Μελέτη της επίδρασης των πολυμορφισμών PvuII και XbαI του οιστρογονικού υποδοχέα α στην γυναικεία σεξουαλική συμπεριφορά.

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ Μελέτη της επίδρασης των πολυμορφισμών PvuII και XbαI του οιστρογονικού υποδοχέα α στην γυναικεία σεξουαλική συμπεριφορά. Μιχαηλίδου Ευτυχία Α.Μ.3169 Πάτρα, Ιούλιος 2013

2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο της Μαιευτικής Γυναικολογικής Κλινικής της Ιατρικής σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών κατά την περίοδο με επιβλέπων τον επίκουρο καθηγητή, κύριο Γεωργόπουλο Νεοκλή. Η διεκπεραίωση της εργασίας αυτής σηματοδοτεί το τέλος των σπουδών μου στην Ελλάδα. Θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου σε όσους με βοήθησαν να φέρω εις πέρας τη δουλειά μου και στάθηκαν δίπλα μου κατά τη διάρκεια της διπλωματικής μου εργασίας. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στη Δήμητρα Μαριόλη που όχι μόνο με έμαθε να δουλεύω αλλά και να διατυπώνω τις σκέψεις μου σωστά, ώστε να γίνεται η δουλειά μου πιο αποτελεσματική και εμπεριστατωμένη. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους δικούς μου ανθρώπους, που με υποστήριξαν και ήτανε δίπλα μου ο καθένας με το δικό του τρόπο. Σας ευχαριστώ όλους 2

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. Εισαγωγή.σελ.5 1. Δυσλειτουργίες γυναικείας σεξουαλικότητας..σελ Οιστρογόνα..σελ Επιδράσεις των οιστρογόνων σελ.10 i. Επιδράσεις στο μαστό..σελ ii. Επιδράσεις στο Κεντρικό νευρικό σύστημα..σελ.11 iii. Επιδράσεις στο καρδιαγγειακό σύστημα σελ.12 iv. Επιδράσεις στην ομοιόσταση των οστών σελ Βιοσύνθεση των οιστρογόνων.σελ i. Ένζυμο αρωματάση σελ Ιστοί σύνθεση των οιστρογόνων...σελ i. Ιστοειδική και κυτταροειδική σύνθεση της οιστραδιόλης.....σελ ii. Σύνθεση της οιστραδιόλης στις ωοθήκες σελ iii. Σύνθεση της οιστραδιόλης στον εγκέφαλο σελ Μεταφορά και μεταβολισμός των οιστρογόνων.σελ Μηχανισμοί δράσης των οιστρογόνων.... σελ.21 i. Σύνδεση με ενδοκυτταρικούς υποδοχείς.. σελ ii. Σύνδεση με υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης...σελ Οιστρογονικοί υποδοχείς (ERs) σελ Οιστρογονικοί υποδοχείς α και β..σελ Οιστρογονικός υποδοχέας α (ΕRα)..σελ Γενετικοί πολυμορφισμοί του οιστρογονικού υποδοχέα α..σελ Σκοπός..σελ Υλικά και μέθοδοι..σελ Πληθυσμός μελέτης. σελ Παρασκευή διαλυμάτων, εμπορικά αντιδραστήρια..σελ Χρήση λογισμικών προγραμμάτων..σελ Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) σελ i. Taq DNA πολυμεράση.σελ.35 3

4 ii. Εκκινητές (Primers).σελ iii. Αριθμός κύκλων... σελ.36 iv. Αντίδραση..σελ Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης... σελ.40 i. Αρχή της μεθόδου σελ ii. Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης...σελ.41 iii. Βρωμιούχο αιθίδιο. σελ.42 iv. Παρασκευή πηκτώματος αγαρόζης...σελ v. Πορεία ηλεκτροφόρησης σελ Πολυμορφισμός μήκους περιοριστικών θραυσμάτων- Κατάτμηση με ένζυμα περιορισμού σελ i. Μέθοδος.σελ ii. Πρωτόκολλο.σελ Αποτελέσματα.. σελ Πληθυσμός μελέτης.σελ Πολυμορφισμός PvuII.σελ Πολυμορφισμός XbaI..σελ Γονοτυπικές και γονιδιακές συχνότητες σελ Στατιστική επεξεργασία.σελ Συμπεράσματα- Συζήτηση.σελ Βιβλιογραφία.σελ

5 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 5

6 1.1. Δυσλειτουργίες της γυναικείας σεξουαλικότητας To βιολογικό και ψυχικό υπόβαθρο της σεξουαλικής επιθυμίας και της ερωτικής διέγερσης στις γυναίκες είναι μέχρι στιγμής ασαφές, αλλά φαίνεται να περιλαμβάνει αλληλεπιδράσεις μεταξύ νευροδιαβιβαστών, φυλετικών ορμονών και περιβαλλοντικών παραγόντων (Basson R, 2006). Το σύνολο των διαταραχών που σχετίζονται με την ερωτική πράξη στις γυναίκες χαρακτηρίζεται ως γυναικεία σεξουαλική δυσλειτουργία. Σε αυτή περιλαμβάνονται διαταραχές της σεξουαλικής επιθυμίας και της ερωτικής διέγερσης, διαταραχές του οργασμού και διαταραχές που σχετίζονται με την εμφάνιση πόνου κατά την ερωτική επαφή όπως η δυσπαρεύνια (Basson R., 2006). Αν και τα υπάρχοντα επιδημιολογικά δεδομένα είναι περιορισμένα, τα αποτελέσματα των διαθέσιμων μελετών δείχνουν ότι περίπου το 43% των γυναικών επικαλούνται κάποια σεξουαλική δυσλειτουργία, ενώ το 11-33% των γυναικών που έχουν συμμετάσχει σε επιδημιολογικές ή/ και κλινικές μελέτες υπάγονται σε κάποια συγκεκριμένη κατηγορία σεξουαλικής δυσλειτουργίας (Rosen R., 2000 και Laumann E., 1999). Παρά την υψηλή συχνότητα εμφάνισης, η οποία φαίνεται να υπερβαίνει αυτή της ανδρικής σεξουαλικής δυσλειτουργίας, δεν έχει δοθεί έμφαση στις διαταραχές της γυναικείας σεξουαλικότητας και ως εκ τούτου ελάχιστες μελέτες έχουν διερευνήσει το βιολογικό και ψυχικό υπόβαθρο της (Rosen R,2000). Η συμμετοχή της γενετικής, έναντι της περιβαλλοντικής επίδρασης στη συμπεριφορά αποτελεί θεμελιώδες ερώτημα για τις νευροεπιστήμες και αποτελεί πεδίο έντονου ερευνητικού ενδιαφέροντος. Η φυλετική γενετική επίδραση της συμπεριφοράς είναι καθοριστική. Υπό την επίδραση των ορμονών του φύλου, ο αναπτυσσόμενος εγκέφαλος των περισσοτέρων ειδών και του ανθρωπίνου συμπεριλαμβανομένου, εμφανίζει φυλετικό διμορφισμό, όσον αφορά δομικά (Rhoshel K. et al., 2007), λειτουργικά χαρακτηριστικά (Patrik Lindenfors et al., 2007) και γονιδιακή έκφραση (Reinius B. et al., 2008, Eduarda M. Santos et al., 2008 και Jai Y. Yu et al., 2006). Oι διαφοροποιήσεις αυτές καθορίζουν τη φυλετική ταυτότητα των ατόμων και συνδιαμορφώνουν τη σεξουαλική και κοινωνική τους συμπεριφορά (Dick F., 2008). 6

7 Η αρρενοποίηση του αναπτυσσόμενου εγκεφάλου διαμεσολαβείται από οιστρογόνα καθώς η τεστοστερόνη αρωματοποιείται και μετατρέπεται σε οιστραδιόλη (Jaclyn M. et al., 2008). Κατά την ενήλικο ζωή, η σεξουαλική συμπεριφορά στους άρρενες επηρεάζεται από τα επίπεδα της τεστοστερόνης, όχι μόνο όσον αφορά τη στυτική λειτουργία (Yassin AA. et al., 2008) αλλά και την αύξηση της σεξουαλικής επιθυμίας και διέγερσης (Siemens DR. et al.,2009, Gades NM. et al., 2008). Για το ρόλο των ανδρογόνων στη γυναικεία σεξουαλικότητα υπάρχουν αντικρουόμενα ευρήματα (Stuckey BG, 2008). Υποστηρίζεται ότι δεν υπάρχει συσχετισμός μεταξύ επιπέδων των ανδρογόνων και ερωτικής επιθυμίας στις γυναίκες και ότι αυτή καθορίζεται κυρίως από τη δυσπαρεύνια και συναισθηματικές επιδράσεις (Van der Stege JG et al., 2008). Παραταύτα, η υποκατάσταση με ανδρογόνα σε προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με χαμηλά επίπεδα τεστοστερόνης και αναφερόμενη σεξουαλική δυσλειτουργία (μειωμένη ερωτική επιθυμία και ικανοποίηση ) προκαλεί αύξηση της ερωτικής επιθυμίας και της συχνότητας των σεξουαλικών επαφών (Van der Stege JG. et al., 2008, Davis S, et al., 2008 και Shufelt CL. Et al., 2009). Παρόμοια αποτελέσματα της χορήγησης ανδρογόνων και βελτίωσης της ερωτικής τους ζωής αναφέρονται και σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με σεξουαλική δυσλειτουργία (Davis SR. et al., 2005). Όσον αφορά την επίδραση των οιστρογόνων στην σεξουαλική λειτουργία, αυτή φαίνεται να είναι πολύπλοκη. Υπάρχουν μελέτες που συσχετίζουν τα επίπεδα των οιστρογόνων με αυξημένη ερωτική επιθυμία και διέγερση (Jennifer e. Frank et al., 2008), έντονο αίσθημα θελκτικότητας και αύξηση της σεξουαλικής δραστηριότητας (Kristina M Durante et al., 2009). H υποκατάσταση με οιστρογόνα σε γυναίκες με πρώιμη ωοθηκική ανεπάρκεια βελτιώνει την αναφερόμενη σεξουαλική δυσλειτουργία της συγκεκριμένης ομάδας (Sophia N. Kalantaridou et al., 2008). Αντιθέτως, παρόλο που τα χαμηλά επίπεδα οιστρογόνων και η κολπική ατροφία συσχετίζονται με μειωμένες τιμές κολπικής τονικότητας (vaginal congestion) όταν μια γυναίκα δεν λαμβάνει ερωτικά ερεθίσματα, το ποσοστό αύξησης της κολπικής τονικότητας ως απόκριση σε ένα ερωτικό ερέθισμα είναι παρόμοιο παρουσία χαμηλών και υψηλών επιπέδων οιστρογόνων (Van Lunsen RHW, 2004). Παρομοίως, οι αλλαγές τόσο στον όγκο του κολπικού τοιχώματος και 7

8 της κλειτορίδας, όσο και της αιμάτωσης στις επικείμενες περιοχές ως απόκριση σε ένα ερωτικό ερέθισμα είναι παρόμοιες πριν και μετά την εμμηνόπαυση. Επιπλέον, ανεπάρκεια των οιστρογόνων δεν αποκλείει επαρκή εφύγρανση του κόλπου υπό την προϋπόθεση ότι το ερωτικό ερέθισμα είναι ικανοποιητικό (Van Lunsen RHW,2004 και Maravilla KR., 2003). Ωστόσο, έως και 40% των γυναικών με ανεπάρκεια οιστρογόνων μπορεί να έχουν συμπτωματική κολπική ατροφία η οποία επηρεάζει δυσμενώς την σεξουαλική λειτουργία (Rosen R, 2000). Επιπλέον, υπάρχουν μελέτες που υποστηρίζουν ότι η γυναικεία σεξουαλική δυσλειτουργία οφείλεται σε προβλήματα στις σχέσεις και προσωπικές αναστολές και δεν υπάρχουν ορμονικές συσχετίσεις με τα επίπεδα των οιστρογόνων και των ανδρογόνων (Schover LR., 2008 και Prescrire Int., 2007). Για τους λόγους αυτούς, η επίδραση των φυλετικών ορμονών στη γυναικεία σεξουαλική συμπεριφορά αποτελεί αντικείμενο περαιτέρω μελέτης (Stuckey BG, 2008) ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΑ Τα οιστρογόνα είναι μια ομάδα στεροειδών χημικών ενώσεων με ορμονική δράση. Τα οιστρογόνα συντίθενται σε ιστούς, όπως το ήπαρ, η καρδιά, οι μύες, τα οστά καθώς και τον εγκέφαλο. Τα οιστρογόνα κυκλοφορούν στο αίμα και των δύο φύλων αλλά βρίσκονται σε πολύ μεγαλύτερες συγκεντρώσεις σε γυναίκες αναπαραγωγικής ηλικίας. Αποτελούν τις κύριες ορμόνες του θηλυκού φύλου, παίζοντας σημαντικό ρόλο τόσο στο αναπαραγωγικό σύστημα, ρυθμίζοντας την ανάπτυξη και την φυσιολογία του, όσο και σε άλλα συστήματα του οργανισμού. Στους άνδρες τα οιστρογόνα ρυθμίζουν διάφορες λειτουργίες του αναπαραγωγικού συστήματος που έχουν να κάνουν με ωρίμανση του σπέρματος και είναι συνδεδεμένα με τη σεξουαλική επιθυμία. Τα οιστρογόνα διαδραματίζουν διαφορετικό ρόλο σε διαφορετικούς ιστούς, πολλές φορές έχοντας ευεργετικό ρόλο ενώ άλλες φορές επιβλαβή (Πίνακας 1.1). 8

