ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΒΑΣΙΛΙΚΗΣ ΠΑΠΩΤΗ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΒΑΣΙΛΙΚΗΣ ΠΑΠΩΤΗ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΑΞΙΟΠΟΙΗΣΗ ΒΙΟΕΝΕΡΓΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ ΙΑΤΡΟΦΗΣ ΜΕ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ. Η ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΤΗΣ Olea europaea L. Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 29

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΒΑΣΙΛΙΚΗΣ ΠΑΠΩΤΗ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΑΞΙΟΠΟΙΗΣΗ ΒΙΟΕΝΕΡΓΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ ΙΑΤΡΟΦΗΣ ΜΕ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ. Η ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΤΗΣ Olea europaea L. Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων του Τοµέα Χηµικής Τεχνολογίας και Βιοµηχανικής Χηµείας του Τµήµατος Χηµείας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης και υλοποιήθηκε στο πλαίσιο του Μέτρου 8.3 του Ε. Π. Ανταγωνιστικότητα Γ Κοινοτικό Πλαίσιο Στήριξης και συγχρηµατοδοτήθηκε κατά 75% της ηµόσιας απάνης από την Ευρωπαϊκή Ενωση - Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταµείο και κατά 25% της ηµόσιας απάνης από το Ελληνικό ηµόσιο - Υπουργείο Ανάπτυξης Γενική Γραµµατεία Έρευνας και Τεχνολογίας. Ηµεροµηνία προφορικής εξέτασης: 25/6/29 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αναπλ. Καθηγήτρια Μ. Τσιµίδου Επιβλέπουσα καθηγήτρια Καθηγητής I. Γεροθανάσης Μέλος συµβουλευτικής επιτροπής Αναπλ. Καθηγητής Β. Κιοσέογλου Μέλος συµβουλευτικής επιτροπής Καθηγητής Ι. Θεριός Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης Αναπλ. Καθηγητής Γ. Μπλέκας Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης Επικ. Καθηγήτρια Α. Χίου Χαροκόπειο Πανεπιστήµιο Αθηνών Λέκτορας Α. Ασηµοπούλου Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης

3 Η επταµελής εξεταστική επιτροπή, που ορίστηκε από τη Γ.Σ.Ε.Σ του τµήµατος Χηµείας (26/ ) για την κρίση της ιδακτορικής ιατριβής της κ. Βασιλικής Παπώτη, Χηµικού, κατόχου Μ..Ε. ιαπανεπιστηµιακού - ιατµηµατικού Μ.Π.Σ.: Xηµική Ανάλυση-Έλεγχος Ποιότητας συνήλθε σε συνεδρίαση στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο την 25 Ιουνίου 29, όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της διατριβής της µε τίτλο: «Αξιοποίηση βιοενεργών ενώσεων στην παραγωγή σκευασµάτων διατροφής µε λειτουργικές ιδιότητες. Η περίπτωση των φύλλων της Olea europaea L.». Η επιτροπή έκρινε οµόφωνα ότι η διατριβή είναι πρωτότυπη και αποτελεί ουσιαστική συµβολή στην πρόοδο της επιστήµης. ΤΑ ΜΕΛΗ ΤΗΣ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Αναπλ. Καθηγήτρια Μ. Τσιµίδου (Επιβλέπουσα Καθηγήτρια) Καθηγητής Ι. Γεροθανάσης (Μέλος Συµβουλευτικής Επιτροπής) Αναπλ. Καθηγητής Β. Κιοσέογλου (Μέλος Συµβουλευτικής Επιτροπής) Καθηγητής Ι. Θεριός Αναπλ. Καθηγητής Γ. Μπλέκας Επικ. Καθηγήτρια Α. Χίου Λεκτόρισσα Α. Ασηµοπούλου

4 Βασιλική Θ. Παπώτη ΑΠΘ Αξιοποίηση βιοενεργών ενώσεων στην παραγωγή σκευασµάτων διατροφής µε λειτουργικές ιδιότητες. Η περίπτωση των φύλλων της Olea europaea L. ISBN «Η έγκριση της παρούσης ιδακτορικής ιατριβής από το Τµήµα του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωµών του συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 22, παρ.2)

5 Στην οικογένειά µου Θεοχάρη, Παρασκευούλα & Αναστασία, και στον π. Συµεών Κ.

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Κύριος στόχος της διατριβής ήταν η αξιολόγηση του αντιοξειδωτικού δυναµικού των φύλλων της Olea europaea L. µε σκοπό τη µελλοντική αξιοποίησή τους στην παραγωγή σκευασµάτων διατροφής µε λειτουργικές ιδιότητες. Η διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων του Τµήµατος Χηµείας του Α.Π.Θ. µε την επιστηµονική επίβλεψη της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας κ. Μαρίας Τσιµίδου και υλοποιήθηκε στο πλαίσιο του Μέτρου 8.3 του Ε. Π. Ανταγωνιστικότητα Γ Κοινοτικό Πλαίσιο Στήριξης (ΠΕΝΕ 23) µε συγχρηµατοδότηση κατά 75% της ηµόσιας απάνης από την Ευρωπαϊκή Ενωση - Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταµείο και κατά 25% της ηµόσιας απάνης από το Ελληνικό ηµόσιο - Υπουργείο Ανάπτυξης - Γενική Γραµµατεία Έρευνας και Τεχνολογίας. Ευχαριστώ ολόθερµα την επιβλέπουσα καθηγήτρια και η επιστηµονικώς υπεύθυνη του έργου (για το ΑΠΘ) κ. Μ. Τσιµίδου για την καθοριστική συµβολή της τόσο στην ολοκλήρωση της διατριβής, όσο και στη συγγραφή και επιµέλεια του δοκιµίου. Της είµαι ιδιαίτερα ευγνώµων για τη δυνατότητα που µου παρείχε να συµµετέχω στο ερευνητικό έργο εξασφαλίζοντάς µου οικονοµική βοήθεια και πολύτιµη επιστηµονική εµπειρία. Για τη διαρκή, ουσιαστική επίβλεψη και καθοδήγησή της, τις πολυδιάστατες συµβουλές της, το ενδιαφέρον της, τις εµπειρίες και γνώσεις που µου µετέδωσε, αλλά και το αίσθηµα ασφάλειας που µου παρείχε καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής την ευχαριστώ ειλικρινά από καρδιάς. Είναι ιδιαίτερα σηµαντικό για µένα το γεγονός ότι από τη συνάντηση αυτή αποκόµισα όχι µόνο εµπιστοσύνη στο επιστηµονικό µου υπόβαθρο και τις δυνατότητές µου, αλλά και λαχτάρα για την ωραία τέχνη, τις όµορφες εικόνες, την ποίηση και τις µελωδίες. Ο ζήλος, το ήθος, η ακεραιότητα και συνέπεια που τη διακρίνουν θα αποτελούν για µένα φωτεινό παράδειγµα στη µετέπειτα πορεία µου. Ευχαριστώ επίσης θερµά, τον Καθηγητή κ. Ιωάννη Γεροθανάση (Τµήµα Χηµείας Πανεπιστήµιο Ιωαννίνων), µέλος της συµβουλευτικής µου επιτροπής και ο επιστηµονικώς υπεύθυνο του έργου, για τη συνεργασία µας, τις εύστοχες διορθώσεις του στο δοκίµιο της διατριβής, αλλά και την προθυµία και άµεση ανταπόκρισή του, παρά τον φόρτο των πρυτανικών του καθηκόντων, καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής. i

7 Επίσης, θα ήθελα να εκφράσω θερµές ευχαριστίες στον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Βασίλειο Κιοσέογλου (Τµήµα Χηµείας ΑΠΘ), µέλος της συµβουλευτικής µου επιτροπής, για τις εύστοχες διορθώσεις στο δοκίµιο της διατριβής, για το ενδιαφέρον του και τις γνώσεις που µου µετέδωσε καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών µου. Τον Καθηγητή κ. Ιωάννη Θεριό (Γεωπονική Σχολή, ΑΠΘ), µέλος της εξεταστικής µου επιτροπής, ευχαριστώ ειλικρινά τόσο για τις χρήσιµες διορθώσεις στο δοκίµιο της διατριβής, όσο και για τις πολύτιµες γνώσεις που µου µετέδωσε για την ελαιοκοµία και τη φυσιολογία των φύλλων της ελιάς. Τον ευχαριστώ επίσης για τη χορήγηση φυτικού υλικού από τον Πανεπιστηµιακό ελαιώνα του ΑΠΘ, καθώς και για τη βοήθειά του κατά τη συλλογή του υλικού αυτού. Θερµές ευχαριστίες οφείλω επίσης και στον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γεώργιο Μπλέκα (Τµήµα Χηµείας, ΑΠΘ), µέλος της εξεταστικής µου επιτροπής, για τις εποικοδοµητικές παρατηρήσεις και διορθώσεις στο δοκίµιο, για το ενδιαφέρον που έδειξε και τις γνώσεις που µου µετέδωσε καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών µου. Τα µέλη της εξεταστικής µου επιτροπής την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Αντωνία Χίου (Τµήµα Επιστήµης ιαιτολογίας και ιατροφής, Χαροκόπειο Πανεπιστήµιο Αθηνών) και την Λέκτορα κ. Ανδρεάνα Ασηµοπούλου (Τµήµα Χηµικών Μηχανικών, ΑΠΘ) θα ήθελα να ευχαριστήσω επίσης για τις εύστοχες παρατηρήσεις τους και το αµέριστο ενδιαφέρον. Ευχαριστώ επίσης τον καθηγητή Α-ΤΕΙΘ κ. Αθανάσιο Ρούµπο για την υπόδειξη του πειραµατικού ελαιώνα στον Άγιο Μάµα Χαλκιδικής, αλλά και για τις ωφέλιµες συµβουλές του στον τοµέα της ελαιοκοµίας και της φυσιολογίας των φύλλων της ελιάς. θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την ρ. κ. Βασιλική Εξάρχου (Κέντρο NMR, Π.Ι.) και τον υποψήφιο διδάκτορα κ. Βλάση Γούλα για την εξαιρετική συνεργασία µας στο πλαίσιο του έργου, την ανταλλαγή γνώσεων και εµπειριών, τη στενή συνεργασία µας σε µέρος της πειραµατικής διαδικασίας και τη φιλική τους διάθεση. Την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Πηνελόπη Μαυραγάνη-Τσιπίδου (Τµήµα Βιολογίας, ΑΠΘ) ευχαριστώ για την αµεσότητα της συνεργασίας µας, τις χρήσιµες συµβουλές της και τη φιλική της διάθεση κατά τη διεξαγωγή πειράµατος ελέγχου της µεταλλαξιγόνου και ανασυνδυαστικής δράσης εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς. ii

