Φαηλνηππηθόο θαη Γνλνηππηθόο Υαξαθηεξηζκόο Δληεξνθόθθσλ ζε Κιηληθά θαη Πεξηβαιινληηθά Γείγκαηα

Transcript

1 Παλεπηζηήκην Παηξώλ ρνιή Δπηζηεκώλ Τγείαο Σκήκα Ηαηξηθήο Μεηαπηπρηαθό Πξόγξακκα πνπδώλ Βαζηθέο Ηαηξηθέο Δπηζηήκεο Καηεύζπλζε Μνξηαθήο Γελεηηθήο-Κπηηαξνγελεηηθήο Φαηλνηππηθόο θαη Γνλνηππηθόο Υαξαθηεξηζκόο Δληεξνθόθθσλ ζε Κιηληθά θαη Πεξηβαιινληηθά Γείγκαηα Πάηξα, 2011 Γηπισκαηηθή Δξγαζία Φηιηππίδνπ εβαζηή, Μνξηαθή Βηνιόγνο Δπηβιέπσλ Καζεγεηήο: Βαληαξάθεο Απόζηνινο, Δπ. Καζεγεηήο Τγηεηλήο

2 Σηον Γηαννάθε, γηα ηεν αγάπε ηοσ θαη ηεν βοήζεηά ηοσ. 2

3 Μέιε Τξηκεινύο Δμεηαζηηθήο Δπηηξνπήο Βαληαξάθεο Απόζηνινο, Δπηβιέπσλ Καζεγεηήο Δπίθνπξνο Καζεγεηήο, Δξγαζηήξην Τγηεηλήο, Ηαηξηθό Σκήκα, Παλεπηζηήκην Παηξώλ πειηνπνύινπ Ίξηο, Μέινο Σξηκεινύο Δπηηξνπήο, Καζεγήηξηα, Δξγαζηήξην Μηθξνβηνινγίαο, Ηαηξηθό Σκήκα, Παλεπηζηήκην Παηξώλ Κνινλίηζηνπ Φεβξoλία, Μέινο Σξηκεινύο Δπηηξνπήο, Δπίθνπξνο Καζεγήηξηα, Δξγαζηήξην Μηθξνβηνινγίαο, Ηαηξηθό Σκήκα, Παλεπηζηήκην Παηξώλ 3

4 Πξόινγνο Οη εληεξόθνθθνη απνηεινύλ ζνβαξό αίηην λνζνθνκεηαθώλ ινηκώμεσλ θαη ππεξινηκώμεσλ. Ζ ηθαλόηεηα πξνζαξκνγήο ηνπ βαθηεξίνπ ζε δπζκελείο ζπλζήθεο θαζώο θαη ε ηθαλόηεηά ηνπ λα απνθηά θαη λα δηαζπείξεη αληίζηαζε ζε αληηβηνηηθά απνηεινύλ ζήκεξα γλσζηέο θαη πνιπκειεηεκέλεο ηδηόηεηέο ηνπ. Απνηεινύλ, κε άιια ιόγηα ζνβαξό θίλδπλν γηα ηελ Γεκόζηα Τγεία. Λίγα όκσο είλαη γλσζηά γηα ηελ νηθνινγία ηνπ, ηε δηαζπνξά ηνπ ζην πεξηβάιινλ, ελώ ζηε ρώξα καο ιίγα δεδνκέλα ππάξρνπλ γηα ηελ επηδεκηνινγηθή ηνπο επηηήξεζε. Ζ παξνύζα δηπισκαηηθή εξγαζία έρεη ζαλ ζηόρν λα κειεηήζεη ηα θαηλνηππηθά θαη γνλνηππηθά ραξαθηεξηζηηθά ησλ πεξηβαιινληηθώλ εληεξνθόθθσλ θαη λα επηρεηξήζεη κηα ζπζρέηηζε κε θιηληθνύο εληεξόθνθθνπο, πξνζπαζώληαο έηζη λα ζπκβάιιεη ζην εγρείξεκα ηεο δηαζθάιηζεο ηεο Γεκόζηαο Τγείαο. Γηα ηελ παξνύζα εξγαζία ζα ήζεια ηδηαηηέξσο λα επραξηζηήζσ ηνλ επηβιέπνληα θαζεγεηή κνπ, θ. Βαληαξάθε Απόζηνιν, πνπ γηα κηα αθόκε θνξά ππνζηεξίδεη ηα επηζηεκνληθά κνπ βήκαηα. Ζ ελζάξξπλζε θαη ε επηζηεκνληθή ηνπ θαζνδήγεζε θάλνπλ πάληα πην εύθνιν ηνλ δύζθνιν δξόκν ηεο έξεπλαο. Θα ήηαλ κεγάιε κνπ ακέιεηα, εάλ δελ επραξηζηνύζα ηνπο ζπλαδέιθνπο ζηε Μνλάδα Πεξηβαιινληηθήο Μηθξνβηνινγίαο ηνπ εξγαζηεξίνπ Τγηεηλήο, ηνλ θ. Κόθθηλν Πέηξν, Μνξηαθό Βηνιόγν, κεηαδηδαθηνξηθό εξεπλεηή, γηα ηηο πνιύηηκεο ζπκβνπιέο ηνπ θαη γηα ηελ πξνζσπηθή ηνπ ζπκβνιή ηόζν ζε ζρέζε κε ηελ παξνύζα κειέηε όζν θαη ζε κειινληηθά ζρέδηα, ηηο θ.θ. Φξάγθνπ Καηεξίλα, Υεκηθό, θαη καΐιε Μαίξε, Βηνιόγν, γηα ηελ άςνγε ζπλεξγαζία αιιά θαη ην ζύλνιν ησλ ππόινηπσλ κειώλ ηνπ εξγαζηεξίνπ. Δπηπιένλ, ζα ήζεια λα εθθξάζσ ηηο βαζηέο κνπ επραξηζηίεο πξνο ηελ θαζεγήηξηα Μηθξνβηνινγίαο θ. πειηνπνύινπ Ίξηδα γηα ηελ ζπλερή παξαθνινύζεζε απηήο ηεο κειέηεο θαη ηηο πνιύηηκεο ζπκβνπιέο ηεο, γηα ηελ θηινμελία ζην Δξγαζηήξην Μηθξνβηνινγίαο θαη γηα ηελ επηζηεκνληθή ππνζηήξημε ζην πεηξακαηηθό κέξνο ηεο κειέηεο. ην εξγαζηήξην ηεο Μηθξνβηνινγίαο, εμέρνπζαο ζεκαζίαο ήηαλ ε ζπκπαξάζηαζε θαη ε 4

5 εθπαίδεπζε από ηηο ζπλαδέιθνπο θ.θ. Διεάλλα Γξνύγθα θαη Αληηγόλε Φσθά, Βηνιόγνπο, ηηο νπνίεο θαη επραξηζηώ ζεξκά. Δπραξηζηώ πνιύ ηελ επίθνπξν θαζεγήηξηα Μηθξνβηνινγίαο θ. Κνινλίηζηνπ Φεβξνλία γηα ηηο ρξήζηκεο ππνδείμεηο ηεο θαη ηελ πνιύηηκε βνήζεηά ηεο θαζώο θαη ηελ επηζηεκνληθή ηεο παξαθνινύζεζε θαηά ηα πξώηα πεηξακαηηθά κνπ δεδνκέλα. Σέινο, ζα ήζεια λα επραξηζηήζσ ηελ πνιύ θαιή θίιε θαη ζπλάδειθν Άλλα Βνύιγαξε-Κόθνηα γηα ηελ επγεληθή ζπλεηζθνξά ηεο ζηελ ηειηθή επηκέιεηα ηνπ θεηκέλνπ ηεο παξνύζαο κειέηεο. 5

6 Πεξηερόκελα ειίδα Μέιε Σξηκεινύο Δμεηαζηηθήο Δπηηξνπήο 3 Πξόινγνο 4 Γεληθό Μέξνο 9 Δηζαγσγή 10 Α. Ηζηνξηθή Αλαδξνκή 10 Β. Σαμηλόκεζε ησλ Δληεξνθόθθσλ 11 Γ. Μνξθνινγία θαη Υαξαθηεξηζηηθά 15 Γ. Γελεηηθή ησλ Δληεξνθόθθσλ 17 Δ. Παζνγέλεηα ησλ εληεξνθόθθσλ 19 Σ. Οηθνινγία ησλ εληεξνθόθθσλ 19 Σ.1. Γηαζπνξά θαη Μεηάδνζε ησλ Δληεξνθόθθσλ 20 Σ.2. Δληεξόθνθθνη ζην λεξό 22 Σ.3. Δληεξόθνθθνη ζηα ηξόθηκα 25 Σ.4. Δληεξόθνθθνη ζην ρώκα 27 Ε. Δπηδεκηνινγία λνζνθνκεηαθώλ ινηκώμεσλ θαη πξσηόθνιια δηαρείξηζεο 27 Ζ Πεξηβαιινληηθή επηδεκηνινγία εληεξνθόθθσλ. 31 Θ. Αλζεθηηθόηεηα ζηα Αληηβηνηηθά 33 Θ.1. Δγγελήο Αλζεθηηθόηεηα 35 6

7 Θ.1.1 Β-ιαθηακηθά αληηβηνηηθά 35 Θ.1.2. Ακηλνγιπθνζίδεο 36 Θ.1.3. Φζνξνθηλνιόλεο 36 Θ.1.4. Ληλθνζακίδεο 36 Θ.1.5. ηξεπηνγξακκίλεο 36 Θ.1.6. Σξηκεζνπξίκε-ζνπιθνκεζνμαδόιε 37 Θ.2. Δπίθηεηε Αλζεθηηθόηεηα 37 Θ.2.1. Β-ιαθηακηθά αληηβηνηηθά 37 Θ.2.2. Ακηλνγιπθνζίδεο 37 Θ.2.3. Γιπθνπεπηίδηα 38 Η. Μέζνδνη Αλίρλεπζεο Δληεξόθνθθσλ ζην Πεξηβάιινλ 39 Η.1. Καιιηεξγεηηθέο Σερληθέο 40 Η.2 Φαηλνηππηθέο Σερληθέο 41 Η.2.1. Φαηλόηππνο Αληηβηνγξάκκαηνο 41 Η.2.2. Βηνρεκηθόο Φαηλόηππνο Vitek 43 Η.3 Γνλνηππηθέο Σερληθέο 46 Η.3.1 Ζιεθηξνθόξεζε ζε Παιιόκελν Ζιεθηξηθό Πεδίν 46 θνπόο 49 Δηδηθό κέξνο 50 Τιηθά θαη Μέζνδνη 51 Α. Τιηθά 51 7

8 Β. Μέζνδνη 57 Β.1. Παξαζθεπή Θξεπηηθώλ Τιηθώλ 57 Β.2. Γηήζεζε 58 Β.3. Καιιηέξγεηεο 59 Β.4. Αληηβηόγξακκα 60 Β.5. Vitek 60 Β.6. Παξαζθεπή DNA Agarose Disks 60 Β.7. Πέςε κε πεξηνξηζηηθό έλδπκν θαη Pulse-Field Gel Electrophoresis 62 Β.8. Σππνπνίεζε ζηειερώλ-θαζνξηζκόο θιώλσλ 63 Απνηειέζκαηα 65 Α. πλνπηηθή Παξνπζίαζε Απνηειεζκάησλ 65 Β. Αλαιπηηθνί Πίλαθεο Απνηειεζκάησλ 66 Γ. Γελδξνγξάκκαηα PFGE 88 πδήηεζε 95 πκπεξάζκαηα 105 Πεξίιεςε 64 Summary 65 Βηβιηνγξαθία 66 8