9 Πίνακας 1.1: Σύνοψη των βασικών βιολογικών ρόλων των οιστρογόνων Οιστρογόνα- Γενικός Βιολογικός τους ρόλος 1. Διεγείρουν την ανάπτυξη των ωοθηκών και των ωοθηλακίων. 2. Διεγείρουν την ανάπτυξη του λείου μυός και την υπερπλασία των επιθηλιακών επιφανειών της αναπαραγωγικής οδού. Επιπρόσθετα: I. Ωαγωγοί: Αυξάνουν τις συστολές και τη δραστηριότητα των κροσσών II. Μήτρα: Αυξάνουν τις μυομήτριες συστολές και την ανταποκρισιμότητα σε ωοκυτοκίνη. Διεγείρουν την έκκριση άφθονης διαυγούς βλέννας από τον τράχηλο. Πορετοιμάζουν το ενδομήτριο για προγεστερονική επίδραση, αυξάνοντας τους υποδοχείς προγεστερόνης. III. Κόλπος: Αυξάνουν την επιστρωμάτωση των επιθηλιακών κυττάρων 3. Διεγείρουν την ανάπτυξη των έξω γεννητικών οργάνων 4. Διεγείρουν την ανάπτυξη των μαστών και ιδιαίτερα τους αντίστοιχος πόρους και την εναπόθεση λίπους. 5. Διεγείρουν την σχηματοποίηση του θηλυκού σώματος: στενοί ώμοι, ευρεία ισχία, ειδική κατανομή, σε σχέση με του άρρενες, του λίπους στην ισχιακή χώρα και στους μαστούς. 6. Διεγείρουν την έκκριση μιας αδενοϋγρώδους σμηγματογόνου ουσίας, η οποία αντιτίθεται στη φέρουσα ακμή ιδιότητα των ανδρογόνων. 7. Διεγείρουν την εμφάνιση συγκεκριμένου σχεδίου κατανομής της εφηβικής θηλυκής τριχοφυΐας. Η καθαυτό αύξηση, σε αντίθεση με την εμφάνιση του σχεδίου τόσο στο εφηβαίο όσο και στη μασχαλιαία τριχοφυΐα είναι ανδρογονοδιεγειρόμενη. 8. Διεγείρουν την αύξηση των οστών όπως επίσης και την παύση της οστικής αύξησης (οστεοποίηση συζευκτικών χόνδρων). Προστατεύουν από την οστεοπόρωση και δεν έχουν αναβολική δράση στους σκελετικούς μύες. 9. Φέρουν αγγειακές επιδράσεις ( ανεπάρκεια τους δημιουργεί θερμοερυθρίαση). 10. Επιδρούν ανατροφοδοτικά στον υποθάλαμο και στην πρόσθια υπόφυση. 11. Συμβάλλουν στη σωματική κατακράτηση υγρών από τους νεφρούς. 12. Διεγείρουν την έκκριση της προλακτίνης αλλά αναστέλλουν την γαλακτοπαραγωγική επίδραση της ίδιας ορμόνης επάνω στους μαστούς. 13. Προστατεύουν από την αρτηριοσκλήρυνση, τουλάχιστον μερικώς, με τις επιδράσεις τους στη χοληστερίνη του πλάσματος, στα αιμοφόρα αγγεία και στην πήξη του αίματος. 14. Επιδρούν σε εγκεφαλικούς νευρώνες, όπου μπορεί να ενδυναμώσουν τη μάθηση και τη θύμηση. 9

10 Εικόνα 1.1: Ενδεικτικό σχήμα για τις περιοχές δράσης και λειτουργίες των οιστρογόνων 1.3. ΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ Τα οιστρογόνα δρουν με πολλαπλούς μηχανισμούς σε πολλούς διαφορετικούς ιστούς του ανθρώπου. Επιδρούν κυρίως στους ιστούς του γυναικείου και του ανδρικού αναπαραγωγικού συστήματος όπως, οι μαστοί, η μήτρα, ο κόλπος, οι ωοθήκες, οι όρχεις και ο προστάτης (Nikov GN et al., 2000) (Εικόνα 1.1). Στα όργανα του γυναικείου αναπαραγωγικού συστήματος, τα οιστρογόνα διεγείρουν την αύξηση, τη ροή του αίματος και την κατακράτηση ύδατος. Παίζουν επίσης σπουδαίο ρόλο στην ομοιόσταση των οστών, στο κεντρικό νευρικό σύστημα καθώς και στο καρδιαγγειακό σύστημα (Gruber CJ et al., 2002, Vander A et al., 2001). Επιδράσεις στο μαστό Στο μαστικό αδένα τα οιστρογόνα διεγείρουν την αύξηση και τη διαφοροποίηση των επιθηλιακών κυττάρων και των γαλακτοφόρων πόρων. Επάγουν τη μιτωτική δραστηριότητα των κυλινδρικών κυττάρων των γαλακτοφόρων πόρων και διεγείρουν την αύξηση του κολλαγόνου του 10

11 συνδετικού ιστού. Προκαλούν επίσης αύξηση του λιπώδους ιστού του μαστού. Η άθροιση λιπώδους ιστού και κολλαγόνου του συνδετικού ιστού προκαλεί διόγκωση των μαστών κατά την εφηβεία (Junquiera LC et al., 1992). Τα οιστρογόνα επιδρούν και στη μικροκυκλοφορία του μαστού εκδηλώνοντας δράσεις παρόμοιες με αυτές της ισταμίνης (Gruber CJ et al., 2002). Η πυκνότητα των υποδοχέων των οιστρογόνων στο μαστικό αδένα μεταβάλλεται ανάλογα με τη φάση του εμμηνορυσιακού κύκλου. Η μεγαλύτερη συγκέντρωση παρατηρείται κατά τη ωοθυλακική φάση όπου σημειώνεται πολλαπλασιασμός των κυττάρων των γαλακτοφόρων πόρων (Junquiera LC et al., 1992). Μετά την ωορρηξία η συγκέντρωση των υποδοχέων ελαττώνεται (Gruber CJ et al., 2002). Επιδράσεις στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα Το ποσό των οιστρογόνων που συντίθενται στον εγκέφαλο είναι μικρό σε σχέση με αυτό που συντίθεται σε άλλους ιστούς. Παρόλα αυτά πιστεύεται ότι τα οιστρογόνα που παράγονται στο όργανο αυτό εκδηλώνουν σπουδαίες δράσεις. Με την πάροδο της ηλικίας τα οιστρογόνα πιστεύεται ότι έχουν νευροπροστατευτική δράση. Σε εγκεφαλικό ιστό από ενήλικους αρουραίους τα οιστρογόνα επάγουν την αναδόμηση των δενδριτών και των συνάψεων και προκαλούν ενεργοποίηση νευρογλοιακών κυττάρων. Σε καλλιέργειες ανθρώπινων κυττάρων νευροβλαστώματος, τα οιστρογόνα παρουσιάζουν νευροπροστατευτική δράση και μειώνουν την παραγωγή των πεπτιδίων β-αμυλοειδούς. Υπάρχουν επιδημιολογικά δεδομένα που υποδεικνύουν ότι η πτώση στα επίπεδα των οιστρογόνων (κάτι το οποίο συμβαίνει κατά την εμμηνόπαυση) σχετίζεται με μείωση της γνωστικής λειτουργίας και με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης της νόσου του Alzheimer. Σε μια τυχαιοποιημένη μελέτη ωστόσο, εξωγενής χορήγηση οιστρογόνων δεν είχε καμία ευεργετική δράση σε γυναίκες με τη νόσο αυτή. 11

12 Επιδράσεις στο καρδιαγγειακό σύστημα Τα οιστρογόνα θεωρούνται φυσικοί αγγειοπροστατευτικοί παράγοντες. Υποδοχείς των οιστρογόνων έχουν εντοπιστεί στα λεία κύτταρα των στεφανιαίων αρτηριών και σε ενδοθηλιακά κύτταρα σε διάφορα σημεία. Τα οιστρογόνα προκαλούν βραχείας διάρκειας αγγειοδιαστολή μέσω αυξημένης σύνθεσης νικτρικού οξειδίου και προστακυκλίνης στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Προκαλούν, επίσης, ελάττωση του λείου μυϊκού τόνου των αγγείων, επιδρόντας σε συγκεκριμένα κανάλια ασβεστίου. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω ενός μηχανισμού που εξαρτάται από το κυκλικό camp. Στο ήπαρ, τα οιστρογόνα αυξάνουν τους υποδοχείς των λιποπρωτεϊνών με επακόλουθο τη μείωση της συγκέντρωσης της LDLχοληστερόλης στο πλάσμα. Από την άλλα πλευρά, αυξάνουν τη σύνθεση των παραγόντων πήξης με συνέπεια τον αυξημένο κίνδυνο θρομβώσεων. Τα οιστρογόνα μπορούν να δράσουν προστατευτικά όσον αφορά την αθηροσκλήρωση. Αυτό έδειξαν πειράματα σε πιθήκους, στα οποία η χορήγηση οιστρογόνων επιβράδυνε το σχηματισμό αθηρωματικών πλακών στις στεφανιαίες αρτηρίες. Δεν είχε ωστόσο καμία επίδραση σε ήδη σχηματισμένες αθηρωματικές πλάκες. Σε κυτταρικό επίπεδο, τα οιστρογόνα αναστέλλουν την απόπτωση των κυττάρων του ενδοθηλίου και in vitro προάγουν την αγγειογενετική τους δραστηριότητα (Gruber CJ et al., 2002). Επιδράσεις στην ομοιόσταση των οστών Παρά το γεγονός ότι οι υποδοχείς οιστρογόνων υπάρχουν και στους οστεοβλάστες και τους οστεοκλάστες, η κύρια δράση των οιστρογόνων στα οστά συνίσταται στην αναστολή της λειτουργίας των οστεοκλαστών. Σε ποντίκια, η έλλειψη οιστρογόνων οδήγησε σε αύξηση της παραγωγής ιντερλευκίνης-6, ιντερλευκίνης-1 και TNF (tumor necrosis factor) στους οστεοβλάστες και άλλα κύτταρα των οστών. Οι παράγοντες αυτοί διεγείρουν έμμεσα τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών. Σε δείγματα οστών που ελήφθησαν από μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με οστεοπόρωση, τα mrna της ιντερλευκίνης-6 και ιντερλευκίνης-1 βρέθηκαν 12

13 σε υψηλά επίπεδα. Τα χαμηλά επίπεδα οιστρογόνων φαίνεται να επιταχύνουν την απώλεια του οστίτη ιστού και να αυξάνουν τον κίνδυνο καταγμάτων. Η θεραπεία με οιστρογόνα ελαττώνει την απώλεια οστίτη ιστού και τον κίνδυνο καταγμάτων τόσο σε υγιείς γυναίκες όσο και σε γυναίκες με οστεοπόρωση(gruber CJ et al., 2002) ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ Τα οιστρογόνα παράγονται στις προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες, κυρίως στις ωοθήκες, στο ωχρό σωμάτιο, και στον πλακούντα. Μια μικρή αλλά σημαντική ποσότητα των οιστρογόνων μπορεί επίσης να παραχθεί και σε άλλα όργανα (που δεν αποτελούν μέρος του αναπαραγωγικού συστήματος), όπως το ήπαρ, την καρδιά, το δέρμα, και τον εγκέφαλο, όπως αναφερθήκαμε και παραπάνω. Υπάρχουν τρεις κύριες μορφές των οιστρογόνων στα θηλυκά άτομα: η οιστρόνη (Ε1), η οιστραδιόλη (Ε2, ή 17β-οιστραδιόλη) και η οιστριόλη (Ε3) H βιοσύνθεση των οιστρογόνων ξεκινά από την χοληστερόλη που είναι στερόλη με 27 άτομα άνθρακα. Η οιστραδιόλη (Ε2) είναι το κύριο προϊόν από την όλη τη διαδικασία της βιοσύνθεσης και είναι το πιο ισχυρό οιστρογόνο κατά τη διάρκεια της προεμμηνοπαυσιακής περιόδου στη ζωή της γυναίκας, ενώ η οιστρόνη (Ε1) διαδραματίζει σημαντικότερο ρόλο μετά την εμμηνόπαυση, όταν συντίθεται στο λιπώδη ιστό από την επινεφριδιακή διϋδροεπιανδροστενεδιόνη (DHEA). Η οιστριόλη (Ε3) είναι το λιγότερο ισχυρό οιστρογόνο και σχηματίζεται από την οιστρόνη μέσω 16α-υδροξυλίωσης και παίζει σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης όταν αυτή παράγεται σε μεγάλες ποσότητες από τον πλακούντα. Αυτό το οποίο παίζει πρωταρχικό ρόλο στη ρύθμιση του μηχανισμού σύνθεσης των οιστρογόνων είναι το ένζυμο αρωματάση. Αφού συνδεθεί με λιποπρωτεϊνικούς υποδοχείς, η χοληστερόλη εισέρχεται στα κύτταρα που παράγουν στεροειδείς ορμόνες, αποθηκεύεται και μετακινείται προς τα σημεία που γίνεται η σύνθεση των ορμονών (Gruber CJ et al., 2002). Η σύνθεση των στεροειδών ορμονών από τη χοληστερόλη περιλαμβάνει μια σειρά 13

