ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΤΩΝ ΥΛΙΚΩΝ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΤΩΝ ΥΛΙΚΩΝ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΥΜΕΝΙΑ TiO 2 ΓΙΑ ΤΗΝ ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΩΝ ΒΙΟΑΙΣΘΗΤΗΡΩΝ» ΧΡΙΣΤΙΝΑ ΤΙΦΛΙΔΟΥ Α.Μ. 884 ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ κ. ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ ΤΟΠΟΓΛΙΔΗΣ (Λέκτορας Τμήματος Επιστήμης των Υλικών) ΠΑΤΡΑ, Φεβρουάριος 2013

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΤΩΝ ΥΛΙΚΩΝ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΥΜΕΝΙΑ TiO 2 ΓΙΑ ΤΗΝ ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΩΝ ΒΙΟΑΙΣΘΗΤΗΡΩΝ» ΧΡΙΣΤΙΝΑ ΤΙΦΛΙΔΟΥ Α.Μ. 884 ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ κ. ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ ΤΟΠΟΓΛΙΔΗΣ (Λέκτορας Τμήματος Επιστήμης των Υλικών) ΠΑΤΡΑ, Φεβρουάριος 2013 ii

3 Αφιερωμένο σε όσους ξημεροβραδιάζονται στα εργαστήρια iii

4 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέπων μου Δρ. Εμμανουήλ Τοπογλίδη (Λέκτορα του Τμήματος Επιστήμης των Υλικών Πανεπιστημίου Πατρών) για την άριστη συνεργασία, την πολύτιμη βοήθειά του στην επίβλεψη της εργασίας, τις υποδείξεις του που με βοήθησαν να κατανοήσω καλύτερα το θέμα της ανάπτυξης βιοαισθητήρων καθώς επίσης για την εμπιστοσύνη του προς το πρόσωπο μου για την ανάθεση αυτής της εργασίας. Ευχαριστώ πολύ τον Καθηγητή Emilio Palomares (Group Leader at Institute of Chemical Research of Catalonia-ICIQ, Tarragona Spain) καθώς και την ερευνητική του ομάδα για την ευκαιρία που μου δόθηκε μέσο του προγράμματος LLP-Erasmus Student Placements να συνεργαστώ μαζί τους και να μάθω πολλά πράγματα πάνω στο αντικείμενο της παρούσας εργασίας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Δρ. Ευάγγελο Καρούτσο (Ειδικό Τεχνικό Εργαστηριακό Προσωπικό του Τμήματος Επιστήμης των Υλικών Πανεπιστημίου Πατρών) για τις πειραματικές μετρήσεις που πραγματοποίησε (SEM), οι οποίες αποτελούν περιεχόμενο της παρούσας εργασίας. Ευχαριστώ πολύ τον Δρ. Νικόλαο Μπούκο (Ερευνητή Β του Ερευνητικού Ινστιτούτου «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ») για τις μετρήσεις που πραγματοποίησε (TEM), οι οποίες επίσης αποτελούν περιεχόμενο της παρούσας εργασίας. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς μου Αλεξάνδρα και Λάζαρο, τους φίλους μου και τους συναδέλφους, για την συνεχή τους υποστήριξη κατά τη διάρκεια εκπόνησης της διπλωματικής μου εργασίας. iv

5 ΠΙΝΑΚΑΣ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΩΝ TiO 2 : Υμένιο Διοξειδίου του Τιτανίου Cyt-c: Κυτόχρωμα c Hb: Αιμοσφαιρίνη PBS: Ρυθμιστικό Διάλυμα Φωσφορικών TRIS: Ρυθμιστικό Διάλυμα Tris-(hydroxilmethyl) amino-methane HEPES: Ρυθμιστικό Διάλυμα C 8 H 18 N 2 O 4 S SEM: Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης TEM: Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης BET: Ανάλυση Ειδικής Επιφάνειας Brunauer-Emmett-Teller XRD: Περίθλαση Ακτίνων Χ UV-Vis: Φασματοφωτομετρία Υπεριώδους-Ορατού CV: Κυκλική Βολταμετρία WE: Ηλεκτρόδιο Εργασίας RE: Ηλεκτρόδιο Αναφοράς CE: Αντίθετο (Βοηθητικό) Ηλεκτρόδιο v

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα διπλωματική εργασία γίνεται χρήση λεπτών υμενίων TiO 2 ως στερεό υπόστρωμα για την ακινητοποίηση πρωτεϊνών με απώτερο σκοπό την ανάπτυξη ενός αμπερομετρικού βιοαισθητήρα με ευαισθησία στο υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ). Αρχικά περιγράφεται η λειτουργία των βιοαισθητήρων καθώς και οι σημαντικότεροι τύποι βιοαισθητήρων που έχουν κατασκευαστεί μέχρι σήμερα. Σημαντικό ρόλο στην επιτυχή κατασκευή ενός βιοαισθητήρα παίζει η επιλογή του υλικού που θα χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα / ηλεκτρόδιο (υμένια TiO 2 ) καθώς και ο τρόπος που ακινητοποιείται το βιομόριο πάνω σε αυτό, γι αυτό και έχει δοθεί έμφαση στην ανάλυση των παραπάνω πληροφοριών. Επίσης περιγράφεται η δομή και η φυσική λειτουργία της πρωτεΐνης, (κυτόχρωμα c), που χρησιμοποιήθηκε ως το βιομόριο επιλογής για την ανάπτυξη του βιοαισθητήρα. Αναλύθηκαν επίσης οι κρυσταλλικές δομές του διοξειδίου του τιτανίου, οι βασικές φυσικοχημικές τους ιδιότητες και οι λόγοι που επιλέξαμε την ανατάση για τη συγκεκριμένη εργασία. Περιγράφεται η πειραματική διαδικασία εναπόθεσης των υμενίων του TiO 2 σε υποστρώματα αγώγιμου υάλου. Στη συνέχεια περιγράφονται οι πειραματικές διατάξεις που χρησιμοποιήθηκαν τόσο για τον χαρακτηρισμό των υμενίων διοξειδίου του τιτανίου (TiO 2 ) όσο και για την αναλυτική μελέτη της ακινητοποίησης του κυτοχρώματος c πάνω σε αυτά. Τέλος περιγράφεται η ηλεκτροχημική κυψελίδα 3 ηλεκτροδίων και η τεχνική της κυκλικής βολταμετρίας που επιλέχθηκαν τόσο για τη μελέτη των ηλεκτροχημικών ιδιοτήτων των υμενίων TiO 2 με ή χωρίς ακινητοποιημένη πρωτεΐνη όσο και για την ανάπτυξη ενός αμπερομετρικού βιοαισθητήρα με ευαισθησία στο H 2 O 2. vi

7 ABSTRACT In the present study, the use of thin nanocrystalline TiO 2 films as solid substrates for protein immobilization and for the development of an electrochemical biosensor for hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) are investigated. First of all, a general description of biosensors and their most important types that have been developed to date is given. For the successful development of a biosensor, the choice of material/substrate used as the surface/electrode (thin film of TiO 2 ) for the attachment of the bio-molecule of interest, as well as the manner in which the biomolecule is immobilized upon it are critical and therefore emphasis is given for the analysis of this information. Furthermore, a description of the structure and basic functions of the bio-molecules (cytochrome c and hemoglobin), used for the immobilization studies and for the development of the biosensor is presented. Additionally, the crystalline structures of titanium dioxide have been analyzed, along with its basic physicochemical properties and the reasons for choosing its anatase structure for the specific project. In the experimental part, the deposition of the colloidal TiO 2 paste on conducting glass for the preparation of the thin mesoporous TiO 2 films is described in detail. Also described are the experimental techniques used for the characterization of these films as well as a thorough analysis of the binding of cytochrome c upon them and the parameters that influence its adsorption. Finally, description of the 3-elecrode electrochemical cell used in this study of perform of cyclic voltammetry experiments in order to investigate the electrochemical properties of the TiO 2 thin films with or without immobilized protein is given. The same setup is also used for the development of an electrochemical biosensor for H 2 O 2. vii

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ... iv ΠΙΝΑΚΑΣ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΩΝ... v ΠΕΡΙΛΗΨΗ... vi ABSTRACT... vii ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εισαγωγή Στους Βιοαισθητήρες Νανοβιοτεχνολογία Λειτουργία Βιοαισθητήρα Τύποι Βιοαισθητήρων Τεχνικές Ακινητοποίησης Κριτήρια Ποιότητας Βιοαισθητήρων Εφαρμογές Των Βιοαισθητήρων Ημιαγωγοί Θεωρία ενεργειακών ζωνών Ημιαγωγοί n και p τύπου Διοξείδιο Του Τιτανίου (TiO 2 ) Οι Κρυσταλλικές Δομές του TiO Πλεονεκτήματα Και Μειονεκτήματα Χρήσης TiO Πρωτεΐνες Κυτόχρωμα c (Cyt-c) Αιμοσφαιρίνη (Hb) Ισοηλεκτρικό Σημείο Υπεροξείδιο Του Υδρογόνου (H 2 O 2 ) H 2 O 2 Βιοαισθητήρες Που Έχουν Κατασκευαστεί Με Βάση Το Κυτόχρωμα C Μέχρι Σήμερα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΞΕΙΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης (TEM) Ανάλυση Ειδικής Επιφάνειας Brunauer-Emmett-Teller (BET) Περίθλαση Ακτίνων Χ (XRD) Φασματοφωτομετρία Υπεριώδους-Ορατού (UV-Visible) Οργανολογία Βολταμμετρικών Τεχνικών viii

9 Κυκλική Βολταμμετρία ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ο ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Αντιδραστήρια-Υλικά Προετοιμασία Υμενίων TiO 2 (ανατάση) Ακινητοποίηση πρωτεΐνης Προετοιμασία Δειγμάτων Για Χαρακτηρισμό Προετοιμασία Δειγμάτων TiO 2 Για Χαρακτηρισμό SEM Προετοιμασία Δειγμάτων TiO 2 Για Χαρακτηρισμό TEM, BET και XRD Μέτρηση Απορρόφησης Πρωτεΐνης Στα Υμένια TiO Διάταξη Ηλεκτροχημικής Κυψελίδας Τριών Ηλεκτροδίων Για Τις Μετρήσεις Κυκλικής Βολταμμετρίας Ανάπτυξη Βιοαισθητήρα Με Ευαισθησία Στο H 2 O ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ο ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Χαρακτηρισμός Υμενίων TiO Χαρακτηρισμός SEM Χαρακτηρισμός TEM Ανάλυση BET Χαρακτηρισμός XRD Μελέτη Προσρόφησης Κυτοχρώματος C Σε Υμένια TiO Μελέτη Των Παραγόντων Που Επηρεάζουν Την Απορρόφηση Μελέτη Της Εκρόφησης Κυτοχρώματος-c Από Τα Υμένια TiO Κυκλική Βολταμμετρία Αμπερομετρικός Βιοαισθητήρας Με Ευαισθησία Στο H 2 O ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ix

