ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 Τ.Ε.Ι. ΛΑΡΙΣΑΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ρ. Ηλίας Αναστασόπουλος ΛΑΡΙΣΑ 2004

2 Περιεχόµενα Κεφάλαιο 1ο ΝΟΥΚΛΕΪΝΙΚΑ ΟΞΕΑ- ΤΟ DNA....3 Κεφάλαιο 2 ο Τo RNA....8 Κεφάλαιο 3 ο Οι ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Κεφάλαιο 4 ο ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ Κεφάλαιο 5 ο ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΣ ΤΟΥ DNA. 24 Κεφάλαιο 6 ο ΜΟΡΙΑΚΗ ΧΑΡΤΟΓΡΑΦΗΣΗ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΩΝ Κεφάλαιο 7 ο ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΕΙΚΤΕΣ 32 Κεφάλαιο 8 ο ΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΦΥΤΩΝ...39 Κεφάλαιο 9 ο ΙΑΓΟΝΙ ΙΑΚΑ ΦΥΤΑ ΑΝΘΕΚΤΙΚΑ ΣΤΟ ΠΑΓΕΤΟ.45 Κεφάλαιο 10 ο ΙΑΓΟΝΙ ΙΑΚΑ ΦΥΤΑ ΑΝΘΕΚΤΙΚΑ ΣΕ ΕΝΤΟΜΑ...48 Κεφάλαιο 11 ο ΙΑΓΟΝΙ ΙΑΚΑ ΦΥΤΑ ΑΝΘΕΚΤΙΚΑ ΣΕ ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΟΝΑ.53 Κεφάλαιο 12 ο ΙΑΓΟΝΙ ΙΑΚΑ ΦΥΤΑ ΑΝΘΕΚΤΙΚΑ ΣΕ ΙΟΥΣ...57 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ..60 2

3 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1ο ΝΟΥΚΛΕΪΝΙΚΑ ΟΞΕΑ- ΤΟ DNA Τα νουκλεϊνικά οξέα είναι µακροµόρια που µετέχουν στην µεταφορά γενετικών πληροφοριών από γενιά σε γενιά και στην έκφραση αυτής της πληροφορίας µέσο της σύνθεσης πρωτεϊνών. Υπάρχουν δύο κατηγορίες νουκλεϊνικών οξέων, τα ριβοζονουκλεϊνικά (RNA) και τα δεσοξυριβοζονουκλειϊνικά οξέα (DNA). Το γενετικό υλικό των περισσοτέρων οργανισµών αποτελείται από DNA, εξαίρεση αποτελούν µόνο ορισµένοι ιοί (ρετροϊοί) που αντί για DNA έχουν RNA σαν το γενετικό τους υλικό. Το DNA βρίσκεται στον πυρήνα και στα µιτοχόνδρια ευκαρυωτικών κυττάρων, ενώ ειδικά στα φυτικά κύτταρα DNA υπάρχει και στους χλωροπλάστες. Τα προκαρυωτικά κύτταρα δεν διαθέτουν κανένα από τα παραπάνω οργανίδια. Το DNA σε αυτούς τους οργανισµούς βρίσκεται, µε τη µορφή νηµατίου, διασκορπισµένο στο κυτταρόπλασµα (περίπτωση βακτηρίων), ή ενσωµατωµένο στο καψίδιο (περίπτωση ιών). Πυρήνας Μιτοχόνδρια Χλωροπλάστες Εικόνα 1.1 Σε ένα φυτικό κύτταρο DNA υπάρχει στο πυρήνα, στα µιτοχόνδρια και στους χλωροπλάστες του. 3

4 Όλοι οι οργανισµοί δεν έχουν την ίδια ποσότητα DNA. Η συνολική ποσότητα DNA που περιέχεται στην απλοειδή οµάδα χρωµοσωµάτων ενός οργανισµού ορίζεται σαν C-value και είναι χαρακτηριστική για κάθε οργανισµό. Η δοµή του DNA λύθηκε το 1953 από τους James Watson και Francis Krieg, ενώ όπως αποδείχθηκε αρκετά χρόνια αργότερα πολύτιµη ήταν και η συµβολή της Rosalin Franklin σε αυτή την ανακάλυψη. Πρόκειται για µόριο που αποτελείται από δύο αλυσίδες (δίκλωνο µόριο) που ενώνονται µεταξύ τους σχηµατίζοντας την µορφή µίας σκάλας (ή έλικας) της οποίας κάθε σκαλί συγκροτείται από βάσεις που ενώνονται µεταξύ τους κατά παρόµοιο τρόπο µε τον οποίο κλείνει ένα φερµουάρ. Τo DNA είναι πολυµερές µόριο, του οποίου οι δοµικές µονάδες είναι τα νουκλεοτίδια. Κάθε νουκλεοτίδιο αποτελείται από ένα σάκχαρο (δεσοξυριβόζη), µία φωσφορική οµάδα και µια οργανική αζωτούχο βάση, η οποία µπορεί να είναι είτε πουρίνη (διπλός δακτύλιος), είτε πυριµιδίνη (απλός δακτύλιος). Το DNA περιέχει τις εξής πουρίνες αδενίνη (A), γουνίνη (G) και τις πυριµιδίνες κυτοσίνη (C) και θυµίνη (T). Οι δύο αλυσίδες είναι µεταξύ τους συµπληρωµατικές, δηλαδή απέναντι από κάθε αδενίνη που υπάρχει στη µία αλυσίδα υπάρχει µία θυµίνη στην άλλη αλυσίδα και απέναντι από κάθε γουανίνη που υπάρχει στην µία αλυσίδα υπάρχει µία κυτοσίνη στην άλλη αλυσίδα. Κάθε µόριο DNA έχει µία αρχή και ένα τέλος. Στην αρχή του, που καλείται 5 άκρο, υπάρχει µία φωσφορική οµάδα που είναι συνδεδεµένη στη 5 θέση του πρώτου σακχάρου. Στο τέλος του, που καλείται 3 άκρο, υπάρχει µια υδροξυλοµάδα που είναι συνδεδεµένη στη 3 θέση του τελευταίου σακχάρου. Η φωσφορική οµάδα και η οµάδα υδροξυλίου που βρίσκονται στα άκρα του DNA, του προσδίδουν χαρακτήρα διπόλου. ύο είναι οι χαρακτηριστικοί δεσµοί που απαντώνται σε ένα µόριο DNA. Οι δεσµοί υδρογόνου µεταξύ των βάσεων και οι φωσφοδιεστερικοί δεσµοί που ενώνουν φωσφρορικές οµάδες µε σάκχαρα. 4

5 Εικόνα 1.2. Α. Οι δύο αλυσίδες του DNA συγκροτούνται µεταξύ τους µέσο των δεσµών υδρογόνου που ενώνουν τις βάσεις κάθε αλυσίδας, µε τις αντίστοιχες της άλλης. Β. Τα νουκλεοτίδια ενώνονται µεταξύ τους µέσο φωσφοδιεστερικών δεσµών, προκειµένου να συγκροτήσουν κάθε αλυσίδα. Σε υψηλές θερµοκρασίες το DNA έχει την ικανότητα να απόδιατάσσεται, να ξετυλίγεται δηλαδή και να χωρίζουν οι δύο αλυσίδες του. Το ίδιο µόριο σε χαµηλές θερµοκρασίες υπόκεινται στην αντίστροφή διαδικασία, δηλαδή επαναδιατάσσεται, οι δύο αλυσίδες ενώνονται µεταξύ τους όπως πριν την αποδιάταξη. Επίσης διάφορα ένζυµα µπορούν να δράσουν πάνω στο DNA, άλλοτε καταστρέφοντας κάποιους δεσµού του, όπως π.χ. οι ενδονουκλεάσες και άλλοτε συµβάλλοντας στη δηµιουργία άλλων όπως π.χ. οι λιγάσες. (Τα ένζυµα αυτά, λόγο της ιδιαίτερης σηµασίας τους, αναλύονται διεξοδικότερα στο κεφάλαιο της κλωνοποίησης). 5

6 Το DNA δεν είναι σε όλους τους οργανισµούς ευθύγραµµο. Για παράδειγµα στα ευκαρυωτικά κύτταρα και κατά την µετάφαση βρίσκεται περιελικωµένο γύρω από συγκεκριµένες πρωτεΐνες τις ιστόνες προκειµένου να συγκροτηθούν τα χρωµοσώµατα. Αντίθετα σε ένα βακτηριακό κύτταρο µπορεί να υπάρχει σαν κυκλικό µόριο. Στο εργαστήριο, όπου µπορούµε να αποµονώσουµε DNA µόρια, η µορφή του εξαρτάται και από το διάλυµα στο οποίο βρίσκεται. Α.. Β. Ε. Γ. Ζ. Εικόνα 1.3. Το σχήµα αναφέρεται στο πώς είναι συγκροτηµένα τα χρωµοσώµατα, κατά την µετάφαση, από DNA (κόκκινη γραµµή) και πρωτεϊνες (ιστόνες) (µπλέ γραµµή). Σήµερα µπορεί να γνωρίζουµε µία-µία της βάσης από τις οποίες αποτελείται ένα DNA µόριο, εφαρµόζοντας µία διαδικασία που καλείται αλληλούχιση. Πολλοί οργανισµοί έχουν πλήρως αλληλουχηθεί µέχρι σήµερα. Τα δεδοµένα από αυτές τις αλληλουχίσεις καταχωρούνται σε ειδικές βάσεις δεδοµένων DNA, τα οποία επεξεργάζονται επιστήµονες από διαφορετικά επιστηµονικά πεδία της βιολογίας. Η µέχρι τώρα ανάλυση αυτών των δεδοµένων έχει δείξει ότι σε ορισµένους οργανισµούς το DNA είναι γεµάτο γονίδια, τα οποία µάλιστα µπορεί και να επικαλύπτουν το ένα το άλλο, ενώ στο DNA 6