14 μετατροπών κατά τις οποίες η πλευρική αλυσίδα του D-δακτυλίου αφαιρείται μερικώς δημιουργώντας ενώσεις με 21 άτομα άνθρακα (προγεστερόνη και γλυκοκορτικοειδή). Στη συνέχεια, η πλευρική αλυσίδα του D-δακτυλίου αφαιρείται ολοκληρωτικά. Έτσι δημιουργούνται στεροειδή με 19 άτομα άνθρακα, τα ανδρογόνα. Τέλος, αφαιρείται η μεθυλομάδα που βρίσκεται μεταξύ του Α- και Β- δακτυλίου, αντίδραση που οδηγεί στην παραγωγή στεροειδών με 18 άτομα άνθρακα, δηλαδή τα οιστρογόνα. Όλες οι παραπάνω αντιδράσεις γίνονται με τη βοήθεια ενζύμων που ονομάζονται μονοοξυδάσες ή οξειδάσες μεικτής λειτουργίας (Miller WR., 2004) και (Εικόνα 1.2). Εικόνα 1.2: Η βιοσύνθεση των οιστρογόνων από τη χοληστερόλη Η τελευταία αντίδραση, αυτή της μετατροπής των ανδρογόνων σε οιστρογόνα, καταλύεται από μια μονοοξυγονάση που ονομάζεται αρωματάση του κυτοχρώματος Ρ-450 (Εικόνα 1.3). Η αρωματοποίηση γίνεται με 3 διαδοχικές αντιδράσεις υδροξυλίωσης κατά τις οποίες χρησιμοποιείται μοριακό οξυγόνο και το ανηγμένο συνένζυμο NADPH. Για το σχηματισμό κάθε τάξης οιστρογόνου χρησιμοποιείται διαφορετικό μόριο ανδρογόνου. Για παράδειγμα η 17-β οιστραδιόλη σχηματίζεται από την τεστοστερόνη και η οιστρόνη από την Δ4- ανδροστενεδιόνη. Στο ήπαρ εξάλλου η οιστραδιόλη μπορεί να μετατραπεί σε οιστριόλη (Gruber CJ et al., 2002). Η οιστραδιόλη είναι το πιο ισχυρό οιστρογόνο από τις 3 ενώσεις (Junquiera LC et al., 1992). Το ένζυμο αρωματάση, το γονίδιο του οποίου εντοπίζεται στον μεγάλο βραχίονα του χρωμοσώματος 15 (15q), είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση όλων των οιστρογόνων, ανεξαρτήτως του ανδρογόνου που χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα ή 14

15 και του ιστού όπου γίνεται η σύνθεση. Το ανδρογόνο που χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα στους περισσότερους ιστούς είναι η ανδροστενεδιόνη και προκειμένου να εκδηλωθεί πλήρης οιστρογονική δραστηριότητα, η παραγόμενη οιστρόνη μετατρέπεται σε οιστραδιόλη με τη δράση του ενζύμου δεϋδρογονάση της 17βοιστραδιόλης (Miller WR., 2004). Εικόνα 1.3: Δομή και σύνθεση των ενδογενών οιστρογόνων από τα ανδρογόνα Ένζυμο Αρωματάση Το ένζυμο αρωματάση είναι υπεύθυνο για το τελευταίο βήμα στη σύνθεση της οιστραδιόλης. Η αρωματάση είναι ένα μέλος της υπεροικογένειας του κυτοχρώματος Ρ-450 και εκφράζεται ευρέως σε πολλές περιοχές, συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου, των γονάδων, των αιμοφόρων αγγείων, του ήπατος, των οστών, του δέρματος, τους λιπώδους ιστού καθώς και του ενδομητρίου (Santen RJ et al., 2009). Αναστέλλοντας τη δράση του ενζύμου αρωματάση, μειώνονται τα επίπεδα οιστρογόνων στο αίμα ή στους νεοπλασματικούς ιστούς εμποδίζοντας έτσι το σχηματισμό της οιστραδιόλης. Η δραστικότητα της αρωματάσης μπορεί να διαφοροποιηθεί από μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις όπως η φωσφορυλίωση (Charlier TD et al., 2011). Η δραστηριότητας της αρωματάσης αναστέλλεται ισχυρά επίσης 15

16 και από αυξημένες συγκεντρώσεις του ΑΤΡ, Mg 2+, Ca 2+ ή από κάποιες επιδράσεις που εξαρτώνται από την δραστικότητα των κινασών πρωτεϊνών. Η αρωματάση εκφράζεται στις γονάδες και των δύο φύλων. Στην ωοθήκη, περιορισμένη έκφραση της αρωματάσης έχουμε μόνο στα κοκκιώδη και ωχρινικά κύτταρα ΙΣΤΟΙ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ Τα κύρια σημεία βιοσύνθεσης των οιστρογόνων στον οργανισμό διαφέρουν στις προεμμηνοπαυσιακές και μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες (Miller WR., 2004). Πριν την εμμηνόπαυση η κύρια πηγή της οιστραδιόλης στις γυναίκες είναι οι ωοθήκες και συγκεκριμένα τα κοκκιώδη κύτταρα της έσω θήκης των ωοθηλακίων. Σύμφωνα με τη «θεωρία των δύο κυττάρων», τα κύτταρα της έσω θήκης των ωοθυλακίων εκκρίνουν ανδρογόνα τα οποία στη συνέχεια μετατρέπονται σε οιστρογόνα από τα κοκκιώδη κύτταρα. Υπάρχουν ωστόσο ενδείξεις ότι και οι δύο τύποι κυττάρων, (κοκκιώδη κύτταρα και κύτταρα της έσω θήκης), είναι σε θέση να παράγουν τόσο ανδρογόνα όσο και οιστρογόνα. Τα άλλα δύο οιστρογόνα η οιστρόνη και η οιστριόλη συντίθενται κυρίως στο ήπαρ με πρόδρομο την οιστραδιόλη (Gruber CJ et al., 2002). In vitro μελέτες έχουν δείξει ότι η σύνθεση των οιστρογόνων λαμβάνει χώρα και σε μια σειρά άλλων ιστών όπως ο λιπώδης ιστός, ο μυϊκός ιστός, η επιδερμίδα, το ήπαρ, ο νευρικός ιστός και τα κύτταρα Leydig των όρχεων (Gruber CJ et al., 2002) και (Miller WR., 2004). Τα ποσά των οιστρογόνων που παράγονται στους παραπάνω ιστούς είναι μικρότερα σε σχέση με αυτά που απελευθερώνονται από τις ωοθήκες. Αυτό οφείλεται στη χαμηλότερη δράση της αρωματάσης (Miller WR., 2004). Τα επίπεδα των οσιτρογόνων στο πλάσμα μεταβάλλονται κατά τη διάρκεια του εμμηνορυσιακού κύκλου. Τα υψηλότερα επίπεδα οιστραδιόλης παρατηρούνται στη φάση πριν την ωορρηξία και τα χαμηλότερα στην προεμμηνοροϊκή φάση. Μετά την εμμηνόπαυση, οι ωοθήκες χάνουν την ικανότητα μετατροπής των ανδρογόνων σε οιστρογόνα (Miller WR., 2004). Τα επίπεδα της οιστραδιόλης στο πλάσμα είναι συχνά χαμηλότερα από 20pg/ml και το μεγαλύτερο μέρος της οιστραδιόλης σχηματίζεται στους περιφερικούς ιστούς. Η οιστρόνη είναι το οιστρογόνο που επικρατεί σε αυτές τις γυναίκες (Gruber CJ et al., 2002). 16

17 Παρά το γεγονός ότι ο λιπώδης και μυϊκός ιστός παρουσίαζουν μικρή δραστηριότητα αρωματάσης, η μεγάλη μάζα τους στο σώμα μπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή σχετικά σημαντικών ποσών οιστρογόνων ημερησίως. In vivo μελέτες έδειξαν ότι οι μυς μπορούν να συνθέσουν έως και το 30% των περιφερικών παραγόμενων οιστρογόνων, ενώ για το λιπώδη ιστό το αντίστοιχο ποσό μπορεί να φτάσει το 15%. Φαίνεται επομένως, ότι υπάρχει θετική συσχέτιση μεταξύ των ποσοστών του μυϊκού και λιπώδους ιστούς και των επιπέδων των οιστρογόνων στο πλάσμα των μετεμμηνοπαυσικών γυναικών. Η δραστηριότητα της αρωματάσης μπορεί επίσης να διαφέρει μεταξύ διαφορετικών περιοχών του ίδιου ιστού. Για παράδειγμα ο λιπώδης ιστός των γλουτών εμφανίζει σημαντικά υψηλότερη δραστηριότητα του ενζύμου συγκριτικά με το λιπώδη ιστό των μηρών. Οι διαφορές αυτές αντανακλούν διαφορές στον τοπικό έλεγχο της σύνθεσης των οιστρογόνων (Miller WR., 2004). Ο έλεγχος της σύνθεσης των οιστρογόνων διαφέρει ανάμεσα σε γυναίκες που βρίσκονται σε αναπαραγωγική ηλικία και σε γυναίκες μετά την εμμηνόπαυση. Πριν την εμμηνόπαυση, ο κύριος έλεγχος εξασκείται από τις γοναδοτροπίνες της υπόφυσης, δηλαδή την ωοθυλακιοτρόπο ορμόνη (FSH) και ωχρινοτρόπο ορμόνη (LH). Στους περιφερικούς ιστούς οι ρυθμιστικοί παράγοντες δεν έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως, περιλαμβάνουν όμως γλυκοκορικοειδή, κυτονίνες, προσταγλανδίνες κ.α. Παράγοντες που δρουν είτε μέσω του camp είτε μέσω των προσταγλανδινών E2 είναι σε θέση να επάγουν τη δραστηριότητα της αρωματάσης σε καλλιέργειες ινοβλαστών του μαστού. Ιστοειδική και κυτταροειδική σύνθεση της οιστραδιόλης Η σύνθεση οιστρογόνων διαφέρει μεταξύ γυναικών αναπαραγωγικής ηλικίας και γυναικών μη αναπαραγωγικής ηλικίας που βρίσκονται είτε στην εμμηνόπαυση είτε πριν από την εφηβεία. Στις γυναίκες μη αναπαραγωγικής ηλικίας, οι κύριες πηγές παραγωγής οιστρογόνων περιλαμβάνουν τους περιφερικούς ιστούς όπως, τα νεφρά, τον λιπώδη ιστό, το δέρμα και τον εγκέφαλο. Τα οιστρογόνα που συντίθενται στις ωοθήκες απελευθερώνονται κυρίως στην κυκλοφορία του αίματος. Αντίθετα, τα οιστρογόνα που 17

18 συντίθενται εντός του εγκέφαλου, του δέρματος, των νεφρών και του λιπώδους ιστού δρουν κυρίως τοπικά στην θέση της σύνθεσης τους και λειτουργούν ως παρακρινή μόρια ώστε να διατηρήσουν σημαντικές ειδικές λειτουργίες των ιστών (Inoue T et al., 2012). Επισπροσθέτως, τα οιστρογόνα συντίθενται και στα οστά. Αυτό φαίνεται και από την παρουσία υψηλών επιπέδων δραστικότητας της αρωματάσης σε πρωτογενή κύτταρα οστεοβλαστών (Watanabe M et al., 2007). Η σύνθεση των οιστρογόνων εμφανίζεται πιο ενεργή σε μεσεγχυματικά κύτταρα του λιπώδους ιστού και στους οστεοβλάστες των οστών των μετεμμηνοπαυσιακών γυναικών από ότι γυναικών οι οποίες βρίσκονται σε ηλικία αναπαραγωγής, υποδηλώνοντας ότι αυτή η παραγωγή οιστρογόνων διαδραματίζει σημαντικό φυσιολογικό ρόλο σε ιστοειδικές λειτουργίες (Janssen JM et al., 1999). Επίσης, η σύνθεση οιστρογονών παρατηρείται και σε όρχεις δρώντας τοπικά ώστε να ρυθμιστεί η κανονική ανάπτυξη των αρσενικών γονάδων και παίζοντας ιδιαίτερο ρόλο στη σπερματογένεση (Carreau S et al., 2012). Σύνθεση της οιστραδιόλης στις ωοθήκες Η ικανότητα σύνθεσης οιστρογόνων είναι ένα ουσιαστικό χαρακτηριστικό υγιών ωοθηκών στα αναπαραγωγικά θηλυκά άτομα (Εικόνα 1.4). Εντός της ωοθήκης, αρκετοί κυτταρικοί τύποι υποστηρίζουν κανονική ωορρηξία κατά τη διάρκεια του εμμηνορυσιακού κύκλου και κατά τη διαδικασία της ωοθυλακιορρηξίας το αναπτυσσόμενο ωοθυλάκιο εμπλέκεται στην κύτταρο-ειδική σύνθεση οιστρογόνων. Τα οιστρογόνα που προέρχονται από την ωοθήκη, απελευθερώνονται στη γενική κυκλοφορία και δρουν σε αποκρινόμενους ιστούς συμπεριλαμβανομένων αναπαραγωγικών και μη αναπαραγωγικών οργάνων. Τα επίπεδα σύνθεσης οιστρογόνων εξαρτώνται από την αναπαραγωγική κατάσταση του ατόμου και φθάνουν τα υψηλότερα επίπεδα κατά τη διάρκεια των αναπαραγωγικών ετών, και μειώνονται κατά τη διάρκεια της μετάβασης δηλαδή την εφηβεία και την περίοδο μετά την εμμηνόπαυση. Κατά τη διάρκεια του εμμηνορρυσιακού κύκλου η οιστραδιόλη φτάνει στο υψηλότερο επίπεδο της αμέσως πριν την ωορρηξία. 18