10 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.1. Εισαγωγή Στους Βιοαισθητήρες Νανοβιοτεχνολογία Η νανοβιοτεχνολογία είναι ένας ραγδαία αναπτυσσόμενος κλάδος της σύγχρονης νανοεπιστήμης και νανοτεχνολογίας στον οποίον εφαρμόζονται τα εργαλεία και οι διεργασίες κατασκευής νανοδιατάξεων για την κατασκευή νανοδομών και νανοσυστημάτων που θα προορίζονται για τη μελέτη βιολογικών συστημάτων. Ποια είναι τα building blocks της νανοβιοτεχνολογίας; Σε διαστάσεις νανομέτρου μπορούν τώρα να κατασκευαστούν διάφορες δομές και συστήματα τα οποία λόγω της διάστασής τους έχουν πολύ μεγαλύτερη ευαισθησία και διαπερατότητα, και επιτρέπουν μεγαλύτερη αλληλεπίδραση με τα βιολογικά συστήματα Ακολουθούν μερικές από τις εφαρμογές της νανοβιοτεχνολογίας που αναπτύσσονται: Διαγνωστική: Η αγορά της έρευνας στις Επιστήμες Υγείας επιδιώκει συνεχώς τη βελτίωση των μεθόδων βιοανάλυσης μέσα από την ανάπτυξη νανοδομών για διάφορες βιολογικές διεργασίες. Με τον τρόπο αυτό μειώνεται σημαντικά ο χρόνος, η προσπάθεια αλλά και η δαπάνη κατά την προετοιμασία και την ανάλυση δειγμάτων DNA, αίματος, δειγμάτων ιστών κτλ. Επίσης, η απαίτηση μικρότερης ποσότητας δειγμάτων σημαίνει ελαχιστοποίηση της επέμβασης στον ανθρώπινο οργανισμό για την εξαγωγή του δείγματος, που είναι μία από τις κύριες επιδιώξεις της Νανοϊατρικής. Η νανοβιοτεχνολογία είναι στο επίκεντρο της ανάπτυξης στο πεδίο των βιοαισθητήρων (biosensors) (Εικόνα 1.1.) μέσω της χρήσης νέων προηγμένων νανοϋλικών (nanowires, νανοσωματίδια κ.ά.) βελτιωμένης επιφανειακής μηχανικής που συνδυάζουν οπτικές και ηλεκτροχημικές ιδιότητες. Εικόνα 1.1.: Βιοαισθητήρας. Πηγή: 1

11 Θεραπευτική: Διακρίνεται σε δύο ευρείς τομείς: αυτόν της στοχευμένης θεραπείας (targeted delivery) και στον τομέα της αναγεννητικής ιατρικής (regenerative medicine). [1] Λειτουργία Βιοαισθητήρα Οι βιοαισθητήρες αναπτύχθηκαν κατά το δεύτερο μισό του 20 ου αιώνα. Ο πρώτος βιοαισθητήρας που ήταν ηλεκτροχημικός (ενζυμικά ηλεκτρόδια γλυκόζης, enzyme electrodes for glucose) παρουσιάστηκε το 1962 από τον καθηγητή Leland C.Clark στο Cincinnati. Από τότε έγιναν εκτεταμένες μελέτες που αφορούσαν το σχεδιασμό βιοαισθητήρων για πληθώρα εφαρμογών και κυρίως την κατασκευή σακχαρομέτρων. Ο βιοαισθητήρας είναι μια αυτόνομη συσκευή που παρέχει εξειδικευμένες ποσοτικές ή ημιποσοτικές πληροφορίες για έναν αναλύτη χρησιμοποιώντας ένα βιολογικό αναγνωριστικό στοιχείο που διατηρείται σε άμεση επαφή με έναν μεταλλάκτη σήματος. Ο βιοαισθητήρας είναι ευαίσθητος σε ένα φυσικό ή χημικό ερέθισμα (φως, πίεση, ηλεκτρικό φορτίο κ.λπ.) και μετατρέπει την βιολογική απόκριση σε ένα μετρήσιμο ηλεκτρικό σήμα. Αποτελείται από δύο κύρια μέρη (Εικόνα 1.2.): i. Τον υποδοχέα, ένα εξειδικευμένο βιομόριο (πρωτεΐνες, αντισώματα, DNA, κύτταρα) που αντιδρά πολύ εξειδικευμένα με έναν αναλύτη (μόριο ουσία που προστίθεται για ανίχνευση και μπορεί να είναι μια πρωτεΐνη, ένα σάκχαρο, ένα αντίσωμα ή αντιγόνο, ιόντα, βαρέα μέταλλα, αέρια κ.λπ.). Το βιομόριο είναι ικανό να αναγνωρίζει την παρουσία, την ενεργότητα ή τη συγκέντρωση ενός συγκεκριμένου αναλύτη σε διάλυμα. ii. Την επιφάνεια ακινητοποίησης / Μετατροπέας σήματος (Transducer), που μετατρέπει τη βιολογική / βιοχημική απόκριση (που οφείλεται στην ανίχνευση του αναλύτη) σε μετρήσιμο ηλεκτρικό σήμα. Το μέγεθος του παραγόμενου ηλεκτρικού σήματος είναι αντίστοιχο της συγκέντρωσης του αναλύτη που ανιχνεύθηκε. Εικόνα 1.2.: Δομή του βιοαισθητήρα (receptor ο υποδοχέας, εξειδικευμένο βιομόριο και detector ο ανιχνευτής, ο οποίος παίζει το ρόλο του transducer μετατροπέας σήματος, που μετατρέπει τη βιολογική / βιοχημική απόκριση σε μετρήσιμο ηλεκτρικό σήμα). Πηγή: 2

12 Τα βιολογικά μόρια έχουν την ικανότητα να αντιδρούν και να ανιχνεύουν μόρια πολύ χαμηλών συγκεντρώσεων και γι αυτό χρησιμοποιούνται σε περιβαντολλογικές αναλύσεις (ανίχνευση ρυπαντικών ουσιών, τοξινών στο νερό, στον αέρα και στο έδαφος), σε αναλύσεις τροφίμων (ποιοτικός έλεγχος), σε ιατρικές διαγνωστικές συσκευές (μέτρηση σακχάρου) κ.λπ. [2] Τύποι Βιοαισθητήρων Η ταξινόμηση των βιοαισθητήρων γίνεται με βάση: a) Τον μετατροπέα σήματος που χρησιμοποιείται. b) Τη φύση και τον τρόπο δράσης του βιομορίου αναγνώρισης. c) Τη μέθοδο ακινητοποίησης. Με βάση τον μετατροπέα του σήματος οι βιοαισθητήρες διακρίνονται σε Οπτικούς (μέτρηση απορρόφησης, φθορισμού, χημειοφωτοαύγειας), Ηλεκτροχημικούς (Αμπρομετρικοί, Ποτενσιομετρικοί), Θερμικούς (υπολογίζουν την έκλυση και την απορρόφηση θερμότητας), Βαρυμετρικούς μετρώντας την αλλαγή στη μάζα και υπάρχουν δύο τύποι, οι πιεζοηλεκτρικοί (Piezoelectric) και οι ακουστικοί επιφανειακών κυμάτων (Surface Acoustic wave). Οπτικοί βιοαισθητήρες: Πολύ διαδεδομένοι βιοαισθητήρες. Παρουσιάζεται αλλαγή των οπτικών ιδιοτήτων (στην απορρόφηση ή στον φθορισμό) του βιομορίου αναγνώρισης κατά την ανίχνευση του αναλύτη ή και του ίδιου του αναλύτη. Ηλεκτροχημικοί βιοαισθητήρες: Είναι οι πιο διαδεδομένοι και συχνά χρησιμοποιούμενοι βιοαισθητήρες. Ο μεταλλάκτης σήματος είναι ηλεκτροχημικός και συνήθως είναι ένα ηλεκτρόδιο. Βασίζονται σε κάποια ενζυμικά καταλυόμενη αντίδραση που οδηγεί στην παραγωγή προϊόντων που ανιχνεύονται. Η μετατροπή του σήματος από ηλεκτροχημικό σε μετρήσιμο ηλεκτρικό είναι εύκολη και χαμηλού κόστους. Χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση γλυκόζης στο αίμα. Οι ηλεκτροχημικοί μεταλλάκτες σήματος διακρίνονται σε ποτενσιομετρικούς και αμπερομετρικούς. Ποτενσιομετρικοί βιοαισθητήρες: Υπολογίζουν το οξειδωτικό / αναγωγικό δυναμικό μιας ηλεκτροχημικής αντίδρασης. Καταγράφεται το δυναμικό που διαρρέει ένα ηλεκτροχημικό στοιχείο σε συνθήκες μηδενικού ρεύματος. Αμπερομετρικοί βιοαισθητήρες: Βασίζονται στην ακινητοποίηση ενζύμου στην επιφάνεια ηλεκτροδίου στερεάς κατάστασης (λευκόχρυσου, γραφίτη, άνθρακα, οξειδίων μετάλλων, εκτυπωμένων ηλεκτροδίων) που αποτελεί τον μεταλλάκτη του βιοαισθητήρα. Υπό μια σταθερά εφαρμοζόμενη διαφορά δυναμικού το ηλεκτρόδιο μετρά το ρεύμα που παράγεται κατά τη διάρκεια μιας οξειδοαναγωγικής αντίδρασης (Εικόνα 1.3.). Κατά την αντίδραση λοιπόν του ακινητοποιημένου ενζύμου παράγεται ρεύμα ανάλογο της συγκέντρωσης του αναλύτη. Προέρχεται από την ανταλλαγή ηλεκτρονίων μεταξύ του ενεργού κέντρου του ενζύμου και του ηλεκτροδίου εργασίας. Ο βιοαισθητήρας του 3

13 γλυκόζης του Clark βασίζεται σε αυτή την αρχή λειτουργίας. Επίσης ο βιοαισθητήρας που θα ασχοληθούμε στην παρούσα εργασία βασίζεται σε αυτήν την αρχή λειτουργίας. Τα πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα κατασκευής αμπερομετρικού βιοαισθητήρα όσο και η χρήση διοξειδίου του τιτανίου (TiO 2 ) ως επιφάνεια ηλεκτροδίου στερεάς κατάστασης αναφέρονται σε επόμενο κεφάλαιο. Εικόνα 1.3.: Σχηματική απεικόνιση αμπερομετρικού βιοαισθητήρα (μετρητής χοληστερόλης). Πηγή: Βαρυμετρικοί βιοαισθητήρες: Διακρίνονται σε πιεζοηλεκτρικούς (Piezoelectric) και σε ακουστικούς επιφανειακών κυμάτων (Surface Acoustic wave). Και οι δύο είναι αισθητήρες μάζας, αφού παρουσιάζουν γραμμική σχέση ανάμεσα στην αλλαγή της μάζας στην επιφάνεια του κρυστάλλου και στη συχνότητα ταλάντωσής του. Θερμικοί βιοαισθητήρες: Κατά την αναγνώριση του αναλύτη από το βιομόριο γίνεται μέτρηση της θερμοκρασίας από τη θερμότητα που εκλύεται ή απορροφάται. Με βάση το είδος του βιομορίου αναγνώρισης οι βιοαισθητήρες διακρίνονται σε Ενζυμικούς (ακινητοποιημένα ένζυμα και πρωτεΐνες), DNA βιοαισθητήρες (νουκλεϊκά οξέα), Κυτταρικούς βιοαισθητήρες (ακινητοποιημένα κύτταρα ή ένας ιστός), Ανοσοαισθητήρες Immunosensors (ακινητοποιημένο αντίσωμα ή αντιγόνο συζευγμένο με ένζυμο ή χρωστική) και Βιοαισθητήρες Μικροοργανισμών. Με βάση τον τρόπο δράσης του βιομορίου αναγνώρισης οι βιοαισθητήρες χωρίζονται σε βιοκαταλυτικούς και βιοαισθητήρες συγγένειας. [2] 4