9 Γεληθό Μέξνο 9

10 Δηζαγσγή Α. Ηζηνξηθή Αλαδξνκή ηα ηέιε ηνπ 19νπ αηώλα, πεξηγξάθεθε από ηνλ Thiercelin (1899) ζηέιερνο κηθξόθνθθνπ σο «ζηξεπηόθνθθνο εληεξηθήο πξνέιεπζεο», ην νπνίν νλνκάζηεθε εληεξόθνθθνο, αθξηβώο γηα λα δεηρζεί ε εληεξηθή ηνπ πξνέιεπζε [Thiercelin, 1899]. Οη εληεξόθνθθνη ηαμηλνκήζεθαλ ην 1933, από ηελ Lancefield, σο ζηξεπηόθνθθνη D, επεηδή εθθξάδνπλ ην αληηγόλν ηύπνπ D ζηελ επηθάλεηα ηνπ θπηηαξηθνύ ηνπο ηνηρώκαηνο θαη ζπγθνιιώληαη κε ηνλ αληίζηνηρν αληηνξό, ελώ άιινη ζηξεπηόθνθθνη θέξνπλ αληηγόλα όπσο Α, Β, C, E, θιπ [Lancefield, 1933]. To 1937 o Sherman θαηέηαμε ηνπο ζηξεπηόθνθθνπο ζηηο αθόινπζεο ηέζζεξηο νκάδεο: ζηξεπηόθνθθνη εληεξηθήο πξνέιεπζεο (εληεξόθνθθνη), ζηξεπηόθνθθνη γαιαθηνθνκηθώλ πξντόλησλ (ιαθηόθνθθνη), ππνγελείο ζηξεπηόθνθθνη θαη ζηξεπηόθνθθνη κνιπζκαηηθήο νκάδαο [Sherman, 1937]. Δηθόλα 1. Γελδξόγξακκα κε βάζε ηηο δηαθνξέο ηνπ 16S rrna θαη θπινγελεηηθή απόζηαζε ησλ εληεξνθόθθσλ από ηα άιια γέλε Gram ζεηηθώλ βαθηεξίσλ [Klein, 2003] 10

11 Σν 1985, νη Ludwig θαη νη ζπλεξγάηεο ηνπ, έδεημαλ όηη νη εληεξόθνθθνη, νη ιαθηόθνθθνη θαη νη ππόινηπνη ζηξεπηόθνθθνη, δηαθέξνπλ ζεκαληηθά σο πξνο ηελ αιιεινπρία ηνπ 16S rrna [Ludwig et al, 1985]. Με ηελ αλάπηπμε κνξηαθώλ ηερληθώλ θαη θπξίσο ηελ αλάιπζε ηνπ 16S rrna, δηαπηζηώζεθε πσο ηειηθώο, νη εληεξόθνθθνη παξνπζηάδνπλ κηθξή νκνηόηεηα κε ηνπο ππόινηπνπο ζηξεπηόθνθθνπο θαη ηαμηλνκνύληαη πιένλ σο μερσξηζηό γέλνο, απηό ησλ εληεξνθόθθσλ. Όπσο παξνπζηάδεηαη θαη ζηελ εηθόλα 1, νη εληεξόθνθθνη απέρνπλ θπινγελεηηθά από ηνπο ππόινηπνπο ζηξεπηόθνθθνπο θαη από ηα άιια γέλε Gram ζεηηθώλ βαθηεξίσλ. Β. Ταμηλόκεζε ησλ Δληεξνθόθθσλ Σν γέλνο ησλ εληεξνθόθθσλ αλήθεη ζηελ νηθνγέλεηα Enterococcaceae θαη θέξεη πεξηζζόηεξα από 28 είδε, κε πην γλσζηά ηνλ E. faecalis, E. faecium, E. durans, E. hirae, E. villorum, E. casseliflavus θαη E. mundtii [Winn et al, 2005]. ηνλ πίλαθα 1 παξνπζηάδνληαη ηα είδε πνπ έρνπλ πεξηγξαθεί σο ζήκεξα, θαηά ηνλ Konnenman [Winn et al, 2005]. O Konnenman δηαθξίλεη 5 νκάδεο βαζηδόκελνο ζε γελεηηθά ραξαθηεξηζηηθά ησλ εληεξνθόθθσλ (Πίλαθαο 1). Πίλαθαο 1. Δίδε Δληεξόθνθθσλ θαηά Konnenman. Α/Α Δίδνο Οηθνινγία Οκάδα 1 1 E.avium Πηελά, θύινο, Άλζξσπνο 2 E.gilvus Άλζξσπνο (2002) 3 E. malodoratus Γαιαθηνθνκηθά πξντόληα 11

12 4 E. pallens Άλζξσπνο 5 E. pseudoavium Βννεηδή 6 E. raffinosus Άλζξσπνο 7 E. saccharolyticus Αγειάδεο 8 Enterococcus sp CDC PNS-E-3 Άλζξσπνο Οκάδα 2 9 E. faecalis Άλζξσπνο, Πνπιεξηθά, Βννεηδή, Υνίξνη, Άινγα, Πξόβαηα, Καηζίθηα 10 E. faecium Άλζξσπνο, δηάθνξα δώα 11 E. casseliflavus Φπηά, ρώκα, ζπαλίσο ζε θόπξαλα πνπιεξηθώλ. 12 E. gallinarum Κόπξαλα πνπιεξηθώλ, Άλζξσπνο 13 E. mundtii Φπηά, Υώκα, Βννεηδή, Υνίξνη, Άινγα, Άλζξσπνο 14 E. haemoperoxidus Δπηθαλεηαθά ύδαηα, θνιπκβεηηθέο δεμακελέο, πόζηκν λεξό 15 Enterococcus sp CDC PNS-E-2 Άλζξσπνο Οκάδα 3 16 E. dispar Άλζξσπνο 17 E. durans Γαιαθηνθνκηθά πξντόληα, Άλζξσπνο 18 E. hirae Πνπιεξηθά, Βννεηδή, Υνίξνη, θύινη, 12

13 Άινγα, Πξόβαηα, Καηζίθηα, Κνπλέιηα, Άλζξσπνο 19 E. ratti Αξνπξαίνη 20 E. villorum θύινη, Υνίξνη (Ε. porcinus) Οκάδα 4 21 E. asini Γάηδαξνη 22 E. cecorum Πνπιεξηθά, Άλζξσπνο 23 E. sulfurous Φπηά 24 E. phoeniculicola Σζαιαπεηεηλόο 25 Enterococcus sp CDC PNS-E-1 Άλζξσπνο Οκάδα 5 26 E. columbae Πεξηζηέξηα 27 E. canis θύινο 28 E. moraviensis Δπηθαλεηαθό θαη πόζηκν λεξό Σα είδε απηά ηαμηλνκνύληαη από νξηζκέλνπο εξεπλεηέο ζε νκάδεο, κε βάζε ηελ αλάιπζε γνληδηαθήο νκνηόηεηαο ηνπ 16S rrna. Καηά ηνλ Klein, (Πίλαθαο 2), ζρεκαηίδνληαη νη νκάδεο faecalis, faecium, avium, casseliflavus, cecorum, dispars θαη saccharolyticus [Klein, 2003], ελώ θαηά ηνλ Williams, (Πίλαθαο 3), δηαρσξίδνληαη νη νκάδεο faecium, avium, gallinarum, cecorum θαη νκάδα ινηπώλ εηδώλ [Williams et al., 1991]. 13

14 Πίλαθαο 2. Οκαδνπνίεζε θαηά Klein Faecalis Faecium Avium Casseliflavus E.faecalis E. faecium E. avium E. casseliflavus, E.haemoperoxidus E. durans E. pseudoavium E. gallinarum E moraviensis E. hirae E. malodoratus E. flavescens E. mundii E. raffinosus E. porcinus E. villorum Cecorum Dispars Saccharolyticus Με νκαδνπνηεκέλα E. cecorum E. dispar E.saccharolyticus E. gilvus E. columbae E. asini E. sulfureus E. pallens E. Ratti 14

15 Πίλαθαο 3. Οκαδνπνίεζε θαηά Williams Faecium Avium Gallinarum Cecorum Με νκαδνπνηεκέλα E. faecium E. avium E. gallinarum E. cecorum E. faecalis E. mundii E. malodoratus E. casseliflavus E. columbae E. dispar E. durans E. raffinosus E. sulfureus E. hirae E. pseudoavium E. solitarius E. saccharolyticus E. flavescens Γ. Μνξθνινγία θαη Φαξαθηεξηζηηθά Οη Δληεξόθνθθνη είλαη Gram-ζεηηθά βαθηήξηα, δελ δίλνπλ ζεηηθή αληίδξαζε θαηαιάζεο, πδξνιύνπλ ηελ εζθνπιίλε ζε ζξεπηηθό πιηθό ρνιήο (bile-aesculin agar) θαη δίδνπλ ζεηηθή ηελ αληίδξαζε ηεο πδξόιπζεο ηεο L- ππξνιηδνλπι-2-λαθζπιακίδεο. 15

16 Δηθόλα 2. Αξλεηηθή αληίδξαζε Καηαιάζεο ζηνπο εληεξόθνθθνπο. Πεγή: Μνλάδα Πεξηβαιινληηθήο Μηθξνβηνινγίαο, Δξγαζηήξην Τγηεηλήο Π.Παηξώλ Δηθόλα 3. Τδξόιπζε ηεο Δζθνπιίλεο ζε ζξεπηηθό πιηθό 40% ρνιήο. Πεγή: Μνλάδα Πεξηβαιινληηθήο Μηθξνβηνινγίαο, Δξγαζηήξην Τγηεηλήο Π.Παηξώλ. πλήζσο, είλαη δπλεηηθά αλαεξόβηα θαη κπνξνύλ λα αλαπηπρζνύλ ζε 6.5% NaCl, ζηνπο 10 C θαη ζηνπο 45 C [Manero & Blanch, 1999]. Δπηπιένλ, κπνξνύλ λα επηβηώζνπλ ζε ζρεηηθά κεγάιν εύξνο ηηκώλ ph, ην νπνίν θπκαίλεηαη από 4,6 έσο 9,9, κε βέιηηζηε ηηκή εθείλε ηνπ 7,5. Δίλαη ζθαηξηθνί ή σνεηδείο (ελίνηε ινγρνεηδείο) κνλνθύηηαξνη νξγαληζκνί, κε δηάκεηξν από 0,2 έσο 2,5 κm, ελώ ζπρλά εκθαλίδνληαη σο δηπιόθνθθνη ή ζπαληόηεξα δεκηνπξγνύλ αιπζίδεο. Γελ δηαζέηνπλ έιπηξν θαη βιεθαξίδεο [Fisher & Phillips, 2009; Jett et al., 1994]. Σν αληηγόλν D πνπ θέξνπλ νη πεξηζζόηεξνη εληεξόθνθθνη ζην θπηηαξηθό ηνπο ηνίρσκα, δελ είλαη πνιπζαθραξίηεο αιιά ηεηρντθό νμύ. 16

17 Γ. Γελεηηθή ησλ Δληεξνθόθθσλ ύκθσλα κε ηηο κέρξη ζήκεξα θαηαρσξεκέλεο λνπθιενηηδηθέο αιιεινπρίεο ζηειερώλ εληεξνθόθθσλ ζηηο δηεζλείο βάζεηο δεδνκέλσλ, ην γελεηηθό ηνπο πιηθό απνηειείηαη από θπθιηθό DNA κεγέζνπο 2,7-3,3 Μbp, ελώ δηαζέηνπλ ηξεηο βαζηθνύο κεραληζκνύο αληαιιαγήο γελεηηθνύ πιηθνύ, πιαζκίδηα, ηξαλζπνδόληα θαη αιιεινπρίεο έλζεζεο. Σν γελεηηθό απηό πιηθό πεξηέρεη γνλίδηα πνπ θσδηθνπνηνύλ ραξαθηεξηζηηθά ζρεηηθά κε ηελ αληηγξαθή θαη ηε κεηαθνξά ηνπ πιαζκηδίνπ, ηελ αλζεθηηθόηεηα ζε αληηβηνηηθά θαη ην κεηαβνιηζκό πνηθίισλ ππνζηξσκάησλ. Δπηπιένλ, πεξηιακβάλεη γνλίδηα ηα νπνία θσδηθνπνηνύλ κνιπζκαηηθνύο παξάγνληεο θαη γνλίδηα αληνρήο ζε αληηβηνηηθά [Jett et al., 1994]. Οη παξάγνληεο απηνί πνπ θαζνξίδνπλ ηελ παζνγνληθόηεηα ησλ εληεξνθόθθσλ, νπζηαζηηθά εμππεξεηνύλ ηελ αλάγθε επηβίσζεο ηνπ κηθξννξγαληζκνύ: Από ηε ζηηγκή πνπ πξνζβάιιεη ηνλ μεληζηή ηνπ, ν εληεξόθνθθνο ζα πξέπεη λα πξνζαξκνζηεί ζε έλα λέν θαη αθηιόμελν γηα απηόλ πεξηβάιινλ, όπνπ ππάξρεη πεξηνξηζκέλε πεγή ηξνθήο θαη δηαθνξεηηθό ph, ελώ ζα πξέπεη λα αληηκεησπίζεη θαη ηελ άκπλα ηνπ μεληζηή. Γηα λα θαηαθέξεη λα επηβηώζεη εθθξάδεη πξσηεΐλεο νη νπνίεο ηνπ επηηξέπνπλ λα πξνζδέλεηαη ζηα θύηηαξα ηνπ μεληζηή θαη ζηελ εμσθπηηάξηα νπζία, λα δηεηζδύεη ζηνπο ηζηνύο, λα δηαθεύγεη ηνπ αλνζνπνηεηηθνύ ζπζηήκαηνο θαη λα πξνθαιεί βιάβε ζηνλ μεληζηή κέζσ ηνμηλώλ πνπ εθθξίλεη [Johnson et al., 1994]. Ζ θπηηαξνιπζίλε είλαη ε πξώηε θαη ε πην θαιά κειεηεκέλε πξσηεΐλε ησλ εληεξνθόθθσλ σο κνιπζκαηηθόο παξάγνληαο. Πξσηνπεξηγξάθεθε από ηνλ Todd ην 1934 [Todd, 1934] θαη έγηλε γλσζηή σο αηκνιπζίλε, γηα ηελ ραξαθηεξηζηηθή αηκόιπζε πνπ πξνθαιεί ν εληεξόθνθθνο όηαλ θαιιηεξγεζεί ζε αηκαηνύρν άγαξ. ήκεξα, ραξαθηεξίδεηαη σο θπηηαξνιπζίλε θαζώο κπνξεί λα πξνθαιέζεη ιύζε πνιιώλ θπηηαξηθώλ ηύπσλ θαη όρη κόλν ησλ εξπζξνθπηηάξσλ. Γηα ηελ πιήξε δξάζε ηεο θπηηαξνιπζίλεο είλαη απαξαίηεηα ηέζζεξα γνλίδηα, ην CylA, ην νπνίν θσδηθνπνηεί ηνλ ελεξγνπνηεηή ηεο ιπζίλεο, ην CylB, ην νπνίν ζπκβάιιεη ζηελ έθθξηζε ηεο θπηηαξνιπζίλεο από ην βαθηεξηαθό θύηηαξν, ην CylM πνπ θσδηθνπνηεί κηα πξσηεΐλε απαξαίηεηε γηα 17