8 Το συνάδελφο και φίλο ρ. Νίκο Νενάδη θα ήθελα από καρδιάς να ευχαριστήσω για την επιστηµονική συµβολή του και τις εποικοδοµητικές υποδείξεις του τόσο κατά την εκπαίδευσή µου σε αναλυτικές µεθόδους, όσο και καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής. Τον ευχαριστώ επίσης για την άψογη συνεργασία µας κατά τη διεξαγωγή πειράµατος ελέγχου της αντιοξειδωτικής ικανότητας φυτικών εκχυλισµάτων µέσω δοκιµής επιταχυνόµενης οξείδωσης λιποσωµάτων, καθώς και για τις εύστοχες παρατηρήσεις του, το ενδιαφέρον και τη συµπαράστασή του κατά τη διάρκεια συγγραφής της διατριβής. Τις συναδέλφους και φίλες ρ. Στέλλα Ορδούδη και την Λέκτορα Φανή Μαντζουρίδου ευχαριστώ επίσης από καρδιάς για τη βοήθειά τους, τις χρήσιµες συµβουλές και υποδείξεις τους, σε επιστηµονικό και προσωπικό επίπεδο, καθώς και για την προθυµία τους να µε ενθαρρύνουν και διευκολύνουν σε δύσκολες στιγµές. Τη ρ. Στέλλα Ορδούδη θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω για την εκπαίδευσή µου σε ορισµένες αναλυτικές µεθόδους. Ευχαριστώ επίσης, τις κ. Ε. Ναζίρη και κ. Ε. Περιφάντση, καθώς και όλους τους συναδέλφους-µέλη του Εργαστηρίου Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων, παλαιότερους και νεότερους για τη συναδελφική και φιλική τους διάθεση. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον υποψήφιο διδάκτορα κ. Κ. Ρούµπο για τη βοήθειά του στη σωστή απόδοση γεωπονικών όρων. Για την ιδιαίτερα ζεστή ατµόσφαιρα συνεργασίας, τη βοήθειά τους, την ανταλλαγή γνώσεων και εµπειριών και τη φιλία τους, ευχαριστώ επίσης τους τότε µεταπτυχιακούς φοιτητές Ο. Λαζαρίδου, Α. Ανδρουλάκη, Μ. Χαλαστάρα και Α. Μ. Inarejos-Garcia, καθώς και τους προπτυχιακούς φοιτητές Κ. Παπαγιάννη και Σ. Ξυστούρη. Θα ήταν µεγάλη παράλειψη να µην εκφράσω την ευγνωµοσύνη µου στον αείµνηστο Αναπληρωτή Καθηγητή Γεώργιο οξαστάκη, τον άνθρωπο που µε βοήθησε να ανακαλύψω το ιδιαίτερο ενδιαφέρον µου για την έρευνα κατά τη διάρκεια των σπουδών µου. Όλους τους στενούς µου φίλους ευχαριστώ ολόθερµα για την αγάπη τους και την πίστη τους σε µένα. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τις καρδιακές µου φίλες Βίκυ Στεργιανούδη και Άννα Καρυπίδου για την κατανόησή τους, τη ψυχολογική συµπαράσταση και τη διαρκή τους ενθάρρυνση για το καλύτερο. Στη Βίκυ Σ. χρωστώ επίσης την ορθότερη παρουσίαση των αρχικών κειµένων της διατριβής χάρη στη φιλολογική της επιµέλεια. iii

9 Τέλος, εκφράζω την ευγνωµοσύνη µου στην οικογένειά µου για την αµέριστη αγάπη τους, την κατανόησή τους και τη διαρκή συµπαράσταση και ενθάρρυνσή τους σε κάθε µου βήµα. Τον π. Συµεών Κραγιόπουλο, µια µορφή που αποτελεί για µένα πηγή έµπνευσης και δύναµης, θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω για την αγάπη του και τη διαρκή ενθάρρυνσή του για το καλύτερο. Θεσσαλονίκη, Ιούνιος 29 Βίκυ Παπώτη iv

10 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ Α : ρίζα φαινολικού αντιοξειδωτικού AAPH: 2,2 - azobis (2-amino-propane) dihydrochloride ABTS: 2,2 -azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ΑCN: acetonitrile AH: φαινολικό αντιοξειδωτικό AIBN: 2,2 - azobis- isobutyronitrile AMVN: 2,2 - azobis (2,4-dimethylvaleronitrile) ΑΠΘ: Aριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης AY: Αριθµός Υπεροξειδίων. ΓΑΛ: γαλλικό oξύ CBA: crocin bleaching assay DAD: diode array detector 3,4 DHPEA-EA: 3,4-(dihydroxyphenyl)ethanol elenolic acid ester 3,4 DHPEA-EDA: 3,4-dihydroxyphenylethyl 4-formyl-3-formylmethyl- 4-hexenoate DMPD: N,N -dimethyl-p-phenylendiamine dihydrochloride DMSO: dimethyl sulfoxide DNA: deoxyribonucleic acid DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (radical) ε.: εκχυλίσµατος EDTA: ethylene diamine tetra acetic acid EMS: ethyl methanesulfonate ET: electron transfer EtOH: ethanol F-C: Folin-Ciocalteu FDA: Food and Drug Administration flr3: flare HAT: hydrogen atom transfer HPLC: High Performance Liquid Chromatography Inh: inhibition ΚΑΦ: καφεϊκό οξύ LC-MS: Liquid Chromatography Mass Spectrometry v

11 LOD: limit οf detection LOQ: limit of quantification Μ: µέταλλο MeOH: methanol mwh: multiple wing hair NMR: Nuclear Magnetic Resonance ν. υ.: νωπού υλικού ξ. υ.: ξηρού υλικού O. europaea L.: Olea europaea L. ΟΛ: ελαιοευρωπαΐνη ORAC: oxygen radical absorbance capacity ΟΦ: ολικές φαινόλες ΟΦΛ: ολικά φλαβονοειδή PB: phosphate buffer PBS: phosphate buffer saline ΠΕ: πολικό εκχύλισµα ελαιολάδου RH: λιπαρό υπόστρωµα RO : αλκοξυ ρίζα ROO : υπεροξυ ρίζα RΟΟH: υδροϋπεροξείδια RP-HPLC: Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography SFE: supercritical fluid extraction SMART: somatic mutation and recombination test ΤΑΝ: ταννικό οξύ ΤΥ: τυροσόλη UV: Ultraviolet Vis: Visible Χ. Χαλκιδικής: Χονδρολιά Χαλκιδικής vi

12 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σελίδα Σχήµα 1.1. Βασική δοµή φλαβονοειδών (Malešev & Kuntić, 27). 18 Σχήµα 1.2. Βιοσύνθεση ελαιοευρωπαΐνης (Damtoft et al., 1993, Soler- Rivas et al., 2). 18 Σχήµα 1.3. Αντίδραση DPPH - αντιοξειδωτικού και σχηµατισµός DPPH- H (Μοοn & Shibamoto, 29). 21 Σχήµα 1.4. Σχηµατισµός της κατιοντικής ρίζας ABTS + (Μοοn & Shibamoto, 29). 22 Σχήµα 1.5. Σχηµατική αναπαράσταση Α) σχηµατισµού λιποσώµατος α, φωσφολιπίδιο (αµφίφιλο µόριο µε ταυτόχρονη παρουσία υδρόφιλου και υδρόφοβου τµήµατος), β, διπλοστιβάδα, γ, λιπόσωµα, Β) βιολογικής 24 µεµβράνης. Σχήµα 1.6. Κέντρα συµπλοκοποίησης φλαβονοειδών-µετάλλων (Pietta, 2). 26 Σχήµα 1.7. Σχηµατισµός συµπλόκων φλαβονοειδών - AlCl 3 παρουσία και απουσία οξέος (Markham & Marby, 1968). 27 Σχήµα 1.8. Βασική δοµή φαινολικών αντιοξειδωτικών (Rappoport, 23). 28 Σχήµα 1.9. Μετατροπή ελαιοευρωπαΐνης σε δύο µορφές ελενολικού οξέος και υδροξυτυροσόλη (Briante et al., 22a). 43 Σχήµα 1.1. Πιθανές αλληλοµετατροπές µεταξύ διαφόρων φαινολικών συστατικών των προϊόντων της ελιάς (Paiva-Martins & Gordon, 21, 45 Ryan et al., 23). Σχήµα 3.1. Αφέψηµα φύλλων ελιάς. 75 Σχήµα 3.2. Χυµός από φύλλα ελιάς (φωτογραφία Β. Παπώτη). 76 Σχήµα 4.1. Σχηµατική απεικόνιση του φαινοµένου της φωταύγειας (Lakowicz, 1999). 96 Σχήµα 4.2. Φάσµατα εκποµπής δείγµατος ΠΕ που λήφθηκαν για διαφορετικές τιµές απόκρισης (χρόνου, ταχύτητας και ευαισθησίας) του 99 οργάνου. Σχήµα 4.3. Εξισώσεις γραµµικής συσχέτισης της συγκέντρωσης 12 vii