14 Τεχνικές Ακινητοποίησης Ένα πολύ σημαντικό στοιχείο της επιτυχίας ενός βιοαισθητήρα είναι η επιλογή του κατάλληλου υλικού στήριξης για την ακινητοποίηση των βιομορίων. Το βιομόριο πρέπει να συνδεθεί και να σταθεροποιηθεί στο υλικό με τέτοιο τρόπο ώστε να διατηρήσει της φυσικοχημικές και καταλυτικές του ιδιότητες στο maximum. Είναι σημαντικό η ακινητοποίηση να γίνεται με τέτοιον τρόπο ώστε να υπάρχει η όσο το δυνατόν καλύτερη εγγύτητα μεταξύ του βιομορίου και της επιφάνειας στήριξης / μετατροπέα και η δομή να παραμένει σταθερή ώστε ο βιοαισθητήρας να μπορεί να ξαναχρησιμοποιηθεί. Η ακινητοποίηση μπορεί να προκαλέσει δομικές αλλαγές στο βιομόριο που ενδέχεται να το απενεργοποιήσουν κατά ένα ποσοστό. Το βιομόριο μπορεί να ακινητοποιηθεί με λάθος προσανατολισμό ώστε το ενεργό κέντρο του να δεσμευτεί ή κρυφτεί από το υλικό στήριξης και οι αναλύτες προς ανίχνευση να μην έχουν πλέον πρόσβαση σε αυτό. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την ακινητοποίηση των βιομορίων χωρίζονται σε φυσικές, χημικές ή και συνδυασμούς αυτών. Φυσικές μέθοδοι: Φυσική Προσρόφηση (physical adsorption) σε μη υδατοδιαλυτό υλικό μέσω ιοντικών ή υδρόφοβων δεσμών ή δυνάμεων Van der Waals ή ηλεκτροστατικών δυνάμεων κλπ. Το βιομόριο σε υδατικό διάλυμα έρχεται σε επαφή με το υλικό στήριξης για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα. Στη συνέχεια το υλικό με το προσροφημένο βιομόριο απομακρύνεται από το διάλυμα (Εικόνα 1.4.). Η τεχνική αυτή είναι απλή και φιλική της το βιομόριο (διατηρεί την αρχική του διαμόρφωση και της φυσικοχημικές ιδιότητες). Σημαντικό της είναι το βιομόριο να προσροφάται με τρόπο ώστε το ενεργό του κέντρο να είναι προσβάσιμο στον αναλύτη. Το ph, η ιοντική ισχύ, το ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτεΐνης και η θερμοκρασία επηρεάζουν την προσρόφηση. Κεραμικά υλικά, μεταλλικά οξείδια (TiO 2, ZnO, SnO 2 ), silica gel, αλουμίνα, κατιονικές και ανιονικές ιοντοανταλλακτικές ρητίνες κλπ. είναι υλικά που έχουν χρησιμοποιηθεί για ακινητοποίηση πρωτεϊνών με αυτήν την μέθοδο. Στην πειραματική διαδικασία της παρούσας εργασίας θα χρησιμοποιήσουμε την παραπάνω μέθοδο για την ακινητοποίηση της πρωτεΐνης (κυτόχρωμα C) σε μεταλλικό οξείδιο (TiO 2 ). Παγίδευση (gel entrapment) των βιομορίων σε μη υδατοδιαλυτές πηκτές πολυμερών (sol-gels). Το sol-gel φτιάχνεται από διάλυμα πήκτης μονομερούς που εμπεριέχει το βιομόριο, το οποίο έτσι παγιδεύεται μέσα στο πλέγμα του πολυμερούς. Τα παγιδευμένα βιομόρια δε σχηματίζουν δεσμούς με το sol-gel. 5

15 Ενθυλάκωση (encapsulation) των βιομορίων σε αδρανείς μεμβράνες (πολυκαρβονικές, οξικής κυτταρίνης, λιποσώματα κλπ.) στην επιφάνεια του μεταλλάκτη με τον οποίο αποκτούν στενή επαφή. Απλή τεχνική που εφαρμόζεται εύκολα σε πολλά βιομόρια. Χημικές μέθοδοι: Χημική ακινητοποίηση με διασταυρούμενη (διαμοριακή) σύνδεση των βιολογικών μορίων (cross-linking). Είναι απλή μέθοδος και δημιουργεί ισχυρούς δεσμούς σύνδεσης μεταξύ του βιομορίου και του υλικού στήριξης. Μειονέκτημά της είναι η ελάττωση της ενζυμικής ενεργότητας λόγω των χημικών μεταβολών που προκαλούν τα αντιδραστήρια στο ενεργό κέντρο του βιομορίου. Ομοιοπολική σύνδεση (covalent binding) σε αδιάλυτους φορείς ή μεμβράνες (νάιλον ή γυαλί) που δεν επηρεάζεται από το ph, την ιοντική ισχύ, τη θερμοκρασία και τον διαλύτη. Η μέθοδος αυτή υστερεί σε απλότητα, είναι χρονοβόρα και ακριβή διαδικασία, υπάρχει πιθανότητα απώλειας ενζυμικής ενεργότητας λόγω των αντιδράσεων σύνδεσης. Εικόνα 1.4.: Ακινητοποίηση ενζύμου a) με φυσική προσρόφηση b) ομοιοπολική σύνδεση c) παγίδευση (gel entrapment) και d) ενθυλάκωση (encapsulation). Πηγή: [3] 6

16 Τα ακινητοποιημένα βιομόρια με της παραπάνω τρόπους δείχνουν συνήθως βελτιωμένη σταθερότητα σε σχέση με τα βιομόρια που βρίσκονται σε διάλυμα. Έχει παρατηρηθεί ότι τα ακινητοποιημένα βιομόρια και κυρίως οι πρωτεΐνες / ένζυμα απενεργοποιούνται ή αποικοδομούνται δυσκολότερα και πιο αργά από αυτά που είναι σε διαλυτή μορφή, γιατί το υλικό στήριξης περιορίζει πολύ τη δυνατότητα κίνησης των μορίων της (της δημιουργεί ακαμψία). [2] Κριτήρια Ποιότητας Βιοαισθητήρων Χαρακτηριστικά κριτήρια ποιότητας βιοαισθητήρων: Χρήση της κατάλληλης βιοσυμβατής επιφάνειας για ακινητοποίηση. Ευαισθησία, Καμπύλη Βαθμονόμησης (πάντα αύξουσα ή φθίνουσα σε σχέση με την αύξηση της ποσότητας του αναλύτη) και Γραμμικό Εύρος (η απόκριση να μεταβάλλεται γραμμικά με το μετρούμενο μέγεθος). Όριο Ανίχνευσης του μετρούμενου αναλύτη (συστατικού), μέγιστη και ελάχιστη τιμή που μπορεί να μετρήσει ο βιοαισθητήρας. Επιλεκτικότητα (Ανάλυση δείγματος που περιέχει πολλά συστατικά και ικανότητα του βιοαισθητήρα να αναγνωρίζει μόνο ένα από αυτά τα συστατικά, εξαρτάται κυρίως από το βιομόριο αναγνώρισης του βιοαισθητήρα και τον τρόπο λειτουργίας του μετατροπέα του). Αναπαραγωγιμότητα και Επαναληψιμότητα της μέτρησης (των αποτελεσμάτων) και της κατασκευής του βιοαισθητήρα. Χρόνος Απόκρισης (Response Time) είναι ο χρόνος που απαιτείται για να προσεγγιστεί το μέγιστο της συγκέντρωσης του αναλύτη (και κάθε φορά που αυτή μεταβάλλεται). Σταθερότητα Χρόνος Ζωής Βιοαισθητήρα (εξαρτάται από το χρόνο ζωής του ακινητοποιημένου βιομορίου). Πολλοί παράγοντες (ακραία ph, οξειδωτικές αντιδράσεις στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου, κακή ακινητοποίηση, θερμοκρασία, προσρόφηση μορίων στο βιομόριο κλπ.) απενεργοποιούν το βιομόριο. Η σταθερότητα του βιοαισθητήρα κατά την αποθήκευση και σε συνθήκες συνεχούς λειτουργίας είναι δύο από τα ποιοτικότερα χαρακτηριστικά της βιοαισθητήρα. Μικρό μέγεθος, χαμηλό κόστος και ευκολία στον Χειρισμό. [2] Εφαρμογές Των Βιοαισθητήρων Η ανάπτυξη του βιοαισθητήρα πρέπει να καθοδηγείται από την αγορά. Τα χαρακτηριστικά των βιοαισθητήρων τους καθιστούν χρήσιμα εργαλεία στους παρακάτω τομείς: Ανάπτυξη Ιατρικών / Κλινικών Διαγνωστικών Συσκευών, κατάλληλες για τη μέτρηση αναλυτών κλινικού ενδιαφέροντος. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η ανάπτυξη και η επιτυχία του σακχαρομέτρου (μια μικροσυσκευή μέτρησης γλυκόζης 7

17 στο αίμα). Μπορούν στο μέλλον να αντικαταστήσουν μερικές από τις διαγνωστικές εξετάσεις που γίνονται σε εργαστήρια νοσοκομείων. Προσφέρουν μικρό μέγεθος, ευκολία στη χρήση, χαμηλό κόστος, άμεσο ποσοτικό αποτέλεσμα (διάγνωση) και δυνατότητα μέτρησης ταυτόχρονα πολλών αναλυτών (δεικτών). Ανάλυση Τροφίμων (σε ποιοτικούς ελέγχους τροφίμων που αποσκοπούν στον καθορισμό της ποιότητας και στην πιστοποίηση της συμμόρφωσης με τη νομοθεσία). Χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό σακχάρων, αιθανόλης σε ποτά τεχνητών αρωματικών και γλυκαντικών, εντοπισμό συντηρητικών και τοξινών κλπ. Περιβαλλοντικές Αναλύσεις (ανιχνεύουν ρυπαντικές ουσίες και απόβλητα επικίνδυνα για το περιβάλλον). Το μικρό της μέγεθος, η ευκολία στη μεταφορά και στη χρήση, η δυνατότητα για επί τόπου γρήγορους και συνεχείς ελέγχους και το χαμηλό της κόστος της καθιστούν ιδανικούς για περιβαλλοντικές αναλύσεις. Έχουν κατασκευαστεί βιοαισθητήρες για παρασιτοκτόνα, για βαρέα μέταλλα, για τοξίνες, για χλωροφαινόλες, βακτήρια κλπ. Επίσης χρησιμοποιούνται σε Εγκληματολογικές Αναλύσεις και σε Ανίχνευση Βιολογικών και Χημικών Όπλων. [2] 1.2. Ημιαγωγοί Κάθε στερεό σώμα αποτελείται από άτομα και κάθε άτομο περιλαμβάνει έναν πυρήνα και έναν αριθμό ηλεκτρονίων, που περιφέρονται γύρω από αυτόν. Ο πυρήνας φέρει θετικό ηλεκτρικό φορτίο και τα ηλεκτρόνια αρνητικό. Τα ηλεκτρόνια της εξωτερικής στοιβάδας ονομάζονται ειδικότερα ηλεκτρόνια σθένους. Κάθε ηλεκτρόνιο σθένους έχει μια συγκεκριμένη ενέργεια, δηλαδή, βρίσκεται σε μια συγκεκριμένη στάθμη ενέργειας. Ηλεκτρική αγωγιμότητα ονομάζεται η κίνηση των ηλεκτρονίων μέσα σε ένα σώμα. Οι κατηγορίες των φυσικών υλικών σύμφωνα με τα ηλεκτρικά χαρακτηριστικά τους είναι οι αγωγοί του ηλεκτρισμού, οι μονωτές και οι ημιαγωγοί. Η διαφορετικότητα ενός ημιαγωγού έγκειται στον αριθμό των ηλεκτρονίων ενός ατόμου που βρίσκεται στην εξωτερική του στοιβάδα. [4] Θεωρία ενεργειακών ζωνών Εάν υποθέσουμε ότι έχουμε ένα άτομο τελείως απομονωμένο, τότε λέμε ότι έχουμε ένα σύστημα που αποτελείται από έναν πυρήνα και ατομικά τροχιακά. Ας υποθέσουμε ότι δυο άτομα συνέρχονται και σχηματίζουν ένα σύστημα με μορφή μορίου. Τότε το μόριο που θα σχηματιστεί θα έχει δυο πυρήνες στους οποίους σύμφωνα με τη θεωρία των μοριακών τροχιακών, τα τροχιακά στα οποία θα αναφέρεται ο σχηματισμός του μορίου θα ανήκουν σε δυο κέντρα. Τα τροχιακά αυτά θα είναι δυο, το ένα δεσμικό και το άλλο αντιδεσμικό. Συνεπώς θα έχουμε σύστημα τροχιακών δυο κέντρων. Στην περίπτωση τριών ατόμων για το σχηματισμό μορίου, 8