19 Εικόνα 1.4: Σύνοψη των ορμονικών δράσεων κατά τον ωοθυλακικό και ενδομήτριο κύκλο της έμμηνου ρύσης. Στην εικόνα παρουσιάζεται η σχέση μεταξύ των αλλαγών στις ωοθήκες και στη μήτρα κατά τη διάρκεια του εμμηνορυσιακού κύκλου υπό την επίδραση των γοναδοτροπινών (FSH, LH) και των οιστρογόνων. Σύνθεση της οιστραδιόλης στον εγκέφαλο Ο εγκέφαλος είναι ένα πρόσθετο όργανο σύνθεσης οιστρογόνων από χοληστερόλη, το οποίο δεν ανήκει στο αναπαραγωγικό σύστημα. Μπορεί να συνθέσει από χοληστερόλη οιστρογόνα κάτι το οποίο αποδεικνύεται από την παρουσία όλων των ενζύμων που απαιτούνται για την σύνθεση οιστραδιόλης (Do Rego JL et al., 2009). Το Ρ-450 είναι ένα ένζυμο το οποίο καταλύει την μετατροπή της χοληστερόλης σε πρεγνενολόνη και έχει βρεθεί στον ιππόκαμπο, υποθάλαμο, αμυγδαλή, κερκοφόρο πυρήνα, θάλαμο, εγκεφαλικό φλοιό, παρεγκεφαλίδα κτλ. Επιπλέον, η δραστικότητα και έκφραση της αρωματάσης στον ανθρώπινο εγκέφαλο, που αποτελεί το τελικό ένζυμο στη σύνθεση της οιστραδιόλης, περιγράφηκε για πρώτη φορά στην υποθαλαμική και μεταιχμιακή περιοχή, όπου τα οιστρογόνα παίζουν σημαντικούς ρόλους στην διαφοροποίηση του φύλου και τον έλεγχο της σεξουαλικής συμπεριφοράς (Naftolin F et al., 1971, Wright CL, et al., 2010 και Azcoitia I et al., 2011). 19

20 Αργότερα, η έκφραση της αρωματάσης ανακαλύφθηκε και σε "μηπρωτεύοντες αναπαραγωγικές" περιοχές του εγκεφάλου, συμπεριλαμβανομένων των περιοχών του προσθίου εγκεφάλου, του ιππόκαμπου, του θαλάμου, του εγκεφαλικού φλοιού, της παρεγκεφαλίδας καθώς και του εγκεφαλικού στελέχους. Αυτές οι περιοχές εμπλέκονται στη ρύθμιση της ανάπτυξης του νευρικού συστήματος, της συναπτικής πλαστικότητας καθώς και στην επιβίωση των κυττάρων (Azcoitia I et al., 2011). Ύστερα από in situ υβριδοποίηση, ανοσοϊστοχημεία και ποσοτικό προσδιορισμό σε κυτταρικό επίπεδο, η δραστηριότητα της αρωματάσης εντοπίστηκε σε αστροκύτταρα και νευρώνες (Gatson JW et al., 2011). Αυτή η κύτταρο-ειδική έκφραση της αρωματάσης σε αυτή την περιοχή του εγκεφάλου δείχνει ότι η τοπική παραγωγή της οιστραδιόλης μπορεί να είναι σημαντική για συγκεκριμένες λειτουργίες του εγκεφάλου. Έχει αναφερθεί ότι τα επίπεδα οιστραδιόλης στον εγκέφαλο κυμαίνονται από 0,08 έως 0,19 ng / g υγρού βάρους (Rosario ER et al., 2011), συνεπώς, τα επίπεδα των οιστρογόνων στον εγκέφαλο μπορεί να μην είναι τα ίδια με εκείνα στο αίμα, τα οποία συχνά χρησιμοποιούνται ως διαγνωστικός παράγων σε κλινικές μελέτες. Τα επίπεδα σύνθεσης της οιστραδιόλης κατά την διάρκεια της γήρανσης αποτελούν μια κρίσιμη βιοχημική μεταβολή για τα θηλυκά άτομα. Η απότομη μείωση των επιπέδων της οιστραδιόλης κατά τη διάρκεια της εμμηνόπαυσης συνήθως συνδέεται με διάφορες ασθένειες που παρατηρήθηκαν σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες καθώς και η μείωση της γνωστικής λειτουργίας ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ Μετά τη σύνθεση της 17β- οιστραδιόλης κυρίως στις ωοθήκες, απελευθερώνεται στην κυκλοφορία του αίματος, όπου συνδέεται αντιστρεπτά με μια β- σφαιρίνη που συνδέεται με τις ορμόνες του φύλου (sex-hormone-binding globulin, SHBG). Με μικρότερη συγγένεια γίνεται η σύνδεση της με την αλβουμίνη ενώ ένα ποσοστό της γύρω στο 2-3% κυκλοφορεί ελεύθερο. 20

21 Τα οιστρογόνα μεταβολίζονται με τη δράση είτε σουλφατασών είτε γλυκουρονιδασών και τα παράγωγά τους απεκκρίνονται μέσω της χολής ή των ούρων. Τα παράγωγα αυτά μπορούν να υδρολυθούν στη συνέχεια από τη μικροχλωρίδα του εντέρου και τα οιστρογόνα που θα προκύψουν να επαναπορροφηθούν μέσω της εντεροηπατικής κυκλοφορίας. Τα οιστρογόνα μεταβολίζονται επίσης μέσω υδροξυλίωσης και επακόλουθης μεθυλίωσης τους προς τα υδροξυλιωμένα και μεθυλιωμένα παράγωγά τους. Η υδροξυλίωση οδηγεί στο σχηματισμό 2-υδρόξυ-οιστρογόνων, 4-υδρόξυοιστρογόνων και 16-υδρόξυ-οιστρογόνων από τα οποία η 4-υδρόξυ-οιστρόνη και 16-υδρόξυ-οιστραδιόλη θεωρούνται καρκινογόνα. Τα υδροξυλιωμένα παράγωγα των οιστρογόνων προσδένονται στους υποδοχείς οιστρογόνων και παρουσιάζουν ασθενή οιστρογονική δράση σε ζώα. Επιπλέον συμμετέχουν σε μια σειρά αντιδράσεων κατά τις οποίες παρατηρείται σχηματισμός ελευθέρων ριζών. Εξαιτίας τους σχηματισμού των ελευθέρων ριζών τα υδροξυ-οιστρογόνα πιστεύεται ότι μπορούν να προκαλέσουν γενετικές βλάβες ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ Τα οιστρογόνα όπως όλες οι ορμόνες μπορούν να επιδράσουν πάνω σε όλους τους ιστούς, αφού κυκλοφορούν μέσω του αίματος σε ολόκληρο το ανθρώπινο σώμα. Παρόλα αυτά, η απόκριση σε μια ορμόνη δεν είναι καθολική. Αντίθετα υπάρχει υψηλή εξειδίκευση η οποία αφορά μόνα κύτταρα-στόχους πάνω στα οποία δρα η ορμόνη αυτή. Η ικανότητα ορμονικής απόκρισης εξαρτάται από την παρουσία εξειδικευμένων υποδοχέων πάνω ή μέσα στο κύτταρο (Vander A et al., 2001). Σύνδεση με ενδοκυτταρικούς υποδοχείς Πρόκειται για τον κύριο μηχανισμό δράσης των οιστρογόνων. Οι ενδοκυττάριοι υποδοχείς των οιστρογόνων ανήκουν σε μια μεγάλη οικογένεια, την υπεροικογένεια των υποδοχέων των στεροειδών ορμονών. Οι υποδοχείς αυτοί εντοπίζονται κυρίως στον πυρήνα των κυττάρων στόχων (Piersen CE. 2003, Nikov GN et al., 2000 και Vander A et al., 2001). Το ελεύθερο οιστρογόνο διαχέεται μέσω της κυτταρικής μεμβράνης και εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα. Όταν ο υποδοχέας είναι πυρηνικός, η 21

22 ορμόνη διαχέεται μόνη της μέχρι τον πυρήνα και συνδέεται με τον υποδοχέα εκεί. Στην περίπτωση του κυτταροπλασματικού υποδοχέα, το σύμπλοκο σχηματίζεται στο κυτταρόπλασμα και στη συνέχεια διαχέεται προς τον πυρήνα. Ο υποδοχέας, ο οποίος είναι ανενεργός για όσο χρονικό διάστημα δεν έχει δεσμευτεί με την ορμόνη, μετά τη σύνδεση του με αυτή αλλάζει τη στερεοδιαμόρφωσή του και ενεργοποιείται (Vander A, et al. 2001). Ο ενεργοποιημένος πλέον υποδοχέας, δεσμεύεται σε μια συγκεκριμένη αλληλουχία βάσεων κοντά σε ένα γονίδιο του DNA, η οποία ονομάζεται στοιχείο απόκρισης στα οιστρογόνα (Estrgen Response Elements- EREs) και μεταβάλλει το ρυθμό μεταγραφής των γονιδίων-στόχων (Nikov GN et al., 2000 και Vander A et al., 2001). Προκαλείται έτσι αλλαγή στο ρυθμό σύνθεσης της πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από συγκεκριμένο το γονίδιοστόχο. Το τελικό αποτέλεσμα της αλλαγής της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης είναι η ενεργοποίηση ή η αναστολή διαδικασιών οι οποίες επιτελούνται στο κύτταρο ή και ακόμη η αλλαγή του ρυθμού έκκρισης της συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Αν για παράδειγμα, η πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο είναι ένα ένζυμο τότε η απόκριση του κυττάρου θα εκδηλωθεί με μεταβολή της ταχύτητας της αντίδρασης η οποία καταλύεται από το συγκεκριμένο ένζυμο. Μεταξύ των πρωτεϊνών των οποίων η σύνθεση προάγεται από τα οιστρογόνα είναι αυτή η οποία παράγει τον υποδοχέα της προγεστερόνης (Vander A et al., 2001). Τα οιστρογόνα μπορούν επίσης να μεταβάλλουν την μεταγραφή γονιδίων που δεν διαθέτουν λειτουργικό στοιχείο απόκρισης στα οιστρογόνα. Αυτό επιτυγχάνεται με ρύθμιση της δραστηριότητας άλλων μεταγραφικών παραγόντων. Σύνδεση με υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης Οι μεταβολές στην πρωτεϊνική σύνδεση που εκκινούνται από τους ενδοκυττάριους υποδοχείς είναι σχετικά αργές, δηλαδή απαιτούν κάποια λεπτά ή και ώρες για να εκδηλωθούν. Τα οιστρογόνα όμως παρουσιάζουν και κάποιες δράσεις που δεν μπορούν να εξηγηθούν με τον μηχανισμό που 22

23 περιγράφτηκε παραπάνω λόγω της γρήγορης απόκρισης τους. Οι δράσεις αυτές είναι αποτέλεσμα της σύνδεσης των οιστρογόνων με υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης οι οποίοι παρουσιάζουν αρκετές ομοιότητες με τους ενδοκυττάριους υποδοχείς. Παράδειγμα τέτοιων δράσεων είναι η ταχεία αγγειοδιαστολή των στεφανιαίων αρτηριών (Gruber CJ et al., 2002). Η ενεργοποίηση των οιστρογονικών υποδοχέων είναι δυνατόν να επιτευχθεί κάποιες φορές χωρίς να έχει προηγηθεί η σύνδεση τους με την ορμόνη. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η ενεργοποίηση είναι αποτέλεσμα φωσφορυλίωσης του υποδοχέα με ειδικές κινάσες. Η φωσφορυλίωση γίνεται κυρίως σε συγκεκριμένα υπολείμματα σερίνης ή τυροσίνης και καταλύεται από τα ένζυμα όπως κινάση της τυροσίνης. In vitro μελέτες έχουν δείξει ότι σαν ενεργοποιητές κινασών μπορούν να δράσουν η ντοπαμίνη, ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας και η ινσουλίνη ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΙΚΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ (ERs) Οι βιολογικές λειτουργίες των οιστρογόνων εξαρτώνται από τη σύνδεση τους με τους οιστρογονικούς υποδοχείς (ERs) οι οποίοι χωρίζονται σε άλφα οιστρογονικούς υποδοχείς (ΕRα) και βήτα οιστρογονικούς υποδοχείς (ΕRβ). Η σηματοδότηση των οιστρογόνων διεγείρεται επιλεκτικά ή αναστέλλεται ανάλογα με την ισορροπία που υπάρχει μεταξύ των δραστηριοτήτων των ΕRα και ΕRβ σε όργανα-στόχους (Benita S. et al., 2000). Οι οιστρογονικοί υποδοχείς (ERs) ανήκουν στην υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων των στεροειδών ορμονών (NRs) (Osz J, et al., 2012 και Choi KC et al., 2003). Άλλοι τύποι υποδοχέων στεροειδών ορμονών περιλαμβάνουν τους συγγενείς με οιστρογόνα υποδοχείς (EER), τους υποδοχείς προγεστερόνης (PR) και τον υποδοχέα των ανδρογόνων (AR). Οι υποδοχείς των στεροειδών (SRS), ενεργούν εξαρτώμενοι από τη σύνδεση με παράγοντες μεταγραφής και η δραστηριότητά τους σχετίζεται με τον κυτταρικό κύκλο (Weigel NL et al., 2007). Αναλύσεις της σχέσης μεταξύ της ενεργοποίησης του στεροειδικού υποδοχέα και του κυτταρικού κύκλου έδειξαν ότι οι υποδοχείς των στεροειδών (SRs) και ειδικά οι οιστρογονικοί 23

