ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ: Πρακτική Εργαστηριακή Προσέγγιση

Transcript

1 ΜΜ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ: Πρακτική Εργαστηριακή Προσέγγιση ΜΑΡΙΑΝΝΑ Α. ΝΤΑΛΑΜΑΓΚΑ, MD, MSc, MPH, PhD ΙΑΤΡΟΣ ΒΙΟΠΑΘΟΛΟΓΟΣ, FCAP ΕΠ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ ΠΑΝ/ΚΟ ΓΕΝΙΚΟ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟ «ΑΤΤΙΚΟΝ»

2 ΤΙ ΕΙΝΑΙ Η ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ; Principle Οι πρωτεϊνες μετακινούνται στο ηλεκτρικό πεδίο (Η/Φ ή ηλεκτρομεταφορά). Η σχετική ταχύτητά τους εξαρτάται από το φορτίο, το μέγεθος και το σχήμα της πρωτεϊνης, τη θερμοκρασία, τις ιδιότητες του μέσου και την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου. Η Η/Φ ΕΙΝΑΙ ΜΙΑ ΜΕΘΟΔΟΣ ΣΤΗΝ ΟΠΟΙΑ ΦΟΡΤΙΣΜΕΝΑ ΜΟΡΙΑ (ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ-ΝΟΥΚΛΕΪΚΑ ΟΞΕΑ) ΜΕΤΑΚΙΝΟΥΝΤΑΙ ΣΕ ΕΝΑ ΔΙΑΛΥΜΑ ΥΠΟ ΤΗΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΕΝΟΣ ΣΤΑΘΕΡΟΥ ΗΛΕΚΤΡΙΚΟΥ ΠΕΔΙΟΥ

3 ΑΜΙΝΟΞΕΑ-ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Οι πρωτεϊνες έχουν ιδιότητα αμφολύτη, δηλ. είναι + ή φορτισμένες ανάλογα με το ΡΗ του ρυθμιστικού διαλ/τος (buffer) στο οποίο βρίσκονται. Για κάθε πρωτεϊνη υπάρχει μια τιμή ΡΗ, στη οποία η πρωτεϊνη έχει ουδέτερο φορτίο και η οποία ονομάζεται ισοηλεκτρικό σημείο (pι).

4 Ισοηλεκτρικό Σημείο (pi) Σε συγκεκριμένο ph διαλύματος, η πρωτεϊνη έχει ουδέτερο φορτίο: αυτό είναι το ισοηλεκτρικό σημείο (pi). Πάνω από το pi (αλκαλικό ΡΗ), η πρωτεϊνη είναι αρνητικά φορτισμένη (ανιόν) και κινείται στην άνοδο (+). Κάτω από το pi (όξινο ΡΗ), η πρωτεϊνη είναι θετικά φορτισμένη (κατιόν) και κινείται προς την κάθοδο (-).

5

6 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Απλή, γρήγορη και πολύ ευαίσθητη τεχνική διαχωρισμού των πρωτεϊνών

7 ΕΙΔΗ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ΚΙΝΟΥΜΕΝΟΥ ΟΡΙΟΥ TISELIUS, 1937 H/Φ ΖΩΝΗΣ

8 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΖΩΝΗΣ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΡΙΧΟΕΙΔΩΝ-Capillary zone electrophoresis

9 Η ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ 1. Συσκευή Ηλεκτροφόρησης (πηγή ρεύματος, λεκάνη με 2 δεξαμενές, ταινία Η/Φ) 2. Ρυθμιστικά διαλύματα (δ/τα βαρβιτουρικών με ΡΗ 8,8): μεταφορά ηλεκτρικού ρεύματος και διατήρηση σταθερού ΡΗ 3. Υποστηρικτικά μέσα (ταινίες οξεικής κυτταρίνης, αγαρόζη, πήκτωμα ακρυλαμιδίου) 4. Χρωστικές: μετά το πέρας της Η/Φ γίνονται ορατές οι ζώνες χάρη στα σύμπλοκα χρωστικών και πρωτεϊνών (χρώση Ponceau, Amido Black, Coomassie Brilliant Blue, χρώση αργύρουχρυσού)

10 From large to small and simple ΣΥΣΚΕΥΕΣ Η/Φ: από τις πιο σύνθετες στις πιο απλές

11 ΣΥΣΚΕΥΗ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ

12 Στις περισσότερες μονάδες Η/Φ, το gel βρίσκεται μεταξύ 2 θέσεων buffer όπου υπάρχουν ξεχωριστά ηλεκτρόδια έτσι ώστε η μόνη ηλεκτρική σύνδεση τους γίνεται μέσω του gel.