13 µεθανολικών, αιθανολικών, υδατοµεθανολικών (ΜeOH/H 2 O, 6/4), υδατοαιθανολικών (EtOH/H 2 O, 5/5) και υδατικών διαλυµάτων ΟΛ µε την ένταση φθορισµού τους. Σχήµα 4.4. ιαγραµµατική απεικόνιση της αντοχής της φθορισµοµετρικής µεθόδου στο χρόνο. Γραµµική συσχέτιση της συγκέντρωσης της ΟΛ σε µεθανολικό διάλυµα µε την ένταση φθορισµού. Σχήµα 4.5. Συσχέτιση φθορισµοµετρικών και χρωµατοµετρικών αποτελεσµάτων εκτίµησης των ολικών πολικών φαινολών σε εκχυλίσµατα φύλλων και καρπών ελιάς. Σχήµα 4.6. Υδατικό, υδατοαιθανολικό και αιθανολικό εκχύλισµα φύλλων ελιάς (φωτογραφία Β. Παπώτη). Σχήµα 4.7. Χαρακτηριστικά UV-Vis φασµάτων πολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς: ΜeOH, ΜeOH/H 2 O (5/5), ΜeOH/χρήση ενεργού C, ΜeOH/H 2 O/χρήση ενεργού C, ΜeOH/πλύση µε εξάνιο. Σχήµα 4.8. Χαρακτηριστικά UV-Vis φασµάτων πολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς: ΜeOH, ΜeOH/H 2 O (5/5), ΜeOH/1 η πλύση µε εξάνιο, ΜeOH/2 η πλύση µε εξάνιο, ΜeOH/3 η πλύση µε εξάνιο, ΜeOH/4 η πλύση µε εξάνιο. Σχήµα 4.9. Υγροχρωµατογραφικό προφίλ υδατοµεθανολικού και µεθανολικού (28 nm) εκχυλίσµατος φύλλων ελιάς (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα Ι). Σχήµα 4.1. Αντιπροσωπευτικό υγροχρωµατογράφηµα υδατοµεθανολικού εκχυλίσµατος φύλλων ελιάς στα 28 και 335 nm και 28/32 nm (λ exc. /λ emis. ) (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα ΙΙ). Σχήµα Υγροχρωµατογράφηµα στα 28 nm υδατοµεθανολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς από 12 ποικιλίες (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα ΙΙ). Σχήµα Υγροχρωµατογράφηµα στα 245 nm υδατοµεθανολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς από ποικιλίες µε υψηλά (Αµφίσσης, Βασιλικάδα), µέτρια (Αδραµυτινή) και χαµηλά (Κορωνέϊκη) επίπεδα ΟΛ (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα ΙΙ). Σχήµα Υγροχρωµατογράφηµα στα 28 και 335 nm και 28/32 nm (λ exc. /λ emis. ) υδατοµεθανολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς. είγµατα viii

14 ποικιλίας Κορωνέϊκη (αριστερά) και Χ. Χαλκιδικής (δεξιά), δένδρα από 3 διαφορετικές οµάδες (Α, Β και Γ) (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα ΙΙ). Σχήµα Υγροχρωµατογράφηµα στα 245 nm υδατοµεθανολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς ποικιλιών Αµφίσσης, Βασιλικάδα, Αδραµυτινή και Χ. Χαλκιδικής (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα ΙΙ). Συγκριτική παρουσίαση δειγµάτων πρώτης και δεύτερης δειγµατοληψίας. Σχήµα Υγροχρωµατογράφηµα στα 28 και 335 nm και 28/32 nm (λ exc. /λ emis. ) µεθανολικών εκχυλισµάτων που παραλήφθηκαν από νέα, ώριµα, παλιά και κίτρινα φύλλα ελιάς (Χ. Χαλκιδικής, Ελαιώνας ΑΠΘ, δειγµατοληψία Οκτώβριος 27, υγροχρωµατογραφικό σύστηµα ΙΙ). Σχήµα Συγκριτική παρουσίαση υγροχρωµατογραφηµάτων στα 28 και 335 nm υδατοµεθανολικών εκχυλισµάτων που παραλήφθηκαν από νέα, ώριµα, παλιά και κίτρινα φύλλα ελιάς που συλλέχθηκαν σε δύο διαφορετικές περιόδους (Οκτώβριος 27, Απρίλιος 28) (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα ΙΙ). Σχήµα Συγκριτική παρουσίαση υγροχρωµατογραφηµάτων στα 335 nm µεθανολικών εκχυλισµάτων που παραλήφθηκαν από νέα φύλλα ελιάς δύο ποικιλιών, σε τρεις διαφορετικές χρονικές περιόδους συλλογής (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα Ι). Σχήµα Συγκριτική παρουσίαση υγροχρωµατογραφηµάτων µεθανολικών εκχυλισµάτων στα 28 nm που παραλήφθηκαν από νέα φύλλα ελιάς (ποικιλίας Κορωνέϊκη) που συλλέχθησαν το διάστηµα Ιούνιος-Νοέµβριος 26 (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα Ι). Σχήµα Συγκριτική παρουσίαση υγροχρωµατογραφηµάτων στα 335 nm µεθανολικών εκχυλισµάτων που παραλήφθηκαν από νέα φύλλα ελιάς (ποικιλίας Κορωνέϊκη) που συλλέχθησαν το διάστηµα Ιούνιος-Νοέµβριος 26 (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα Ι). Σχήµα 4.2. Συγκριτική παρουσίαση υγροχρωµατογραφηµάτων στα 28/32 nm (λ exc. /λ emis. ) µεθανολικών εκχυλισµάτων που παραλήφθηκαν από νέα φύλλα ελιάς (ποικιλίας Κορωνέϊκη) που συλλέχθησαν το διάστηµα Ιούνιος-Νοέµβριος 26 (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα Ι). Σχήµα Συγκριτική παρουσίαση υγροχρωµατογραφηµάτων στα 245 nm µεθανολικών εκχυλισµάτων που παραλήφθηκαν από νέα φύλλα ελιάς ix

15 (ποικιλίας Κορωνέϊκη) που συλλέχθησαν το διάστηµα Ιούνιος-Νοέµβριος 26 (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα Ι). Σχήµα Συγκριτική παρουσίαση υγροχρωµατογραφηµάτων στα 28 και 335 nm µεθανολικών εκχυλισµάτων που παραλήφθηκαν από καρπούς ελιάς (ποικιλίας Κορωνέϊκη) που συλλέχθησαν το διάστηµα Ιούνιος- Νοέµβριος 26 (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα Ι). Σχήµα Υγροχρωµατογράφηµατα στα 254, 28, 335, και 517 nm µεθανολικών εκχυλισµάτων που παραλήφθηκαν από φύλλα ελιάς διαφόρων ηλικιών (Οκτώβριος 27, υγροχρωµατογραφικό σύστηµα IV). Σχήµα Υγροχρωµατογράφηµατα στα 254, 28 και 335 nm µεθανολικών εκχυλισµάτων που παραλήφθηκαν από παλιά φύλλα ελιάς (Οκτώβριος 27, υγροχρωµατογραφικό σύστηµα IV) α) πριν και β) µετά την on line αντίδραση µε τη ρίζα DPPH. Σχήµα Υγροχρωµατογράφηµατα στα 245, 28, 335 nm και 28/32 nm (λ exc. /λ emis. ) πολικών εκχυλισµάτων (αφέψηµα, έγχυµα, βάµµα) που παραλήφθηκαν από αντιπροσωπευτικό δείγµα φύλλων ελιάς. Σχήµα 4.26 Επιταχυνόµενη οξείδωση λιποσωµάτων λεκιθίνης στους 37 ο C παρουσία αφεψηµάτων, εγχυµάτων και βαµµάτων φύλλων ελιάς, καθώς και ελαιοευρωπαΐνης σε τρία επίπεδα συγκεντρώσεων. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Σχήµα Π.1. Σχηµατική αναπαράσταση του πειραµατικού ελαιώνα του Σταθµού Γεωργικής Έρευνας στον Άγιο Μάµα Χαλκιδικής. Σχήµα Π.2. Οργανολογία για την On line εκτίµηση της ικανότητας των επιµέρους συστατικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς να δεσµεύουν τη ρίζα DPPH µετά από διαχωρισµό τους µε RP-HPLC. Σχήµα Π.3. Υγροχρωµατογραφικό προφίλ µεθανολικού εκχυλίσµατος φύλλων ελιάς στα 28 και 335 nm (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα ΙI). Το εκχύλισµα αξιοποιήθηκε κατά τον έλεγχο της ασφαλούς χρήσης πολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς (SMART test) x

16 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1.1. Ορισµοί φαρµακευτικού ιδιοσκευάσµατος, φαρµάκου, παραδοσιακού φαρµάκου φυτικής προέλευσης, φαρµάκου φυτικής προέλευσης, φυτικών ουσιών, φυτικών παρασκευασµάτων, τροφίµων ειδικής διατροφής, νέων τροφίµων Πίνακας 1.2. ηµοσιευµένα αποτελέσµατα για τα επίπεδα των ολικών φαινολών που περιέχονται σε διάφορα εκχυλίσµατα φύλλων ελιάς Πίνακας 1.3. οκιµές εκτίµησης αντιοξειδωτικής δράσης που έχουν αξιοποιηθεί στο πλαίσιο αξιολόγησης του δυναµικού των φύλλων της ελιάς Πίνακας 1.4. Συνήθεις τρόποι παραλαβής βιοενεργών συστατικών από φυσικά προϊόντα Πίνακας 3.1. Χρωµατογραφικές συνθήκες για το διαχωρισµό των φαινολικών συστατικών σε πολικά εκχυλίσµατα φύλλων ελιάς Πίνακας 4.1. Επίδραση εύρους σχισµής διέγερσης και εκποµπής στην ένταση φθορισµού διαλυµάτων ΟΛ, ΤΥ και ΠΕ (29 o C, auto, fast και high sensitivity) Πίνακας 4.2. Επίδραση θερµοκρασίας στην ένταση φθορισµού διαλυµάτων ΟΛ, ΤΥ και ΠΕ (1 nm, auto, fast και high sensitivity) Πίνακας 4.3. Επίδραση διαλύτη εργασίας στην ένταση φθορισµού διαλυµάτων ΟΛ και ΤΥ (1 nm, 29 o C, auto, fast και high sensitivity) Πίνακας 4.4. Επίδραση του ph εργασίας στην ένταση φθορισµού διαλυµάτων ΟΛ, ΤΥ και ΠΕ (1 nm, 29 o C, auto, fast και high sensitivity) Πίνακας 4.5. Έλεγχος ανθεκτικότητας µεθόδου σε µικρές διακυµάνσεις του µήκους κύµατος διέγερσης διαλυµάτων ΟΛ, ΤΥ και ΠΕ (1 nm, 29 o C, auto, fast και high sensitivity) Σελίδα Πίνακας 4.6. Μορφολογικά χαρακτηριστικά και % περιεκτικότητα σε νερό δειγµάτων ώριµων φύλλων ελιάς που συλλέχθησαν για τη 115 διερεύνηση της επίδρασης του παράγοντα «ποικιλία» (12 ποικιλίες, ελαιώνας Αγίου Μάµα, εκέµβριος 26 και Φεβρουάριος 28) Πίνακας 4.7. Επίδραση του παράγοντα «ποικιλία». Εκτίµηση 116 xi