24 υποδοχείς (ERs), συμμετέχουν στην ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Lee HR et al., 2012). Όταν ένας αγωνιστής δεσμευτεί με τον υποδοχέα των οιστρογόνων, αυτός διμερίζεται με έναν άλλον υποδοχέα οιστρογόνου και το σύμπλοκο προσδένεται διαμέσου των ειδικών περιοχών πρόσδεσης του υποδοχέα (DNA-binding domains, DBDs), σε συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA που ονομάζονται στοιχεία απόκρισης στα οιστρογόνα (Εstrogen Responsive Εlements-EREs) και βρίσκονται εντός της αλληλουχίας του υποκινητή του γονιδίου-στόχου. Εν συνεχεία, αλληλεπιδράσεις των περιοχών του υποδοχέα λειτουργίας ενεργοποίησης 1 και 2 (Activation Function AF-1 και AF-2) μαζί με ιστο-ειδικούς συνενεργοποιητές οδηγούν σε στοχευμένη έκφραση γονιδίου (McKenna NJ et al., 1999) ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΙΚΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ α ΚΑΙ β Από το 1962 και το 1996 που κλωνοποιήθηκαν τα γονίδια των οιστρογονικών υποδοχέων, έχει περιγραφεί η δομή αυτών (η ύπαρξη εξωνίων και εσωνίων) καθώς και η χρωμοσωμική θέση τους, και εν συνεχεία έχουν γίνει μελέτες για την δομή της πρωτεΐνης που εκφράζουν (Osborne CK et al.2001). Οι υποδοχείς των οιστρογόνων καθώς και των υπολοίπων στεροειδών ορμονών, των θυρεοειδικών ορμονών, της βιταμίνης D και του ρετινοϊκού οξέος έχουν τον ίδιο μοριακό μηχανισμό δράσης και παρόμοια δομικά χαρακτηριστικά (Εικόνα 1.5). Εικόνα 1.5: Ενδεικτικό σχήμα για τη δράση των οιστρογονικών υποδοχέων Είναι πρωτεΐνες που έχουν περιοχές (domains) με συγκεκριμένες λειτουργίες, όπως περιοχή πρόσδεσης της ορμόνης (Ligand Binding Domain, LBD), περιοχή αλληλεπίδρασης του υποδοχέα με το DNA, πρόσδεσης του υποδοχέα στο 24

25 DNA (DNA-Binding Domain, DBD), και περιοχές αλληλεπίδρασης με πυρηνικές πρωτεΐνες που επηρεάζουν την μεταγραφή (θέσεις ενεργοποίησης της μεταγραφής) (Εικόνα 1.6). Η περιοχή πρόσδεσης των υποδοχέων χαρακτηρίζεται από την παρουσία δύο δακτυλίων ψευδαργύρου (Zn). Ο πρώτος χρησιμεύει για την αναγνώριση των στοιχείων απόκρισης στα οιστρογόνα (Εstrogen Responsive Εlements-EREs) του DNA και ο δεύτερος, κυρίως για την σταθεροποίηση του δεσμού υποδοχέα-dna και για τον διμερισμό του υποδοχέα. Στο πρωτεϊνικό μόριο του υποδοχέα, υπάρχουν και σηματοδοτικές αλληλουχίες, στις οποίες οφείλονται άλλες λειτουργικές δράσεις του υποδοχέα, όπως η μετακίνησή του προς τον πυρήνα, ο διμερισμός του και η αλληλεπίδραση με κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες. Παρατηρείται μεγάλη ομοιότητα στην αλληλουχία της περιοχής DBD μεταξύ των διαφόρων τύπων υποδοχέων, μικρότερη στην περιοχή LBD, και πολύ μικρή στις περιοχές ενεργοποίησης της μεταγραφής. Ο υποδοχέας α κλωνοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1986, ενώ ο υποδοχέας β ανακαλύφθηκε πιο πρόσφατα. Οι δύο τύποι υποδοχέων διαφέρουν στην δομή και τα γονίδια τους εντοπίζονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα. Το γονίδιο του υποδοχέα α έχει χαρτογραφηθεί στο μεγάλο βραχίονα του χρωμοσώματος 6, ενώ αυτό του υποδοχέας β εντοπίζεται στην περιοχή q22-22 του χρωμοσώματος 14 (Gruber CJ et al., 2002). Εικόνα 1.6: Δομή των δύο δεσμευτικών περιοχών του πυρηνικού ορμονικού υποδοχέα (DNA-binding domain / Ligand-binding domain). Οι πυρηνικοί ορμονικοί υποδοχείς 25

26 περιέχουν δύo σημαντικές περιοχές : (1) μια περιοχή αλληλεπίδρασης του υποδοχέα με το DNA και πρόσδεσης του υποδοχέα στο DNA (DNA-Binding Domain, DBD) προς το κέντρο της ακολουθίας και (2) μια περιοχή πρόσδεσης της ορμόνης (Ligand Binding Domain, LBD) προς το καρβοξυλικό άκρο. Φαίνεται η δομή ενός διμερούς του DBD προσδεδεμένου στο DNA, καθώς επίσης και ενός μονομερούς του LBD. Οι δύο τύποι υποδοχέων παρουσιάζουν μεγάλη ομοιότητα στην περιοχή του υποδοχέα που συνδέεται με το DNA, αλλά δεν συμβαίνει το ίδιο με την περιοχή που συνδέεται με το υπόστρωμα. Μόνο το 55% των αμινοξέων της περιοχής αυτής είναι κοινό και στις δύο κατηγορίες υποδοχέων. Αποτέλεσμα αυτού είναι ότι μερικά υποστρώματα προσδένονται με διαφορετική συγγένεια στους δύο τύπους υποδοχέων. Για παράδειγμα η 17-α οιστραδιόλη και η οιστρόνη εμφανίζουν μεγαλύτερη συγγένεια προς τους υποδοχείς α ενώ η 17-β οιστραδιόλη προσδένεται με την ίδια συγγένεια και στους 2 υποδοχείς (Gruber CJ et al., 2002). Οι υποδοχείς α βρίσκονται κυρίως σε ιστούς του αναπαραγωγικού συστήματος όπως το ενδομήτριο, ο μαστός και το στρώματα των ωοθηκών. Τέτοιου είδους υποδοχείς διαθέτει επίσης ο εγκέφαλος, το ήπαρ καθώς και οι νεφροί. Οι υποδοχείς β εντοπίζονται κυρίως στα οστά, στον εγκέφαλο, στο ενδοθήλιο, στον προστάτη, στο βλεννογόνονου εντέρου κ.α. Υποδοχείς β συναντάμε επίσης και στους νεφρούς, τα κοκκιώδη κύτταρα των ωοθηκών και στις αναπτυσσόμενες σπερματίδες.( Gruber CJ et al., 1998). Σε μελέτη βρέθηκε άντρας με μη λειτουργικούς υποδοχείς οιστρογόνων. Αυτός ο άντρας παρουσίαζε μειωμένη γονιμότητα και σοβαρής μορφής οστεοπόρωση. Έρευνες σε ποντικούς έδειξαν ότι η αδρανοποίηση του γονιδίου του υποδοχέα α προκαλεί στειρότητα τόσο στα θηλυκά όσο και στα αρσενικά άτομα. Ακόμη η παρατηρήθηκε μικρή μείωση της οστικής πυκνότητας τους μηριαίου οστού στα θηλυκά άτομα ενώ στα αρσενικά άτομα παρατηρήθηκε σημαντική μείωση. Θηλυκά άτομα ποντικών με αδρανοποιημένο το γονίδιου του οιστρογονικού υποδοχέα β ήταν στείρα, ενώ τα αρσενικά άτομα εμφάνιζαν υπερπλασία του προστάτη και απώλεια λίπους της κοιλιακής χώρας (Gruber CJ et al., 2002). Mελέτες σε ζωικά μοντέλα έχουν αναδείξει το ρόλο των ERα και ERβ στη αναπαραγωγική λειτουργία. Η αρσενική σεξουαλική λειτουργικότητα απαιτεί 26

27 έκφραση του ERα (Wersinger S. R. Et al., 2000). Μειωμένη έκφραση του ERα σε αρσενικά άτομα επιδρά αρνητικά στη σεξουαλική δραστηριότητα (W. Portillo et al., 2006). Aυξημένα επίπεδα έκφρασης του ERα σε θηλυκά άτομα εγκαθιστούν αυξημένη δεκτικότητα για ζευγάρωμα (Beck LA et al., 2009 και Kudwa AE et al., 2003) ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΙΚΟΣ ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ α (ERα) Το γονίδιο του ανθρώπινου ERα έχει μέγεθος 140 Kb, εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 6q24-27 και περιέχει 6 εξώνια. Η πρωτεΐνη που κωδικοποιεί το γονίδιο αυτό αποτελείται από 595 αμινοξέα, έχει μοριακό βάρος 67 KDa και εντοπίζεται στον πυρήνα. Έχουν περιγραφεί πολυμορφικές συνθήκες που καθορίζουν το επίπεδο έκφρασης και την λειτουργικότητα των υποδοχέων των οιστρογόνων. Αφ' ενός μεν παρατηρούνται διαφορετικά επίπεδα έκφρασης των υποδοχέων στις διάφορες φυλετικές ομάδες. Συγκεκριμένα στις γυναίκες της λευκής φυλής οι ER παρουσιάζουν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης απ' ότι στις γυναίκες της μαύρης ή της κίτρινης φυλής. Έχει, επίσης, παρατηρηθεί ότι τα επίπεδά τους αυξάνουν και με την ηλικία. Ρυθμιστικό παράγοντα στην έκφραση των οιστρογονικών υποδοχέων αποτελούν και κάποια ογκοκατασταλτικά γονίδια. Σε περιπτώσεις παρουσίας μεταλλάξεων σε αυτά τα ρυθμιστικά μόρια, όπου παρατηρείται απώλεια της δράσης των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, καταργείται ή να μειώνεται η ανασταλτική ρύθμιση (down regulation) που παρέχουν στην έκφραση των οιστρογονικών υποδοχέων, και επομένως να συντελούν στον μετασχηματισμό των υγιών κυττάρων σε καρκινικά ΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΙ ΤΟΥ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ α Ως γενετικός πολυμορφισμός του DNA ορίζονται οι εναλλακτικές μορφές (αλληλόμορφα) ενός γενετικού τόπου, οι οποίες διαφέρουν ως προς τη νουκλεοτιδική αλληλουχία τους. Ένας γενετικός τόπος θεωρείται πολυμορφικός όταν το σπανιότερο αλληλόμορφο έχει συχνότητα μεγαλύτερη από 0,01 και 27

28 επομένως η συχνότητα ετεροζυγωτίας είναι τουλάχιστον 0,02. Μια πολυμορφική γενετική θέση μπορεί να εντοπίζεται παντού μέσα στο γονιδίωμα και όχι απαραίτητα μέσα σε ένα γονίδιο. Η σημαντικότητα των πολυμορφισμών βρίσκεται στο γεγονός ότι σε πολλές περιπτώσεις αυτές οι παραλλαγές τροποποιούν τη δομή ή τη λειτουργία ή την έκφραση μιας πρωτεΐνης, και αυτό μπορεί να έχει συνέπειες στη λειτουργία ενζύμων, μεταφορέων, υποδοχέων ή και άλλων πιθανών μορίων -στόχων που ενέχονται στην διαμεσολάβηση της δράσης των φαρμάκων. Αυτό, επομένως, εξηγεί εν μέρη την παρατηρούμενη -μεταξύ των ατόμων- διαφορετικότητα όσον αφορά στους κλινικούς φαινοτύπους και στις φαρμακολογικές αποκρίσεις (Flordellis C., et al., 2004). Η ικανότητα που έχουμε πλέον να χαρτογραφήσουμε χιλιάδες γονιδιωματικούς πολυμορφισμούς, έχει δημιουργήσει την δυνατότητα μελέτης αυτών καθώς και των γονιδίων σε άμεση συνάρτηση με αυτούς, που έχουν ιατρική σπουδαιότητα. Υπάρχουν τρείς κύριες κατηγορίες πολυμορφισμών DNA: οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNP, Single Nucleotide Polymorphisms), οι βραχείες επαναλήψεις (STR, Short Tandem Repeats) και οι ποικίλου αριθμού διαδοχικές επαναλήψεις (VNTR, Variable Number of Tandem Repeats). Οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί αποτελούν τον πιο συνηθισμένο τύπο πολυμορφισμού καθώς συναντάται με συχνότητα 1 ανά 350 bp και ευθύνεται για το 90-95% της ποικιλομορφίας που εμφανίζει η αλληλουχία του ανθρώπινου γονιδιώματος. Διάφοροι πολυμορφισμοί έχουν περιγραφεί στο γονίδιο του α οιστρογονικού υποδοχέα (Εικόνα 1.7), οι οποίοι αφορούν κυρίως αλλαγές σε ένα ζεύγος βάσεων, κατά μήκος του γενετικού τόπου του γονιδίου που κωδικοποιεί τον υποδοχέα (μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί). Πολυμορφισμοί του ERα ενέχονται στην αύξηση των επιπέδων των ενδογενών στεροειδών στην εμμηνόπαυση, κυρίως όσον αφορά τα επίπεδα ελεύθερης οιστραδιόλης στον ορό, στη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του μαστού, καθώς και στην εμφάνιση αντίστασης στη δράση της θεραπείας με αντι-οιστρογόνα (Anderson TI et al 1994). Οι ίδιοι πολυμορφισμοί του ERα ενέχονται και στη συχνότητα εμφάνισης 28