13 Aγαρόζη και Πολυακρυλαμίδιο Επειδή οι πόροι του gel αγαρόζης είναι μεγάλοι, η αγαρόζη χρησιμοποιείται στο διαχωρισμό μακρομορίων όπως νουκλεϊκά οξέα, μεγάλες πρωτεϊνες και σύμπλοκα Το πολυακρυλαμίδιο, gel με μικρότερους πόρους, χρησιμοποιείται στο διαχωρισμό πρωτεϊνών και μικρών ολιγονουκλεοτιδίων. Και τα δύο gel είναι ηλεκτρικά ουδέτερα

14 Gels αγαρόζης Η αγαρόζη είναι ένας ουδέτερος πολυσακχαρίτης που παράγεται από άγαρ Εύκολη στη χρήση Χαμηλό κόστος Εμπορική διαθεσιμότητα Χαμηλή συγγένεια με πρωτεϊνη (δεν επηρεάζει την κινητικότητά τους) Ελεύθερη από ιονισμένες ομάδες

15 Χρωστική Coomassie Blue

16 Χρωστική αργύρου Η χρωστική αργύρου είναι συνήθως φορές ευαίσθητη από την Coomassie Blue αλλά πιο δύσχρηστη. Οι πολύ λεπτές γραμμές περιέχουν μόνο 0.5 ng πρωτεϊνης!!!

17 Χρωστική αργύρου

18 ΧΡΩΣΗ PONCEAU

19 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΖΩΝΗΣ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΡΙΧΟΕΙΔΩΝ-Capillary zone electrophoresis (1) Παραγωγή ηλεκτρο-ωσμωτικής ροής προς την κάθοδο

20 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΖΩΝΗΣ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΡΙΧΟΕΙΔΩΝ-Capillary zone electrophoresis (2)

21 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΖΩΝΗΣ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΡΙΧΟΕΙΔΩΝ (2)

22 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΖΩΝΗΣ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΡΙΧΟΕΙΔΩΝ (3) Η/Φ σε μικρά τριχοειδή τα οποία γεμίζουν μόνο με buffer Κάθε τριχοειδές έχει μm διάμετρο Εφαρμογή υψηλής τάσης (9000 V) με μεγάλη διακριτική ικανότητα. Διαχωρισμός πρωτεϊνών με βάση το φορτίο και το μέγεθος Εγχυση μικρών όγκων από το εξεταστέο δείγμα Ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων Μικρό κόστος

23 ΩΣ ΓΕΝΙΚΟΣ ΚΑΝΟΝΑΣ, ΌΤΑΝ ΟΙ ΟΛΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΤΟΥ ΟΡΟΥ ΕΊΝΑΙ 8.5 g/dl ή 6 g/dl Η ΕΞΕΤΑΣΗ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΣΥΜΠΛΗΡΩΝΕΤΑΙ ΜΕ Η/Φ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΟΡΟΥ

24

25 ΠΡΟΫΠΟΘΕΣΕΙΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ 1. ΟΡΟΣ ΚΑΙ ΟΧΙ ΠΛΑΣΜΑ ΤΟ ΟΠΟΙΟ ΠΕΡΙΕΧΕΙ ΙΝΩΔΟΓΟΝΟ (β2 και γ περιοχή) 2. ΟΡΟΣ ΌΧΙ ΛΙΠΑΙΜΙΚΟΣ Ή ΑΙΜΟΛΥΜΕΝΟΣ 3. ΜΙΚΡΗ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48 ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ ΚΛΑΣΜΑΤΩΝ (5-6) ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ Με την εφαρμογή υψηλής τάσης και τροποποίηση του buffer γίνονται εμφανή 15 κλάσματα: Η/Φ υψηλής διακριτικής ικανότητας

49 Φωτομέτρηση σάρωσης (scanning densitometer) για τον προσδιορισμό της % αναλογίας των κλασμάτων

50 ΚΥΡΙΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΤΟΥ ΟΡΟΥ ΠΟΥ ΓΙΝΟΝΤΑΙ ΕΜΦΑΝΕΙΣ ΜΕ ΤΗΝ Η/Φ

51 ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΟ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ

52 TI EINAI Η ΜΟΝΟΚΛΩΝΙΚΗ ΠΑΡΑΠΡΩΤΕΪΝΗ; Παραγωγή μιας ανοσολογικά ομοιογενούς πρωτεϊνης από τον πολλαπλασιασμό ενός κλώνου πλασματοκυττάρων. Διακριτή ζώνη στην ταινία Η/Φ Οξυκόρυφο έπαρμα (peak) με στενή βάση (α2-γ περιοχή)