17 περιεχοµένου σε ΟΦ µεθανολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς και της ικανότητάς τους να δεσµεύουν τη ρίζα DPPH (12 ποικιλίες, ελαιώνας Αγίου Μάµα, εκέµβριος 26 και Φεβρουάριος 28) Πίνακας 4.8. Επίδραση του παράγοντα «περιβάλλον ανάπτυξης». Εκτίµηση περιεχοµένου σε ΟΦ µεθανολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς 118 και της ικανότητάς τους να δεσµεύουν τη ρίζα DPPH Πίνακας 4.9. Μορφολογικά χαρακτηριστικά και % περιεκτικότητα σε νερό δειγµάτων φύλλων ελιάς που συλλέχθησαν για τη διερεύνηση της επίδρασης του παράγοντα «ηλικία φύλλων» (Χ. Χαλκιδικής, ελαιώνας ΑΠΘ, Οκτώβριος 27 και Απρίλιος 28) Πίνακας 4.1. Επίδραση του παράγοντα «ηλικία φύλλων». Εκτίµηση περιεχοµένου σε ΟΦ µεθανολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς και της ικανότητάς τους να δεσµεύουν τη ρίζα DPPH (Χ. Χαλκιδικής, ελαιώνας ΑΠΘ, Οκτώβριος 27 και Απρίλιος 28) Πίνακας Μορφολογικά χαρακτηριστικά και % περιεκτικότητα σε νερό δειγµάτων φύλλων ελιάς που συλλέχθησαν για τη διερεύνηση της επίδρασης του παράγοντα «εποχική διακύµανση» (Κορωνέϊκη και Χ. Χαλκιδικής, ελαιώνας Αγίου Μάµα, Ιούνιος-Νοέµβριος 26) Πίνακας Επίδραση του παράγοντα «εποχική διακύµανση». Εκτίµηση περιεχοµένου σε ΟΦ µεθανολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς και της ικανότητάς τους να δεσµεύουν τη ρίζα DPPH (Κορωνέϊκη και Χ. Χαλκιδικής, ελαιώνας Αγίου Μάµα, Ιούνιος-Νοέµβριος 26) Πίνακας Συγκεντρωτικός πίνακας παρουσίασης βιβλιογραφικών δεδοµένων για τα επίπεδα ΟΦ που περιέχονται σε διάφορα φυτικά υλικά Πίνακας Περιεχόµενο σε ΟΦ µεθανολικών εκχυλισµάτων καρπών ελιάς (Κορωνέϊκη) που συλλέχθησαν σε διάφορα στάδια ωρίµανσης (ελαιώνας Αγίου Μάµα) και εκχυλισµάτων φύλλων διαφορετικής ποικιλίας, ηλικίας, περιόδου και τόπου συλλογής Πίνακας Επίδραση των συνθηκών παραλαβής µεθανολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς στην εκτίµηση του περιεχοµένου τους σε 127 ΟΦ και της ικανότητας δέσµευσης της ρίζας DPPH Πίνακας Επίπεδα επιµέρους φαινολικών συστατικών στα πολικά εκχυλίσµατα φύλλων ελιάς xii

18 Πίνακας Επίπεδα επιµέρους κύριων φαινολικών συστατικών υδατοµεθανολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς (12 ποικιλίες ελαιώνας Αγίου Μάµα, εκέµβριος 26, υγροχρωµατογραφικό σύστηµα ΙΙ) Πίνακας Επίδραση του παράγοντα «ποικιλία». Εκτίµηση περιεχοµένου σε ΟΦ υδατοµεθανολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς και της ικανότητάς τους να δεσµεύουν τη ρίζα DPPH (12 ποικιλίες, ελαιώνας Αγίου Μάµα, εκέµβριος 26) Πίνακας Εύρος επιπέδων των κύριων φαινολικών συστατικών µεθανολικών εκχυλισµάτων που παραλήφθηκαν από φύλλα ελιάς διαφορετικής ηλικίας (Χ. Χαλκιδικής, ελαιώνας ΑΠΘ, Οκτώβριος, 27, υγροχρωµατογραφικό σύστηµα ΙΙ) Πίνακας 4.2. Επίδραση του παράγοντα «ηλικία φύλλων». Ικανότητα δέσµευσης της ρίζας DPPH από µεθανολικά εκχυλίσµατα φύλλων ελιάς (Χ. Χαλκιδικής, ελαιώνας ΑΠΘ, Οκτώβριος 27) Πίνακας Εξισώσεις παλινδρόµησης για την ποσοτική αποτίµηση φλαβονοειδών Πίνακας Επίδραση του παράγοντα «ποικιλία». Εκτίµηση περιεχοµένου σε ΟΦΛ µεθανολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς και της ικανότητάς τους να δεσµεύουν τη ρίζα DPPH (12 ποικιλίες, ελαιώνας Αγίου Μάµα, εκέµβριος 26, σε παρένθεση τα αποτελέσµατα από τη δειγµατοληψία Φεβρουάριος 28) Πίνακας Επίδραση του παράγοντα «ηλικία φύλλων». Εκτίµηση περιεχοµένου σε ΟΦΛ µεθανολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς και της ικανότητάς τους να δεσµεύουν τη ρίζα DPPH (Χ. Χαλκιδικής, ελαιώνας ΑΠΘ, Οκτώβριος 27 και Απρίλιος 28) Πίνακας Επίδραση του παράγοντα «εποχική διακύµανση». Εκτίµηση περιεχοµένου σε ΟΦΛ µεθανολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς και της ικανότητάς τους να δεσµεύουν τη ρίζα DPPH (Κορωνέϊκη και Χ. Χαλκιδικής, ελαιώνας Αγίου Μάµα, Ιούνιος - Νοέµβριος 26) Πίνακας Περιεχόµενο πολικών εκχυλισµάτων που παραλήφθηκαν από αντιπροσωπευτικό δείγµα φύλλων ελιάς σε ΟΦΛ Πίνακας Συγκεντρωτικός πίνακας παρουσίασης βιβλιογραφικών δεδοµένων για τα επίπεδα ΟΦΛ που περιέχονται σε διάφορα φυτικά xiii

19 υλικά Πίνακας Σχετική συνεισφορά (%) επιµέρους φαινολικών συστατικών µεθανολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς διαφορετικής ηλικίας (Οκτώβριος 27 και Απρίλιος 28) στην ολική αντιοξειδωτική δράση σύµφωνα µε την on line µεθοδολογία εκτίµησης της ικανότητας των συστατικών να δεσµεύουν τη ρίζα DPPH µετά από διαχωρισµό τους µε RP-HPLC Πίνακας Περιεχόµενο διαφόρων τύπων εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς σε ΟΦ σε σχέση µε την επίδραση του παράγοντα «θερµοκρασία εκχύλισης» Πίνακας Περιεχόµενο διαφόρων τύπων εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς σε ΟΦ σε σχέση µε την επίδραση του παράγοντα «αναλογία φυτικού υλικού/διαλύτη» Πίνακας 4.3. Περιεχόµενο διαφόρων τύπων εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς σε ΟΦ σε σχέση µε την επίδραση του παράγοντα «χρόνος εκχύλισης» Πίνακας Περιεχόµενο σε ΟΦ και ΟΦΛ και απόδοση σε ξηρό εκχύλισµα πολικών εκχυλισµάτων αντιπροσωπευτικού δείγµατος φύλλων ελιάς Πίνακας Ικανότητα δέσµευσης της ρίζας DPPH από τα φαινολικά συστατικά πολικών εκχυλισµάτων αντιπροσωπευτικού δείγµατος φύλλων ελιάς Πίνακας Επιµέρους επίπεδα βιοφαινολών που περιέχονται σε πολικά εκχυλίσµατα αντιπροσωπευτικού δείγµατος φύλλων ελιάς Πίνακας εδοµένα εκτίµησης της µεταλλαξιγόνου και ανασυνδυαστικής δράσης πολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς και ελαιοευρωπαΐνης από το πείραµα της επίδρασης µέσω της δοκιµής SMART ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Πίνακας Π.1. Βιοενεργά συστατικά πολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς Πίνακας Π.2. Κύρια φαινολικά συστατικά πολικών εκχυλισµάτων 218 xiv

20 φύλλων ελιάς (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα Ι) Πίνακας Π.3. Κύρια φαινολικά συστατικά πολικών εκχυλισµάτων καρπών ελιάς (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα Ι) Πίνακας Π.4. Κύρια φαινολικά συστατικά πολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα ΙΙ) Πίνακας Π.5. Κύρια φαινολικά συστατικά πολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς (υγροχρωµατογραφικό σύστηµα ΙΙΙ) Πίνακας Π.6. Περιγραφή χαρακτηριστικών ελληνικών και ξένων ποικιλιών που αξιοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή xv