29 παθολογίας του ενδομητρίου όπως ενδομητρίωση (Nikov GN et al., 2000 και Osborne CK et al., 2001), πολύποδες και υπερπλασία (Kitawaki J, et al 2001). Γυναίκες με καρκίνο του μαστού και θετικούς οιστρογονικούς υποδοχείς είχαν και συχνότερο ιστορικό αποβολών (Lehrer SP, et al 1993). Eπίσης, έχει αναφερθεί η περίπτωση άνδρα με μη λειτουργικούς οιστρογονικούς υποδοχείς, ο οποίος παρουσίαζε μειωμένη γονιμότητα και σοβαρής μορφής οστεοπόρωση. Έρευνες σε ποντικούς έδειξαν ότι η αδρανοποίηση του γονιδίου του α οιστρογονικού υποδοχέα, προκαλεί στειρότητα τόσο στα θηλυκά όσο και στα αρσενικά άτομα. Επιπλέον, η οστική πυκνότητα του μηριαίου οστού παρουσίαζε ελαφρά μείωση στα θηλυκά και σημαντική μείωση στα αρσενικά (Gruber CJ et al. 2002). Στον άνθρωπο, οι πολυμορφισμοί που έχουν βρεθεί για το γονίδια του ERα έχουν συσχετιστεί με διάφορες καταστάσεις. Ο πολυμορφισμός PvuII του ERα προκαλείται από μία T/C αντικατάσταση στο εσώνιο 1 (T/C, rs ), και έχει αναλυθεί και αναφερθεί σε περισσότερες από 140 δημοσιεύσεις, οι οποίες περιλαμβάνουν ασθένειες όπως η νόσος του Alzheimer s, διαταραχές της οστικής πυκνότητας, ο καρκίνος του μαστού και η ενδομητρίωση (Bert Gold et al., 2004, RM Corbo et al., 2007, Dennison E et al., 2005 και Holmberg-Marttila D et al., 2000). Ο δεύτερος πολυμορφισμός του ERα, ο XbαI (A/G, rs ), έχει μελετηθεί σε πολύ μικρότερο βαθμό. Έχει βρεθεί γενετική σύνδεση του με τον PvuII και συσχέτιση με καρκίνο του μαστού (Yumiko Matsubara et al., 2004 και Bert Gold et al., 2004). Ωστόσο, τα υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα παρουσιάζουν αντιφάσεις όσον αφορά την εμπλοκή και επίπτωση των πολυμορφισμών αυτών στην εμφάνιση παθολογικών καταστάσεων. Συμπερασματικά, απαιτείται περαιτέρω ανάλυση αυτών στον γενικό πληθυσμό προκειμένου να αποσαφηνιστούν οι επιπτώσεις που έχουν στην δράση του υποδοχέα και κατ επέκταση η εμπλοκή τους σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις. Aξίζει να αναφερθεί ότι οι ανωτέρω πολυμορφισμοί του ER δεν έχουν σχετιστεί στο παρελθόν με τη γυναικεία σεξουαλικότητα. 29

30 Εικόνα 1.7: Δομή του γονιδίου του ER α και οι γνωστοί πολυμορφισμοί του ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η διερεύνηση της συσχέτισης των πολυμορφισμών PvuII (T/C, rs ) και XbαI (A/G, rs ) του οιστρογονικού υποδοχέα α με την γυναικεία σεξουαλική συμπεριφορά. Για το λόγο αυτό οι γονότυποι του πληθυσμού μελέτης θα εξεταστούν σε σχέση με τα επίπεδα ορμονών του πληθυσμού μελέτης όπως τα επίπεδα των φυλετικών ορμονών (οιστραδιόλη, τεστοστερόνη), των γοναδοτροπινών (LH και FSH) καθώς και χαρακτηριστικά της γυναικείας σεξουαλικότητας, όπως η ερωτική επιθυμία, η ερωτική διέγερση, και η ερωτική ικανοποίηση. 30

31 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 31

32 2.1. ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Η συγκεκριμένη μελέτη συμπεριελάμβανε 161 φυσιολογικές γυναίκες. Όλες οι γυναίκες που συμπεριελήφθησαν στον πληθυσμό μελέτης υποβλήθηκαν σε ψυχομετρικές δοκιμασίες που αφορούσαν την αξιολόγηση της σεξουαλικής συμπεριφοράς. Για το σκοπό αυτό όλες οι συμμετέχουσες απάντησαν στο ερωτηματολόγιο σεξουαλικής δραστηριότητα (Female Sexual Function Index -FSFI) (Rosen R. et al., 2000). Επιπλέον, για όλες τις συμμετέχουσες πραγματοποιήθηκαν ορμονικοί προσδιορισμοί σε αυτόματο αναλυτή με τη χρήση εμπορικών αντιδραστηρίων, καθώς και εύρεση του γονότυπου του οιστρογονικού υποδοχέα α για τους πολυμορφισμούς PvuII (T/C, rs ) και XbαI (A/G, rs ) με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης ακολουθούμενης από κατάτμηση του προϊόντος της αντίδρασης με ένζυμο περιορισμού (PCR-RFLP). 2.2 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ, ΕΜΠΟΡΙΚΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 10X TBE Buffer Για την παρασκευή 1 lt διαλύματος, προσθήκη: 108 g Trisma Base, 55 g Boric acid, 40 ml 0,5 M EDTA σε 800 ml ddh 2 O. Καλή ανάδευση. Ογκομέτρηση στο 1 lt. Υγρή αποστείρωση. Δ/μα δεoξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) Παρασκευή 25 mm δ/μα dntps με ανάμιξη ίσων όγκων από τα stock δ/ματα 100 mm datp, dttp, dctp και dgtp. KAPATaq PCR Kit (Kapabiosystems) KAPATaq DNA πολυμεράση (5U/μl) 5 x KAPATaq ρυθμιστικό διάλυμα Δ/μα MgCl 2 (25mM) Περιοριστική 10X Ρυθμιστικό διάλυμα (NEBuffer 3.1) ενδονουκλεάση 1X NEBuffer 3.1: PvuII (New England Biolabs) 100 mm NaCl 50 mm Tris-HCl 10 mm MgCl μg/ml BSA 32

33 ph 7.9 (25 C) Περιοριστική 10X Ρυθμιστικό διάλυμα (NEBuffer 2.1) 1X ενδονουκλεάση NEBuffer 3.1: ΧbaI 50mM NaCl (New England Biolabs) 10mM Tris-HCl 10mM MgCl 2 1mM DTT ph 7.9 (25 C) Για την παρασκευή των διαλυμάτων χρησιμοποιήθηκαν αποστειρωμένα υλικά. Όλα τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν για τις πειραματικές διαδικασίες παρασκευάστηκαν από τα παραπάνω βασικά διαλύματα με τις κατάλληλες αραιώσεις. Οι υγρές αποστειρώσεις των διαλυμάτων έγιναν σε αυτόκαυστο στους 121 ο C και 1,1 atm για 30 min ΧΡΗΣΗ ΛΟΓΙΣΜΙΚΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΩΝ Αναζήτηση και ανάλυση νουκλεοτιδικών αλληλουχιών - Έλεγχος των εκκινητών (primers) με Blast Για την αναζήτηση και ανάλυση των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών του γονιδίου ERa χρησιμοποιήθηκe το κάτωθι λογισμικό πρόγραμμα: NCBI-GenBank ( : Ψηφιακή βάση δεδομένων νουκλεοτιδικών αλληλουχιών του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας των Ηνωμένων Πολιτειών (ΝΙΗ- Νational Institute of Health) στην οποία βρίσκονται καταχωρημένες όλες οι διαθέσιμες αλληλουχίες DNA (Benson DA et al; 2008). 33

34 Εικόνα 2.1: Ενδεικτική εικόνα όσον αφορά το πρόγραμμα αναζήτησης και ανάλυσης νουκλεοτιδικών αλληλουχιών. Έλεγχος των εκκινητών (primers) με τη χρήση Blast. Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων Η στατιστική επεξεργασία έγινε με τη χρήση του SPSS 19.0 for Windows (IBM SPSS Statistics, IBM software). Ο έλεγχος κανονικότητας έγινε με τη δοκιμασία Kolmogorov-Smirnov. Όλες οι παράμετροι παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± σταθερά απόκλισης (mean±s.d), ανεξαρτήτως της κατανομής τους. Η σύγκριση των μέσων επιπέδων των μεταβλητών για κάθε γονότυπο ξεχωριστά, καθώς και για την αλληλεπίδρασή τους έγινε με εφαρμογή της μεθόδου two-way ANOVA μέσω του πολυπαραγοντικού γενικού γραμμικού μοντέλου (multivariate general linear model), με ορισμό των δύο γονοτύπων ως σταθερών παραγόντων. Οι μεταβλητές που δεν ακολουθούσαν κανονική κατανομή υπεστήσαν λογαριθμική μετατροπή προκειμένου να εφαρμοσθεί το πολυπαραγοντικό γενικό γραμμικό μοντέλο. Το επίπεδο σημαντικότητας διπλής ουράς (two tailed significance) ορίστηκε στο 5% ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ- (PCR-Polymerase Chain Reaction) Αρχή της μεθόδου H PCR είναι μια αντίδραση η οποία επιτρέπει την παραγωγή in vitro, από κάποιο μείγμα DNA, ενός εξαιρετικά μεγάλου αριθμού αντιγράφων μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας. Ο πολλαπλασιασμός επιτυγχάνεται με πολλαπλούς γύρους αντιγραφής της αλληλουχίας- στόχου, μέσω της χρήσης του ενζύμου DNA πολυμεράση, χρησιμοποιώντας ως εκκινητές (primers) ένα ζεύγος ολιγονουκλεοτιδίων τα οποία προσδένονται στο μονόκλωνο DNA στα άκρα της αλληλουχίας- στόχου σύμφωνα με τον κανόνα της συμπληρωματικότητας. Οι εκκινητές (primers) αυτοί έχουν συνήθως μήκος περίπου 20 νουκλεοτιδίων και συντίθενται σε κατάλληλα μηχανήματα. Η αναγνώριση των ειδικά πολλαπλασιασμένων αλληλουχιών γίνεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, όπου το DNA εμφανίζεται σε μια ζώνη. 34

35 Ένας περιορισμός της PCR είναι ότι θα πρέπει να γνωρίζουμε εκ των προτέρων ορισμένες πληροφορίες για την αλληλουχία- στόχο, ώστε να είμαστε σε θέση να συνθέσουμε τους εκκινητές, οι οποίοι θα είναι συμπληρωματικοί με τα άκρα της αλληλουχίας- στόχου, και έτσι να μπορέσουμε να την πολλαπλασιάσουμε. Taq DNA πολυμεράση Λόγω του ότι η αντίδραση της PCR πραγματοποιείται σε πολύ ψηλές θερμοκρασίες, ειδικά όταν πρόκειται να αποδιαταχθεί το DNA, χρησιμοποιείται ένα θερμοανθεκτικό ένζυμο η Taq DNA πολυμεράση. Το ένζυμο αυτό απομονώνεται από το από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus έτσι μπορεί να αντέξει επαναλαμβανόμενη θέρμανση σε ο C και έτσι δεν χρειάζεται κάθε φορά να προσθέτουμε καινούριο ένζυμο, κάτι το οποίο θα κάναμε εάν χρησιμοποιούσαμε DNA πολυμεράσες που προέρχονται από ευκαρυωτικούς οργανισμούς και απενεργοποιούνται σε τόσο υψηλές θερμοκρασίες. Η βέλτιστη θερμοκρασία πολυμερισμού είναι ο C και η ταχύτητα πολυμερισμού 150 νουκλεοτίδια/μόριο ενζύμου το δευτερόλεπτο. Συνήθως η θερμοκρασία πολυμερισμού που χρησιμοποιείται στις πειραματικές διαδικασίες είναι 72 ο C. Το κυριότερο μειονέκτημα της Taq πολυμεράσης είναι ότι δεν φέρει 3 5 νουκλεοτιδική δραστηριότητα (δηλ. ικανότητα διόρθωσης των λαθών) με αποτέλεσμα να παραμένουν στο τελικό προϊόν νουκλεοτίδια που έχουν εισαχθεί λανθασμένα. Εκκινητές (Primers) Ως εκκινητής (primer) ορίζεται ένα μικρό ολιγονουκλεοτίδιο συμπληρωματικό ως προς την αλληλουχία DNA που πολλαπλασιάζεται in vitro. Οι εκκινητές αξιοποιούνται ως σημεία έναρξης της αντιγραφής μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας στην αντίδραση της PCR. Η συγκέντρωση των primers καθορίζεται συνήθως μεταξύ 0,1-5μΜ. Μεγαλύτερες συγκεντρώσεις μπορούν να οδηγήσουν στην λανθασμένη υβριδοποίηση και την παραγωγή μη ειδικών προϊόντων ή στην δημιουργία διμερών primers που χρησιμοποιούνται επίσης σαν στόχος από το 35