7 άλλων οργανισµών, γονίδια εντοπίζονται σε αραιή διάταξη µεταξύ τους. Είναι επίσης συχνό το φαινόµενο σε κάποιους οργανισµούς, τα ίδια γονίδια να επαναλαµβάνονται για περισσότερες από µία φορές. Ανεξαρτήτως του τρόπου µε τον οποίο εµφανίζονται τα γονίδια στο DNA ενός οργανισµού, ο τρόπος µε τον οποίο µετριέται το µέγεθος νουκλεϊνικών οξέων, άρα και των γονιδίων, είναι σε ζεύγη βάσεων (bp-base pairs), ενώ άλλα µεγέθη τις ίδιας µονάδας µέτρησης είναι η Kb (kilobase) η Mb (megabase). Το DNA παράγεται µέσο µίας διαδικασίας που ονοµάζεται αντιγραφή. Σε αυτήν µετέχουν ένζυµα που καλούνται πολυµεράσες και συγκεκριµένα DNA πολυµεράσες προκειµένου να τις διακρίνουµε, από τις αντίστοιχες που µετέχουν στο πολλαπλασιασµό RNA µορίων και οι οποίες καλούνται RNA πολυµεράσες. Κάθε DNA πολυµεράση χρειάζεται ένα µικρό DNA µόριο, σαν εκκινητή, προκειµένου να αρχίσει την αντιγραφή. Επίσης χρειάζεται νουκλεοτίδια (dntps) που χρησιµεύουν σαν δοµική λίθοι για τη συγκρότηση της δίκλωνης αλυσίδας. Η DNA πολυµεράση αντιγράφει πάντοτε ξεκινώντας από το 5 ακρο του µορίου για να καταλήξει στο 3. Όλες οι πολυµεράσες δεν έχουν την ίδια πιστότητα. Ορισµένες από αυτές αναπαράγουν τα DNA µόρια κάνοντας, σχετικά, πολλά λάθη (error prone) και άλλες είναι γνωστές για το ιδιαίτερα χαµηλό ποσοστό λαθών που κάνουν κατά την αντιγραφή των ίδιων µορίων. Σηµειώνεται ότι εκτός των πολυµερασών που παράγουν DNA µόρια, υπάρχουν και οι DNases, ένζυµα που καταστρέφουν DNA. Γι αυτό όταν θέλουµε να αποµονώσουµε DNA από κύτταρα λαµβάνουµε µέτρα καταστολής της δράσης τους. 7

8 Κεφάλαιο 2 ο To RNA Το RNA όπως και το DNA είναι πολυµέρες µόριο. Αποτελείται από το σάκχαρο, D-ριβόζη, µία φωσφορική ρίζα και µία αζωτούχο βάση. Οι αζωτούχες βάσεις διαφέρουν από αυτές του DNA γιατί αντί της θυµίνης έχουµε ουρακίλη, ενώ η αδενίνη, η κυτοσίνη και η γουανίνη υπάρχουν και στο RNA µόριο. Το RNA είναι προϊόν µεταγραφής, ενώ το DNA παράγεται µε τη διαδικασία της αντιγραφής. Κυριότερη διαφορά µεταξύ του DNA και του RNA είναι ότι συνήθως, το πρώτο είναι δίκλωνο, ενώ το δεύτερο µονόκλωνο µόριο. οµικές µονάδες του RNA είναι τα ριβοζονουκλοετίδια (rntps), ενώ στη περίπτωση του DNA έχουµε τα δεσοξυριβοζονουκλεοτίδια (dntps). Οι διαφορές τους, εκτός από την αζωτούχο βάση, έγκειται στο σάκχαρο (ριβόζη αντί δέσοξυριόζης) και σε ένα παραπάνω υδροξύλιο που έχουν στο µόριο του σακχάρου. r N T P Εικόνα 2.1. Η δοµή ενός ριβοζονουκλεοτιδίου. 8

9 Στη διαδικασία της µεταγραφής εκτός των rntps που µετέχουν σαν δοµικοί λύθοι, µετέχει και DNA που χρησιµεύει σαν µήτρα (καλούπι) και µία RNA πολυµεράση. Υπάρχουν τρις τύποι RNA πολυµερασών. Κάθε µία από αυτές παράγει και διαφορετικό τύπο RNA µορίου. Οι τρις τύποι RNA µορίων είναι, το αγγελιοφόρο (messenger RNA) mrna, το ριβοσωµικό (ribosomal RNA) rrna και το µεταφορικό (transfer RNA) trna. Το mrna µεταγράφεται από RNA polymerase II και κωδικοποιεί πρωτεΐνη. Πριν τη δηµιουργία του mrna, παράγεται ένα ενδιάµεσο µόριο το hnrna (heterologus nuclear RNA) το οποίο όµως γρήγορα µετατρέπεται σε mrna. Το rrna παράγεται από τη RNA polymerase I, µέσα στο ριβόσωµα και ο ρόλος του στη πρωτεϊνοσύνθεση είναι τόσο δοµικός όσο και λειτουργικός. Το trna παράγεται από τη RNA polymerase III και χρησιµεύει στην µεταφορά αµινοξέων στο ριβόσωµα. Αντίθετα µε την αντιγραφή που δεν διαφέρει µεταξύ των προκαρυωτικών και των ευκαρυωτικών οργανισµών, η µεταγραφή διαφέρει ουσιωδώς µεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών οργανισµών, όπως ουσιώδεις διαφορές υπάρχουν και µεταξύ γονιδίων προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών οργανισµών. Στα προκαρυωτικά κύτταρα η µεταγραφή γίνεται από ένα είδος RNA πολυµεράσης, ενώ στα ευκαρυωτικά από τρις διαφορετικές. Και στους δύο τύπους κυττάρων η RNA πολυµέραση συνδέεται σε ορισµένη περιοχή του DNA προκειµένου να αρχίσει η µεταγραφή. Η περιοχή αυτή καλείται υποκινητής και βρίσκεται στο 5 άκρο των γονιδίων. Σηµειώνεται ότι ενώ στην αντιγραφή µετέχει όλο το µόριο του DNA, στη µεταγραφή µετέχουν µόνο ορισµένες περιοχές, οι περιοχές που αποτελούν γονίδια ή άλλες που ελέγχουν την έκφραση των γονιδίων. Κάθε γονίδιο είναι υπεύθυνο για το σχηµατισµό συνήθως µίας πρωτεΐνης, χωρίζεται δε, σε δύο περιοχές. Στον υποκινητή που χρησιµεύει στην µεταγραφή του γονιδίου και στην κωδικοποιούσα περιοχή του γονιδίου η οποία φέρει όλες της πληροφορίες για το σχηµατισµό της πρωτεΐνης. Σε πολλά ευκαρυωτικά γονίδια συµβαίνει η κωδικοποιούσα περιοχή τους, (αυτή που είναι υπεύθυνη για την παραγωγή πρωτεΐνης) να περιέχει εξόνια 9

10 και ιντρόνια. Μόνο τα εξόνια φέρουν πληροφορίες για το σχηµατισµό της πρωτεΐνης. Τα ιντρόνια αφαιρούνται από το hnrna µε µία διαδικασία που καλείται ωρίµανση (splicing), η οποία είναι µέρος της µεταµεταγραφικής ρύθµισης. Μπορούµε να διακρίνουµε τρις τύπους γονιδίων. Τα δοµικά γονίδια, που κωδικοποιούν καθένα και από ένα πολυπεπτίδιο. Τα ρυθµιστικά γονίδια που ρυθµίζουν ή αλλάζουν την έκφραση άλλων γονίδιων και τα ψευδογονίδια, που είναι αλληλουχίες DNA παρόµοιες µε αυτές δοµικού γονιδίου, που όµως δεν µεταγράφονται. Κάθε υποκινητής χαρακτηρίζεται από ορισµένα στοιχεία στην αλληλουχία του. Στη περίπτωση προκαρυωτικών υποκινητών τα στοιχεία αυτά είναι το Pribnow ή αλλιώς TATA box που είναι µία αλληλουχία ίδια ή παρόµοια µε την TATAAT, η οποία βρίσκεται στη 10 θέση του γονιδίου και το 35S box που βρίσκεται στη -35 θέση και αποτελείται από την αλληλουχία TTGACA. Συµβατικά η έναρξη της µεταγραφής γίνεται στο +1 σηµείο κάθε γονιδίου. Πρόκειται για τη πρώτη αδενίνη που απαντάται στο γονίδιο. Η αρίθµηση της υπόλοιπης αλληλουχίας του DNA γίνεται χρησιµοποιώντας αυτό το σηµείο σαν σηµείο αναφοράς. (Π.χ. όλες οι βάσεις που βρίσκονται 5 αυτής της αδενίνης έχουν αρνητικό πρόσηµο -1, -2 κ.λ.π., ενώ όσες βρίσκονται 3 αυτής της βάσης έχουν θετικό πρόσηµο). Ο τερµατισµός της µεταγραφής γίνεται µέσω ειδικών σηµάτων που βρίσκονται στο 3 άκρο των γονιδίων. Όπως και στην αντιγραφή έτσι και στην µεταγραφή η RNA πολυµεράση µεταγράφει µε κατεύθυνση από το 5 στο 3 κάθε DNA αλυσίδας. εδο- µένου ότι,αναλόγως του οργανισµού, γονίδια µπορεί να υπάρχουν και στις δύο DNA αλυσίδες, η κατεύθυνση της µεταγραφής για κάθε γονίδιο µπορεί να είναι διαφορετική. 10

11 χρωµόσωµα Γονίδιο 1 Γονίδιο 2 Γονίδιο 3 Γονίδιο 4 Γονίδιο 5 Πρωτεΐνη Πρωτεΐνη Πρωτεΐνη Πρωτεΐνη Πρωτεΐνη Εικόνα 2.2. Το προϊόν έκφρασης ενός γονιδίου είναι µία πρωτεΐνη. Συχνά συµβαίνει η διαδικασία της µεταγραφής να ελέγχεται από DNA στοιχεία που καλούνται ενισχυτές (enhancers) αν προκαλούν την µεταγραφή ενός γονιδίου ή σιωπητές (silencers) αν προκαλούν την καταστολή της µεταγραφής ενός γονιδίου. Τα στοιχεία αυτά εµφανίζονται στα ιντρόνια και στις περιοχές µεταξύ των γονιδίων. Η διάρκεια ζωής των mrna µορίων διαφέρει. Το mrna προκαρυωτικών οργανισµών είναι πολύ ασταθές µε µέσο όρο ζωής 2-4 min,ενώ αυτό των ευκαρυωτικών οργανισµών έχει µεγαλύτερο χρόνο ζωής. Μία σειρά µεταµεταγραφικών ρυθµίσεων επιτρέπουν στο mrna ευκαρυωτικών οργανισµών να ετοιµαστεί για το µακρύ ταξίδι του από το πυρήνα του κυττάρου στο κυτταρόπλασµα. Οι ρυθµίσεις αυτές είναι η προσθήκη µία µεθυλικής γουανοσίνης στο 5 άκρο του (CAP -7 methylguanosine), η προσθήκη µίας ουράς από αδενίνες (polya tail) στο 3 άκρο του µεταγράφου και η ωρίµανση, η αποβολή αλληλουχιών (ιντρονίων) από εσωτερικά τµήµατα RNA. Όπως οι DNases είναι υπεύθυνες για την καταστροφή DNA µορίων, έτσι και οι ριβονουκλεάσες (RNases), είναι ένζυµα που καταλύουν το σπάσιµο RNA µορίων. Οι περισσότερες απαιτούν Ca 2+, Mg 2+ σαν συµπαράγοντες, ενώ η δράση τους µπορεί να σταµατήσει µε προσθήκη EDTA. 11