18 ηελ σξίκαλζε ηνπ πξόδξνκνπ κνξίνπ ηεο θπηηαξνιπζίλεο θαη ην CylL, ην νπνίν θσδηθνπνηεί ηελ ίδηα ηε ιπζίλε [Jett et al., 1994]. Ζ επηθαλεηαθή πξσηεΐλε πνπ είλαη ππεύζπλε γηα ηελ πξνζθόιιεζε ζηα επηζειηαθά θύηηαξα ηνπ μεληζηή θαη γηα ηε δεκηνπξγία ζπζζσκαησκάησλ είλαη ε as (aggregation substance). H as δηεπθνιύλεη ηε ζύλαςε δύν βαθηεξηαθώλ θπηηάξσλ γηα ηελ αληαιιαγή γελεηηθνύ πιηθνύ. Δθθξάδεηαη ζηελ επηθάλεηα ηνπ βαθηεξίνπ-δόηε θαη ην γνλίδηό ηεο βξίζθεηαη ζπλήζσο ζε πιαζκίδηα [Galli et al.,1990; Olmsted et al., 1993; Jett et al.,1994; Shankar et al.,1999]. Δθηόο από ηελ as, έρνπλ απνκνλσζεί πνιιέο επηθαλεηαθέο ή εθθξηλόκελεο πξσηεΐλεο νη νπνίεο ζρεηίδνληαη κε ηνλ απνηθηζκό ηνπ επηζειίνπ. Ζ πξσηεΐλε ace ζπκβάιιεη επίζεο ζηελ ηθαλόηεηα πξνζθόιιεζεο ηνπ κηθξννξγαληζκνύ, αθνύ πξνζδέλεηαη εηδηθά ζην θνιιαγόλν ηεο εμσθπηηάξηαο νπζίαο [Nallapareddy et al., 2000]. Σν γνλίδην gele θσδηθνπνηεί κηα εμσθπηηάξηα κεηαιινελδνπεπηηδάζε, ε νπνία εθθξίλεηαη θαη αιιειεπηδξά κε πδξόθνβα θαη αδηάιπηα ππνζηξώκαηα [Su et al., 1991]. Οη πδξόθηιεο πξσηεΐλεο ηνπ θπηηαξηθνύ ηνηρώκαηνο efaafs θαη afaafm ζπκβάιινπλ ζηελ πξνζθόιιεζε ηνπ βαθηεξίνπ ζην επηζήιην [Lowe et al., 1995]. Σν γνλίδην esp θσδηθνπνηεί κηα εληεξνθνθθηθή επηθαλεηαθή πξσηεΐλε (enterococcus surface protein), ε νπνία απνκνλώλεηαη ζπλήζσο από ηα πην κνιπζκαηηθά ζηειέρε εληεξνθόθθσλ θαη ζπκβάιιεη ζηελ κε αλαγλώξηζή ηνπ από ην αλνζνπνηεηηθό ζύζηεκα ηνπ αζζελνύο [Shankar et al., 1999]. Οη εληεξόθνθθνη πνπ δελ θέξνπλ πιαζκίδηα (βαθηήξηα δέθηεο), θέξνπλ ζην βαθηεξηαθό ρξσκόζσκα γνλίδηα ηα νπνία εθθξάδνπλ θεξνκόλεο, κε απνηέιεζκα λα πξνζειθύζνπλ άιια βαθηήξηα-δόηεο πιαζκηδίνπ. Αιιά θαη ζε εληεξόθνθθνπο δόηεο, ζην πιαζκηδηαθό DNA ππάξρνπλ γνλίδηα πνπ θσδηθνπνηνύλ πξσηεΐλεο νη νπνίεο ζπκβάιινπλ ζηε δηεπθόιπλζε ηεο ζύλαςεο δηαθπηηαξηθώλ επαθώλ γηα ηελ αληαιιαγή πιαζκηδίσλ. Λόγσ ησλ γνληδίσλ ησλ θεξνκνλώλ απηώλ, ηα βαθηήξηα κπνξνύλ λα αληαιιάζζνπλ παξάγνληεο αληνρήο θαη κνιπζκαηηθόηεηαο [An et al., 1999]. Ζ παζνγέλεηα ησλ εληεξνθόθθσλ ζρεηίδεηαη κε ηελ παξνπζία απηώλ ησλ κνιπζκαηηθώλ παξαγόλησλ ζην γνληδίσκά ηνπο. Σα ζηειέρε πνπ 18

19 πξνθαινύλ βαθηεξηαηκία θέξνπλ πάληα ην γνλίδην esp, ελώ απηά πνπ πξνθαινύλ ελδνθαξδίηηδα θέξνπλ ηελ επηθαλεηαθή πξσηεΐλε efaa. Πνιιαπινί κνιπζκαηηθνί παξάγνληεο αληρλεύνληαη ζε ζηειέρε πνπ ζρεηίδνληαη κε άιιεο ινηκώμεηο, όπσο νη ινηκώμεηο ηνπ νπξνπνηεηηθνύ [Amyes et al., 2007]. Δ. Παζνγέλεηα ησλ εληεξνθόθθσλ ύκθσλα κε ηε δηεζλή βηβιηνγξαθία, νη εληεξόθνθθνη ελέρνληαη ζε πιήζνο ινηκώμεσλ. Δλδνθαξδίηηδα, βαθηεξηαηκία, ινηκώμεηο ηνπ νπξνπνηεηηθνύ ζπρλά νθείινληαη ζην E. faecalis, όκσο θαη άιια είδε, όπσο ν E. faecium ή ν Ε. durans έρνπλ απνκνλσζεί από θιηληθά δείγκαηα [Murray et al., 1990; Johnson et al., 1994; Moore et al., 2002]. Δπηπιένλ, κπνξεί κπνξνύλ λα είλαη αίηην πξνζηαηίηηδαο ή θνιπίηηδαο. Δληεξόθνθθνο, θπξίσο ηνπ είδνπο faecium, έρεη απνκνλσζεί από αίκα ή εγθεθαινλσηηαίν πγξό από πεξηζηαηηθά κεληγγίηηδαο θαη λενγληθήο κεληγγίηηδαο [Zeana et al., 2001]. Σέινο, ζηειέρε εληεξνθόθθσλ έρνπλ βξεζεί θαη ζηε ζηνκαηηθή θνηιόηεηα, όπνπ αλαπηύζζνπλ βηνκεκβάλεο αλάκεζα ζηα δόληηα θαη πξνζηαηεύνληαη από ηελ νδνληηθή πέηξα. ε πεξηπηώζεηο ρξόλησλ θιεγκνλώλ ηεο ζηνκαηηθήο θνηιόηεηαο κπνξνύλ λα πξνθαιέζνπλ βαθηεξηαηκία [Forner et al., 2006]. ΣΤ. Οηθνινγία ησλ εληεξνθόθθσλ Ο ξόινο ηεο πεξηβαιινληηθήο κηθξνβηνινγίαο, ηεο κειέηεο δειαδή ησλ κηθξννξγαληζκώλ ζην πεξηβάιινλ, είλαη εμαηξεηηθά ζεκαληηθόο γηα ηε Γεκόζηα Τγεία. Γηα λα πεξηνξηζηεί ή λα εμαιεηθζεί κία αζζέλεηα ζα πξέπεη λα είλαη γλσζηό πώο κπνξεί ν κηθξννξγαληζκόο πνπ ηελ πξνθαιεί λα πεξηνξηζηεί ζην λεξό, ην έδαθνο, ηα ηξόθηκα, ηνλ αέξα. Γηα λα γίλεη απηό, ζα πξέπεη λα είλαη θαηαλνεηόο ν ξόινο ηνπ κηθξννξγαληζκνύ ζην πεξηβάιινλ [Black, 1996]. 19

20 Οη εληεξόθνθθνη είλαη κέιε ηεο θπζηνινγηθήο ρισξίδαο ηνπ επηζειίνπ ηνπ εληέξνπ ζηνλ άλζξσπν θαη ηα δώα. Απνηεινύλ πεξίπνπ ην 0.01% ηεο εληεξηθήο ρισξίδαο, όκσο ν απόιπηνο αξηζκόο ηνπο πνηθίιεη, αλάινγα κε ηηο δηαηξνθηθέο ζπλήζεηεο, ην πεξηβάιινλ θαη ηελ γεσγξαθηθή θαηαλνκή [Chenoweth & Schaberg, 1990; Jett et al., 1994]. Απνβάιινληαη κέζσ ησλ θνπξάλσλ ζε πνιύ κεγάιεο πνζόηεηεο, πνπ θηάλνπλ κέρξη θαη 108 CFU/γξακκάξην θνπξάλσλ [Tendolkar et al., 2003]. Αλ θαη ζην έληεξν είλαη απηόρζνλεο νξγαληζκνί θαη κάιηζηα κε παζνγόλνη, νπνπδήπνηε ζην πεξηβάιινλ είλαη αιιόρζνλεο θαη ε παξνπζία ηνπο εθεί ζεκαηνδνηεί θνπξαλώδε κόιπλζε [Παπαπεηξνπνύινπ & Μαπξίδνπ,1995]. ΣΤ.1. Γηαζπνξά θαη Μεηάδνζε ησλ Δληεξνθόθθσλ Μέρξη ηε δεθαεηία ηνπ 90, θπξηαξρνύζε ε αληίιεςε όηη ε ινίκσμε από εληεξόθνθθν πξνέθππηε ελδνγελώο, κέζσ κε θπζηνινγηθήο αύμεζεο ηνπ αξηζκνύ ησλ εληεξόθνθθσλ ζηελ εληεξηθή ρισξίδα ή/ θαη κεηαλάζηεπζήο ηνπο ζην αίκα θαη ζε άιινπο ηζηνύο. εηξά κειεηώλ, όπσο ε κειέηε δεύγνπο ζπδύγσλ κε ελδνθαξδίηηδα, από ηνπο νπνίνπο απνκνλώζεθε ην ίδην ζηέιερνο, έρνπλ δείμεη όηη κπνξεί λα ππάξμεη θαη εμσγελήο ινίκσμε, κε άκεζε κεηάδνζε από άλζξσπν ζε άλζξσπν [Chenoweth & Schaberg, 1990] ή από ηα δώα ζηνλ άλζξσπν [Guardabassi et al., 2004], είηε έκκεζα κε ηελ θαηαλάισζε κνιπζκέλνπ ηξνθίκνπ [Hammerum et al., 2010] ή λεξνύ. Ζ πεγή πξνέιεπζεο ησλ εληεξνθόθθσλ είλαη ν γαζηξεληεξηθόο ζσιήλαο αλζξώπσλ θαη δώσλ. Από εθεί απνβάιινληαη θαη κεηαδίδνληαη ζην πεξηβάιινλ κέζσ ησλ ζθνππηδηώλ θαη ησλ αζηηθώλ ιπκάησλ. Μέζσ ησλ αζηηθώλ απνβιήησλ κνιύλνληαη ηα ππόγεηα θαη επηθαλεηαθά ύδαηα, πνπ ρξεζηκνπνηνύληαη είηε γηα άξδεπζε, είηε γηα πδξνδόηεζε, αιιά θαη νη ζάιαζζεο σο απνδέθηεο ησλ επεμεξγαζκέλσλ ιπκάησλ ησλ βηνινγηθώλ θαζαξηζκώλ. 20