53

54 Περαιτέρω διερεύνηση με ανοσοκαθήλωση και ποσοτικό προσδιορισμό ανοσοσφαιρινών με νεφελομετρία

55 ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΜΕ ΑΝΟΣΟΚΑΘΗΛΩΣΗ IgG κ μονοκλωνική παραπρωτεϊνη

56

57 ARTEFACTS ΕΚΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΑ ΩΣ ΜΟΝΟΚΛΩΝΙΚΗ ΠΑΡΑΠΡΩΤΕΪΝΗ α2 περιοχή: οξεία φλεγμονώδης αντίδραση ( απτοσφαρίνης-συνυπάρχει όμως με α1 σφαιρίνών) β περιοχή: 1) αιμολυμένος ορός (ελεύθερη αιμσφαιρίνη σχηματίζει σύμπλεγμα και με την α2 περιοχήαπτοσφαιρίνη) 2) αναιμία τρανσφερίνης 3) χολόσταση και αύξηση C3 και 3) υπερλιπιδαιμία με αύξηση της apo- B γ-περιοχή: ινωδογόνου (για πχ λόγω καθυστέρησης πήξης σε πλαστικά σωληνάρια)

58 Περίπτωση σιδηροπενικής αναιμίας ( τρανσφερίνης )

59 ΙΝΩΔΟΓΟΝΟ ΠΟΥ ΕΜΦΑΝΙΖΕΤΑΙ ΩΣ ΜΟΝΟΚΛΩΝΙΚΗ ΠΑΡΑΠΡΩΤΕΪΝΗ

60 Παθήσεις που συνδυάζονται με μονοκλωνική παραπρωτεϊνη Ιδιοπαθή μονοκλωνική γαμμοπάθεια (MGUS) Πολλαπλούν μυέλωμα (ΠΜ) Λεμφοπλασματοκυτταροειδές λέμφωμα (Νόσος του Waldenström) AL αμυλοείδωση Αυτοάνοσα νοσήματα

61 Ιδιοπαθής μονοκλωνική γαμμοπάθεια (MGUS) Συχνότητα >50y: 3.2% >70y:5.3% >85y:7.5%

62 ΠΟΛΛΑΠΛΟΥΝ ΜΥΕΛΩΜΑ Definition: Ογκος monoclonal protein Αποτελέσματα plus CRAB Κακοήθεια των πλασματοκυττάρων και διήθηση του μυελού των οστών με παραγωγή μονοκλωνικής παραπρωτεϊνης C: υπερασβεστιαμία και λυτικές βλάβες των οστών R: Νεφρική ανεπάρκεια A: αναιμία B: βλάβες οστών

63 Η επίπτωση του Π. Μυελώματος αυξάνει με την ηλικία

64 Plasma Cells The bone marrow aspirate in multiple myeloma

65 Plasma cell Rouleaux The peripheral blood film in advanced myeloma

66 Multiple punched-out lytic lesions in the skull in myeloma

67 Wedge compression fracture of a thoracic vertebra

68 ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ ΣΤΗΝ ΑΛΒΟΥΜΙΝΗ

69 ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ ΣΤΟ ΝΕΦΡΩΣΙΚΟ ΣΥΝΔΡΟΜΟ

70 ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ ΣΤΗΝ ΚΙΡΡΩΣΗ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣ

71 ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ ΣΕ ΧΡΟΝΙΕΣ ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΕΙΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΕΙΣ

72 ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ ΣΕ ΟΞΕΙΕΣ ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΕΙΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΕΙΣ Πτώση αλβουμίνης α1 σφαιρινών α2 σφαιρινών τρανσφερρίνης C3, CRP

73 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΤΟ ΕΝΥ

74 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΤΑ ΟΥΡΑ

75 ΛΕΥΚΩΜΑ BENCE-JONES Μονοκλωνική παραπρωτεϊνη (κ ή λ) kd σε ΜΒ, εμφανιζόμενη στα ούρα, η οποία παράγεται από πλασματοκύτταρα. Πήζει και προκαλεί θολερότητα στους C η οποία εξαφανίζεται στο βρασμό.

76

77 ΔΙΣΔΙΑΣΤΑΤΗ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ: ισοηλεκτρική εστίαση και ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS-πολυακρυλαμίδης

78 Η ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ MALDI-TOF ΣΤΟΝ ΚΑΘΟΡΙΣΜΟ ΤΟΥ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΟΥ PROFIL

79 ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ!