTACACCC ACTGCTGCAG GAGATCATGA 1800 AGGACTTGTA TTAGCCTTTA ACAAGAGTA 1829

142 100bp A/B C D LBD Zn1 Zn2 E1 E2 E3 E4 5 3 Εικόνα 12B. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARγ της τσιπούρας. Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένο σύμφωνα με την κλίμακα των 100bp που δίνεται. Οι διακεκομμένες γραμμές αναπαριστούν τις ακολουθίες των 5 και 3 αμετάφραστων άκρων. Οι συνεχόμενες γραμμές τις ακολουθίες των κωδικοποιούμενων περιοχών. Στο σχήμα διακρίνονται και τα μεγέθη των περιοχών του υποδοχέα και των εξωνίων, όπως βρέθηκαν από τη μελέτη των γενωμικών ακολουθιών τους. Figure 12B. Schematic representation of the sea bream PPARγ cdna clone. The diagram is drawn approximately in scale of 100bp that is given. The square dots represent the 5 and 3 untranslated regions and the lines represent the coding sequences. The figure is also showing the size of the functional domains and the exons size according to the genomic sequences.

143 3.2.1.δ) cdna του PPARα2 της τσιπούρας Χρησιμοποιώντας ως μήτρα το cdna που συντέθηκε με αντίστροφη μεταγραφή του ολικού RNA από το ήπαρ της τσιπούρας, ενισχύθηκε και μερική αλληλουχία της κωδικοποιημένης περιοχής του PPARα2, αποτελούμενη από 1197bp (Σχήμα 13A). Η ενίσχυση αυτού του τμήματος cdna πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του ενός εκκινητή που χρησιμοποιήθηκε στην ενίσχυση του γενωμικού κλώνου του PPARα2 της τσιπούρας και του εκκινητή που σχεδιάστηκε βασιζόμενος στην αλληλουχία του 5 άκρου του υποδοχέα της πρώτης ισομορφής του PPARα της τσιπούρας. Η χρησιμοποίηση του ίδιου εκκινητή για το 5 άκρο των δύο ισομορφών του υποδοχέα στηρίχτηκε στα αποτελέσματα της σύγκρισης των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών των δυο ισομορφών του PPARα από τα άλλα είδη ψαριών (λαβράκι, F. rubribes και T. nigroviridis), τα οποία έδειξαν ότι οι περισσότερες διαφορές στις αλληλουχίες τους εντοπίζονται στο 3 άκρο των υποδοχέων. Σύμφωνα με τη δομή της πρώτης ισομορφής του PPARα της τσιπούρας και του PPARα2 των άλλων ειδών ψαριών, καθώς και με τη βοήθεια της πληροφορίας που προέκυψε από την ενίσχυση της γενωμικής αλληλουχίας της LBD περιοχής του PPARα2 της τσιπούρας, καθορίστηκαν τα όρια των περιοχών του υποδοχέα. Έτσι φαίνεται ότι η Α/Β περιοχή κωδικοποιείται από τα πρώτα 204bp, η DBD περιοχή από 294bp, η D περιοχή από 201bp και το τμήμα της LBD περιοχής που ενισχύθηκε από 498bp (Εικόνα 13Β).

144 Εικόνα 13Α. Μερική νουκλεοτιδική ακολουθία της κωδικοποιούμενης περιοχής του υποδοχέα PPARα2 από τη τσιπούρα. Figure 13A. The coding sequence of PPARα2 from sea bream. ATGTCTGCCT TGATCTCCAC CATGGCGGGG GATCTCTTCA GCCCACCATC CCCACTGGGG 60 GATTCCCTGC TGGACAGTCC GCTGTGTGGA GACCTGATGG AGGATCTCCG TGACATCTCC 120 CAGTCCATAG GAGACGACAC GCTGGGATTT GATTTCCCAC AGTATCAGAG TACTGGCTCG 180 GGGTCTGAGA GCTCCATCGC ACTGGACACG TTGACCCCAG CCTCCAGTCC GTCTTCAGGG 240 GTGTGTGGAG CCACACAGGG CCCAGAAGAG ACCTCCACCC CCCTCAACCT GGAGTGCCGC 300 ATATGCTCTG ACAAGGCTTC AGGCTTCCAC TACGGCGTGC ATGCCTGTGA GGGCTGCAAG 360 GGTTTCTTCA GGAGGACCAT CAGACTAAAG CTGGAGTACG ACAAGTGTGA ACGCAACTGC 420 AAGATCCAAA AGAAGAACCG CAACAAGTGC CAGTACTGCC GATTCCACAA GTGCCTGTCA 480 GTGGGCATGT CCCACAACGC TATCCGTTTC GGTCGGATGC CCCAGTCAGA GAAGCTAAAG 540 CTAAAGGCGG AGATGGTGAC GGGGGACAGG GAGGTTGAAG ACCCCCAGGT ATCCGACCAG 600 AAGACACTGG CCAGGCAGAT CTACGAGGCC TACCTCAAGA ACTTCAACAT GAACAAGGCC 660 AAGGCTCGAA CAATTCTCAC CGGCAAGACC AGCACCCCTC CTTTCGTCAT CCACGACATG 720 GAAACCCTCC AGCTGGCAGA GCAGACCCTG GTGGCAAAGA TGGTGGGCTC GGCGGCCTCG 780 CTGAAGGACA GGGAGGCGGA AGTTCGCATC TTCCACTGCT GCCAGTGCAC GTCGGTGGAA 840 ACGGTGACAG AGCTCACGGA GTTCGCGAAG TCCGTCCCCG GCTTCTCGAG CCTGGACCTC 900 AACGATCAGG TGACTCTTTT GAAATACGGC GTGTACGAGG CCCTCTTCGC CTTGCTCGCC 960 TCCAGCATGA ACAAGGACGG GCTCCTCGTG GCGTACGGCT CAGGCTTCAT CACCCGGGAA 1020 TTCCTCAAGA GCCTGCGGCG GCCGTTCAGT GATATGATGG AGCCAAAGTT CCAGTTTGCA 1080 ATGAAGTTCA ACGGGCTGGA GCTGGACGAC AGTGACCTGG CTCTGTTTGT GGCTGCTATC 1140 ATCTGCTGTG GAGACCGACC CGGCCTGGTG AATGTGGCGC ACATCGAGCG AATGCAG 1197

145 100bp A/B C Zn1 Zn2 D E1 LBD E2 Εικόνα 13B. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARα2 της τσιπούρας. Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένο σύμφωνα με την κλίμακα των 100bp που δίνεται. Στο σχήμα διακρίνονται τα όρια των περιοχών του υποδοχέα και των εξωνίων, όπως βρέθηκαν από τη μελέτη του γενωμικού κλώνου της LBD περιοχής του PPARα2 της τσιπούρας και σύμφωνα με τη δομή των γονιδίων του PPARα της τσιπούρας και του λαβρακιού. Figure 13B. Schematic representation of the sea bream PPARα2 cdna clone. The diagram is drawn approximately in scale of 100bp that is given. The figure is showing the size of the functional domains and exons according to the sea bream PPARα2 genomic clone and sea bream and sea bass PPARα genes.

146 cdnas των PPARs του λαβρακιού α) cdna του PPARα του λαβρακιού Παρόμοια με την τσιπούρα, χρησιμοποιώντας ως μήτρα το cdna που συντέθηκε με αντίστροφη μεταγραφή του ολικού RNA από το ήπαρ του λαβρακιού, με RT-PCR, ενισχύθηκε μερική αλληλουχία του cdna του PPARα μεγέθους 1462bp (Εικόνα 14Α). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στηρίχτηκαν, όπως και στην τσιπούρα στις αλληλουχίες των 5 και 3 άκρων της κωδικοποιούμενης περιοχής του PPARα από το φασί του Ατλαντικού (Leaver et al., 2005). Η αλληλουχία του cdna που ενισχύθηκε ήταν όμοια με τις αλληλουχίες των εξωνίων του γονιδίου του PPARα που ενισχύθηκαν από το λαβράκι και σε μεγάλο ποσοστό παρόμοια με τις αλληλουχίες του PPARα των θηλαστικών. Το τμήμα της κωδικοποιούμενης περιοχής που ενισχύθηκε πρέπει να θεωρείται μερικό καθώς προέκυψε πρόβλημα στην ενίσχυση του 5 άκρου του υποδοχέα. Το κωδικόνιο έναρξης δεν εντοπίστηκε σε κανένα προϊόν των 5 RACE PCR αντιδράσεων. Βάση της δομής του γονιδίου του PPARα του λαβρακιού και των αντίστοιχων γονιδίων των θηλαστικών, καθορίστηκαν τα όρια κάθε περιοχής του PPARα του λαβρακιού. Η ενισχυμένη Α/Β περιοχή φαίνεται ότι κωδικοπιείται από 209bp, η DBD περιοχή από 293bp, η D περιοχή από 201bp και η LBD περιοχή από 756bp (Εικόνα 14Β).

147 Εικόνα 14Α. Μερική νουκλεοτιδική ακολουθία της κωδικοποιημένης περιοχής του υποδοχέα PPARα από το λαβράκι. Figure 14A. The coding sequence of sea bass PPARα. ACGCGGGTGG TATTTATCTT CTCATCTCAT CTCAACTCGA ATAAGCGTAT CTCCCATAAT 60 GTCGAACTAT TGTCCGACTA TTCCTCAAGT GCTGTCAGTT TGGCAACCAA GGGCCAAACC 120 AAAGCAAAGG GTTCCTGCTC CTTTTGTAAA TAATGGCATG GTGAATCAGA GTAGGTGTAA 180 CAGTAAAAAA AAAAAAAAGA AATGGAGGTC AAAGTTTGGA TTGAGTTTGT TTCTCCTCTC 240 TGCTCTGTTG TGTGCCGCAG ACACGTTGAC CCCAGCTTCC AGTCCGTCAT CTGGGGTGTG 300 TGGAGCAGCG CCAGGCCCAG AGGAGAGCTT CAGCCCACTC AACCTGGAGT GCCGGGTGTG 360 CTCAGACAAG GCTTCAGGCT TCCACTATGG CGTGCATGCC TGCGAGGGCT GCAAGGGTTT 420 CTTCAGGAGG ACCATCAGAC TAAAGCTGGA TTATGATAAG TGTGAACGCA ACTGCAAAAT 480 CCAAAAGAAG AACCGCAACA AGTGCCAGTA CTGCCGATTC CACAAGTGCC TCTCTGTGGG 540 CATGTCCCAC AATGCTATCC GGTTTGGTCG GATGCCTCAG GTGGCAAGCC CCATGCTGGA 600 CGACCACAAG ATTCTGGTCA GGCAGATCCA TGAAGCCTAC ATGAAGAACT TCAACATGAA 660 CAAGGCGAAA GCTCGGCTCA TACTCACCGG AAAGACAAGC AAGCCGCCTT TCATCATTCA 720 CGACATGGAG ACGTTCCAGC TGGCAGAGAG GACGCTAGCG GCCCATATGG TAAATGGTGA 780 CTATCCGGAG CCCGAGAGCG GCCTTCAAGG TGGGGAGGTG GTTCCGGCTG GGGGGTGTGT 840 GGAGCTCCAG CAGAGGAAGG CTGAAGCCAG GCTCTTCCAC TGCTGCCAGA GTACCTCGGT 900 GGAGACGGTC ACTGAGCTGA CGGAGTTCGC CAAGGCGGTG CCAGGTTTCC AGAGCCTGGA 960 TCTGAATGAC CAGGTGACTC TCTTGAAGTA CGGCGTTTAC GAAGCCCTCT TCACCCTCCT 1020 GGCTTCCTGC ATGAACAAAG ATGGCCTCCT GGTGGCCCGT GGTGGAGGCT TCATCACCCG 1080 AGAGTTTCTC AAGACCCTCC GGCGGCCATT TAGCGACATG ATGGAGCCCA AATTCCAGTT 1140 TGCMACACGC TTCAACTCCC TGGAGCTGGA TGACAGTGAC CTGGCCCTTT TTGTGGCTGC 1200 CATTATCTGC TGTGGAGATC GCCCAGGCCT GGTGGACGTG CCTCTAGTGG AACAGCTGCA 1260 GGAAAGCCTC GTTCAGGCAC TACGGCTCCA CCTGCTGGCC AACCACCCGG ACGACAACTT 1320 CCTCTTCCCC AGACTGCTGC AGAAACTGGC CGACCTCCGG GAGCTGGTCA CCGAGCACGC 1380 TCAGTTGGTG CAGGAAATCA AGACAACAGA GGACACGTCG CTGCACCCGC TCTTGCAAGA 1440 AATCTACAGA GACATGTACT GA 1462

148 100bp A/B C D LBD Zn1 Zn2 E1 E2 E3 5 3 Εικόνα 14B. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARα του λαβρακιού. Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένο σύμφωνα με την κλίμακα των 100bp που δίνεται. Στο σχήμα διακρίνονται τα μεγέθη των περιοχών του υποδοχέα και των εξωνίων, όπως βρέθηκαν από τη μελέτη των γενωμικών ακολουθιών τους. Figure 14B. Schematic representation of the sea bass PPARα cdna clone. The diagram is drawn approximately in scale of 100bp that is given. The figure is showing the size of the functional domains and the exons size according to the genomic sequences.

149 3.2.2.β) cdna του PPARβ του λαβρακιού Η κωδικοποιούμενη περιοχή του PPARβ του λαβρακιού ενισχύθηκε με RT-PCR, με τη βοήθεια των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν και στην ενίσχυση του γονιδίου του. Η ενισχυμένη cdna αλληλουχία μεγέθους 1533bp (Εικόνα 15Α) ήταν όμοια με την αλληλουχία του γονιδίου του PPARβ του λαβρακιού. Σύμφωνα με τη δομή του γονιδίου του καθορίστηκαν τα μεγέθη των περιοχών του υποδοχέα (Εικόνα 15Β). Έτσι η Α/Β περιοχή κωδικοποιείται από 339bp, η DBD περιοχή από 291bp, η D περιοχή από 204bp και η LBD περιοχή από 699bp. Ακόμη, 290bp του 5 αμετάφραστου άκρου του PPARβ του λαβρακιού ενισχύθηκαν με RACE PCR, επιβεβαιώνοντας την αλληλουχία του 5 άκρου που βρέθηκε από την ενίσχυση της κωδικοποιούμενης περιοχής του. (Εικόνα 15Α).

150 Εικόνα 15Α. Νουκλεοτιδική ακολουθία του υποδοχέα PPARβ από το λαβράκι. Με έντονα γράμματα δίνεται η ακολουθία της κωδικοποιημένης περιοχής και με κανονικά του 5 αμετάφραστου άκρου. Figure 15A.The coding sequence of sea bass PPARβ is given in bold letters and in normal letters the sequence of the 5 untranslated region. CCACACACAC ACACACACAC ACACACACAC GTTGGCCCTG AGCCAGTGTT AAGTTTATGT 60 TAGCAGTCTG ACGTTAGCTC CCGCTTCTAA ACAACTTGTC AGCAGCCGAT CGATCGATCG 120 ATCCTGGACG GGACCTGCTT TTSTCTAGTA ACCTGTTTGT TTCCAATGCC CGGCTGGTAA 180 CTTATCGTAG AGTAAAAAGA CCTCCTGAAC CAGCAGCACT ATTGTGGAGA GTGGAGCTAT 240 GATGGCAACG TGACAGGAGG GGAGCCGCTG AGTCAGCTTC AACAGGAACC ATGGAAGGGT 300 TTAACAAGAC TGCTACAGAG CAGCACGACA GGGTGAATGG CTACTGCAAG CCCAAATCTC 360 CCCAGGACGC GGCTGATGTC AGGTGGACGC CGCCAGAGGG AGAGTCTGGA GGCTCAGACA 420 GCTGTGGGGG GACGAGTGTG TCGGAGCTGA CGGACCTGCA AGAGTTGAAG GCCAGGGAAA 480 GCGAAGATGA GGAGGACAAG GAGGACAAGG AGAGGGATGT AGTTCCTGCT TCTAAAGGCC 540 TGAAAGGGGA CCAGAAGAAA AAAGAGAAGG AGAGTTTGGA TCAGGAGGAG AACAGCAAGA 600 AAAACAGCAG TGCAGCAACC AGCTACACAG ACCTGTCACA TACCTCGTCG CCCTCGCTGT 660 CAGAACAGCT GCGTCTAGGG CGAGAAGACA GCACAGGGTC TGGGATCAGC GTGGAGTGTA 720 AGGTCTGTGG GGGCAAGGCC TCTGGCTTCC ACTATGGCGT CCACGCCTGC GAGGGTTGCA 780 AGGGCTTTTT CCGGCGAACC GTGCGGATGA AACTGGAATA TGATCGCTGT GAGCGTTCCT 840 GCAAGATTCA GAAGAAGGAT CGTAACAAGT GCCAATATTG TCGCTTCCAG AAGTGCCTGT 900 CTTTGGGAAT GTCCCATGAT GCGATCCGAT ATGGACGTAT GCCTGAGGCG GAGAGGAAAA 960 GGCTGGTGGC AGGTCTGCTT GCAGAGGAGC AAAACCATGG CAAACCAGGT GGCTCAGACC 1020 TGAAGACCTT GGCCAAACAA GTCAACACAG CCTACCTGAA GAACCTCAGT ATGACCAAGA 1080 AGAGGGCCCG CAGTATCCTG ATGGGCAAAA CCAGCAGCAC CTCGCCGTTT GTGATCTACG 1140 ATGTGGACAC GCTGTGGAAG GCAGAAAGTG GTTTGGTATG GAGCCAGTTA GTTCCAGGTG 1200 CGCCCCTGAC CAAGGAGATT GGGGTCCATG TGTTCTACCG CTGCCAATGC ACCACGGTGG 1260 AGACTGTGCG GGAGCTCACC GAGTTTGCCA AGTGCATTCC AGGGTTTGTG GACCTCTTCC 1320 TTAATGACCA GGTGACTTTG CTGAAATATG GTGTGCACGA GGCTATTTTT GCCATGCTGC 1380 CCTCTCTCAT GAACAAAGAT GGGCTGTTGG TGGCCAATGG TAAAGGCTTC GTGACCAGGG 1440 AGTTCCTGCG CAGCTTAAGA AAGCCCTTCA GTGAGATCAT GGAGCCCAAG TTTGAGTTTG 1500 CCGTCAAGTT TAATGCTCTG GAGTTGGATG ACAGCGACCT GGCCCTGTTT GTTGCTGCCA 1560 TTATTCTCTG TGGAGATCGC CCCGGGCTAA TTAATGTTAA GCAGGTGGAG CAGAGTCAGG 1620 ACAGCATCCT CCAGGCCCTG GACCTCCATC TACAAGCAAA CCACTCTGAC TCAGTCTACC 1680 TCTTCCCCAA GCTGCTGCAG AAGATGGCCG ACCTCCGTCA GCTGGTTACA GAGAACGTTC 1740 ACCTTGTCCA AAAGATCAAA AAGACTGAGT CGGAGACCTC GCTCCACCCT CTACTACAGG 1800 AGATCTACAA AGACATGTAT TA 1822

151 100bp 5 A/B C D LBD Zn1 Zn2 E1 E2 E3 3 Εικόνα 15B. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARβ του λαβρακιού. Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένο σύμφωνα με την κλίμακα των 100bp που δίνεται. Οι διακεκομμένες γραμμές αναπαριστούν τις ακολουθίες του 5 αμετάφραστου άκρου. Οι συνεχόμενες γραμμές τις ακολουθίες των κωδικοποιούμενων περιοχών. Στο σχήμα διακρίνονται και τα μεγέθη των περιοχών του υποδοχέα και των εξωνίων, όπως βρέθηκαν από τη μελέτη των γενωμικών ακολουθιών τους. Figure 15B. Schematic representation of the sea bass PPARβ cdna clone. The diagram is drawn approximately in scale of 100bp that is given. The square dots represent the 5 untranslated region and the lines represent the coding sequences. The figure is also showing the size of the functional domains and the exons size according to the genomic sequences.

152 3.2.2.γ) cdna του PPARγ του λαβρακιού Τμήμα του cdna του PPARγ του λαβρακιού μεγέθους 1569bp (Εικόνα 16Α) ενισχύθηκε με RT-PCR. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν, όπως και στην τσιπούρα, βασίστηκαν στην αλληλουχία του PPARγ από το φασί του Ατλαντικού (Leaver et al., 1997). Η σύγκριση της ακολουθίας του ενισχυμένου cdna κλώνου παρουσίασε 100% ομοιότητα με τα τμήματα των αλληλουχιών του γονιδίου του, δηλαδή την Α/Β περιοχή, την DBD περιοχή και το τμήμα της LBD περιοχής. Υψηλά ήταν και τα ποσοστά ομοιότητας του cdna του PPARγ του λαβρακιού με τις αλληλουχίες του PPARγ από το φασί του Ατλαντικού και τα θηλαστικά. Με συγκρίσεις με τον PPARγ των άλλων ειδών και με βάση τα δεδομένα από τα τμήματα του γονιδίου του PPARγ του λαβρακιού, καθορίστηκαν τα όρια των περιοχών του υποδοχέα. Η περιοχή Α/Β του PPARγ του λαβρακιού κωδικοποιείται από 291bp, η DBD περιοχή από 306bp, η D περιοχή από 202bp και η LBD περιοχή από 770bp (Εικόνα 16Β).

153 Εικόνα 16Α. Η νουκλεοτιδική ακολουθία της κωδικοποιημένης περιοχής του υποδοχέα PPARγ από το λαβράκι. Figure 16A. The coding sequence of sea bass PPARγ. ATGGTGGACA CCCAGCAGCT CCTAGCCTGG CCTGTCGGTT TTAGTCTGAA CGCCGTGGAC 60 CTGTCAGAGC CGGACGACAG CTCCCACTCC CTCGACATGA AGCATTTGTC CACGTTGGAC 120 TACGCCTCCA TCTCCTCGTC CTCCATCCCG TCTTCCTTGT CTCCCTCGCT TGTATCCTGC 180 ATCTCCCCTG CTGGTGTGGC CTATGACCCC AGCCCAACGC AGAGCGAAGA ACACCTGACC 240 AACATGGACT ACACCAACAT GCACATCTAC AGGACGGAGC AGGACACGCA CAACTCAATC 300 AAGCTGGAGC CGGAGTCGCC TCCACAGTTT TCTGACTGTC CCGTGTTCTC CAAGCACCAG 360 GACGATACGC CGGCAGCAGC ACTGAACATC GAGTGTCGCG TGTGTGGAGA CAAAGCCTCT 420 GGGTTTCACT ATGGTGTCCA TGCCTGTGAG GGCTGTAAGG GTTTCTTCAG ACGCACAATC 480 AGGTTAAAGT TGGTGTACGA TCACTGCGAT CTTCACTGTC GCATTCACAA GAAGTCCCGC 540 AACAAATGCC AATACTGCCG CTTCCAGAAG TGCCTCAATG TAGGCATGTC ACACAACGCC 600 ATTCGTTTTG GCCGGATGCC ACAGGCGGAG AAGGAGAAAC TGCTGGCTGA GTTCTCGTCT 660 GACATGGAGC ACATGCACCC GGAGGCAGCA GATCTGAGGG CTCTGTCCCG GCATCTGTAC 720 GAGGCCTATC TGAAATACTT CCCCCTCACC AAGGCCAAGG CCAGGGCCAT CCTCTCTGGG 780 AAGACCGGAG ATAATGCGCC ATTTGTCATC CATGACATGA AGTCTCTAAT GGAAGGAGAG 840 CAGTTTATTA ATTGTAAGCA GATACCCACC CAGGAGCACC AGCCGCAGAC GTCTGCCCTA 900 TCAGTCGGAC ATGGAGGTCT CATGGGAGCT CACCTGGGGT CAGAGTGTAA CATTTTGGAC 960 GCTGTGGAGC TGCGTTTCTT CCATAGTTGT CAATCACGTT CAGCTGAAGC AGTGAGAGAA 1020 GTGACAGAGT TCGCCAAGAG TATACCAGGA TTCATAAACC TGGATCTAAA TGATCAGGTA 1080 ACTTTGCTGA AGTATGGTGT GATCGAGGTC TTAATCATCA TGATGGCGCC TCTGATGAAC 1140 AAAGACGGGA CCCTCATTGC CTACGGACAG ATCTTCATGA CGCGGGAGTT CCTCAAGAGT 1200 CTCAGGAAAC CCTTTTGTCA AATGATGGAA CCAAAGTTTG AGTTCTCAGT CAAGTTCAAC 1260 ACGCTGGAAC TGGACGACAG CGACATGGCG CTGTTTCTGG CTGTCATTAT CCTCAGCGGG 1320 GACCGTCCAG GCCTGCTGAA CGTGAAGCCC ATTGAACAGC TTCAGGAGAC GGTTCTTCAT 1380 GCGCTGGAGC TGCAGCTGAA ACTAAACCAC CCAGACTCTC TGCAACTGTT TGCCAAGCTG 1440 CTTCAGAAAA TGACCGACCT GCGTCAGATC GTCACCGACC ACGTCCACCT CATCCAGCTG 1500 CTGAAGAAGA CGGAGGTGGA TATGTGCTTA CACCCACTGC TGCAGGAGAT CATGAAAGAC 1560 TTGTATTAG 1569

154 100bp A/B C D LBD Zn1 Zn2 E1 5 3 Εικόνα 16Β. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARγ του λαβρακιού. Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένα σύμφωνα με την κλίμακα των 100bp που δίνεται. Στο σχήμα διακρίνονται τα μεγέθη των περιοχών του υποδοχέα και των εξωνίων, όπως βρέθηκαν από τη μελέτη των γενωμικών ακολουθιών τους. Figure 16Β. Schematic representation of the sea bass PPARγ cdna clone. The diagram is drawn approximately in scale of 100bp that is given. The figure is showing the size of the functional domains and the exons size according to the genomic sequences.

155 cdnas των PPARs στην ιππόγλωσσα Η ιππόγλωσσα αποτελεί ένα σημαντικό ψάρι των ιχθυοκαλλιεργειών της Νορβηγίας. Πολλές φορές παρουσιάζονται δυσμορφίες κατά την ανάπτυξη του συγκεκριμένου είδους στις συνθήκες των ιχθυοκαλλιεργειών, οι οποίες πιστεύεται ότι σχετίζονται με τη διατροφή και το μεταβολισμό των λιπιδίων. Θεωρώντας ότι οι PPARs στα ψάρια ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με το μεταβολισμό των λιπιδίων, είναι πιθανή η εμπλοκή τους και στα αίτια που προκαλούν τα συγκεκριμένα προβλήματα. Με τη βοήθεια των αλληλουχιών των cdnas των PPARs από την τσιπούρα και το φασί του Ατλαντικού (Leaver et al., 2005) σχεδιάστηκαν εκκινητές για την ενίσχυση των cdnas των τριών τύπων PPAR από την ιππόγλωσσα α) cdna του PPARα της ιππόγλωσσας Με βάση τις αλληλουχίες του PPARα από την τσιπούρα και το φασί του Ατλαντικού (Leaver et al., 2005), σχεδιάστηκαν εκκινητές για τα 5 και 3 άκρα του υποδοχέα. Με RT-PCR ενισχύθηκε η κωδικοποιούμενη περιοχή του PPARα της ιππόγλωσσας μεγέθους 1425bp (Εικόνα 17Α). Η σύγκριση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του με τις αντίστοιχες ακολουθίες από την τσιπούρα, το λαβράκι και το φασί του Ατλαντικού παρουσίασε πολύ υψηλά ποσοστά ομοιότητας και γι αυτό στην Εικόνα 17Β, διακρίνονται τα μεγέθη κάθε περιοχής βάση των δεδομένων από τα άλλα είδη ψαριών. Έτσι η Α/Β περιοχή του PPARα της ιππόγλωσσας κωδικοποιείται από 183p, η DBD περιοχή από 285bp, η D περιοχή από 201bp και η LBD περιοχή από 756bp (Εικόνα 17Β).

156 Εικόνα 17Α. Η νουκλεοτιδική ακολουθία της κωδικοποιούμενης περιοχής του υποδοχέα PPARα της ιππόγλωσσας. Figure 17A. The coding sequence of halibut PPARα. ATGGCAGGGG ACCTCTACAG CCCCCCATCC CCGCTGGGGG ATTCCCTCCT GGGCAGTCCT 60 CTGTGTGGAG ACCTGATGGA GGACCTCTGT GACATCTCCC AGTCGATGGG AGACAGCGCA 120 CTGGGATTTG ACATCCCAGA ATACCAGAGC ACCGGCTCAG GGTCCGAGAG CTCCACTGCA 180 CTGGACACCC TGACCCCGGC CTCCAGTCCG TTGTCGGGGG TTTGCGGAGC TGCACCGGGC 240 ACAGAGGACA GCCTGAACCT GGAGTGCCGG GTGTGCTCGG ACAAAGCTTC AGGCTTCCAC 300 TACGGGGTGC ACGCATGCGA GGGCTGCAAG GGTTTCTTCA GGAGGACCAT CAGGTTGAAG 360 CTGGAGTACG ACAAGTGTGA ACGGAACTGC AAAATCCTGA AGAAGAACCG CAACAAGTGC 420 CAGTACTGCC GGTTCCACAA GTGCCTCTCT GTGGGAATGT CCCACAACGC CATTCGGTTT 480 GGTCGGATGC CACAGGCGGA GAAGCTGAAA CTCAAGGCGG AAAGCAATAT GGTGGAGAAG 540 GAAGCGGAAA GCCCCATGCT GGCAGACCAC AAGATTCTGG TCAGGCAGAT TCATGACGCC 600 TACATGAAGA ACTTCAACAT GAGCAAGGCG AAGGCGAAGC TCATACTCAC CGGAAAAACC 660 AGCAAACCGC CGTTCATCAT CCACGACATG GAGACGTTCC AGCTGGCCGA GAGGACGTTA 720 GCTGCCCACA TGGTAAACGG TGACCAAGCC GAGCCCGAGT GCGGCCTTCA GTCTCGGGAT 780 GTGGCTCTGG ACGCAGAGTG CGGGGAGCTC GAGCAGAGGG AGGCCGAAGC GAGGCTCTTT 840 TACTGCTGCC AGAGCACGTC GGTGGAGACG GTGACGGAGC TGACAGAGTT CGCGAAGGCC 900 GTGCCGGGTT TCCAGAGCCT GGATCTGAAC GATCAGGTGA CCCTATTGAA GTACGGCGTT 960 TACGAGGCAC TCTTCACCCT CCTGGCCTCC TGCATGAACA AAGATGGCCT CCTGGTGGCA 1020 CGTGGCGGCG GTTTCATCAC ACGTGAGTTC CTCAAAAGCC TCCGTCGTCC TTTTAGCGAC 1080 ATGATGGAGC CCAAGTTCCA GTTCGCCACG CGCTTCAACT CTCTGGAGCT GGACGACAGC 1140 GACCTGGCCC TTTTCGTGGC CGCCATCATC TGCTGCGGAG ACCGTCCAGG CCTGGTGGAT 1200 GTACCTCTGG TGGAGCAGCT GCAGGAAAGC ATTGTCCAGG CGCTGCAGCT CCACCTGCTG 1260 GCCAACCACC CTGACAACAC CTTCCTCTTC CCCAGACTTC TGCAGAAACT GGCCGACCTG 1320 CGGGAGCTGG TCACCGAGCA CGCTCAGCTG GTGCAGGAAA TCAAGACGAC TGAGGACGCT 1380 GCACTGCACC CGCTCTTGCA AGAAATCTAC AGAGACATGT ACTGA 1425

157 100bp A/B C D LBD Zn1 Zn2 5 3 Εικόνα 17Β. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARα της ιππόγλωσσας. Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένο σύμφωνα με την κλίμακα των 100bp που δίνεται. Στο σχήμα διακρίνονται τα όρια των περιοχών του υποδοχέα σύμφωνα με τις αντίστοιχες ακολουθίες από την τσιπούρα το λαβράκι και το φασί του Ατλαντικού. Figure 17Β. Schematic representation of the halibut PPARα cdna clone. The diagram is drawn approximately in scale of 100bp that is given. The figure is showing the size of the functional domains according to the cdna sequences of sea bream, sea bass and plaice.