12 Τελευταία έχουν βρεθεί σε ορισµένους ιούς ένζυµα που κάνουν την αντίστροφή διαδικασία της µεταγραφής, δηλαδή παράγουν DNA από RNA. Τα ένζυµα αυτά καλούνται αντίστροφες µεταγραφάσες. Τέλος ο πολλαπλασιασµός RNA ιών γίνεται από τις RNA αντιγραφάσες (replicases), οι οποίες καταλύουν το πολλαπλασιασµό RNA γονιδιωµάτων ιών, περιπτώσεων δηλαδή όπου RNA µόρια χρησιµοποιούνται σαν εκµαγεία στον πολλαπλασιασµό. 12

13 Κεφάλαιο 3 ο ΟΙ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Ο Gerardus Johannes Mulder ( ), ονόµασε πρωτεΐνες, τις οργανικές ουσίες που υπάρχουν παντού στα ζώα, και όπως φάνηκε αργότερα και στα φυτά, από τη λέξη πρωτείο, θέλοντας να τονίσει τη σηµασία τους. Σε ένα τυπικό κύτταρο E. coli υπάρχουν: 70% Νερό 15% Πρωτεΐνες 7% Νουκλεϊνικά Οξέα 3% Υδατάνθρακες 2% Λιπίδια 3% Άλλα Εικόνα 3.1. Η ποσοστιαία αναλογία των συστατικών ενός κυττάρου E.coli Οι δοµικές µονάδες των πρωτεϊνών είναι τα αµινοξέα. Τα αµινοξέα φέρουν στο ένα άκρο τους µίας αµινοµάδα και στο άλλο µια καρβοξυλοµάδα. Μερικές εκατοντάδες αµινοξέα είναι γνωστά, εκ των οποίων όµως µόνο 20 αποτελούν συστατικά των πρωτεϊνών. Όλα τα αµινοξέα είναι δίπολα. Κατατάσσονται σε κατηγορίες αναλόγως των ιδιοτήτων τους, όπως όξινα και βασικά, υδρόφοβα και πολικά (υδρόφιλα). Οι ιδιότητές των πρωτεϊνών καθορίζονται σε µεγάλο βαθµό από τις ιδιότητες των αµινοξέων τους. Αντίστροφη Μεταγραφή DNA RNA Πρωτεΐνη Μεταγραφή Μετάφραση Αντιγραφή Εικόνα 3.2. Σύνοψη των βασικών µοριακών λειτουργιών. Η πρωτεϊνοσύνθεση γίνεται µε µία διαδικασία που καλείται µετάφραση. Όπως τα νουκλεϊνικά οξέα αποτελούνται από µία αλληλουχία νουκλεοτιδίων, έτσι και οι πρωτεΐνες αποτελούνται από µία αλληλουχία αµινοξέων. ύο ή περισσότερα αµινοξέα 13

14 συνδεδεµένα µεταξύ τους µε πεπτιδικούς δεσµούς συγκροτούν ένα πεπτίδιο. Όταν υπάρχουν 3 ή περισσότερα αµινοξέα ενωµένα σε σειρά µεταξύ τους, τότε προκύπτει ένα ολιγοπεπτίδιο και όταν περισσότερα αµινοξέα σχηµατίζουν µία αλυσίδα τότε προκύπτει ένα πολυπεπτίδιο ή αλλιώς µία πρωτεΐνη. Το µέγεθος των πρωτεϊνών µετριέται σε µονάδες Dalton (d), ενώ συνηθέστερα χρησιµοποιείται το Kd. Εικόνα 3.3. Ένα «φορτισµένο µόριο» trna, είναι ένα trna που µεταφέρει ένα αµινοξύ. Η σύνθεση των πρωτεϊνών από αµινοξέα γίνεται στα ριβοσώµατα του κυτταροπλάσµατος. Το ριβόσωµα είναι σύµπλοκο αποτελούµενο από rrna και πρωτεΐνες, οργανωµένο σε µικρή και µεγάλη υποµονάδες. Οι πρωτεΐνες και τα RNA στις δύο υποµονάδες διαφέρουν. Το mrna αφήνοντας τον πυρήνα, µεταφέρεται στα ριβοσώµατα, όπου µε τη βοήθεια του rrna συνδέεται µε την µικρή υποµονάδα του ριβοσώµατος. Το trna φέρνει συγκεκριµένα αµινοξέα στο ριβόσωµα, όπου ένα αντικωδικόνιο του trna συνδέεται στο κωδικόνιο του mrna. Κάθε αµινοξύ σχηµατίζει δεσµό µε το διπλανό του αµινοξύ προκειµένου να σχηµατισθεί µία αναπτυσσόµενη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Κατόπιν το trna χωρίς το αµινοξύ απελευθερώνεται από το 14

15 ριβόσωµα, ενώ άλλα trna µεταφέρουν αµινοξέα στο ριβόσωµα για να συµπληρώσουν το πρωτεϊνικό µόριο. Κάθε trna αναγνωρίζει το σωστό κωδικόνιο στο mrna µεταφέροντας το αντίστοιχο αµινοξύ. Κάθε κωδικόνιο είναι µία οµάδα τριών νουκλεοτιδιών που κωδικοποιεί ένα αµινοξύ. Το είδος του αµινοξέος που κωδικοποιεί κάθε κωδικόνιο, εξαρτάται εν µέρει µόνο από το είδος των νουκλεοτιδίων από τα οποία αποτελείται, και τη σειρά µε την οποία είναι ενωµένα. Αυτό συµβαίνει γιατί ενώ θεωρητικά τα 4 διαφορετικά νουκλεοτίδια συνδυαζόµενα ανά 3 θα έπρεπε να µας δώσουν 4 3 κωδικόνια, στη φύση βρέθηκε ότι υπάρχουν µόνο 61 συνδυασµοί νουκλεοτιδίων (κωδικόνια) που δίνουν αµινοξέα. Επίσης πολλά κωδικόνια κωδικοποιούν για το ίδιο αµινοξύ µε αποτέλεσµα τα αµινοξέα να είναι λιγότερα από όσα θεωρητικά αναµένονται. Συγκεκριµένα είναι µόνο 20 αυτά που µετέχουν στο σχηµατισµό των πρωτεϊνών, όπως φαίνεται και από το γενετικό κώδικα, που για τους παραπάνω λόγους λέγεται εκφυλισµένος. Εικόνα Απεικόνιση της µετάφρασης ενός mrna στο ριβόσωµα. Στα προκαρυωτικά κύτταρα απαντώνται τα πολυριβοσώµατα, που είναι οµάδες ριβοσωµάτων που «διαβάζουν» το ίδιο mrna παράγοντας ταυτόχρονα πολλές πρωτεΐνες (πολυπεπτίδια). 15

16 ΕΥΤΕΡΗ ΘΕΣΗ ΚΩ ΙΚΟΝΙΟΥ T C A G Π Ρ Ω Τ T TTT Phe [F] TTC Phe [F] TTA Leu [L] TTG Leu [L] TCT Ser [S] TCC Ser [S] TCA Ser [S] TCG Ser [S] TAT Tyr [Y] TAC Tyr [Y] TAA Ter [stop] TAG Ter [stop] TGT Cys [C] TGC Cys [C] TGA Ter [stop] TGG Trp [W] T C A G Τ Ρ Ι Τ Η Η Θ Ε Σ C CTT Leu [L] CTC Leu [L] CTA Leu [L] CTG Leu [L] CCT Pro [P] CCC Pro [P] CCA Pro [P] CCG Pro [P] CAT His [H] CAC His [H] CAA Gln [Q] CAG Gln [Q] CGT Arg [R] CGC Arg [R] CGA Arg [R] CGG Arg [R] T C A G Θ Ε Σ Η Η ATT Ile [I] ACT Thr [T] AAT Asn [N] AGT Ser [S] T Κ Κ Ω Ι Κ Ο Ν Ι Ο Υ A G ATC Ile [I] ATA Ile [I] ATG Met [M] GTT Val [V] GTC Val [V] GTA Val [V] GTG Val [V] ACC Thr [T] ACA Thr [T] ACG Thr [T] GCT Ala [A] GCC Ala [A] GCA Ala [A] GCG Ala [A] AAC Asn [N] AAA Lys [K] AAG Lys [K] GAT Asp [D] GAC Asp [D] GAA Glu [E] GAG Glu [E] AGC Ser [S] AGA Arg [R] AGG Arg [R] GGT Gly [G] GGC Gly [G] GGA Gly [G] GGG Gly [G] C A G T C A G Ω Ι Κ Ο Ν Ι Ο Υ Εικόνα 3.5. Ο γενετικός κώδικας είναι εκφυλισµένος, γιατί διαφορετικά κωδικόνια µπορεί να κωδικοποιούν το ίδιο αµινοξύ. Οι πρωτεΐνες είναι τα προϊόντα έκφρασης των γονιδίων. Όλα τα γονίδια δεν εκφράζονται την ίδια χρονική στιγµή. Υπάρχουν ορισµένα γονίδια που πρέπει να εκφράζονται συνέχεια, συστατικά γονίδια (housekeeping genes) και άλλα που εκφράζονται µόνο υπό ορισµένες συνθήκες. ύο γονίδια που εκφράζονται την ίδια χρονική στιγµή δεν δίνουν κατ ανάγκη την ίδια ποσότητα προϊόντος (πρωτεΐνης). Οι διαφορές αυτές στα προϊόντα 16