18 μέσω της ίδιας λογικής θα έχουμε το σχηματισμό ενός συστήματος τριών κέντρων με τα αντίστοιχα τροχιακά που θα είναι το δεσμικό, το αντιδεσμικό και το μη δεσμικό. Γενικά εάν έχουμε Ν ηλεκτροθετικά άτομα που συνέρχονται για το σχηματισμό δεσμών έχουμε σύστημα Ν κέντρων όπου θα υπάρξουν Ν τροχιακά τα οποία θα τοποθετούνται το ένα κοντά στο άλλο αλληλοεπικαλυπτόμενα και θα σχηματίζουν μια ζώνη όπως απεικονίζεται στην Εικόνα 1.5. Αφού σχηματιστούν οι ζώνες και δημιουργηθούν τα συστήματα ατόμων για το σχηματισμό μεταλλικού δεσμού στην στερεά κατάσταση, θα πρέπει να τοποθετηθούν τα ηλεκτρόνια στα μοριακά τροχιακά. Εικόνα 1.5.: Σχηματισμός της ενιαίας ζώνης ενέργειας στο μεταλλικό πλέγμα. Πηγή: [5] Εάν το πλήθος των ηλεκτρονίων είναι αρκετό ώστε να γεμίσει η ζώνη από ηλεκτρόνια τότε η ζώνη ονομάζεται ζώνη σθένους. Εάν αντίθετα το πλήθος των ηλεκτρονίων που προστίθεται για την πλήρωση της ζώνης, δεν επαρκεί για το σκοπό αυτό, τότε η ζώνη φέρεται ως μερικώς συμπληρωμένη και ονομάζεται ζώνη αγωγιμότητας, όπως φαίνεται στο παράδειγμα του μεταλλικού λιθίου (Li) στην Εικόνα 1.6. Μεταξύ της ζώνης σθένους και της ζώνης αγωγιμότητας στο μεταλλικό Li υφίσταται ένα ενεργειακό κενό το οποίο ονομάζεται χάσμα απαγορευμένης ενέργειας. Τα ηλεκτρόνια δεν μπορούν να μεταβούν από τη ζώνη σθένους στη ζώνη αγωγιμότητας του Li, μέσω απλών θερμικών διαδικασιών, όμως μπορούν να κινηθούν στη ζώνη αγωγιμότητας του Li, με αποτέλεσμα το Li να είναι ηλεκτροαγώγιμο υλικό. Σε ορισμένες περιπτώσεις ηλεκτροαγώγιμων υλικών (μετάλλων) είναι δυνατόν να είναι άδεια η ζώνη αγωγιμότητας χωρίς όμως να υπάρχει ενεργειακό χάσμα μεταξύ ζώνης σθένους και ζώνης αγωγιμότητας. 9

19 Εικόνα 1.6.: Περίπτωση μετάλλου με μερικώς συμπληρωμένη ζώνη αγωγιμότητας. Πηγή: [5] Το εύρος του ενεργειακού χάσματος είναι η αιτία διαχωρισμού των στερεών σε μέταλλα, ημιαγωγούς και μονωτές. Οι μονωτές έχουν ενεργειακό χάσμα (Eg) μεγαλύτερο των 4 ev όπως για παράδειγμα το διαμάντι, όπου Eg ~ 5.3 ev, εξηγώντας έτσι γιατί οι μονωτές παρουσιάζουν αμελητέα συγκέντρωση ηλεκτρονίων στην επάνω ζώνη. Εικόνα 1.7.: Διάγραμμα ενεργειακών ζωνών για μέταλλο, μονωτή και ημιαγωγό. Πηγή: [4] 10

20 Σε υλικά που χαρακτηρίζονται ως ημιαγωγοί, το ενεργειακό χάσμα έχει ενδιάμεση τιμή και συνήθως εκτείνεται σε λιγότερο από 4 ev και η πυκνότητα ηλεκτρονίων στην επάνω ζώνη (ή των οπών στη χαμηλότερη) είναι συνήθως μικρότερη από cm -3. Η διάκριση αυτή των στερεών απεικονίζεται στην Εικόνα 1.7. [5] Ενέργεια Fermi Η ενέργεια της τελευταίας κατειλημμένης στάθμης ενός συστήματος φερμιονίων στο απόλυτο μηδέν και γενικότερα ενός στερεού ονομάζεται ενέργεια Fermi ΕF. Τυπικές τιμές της ενέργειας Fermi είναι ~5 ev και δίνεται από τον τύπο: E F 2 2 m 2 2/3 3 n 1.2. Όπου n: ο αριθμός ηλεκτρονίων ανά μονάδα όγκου. [4] Ημιαγωγοί n και p τύπου Οι ημιαγωγοί διακρίνονται σε δύο είδη: a) ενδογενείς ημιαγωγοί (intrinsic semiconductors) όπως Si, Ge, CuO κ και b) εξωγενείς ημιαγωγοί (extrinsic semiconductors) όπως ZnO, NiO και TiO 2. Η διαφορά στους τύπους των ημιαγωγών οφείλεται στα παρακάτω γνωρίσματα: Στους ενδογενείς ημιαγωγούς το χάσμα απαγορευμένης ενέργειας (Εg) μεταξύ της ζώνης σθένους και της ζώνης αγωγιμότητας είναι σχετικά μικρό. Με αύξηση της θερμοκρασίας ηλεκτρόνια (e - ) μεταπηδούν από τη ζώνη σθένους στη ζώνη αγωγιμότητας με αποτέλεσμα μικρή αύξηση της αγωγιμότητας με τη θερμοκρασία και δημιουργία κενών θέσεων (οπών, h + ) στη ζώνη σθένους. Σε ένα καθαρό κρύσταλλο ενδογενή ημιαγωγού, όπως είναι φυσικό, ο αριθμός των ενδογενών παραγόμενων ηλεκτρονίων είναι ίσος με τον αριθμό των οπών. Σε χαμηλές θερμοκρασίες οι ενδογενείς ημιαγωγοί γίνονται μονωτές. 11

21 Εικόνα 1.8.: Ζώνη σθένους και αγωγιμότητας και διάφορα ενεργειακά επίπεδα σε αγωγούς και ημιαγωγούς. Πηγή: [5] Χαρακτηριστικό παράδειγμα ενδογενή ημιαγωγού είναι το Si. Ελάχιστες προσμίξεις άλλων στοιχείων (συνήθως φωσφόρου P) σε έναν ενδογενή ημιαγωγό μπορούν να αυξήσουν την αγωγιμότητα του ημιαγωγού. Στους εξωγενείς ημιαγωγούς η αγωγιμότητα παράγεται από εξωγενή αίτια π.χ. από την προσθήκη προσμίξεων σε ένα μονωτή. Τα ίχνη των προσμίξεων ενσωματώνονται στο κρυσταλλικό πλέγμα του μονωτή. Ανάλογα το είδος του στοιχείου που προστίθεται ως πρόσμιξη, οι εξωγενείς ημιαγωγοί διακρίνονται σε δύο τύπους, στους ημιαγωγούς n-τύπου και στους ημιαγωγούς p-τύπου (Εικόνα 1.8.). Για παράδειγμα, στο στοιχείο του Si κάθε άτομο συνδέεται με τα γειτονικά του με τέσσερις ομοιοπολικούς δεσμούς. Όταν προστεθεί σε ίχνη στα παραπάνω στοιχεία ένα στοιχείο της V ομάδας του Περιοδικού Συστήματος, το στοιχείο αυτό εισέρχεται στο πλέγμα του Si χωρίς να διαταράξει αισθητά τόσο τις ενδοατομικές αποστάσεις όσο και τη γεωμετρία και γενικά τους δεσμούς του πλέγματος κάθε ατόμου Si. Επειδή τα άτομα της V ομάδας του Περιοδικού Συστήματος έχουν ηλεκτρονιακή απεικόνιση ns 2 np 3 στην στοιβάδα σθένους, δηλαδή πέντε ηλεκτρονίων αντί τεσσάρων, που απαιτούνται για την δημιουργία τεσσάρων ομοιοπολικών δεσμών, απομένει ένα ηλεκτρόνιο σε περίσσεια σε κάθε προστιθέμενο άτομο, μετά την διευθέτηση του πλέγματος. 12

22 Τα ηλεκτρόνια αυτά που βρίσκονται σε περίσσεια, τοποθετούνται στο σύνολο τους λίγο χαμηλότερα από τη ζώνη αγωγιμότητας του μονωτή ή του ημιαγωγού και σχηματίζουν μια στενή ζώνη που ονομάζεται επίπεδο δότου ή στάθμη δότου (donor level). Ο μονωτής ή ημιαγωγός μικρής αγωγιμότητας γίνεται ημιαγωγός καλής αγωγιμότητας διότι τα ηλεκτρόνια αυτά μεταβαίνουν εύκολα, με μικρή αύξηση της θερμοκρασίας, στη ζώνη αγωγιμότητας. Επειδή η αγωγιμότητα αυτή οφείλεται στην παρουσία ηλεκτρονίων, δηλαδή στην περίσσεια αρνητικών (negative) φορτίων στη ζώνη αγωγιμότητας του ημιαγωγού, ονομάζεται ημιαγωγός n τύπου (Εικόνα 1.8.ε). Συνήθως οι προσμίξεις για την παραγωγή καλού ημιαγωγού είναι συγκέντρωσης της τάξεως ppm. Εάν στο Si προστεθεί στοιχείο της III ομάδας του Περιοδικού Συστήματος, π.χ. B ή Al με ηλεκτρονιακή απεικόνιση ns 2 np 1 προκύπτει ημιαγωγός p-τύπου. Λόγω των τριών ηλεκτρονίων η πρόσμιξη μπορεί να σχηματίσει τρεις μόνο δεσμούς με τα γειτονικά άτομα Si. Έτσι σε κάθε άτομο προσμίξεως υπάρχει έλλειμμα ηλεκτρονίων και συνεπώς υπάρχουν άδειες ζώνες που μπορούν να δεχτούν ηλεκτρόνια. Οι ζώνες αυτές αποτελούν το επίπεδο του δέκτου (acceptor level) και βρίσκονται συνήθως κοντά στη ζώνη σθένους του μονωτή ή του ημιαγωγού μικρής αγωγιμότητας που δέχεται την πρόσμιξη όπως φαίνεται στο Εικόνα 1.8.ζ. Έτσι τα ηλεκτρόνια από τη ζώνη σθένους του μονωτή ή του ημιαγωγού μικρής αγωγιμότητας μεταπηδούν, με μικρή αύξηση της θερμοκρασίας, στο επίπεδο δέκτου όπου υπάρχει κενό ηλεκτρονίων για να τα δεχτεί. Με τη μεταπήδηση αυτή σχηματίζονται κενές θετικές οπές στη ζώνη σθένους του μονωτή ή του ημιαγωγού που δέχεται την πρόσμιξη. Μετακίνηση των θετικών φορτίων στη ζώνη σθένους επιφέρει τη δημιουργία ρεύματος και σημαντικής αγωγιμότητας. Εξαιτίας της δημιουργίας ηλεκτρικού ρεύματος μέσω θετικών φορτίων που κινούνται στο πλέγμα οι ημιαγωγοί αυτοί ονομάζονται ημιαγωγοί p-τύπου από το αρχικό της λέξης positive. Εάν ένας ημιαγωγός είναι n-τύπου, τότε η ενεργειακή στάθμη Fermi τοποθετείται κάτω από τη ζώνη αγωγιμότητας και ακριβώς επάνω από την ενεργειακή στάθμη του δότη, ενώ αντίστοιχα εάν είναι p-τύπου η στάθμη Fermi μετατοπίζεται προς τη ζώνη σθένους όπου σε χαμηλές θερμοκρασίες βρίσκεται στο μέσο της απόστασης της στάθμης του δέκτη από τη ζώνη σθένους (Εικόνα 1.8.). Οι βασικές διαφορές μεταξύ ενδογενών και εξωγενών ημιαγωγών, εντοπίζονται στο ενεργειακό τους χάσμα και στο μηχανισμό παραγωγής ευκίνητων φορέων φορτίου. Η αγωγιμότητα των ενδογενών ημιαγωγών, λόγω του μικρού ενεργειακού τους χάσματος (Εg 1,2 ev), οφείλεται μόνο στη θερμική τους διέγερση και εξαρτάται σημαντικά από τη θερμοκρασία. Το μικρό ενεργειακό χάσμα ευνοεί τη ταχύτατη επανασύνδεση ηλεκτρονίου-οπής με αποτέλεσμα τη θερμική αποδιέγερση του ημιαγωγού. 13