21 Ο άλζξσπνο κπνξεί λα απνηειέζεη θαη ν ίδηνο πεγή εμάπισζεο ησλ εληεξνθόθθσλ. ε θνιπκβεηηθέο δεμακελέο έρνπλ ε πεξηπηώζεηο θαθήο πξνζσπηθήο πγηεηλήο, ν κηθξννξγαληζκόο κπνξεί λα κεηαδνζεί ζε επηθάλεηεο θαη ζε έηνηκα πξνο βξώζε ηξόθηκα, αιιά θαη ζε άιινπο αλζξώπνπο. Δθηόο από ηα κνιπζκέλα ρέξηα ηνπ αλζξώπνπ, ηα ηξόθηκα κπνξνύλ λα κνιπλζνύλ από εληεξόθνθθν κε πνηθίινπο ηξόπνπο. Όηαλ πξόθεηηαη γηα θξνύηα θαη ιαραληθά, ηα νπνία θαηαλαιώλνληαη σκά, ε κόιπλζε κπνξεί λα πξνέιζεη από ην ρώκα ή ην λεξό, θαηά ηελ θαιιηέξγεηα ηνπ θπηνύ, είηε θαηά ηελ επεμεξγαζία θαη ηελ παξαζθεπή ηνπ, κέζσ ηεο ρξήζεο κνιπζκέλνπ λεξνύ ή ιόγσ θαθήο πγηεηλήο ηνπ πξνζσπηθνύ. Ο ηξόπνο κεηάδνζεο ζην θξέαο, ην γάια θαη ηα ιαραληθά πνπ καγεηξεύνληαη, είλαη ζρεδόλ παξόκνηνο. Ζ κε ηήξεζε ζπλζεθώλ πγηεηλήο ζε κνλάδεο παξαγσγήο, επεμεξγαζίαο θαη κεηαπνίεζεο, ζπκβάιιεη ζηελ εμάπισζε ηνπ παζνγόλνπ. Πξόζθαηεο κειέηεο έρνπλ δείμεη όηη ηα έληνκα κπνξνύλ λα παίδνπλ επίζεο ελδηάκεζν ξόιν ζηε κεηάδνζε ηνπ εληεξνθόθθνπ, αθνύ κπνξνύλ λα πεηνύλ από πεξηηηώκαηα αλζξώπσλ θαη δώσλ πξνο εθηεζεηκέλα ηξόθηκα θαη λα κεηαθέξνπλ ην βαθηήξην [Martin & Mundt, 1972; Graczyk et al, 2001; Macovei & Zurek, 2006; Ahmad et al, 2011]. 21

22 Σρεδηάγξακκα 1. Γηαζπνξά θαη κεηάδνζε ησλ εληεξνθόθθσλ. ΣΤ.2. Δληεξόθνθθνη ζην λεξό Οη εληεξόθνθθνη κπνξνύλ λα επηβηώζνπλ ζην λεξό γηα κεγάιν ρξνληθό δηάζηεκα, ην νπνίν κάιηζηα είλαη κεγαιύηεξν από εθείλν ηεο Escherichia coli θαη ησλ Δληεξνβαθηεξηνεηδώλ. Δπηπιένλ, δελ απμάλνπλ ηνλ αξηζκό ηνπο, θαζώο δελ πνιιαπιαζηάδνληαη ζην πδάηηλν πεξηβάιινλ ή εθηόο ζώκαηνο. Βαζηθό ραξαθηεξηζηηθό ηνπο είλαη όηη κπνξνύλ λα επηβηώζνπλ ζε αληίμνεο ζπλζήθεο, αιιά επηπιένλ θαη ππό ζπλζήθεο stress. Δληεξόθνθθνη έρνπλ 22

23 απνκνλσζεί από επηθαλεηαθά ύδαηα θαη ύδαηα αλαςπρήο, όπσο επίζεο θαη από πόζηκν θαη αξδεπηηθό λεξό. Σόζν ζην εμσηεξηθό, όζν θαη ζηε ρώξα καο, έρεη θαλεί ζπζρέηηζε θιηληθώλ ζηειερώλ θαη πεξηβαιινληηθώλ ζηειερώλ απνκνλσκέλσλ από ύδαηα [Grammenou et al., 2006; Abriouel et al., 2008]. Γηα όινπο ηνπο παξαπάλσ ιόγνπο, νη εληεξόθνθθνη ζεσξνύληαη δείθηεο θνπξαλώδνπο κόιπλζεο, όηαλ βξεζνύλ ζην λεξό θαη ζηα ηξόθηκα [Charles et al., 1999]. Σρεδηάγξακκα 2. Κύθινο κεηάδνζεο παζνγόλσλ κέζσ ηνπ λεξνύ. ην πδάηηλν πεξηβάιινλ νη εληεξόθνθθνη αληρλεύνληαη ζηα επηθαλεηαθά ύδαηα, όπσο ηα ύδαηα ησλ πνηακώλ, ζην πόζηκν θαη ζην ζαιαζζηλό λεξό. Οη πνηακνί κνιύλνληαη είηε από δσηθήο πξνέιεπζεο θόπξαλα, πξνεξρόκελα από θηελνηξνθηθέο κνλάδεο είηε ζπαληόηεξα, από αλζξώπηλεο πξνέιεπζεο απόβιεηα [Santiago-Rodrıguez et al., 2010; Hampson et al., 2010]. ην ζαιάζζην πεξηβάιινλ ζπρλά απνξξίπηνληαη ιύκαηα πξνεξρόκελα από έλα επξύ θάζκα πεγώλ: βηνινγηθνί θαζαξηζκνί, βηνκεραλίεο, αγξνηηθέο θαη θηελνηξνθηθέο κνλάδεο, θαζώο θαη κε επεμεξγαζκέλα ιύκαηα από 23

24 παξαζαιάζζηεο νηθίεο. Οη παξάθηηεο δώλεο είλαη επνκέλσο επηβαξπκέλεο από πιεζώξα κηθξννξγαληζκώλ θνπξαλώδνπο πξνέιεπζεο, ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ θαη ησλ εληεξόθνθθσλ. Παξάιιεια όκσο, νη δώλεο απηέο απνηεινύλ ρώξνπο αλαςπρήο γηα ηνλ άλζξσπν, γεγνλόο πνπ ηνλ εθζέηεη άκεζα ή έκκεζα ζε κεγάιν θίλδπλν ινηκώμεσλ από παζνγόλα. Ο θίλδπλνο απμάλεη όηαλ νη παξάθηηεο πεξηνρέο είλαη ππθλνθαηνηθεκέλεο ή πξνζειθύνπλ κεγάιν αξηζκό παξαζεξηζηώλ [Furukawa et al., 2011; Janelidze et al., 2011]. Γηα πεξίπνπ έλαλ αηώλα, ε δηαζθάιηζε ηεο κηθξνβηαθήο πνηόηεηαο ηνπ πόζηκνπ ύδαηνο ζηνρεύεη ζηελ πξνζηαζία ηνπ θαηαλαισηή. Ζ πξόιεςε πδαηνγελώλ κνιύλζεσλ απνηειεί πάληνηε πξόθιεζε γηα ηε Γεκόζηα Τγεία. Σν πόζηκν λεξό, ηόζν ζηελ Διιάδα, όζν θαη ζηηο ππόινηπεο αλαπηπγκέλεο ρώξεο πξνέξρεηαη είηε από πεγέο, είηε από γεσηξήζεηο. Ζ θνπξαλώδεο κόιπλζε ηνπ πόζηκνπ λεξνύ κπνξεί ινηπόλ λα αλαδεηεζεί, ηόζν ζηελ πξνέιεπζε ηνπ ύδαηνο, όζν θαη ζηελ επεμεξγαζία ηνπ. Διιεηπή κέηξα απνιύκαλζεο ηνπ λεξνύ πνπ ρξεζηκνπνηείηαη γηα πδξνδόηεζε, όπσο ε κεησκέλε ρισξίσζε, αιιά θαη ε ιαλζαζκέλε ή αλύπαξθηε ζπληήξεζε ηεο δηαδηθαζίαο επεμεξγαζίαο ηνπ πόζηκνπ ύδαηνο, νδεγεί ζηελ επηβίσζε θαη δηαζπνξά παζνγόλσλ κηθξννξγαληζκώλ, όπσο ν εληεξόθνθθνο [Levy et al., 2008; Figueras & Borrego, 2010]. Παξνπζία εληεξνθόθθσλ κπνξεί ηέινο λα παξαηεξεζεί θαη ζε θνιπκβεηηθέο δεμακελέο, εμαηηίαο ηεο κε ζσζηήο ηήξεζεο γεληθώλ θαλόλσλ πγηεηλήο, θαζαξηζκνύ θαη ρισξίσζεο. Οη εληεξόθνθθνη ζηηο θνιπκβεηηθέο δεμακελέο πξνέξρνληαη είηε από ην λεξό ηνπ δηθηύνπ είηε, θπξίσο, από θνιπκβεηέο θνξείο ή λνζνύληεο. Ζ κεηάδνζε κπνξεί λα γίλεη άκεζα ζε πγηείο θνιπκβεηέο κέζσ ηεο θαηάπνζεο ηνπ ύδαηνο ηεο δεμακελήο, κε απνηέιεζκα ηε δηαζπνξά ηνπ εληεξόθνθθνπ ζηνλ πιεζπζκό. 24

25 ΣΤ.3. Δληεξόθνθθνη ζηα ηξόθηκα ε αληίζεζε κε ην πδάηηλν πεξηβάιινλ, όπνπ δελ απμάλνπλ ηνλ αξηζκό ηνπο, νη εληεξόθνθθνη ζηα ηξόθηκα βξίζθνπλ θαηάιιεια ζξεπηηθά ππνζηξώκαηα, ώζηε λα πνιιαπιαζηαζηνύλ. Σα ηξόθηκα ζηα νπνία κπνξνύλ λα απνκνλσζνύλ ζηειέρε εληεξνθόθθνπ δηαθξίλνληαη ζε ηξόθηκα έηνηκα πξνο θαηαλάισζε (σκά) θαη ζε ηξόθηκα πνπ καγεηξεύνληαη θαη ζηα νπνία ιόγσ ζεξκηθήο επεμεξγαζίαο κεηώλεηαη ην κηθξνβηαθό θνξηίν. ηελ πξώηε πεξίπησζε, νη εληεξόθνθθνη κπνξνύλ λα βξεζνύλ ζε θξέζθα θξνύηα θαη ιαραληθά, ηα νπνία θαηαλαιώλνληαη ρσξίο θαιό πιύζηκν. Ζ αξρηθή παξνπζία ηνπ παζνγόλνπ ζην ηξόθηκν νθείιεηαη, είηε ζηε ρξήζε κνιπζκέλνπ κε εληεξόθνθθνπο αξδεπηηθνύ λεξνύ, είηε ζε θαθέο ζπλζήθεο πγηεηλήο θαηά ηηο δηαδηθαζίεο κεηαθνξάο, ζπζθεπαζίαο θαη δηάζεζεο ησλ πξντόλησλ ζηα ηειηθά ζεκεία πώιεζεο ηνπο [Abriouel et al., 2008]. Δπηπιένλ, κπνξνύλ λα εληνπηζηνύλ θαη ζε θξέζθν θξέαο, όπσο ηα θξέζθα ινπθάληθα, ηα νπνία είλαη πνιύ δεκνθηιή ζηηο κεζνγεηαθέο ρώξεο θαη κπνξνύλ λα θαηαλαισζνύλ σκά ή κέηξηα ςεκέλα [Cocolin et al., 2004]. Καη ζηε δεύηεξε πεξίπησζε όκσο ε επηθηλδπλόηεηα δελ κεηώλεηαη ιόγσ ηεο ζεξκηθήο επεμεξγαζίαο ησλ πξντόλησλ. Οξηζκέλα είδε εληεξνθόθθσλ, όπσο ν Ε. faecium θαη ν E. faecalis, επηβηώλνπλ ζε ζεξκνθξαζία 60 ν C θαη άξα επηδνύλ αθόκε θαη ηεο ρακειήο παζηεξίσζεο. Πην ζπγθεθξηκέλα, νη εληεξόθνθθνη κπνξνύλ λα εληνπηζηνύλ ζην γάια θαη ζηα γαιαθηνθνκηθά πξντόληα, αθνύ κπνξνύλ λα δηαζπάζνπλ ηελ θαδεΐλε θαη λα κεηαβνιίζνπλ ηε ιαθηόδε. Ζ εκθάληζε ηνπο ζην γάια γίλεηαη είηε κέζσ ηνπ δηθηύνπ πδξνδόηεζεο, είηε ηνπ εμνπιηζκνύ ηεο κνλάδαο επεμεξγαζίαο, είηε θπζηθά ιόγσ αλζπγηεηλώλ ζπλζεθώλ θαηά ηελ παξαγσγή ή ηελ κεηαπνίεζε [Garg & Mital, 1991]. Δπηπιένλ, κειέηεο ζε δηάθνξεο πνηθηιίεο ηπξηώλ έδεημαλ ηελ παξνπζία αιιά θαη ηελ επηβίσζε ηνπ κηθξννξγαληζκνύ, ηόζν ζε θξέζθν ηπξί, όζν θαη ζε ηπξηά πνπ πεξλνύλ από δηαδηθαζία σξίκαλζεο [Efthymiou et al., 1974]. 25