158 3.2.3.β) cdna του PPARβ της ιππόγλωσσας Με παρόμοιο τρόπο, με μήτρα το cdna που συντέθηκε από το ολικό RNA του ήπατος της ιππόγλωσσας και με τη βοήθεια εκκινητών που σχεδιάστηκαν στηριζόμενοι στις αλληλουχίες της κωδικοποιούμενης περιοχής του PPARβ από την τσιπούρα και το φασί του Ατλαντικού (Leaver et al., 2005), ενισχύθηκε τμήμα του cdna του PPARβ της ιππόγλωσσας, μεγέθους 1533bp (Εικόνα 18Α). Η αλληλουχία του παρουσίασε πολύ υψηλά ποσοστά ομοιότητας με τις αλληλουχίες του PPARβ από την τσιπούρα, το λαβράκι και το φασί του Ατλαντικού. Θεωρώντας ότι ο PPARβ της ιππόγλωσσας θα έχει παρόμοια οργάνωση με τα υπόλοιπα ψάρια η αλληλουχία που ενισχύθηκε διαχωρίστηκε, όπως φαίνεται και στην Εικόνα 18Β, στις τέσσερις περιοχές αποτελούμενες η Α/Β από 339p, η DBD από 291bp, η D από 204bp και η LBD από 699bp.

159 Εικόνα 18Α. Η νουκλεοτιδική ακολουθία της κωδικοποιούμενης περιοχής του υποδοχέα PPARβ από την ιππόγλωσσα. Figure 18A. The coding sequence of halibut PPARβ. ATGGAAGGGG TTCAGCCTAC TGTTACGGAG CAGCATGACG GGGTGAACGG TTACTGCGAG 60 CCCAAATCCC CCCAGGACGC CGCCGATGTC AGGTGGACGT CCCCGAAGAG AGAGTCTGGT 120 GGTTCGGACA GCTGTGGGGG GGCAAGTGTG TCAGAGCTGA CAGACGTGCA AGAGTTGAAG 180 GCCAGGGAAA GTGAGGATGA GGAGGACAGG GTGAAGAAGG AGAGAGTCCC TGTCTCTAAA 240 GGCCTGAAAG GGGACCAGAA GAGCAAAGAG AAGGAGCATC TGGATCAGGA AAAGAACAAT 300 CACAGCAAGC AAAACAGCAG TGGAGCATCC AGCTACACAG ACCTGTCCCA TACCTCGTCC 360 CCCTCGCTGT CAGAGCAGCT GCGTCTTGGC CGCGAGGACA GCACAGGGGC AGGGATCAGT 420 GTGGAGTGTA AGGTCTGTGG GGACAAGGCC TCAGGCTTCC ACTATGGCGT GCACGCCTGT 480 GAGGGTTGCA AGGGCTTTTT CCGGCGAACC GTGAGGATGA AACTGGAGTA TGATCGCTGC 540 GAGCGTTCCT GCAAGATTCT GAAGAAGAAT CGCAACAAGT GCCAATATTG TCGCTTCCAG 600 AAGTGCCTGT CTTTGGGAAT GTCCCATGAT GCGATCCGAT ACGGACGTAT GCCTGAGGCG 660 GAGAGGAAGA AGCTGGTGGC TGGCCTGCTT GCAGAGGAAC TGAATGTTAG CAAACCAGGT 720 GGCTCTGACT TGAAGACCTT GGCCAAACAA GTCAACGCAG CCTACCTGAA GAACCTCAGT 780 ATGACCAAGA AGAGGGCCCG CAGCATCCTG ACAGGCAAAA CCAGCAGCAC CTCGCCGTTT 840 GTTATCTACG ATGTGGACAC ACTCTGGAAG GCAGAGAGTG GTTTGGTGTG GAGCCAGTTA 900 CTTCCAGGTG CGCCCCTGAC CAAGGAGATC GGGGTCCATG TGTTCTACCG CTGTCAGTGT 960 ACTACGGTGG AGACTGTGCG AGAGCTCACA GAGTTTGCCA AGTCCATTCC AGGGTTTGTG 1020 GACCTCTATC TTAATGACCA GGTGACTTTG CTAAAGTATG GCGTACATGA GGCTATTTTT 1080 GCCATGCTGC CGTCTCTCAT GAACAAAGAT GGACTGTTGG TGGCCAACGG TAAAGGCTTC 1140 GTCACCAGGG AGTTCCTGCG AAGCCTAAGA AAGCCCTTCA GTGAGATCAT GGAGCCCAAA 1200 TTTGAGTTTG CTGTCAAATT TAATGCTCTG GAGCTGGATG ACAGTGACCT GGCCCTGTTT 1260 GTTGCTGCCA TTATTCTCTG TGGAGATCGT CCCGGGCTAA TGAACGTGAA GCAGGTGGAG 1320 CAGAGTCAGG ACAACATCCT CCAGGCTCTG GACCTCCATC TCCAAGCAAA CCACTCTGAC 1380 TCCGCCTACC TCTTCCCCAA GCTGCTGCAG AAGATGGCCG ACCTCCGTCA GCTGGTTACT 1440 GAGAACGCTC TGCTTGTCCA AAAGATTAAA AAGACTGAGT CGGAGACCTC GCTCCATCCT 1500 TTACTACAGG AGATCTACAA AGACATGTAT TAG 1533

160 100bp A/B C D LBD Zn1 Zn2 5 3 Εικόνα 18Β. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARβ της ιππόγλωσσας. Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένο σύμφωνα με την κλίμακα των 100bp που δίνεται. Στο σχήμα διακρίνονται τα όρια των περιοχών του υποδοχέα σύμφωνα με τις αντίστοιχες ακολουθίες από την τσιπούρα το λαβράκι και το φασί του Ατλαντικού. Figure 18Β. Schematic representation of the halibut PPARβ cdna clone. The diagram is drawn approximately in scale of 100bp that is given. The figure is showing the size of the functional domains according to the cdna sequences of sea bream, sea bass and plaice.

161 3.2.3.γ) cdna του PPARγ της ιππόγλωσσας Τμήμα της κωδικοποιούμενης περιοχής του PPARγ της ιππόγλωσσας ενισχύθηκε με RT-PCR, χρησιμοποιώντας εκκινητές σχεδιασμένους βάση των αλληλουχιών των cdna κλώνων του PPARγ από την τσιπούρα και το φασί του Ατλαντικού (Leaver et al., 2005). Και η αλληλουχία του PPARγ της ιππόγλωσσας παρουσίασε πολύ μεγάλη ομοιότητα με τις αντίστοιχες αλληλουχίες από την τσιπούρα, το λαβράκι και το φασί του Ατλαντικού. Έτσι σύμφωνα με την οργάνωση του PPARγ στα συγκεκριμένα είδη, διαχωρίστηκε η αλληλουχία που ενισχύθηκε από την ιππόγλωσσα μεγέθους 1545bp (Εικόνα 19Α), στην Α/Β περιοχή που κωδικοποιείται από 291bp, τη DBD περιοχή από 306bp, τη D περιοχή από 202bp και το τμήμα της LBD περιοχής (δεν ενισχύθηκε το 3 άκρο της κωδικοποιούμενης περιοχής του υποδοχέα) από 746bp (Εικόνα 19Β).

162 Εικόνα 19Α. Μερική νουκλεοτιδική ακολουθία της κωδικοποιούμενης περιοχής του υποδοχέα PPARγ της ιππόγλωσσας. Figure 19A. Partial coding sequence of halibut PPARγ. ATGGTGGACA CCCAGCAGCT CCTGGCTTGG CCTGTGGGTT TCAGTCTGAG CGCCGTGGAC 60 CTCTCGGAGC TGGACGACAG CTCCCACTCT CTCGACATGA AGCACTTGTC CACGTTGGAC 120 TACACCTCCA TCTCCTCCGC CTCCGTCCCG TCCTCTCTGT CTCCCCAGCT CATGTCCTCC 180 ATCTCTTCCG TCGGCGTGGC CTATGACCCC AGTCCGCCGC AGAGCGAAGA ACACCTGACG 240 AACATGGATT ACACCAACAT GCACAGCTAC AGGACAGAGC AGAACGTGCA CAATTCAATC 300 AAGATGGAGC CAGAGTCACC ACCTCAGTAC TCAGACAGTC CCGTGTTTTC CAAGCTCCAG 360 GACGACACGT CGACGGCATC GCTAAATATC GAGTGCCGCG TTTGCGGTGA CAAAGCCTCA 420 GGGTTTCACT ATGGCGTCCA TGCCTGTGAG GGCTGCAAGG GTTTCTTCAG ACGCACTATC 480 AGGTTAAAGT TGGTGTACGA TCACTGTGAT CTTCACTGTC GCATTCACAA GAAGTCCCGC 540 AACAAATGCC AATACTGTCG CTTCCAGAAG TGCCTTAATG TCGGCATGTC ACACAACGCT 600 ATTCGTTTTG GCCGGATGCC TCAGGCAGAG AAGGAGAAGC TTCTGGCGGA GTTCTCGTCT 660 GACATGGAGC ACATGCACCC GGAGGCAGCA GATCTGAGGG CCTTGGCCCG CCATCTGTAT 720 GAGGCCTATC TGAAATACTT CCCCCTCACC AAGGCCAAGG CTAGAGCCAT CCTCTCTGGG 780 AAGACCGGAG ACAACGCGCC TTTTGTCATC CATGACATGA AGTCTCTAAT GGAAGGAGAG 840 CAGTTCATTA ATTGCAGGCA GATGCCCATC CAGGAGCAGC AGGCCTCTGT CCTCACAGCC 900 GCACACGGAG GCCTCACAGA AGTTCACATG GGGTCAGATT ATAGCGTCTG GGGAATGACG 960 AGCATCAGCG GACAGGAGCC ACAGAACGCT TTGGAGCTAC GTTTCTTCCA AAGCTGTCAG 1020 TCACGCTCTG CTGAAGCAGT GAGGGAAGTG ACAGAGTTTG CCAAGAGTAT CCCAGGATTC 1080 ACTGATCTGG ATCTAAACGA TCAGGTGACT CTGCTGAAGT ATGGTGTGAT AGAGGTCTTG 1140 ATTATCATGA TGTCACCTCT GATGAACAAA GACGGGACCC TGATCTCCTA CGGACAGATC 1200 TTCATGACGC GGGAGTTCCT CAAGAGTCTC AGGAAACCTT TCTGTCAAAT GATGGAACCA 1260 AAGTTCGAGT TCTCCGTTAA ATTCAACACG CTCGAGCTGG ACGACAGTGA CATGGCGCTG 1320 TTTCTGGTTG TCATTATCCT CAGCGGGGAC CGTCCAGGCC TTCTGAATGT GAAACCCATC 1380 GAGCAGCTTC AGGAGACCGT GCTTCATTCC CTCGAGTTGC AGCTGAAGCT GAACCACCCG 1440 GACTCTCTGC AGCTGTTCGC CAAGCTGCTC CAGAAGATGA CCGACCTGCG GCAGATCGTC 1500 ACGGACCACG TGCACCTCAT CCAGCTGCTG AAGAAGACGG AGATT 1545

163 100bp A/B C D LBD Zn1 Zn2 5 3 Εικόνα 19Β. Σχηματική απεικόνιση του cdna κλώνου του PPARγ της ιππόγλωσσας. Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένο σύμφωνα με την κλίμακα των 100bp που δίνεται. Στο σχήμα διακρίνονται τα όρια των περιοχών του υποδοχέα σύμφωνα με τις αντίστοιχες ακολουθίες από την τσιπούρα το λαβράκι και το φασί του Ατλαντικού. Figure 19Β. Schematic representation of the halibut PPARγ cdna clone. The diagram is drawn approximately in scale of 100bp that is given. The figure is showing the size of the functional domains according to the cdna sequences of sea bream, sea bass and plaice.

164 Ομοπαραθέσεις των αμινοξικών ακολουθιών των τριών τύπων PPAR των ψαριών Χρησιμοποιώντας το λογισμικό OMIGA 2.0 (Oxford Molecular) μεταφράστηκαν οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των cdnas των PPARs των ψαριών. Τα αναγνωστικά πλαίσια των πρωτεϊνών καθορίστηκαν με τη βοήθεια των αντίστοιχων αμινοξικών ακολουθιών των PPARs από τα θηλαστικά, το βάτραχο (Xenopus laevis) και το φασί του Ατλαντικού (Leaver et al., 2005). Σύμφωνα με αυτή τη διαδικασία, η κωδικοποιούμενη περιοχή του υποδοχέα PPARα στην τσιπούρα αποτελείται από 477 αμινοξέα. Στο λαβράκι η ακολουθία του PPARα που ενισχύθηκε με το ανοικτό αναγνωστικό πλαίσιο αποτελείται από 502 αμινοξέα, στην ιππόγλωσσα όπως και στο φασί του Ατλαντικού από 474 και στο σολομό από 465 (προσωπική επικοινωνία με τον Dr Mike Leaver), ενώ στον άνθρωπο από 468 και στο βάτραχο από 470. Ο PPARβ υποδοχέας κωδικοποιείται από 506 αμινοξέα στην τσιπούρα, 510 στο λαβράκι, 443 στο φασί του Ατλαντικού, την ιππόγλωσσα και το σολομό (η μια ισομορφή του, προσωπική επικοινωνία με τον Dr Mike Leaver), στον άνθρωπο από 441 και στο βάτραχο από 396. Ο PPARγ αποτελείται από 522 αμινοξέα στην τσιπούρα και το λαβράκι, 532 στο φασί του Ατλαντικού, 515 το τμήμα που απομονώσαμε στην ιππόγλωσσα (λείπει τμήμα του 3 άκρου) και 543 στο σολομό (προσωπική επικοινωνία με τον Dr Mike Leaver). Στον άνθρωπο ο PPARγ κωδικοποιείται από 475 αμινοξέα και στο βάτραχο από 477. Με τη βοήθεια του ίδιου προγράμματος OMIGA 2.0, έγιναν οι ομοπαραθέσεις των αμινοξικών ακολουθιών των τριών τύπων υποδοχέων από την τσιπούρα, το λαβράκι και την ιππόγλωσσα, χρησιμοποιώντας και τις ακολουθίες των PPARs από το φασί του Ατλαντικού (Leaver et al., 2005) και το σολομό. Επίσης έγιναν οι συγκρίσεις των αμινοξικών αλληλουχιών κάθε περιοχής των τριών τύπων PPAR της τσιπούρας με τις αντίστοιχες ακολουθίες από τα άλλα τέσσερα είδη ψαριών, τον άνθρωπο και το βάτραχο (Εικόνα 24). Τα αποτελέσματα αυτών των συγκρίσεων έδειξαν ότι τα μεγαλύτερα ποσοστά ομοιότητας ανάμεσα στα είδη των ψαριών, αλλά και στους αντίστοιχους τύπους των υποδοχέων στο βάτραχο και στον άνθρωπο, παρουσιάζονται στη DBD και στην LBD περιοχή (Εικόνα 24). Το επί τις εκατό ποσοστό ομοιότητας στις συγκεκριμένες