17 έκφρασης γονιδίων που παρουσιάζονται οποιαδήποτε χρονική στιγµή αποδίδονται µε τον όρο διαφορική έκφραση γονιδίων. Εικόνα 3.6. Η διαφορική έκφραση δύο ή περισσοτέρων γονιδίων, αφορά διαφορές τους που παρουσιάζονται τόσο στην µεταγραφή, όσο και στην µετάφραση αυτών των γονιδίων. Η βιολογική δράση (λειτουργία) των πρωτεϊνών εξαρτάται και από την τρισδιάστατη (3D) δοµή τους. Οι πρωτεΐνες έχουν τέσσερα επίπεδα οργάνωσης. Το πρωτοταγές επίπεδο είναι η αλληλουχία των αµινοξέων, το δευτεροταγές επίπεδο καθορίζεται από τους δεσµούς υδρογόνου που συχνά συµβάλουν στο δηµιουργία σχηµάτων, όπως οι άλφα έλικες (alpha helix), οι βήτα πτυχωτές επιφάνειες (beta pleated sheets) και οι τυχαίες περιελίξεις (random coils). Το τριτοταγές επίπεδο διαµορφώνεται µε την αναδίπλωση των αµινοξικών αλυσίδων και διατηρείται εξαιτίας της ανάπτυξης δεσµών στην πρωτεΐνη, όπως δυσουλφιδικοί δεσµοί και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Τεταρτοταγές επίπεδο έχουν µόνο µεγάλες ή και πολύπλοκες πρωτεΐνες οι οποίες αποτελούνται από 17

18 υποµονάδες κάθε µία από τις οποίες σχηµατίζεται και από µία διαφορετική πολυπεπτιδική αλυσίδα. Σε κάθε µία πρωτεΐνη, αυτές οι υποµονάδες µπορεί να είναι ίδιες ή να διαφέρουν µεταξύ τους, τόσο στο µέγεθος όσο και στην πολυπλοκότητά τους. Άλλα στοιχεία της δοµής µίας πρωτεΐνης αποτελούν και οι περιοχές αναδίπλωσης (protein folding domains). Πρόκειται για µέρη της πρωτεΐνης που αναδιπλώνονται ανεξάρτητα από άλλες περιοχές της πρωτεΐνης. Την δοµή κάθε πρωτεΐνης την καθορίζουν τόσο οµοιοπολικές αλληλεπιδράσεις, όπως πεπτιδικοί και δισουλφιδικοί δεσµοί, όσο και µη οµοιοπολικές αλληλεπιδράσεις, όπως δεσµοί υδρογόνου, υδρόφοβες και ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις, καθώς και δυνάµεις van der Waals. Εικόνα 3.7. Τα διαφορετικά επίπεδα οργάνωσης µία πρωτεΐνης. Στις πρωτεΐνες µπορεί να γίνουν οµοιοπολικές προσθήκες, όπως φωσφορυλίωση και γλυκοζυλίωση, αλλά να προστεθούν και διάφοροι συµπαράγοντες (cofactors), όπως ανόργανα µεταλλικά ιόντα ή συνένζυµα (coenzymes). Επίσης οι πρωτεΐνες υπόκεινται 18

19 σε διάφορες µεταµεταφραστικές αλλαγές, όπως πρωτεόλυση (proteolytic processing) και αναδιπλώσεις (folding). Τέλος οι πρωτεΐνες αποικοδοµούνται, είτε για λόγους ανακύκλωσης των αµινοξέων τους, είτε για ρύθµιση της δράσης άλλων πρωτεϊνών, είτε για την αποµάκρυνση µη κανονικών πρωτεϊνών. Σηµειώνεται ότι υπάρχουν και ένζυµα που υδρολύουν πρωτεΐνες, τα οποία καλούνται πρωτεϊνάσες. Με την υδρόλυση των πρωτεϊνών προκύπτουν µικρά πεπτίδια. Όλα τα ένζυµα είναι πρωτεΐνες, όµως δεν έχουν όλες οι πρωτεΐνες καταλυτικό ρόλο. Υπάρχουν πρωτεΐνες που έχουν ρυθµιστικό ρόλο (ορµόνες), άλλες που έχουν προστατευτικό ρόλο (αντισώµατα), άλλες δοµικό (οι πρωτεΐνες στους µις) και άλλες αποθηκευτικό ρόλο. Η δράση κάθε πρωτεΐνης ελέγχεται από το ph του διαλύµατος στο οποίο βρίσκεται, τη θερµοκρασία, τη συγκέντρωση υποστρώµατος, από ενζυµικούς παράγοντες, και από πρωτεΐνες ελέγχου. 19

20 Κεφάλαιο 4 ο ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ Περίπου είκοσι χρόνια µετά την ανακάλυψη της δοµής του DNA, το 1953 από τους Watson και Crick, ο Berg και οι συνεργάτες του δηµιουργούν το 1972 το πρώτο ανασυνδυασµένο µόριο, σηµατοδοτώντας την έναρξη µίας εποχής που χαρακτηρίζεται από την αλµατώδη πρόοδο της βιολογίας, στηριζόµενοι σε τεχνικές όπως αυτή της κλωνοποίησης. Τα βασικά βήµατα της κλωνοποίησης είναι τα ακόλουθα. Το γονίδιο που πρόκειται να κλωνοποιηθεί (ένθετο) ενσωµατώνεται σε ένα, συνήθως, κυκλικό DNA µόριο που καλείται φορέας κλωνοποίησης προκειµένου να δηµιουργηθεί ένα ανασυνδυασµένο DNA µόριο. Ο φορέας χρησιµοποιείται για την µεταφορά και το πολλαπλασιασµό του γονιδίου στον οργανισµό κλωνοποίησης που συνήθως είναι ένα βακτήριο. Μέσα στο βακτηριακό κύτταρο παράγονται πολλά αντίγραφα του ανασυνδυασµένου µορίου. Ο αριθµός αυτών των αντιγράφων αυξάνεται καθώς διαιρείται το κύτταρο σε άλλα κύτταρα, καθένα από τα οποία φέρει και κάποια ανασυνδυασµένα µόρια. Μετά από πολλές κυτταρικές διαιρέσεις και επώαση σε κατάλληλες συνθήκες, δηµιουργούνται αποικίες βακτηρίων, κάθε µία από τις οποίες αποτελείται από ένα µεγάλο αριθµό κυττάρων, µέσα στα οποία υπάρχουν αντίγραφα του ανασυνδυασµένου µορίου. Η διαδικασία της κλωνοποίησης αρχίζει µε την αποµόνωση του DNA (του γονιδίου που πρόκειται να κλωνοποιήσουµε). Ακολουθεί η πέψη (το κόψιµο) του φορέα που πρόκειται να δεχθεί το ένθετο. Κατόπιν ενώνονται τα δύο µόρια, προκειµένου να δηµιουργηθεί το ανασυνδυασµένο µόριο, το οποίο εισάγουµε σε ένα οργανισµό κλωνοποίησης (µετασχηµατισµός). Τέλος οι διάφορες βακτηριακές αποικίες που προκύπτουν ελέγχονται για να εντοπιστεί αυτή που περιέχει το ανασυνδυασµένο µόριο. Συνηθέστεροι φορείς κλωνοποίησης είναι τα πλασµίδια, τα οποία είναι µικρά κυκλικά µόρια DNA που περιλαµβάνουν µία περιοχή πολλαπλασιασµού τους (ori), ένα τουλάχιστον γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικό, π.χ. Amp r και µία πολλαπλή περιοχή κλωνοποίησης MCS (Multiple Cloning Site). Τα πλασµίδια πολλαπλασιάζονται σε πολλά αντίγραφα, αυτόνοµα, ανεξάρτητα δηλαδή από το βακτηριακό χρωµόσωµα. Το 20

21 µέγεθος του ενθέτου που µπορεί να δεχθούν είναι µικρότερο από 30 Kb. Εκτός από τα πλασµίδια υπάρχουν και τα BACs (Bacterial Artificial Chromosomes), που χρησιµοποιούνται για την κλωνοποίηση τµηµάτων DNA µεγέθους (100 έως 300kb), τα YACs (Yeast Artificial Chromosomes) που είναι DNA ζύµης στα οποία ενσωµατώνονται (κλωνοποιούνται) µεγάλα τµήµατα γονιδιώµατος (έως 1000 Kb), το DNA βακτηριοφάγων (ιών που προσβάλουν βακτήρια) στο οποίο µπορεί να κλωνοποιηθούν ένθετα µεγέθους 23 Kb και τα κοσµίδια, υβριδικά µόρια φάγων και βακτηριακών πλασµιδίων, στα οποία µπορεί να κλωνοποιηθούν ένθετα µεγέθους µέχρι και 40 Kb. Εικόνα 4.1. Τα βασικά βήµατα της κλωνοποίησης. Τα ένζυµα που σχετίζονται µε τη διαδικασία της κλωνοποίησης χωρίζονται στις εξής κατηγορίες. Νουκλεάσες (nucleases), ένζυµα τα οποία αποικοδοµούν (κόβουν) νουκλεϊνικά οξέα, οι λιγάσες (ligases) οι οποίες συνδέουν νουκλεϊνικά µόρια µεταξύ τους, οι πολυµεράσες (polymerases) οι οποίες δηµιουργούν αντίγραφα µορίων, τα τροποποιητικά ένζυµα (modifying enzymes) τα οποία προσθέτουν ή αφαιρούν χηµικές οµάδες και οι 21