36 ένζυμο ελαττώνοντας έτσι την ποσότητα των ειδικών προϊόντων. Ο σχεδιασμός των εναρκτήριων ολιγονουκλεοτιδίων γίνεται λαμβάνοντας υπόψη τους εξής κανόνες: 1. Το μήκος τους πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ των ορίων νουκλεοτίδια με περιεκτικότητα 50-60% σε G-C. 2. Οι θερμοκρασίες τήξεως πρέπει να είναι παρόμοιες. 3. Τα 3 άκρα τους δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικά έτσι ώστε να αποφεύγεται η δημιουργία διμερών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως υπόστρωμα στον πολυμερισμό. 4. Πρέπει να αποφεύγεται τα 3 άκρα των primers να φέρουν περισσότερα από 3 συνεχόμενες πουρίνες (G-C) έτσι ώστε να μην παρατηρηθεί λανθασμένη εκκίνηση από περιοχές πλούσιες σε GC. 5. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία τους δεν πρέπει να φέρει παλίνδρομες περιοχές που μπορούν να οδηγήσουν στην δημιουργία διμερών Η θερμοκρασία (Τ annealing) και ο χρόνος που χρειάζεται για την υβριδοποίηση των εναρκτήριων ολιγονουκλεοτιδίων εξαρτάται από τη συγκέντρωσή τους στην αντίδραση, το μήκος και την αλληλουχία των βάσεών τους. Αυξάνοντας τη θερμοκρασία της υβριδοποίησης, αυξάνεται η ειδικότητα του τελικού προϊόντος μια και έτσι περιορίζεται η υβριδοποίηση των primers στις περιοχές του DNA με τη μέγιστη συμπληρωματικότητα. Αλληλουχία των εκκινητών που χρησιμοποιούμε: ER28: 5 - CTG CCA CCC TAT CTG TAT CTT TTC CTA TTC TCC - 3 ER29: 5 - TCT TTC TCT GCC ACC CTG GCG TCG ATT ATC TGA - 3 PCR product: 1374 bp Αριθμός κύκλων Αφού βεβαιωθούμε ότι όλοι οι παράγοντες που απαιτούνται για μια επιτυχή αντίδραση PCR είναι σωστά ρυθμισμένοι τότε θα πρέπει να λάβουμε υπόψη μας και τον αριθμό των κύκλων της αντίδρασης, ο οποίος εξαρτάται κυρίως από την αρχική συγκέντρωση του DNA στόχου. Η διεξαγωγή περισσότερων κύκλων από όσους χρειάζονται αυξάνουν τον αριθμό των μη ειδικών προϊόντων ενώ λιγότεροι κύκλοι 36

37 παράγουν μικρότερη ποσότητα του ειδικού προϊόντος. Στην συγκεκριμένη αντίδραση ο βέλτιστος αριθμός κύκλων θεωρείται 30. Αντίδραση Σε μία αντίδραση PCR αναμιγνύεται μίγμα DNA μαζί με δεοξυριβονουκλεοτίδια (dntps), δυο εναρκτήρια ολιγινουκλεοτίδια ή εκκινητές (primers) και την ειδική DNA πολυμεράση(taq). Αρχικά, το DNA που φέρει την αλληλουχία- στόχο, δηλαδή την αλληλουχία που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί, αποδιατάσσεται με θέρμανση στους 94 ο C. Στη συνέχεια ψύχεται σε κατάλληλη θερμοκρασία (58 ο C) ούτως ώστε να επιτευχθεί η υβριδοποίηση των εκκινητών. Η πρόσδεση γίνεται με τέτοιο προσανατολισμό ώστε τα 3 άκρα των εκκινητών να είναι στραμμένα προς το εσωτερικό της αλληλουχίας- στόχου (Εικόνα 2.2). Ακολουθεί πολυμερισμός στους 72 ο C από την Taq πολυμεράση και τα παραπάνω βήματα επαναλαμβάνονται πολλές φορές έως ότου συντεθεί αρκετό προϊόν (30 κύκλοι) (Εικόνα 2.2). Η αντίδραση είναι εκθετική αφού σε κάθε κύκλο η ποσότητα του DNA διπλασιάζεται. Δηλαδή ξεκινώντας από 1 μόριο DNA, μετά από 1 κύκλο παράγονται 2 μόρια DNA, μετά από 2 κύκλους 4 μόρια και μετά από 3 κύκλους 8 μόρια. Μετά από 10 κύκλους παράγονται (2 10 ) αντίγραφα του επιθυμητού προϊόντος ο αριθμός των οποίων αυξάνεται σε (2 20 ) μετά από 20 κύκλους. Τελικά παίρνουμε ένα τεράστιο αριθμό αντιγράφων της αλληλουχίας που μας ενδιαφέρει μετά από 30 κύκλους που ακολουθείται στο πρωτόκολλο μας. Στάδια PCR: 1. Αποδιάταξη με θέρμανση στους 94 ο C του δίκλωνου μορίου DNA το οποίο φέρει την αλληλουχία στόχο. 2. Ψύξη του μείγματος της αντίδρασης σε θερμοκρασία 58 ο C. Στο στάδιο αυτό επιτυγχάνεται η υβριδοποίηση των εκκινητών (primers). Η πρόσδεση γίνεται με τέτοιο προσανατολισμό ώστε τα 3 άκρα των εκκινητών (primers) να είναι στραμμένα προς το εσωτερικό της αλληλουχίας- στόχου. 3. Θέρμανση του μείγματος στους 72 ο C. Στο στάδιο αυτό οι εκκινητές επιμηκύνονται από την Taq πολυμεράση. 37

38 4. Επαναλαμβάνονται οι διαδικασίες αποδιάταξης του δίκλωνου DNA και πρόσδεση ξανά των εκκινητών(primers). Ακολουθεί νέα σύνθεση DNA μέσω της επιμήκυνσης των εκκινητών από την Taq πολυμεράση (Εικόνα 2.2). Εικόνα 2.2: Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Ενδεικτικά φαίνονται τα βασικά στάδια της αντίδρασης: 1) Αποδιάταξη του δίκλωνου μορίου του DNA, 2) Υβριδοποίηση με τους εκκινητές και 3) Επιμήκυνση με τη βοήθεια του ενζύμου Taq πολυμεράση. Υλικά Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν : - Δεοξυνουκλεοτίδια ( dntps ) - KAPATaq PCR Kit / Kapabiosystems - DNA μήτρα (gdna) - Ολιγονουκλεοτίδιο 1 (Forward)- ER28 - Ολιγονουκλεοτίδιο 2 (Reverse)- ER29 Σε κάθε αντίδραση, ανάλογα με την συγκέντρωση του κάθε δείγματος, χρησιμοποιήθηκαν 1 ή 1,5 μl gdna. Για την κάθε αντίδραση αναμειγνύονται σε eppendorf των 200 μl με την βοήθεια πιπέτας τα ακόλουθα υλικά: 38

39 Αντίδραση Αντιδραστήριο Όγκος (μl) Όγκος (μl) ddh 2 O 29,9 29,4 5xb (Buffer) MgCl dntps 1 1 ER 28 0,8 0,8 ER 29 0,8 0,8 Taq 0,5 0,5 gdna 1 1,5 Τελικός όγκος Πίνακας 2.1: Αντιδραστήρια και ποσότητες που χρησιμοποιούνται στην αντίδραση της PCR Αφού γίνει καλή ανάμειξη των αντιδραστηρίων τότε τα σωληνάκια eppendorf τοποθετούνται σε θερμικό ανακυκλωτή (της εταιρίας Biorad) για να ξεκινήσει η αντίδραση της PCR. Συνθήκες Αντίδρασης Θερμοκρασία Χρόνος 94 o C 4 min 94 o C 45 sec 58 o C 45 sec x 30 κύκλους 72 o C 1 min 72 o C 10 min Πίνακας 2.2: Συνθήκες αντίδρασης (θερμοκρασία, χρόνος και κύκλοι αντίδρασης) 39

40 2.5. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ Αρχή της μεθόδου H ηλεκτροφόρηση, είναι η ηλεκτροχημική μέθοδος διαχωρισμού ηλεκτρικά φορτισμένων σωματιδίων από ένα μίγμα τους. Κατά την ηλεκτροφόρηση διοχετεύεται ηλεκτρικό ρεύμα μέσω ηλεκτροδίων σε ένα μέσο που πάνω του έχει φορτωθεί σε ένα σημείο (πηγαδάκια) το προς ανάλυση δείγμα. Το αποτέλεσμα είναι ότι τα φορτισμένα σωματίδια κινούνται προς τα ηλεκτρόδια με ταχύτητες διαφορετικές ανάλογα με το φορτίο τους και αντιστρόφως ανάλογα με το μέγεθος τους. Έτσι τα περισσότερο φορτισμένα και μικρότερα μόρια απομακρύνονται περισσότερο από το αρχικό σημείο, ενώ τα μεγαλύτερα και λιγότερο φορτισμένα λιγότερο. Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης επιτρέπει το διαχωρισμό, το χαρακτηρισμό και την απομόνωση τμημάτων DNA. Η βασική αρχή της μεθόδου είναι ότι εφόσον τα μόρια DNA τοποθετηθούν σε ηλεκτρικό πεδίο, λόγω του αρνητικού φορτίου του φωσφορικού σκελετού θα μετακινηθούν προς το θετικό πόλο του πεδίου. Τα δίκλωνα γραμμικά τμήματα DNA κινούνται σε ένα πήκτωμα αγαρόζης με ρυθμό ο οποίος είναι αντιστρόφως ανάλογος του μοριακού τους βάρους ή του αριθμού των βάσεών τους. Κατά συνέπεια, τα μεγάλα τμήματα DNA μεταναστεύουν πιο αργά κατά μήκος του πηκτώματος και ο διαχωρισμός των μορίων DNA γίνεται με βάση το μέγεθός τους. Ποσότητα της αγαρόζης στο πήκτωμα (% w/v) Εύρος διαχωρισμού τμημάτων DNA (kb)

41 Πίνακας 2.3: Στον πίνακα παραπάνω περιλαμβάνονται οι ποσότητες της αγαρόζης στο πήκτωμα(% w/v), αναλόγως του μεγέθους του τμήματος του DNA που πρόκειται να διαχωριστεί. Αναλυτικότερα, η πλευρά του πηκτώματος στην οποία βρίσκονται οι θέσεις υποδοχείς των δειγμάτων τοποθετείται προς τον αρνητικό πόλο του ηλεκτρικού πεδίου και το DNA (που είναι αρνητικά φορτισμένο λόγω των φωσφορικών του ομάδων) μεταναστεύει σε μια ευθεία γραμμή προς το θετικό πόλο. Επειδή τα μικρότερα τμήματα DNA διέρχονται με μεγαλύτερη ευκολία μέσα από τους πόρους του πλέγματος της αγαρόζης, μετακινούνται γρηγορότερα από τα μεγαλύτερα κομμάτια. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, κάθε τμήμα DNA σχηματίζει μια ζώνη, της οποίας η απόσταση από τις θέσεις υποδοχείς των δειγμάτων εξαρτάται από το μέγεθός του. Όσο πιο μικρό είναι το τμήμα DNA, τόσο περισσότερο θα έχει απομακρυνθεί από τα πηγαδάκια. Προκειμένου να υπολογιστεί το μοριακό βάρος των δειγμάτων DNA που ηλεκτροφορούνται στο πήκτωμα αγαρόζης χρησιμοπποιείται και ένα δείγμα γνωστού μοριακού βάρους, ο μάρτυρας. Οι μάρτυρες γνωστού μοριακού βάρους περιέχουν τμήματα DNA γνωστού μεγέθους που χρησιμοποιούνται προκειμένου να υπολογιστεί το άγνωστο μοριακό βάρος άλλων τμημάτων DNA, τα οποία ηλεκτροφορούνται μαζί με αυτούς στο πήκτωμα. Προκειμένου οι ζώνες αυτές όμως να καταστούν ορατές, το DNA υφίσταται, μέσα στο πήκτωμα, χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο, το οποίο προσδένεται στα μόρια του DNA και, όταν αυτά εκτεθούν σε υπεριώδη ακτινοβολία, φθορίζει εκπέμποντας ορατό φως, με αποτέλεσμα να αποκαλύπτεται η θέση των διαφόρων ζωνών στο πήκτωμα. Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης Το ρυθμιστικό διάλυμα βοηθά στην διατήρηση της σταθερότητας του ph και παρέχει τα απαραίτητα ιόντα για την αύξηση της ηλεκτρικής αγωγιμότητας. Απουσία ιόντων η ηλεκτρική αγωγιμότητα είναι ελάχιστη και το DNA μετακινείται ελάχιστα ή καθόλου. Στην παρούσα εργασία ως ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιήσαμε το 0,5Χ TBE ( Tris-borate-EDTA). 41

