Έλεγχος ποιότητας εκτρεφόμενων πληθυσμών τσιπούρας, Sparus aurata (Linnaeus, 1758) με έμφαση τις σκελετικές παραμορφώσεις και το σχήμα σώματος

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΩΚΕΑΝΟΓΡΑΦΙΑΣ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΘΑΛΑΣΣΙΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ Έλεγχος ποιότητας εκτρεφόμενων πληθυσμών τσιπούρας, Sparus aurata (Linnaeus, 1758) με έμφαση τις σκελετικές παραμορφώσεις και το σχήμα σώματος ΛΟΪΖΙΔΗΣ ΜΙΧΑΛΗΣ (Α.Μ.: 29001) ΑΘΗΝΑ, 2011

2 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΩΚΕΑΝΟΓΡΑΦΙΑΣ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΘΑΛΑΣΣΙΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ Έλεγχος ποιότητας εκτρεφόμενων πληθυσμών τσιπούρας, Sparus aurata (Linnaeus, 1758) με έμφαση τις σκελετικές παραμορφώσεις και το σχήμα σώματος ΛΟΪΖΙΔΗΣ ΜΙΧΑΛΗΣ (Α.Μ.: 29001) ΑΘΗΝΑ,

3 Επιβλέπων Καθηγητής Βερροιόπουλος Γεώργιος (Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών) Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή Βερροιόπουλος Γεώργιος (Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών) Κουμουνδούρος Γεώργιος (Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Κρήτης) Μήλιου-Μπαρσάκη Ελένη (Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήματος Επιστήμης Ζωικής Παραγωγής και Υδατοκαλλιεργειών, Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών) 2

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Θαλάσσιας Βιολογίας και Βιολογίας Ιχθύων του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Κρήτης, υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Κουμουνδούρου Γ. στα πλαίσια του Διατμηματικού Μεταπτυχιακού Προγράμματος: «Ωκεανογραφία και Διαχείριση Θαλάσσιου Περιβάλλοντος». Καταρχάς θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή της εργασίας, κ. Βερροιόπουλο Γ. για την εμπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπο μου και στην ελευθερία κινήσεων που μου έδωσε ώστε να ασχοληθώ με το ερευνητικό αντικείμενο που πάντα ήθελα να ακολουθήσω. Πιστεύω ότι αυτή η εμπιστοσύνη πηγάζει και από το γεγονός ότι γνώριζε ότι δουλεύοντας με τον κ. Κουμουνδούρο, ο χρόνος μου δεν θα πήγαινε ανεκμετάλλευτος. Όντος ο σωστός προγραμματισμός και ο υποδειγματικός επαγγελματισμός του κ. Κουμουνδούρου με βοήθησε ώστε να αντεπεξέλθω στις απαιτήσεις της παρούσας διπλωματικής εργασίας, και παράλληλα να επεκτείνω τα πεδία των γνώσεων μου σε ποικίλους τομείς της ιχθυολογίας και της έρευνας γενικότερα. Οφείλω λοιπόν ένα μεγάλο ευχαριστώ στον κ. Κουμουνδούρο, αφού ουσιαστικά αποτελεί τον κυριότερο παράγοντα καθορισμού των ερευνητικών μου ικανοτήτων και δεξιοτήτων. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα. Μήλιου- Μπαρσάκη Ε. που αποδέχθηκε να συμμετάσχει ως μέλος της εξεταστικής επιτροπής όπως επίσης και για τις διορθώσεις και τις επισημάνσεις της παρούσας εργασίας. Μεγάλη βοήθεια στην παρούσα εργασία έχει προσφέρει και ο Επίκουρος Καθηγητής του Εργαστήριου Εφαρμοσμένης Γενετικής & Γενετικής Βελτίωσης του Τμήματος Υδατοκαλλιεργειών & Αλιευτικής Διαχείρισης του Τ.Ε.Ι Μεσολογγίου, κ. Μπαταργιάς Κ.. Μέσω της συνεργασίας μας είχα την ευκαιρία να εκτιμήσω την αξία του να έχεις σωστούς συνεργάτες. Μεγάλο μέρος των δεδομένων προς ανάλυση της παρούσας εργασίας και συγκεκριμένα τα δείγματα των ενήλικων ατόμων για την εκτίμηση του σχήματος σώματος, προέρχονται από την ΑΝΔΟΜΕΔΑ Α.Ε. την οποία ευχαριστώ για την διάθεσή τους. Θα ήθελα να ευχαριστήσω επίσης την υποψήφιο διδάκτορα Σχισμένου Ε. και τον Ερευνητή B του ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε κ. Σωμαράκη Σ. για την απλόχερη διάθεση του εξοπλισμού ιστολογικής ανάλυσης και για την βοήθεια που μου προσέφεραν. Τέλος, μα όχι τελευταία, ευχαριστώ τους γονείς, τα αδέλφια μου και την Σοφία για την αγάπη και στήριξη που μου προσφέρουν όλα αυτά τα χρόνια και που μου δίνουν δύναμη να συνεχίσω. Θα ήθελα ως ελάχιστο δείγμα ευγνωμοσύνης να τους αφιερώσω αυτή την εργασία που πραγματικά ήταν ένα από τα πιο δημιουργικά πράγματα που έχω κάνει στη ζωή μου μέχρι σήμερα. 3

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ποιότητα στην υδατοκαλλιέργεια Κανονιστικό πλαίσιο Ο έλεγχος ποιότητας των ιχθύων Οι μορφο-ανατομικές ανωμαλίες στην ιχθυοκαλλιέργεια Ανωμαλίες νηκτικής κύστης Χρωματικές ανωμαλίες Σκελετικές παραμορφώσεις Το σχήμα σώματος στην ιχθυοκαλλιέργεια Η μορφολογική πλαστικότητα των ιχθύων Μέθοδοι μορφομετρικής ανάλυσης Το είδος Sparus aurata Στοιχεία βιολογίας Κύκλος παραγωγής Στόχος της παρούσας εργασίας ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Δείγματα για μελέτη των σκελετικών παραμορφώσεων Δείγματα για μελέτη του σχήματος σώματος Στατιστική επεξεργασία ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Αποτελέσματα κρανιακών παραμορφώσεων Συσχέτιση παραμορφώσεων με την ένταση και την ασυμμετρία Συσχέτιση των διαφορετικών παραμορφώσεων Επίδραση της έντασης κάθε παραμόρφωσης στο ρυθμό αύξησης Αποτελέσματα παραμόρφωσης σπονδυλικής στήλης Αποτελέσματα της επίδρασης της θερμοκρασίας πρώιμης ανάπτυξης στην πλαστικότητα του σχήματος των ιχθυδίων 51 4

6 3.4. Αποτελέσματα της πλαστικότητα του σχήματος πληθυσμών που προέρχονται από πρόγραμμα γενετικής βελτίωσης ΣΥΖΗΤΗΣΗ Έλεγχος ποιότητας ως προς τις σκελετικές παραμορφώσεις Κρανιακές παραμορφώσεις Παραμόρφωση σπονδυλικής στήλης Έλεγχος ποιότητας με βάση το σχήμα σώματος Θερμοκρασιακά ελεγχόμενη μορφολογική πλαστικότητα ιχθυδίων Μορφολογική πλαστικότητα ενήλικων πληθυσμών τσιπούρας ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ & ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 85 5

7 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 6

8 1.1. Η ποιότητα στην υδατοκαλλιέργεια Κανονιστικό πλαίσιο Η βελτίωση της ποιότητας των καλλιεργούμενων προϊόντων αποτελεί διακύβευμα για την Ευρωπαϊκή Ένωση τα τελευταία 20 χρόνια. Προς αυτή την κατεύθυνση στοχεύουν οι νομοθετικές διατάξεις που εκδίδονται κατά καιρούς και για τα θαλάσσια προϊόντα, με γενικό γνώμονα την παραγωγή ή/και διάθεση ασφαλών τροφίμων (Κανονισμός ΕΚ no. 178/2002) εφαρμόζοντας τεχνικές και μεθόδους που δεν επιβαρύνουν το περιβάλλον και τη βιοποικιλότητά του (Οδηγία 2000/60/ΕΚ). Η διττή εξασφάλιση της ποιότητας (παραγόμενο προϊόν και αντίκτυπος στο περιβάλλον), είναι απαραίτητο στοιχείο για τη βιωσιμότητα των θαλάσσιων πόρων και της απασχόλησης (Οδηγία 2008/56/ΕΚ). Βάσει των πιο πάνω κινήθηκε και το 2002 η αναθεώρηση της Κοινής Αλιευτικής Πολιτικής, όπου αναφέρεται ότι μεταξύ άλλων στόχος της είναι να προωθήσει μέχρι το 2020: «Τη βιώσιμη αλιεία και υδατοκαλλιέργεια σε ένα υγιές θαλάσσιο περιβάλλον που να είναι σε θέση να στηρίξει μια οικονομικώς βιώσιμη βιομηχανία η οποία θα παρέχει ευκαιρίες απασχόλησης και άλλες δυνατότητες στις παράκτιες κοινότητες». Σύμφωνα όμως με την Πράσινη Βίβλο για την Μεταρρύθμιση της Κοινής Αλιευτικής Πολιτικής «Το παραπάνω όραμα για το μέλλον απέχει παρασάγγας από τη σημερινή πραγματικότητα» (Ανακοίνωση COM/2009/163/FINAL). Αποτελεί κοινή διαπίστωση, ότι ο κυριότερος παράγοντας της -μέχρι τώρααποτυχίας της Κοινής Αλιευτικής Πολιτικής είναι η υπεραλίευση των ιχθυοαποθεμάτων. Το κενό αυτό το καλύπτει σήμερα ο τομέας των υδατοκαλλιεργειών, με το 50% της παγκόσμιας προσφοράς ιχθύων για κατανάλωση από τον άνθρωπο να προέρχεται από αυτόν (FAO, 2008). Ειδικότερα στην Ε.Ε., η υδατοκαλλιέργεια έχει αποκτήσει ιδιαίτερης προσοχής από τους ιθύνοντες, αφού αφενός μεν στηρίζεται μια τεράστια οικονομική δραστηριότητα γύρω από τον κλάδο, αφετέρου δε μπορεί να λύσει το πρόβλημα της εισαγωγής αλιευμάτων από χώρες εκτός της Κοινότητας. Δεν θα μπορούσε όμως και ο τομέας της υδατοκαλλιέργειας να μην συσχετιστεί με την ποιότητα, τόσο του προϊόντος όσο και του αντίκτυπου των εργασιών της στο περιβάλλον. Το θεσμικό πλαίσιο σήμερα στην Ε.Ε. εξασφαλίζει την υψηλή ποιότητα των τροφίμων (Κανονισμός 854/2004/ΕΚ) όπου το προϊόν ιχνηλατείται σε κάθε στάδιο παραγωγής (Κανονισμός 834/2007/ΕΚ), δεν επιβαρύνεται το περιβάλλον και δεν δημιουργούνται συνθήκες πίεσης για τους εκτρεφόμενους πληθυσμούς (Κανονισμός 710/2009/ΕΚ). Από το 2002 η Επιτροπή της Ε.Ε. με ανακοινώσεις της προς το Ευρωπαϊκό Κοινοβούλιο και το Συμβούλιο προωθεί σχέδιο για τη δημιουργία Στρατηγικής για τη Βιωσιμότητα της Ευρωπαϊκής Υδατοκαλλιέργειας (Ανακοίνωση COM/2002/511/FINAL), όπου συμπεριλαμβάνει όλα τα πιο πάνω και θα συμβάλει ουσιαστικά στους στόχους του

9 Ο έλεγχος ποιότητας των ιχθύων Καθώς ένα σημαντικότατο ποσοστό της υδατοκαλλιέργειας καλύπτεται από αυτόν της θαλάσσιας ιχθυοκαλλιέργειας, μεγάλη βαρύτητα έχει δοθεί στην «ποιότητα ιχθύων». Η δυσκολία που παρουσιάζεται στην αποσαφήνιση του όρου και του πεδίου έρευνας έγκειται σε γεωγραφικούς, πολιτισμικούς και επιχειρηματικούς παράγοντες (Rasmussen, 2001). Η αντίληψη της ποιότητας διαφέρει για τον παραγωγό, το επιστημονικό δυναμικό και τον καταναλωτή ανά γεωγραφική περιοχή, εκτρεφόμενο είδος και ανά τύπο διάθεσης ή/και μεταποίησης (Rasmussen, 2001, Olafsdottir et al. 2004, Costa et al. 2009, Menesatti et al. 2010). Σε κάθε περίπτωση, ο όρος «ποιότητα ιχθύων» αναφέρεται σε συνδυασμό χαρακτηριστικών όπως η ασφάλεια, η διατροφική αξία, η φρεσκάδα, η γεύση και τα φυσικά χαρακτηριστικά του είδους (Bremner, 2000). Σε σχέση όμως με άλλα ζωικά προϊόντα, η ποιότητα των ιχθύων είναι δύσκολο να ελεγχθεί λόγω αποκλίσεων που οφείλονται στο είδος, στον οργανισμό, στο φύλο, στην ηλικία, αλλά και στις συνθήκες εκτροφής, και επεξεργασίας του τελικού προϊόντος (Rasmussen, 2001, Olafsdottir et al. 2004, Costa et al. 2009). Για αυτόν το λόγο έχουν αναπτυχθεί ποικίλες μέθοδοι ελέγχου της ποιότητας: οργανοληπτικές με ή χωρίς τη χρήση δεικτών (Connel, 1995, Huss, 1995, Olafsdottir et al. 2004), χημικές, βιοχημικές και μικροβιολογικές (Botta, 1995, Huss, 1995), μοριακές (Geay et al. 2009) και ενόργανες (βιοχημικές-χημικές, μικροβιολογικές και φυσικές) (Huss, 1995, Olafsdottir et al. 2004, Menesatti et al. 2010) και φασματοσκοπικές. Ειδικότερα οι δύο τελευταίες τείνουν να αντικαταστήσουν τις οργανοληπτικές ώστε να επιταχυνθεί ο χρόνος εκτίμησης της ποιότητας, αλλά και να αποκλειστούν υποκειμενικοί παράγοντες που οφείλονται στον ανθρώπινο παράγοντα (Olafsdottir et al. 2004). Η τελική ποιότητα των ιχθύων είναι αποτέλεσμα και της συνολικής «βιολογικής ιστορίας» των οργανισμών, και για αυτό το λόγο έμφαση έχει δοθεί στη βελτίωση των συνθηκών εκτροφής (θερμοκρασία, φωτοπερίοδος, ποιότητα νερού, συγκέντρωση πληθυσμού, διατροφή, κολυμβητική δραστηριότητα, κ.α.) και στη δειγματοληπτική παρακολούθηση της παραγωγικής διαδικασίας. Σε εργασία ανασκόπησης του Rasmussen (2001) καταγράφονται οι παράγοντες που παρακολουθούνται κατά την εκτροφή του σολωμού, όπως το ποσοστό του εδώδιμου προϊόντος (fillet yield), η ποσοστιαία σύνθεση σε μυϊκό και λιπώδη ιστό αλλά και η συγκέντρωση σε πρωτεΐνες και λιπίδια. Η ίδια προσέγγιση γίνεται και από τον Grigorakis (2007) για τους εκτρεφόμενους πληθυσμούς τσιπούρας και λαβρακιού, όπου παρατίθενται και οι κυριότεροι παράγοντες (με σημαντικότερους αυτούς της διατροφής) που επηρεάζουν την τελική ποιότητα, ενώ γίνεται και συσχετισμός μεταξύ εκτρεφόμενων και φυσικών πληθυσμών (με τους δεύτερους να αναφέρονται ως «ποιοτικότεροι»). Θα πρέπει να αναφερθεί ότι και οι δύο εργασίες ανασκόπησης αναφέρουν ότι σημαντικός παράγοντας της ποιότητας είναι η εξωτερική εμφάνιση. Ωστόσο, αν και η εξωτερική εμφάνιση των εκτρεφόμενων πληθυσμών (σχήμα σώματος, μορφοανατομικές ανωμαλίες, χρωματισμός) αποτελεί πεδίο μελέτης πολλών ερευνητικών 8

10 ομάδων (Froese & Pauly, 2011), μέχρι σήμερα δεν έχει ενταχθεί στον κατάλογο των θεσμοθετημένων κριτηρίων ελέγχου και πιστοποίησης της ποιότητας των προϊόντων Οι μορφο-ανατομικές ανωμαλίες στην ιχθυοκαλλιέργεια Η ποιότητα των εκτρεφόμενων ειδών της ιχθυοκαλλιέργειας εξαρτάται και από τα οργανοληπτικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά, τα οποία σχετίζονται άμεσα με την επί μέρους ποιότητα του γόνου και της χορηγούμενης διατροφής (Dinis & Soares, 1993). Στα μορφολογικά χαρακτηριστικά συγκαταλέγονται και οι μορφο-ανατομικές ανωμαλίες όπου σύμφωνα με τον Koumoundouros (2010), χαρακτηρίζονται ως «η όποια απόκλιση της (φυσιολογικής) εξωτερικής μορφολογίας, που συχνά συνοδεύεται με αλλοιώσεις στην εσωτερική ανατομία.». Οι μορφο-ανατομικές ανωμαλίες, αποτελούν ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα ποιότητας στην ιχθυοκαλλιέργεια. Η παρουσία τους στους εκτρεφόμενους πληθυσμούς υποβαθμίζει τόσο την εξωτερική μορφολογία του τελικού προϊόντος και την άποψη του καταναλωτή για τα προϊόντα ιχθυοκαλλιέργειας, όσο και τις βιολογικές επιδόσεις (π.χ. κολυμβητική δραστηριότητα, μετατρεψιμότητα τροφής, ρυθμός αύξησης και επιβίωσης, ανοσοαντίδραση) των πασχόντων ατόμων κατά τη διάρκεια της εκτροφής (Paperna et al. 1977, Barahona-Fernandes, 1982, Chatain, 1994, Andrades et al. 1996, Hilomen- Garcia, 1997, Koumoundouros et al. 1997b, Koumoundouros et al. 2002, Sfakianakis et al. 2006a, Georgakopoulou et al. 2010). Επακόλουθη είναι και η υποβάθμιση της εμπορικής αξίας του προϊόντος λόγω της απόκλισής του από το φυσιολογικό φαινότυπο των άγριων πληθυσμών (Loy et al. 1998, Boglione et al. 2001). Η έγκαιρη διαλογή-απομάκρυνση των δύσμορφων ατόμων από τους εκτρεφόμενους πληθυσμούς αποτελεί σήμερα τη συνηθέστερη πρακτική για την ελαχιστοποίηση των όποιων αρνητικών επιπτώσεων (Koumoundouros et al. 1997b, Boglione et al. 2001). Δεδομένου ότι η πλειονότητα των ανωμαλιών αναπτύσσεται κατά τα πρώιμα οντογενετικά στάδια (Chatain & Ounais-Guschemann, 1990, Koumoundouros et al. 1997a, Koumoundouros et al. 1997b, Cobcroft et al. 2001, Koumoundouros et al. 2001b, Koumoundouros et al. 2002, Sfakianakis et al. 2003, Sfakianakis et al. 2004, Sfakianakis et al. 2006b, Georgakopoulou et al. 2007a, Mazurais et al. 2009, Georgakopoulou et al. 2010), η απομάκρυνση των παραμορφωμένων ατόμων γίνεται στους ιχθυογεννητικούς σταθμούς. Γεγονός ωστόσο που αυξάνει σημαντικά το κόστος παραγωγής του γόνου, δαπανώντας πόρους (ανθρώπινο δυναμικό, υποδομές, πρώτες ύλες) για άτομα τα οποία απορρίπτονται λόγω της κακής ποιότητάς τους. Σύμφωνα με τους Gavaia et al. (2001), η υψηλή συχνότητα μορφο-ανατομικών ανωμαλιών αποδίδεται στο μειωμένο ρυθμό αύξησης και επιβίωσης, ενώ μπορεί να προκαλείται από γενετικούς (Afonso et al. 2000, Sadler et al. 2001, Kause et al. 2005, Shikano et al. 2005) ή/και επιγενετικούς παράγοντες (Πίνακας 1.1). Όσον αφορά στους γενετικούς παράγοντες, σε κάποια είδη έχει βρεθεί ότι η πολυπλοειδία, ο υβριδισμός και οι μεταλλάξεις προκαλούν δυσπλασίες (Afonso et al. 9