22 τοποϊσοµεράσες (topoisomerases) οι οποίες εισάγουν ή αποµακρύνουν υπερελικώσεις από κυκλικά DNA µόρια. Οι νουκλεάσες καταστρέφουν τους φωσφοδιεστερικούς δεσµούς που ενώνουν τα νουκλεοτίδια µεταξύ τους. Υπάρχουν δύο ειδών νουκλεάσες. Οι εξωνουκλεάσες, οι οποίες αφαιρούν ένα νουκλεοτίδιο κάθε φορά, αρχίζοντας από το τέλος του DNA µορίου και οι ενδονουκλεάσες, οι οποίες µπορούν και καταστρέφουν εσωτερικούς φωσφοδεστερικούς δεσµούς στο µόριο του DNA. Στην κατηγορία των ενδονουκλεασών ανήκουν και τα περιοριστικά ένζυµα, η σηµαντικότερη κατηγορία ενζύµων κλωνοποίησης. Τα περιοριστικά ένζυµα αναγνωρίζουν και κόβουν συγκεκριµένες περιοχές του DNA (περιοριστικές θέσεις). Κάθε περιοριστικό ένζυµο, όχι µόνο αναγνωρίζει ορισµένη θέση περιορισµού, αλλά την κόβει και µε ορισµένο τρόπο. Οι περισσότερες περιοριστικές θέσεις είναι παλίνδροµα αποτελούµενες από 4-, 6-, ή 8- ζεύγη βάσεων. Όσο λιγότερες είναι οι βάσεις από τις οποίες αποτελείται µία περιοριστική θέση τόσο συνηθέστερα, η θέση αυτή απαντάται στο γονιδίωµα. Τα ονόµατα των περιοριστικών ενζύµων ξεκινούν µε τρία γράµµατα που δηλώνουν τον οργανισµό από τον οποίο αποµονώνονται, π.χ. EcoRI είναι το ένζυµο που αποµονώνεται από βακτηριακά στελέχη E. coli RY13. Η βιολογική σηµασία της ύπαρξης των περιοριστικών ένζύµων σχετίζεται µε την άµυνα των βακτηρίων έναντι των ιών. Συγκεκριµένα, τα βακτήρια χρησιµοποιούν τα περιοριστικά ένζυµα για να κόβουν το DNA των ιών σε περίπτωση που µολυνθούν από αυτούς. Τα ίδια βακτήρια προστατεύουν το δικό τους DNA από τα περιοριστικά ένζυµα µεθυλιώνοντάς το. Εκτός από τα περιοριστικά ένζυµα κατά την κλωνοποίηση χρησιµοποιούνται, λιγάσες, φωσφατάσες και κινάσες. Οι λιγάσες όπως προαναφέρθηκε ενώνουν δύο DNA µόρια µεταξύ τους, ενώ ο φυσικός τους ρόλος είναι να «επισκευάζουν» οποιαδήποτε ανοίγµατα υπάρχουν σε ένα δίκλωνο DNA µόριο, προσθέτοντας φωσφοδιεστερικούς δεσµούς. Οι φωσφατάσες αποµακρύνουν φωσφορικές οµάδες από το 5 άκρο DNA µορίων, ενώ οι κινάσες κάνουν ακριβώς την αντίθετη δουλειά. 22

23 Εικόνα 4.2. Η µεθυλίωση του βακτηριακού DNA εµποδίζει τα περιοριστικά ένζυµα να κόψουν το βακτηριακό DNA, ενώ µπορούν να κόψουν το DNA του φάγου που δεν είναι µεθυλιωµένο, εξουδετερώνοντάς τον. Κατά την κλωνοποίηση χρειάζεται να βρεθεί και ένας οργανισµός στον οποίο θα εκφρασθεί η ανασυνδυασµένη πρωτεϊνη. Σαν τέτοιος µπορεί να χρησιµοποιηθεί, οποιοσδήποτε από τους παρακάτω φορείς, καθένας από τους οποίους έχει και συγκεκριµένα χαρακτηριστικά έκφρασης, όπως π.χ. ο Saccharomyces cerevisiae που δεν γλυκοζυλιώνει και δεν εκκρίνει πρωτεΐνες στο µέσο καλλιέργειας, ο Pichia pastoris που γλυκοζυλιώνει, ο Aspergillus nidulans που επίσης γλυκοζυλιώνει και εκκρίνει πρωτεΐνες στο µέσο καλλιέργειας, καθώς και το Trichoderma reesei που επίσης γλυκοζυλιώνει και εκκρίνει πρωτεΐνες στο µέσο καλλιέργειας. 23

24 Κεφάλαιο 5 ο ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΣ ΤΟΥ DNA Η δεκαετία του 80 χαρακτηρίστηκε από µία ραγδαία εξάπλωση της γενετικής µηχανικής σε πολλά εργαστήρια, µε αποτέλεσµα οι επιστήµονες να χρειάζονται όλο και µεγαλύτερες ποσότητες DNA για τα πειράµατά τους. Ορισµένοι επιστήµονες σκέφτηκαν ότι θα έπρεπε να βρεθεί ένας τρόπος πολλαπλασιασµού του DNA, που θα ήταν χρήσιµος στις περιπτώσεις µικροοργανισµών των οποίων η απόδοση σε DNA είναι πολύ χαµηλή. Το 1983 ο Kary Mullis ανακοίνωσε τη πλέον ολοκληρωµένη πρόταση για το πολλαπλασιασµό του DNA, η οποία δηµοσιεύθηκε το 1985 και η οποία όπως φάνηκε τα επόµενα χρόνια, ήταν τόσο επαναστατική, ώστε το 1993 του απονεµήθηκε το βραβείο Nobel Χηµείας. Η µέθοδος που πρότεινε απαιτεί τη χρήση ενός κυκλοποιητή, µίας συσκευής που θερµαίνεται και ψύχεται µε ακρίβεια και πολύ γρήγορα. Η συσκευή αυτή χρησιµοποιείται για την εφαρµογή µίας αντίδρασης που ονοµάζεται αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης, ή PCR (Polymerase Chain Reaction). Συγκεκριµένα στην αντίδραση αυτή µετέχει µία πολυµεράση η οποία όχι µόνο πολλαπλασιάζει µόρια DNA, αλλά και δεν καταστρέφεται σε υψηλές θερµοκρασίες. Αυτή η DNA πολυµεράση ονοµάζεται Taq από το Thermus aquaticus, ένα βακτήριο θερµών πηγών, από το οποίο αποµονώθηκε. Εκτός από τη πολυµεράση στην ίδια αντίδραση µετέχουν dntps, κατάλληλο για τη δράση της πολυµεράσης ρυθµιστικό διάλυµα και εκκινητές απαραίτητοι στην αρχή κάθε αντίδρασης πολυµερισµού. Η αντίδραση γίνεται σε µικρό όγκο, µε τη προσθήκη νερού. Τα αρχικά προβλήµατα που εντοπίσθηκαν στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης σχετίζονταν µε το γεγονός ότι η Taq DNA πολυµεράση έκανε συχνά λάθη κατά το πολλαπλασιασµό του DNA. ιάφορες άλλες πολυµεράσες που αποµονώθηκαν τα τελευταία χρόνια είναι πολύ περισσότερο αποτελεσµατικές από τη Taq, η οποία όµως εξακολουθεί και χρησιµοποιείται σε πολλές εφαρµογές. 24

25 Εικόνα 5.1. Οι κυκλοποιητές έχουν χαρακτηριστεί και ως «µοριακές φωτοτυπικές µηχανές» εξαιτίας της δυνατότητάς τους να αναπαραγάγουν πολλά αντίγραφα του ίδιου DNA µορίου. Τα βήµατα µίας αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµερισµού δεν έχουν αλλάξει, παρόλο που υπάρχουν πλέον πολλές παραλλαγές τους, οι οποίες εφαρµόζονται κατά περίπτωση. Σε κάθε περίπτωση πρόκειται για ένα σύνολο κύκλων οι οποίοι συνήθως κυµαίνονται από Κάθε κύκλος χωρίζεται σε τρις φάσεις. Πρώτη είναι η φάση της αποδιάταξης της δίκλωνης αλυσίδας σε δύο µονόκλωνες. Αυτό γίνεται σε θερµοκρασία o C. Στην επόµενη φάση έχουµε τη συγκόλληση των εκκινητών σε συγκεκριµένες (οµόλογες) θέσεις στο DNA, αναλόγως της αλληλουχίας τους. Στη τελευταία φάση η πολυµεράση βρίσκει τα σηµεία στα οποία είναι προσδεδεµένοι οι εκκινητές και αρχίζει από αυτά τη σύνθεση µίας δίκλωνης αλυσίδας από κάθε µονόκλωνη αλυσίδα. Στο τέλος κάθε κύκλου προκύπτουν από κάθε αλυσίδα δύο άλλες, ώστε στο τέλος όλης της αντίδρασης να προκύπτουν, συνολικά, 2 n αλυσίδες, όπου n είναι ο αριθµός των κύκλων κάθε αντίδρασης. Η αύξηση των κύκλων πάνω από έναν αριθµό συνήθως 40 κύκλων δεν συνεπάγεται και αύξηση των προϊόντων της αντίδρασης γιατί είτε κάποια από τα αντιδραστήρια τελειώνουν, είτε τα προϊόντα επανενώνονται µεταξύ τους, είτε το ένζυµο καταστρέφεται, είτε ανεπιθύµητα προϊόντα συσσωρεύονται. 25

26 ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗ 37 C - 65 C ΚΥΚΛΟΙ ΑΠΟ ΙΑΤΑΞΗ 93 C - 95 C ΣΥΝΘΕΣΗ 72 C Εικόνα 5.3. Τα βήµατα µίας αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης. Η αντίδραση PCR βρίσκει εφαρµογή σε πολλούς τοµείς, κυριότεροι των οποίων είναι ο τοµέας της υγείας, της φυτοπαθολογίας, της βελτίωσης φυτών και της εγκληµατολογίας. Στο τοµές της υγείας η PCR χρησιµοποιείται για τη διάγνωση µολυσµατικών ασθενειών όπως είναι η otitis media-middle µία ασθένεια µόλυνσης του αυτιού, το AIDS, αλλά και άλλες σεξουαλικά µεταδιδόµενες ασθένειες, όπως swab-herpes, papillomarvirus, chlamydia, οι οποίες µάλιστα µπορούν και οι τρις να ανιχνευθούν σε µία αντίδραση. Επίσης η αντίδραση PCR µπορεί να χρησιµοποιηθεί για να διαπιστωθεί αν η µητέρα και το έµβρυο έχουν συµβατές οµάδες αίµατος. Η ίδια αντίδραση χρησιµοποιείται για την ανίχνευση κληρονοµικής προδιάθεσης για συγκεκριµένες ασθένειες, όπως τη διάγνωση µεταλλάξεων στο DNA που είναι χαρακτηριστικές για κάποιες µορφές καρκίνου. 26