21 xvi

22 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΧΗΜΑΤΩΝ ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ i v vii xi 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΑΞΙΟΠΟΙΗΣΗ ΒΙΟΕΝΕΡΓΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ ΙΑΤΡΟΦΗΣ ΜΕ 3 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΑ ΤΡΟΦΙΜΑ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΑ ΙΑΤΡΟΦΗΣ ΘΕΜΑΤΑ ΑΣΦΑΛΟΥΣ ΧΡΗΣΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΩΝ ΙΑΤΡΟΦΗΣ ΦΑΙΝΟΛΙΚΑ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΑ, ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΡΑΣΗ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΑ Γενικά Τι ορίζεται ως «αντιοξειδωτικό» Κατηγορίες αντιοξειδωτικών α Συνθετικά και φυσικά αντιοξειδωτικά β Πρωτοταγή και δευτεροταγή αντιοξειδωτικά γ Αντιοξειδωτικά παρεµποδιστές έναρξης και 15 xvii

23 αντιοξειδωτικά παρεµποδιστές διάδοσης αντιδράσεων οξείδωσης ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΑ ΦΑΙΝΟΛΙΚΟΥ ΤΥΠΟΥ Γενικά Φλαβονοειδή και σεκοϊριδοειδή ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΡΑΣΗ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ Γενικά οκιµές δέσµευσης ελευθέρων ριζών α οκιµή δέσµευσης της ρίζας DPPH β Άλλες δοκιµές οκιµές επιταχυνόµενης οξείδωσης λιπαρών υποστρωµάτων Άλλες προσεγγίσεις αξιολόγησης του αντιοξειδωτικού δυναµικού α Προσδιορισµός ολικών φαινολών και ολικών φλαβονοειδών β Προσδιορισµός ολικών φλαβονοειδών Σχέσεις δοµής-δραστικότητας Φαινολικά αντιοξειδωτικά και in vivo δράση ΤΑ ΦΥΛΛΑ ΤΗΣ Οlea europaea L. ΩΣ ΠΗΓΗ ΑΗ ΤΑ ΦΥΤΑ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ Oleaceae ΩΣ ΠΗΓEΣ ΑΗ ΦΥΛΛΑ ΤΗΣ Οlea europaea L Γενικά Φυσιολογία φύλλων α Χαρακτηριστικά β Λειτουργία φύλλων 35 xviii

24 Σπουδαιότητα δειγµατοληψίας α Γενικά β Συλλογή και διαχείριση πρώτης ύλης (µεταφορά, προκατεργασία, ξήρανση, αποθήκευση) Χηµική σύσταση α Γενικά β Φαινολικά συστατικά γ Άλλα βιοενεργά συστατικά Αντιοξειδωτική ικανότητα εκχυλισµάτων φύλλων της Ο. europaea L. και επιµέρους συστατικών τους Μέθοδοι παραλαβής βιοενεργών κλασµάτων Μέθοδοι προσδιορισµού βιοενεργών συστατικών µε έµφαση στις φαινολικές ενώσεις α Γενικά β Φαινολικές ενώσεις Χρήσεις και εφαρµογές (παραδοσιακές και σύγχρονες) ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΙΚOΣ ΣΚΟΠOΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΤΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ ΦΥΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ Φύλλα της O. europaea L α Συλλογή φύλλων από διαφορετικές ποικιλίες β Συλλογή φύλλων διαφορετικής ηλικίας γ Συλλογή φύλλων σε διαφορετικές χρονικές περιόδους Καρποί της O. europaea L ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΦΥΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ 69 xix

25 ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΤΟΥ ΦΥΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΠΡΟΤΥΠΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ ΙΑΛΥΤΕΣ ΥΛΙΚΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ-ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΟΡΓΑΝΑ-ΣΥΣΚΕΥΕΣ ΜΕΘΟ ΟΙ ΠΑΡΑΛΑΒΗ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ Παρασκευή εκχυλισµάτων σε λουτρό υπερήχων Παρασκευή εγχυµάτων Παρασκευή αφεψηµάτων Παρασκευή εκχυλισµάτων (βαµµάτων) σε θερµοστατούµενο τάρακτρο Παρασκευή χυµού από φύλλα ελιάς Παρασκευή εκχυλισµάτων που χρησιµοποιήθηκαν κατά την ανάπτυξη µεθόδου εκτίµησης ολικών φαινολών µε 77 φθορισµοµετρία α Παραλαβή φαινολικού κλάσµατος από παρθένο ελαιόλαδο β Παραλαβή φαινολικού κλάσµατος από επεξεργασµένους καρπούς ελιάς γ Παραλαβή φαινολικού κλάσµατος από φύλλα ελιάς και ελαιόκαρπο ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟΣ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ 78 ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΕΛΙΑΣ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΟΛΙΚΩΝ ΦΑΙΝΟΛΩΝ (ΟΦ) 81 xx

26 Εκτίµηση ολικών φαινολών µε τη χρωµατοµετρική µέθοδο Folin-Ciocalteu Φθορισµοµετρική εκτίµηση ολικών φαινολών ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΦΛΑΒΟΝΟΕΙ ΩΝ (ΟΦΛ) Πρωτόκολλο των Cvek και συνεργατών (27) Πρωτόκολλο των Zhinsen και συνεργατών (1999) ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΦΥΤΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΜΕ ΟΚΙΜΕΣ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΤΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ 84 ΕΣΜΕΥΣΗΣ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΡΙΖΩΝ Γρήγορη δοκιµή δέσµευσης της σταθερής ρίζας DPPH οκιµή µε τη ρίζα ABTS οκιµή αποχρωµατισµού της κροκίνης (crocin bleaching assay, CBA) οκιµή ORAC (oxygen radical absorbance capacity) On line εκτίµηση της ικανότητας επιµέρους συστατικών των εκχυλισµάτων να δεσµεύουν τη ρίζα DPPH µετά από διαχωρισµό τους µε RP-HPLC ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΦΥΤΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΜΕ ΕΠΙΤΑΧΥΝΟΜΕΝΕΣ ΟΚΙΜΕΣ ΟΞΕΙ ΩΣΗΣ ΣΕ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΙΑΣΠΟΡΑΣ Λιποσώµατα λεκιθίνης ΕΛΕΓΧΟΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΙΓΟΝΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΤΙΚΗΣ ΡΑΣΗΣ ΜΕΣΩ ΤΗΣ ΟΚΙΜΗΣ 89 SMART (SOMATIC MUTATION AND RECOMBINATION TEST) 3.7. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ 91 xxi

27 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΡΑΣΗ ΠΟΛΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΤΗΣ O. europaea L ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΤΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟΥ ΣΕ ΟΛΙΚΕΣ ΦΑΙΝΟΛΕΣ Γενικά Επιλογή ζεύγους µηκών κύµατος (διέγερσηςεκποµπής) Ανάπτυξη µεθόδου Επικύρωση µεθόδου Έκφραση αποτελεσµάτων Εφαρµογή σε πολικά εκχυλίσµατα ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ ΣΤΟ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΣΕ ΟΛΙΚΕΣ ΦΑΙΝΟΛΕΣ ΚΑΙ ΤΗΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΡΑΣΗ ΠΟΛΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ 112 ΦΥΛΛΩΝ ΤΗΣ O. europaea L Σχεδιασµός δειγµατοληψίας α Συλλογή φύλλων από διαφορετικές ποικιλίες β Συλλογή φύλλων διαφορετικής ηλικίας γ Συλλογή φύλλων σε διαφορετικές χρονικές περιόδους Επίδραση του παράγοντα «ποικιλία» Επίδραση του παράγοντα «ηλικία φύλλων» Επίδραση του παράγοντα «εποχική διακύµανση» Αξιολόγηση περιεχοµένου φύλλων της O. europaea L σε ΟΦ σε σχέση µε εκείνο άλλων φυτικών υλικών 122 xxii

28 4.2. ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗΣ ΡΑΣΗΣ ΜΕ ΤΗ ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΠΟΛΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΤΗΣ O. europaea L ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΠΙΜΕΡΟΥΣ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ Συνθήκες υγροχρωµατογραφικής ανάλυσης α Επιλογή συνθηκών εκχύλισης β Συνθήκες καταγραφής χρωµατογραφικών δεδοµένων και χαρακτηρισµός συστατικών Υγροχρωµατογραφικό προφίλ και σύσταση των πολικών εκχυλισµάτων σε επιµέρους φαινολικά συστατικά ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ ΣΤΗ ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΠΟΛΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ Επίδραση του παράγοντα «ποικιλία» Επίδραση του παράγοντα «ηλικία φύλλων» Επίδραση του παράγοντα «εποχική διακύµανση» ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΣΥΝΕΙΣΦΟΡΑΣ ΕΠΙΜΕΡΟΥΣ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΤΑΞΕΩΝ ΤΟΥΣ ΣΤΗΝ ΟΛΙΚΗ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΡΑΣΗ 151 ΠΟΛΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΕΛΙΑΣ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗΣ ΡΑΣΗΣ ΠΟΛΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΜΕ ΤΟ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ 151 ΤΟΥΣ ΣΕ «ΟΛΙΚΑ ΦΛΑΒΟΝΟΕΙ Η» Επιλογή πρωτοκόλλου εκτίµησης «ολικών φλαβονοειδών» (ΟΦΛ) Περιεχόµενο σε ΟΦΛ και αντιοξειδωτική δράση πολικών εκχυλισµάτων Συγκριτική αξιολόγηση του περιεχοµένου φύλλων της 157 xxiii