23 Αντίθετα στους εξωγενείς ημιαγωγούς με σημαντικά μεγαλύτερο ενεργειακό χάσμα η αγωγιμότητα τους οφείλεται σε απορρόφηση φωτός (φωτοαγωγιμότητα) ενέργειας μεγαλύτερης του ενεργειακού του χάσματος. Ταυτόχρονα η περίσσεια φορέων φορτίου, κυρίως ηλεκτρονίων στους n-τύπου ημιαγωγούς, και το μεγάλο ενεργειακό τους χάσμα μειώνει την πιθανότητα επανασύνδεσης ηλεκτρονίου-οπής. [5] 1.3. Διοξείδιο Του Τιτανίου (TiO 2 ) Οι Κρυσταλλικές Δομές του TiO 2 Το TiO 2 είναι ένα ημιαγώγιμο υλικό το οποίο βρίσκεται στην φύση έχοντας τρείς κρυσταλλικές δομές: ανατάση με ενεργειακό χάσμα 3,23 ev, ρουτίλιο με ενεργειακό χάσμα 3,02 ev και μπρουκίτης. Χρησιμοποιείται ευρύτατα ως χρωστική ουσία (λευκή σκόνη) σε ποικιλία βαφών, σε καλλυντικά, σε υφάσματα, στην βιομηχανία τροφίμων, σε δομικά στοιχεία λόγω της φωτοκαταλυτικής του δράσης, σε ηλεκτρονικές και ηλεκτροχρωμικές διατάξεις, ως αισθητήρα αερίων, ως αντιδιαβρωτικό, όπως και σε οργανικά φωτοβολταϊκά, ως λεπτό φιλμ. Η εκτεταμένη χρήση του TiO 2 αποδίδεται στο γεγονός ότι είναι ένα υλικό φθηνό που απαντάται σε αφθονία, είναι χημικά σταθερό, μη τοξικό, είναι αποδοτικό στην επίδραση της ηλιακής ακτινοβολίας και παρασκευάζεται εύκολα με την τεχνική doctor blade, η οποία θα αναλυθεί παρακάτω. (α) (β) (γ) Εικόνα 1.9.: Κρυσταλλική δομή (α) μπρουκίτης (β) ρουτίλιο (γ) ανατάση. Πηγή: [4] 14

24 Οι πιο σπουδαίες κρυσταλλικές δομές από τεχνολογική άποψη είναι το ρουτίλιο και η ανάταση, όπως φαίνεται και στον Πίνακα 1.1. H ανατάση και το ρουτίλιο έχουν τις ίδιες κρυσταλλικές δομές αλλά διαφορετική γεωμετρία και χημεία. Το διοξείδιο του τιτανίου (TiO 2 ) είναι ημιαγωγός τύπου n, με έμμεσο ενεργειακό χάσμα, από 3 έως 3,3 ev. Λόγω αυτού του μεγάλου εύρους το TiO 2 απορροφά μόνο ελάχιστη ορατή ακτινοβολία. Η ενέργεια Fermi (Ε f ) του βρίσκεται 1,6 ev κάτω από τη ζώνη αγωγιμότητας. Οι ελλείψεις ατόμων οξυγόνου, επιφανειακές ατέλειες, συντελούν στη δημιουργία ενεργειακών καταστάσεων μέσα στο ενεργειακό χάσμα, γύρω στα 1-1,4 ev κάτω από τη ζώνη αγωγιμότητας. Αυτές οι καταστάσεις προκύπτουν, όπως αναφέρθηκε, από ατέλειες και προσμίξεις του κρυσταλλικού πλέγματος του TiO 2 και επηρεάζουν την συμπεριφορά του ημιαγωγού σε διάφορες εφαρμογές. Πίνακας 1.1.: Βασικές φυσικοχημικές ιδιότητες του TiO 2. Πηγή: [4] Ρουτίλιο Ανατάση Ενεργειακό Χάσμα 3,02 ev 3,23 ev (Eg) o G f Σχηματισμού -212,6 kcal/mol -211,4 kcal/mol Ισοηλεκτρικό Σημείο (pi) - 4,9-5,2 (μέθοδος sol-gel) Πυκνότητα e (ρ) 4,250 g cm -3 3,894 g cm -3 Ενεργός μάζα m*/m o Ενεργός μάζα - (0,8±0,2) m e οπής Δομή πλήρωσης χώρου Παρατηρούμε ότι η μορφή της ανατάσης έχει μεγαλύτερο ενεργειακό χάσμα που μπορεί να συνδυαστεί και με την μικρότερη πυκνότητα, δηλαδή τα άτομα είναι πιο απομακρυσμένα από ότι στο ρουτίλιο. Όπως παρατηρούμε και στα σχήματα που παρατέθηκαν πιο πάνω, κάθε άτομο οξυγόνου έχει τρία κοντινά συνεπίπεδα κατιόντα τιτανίου. Στη μορφή του ρουτιλίου, η δομή είναι οκταεδρική με τρεις γωνίες Ti-O-Ti περίπου 120 ο. Στη μορφή της ανατάσης που έχει δομή παραμορφωμένου οκτάεδρου, η μία γωνία Ti-O-Ti είναι σχεδόν 180 ο και οι άλλες δύο είναι 90 ο. Το πλέγμα του ρουτιλίου είναι παρόμοιο με πλέγμα bcc, όπου για την διατήρηση της στοιχειομετρίας της δομής, μόνο οι μισές τριγωνικές οπές είναι κατειλημμένες από ανιόντα. Αντίθετα, 15

25 το πλέγμα της ανατάσης είναι παρόμοιο με πλέγμα fcc όπου οι μισές θέσεις του είναι κατειλημμένες από κατιόντα Ti +4. Η μορφή της ανατάσης λαμβάνεται με οξείδωση του TiCl 4 σε θερμοκρασία 925 Κ με 1025 Κ. Αν η οξείδωση γίνει παρουσία υδρατμών ή SiCl 4 τότε παίρνουμε ρουτίλιο για θερμοκρασίες μικρότερες ακόμα και των 250 ο C. Εν ολίγοις, η χαμηλή θερμοκρασία ευνοεί το σχηματισμό της ανατάσης ενώ οι υψηλές θερμοκρασίες το σχηματισμό του ρουτιλίου το οποίο είναι θερμοδυναμικά σταθερό. Η ανατάση, όπως συμπεραίνουμε, είναι θερμοδυναμικά μετασταθής φάση κι αυτό είναι που εμποδίζει το σχηματισμό μονοκρυστάλλων τέτοιας φάσης σε μεγάλες ποσότητες. [4] Πλεονεκτήματα Και Μειονεκτήματα Χρήσης TiO 2 Όπως είπαμε και παραπάνω η επιτυχής κατασκευή ενός βιοαισθητήρα εξαρτάται κατά μεγάλο βαθμό από το υλικό που θα επιλέξουμε για την παρασκευή του ηλεκτροδίου. Γι αυτό ένα σημαντικό βήμα πριν την έναρξη του πειράματος είναι η μελέτη των πλεονεκτημάτων και μειονεκτημάτων χρήσης υμενίων TiO 2 (ανατάση). Πλεονεκτήματα: 1. Πορώδης υφή, αρκετά ομοιογενής κατανομή των πόρων. Μέγεθος πόρων nm. 2. Μεγάλη ενεργή επιφάνεια με πολύπλοκη μορφολογία, υψηλό παράγοντα τραχύτητας και πολύ μεγάλο ανάπτυγμα επιφάνειας. Δρα ουσιαστικά ως ιδανικό υπόστρωμα που προσροφά μεγάλες συγκεντρώσεις πρωτεϊνικών μορίων. 3. Ημιαγωγός n τύπου με ενεργειακό χάσμα ~3,23 ev επιτρέπει τη μελέτη οξειδοαναγωγικών αντιδράσεων. 4. Το ισοηλεκτρικό σημείο του TiO 2 (4,9-5,2) καθιστά εύκολη την διαδικασία ακινητοποίησης θετικά φορτισμένων πρωτεϊνών όπως του κυτοχρώματος c και της αιμοσφαιρίνης. 5. Οπτικά διαφανές υλικό στο ορατό φως ( nm), το φάσμα απορρόφησης του TiO 2 δεν συμπίπτει με το φάσμα απορρόφησης της πρωτεΐνης, γι αυτό είναι εύκολη η παρακολούθηση της ακινητοποίησης. 6. Η παρασκευή τους είναι εύκολη και χαμηλού κόστους. [6] Μειονεκτήματα: 1. Πρέπει να φυλάσσεται σε καθαρό, χωρίς σκόνη και υγρασία περιβάλλον. Αν για κάποιο λόγο δεν επιτευχθεί αυτό τότε καταστρέφεται το υλικό (χάνει τις ιδιότητές του και την ομοιογένεια). 2. Εξαιτίας του μεγάλου του ενεργειακού χάσματος του μεσοπορώδους TiO 2, η κίνηση των ηλεκτρονίων και η παγίδευσή τους σε όλο το πάχος του υμενίου συμβαίνει για δυναμικά μεγαλύτερα των -0.3 V. Για τιμές θετικότερες των -0,3 V το υμένιο συμπεριφέρεται ως μονωτής. 16