27 Εικόνα 5.4. Ένας τυπικός κύκλος αντίδρασης PCR. Μία από τις πρώτες εφαρµογές της αντίδρασης PCR ήταν στη εγκληµατολογία, όπου από ελάχιστες ποσότητες DNA που βρίσκονται στο αίµα, σε τρίχες, στο σάλιο, και σε άλλα σωµατικά υγρά, µπορεί να πολλαπλασιασθούν µεγαλύτερες ποσότητες DNA του δράστη ενός εγκλήµατος, το οποίο χρησιµοποιείται εν είδη µοριακού αποτυπώµατος. Σε πολλά µέρη του κόσµου, ανάµεσά τους και η Ελλάδα, αναλόγως των αποτελεσµάτων της αντίδρασης PCR, υπάρχουν άτοµα που καταδικάσθηκαν για συγκεκριµένα εγκλήµατα και άλλα που αθωώθηκαν. ιάφορες αστυνοµικές αρχές στον κόσµο, ανταλλάσσουν και συγκρίνουν δείγµατα DNA σε εθνικό και διεθνές επίπεδο, συνδέουν εγκλήµατα µεταξύ τους και συσχετίζουν δείγµατα από κατά συρροή εγκληµατίες µε δείγµατα που συλλέχθηκαν από τόπους εγκληµάτων, ώστε οι εξυγνιάσεις εγκληµάτων να γίνονται γρηγορότερα και µε περισσότερη ακρίβεια. 27

28 Κεφάλαιο 6 ο ΜΟΡΙΑΚΗ ΧΑΡΤΟΓΡΑΦΗΣΗ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΩΝ To 1979 σε δύο εργαστήρια που δούλευαν ανεξάρτητα, αυτά των Maxam και Gilbert και του Sanger αναπτύχθηκαν µέθοδοι για την αλληλούχιση DNA. Το 1980 οι Botstein, Davis, Skolnick και White προτείνουν την χαρτογράφηση του ανθρώπου, ενώ το 1982 ο Wada πρότεινε την αυτόµατη αλληλούχιση οργανισµών, για την οποία, η πρώτη µηχανή ήταν έτοιµη το 1986 κατασκευασµένη από τους Hood και Smith. Σκοπός της γενοµικής είναι να περιγράψει την λειτουργία κάθε γονιδίου, τα δεδοµένα έκφρασής του, τις σχέσεις του µε άλλα µόρια και τη σχέση του µε το φαινότυπο. Ο τοµέας της γενοµικής χωρίζεται στη δοµική που έχει σαν αντικείµενό της, το που βρίσκεται κάθε αλληλουχία, την λειτουργική που αναφέρεται στο τι κάνει η συγκεκριµένη αλληλουχία και τέλος τη συγκριτική που αναφέρεται στα σηµαντικά κοινά στοιχεία ορισµένης αλληλουχίας, µε άλλες αλληλουχίες. Στις αρχές του 20 ου αιώνα ο άνθρωπος είχε αναπτύξει πολλές διαφορετικές τεχνικές για την χαρτογράφηση τόσο του γονιδιώµατός του, όσο και για τη χαρτογράφηση γονιδιωµάτων άλλων οργανισµών. Στις 15 Φεβρουάριου 2001 στο επιστηµονικό περιοδικό Nature, ανακοινώνεται ένα µεγάλο µέρος της αλληλουχίας του ανθρώπινου χρωµοσώµατος, ενώ µία µέρα αργότερα ανακοινώνονται τα αποτελέσµατα της χαρτογράφησης του ίδιου γονιδιώµατος, από µία ιδιωτική εταιρία, τη Celera, στο περιοδικό Science. Η χαρτογράφηση του ανθρώπου απεκάλυψε ένα µέγεθος γονιδιώµατος 3000 Mb, στο οποίο υπάρχουν γονίδια. Οι άνθρωποι µεταξύ µας είµαστε σε επίπεδο αληλουχίας κατά 99,9% ίδιοι. Με τις σηµερινές τεχνικές µπορούµε να γνωρίζουµε την αλληλουχία ενός ανθρώπου, και ως εκ τούτου και τη πιθανότητα να νοσήσει από συγκεκριµένες ασθένειες. Τα δεδοµένα όµως αυτά εµπίπτουν στην κατηγορία των ευαίσθητων προσωπικών δεδοµένων και εποµένως δεν επιτρέπεται, ο οποιοσδήποτε να έχει πρόσβαση σε αυτά. 28

29 Εικόνα 7.1. Τα ιστορικά εξώφυλλα των δύο περιοδικών Nature και Science στα οποία δηµοσιεύθηκαν για πρώτη φορά αλληλουχίες ανθρώπινων χρωµοσωµάτων. Η συνηθέστερη στρατηγική χαρτογράφησης περιλαµβάνει την κατασκευή µίας βιβλιοθήκης κλώνων, τη διευθέτηση των κλώνων σε σειρά, την εύρεση των υπερκαλύψεων µεταξύ των κλώνων και τέλος την αλληλούχιση κάθε κλώνου, προκειµένου να αποκαλυφθεί η πλήρης αλληλουχία του οργανισµού. Ακολουθεί η επεξεργασία αυτής της πληροφορίας σε ηλεκτρονικούς υπολογιστές, χρησιµοποιώντας λογισµικό (software) που µας επιτρέπει να αντλούµε πολύτιµες πληροφορίες σχετικές µε την αλληλουχία. Οι διαφορετικές προσεγγίσεις στη χαρτογράφηση διαφόρων γονιδιωµάτων αφορούν κυρίως του φορείς που θα χρησιµοποιηθούν για την κατασκευή της βιβλιοθήκης, καθώς και τον τρόπο µε τον οποίο θα γίνει η αλληλούχιση των κλώνων της βιβλιοθήκης. Η σύγκριση των γονιδιωµάτων διαφόρων οργανισµών, αποκάλυψε ότι σε κάθε είδος υπάρχουν συγκεκριµένα κωδικόνια που χρησιµοποιούνται περισσότερο από άλλα. Το γεγονός αυτό της επιλεκτικής χρήσης κωδικονίων (codon usage) λαµβάνεται υπ οψιν 29

30 στις περιπτώσεις που θέλουµε να εκφράσουµε ένα διαγονίδιο σε έναν οργανισµό. Προκειµένου να διευκολύνουµε την έκφραση του διαγονιδίου (transgene), του γονιδίου δηλαδή που ενδιαφερόµαστε να ενσωµατωθεί σε ένα οργανισµό έκφρασης π.χ. ένα φυτό, πρέπει να το σχεδιάσουµε κατά τέτοιο τρόπο, ώστε να χρησιµοποιούµε κωδικόνια που συνηθέστερα χρησιµοποιούνται από αυτό τον οργανισµό. Εικόνα 7.2. Τα βήµατα µίας συνήθης στρατηγική χαρτογράφησης. 30

31 Σήµερα υπάρχουν πολλές βάσεις δεδοµένων, τόσο νουκλεοτιδίων όσο και πρωτεϊνών. Σε αυτές συγκεντρώνονται όλες οι αλληλουχίες γονιδίων, αλλά και µεταγραφικών παραγόντων, ακόµα και αλληλουχιών των οποίων η λειτουργία µπορεί να µην είναι ακόµα γνωστή. Οι βάσεις αυτές βρίσκονται στο διαδίκτυο, ώστε όσο το δυνατόν περισσότεροι επιστήµονες να έχουν πρόσβαση σε αυτές. Επίσης στο διαδίκτυο υπάρχουν και πολλά προγράµµατα που χρησιµεύουν στην ανάλυση των παραπάνω αλληλουχιών. Το πρώτο φυτό που χαρτογραφήθηκε ήταν το Arabidopsis thaliana, εξαιτίας του µικρού γονιδιώµατός του, 120 Mb, του µικρού βιολογικού του κύκλου, 40 µέρες και του µικρού του µεγέθους, cm. Άλλα πλεονεκτήµατα, του ίδιου φυτού που το κατέστησαν πρώτη επιλογή για χαρτογράφηση φυτού είναι ο εύκολος πολλαπλασιασµός του και ο µικρός αριθµός των χρωµοσωµάτων του, µόνο 5. Μεγαλύτερο µειονέκτηµα του συγκεκριµένου φυτού, είναι το γεγονός ότι το Arabidopsis thaliana είναι ένα ζιζάνιο και όχι ένα καλλιεργούµενο είδος. Εικόνα 7.3. Το πρώτο φυτό που χαρτογραφήθηκε ήταν το φυτό Arabidopsis thaliana. 31

32 Κεφάλαιο 7 ο ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΕΙΚΤΕΣ Εξαιτίας της µεγάλης προόδου που παρατηρείται τα τελευταία χρόνια στην µοριακή βιολογία, µπορούµε σήµερα να χρησιµοποιούµε µοριακές τεχνικές που µας διευκολύνουν πολύ στη προσπάθειά µας να επιλέξουµε, µέσα από ένα πληθυσµό, συγκεκριµένα άτοµα που έχουν ορισµένους επιθυµητούς χαρακτήρες. Η επιλογή αυτή γίνεται σε µοριακό επίπεδο, µε τη βοήθεια µοριακών δεικτών. Υπάρχουν δύο κατηγορίες µοριακών δεικτών. Οι DNA και οι πρωτεϊνικοί δείκτες. Οι πρώτοι αφορούν τόσο το πυρηνικό όσο και το εξωπυρηνικό (µιτοχονδριακό και χλωροπλαστικό) DNA. Τα κριτήρια επιλογής µοριακών δεικτών είναι πολλά και σχετίζονται τόσο µε αυτούς καθ αυτούς του δείκτες όπως η αφθονία, ο πολυµορφισµός, η εξειδίκευση για ορισµένο γενετικό τόπο, οι συγκυρίαρχοι αλληλόµορφοι, όσο και µε τη διαδικασία παραγωγής τους. Αναφορικά µε τη διαδικασία παραγωγής τους, θα πρέπει να δίνει επαναλήψιµα αποτελέσµατα, να έχει χαµηλές απαιτήσεις σε ανθρώπινο δυναµικό και τεχνική εξειδίκευση, να έχει µικρό κόστος εφαρµογής και εξέλιξης, να απαιτεί µικρή ποσότητα DNA, και να επιδέχεται αυτοµατισµούς. Στους πρωτεϊνικούς δείκτες, που εµφανίσθηκαν προτού εµφανισθούν οι DNA δείκτες, ανήκουν τα ισοένζυµα και τα αλλοένζυµα. Υπάρχουν µικρές διαφορές µεταξύ των ισοενζύµων και των αλλοενζύµων. Τα ισοένζυµα είναι διαφορετικές µορφές ενός ενζύµου που καταλύουν την ίδια αντίδραση, αλλά διαφέρουν ελάχιστα στην αµινοξική τους σύσταση ή στην δοµή τους, τόσο ώστε να µπορούν να διαχωριστούν µεταξύ τους µε ηλεκτροφόρηση ή χρωµατογραφία. Τα αλλοένζυµα αποτελούν διαφορετικές µορφές του ίδιου ενζύµου που κωδικοποιούνται από διαφορετικούς αλληλοµόρφους που βρίσκονται στον ίδιο γενετικό τόπο. 32

33 Πυρηνικό DNA (2n) µητρικό + πατρικό (έµβρυο) Μιτοχονδριακό DNA (n) Μητρικό (σπόρος) Χλωροπλαστικό DNA (n) Αγγειόσπερµα µητρικό (σπόρος) Γυµνόσπερµα πατρικό (γύρη) Εικόνα 7.1. Η προέλευση των διαφόρων ειδών DNA ενός φυτικού κυττάρου. Η εφαρµογή πρωτεϊνικών δεικτών έχει τα εξής πλεονεκτήµατα, δεν χρειάζεται εκκινητές ή σηµαντές, είναι γρήγορη και εύκολη, µε χαµηλό κόστος. Τα ζυµογράµµατα που προκύπτουν από την εφαρµογή πρωτεϊνικών δεικτών, µπορούν να αφορούν συγκεκριµένους γενετικούς τόπους και αλληλόµορφους. Στην περίπτωση των πρωτεϊνικών δεικτών υπάρχει συγκυριαρχία αλληλοµόρφων και τα αποτελέσµατά τους είναι επαναλήψιµα. Τα µειονεκτήµατα της εφαρµογής πρωτεϊνικών δεικτών είναι ότι δεν βρίσκονται σε αφθονία, έχουν χαµηλό πολυµορφισµό, τα ζυµογράµµατα µερικές φορές ερµηνεύονται δύσκολα εξαιτίας «ζωνών» που οφείλονται σε πολυπλοειδία ή σε γονίδια που έχουν διπλασιασθεί, οι πρωτεΐνες που έχουν όµοια ηλεκτροφορητική ικανότητα µπορεί να µην είναι οµόλογες, ενώ δεν είναι «ουδέτερη» σε επιλεκτική πίεση. 33

34 Εικόνα 7.2. Παράδειγµα εφαρµογής ισοενζύµων στη δηµιουργία δενδρογραµµάτων. Στους DNA δείκτες ανήκουν τα RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms), τα RAPDs (Randomly Amplified DNA Polymorphisms), τα AFLPs ( Amplified Fragment Length Polymorphisms), οι µινιδορυφόροι (minisatellites) και οι µικροδορυφόροι (microsatellites) ή αλλιώς SSRs (Simple Sequence Repeats). Η διαδικασία των RFLP περιλαµβάνει την αποµόνωση και τη πέψη του DNA, το διαχωρισµό των τµηµάτων του DNA µε ηλεκτροφόρηση αγαρόζης, τα οποία συνήθως έχουν µεγέθος 2-10 kb, την υβριδοποίησή τους κατά Southern µε σηµαντή ειδικό για ορισµένο γενετικό τόπο και τέλος την ανίχνευση τυχόν πολυµορφισµού µε αυτοραδιογραφία ή µη ραδιενεργή σήµανση. Οι δείκτες RFLP, υπάρχουν άφθονοι στα περισσότερα γονιδιώµατα, όπου είναι τυχαία διασκορπισµένοι, οι ζώνες που παράγουν µπορεί να αποδοθούν σε γενετικούς τόπους και αλληλοµόρφους, υπάρχει συγκυριαρχία αλληλοµόρφων, ενώ τα αποτελέσµατα που προκύπτουν είναι επαναλήψιµα. Γενικά πρόκειται για χρονοβόρα και τεχνικά δύσκολη διαδικασία, µε υψηλό κόστος εφαρµογής, και πρόσθετο κόστος σε περίπτωση που δεν υπάρχουν κατάλληλοι σηµαντές. Απαιτεί µεγάλη συγκέντρωση DNA (5-10µg), µεγάλου µοριακού βάρους, ενώ δεν επιδέχεται αυτοµατισµό. 34

35 Η διαδικασία παραγωγής των RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) ξεκινάει µε την αποµόνωση και την αναπαραγωγή τµηµάτων DNA, µεγέθους kb, µε PCR, το διαχωρισµό των τµηµάτων DNA µε ηλεκτροφόρηση αγαρόζης και την ανίχνευση πολυµορφισµού µετά από χρώση βρωµιούχου εθιδίου χρησιµοποιώντας υπεριώδη ακτινοβολία Εικόνα 7.3. Μινιδορυφόροι όπως φαίνονται σε φιλµ αυτοραδιογραφίας. Τα πλεονεκτήµατα των RAPDs είναι ότι για την εφαρµογή τους απαιτείται χαµηλή συγκέντρωση DNA, 5-50 ng για κάθε αντίδραση, ενώ οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιµοποιούνται είναι τυχαίες. Η δοκιµή γίνεται εύκολα και γρήγορα, µε χαµηλό κόστος. RAPD δείκτες υπάρχουν άφθονοι και τυχαία διασκορπισµένοι στο γονιδίωµα. Σε κάθε αντίδραση παράγονται συνήθως πολλές ζώνες, ενώ υπάρχει η δυνατότητα αυτοµατισµού τους. Τα µειονεκτήµατά τους είναι ότι απαιτούν καθαρό DNA, µεγάλου µοριακού βάρους. Επίσης απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή για την αποφυγή µολύνσεων και 35

36 κανονικοποίηση των συνθηκών της αντίδρασης. ενώ οι ζώνες που αναπαράγονται δεν µπορούν να αποδοθούν σε γενετικούς τόπους και αλληλοµόρφους. Τέλος παράγουν κυρίαρχους αλληλόµορφους, έχουν µικρή επαναληψιµότητα, ενώ τµήµατα ίδιου µεγέθους µπορεί να µην είναι οµόλογα Εικόνα 7.4. είγµατα RAPDs, µε βάση τα οποία µπορούν να εντοπισθούν οµοιότητες και διαφορές µεταξύ των δειγµάτων. Η διαδικασία παραγωγής των AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ξεκινάει µε την αποµόνωση και πέψη του DNA καθώς και την πρόσδεση ολιγονουκλεοτιδίων προσαρµοστών στα τµήµατα του DNA που προκύπτουν από τη πέψη. Κατόπιν γίνεται µε PCR, επιλεκτική αναπαραγωγή τµηµάτων DNA και διαχωρισµός του µε ηλεκτροφόρηση πολυακριµαλίδης. Η ανίχνευση των ζωνών που προκύπτουν γίνεται µε αυτοραδιογραφία, χρώση µε άργυρο, ή φθωρισµό. Οι εκκινητές δεν χρειάζεται να έχουν γνωστή αλληλουχία. AFLPs βρίσκονται άφθονοι, διασκορπισµένοι στο γονιδίωµα, αν και σε µερικές περιπτώσεις εντοπίζονται γύρω από τα κεντροσωµάτια. Μπορεί να γίνει αναπαραγωγή πολλών «ζωνών» σε κάθε αντίδραση. Τα αποτελέσµατα είναι επαναλήψιµα και υπάρχει η δυνατότητα αυτοµατισµού. Απαιτούν όµως πολύ καθαρό DNA, µεγάλου µοριακού βάρους. Το DNA προφίλ δεν µπορεί να 36

37 ερµηνευθεί σχετίζοντας αλληλόµορφους και γενετικούς τόπους. Είναι κυρίαρχοι αλληλόµορφοι, ενώ παρόµοιου µεγέθους τµήµατα, µπορεί να µην είναι οµόλογα. Εικόνα 7.5. Προφίλ AFLP δεικτών. Είναι χαρακτηριστική η πληθώρα των ζωνών που υπάρχουν σε κάθε δείγµα. Οι µινιδορυφόροι παράγονται µε αποµόνωση, πέψη και διαχωρισµό των τµηµάτων DNA, µεγέθους 4-20 kb, µε ηλεκτροφόρηση αγαρόζης, υβριδοποίηση κατά Southern µε ραδιοσηµασµένο µινιδορυφορικό σηµαντή και ανίχνευση πολυµορφισµού µε αυτοραδιογραφία. Οι µινιδορυφόροι έχουν υψηλό βαθµό πολυµορφισµού, παράγουν πολλές ζώνες, ενώ τα αποτελέσµατά της εφαρµογής τους είναι επαναλήψιµα. Απαιτούν όµως µεγάλες συγκεντρώσεις DNA, 5-10µg, µεγάλου µοριακού βάρους και έχουν µεγάλο κόστος εφαρµογής. Η διαδικασία παραγωγής τους είναι χρονοβόρα και απαιτεί επιδεξιότητα. Η διασπορά των µινιδορυφόρων στο γονιδίωµα µπορεί να µην είναι τυχαία. Οι ζώνες που παράγουν δεν µπορεί να αποδοθούν σε γενετικούς τόπους και αλληλοµόρφους. Είναι κυρίαρχοι αλληλόµορφοι, ενώ ζώνες ίδιου µεγέθους µπορεί να 37