11 2000, Sadler et al. 2001, Kause et al. 2005, Shikano et al. 2005). Επιπρόσθετα, η θετική συσχέτιση ορισμένων ανωμαλιών με το γενότυπο υπό συγκεκριμένες περιβαλλοντικές προϋποθέσεις, υποδεικνύει τη σημαντικότητα της αλληλεπίδρασης γενότυπου-περιβάλλοντος (Kause et al. 2007). Παρόλα αυτά σε άλλες εργασίες τα αποτελέσματα δεν συμφωνούν με τις πάνω διαπιστώσεις αναφέροντας μηδενική κληρονομησιμότα των δυσμορφιών (Castro et al. 2008). Πίνακας 1.1: Οι κύριοι επιγενετικοί παράγοντες πρόκλησης μορφο-ανατομικών ανωμαλιών. Ασυ., σωματική ασυμμετρία, Βρα, βραγχιοστεγείς ακτίνες, Γνά., γνάθοι, Επι., επικαλυματικό, Κύφ., κύφωση, Λορ., λόρδωση, Μ.Λ.Ν., μη λειτουργική νηκτική κύστη, Ουρ., ουραίο πτερύγιο, Σκο., σκολίωση, Σπο., σπονδυλικής στήλης, Χρω., χρωματισμός. Καταγράφεται και το αναπτυξιακό στάδιο εμφάνισης κάθε ανωμαλίας σε κάθε είδος. Εμβ., εμβρυικό, Ιχθ., ιχθυδίου, Λεκ., λεκιθοφόρου προνύμφης, Νυμ., νυμφικό. Τροποποίηση από Koumoundouros (2010). Επιγενετικοί παράγοντες Βιοτικοί Διατροφή Είδος Εμφάνισης Οντογενετικό Στάδιο Πρωτεϊνες, Λιπίδια Ποικίλα Νυμ.-Ιχθυ. Ποικίλες Βιταμίνες Παθογόνοι οργανισμοί Μορφο-ανατομική Ανωμαλία Salmonids Ιχθ. Σπο.,Γνά. Myxobolus sp. Scomber japonicus Ιχθ. Κύφ. Seriola quinqueradiata Ιχθ. Σκολ. Μητρικό στρες Salmo salar Εμβ., Λεκ., Ιχθ. Επι., Γνά. Αβιοτικοί Dicentrarchus labrax Νυμ. Βρα. D. labrax Νυμ. Λορ. Gadus morhua Εμβ., Λεκ. Νωτ. Θερμοκρασία Pleuronectes platessa Εμβ., Λεκ. Νωτ. Pagellus erythrinus Εμβ., Λεκ. Ουρ., Ασυ. Pseudopleuronectes herzensteini Νυμ. Χρω., Ασυ. Sparus aurata Λεκ. Γνά., Νωτ., Salmo salar Εμβ., Ιχθ. Σπο. Gadus morhua Εμβ., Λεκ. Γνά. Αλατότητα Hippoglossus hippoglossus Λεκ. Νωτ. ph Cyprinus caprio Εμβ., Λεκ. Νωτ. Ο 2 Danio rerio Εμβ., Λεκ. Νωτ. Ελαιώδες φίλμ Φυσόκλειστα Νυμ. Μ.Λ. Ν. D. labrax Νυμ.-Ιχθ. Λόρ. Υδροδυναμική Pagrus major Ιχθ. Λόρ. Ρύποι Ποικίλα Ποικίλα Ποικίλες Η συχνότητα των μορφο-ανατομικών ανωμαλιών φαίνεται να καθορίζεται σημαντικά και από τους επιγενετικούς παράγοντες (βιοτικούς και αβιοτικούς). Συγκεκριμένα έχει αποδειχθεί ότι παράγοντες όπως η θερμοκρασία (Georgakopoulou 10

12 et al. 2007a, 2010), η ποιότητα, η ένταση και η διάρκεια του φωτισμού (Trotter et al. 2003), η αλατότητα (Ottesen & Bolla, 1998), η συγκέντρωση διαλελυμένου οξυγόνου (Shang & Wu, 2004), η ένταση των ρευμάτων (Sfakianakis et al. 2006b), η ποιότητα της δίαιτας (Mazurais et al. 2009) και το ph (Oyen et al. 1991) συσχετίζονται με την εμφάνιση δυσμορφιών σε διάφορα οντογενετικά στάδια (Πίνακας 1.1). Μεγάλη πρόοδος έχει επιτευχθεί τα τελευταία χρόνια όσον αφορά στην περιγραφή των εμφανιζόμενων μορφο-ανατομικών ανωμαλιών, των συνθηκών πρόκλησής τους και το στάδιο κατά το οποίο εμφανίζονται (Πίνακας 1.1, Koumoundouros, 2010). Αυτή η πρόοδος οδήγησε στη μείωση της συχνότητας των παραμορφώσεων στους εκτρεφόμενους πληθυσμούς (Froese & Pauly, 2011). Παρόλα αυτά δεν έχουν γίνει γνωστοί όλοι οι βιολογικοί γενεσιουργοί παράγοντες και τα μεταβολικά και αναπτυξιακά μονοπάτια που οδηγούν στην απόκλιση από το φυσιολογικό φαινότυπο. Οι έρευνες πλέον επικεντρώνονται στα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια, όπου η έκθεση των αναπτυσσόμενων εμβρύων και νυμφών στις περιβαλλοντικές συνθήκες είναι καθοριστική (Fernández et al. 2008). Έμφαση δίνεται τόσο στη θερμοκρασία ανάπτυξης, ως τον γενεσιουργό παράγοντα προγραμματισμού των αναπτυξιακών γεγονότων, όσο και στην ποιότητα της διατροφής (ειδικότερα κατά τα στάδια πρώτης πρόσληψης τροφής μέχρι την πλήρη ανάπτυξη του πεπτικού συστήματος) (Villeneuve et al. 2005b, Fernández et al. 2008, Mazurais et al. 2009, Georgakopoulou et al. 2010). Σύμφωνα με τα προαναφερθέντα, για την περαιτέρω μείωση των συχνοτήτων εμφάνισης των μορφο-ανατομικών ανωμαλιών χρειάζεται η κατανόηση των ειδο-ειδικών περιβαλλοντικών προτιμήσεων σε κάθε αναπτυξιακό στάδιο, καθώς επίσης και η γνώση της οντογένεσης της κάθε δυσμορφίας (Fernández et al. 2008). Οι μορφο-ανατομικές ανωμαλίες διακρίνονται σε (α) ανωμαλίες της νηκτικής κύστης, (β) χρωματικές ανωμαλίες και (γ) στις σκελετικές παραμορφώσεις. Η τελευταία κατηγορία που αποτελεί και τη συχνότερη, διακρίνεται σε παραμορφώσεις (ια) του κρανίου, (ιβ) της σπονδυλικής στήλης, (ιγ) των πτερύγιων, (ιδ) των λεπιών και (ιε) του σχήματος του σώματος (Εικόνα 1.1). Εικόνα 1.1: Κατηγορίες μορφο-ανατομικών ανωμαλιών. 11

13 Ανωμαλίες νηκτικής κύστης Στους περισσότερους Οστεϊχθύες συναντάται ένα εξειδικευμένο όργανο υδροστατικής ρύθμισης, η νηκτική κύστη, το οποίο σε κάποια είδη χρησιμεύει και για την αντίληψη του περιβάλλοντος, την παραγωγή ήχων ή/και την αναπνοή (Hickman, et al. 2003, Peruzzi et al. 2007). Η πλήρωση της νηκτικής κύστης με αέρα επιτυγχάνεται είτε με την μεταφορά ατμοσφαιρικού αέρα μέσω του πνευματικού αγωγού (φυσόστομοι ιχθύες), είτε με τη διάχυση των αερίων μέσω του κυκλοφορικού συστήματος (φυσόκλειστοι ιχθύες), ή ακόμη και από τον συνδυασμό και των δύο (Peruzzi et al. 2007). Οι φυσόκλειστοι ιχθύες κατά την πρώιμη νυμφική περίοδο και συγκεκριμένα πριν από την κάμψη της νωτοχορδής (pre-flexion stage), παρουσιάζουν μεταβατικό φυσόστομο στάδιο (Trotter et al. 2003, Koumoundouros, 2010). Κατά το στάδιο αυτό (που συμπίπτει και με την μετάβαση από την ενδογενή στην εξωγενή διατροφή) παρατηρείται μετάβαση των οργανισμών στην επιφάνεια του νερού όπου γίνεται πρόσληψη φυσαλίδας αέρα, η οποία μέσω του οισοφάγου και ακολούθως μέσω του πνευματικού αγωγού (που μετέπειτα ατροφεί) καταλήγει στη νηκτική κύστη (που μετέπειτα ενεργοποιείται ως κλειστό όργανο) (Trotter et al. 2003, Koumoundouros, 2010). Η αποτυχία πλήρωσης της νηκτικής κύστης με αέρα (Εικόνα 1.2) έχει παρατηρηθεί σε αρκετά εκτρεφόμενα είδη συμπεριλαμβανομένου της τσιπούρας και του λαυρακιού (Chatain, 1994). Στους πληθυσμούς αυτούς παρατηρείται υψηλότερη θνησιμότητα (Chatain, 1986, 1987, Chapman et al. 1988a, Chatain & Dewavrin, 1989, Trotter et al. 2003), αυξημένος μεταβολικός ρυθμός (Marty et al. 1995), μειωμένος ρυθμός αύξησης (Battaglene & Talbot, 1992, Crespo et al. 2001, Jacquemond, 2004) και υψηλότερη συχνότητα σκελετικών παραμορφώσεων (Chatain, 1994) όπως η προ-αιματική λόρδωση. Εικόνα 1.2: Νύμφες D. labrax μήκους 7-8 mm TL με φυσιολογική και λειτουργική (Α), υπερπληρωμένη (Β) και μη-πληρωμένη (Γ) νηκτική κύστη. Η κλίμακα αντιστοιχεί σε 1 mm. Τροποποίηση από Peruzzi et al. (2007). 12

14 Ο κυριότερος παράγοντας της αποτυχίας πλήρωσης είναι η παρουσία ελαιώδους φιλμ στην επιφάνεια του νερού και αντιμετωπίζεται με τη χρήση ειδικών συσκευών καθαρισμού (Chatain & Ounais-Guschemann, 1990). Επίσης παράγοντες όπως η υδροδυναμική, η ένταση και η διάρκεια του φωτισμού, η αλατότητα, η θερμοκρασία αλλά και το γενετικό υπόβαθρο επηρεάζουν τη φυσιολογική ανάπτυξη της νηκτικής κύστης (Divanach et al. 1996, Peruzzi et al. 2007, Koumoundouros, 2010). Εκτός από την αποτυχία πλήρωσης έχουν παρατηρηθεί και φαινόμενα υπερπλήρωσης της νηκτικής κύστης (Εικόνα 1.2, Peruzzi et al. 2007). Για την αντιμετώπιση του γενικότερου προβλήματος στους ιχθυογεννητικούς σταθμούς εκτός από την βελτίωση των πρωτοκόλλων εκτροφής, προβλέπεται και η εφαρμογή του ελέγχου πλευστότητας κατά τη φάση του απογαλακτισμού (weaning phase) και της προ-πάχυνσης (pre-growing phase) (Koumoundouros, 2010) Χρωματικές ανωμαλίες Η αλλαγή στο χρωματισμό των εκτρεφόμενων ιχθύων περιλαμβάνει το μερικό ή ολικό αλφισμό, τη διχρωμία ή τη σκουροχρωμία. Τα περιστατικά χρωματικών αλλοιώσεων που έχουν αναφερθεί στο λαβράκι και στην τσιπούρα είναι σπάνια (Divanach et al. 1996), ενώ η σκουρόχρωμη μεταβολή του ερυθρόλευκου χρώματος στο φαγκρί (Pagrus pagrus) έχει αποφευχθεί με την προσθήκη στη διατροφή φυσικών χρωστικών όπως καροτενοειδών και στη ορθή post mortem διαχείριση με ιόντα νατρίου και καλίου (Lin et al. 1998, Cejas et al. 2003) Σκελετικές παραμορφώσεις Οι σκελετικές παραμορφώσεις είναι ο συχνότερος τύπος μορφο-ανατομικών ανωμαλιών που παρατηρούνται στα εκτρεφόμενα είδη ιχθύων. Διακρίνονται ανάλογα με την ανατομική περιοχή που εμφανίζονται (κρανίο, σπονδυλική στήλη, πτερύγια, λέπια) και επιδρούν άμεσα στη μορφολογία της περιοχής όπου αναπτύσσονται ή/και σε ολόκληρο το σώμα του πάσχοντος ατόμου Κρανιακές παραμορφώσεις Οι κρανιακές δυσμορφίες αφορούν κυρίως σε παραμορφώσεις του βραγχιακού επικαλύμματος, των γνάθων, του υοειδούς τόξου και των βραγχιοστεγών ακτίνων, ενώ ποικίλουν στο βαθμό έντασης και μορφολογίας (ανασκόπηση από Koumoundouros, 2010). Δεδομένου των ζωτικών λειτουργιών του κρανίου (αναπνοή, πρόσληψη τροφής, νευροδιαβίβαση), η όποια δυσμορφία σε αυτό έχει αρνητικό αντίκτυπο στην ανάπτυξη, την επιβίωση και την ανοσοαντίσταση (Paperna et al. 1980, Barahona-Fernandes, 1982, Koumoundouros et al, 1997b). Η παραμόρφωση του βραγχιακού επικαλύμματος (Εικόνα 1.3) είναι η συχνότερα παρατηρούμενη, ειδικά στην τσιπούρα, και μπορεί να επηρεάσει έως και το 80% του πληθυσμού (Andrades et al. 1996). Μακροσκοπικά διακρίνεται ως 13

15 απώλεια ή βράχυνση του βραγχιακού επικαλύμματος (Εικόνα 1.3), με συνεπακόλουθη την έκθεση των βραγχίων (Εικόνα 1.3) και την ουσιαστική υποτίμηση της ποιότητας (Koumoundouros, 2010). Σύμφωνα με τους Koumoundouros et al. (1997b), η συγκεκριμένη παραμόρφωση εμφανίζεται κατά το νυμφικό στάδιο (20 dph) και οφείλεται στην αναδίπλωση προς τη βραγχιακή κοιλότητα του επικαλυμματικού ή και του υποεπικαλυμματικού οστού, ενώ συνοδεύεται κατά κόρον με ανωμαλίες των βραγχιοστεγών ακτίνων. Επίσης παρατηρήθηκε από τους συγγραφείς υψηλή συχνότητα μονόπλευρης εμφάνισης της παραμόρφωσης, ενώ χρονικά συμπίπτει με την οστεοποίηση (ανώμαλη) των πιο πάνω μεμβρανικών οστών. Οι κυριότεροι παράγοντες πρόκλησης της παραμόρφωσης διακρίνονται σε διατροφικούς (συγκέντρωση βιταμινών Α, C και πολυακόρεστων λιπαρών οξέων) και αβιοτικούς όπως ο υπερκορεσμός σε οξυγόνο και η θερμοκρασία ανάπτυξης (Jensen, 1988, Koumoundouros et al. 1997b, Villeneuve et al. 2005a, Georgakopoulou et al. 2010). Εικόνα 1.3: Παραμόρφωση του βραγχιακού επικαλύμματος, όπου διακρίνεται με βέλος η αναδίπλωση προς τη βραγχιακή κοιλότητα του επικαλυμματικού οστού σε νύμφη S. aurata μήκους 9.3 mm TL (Α) και η μετέπειτα ( dph) έκθεση των βραγχίων (Γ). Β, Δ, Φυσιολογικά άτομα στα αντίστοιχα στάδια. Τροποποίηση από Koumoundouros (2010) (Α, Β κλίμακα =1 mm) και Beraldo et al. (2003) (Γ, Δ). Όσον αφορά τις παραμορφώσεις των γνάθων (Εικόνα 1.4), μέχρι σήμερα έχουν περιγραφεί: (α) το σύνδρομο pugheadness (οπίσθια συμπίεση της ηθμοειδούς περιοχής και των άνω γνάθων), (β) το σύνδρομο cross-bite (πλευρική στρέβλωση 14

16 των κάτω γνάθων) και (γ) το σύνδρομο sucker-mouthed (μειωμένο μέγεθος οδοντικού και γωνιακού οστού). Χαρακτηριστικό επίσης είναι το σύνδρομο mandibular prognathism το οποίο αν και οφείλεται στην πρόσθιο-οπίσθια μετατόπιση του υογναθικού οστού, διακρίνεται από την ταυτόχρονη πρόσθιο-οπίσθια μετατόπιση των γνάθων (Ferraresso et al. 2010). Η συγκεκριμένη παραμόρφωση εμφανίζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον αφού είναι η μοναδική κρανιακή ανωμαλία με γνωστή γενετική προδιάθεση, ενώ αντιστοιχεί στο σύνδρομο Habsburg jaw που απασχολεί την ιατρική και την ανθρωπολογία (Chudley, 1998, Ferraresso et al. 2010). Όπως και στην περίπτωση του βραγχιακού επικαλύμματος, οι διατροφικές συνθήκες επηρεάζουν τη συχνότητα των παραμορφώσεων των γνάθων (Cobcroft et al. 2001, Villeneuve et al. 2005b, 2006). Εικόνα 1.4: Παραμορφώσεις των γνάθων σε νύμφες (Α, Γ, Δ) και ιχθύδια (Β) S. aurata. Pugheadness (A), sucker-mouthed (B), πλευρική και κοιλιακή κάτοψη του συνδρόμου cross-bite (Γ, Δ). Η κλίμακα αντιστοιχεί σε 1 mm. Τροποποίηση από Koumoundouros (2010). Όσον αφορά τις παραμορφώσεις του υοειδούς τόξου, η κοιλιακή προεκβολή του υοβραγχιακού σκελετού αποτελεί την συχνότερα παρατηρούμενη δυσμορφία, όπου μπορεί να φτάσει και το 40-80% στα εκκολαπτήρια (Koumoundouros, 2010). Ανατομικά οφείλεται στην κοιλιακή προεκβολή του υποϋοειδούς και γλωσσοϋοειδούς οστού, ενώ συχνά συνοδεύεται με κάμψη ή/και εξάρθρωση των κερατοϋοειδών οστών (Koumoundouros, 2010). Τέλος όσον αφορά τις παραμορφώσεις των βραγχιοστεγών ακτίνων, εκτός από τη συσχέτισή τους με τις παραμορφώσεις του βραγχιακού επικαλύμματος, βρέθηκε ότι συσχετίζονται και με την κύφωση (Koumoundouros et al. 2002). 15

17 Παραμορφώσεις σπονδυλικής στήλης Οι κυριότερες παραμορφώσεις που αναπτύσσονται στη σπονδυλική στήλη διακρίνονται στη λόρδωση, κύφωση και σκολίωση (Εικόνα 1.6). Παρουσιάζονται είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό και εμφανίζουν διαφορετικό βαθμό έντασης (Barahona-Fernandes et al. 1982, Andrades et al. 1996, Divanach et al. 1997, Koumoundouros et al. 2002). Ανατομικά σχετίζονται (όχι απαραίτητα, εμφανίζονται και μεμονωμένα) με μετατόπιση, σύμπτυξη, βράχυνση ή παραμόρφωση σπονδύλων (Divanach et al. 1997, Fraser et al. 2004). Εικόνα 1.6: Παραμορφώσεις της σπονδυλικής στήλης σε άτομα S. aurata (Α, Β, Δ, Στ) και D. labrax (Γ, Ε). Προ-αιματική (Α), αιματική (Β) και κεφαλική λόρδωση (Γ), αιματική κύφωση (Δ), σκολίωση (Ε) και σύνδρομο LSK (Στ). Τροποποίηση από Koumoundouros (2010) (Α-Δ, κλίμακα =5 mm), Γλυνάτση (2008) (Ε, κλίμακα =1 mm) και Afonso et al. (2000) (Στ). Η λόρδωση (Εικόνα 1.6) αναπτύσσεται στην κρανιακή (σύνδρομο star gazer ), προ-αιματική και αιματική περιοχή της σπονδυλικής στήλης (Sfakianakis et al. 2006a, Koumoundouros, 2010), όπου παρατηρείται νωτοκοιλιακή κάμψη σχήματος V (Barahona-Fernandes et al. 1982, Andrades et al. 1996). Στην προαιματική λόρδωση (Εικόνα 1.6) συνήθως εμπλέκονται 2-3 σπόνδυλοι (Chatain & Dewavrin, 1989), και σχετίζεται αποκλειστικά με την αποτυχία πλήρωσης της νηκτικής κύστης με αέρα που οδηγεί στη μηχανική καταπόνηση λόγω έντονης κολυμβητικής δραστηριότητας (Chatain & Dewavrin, 1989). Η λόρδωση εμφανίζεται όμως και κάτω υπό προϋποθέσεις (υδροδυναμική, θερμοκρασία ανάπτυξης κατά τη μεταμόρφωση, σοβαρές παραμορφώσεις ουραίου πτερυγίου) αυξημένης κολυμβητικής δραστηριότητας (Kihara et al. 2002, Sfakianakis et al. 2006b). Επίσης η κακή δίαιτα (Lopez-Albors et al. 1995, Dabrowski et al. 1990) και οι κακές περιβαλλοντικές συνθήκες κατά το εμβρυικό στάδιο (Andrades et al. 1996) συμβάλλουν στην συχνότητα της παραμόρφωσης. 16