26 3. Η πάστα TiO 2 λόγω της παρασκευής της με τη μέθοδο sol-gel δεν είναι 100% αναπαραγωγίσιμο υλικό Πρωτεΐνες Κυτόχρωμα c (Cyt-c) Η πρωτεΐνη που επιλέχθηκε σε αυτήν την εργασία για ακινητοποίησή της στα μεσοπορώδη υμένια TiO 2 είναι το κυτόχρωμα c, λόγω του μεγέθους της, του οπτικού της φάσματος και επειδή έχουν μελετηθεί ευρέως οι φυσικοχημικές της ιδιότητες. [25] Γενικά το κυτόχρωμα είναι μεμβρανο-συνδεόμενη πρωτεΐνη, που περιέχει τη σιδηρούχο ένωση της αίμης και χρησιμεύει στη μεταφορά ηλεκτρονίων ή πρωτονίων. Συναντάται είτε ως μονομερές, κυτόχρωμα c, είτε ως τμήμα μιας πιο πολύπλοκης ενζυμικής ένωσης πχ. το ένζυμο της κυτοχρωμικής οξειδάσης. Βρίσκεται στις μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου των μιτοχονδρίων, των χλωροπλαστών καθώς και των βακτηρίων. Το είδος του κυτοχρώματος διακρίνεται από τη διαφορετική απορρόφησή του σε διάφορα μήκη κύματος. [7] Δομή Το κυτόχρωμα c κατατάσσεται στις σφαιρικές πρωτεΐνες (Εικόνα 1.10.), που είναι διαλυτές στο νερό και σε αραιά διαλύματα αλάτων. Είναι μικρή πρωτεΐνη Μοριακού Βάρους g/mol, διαμέτρου 3,2 nm και με πρότυπο δυναμικό +0,13 V έναντι ηλεκτροδίου αναφοράς Ag/AgCl. Το χρώμα της πρωτεΐνης είναι πορτοκαλί λόγω της αίμης και είναι μια φωτοευαίσθητη πρωτεΐνη. Ένα πολύ σημαντικό πλεονέκτημα που εκμεταλλευόμαστε για την κατασκευή του βιοαισθητήρα είναι η χρήση της για ταχεία μεταφορά ηλεκτρονίων (fast electron transfer). Εικόνα 1.10.: (α) Δομή της πρωτεΐνης κυτόχρωμα c και (β) δομή κυτοχρώματος c με βάση το φορτίο (μπλε θετικά φορτισμένα αμινοξέα, κόκκινα αρνητικά φορτισμένα αμινοξέα και πορτοκαλί η αίμη) με τη χρήση ειδικού προγράμματος. Πηγή: 17

27 Ενεργό κέντρο κυτοχρώματος c Το ενεργό κέντρο του κυτοχρώματος c είναι μια αίμη (Εικόνα 1.11.), που το κεντρικό άτομο είναι σίδηρος (Fe II ή Fe III ) ανάλογα αν γίνεται οξείδωση ή αναγωγή. [8] Λειτουργία Εικόνα 1.11.: Αίμη ομάδας c. Πηγή: Το κυτόχρωμα c έχει δύο βασικές λειτουργίες στο κύτταρο: 1) Συμβολή στην Κυτταρική Αναπνοή Το κυτόχρωμα c δρα σαν φορέας συνδεόμενο με άλλα οργανωμένα σύμπλοκα της αναπνευστικής αλυσίδας. Τα οξειδοαναγωγικά συστήματα της αλυσίδας είναι έτσι τοποθετημένα, ώστε τα ηλεκτρόνια να ρέουν από τα στοιχεία με αρνητικό δυναμικό προς τα στοιχεία με θετικό δυναμικό. Μέχρι τα κυτοχρώματα τα ηλεκτρόνια μεταφέρονται προσδεδεμένα στο υδρογόνο. Από τα κυτοχρώματα μέχρι το Ο 2, το υδρογόνο ιονίζεται και μεταφέρονται μόνο ηλεκτρόνια. [9],[10] 2) Απόπτωση (κυτταρικός θάνατος) Το κυτόχρωμα c περιέχει 100 αμινοξέα και συγκρατείται χαλαρά με ιοντικές αλληλεπιδράσεις στην εσωτερική μεμβράνη του μιτοχονδρίου. Το κυτόχρωμα c πυροδοτεί την ενεργοποίηση κασπασών μέσω της δημιουργίας του αποπτωσωματίου (Cyt-C / Apaf-1 / Pro-caspase 9 / ATP). Το κυτόχρωμα c αποτελεί την εκκίνηση ενός μηχανισμού ενεργοποίησης μεγάλου αριθμού κασπασών, ο οποίος τελικά θα οδηγήσει στην απόπτωση. Ο παράγοντας AIF προκαλεί συμπύκνωση της χρωματίνης και κατακερματισμό του DNA. Όταν ένα μεγάλο ποσοστό κυτοχρώματος c βγει στο κυτταρόπλασμα, τότε παρατηρείται μεγάλη πτώση των επιπέδων του ATP. Τελικό αποτέλεσμα: πλήρης διάρρηξη της εσωτερικής μεμβράνης και νέκρωση του κυττάρου. [11] 18

28 1.4.2.Αιμοσφαιρίνη (Hb) Η αιμοσφαιρίνη περιέχεται στα ερυθροκύτταρα και είναι ο κύριος μεταφορέας οξυγόνου στο αίμα. Αποτελείται από 4 πολυπεπτιδικές αλυσίδες [α(2):β(2)], κάθε μία από τις οποίες φέρει από ένα μόριο αίμης (δηλαδή έχει τέσσερα ενεργά κέντρα τα οποία επικοινωνούν μεταξύ τους). Είναι μεγάλη πρωτεΐνη Μοριακού Βάρους g/mol, διαμέτρου 5,5 nm και με πρότυπο δυναμικό -0,17 V έναντι ηλεκτροδίου αναφοράς Ag/AgCl. Ο σίδηρος της αίμης βρίσκεται στην Fe 2+ μορφή και συνδέει αντιστρεπτά ένα μόριο οξυγόνου. Στις δύο ακραίες μορφές της η αιμοσφαιρίνη απαντάται σαν δεοξυαιμοσφαιρίνη (Hb), όταν δεν περιέχει κανένα μόριο Ο 2, ή σαν οξυαιμοσφαιρίνη (HbΟ 2 ), όταν περιέχει τέσσερα μόρια Ο 2. Το άτομο του Fe 2+ στην δεοξυαιμοσφαιρίνη βρίσκεται σε πεντασυναρμοσμένο σύμπλοκο (κατάσταση υψηλού spin), ενώ στην οξυαιμοσφαιρίνη βρίσκεται σε εξασυναρμοσμένο σύμπλοκο (κατάσταση χαμηλού spin). [13] Εικόνα 1.12.: (α) Δομή της πρωτεΐνης αιμοσφαιρίνη και (β) δομή αιμοσφαιρίνης με βάση το φορτίο (μπλε θετικά φορτισμένα αμινοξέα, κόκκινα αρνητικά φορτισμένα αμινοξέα και πορτοκαλί η αίμη) με τη χρήση ειδικού προγράμματος. Πηγή: 19

29 Ισοηλεκτρικό Σημείο Οι πρωτεΐνες καθώς περιέχουν και αμινομάδα και καρβοξυλομάδα, εμφανίζουν τόσο τον όξινο όσο και το βασικό χαρακτήρα. Είναι δηλαδή αμφολύτες. Για κάθε πρωτεΐνη υπάρχει ένα χαρακτηριστικό ισοηλεκτρικό σημείο (pi), στο οποίο η πρωτεΐνη εμφανίζεται ως δίπολο με συνολικό φορτίο μηδέν. [14] Το ισοηλεκτρικό σημείο του κυτοχρώματος c είναι pi=10,7 [15] Το ισοηλεκτρικό σημείο της αιμοσφαιρίνης είναι pi=6,8 Επειδή τα ρυθμιστικά διαλύματα που παρασκευάζουμε για τις πρωτεΐνες έχουν ph~7 και το ισοηλεκτρικό σημείο της επιφάνειας που γίνεται η ακινητοποίηση (TiO 2 ) είναι pi=4,9-5,2 (όπως αναφέραμε στον πίνακα ) το κυτόχρωμα c είναι θετικά φορτισμένη ενώ η αιμοσφαιρίνη είναι ελάχιστα θετικά φορτισμένη. Στην παρούσα εργασία επιλέξαμε να μελετήσουμε περισσότερο την ακινητοποίηση με βάση το κυτόχρωμα c για τους παρακάτω λόγους: Είναι περισσότερο θετικά φορτισμένη (γιατί έχει περισσότερες λυσίνες και αργινίνες στην επιφάνειά της), οπότε ακινητοποιείται πιο γρήγορα και πιο ισχυρά από την αιμοσφαιρίνη. Έχοντας σχεδόν τη μισή διάμετρο από την αιμοσφαιρίνη, μπορεί να ακινητοποιηθεί μεγαλύτερη ποσότητα γιατί έχει τη δυνατότητα να εισέλθει και σε μικρότερους πόρους του υμενίου. Το μοριακό βάρος του κυτοχρώματος c είναι περίπου 5 φορές μικρότερο από το μοριακό βάρος της αιμοσφαιρίνης. Ηλεκτροχημικά μας ενδιαφέρει η επικοινωνία του ενεργού κέντρου της πρωτεΐνης με την επιφάνεια ακινητοποίησης και όχι η ποσότητα των αμινοξέων της. Το κυτόχρωμα c έχει μόνο μια αίμη (ενεργό κέντρο), η οποία περιτριγυρίζεται από θετικά φορτισμένα αμινοξέα. Έτσι η ακινητοποίησή της επιτυγχάνεται με την ελάχιστη δυνατή απόσταση από την επιφάνεια ακινητοποίησης (άμεση επαφή), ενώ η αιμοσφαιρίνη έχει τετραπλάσιο αριθμό αίμης (ενεργά κέντρα). Αν και επικοινωνούν μεταξύ τους, η επαφή με την επιφάνεια ακινητοποίησης είναι λιγότερο άμεση Υπεροξείδιο Του Υδρογόνου (H 2 O 2 ) Τα οξυγονο-αντιδραστικά είδη (ROS), συμπεριλαμβανομένου τα ανιόντα υπεροξειδίου (Ο - 2 ), το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ), τη ρίζα υδροξυλίου (-ΟΗ), το υπεροξεινιτρικό (ΟΝΟΟ - ) και ούτω καθεξής, έχουν κεντρίσει την προσοχή σε μια ποικιλία ερευνητικών πεδίων, επειδή θεωρούνται μεσολαβητές στην βιοχημεία και στην κυτταρική παθολογία και μπορεί να εμπλέκονται στην αιτιολογία της γήρανσης και στη ανάπτυξη νευροεκφυλιστικών ασθενειών, όπως στην ασθένεια του Πάρκινσον. Υπό κανονικές συνθήκες μεταβολισμού, τα ROS παράγονται με ταχύτητα η οποία συνδέεται με την ικανότητα των ιστών να τα καταβολίζουν. Μετά 20