42 Βρωμιούχο Αιθίδιο Το βρωμιούχο αιθίδιο είναι μια φθορίζουσα χρωστική η οποία έχει την ικανότητα να παρεμβάλλεται μεταξύ διαδοχικών ζευγών βάσεων του DNA και λόγω της επίπεδης διαμόρφωσής του να δεσμεύεται στο DNA. Λόγω του ότι το DNA δεν είναι ορατό χρησιμοποιούμε την φθορίζουσα αυτή χρωστική, είτε προσθέτοντας την μέσα στο πήκτωμα αγαρόζης είτε απευθείας στο δείγμα DNA, προκειμένου να μπορέσουμε να παρατηρήσουμε τις ζώνες του DNA οι οποίες παρατηρούνται σε UV ακτινοβολία (Εικόνα 2.3). Παρασκευή πηκτώματος αγαρόζης Το πήκτωμα αγαρόζης είναι μια ορθογώνια πλάκα αγαρόζης ( πηκτό, ζελατινώδες υλικό) η οποία τοποθετείται οριζόντια μέσα στη συσκευή ηλεκτροφόρηση και φέρει ένα πλέγμα πόρων διαμέσου των οποίων περνά το DNA. 1. Η αγαρόζη διαλύεται σε διάλυμα 0,5Χ TBE με βρασμό. Ανάλογα με τον όγκο ΤΒΕ που θα χρησιμοποιήσουμε προστίθεται η κατάλληλη ποσότητα αγαρόζης. Στην συγκεκριμένη πειραματική διαδικασία χρησιμοποιείται πήκτωμα 1,5 % w/v αγαρόζης για τα αποτελέσματα της PCR και πήκτωμα 2% w/v αγαρόζης για τα 42

43 αποτελέσματα της κατάτμησης με ένζυμα περιορισμού. Το ποσό της αγαρόζης που προστίθεται υπολογίζεται με βάση την επιθυμητή τελική συγκέντρωση αγαρόζης του πηκτώματος. Πχ αν χρησιμοποιήσαμε 170 ml όγκο TBE τότε η ποσότητα αγαρόζης που θα χρησιμοποιήσουμε για την παρασκευή του πηκτώματος αγαρόζης 1,5% w/v είναι: 2,55g (Στα 100ml πηκτώματος περιέχονται 1,5g αγαρόζης. Στα 170ml πηκτώματος θα περιέχονται 170*1,5/100=2,55g αγαρόζης) 2. Λίγο πριν η θερμοκρασία του διαλύματος φτάσει στο σημείο πήξης (~ ο C) προστίθεται διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου σε αναλογία 5μl EtBr 2 /100ml πηκτώματος. Το βρωμιούχο αιθίδιο δεν πρέπει να προστίθεται σε υψηλότερες θερμοκρασίες αφού είναι εξαιρετικά πτητικό. 3. Με το βρασμό, η αγαρόζη διαλύεται και δημιουργεί ένα ομοιογενές διάφανο μίγμα το οποίο χύνεται σε ένα καλούπι όπου παραμένει έως ότου ψυχθεί και στερεοποιηθεί. Οι θέσεις υποδοχής των δειγμάτων DNA σχηματίζονται με τη βοήθεια ειδικών χτενών που τοποθετούνται στη συσκευή πριν από την πήξη του πηκτώματος. 4. Αφήνουμε το πήκτωμα να στερεοποιηθεί σε θερμοκρασία δωματίου. Όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση της αγαρόζης τόσο γρηγορότερα επέρχεται η στερεοποίηση. Το πήκτωμα φυλάσσεται σε σκοτεινό μέρος αφού το βρωμιούχο αιθίδιο είναι φωτοευαίσθητο. Πορεία Ηλεκτροφόρησης: 1. Στα δείγματα DNA που πρόκειται να αναλυθούν προστίθεται 3μl ddh 2 O και 2μl 10Χ loading buffer (διάλυμα χρωστικής) ανά 10 μl δείγμα DNA. 2. Μαζί με τα δείγματα ηλεκτροφορείται μάρτυρας DNA γνωστών μοριακών μεγεθών και συγκέντρωσης, προκειμένου να είναι δυνατή η εκτίμηση του μεγέθους των τμημάτων DNA που αναλύονται. 3. Τα δείγματα DNA και το δείγμα του μάρτυρα τοποθετούνται σε ειδικές θέσεις του πηκτώματος με τη βοήθεια μικροπιπέττας. Η μέγιστη χωρητικότητα των θέσεων υποδοχής των δειγμάτων είναι 30 μl. 43

44 4. Η ανάλυση των δειγμάτων γίνεται σε θερμοκρασία δωματίου υπό σταθερή ένταση ρεύματος ma με ρυθμιστικό διάλυμα 0,5Χ TBE. 5. Ηλεκτροφόρηση για λεπτά στα 130 V. 6. Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης το πήκτωμα φωτογραφίζεται σε σύστημα: Kodak Digital Science Electrophoresis Documentation and Analysis System 120 (EDAS 120) υπό την επίδραση υπεριώδους ακτινοβολίας όπως φαίνεται στην εικόνα παρακάτω. Εικόνα 2.3: Α) Συσκευή ηλεκτροφόρησης και πιπέτα. Β) Ενδεικτικά φαίνεται πως εμφανίζονται οι ζώνες της ηλεκτροφόρησης στο πήκτωμα αγαρόζης έπειτα με τη βοήθεια της υπεριώδους ακτινοβολίας (UV). 2.6 ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ ΜΗΚΟΥΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΩΝ ΘΡΑΥΣΜΑΤΩΝ (RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism)-ΚΑΤΑΤΜΗΣΗ ΤΟΥ DNA ΜΕ ΕΝΖΥΜΑ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ Ο πολυμορφισμός μήκους περιοριστικών θραυσμάτων (RFLP:Restriction Fragment Length Polymorphism) είναι μια διαφορά στα αλληλόμορφα ενός γενετικού τόπου που μπορεί να ανιχνευθεί από την παρουσία θραυσμάτων DNA που έχουν διαφορετικά μήκη μετά την κατάτμηση των δειγμάτων DNA με ένζυμα περιορισμού (Εικόνα 2.4). Αλλαγή στην αλληλουχία του DNA, η οποία αναιρεί ή δημιουργεί μία θέση αναγνώρισης περιοριστικού ενζύμου, έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή τμημάτων DNA διαφορετικών μεγεθών, χαρακτηριστικών για κάθε 44

45 ένζυμο περιορισμού σε συγκεκριμένο τμήμα DNA του γονιδιώματος. Εικόνα 2.4: Σχηματική αναπαράσταση RFL. To αλληλόμορφο Α διαθέτει τρεις θέσεις αναγνώρισης ενός ενζύμου περιορισμού (1, 2 και 3) ενώ το αλληλόμορφο a διαθέτει μόνο δυο τις θέσεις αναγνώρισης για το ίδιο ένζυμο, τις 1 και 3. Η θέση 2 έχει καταργηθεί λόγω αλλαγής στην αλληλουχία του DNA. Μέθοδος Ένζυμα περιορισμού(restriction enzyme) ή αλλιώς ενδονουκλεάσες περιορισμού(restriction endonuclease) είναι ένζυμα τα οποία αναγνωρίζουν συγκεκριμένες αλληλουχίες ζευγών βάσεων (bp, base pairs) στο DNA οι οποίες ονομάζονται θέσεις περιορισμού (restriction sites) και διασπούν το DNA, υδρολύοντας τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς στο εσωτερικό ή κοντά σε αυτή την αλληλουχία (Εικόνα 2.5). Όλα τα ένζυμα περιορισμού κόβουν το DNA ανάμεσα στον 3 άνθρακα και στη φωσφορική ομάδα του φωσφοδιεστερικού δεσμού, επομένως τα τμήματα που προκύπτουν από την κατάτμηση ( διαδικασία αναγνώρισης και διάσπασης τμημάτων DNA από ένζυμα περιορισμού), φέρουν ελεύθερες 5 φωσφορικές ομάδες και 3 υδροξύλια. Τα ένζυμα περιορισμού συναντώνται στα βακτήρια. Τα ένζυμα περιορισμού προστατεύουν τα βακτήρια από τους ιούς που τα προσβάλλουν κατακερματίζοντας το DNA, ένα φαινόμενο που ονομάζεται περιορισμός ξενιστή(host restriction). Το βακτήριο τροποποιεί στο DNA του τις θέσεις περιορισμού που αναγνωρίζονται από τα ένζυμα, μέσω μεθυλίωσης ώστε το γονιδίωμα του να μην υφίσταται κατάτμηση. Για την ονομασία των ενζύμων περιορισμού χρησιμοποιείται ένα σύστημα τριών γραμμάτων που ακολουθείται από ένα λατινικό αριθμό. Το πρώτο γράμμα προέρχεται από το όνομα του γένους ενώ το δεύτερο γράμμα και τρίτο γράμμα 45

46 προέρχονται από το όνομα του είδους του οργανισμό από τον οποίο απομονώνονται. Ανάλογα με τη δομή τους και το μηχανισμό δράσης τους διακρίνονται σε τρεις τύπους: Ένζυμα τύπου Ι Ένζυμα τύπου ΙΙ Ένζυμα τύπου ΙΙΙ Δομή πρωτεΐνης Διλειτουργικά Ενδονουκλεάση και Διλειτουργικά ένζυμα με 3 μεθυλάση χωριστές ένζυμα με 2 υπομονάδες υπομονάδες Περιοχές Διτμηματικές και Ακολουθίες 4-6bp Ασύμμετρες Αναγνώρισης ασύμμετρες συχνά παλίνδρομες ακολουθίες 5-7 bp ακολουθίες Περιοχές Μη ειδικές σε Ίδιες ή πολύ κοντά bp δεξιά ή Κοψίματος απόσταση >1000bp στην περιοχή αριστερά της από την περιοχή αναγνώρισης περιοχής αναγνώρισης αναγνώρισης Περιορισμός Αποκλειόμενα Ξεχωριστές Σύγχρονες και αμοιβαία αντιδράσεις Μεθυλίωση Απαίτηση ATP ΝΑΙ ΟΧΙ ΝΑΙ Πίνακας 2.4: Στον παραπάνω πίνακα περιλαμβάνονται πληροφορίες για τους τύπους των ενζύμων (Ι, ΙΙ και ΙΙΙ). Οι πληροφορίες αυτές περιλαμβάνουν την δομή τους, τις περιοχές αναγνώρισης τους, περιοχές κοψίματος καθώς και την απαίτηση τους σε ATP. Οι κύριοι παράγοντες από τους οποίους εξαρτάται η δράση των ενζύμων είναι: η θερμοκρασία το ph και η ιοντική ισχύς του ρυθμιστικού διαλύματος της αντίδρασης. Οι βέλτιστες συνθήκες δράσεις του κάθε ενζύμου καθορίζονται από την προμηθεύτρια εταιρία. 46

47 Εικόνα 2.5: Παράδειγμα ενζύμου (EcoRI) που αναγνώρισε συγκεκριμένη αλληλουχία ζευγών βάσεων στο DNA (θέση περιορισμού) και διασπά το DNA, υδρολύοντας τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς στο εσωτερικό της αλληλουχίας. Στα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω ένζυμα περιορισμού: Πίνακας 2.6: Στον παραπάνω πίνακα δίνονται οι ενδονουκλεάσες περιορισμού PvuII και XbaI, θερμοκρασία επώασης τους και η αλληλουχία αναγνώρισης τους. Ένζυμο Θερμοκρασία Επώασης Αλληλουχία Αναγνώρισης PvuII 37 C 5 CAGCTG3 XbaI 37 C 5 TCTAGA3 Πρωτόκολλο Πίνακας 2.5: Αντιδραστήρια και ποσότητες που χρησιμοποιούνται στην αντίδραση της κατάτμησης με PvuII και XbaI. PvuII XbaI Αντίδραση Όγκος (μl) Όγκος (μl) ddh 2 O 11,5 11,45 10 x b 3 3 BSA - 0,3 PvuII 0,5 (5u) - XbaI - 0,25 (5u) PCR Product Τελικός όγκος Αφού πραγματοποιήθηκε επιτυχώς η αντίδραση της PCR τότε σε σωληνάκια eppendorf προστίθενται οι παραπάνω ποσότητες ξεχωριστά για το κάθε ένζυμο. Έπειτα τα σωληνάκια eppendorf τοποθετούνται σε υδατόλουτρο (Εικόνα 2.6) στους 47

48 37 ο C και αφήνονται ο/n (over night) για 24 ώρες δηλαδή, ούτως ώστε να γίνει η αντίδραση, δηλαδή να κοπεί το τμήμα PCR στις κατάλληλες θέσεις από τα συγκεκριμένα ένζυμα. Εικόνα 2.6: Υδατόλουτρο 48