29 O. europaea L. σε ΟΦΛ σε σχέση µε εκείνο άλλων φυτικών υλικών ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΣΥΝΕΙΣΦΟΡΑΣ ΤΩΝ ΕΠΙΜΕΡΟΥΣ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΟΛΙΚΗ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΡΑΣΗ ΠΟΛΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΕΛΙΑΣ Γενικά Συνεισφορά επιµέρους φαινολικών συστατικών ΠΡΟΟΠΤΙΚΗ ΑΞΙΟΠΟΙΗΣΗΣ ΠΟΛΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΕΛΙΑΣ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ ΙΑΤΡΟΦΗΣ ΜΕ 166 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΠΑΡΑΛΑΒΗΣ ΠΟΛΙΚΟΥ ΚΛΑΣΜΑΤΟΣ ΦΥΛΛΩΝ ΕΛΙΑΣ ΣΤΟ ΦΑΙΝΟΛΙΚΟ ΤΟΥΣ 167 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΠΟΛΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΕΛΙΑΣ ΩΣ ΠΡΟΣ ΤΟ ΦΑΙΝΟΛΙΚΟ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΚΑΙ ΤΗΝ 172 ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΡΑΣΗ ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΕΛΙΑΣ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ 176 ΠΟΥ ΠΡΟΣΟΜΟΙΑΖΟΥΝ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ Αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας πολικών εκχυλισµάτων φύλλων ελιάς µέσω της δοκιµής επιταχυνόµενης 176 οξείδωσης λιποσωµάτων ΕKTIMHΣΗ ΤΗΣ ΑΣΦΑΛΟΥΣ ΧΡΗΣΗΣ ΠΟΛΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΕΛΙΑΣ Γενικά 179 xxiv

30 Εκτίµηση της µεταλλαξιγόνου και ανασυνδυαστικής δράσης πολικών εκχυλισµάτων φυλλων ελιάς µέσω της δοκιµής SMART (somatic mutation and recombination test) 5. ΓΕΝΙΚΗ ΣΥΖΗΤΗΣΗ- ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 6. ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ABSTRACT-ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ xxv

31 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1

32 2

33 1.1. ΑΞΙΟΠΟΙΗΣΗ ΒΙΟΕΝΕΡΓΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ ΙΑΤΡΟΦΗΣ ΜΕ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ «η τροφή σου να είναι το φάρµακό σου και το φάρµακό σου να το παίρνεις από την τροφή» (Ιπποκράτης, Περί τροφής) ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΑ ΤΡΟΦΙΜΑ «Η τροφή να είναι το φάρµακό σου και το φάρµακό σου να το παίρνεις από την τροφή», συνιστούσε ο Ιπποκράτης, πατέρας της ιατρικής 2.5, χρόνια πριν. Από τότε έως σήµερα εµπειρικά και επιστηµονικά ευρήµατα υποστηρίζουν ότι διατροφή και υγεία είναι άρρηκτα συνδεδεµένες. Αποτελέσµατα ποικίλων µελετών (επιδηµιολογικών, κλινικών, εργαστηριακών) συνεισέφεραν στην καλύτερη κατανόηση της σχέσης διατροφής-υγείας οδηγώντας στο συµπέρασµα ότι επαρκής ποσότητα και κυρίως ποικιλία στη διατροφή κάτω από φυσιολογικές συνθήκες προσφέρει στον άνθρωπο όλα τα αναγκαία θρεπτικά συστατικά για την καλή ανάπτυξη και διατήρηση του οργανισµού του. Tην τρέχουσα δεκαετία οι διατροφικές απαιτήσεις επηρεάστηκαν σηµαντικά από πολυάριθµα επιστηµονικά ευρήµατα που αναδεικνύουν τον ευεργετικό ρόλο και τις βιοενεργές δράσεις διαφόρων συστατικών. Το γεγονός αυτό οδήγησε στη διεθνώς ραγδαία εξέλιξη της Βιοµηχανίας Λειτουργικών Τροφίµων (functional foods) από το 1985 και εφεξής. Όλο και περισσότερα προϊόντα διατίθενται στην αγορά ως λειτουργικά τρόφιµα που στόχο έχουν να συµπληρώσουν την πρόσληψη θρεπτικών συστατικών από τη συνήθη διατροφή και να ενισχύσουν τους µηχανισµούς άµυνας του ανθρώπινου οργανισµού (Schmidl & Labuza, 2). Μεταξύ των ευεργετικών ιδιοτήτων των λειτουργικών τροφίµων συγκαταλέγονται δράσεις για α) την βέλτιστη ανάπτυξη και υγεία, β) τη ρύθµιση βασικών µεταβολικών διαδικασιών, γ) την ενίσχυση πνευµατικών και µαθησιακών λειτουργιών, δ) την πρόληψη διαφόρων ασθενειών όπως καρδιοπαθειών, διαβήτη, παχυσαρκίας, τύπων καρκίνου, 3

34 οστεοπόρωσης, νευροεκφυλιστικών ασθενειών, καθώς και ε) ευεργετικές δράσεις ενάντια των βλαβερών συνεπειών του οξειδωτικού stress (Sarkar, 27). Η έννοια των λειτουργικών τροφίµων θεωρείται ότι προήλθε από την Ιαπωνία (1991). Σύµφωνα µε τη νοµοθεσία της χώρας αυτής τα λειτουργικά τρόφιµα συγκροτούν ειδική κατηγορία τροφίµων (Gulati et al., 26). Στην Ευρώπη, τα λειτουργικά τρόφιµα δεν αποτελούν κατηγορία συγκεκριµένων τροφίµων και συνεπώς δεν υπάρχει ορισµός που να τα περιγράφει µε σαφήνεια. Γενικότερα, µε τον όρο λειτουργικά τρόφιµα χαρακτηρίζονται τρόφιµα ή συστατικά που ενώ δεν έχουν φαρµακευτική δράση (δηλαδή η κατανάλωσή τους δεν συνιστάται για θεραπευτικούς σκοπούς), πέραν της βασικής διατροφικής αξίας τους προάγουν την υγεία των ανθρώπων και µειώνουν τον κίνδυνο εµφάνισης ασθενειών (Schmidl & Labuza, 2, Gulati et al., 26). Μεταξύ των διαφόρων υποκατηγοριών τροφίµων που εµπίπτουν στην ευρύτερη έννοια του όρου λειτουργικά τρόφιµα υπάγονται και τα σκευάσµατα/συµπληρώµατα διατροφής (dietary supplements ή food supplements) ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΑ ΙΑΤΡΟΦΗΣ 1 Με τον όρο συµπληρώµατα διατροφής χαρακτηρίζονται διάφορα προϊόντα µε µη σαφώς οριοθετηµένο νοµοθετικό πλαίσιο. Από χώρα σε χώρα, τα προϊόντα αυτά διέπονται από διαφορετικούς εθνικούς κανόνες και ρυθµίσεις που υπόκεινται σε συνεχείς αναθεωρήσεις και τροποποιήσεις. Στην Αµερική, ο Food and Drug Administration (FDA), σύµφωνα µε την Dietary Supplement Health and Education Act (1994:6), ως συµπληρώµατα διατροφής αναγνωρίζει κάθε προϊόν (πλην του καπνού) που στοχεύει στη συµπλήρωση της συνήθους δίαιτας, και περιέχει βιταµίνες, ανόργανα στοιχεία, βότανα ή φυτά (φυτικά µέρη), αµινοξέα, ύλες που χρησιµοποιούνται για να εµπλουτίσουν την ανθρώπινη διατροφή µε αύξηση της συνολικής ηµερήσιας πρόσληψης θρεπτικών συστατικών ή ακόµη συµπυκνωµένες πηγές θρεπτικών συστατικών, µεταβολίτες, εκχυλίσµατα ή συνδυασµούς των παραπάνω. Τα προϊόντα 1 Οι πληροφορίες συλλέχθησαν από Schmidl & Labuza, 2, Gulati et al., 26, καθώς και τους δικτυακούς τόπους σηµαντικών εθνικών και διεθνών φορέων και οργανισµών: www. fda.gov, 4

35 αυτά που προορίζονται να ληφθούν σε µορφές όπως κάψουλες, δισκία, χάπια και άλλες υγρές µορφές δεν πρέπει να παρουσιάζονται για χρήση ως συµβατικά τρόφιµα ή ως επαρκή να χρησιµοποιηθούν µεµονωµένα για ισορροπηµένη διατροφή. Στην Ευρώπη, τα συµπληρώµατα διατροφής που εντάσσονται στα λειτουργικά τρόφιµα, καλύπτονται από νοµοθετικά κείµενα γενικής εφαρµογής και υπάγονται στη νοµοθεσία σχετικά µε την ασφάλεια των τροφίµων. Ως συµπληρώµατα διατροφής ορίζονται τα τρόφιµα που στοχεύουν στη συµπλήρωση της συνήθους δίαιτας, και αποτελούν συµπυκνωµένες πηγές θρεπτικών συστατικών ή άλλων συστατικών µε θρεπτικές ή φυσιολογικές επιδράσεις, µεµονωµένων ή σε συνδυασµό, και τα οποία διατίθενται στο εµπόριο σε δοσιµετρικές µορφές, ήτοι µορφές παρουσίασης όπως, κάψουλες, παστίλιες, δισκία, χάπια και άλλες παρόµοιες µορφές, καθώς και φακελάκια σκόνης, φύσιγγες υγρού προϊόντος, φιαλίδια µε σταγονόµετρο, και άλλες παρόµοιες µορφές υγρών και κόνεων που προορίζονται να ληφθούν σε προµετρηµένες µικρές µοναδιαίες ποσότητες. Το φάσµα των συστατικών που βρίσκουν εφαρµογή στην παρασκευή συµπληρωµάτων διατροφής είναι ευρύ και µπορεί να περιλαµβάνει βιταµίνες, ανόργανα στοιχεία, αµινοξέα, απαραίτητα λιπαρά οξέα, ίνες, ύλες που έχουν εγκριθεί από την επιστηµονική επιτροπή τροφίµων για χρήσεις στην παρασκευή τροφίµων ειδικής διατροφής ή νέων τροφίµων, καθώς και διάφορα φυτά και φυτικά εκχυλίσµατα. Αρχικά εκδόθηκε η οδηγία 22/46/ΕΚ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συµβουλίου, της 1ης Ιουνίου 22, η οποία επέφερε µερική εναρµόνιση των κανόνων που διέπουν τη διάθεση στην αγορά συµπληρωµάτων διατροφής που περιέχουν µόνο βιταµίνες και ανόργανα στοιχεία. Η θέσπιση ειδικών κανόνων σχετικά µε άλλες ύλες που έχουν θρεπτικές ή φυσιολογικές επιδράσεις και χρησιµοποιούνται ως συστατικά των συµπληρωµάτων διατροφής, αποτέλεσε τότε µεταγενέστερο στόχο. Στις 5/12/28 η έκθεση της Επιτροπής στο Συµβούλιο και στο Ευρωπαϊκό Κοινοβούλιο σχετικά µε τη χρήση άλλων συστατικών, εκτός από τις βιταµίνες και τα ανόργανα στοιχεία, στα συµπληρώµατα διατροφής κατέληξε στο συµπέρασµα ότι: δεν αιτιολογείται η θέσπιση ειδικών κανόνων, καθώς α) δεν διατίθενται επαρκή και κατάλληλα επιστηµονικά δεδοµένα, β) η αγορά των συµπληρωµάτων διατροφής τα οποία περιέχουν άλλες ουσίες χαρακτηρίζεται από ετερογένεια και γ) είναι δυσχερές να αποφευχθεί η διατήρηση διαφορών µεταξύ των 5