26 Μειέηεο πνπ έρνπλ δηεμαρζεί, ηόζν ζηελ Διιάδα, όζν θαη ζην εμσηεξηθό, έρνπλ δείμεη ηελ παξνπζία εληεξνθόθθσλ ζην βόεην θαη ην ρνηξηλό θξέαο, θαζώο θαη ζε πξντόληα θξέαηνο, όπσο ινπθάληθα θαη αιιαληηθά.. [Knudtson & Hartman,1993; Devriese et al., 1995; Cocolin et al., 2004; Paramithiotis et al., 2008]. ε ζύγθξηζε κε ηα ζηειέρε εληεξνθόθθσλ πνπ απνκνλώλεηαη από θξνύηα θαη ιαραληθά, ηα νπνία είλαη ζπλήζσο ζηειέρε θπηηθήο ή αλζξώπηλεο θνπξαλώδνπο πξνέιεπζεο, ηα είδε ησλ εληεξνθόθθσλ πνπ αληρλεύνληαη ζην θξέαο πνηθίινπλ αλάινγα κε ην είδνο θξέαηνο [Devriese et al., 1995]. Ζ κόιπλζε κε είδε εληεξνθόθθσλ κπνξεί λα γίλεη ζε δηάθνξα ζηάδηα ηεο ζθαγήο θαη επεμεξγαζίαο ηνπ θξέαηνο θαη ν πξνζδηνξηζκόο ηνπ ζηαδίνπ ζην νπνίν έρεη ζπκβεί ε επηκόιπλζε είλαη θξίζηκνο γηα ηελ απνιύκαλζε [Knudtson & Hartman,1993]. Δπηπιένλ, πξέπεη λα ζεκεησζεί όηη εληεξόθνθθνη έρνπλ απνκνλσζεί θαη από ςάξηα θαη ζαιαζζηλά. Σα ζηειέρε απηά θαίλεηαη λα ζπζρεηίδνληαη κε εληεξόθνθθνπο πνπ απνκνλώλνληαη ζην ζαιαζζηλό λεξό [Hackney et al., 1974]. Πνιιέο έξεπλεο επηθεληξώλνληαη ζηελ αλίρλεπζε ηεο παξνπζίαο εληεξόθνθθνπ πξηλ ηελ πξνεηνηκαζία θαη ην καγείξεκα. Δμίζνπ ζεκαληηθή όκσο είλαη θαη ε κειέηε ζε έηνηκα πξνο θαηαλάισζε ηξόθηκα, ηα νπνία παξαζθεπάδνληαη ζε ρώξνπο καδηθήο εζηίαζεο ή γξήγνξνπ θαγεηνύ. ε απηνύ ηνπ είδνπο ηα ηξόθηκα έρεη δεηρζεί όηη ε πξνέιεπζε ηεο κόιπλζεο είλαη θπξίσο νη παξαζθεπαζηέο ησλ ηξνθίκσλ [Macovei & Zurek, 2007]. Σέινο, ζε κεγάιεο θηελνηξνθηθέο κνλάδεο, ζηειέρε εληεξνθόθθνπ θπξίσο E. faecium θαη Ε.faecalis, εληνπίδνληαη θαη ζηηο δσνηξνθέο. Πεγή κόιπλζεο ησλ δσνηξνθώλ κπνξεί λα είλαη ηα θόπξαλα ησλ δώσλ, αιιά θαη ε ιαλζαζκέλε ζπληήξεζε θαη ν ρεηξηζκόο ηεο ηξνθήο [Mackey & Inton, 1990]. 26

27 ΣΤ.4. Δληεξόθνθθνη ζην ρώκα Σν έδαθνο ρξεζηκνπνηείηαη επξέσο σο ρώξνο ηαθήο αζηηθώλ βηνκεραληθώλ θαη θηελνηξνθηθώλ απνξξηκκάησλ. Μηα από ηηο πνιιέο ζπλέπεηεο απηνύ ηνπ ηξόπνπ δηαρείξηζεο ησλ απνβιήησλ είλαη θαη ε δηαζπνξά κηθξννξγαληζκώλ πνπ απνβάιινληαη κε ηα θόπξαλα ζην πεξηβάιινλ. Κπξίσο ζηηο αγξνηηθέο πεξηνρέο, νη κηθξννξγαληζκνί κεηαθέξνληαη ζε κεγάιεο απνζηάζεηο κέζσ ηνπ ύδαηνο ζε θαιιηεξγεηηθά εδάθε. Μεγάιε αλεζπρία πξνθαιεί ην γεγνλόο όηη θαη' απηόλ ηνλ ηξόπν κνιύλνληαη ηα ζπαξηά θαη θαη' επέθηαζε ην παζνγόλν πξνζβάιιεη ηνλ άλζξσπν [Kibbey et al., 1978]. Έξεπλεο έρνπλ δείμεη ήδε από ηε δεθαεηία ηνπ 60, ηελ παξνπζία εληεξνθόθθσλ ζην ρώκα, [Mundt, 1961; Kibbey et al., 1978] ελώ αθόκε θαη επηδεκίεο νη νπνίεο νθείινληαη ζε ππόγεηα ύδαηα, ηα νπνία ρξεζηκνπνηνύληαλ γηα πδξνδόηεζε, έρνπλ ζπζρεηηζηεί κε ηελ κόιπλζε ηνπ εδάθνπο. ηηο κειέηεο απηέο, ηόζν ζην έδαθνο, όζν θαη ζηα ππόγεηα ύδαηα απνκνλώζεθαλ ζηειέρε εληεξνθόθθσλ [Fong et al., 2007]. Δπηπιένλ, εληεξόθνθθνη είλαη δπλαηόλ λα απνκνλσζνύλ θαη από ακκώδε εδάθε, θπξίσο από παξαιίεο. Ζ κόιπλζε ησλ πεξηνρώλ απηώλ γίλεηαη είηε από ην ζαιαζζηλό λεξό, είηε άκεζα από κνιπζκέλνπο ινπόκελνπο [Yamahara et al., 2009]. Ε. Δπηδεκηνινγία λνζνθνκεηαθώλ ινηκώμεσλ θαη πξσηόθνιια δηαρείξηζεο. Οη εληεξόθνθθνη αληρλεύνληαη πνιύ ζπρλά ζε ελδνλνζνθνκεηαθέο ινηκώμεηο θαη ππεξινηκώμεηο. ηειέρε ησλ εηδώλ E. faecalis θαη Ε.faecium, πνπ είλαη αλζεθηηθνί ζηελ Βαλθνκπθίλε θαη ζε άιια αληηβηνηηθά, απνηεινύλ ζήκεξα ην ηξίην κε ηέηαξην ζε ζπρλόηεηα ελδνλνζνθνκεηαθό παζνγόλν 27

28 [Wegner et al., 2008]. ηελ Διιάδα, ην πξώην θιηληθό ζηέιερνο αλζεθηηθό ζηελ βαλθνκπθίλε πεξηγξάθεθε ην Έσο ζήκεξα, δελ ππάξρνπλ αξθεηά επηδεκηνινγηθά δεδνκέλα πνπ λα επηηξέπνπλ ην ζπζρεηηζκό θιηληθώλ θαη πεξηβαιινληηθώλ δεηγκάησλ [Damani et al., 2010]. ηνλ πίλαθα 4 αλαθέξνληαη παξαδείγκαηα επηδεκηώλ πνπ μέζπαζαλ ελδνλνζνθνκεηαθά, ελώ ε πξνέιεπζε ηνπ εληεξνθόθθνπ ήηαλ είηε αλζξώπηλε, δειαδή θάπνηνο αζζελήο πνπ έπαζρε από εληεξνθνθθηθή ινίκσμε, είηε πεξηβάιινληηθή, κέζσ αληηθεηκέλσλ πνπ κεηαθέξζεθαλ πξνο ην λνζνθνκείν. Πίλαθαο 4. Δπηδεκίεο ζε λνζνθνκεία Έηνο Φώξα Πξνέιεπζε Δίδνο Αξ. Αζζελώλ Βηβι Απζηξαιία Δλδνλνζνθνκεηαθή E. faecium 68 Christiansen et al., Βξαδηιία Δλδνλνζνθνκεηαθή E.faecalis/ E.feacium 66 Moretti et al., Καλαδάο Παηρλίδη E. faecium 34 Drews et al., Γαιιία Δλδνλνζνθνκεηαθή E. faecium 38 Lucet et al., Γεξκαλία Δλδνλνζνθνκεηαθή E. faecium 105 Sagel et al., Ηηαιία Δλδνλνζνθνκεηαθή E. faecium 43 Peta et al., 28

29 Σνπξθία Δλδνλνζνθνκεηαθή E. faecium 7 Kirdar et al., Ηαπσλία Δλδνλνζνθνκεηαθή E. faecium 100 Shirano et al., Πνισλία Δλδνλνζνθνκεηαθή E.raffinosus/ E.faecium 27 Kawalec et al., Ρσζία Δλδνλνζνθνκεηαθή E. faecium 129 Brilliantova et al., Ζλ. Βαζίιεην Δλδνλνζνθνκεηαθή E. faecium 35 Chadwick et al., Ζ.Π.Α Δλδνλνζνθνκεηαθή E. faecium/ Ε.faecalis 213 Boyle et al., Ζ.Π.Α Δλδνλνζνθνκεηαθή E. faecium 61 Wells et al., 1995 Οη επηδεκίεο πνπ έρνπλ μεζπάζεη ελδνλνζνθνκεηαθά κνηξάδνληαη νξηζκέλα θνηλά ραξαθηεξηζηηθά: Σν παζνγόλν είλαη εληεξόθνθθνο κε αλζεθηηθόηεηα ζε αληηβηνηηθό, θπξίσο ζηελ βαλθνκπθίλε, ή πνιιαπιή αληνρή ζε αληηβηνηηθά. Όια ζρεδόλ ηα απνκνλσκέλα ζηειέρε πξνέξρνληαη από έλα ή ιίγνπο θιώλνπο βαθηεξίσλ, γεγνλόο πνπ απνδεηθλύεη θαη ηελ ελδνλνζνθνκεηαθή ηνπο κεηάδνζε. Ζ επηδεκία δηαξθεί έσο θαη κεξηθνύο κήλεο θαη ζπρλά ππάξρεη απνηπρία λα πεξηνξηζηεί ζην ζάιακν ή ζηελ θιηληθή θαη 29