18 Όσον αφορά την κύφωση (Εικόνα 1.6), η σπονδυλική στήλη των παραμορφωμένων ατόμων εμφανίζει νωτοκοιλιακή κάμψη σχήματος Λ (Koumoundouros, 2010). Παρατηρείται τόσο στην προ-αιματική περιοχή (σπόνδυλοι 5-6, Koumoundouros et al. 2002), όσο και στην αιματική περιοχή (Εικόνα 1.6), ενώ μπορεί να συνοδεύεται ή όχι από παραμορφώσεις της νηκτικής κύστης. Οι Koumoundouros et al. (2002) παρατήρησαν ληθαργική συμπεριφορά στα άτομα με την συγκεκριμένη παραμόρφωση, η οποία μετά τα 17 mm TL αποδείχθηκε θνησιγενής. Η σκολίωση (Εικόνα 1.6) αναφέρεται στην πλευρική κάμψη της σπονδυλικής στήλης. Θεωρείται σπάνια παραμόρφωση για εκτρεφόμενους πληθυσμούς. Στην τσιπούρα, η εμφάνιση σκολίωσης έχει αναφερθεί μόνο σε συνδυασμό με λόρδωση και κύφωση (σύνδρομο Lordosis Kyphosis Scoliosis, Afonso et al. 2000, Εικόνα 1.6). Yψηλά ( %) ή πολύ χαμηλά επίπεδα (0.3%) πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (DHA, EPA) στο φωσφολιπιδικό κλάσμα της παρεχόμενης τροφής (Villeneuve et al. 2006) και η ανεπάρκεια της βιταμίνης C (Dabrowski et al. 1990) επάγουν την ανάπτυξη ατόμων με σκολίωση Παραμορφώσεις πτερυγίων Οι κυριότερες παραμορφώσεις της κατηγορίας αυτής αφορούν την ατελή ανάπτυξη του ραχιαίου (σύνδρομο saddleback ) και του εδρικού πτερυγίου, το διπλασιασμό ή την κάμψη του ουραίου πτερυγίου και τη μονόπλευρη απώλεια των κοιλιακών πτερυγίων (Εικόνα 1.7). Η μερική ανάπτυξη του ραχιαίου ή του εδρικού πτερυγίου αποτελεί μία από τις σοβαρότερες παραμορφώσεις των συγκεκριμένων πτερυγίων (Tave et al. 1983). Έχει αναφερθεί σε είδη όπως η τσιπούρα, το λαβράκι αλλά και η συναγρίδα (Koumoundouros 2010). Στη συναγρίδα (Dentex dentex) (Koumoundouros et al. 2001b) και το λαβράκι (Koumoundouros 2010) η ατελής ανάπτυξη του ραχιαίου πτερυγίου ξεκινάει στο πρώιμο νυμφικό στάδιο κατά το οποίο ήδη γίνονται εμφανείς οι ανωμαλίες τόσο στο σχήμα και όσο και στον αριθμό των αντίστοιχων εγγύς πτερυγιοφόρων οστών. Στα προηγούμενα είδη ιχθύων το σύνδρομο saddleback (Εικόνα 1.7), σχετίζεται με σοβαρές παραμορφώσεις του ουραίου πτερυγίου (που εκφράζονται κυρίως ως έλλειψη άνω λεπιδοτριχίων και δερματοτριχίων). Οι δύο αυτές ομάδες παραμορφώσεων οφείλονται σε ανωμαλίες της πρωτογενούς περιφερειακής πτερυγιοπτυχής και της κάμψης του οπίσθιου τμήματος της νωτοχορδής κατά το σχηματισμό του ουραίου πτερυγίου (flexion stage). Όσον αφορά το εδρικό πτερύγιο έχει αναφερθεί η ολική ή η μερική έλλειψη σκελετικών στοιχείων (Εικόνα 1.7). Όλες οι περιπτώσεις παραμορφώσεων των πτερυγίων συνοδεύονται από παραμορφώσεις των εσωτερικών στηρικτικών στοιχείων, όπως συντήξεις, κάμψεις, επιπλέον σχηματισμός ή μη φυσιολογικό μέγεθος και σχήμα τους. Εντούτοις, οι δυσπλασίες των εσωτερικών στηρικτικών οστών είναι πολύ συχνές χωρίς απαραίτητα να σχετίζονται με σοβαρές παραμορφώσεις μακροσκοπικά (Divanach et al. 1996). 17

19 Εικόνα 1.7: Παραμορφώσεις των πτερυγίων σε άτομα S. aurata (Α-Δ) και D. labrax (Ε). Σύνδρομο saddleback στο νυμφικό στάδιο (Α) και στο στάδιο του ιχθυδίου (Β), απουσία εδρικού πτερυγίου (Γ), διπλασιασμός ουραίου πτερυγίου (Δ) και μονόπλευρη απώλεια των κοιλιακών πτερυγίων (Ε, Bp βασυπτερύγιο). Τροποποίηση από Koumoundouros (2010) (Α-Γ, κλίμακα =5 mm, Δ, κλίμακα = 1 mm) και Mazurais et al. (2009) (Ε, κλίμακα =1 mm) Η μη φυσιολογική ανάπτυξη του ουραίου πτερυγίου μελετήθηκε αρχικά από τους Koumoundouros et al. (1997a) στην τσιπούρα. Περιγράφτηκαν δύο περιπτώσεις παραμορφώσεων, του διπλού πτερυγίου (Εικόνα 1.7) και του πτερυγίου με πλάγια κάμψη. Το διπλό πτερύγιο (Εικόνα 1.7) χαρακτηρίζεται από το σχηματισμό επιπλέον ραχιαίων κύριων ακτινών που αρθρώνονται σε επιπλέον μικρά και επίπεδα επουραία οστά. Τα παραπάνω επουραία οστά εδράζονται μεταξύ του τελευταίου υπουραίου ή της νωτοχορδής και του τελευταίου κανονικού επουραίου οστού. Το δεύτερο ουραίο πτερύγιο αναπτύσσεται ραχιαία του κανονικού. Η πλάγια κάμψη του ουραίου πτερυγίου οφείλεται στην παραμόρφωση και σύντηξη των υπουραίων οστών. Αξιοσημείωτο είναι ότι και οι δυο τύποι δυσπλασιών συνοδεύονταν από εκτεταμένες παραμορφώσεις όλων των εσωτερικών στηρικτικών στοιχείων του ουραίου πτερυγίου. Τέλος όσον αφορά τα κοιλιακά πτερύγια, από εργασία των Mazurais et al. (2009), παρατηρήθηκε μονόπλευρη απώλεια αυτών (Εικόνα 1.7) ως αποτέλεσμα της υψηλής συγκέντρωσης χορηγούμενης βιταμίνης Α. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν και με την εργασία των Tanaka et al. (2005) αναφορικά με τη γενετική βάση της παραμόρφωσης, όπου στοχοποιείται η έκφραση του γονιδίου Hoxd-9. 18

20 Παραμορφώσεις στη λεπίδωση Οι παραμορφώσεις της κατηγορίας αυτής αφορούν στη μερική απώλεια λεπιών και στην ακανόνιστη κατανομή τους κατά μήκος του σώματος (Koumoundouros, 2010). Η σοβαρότερη όμως περίπτωση της προκειμένης παραμόρφωσης αφορά στις δυσμορφίες της πλευρικής γραμμής (Εικόνα 1.8). Εικόνα 1.8: Σχηματική αναπαράσταση εγκάρσιας τομής της πλευρικής γραμμής. (τροποποίηση από Helfman et al. 2009). Στην φωτογραφία παρουσιάζεται ενήλικο άτομο S. aurata με παραμόρφωση στην πλευρική γραμμή. Τροποποίηση από Koumoundouros (2010). Η κλίμακα αντιστοιχεί σε 2 cm. Σύμφωνα με τους Helfman et al. (2009), η πλευρική γραμμή αποτελείται από μία σειρά από τροποποιημένα λέπια που φέρουν πόρους και επικοινωνούν με ένα αγωγό στον οποίο εκφύονται οι νευρομαστοί (κύρια αισθητήρια όργανα) (Εικόνα 1.8). Τα όργανα αυτά είναι υπεύθυνα για την αντίληψη των ρευμάτων και των ακουστικών κυμάτων, καθιστώντας την πλευρική γραμμή κρίσιμο λειτουργικό στοιχείο για την συνάθροιση των πληθυσμών, την αποφυγή των θηρευτών, την 19

21 θηρευτική ικανότητα και την κοινωνική συμπεριφορά (Partridge & Pitcher, 1980, Bleckmann, 1986). Οι δυσμορφίες της πλευρικής γραμμής (Εικόνα 1.8) παρουσιάζουν υψηλή συχνότητα εμφάνισης (Koumoundouros, 2010). Μπορεί να σχετίζονται και με παραμορφώσεις της σπονδυλικής στήλης (Andrades et al. 1996) ή όχι (Carillo et al. 2001), με αποτέλεσμα την μειωμένη αντίληψη του περιβάλλοντος και την μεταβολή της συμπεριφοράς των ατόμων Δυσμορφίες στο σχήμα του σώματος Σχεδόν όλες οι σκελετικές παραμορφώσεις (και ειδικότερα της σπονδυλικής στήλης) έχουν ως αποτέλεσμα μεταβολές στο σχήμα του σώματος των ιχθύων (Divanach et al. 1997, Koumoundouros et al. 1997b, 2001a, 2002, Loy et al. 2000, Sfakianakis et al. 2003, 2006a, Gjerde et al. 2005, Verhaegen et al. 2007). Η οποιαδήποτε απόκλιση από το φυσιολογικό σχήμα αποτελεί κριτήριο στα εκκολαπτήρια κατά τη διαδικασία της διαλογής. Παρόλα αυτά η μακροσκοπική παρατήρηση και μόνον δεν είναι αρκετή, αφού ανάμεσα στα φαινομενικά φυσιολογικά άτομα ενδέχεται να «κρύβονται» παραμορφώσεις μικρής έντασης που μόνον οι εξειδικευμένες πολυπαραγοντικές μεθόδοι (γεωμετρική μορφομετρία) μπορούν να διακρίνουν (Sfakianakis et al. 2006a) Το σχήμα σώματος στην ιχθυοκαλλιέργεια Όπως έχει προαναφερθεί, η παρέκκλιση του σχήματος σώματος από τα φυσιολογικά όρια είναι αποτέλεσμα σκελετικών παραμορφώσεων και αντιμετωπίζεται με την διαδικασία της διαλογής στα εκκολαπτήρια (Koumoundouros et al. 1997b). Παρόλα αυτά η διακύμανση του σχήματος σώματος (εντός των φυσιολογικών ορίων) παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τον κλάδο (Kause et al. 2004), τόσο για τα είδη που πωλούνται ατόφια όσο και για τα είδη που τυγχάνουν μεταποίησης (π.χ. φιλετοποίηση). Για τα μεν πρώτα λαμβάνεται υπόψη η άποψη του καταναλωτή για το βέλτιστο σχήμα ως κριτήριο ποιότητας (Bonk et al. 2010), για τα δε δεύτερα επιλέγεται το βέλτιστο σχήμα που αυξάνει την απόδοση σε παραγόμενο προϊόν (processing yield) (Bosworth & Wolters, 2005) Η μορφολογική πλαστικότητα των ιχθύων Η ποικιλότητα της εξωτερικής μορφολογίας των ιχθύων μπορεί να είναι αποτέλεσμα της επίδρασης του περιβάλλοντος (οικομορφολογία) (Antonucci et al. 2009), της ποικιλότητας του γονότυπου (Marcil et al. 2006) και της φαινοτυπικής πλαστικότητας (Kerschbaumer et al. 2010). Ενώ οι δύο πρώτοι παράγοντες παρουσιάζουν οικολογικό και εξελικτικό ενδιαφέρον, στους εκτρεφόμενους πληθυσμούς γίνεται μεγάλη προσπάθεια εκμετάλλευσης του τελευταίου παράγοντα που ορίζεται ως «η ικανότητα ενός μοναδικού γονότυπου να παράγει μια σειρά 20

22 εναλλακτικών φαινότυπων, ως απόκριση στις περιβαλλοντικές συνθήκες» (Eberhard, 1989). H μορφολογία των εκτρεφόμενων ειδών έχει βρεθεί ότι επηρεάζεται από περιβαλλοντικούς παράγοντες όπως η θερμοκρασία ανάπτυξης (Georgakopoulou et al. 2007b, Costa et al. 2010, Georga & Koumoundouros, 2010, Lõhmus et al. 2010,), η φωτοπερίοδος (Okumoto et al. 1989), η συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου (Crispo & Chapman, 2011), οι υδροδυναμικές συνθήκες (Fisher-Rousseau et al. 2010), η πυκνότητα πληθυσμού (Ambrosio et al. 2008) ο τύπος εκτροφής (Sarà et al. 1999), η διαθεσιμότητα (Bosworth & Wolters, 2005) και η ποιότητα της τροφής (Alam et al. 2009). Από τους προαναφερθέντες περιβαλλοντικούς παράγοντες ιδιαίτερα σημαντικός θεωρείται η θερμοκρασία ανάπτυξης, ειδικότερα κατά τα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια. Απόδειξη αυτού αποτελεί η εργασία των Georgakopoulou et al. (2007b), όπου βρέθηκε ετερόχρονη θερμοεξαρτώμενη μορφολογική και οντογενετική πλαστικότητα σε εκτρεφόμενους πληθυσμούς D. labrax. Η περιβαλλοντική ρύθμιση της πλαστικότητας-αποδοτικότητας των εκτρεφόμενων πληθυσμών σήμερα έχει φτάσει σε ένα ικανοποιητικό επίπεδο με την βελτίωση των πρωτοκόλλων εκτροφής (Ernst, 2000). Τα πρωτόκολλα αυτά, έχουν συνταχθεί, διορθωθεί και πιστοποιηθεί επανειλημμένα με βάση τα παρελθόντα και εμπειρικά στοιχεία, για να είναι κατάλληλα για εφαρμογή και να παράγουν το μέγιστο δυνατό αποτέλεσμα (Ernst, 2000). Στα πρωτόκολλα καταγράφονται μέχρι και τέσσερις καθορισμένες τιμές: η ανώτατη και η κατώτατη τιμή για την ανοχή και για το βέλτιστο, και σύμφωνα με αυτές τις τιμές συντάσσονται οι κωδωνοειδές καμπύλες αποδοτικότητας (Εικόνα 1.9). Εικόνα 1.9: Κωδωνοειδές καμπύλες της αποδοτικότητας του Oreochromis spp. σε σχέση με τη θερμοκρασία του νερού σύμφωνα με τα τρία προτεινόμενα μοντέλα (γραμμικό, εκθετικό πολυωνυμικό). Καταγράφονται η ανώτερη και κατώτερη τιμή ανοχής (C max t, C min t) και η ανώτερη και κατώτερη βέλτιστη τιμή (C max o, C min o), και σύμφωνα με αυτές τις τιμές διαμορφώνονται τα τρία φάσματα (θανάσιμο, ανοχής, βέλτιστο). Τροποποίηση από Ernst (2000). 21

23 Μέθοδοι μορφομετρικής ανάλυσης Το σχήμα του σώματος αποτελούσε πάντα ένα σημαντικό χαρακτήρα (Monteiro et al. 2002), αφού θεωρείται από κάποιους ως ο σύνδεσμος μεταξύ γονότυπου και περιβάλλοντος (Ricklefs & Miles, 1994). Παρόλα αυτά η ποσοτικοποίηση του σχήματος δεν είναι μια εύκολη διεργασία (Parsons et al. 2003). Για παράδειγμα, οι αποστάσεις χαρακτήρων (π.χ. μήκος κεφαλής) που εφαρμόζονταν τον 18 ο - 19 ο αιώνα (ανασκόπηση από Sidlauskas et al. 2011) δεν μπορούν να αποτελούν μορφομετρικό χαρακτήρα, λόγω της ποικιλότητας του μεγέθους. Το πρόβλημα αυτό αντιμετωπίστηκε υπολογίζοντας αναλογίες αποστάσεων, χρησιμοποιώντας ως παρανομαστή είτε το ολικό μήκος είτε το μήκος κεφαλής και εφαρμόζοντας διμεταβλητές και αργότερα πολυπαραγοντικές στατιστικές μεθόδους ανάλυσης (ανασκόπηση από Sidlauskas et al. 2011). Στις πιο πάνω αναλύσεις «κλασσικής μορφομετρίας» εφαρμόστηκε για πρώτη φορά η φωτογραφική τοποθέτηση οροσήμων (landmarks) σε ομόλογα διακριτά ανατομικά σημεία για τον υπολογισμό βιομετρικών αποστάσεων ή/και γωνιών (Marcus, 1990, Rohlf & Marcus 1993). Η εξέλιξη της υπολογιστικής τεχνολογίας και των μαθηματικών οδήγησε στην δεκαετία του 1990 στην ανάπτυξη της επαναστατικής μεθόδου της «γεωμετρικής μορφομετρίας» (Rohlf & Marcus 1993, Bookstein, 1996), όπου πλέον δεν γίνεται επεξεργασία αποστάσεων ή λόγων αλλά της σχετικής τοποθεσίας των οροσήμων (Parsons et al. 2003). Εικόνα 1.10: Παρερμηνεύσεις του σχήματος σώματος λόγω της χρήσης της κλασσικής μορφομετρίας. Τα ορόσημα στα δύο σχήματα τοποθετήθηκαν σε ομόλογα σημεία (Α, Β, Γ, Δ) που ερμηνεύουν τις ανάλογες αποστάσεις μήκους (ΑΒ) και ύψους (ΓΔ). Τα δύο σχήματα έχουν ίδια αναλογία αποστάσεων αλλά διαφορετικό μέγεθος και σχήμα. Οι γεωμετρική προσέγγιση υπερέχει έναντι της κλασσικής κυρίως λόγω της δυνατότητας ανεξάρτητου υπολογισμού του σχήματος και του μεγέθους (Bookstein et al. 1985), που μπορεί να προκληθούν από παρερμήνευση των αναλογιών μεγέθους (Εικόνα 1.10). Επειδή η γεωμετρική τοποθέτηση των ορόσημων (συντεταγμένες Χ, Ψ) είναι δυνατόν να οδηγήσει και αυτή σε παρερμηνεύσεις ανάλυσης σχήματος λόγω της θέσης, του προσανατολισμού και του μεγέθους (Εικόνα 1.11), είναι απαραίτητος ο μετασχηματισμός των σχετικών θέσεων σε «κανονικοποιημένες συντεταγμένες» (Bookstein coordinates) (Adams et al. 2004). Οι συντεταγμένες αυτές εξάγονται μετά από την εφαρμογή μιας μεθόδου που χρησιμοποιεί τις Γενικευμένες Προκρούστιες 22

24 Αποστάσεις (Generalized Procrustes Analysis) μεταξύ των οροσήμων, ώστε να υπολογιστεί το κεντροειδές σημείο (centroid) και το κεντροειδές μέγεθος (centroid size) κάθε ατόμου (Bookstein et al. 1985). Εικόνα 1.11: (Ι) Παρερμηνεύσεις του σχήματος σώματος που μπορεί να προκύψουν στην γεωμετρική μορφομετρία λόγω της θέσης, του προσανατολισμού και του μεγέθους του δείγματος, και ο μετασχηματισμός των Χ, Ψ συντεταγμένων σε σχετικές «κανονικοποιημένες συντεταγμένες» (0-1) ως προς την θέση των οροσήμων αναφοράς (Α, Β). (ΙΙ) Η χαρτογράφηση και η ποσοτικοποίηση των μεταβολών του σχήματος σώματος μεταξύ δύο ειδών του γένους Amphilophus spp., μέσω των πλεγμάτων παραμόρφωσης (deformation grids). Τροποποίηση (II) από Parsons et al. (2003). Μετά από την εφαρμογή των παραπάνω, οι γεωμετρικές διαμορφώσεις βρίσκονται τοποθετημένες σε έναν μη ευκλείδιο, αλλά πολυδιάστατο γεωμετρικό χώρο (Kendall s shape space), όπου με την εφαρμογή ενός αλγόριθμού (thin-plate spline) είναι δυνατή η χαρτογράφηση των μεταβολών του σχήματος μεταξύ των ατόμων, αλλά και μεταξύ του κάθε ατόμου και του μέσου σχήματος (consensus) (Bookstein, 1991). Οι μεταβολές του σχήματος μπορούν να ποσοτικοποιηθούν μαθηματικά (partial warps) ως η «τάση» που απαιτείται για την στρέβλωση 23