30 κάθε προϊόν υπερβαίνει την φυσιολογική ικανότητα του σώματος να ασχοληθεί με τα δυνητικά κυτταροτοξικά είδη, με αποτέλεσμα μια ποικιλία από παθολογικές καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένου τον καρκίνο, το εγκεφαλικό επεισόδιο και τον νευροεκφυλισμό. Μεταξύ των ROS, το υπεροξείδιο του υδρογόνου είναι το πιο σταθερό είδος και μπορεί να διαχυθεί κατά μήκος των μεμβρανών διαμέσου καναλιών νερού και να προκαλέσει οξειδωτικές τροποποιήσεις πρωτεϊνών στις άπω περιοχές κάθε προϊόντος. Το H 2 O 2 είναι ένα από τα προϊόντα της αυτοξειδοαναγωγής του Ο 2 - από το ένζυμο αυτοξειδοαναγωγική υπεροξειδάση (SOD), και δημιουργεί ρίζες υδροξυλίου παρουσία μετάλλων μετάπτωσης όπως σίδηρος και χαλκός (αντίδραση Fenton). Συνεπώς, τα φυσιολογικά επίπεδα του H 2 O 2 συνδέονται στενά με την αποδόμηση και τον σχηματισμό αντιδραστικών ελεύθερων ριζών, όπως (Ο 2 - ) και (-ΟΗ). Ως εκ τούτου, μια επιλεκτική και ευαίσθητη μέθοδος για τον αξιόπιστο και διαρκή προσδιορισμό του Η 2 Ο 2 με εξωτερικό γραμμικό φάσμα είναι απαραίτητη και πολύ χρήσιμη για την απόκτηση πλήρης γνώσης του ρόλου που παίζει το Η 2 Ο 2 και τα ROS στην παθολογία και φυσιολογία και στη σχέση μεταξύ του Η 2 Ο 2 και τις περιβαλλοντικές πιέσεις και την υπεροξείδωση των λιπιδίων. Κατά τα τελευταία χρόνια, καταβάλλονται σημαντικές προσπάθειες για την ανάπτυξη των ηλεκτροχημικών μεθόδων για την ανίχνευση του Η 2 Ο 2 εξαιτίας των άμεσων και σε πραγματικό χρόνο μετρήσεων. Κυρίως, οι βιοαισθητήρες τρίτης γενιάς του Η 2 Ο 2 βασισμένοι στην άμεση μεταφορά ηλεκτρονίων από τις πρωτεΐνες άνοιξαν τον δρόμο για την ανίχνευση του Η 2 Ο 2 εξαιτίας της άριστης επιλεκτικότητας και υψηλής ευαισθησίας. Οι πρωτεΐνες που χρησιμοποιήθηκαν είναι: κυτόχρωμα c, υπεροξειδάση του χρένου, μυοσφαιρίνη και αιμοσφαιρίνη. [16] Στην παρούσα εργασία κατασκευάσαμε Η 2 Ο 2 βιοαισθητήρα με ακινητοποιημένη πρωτεΐνη το κυτόχρωμα c και η οξειδοαναγωγική αντίδραση που συμβαίνει κατά τη διάρκεια των μετρήσεων απόκρισης είναι η εξής: Ηλεκτροχημική αναγωγή: cytc-fe(iii) + e - cytc-fe(ii) Χημική αντίδραση: 2cytc-Fe(II) + 2H + + H 2 O 2 2cytc-Fe(III) + 2H 2 O [17] 21

31 1.6. H 2 O 2 Βιοαισθητήρες Που Έχουν Κατασκευαστεί Με Βάση Το Κυτόχρωμα C Μέχρι Σήμερα Πίνακας 1.2.: H 2 O 2 Βιοαισθητήρες με βάση την ακινητοποίηση κυτοχρώματος c Ηλεκτρόδιο Εργασίας (WE) NaY/ITO Ηλεκτρόδιο Αναφοράς (RE) Κορεσμένο Ηλεκτρόδιο Καλομέλανος (SCE) Σταθερά Ταχύτητας Μεταφοράς Ηλεκτρονίων k s (s -1 ) Όριο Ανίχνευσης / Γραμμικό Εύρος (μm) Πηγή [18] Nano-LTL-zeolite/ITO (SCE) [19] Μεσοπορώδεις νανοσφαίρες άνθρακα/pdda/ito (SCE) 5.9± [20] Νανοπορώδες Au Ag/AgCl [21] Au/πάστα άνθρακα Ag/AgCl 1.21± [22] Μακροπορώδης διατεταγμένος αφρός πυριτίου (MOSF) (SCE) [23] Μακροπορώδες ηλεκτρόδιο άνθρακα (MCE) CdO νανοσωματίδια/ τροποποιημένο ηλεκτρόδιο πάστας άνθρακα Poly-3- methylthiophene/mwcns υβριδικά τροποποιημένο ηλεκτρόδιο ZrO 2 νανοσωματίδια/ τροποποιημένο ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα (SCE) [24] (SCE) 0,84 20 έως 210 [25] Ag/AgCl 0.49± [26] (SCE) 1,83 40 έως 270 [27] 22

32 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΞΕΙΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Στο παρακάτω κεφάλαιο περιγράφονται συνοπτικά οι πειραματικές διατάξεις που χρησιμοποιήθηκαν για τον χαρακτηρισμό των υμενίων διοξειδίου του τιτανίου (TiO 2 ) που παρασκευάσαμε καθώς και οι τεχνικές για την μελέτη της ακινητοποίησης των πρωτεϊνών σε αυτά. Οι τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν είναι: Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM), Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης (TEM), Ανάλυση Ειδικής Επιφάνειας Brunauer-Emmett-Teller (BET), Περίθλαση Ακτίνων X (XRD), Φασματοφωτομετρία Υπεριώδους-Ορατού (UV-Visible), και Κυκλική Βολταμμετρία (CV) Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης ( SEM) Το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης είναι ένα όργανο που λειτουργεί όπως περίπου και ένα οπτικό μικροσκόπιο μόνο που χρησιμοποιεί δέσμη ηλεκτρονίων υψηλής ενέργειας αντί για φως, για να εξετάσει αντικείμενα σε λεπτομερή κλίμακα. Τα ηλεκτρόνια λόγω της κυματικής τους φύσης μπορούν να εστιαστούν όπως και τα φωτεινά κύματα αλλά σε πολύ μικρότερη επιφάνεια (π.χ. κόκκος υλικού). Η δέσμη ηλεκτρονίων σαρώνει την επιφάνεια του δείγματος με το οποίον αλληλεπιδρά. Από την αλληλεπίδραση αυτή προκύπτουν πληροφορίες σε σχέση με τα άτομα των στοιχείων που απαρτίζουν το εξεταζόμενο υλικό. Από τα άτομα των στοιχείων εκπέμπονται κυρίως δευτερογενή (secondary) και οπισθοσκεδαζόμενα (backscattered) ηλεκτρόνια καθώς και ακτίνες Χ. Η ένταση των εκπεμπομένων ηλεκτρονίων επηρεάζεται από τα χαρακτηριστικά της επιφάνειας. Έτσι το SEM δίνει πληροφορίες που αφορούν κυρίως στη μορφολογία και στη σύσταση της επιφανείας. Εφαρμόζοντας ένα σύστημα ανίχνευσης της διασποράς των ενεργειών των ακτίνων Χ που δημιουργούνται στην επιφάνεια από την προσπίπτουσα δέσμη, μπορεί να γίνει ημιποσοτική στοιχειακή ανάλυση του υλικού. Επομένως το SEM χρησιμοποιείται για την εξέταση μικροδομής στερεών δειγμάτων και για να δίνει εικόνες υψηλού βαθμού διείσδυσης. Αλληλεπιδράσεις δέσμης δείγματος Οι αλληλεπιδράσεις που συμβαίνουν ανάμεσα στο δείγμα και τα ηλεκτρόνια της δέσμης περιλαμβάνουν: 23

33 1) Φόρτιση (Charging) Συσσώρευση φορτίου ηλεκτρονίων στο δείγμα (Για να μην συμβαίνει αυτό το δείγμα θα πρέπει να είναι αγώγιμο και συνδεδεμένο με γείωση ή να χρησιμοποιείται χαμηλό δυναμικό επιτάχυνσης). 2) Ελαστική σκέδαση ηλεκτρονίων Ελαστικά σκεδαζόμενα ηλεκτρόνια δέσμης (Elastically scattered primary electrons) τα οποία δεν αχνιεύονται από το σύστημα. Οπισθοσκεδαζόμενα ηλεκτρόνια (Backscattered Electrons). Όταν τα ηλεκτρόνια της δέσμης με ενέργεια πχ 30 KeV φθάσουν στην επιφάνεια του δείγματος διεισδύουν σε βάθος που εξαρτάται από τον ατομικό αριθμό. Τα ηλεκτρόνια ταξιδεύουν προς τυχαίες κατευθύνσεις μέσα στο δείγμα και συγκρούονται με τα άτομα του δείγματος. Τα ηλεκτρόνια συγκρούονται ελαστικά με τον πυρήνα του ατόμου (ειδικά σε μεγάλα άτομα) και σκεδάζονται προς οποιαδήποτε κατεύθυνση χωρίς σημαντική απώλεια της ενέργειάς τους (κρατούν το 50 με 80% της αρχικής ενέργειας). Εκείνα τα ηλεκτρόνια που σκεδάζονται προς τα πίσω με γωνία 180 ο λέγονται οπισθοσκεδαζόμενα (Backscattered electrons, BSE) (Εικόνα 2.1.α). Έχουν μεγαλύτερη ενέργεια και εκπέμπονται από μεγαλύτερο βάθος από το δείγμα. 3) Μη ελαστική σκέδαση ηλεκτρονίων Μη ελαστικά σκεδαζόμενα ηλεκτρόνια (Inelastically scattered electrons), τα οποία δεν ανιχνεύονται από το σύστημα. Δευτερογενή ηλεκτρόνια (Secondary electrons, SE). Δευτερογενή ηλεκτρόνια Όταν τα ηλεκτρόνια της δέσμης συγκρούονται με τα ηλεκτρόνια του ατόμου μερικά από τα χαλαρά συγκρατούμενα ηλεκτρόνια μπορεί να φύγουν από το άτομο και ονομάζονται δευτερογενή ηλεκτρόνια. (Κάθε προσπίπτον ηλεκτρόνιο μπορεί να παράγει αρκετά δευτερογενή). Κάθε ηλεκτρόνιο που εγκαταλείπει το άτομο μετά από σύγκρουση με άλλο υψηλής ενέργειας είναι θεωρητικά ένα δευτερογενές ηλεκτρόνιο. Τα δευτερογενή ηλεκτρόνια είναι χαμηλής ενέργειας (50eV) και εκπέμπονται κοντά στην επιφάνεια του δείγματος (Εικόνα 2.1.β) αφού αυτά που εκπέμπονται από μεγαλύτερο βάθος, απορροφούνται εύκολα από την μάζα του δείγματος. Γι αυτό τα δευτερογενή ηλεκτρόνια είναι χρήσιμα για την απεικόνιση της επιφάνειας του δείγματος. 24

34 Τα δευτερογενή ηλεκτρόνια παράγονται με δύο κυρίως μηχανισμούς Καθώς η δέσμη εισέρχεται στην επιφάνεια Καθώς η οπισθοσκεδαζόμενη δέσμη εξέρχεται από την επιφάνεια Ο δεύτερος μηχανισμός είναι δέκα φορές πιο πιθανός από τον πρώτο. Επομένως είναι αναμενόμενο να υπάρχει μεγαλύτερη εκπομπή δευτερογενών ηλεκτρονίων εκεί που είναι μεγάλη και η εκπομπή οπισθοσκεδαζόμενων. Γι αυτό οι εικόνες των δευτερογενών και των οπισθοσκεδαζόμενων δεν διαφέρουν πολύ. (α) (β) Εικόνα 2.1.: Σχηματική αναπαράσταση (α) της οπισθοσκέδασης και (β) της δευτερογενούς εκπομπής ηλεκτρονίων. Πηγή: [28] 4) Θέρμανση του δείγματος Οργανολογία Η λειτουργία του SEM στηρίζεται στις αλληλεπιδράσεις του προς εξέταση δείγματος και της προσπίπτουσας σε αυτό δέσμης ηλεκτρονίων. Οι βασικές διατάξεις που υπάρχουν στο μικροσκόπιο είναι το σύστημα παραγωγής δέσμης ηλεκτρονίων (Εικόνα 2.2.), το σύστημα κατεύθυνσης της δέσμης, το σύστημα πληροφοριών και τέλος το σύστημα κενού. Εικόνα 2.2.: Διάγραμμα εκπομπής δέσμης. Πηγή: [28] 25