38 µην είναι οµόλογες. Επίσης είναι δύσκολο να συγκρίνει κανείς πολυµορφισµούς σε διαφορετικά πηκτώµατα, ενώ δεν επιδέχονται αυτοµατισµό. Οι µικροδορυφόροι ή αλλιώς SSRs (Simple Sequence Repeats), παράγονται µετά από αποµόνωση και αναπαραγωγή τµηµάτων DNA µε PCR. Ο διαχωρισµός «ζωνών» γίνεται µε ηλεκτροφόρηση πολυακρυλαµίδης ή αγαρόζης και η ανίχνευση του πολυµορφισµού µε αυτοραδιογραφία, χρώση µε άργυρο, φθωρισµό, ή χρώση µε βρωµιούχο εθίδιο και χρήση υπεριώδους ακτινοβολίας. Η εφαρµογή µικροδορυφόρων απαιτεί χαµηλή συγκέντρωση DNA, ng/ αντίδραση, µε την οποία παράγονται «ζώνες» που µπορούν να αποδοθούν σε γενετικούς τόπους και αλληλοµόρφους. Μικροδορυφόροι βρίσκονται σε αφθονία και διασκορπισµένοι στο γονιδίωµα. Είναι συγκυρίαρχοι αλληλόµορφοι, δίνουν επαναλήψιµα αποτελέσµατα, και υπάρχει η δυνατότητα εφαρµογής αυτοµατισµού στην παραγωγή τους. υστυχώς αν δεν υπάρχουν γνωστοί εκκινητές, το κόστος τους είναι υψηλό. Επίσης ετερόζυγα άτοµα µπορεί να θεωρηθούν οµόζυγα, όταν εµφανίζονται «µηδενικά» αλληλόµορφα, εξαιτίας µετάλλαξης σε θέση πρόσδεσης εκκινητή, ενώ «λάθος» ζώνες δυσχεραίνουν την βαθµολόγιση του πολυµορφισµού. εν είναι κυρίαρχοι αλληλόµορφοι. Παρόµοιου µεγέθους τµήµατα, µπορεί να µην είναι οµόλογα. Οι µοιριακοί δείκτες έχουν πολλές εφαρµογές στη βελτίωση φυτών. Χρησιµοποιώντας µοριακούς δείκτες που είναι στενά συνδεδεµένοι, ή βρίσκονται µέσα σε έναν ή περισσότερους γενετικούς τόπους ποσοτικών χαρακτήρων QTL (Quantitative trait loci) η επιλογή γίνεται περισσότερο αποτελεσµατική (marker-assisted selection). Άλλη εφαρµογή αποτελεί η ενσωµάτωση γονιδίων από άγρια είδη µε την βοήθεια δεικτών (marker assisted introgression). Επίσης, οι µοριακοί δείκτες µπορούν να χρησιµοποιηθούν σε µελέτες γενετικής ποικιλοµορφίας και ταξονοµικών /φυλλογενετικών αναλύσεων διαφορετικών φυτικών ειδών ή πληθυσµών συγκεκριµένων ειδών. Τέλος µπορούν να χρησιµοποιηθούν και σε µελέτες βιολογικών διεργασιών, όπως ο τρόπος αναπαραγωγής, ο διασκορπισµός της γύρης, ή των σπόρων κ.α. 38

39 Κεφάλαιο 8 ο ΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΦΥΤΩΝ Τα πρώτα διαγονιδιακά φυτά δηµιουργήθηκαν αρχές της δεκαετίας του 1990 και ήταν φυτά καπνού. Από τότε ένα πλήθος φυτών έχει µετασχηµατισθεί, όπως φυτά µεγάλης καλλιέργειας και τελευταία δενδρώδεις καλλιέργειες, µε σκοπό οι νέες καλλιέργειες να είναι ανθεκτικές σε διάφορες αβιοτικές, αλλά και βιοτικές καταπονήσεις, και πολλά άλλα χαρακτηριστικά. Πρώτα διαγονιδιακά φυτά ηµιουργία Bt καλαµποκιού Φυτά ανθεκτικά σε έντοµα και ζιζάνια διατίθενται στην αγορά Τοµάτα µε καθυστερηµένη ωρίµανση διατίθεται στην αγορά Εγκρίνεται διαγονιδιακό καλαµπόκι στην ΕΕ Εικόνα 8.1. Ορισµένες χρονολογίες ορόσηµα για την δηµιουργία και την καλλιέργεια διαγονιδιακών φυτών. Στην διάρκεια αυτών των χρόνων πολλές µέθοδοι µετασχηµατισµού των φυτών δοκιµάσθηκαν. ύο όµως από αυτές ξεχώρισαν σαν οι περισσότερο αποτελεσµατικές και αποτελούν σήµερα τις κύριες µεθόδους παραγωγής γενετικά τροποποιηµένων φυτών. Η µέθοδος του αγροβακτηρίου (Agrobacterium-mediated transformation) και η µέθοδος του εκτοξευτήρα µικροσωµατιδίων (microprojectile bombardment, particle gun technology). 39

40 Το αγροβακτήριο, Agrobacterium tumefaciens, είναι ένα παθογόνο εδάφους δικοτυλήδονων φυτών που προκαλεί τον "καρκίνο του λαιµού" (crown gall disease). Εικόνα 8.2. Όγκοι στο «λαιµό» φυτού που έχουν προκληθεί µετά από µόλυνση µε αγροβακτήριο. Η ογκογόνα δράση του αγροβακτηρίου, οφείλεται στο πλασµίδιο Ti (tumor- inducing plasmid) και συγκεκριµένα σε δύο οµάδες γονιδίων που εδράζονται σε αυτό. Η πρώτη οµάδα βρίσκεται σε µία περιοχή του Ti πλασµιδίου, που ονοµάζεται T-DNA, η οποία οριοθετείται από δύο παρόµοιες αλληλουχίες 24 νουκλεοτιδίων. Αυτές οι αλληλουχίες αποτελούν τα άκρα της T-DNA περιοχής. Η T-DNA περιοχή είναι αυτή που αποκόπτεται από το υπόλοιπο πλασµίδιο και ενσωµατώνεται σε τυχαία θέση του φυτικού χρωµοσώµατος, προκειµένου να αρχίσει ο σχηµατισµός όγκου στο φυτικό ιστό. Η T- DNA περιοχή αποτελείται από γονίδια που είναι υπεύθυνα για την βιοσύνθεση και τον µεταβολισµό συγκεκριµένων φυτορµονών που ονοµάζονται "οπίνες" (opines) και οι οποίες παράγονται σε µεγάλες ποσότητες µόνο στον καρκινικό ιστό. Εξαιτίας της υπερπαραγωγής αυτών των φυτορµονών τα µετασχηµατισµένα φυτικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται, αδιαφοροποίητα, χωρίς έλεγχο, σχηµατίζοντας µία άµορφη µάζα κυττάρων, τον καρκινικό όγκο. 40

41 Η δεύτερη οµάδα γονιδίων που σχετίζονται µε την ογκογόνο δράση του Ti πλασµιδίου, είναι τα vir γονίδια (virulence genes), που σχετίζονται µε τη παθογόνο ικανότητα του βακτηρίου και µια σειρά άλλων γονιδίων που αναγνωρίζουν τα συνοριακά άκρα της Τ- DNA περιοχής. LB T-DNA B A D C G E vir RB Ογκογονίδια σύνθεσης οπινών Ti Καταβολισµός οπινών ori Εικόνα 8.2. Ένα Ti πλασµίδιο, στο οποίο φαίνονται η περιοχή των vir γονιδίων, η περιοχή του καταβολισµού των οπινών, η T-DNA περιοχή και τα άκρα της, αριστερό (RB) και δεξιό (LB), και τέλος η περιοχή πολαπλασιασµού του πλασµιδίου (ori-origin of replication). Τα εργαστηριακά στελέχη αγροβακτηρίου που χρησιµοποιούνται για το γενετικό µετασχηµατισµό των φυτών είναι γενετικά "αφοπλισµένα", δεν προκαλούν δηλαδή ασθένεια, ενώ διατηρούν την ικανότητά τους να µεταφέρουν γονίδια στα φυτά. Το αφοπλισµένο Ti πλασµίδιο έχει λειτουργική και ακέραιη τη vir περιοχή, καθώς και τα 41

42 άκρα της T-DNA περιοχής. Από τη Τ-DNA περιοχή όµως έχουν αφαιρεθεί τα ογκογόνα γονίδια. Η τεχνητή µεταφορά του T-DNA στο φυτό, µπορεί να γίνει µε δύο τρόπους. Είτε χρησιµοποιώντας δυαδικούς φορείς (binary vectors), είτε χρησιµοποιώντας φορείς σύντηξης (cointegrative vectors). Η στρατηγική των δυαδικών φορέων βασίζεται στη παρατήρηση ότι η T-DNA περιοχή δεν χρειάζεται να αποτελεί µέρος του Ti πλασµιδίου προκειµένου να είναι λειτουργική. Έτσι η Τ-DNA περιοχή βρίσκεται σε ένα σχετικά µικρό πλασµίδιο, ενώ η µεταφορά και ενσωµάτωση αυτής της περιοχής γίνεται από γονίδια που υπάρχουν σε ένα άλλο πλασµίδιο (αφοπλισµένο Ti πλασµίδιο). Η στρατηγική των φορέων σύντηξης είναι παρόµοια, µόνο που βασίζεται στο γενετικό ανασυνδυασµό µεταξύ δύο πλασµιδίων. Τα δύο πλασµίδια έχουν οµόλογες αλληλουχίες, οι οποίες είναι υπεύθυνες για το γενετικό ανασυνδυασµό που συµβαίνει µεταξύ των δύο. Ο ένας εκ των δύο φορέων φέρει τη T-DNA περιοχή χωρίς τα άκρα της και χωρίς την ικανότητα να πολλαπλασιάζεται και ο άλλος είναι ένα αφοπλισµένο Ti πλασµίδιο που έχει όλα τα απαραίτητα στοιχεία για την µεταφορά της και την ενσωµάτωσή της στο φυτικό χρωµόσωµα. Με το γενετικό ανασυνδυασµό δηµιουργείται ένα πλασµίδιο που έχει την ικανότητα να µεταφέρει όσα γονίδια υπάρχουν κλωνοποιηµένα στη T-DNA, περιοχή προκειµένου να ενσωµατωθούν στο φυτικό χρωµόσωµα. Όταν τα διαγονίδια ενσωµατώνονται στα χρωµοσώµατα του φυτικού κυττάρου, τότε κληρονοµούνται σαν Μενδελιανοί χαρακτήρες στις επόµενες γενεές. Υπάρχουν όµως και περιπτώσεις, όπου τα γονίδια δεν ενσωµατώνονται στο φυτικό χρωµόσωµα, µε αποτέλεσµα να µην κληρονοµούνται και η έκφρασή τους να φθίνει µε το χρόνο. Στη πρώτη περίπτωση αναφερόµαστε σε σταθερό µετασχηµατισµό (stable transformation) των φυτικών κυττάρων, ενώ στη δεύτερη περίπτωση, σε παροδική έκφραση (transient expression) των διαγονιδίων. Η µέθοδος του αγροβακτηρίου είναι σχετικά απλή και απαιτεί εξοπλισµό για ιστοκαλλιέργεια φυτών. Κύριο µειονέκτηµα της µεθόδου είναι ότι το αγροβακτήριο, µερικές φορές, παραµείνει στους ιστούς του µετασχηµατισµένου φυτού για µεγάλο χρονικό διάστηµα, παρότι δεν υπάρχει στους απογόνους του. 42