25 (deformation) του πλέγματος παραμόρφωσης (deformation grids, Εικόνα 1.11) που ορίζουν οι μέσες Bookstein συντεταγμένες (Bookstein, 1991). Από το 1990 μέχρι σήμερα η μέθοδος της γεωμετρικής μορφομετρίας έχει τύχει μεγάλης αναγνώρισης από τις επιστημονικές ομάδες και τείνει να αντικαταστήσει πλήρως τις κλασσικές μεθόδους μορφομετρίας (Adams et al. 2004). Η μέθοδος πλέον βρίσκει εφαρμογή στους κλάδους της ιατρικής (π.χ. Bookstein, 1997), της ανθρωπολογίας (π.χ. Marcus et al. 2000), της γενετικής (π.χ. Klingenberg & Leamy, 2001), της οικολογίας (π.χ. Monteiro-Filho et al. 2002), της ταξινομικής ζωολογίας (π.χ. Sidlauskas et al. 2011), της πειραματικής ζωολογίας (π.χ. Georga & Koumoundouros, 2010), της εξελικτικής βιολογίας (π.χ. Kerschbaumer et al. 2010), κ.α. Η μέθοδος της γεωμετρικής μορφομετρίας είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί ως εργαλείο ποσοτικοποίησης του σχήματος σώματος των εκτρεφόμενων ιχθυοπληθυσμών, ενώ η χαρτογράφηση των διαφορών στο σχήμα δύναται να βοηθήσει στον μορφολογικό ποιοτικό έλεγχο Το είδος Sparus aurata Στοιχεία βιολογίας Η τσιπούρα (S. aurata, Εικόνα 1.12) ανήκει στην Οικογένεια των Σπαροειδών (Sparidae) η οποία περιλαμβάνει ένα μεγάλο εύρος από Γένη. Στην Μεσόγειο θάλασσα συναντώνται τα Γένη: Dentex, Sparus, Diplodus, Pagellus, Pagrus, Lithognatus, Spondyliosoma, Oblada, Crenidens, Boops και Sarpa (Froese & Pauly, 2011). Σύμφωνα με τους Barusco et al. (2011), το είδος συναντάται σε παράκτιες περιοχές της Μεσογείου θάλασσας, του ανατολικού Ατλαντικού ωκεανού και των Βρετανικών και Κανάριων Νήσων (Εικόνα 1.12). Είναι βενθοπελαγικό είδος και απαντάται συνήθως σε ρηχά νερά μέχρι τα 30 m. Τα ενήλικα άτομα μπορούν να βρεθούν και σε βάθη μέχρι τα 150 m (Bauchot & Hureau, 1990). Διαβιεί σε ποσειδωνίες και σε αμμώδη ενδιαιτήματα της αιγιαλίτιδας ζώνης. Είναι σαρκοβόρο είδος και τρέφεται κυρίως με δίθυρα μαλάκια, δεκάποδα καρκινοειδή και σκώληκες (Stergiou & Karpouzi, 2001). Το μέγιστο ολικό μήκος που έχει καταγραφεί μέχρι σήμερα φθάνει τα 70 cm (Frimodt, 1995). Η τσιπούρα είναι πρώτανδρο ερμαφροδιτικό είδος, όπου κατά την πρώτη αναπαραγωγική ωρίμανση (1 ο έτος) είναι αρσενικό ενώ κατά το 2 ο -4 ο έτος παρατηρείται αναστροφή του φύλου (Zohar et al. 1995). Η ωοτοκία γίνεται σε μεγάλες ομάδες ατόμων (Gorshkov et al. 1997), είναι τμηματική (20,000 30,000 αυγά/kg σωματικού βάρους ανά μέρα) (Zohar et al. 1995) και πραγματοποιείται σε θερμοκρασίες C (Δεκέμβρης-Απρίλιος). 24

26 Εικόνα 1.12: Σχηματική αναπαράσταση της τσιπούρας (S. aurata) κατά Schneider (1990) και η γεωγραφική αναπαράσταση της περιοχή εξάπλωσης του είδους σύμφωνα με τους Kaschner et al. (2010) Κύκλος παραγωγής Σύμφωνα με τους Barusco et al. (2011), η ωοτοκία στα εκκολαπτήρια επιτυγχάνεται σε δεξαμενές με πυκνότητα γεννητόρων 4-8 kg/m 3. Κατά τον πρώτο μήνα του κύκλου ζωής, ο γόνος μπορεί να διατηρείται σε κωνικές δεξαμενές διαμέτρου 3-6 m. Η εξωγενής διατροφή ξεκινάει κατά την 3 η -4 η μέρα μετά την εκκόλαψη (dph), όπου χορηγείται δίαιτα (εμπλουτισμένη ζωντανή τροφή) από τροχόζωα (Brachionus plicatilis) και μετέπειτα (10-11 dph) σε συνδυασμό με βραγχιονόποδα (Artemia spp.) μέχρι το στάδιο της μεταμόρφωσης (32-35 dph). Η ποιότητα του νερού και των τροχοζώων εξασφαλίζεται με την εφαρμογή της μεθόδου των «πράσινων νερών» ή των «ψευδο-πράσινων νερών». Η αποκοπή από τη ζωντανή τροφή γίνεται κατά την 45 η dph (ημέρα μετά την εκκόλαψη), όπου τα ιχθύδια μεταφέρονται σε μεγαλύτερες δεξαμενές (10-25 m 3 ). Σε αυτή τη φάση εφαρμόζεται συνεχής χορήγηση τροφής (ξηρή τροφή, κάθε 2 ώρες). Η φάση ολοκληρώνεται όταν τα άτομα φθάνουν σε μέσο βάρος 2-10 g. Ακολούθως τα 25

27 ιχθύδια μεταφέρονται σε κλωβούς θαλάσσης, όπου διεξάγεται η πάχυνσή τους μέχρι το ατομικό βάρος των g. Σύμφωνα με την στατιστική υπηρεσία της Διεθνής Οργάνωσης Τροφίμων και Γεωργίας (FAO, Fisheries & Aquaculture Information & Statistics Service), η συνολική παραγωγή το 2009 έχει φτάσει τους 136,976 τόνους. Η Ελλάδα είναι η κύρια παραγωγός και εξαγωγός χώρα με ποσοστό 49%. Δεύτερη χώρα στην σχετική κατάταξη είναι η Τουρκία (15%), τρίτη η Ισπανία (14%) και τέταρτη η Ιταλία (6%) (FAO, 2009) Στόχος της παρούσας εργασίας Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της ποιότητας εκτρεφόμενων πληθυσμών τσιπούρας, με έμφαση (Ι) στις σκελετικές παραμορφώσεις και (ΙΙ) στο σχήμα σώματος. (Ι) Όσον αφορά τις σκελετικές παραμορφώσεις μελετώνται: (ι) σε πληθυσμούς νυμφικού σταδίου 2 τύποι κρανιακών παραμορφώσεων, εκ των οποίων ο ένας (βραγχιακό επικάλυμμα) είναι πολύ καλά χαρακτηρισμένος ενώ ο άλλος (γνάθοι) δεν έχει περιγραφεί μέχρι σήμερα. Για κάθε παραμόρφωση περιγράφεται η ένταση και η ασυμμετρία εμφάνισης, γίνεται συσχετισμός με το ρυθμό αύξησης, και ελέγχεται η συσχέτιση των παραμορφώσεων μεταξύ τους. (ιι) Σε πληθυσμούς νυμφικού σταδίου και μετέπειτα σε ιχθύδια, ένας νέος τύπος σκελετικής παραμόρφωσης της σπονδυλικής στήλης που δεν έχει περιγραφεί μέχρι σήμερα. Γίνεται η περιγραφή της έντασης, του κέντρου εμφάνισης και της θνησιγόνου δράσης της, ενώ γίνεται προσπάθεια της μορφομετρικής τυποποίησης της παραμόρφωσης. (ΙΙ) Όσον αφορά το σχήμα σώματος, μελετάται: (ι) η μορφολογική πλαστικότητα σε πληθυσμούς στο στάδιο του ιχθυδίου, κατόπιν ετερόχρονης (εμβρυϊκό-νυμφικό στάδιο) θερμοκρασιακής επίδρασης και (ιι) η μορφολογική πλαστικότητα σε ενήλικους πληθυσμούς που προέρχονται από πρόγραμμα γενετικής βελτίωσης. Ελέγχεται η επίδραση του γονότυπου και του περιβάλλοντος στην ποικιλομορφία της μορφολογίας. 26

28 2. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 27

29 2.1. Δείγματα για μελέτη των σκελετικών παραμορφώσεων Τα δείγματα προέρχονται από την βιβλιοθήκη συντηρημένων (δ/μα φορμαλίνης 5%) δειγμάτων του Εργαστηρίου Θαλάσσιας Βιολογίας και Βιολογίας Ιχθύων του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Κρήτης. Κατόπιν ενός προκαταρτικού ελέγχου του αρχείου δειγμάτων του εργαστηρίου (τρεις χιλιάδες δείγματα περίπου), για τη μελέτη των κρανιακών παραμορφώσεων επιλέχθηκαν δείγματα από πέντε πληθυσμούς με βάση τα εξής κριτήρια: τα δείγματα να προέρχονται από πληθυσμούς που εκτράφηκαν ταυτόχρονα στον ίδιο ιχθυογεννητικό σταθμό (εξασφάλιση δειγμάτων από κοινές συνθήκες εκτροφής και από ενιαίο απόθεμα γεννητόρων), και να παρουσιάζουν ευρεία διακύμανση συχνότητας παραμορφωμένων ατόμων. Η μελέτη των σκελετικών παραμορφώσεων στηρίχθηκε σε ένα μοναδικό δείγμα το οποίο έφερε υψηλή συχνότητα νυμφών με μορφολογικά συμπιεσμένο σχήμα σώματος. Ανάλογα με την προέλευσή τους τα δείγματα χωρίστηκαν σε δύο προς εξέταση ομάδες (Α και Β) και ακολούθησε διπλή χρώση με κυανό της Αλσατίας και κόκκινο της Αλιζαρίνης (Alcian Blue/Alizarin Red S) για την εκλεκτική χρώση των χόνδρων και των ασβεστοποιημένων δομών αντίστοιχα (τροποποίηση από Park & Kim, 1984) (Εικόνα 2.1). Τη χρώση ακολούθησε παρατήρηση κάθε ατόμου στο σύνολο του δείγματος με στερεοσκόπιο και επιμέρους ψηφιακή φωτογράφηση (Εικόνα 2.1). Εικόνα 2.1: Ψηφιακή φωτογραφία νύμφης τσιπούρας κατόπιν διπλής χρώσης με Alcian Blue/Alizarin Red S. Στο δείγμα υποδεικνύονται τα ορόσημα που χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση του ολικού μήκους (TL). Η κλίμακα αντιστοιχεί σε 1 mm. Στην ομάδα Α περιλήφθηκαν 5 δείγματα (Α1-Α5) των ατόμων το καθένα, με κλιμακούμενη συχνότητα παραμορφώσεων ως προς (ι) το βραγχιακό επικάλυμμα (OPER, operculum), και (ιι) την παραμόρφωση των γνάθων (KUM). Οι ατομικές ψηφιακές φωτογραφίες χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση του ολικού μήκους, με τη χρήση του λογισμικού tpsdig2 (έκδοση 2.16) (Εικόνα 2.1). Η Β ομάδα περιελάμβανε τρία δείγματα ενός πληθυσμού που λήφθηκαν στο τέλος της φάσης 28

30 νυμφικής εκτροφής (35 ημέρες μετά την εκκόλαψη, dph), και στο μέσο του σταδίου της μεταμόρφωσης (61 dph) Συνολικά εξετάστηκαν 1400 άτομα από τον πληθυσμό Α και 483 άτομα (157 νύμφες και 326 ιχθύδια) από τον πληθυσμό Β. Όσον αφορά την ομάδα Β, έγινε προσπάθεια μορφομετρικής τυποποίησης της παραμόρφωσης (για μεθοδολογία βλέπε 2.2, Εικόνα 2.3). Τέλος προκειμένου να μελετηθεί ιστολογικά η παραμόρφωση, πραγματοποιήθηκε εγκλεισμός των ατόμων σε μέθυλ-μεθυλακρυλικά πολυμερή (Technovit 7100), τμήση των δειγμάτων (5 μm) με μικροτόμο και χρώση των τομών με Masson Trichrome Stain (τροποποίηση από Witten & Hall, 2003) Δείγματα για μελέτη του σχήματος σώματος Το σχήμα σώματος μελετήθηκε σε ιχθύδια και σε ενήλικα άτομα τσιπούρας που δεν παρουσίαζαν οποιαδήποτε μορφή παραμόρφωσης. Τα μεν ιχθύδια προέρχονται από την βιβλιοθήκη ακτινογραφιών του Εργαστηρίου Θαλάσσιας Βιολογίας και Βιολογίας Ιχθύων του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Κρήτης, ενώ τα ενήλικα άτομα προέρχονται από το αρχείο ψηφιακών φωτογραφιών του ίδιου εργαστηρίου. Τα δείγματα των ιχθυδίων προήλθαν από δώδεκα πληθυσμούς οι οποίοι ανά δύο υποβλήθηκαν σε διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας κατά την πρώιμη οντογένεση (Εικόνα 2.2). Ο πειραματικός σχεδιασμός περιγράφεται αναλυτικότερα στην εργασία των Georgakopoulou et al. (2010). Από κάθε πληθυσμό εξετάσθηκαν άτομα τα οποία επιλέχθηκαν με κριτήριο τη φυσιολογική ανάπτυξη του σκελετού τους. Εικόνα 2.2: Πειραματικός σχεδιασμός της εργασίας των Georgakopoulou et al. (2010). Ένας κοινός πληθυσμός 600,000 αυγών χωρίστηκε σε 12 πληθυσμούς, οι οποίοι ανά δύο υποβλήθηκαν σε έξι διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες (16, 19, 22, 16-19, 19-22, C) κατά το αυτότροφο (FfF, Fertilization-firstFeeding) και το ετερότροφο (F-M, Fertilization-Metamorphosis) στάδιο ανάπτυξης. Τα δείγματα (~30 φυσιολογικά άτομα ανά συνθήκη) για την μορφομετρική ανάλυση πάρθηκαν κατά το στάδιο του ιχθυδίου (J, Juvenile). Από Georgakopoulou et al

31 Για να διευκρινιστεί η επίδραση της επιλεκτικής πίεσης (γενετικής και περιβαλλοντικής) του προγράμματος γενετικής επιλογής της ΑΝΔΟΜΕΔΑ Α.Ε. στην εξωτερική μορφολογία της τσιπούρας, έγινε ανάλυση του σχήματος σώματος των ενήλικων σε ψηφιακές φωτογραφίες συνολικά 4324 ατόμων από 3 μη συνεχής γενεές (G1, G3, G4). Εντός της G4 γενεάς μελετήθηκε και η επίδραση δύο περιβαλλόντων εκτροφής κατά το στάδιο της πάχυνσης (κλωβοί, δεξαμενές). Τα ορόσημα (landmarks) για τη μορφομετρική ανάλυση επιλέχθηκαν ώστε να καθορίζουν διακριτές ανατομικές περιοχές. Η τοποθέτησή τους στις ψηφιακές φωτογραφίες των υπό εξέταση δειγμάτων έγινε με τη βοήθεια το λογισμικού tpsdig2 (έκδοση 2.16) (Εικόνα 2.3). Τα ορόσημα κάθε δείγματος των υπό εξέταση πληθυσμών, επεξεργάστηκαν με το λογισμικό πρόγραμμα IMP-CoordGen6d (Sheets, 2001), οπότε και καθορίστηκε η μέση διαμόρφωση σχήματος και το κεντροειδές μέγεθος (Rohlf & Slice, 1990). Ακολούθως υπολογίστηκε ο πίνακας βαρύτητας (weight matrix) των τιμών στρέβλωσης (partial warp scores), αφού εφαρμόστηκε ο αλγόριθμος thin-plate spline στο σύνολο των μορφομετρικών σημείων κάθε δείγματος (TpsRelw, έκδοση 1.49, Rohlf, 1996) και αφαιρέθηκε οποιαδήποτε επίδραση του μεγέθους και της αλλομετρίας (Parsons et al. 2011) με το λογισμικό IMP-Standard6 (Sheets, 2001) Στον πίνακα βαρύτητας εφαρμόστηκε η τροποποιημένη (RWA, Relative Warp Analysis, Rohlf, 1993) ανάλυση κυρίων συνιστωσών (PCA, Principal Component Analysis) και η ανάλυση κανονικών συνιστωσών (CVA, Canonical Variate Analysis) (Statistica, έκδοση 7.0) για την εκτίμηση της σημαντικότητας των διαφορών σχήματος μεταξύ των υπό εξέταση πληθυσμών (Georgakopoulou et al. 2007a). Στις αποστάσεις Mahalanobis (Ευκλείδειες αποστάσεις) κάθε δείγματος πραγματοποιήθηκε ανάλυση ιεραρχικής ομαδοποίησης (Cluster Analysis) για να διαπιστωθούν οι ομαδοποιήσεις με βάση το σχήμα σώματος. Για τον προσδιορισμό των πλεγμάτων παραμόρφωσης, έγινε ανάλυση πολλαπλής παλινδρόμησης των ομοιόμορφων και των μη ομοιόμορφων συνιστωσών του σχήματος, με τις μεταβλητές της ανάλυσης κανονικών συνιστωσών και της τροποποιημένης ανάλυσης κυρίων συνιστωσών (tpsregr, έκδοση 1.37, Rohlf 1996) (Georgakopoulou et al. 2007a) Στατιστική επεξεργασία Η ανάλυση των δεδομένων των κρανιακών παραμορφώσεων έγινε με τη βοήθεια του λογισμικού πακέτου Statistica (έκδοση 7.0). Η συσχέτιση κάθε παραμόρφωσης (ανά ένταση) με τον ρυθμό αύξησης έγινε με μη παραμετρικά έλεγχο (Kruskal-Wallis-test) και με την ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA, Bonferoni post-hoc test). Ο έλεγχος της συσχέτισης της συχνότητας μεταξύ των παραμορφώσεων και της συχνότητας της ασυμμετρίας κάθε παραμόρφωσης έγινε με G-test (Sokal & Rohlf 1981). Όσον αφορά την ανάλυση του σχήματος σώματος, η στατιστική επεξεργασία περιγράφεται στην

32 Εικόνα 2.3: Θέση των οροσήμων (landmarks) ανά πληθυσμό προς μελέτη. (Ι) τυποποίηση παραμόρφωσης σπονδυλικής στήλης. (1) πρόσθιο άκρο του ρύγχους, (2) οπίσθιο άκρο βραγχιακού επικαλύμματος, (3) πρόσθιο άκρο 11 ου σπονδύλου, (4) o σπόνδυλος που χαρακτηρίστηκε ως το κέντρο παραμόρφωσης (ημι-ορόσημο, semi-landmark), (5) πρόσθιο άκρο 19 ου σπονδύλου, (6) μέσο της βάσης των ουραίων λεπιδοτριχίων, (7, 8) ραχιαίο και κοιλιακό σωματικό σημείο τομής όπως ορίζεται από την προέκταση των καθέτων προβολών στο ύψος του 15 ου σπονδύλου (ημι-ορόσημα, semi-landmarks). (II) μορφολογική πλαστικότητα ιχθυδίων. (1) πρόσθιο άκρο του ρύγχους, (2) οπίσθιο άκρο ινιακού οστού, (3) βάση 2 ης ακτίνας του ραχιαίου πτερυγίου, (4) βάση 11 ης ακτίνας του ραχιαίου πτερυγίου, (5, 7) ραχιαίο και κοιλιακό άκρο της βάσης των ουραίων λεπιδοτριχίων, (6) διάκενο μεταξύ 2 ου και 3 ου υπουραίου οστού, (8) πρόσθια βάση του εδρικού πτερυγίου, (9) πρόσθια βάση των κοιλιακών πτερυγίων, (10) κοιλιακή βάση του βραγχιακού επικαλύμματος, (11) οπίσθιο άκρο οδοντικού οστού, (12) πρόσθιο άκρο παρασφηνοειδούς οστού στο ύψος των υποκογχικών οστών, (13, 14, 15) πρόσθιο άκρο 1 ου, 10 ου και 20 ου σπονδύλου αντίστοιχα. (ΙΙΙ) ενήλικα άτομα προγράμματος γενετικής επιλογής. (1) πρόσθιο άκρο του ρύγχους, (2) οπίσθια βάση ραχιαίου πτερυγίου, (3, 5) ραχιαίο και κοιλιακό άκρο της βάσης του ουραίου πτερυγίου, (4) μέσο της βάσης των ουραίων λεπιδοτριχίων, (6, 7) οπίσθια και πρόσθια βάση του εδρικού πτερυγίου αντίστοιχα, (8) πρόσθια βάση των κοιλιακών πτερυγίων, (9) κοιλιακή βάση του βραγχιακού επικαλύμματος, (10) διάκενο μεταξύ ρώθωνα και οφθαλμικής κόγχης, (11) οπίσθιο άκρο βραγχιακού επικαλύμματος, (12) ραχιαία βάση των θωρακικών πτερυγίων, (13) ραχιαίο σωματικό σημείο τομής όπως ορίζεται από την προέκταση των καθέτων προβολών στο ύψος της πρόσθιας βάσης των κοιλιακών πτερυγίων (ημι-ορόσημο, semi-landmark). 31

33 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 32

34 3.1. Αποτελέσματα κρανιακών παραμορφώσεων Οι τύποι των παραμορφώσεων που εξετάστηκαν απεικονίζονται στην Εικόνα 3.1. Αφορούν (α) την παραμόρφωση του βραγχιακού επικαλύμματος (OPER) που οφείλεται στην αναδίπλωση (Ι, Εικόνα 3.1) προς τη βραγχιακή κοιλότητα του επικαλυμματικού ή και του υποεπικαλυμματικού οστού, ή στη βράχυνση αυτών των οστών (ΙΙ, Εικόνα 3.1) και (β) την παραμόρφωση των γνάθων (KUM) που οφείλεται στην οπισθο-νωτιαία σύγκλιση των πρόσθιων άκρων των γναθικών και προγναθικών οστών, με αποτέλεσμα τη βράχυνση της άνω γνάθου (Ι, Εικόνα 3.1). Εικόνα 3.1: Οι εξεταζόμενες κρανιακές παραμορφώσεις στη σοβαρότερη μορφή τους (Deformed) και ο ανάλογος φυσιολογικός φαινότυπος (Normal) προς σύγκριση. Η κλίμακα αντιστοιχεί σε 1 mm Συσχέτιση παραμορφώσεων με την ένταση και την ασυμμετρία Για κάθε παραμόρφωση υπολογίστηκε η συχνότητα εμφάνισης (Deformed) σε σχέση με τα φυσιολογικά άτομα (Normal) ανά δείγμα (Α1-Α5) (Πίνακας 3.1, Εικόνα 3.2). Όσον αφορά την παραμόρφωση OPER, βρέθηκε ότι τα δύο δείγματα παρουσιάζουν υψηλή συχνότητα παραμορφώσεων (Α1, Α2), τα δύο χαμηλή συχνότητα παραμορφώσεων (Α3, Α4) και το ένα (Α5) ενδιάμεση συχνότητα παραμορφώσεων (Πίνακας 3.1, Εικόνα 3.2). Όμοια για την παραμόρφωση KUM, βρέθηκε ότι δύο δείγματα παρουσιάζουν χαμηλή συχνότητα παραμορφώσεων (Α1, 33

35 Α5) και τα τρία (Α2, Α3, Α4) χαμηλή-ενδιάμεση συχνότητα παραμορφώσεων (Πίνακας 3.1, Εικόνα 3.2). Πίνακας 3.1: Συχνότητα φυσιολογικών (Normal) και παραμορφωμένων (Deformed) ατόμων ανά τύπο παραμόρφωσης (KUM, OPER) και ανά δείγμα (Α1-Α5). Τα διαφορετικά γράμματα (a, b, c) υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων στη συχνότητα της κάθε παραμόρφωσης ξεχωριστά (G-test, p<0.05). KUM Group Deformed Normal % Deformed % Normal N G-test Α a Α b Α b Α b Α a Total OPER Α a Α a Α b Α b Α c Total Πίνακας 3.2: Συχνότητα υψηλής (Severe) και μικρής (Light) έντασης παραμόρφωσης (KUM, OPER) και ανά δείγμα (Α1-Α5). Τα διαφορετικά γράμματα (a, b, c, d) υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων στη συχνότητα της έντασης κάθε παραμόρφωσης ξεχωριστά (G-test, p<0.05). KUM Group Severe Light % Severe % Light N G-test Α a Α b Α c Α d Α a,c Total OPER Α a Α b Α c Α c Α c Total

36 Εικόνα 3.2: Αθροιστικές ποσοστιαίες (%) συχνότητες των φυσιολογικών (Normal) και παραμορφωμένων (Deformed) ατόμων, ανά τύπο παραμόρφωσης (KUM, OPER) και ανά δείγμα (Α1- Α5). Τα διαφορετικά γράμματα (a, b, c) υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων στη συχνότητα της κάθε παραμόρφωσης ξεχωριστά (G-test, p<0.05). Εικόνα 3.3: Αθροιστικές ποσοστιαίες (%) συχνότητες της έντασης (Severe, Light), ανά τύπο παραμόρφωσης (KUM, OPER) και ανά δείγμα (Α1-Α5). Τα διαφορετικά γράμματα (a, b, c, d) υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων στη συχνότητα της έντασης κάθε παραμόρφωσης ξεχωριστά (G-test, p<0.05). 35

37 Πίνακας 3.3: Συχνότητα ασύμμετρα (Asymmetry) και συμμετρικά (Symmetry) παραμορφωμένων ατόμων ανά τύπο παραμόρφωσης (KUM, OPER) και ανά δείγμα (Α1-Α5). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές της συχνότητας μεταξύ ασύμμετρων και συμμετρικών ανά δείγμα (G-test, *** p<0.001, ** p<0.01, * p<0.05, - p>0.05). KUM Group Assymetry Symmetry % Assymetry % Symmetry N G-test Α Α Α Α Α *** Total OPER Α *** Α *** Α *** Α *** Α * Total Πίνακας 3.4: Συχνότητα κατευθυνόμενης ασυμμετρίας (Left, Right) ανά παραμόρφωση (KUM, OPER) και ανά δείγμα (Α1-Α5). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές της συχνότητας της κατεύθυνσης της παραμόρφωσης ανά δείγμα (G-test, *** p<0.001, ** p<0.01, * p<0.05, - p>0.05). KUM Group Left Right % Left % Right N G-test Α Α Α Α Α Total OPER Α Α Α *** Α Α *** Total Σχετικά με τη σοβαρότητα (Severe, Light) της κάθε παραμόρφωσης, για την παραμόρφωση OPER βρέθηκε ότι τα τρία δείγματα παρουσιάζουν χαμηλή συχνότητα έντονης παραμόρφωσης (Severe) (Α3-Α5), ενώ τα δύο υψηλή έως πολύ υψηλή (Α1- Α2 αντίστοιχα) (Πίνακας 3.2, Εικόνα 3.3). Όσον αφορά στην παραμόρφωση KUM, παρόλο που βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων (Gtest, p<0.05) η συχνότητα της έντονης παραμόρφωσης κυμάνθηκε σε χαμηλά-μεσαία επίπεδα (Πίνακας 3.2, Εικόνα 3.3). Κατόπιν για κάθε παραμόρφωση εξετάστηκε η ασυμμετρία (Asymmetry, Symmetry) εμφάνισης. Τα αποτελέσματα έδειξαν (G-test, p<0.05) για την παραμόρφωση OPER, ότι το φαινόμενο της ασυμμετρίας ισχύει σε όλα τα δείγματα (Πίνακας 3.3, Εικόνα 3.4). 36

38 Εικόνα 3.4: Αθροιστικές ποσοστιαίες (%) συχνότητες της ασυμμετρίας (Asymmetry, Symmetry), ανά τύπο παραμόρφωσης (KUM, OPER) και ανά δείγμα (Α1-Α5). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές της συχνότητας μεταξύ ασύμμετρων και συμμετρικών ανά δείγμα (G-test, *** p<0.001, * p<0.05). Εικόνα 3.5: Αθροιστικές ποσοστιαίες (%) συχνότητες της κατευθυνόμενης ασυμμετρίας (Left, Right) ανά παραμόρφωση (KUM, OPER) και ανά δείγμα (Α1-Α5). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές της συχνότητας της κατεύθυνσης της παραμόρφωσης ανά δείγμα (G-test, *** p<0.001). 37

39 Παρόλα αυτά δε φαίνεται να υπάρχει τάση κατευθυνόμενης ασυμμετρίας (Left or Right) στα δείγματα (Α1, Α2) που κυριαρχούν τα έντονα παραμορφωμένα (Severe), ενώ αντίθετα στα δείγματα που κυριαρχούν τα ελαφριά παραμορφωμένα άτομα (Light) ισχύει (G-test, p<0.001) το φαινόμενο αυτό (Α3, Α5) (Πίνακας 3.4, Εικόνα 3.5). Αντίθετα στη παραμόρφωση KUM δεν φαίνεται να ισχύει οποιοδήποτε φαινόμενο της ασυμμετρίας (Πίνακας 3.3, 3.4, Εικόνα 3.4, 3.5) Συσχέτιση των διαφορετικών παραμορφώσεων Για να διαπιστωθεί κατά πόσον η παραμόρφωση του βραγχιακού επικαλύμματος (OPER) συσχετίζεται με την παραμόρφωση των γνάθων (KUM) πραγματοποιήθηκε έλεγχος συσχέτισης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ανάπτυξη της παραμόρφωσης KUM δεν συσχετίζεται με την ανάπτυξη της OPER (p>0.05) (Εικόνα 3.6). Αντίθετα παρατηρήθηκε αρνητική συσχέτιση (p<0.001) μεταξύ της παραμόρφωσης KUM με μία άλλη παραμόρφωση των γνάθων που αφορά τη σύντηξη των γναθικών και προγναθικών οστών (FUS) (Εικόνα 3.6). Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώθηκε για όλα τα δείγματα (Α1-Α5) (Εικόνα 3.6). Καμία συσχέτιση δεν αποδείχθηκε (p>0.05) μεταξύ KUM και FUS (Εικόνα 3.6). Φαίνεται λοιπόν ότι οι παραμορφώσεις του βραγχιακού επικαλύμματος και των γνάθων δεν συσχετίζονται μεταξύ τους, ενώ αντίθετα συσχετίζονται μεταξύ τους οι δύο παραμορφώσεις των γνάθων (Εικόνα 3.6). Εικόνα 3.6: Αθροιστικές ποσοστιαίες (%) συχνότητες συσχέτισης μεταξύ των παραμορφώσεων (ΟPER-FUS, KUM-FUS, OPER-KUM) ανά δείγμα (Α1-Α5). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν συσχέτιση των παραμορφώσεων (G-test, *** p<0.001, Spearman-test, αρνητική συσχέτιση). 38

40 Επίδραση της έντασης κάθε παραμόρφωσης στο ρυθμό αύξησης Επειδή τα δείγματα (Α1-Α5) προέρχονται από πληθυσμούς κοινής προέλευσης, έγινε προσπάθεια συσχέτισης της έντασης (Severe, Light) κάθε παραμόρφωσης (OPER, KUM) με το ολικό μήκος κάθε ατόμου για να διαπιστωθεί η πιθανή συσχέτισή τους με το ρυθμό αύξησης. Για το λόγο αυτό και τα φυσιολογικά (χωρίς καμία κρανιακή παραμόρφωση) και τα παραμορφωμένα άτομα χωρίστηκαν σε 10 κλάσεις μεγέθους (ανά 1 mm), ενώ τα παραμορφωμένα άτομα ομαδοποιήθηκαν ανάλογα με την ένταση της κάθε παραμόρφωσης (Severe, Light). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αυξανομένης της έντασης και των δύο παραμορφώσεων παρατηρήθηκε η τάση μετατόπισης προς μικρότερες κλάσεις μεγέθους (Εικόνα 3.7, 3.8, Total ). Η τάση αυτή επιβεβαιώθηκε και στατιστικά (Kruskal-Wallis-test, p<0.05) όταν τα δείγματα ομαδοποιήθηκαν. Παρόλα αυτά στα επιμέρους δείγματα επιβεβαιώνεται στατιστικά (Kruskal-Wallis-test, p<0.05) μόνο σε μία περίπτωση για την παραμόρφωση OPER (Α3, Εικόνα 3.7) και σε τρεις περιπτώσεις για την παραμόρφωση KUM (Α2, Α4, Α5, Εικόνα 3.8). Τα πιο πάνω αποτελέσματα επιβεβαιώνονται και από την ανάλυση διακύμανσης (ANOVA, Εικόνα 3.10). Κατόπιν της παρατήρησης ότι οι κατανομές συχνοτήτων των φυσιολογικών ατόμων (Normal) μετατοπίζονται προς τις μεγαλύτερες κλάσεις μεγέθους μεταξύ των δειγμάτων (Εικόνα 3.7, 3.8), και λόγω του γεγονότος ότι τα δείγματα παρουσιάζουν στατιστικά σημαντικές διαφορές στις συχνότητες των παραμορφώσεων (Πίνακας 3.1, Εικόνα 3.2) και της έντασης αυτών (Πίνακας 3.2, Εικόνα 3.3), σχηματίστηκε η υπόθεση ότι η συχνότητα και η ένταση της παραμόρφωσης επηρεάζει το ρυθμό αύξησης των φυσιολογικών ατόμων (ή/και το αντίστροφο). Για τον έλεγχο της υπόθεσης, εφαρμόστηκε μη παραμετρικός έλεγχος (Kruskal-Wallis-test) στα φυσιολογικά άτομα μεταξύ των δειγμάτων. Βρέθηκε ότι το μήκος (και επομένως και ο ρυθμός αύξησης) των φυσιολογικών ατόμων στα δείγματα με υψηλή συχνότητα παραμορφώσεων (Πίνακας 3.1, Εικόνα 3.2) αλλά και ένταση παραμορφώσεων (Πίνακας 3.2, Εικόνα 3.3) (Α1, Α2), είναι μικρότερο (Kruskal-Wallis-test, p<0.001, Εικόνα 3.9) σε σχέση με αυτά των δειγμάτων με χαμηλή συχνότητα και ένταση παραμορφώσεων (Πίνακας 3.1, Εικόνα 3.2) (Πίνακας 3.2, Εικόνα 3.3) (Α3, Α4). Μπορούμε λοιπόν να πούμε ότι υπάρχει αρνητική συσχέτιση μεταξύ ρυθμού αύξησης και των κρανιακών παραμορφώσεων. 39

41 Εικόνα 3.7: Κατανομές συχνοτήτων φυσιολογικών (Normal), έντονα (Severe) και ελαφριά (Light) παραμορφωμένων ατόμων για την παραμόρφωση OPER ανά κλάση μεγέθους ( mm ανά 1 mm). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές στις κατανομές συχνοτήτων μεταξύ των πιο πάνω ομαδοποιήσεων (Normal-Severe-Light) (Kruskal-Wallis-test, *** p<0.001, ** p<0.01, * p<0.05, - p>0.05). 40

42 Εικόνα 3.8: Κατανομές συχνοτήτων φυσιολογικών (Normal), έντονα (Severe) και ελαφριά (Light) ατόμων για την παραμόρφωση KUM ανά κλάση μεγέθους ( mm ανά 1 mm). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές στις κατανομές συχνοτήτων μεταξύ των πιο πάνω ομαδοποιήσεων (Normal-Severe-Light) (Kruskal-Wallis-test, *** p<0.001, ** p<0.01, * p<0.05, - p>0.05). 41

43 Εικόνα 3.9: Κατανομές μηκών των φυσιολογικών (Normal) ατόμων ανά δείγμα (Α1-Α5). Τα διαφορετικά γράμματα (a, b, c, d) υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων στη κατανομή των συχνοτήτων μεταξύ των δειγμάτων (Kruskal-Wallis-test, p<0.001). 42

44 Εικόνα 3.10: Ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) του μέσου μήκους (mean TL±SE) των φυσιολογικών (NORM) και παραμορφωμένων ατόμων ανά παραμόρφωση (KUM, OPER), ένταση (Light, Severe) και ανά δείγμα (A1-A5). Τα όμοια γράμματα (a, b, c, d) υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές ανά συνθήκη ανά δείγμα (Bonferoni post-hoc test, p<0.05). 43

45 3.2. Αποτελέσματα παραμόρφωσης σπονδυλικής στήλης Γενικά η παραμόρφωση αφορά σε δυσμορφίες της σπονδυλικής στήλης (αιματική περιοχή) στα πρώιμα στάδια ανάπτυξής της, όπου δεν έχουν δημιουργηθεί πλήρως όλα τα κέντρα που αντικαθιστούν την νωτοχορδή (Εικόνα 3.11, Α, Β). A B C D E F Εικόνα 3.11: Νυμφικό στάδιο. Οι διάφορες παραλλαγές (A-F αριστερά) της καινούριας παραμόρφωσης της σπονδυλικής στήλης (NSD) και η αντίστοιχη εστίαση στο κέντρο κάθε παραλλαγής (A-F δεξιά). (Α, Β) Απόδειξη ότι στην ουσία πρόκειται για παραμόρφωση της νωτοχορδής που μπορεί να εξελιχθεί σε πολύ σοβαρή μορφή σύμπτυξης των σπονδύλων (C), ή σε μορφές αιματικής σκολίωσης (D-F) με εμπρόσθιο (F), μέσο (Ε) ή οπίσθιο (D) κέντρο παραμόρφωσης. Η κλίμακα αντιστοιχεί σε 1 mm. 44

46 Εξωτερικά η δυσπλασία γίνεται αντιληπτή ως παθολογία αιματικής σκολίωσηςλόρδωσης, διαφορετικής έντασης, που μπορεί να ακολουθείται από συμπίεση του σώματος κατά τον επιμήκη άξονα (Εικόνα 3.11, Α-Ε). Εστιάζοντας στην σπονδυλική στήλη, παρατηρείται υπερασβεστοποίηση των κέντρων (Εικόνα 3.11, Α, C) των σπονδύλων που μπορεί να συνδυάζεται με καταστροφή (Εικόνα 3.11, D), σύμπτυξη (Εικόνα 3.11, C), ή και απώλεια αυτών και των αποφύσεων τους (Εικόνα 3.11, D, F). Η συχνότητα των παραμορφωμένων ατόμων στο εξεταζόμενο δείγμα των νυμφών ήταν 50.3% σε ένα σύνολο 157 ατόμων μέσου μήκους 9.6±1.3 mm. Ενώ το μέσο μήκος (SL, standard length) και το μήκος κεφαλής (HL, head length) των παραμορφωμένων ατόμων δεν διέφερε σημαντικά σε σχέση με τα κανονικά άτομα (ANOVA, p>0.05), ο λόγος HL/SL τους διαφέρει σημαντικά (ANOVA, p<0.001). Σε κάθε παραμορφωμένο άτομο καταγράφηκε το κέντρο (σπόνδυλος) της παραμόρφωσης (Deformity Center), όπως επίσης και το εύρος-έντα]ση (αριθμός σπονδύλων) αυτής (Intensity) ανά τέσσερις κλάσεις μεγέθους κεφαλής ( mm HL ανά 0.4 mm). Από τα αποτελέσματα παρατηρήθηκε ότι η παραμόρφωση παρουσιάζει δύο ξεχωριστά κέντρα, μεταξύ του 13 ου -15 ου σπονδύλου (Εικόνα 3.11, E, F) και του 17 ου -20 ου σπονδύλου (Εικόνα 3.12). Η υψηλότερη συχνότητα παραμορφωμένων ατόμων παρατηρείται στη δεύτερη κατηγορία (Εικόνα 3.12, Εικόνα 3.11, A-D). Επίσης παρατηρήθηκε ότι η παραμόρφωση παρουσιάζει μεγαλύτερη ένταση στο μέσο των κέντρων (μεταξύ 16 ου -17 ου σπονδύλου) σε σχέση με τις πρόσθιες ή τις οπίσθιες περιοχές (Εικόνα 3.12). Εικόνα 3.12: Κάτω γράφημα: Κατανομή συχνοτήτων (Count) των παραμορφωμένων ατόμων ανά κλάση μεγέθους κεφαλής ( mm HL ανά 0.4 mm) και ανά κέντρο παραμόρφωσης (Deformity Center). Πάνω γράφημα: Ο μέσος όρος (mean±sd) της έντασης (Intensity) της παραμόρφωσης ανά κέντρο παραμόρφωσης (Deformity Center). Ως μέτρο έντασης χρησιμοποιήθηκε ο αριθμός των παραμορφωμένων σπονδύλων. 45

47 Εικόνα 3.13: Πάνω: Διαγραμματική απεικόνιση (, παραμορφωμένα άτομα,, φυσιολογικά άτομα) των δύο πρώτων μορφολογικών αξόνων (RW1, RW2) με το ποσοστό (%) της διακύμανσης που εξηγείται από αυτούς. Κάτω: Η ανυσματική απεικόνιση των διαφορών σχήματος για τις αρνητικές (-) ακραίες τιμές κάθε μορφολογικού άξονα (RW1, RW2). Τα πιο πάνω περιγραφικά στοιχεία δεν μπορούν να επιβεβαιωθούν στατιστικά λόγω του μικρού αριθμού δειγμάτων (157 άτομα), αφού αποτελεί ένα μεμονωμένο περιστατικό που δεν έχει περιγραφεί μέχρι σήμερα. Παρόλα αυτά και κατόπιν της παρατήρησης ότι ο λόγος HL/SL διαφέρει σημαντικά (ANOVA, p<0.001) μεταξύ φυσιολογικών και παραμορφωμένων ατόμων, έγινε εφαρμογή της μεθόδου της γεωμετρικής μορφομετρίας (και στα παραμορφωμένα και στα φυσιολογικά άτομα) 46

48 για να εξεταστεί η συνεπίδραση της έντασης (Intensity) και της θέσης (Deformity Center) της παραμόρφωσης στο σχήμα του σώματος. Τα αποτελέσματα από την Relative Warp Analysis (RWA) έδειξαν ότι το 82.63% της διακύμανσης του σχήματος σώματος εξηγείται από τους δύο πρώτους μορφολογικούς άξονες (RW1, RW2). Συνυπολογίζοντας όμως το γεγονός ότι τα 3 από τα 8 ορόσημα (4, 7, 8, Εικόνα 2.3 (Ι)) δεν αποτελούν σημεία που καθορίζουν διακριτά ανατομικά στοιχεία αλλά μεταβαλλόμενα σημεία (ημι-ορόσημα, semilandmarks) που χαρακτηρίζουν την παραμόρφωση, μπορούμε να πούμε ότι η παραμόρφωση μπορεί να περιγραφεί κατά 82.63% από τους δύο πρώτους μορφολογικούς άξονες (RW1, RW2) (Εικόνα 3.13). Συγκεκριμένα, ο πρώτος μορφολογικός άξονας (RW1) εξηγεί τη διακύμανση του σχήματος που οφείλεται κυρίως στην προσθιο-οπίσθια μετατόπιση του κέντρου της παραμόρφωσης (Εικόνα 3.13), ενώ ο δεύτερος άξονας (RW2) εξηγεί τη διακύμανση που οφείλεται στη προσθιο-οπίσθια συμπίεση της αιματικής περιοχής του σώματος (Εικόνα 3.13, Εικόνα 3.11, Α, C). Με άλλα λόγια ο RW1 εξηγεί τη θέση και ο RW2 την ένταση της παραμόρφωσης. Τα φυσιολογικά άτομα δεν εμφάνισαν καμία μορφολογική διακύμανση (Εικόνα 3.13). Από τα αποτελέσματα της μορφομετρικής ανάλυσης, επιβεβαιώνεται προηγούμενη παρατήρηση (Εικόνα 3.12) ότι η ένταση της παραμόρφωσης μειώνεται όταν η θέση της είναι στους πρώτους ή τους τελευταίους σπονδύλους (Εικόνα 3.14), ενώ η μέγιστη ένταση παρατηρείται στο 70-75% του άξονα της αιματικής περιοχής (Εικόνα 3.14). Εικόνα 3.14: Κατανομή συχνοτήτων (Count, γκρίζες στήλες) των παραμορφωμένων ατόμων ανά κέντρο παραμόρφωσης (Deformity Center, εκφρασμένο επί % του ολικού αριθμού των σπονδύλων) και οι μέσες τιμές (αντιστραμμένες) του δεύτερου μορφολογικού άξονα (RW2, κόκκινες στήλες) ανά κέντρο παραμόρφωσης. Οι θετικές τιμές του RW2 δείχνουν παραμόρφωση αυξημένης έντασης. 47

49 Οι πιο πάνω έλεγχοι έγιναν σε νύμφες μήκους μέσου μήκους 9.6±1.3 mm. Για να διαπιστωθεί κατά πόσον η παραμόρφωση είναι θνησιγόνος, πραγματοποιήθηκε έλεγχος σε ιχθύδια μήκους 18.8±1.9 mm από τον ίδιο πληθυσμό. Η συχνότητα των παραμορφωμένων ατόμων βρέθηκε να είναι 36% σε ένα σύνολο 326 ατόμων. Παρατηρήθηκε δηλαδή μείωση κατά 28.5% επί του συνόλου των παραμορφωμένων ατόμων μεταξύ των δύο περιόδων (νύμφη, ιχθύδιο), που ουσιαστικά είναι και το ποσοστό της θνησιμότητας λόγω της επίδρασης της παραμόρφωσης. A B C D E Εικόνα 3.15: Στάδιο ιχθυδίου. Οι διάφορες παραλλαγές (A-Ε αριστερά) της εξέλιξης της καινούριας παραμόρφωσης της σπονδυλικής στήλης (NSD) και η αντίστοιχη εστίαση στο κέντρο κάθε παραλλαγής (A-Ε δεξιά). (Α, Β) Αντιστοίχηση με τις παραλλαγές Α, Β της Εικόνας 3.11, (C) σκολίωση που επηρεάζει μόνο τον ουραίο μίσχο, (D) αντιστοίχηση με την παραλλαγή Ε της Εικόνας 3.11, (Ε) αντιστοίχηση την παραλλαγή F της Εικόνας Η κλίμακα αντιστοιχεί σε 1 mm. 48

50 Στο δείγμα των ιχθυδίων παρατηρήθηκε να κυριαρχούν οι παραμορφώσεις με το κέντρο μετατοπισμένο προς την ουραία περιοχή (70-95% του άξονα της αιματικής περιοχής, Εικόνα 3.15, Α-D). Η παρατήρηση αυτή συμφωνεί και με τα αποτελέσματα του δείγματος των νυμφών (Εικόνα 3.14). Παρόλα αυτά η συχνότητα της παραμόρφωσης με κέντρο στην πρόσθια περιοχή (50-70% του άξονα της αιματικής περιοχής, Εικόνα 3.15, Ε) ήταν πολύ χαμηλή (κάτω από 2%). Συμπερασματικά, η μετατόπιση του κέντρου της παραμόρφωσης προς τους πρόσθιους αιματικούς σπονδύλους έχει θνησιγόνο επίδραση. Τα αποτελέσματα από την ιστολογική εξέταση έδειξαν ότι τα παραμορφωμένα άτομα σε σχέση με τα φυσιολογικά, δεν παρουσιάζουν μια ομοιόμορφη, συνεχή σπονδυλική στήλη (Εικόνα 3.16). Εντός των κέντρων της σπονδυλικής στήλης όπου διακρίνονται τα υπολείμματα της νωτοχορδής, στα φυσιολογικά άτομα τα κενοτοπικά κύτταρα (vacuolized cells) είναι καλά οργανωμένα σε αντίθεση με τα παραμορφωμένα άτομα που οι μεμβράνες τους είναι πλήρως αποδιοργανωμένες, γεγονός που υποδηλώνει ότι η παραμόρφωση ξεκίνησε από το στάδιο της νωτοχορδής (Εικόνα 3.16). Η παραμόρφωση φαίνεται να επηρεάζει τον περιβάλλοντα μυϊκό ιστό, όπου οι μυϊκές ίνες δεν είναι παράλληλες με την σπονδυλική στήλη, κάμπτονται στο σημείο της παραμόρφωσης και παρεμβάλλονται μεταξύ των ασυνεχειών αυτής (Εικόνα 3.16). Εικόνα 3.16: Επιμήκεις τομές παραμορφωμένου (a1, b1) και φυσιολογικού (a2, b2) ατόμου σε μεγεθύνσεις 10x (a1, a2, κλίμακα 0.1 mm) και 40x (b1, b2, κλίμακα 1 μm). Με τα βέλη διακρίνεται ο περινωτοχορδικός συνδετικός ιστός όπου το κυανό χρώμα υποδεικνύει μεγάλη συγκέντρωση σε κολλαγόνο. Με αστερίσκο διακρίνεται η ασυνέχεια της σπονδυλικής στήλης. (1) μυϊκές ίνες, (2) υπολείμματα νωτοχορδής και κενοτοπικά κύτταρα (vacuolized cells), (3) νωτιαίος μυελός. 49

51 Εκτός από τα προαναφερθέντα, σε άλλες περιπτώσεις παρατηρήθηκαν ρήγματα στη σπονδυλική στήλη και στον περινωτοχορδικό συνδετικό ιστό στα σημεία όπου καθυστερεί η οστεοποίηση των κέντρων (Εικόνα 3.17). Η παρατήρηση της ασυνέχειας του περινωτοχορδικού συνδετικού ιστού αλλά και της έντονης συγκέντρωσής του στα σημεία που παρατηρείται, διακρίνεται και σε άλλα παραμορφωμένα άτομα (Εικόνα 3.18). Αυτή η ασυνέχεια ιστολογικά γίνεται αντιληπτή ως διακοπή της στιβάδας των ινιδίων κολλαγόνου (κυανό) με μία έντονα βαμμένη στρώση από (ίσως) υπεραστεστοποιημένο οστίτη ιστό (Εικόνα 3.18). Εικόνα 3.17: Φωτογραφία από στερεοσκόπιο (κλίμακα 1 mm) παραμορφωμένου ατόμου και η επιμήκης τομή αυτού σε μεγεθύνσεις 10x (b, κλίμακα 0.1 mm) και 40x (c, κλίμακα 1 μm). Με το βέλος διακρίνεται ένα μυοδιάφραγμα. Με αστερίσκο διακρίνονται ρήγματα στη σπονδυλική στήλη και τον περινωτοχορδικό συνδετικό ιστό (έντονο ερυθρό). (1) μυϊκές ίνες, (2) υπολείμματα νωτοχορδής και κενοτοπικά κύτταρα (vacuolized cells), (3) νωτιαίος μυελός. Εικόνα 3.18: Φωτογραφία από στερεοσκόπιο (κλίμακα 1 mm) παραμορφωμένου ατόμου και η εγκάρσια τομή αυτού σε μεγεθύνσεις 10x (b, κλίμακα 0.1 mm) και 40x (c, κλίμακα 1 μm). Με αστερίσκο διακρίνεται έντονη συγκέντρωση κολλαγόνου που διακόπτεται από (ίσως) υπεραστεστοποιημένο οστίτη ιστό (3). (1) μυϊκές ίνες, (2) υπολείμματα νωτοχορδής. 50

52 3.3. Αποτελέσματα της επίδρασης της θερμοκρασίας πρώιμης ανάπτυξης στην πλαστικότητα του σχήματος των ιχθυδίων Εξετάστηκε η μορφολογική πλαστικότητα σε πληθυσμούς στο στάδιο του ιχθυδίου, κατόπιν ετερόχρονης (εμβρυϊκό-νυμφικό στάδιο) θερμοκρασιακής επίδρασης (Εικόνα 2.2). Τα αποτελέσματα της μορφομετρικής ανάλυσης είχαν καλή επαναληψιμότητα (ANOVA, p>0.05) (Εικόνα 3.19) και έδειξαν ότι οι δύο πρώτοι μορφολογικοί άξονες της ανάλυσης κανονικών συνιστωσών (CVA, Canonical Variate Analysis) εξηγούν το 74.60% της διακύμανσης του σχήματος σώματος (Εικόνα 3.19). Εικόνα 3.19: Διαγραμματική απεικόνιση των μέσων τιμών (mean±2se) των δύο πρώτων μορφολογικών αξόνων (CV1, CV2) με το ποσοστό (%) της διακύμανσης που εξηγείται από αυτούς, ανά θερμοκρασιακή συνθήκη (εις διπλούν, ανοικτά και κλειστά σύμβολα, πάνω διάγραμμα). 51

53 H διακύμανση του σχήματος που εξηγείται από τους δύο πρώτους μορφολογικούς άξονες είναι ανεξάρτητη του μεγέθους (CS, Εικόνα 3.20). Αυτό γίνεται αντιληπτό από τους συντελεστές προσδιορισμού (R 2 ), οι οποίοι εξηγούν μόνο το 2-3% της μορφολογικής διακύμανσης (Εικόνα 3.20). Με άλλα λόγια οι διαφορές σχήματος (Εικόνα 3.19) μεταξύ των θερμοκρασιακών συνθηκών δεν είναι αποτέλεσμα των διαφορών μεγέθους. Εικόνα 3.20: Διαγραμματική απεικόνιση της σχέσης μεταξύ κεντροειδούς μεγέθους (CS) και των μορφολογικών τιμών των δύο πρώτων αξόνων (CV1, CV2). Για κάθε μορφολογικό άξονα (CV1, CV2) δίνονται οι εξισώσεις (ψ=αx+β) και οι συντελεστές προσδιορισμού (R 2 ) 52

54 Οι θερμοκρασιακές συνθήκες φαίνεται να ομαδοποιούνται κατά μήκος των δύο πρώτων αξόνων ως εξής: (α) η συνθήκη με τους 22, (β) η συνθήκη με τους 16 και (γ) η συνθήκη με τους 19 (Εικόνα 3.19). Παρατηρούνται λοιπόν 3 ομαδοποιήσεις, γεγονός που επιβεβαιώνεται και από την ανάλυση ιεραρχικής ομαδοποίησης (Cluster Analysis) των αποστάσεων Mahalanobis (Ευκλείδειες αποστάσεις) (Εικόνα 3.21), όπου φαίνεται και η υψηλότερη συσχέτιση μεταξύ των δύο τελευταίων ομαδοποιήσεων. Εικόνα 3.21: Ανάλυση ιεραρχικής ομαδοποίησης (Cluster Analysis) των αποστάσεων Mahalanobis ανά θερμοκρασιακή συνθήκη. Ο πρώτος μορφολογικός άξονας (CV1) εξηγεί τις διαφορές που οφείλονται σε μετατοπίσεις των οροσήμων που ορίζουν το πρόσθιο άκρο του ρύγχους, το οπίσθιο άκρο του ινιακού οστού, τη βάση 2 ης ακτίνας του ραχιαίου πτερυγίου, τη βάση 11 ης ακτίνας του ραχιαίου πτερυγίου, και το πρόσθιο άκρο του 1 ου σπονδύλου (Εικόνα 3.22). Ο δεύτερος μορφολογικός άξονας (CV2) εξηγεί τις διαφορές που οφείλονται σε ραχιαιοκοιλιακές μετατοπίσεις των οροσήμων που αφορούν την κοιλιακή και ραχιαία περιοχή του σώματος καθώς επίσης και της σπονδυλικής στήλης (Εικόνα 3.22). Η ομαδοποίηση α (CV1-) διακρίνεται από τις ομαδοποιήσεις β και γ (CV1+) κυρίως λόγω της κοιλιακής μετατόπισης του ρύγχους, της ραχιαιοπρόσθιας μετατόπισης του ινιακού οστού και του 1 ου σπονδύλου, και της οπίσθιας μετατόπισης των άλλων σημαντικών οροσήμων. Η ομαδοποίηση β (CV2-) διακρίνεται από την ομαδοποίηση γ (CV2+) κυρίως λόγω της ραχιαίας μετατόπισης του κορμού και της ταυτόχρονης κοιλιακής μετατόπισης της σπονδυλικής στήλης (Εικόνα 3.22). 53

55 Εικόνα 3.22: Η ανυσματική απεικόνιση των διαφορών σχήματος για τις ακραίες τιμές (-, + x3) των δύο πρώτων μορφολογικών αξόνων (CV1, CV2). 54

56 Σημαντικό ποσοστό της διακύμανσης (12.65%) του σχήματος σώματος εξηγεί και ο τρίτος μορφολογικός άξονας (CV3), κατά μήκος του οποίου γίνεται η διάκριση μεταξύ των δύο ακραίων θερμοκρασιακών συνθηκών (16 και C) (Εικόνα 3.23). Φαίνεται ότι η μικρότερη θερμοκρασία (16 C, CV3+) είχε ως αποτέλεσμα την καθιέρωση ενός μορφότυπου που χαρακτηρίζεται από ένα πιο επίμηκες σχήμα σώματος και ένα μεγαλύτερο μήκος κεφαλής, σε σχέση με τη υψηλότερη θερμοκρασιακή συνθήκη (22-19 C, CV3-) (Εικόνα 3.23). Εικόνα 3.23: Διαγραμματική απεικόνιση των μέσων τιμών (mean±2se) του πρώτου και του τρίτου μορφολογικού άξονα (CV1, CV3) με το ποσοστό (%) της διακύμανσης που εξηγείται από αυτούς. Δίνεται ανυσματική απεικόνιση των διαφορών σχήματος για τις ακραίες τιμές (-, + x3) του τρίτου άξονα (CV3). 55

57 3.4. Αποτελέσματα της πλαστικότητα του σχήματος πληθυσμών που προέρχονται από πρόγραμμα γενετικής βελτίωσης Εξετάστηκε η επίδραση της επιλεκτικής πίεσης (γενετικής και περιβαλλοντικής) ενός προγράμματος γενετικής βελτίωσης στο σχήμα σώματος ενήλικων πληθυσμών τσιπούρας. Για αυτό το σκοπό έγινε μορφομετρική ανάλυση σε συνολικά 4324 άτομα μέσου μήκους 22.93±2.04 cm SL, εκ των οποίων (Εικόνα 3.24) τα 1082 άτομα προέρχονται από την αρχική γενεά (G1cages, 23.24±1.77 cm SL) στην οποία δεν εφαρμόστηκε επιλεκτική πίεση, τα 1132 άτομα προέρχονται από την τρίτη γενεά (G3cages, 24.73±1.16 cm SL) του προγράμματος γενετικής βελτίωσης και τα 2110 άτομα προέρχονται από την τέταρτη γενεά του προγράμματος γενετικής βελτίωσης. Στην τελευταία γενεά εξετάστηκε και η περιβαλλοντική πίεση εφαρμόζοντας δύο διαφορετικές συνθήκες εκτροφής κατά το στάδιο της πάχυνσης, σε κλωβούς ανοικτής θαλάσσης (1010 άτομα, G4cages, 21.01±1.70 cm SL) όπως ισχύει και στις προηγούμενες γενεές (G1cages, G3cages) και σε δεξαμενές (1100 άτομα, G4tanks, 22.56±1.53 cm SL). Εικόνα 3.24: Κατανομές μηκών των τριών εξεταζόμενων γενεών (G1, G3, G4) και των δύο διαφορετικών περιβαλλόντων εντός της τελευταίας γενεάς (G4tanks, G4cages). Οι διαφορές στα μήκη είναι στατιστικά σημαντική για όλες τις ομάδες (ANOVA, p<0.001). Αν και τα μέσα μήκη (SL) μεταξύ των εξεταζόμενων πληθυσμών είναι διαφορετικά (ANOVA, p<0.001, Εικόνα 3.24), η μέθοδος της γεωμετρικής μορφομετρίας επιτρέπει την αφαίρεση του παράγοντα μεγέθους (π.χ. κεντροειδές μέγεθος, Centoid Size, CS). Πράγματι η διακύμανση του σχήματος που εξηγείται από 56

58 τους δύο πρώτους μορφολογικούς άξονες (RW1, RW2) αποδείχθηκε ανεξάρτητη του μεγέθους (CS, Εικόνα 3.25). Εικόνα 3.25: Διαγραμματική απεικόνιση της σχέσης μεταξύ κεντροειδούς μεγέθους (CS) και των μορφολογικών τιμών των δύο πρώτων αξόνων (RW1, RW2) ανά εξεταζόμενο πληθυσμό (G1cages, G3cages, G4cages, G4tanks). Για κάθε μορφολογικό άξονα (RW1, RW2) δίνονται οι εξισώσεις (ψ=αx+β) και οι συντελεστές προσδιορισμού (R 2 ). 57

59 Η τροποποιημένη ανάλυση των κυρίων συνιστωσών (RWA, Relative Warp Analysis) έδειξε ότι οι τρεις πρώτοι μορφολογικοί άξονες (RW1, RW2, RW3) εξηγούν το 53.62% της διακύμανσης του σχήματος σώματος (Εικόνα 3.26). Η μορφολογική διάκριση είναι έντονη κυρίως κατά μήκος των δύο πρώτων (RW1, RW2) μορφολογικών αξόνων (Εικόνα 3.26, 3.27), όπου εξηγείται το 42.61% της διακύμανσης του σχήματος σώματος. Εικόνα 3.26: Διαγραμματική απεικόνιση (ανά εξεταζόμενο πληθυσμό) των τριών πρώτων μορφολογικών αξόνων (RW1, RW2, RW3) με το ποσοστό (%) της διακύμανσης που εξηγείται από αυτούς. 58

60 Εικόνα 3.27: Διαγραμματική απεικόνιση (ανά εξεταζόμενο πληθυσμό) των μέσων τιμών (mean±2se) των τριών πρώτων μορφολογικών αξόνων (RW1, RW2, RW3) με το ποσοστό (%) της διακύμανσης που εξηγείται από αυτούς. Από την ανυσματική απεικόνιση των διαφορών σχήματος (Εικόνα 3.28) παρατηρείται ότι κατά μήκος του πρώτου μορφολογικού άξονα (RW1) η διακύμανση του σχήματος σώματος μεταξύ των εξεταζόμενων πληθυσμών (Εικόνα 3.26, 3.27) οφείλεται κυρίως σε προσθιο-οπίσθιες μετατοπίσεις όλων των ορόσημων εκτός από αυτών που ορίζουν τη κοιλιακή περιοχή του κορμού. Αντίθετα κατά μήκος του 59

61 δεύτερου μορφολογικού άξονα (RW2) η διακύμανση του σχήματος σώματος μεταξύ των εξεταζόμενων πληθυσμών (Εικόνα 3.26, 3.27) οφείλεται κυρίως σε ραχιαιοκοιλιακές μετατοπίσεις των οροσήμων που ορίζουν το ύψος των ατόμων (Εικόνα 3.28). Εικόνα 3.28: Η ανυσματική απεικόνιση των διαφορών σχήματος για τις ακραίες τιμές (-, + x3) των δύο πρώτων μορφολογικών αξόνων (RW1, RW2). Ενώ η τροποποιημένη ανάλυση των κυρίων συνιστωσών (RWA, Relative Warp Analysis) είναι ιδανική για την απεικόνιση της πραγματικής ποικιλομορφίας του σχήματος σώματος, δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επεξήγηση της ολικής διακύμανσης. Για αυτό το σκοπό χρησιμοποιήθηκε και η ανάλυση κανονικών συνιστωσών (CVA, Canonical Variate Analysis) για την λεπτομερέστερη εκτίμηση των διαφορών σχήματος μεταξύ των υπό εξέταση πληθυσμών. Εικόνα 3.29: Ανάλυση των ιεραρχικής ομαδοποίησης (Cluster Analysis) των αποστάσεων Mahalanobis ανά εξεταζόμενο πληθυσμό. 60

62 Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι δύο πρώτοι (CV1, CV2) από τους τρεις μορφολογικούς άξονες εξηγούν το 95.59% της διακύμανσης του σχήματος σώματος (Εικόνα 3.30) και επιβεβαίωσαν την μορφολογική διάκριση των πληθυσμών. Παρόλο που υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0.001, ANOVA, ±10SE) μεταξύ όλων των εξεταζόμενων πληθυσμών και για τους δύο μορφολογικούς άξονες (CV1, CV2), παρατηρούνται οι εξής διακρίσεις: (α) η γενεαλογική, δηλαδή η διάκριση μεταξύ της πρώτης γενεάς (G1cages) και των επακόλουθων (G3cages, G4cages, G4tanks) κατά μήκος του πρώτου μορφολογικού άξονα (CV1) και (β) η περιβαλλοντική, δηλαδή η διάκριση μεταξύ των πληθυσμών των κλωβών (G1cages, G3cages, G4cages) και του πληθυσμού των δεξαμενών (G4tanks) κατά μήκος του δεύτερου μορφολογικού άξονα (CV2). Εικόνα 3.30: Διαγραμματική απεικόνιση των μέσων τιμών (mean±10se) των δύο πρώτων μορφολογικών αξόνων (CV1, CV2) με το ποσοστό (%) της διακύμανσης που εξηγείται από αυτούς. Δίνεται η ανυσματική απεικόνιση των διαφορών σχήματος για τις ακραίες τιμές (-, + x3) κάθε άξονα. 61

63 Οι πιο πάνω διακρίσεις συμφωνούν με την ανάλυση ιεραρχικής ομαδοποίησης (Cluster Analysis) των αποστάσεων Mahalanobis (Εικόνα 3.29), ενώ η ανυσματική απεικόνιση των διαφορών σχήματος για τους δύο πρώτους μορφολογικούς άξονες (CV1, CV2) της ανάλυσης κανονικών συνιστωσών, συμφωνεί σε γενικές γραμμές (Εικόνα 3.30) με τα αποτελέσματα της τροποποιημένης ανάλυσης κυρίων συνιστωσών (RWA, Εικόνα 3.28). Αναλυτικότερα, η γενεαλογική διάκριση (CV1, +, -) οφείλεται σε μετατοπίσεις των οροσήμων που ορίζουν το κεφάλι και το κοιλιακού μέρους του κορμού (Εικόνα 3.30). Η πρώτη γενεά (G1cages, CV1+) διακρίνεται των επακόλουθων (G3cages, G4cages, G4tanks, CV1-), λόγω του μικρότερου κεφαλιού, του μεγαλύτερου ουραίου μίσχου, του μικρότερου εδρικού πτερυγίου και της κοιλιακής μετατόπισης των θωρακικών πτερυγίων (Εικόνα 3.30). Η περιβαλλοντική διάκριση (CV2, +, -) οφείλεται σε προσθιο-οπίσθιες μετατοπίσεις των οροσήμων που αφορούν το κεφάλι και ραχιαιοκοιλιακές μετατοπίσεις των οροσήμων που ορίζουν τον κορμό (Εικόνα 3.30). Ο πληθυσμός των δεξαμενών (G4tanks, CV2-) διακρίνεται από αυτούς των κλωβών (G1cages, G3cages, G4cages, CV2+), λόγω του μικρότερου κεφαλιού και του μικρότερου ύψους του κορμού (Εικόνα 3.30), με αποτέλεσμα να εμφανίζει ένα πιο επίμηκες τορπιλοειδές σχήμα σώματος (ANOVA, p<0.001), όπως αποδεικνύεται και από τον λόγο ύψος προς μήκος (Εικόνα 3.31). Εικόνα 3.31: Ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) του λόγου ύψους προς μήκους (mean Height/SL ±SD) ανά εξεταζόμενο πληθυσμό. Τα διαφορετικά γράμματα (a, b) υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (Bonferoni post-hoc test, p<0.001). 62

64 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 63

65 4.1. Έλεγχος ποιότητας ως προς τις σκελετικές παραμορφώσεις Στην παρούσα εργασία εξετάστηκαν τρεις τύποι σκελετικών δυσπλασιών σε δείγματα νυμφών τσιπούρας. Οι σκελετικές δυσπλασίες ομαδοποιήθηκαν στις ακόλουθες δύο κατηγορίες: (ι) Κρανιακές παραμορφώσεις: Αφορούσαν τις δυσπλασίες του βραγχιακού επικαλύμματος και των γνάθων. Για κάθε παραμόρφωση περιγράφηκε η ένταση, η ασυμμετρία εμφάνισης και έγινε συσχετισμός με το ρυθμό αύξησης. Τέλος ελέγχθηκε η συσχέτιση της ανάπτυξης των δύο παραμορφώσεων. (ιι) Σπονδυλικές δυσπλασίες: Αφορούσαν σε ένα νέο τύπο σκελετικής παραμόρφωσης της σπονδυλικής στήλης που δεν έχει περιγραφεί μέχρι σήμερα. Έγινε η περιγραφή της έντασης, του κέντρου εμφάνισης και της θνησιγόνου δράσης της, ενώ έγινε και προσπάθεια της μορφομετρικής τυποποίησης της παραμόρφωσης Κρανιακές παραμορφώσεις Η παραμόρφωση του βραγχιακού επικαλύμματος (OPER) που παρατηρήθηκε στα εξεταζόμενα δείγματα είχε την ίδια περιγραφή με αυτή που παρουσιάζεται στη βιβλιογραφία (Koumoundouros et al. 1997b) Πράγματι παρατηρήθηκε ότι τα άτομα που παρουσίασαν τη συγκεκριμένη παραμόρφωση εμφάνισαν αναδίπλωση προς τη βραγχιακή κοιλότητα του επικαλυμματικού ή και του υποεπικαλυμματικού οστού, ή τη βράχυνση των δομών αυτών. Στην παρούσα εργασία τεκμηριώθηκε για πρώτη φορά η ανάπτυξη της παραμόρφωσης σε νύμφες ολικού μήκους (TL) 5.0 mm, σωματικό μήκος το οποίο διαφοροποιείται σημαντικά από το χαμηλότερο όριο εμφάνισης της παραμόρφωσης που παρατηρείται στη βιβλιογραφία (6.1 mm TL, Koumoundouros et al. 1997b). Το γεγονός αυτό ενισχύει τη σημασία του πρώιμου νυμφικού σταδίου για τη φυσιολογική ανάπτυξη του βραγχιακού επικαλύμματος, εστιάζοντας την έρευνα για την επίλυση των σχετικών προβλημάτων σε αυτό το στάδιο. Στην παρούσα εργασία, ακόμα και στα μικρότερα δείγματα παραμορφωμένων ατόμων η ανάπτυξη των βραγχιοστεγών ακτίνων δεν επηρεάστηκε από την ανώμαλη ανάπτυξη του επικαλυμματικού ή του υποεπικαλυμματικού οστού. Το γεγονός αυτό συμφωνεί με τα αποτελέσματα των Koumoundouros et al. (1997b) και προτείνει ότι είναι η μετέπειτα μηχανική δράση της ανάπτυξης της παραμόρφωσης του βραγχιακού επικαλύμματος που οδηγεί σε βλάβες των βραγχιοστεγών ακτίνων. Παρόμοια, οι Galeotti et al. (2000) υποστηρίζουν ότι δεν είναι δυνατόν σε αυτές τις ηλικίες (17-20 dph) να προκληθούν βλάβες στις βραγχιοστεγείς ακτίνες της τσιπούρας, αφού η στήριξη του επικαλυμματικού στη βραγχιοκρανιακή περιοχή είναι χόνδρινη, ενώ η ίδια η δομή του επικαλυμματικού αποτελείται από ένα έλασμα πυκνού συνδετικού ιστού. Η παρούσα εργασία δεν είχε σκοπό την τυποποίηση της παραμόρφωσης του βραγχιακού επικαλύμματος (OPER), αφού έχει γίνει περιγραφή της στο παρελθόν (Koumoundouros et al. 1997b). Παρόλα αυτά έγινε προσπάθεια της περιγραφής της 64

66 έντασής της. Μεταξύ των δειγμάτων προς ανάλυση, βρέθηκε ότι τα τρία δείγματα παρουσιάζουν χαμηλή συχνότητα έντονης παραμόρφωσης (Severe) (Α3 13%, Α4 13%, Α5 11%), ενώ τα δύο υψηλή έως πολύ υψηλή (Α1 81%, Α2 96%). Κατόπιν ελέγχθηκε η τάση ασυμμετρίας της παραμόρφωσης, όπου τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το φαινόμενο της ασυμμετρίας ισχύει σε όλα τα δείγματα. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με προηγούμενες εργασίες (Koumoundouros et al. 1997b, Galeotti et al. 2000, Beraldo et al. 2003, Verhaegen et al. 2007, Fernández et al. 2008) όπου αναφέρεται ότι η παραμόρφωση του βραγχιακού επικαλύμματος είναι ασύμμετρα εμφανιζόμενη. Το φαινόμενο της ασυμμετρίας της παραμόρφωσης του βραγχιακού επικαλύμματος αποτελεί μέχρι σήμερα ένα πεδίο διχογνωμίας για τους επιστήμονες. Ενώ όλοι συμφωνούν ότι η παραμόρφωση είναι ασύμμετρα εμφανιζόμενη, διαφωνούν στο κατά πόσο η ασυμμετρία είναι κυμαινόμενη (fluctuating asymmetry) ή κατευθυνόμενη (directional asymmetry). Η πρώτη θα μπορούσε να αποδοθεί στην επίδραση των περιβαλλοντικών παραγόντων (Baharona-Fernandes, 1982), ενώ η δεύτερη ενισχύει την υπόθεση της γενετικά ελεγχόμενης παραμόρφωσης του βραγχιακού επικαλύμματος (Verhaegen et al. 2007). Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας υποδεικνύουν ότι δεν υπάρχει τάση κατευθυνόμενης ασυμμετρίας (αριστερά ή δεξιά) στα δείγματα που κυριαρχούν τα έντονα παραμορφωμένα (Α1, Α2). Αντίθετα στα δείγματα που κυριαρχούν τα ελαφριά παραμορφωμένα άτομα (Α3, Α5) η ανάπτυξη της δυσπλασίας είναι κατευθυνόμενα ασύμμετρη. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν για πρώτη φορά ότι η σοβαρότητα της παραμόρφωσης είναι αποτέλεσμα δύο ξεχωριστών μηχανισμών πρόκλησή τους. Στα μεν έντονα παραμορφωμένα άτομα η δυσπλασία θα μπορούσε να οφείλεται σε δράση περιβαλλοντικών παραγόντων (κυμαινόμενη ασυμμετρία, Koumoundouros et al. 1997b, Beraldo et al. 2003), ενώ στα δε ελαφριά παραμορφωμένα άτομα η δυσπλασία θα μπορούσε να αποδοθεί σε γενετικούς παράγοντες (κατευθυνόμενη ασυμμετρία, Galeotti et al. 2000, Verhaegen et al. 2007, Fernández et al. 2008). Παρόλα αυτά μέχρι σήμερα δεν έχει αποδειχθεί ότι η παραμόρφωση κληρονομείται (Tave & Handwerker, 1994, Handwerker & Tave, 1994, Castro et al. 2010), πλην μίας εργασίας στο είδος Cichlasoma nigrofasciatum (Winemiller & Taylor, 1982). Η συσχέτιση της παραμόρφωσης του βραγχιακού επικαλύμματος με το μήκος/ηλικία από τους Koumoundouros et al. (1997b) έδειξε ότι τα παραμορφωμένα άτομα έχουν μικρότερο μέγεθος από τα φυσιολογικά. Αντίθετα, το φαινόμενο αυτό δεν παρατηρήθηκε από τους Galeotti et al. (2000) και τους Verhaegen et al. (2007). Δημιουργείται λοιπόν το εύλογο ερώτημα, κατά πόσον είναι η παραμόρφωση που προκαλεί μείωση στο ρυθμό αύξησης ή ισχύει το αντίστροφο. Στην παρούσα εργασία, για πρώτη φορά, βρέθηκε ότι το μήκος (και επομένως και ο ρυθμός αύξησης για άτομα ίδιας ηλικίας) των φυσιολογικών ατόμων στα δείγματα με υψηλή συχνότητα και ένταση παραμορφώσεων (Α1, Α2) είναι μικρότερο από ότι στα δείγματα με χαμηλή συχνότητα και ένταση παραμορφώσεων (Α3, Α4). Το αποτέλεσμα αυτό προτείνει ότι ο χαμηλός ρυθμός αύξησης προηγείται και δεν έπεται της ανάπτυξης της δυσπλασίας του βραγχιακού επικαλύμματος. 65

67 Προηγούμενες εργασίες δείχνουν ότι η δράση ενός και μόνο παράγοντα θα μπορούσε να προκαλεί την ανώμαλη ανάπτυξη ανατομικά ασύνδετων σκελετικών στοιχείων, τα οποία ωστόσο αναπτύσσονται στο ίδιο αναπτυξιακό στάδιο και έχουν ίδια αναπτυξιακή φύση (π.χ. μεμβρανικά οστά, Koumoundouros et al. 2002). Εφόσον γνωρίζουμε ότι τόσο τα οστά του βραγχιακού επικαλύμματος όσο και αυτά των γνάθων αποτελούν μεμβρανικά οστά του κρανίου, στην παρούσα εργασία ελέγχθηκε το κατά πόσο υπάρχει συσχέτιση μεταξύ των παραμορφώσεών τους. Τα αποτελέσματα δεν έδειξαν να υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της παραμόρφωσης του βραγχιακού επικαλύμματος και της παραμόρφωσης των γνάθων. Αντίθετα παρατηρήθηκε αρνητική συσχέτιση μεταξύ της παραμόρφωσης KUM με μία άλλη παραμόρφωση των γνάθων που αφορά τη σύμπτυξη των γναθικών και προγναθικών οστών (FUS). Όσον αφορά στην παραμόρφωση KUM, δεν έχει αναφερθεί μέχρι σήμερα στη διεθνή βιβλιογραφία και αφορά τη ραχιαιο-οπίσθια σύγκλιση των πρόσθιων άκρων των γναθικών και προγναθικών οστών, με αποτέλεσμα τη βράχυνση της άνω γνάθου. Παρουσιάζει δε παρόμοια τυπολογία με το σύνδρομο pugheadness (οπίσθια συμπίεση της ηθμοειδής περιοχής και των άνω γνάθων) (Baharona-Fernandes, 1982). Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας έδειξαν ότι το ελάχιστο μέγεθος διάγνωσης της παραμόρφωσης είναι τα 6.1 mm TL όπως επίσης ότι ο μειωμένος ρυθμός αύξησης προηγείται της ανάπτυξης της παραμόρφωσης (όμοια δηλαδή με την περίπτωση της παραμόρφωσης του βραγχιακού επικαλύμματος). Η παραμόρφωση παρατηρήθηκε από τα 6.1 mm TL, όταν είχε ξεκινήσει ήδη η οστεοποίηση των γναθικών οστών. Δεν μπορούμε να γνωρίζουμε κατά πόσον η παραμόρφωση είναι αποτέλεσμα της οστεοποίησης ή της προϋπάρχουσας δομής, αφού δεν είχαμε στα δείγματά μας άτομα μικρότερης ηλικίας. Για να απαντήσουμε στο ερώτημα αυτό ανατρέξαμε στη διεθνή βιβλιογραφία. Οι Kužir et al. (2004) μελετώντας την κρανιακή ανάπτυξη ενός παρόμοιου είδους (ως προς την ανάπτυξη) του D. labrax, αναφέρουν ότι τα πρώτα μεμβρανικά οστά που αναπτύσσονται (5.9 mm SL) στο κρανίο είναι τα γναθικά. Συνεχίζοντας αναφέρουν ότι πριν από το μήκος αυτό δεν υπάρχουν οποιεσδήποτε οστεοποιημένες δομές, ενώ τα προγναθικά οστά αναπτύσσονται μετέπειτα (7.9 mm SL) μαζί με τα οδοντικά οστά. Με το πιο πάνω πρότυπο ανάπτυξης συμφωνούν και οι Koumoundouros et al. (2000), μελετώντας το είδος Dentex dentex. Επίσης συμφωνούν και με το πρότυπο ανάπτυξης που προτείνουν οι Faustino & Power (2001) για την τσιπούρα, με τη διαφορά ότι τα αποτελέσματά τους παρουσιάζουν μια μετατόπιση προς μικρότερες ηλικίες (κατά περίπου 1-2 mm SL) σε σχέση με τα άλλα είδη, κάτι που φαίνεται να ισχύει και για την παρούσα εργασία αφού φαίνεται να έχουν οστεοποιηθεί και τα οδοντικά οστά. Τέλος από την εργασία των Roo et al. (2010), όπου μελετήθηκε η ανάπτυξη των σκελετικών παραμορφώσεων στο είδος Pagrus pagrus, βρέθηκε ότι η βράχυνση της άνω γνάθου συμβαίνει από τα πολύ αρχικά στάδια όταν δεν έχει οστεοποιηθεί κανένα μεμβρανικό οστό. Μπορούμε λοιπόν να υποθέσουμε ότι είναι η αρχική ανώμαλη δομή (οστεοειδής κρηπίδα) που οδήγησε στην παραμόρφωση KUM. 66

68 Το γεγονός ότι η ανάπτυξη πρώτα των γναθικών οστών και έπειτα των άλλων μεμβρανικών οστών του κρανίου αποσκοπεί στην υποστήριξη της μετάβασης από την ενδογενή (λεκιθοφόρο στάδιο) στην εξωγενή διατροφή (νυμφικό στάδιο), καθώς και το γεγονός ότι οι παραμορφώσεις των γνάθων εμφανίζονται από τα πολύ αρχικά στάδια της εξωγενούς διατροφής, οδήγησε τους επιστήμονες στην υπόθεση της εμπλοκής της ποιότητας και της ποσότητας της παρεχόμενης τροφής στην ανάπτυξή τους (Zambonino Infante et al. 1997, 1999). Έτσι, η ανάπτυξη των δυσπλασιών των γνάθων από νωρίς αποδόθηκε στην τερατογόνο δράση του ρετινοϊκού οξέως που αποτελεί μεταβολικό προϊόν της παρεχόμενης μέσω των εμπλουτιστικών, βιταμίνης Α (Dedi et al. 1997). Τόσο η έλλειψη όσο και η υπερβολική συγκέντρωση βιταμίνης Α διαταράσσουν το μονοπάτι των ρετινοειδών προκαλώντας ανώμαλη ανάπτυξη των οστών, του κεντρικού νευρικού συστήματος και του καθορισμού του προσθιοοπίσθιου άξονα των εμβρύων των σπονδυλωτών (Suzuki et al. 2000, Haga et al. 2002, 2003). Σε εργασία των Villeneuve et al. (2005), όπου εξετάστηκε η επίδραση της βιταμίνης Α στη σκελετική ανάπτυξη του D. labrax, βρέθηκε σημαντική μεταβολή (μεταξύ παραμορφωμένων και φυσιολογικών ατόμων) των υποδοχέων (RARα και RARγ) του ρετινοϊκού οξέως κατά την 21dph. Σε μετέπειτα εργασία της (Villeneuve et al. 2005), η πιο πάνω επιστημονική ομάδα αναφέρει ότι οι υποδοχείς αυτοί ίσως ρυθμίζονται κατά την 13dph μαζί με την πρωτεΐνη BMP4 που είναι πολύ σημαντική για την ανάπτυξη των οστών. Στα πιο πάνω μόρια φαίνεται να συμμετέχουν και ο αυξητικός παράγοντας IGF-1, η ενδοθελίνη (ΕΤ-1), όπως επίσης και η πρωτεΐνη PTHrP (parathyroid hormone-related protein), μέσω ενός μονοπατιού που δεν έχει ακόμα αποσαφηνιστεί (Villeneuve et al. 2005, Abzhanov et al. 2007, Fernández et al. 2008, Geay et al. 2009). Παρόλα αυτά γνωρίζουμε με σιγουριά ότι η τοξικότητα της βιταμίνης Α (μέσω της μετατροπής των μεταβολικών μονοπατιών), οδηγεί τελικά σε ανωμαλίες μεταβολής του ορίου έκφρασης των γονιδίων Hox με αποτέλεσμα την μετατόπιση των εμπλεκόμενων κυττάρων σε οπισθιότερες περιοχές (Suzuki et al. 1998). Η βέλτιστη συγκέντρωση βιταμίνης Α θεωρείτο μέχρι και το 2009 αυτή των 31 mg/kg. Οι Mazurais et al. (2009) ωστόσο έδειξαν ότι η συγκέντρωση των 5 mg/kg αποτελεί τη βέλτιστη συγκέντρωση για τη φυσιολογική ανάπτυξη του D. labrax Παραμόρφωση σπονδυλικής στήλης Η παραμόρφωση της σπονδυλικής στήλης που εξετάστηκε, έγινε αντιληπτή ως παθολογία αιματικής σκολίωσης διαφορετικής έντασης που μπορεί να ακολουθείται από συμπίεση του σώματος κατά τον επιμήκη άξονα. Στα παραμορφωμένα άτομα παρατηρήθηκε υπερασβεστοποίηση των κέντρων των σπονδύλων ή καθυστερημένη ασβεστοποίηση τους, που μπορεί να συνδυάζεται με καταστροφή, σύμπτυξη, και απώλεια αυτών όπως επίσης και των αποφύσεων τους. Η δυσπλασία αναπτύχθηκε στο 50.3% του δείγματος των νυμφών σε δύο ξεχωριστά κέντρα, ένα πρόσθιο μεταξύ 67