165 περιοχές ξεπερνά το 90% ανάμεσα στα είδη των ψαριών, με εξαίρεση τον σολομό, ο οποίος εμφανίζει τις περισσότερες διαφοροποιήσεις από τα υπόλοιπα είδη. Υψηλότερο από 70% είναι το ποσοστό ομοιότητας στις DBD και LBD περιοχές ανάμεσα στα ψάρια, το βάτραχο και τον άνθρωπο. Η λιγότερη συντηρημένη περιοχή σε όλους τους τύπους PPAR και σε όλα τα είδη είναι η Α/Β (Εικόνα 24). Το επί τις εκατό ποσοστό ομοιότητας ανάμεσα στα ψάρια και στα άλλα σπονδυλωτά στη συγκεκριμένη περιοχή είναι <30% στους PPARα και PPARγ, με ελαχιστοποίησή του σε ποσοστό <15% στο PPARβ. Ενδιαφέρον αποτελεί το υψηλό ποσοστό ομοιότητας που παρουσιάζεται στην Α/Β περιοχή ανάμεσα στην τσιπούρατο λαβράκι και το φασί του Ατλαντικού. Επικεντρώνοντας στους PPARs των ψαριών, η σύγκριση της ακολουθίας των αμινοξέων της πρωτεΐνης του PPARα της τσιπούρας με τις αντίστοιχες των υπολοίπων ειδών ψαριών έδειξε ομοιότητα 84% με το λαβράκι, 89% με το φασί του Ατλαντικού, 87% με την ιππόγλωσσα και 72% με το σολομό (Εικόνα 20). Στον PPARβ, τα ποσοστά ομοιότητας που παρατηρήθηκαν ανάμεσα στην αμινοξική αλληλουχία της τσιπούρας και των άλλων ειδών ήταν τα υψηλότερα και συγκεκριμένα 95% με το λαβράκι, 90% με το φασί του Ατλαντικού, 91% με την ιππόγλωσσα και 70% με το σολομό. Το μικρό αυτό ποσοστό ομοιότητας με το σολομό οφείλεται κυρίως στην κατά πολύ μικρότερη Α/Β περιοχή του PPARβ του σολομού, όπως φαίνεται από την ομοπαράθεση των ακολουθιών του συγκεκριμένου υποδοχέα των ψαριών (Εικόνα 21). Η σύγκριση της αμινοξικής ακολουθίας του PPARγ του σολομού με την αντίστοιχη της τσιπούρας έδειξε μόλις 63% ομοιότητα, ενώ ανάμεσα στην τσιπούρα και στα υπόλοιπα είδη ψαριών η ομοιότητα παραμένει σε υψηλά επίπεδα (Εικόνα 22). Το μεγαλύτερο ποσοστό ομοιότητας παρουσιάζεται μεταξύ τσιπούρας και λαβρακιού (92%), ακολουθεί η ομοιότητα μεταξύ τσιπούρας και φασί του Ατλαντικού (89%) και τέλος μεταξύ τσιπούρας και ιππόγλωσσας (88%).

166 D. labrax PPARα RGWYLSSHLI STRISVSPIM SNYCPTIPQV LSVWQ PR AKPKQRVPAP H. hippoglossus PPARα MA GDLYSPPSPL GDSLLGSPLC GDLME DL CDISQSMGDS P. platessa PPARα MA GDLYSPPSPL GESLLGSPLC GDLME DY CDISQSMEDS S. aurata PPARα MSALISTMA GDLFSPPSPL GDSLLDSPLC GDLME DP RDISQSIGDD S. salar PPARα M ASHYRPPSPL EDSVLGSPVC GDFLGGMEEL QDISQSIDGD D. labrax PPARα FVN NGMVN QSRCNSKKKK KKWRSKFGLS LFLLSALLCA ADTLTPASSP H. hippoglossus PPARα ALG FDIPE YQSTGSG SESSTA LDTLTPASSP P. platessa PPARα ALG FDIPE YQSTGSG SESSTA LDTLTPASSP S. aurata PPARα TLG FDFPQ YQSTGSG SESSIA LDTLTPASSP S. salar PPARα ALSSLEMIPE YQSQSSNG SEGSTV LDALTPASSP D. labrax PPARα SSGVCGAAPG PEE SFSPLN LECRVCSDKA SGFHYGVHAC EGCKGFFRRA H. hippoglossus PPARα LSGVCGAAPG TEDSLN LECRVCSDKA SGFHYGVHAC EGCKGFFRRT P. platessa PPARα LSGVCGAAPG TEESLN LECRVCSDKA SGFHYGVHAC EGCKGFFRRT S. aurata PPARα SSGVCGATQG PEE TSTPLN LECRICSDKA SGFHYGVHAC EGCKGFFRRT S. salar PPARα SSGGYGAAAG LEEFSSTSLN LECRVCADRA SGYHYGVHAC EGCKGFFRRT D. labrax PPARα IRLKLDYDKC ERNCKIQKKN RNKCQYCRFH KCLSVGMSHN AIRFGRMPQA H. hippoglossus PPARα IRLKLEYDKC ERNCKILKKN RNKCQYCRFH KCLSVGMSHN AIRFGRMPQA P. platessa PPARα IRLKLEYDKC ERSCKILKKN RNKCQYCRFH KCLSVGMSHN AIRFGRMPQA S. aurata PPARα IRLRLEYDKC ERNCKIQKKN RNKCQYCRFH KCLSVGMSHN AIRFGRMPQA S. salar PPARα IRLKLEYDKC ERRCKIQKKN RNKCQYCRFQ KCLSVGMSHN AIRFGRMPQS D. labrax PPARα EKLKLKAESK MVEKEVASPM LDDHKILVRQ IHEAYMKNFN MNKAKARLIL H. hippoglossus PPARα EKLKLKAESN MVEKEAESPM LADHKILVRQ IHDAYMKNFN MSKAKAKLIL P. platessa PPARα EKLKLKAESN MVEKEAESPM LADHKILVRQ IHDAYMKNFN MSKAKAKLIL S. aurata PPARα EKLKLKAERK VVEKEVAGPM LADHKILVRE IHGAYMKNFS MNKAKARLIL S. salar PPARα EKLKLKAEIL TGDREVEDPQ QADQKTLARH IYEAYLKNFN MNKAKARTIL D. labrax PPARα TGKTSKPPFI IHDMETFQLA ERTLAAHMVN GDYPEPESGL QGGEVVPAGG H. hippoglossus PPARα TGKTSKPPFI IHDMETFQLA ERTLAAHMVN GDQAEPECGL QSRDVALDAE P. platessa PPARα TGKTSKPPFI IHDMETFQLA ERTLAAHMVN GDQAEPECGL QSRAVALDAE S. aurata PPARα TGKTSKQPFI IHDMETFQLA EKTLAAHMVN GDNQEPESGL QAGELVPAVG S. salar PPARα TGKTSTPPFV IHDMETLQLA EQTLVAKMVG T AG D. labrax PPARα CVELQQRKAE ARLFHCCQST SVETVTELTE FAKAVPGFQS LDLNDQVTLL H. hippoglossus PPARα CGELEQREAE ARLFYCCQST SVETVTELTE FAKAVPGFQS LDLNDQVTLL P. platessa PPARα CGELEQREAE ARLFFCCQST SVETVTELTE FAKAVPGFQS LDLNDQVTLL S. aurata PPARα CGELQQREAE ARLFHCCQST SVETVTELTE FAKAVPGFQS LDLNDQVTLL S. salar PPARα SHLLEKEAE VRIFHCCQCT SVETVTELTE FAKSVPGFSS LDLNDQVTLL D. labrax PPARα KYGVYEALFT LLASCMNKDG LLVARGGGFI TREFLKTLRR PFSDMMEPKF H. hippoglossus PPARα KYGVYEALFT LLASCMNKDG LLVARGGGFI TREFLKSLRR PFSDMMEPKF P. platessa PPARα KYGVYEALFT LLASCMNKDG LLVARGGGFI TREFLKSLRR PFSDMMEPKF S. aurata PPARα KYGVYEALFT LLASCMNKDG LLVARGGGFI TREFLKSLRR PFSDMMEPKF S. salar PPARα KYGVYEALFA LLASCMNKDG LLVAYGSGFI TREFLKSLRR PFSDMMERKF D. labrax PPARα QFATRFNSLE LDDSDLALFV AAIICCGDRP GLVDVPLVEQ LQESLVQALR H. hippoglossus PPARα QFATRFNSLE LDDSDLALFV AAIICCGDRP GLVDVPLVEQ LQESIVQALQ P. platessa PPARα QFATRFNSLE LDDSDLALFV AAIICCGDRP GLVDVPLVEQ LQESIVQALQ S. aurata PPARα QFATRFNSLE LDDSDLALFV AAIICCGDRP GLVDVPLVEQ LQESIVQVLR S. salar PPARα QFAMKFNGLE LDDSDLALFV AAIICCGDRP GLVNVTHIEC MQENIVQVLQ D. labrax PPARα LHLLANHPDD NFLFPRLLQK LADLRELVTE HAQLVQEIKT TEDTSLHPLL H. hippoglossus PPARα LHLLANHPDN TFLFPRLLQK LADLRELVTE HAQLVQEIKT TEDAALHPLL P. platessa PPARα LHLLANHPDI TFLFPRLLQK LADLRELVTE HAQLVQEIKT TEDAALHPLL S. aurata PPARα LHLLANHPDD TFLFPRLLQK LADLRELVTE HAQLVQEIKT TEDTSLHPLL S. salar PPARα LHLLANHPDD TFLFPNLLQK LADLRQLVTE HAQLVQEIKK TEDTSLHPLL 508 D. labrax PPARα QEIYRDMY H. hippoglossus PPARα QEIYRDMY P. platessa PPARα QEIYRDMY S. aurata PPARα QEIYRDMY S. salar PPARα QEIYRDMY Εικόνα 20. Ομοπαράθεση των υποδοχέων PPARα από το λαβράκι (D. labrax), την ιππόγλωσσα (H. hippoglossus), το φασί του Ατλαντικού (P.platessa), την τσιπούρας (S.aurata) και το σολoμό (S.salar). Figure 20. Alignment of the amino acid sequences of PPARα of sea bass (D. labrax), halibut (H. hippoglossus), plaice (P.platessa), sea bream (S.aurata) and salmon (S.salar).

167 D. labrax PPARβ MEGFNKTATE QHDRVNGYCK PKSPQDAADV RWTPPEGESG GSDSCGGTSV H. hippoglossus PPARβ MEGVQPTVTE QHDGVNGYCE PKSPQDAADV RWTSPKRESG GSDSCGGASV P. platessa PPARβ MEGVQPTVSE QHDRVNGYCE PKSPQDAAEV RWTSPKRESG GSDSCGGASV S. aurata PPARβ MEWFQETATE QHDRVNGYCN PKSPQDTADV RWTPPEGESG GSDSCGGTSV S. salar PPARβ D. labrax PPARβ SELTDLQELK ARESEDEEDK EDKERDVVPA SKGLKGDQKK KEKESLDQ H. hippoglossus PPARβ SELTDVQELK ARESEDEEDR VKKE RVPV SKGLKGDQKS KEKEHLDQEK P. platessa PPARβ SELTDEQELK ARESEDEEDN EKKK RVPV SKGLKGDQKS KEKEHLDQEK S. aurata PPARβ SELTDVQELK ARESEDEEDK EEKE VVPA SKGLKGDQAK KEKESP S. salar PPARβ MKSHDEEVV QQEQ E DQQE KGNSNS H D. labrax PPARβ EENSKKNSSA ATSYTDLSHT SSPSLSEQLR LGREDSTGSG ISVECKVCGG H. hippoglossus PPARβ NNHSKQNSSG ASSYTDLSHT SSPSLSEQLR LGREDSTGAG ISVECKVCGD P. platessa PPARβ NNHSKQKSSG ASSYTDLSHT SSPSLSEQLR LGREDSTGAG ISVECKVCGD S. aurata PPARβ EEKNKQNSSA ATSYTDLSQT SSPSLSEQLR LGREDNAGAG ISVECKVCGD S. salar PPARβ STSNTDSPAL SSSCTDLSQT SSPSLSDQLL LGREDVTGAG INVECRICGD D. labrax PPARβ KASGFHYGVH ACEGCKGFFR RTVRMKLEYD RCERSCKIQK KDRNKCQYCR H. hippoglossus PPARβ KASGFHYGVH ACEGCKGFFR RTVRMKLEYD RCERSCKILK KNRNKCQYCR P. platessa PPARβ KASGFHYGVH ACEGCKGFFR RTVRMKLEYD RCERSCKILK KNRNKCQYCR S. aurata PPARβ KASGFHYGVH ACEGCKGFFR RTVRMKLEYD RCERSCKIQK KNRNKCQYCR S. salar PPARβ KASGFHYGVH ACEGCKGFFR RTIRMKLEYE RCERSCKIQK KSRNKCQYCR D. labrax PPARβ FQKCLSLGMS HDAIRYGRMP EAERKRLVAG LLAEEQNHGK PGGSDLKTL H. hippoglossus PPARβ FQKCLSLGMS HDAIRYGRMP EAERKKLVAG LLAEELNVSK PGGSDLKTL P. platessa PPARβ FQKCLSLGMS HDAIRYGRMP EAERKKLVAG LLAEELTVSK PGGSDLKTL S. aurata PPARβ FQKCLSLGMS HDAIRYGRMP EAERKKLVAG LLAEELNVGK PGGSDLKTL S. salar PPARβ FQKCLLLGMS HDAIRYGRMP EAEKRKLVAG LLAGERAPTT NPNGSDLKSL D. labrax PPARβ AKQVNTAYLK NLSMTKKRAR SILMGKTSST SPFVI YDVDTLWKAE H. hippoglossus PPARβ AKQVNAAYLK NLSMTKKRAR SILTGKTSST SPFVI YDVDTLWKAE P. platessa PPARβ AKQVNAAYLK NLVMTKKRAR SILTGKTSST SPFVI YDVDTLWKAE S. aurata PPARβ AKQVYTAYLK NLSMTKKRAR SILMGKTAST SPFVI YDVDTLWKAE S. salar PPARβ AKEVNNAYLK NLNMTKKKAR SILTGKTSSS PVEYPYPFVI HDMDSLCQAE D. labrax PPARβ SGLVWSQLVP GAPLTKEIGV HVFYRCQCTT VETVRELTEF AKCIPGFVDL H. hippoglossus PPARβ SGLVWSQLLP GAPLTKEIGV HVFYRCQCTT VETVRELTEF AKSIPGFVDL P. platessa PPARβ SGLVWSQLLA GAPLTKEIGV HVFYRCQCTT VETVRELTEF AKSIPGFQDL S. aurata PPARβ SGLVWSQLVP GAPLTKEIGV HVFYRCQCTT VETVRELTEF AKCIPGFVDL S. salar PPARβ NGLVWKQLIN GTTPNKEIGV HVFYRCQCTT VETVRELTEF AKSIPGFVDL D. labrax PPARβ FLNDQVTLLK YGVHEAIFAM LPSLMNKDGL LVANGKGFVT REFLRSLRKP H. hippoglossus PPARβ YLNDQVTLLK YGVHEAIFAM LPSLMNKDGL LVANGKGFVT REFLRSLRKP P. platessa PPARβ YLNDQVTLLK YGVHEAIFAM LPSLMNKDGL LVANGKGFVT REFLRSLRKP S. aurata PPARβ FLNDQVTLLK YGVHEAIFAM LPSLMNKDGL LVANGKGFVT REFLRSLRKP S. salar PPARβ FLNDQVTLLK YGVHEAIFAM LPSLMNKDGL LVANGKGFVT REFLRSLRRP D. labrax PPARβ FSEIMEPKFE FAVKFNALEL DDSDLALFVA AIILCGDRPG LINVKQVEQS H. hippoglossus PPARβ FSEIMEPKFE FAVKFNALEL DDSDLALFVA AIILCGDRPG LMNVKQVEQS P. platessa PPARβ FSEIMEPKFE FAVKFNALEL DDSDLALFVA AIILCGDRPG LMNVKQVEQS S. aurata PPARβ FSEIMEPKFE FAVKFNALEL DDSDLALFVA AIILCGDRPG LMNVKQVEQS S. salar PPARβ FSEIMEPKFE FAVKFNALEL DDSDLALFVA AIILCGDRPG LINIKQVEEI D. labrax PPARβ QDSILQALDL HLQANHSDSV YLFPKLLQKM ADLRQLVTEN VHLVQKIKKT H. hippoglossus PPARβ QDNILQALDL HLQANHSDSA YLFPKLLQKM ADLRQLVTEN ALLVQKIKKT P. platessa PPARβ QDNILQALDL HLQANHSDSL YLFPKLLQKM ADLRQLVTEN ALLVQKIKKT S. aurata PPARβ QDSILQALDL HLQANHSDSV YLFPKLLQKM ADLRQLVTEN VHLVQKIKKT S. salar PPARβ QDSILQALDQ HLLANHTDSK YLFPKLLNKM ADLRQLVTEN AMLVQKIKKT D. labrax PPARβ ESETSLHPLL QEIYKDMY H. hippoglossus PPARβ ESETSLHPLL QEIYKDMY P. platessa PPARβ ESETSLHPLL QEIYKDMY S. aurata PPARβ ESETSLHPLL QEIYKDMY S. salar PPARβ ESETSLHPLL QEIYKDMY Εικόνα 21. Ομοπαράθεση των υποδοχέων PPARβ από το λαβράκι (D. labrax), την ιππόγλωσσα (H. hippoglossus), το φασί του Ατλαντικού (P.platessa), την τσιπούρα (S.aurata) και το σολoμό (S.salar). Figure 21. Alignment of the amino acid sequences of PPARβ of sea bass (D. labrax), halibut (H. hippoglossus), plaice (P.platessa), sea bream (S.aurata) and salmon (S.salar).