35 Τα βασικά στάδια λειτουργίας ενός ηλεκτρονικού μικροσκοπίου (Εικόνα 2.3.) είναι: i. Σχηματίζεται μια δέσμη ηλεκτρονίων από την πηγή η οποία επιταχύνεται προς το δείγμα μέσω ενός θετικού ηλεκτρικού δυναμικού. ii. Χρησιμοποιώντας μεταλλικά ανοίγματα, ηλεκτρομαγνητικούς φακούς και πηνία σάρωσης, επιτυγχάνεται μια λεπτή εστιασμένη μονοχρωματική δέσμη η οποία σαρώνει την επιφάνεια του δείγματος. iii. Οι αλληλεπιδράσεις δέσμης δείγματος καταγράφονται από τους ανιχνευτές και μετατρέπονται σε εικόνα. Τα παραπάνω στάδια ισχύουν για όλους τους τύπους ηλεκτρονικών μικροσκοπίων. [28] Εικόνα 2.3.: Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης ZEISS EVO MA 10, Εργαστήριο Τμήματος Επιστήμης των Υλικών Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης (TEM) Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης (Εικόνα 2.4.), η πηγή ηλεκτρονίων αποτελείται ένα νήμα βολφραμίου (ή ακίδα LaB 6 ) που με την πυράκτωσή, όταν περάσει από αυτό ηλεκτρικό ρεύμα, εκπέμπει ηλεκτρόνια. Μεταξύ του νήματος, που αποτελεί την κάθοδο, και της ανόδου, εφαρμόζεται μια διαφορά δυναμικού (συνήθως της τάξης των kv) η οποία επιταχύνει τα ηλεκτρόνια. Η πορεία των ηλεκτρονίων, ρυθμίζεται από τους ηλεκτρομαγνητικούς φακούς στους οποίους αλλάζοντας την ένταση του ρεύματος που τους διαπερνάει, μπορούμε να μεταβάλλουμε την ένταση του μαγνητικού πεδίου τους (δηλαδή την εστιακή τους 26

36 απόσταση) και επομένως να εστιάσουμε τη δέσμη των ηλεκτρονίων πάνω στο παρασκεύασμα. Οι κύριες ρυθμίσεις σ' ένα μικροσκόπιο TEM επιτυγχάνονται με: 2. τον συγκεντρωτή φακό (condenser lens), εστίαση της δέσμης στο παρασκεύασμα. 3. τον αντικειμενικό φακό (objective lens), εστίαση της εικόνας στην οθόνη. 4. ενδιάμεσος ή και φακός προβολής (intermediate, projector lens) για τη ρύθμιση της μεγέθυνσης. Η εικόνα σχηματίζεται πάνω σε μια οθόνη επικαλυμμένη με φωσφορίζουσα ουσία η οποία διεγείρεται από τα ηλεκτρόνια που πέφτουν επάνω της, αφού αυτά διαπεράσουν το παρασκεύασμα. Τα σημεία του παρασκευάσματος που δεν είναι διαπερατά από τα ηλεκτρόνια, μας δίνουν σκοτεινές περιοχές (ηλεκτρονιόφιλες, ηλεκτρονιακά πυκνές, electron dense) ενώ αντίθετα τα διαπερατά σημεία (ηλεκτρονιακά διαφανή, electron lucent) μας δίνουν φωτεινές περιοχές. Αυτή η διαφοροποίηση επιτυγχάνεται με την εκλεκτική «χρώση» του παρασκευάσματος Εικόνα 2.4.: Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης FEI CM20, Ερευνητικό Ινστιτούτο «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ». Ο τρόπος που λειτουργεί το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, μας θέτει πολλούς περιορισμούς ως προς τη φύση των δειγμάτων που μπορούμε να παρατηρήσουμε. 27

37 Έτσι ένα δείγμα για να είναι δυνατό να παρατηρηθεί με το κλασσικό Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Διέλευσης και με τις κλασσικές μεθόδους θα πρέπει να έχει τις παρακάτω ιδιότητες: a) να αντέχει σε υψηλό κενό, b) να είναι σταθερό στο βομβαρδισμό ηλεκτρονίων, c) να είναι αρκετά λεπτό για να μπορούν να το διαπερνούν τα ηλεκτρόνια, και d) να επιτρέπει τη διαφορική σκέδαση των ηλεκτρονίων. Αυτές οι ιδιότητες που πρέπει να έχει ένα παρασκεύασμα, μας περιορίζουν στο να μπορούμε να εξετάσουμε μόνο μονιμοποιημένα δείγματα (νεκρά), αφυδατωμένα, κομμένα σε πολύ λεπτές τομές (πάχος nm) και «χρωματισμένα» με «χρωστικές» που περιέχουν βαριά μέταλλα, όπως για παράδειγμα είναι ο μόλυβδος και το ουράνιο. [29] 2.3. Ανάλυση Ειδικής Επιφάνειας Brunauer-Emmett-Teller (BET) Η ειδική επιφάνεια ενός υλικού ισούται με τη συνολική επιφάνεια του ανά μονάδα βάρους του υλικού. Η καθιερωμένη μέθοδος μέτρησης της ειδικής επιφάνειας (Specific Surface Area, SSA), του όγκου πόρων (Pore Volume, Vp) και της κατανομής του μεγέθους πόρων (Pore Size Distribution) των υλικών βασίζεται στη φυσική προσρόφηση ενός αδρανούς αερίου, συνήθως αζώτου, πάνω στην επιφάνειά τους σε θερμοκρασία υγρού αζώτου (-196 ο C). Κάθε προσροφημένο μόριο καλύπτει στην επιφάνεια του πορώδους υλικού εμβαδόν ίσο με την διατομή του. Υπολογίζοντας τον αριθμό των μορίων που απαιτούνται για να επιτευχθεί μονομοριακή κάλυψη της επιφάνειας ενός υλικού και γνωρίζοντας το εμβαδόν της διατομής, είναι δυνατός ο υπολογισμός της ειδικής επιφάνειας του δείγματος. Το όργανο μέτρησης ειδικής επιφάνειας είναι ένα πλήρως αυτοματοποιημένο όργανο (Εικόνα 2.5.). Αποτελείται από τα εξής κύρια μέρη: 1. Θέσεις απαέρωσης (κενό mmhg) υπό θέρμανση (μέχρι 500 ο C) με δυνατότητα τοποθέτησης δύο δειγμάτων. 2. Δοχείο υγρού αζώτου στο οποίο βυθίζεται ο σωλήνας χαλαζία για τη παγίδευση αερίων που εκροφούνται από την απαέρωση του δείγματος. 3. Δοχείο υγρού αζώτου στο οποίο βυθίζεται ο σωλήνας χαλαζία με το δείγμα στο οποίο θα πραγματοποιηθεί η ρόφηση/εκρόφηση. 4. Θέση μέτρησης. 5. Πίνακας ελέγχου με φωτεινές ενδείξεις όσον αφορά την εξέλιξη της διαδικασίας καθώς και οθόνη με πληροφορίες για την πίεση και την θερμοκρασία την συγκεκριμένη χρονική στιγμή. 6. Υπολογιστής ελέγχου του συστήματος και επεξεργασίας των ισόθερμων ρόφησης/εκρόφησης Ν 2, καθώς και μια αντλία κενού. 28

38 Στο πάνω μέρος του οργάνου βρίσκεται ο πίνακας ελέγχου με φωτεινές ενδείξεις όσον αφορά την εξέλιξη της διαδικασίας καθώς και οθόνη με πληροφορίες για την πίεση και την θερμοκρασία την συγκεκριμένη χρονική στιγμή. [30] Εικόνα 2.5.: Όργανο μέτρησης ειδικής επιφάνειας Autosorb-1 series (Model ASIC.LP) QuantaChrome 2.4. Περίθλαση Ακτίνων Χ (XRD) Η περίθλαση, περιγράφεται στη φυσική, ως το φαινόμενο της διάχυσης των κυμάτων προς όλες τις κατευθύνσεις όταν αυτά προσπίπτουν σε ένα φράγμα ή οπή με διαστάσεις παραπλήσιες του μήκους κύματος. Το φράγμα αποτελείται από παράλληλες σχισμές ίσου πλάτους d, και θα πρέπει να ισχύει ο περιορισμός d λ. Ο Max von Laue ήταν ο επιστήμονας που έθεσε τα θεμέλια της τεχνικής του XRD και πρότεινε ότι θα ήταν δυνατό ένας φυσικός κρύσταλλος να αποτελέσει ένα είδος τρισδιάστατου φράγματος περίθλασης των ακτίνων Χ αφού η διάταξη των ατόμων στον κρύσταλλο μπορεί να θεωρηθεί ως μια σειρά από παράλληλα δικτυωτά επίπεδα, τα οποία ισαπέχουν μεταξύ τους αποστάσεις της τάξης του 1 Å. Ως συνέπεια αυτού, μια δέσμη ακτίνων Χ θα μπορούσε να υποστεί σκέδαση, να απορροφηθεί και να εκπεμφθεί εκ νέου, από μεμονωμένα άτομα του κρυστάλλου. Τα αρχικά πειράματα περίθλασης πραγματοποιήθηκαν από τον Knipping και τον Laue, και επιβεβαίωσαν πως οι ακτίνες Χ είναι κύματα και τα άτομα σε έναν κρύσταλλο είναι διευθετημένα σε μια κανονική διάταξη (Εικόνα 2.6.). Έκτοτε, η τεχνική χρησιμοποιείται ευρύτατα για τη μελέτη της κρυσταλλικής δομής. 29

39 Εικόνα 2.6.: Πείραμα περίθλασης ακτίνων Χ. Πηγή: [31] Η μελέτη της δομής, απαιτεί την εφαρμογή του νόμου της σκέδασης ή συνθήκη του Bragg, προς τιμή των πρωτοπόρων της έρευνας στην περιοχή της περίθλασης ακτίνων Χ, W. και L. Bragg, πατέρα και υιού, που συνδέει το μήκος κύματος, λ, της ακτινοβολίας, τη γωνία περίθλασης, θ, και την πλεγματική απόσταση (interplanar distance), d μεταξύ των ατόμων σε ένα κρύσταλλο (Εικόνα 2.7.). n λ 2d sinθ (n=0, 1, 2, 3 ) (2.1.) όπου n ακέραιος αριθμός που παίρνει τιμές 0, 1, 2, 3, 4 και αναφέρεται στα διαδοχικά παράλληλα νοητά κρυσταλλικά επίπεδα, που όλα παράγουν ενισχυτική συμβολή. λ το μήκος κύματος, d η απόσταση μεταξύ των πλεγματικών επιπέδων και θ η γωνία πρόσπτωσης. Εικόνα 2.7.: Νόμος του Bragg. Πηγή: [31] Ένα περιθλασίμετρο ακτίνων Χ αποτελείται κυρίως από (Εικόνα ): i. Το σύστημα πηγής διέγερσης και παραγωγής ακτίνων Χ. ii. Δυο φράγματα των ακτίνων Χ με μεταβαλλόμενη γεωμετρία. iii. Το σύστημα εισαγωγής ή τοποθέτησης του δείγματος. iv. Το μονοχρωμάτορα, το σύστημα διασποράς και το γωνιομετρικό μηχανισμό. v. Το σύστημα ανίχνευσης και συλλογής των δεδομένων. [31] 30