36 κρατών-µελών, όσον αφορά τον χαρακτηρισµό των προϊόντων ως φάρµακα ή ως τρόφιµα. Τα συµπληρώµατα διατροφής που περιέχουν άλλες ύλες εκτός από βιταµίνες ή ανόργανα στοιχεία θεωρούνται ότι εµπίπτουν στην κατηγορία των τροφίµων. Σύµφωνα µε τον ορισµό του άρθρου 2 του κανονισµού (ΕΚ) αριθ. 178/22 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συµβουλίου, ως «τρόφιµα» (ή «είδη διατροφής») ορίζονται ύλες ή προϊόντα, είτε αυτά έχουν υποστεί πλήρη ή µερική επεξεργασία είτε όχι, που προορίζονται για βρώση από τον άνθρωπο ή αναµένεται εύλογα ότι θα χρησιµεύσουν για το σκοπό αυτό. Το άρθρο εξαιρεί ρητά από τον ορισµό των τροφίµων ορισµένες κατηγορίες προϊόντων, στις οποίες περιλαµβάνονται τα φάρµακα, σύµφωνα µε την οδηγία 21/83/ΕΚ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συµβουλίου περί κοινοτικού κώδικος για τα φάρµακα που προορίζονται για ανθρώπινη χρήση. Στο σηµείο αυτό πρέπει όµως να επισηµανθεί ότι ενώ σε ορισµένα κράτη µέλη, συµπληρώµατα διατροφής, που περιέχουν ύλες όπως φυτικά εκχυλίσµατα, επιτρέπεται να διατίθενται στην αγορά ως τρόφιµα, σε άλλα κράτη µέλη τα ίδια προϊόντα θεωρούνται φάρµακα. Καθώς φυτικά εκχυλίσµατα χρησιµοποιούνται ταυτόχρονα στα συµπληρώµατα διατροφής και στην παρασκευή φαρµακευτικών ιδιοσκευασµάτων ενδέχεται να µην είναι ξεκάθαρος ο ορισµός στον οποίο εµπίπτει ένα προϊόν. Σε µία τέτοια περίπτωση (σύµφωνα µε το άρθρο 2 παράγραφος 2 της οδηγίας 21/83/ΕΚ, όπως τροποποιήθηκε από την οδηγία 24/27/ΕΚ6), που ένα προϊόν µε βάση το σύνολο των χαρακτηριστικών του ενδέχεται να εµπίπτει ταυτόχρονα στον ορισµό ενός φαρµάκου και στον ορισµό ενός προϊόντος το οποίο διέπεται από άλλη κοινοτική νοµοθεσία, εφαρµόζονται οι διατάξεις της νοµοθεσίας περί φαρµάκων (οδηγίες 21/83/ΕΚ και 24/24/ΕΚ). Σήµερα κυκλοφορούν στην αγορά διάφορα προϊόντα που περιέχουν φυτικά συστατικά και φέρουν διάφορους ισχυρισµούς υγείας. Για πολλά από αυτά είναι ιδιαίτερα δύσκολο να αποσαφηνισθεί η κατάλληλη κατηγορία (τρόφιµα: σκευάσµατα διατροφής, τρόφιµα ειδικής διατροφής, νέα τρόφιµα ή φάρµακα: φάρµακα φυτικής προέλευσης, φυτικά παρασκευάσµατα, παραδοσιακά φάρµακα φυτικής προέλευσης) στην οποία εµπίπτουν (Gulati et al., 26). Επιπροσθέτως, πολλά προϊόντα δεν έχουν εγκριθεί από επιστηµονικές επιτροπές για την ασφάλεια της χρήσης τους ή/και διέπονται από διαφορετικές εθνικές προδιαγραφές που ενδέχεται να εµποδίζουν την ελεύθερη και υπό ίσους όρους ανταγωνισµού κυκλοφορία τους στα κράτη-µέλη. 6

37 Προκειµένου να εξασφαλισθούν υψηλά επίπεδα προστασίας των καταναλωτών και να διευκολυνθεί η εκ µέρους τους επιλογή, τα προϊόντα που διατίθενται στην αγορά πρέπει τουλάχιστον να είναι ασφαλή και να φέρουν επαρκή και κατάλληλη επισήµανση. Σε ότι αφορά στην επισήµανση των συµπληρωµάτων διατροφής (βλ. και οδηγία 2/13/ΕΚ σχετικά µε την επισήµανση και την παρουσίαση των τροφίµων) αυτή πρέπει να περιέχει: την αναφορά «συµπλήρωµα», την κατηγορία θρεπτικών συστατικών του συµπληρώµατος και/ή το όνοµα των θρεπτικών συστατικών και την ποσότητά τους (υπό αριθµητική µορφή και ως ποσοστό της ηµερήσιας δόσης που συνιστάται από τον παρασκευαστή), τη συνιστώµενη ηµερήσια δόση του προϊόντος και µία προειδοποίηση σχετικά µε τους κινδύνους για την υγεία σε περίπτωση υπέρβασης της δόσης αυτής, µία δήλωση στην οποία να αναφέρεται ότι το συµπλήρωµα δεν υποκαθιστά µία ισορροπηµένη διατροφή, την αναφορά «το παρόν προϊόν δεν είναι φάρµακο», όταν η παρουσίαση του προϊόντος µοιάζει µε αυτήν ενός φαρµάκου, δήλωση σύµφωνα µε την οποία τα προϊόντα πρέπει να φυλάσσονται µακριά από τα µικρά παιδιά. Επιπλέον, η επισήµανση των συµπληρωµάτων διατροφής δεν πρέπει να περιλαµβάνει α) αναφορές που αποδίδουν στο προϊόν ιδιότητες πρόληψης, αγωγής ή θεραπείας ανθρώπινης νόσου, καθώς και β) αναφορές που να βεβαιώνουν ή να υπονοούν ότι µία ισορροπηµένη και ποικίλη δίαιτα δεν αποτελεί επαρκή πηγή κατάλληλων ποσοτήτων θρεπτικών συστατικών γενικώς. Στην περίπτωση που το θρεπτικό συστατικό, είναι π.χ. ένα φυτικό εκχύλισµα για το οποίο δεν υπάρχουν συνιστώµενα επίπεδα ηµερήσιας δόσης αυτό πρέπει να επισηµαίνεται. Επιπλέον σε µία τέτοια περίπτωση απαιτείται να αναφέρονται επίσης το µέρος του φυτού που αξιοποιήθηκε για την παραλαβή του εκχυλίσµατος και η πλήρης (συµπεριλαµβανοµένης και της λατινικής) ονοµασία του φυτού. 7