30 δηαζπείξεηαη πξηλ αληηκεησπηζηεί. Γηα ην ιόγν απηό, δηάθνξα κνληέια πξόβιεςεο επηδεκίαο εληεξνθόθθσλ πξνηείλνληαη, θπξίσο από εξεπλεηέο ηνπ εμσηεξηθνύ, κε ζηόρν ηνλ πεξηνξηζκό ηεο δηαζπνξάο ηνπ αλζεθηηθνύ εληεξόθνθθνπ ζην λνζνθνκεηαθό πεξηβάιινλ κέζσ δηαξθνύο επηδεκηνινγηθήο επηηήξεζεο [Sagel et al., 2008]. Όηαλ ε κεζνδνινγία πξόβιεςεο θαη πξόιεςεο δελ είλαη αξθεηή, πξσηόθνιια δηαρείξηζεο θαη άκεζεο -εληόο 48 σξώλ- ηεο αλαδπόκελεο επηδεκίαο αλαπηύζζνληαη θαη εθαξκόδνληαη. Υαξαθηεξηζηηθό παξάδεηγκα είλαη ην πξσηόθνιιν γηα ηελ αληηκεηώπηζε εληεξνθόθθσλ αλζεθηηθώλ ζηελ βαλθνκπθίλε πνπ έρεη εθδνζεί ην 2006 από ην Ηλζηηηνύην Παζηέξ θαη εθαξκόδεηαη ζηα γαιιηθά λνζνθνκεία. Καηά ηελ πξώηε κέξα αλαγλώξηζεο ηνπ παζνγόλνπ (επίπεδν 1), απνκνλώλεηαη ν πάζρσλ, ελεκεξώλεηαη ε δηεύζπλζε ηνπ λνζνθνκείνπ αιιά θαη ν αξκόδηνο εζληθόο θνξέαο, γίλεηαη παύζε νπνηαζδήπνηε δηαδηθαζίαο κεηαθνξάο ζε άιιε κνλάδα ή δηαθνκηδήο ηνπ πάζρνληνο αιιά θαη όζσλ άιισλ αζζελώλ έρνπλ έξζεη ζε επαθή καδί ηνπ. Δάλ ε κεηαθνξά ζε άιιε κνλάδα έρεη ήδε γίλεη ηόηε απνκνλώλνληαη όινη νη αζζελείο θαη ζηηο δύν κνλάδεο. Σέινο, ειαρηζηνπνηνύληαη ή κεδελίδνληαη νη εηζαγσγέο ζηελ κνλάδα ηνπ πάζρνληνο θαη μεθηλά ν κηθξνβηνινγηθόο έιεγρνο γηα ηελ αλίρλεπζε ηνπ εληεξόθνθθνπ ζε αζζελείο θαη πεξηβάιινλ. Γηα ηνλ έιεγρν απηό πξνηηκνύληαη κνξηαθέο ηερληθέο γηα ηαρύηεξα απνηειέζκαηα. Μέζα ζηηο επόκελεο δύν κέξεο (επίπεδν 2) γίλεηαη πιήξεο θαηαγξαθή όισλ ησλ επαθώλ ηνπ πάζρνληνο, μεθηλά ζην Μηθξνβηνινγηθό Δξγαζηήξην έιεγρνο ζπζρέηηζεο κε παιαηόηεξα πεξηζηαηηθά θαη παξάιιεια εληζρύνληαη ηα κέηξα πγηεηλήο. ην επίπεδν 3 νκαδνπνηνύληαη όινη νη εκπιεθόκελνη αζζελείο ζε πάζρνληεο θαη επαθέο παζρόλησλ. Σν πξνζσπηθό πνπ θξνληίδεη ηελ θάζε νκάδα είλαη ζπγθεθξηκέλν θαη απνθιεηζηηθό. Μεηά από 3 εβδνκάδεο δίρσο λέν θξνύζκα, ε νκάδα ησλ επαθώλ κπνξεί λα κεηαθεξζεί ζε άιιε κνλάδα, ελώ ζηαδηαθά μεθηλά ε κείσζε ησλ αληηβηνηηθώλ ώζηε λα πεξηνξηζηεί ε εμειηθηηθή πίεζε ζηνλ εληεξόθνθθν θαη ε αλάπηπμε αληίζηαζήο ηνπ ζηα αληηβηνηηθά. Μεηά ηελ εμαγσγή, ηεξείηαη αξρείν γηα πεξηπηώζεηο λέαο εηζαγσγήο θαη ηέινο, πιήξεο αλαθνξά απνζηέιιεηαη ζηνλ αξκόδην εζληθό νξγαληζκό [Institut Pasteur, 2006]. 30

31 Ζ. Πεξηβαιινληηθή επηδεκηνινγία εληεξνθόθθσλ Όπσο πξναλαθέξζεθε, νη εληεξόθνθθνη κπνξνύλ λα αληρλεπζνύλ ζην πεξηβάιινλ ζε ηξόθηκα, ύδαηα πόζηκα θαη αλαςπρήο, θαζώο θαη ζε αζηηθά ιύκαηα. Σν θπξίαξρν είδνο θαίλεηαη λα απνηειεί ν E. faecalis, όκσο νη επηδεκηνινγηθέο κειέηεο ζρεηηθά κε ηελ παξνπζία εληεξνθόθθσλ ζην πεξηβάιινλ δείρλνπλ όηη ε δηαζπνξά ησλ ζηειερώλ πνηθίιεη ζηελ Δπξώπε. ε κειέηε πνπ έγηλε ην 2003 ζε ηέζζεξηο ρώξεο Γαλία, νπεδία, Ηζπαλία θαη Ζλσκέλν Βαζίιεην, ηα είδε E. faecalis, E. faecium θαη E. hirae ήηαλ ηα ζπρλόηεξα εκθαληδόκελα. Φάλεθαλ όκσο θαη δηαθνξέο ζρεηηθά κε ην πνηα είδε επηθξαηνύλ ζε θάζε ρώξα. ηελ Ηζπαλία θαη ην Ζλσκέλν Βαζίιεην ν E. faecalis θαη ν E. faecium ήηαλ ηα πην ζπρλά ζηειέρε, ηόζν ζε πεξηβαιινληηθά, όζν θαη ζε θιηληθά δείγκαηα. ηε νπεδία παξαηεξείηαη κηθξόηεξνο πιεζπζκόο E. faecium θαη κεγαιύηεξνο αξηζκόο E. hirae, ελώ ζηε Γαλία, ην είδνο E. hirae είλαη ην επηθξαηέζηεξν, θπξίσο ζην πεξηβάιινλ. Όζνλ αθνξά ην λνζνθνκεηαθό πεξηβάιινλ, ν E. faecalis επηθξαηνύζε ζηα δείγκαηα αζζελώλ θαη απνβιήησλ, ελώ ζηα αζηηθά απόβιεηα θαη ζηνλ πγηή πιεζπζκό ηα πνζνζηά ήηαλ ζαθώο κεησκέλα [Kuhn et al., 2003]. πκπιεξσκαηηθέο ρξήζηκεο πιεξνθνξίεο ζε απηή ηε κειέηε ζα έδηλε ε ηππνπνίεζε ζε επίπεδν ζηειέρνπο. ηνλ πίλαθα 5 αλαθέξνληαη παξαδείγκαηα εληεξνθνθθηθώλ ινηκώμεσλ πεξηβιαιινληηθήο πξνέιεπζεο. Πίλαθαο 5. Δκθάληζε εληεξνθόθθσλ ζην πεξηβάιινλ Υώξα Πξνέιεπζε Δίδνο Βηβιηνγξαθία Ζλ. Βαζίιεην Αθάζαξηνο ηκαηηζκόο λνζνθνκείνπ E.faecium(VRE), E.feacalis (VRE) Wilcox & Jones,1995 Ηηαιία Λνπθάληθα E. casseliflavus Cocolin et al.,

32 Ζ.Π.Α Σπξηά Ε. durans* Efthymiou et al., 1974 Ηζπαλία Φξνύηα, Λαραληθά Enterococcus spp Abriouel et al., 2008 Ζλ. Βαζίιεην Γάια θαη γαιαθηνθνκηθά πξντόληα E. durans, E. faecium Franklin & Sharpe, 1963 Νόηηνο Αθξηθή Πόζηκν λεξό Enterococcus spp. Bessong et al., 2009 Διιάδα Πόζηκν λεξό (βξόρηλν) Enterococcus spp. Sazaklia et al., 2007 Ζ.Π.Α Δπηθαλεηαθά Ύδαηα, θνιπκβεηηθά (ιίκλε) Enterococcus spp. Kinzelman et al., 2003 Ηαπσλία Θαιαζζηλό λεξό E.faecium** Furukawa et al., 2011 εκείσζε: * Γελ αθνινύζεζαλ κνξηαθέο ηερληθέο γηα επηβεβαίσζε ηεο ηππνπνίεζεο ζε είδνο, από ηνπο ζπγγξαθείο αλαθέξεηαη σο πηζαλώο Ε.durans. **ε απηή ηε κειέηε ν E. faecium ρξεζηκνπνηήζεθε σο δείθηεο κνξηαθήο αλαδήηεζεο ηεο πεγήο θνπξαλώδνπο κόιπλζεο. Ζ ζεκαζία ηεο απνπζίαο εληεξνθόθθσλ από ην πόζηκν λεξό θαίλεηαη ηόζν από ηε ζπνξαδηθή αλίρλεπζή ηνπ αιιά θαη από ηηο πεξηπηώζεηο πδαηνγελώλ επηδεκηώλ, όπσο απηή πνπ μέζπαζε ζην Όζιν, Ννξβεγία, ην 2007 θαη πεξηιάκβαλε κόιπλζε ηνπ δηθηύνπ, ζην νπνίν αληρλεύζεθαλ ηόζν 32

33 βαθηεξηαθνί πιεζπζκνί (Enterococci, E. coli, coliforms), αιιά θαη παξάζηηα, όπσο Cryptosporidium θαη Giardia. Ζ επηδεκία απηή αθνξνύζε πιεζπζκό θαηνίθσλ [Robertson et al., 2009]. Μηα άιιε πδαηνγελήο επηδεκία μέζπαζε ην 2004 ζην Οράην ησλ Ζ.Π.Α., ε νπνία νθείινληαλ ζε βαθηεξηαθή κόιπλζε ππόγεησλ πδάησλ, ζπκπεξηιακβαλνκέλεο θαη εληεξνθνθθηθήο κόιπλζεο θαη επεξέαζε 1450 θαηνίθνπο [Fong et al., 2007]. Θ. Αλζεθηηθόηεηα ζηα Αληηβηνηηθά Οη εληεξόθνθθνη εμειίρζεθαλ ζε αλαδπόκελα ελδνλνζνθνκεηαθά παζνγόλα ιόγσ ηεο αλζεθηηθόηεηάο ηνπο ζε πνιιά είδε αληηβηνηηθώλ. Ζ αλάπηπμε πνιιαπιήο αληνρήο ζε ζπλδπαζκό αληηβηνηηθώλ είλαη ε θύξηα αηηία ππεξινηκώμεσλ πνπ νθείιεηαη ζηνπο εληεξόθνθθνπο. Σα βαθηήξηα απηά θέξνπλ εγγελή (ή ελδνγελή) αληνρή ζηηο ακηλνγιπθνζίδεο (ρακεινύ επηπέδνπ), ζηηο θεθαινζπνξίλεο (πςεινύ επηπέδνπ) ζηηο θζνξηνθηλνιόλεο θαη ζηελ θιηλδακπθίλε. Δθηόο από ηελ εγγελή αλζεθηηθόηεηα ππάξρεη θαη ε επίθηεηε ζε ηξεηο επξέσο ρξεζηκνπνηνύκελεο θαηεγνξίεο αληηβηνηηθώλ: ζηηο πεληθηιιίλεο, ζηα γιπθνπεπηίδηα θαη ηηο ακηλνγιπθνζίδεο [Courvalin et al., 2006]. Όια ηα είδε εληεξνθόθθσλ δελ παξνπζηάδνπλ ηελ ίδηα εγγελή θαη επίθηεηε αλζεθηηθόηεηα ζηα αληηβηνηηθά. Παξαθάησ αθνινπζεί δηάθξηζε ζε εγγελή θαη επίθηεηε αλζεθηηθόηεηα, αλάινγα κε ην είδνο ηνπ εληεξνθόθθνπ. 33