168 D. labrax PPARγ MVDTQQLLAW PVGFSLNAVD LSEPDDSSHS LDMKHLSTLD YASISSSSIP H. hippoglossus PPARγ MVDTQQLLAW PVGFSLSAVD LSELDDSSHS LDMKHLSTLD YTSISSASVP P. platessa PPARγ MVDTQQLLAW PVGFSLSAVD LSELDDSSHS LDMKHLATLD YTSISSASVP S. aurata PPARγ MVDTQQLLAW PVGFSLNAVD LSELDDSSHS LDMKHLSTLD YTSISSSSIH S. salar PPARγ MVDTRRAAWS LLSFGLGTLD LVEMDNKMNS FDMKTLSTLD YPYLPSLEYS D. labrax PPARγ SSLSPSLVSC ISPAGVAYDP SPTQ SEEHLTNMDY TNMHIYRTEQ H. hippoglossus PPARγ SSLSPQLMSS ISSVGVAYDP SPPQ SEEHLTNMDY TNMHSYRTEQ P. platessa PPARγ SSLSPQLMSS ISPVGMAYDP SPPQ SEEHLTNMDY TNMHSYRTEP S. aurata PPARγ SPLSPSVVSC MSPAGVAYDP SPPQ GEEHLTNMDY TNMHSYRTEL S. salar PPARγ HNSPHHHHSP DRSHSCNHSP DRSHSFNHSP DRSHSFNHSP DRNHSFNHSP D. labrax PPARγ DTHNSIKLEP E SPPQFSDC PVFSKHQD H. hippoglossus PPARγ NVHNSIKMEP E SPPQYSDS PVFSKLQD P. platessa PPARγ NVHNSIKMEP E SPPQYSDS PVFSKLQD S. aurata PPARγ DTHNMIKREP E SPPQLSDS PVFSKLQD S. salar PPARγ DRSHSFNHSP DRSHSYNDTY SVYQGSVNDK PLSPSQSSDC SIVSLSRPRP D. labrax PPARγ DTP AAALNIECRV CGDKASGFHY GVHACEGCKG FFRRTIRLKL H. hippoglossus PPARγ DTS TASLNIECRV CGDKASGFHY GVHACEGCKG FFRRTIRLKL P. platessa PPARγ DPT AASLNIECRV CGDKASGFHY GVHACEGCKG FFRRTIRLKL S. aurata PPARγ DTP ASALNIECRV CGDKASGFHY GVHACEGCKG FFRRTIRLKL S. salar PPARγ HSNPPTYTDA SSLLNIDCRV CGDKASGFHY GVHVCEGCKG FFRRTVRLKL D. labrax PPARγ VYDHCDLHCR IHKKSRNKCQ YCRFQKCLNV GMSHNAIRFG RMPQAEKEKL H. hippoglossus PPARγ VHDHCDLHCR IHKKSRNKCQ YCRFQKCLNV GMSHNAIRFG RMPQAEKEKL P. platessa PPARγ VYDHCDLHCR IHKKSRNKCQ YCRFQKCLNV GMSHNAIRFG RMPQAEKEKL S. aurata PPARγ VYDHCDLHCR IHKKSRNKCQ YCRFQKCLNV GMSHNAIRFG RMPQAEKEKL S. salar PPARγ VYDHCDLHCR IHKKSRNKCQ YCRFQKCLLV GMSHDAIRFG RMPQVEREKL D. labrax PPARγ LAEFSSDMEH MHPEAADLRA LSRHLYEAYL KYFPLTKAKA RAILSGKTGD H. hippoglossus PPARγ LAEFSSDMEH MHPEAADLRA LARHLYEAYL KYFPLTKAKA RAILSGKTGD P. platessa PPARγ LAEFSSDMEH MHPEAADLRA LARHLYEAYL KYFPLTKAKA RAILSGKTGD S. aurata PPARγ LAEFSSDMEH MHPEAADLRA LSRHLYEAYL KYFPLTKAKA RAILSGKTGD S. salar PPARγ LQAEFMDVEP RNPESADLRA LSRQLCLSYH RHFPLTKSKA KAILSGKTHG D. labrax PPARγ NAPFVIHDMK SLMEGEQFIN CKQIPTQEHQ PQTSALSVGH GGLMGAHLG H. hippoglossus PPARγ NAPFVIHDMK SLMEGEQFIN CRQMPIQEQQ ASVLTAAH GGLTEVHMGS P. platessa PPARγ NAPFVIHDMK SLMEGEQFIN CRQMPIQEQQ QASVLTAAH GGLTEVHMGS S. aurata PPARγ NAPFVIHDMK SLMEGEQFIN CKQLPNQEHQ PQTSALTFGH GGVTGAYLG S. salar PPARγ NSPFVIHDMK SLTAGQYFIN CRQLPVLERQ RSVL P D. labrax PPARγ SECNILDAVE LRFFHSCQSR SAEAVREVTE FAKSIPGFIN H. hippoglossus PPARγ DYSVWGMTSI SGQEPQNALE LRFFQSCQSR SAEAVREVTE FAKSIPGFTD P. platessa PPARγ DYGVWGMTSI SGQEPQNALE LRFFQSCQSP SAEAVREVTE FAKSIPGFTD S. aurata PPARγ LEHSGMDAVE LRFFQSCQSR SAEAVREVTE FAKSIPGFID S. salar PPARγ PEEPAEELE LSVFRRIQFR SAEAVQEVTE FTKSIPGFTE D. labrax PPARγ LDLNDQVTLL KYGVIEVLII MMAPLMNKDG TLIAYGQIFM TREFLKSLRK H. hippoglossus PPARγ LDLNDQVTLL KYGVIEVLII MMSPLMNKDG TLISYGQIFM TREFLKSLRK P. platessa PPARγ LDLNDQVTLL KYGVIEVLII MMSPLMNKDG TLISYGQIFM TREFLKSLRK S. aurata PPARγ LDLNDQVTLL KYGVIEVLII MMAPLMNKDG TLISYGQIFM TREFLKSLRK S. salar PPARγ LDMNDQVILL KYGVIEVMTT MLAPLMNKDG TLFAYGQIFM TREFLKSLRK D. labrax PPARγ PFCQMMEPKF EFSVKFNTLE LDDSDMALFL AVIILSGDRP GLLNVKPIEQ H. hippoglossus PPARγ PFCQMMEPKF EFSVKFNTLE LDDSDMALFL VVIILSGDRP GLLNVKPIEQ P. platessa PPARγ PFCQMMEPKF EFSVKFNTLE LDDSDMALFL VVIILSGDRP GLLNVKPIEQ S. aurata PPARγ PFCQMMEPKF EFSVKFNVPE LDDSDMALFL AVIILSGDRP GLMNVKPIEQ S. salar PPARγ PFCEMMEPKF EFAAKFNLLE LDDSDMALFF AVIILSGDRP GLVNVKPIED D. labrax PPARγ LQETVLHALE LQLKLNHPDS LQLFAKLLQK MTDLRQIVTD HVHLIQLLKK H. hippoglossus PPARγ LQETVLHSLE LQLKLNHPDS LQLFAKLLQK MTDLRQIVTD HVHLIQLLKK P. platessa PPARγ LQETVLHSLE LQLKLNHPDS LQLFAKLLQK MTDLRQIVTD HVHLIQLLKK S. aurata PPARγ LQETVLHSLE LQLKLNHPDS LQLFAKLLQK MTGLRQIVTD HVHLIQLLKK S. salar PPARγ LQETVLQALE LQLKTIHPDC PQLFAKLLQK MTDLRQLVAN HVRHIHLLKK D. labrax PPARγ TEVDMCLHPL LQEIMKDLY H. hippoglossus PPARγ TEI P. platessa PPARγ TEVDMCLHPL LQEIMKDLY S. aurata PPARγ TEIDMCLHPL LQEIMKDLY S. salar PPARγ QELQMCLHPL LQEIMRDLY Εικόνα 22. Ομοπαράθεση των υποδοχέων PPARγ από το λαβράκι (D. labrax), την ιππόγλωσσα (H. hippoglossus), το φασί του Ατλαντικού (P.platessa), τη τσιπούρα (S.aurata) και το σολoμό (S.salar). Figure 22. Alignment of the amino acid sequences of PPARα of sea bass (D. labrax), halibut (H. hippoglossus), plaice (P.platessa), sea bream (S.aurata) and salmon (S.salar).

169 A/B C D. labrax PPARα RGWYLSSHLI STRISVSPIM SNYCPTIPQV LSVWQ PR AKPKQRVPAP FVN NGMVN QSRCNSKKKK KKWRSKFGLS LFLLSALLCA ADTLTPASSP S. aurata PPARα MSALISTMA GDLFSPPSPL GDSLLDSPLC GDLME DP RDISQSIGDD TLG FDFPQ YQSTGSG SESSIA LDTLTPASSP D D. labrax PPARα SSGVCGAAPG PEE SFSPLN LECRVCSDKA SGFHYGVHAC EGCKGFFRRA IRLKLDYDKC ERNCKIQKKN RNKCQYCRFH KCLSVGMSHN AIRFGRMPQA S. aurata PPARα SSGVCGATQG PEE TSTPLN LECRICSDKA SGFHYGVHAC EGCKGFFRRT IRLRLEYDKC ERNCKIQKKN RNKCQYCRFH KCLSVGMSHN AIRFGRMPQA H1 H2 H2 E/F D. labrax PPARα EKLKLKAESK MVEKEVASPM LDDHKILVRQ IHEAYMKNFN MNKAKARLIL TGKTSKPPFI IHDMETFQLA ERTLAAHMVN GDYPEPESGL QGGEVVPAGG S. aurata PPARα EKLKLKAERK VVEKEVAGPM LADHKILVRE IHGAYMKNFS MNKAKARLIL TGKTSKQPFI IHDMETFQLA EKTLAAHMVN GDNQEPESGL QAGELVPAVG H3 H3 H4 H5 H6 H D. labrax PPARα CVELQQRKAE ARLFHCCQST SVETVTELTE FAKAVPGFQS LDLNDQVTLL KYGVYEALFT LLASCMNKDG LLVARGGGFI TREFLKTLRR PFSDMMEPKF S. aurata PPARα CGELQQREAE ARLFHCCQST SVETVTELTE FAKAVPGFQS LDLNDQVTLL KYGVYEALFT LLASCMNKDG LLVARGGGFI TREFLKSLRR PFSDMMEPKF H8 H9 H10 HAF D. labrax PPARα QFATRFNSLE LDDSDLALFV AAIICCGDRP GLVDVPLVEQ LQESLVQAIR LHLLANHPDD NFLFPRLLQK LADLRELVTE HAQLVQEIKT TEDTSLHPLL S. aurata PPARα QFATRFNSLE LDDSDLALFV AAIICCGDRP GLVDVPLVEQ LQESIVQVLR LHLLANHPDD TFLFPRLLQK LADLRELVTE HAQLVQEIKT TEDTSLHPLL 501 D. labrax PPARα QEIYRDMY S. aurata PPARα QEIYRDMY Ομοπαράθεση των αμινοξικών αλληλουχιών του PPARα από το λαβράκι (D. labrax) και τη τσιπούρα (S.aurata). Alignment of the amino acid sequences of PPARα of sea bass (D. labrax) and sea bream (S.aurata) D. labrax PPARβ MEGFNKTATE QHDRVNGYCK PKSPQDAADV RWTPPEGESG GSDSCGGTSV SELTDLQELK ARESEDEEDK EDKERDVVPA SKGLKGDQKK KEKESLDQEE S. aurata PPARβ MEWFQETATE QHDRVNGYCN PKSPQDTADV RWTPPEGESG GSDSCGGTSV SELTDVQELK ARESEDEEDK EEKE..VVPA SKGLKGDQAK KEKESP..EE A/B D. labrax PPARβ NSKKNSSAAT SYTDLSHTSS PSLSEQLRLG REDSTGSGIS VECKVCGGKA SGFHYGVHAC EGCKGFFRRT VRMKLEYDRC ERSCKIQKKD RNKCQYCRFQ S. aurata PPARβ KNKQNSSAAT SYTDLSQTSS PSLSEQLRLG REDNAGAGIS VECKVCGDKA SGFHYGVHAC EGCKGFFRRT VRMKLEYDRC ERSCKIQKKN RNKCQYCRFQ C D H1 H2 H D. labrax PPARβ KCLSLGMSHD AIRYGRMPEA ERKRLVAGLL AEEQNHGKPG GSDLKTLAKQ VNTAYLKNLS MTKKRARSIL MGKTSSTSPF VIYDVDTLWK AESGLVWSQL S. aurata PPARβ KCLSLGMSHD AIRYGRMPEA ERKKLVAGLL AEELNVGKPG GSDLKTLAKQ VYTAYLKNLS MTKKRARSIL MGKTASTSPF VIYDVDTLWK AESGLVWSQL H3 H3 H4 H5 H6 H7 E/F D. labrax PPARβ VPGAPLTKEI GVHVFYRCQC TTVETVRELT EFAKCIPGFV DLFLNDQVTL LKYGVHEAIF AMLPSLMNKD GLLVANGKGF VTREFLRSLR KPFSEIMEPK S. aurata PPARβ VPGAPLTKEI GVHVFYRCQC TTVETVRELT EFAKCIPGFV DLFLNDQVTL LKYGVHEAIF AMLPSLMNKD GLLVANGKGF VTREFLRSLR KPFSEIMEPK H8 H9 H D. labrax PPARβ FEFAVKFNAL ELDDSDLALF VAAIILCGDR PGLINVKQVE QSQDSILQAL DLHLQANHSD SVYLFPKLLQ KMADLRQLVT ENVHLVQKIK KTESETSLHP S. aurata PPARβ FEFAVKFNAL ELDDSDLALF VAAIILCGDR PGLMNVKQVE QSQDSILQAL DLHLQANHSD SVYLFPKLLQ KMADLRQLVT ENVHLVQKIK KTESETSLHP HAF D. labrax PPARβ LLQEIYKDMY S. aurata PPARβ LLQEIYKDMY Ομοπαράθεση των αμινοξικών αλληλουχιών του PPARβ από το λαβράκι (D. labrax) και τη τσιπούρα (S.aurata). Alignment of the amino acid sequences of PPARβ of sea bass (D. labrax) and sea bream (S.aurata).

170 A/B D. labrax PPARγ MVDTQQLLAW PVGFSLNAVD LSEPDDSSHS LDMKHLSTLD YASISSSSIP SSLSPSLVSC ISPAGVAYDP SPTQSEEHLT NMDYTNMHIY RTEQDTHNSI S. aurata PPARγ MVDTQQLLAW PVGFSLNAVD LSELDDSSHS LDMKHLSTLD YTSISSSSIH SPLSPSVVSC MSPAGVAYDP SPPQGEEHLT NMDYTNMHSY RTELDTHNMI C D. labrax PPARγ KLEPESPPQF SDCPVFSKHQ DDTPAAALNI ECRVCGDKAS GFHYGVHACE GCKGFFRRTI RLKLVYDHCD LHCRIHKKSR NKCQYCRFQK CLNVGMSHNA S. aurata PPARγ KREPESPPQL SDSPVFSKLQ DDTPASALNI ECRVCGDKAS GFHYGVHACE GCKGFFRRTI RLKLVYDHCD LHCRIHKKSR NKCQYCRFQK CLNVGMSHNA D H1 H2 H2 H D. labrax PPARγ IRFGRMPQAE KEKLLAEFSS DMEHMHPEAA DLRALSRHLY EAYLKYFPLT KAKARAILSG KTGDNAPFVI HDMKSLMEGE QFINCKQIPT QEHQPQTSAL S. aurata PPARγ IRFGRMPQAE KEKLLAEFSS DMEHMHPEAA DLRALSRHLY EAYLKYFPLT KAKARAILSG KTGDNAPFVI HDMKSLMEGE QFINCKQLPN QEHQPQTSAL E/F H3 H4 H5 H D. labrax PPARγ SVGHGGLMGA HLGSECNILD AVELRFFHSC QSRSAEAVRE VTEFAKSIPG FINLDLNDQV TLLKYGVIEV LIIMMAPLMN KDGTLIAYGQ IFMTREFLKS S. aurata PPARγ TFGHGGVTGA YLGLEHSGMD AVELRFFQSC QSRSAEAVRE VTEFAKSIPG FIDLDLNDQV TLLKYGVIEV LIIMMAPLMN KDGTLISYGQ IFMTREFLKS H7 H8 H9 H D. labrax PPARγ LRKPFCQMME PKFEFSVKFN TLELDDSDMA LFLAVIILSG DRPGLLNVKP IEQLQETVLH ALELQLKLNH PDSLQLFAKL LQKMTDLRQI VTDHVHLIQL S. aurata PPARγ LRKPFCQMME PKFEFSVKFN VLELDDSDMA LFLAVIILSG DRPGLMNVKP IEQLQETVLH SLELQLKLNH PDSLQLFAKL LQKMTDLRQI VTDHVHLIQL HAF D. labrax PPARγ LKKTEVDMCL HPLLQEIMKD LY S. aurata PPARγ LKKTEIDMCL HPLLQEIMKD LY Ομοπαράθεση των αμινοξικών αλληλουχιών του PPARγ από το λαβράκι (D. labrax) και τη τσιπούρα (S.aurata). Alignment of the amino acid sequences of PPARγ of sea bass (D. labrax) and sea bream (S.aurata). Εικόνα 23.Οι αμινοξικές ακολουθίες των τριών τύπων PPAR από το λαβράκι (D.labrax) και την τσιπούρα (S.aurata). Οι τέσσερις λειτουργικές περιοχές των πρωτεϊνών (Α-E/F) φαίνονται στα σχήματα με τις έντονες γραμμές των τεσσάρων διαφορετικών χρωμάτων. Οι ακολουθίες των P-box και D-box αντιστοιχούν στα πράσινα και σκούρα κόκκινα γράμματα. Η πιθανή δευτεροταγή δομή της LBD (α-έλικες, Η1-Η10 και HAF) φαίνεται στα παραπάνω σχήματα με τα μπλε διπλα βέλη. Ακολουθίες που σχετίζονται με τη σύνδεση του προδέτη, σύμφωνα με μελέτες σε άλλα είδη δείχνονται με τα κόκκινα γράμματα. Τα έντονα μαύρα τόξα δείχνουν τα σημεία που παρεμβάλλονται τα ιντρόνια. Figure 23. Amino acid sequence of the three PPAR subtypes from sea bass and sea bream. The four functional domains of the proteins (A-E/F) are indicated by thick lines in different colors. The P-box and D-box sequences are shown in dark green and dark red, respectively. Presumed secondary structure in the ligand binding domain (α- helices, H1-H10, HAF) are indicated by thin blue lines. Residues known to be involved in ligand binding in other species are shown in red. Arrowheads indicate the intron sites.

171 D.labrax P.platessa H.hippoglossus S.salar X.laevis H.sapiens Α/Β C D E PPARα PPARβ PPARγ Εικόνα 24. Σύγκριση των τριών τύπων PPAR σε διάφορα είδη. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν την επί τις εκατό ομολογία της αμινοξικής ακολουθίας κάθε περιοχής των υποδοχέων από το λαβράκι (D.labrax), το φασί του Ατλαντικού (P.platessa), την ιππόγλωσσα (H.hippoglossus), το σολoμό (S.salar), το βάτραχο (X..laevis) και τον άνθρωπο (H.sapiens) σε σχέση με την ακολουθία της τσιπούρας (S.aurata). Figure 24. Comparison of the three PPAR subtypes in different species. The bars represent the percentage amino acid sequence homology in the different domains of the PPAR subtypes from sea bass (D. labrax), plaice (P. platessa), halibut (H.hippoglossus), Atlantic salmon (S. salar), African clawed frog (X. laevis) and human (H. sapiens) to sea bream (S.aurata).

172 Αμινοξική αλληλουχία του PPARα2 της τσιπούρας Η πρωτεΐνη του τμήματος του PPARα2 της τσιπούρας που ενισχύθηκε κωδικοποιείται από 465 αμινοξέα. Η αμινοξική αλληλουχία καθορίστηκε με τη βοήθεια του λογισμικού OMIGA 2.0 και τη σύγκριση με τις αντίστοιχες αλληλουχίες από το λαβράκι, το Fugu rubribes και το Tetraodon nigroviridis. Μάλιστα η σύγκριση της αμινοξικής αλληλουχίας των LBD περιοχών του PPARα2 από το λαβράκι, το Fugu rubribes, την τσιπούρα και το Tetraodon nigroviridis, παρουσίασε 93% ποσοστό ομοιότητας (Εικόνα 25). Η ομοπαράθεση των αμινοξικών αλληλουχιών των δυο ισομορφών του PPARα στη τσιπούρα έδειξε 83% ομοιότητα, ενώ το ποσοστό έπεσε στο 79% όταν η σύγκριση περιορίστηκε στην αλληλουχία των αμινοξέων μόνο της LBD περιοχής, υποδεικνύοντας ότι είναι μια περιοχή σχετικά υψηλής διαφοροποίησης. Αυτή η διαφοροποίηση της LBD στις δυο ισομορφές του PPARα διακρίνεται και από την ομοπαράθεση των αμινοξικών αλληλουχιών της LBD περιοχής του PPARα2 από το λαβράκι, το Fugu rubribes, την τσιπούρα και το Tetraodon nigroviridis με την LBD περιοχή της πρώτης ισομορφής του PPARα από την τσιπούρα. Γι αυτό το λόγο όλες οι ομοπαραθέσεις της ακολουθίας της συγκεκριμένης ισομορφής περιορίστηκαν στις αμινοξικές αλληλουχίες της συγκεκριμένης περιοχής. Ακόμη η αμινοξική αλληλουχία του PPARα2 της τσιπούρας συγκρίθηκε με τον PPARα που ενισχύθηκε από το σολομό, λόγω της ομοιότητας που παρουσιάζουν στη δομή της LBD περιοχής τους, κωδικοποιούμενες από δύο εξώνια. Οι αμινοξικές ακολουθίες τους παρουσίασαν 85% ομοιότητα και το ποσοστό αυξήθηκε στο 96% όταν περιορίστηκε η σύγκριση στην LBD περιοχής τους (Εικόνα 26).

173 D labrax PPARa2 LBD Fugu rubripesppara2 LBD S aurata PPARa2 LBD T nirgoviridis PPARa2 LBD P F V I H D M E T L Q L A E Q T L V A K M V G S A G T L K D P F V I H D M E T L Q L A E Q T L V A K M V S S E G T L K D S A A S L K D - F V I H D M E T L Q L A E Q T L V A K M V S S A G T L K D D labrax PPARa2 LBD Fugu rubripesppara2 LBD S aurata PPARa2 LBD T nirgoviridis PPARa2 LBD R E A E V R I F H C C Q C T S V E T V T E L T E F A K S V P R E V E V R I F H C C Q Y T S V E T V T E L T E F A K S V P R E A E V R I F H C C Q C T S V E T V T E L T E F A K S V P R E A E V R I F H C C Q Y T S V E T V T E L T E F A K S V P D labrax PPARa2 LBD Fugu rubripesppara2 LBD S aurata PPARa2 LBD T nirgoviridis PPARa2 LBD G F S S L D L S D Q V T L L K Y G V Y E A L F A M L A S S M G F S R L D L N D Q V T L L K Y G V Y E A L F A M L A S C M G F S S L D L N D Q V T L L K Y G V Y E A L F A L L A S S M G F S S L D L N D Q V T L L K Y G V Y E A L F A M L A S C M D labrax PPARa2 LBD Fugu rubripesppara2 LBD S aurata PPARa2 LBD T nirgoviridis PPARa2 LBD N K D G L L V A Y G S G F I T R E F L K S L R R P F S D M M N K D G L L V A Y G S G F I T R E F L K S L R R P F S D M M N K D G L L V A Y G S G F I T R E F L K S L R R P F S D M M N K D G L L V A Y G S G F I T R E F L K S L R R P F S D M M D labrax PPARa2 LBD Fugu rubripesppara2 LBD S aurata PPARa2 LBD T nirgoviridis PPARa2 LBD E P K F Q F A M K F N G L E L D D S D L A L F V A A I I C C E P K F Q F A M K F N G L G L D D S D L A L F V A A I I C C E P K F Q F A M K F N G L E L D D S D L A L F V A A I I C C E P K F Q F A M K F N G L G L D D S D L A L F V A A I I C C D labrax PPARa2 LBD Fugu rubripesppara2 LBD S aurata PPARa2 LBD T nirgoviridis PPARa2 LBD G - D R P G L V N V A H I E R M Q E S I V Q V L Q L H L L A G G D R P G L V N V A H I E R M Q E S I V R V L Q L H L L A G - D R P G L V N V A H I E R M Q G - D R P G L V N V T H I E R M Q E S I V R V L Q L H L L A D labrax PPARa2 LBD Fugu rubripesppara2 LBD S aurata PPARa2 LBD T nirgoviridis PPARa2 LBD N H P D D T F L F P N N H P D D T F L F P R L L Q K L A D L R Q L V T E H A Q V V N H P D D A F L F P R L L Q K L A D L R Q L V T E H A Q L V D labrax PPARa2 LBD Fugu rubripesppara2 LBD S aurata PPARa2 LBD T nirgoviridis PPARa2 LBD Q E I K K T E D T S L H P L L Q E I Y R D M Y Q E I Εικόνα 25. Ομοπαράθεση της αμινοξικής αλληλουχίας της LBD περιοχής του PPARα2 από το λαβράκι (D.labrax), το F.rubripes, τη τσιπούρα (S.aurata) και το T.nigroviridis. Figure 25. Alignment of the amino acid sequences of the PPARα2 LBD domain of sea bass (D.labrax), fugu (F.rubripes), sea bream (S.aurata) and tetraodon (T.nigroviridis).

174 S aurata PPARa2 LBD S salar PPAR alpha LBD S A A S L K P F V I H D M E T L Q L A E Q T L V A K M V G T A G S H L L S aurata PPARa2 LBD S salar PPAR alpha LBD D R E A E V R I F H C C Q C T S V E T V T E L T E F A K S V E K E A E V R I F H C C Q C T S V E T V T E L T E F A K S V S aurata PPARa2 LBD S salar PPAR alpha LBD P G F S S L D L N D Q V T L L K Y G V Y E A L F A L L A S S P G F S S L D L N D Q V T L L K Y G V Y E A L F A L L A S C S aurata PPARa2 LBD S salar PPAR alpha LBD M N K D G L L V A Y G S G F I T R E F L K S L R R P F S D M M N K D G L L V A Y G S G F I T R E F L K S L R R P F S D M S aurata PPARa2 LBD S salar PPAR alpha LBD M E P K F Q F A M K F N G L E L D D S D L A L F V A A I I C M E P K F Q F A M K F N G L E L D D S D L A L F V A A I I C S aurata PPARa2 LBD S salar PPAR alpha LBD C G D R P G L V N V A H I E R M Q C G D R P G L V N V T H I E C M Q E N I V Q V L Q L H L L A S aurata PPARa2 LBD S salar PPAR alpha LBD N H P D D T F L F P N L L Q K L A D L R Q L V T E H A Q L V S aurata PPARa2 LBD S salar PPAR alpha LBD Q E I K K T E D T S L H P L L Q E I Y R D M Y Εικόνα 26. Ομοπαράθεση της αμινοξικής αλληλουχίας της LBD περιοχής του PPARα2 της τσιπούρας (S.aurata) με του σολομού (S.salar). Figure 26. Alignment of the amino acid sequence of the LBD domain of sea bream (S.aurata) PPARα2 and salmon PPARα (S.salar).

175 3.4. Ιστοειδική έκφραση των PPARs στην τσιπούρα και το λαβράκι Το πρότυπο της ιστοειδικής έκφρασης της τσιπούρας και του λαβρακιού, καθορίστηκε με τη μέθοδο RΝase protection, που εφαρμόστηκε σε ολικό RNA από δέκα ιστούς των ψαριών, η επιλογή των οποίων βασίστηκε στα αποτελέσματα μελετών στα θηλαστικά που τους υπέδειξαν ως βασικούς ιστούς έκφρασης των PPARs (Braissant et al., 1996). Στις αντιδράσεις χρησιμοποιήθηκαν ως σημασμένοι ριβονουκλεοανιχνευτές η περιοχή D από κάθε τύπο PPAR. Η συγκεκριμένη περιοχή επιλέχθηκε γιατί παρουσιάζει τις περισσότερες διαφοροποιήσεις ανάμεσα στους τρεις τύπους PPAR μετά από την Α/Β περιοχή, η οποία δεν μπορούσε να χρησιμοποιηθεί εφόσον δε γνωρίζαμε αν υπήρχε περίπτωση εναλλακτικής συρραφής. Τα αποτελέσματα των συγκεκριμένων πειραμάτων έδειξαν ότι οι τρεις τύποι PPAR στην τσιπούρα, όπως φαίνεται και στην Εικόνα 27, εκφράζονται σε όλους σχεδόν τους ιστούς που εξετάστηκαν. Ο PPARα εκφράζεται σε μεγαλύτερο βαθμό στο ήπαρ, στην καρδιά και στον ερυθρό μυ, αποτελώντας και τον κυρίαρχο τύπο PPAR στους συγκεκριμένους ιστούς και σε χαμηλότερο βαθμό στους υπόλοιπους, ενώ δεν ανιχνεύτηκε στο λίπος. Ο PPARβ εκφράζεται σε όλους τους ιστούς που μελετήθηκαν. Στα νεφρά και στη σπλήνα εκφράζεται σε μεγαλύτερο βαθμό από τον PPARα, ενώ στον εγκέφαλο και στο ήπαρ σε μεγαλύτερο βαθμό από τον PPARγ. Ο PPARγ είναι ο κυρίαρχος τύπος PPAR στο λίπος και στο έντερο. Στο λαβράκι (Εικόνα 28), ο PPARα εκφράζεται στο ήπαρ, στα βράγχια, στην καρδιά, στον ερυθρό μυ και στον εγκέφαλο, με μεγαλύτερο βαθμό έκφρασης σε σχέση με τους άλλους δυο τύπους στον ερυθρό μυ. Εκφράζεται ελάχιστα στο έντερο και στη σπλήνα, ενώ δεν ανιχνεύθηκε καθόλου στα νεφρά και στο λίπος. Ο PPARβ του λαβρακιού, όπως και της τσιπούρας εκφράζεται σε όλους τους ιστούς, με μεγαλύτερο βαθμό έκφρασης στο ήπαρ και χαμηλότερο στους υπόλοιπους ιστούς, ενώ μόλις ανιχνεύσιμη ήταν η έκφραση του στο λευκό μυ. Ο PPARγ, όπως και ο PPARα παρουσιάζει περιορισμένο πρότυπο ιστοειδικής έκφρασης, εκφραζόμενος κυρίως στο λιπώδη ιστό. Σχετικά υψηλή έκφραση του PPARγ ανιχνεύθηκε στα βράγχια και χαμηλότερα ποσά στον ερυθρό μυ και στο έντερο.

176 PPARγ (201 nt) L K I G H S W R B A PPARβ (177 nt) PPARα (150 nt) β-actin Εικόνα 27. Πρότυπο ιστοειδικής έκφρασης των τριών τύπων PPARs στην τσιπούρα, με τη μέθοδο RNase protection. Σε κάθε τύπο PPAR αναγράφεται το μέγεθος του «προστατευμένου» τμήματος RNA σε νουκλεοτίδια (nt) που αντιστοιχούν στην περιοχή D. Οι ιστοί που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: L: ήπαρ, K: νεφρά, I: λεπτό έντερο (κοντά στο τυφλό έντερο), G: βράγχια, H: καρδιά, S: σπλήνα, W: λευκός μυς, R: ερυθρός μυς, B: εγκέφαλος και A: λίπος (μεσεντέριο). Μαζί με την έκφραση των PPARs φαίνεται και η έκφραση της β- ακτίνης στους αντίστοιχους ιστούς, που χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Figure 27. Tissue expression profile of sea bream PPARs with RNase protection method. The size (nucleotides, nt) of the protected fragment of the three PPAR riboprobes corresponding to D domain are also indicated. The tissues were used were: L: liver, K: kidney, I: intestine (proximal to cecum), G: gills, H: heart, S: spleen, W: white muscle, R: red muscle, B: brain and A: adipose (mesenteral). β-actin expression was used as an internal standard in order to quantify PPAR subtype expression in the different tissues tested.

177 PPARγ (201 nt) PPARα (197 nt) L K I G H S W R B A PPARβ (175 nt) β-actin Εικόνα 28. Πρότυπο ιστοειδικής έκφρασης των τριών τύπων PPARs στο λαβράκι, με τη μέθοδο RNase protection. Σε κάθε τύπο PPAR αναγράφεται το μέγεθος του «προστατευμένου» τμήματος RNA σε νουκλεοτίδια (nt). Οι ιστοί που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: L: ήπαρ, K: νεφρά, I: λεπτό έντερο (κοντά στο τυφλό έντερο), G: βράγχια, H: καρδιά, S: σπλήνα, W: λευκός μυς, R: ερυθρός μυς, B: εγκέφαλος και A: λίπος (μεσεντέριο). Μαζί με την έκφραση των PPARs φαίνεται και η έκφραση της β-ακτίνης στους αντίστοιχους ιστούς, που χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Figure 28. Tissue expression profile of sea bass PPARs with RNase protection method. The size (nucleotides, nt) of the protected fragment of the three PPAR riboprobes corresponding to D domain are also indicated. The tissues were used were: L: liver, K: kidney, I: intestine (proximal to cecum), G: gills, H: heart, S: spleen, W: white muscle, R: red muscle, B: brain and A: adipose (mesenteral). β-actin expression was used as an internal standard in order to quantify PPAR subtype expression in the different tissues tested.

178 3.5. Οι PPARs από την τσιπούρα, το λαβράκι, το σολομό και το φασί του Ατλαντικού δημιουργούν σύμπλοκα με τον RXR σε αποκρινόμενα στοιχεία του τύπου DR-1 Οι ιδιότητες της DBD περιοχής των PPARs των ψαριών ελέγχθηκαν, μέσω της ικανότητας τους να αναγνωρίζουν ακολουθίες αποκρινόμενων στοιχείων των PPARs (PPREs) καθιερωμένων όπως το ACO από τον προαγωγέα του γονιδίου της ακυλ- CoA οξειδάσης (Tugwood et al., 1992) και το z PPRE του γονιδίου του κυτοχρώματος Cyp4A6 (Muerhoff et al., 1992), ή υποτιθέμενων PPREs από τον προαγωγέα του γονιδίου της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης Α1 (GSTA1) από το φασί του Ατλαντικού (Leaver et al., 1997). Όλες οι ακολουθίες που χρησιμοποιήθηκαν, με τις 5 πλευρικές ακολουθίες τους, φαίνονται στον Πίνακα 2. ACO.A Cyp4A6-Z GSTA1.1 GSTA1.2 GSTA1.3 Consensus GACC AGGACA A AGGTCA AACT AGGGCA A AGTTGA GTAT TGGTCA A GGGTCA TCAA GGGTCA A AGGTCA TGAG TGGTCA A GGATCA AACT AGGNCA A AGGTCA Πίνακας 2. Οι αλληλουχίες των PPREs που χρησιμοποιήθηκαν μαζί με τις 5 πλευρικές ακολουθίες τους. Όλες είναι του τύπου DR-1, συγκεκριμένα συντίθενται από την απευθείας επανάληψη της εξανουκλεοτιδικής αλληλουχίας 5 -AGGTCA, που διαχωρίζεται από ένα νουκλεοτίδιο και παρουσιάζουν σημαντική ομολογία με την ομόφωνη ακολουθία του PPRE σύμφωνα με τον ορισμό αυτής κατά Ijpenberg et al., 1997 (σκιασμένα είναι τα νουκλεοτίδια που είναι όμοια με αυτά της ομόφωνης ακολουθίας -consensus). Table 2. The sequences, including the 5 flanking sequences, of the different PPRE tested. They are response elements of the DR-1 type, consisting of a direct repeat of the hexanucleotide sequence 5 -AGGTCA, spaced by one nucleotide. They exhibit significant homology with the consensus sequence of the PPRE as it was determined by Ijpenberg et al., 1997 (residues identical to the consensus sequence are shaded).

179 Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη μέθοδο προσδιορισμού της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας των συμπλόκων DNA-πρωτεϊνών (Electrophoretic Mobility Shift Assay). Αρχικά ήταν απαραίτητη η in vitro μετάφραση των πρωτεϊνών των PPARs από την τσιπούρα, το λαβράκι, το φασί του Ατλαντικού και το σολομό, καθώς και των πρωτεϊνών των υποδοχέων RXRα από τον άνθρωπο (hrxrα), RXRβ από τον ποντικό (mrxrβ) και RXRα από το φασί του Ατλαντικού (PpRXRα). Η αποτελεσματικότητα της in vitro μετάφρασης ελέγχθηκε με την πραγματοποίηση των αντιδράσεων παρουσία ραδιενεργά σημασμένης μεθειονίνης με 35 S. Στην Εικόνα 29, φαίνονται οι in vitro μεταφρασμένες πρωτεΐνες των PPARs και RXRs, με εξαίρεση την πρωτεΐνη του υποδοχέα PPARα του λαβρακιού (επειδή όπως αναφέρθηκε δεν μπόρεσε να ενισχυθεί το 5 άκρο του υποδοχέα) και την πρωτεΐνη του υποδοχέα RXRα από το φασί του Ατλαντικού (μειωμένη ικανότητα μετάφρασης της πρωτεΐνης). Στη συνέχεια σημάνθηκαν ραδιενεργά με 32 Ρ οι ακολουθίες των υπο εξέταση PPREs και πραγματοποιήθηκαν διάφορες αντιδράσεις που περιγράφονται παρακάτω σύμφωνα με το πρωτόκολλο των Keller et al., (1993). Στα προκαταρκτικά πειράματα χρησιμοποιήθηκαν οι δύο διαφορετικοί υποδοχείς RXR, ο hrxrα και ο mrxrβ. Στην Εικόνα 30, διακρίνεται η ικανότητα του καθενός να σχηματίζουν ετεροδιμερή με τους τρεις τύπους PPAR από το φασί του Ατλαντικού, τους PPAR α και β από την τσιπούρα και τον PPARγ από το λαβράκι και το σολομό, αναγνωρίζοντας ως PPREs τις ακολουθίες των ACO και GSTA1.1. Τα σχηματιζόμενα σύμπλοκα DNA-πρωτεϊνών στις περιπτώσεις που χρησιμοποιήθηκε ο υποδοχέας mrxrβ, ήταν πάντα πολύ πιο ισχυρά, πιθανόν γιατί όπως φαίνεται και στην Εικόνα 29, ήταν πιο αποτελεσματική η in vitro μετάφραση του σε σχέση με του υποδοχέα hrxrα. Έτσι αποφασίστηκε η χρησιμοποίηση του mrxrβ για τα πειράματα που περιγράφονται παρακάτω. Εξετάστηκε η δυνατότητα των τριών τύπων PPAR από την τσιπούρα, να σχηματίζουν ετεροδιμερή με τον υποδοχέα mrxrβ και να δεσμεύονται στις πέντε ακολουθίες που χρησιμοποιήθηκαν ως ραδιενεργά σημασμένοι ανιχνευτές. Τα αποτελέσματα της εφαρμογής της μεθόδου EMSA, έδειξαν ότι και οι τρεις τύποι PPAR της τσιπούρας, μπορούν και δημιουργούν ειδικά σύμπλοκα με τον υποδοχέα mrxrβ αναγνωρίζοντας τις ακολουθίες των ACO, GSTA1.1, GSTA1.2 και Cyp4A6z (Εικόνα 31).

180 Κατά τον ίδιο τρόπο μελετήθηκε και η ικανότητα των τριών τύπων PPAR από το φασί του Ατλαντικού να προσδένονται στις ακολουθίες των ραδιενεργά σημασμένων ανιχνευτών, ως ετεροδιμερή με τον mrxrβ. Το αποτέλεσμα που προέκυψε ήταν παρόμοιο με αυτό της τσιπούρας, δηλαδή οι PPARs από το φασί του Ατλαντικού αναγνώρισαν τις ακολουθίες μόνο των τεσσάρων ραδιενεργά σημασμένων ανιχνευτών ACO, GSTA1.1, GSTA1.2 και Cyp4A6z (Εικόνα 32). Παρόμοια με την τσιπούρα και το φασί του Ατλαντικού, οι PPARs του σολομού μπορούν και σχηματίζουν ετεροδιμερή με τον υποδοχέα mrxrβ και τα ετεροδιμερή τους αναγνωρίζουν και προσδένονται στις ίδιες ακολουθίες (Εικόνα 33). Επίσης, οι PPAR β και γ από το λαβράκι (ο PPARα δε μελετήθηκε, λόγω της έλλειψης του κωδικονίου έναρξης στο cdna κλώνο του, όπως προαναφέρθηκε) μπορούν και ετεροδιμερίζονται με τον mrxrβ, σχηματίζοντας ειδικά σύμπλοκα στους ίδιους τέσσερις ραδιενεργά σημασμένους ανιχνευτές (Εικόνα 34). Κανένας τύπος PPAR, σε κανένα από τα εξεταζόμενα είδη, δεν μπόρεσε να αναγνωρίσει την ακολουθία του ραδιενεργά σημασμένου ανιχνευτή GSTA1.3 στη συγκεκριμένη in vitro κατάσταση. Η ειδική δέσμευση των συμπλόκων των PPARs με τον mrxrβ στις αλληλουχίες των ραδιενεργά σημασμένων ανιχνευτών επιβεβαιώθηκε με πειράματα ανταγωνισμού με ειδικούς και μη ανταγωνιστές. Ενδεικτικά φαίνονται στην Εικόνα 35, τα αποτελέσματα δύο πειραμάτων ανταγωνισμού για τον PPARγ της τσιπούρας και για τον PPARα από το φασί του Ατλαντικού. Το σύμπλοκο του PPARγ της τσιπούρας με τον mrxrβ στο GSTA1.2, ανταγωνίστηκε με μη ραδιενεργά σημασμένες ακολουθίες των ACO, GSTA1.2 και GSTA1.3 σε συγκεντρώσεις 10Χ, 20Χ και 50Χ μεγαλύτερες από τη συγκέντρωση του ραδιενεργά σημασμένου GSTA1.2. Το ACO όπως φαίνεται και στην Εικόνα 35Α, αποτελεί ανταγωνιστή του GSTA1.2, καθώς μειώνει τη δυνατότητα του σχηματισμού του ειδικού συμπλόκου ήδη από τη μικρότερη συγκέντρωση (10Χ) και σχεδόν εξαφανίζοντας το σύμπλοκο στη μεγαλύτερη συγκέντρωση (50Χ). Η προσθήκη του μη ραδιενεργά σημασμένου GSTA1.2 ανταγωνίζεται πλήρως το σχηματισμό του ειδικού συμπλόκου, ακόμα και από τη χαμηλότερη συγκέντρωση που χρησιμοποιήθηκε. Σε αντίθεση το GSTA1.3, επιβεβαιώθηκε ότι δεν δημιουργεί ισχυρά σύμπλοκα στη συγκεκριμένη in vitro κατάσταση, καθώς απέτυχε να ανταγωνιστεί το σχηματισμό του ειδικού συμπλόκου (των PPARs των ψαριών) στο GSTA.1.2, ακόμα και στην υψηλότερη συγκέντρωση που χρησιμοποιήθηκε. Παρόμοια είναι τα αποτελέσματα και με τον PPARα από το

181 φασί του Ατλαντικού (Εικόνα 35Β), όπου το ειδικό σύμπλοκο του με τον mrxrβ στην ακολουθία του ACO εξαφανίστηκε όταν χρησιμοποιήθηκε ο GSTA.1.2 ως ανταγωνιστής ήδη από τη χαμηλότερη χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση, ενώ δεν επηρεάστηκε καθόλου με την προσθήκη του GSTA.1.3. Για να επιβεβαιωθεί η παρουσία του PPARγ στα ετεροδιμερή PPAR:RXR που σχηματίστηκαν στα προαναφερόμενα πειράματα, χρησιμοποιήθηκε το ειδικό αντίσωμα έναντι του PPARγ των ψαριών, που παρασκευάστηκε από την ομάδα του Dr Jose Bautista. Έτσι με την προσθήκη του ειδικού αντισώματος στις αντιδράσεις της μεθόδου EMSA, διακρίνονται εκτός από τα ειδικά σύμπλοκα που σχημάτισαν οι PPARγ από την τσιπούρα (Εικόνα 36Α), το φασί του Ατλαντικού (Εικόνα 36Α) και το λαβράκι (Εικόνα 36Β) με τον mrxrβ στις ακολουθίες των ραδιενεργά σημασμένων ανιχνευτών GSTA1.2 και ACO και τα σχηματιζόμενα «υπερσύμπλοκα». Ενδεικτικά φαίνονται στην Εικόνα 31, η ικανότητα των PPARs των τεσσάρων ειδών ψαριών να σχηματίζουν ετεροδιμερή με τον υποδοχέα PpRXRα και να αναγνωρίζουν τις ίδιες ακολουθίες ως PPREs. Γενικότερα, φαίνεται ότι οι τρεις τύποι PPAR από την τσιπούρα και το φασί του Ατλαντικού, καθώς και οι PPAR β και γ από το λαβράκι, παρουσιάζουν παρόμοιες ιδιότητες στη DBD περιοχή τους, αναγνωρίζοντας και δημιουργώντας σύμπλοκα παρόμοιας ισχύς στις ακολουθίες των ACO, GSTA1.1, GSTA1.2 και Cyp4A6z (Εικόνες 31, 32 και 34). Ο PPARγ του σολομού φαίνεται ότι δημιουργεί πολύ αδύναμα σύμπλοκα με τις ακολουθίες των ACO, GSTA1.1 και Cyp4A6z, με εξαίρεση την ακολουθία του GSTA1.2 (Εικόνα 33). Αυτή η συμπεριφορά δε μελετήθηκε περαιτέρω.

182 A Β M Da Da Εικόνα 29. Α: Διαχωρισμός σε πηκτή πολυακρυλαμίδης SDS PAGE των in vitro μεταφρασμένων και σημασμένων ραδιενεργά με 35 S πρωτεϊνών των PPARs των ψαριών και των RXRs από θηλαστικά που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα EMSA. Μ : ραδιενεργά σημασμένος μάρτυρας, δείκτης μοριακών βαρών πρωτεϊνών (Rainbow Marker, Amersham, Biotech). Σειρές 1-3: PPARα, PPARβ και PPARγ από το φασί του Ατλαντικού, Σειρές 4-7: PPARα, PPARβ και PPARγ από την τσιπούρα, Σειρές 7-8: PPARβ και PPARγ από το σολομό, Σειρά 9: PPARγ από το λαβράκι, Σειρά 10 : RXRβ του ποντικού και Σειρά 11: RXRα από τον άνθρωπο. Β: Οι in vitro μεταφρασμένες πρωτεΐνες των Σειρά 1: PPARβ από το φασί του Ατλαντικού και Σειρά 2: PPARα του σολομού, σημασμένες ραδιενεργά με 35 S. Η πρωτεΐνη του PPARβ από το φασί του Ατλαντικού χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας του μοριακού βάρους της πρωτεΐνης του PPARα του σολομού. Figure 29. Α: The in vitro translated and radiolabeled with 35 S fish PPAR and mammalian RXR proteins seperated on SDS PAGE polyacrylamide gel. M: the molecular weight marker (Rainbow Marker, Amersham, Biotech). Lanes 1-3: plaice PPARα, PPARβ and PPARγ, Lanes 4-7: sea bream PPARα, PPARβ and PPARγ, Lanes 7-8: salmon PPARβ and PPARγ, Lane 9: sea bass PPARγ, Lane 10: mouse RXRβ and Lane 11: human RXRα. Β: Two in vitro translated and radiolabeled with 35 S PPAR proteins. Lane 1: plaice PPARβ and Lane 2: salmon PPARα. The plaice PPARβ protein is used as a molecular weight marker for salmon PPARα protein.

183 Α Είδος: Pp Sa Ss Dl Pp Sa Ss Dl PPAR: C α β γ α β β γ γ C α β γ α β β γ γ PPAR/ hrxrα ACO σύμπλοκα PPAR/ mrxrβ ACO σύμπλοκα μη δεσμευόμενος 32 P-ανιχνευτής μη δεσμευόμενος 32 P-ανιχνευτής Β Είδος: Pp Sa Ss Dl Pp Sa Ss Dl PPAR: C α β γ α β β γ γ C αβ γ α β β γ γ PPAR/ hrxrα GSTA1.1 σύμπλοκα PPAR/ mrxrβ GSTA1.1 σύμπλοκα μη δεσμευόμενος 32 P-ανιχνευτής μη δεσμευόμενος 32 P-ανιχνευτής Εικόνα 30. Σχηματιζόμενα σύμπλοκα των PPARs των ψαριών με τους hrxrα και mrxrβ στους ραδιενεργά σημασμένους ανιχνευτές ACO και GSTA1.1: Τα ειδικά σύμπλοκα των τριών τύπων PPAR από το φασί του Ατλαντικού (Pp), των PPARs α και β από την τσιπούρα (Sa), των PPAR β και γ από το σολομό (Ss) και του PPARγ από το λαβράκι (Dl), που σχηματίζονται στους ραδιενεργά σημασμένους ανιχνευτές Α: ACO και Β: GSTA1.1, με τους υποδοχείς hrxrα και mrxrβ. Τα C είναι οι μάρτυρες : κυτταρόλυμα δικτυοκυττάρων με τον ραδιενεργά σημασμένο ανιχνευτή. Figure 30. The fish PPARs complexes with hrxrα and mrxrβ to the 32 P radiolabeled probes ACO and GSTA1.1: The specific complexes of the three PPAR subtypes from plaice (Pp), PPAR α and β from sea bream (Sa), PPAR β and γ from salmon (Ss) and PPARγ from sea bass (Dl) with (human) hrxrα and (mouse) mrxrβ to the 32 P radiolabeled probe A: ACO and B: GSTA1.1. C is the unprogrammed reticulocyte lysate.

184 32 P- ανιχνευτής: ACO Cyp4A6z GSTA1.1 GSTA1.2 GSTA1.3 PPAR : C α β γ C α β γ C α β γ C α β γ C α β γ PPAR/mRXRβ/ DNA σύμπλοκα μη δεσμευόμενος 32 P-ανιχνευτής Εικόνα 31. Εντοπισμός των αποκρινόμενων στοιχείων των PPARs της τσιπούρας με τη μέθοδο EMSA: Τα ειδικά σύμπλοκα που σχηματίζουν οι τρεις τύποι PPAR της τσιπούρας με τον υποδοχέα mrxrβ και τις ραδιενεργά σημασμένες με 32 Ρ ακολουθίες των ανιχνευτών ACO, GSTA1.1, GSTA1.2, GSTA1.3 και Cyp4A6z. Τα C είναι οι μάρτυρες: κυτταρόλυμα δικτυοκυττάρων με τον κάθε ραδιενεργά σημασμένο ανιχνευτή. Figure 31. Identification of sea bream PPREs by means of EMSA: The specific complexes of the three PPAR subtypes from sea bream with mrxrβ to the 32 P radiolabeled probes ACO, GSTA1.1, GSTA1.2, GSTA1.3 και Cyp4A6z. C is the unprogrammed reticulocyte lysate.

185 32 P- ανιχνευτής: PPAR : ACO Cyp4A6z GSTA1.1 GSTA1.2 GSTA1.3 C α β γ C α β γ C α β γ C α β γ C α β γ PPAR/mRXRβ/ DNA σύμπλοκα μη δεσμευόμενος 32 P-ανιχνευτής Εικόνα 32. Εντοπισμός των αποκρινόμενων στοιχείων των PPARs από το φασί του Ατλαντικού με τη μέθοδο EMSA: Τα ειδικά σύμπλοκα που σχηματίζουν οι τρεις τύποι PPAR από το φασί του Ατλαντικού με τον υποδοχέα mrxrβ και τις ραδιενεργά σημασμένες με 32 Ρ ακολουθίες των αποκρινόμενων στοιχείων ACO, GSTA1.1, GSTA1.2, GSTA1.3 και Cyp4A6z. Τα C είναι οι μάρτυρες: κυτταρόλυμα δικτυοκυττάρων με τον κάθε ραδιενεργά σημασμένο ανιχνευτή. Figure 32. Identification of plaice PPREs by means of EMSA: The specific complexes of the three PPAR subtypes from plaice with mrxrβ to the 32 P radiolabeled probes ACO, GSTA1.1, GSTA1.2, GSTA1.3 και Cyp4A6z. C is the unprogrammed reticulocyte lysate.

186 32 P- ανιχνευτής: ACO GSTA1.1 GSTA1.2 GSTA1.3 Cyp4A6z PPAR: C α β γ C α β γ C α β γ C α β γ C α β γ PPAR/mRXRβ/ DNA σύμπλοκα μη δεσμευόμενος 32 P-ανιχνευτής Εικόνα 33. Εντοπισμός των αποκρινόμενων στοιχείων των PPARs από το σολομό με τη μέθοδο EMSA: Τα ειδικά σύμπλοκα που σχηματίζουν οι τρεις τύποι PPAR του σολομού με τον υποδοχέα mrxrβ και τις ραδιενεργά σημασμένες με 32 Ρ ακολουθίες των αποκρινόμενων στοιχείων ACO, GSTA1.1, GSTA1.2, GSTA1.3 και Cyp4A6z. Τα C είναι οι μάρτυρες: κυτταρόλυμα δικτυοκυττάρων με τον κάθε ραδιενεργά σημασμένο ανιχνευτή. Figure 33. Identification of salmon PPREs by means of EMSA: The specific complexes of the three PPAR subtypes from salmon with mrxrβ to the 32 P radiolabeled probes ACO, GSTA1.1, GSTA1.2, GSTA1.3 και Cyp4A6z. C is the unprogrammed reticulocyte lysate.

187 32 P- ανιχνευτής: PPAR : ACO GSTA1.1 GSTA1.2 GSTA1.3 Cyp4A6z C β γ C β γ C β γ C β γ C β γ PPAR/mRXRβ/ DNA σύμπλοκα μη δεσμευόμενος 32 P-ανιχνευτής Εικόνα 34. Εντοπισμός των αποκρινόμενων στοιχείων των PPAR β και γ του λαβρακιού με τη μέθοδο EMSA: Τα ειδικά σύμπλοκα που σχηματίζουν οι PPARs β και γ του λαβρακιού με τον υποδοχέα mrxrβ και τις ραδιενεργά σημασμένες με 32 Ρ ακολουθίες των αποκρινόμενων στοιχείων ACO, GSTA1.1, GSTA1.2, GSTA1.3 και Cyp4A6z. Τα C είναι οι μάρτυρες: κυτταρόλυμα δικτυοκυττάρων με τον κάθε ραδιενεργά σημασμένο ανιχνευτή. Figure 34. Identification of sea bass PPREs by means of EMSA: The specific complexes of the PPAR subtypes β and γ from sea bass with mrxrβ to the 32 P radiolabeled probes ACO, GSTA1.1, GSTA1.2, GSTA1.3 και Cyp4A6z. C is the unprogrammed reticulocyte lysate.

188 Α ανταγωνιστής : GSTA1.2 ACO-A GSTA Β Ανταγωνιστής: GSTA1.2 GSTA1.3 C PPARγ/ mrxrβ/ GSTA1.2 σύμπλοκα PPAR/ mrxrβ ACO σύμπλοκα μη δεσμευόμενος 32 P-ανιχνευτής 32 P-GSTA1.2 ελεύθερος ανιχνευτής Εικόνα 35. Ανταγωνισμός των σχηματιζόμενων συμπλόκων του PPARγ της τσιπούρας και του PPARα από το φασί του Ατλαντικού με τον mrxrβ στους ραδιενεργά σημασμένους ανιχνευτές GSTA1.2 και ACO, αντίστοιχα. A: Ανταγωνισμός του ειδικού συμπλόκου του υποδοχέα PPARγ της τσιπούρας με τον υποδοχέα mrxrβ στη ραδιενεργά σημασμένη ακολουθία του GSTA1.2, με τις μη ραδιενεργά σημασμένες ακολουθίες των ACO, GSTA1.2 και GSTA1.3. B: Ανταγωνισμός του ειδικού συμπλόκου του υποδοχέα PPARα από το φασί του Ατλαντικού με τον υποδοχέα mrxrβ στη ραδιενεργά σημασμένη ακολουθία του ACO, με τις μη ραδιενεργά σημασμένες ακολουθίες των GSTA1.2 και GSTA1.3. Οι συγκεντρώσεις των ανταγωνιστών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 10Χ, 20Χ και 50Χ μεγαλύτερες από τις συγκεντρώσεις των ραδιενεργά σημασμένων ακολουθιών GSTA1.2. και ACO. 0: είναι η αντίδραση σχηματισμού του ειδικού συμπλόκου χωρίς την προσθήκη ανταγωνιστών. Το C είναι ο μάρτυρας, κυτταρόλυμα δικτυοκυττάρων με τον ραδιενεργά σημασμένο ανιχνευτή. Figure 35. Α: Competition of sea bream PPARγ and plaice PPARα complex formation with mrxrβ to the 32 P radiolabeled probe GSTA1.2 and ACO, respectively. The specific complex of the sea bream PPARγ with mrxrβ to the 32 P radiolabeled probe GSTA1.2 was subjected to competition experiments with the no radiolabeled probes ACO, GSTA1.2 and GSTA1.3. Β: The specific complex of the plaice PPARα with mrxrβ to the 32 P radiolabeled probe ACO was subjected to competition experiments with the no radiolabeled probes GSTA1.2 and GSTA1.3. The competitors concentrations that were used were 10X, 20X and 50X excess the concetration of the 32 P radiolabeled probes GSTA1.2 and ACO. 0: the reactions of the sea bream PPARγ and the plaice PPARα with mrxrβ to the 32 P radiolabeled probes GSTA1.2 and ACO without the addition of a competitor. C is the unprogrammed reticulocyte lysate

189 A C Β 1 2 * PPARs/mRXRβ/ GSTA1.2 σύμπλοκα PPARγ/mRXRβ/ ACO.A σύμπλοκα Εικόνα 36. Επιβεβαίωση της παρουσίας του PPARγ στα ετεροδιμερή PPAR:RXR με την προσθήκη του ειδικού αντισώματος για τον PPARγ των ψαριών στις αντιδράσεις. Στην εικόνα διακρίνονται τα σύμπλοκα των ετεροδιμερών των PPARγ υποδοχέων από την τσιπούρα, το φασί του Ατλαντικού και το λαβράκι με τον υποδοχέα mrxrβ, στους σημασμένους ανιχνευτές GSTA1.2 και ACO και τα σχηματιζόμενα «υπερσύμπλοκα» με την προσθήκη του εξειδικευμένου αντισώματος για τον PPARγ. Α: Οι υποδοχείς PPARγ της τσιπούρας (1 και 2) και του φασί του Ατλαντικού (3 και 4) επωάζονται με τον mrxrβ και το σημασμένο ανιχνευτή GSTA1.2 παρουσία του είτε του ειδικού αντισώματος για τον PPARγ (2 και 4 αντίστοιχα για την τσιπούρα και το φασί του Ατλαντικού) είτε με τον ορό (1 και 3 αντίστοιχα). Β: Ο υποδοχέας PPARγ του λαβρακιού επωάστηκε με τον υποδοχέα mrxrβ και το σημασμένο ανιχνευτή ACO είτε παρουσία του ειδικού αντισώματος για τον PPARγ (2), είτε με τον ορό (1). Τα «υπερσύμπλοκα» στην εικόνα δείχνονται με τους αστερίσκους. Το C είναι ο μάρτυρας: κυτταρόλυμα δικτυοκυττάρων με τον ραδιενεργά σημασμένο ανιχνευτή. Figure 36. The presence of PPARγ in the PPAR:RXR complexes was confirmed by the use of a marine fish PPARγ-specific antibody. The specific complexes of the PPAR γ subtype from sea bream, plaice and sea bass with mrxrβ to the 32 P radiolabeled probes ACO and GSTA1.2 are supershifted with the addition of the PPARγ-specific antibody. A: sea bream PPARγ (1 and 2) and plaice PPARγ (3 and 4) were incubated with mrxrβ and the 32 P radiolabeled probe GSTA1.2 in the presence of either preimmune serum (lanes 1 and 3 respectively) or PPARγ-specific antibody (lanes 2 and 4 respectively). Sypershifts are indicated by asterisks. C is the unprogrammed reticulocyte lysate.

190 A PPAR: PPAR / PPAR mrxrβ /PpRXRα C α β α β B 32 P- ανιχνευτής: PPAR: ACO.A GSTA1.1 GSTA1.2 α β γ α β γ α β γ C C C PPAR/RXR/ GSTA1.2 σύμπλοκα PPAR/ Pp RXRα DNA σύμπλοκα μη δεσμευόμενος 32 P-ανιχνευτής Γ Δ PPAR / mrxrβ PPAR /PpRXRα PPAR / mrxrβ PPAR /PpRXRα PPAR/ mrxrβ PPAR /PpRXRα PPAR/ mrxrβ PPAR /PpRXRα PPAR: C α β γ α β γ C α β γ α β γ PPAR: C β γ β γ C β γ β γ PPAR/RXR/ DNA σύμπλοκα PPAR/ RXR DNA σύμπλοκα 32 P- ανιχνευτής: GSTA.1 2 Cyp4A6z 32 Ρ- ανιχνευτής: GSTA.1 PPRE2 Cyp4A6Ζ