69 του 13 ου -15 ου σπονδύλου και ένα οπίσθιο του 17 ου -20 ου σπονδύλου (συχνότερη περίπτωση). Η παραμόρφωση βρέθηκε να είναι θνησιγόνος, κατόπιν της παρατήρησης της μείωσης κατά 28.5% επί του συνόλου των παραμορφωμένων ατόμων μεταξύ του πληθυσμού του νυμφικού σταδίου (9.6±1.3 mm SL) και του σταδίου του ιχθυδίου (18.8±1.9 mm SL). Στο δείγμα των ιχθυδίων παρατηρήθηκε να κυριαρχούν οι παραμορφώσεις με το κέντρο μετατοπισμένο προς την ουραία περιοχή, ενώ η συχνότητα της παραμόρφωσης με κέντρο στην πρόσθια περιοχή ήταν πολύ χαμηλή (κάτω από 2%). Παρόμοια θνησιγόνο επίδραση έχει αναφερθεί μόνο για την κύφωση στο D. labrax (Koumoundouros et al. 2000). Ουσιαστικά δεν μπορούμε να εντάξουμε τη συγκεκριμένη παραμόρφωση στην κατηγορία της λόρδωσης και της κύφωσης, αφού δεν είναι αποτέλεσμα της μη φυσιολογικής ανάπτυξης της νηκτικής κύστης (προ-αιματική λόρδωση ή κύφωση) ή της έντονης κολυμβητικής δραστηριότητας (αιματική λόρδωση). Η συγκεκριμένη δυσπλασία φαίνεται να οφείλεται σε κάποιο/ους παράγοντες που έδρασαν κατά το πολύ πρώιμο οντογενετικό στάδιο, πριν από την ανάπτυξη των σπονδύλων (στάδιο νωτοχορδής). Από την εργασία ανασκόπησης των Lall & Lewis-McCrea (2007), αναφέρεται ότι παραμορφώσεις ίδιας τυπολογίας με την σκολίωση έχουν αναφερθεί σε ποικίλα είδη και αποδίδονται σε παράγοντες όπως η ανεπάρκεια σε ασβέστιο, η υπερβιταμίνωση Α, η υπερβιταμίνωση C και η ανεπάρκεια σε πολυακόρεστα λιπαρά. Ειδικότερα για την βιταμίνη Α έχει βρεθεί ότι εκτός από την σκολίωση, η υπερδοσολογία (μέσω της χρήσης στα εμπλουτιστικά) οδηγεί και σε συμπίεση των σπονδύλων (Dedi et al. 1995), φαινόμενο που παρατηρήθηκε και στην παρούσα εργασία. Επίσης η ανεπάρκεια της δίαιτας σε ασκορβικό οξύ ή σε τρυπτοφάνη φαίνεται να έχει ως αποτέλεσμα παραμορφώσεις στον συνδετικό ιστό και ειδικότερα στο κολλαγόνο (ανασκόπηση από Santamaria et al. 1994). Παρόμοια τυπολογία της παραμόρφωσης παρατηρήθηκε κατά την δεκαετία του 70 από τον Bucke (1974) στο είδος Abramis brama και αποδόθηκε στη χρόνια έκθεση των πληθυσμών της λίμνης South Holland σε ρυπογόνους παράγοντες. Πολύ αργότερα καταγράφηκε σε νύμφες τσιπούρας από τους Andrades et al. (1996), όπου μετά την διαπίστωση ότι δεν αποτελούσε παραμόρφωση που προκλήθηκε από τη μη φυσιολογική ανάπτυξη της νηκτικής κύστης, αποδόθηκε είτε σε περιβαλλοντικούς είτε σε γενετικούς παράγοντες. Οι συγγραφείς υπέδειξαν και αυτοί ότι λόγω του πρώιμου σταδίου εμφάνισης της παραμόρφωσης θα πρέπει να εξεταστεί η συσχέτισή της με τον περινωτοχοδρικό συνδετικό ιστό και ειδικότερα με το κολλαγόνο. Ο περινωτοχορδικός συνδετικός ιστός ουσιαστικά αποτελεί την εξωκυττάρια ύλη που περιβάλλει τη νωτοχορδή. Αποτελεί ένα σημαντικό στοιχείο για τον έλεγχο της κυτταρικής αύξησης, διαφοροποίησης, μετανάστευσης, απόπτωσης (Hynes, 2009), ενώ η δομική ακεραιότητα των περιβαλλόμενων ιστών θεωρείται ότι ελέγχεται από αυτήν (Tsang et al. 2009). Το κυριότερο συστατικό της εξωκυττάριας ύλης όλων των μεταζώων αποτελείται από μόρια κολλαγόνου (28 τύποι ομαδοποιημένοι σε 5 κλάσεις), που είναι πολύ σημαντικά για τη διατήρηση της δομής των ιστών (Pace et al., 2003, Canty & Kadler, 2005). Μεγάλες συγκεντρώσεις κολλαγόνου μπορούν να 68

70 βρεθούν ειδικότερα στον περινωτοχοδρικό συνδετικό ιστό όπου παρέχουν ελαστικότητα και στήριξη σε άλλα μόρια της εξωκυττάριας ύλης (όπως σε πρωτεογλυκάνες), ενώ ταυτόχρονα δημιουργούν το υπόστρωμα για την απόθεση ασβεστίου (Christiansen et al. 2009). Οι πρωτεογλυκάνες με την σειρά τους, λόγω της ιδιότητας τους να ενυδατώνονται παρέχουν μηχανική αντοχή σε δυνάμεις συμπίεσης (Fenq et al. 2006). Παραμόρφωση παρόμοιας τυπολογίας με αυτή της παρούσας εργασίας παρατηρήθηκε σε νύμφες τσιπούρας από τους Santamaria et al. (1994) και βρέθηκε να συσχετίζεται με «δυσμορφίες» του κολλαγόνου (τύπου ΙΙ). Στα φυσιολογικά άτομα η νωτοχορδή παρουσίαζε καθορισμένα πλαίσια και κλιμάκωση της διαμέτρου της προς τα πίσω, ενώ τα ινίδια κολλαγόνου ήταν καλά τακτοποιημένα γύρω από αυτήν. Αντίθετα στα παραμορφωμένα άτομα η νωτοχορδή είχε ακανόνιστη διάμετρο, ο περινωτοχορδικός συνδετικός ιστός δεν ήταν καλά καθορισμένος και τακτοποιημένος, ενώ οι δέσμες μυϊκών ινών παρουσίαζαν παρόμοια αλλοιωμένη διάταξη. Συμφώνα με τα αποτελέσματα των Santamaria et al. (1994), τα οποία συμφωνούν και με τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας, δημιουργούνται δύο αντίθετες υποθέσεις για την αιτία (σε φυσιολογικό επίπεδο) που προκαλεί την συγκεκριμένη παραμόρφωση: (α) η αυξημένη παραγωγή κολλαγόνου οδηγεί σε αυξημένη μηχανική δράση που έχει ως αποτέλεσμα τη συμπίεση των περιβαλλόμενων ιστών, ή (β) η μειωμένη παραγωγή κολλαγόνου έχει ως αποτέλεσμα την μείωση της μηχανικής υποστήριξης της νωτοχορδής με επακόλουθο την ανώμαλη κάμψη της. Η απάντηση σε αυτό το ερώτημα δίνεται από τους Christiansen et al. (2009), οι οποίοι χρησιμοποίησαν στέλεχος Danio rerio στο οποίο κατεστάλη η έκφραση δύο γονιδίων (col27a1a και col27a1b) που εμπλέκονται στην παραγωγή του κολλαγόνου (τύπου XXVII). Η καταστολή είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη in utero σκολίωσης από το στάδιο της νωτοχορδής (Εικόνα 4.1), την επακόλουθη ανώμαλη οστεοποίηση των εμπλεκόμενων σπονδύλων (Εικόνα 4.1) και την ακανόνιστη συσσώρευση διάφορων πρωτεϊνών στον περινωτοχοδρικό συνδετικό ιστό (Εικόνα 4.1). Φαίνεται λοιπόν ότι η μειωμένη παραγωγή κολλαγόνου έχει ως αποτέλεσμα την μείωση της μηχανικής υποστήριξης της νωτοχορδής με επακόλουθο την ανώμαλη κάμψη της που προκαλείται από την κολυμβητική δραστηριότητα (Christiansen et al. 2009). Κατόπιν της παρατήρησης ότι ο λόγος HL/SL διαφέρει σημαντικά (μεταξύ φυσιολογικών και παραμορφωμένων ατόμων, έγινε εφαρμογή της μεθόδου της γεωμετρικής μορφομετρίας για να εξεταστεί η συνεπίδραση της έντασης και της θέσης της παραμόρφωσης στο σχήμα του σώματος και για να γίνει προσπάθεια τυποποίησης με μορφομετρική μέθοδο. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μέθοδος της γεωμετρικής μορφομετρίας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την τυποποίηση παραμορφώσεων. Συγκεκριμένα βρέθηκε ότι η παραμόρφωση μπορεί να περιγραφεί κατά 82.63% από τους δύο πρώτους 69

71 μορφολογικούς άξονες (RW1, RW2), όπου ο RW1 εξηγεί τη θέση ενώ ο RW2 την ένταση της παραμόρφωσης. Εικόνα 4.1: Φυσιολογικά (Α, C, E) και παραμορφωμένα (Β, D, F) άτομα Danio rerio. (B) Η μεταλλαγή για το γονίδιο col27a1a είχε ως αποτέλεσμα την πλάγια κάμψη (βέλος) της νωτοχορδής (σκολίωση), (D) που έχει ως αποτέλεσμα την ανώμαλη ασβεστοποίηση των κέντρων των σπονδύλων (βέλος) στα μετέπειτα αναπτυξιακά στάδια (Alcian Blue/Alizarin Red Stain) και (F) την ανώμαλη συσσώρευση κυττάρων και πρωτεϊνών στον περινωτοχοδρικό χώρο (Richardson s Stain). Τροποποίηση από Christiansen et al Έλεγχος ποιότητας με βάση το σχήμα σώματος Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η ποιότητα εκτρεφόμενων πληθυσμών τσιπούρας με βάση το σχήμα του σώματος. Συγκεκριμένα εξετάσθηκε: (ι) η μορφολογική πλαστικότητα σε πληθυσμούς στο στάδιο του ιχθυδίου, κατόπιν ετερόχρονης (εμβρυϊκό-νυμφικό στάδιο) θερμοκρασιακής επίδρασης και (ιι) η μορφολογική πλαστικότητα σε ενήλικους πληθυσμούς που προέρχονται από πρόγραμμα γενετικής βελτίωσης. Ελέγχθηκε η επίδραση του γονότυπου και του περιβάλλοντος στη ποικιλομορφία της μορφολογίας. 70

72 Θερμοκρασιακά ελεγχόμενη μορφολογική πλαστικότητα ιχθυδίων Εξετάστηκε η μορφολογική πλαστικότητα των ιχθυδίων τσιπούρας ως απόκριση στη θερμοκρασία κατά το εμβρυϊκό και νυμφικό στάδιο. Τα αποτελέσματα της μορφομετρικής ανάλυσης είχαν καλή επαναληψιμότητα και έδειξαν ότι οι δύο πρώτοι μορφολογικοί άξονες της ανάλυσης κανονικών συνιστωσών (CVA, Canonical Variate Analysis) εξηγούν το 74.60% της διακύμανσης του σχήματος σώματος. Οι διαφορές σχήματος μεταξύ των θερμοκρασιακών συνθηκών δεν ήταν αποτέλεσμα των διαφορών μεγέθους (CS). Οι θερμοκρασιακές συνθήκες ομαδοποιήθηκαν κατά μήκος των δύο πρώτων αξόνων ως εξής: (α) η συνθήκη με την 22, (β) η συνθήκη με την 16 και (γ) η συνθήκη με την 19. Είναι η πρώτη φορά για το είδος που αποδεικνύεται η θερμοκρασιακή επίδραση κατά τα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια στη πλαστικότητα του σχήματος σώματος των ιχθυδίων. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ετερόχρονη θερμοκρασιακή επίδραση έχει ως αποτέλεσμα τη μεταβολή του σχήματος σώματος μετά και από βδομάδες, κατά το στάδιο του ιχθυδίου. Με άλλα λόγια η επίδραση της θερμοκρασίας στο αναπτυξιακό παράθυρο του εμβρύου μέχρι το τέλος του λεκιθοφόρου σταδίου, είναι καθοριστική για το μετέπειτα μορφότυπο των οργανισμών. Σημαντική είναι και η θερμοκρασιακή επίδραση κατά το αναπτυξιακό παράθυρο του εμβρύου μέχρι το στάδιο της μεταμόρφωσης. Η επίδραση της θερμοκρασίας κατά τα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια στο μετέπειτα μορφότυπο των ιχθυδίων αποδείχθηκε στο παρελθόν για το δεύτερο σημαντικότερο είδος της Μεσογειακής ιχθυοκαλλιέργειας, το λαβράκι (Georgakopoulou et al. 2007). Στην εργασία αυτή αποδείχθηκε για πρώτη φορά ότι τα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια είναι ιδιαίτερα πλαστικά όσον αφορά το σχήμα σώματος και καθοριστικά για το σχήμα σώματος των μετέπειτα σταδίων. Αναλυτικότερα η θερμοκρασιακή συνθήκη των 15 C, είχε ως αποτέλεσμα την καθιέρωση ενός επιμήκη μορφότυπου και την οπίσθιο-κοιλιακή μετατόπιση των βάσεων των πτερυγίων, σε σχέση με την θερμοκρασιακή συνθήκη των 20 C. Οι συγγραφείς αποδίδουν τις πιο πάνω μεταβολές στο γενικότερο πλαίσιο της λειτουργικής μορφολογίας (functional morphology) και ειδικότερα στην κολυμβητική προσαρμογή των οργανισμών. Τα αποτελέσματα των Georgakopoulou et al. (2007) έρχονται σε πλήρη συμφωνία με τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας, όπου παρατηρήθηκε ότι οι χαμηλότερες θερμοκρασιακές συνθήκες καθιέρωσαν ένα επιμήκη μορφότυπο. Η επιμήκυνση του σώματος εντάσσεται στο γενικότερο πλαίσιο της οικομορφολογίας (ecomorphology) και αποτελεί αντικείμενο έρευνας από τον 19 ο αιώνα όπου αναπτύχθηκε ο «Νόμος των σπονδύλων» από τον Jordan (1892). Σύμφωνα με αυτόν, τα είδη των υψηλότερων γεωγραφικών πλατών τείνουν να έχουν μεγαλύτερο αριθμό σπονδύλων. Ο νόμος αυτός συμπληρώνει τον νόμο του Bergmann όπου αναφέρεται ότι το μέγεθος αυξάνει επίσης με το γεωγραφικό πλάτος (ανασκόπηση από Ray, 1960). Οι δύο νόμοι ενοποιήθηκαν από τον Lindsey (1975), όπου ανάπτυξε την ιδέα του «πλεομερισμού» όπου συσχετίζει το μέγεθος με τον αριθμό των σπονδύλων (τα 71

73 μεγαλύτερα ψάρια έχουν περισσότερους σπονδύλους). Σημαντικό είναι το γεγονός ότι ο Jordan συνέδεσε τον αριθμό των σπονδύλων με την κολυμβητική δραστηριότητα, όπου χρησιμοποιώντας ως παράδειγμα τα χελιόμορφα απέδωσε τον μεγάλο αριθμό σπονδύλων στην υποστήριξη της κολύμβησης. Το φαινόμενο αυτό φαίνεται να ισχύει για τα ανάδρομα είδη όπως ο σολωμός, όπου η μετάβαση από τα μεταβατικά ύδατα προς την θάλασσα ακολουθείται από αύξηση των σπονδύλων και επιμήκυνση του σχήματος σώματος (Beeman et al. 1994, Sagnes et al. 2000), γεγονός που μπορεί να σχετίζεται με την μεταβολή της κολυμβητικής δραστηριότητας. Το ίδιο φαινόμενο ισχύει και για το είδος Gasterosteus aculeatus όπου η μετάβασή του από τα ζεστότερα πελαγικά νερά προς τα κρύα μεταβατικά ύδατα ακολουθείται από επιμήκυνση του σχήματος σώματος (Lainonen et al. 2006). Τα ίδια αποτελέσματα έχουν παρατηρηθεί και στην εργασία των Morinville & Rasmussen (2008) για το είδος Salvelinus fontinalis, όπου απέδειξαν ότι οι πληθυσμοί κατά τη μετανάστευσή τους αλλάζουν το σχήμα σώματος τους σταδιακά ώστε να ανταποκρίνεται στην αλλαγή της ταχύτητας των ρευμάτων. Αντίθετα για τους πληθυσμούς του ίδιου είδους που δεν μεταναστεύουν δεν παρατηρήθηκε το ίδιο φαινόμενο. Φαίνεται λοιπόν ότι το επιμήκες σχήμα σώματος σχετίζεται με τις αυξανόμενες υδροδυναμικές συνθήκες ως προσαρμοστικός μηχανισμός μείωσης της τριβής και του ενεργειακού κόστους της κολύμβησης (Pettersson & Brοnmark, 1999). Στην παρούσα εργασία οι παρατηρούμενες αλλαγές στο σχήμα σώματος οφείλονται αποκλειστικά και μόνον στην επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης. Τα αποτελέσματα μπορούν να θεωρηθούν ως αναμενόμενα, δεδομένου ότι οι ιχθύες ως ποικιλόθερμοι οργανισμοί είναι ιδιαίτερα ευάλωτοι στις θερμοκρασιακές αλλαγές, ειδικότερα κατά τα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια (Lõhmus et al. 2010) ρυθμίζοντας τους μεταβολικούς ρυθμούς, την κατανάλωση οξυγόνου, το ρυθμό αύξησης και άλλες φυσιολογικές διεργασίες (Pοrtner & Farrell, 2008). Η αποδοτικότητα (performance) των οργανισμών ενδέχεται να μεγιστοποιηθεί υπό βέλτιστες θερμοκρασιακές συνθήκες, με αποτέλεσμα τη γρήγορη αύξηση και διαφοροποίηση και την επακόλουθη εποίκηση νέων ενδιαιτημάτων. Παρόλα αυτά, οι Lõhmus et al. (2010) κατόπιν της μελέτης της επίδρασης του ρυθμού αύξησης στο σχήμα σώματος, βρήκαν ότι οι ταχυαυξείς οργανισμοί καθιερώνουν ένα μορφότυπο που δεν μπορεί να θεωρείται ως ο ιδανικός για την αντιθηρευτική προσαρμογή τους. Αντίθετα οι οργανισμοί που αναπτύσσονται με πιο αργούς ρυθμούς τείνουν να καθιερώνουν ένα σχήμα σώματος ιδανικό για την αποφυγή των θηρευτών. Σε αυτή την παρατήρηση συμφωνούν και οι Bosworth & Wolters (2005), οι οποίοι συνέδεσαν το σχήμα σώματος με τη διαθεσιμότητα τροφής και προτείνουν ότι όταν ευνοείται η αύξηση δεν είναι απαραίτητη η καθιέρωση ενός αντιθηρευτικού μορφότυπου. Η θερμοκρασία ανάπτυξης εκτός από την επίδραση που έχει στο χρονισμό των αναπτυξιακών γεγονότων (Johnston et al. 2001, Koumoundouros et al. 2001, Green & Fisher, 2004), στο φυλοκαθορισμό (Conover & Heins, 1987, Koumoundouros et al., 2002) και στον καθορισμό του μορφότυπου (Georgakopoulou et al., 2007, Georga & Koumoundouros, 2010), επηρεάζει και την συχνότητα εμφάνισης των σκελετικών 72

74 δυσπλασιών. Στην παρούσα εργασία το σχήμα σώματος μελετήθηκε σε φυσιολογικά άτομα, αλλά η συσχέτιση των αποτελεσμάτων (σχήμα σώματος) με αυτά (σκελετικές παραμορφώσεις) των Georgakopoulou et al. (2010) δείχνει ξεκάθαρα ότι εκτός της μεγάλης επικάλυψης των θερμοκρασιακών παραθύρων εντός των ομαδοποιήσεων (Εικόνα 4.2), οι πληθυσμοί της ομαδοποίησης α (19-22, 22, Εικόνα 4.2) εμφάνισαν παρόμοια συχνότητα (35-39%) παραμόρφωσης του ραχιαίου πτερυγίου, ενώ οι πληθυσμοί της ομαδοποίησης γ (16-19, 19, Εικόνα 4.2) εμφάνισαν παρόμοια συχνότητα (8-10%) της παραμόρφωσης της αιματικής λόρδωσης. Δημιουργείται λοιπόν η υποψία ότι η συχνότητα της παραμόρφωσης παρόλο που δεν είναι ορατή στα φυσιολογικά άτομα εντός ενός πληθυσμού, ουσιαστικά καθορίζει και τον φυσιολογικό φαινότυπο εντός ενός ορίου που δεν θεωρείται ως παραμόρφωση. Για να επιβεβαιωθεί η θεωρία αυτή θα πρέπει να πραγματοποιηθούν περαιτέρω μορφομετρικές αναλύσεις στους πληθυσμούς ειδικότερα για το ραχιαίο πτερύγιο (ομαδοποίηση α) και για την γωνία της σπονδυλικής στήλης (ομαδοποίηση γ). Εικόνα 4.2: Ο πειραματικός σχεδιασμός της εργασίας των Georgakopoulou et al και οι post-hoc ομαδοποιήσεις κατόπιν της ανάλυσης του σχήματος σώματος. Μεταξύ των ομαδοποιήσεων α και γ παρατηρείται και επικάλυψη των θερμοκρασιακών παραθύρων. Όσον αφορά στην ομαδοποίηση β (16, 22-19, Εικόνα 4.2), δεν μπορεί να δοθεί σαφής εξήγηση ούτε από τα αποτελέσματα της επικάλυψης των θερμοκρασιακών παραθύρων του πειραματικού σχεδιασμού των Georgakopoulou et al. (2010), ούτε από τα επακόλουθα αποτελέσματα παραμορφώσεων. Κατόπιν όμως της παρατήρησης ότι το σχήμα σώματος αυτής της ομαδοποίησης ήταν το «ποιοτικότερο», υπό την έννοια ότι δεν παρατηρούνταν μεγάλες μεταβολές των σκελετικών στοιχείων από το μέσο σχήμα, δημιουργήθηκε η υποψία ότι η επιλογή επέδρασε στο φαινόμενο αυτό. Πράγματι παρατηρήθηκε ότι η μεγαλύτερη θερμοκρασιακή συνθήκη (22-19) εμφάνισε πολύ μεγάλους ρυθμούς θνησιμότητας (95%), ενώ η μικρότερη (16) είχε πολύ μεγάλα ποσοστά (55%) της παραμόρφωσης του βραγχιακού επικαλύμματος. 73