34 Δηθόλα 4. Αληηβηόγξακκα Δληεξνθόθθσλ κε ηε κέζνδν ησλ δίζθσλ θαη δηάρπζεο ζε άγαξ. ηελ εηθόλα δηαθξίλνληαη ηα αληηβηνηηθά: Πεληθηιίλε, Δξπζξνκπθίλε, Υισξακθαληθόιε, ηπξνθινμαζίλε. Πεγή: Μνλάδα Πεξηβαιινληηθήο Μηθξνβηνινγίαο, Δξγαζηήξην Τγηεηλήο Παλεπηζηεκίνπ Παηξώλ Δηθόλα 5. Αληηβηόγξακκα Δληεξνθόθθσλ κε θαζνξηζκό ηεο Διάρηζηεο Αλαζηαιηηθήο Ππθλόηεηαο ηνπ αληηβηνηηθνύ κε δηαβαζκηζκέλεο ηαηλίεο-etest (Minimum Inhibitory Concentration- MIC). ηελ εηθόλα δηαθξίλνληαη ηα αληηβηνηηθά Βαλθνκπθίλε θαη Σετθνπιαλίλε. Πεγή: Μνλάδα Πεξηβαιινληηθήο Μηθξνβηνινγίαο, Δξγαζηήξην Τγηεηλήο Παλεπηζηεκίνπ Παηξώλ 34

35 Θ.1. Δγγελήο Αλζεθηηθόηεηα Θ.1.1 Β-ιαθηακηθά αληηβηνηηθά Οη β-ιαθηάκεο δξνπλ σο αλαζηνιείο ησλ D,D-ηξαλζπεπηηδαζώλ, ελδύκσλ πνπ θαηαιύνπλ ηε δεκηνπξγία ελδνπεπηηδηθώλ δεζκώλ αλάκεζα ζηα γιπθνπεπηίδηα ησλ πεπηηδνγιπθαλώλ ηνπ θπηηαξηθνύ ηνηρώκαηνο. Λόγσ ηεο κεγάιεο ηνπο ζπλάθεηαο κε ηηο β-ιαθηάκεο, νη D,D-ηξαλζπεπηηδάζεο, νλνκάδνληαη θαη πεληθηιιηλνδεζκεπηηθέο πξσηεΐλεο (PΒPs). Ζ αλαζηνιή απηώλ ησλ ελδύκσλ από ηα β-ιαθηακηθά αληηβηνηηθά έρεη σο απνηέιεζκα ηελ ζπζζώξεπζε πξόδξνκσλ δνκηθώλ ζηνηρείσλ ηνπ θπηηαξηθνύ ηνηρώκαηνο θαη ηελ ελεξγνπνίεζε ηνπ απηνιπηηθνύ ζπζηήκαηνο ηνπ βαθηεξίνπ [Courvalin et al., 2006]. Οη D,D-ηξαλζπεπηηδάζεο δηαθξίλνληαη ζε ηάμεο Α, νη νπνίεο ζην Ν- ηειηθό άθξν ηνπο θέξνπλ ελεξγόηεηα γιπθνδπιηνηξαλζθεξάζεο θαη ζην C- ηειηθό θέξνπλ ελεξγόηεηα ηξαλζπεπηηδάζεο θαη ηάμεο Β, νη νπνίεο δελ θέξνπλ ελεξγόηεηα ζην Ν-ηειηθό άθξν. Μειέηεο ηνπ γνλίδηώκαηνο ησλ εληεξνθόθθσλ έδεημαλ όηη είλαη πινύζηνη ζε PBP5, κηα D,D-ηξαλζπεπηηδάζε ηάμεο Β. Οη εληεξόθνθθνη εκθαλίδνπλ αληνρή ζηελ νμαθηιιίλε ηηο θεθαινζπνξίλεο θαη ηελ εξηαπελέκε, [Πεηεηλάθε, 2007] όρη όκσο θαη ζε άιια β-ιαθηακηθά αληηβηνηηθά. Απηό ζπκβαίλεη δηόηη ε νμαθηιιίλε, νη θεθαινζπνξίλεο, ε εξηαπελέκε, ε πεθινμαζίλε θαη ε θιηληακπθίλε δελ κπνξνύλ λα δεζκεπηνύλ ζηελ PBP5, ελώ ε πεληθηιιίλε κπνξεί. Ο θαλόλαο απηόο γλσξίδεη θαη εμαηξέζεηο θαζώο ν E. faecalis θαη ν Ε. faecium δηαζέηνπλ κία PBP5 κε ρακειή ζπγγέλεηα γηα ηελ πεληθηιιίλε G. Δπηπιένλ ν E. raffinosus παξνπζηάδεη αθόκε κεγαιύηεξε αληνρή ζηελ πεληθηιιίλε G. 35

36 Θ.1.2. Ακηλνγιπθνζίδεο Οη εληεξόθνθθνη παξνπζηάδνπλ εγγελή ρακεινύ επηπέδνπ αληνρή ζηηο ακηλνγιπθνζίδεο. Σα αληηβηνηηθά απηά δξνπλ ελδνθπηηάξηα αλαζηέιινληαο ηελ 6-αθεηπινηξαλθεξάζε. Ζ αληνρή ζπλίζηαηαη ζην γεγνλόο όηη νη ακηλνγιπθνζίδεο δελ κπνξνύλ λα δηαπεξάζνπλ ην θπηηαξηθό ηνίρσκα [Πεηεηλάθε, 2007]. Θ.1.3. Φζνξηνθηλνιόλεο Οη Φζνξηνθηλνιόλεο, ζηηο νπνίεο αλήθεη θαη ε πεθινμαζίλε, δξνπλ αλαζηέιινληαο ηελ DNA-γπξάζε. Όκσο, ζηνπο εληεξνθόθθνπο, ε DNAγπξάζε πνπ θσδηθνπνηείηαη από ην γνλίδην qnr είλαη ηξνπνπνηεκέλε θαη έηζη νη θζνξηνθηλνιόλεο εκθαλίδνπλ κηθξή ζπγγέλεηα κε ην ελδπκν [Courvalin et al, 2006]. Θ.1.4. Ληλθνζακίδεο ηελ θαηεγνξία απηή αλήθεη θαη ε θιηληακπθίλε. Σν αληηβηνηηθό απηό δξα ζηελ 50S ππνκνλάδα ηνπ ξηβνζώκαηνο αλαζηέιινληαο ηελ πξσηετλνζύλζεζε. Ζ αληνρή ησλ εληεξνθόθθσλ ζε απηό, νθείιεηαη ζε ρξσκνζσκηθέο ή πιαζκηδηαθέο κεηαιιάμεηο ηεο 50S ππνκνλάδαο [Courvalin et al, 2006]. Θ.1.5. Σηξεπηνγξακκίλεο ηηο ζηξεπηνγξακκίλεο αλήθεη ην Quinupristin/Dalfopristin θαη έρνπλ παξόκνην κεραληζκό δξάζεο κε ηηο ιηλθνζακίδεο. Όινη νη εληεξόθνθθνη, εθηόο ηνπ Ε. faecium είλαη αλζεθηηθνί ζην Quinupristin/Dalfopristin [Courvalin et al, 2006]. 36

37 . Θ.1.6. Τξηκεζνπξίκε-ζνπιθακεζνμαδόιε Ζ ζπλεξγηθή δξάζε ησλ αληηβηνηηθώλ απηώλ αλαζηέιιεη ηνπο κεραληζκνύο ζύλζεζεο θπιιηθνύ νμέσο. Γελ είλαη απνηειεζκαηηθή, όκσο, γηα ηελ θαηαπνιέκηζε εληεξνθνθθηθήο ινίκσμεο γηαηί ν εληεξόθνθθνο κπνξεί λα πξνζιακβάλεη θπιιηθό νμύ από ην πεξηβάιινλ ηνπ [Πεηεηλάθε, 2007]. Θ.2. Δπίθηεηε Αλζεθηηθόηεηα Θ.2.1. Β-ιαθηακηθά αληηβηνηηθά Ζ επίθηεηε αληνρή ζηα β-ιαθηακηθά αληηβηνηηθά νθείιεηαη ζε κεηαιιάμεηο ή γνλίδηα πνπ νδεγνύλ είηε ζηελ πνζνηηθή αύμεζε ηεο PBP5, είηε ζηελ ηξνπνπνίεζε ηεο ζπγγέλεηαο κε ηελ PBP5 είηε ζηελ παξαγσγή πεληθηιιηλάζεο. Σν γνλίδην παξαγσγήο ηεο πεληθηιιηλάζεο εδξάδεηαη ζε πιαζκίδην [Courvalin et al, 2006]. Θ.2.2. Ακηλνγιπθνζίδεο Οη εληεξόθνθθνη απνθηνύλ πςεινύ επηπέδνπ αληνρή ζηηο ακηλνγιπθνζίδεο κε ηξεηο κεραληζκνύο: α) κεηαβνιή ζηε ζέζε ζηόρν ηνπ ξηβνζώκαηνο, β) παξέκβαζε ζηε κεηαθνξά ηνπ αληηβηνηηθνύ, θαη γ) ελδπκηθή δηάζπαζε ηνπ αληηβηνηηθνύ. Οη πξώηνη δπν κεραληζκνί νθείινληαη ζε ρξσκνζσκηθέο κεηαιιάμεηο, ελώ ν ηξίηνο κεραληζκόο θσδηθνπνηείηαη ζε πιαζκίδηα [Courvalin et al, 2006]. 37

38 Θ.2.3. Γιπθνπεπηίδηα Γύν γιπθνπεπηίδηα, ε Βαλθνκπθίλε θαη ε Σετθνπιαλίλε, νη νπνίεο δνπλ σο αλαζηνιείο ηεο ζύλζεζεο ηνπ θπηηαξηθνύ ηνηρώκαηνο, ρξεζηκνπνηνύληαη ζηελ Δπξώπε θαηά ηεο εληεξνθνθθηθήο ινίκσμεο. Οη πξώηνη εληεξόθνθθνη πνπ παξνπζίαζαλ αλζεθηηθόηεηα ζηα γιπθνπεπηίδηα απνκνλώζεθαλ ην ήκεξα είλαη γλσζηνί 6 δηαθνξεηηθνί ηύπνη αληνρήο ζηελ βαλθνκπθίλε, νη νπνίνη θσδηθνπνηνύληαη ζε ηζάξηζκα γνλίδηα. Σα γνλίδηα vana, vanb, vand, vane θαη vang απνηεινύλ επίθηεηα ραξαθηεξηζηηθά ησλ εληεξνθόθθσλ ελώ ην γνλίδην vanc απνηειεί εγγελέο γνλίδην ησλ E. gallinarum θαη E. casseliflavus. Οη δηαθνξέο ησλ ηύπσλ πεξηγξάθνληαη ζηνλ πίλαθα 6 [Courvalin et al., 2006]. Πίλαθαο 6. Γνλίδηα Αληίζηαζεο ζηελ Βαλθνκπθίλε Τύπνο VanA VanB VanC VanD VanE VanG Θέζε ηνπ Πιαζκίδην, ζπαλίσο Υξσκόζσκα Υξσκόζσκα, ζπαλίσο Υξσκόζσκα γνληδίνπ ζην Υξσκόζσκα ζε πιαζκίδην Αληίζηαζε Τςειή Πνηθίιεη Υακειή Δλδηάκεζε Υακειή Μεηαθνξά κέζσ ζύδεπμεο Ναη Ναη Όρη Όρη Όρη Ναη Δίδε E.faecalis E.faecalis E.gallinarum E. faecium E.faecalis E.faecalis E. faecium E.faecium E.casseliflavus E.faecalis E.gallinaru 38

39 m E.casseliflavus E. avium E. durans E. mundtii E. raffinosus Η. Μέζνδνη Αλίρλεπζεο Δληεξόθνθθσλ ζην Πεξηβάιινλ Οη κέζνδνη αλίρλεπζεο ησλ εληεξνθόθθσλ ζε πεξηβαιινληηθά δείγκαηα δηαθξίλνληαη ζε δύν θαηεγνξίεο, αλάινγα κε ην πνηά ραξαθηεξηζηηθά ηνπ κηθξννξγαληζκνύ δηεξεπλνύληαη: Οη κέζνδνη απηνί ρσξίδνληαη ζε θαηλνηππηθέο θαη γνλνηππηθέο. Οη θαηλνηππηθέο κέζνδνη, δηαθξίλνληαη ζε θιαζζηθέο θαιιηεξγεηηθέο θαη ζε βηνρεκηθέο κεζόδνπο. Όζνλ αθνξά ηηο πξώηεο, νη πεξηβαιινληηθνί εληεξόθθνθνη θαιιηεξγνύληαη ζην εθιεθηηθό ζξεπηηθό κέζν Slanetz & Bartley, γηα 48 ώξεο, ζηνπο 37C, ζηα πεξηζζόηεξα αλαιπηηθά εξγαζηήξηα, [Slanetz & Bartley, 1957] θαη ηα ζεηηθά ζηειέρε επηβεβαηώλνληαη κε ηε δνθηκαζία πδξόιπζεο ηεο εζθνπιίλεο, γηα 2 ώξεο ζηνπο 44C [Swan, 1954]. Γεύηεξε επηβεβαησηηθή δηαδηθαζία κπνξεί λα είλαη ε αλάπηπμε ζε Tryptic Soy Broth παξνπζία 6,5% NaCl, γηα 24 ώξεο, ζηνπο 37C. Ζ ηαπηνπνίεζε ησλ εληεξνθόθθσλ κε ηηο θαιιηεξγεηηθέο ηερληθέο γίλεηαη ζε επίπεδν είδνπο. ε επίπεδν γέλνπο ε ηαπηνπνίεζε κπνξεί λα γίλεη κε βηνηππία, δειαδή κε 39