38 Πίνακας 1.1. Ορισµοί φαρµακευτικού ιδιοσκευάσµατος, φαρµάκου, παραδοσιακού φαρµάκου φυτικής προέλευσης, φαρµάκου φυτικής προέλευσης, φυτικών ουσιών, φυτικών παρασκευασµάτων, τροφίµων ειδικής διατροφής, νέων τροφίµων Φαρµακευτικό ιδιοσκεύασµα 1 Φάρµακο 1 Παραδοσιακό φάρµακο φυτικής προέλευσης 2 Φάρµακο φυτικής προέλευσης 2 Φυτικές ουσίες 2 Φυτικά παρασκευάσµατα 2 Τρόφιµα ειδικής διατροφής 3 Νέα τρόφιµα 4 Κάθε φάρµακο παρασκευασµένο εκ των προτέρων που τίθεται στην κυκλοφορία υπό ειδική ονοµασία και σε ιδιαίτερη συσκευασία. Κάθε ουσία ή σύνθεση ουσιών που χαρακτηρίζεται ως έχουσα θεραπευτικές ή προληπτικές ιδιότητες έναντι ασθενειών. Το φάρµακο φυτικής προέλευσης το οποίο πληροί τους όρους που ορίζονται στο άρθρο 16α παράγραφος 1. Κάθε φάρµακο το οποίο περιέχει αποκλειστικά ως δραστικά συστατικά µία ή περισσότερες φυτικές ουσίες ή ένα ή περισσότερα φυτικά παρασκευάσµατα ή συνδυασµό µίας ή περισσοτέρων φυτικών ουσιών µε ένα ή περισσότερα φυτικά παρασκευάσµατα. Όλα τα κατά κύριο λόγο ακέραια, τεµαχισµένα ή κοµµένα φυτά, µέρη φυτών, φύκη, µύκητες και λειχήνες, τα οποία είναι αµεταποίητα, συνήθως αποξηραµένα ή ενίοτε νωπά. Ως φυτικές ουσίες θεωρούνται επίσης ορισµένα εξιδρώµατα τα οποία δεν έχουν υποστεί ειδική επεξεργασία. Οι φυτικές ουσίες προσδιορίζονται επακριβώς από το χρησιµοποιούµενο µέρος του φυτού και τη βοτανική ονοµασία κατά το διωνυµικό σύστηµα (γένος, είδος, ποικιλία και συγγραφέας). Παρασκευάσµατα που λαµβάνονται διά της υποβολής φυτικών ουσιών σε επεξεργασία, όπως εκχύλιση, απόσταξη, έκθλιψη, κλασµάτωση, καθαρισµό, συµπύκνωση ή ζύµωση. Στα φυτικά παρασκευάσµατα συγκαταλέγονται οι τεµαχισµένες ή κονιοποιηµένες φυτικές ουσίες, τα βάµµατα, τα εκχυλίσµατα, τα αιθέρια έλαια, οι χυµοί που προέρχονται από έκθλιψη και τα µεταποιηµένα εξιδρώµατα. Τρόφιµα τα οποία λόγω της ειδικής σύνθεσής τους ή της ειδικής επεξεργασίας κατά την παρασκευή τους διακρίνονται σαφώς από τα τρόφιµα συνήθους κατανάλωσης, ανταποκρίνονται στο δηλούµενο θρεπτικό προορισµό τους και κατά τη διάθεσή τους στο εµπόριο δηλώνεται ότι επιτελούν τον προορισµό αυτόν. Τρόφιµα ή συστατικά τροφίµων που δεν είχαν χρησιµοποιηθεί ευρέως (για ανθρώπινη κατανάλωση) πριν από το Μάιο του 1997, ηµεροµηνία που τέθηκε σε ισχύ ο Κανονισµός ΕΚ 258/97. Αυτός ο ορισµός περιλαµβάνει επίσης και νέες παραγωγικές διεργασίες από τις οποίες προκύπτει προϊόν που διαθέτει σηµαντικές διαφορές στη σύσταση ή στα θρεπτικά συστατικά. 1 Ο ΗΓΙΑ 21/83/ΕΚ, 2 Ο ΗΓΙΑ 24/24/ΕΚ, 3 Ο ΗΓΙΑ 21/15/ΕΚ & 89/398/ΕΟΚ (1989), 4 ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ 258/97 (1997), βλ. και 8

39 ΘΕΜΑΤΑ ΑΣΦΑΛΟΥΣ ΧΡΗΣΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΩΝ ΙΑΤΡΟΦΗΣ Όπως ήδη περιγράφηκε παραπάνω, τα φυσικά προϊόντα ελκύουν ολοένα και περισσότερο το ενδιαφέρον του καταναλωτικού κοινού και κατά συνέπεια της βιοµηχανίας, κυρίως χάρη στην αυξανόµενη ζήτηση για την αξιοποίηση πηγών µε ευεργετικές για την ανθρώπινη υγεία δράσεις. Στο πλαίσιο µιας καταναλωτικής κοινωνίας µε ροπή προς το εύκολο κέρδος, η επικρατούσα λαθεµένη εντύπωση πως κάθε τι φυσικό είναι ασφαλές και υγιεινό µπορεί να αποβεί εξαιρετικά επικίνδυνη (Bombardelli & Bombardelli, 25, Hanekamp & Bast, 27). Θεωρώντας ότι η ανθρώπινη υγεία υπερέχει της οικονοµίας, η εξασφάλιση ασφαλών και υγιεινών προϊόντων είναι αδιαµφισβήτητης σηµασίας και αποτελεί υποχρέωση τόσο των υπευθύνων ανάπτυξης προϊόντων, όσο και των κρατικών µηχανισµών ελέγχου. Τεράστιες προσπάθειες γίνονται τα τελευταία χρόνια για την εναρµόνιση κανονισµών και νοµοθεσιών που θα περιλαµβάνουν τις απαραίτητες προϋποθέσεις για την ασφαλή διάθεση φυσικών προϊόντων. Υπηρεσίες και οργανισµοί µε επικεφαλείς ειδικούς ασφάλειας και διαχείρισης κινδύνων εισηγούνται ολοένα και πληρέστερους οδηγούς για την εκτίµηση της ασφάλειας, την τοξικότητα και επικινδυνότητά τους. Νοµοθετικό πλαίσιο µε γενική διεθνή ισχύ δεν έχει όµως ακόµη θεσπιστεί, καθώς είναι εξαιρετικά δύσκολο έως αδύνατο να οριστούν τρόποι ελέγχου και απόδειξης της απουσίας κάθε πιθανού κινδύνου, ιδίως από νέα φυσικά προϊόντα (Bast et al., 22, Schilter et al., 23, Coppens et al., 26, Hanekamp & Bast, 27, Rietjens et al., 28). Η αποτίµηση της ασφάλειας φυσικών υλικών και παρασκευασµάτων τους είναι διαδικασία επίπονη και σύνθετη, ακόµη και για τις περιπτώσεις που υπάρχουν δεδοµένα ιστορικού χρήσης, καθώς αυτά αποτελούν περίπλοκα µίγµατα χηµικών ενώσεων, µεταξύ των οποίων κάποιες ενδέχεται να περικλείουν κινδύνους (Schilter et al., 23, Kroes & Walker, 24, Gualati et al., 26, Hanekamp & Bast, 27, van Breeman et al., 27). Απουσία απόδειξης κινδύνου δεν συνεπάγεται απουσία κινδύνου επειδή α) υπάρχει ο κίνδυνος της επιµόλυνσης ενός φυτικού είδους από άλλα ή της λανθασµένης επιλογής του σωστού υλικού ή µέρους αυτού, β) υπάρχει πληθώρα βιοτικών και αβιοτικών παραγόντων που διαφοροποιούν τη χηµική σύσταση ενός φυσικού υλικού, γ) φυσικά συστατικά ή κλάσµατα µε βιοενεργή δράση 9

40 σε ορισµένα επίπεδα µπορεί να έχουν δυσµενείς για την υγεία επιδράσεις σε άλλες συγκεντρώσεις, δ) προϊόντα ασφαλή για ορισµένες οµάδες ανθρώπων µπορεί να είναι επικίνδυνα για άλλες, ε) µικρές διαφοροποιήσεις στις συνθήκες ξήρανσης, αποθήκευσης του υλικού ή τη διαδικασία παραλαβής βιοδραστικών κλασµάτων από αυτό µπορεί να έχουν ουσιαστικές επιπτώσεις στις ιδιότητες του τελικού προϊόντος κ.ά. (Schilter et al., 23). Ακόµη, αποτελέσµατα µεµονωµένων µελετών που ελέγχουν την πιθανή επικινδυνότητα προϊόντων δεν θα πρέπει να έχουν γενικευµένο χαρακτήρα, ενώ η ερµηνεία των εξαγόµενων συµπερασµάτων θα πρέπει να γίνεται µε ιδιαίτερη προσοχή και αυτό γιατί α) αντικρουόµενα είναι συχνά τα αποτελέσµατα δοκιµών εκτίµησης της π.χ. τοξικότητας ενός προϊόντος ανάλογα µε τη µέθοδο που ακολουθείται, τις συνθήκες που εφαρµόζονται, τις συγκεντρώσεις που µελετώνται, β) ο διαφορετικός τρόπος απορρόφησης ή µεταβολισµού των συστατικών των προίόντων στον άνθρωπο σε σχέση µε το πειραµατόζωο µπορεί να διαφοροποιήσει το τελικό αποτέλεσµα, γ) παράγοντες όπως η αλληλεπίδραση των συστατικών των προίόντων µε το γύρω περιβάλλον τους, π.χ. µε άλλα συστατικά που βρίσκονται στον οργανισµό λόγω συγκεκριµένης διατροφής ή οργανικής ιδιαιτερότητας µπορεί να αποβούν κρίσιµα. Η ανίχνευση και ο χαρακτηρισµός των εν δυνάµει κινδύνων απαιτεί δεδοµένα υψηλής ακρίβειας και κατά το δυνατόν σύµφωνα µε καλές γεωργικές, βιοµηχανικές, εργαστηριακές και κλινικές πρακτικές. Οι έλεγχοι επιβάλλεται είτε να αφορούν στο τελικό προϊόν, είτε να εγγυώνται την άµεση συνάφεια των αποτελεσµάτων µε αυτό. Για παράδειγµα, διαφορετικού τύπου αλληλεπιδράσεις µεταξύ συστατικών ακατέργαστων και εξευγενισµένων εκχυλισµάτων µπορούν να ενισχύσουν ή να παρεµποδίσουν την τοξικότητα ενός προϊόντος (Schilter et al., 23). Τεκµήρια της ασφαλούς χρήσης ενός φυσικού προϊόντος µπορεί να αποτελούν εµπειρικά και επιστηµονικά (πειραµατικά, κλινικά κ.ά.) δεδοµένα. Σε κάθε περίπτωση για την εκτίµηση της επικινδυνότητας ενός προϊόντος πρωταρχικής σπουδαιότητας είναι αποτελέσµατα in vivo δοκιµών σε ανθρώπους. Αποτελέσµατα in vitro µελετών και in vivo δοκιµών σε πειραµατόζωα θα πρέπει να έχουν συµπληρωµατικό, υποθετικό και ενδεικτικό χαρακτήρα, όπου αυτό είναι δυνατό. Αναγκαίες και προαπαιτούµενες τοξικολογικές µελέτες εκτείνονται ανά περίπτωση µεταξύ πλήθους δοκιµών που αφορούν ελέγχους µεταλλαξιγόνου και καρκινογόνου δράσης, φαρµακοδυναµικής και φαρµακοκινητικής δράσης, τοξικότητας δι εφάπαξ ή/και δι επανειληµµένης (υποξείας και χρονίας) χρήσεως, εµβρυακής και 1