40 βηνρεκηθά ηεζη, ηα νπνία πεξηιακβάλνπλ αληηδξάζεηο πνπ βαζίδνληαη ζηε ρξήζε πεγήο άλζξαθα, ελδύκσλ θαη ελίνηε αλζεηηθόηεηαο ζε αληηβηνηηθά. Άιιεο θαηλνηππηθέο ηερληθέο είλαη ε ειεθηξνθόξεζε πξσηετλώλ κε SDS- PAGE, ν θαηλόηππνο αληηβηνγξάκκαηνο θαη ε νξνηύπηζε κε ηε ρξήζε ηνπ D αληηγόλνπ [Domig, 2003]. Οη γνλνηππηθέο κέζνδνη αθνξνύλ ζύγρξνλεο κνξηαθέο ηερληθέο, νη νπνίεο ζηνρεύνπλ ην γελεηηθό πιηθό ηνπ κηθξννξγαληζκνύ. Μπνξεί λα επηηεπρζεί ηππνπνίεζε ζε επίπεδν είδνο κε κεγάιε επαηζζεζία, ελώ ζπρλά γίλεηαη νκαδνπνίεζε εληόο ηνπ είδνπο, αθόκε θαη πξνζδηνξηζκόο ζηειέρνπο θαη αληηπαξαβνιή ηνπ κε ηα δηεζλώο θαηαρσξεκέλα ζηειέρε. Οη κέζνδνη απηέο πεξηιακβάλνπλ ηερληθέο βαζηζκέλεο ζηελ ηερληθή ηεο αιπζηδσηήο αληίδξαζεο ηεο πνιπκεξάζεο (PCR) ή ηνλ πβξηδηζκό θαη ειεθηξνθόξεζε νιηθνύ ρξσκνζσκηθνύ DNA, είηε έπεηηα από πέςε κε πεξηνξηζηηθό έλδπκν ζε ζπρλέο ζέζεηο πέςεο (REA), είηε πέςε ζε ζπάληεο ζέζεηο θαη ειεθηξνθόξεζε ζε παιιόκελν ειεθηξηθό πεδίν (PFGE) [Domig, 2003]. Όιεο νη παξαπάλσ κέζνδνη απνηεινύλ ρξήζηκα εξγαιεία, ηόζν γηα ηνλ έιεγρν ηεο πνηόηεηαο ηνπ λεξνύ θαη ησλ ηξνθίκσλ, όζν θαη γηα ηελ αλίρλεπζε ηεο πεγήο ηνπ παζνγόλνπ θαη ηε κηθξνβηνινγηθή επηδεκηνινγηθή επηηήξεζε. Παξαθάησ πεξηγξάθνληαη αλαιπηηθά νη κεζνδνινγίεο πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ ζηελ παξνύζα εξγαζία. Η.1. Καιιηεξγεηηθέο Τερληθέο ύκθσλα κε ην πξόηππν ISO : 2000 γηα ηελ αλίρλεπζε θαη απαξίζκεζε πεξηβαιινληηθώλ εληεξνθόθθσλ ρξεζηκνπνηείηαη ην εθιεθηηθό ζηεξεό ζξεπηηθό πιηθό Slanetz & Bartley (SB). H ζύζηαζή ηνπ, ε νπνία δεκνζηεπηεθε ην 1957 από ηνπο L.W. Slanetz θαη Clara H. Bartley [Slanetz & Bartley, 1957], είλαη ε εμήο: ζε έλα ιίηξν απηνληζκέλν θαη απνζηεηξσκέλν λεξό πεξηιακβάλνληαη Tryptose 20.0 g, Yeast extract 5.0 g, Glucose 2.0 g, 40

41 Dipotassium phosphate K 2 HPO g, Sodium-αzide NaN g, 2,3,5 Triphenyl tetrazolium chloride 0.1 g, θαη Agar 10.0 g. Γηα ηελ δηαδηθαζία επηβεβαίσζεο ρξεζηκνπνηείηαη Bile-Aesculin Agar, ην νπνίν είλαη ζξεπηηθό πιηθό πνπ πεξηέρεη 40% ρνιή θαη εζθνπιίλε, ηελ νπνία νη εληεξόθνθθνη πδξνιύνπλ ζε πξντόληα ηα νπνία αληηδξνύλ κε ηνλ ηξηζζελή ζίδεξν πνπ πεξηέρεηαη ζην ζξεπηηθό κέζν θαη σο απνηέιεζκα παξάγνληαη αδηάιπηα άιαηα ζηδήξνπ ηα νπνία θαη ακαπξώλνπλ ην ζξεπηηθό πιηθό. Σν πιηθό απηό πεξηγξάθεθε ην 1954 από ηνλ Alexander Swan θαη πεξηέρεη ηελ εμήο ζύζηαζε: Peptone 5 g, Beef extract 3 g, Σαπξνρνιηθό λάηξην 40 g, Κηηξηθόο ζίδεξνο (FeC 6 H 5 O 7 ) 0.5 g, Δζθνπιίλε 1 g θαη Άγαξ 15 g, γηα έλα ιίηξν απηνληζκέλν λεξό. Σν πιηθό κόιηο παξαζθεπαζηεί απνζηεηξώλεηαη. Γηα ηελ δηεξεύλεζε ηεο αλάπηπμεο ζε πςειή ζπγθέληξσζε άιαηνο ησλ εληεξνθόθθσλ ρξεζηκνπνηείηαη Tryptic Soy Broth, ην νπνίν πεξηιακβάλεη Casein 17.0 g, Soybean Meal 3.0 g, Sodium Chloride 5.0 g, Dipotassium Phosphate 2.5 g, Dextrose 2.5 g γηα έλα ιίηξν δηαιύκαηνο. ε απηό πξνζηίζεηαη ρισξηνύρν λάηξην 6,5%. Γηα ηνλ δηαρσξηζκό E. faecalis θαη E. durans, ρξεζηκνπνηήζεθε ε αληίδξαζε δύκσζεο ηεο καλληηόιεο. Οη Δ. faecalis αλαπηύζζεηαη ζε mannitol agar ελώ ν Δ. durans όρη [Devriese et al, 1995]. ε έλα ιίηξν δηαιύκαηνο πεξηιακβάλνληαη Beef Extract 1.0 g, Pancreatic Digest of Casein 5.0 g, Peptic Digest of Animal Tissue 5.0 g, Sodium Chloride 75.0 g, D-Mannitol 10.0 g, Phenol Red g θαη Agar 15.0 g. Η.2 Φαηλνηππηθέο Τερληθέο Η.2.1. Φαηλόηππνο Αληηβηνγξάκκαηνο Ο θαηλόηππνο αληηβηνγξάκκαηνο, ή αιιηώο ε δηεξεύλεζε αληoρήο ζε αληηβηνηηθά απνηειεί κία ζπρλή πξαθηηθή όζνλ αθνξά ζηνπο πξνεξρόκελνπο από θιηληθά δείγκαηα εληεξόθνθθνπο. ηνπο πεξηβαιινληηθνύο εληεξόθνθθνπο 41

42 όκσο ειάρηζηεο κειέηεο έρνπλ γίλεη ζρεηηθά κε ηελ αληνρή ηνπο ζε αληηβηνηηθά [Γξακκέλνπ, 2005]. Πίλαθαο 7. Αληηβηνηηθά Όλνκα Έηνο Ταμηλόκεζε Λεηηνπξγία Πεληθηιιίλε 1929 Β-ιαθηάκεο Αλαζηνιή ηεο ζύλζεζεο ηνπ θπηηαξηθνύ ηνηρώκαηνο Υισξακθεληθόιε 1947 Ακθεληθόιεο Αλαζηνιή ηεο πξσηετλνζύλζεζεο Δξπζξνκπθίλε 1952 Μαθξνιίδεο Αλαζηνιή ηεο πξσηετλνζύλζεζεο Βαλθνκπθίλε 1956 Γιπθνπεπηίδηα Αλαζηνιή ηεο ζύλζεζεο ηνπ θπηηαξηθνύ ηνηρώκαηνο ηπξνθινμαζίλε 1981 Κηλνιόλεο Αλαζηνιή ηεο ζύλζεζεο ηνπ βαθηεξηαθνύ DNA Σετθνπιαλίλε 1988 Γιπθνπεπηίδηα Αλαζηνιή ηεο ζύλζεζεο ηνπ θπηηαξηθνύ ηνηρώκαηνο Quinupristin /Dalfopristin 1999 ηξεπηνγξακκίλεο Αλαζηνιή ηεο πξσηετλνζύλζεζεο 42

43 Η.2.2. Βηνρεκηθόο Φαηλόηππνο Vitek Αξρή ηεο κεζόδνπ: Ζ θάξηα αληηδξάζεσλ πεξηιακβάλεη ππνδνρέο πνπ πεξηέρνπλ ππνζηξώκαηα γηα δηάθνξεο κεηαβνιηθέο δξαζηεξηόηεηεο, όπσο νμύηεηα, αιθαιηθόηεηα, ελδπκηθή πδξόιπζε, αλάπηπμε παξνπζία αλαζηνιέσλ θ.ν.θ. ε απηήλ ηελ θάξηα κεηαθέξεηαη βαθηεξηαθό ελαηώξεκα ζνιεξόηεηαο 0,5 ηεο θιίκαθαο McFarland κέζσ ηξηρνεηδνύο ζσιελαξίνπ θαη αθνινπζεί επώαζε. Όιε ε δηαδηθαζία ιακβάλεη ρώξα εληόο θιεηζηνύ απηνκαηνπνηεκέλνπ ζπζηήκαηνο ην νπνίν θαηά ηε δηάξθεηα ηεο επώαζεο κεηξά αλά 15 ιεπηά ηελ δηαθνξά ζηελ νπηηθή ππθλόηεηα ζε θάζε πεγαδάθη, είηε απηή πξόθεηηαη γηα αύμεζε ηεο ζνιεξόηεηαο είηε γηα εκθάληζε έγρξσκνπ πξντόληνο. Οη αληηδξάζεηο νη νπνίεο ιακβάλνπλ ρώξα παξνπζηάδνληαη ζηνλ πίλαθα 8. Πίλαθαο 8. Βηνρεκηθέο Αληηδξάζεηο. Πεγή: Biomerieux S.A. A/A Υπόζηξσκα Πνζόηεηα 1 D-Amygdalin mg 2 Phosphatidylinositol Phospholipace C mg 3 D-Xylose 0.3 mg 4 Arginine Dihydrolase mg 5 β- Galactosidase mg 6 α- Glucosidase mg 43

44 7 Ala-Phe-Pro Arylamidase mg 8 Cyclodextrin 0.3 mg 9 L-aspartate Arylamidase mg 10 β-galactopyranosidase mg 11 α-mannosidase mg 12 Phosphatase mg 13 Leucine Arylamidase mg 14 L-Proline Arylamidase mg 15 β-glucuronidase mg 16 α- Galactosidase mg 17 L-Pyrrolidonyl- Arylamidase mg 18 β-glucuronidase mg 19 Alanine Arylamidase mg 20 Tyrosine Arylamidase mg 21 D- Sorbitol mg 44

45 22 Urease 0.15 mg 23 Polymixin B Resistance mg 24 D-Galactose 0.3 mg 25 D-Ribose 0.3 mg 26 L-Lactate alkalization 0.15 mg 27 Lactose 0.96 mg 28 N-Acetyl- D- Glucosamine 0.3 mg 29 D-Maltose 0.3 mg 30 Bacitracin Resistance mg 31 Novobiocin Resistance mg 32 Growth in 6,5% NaCl 1.68 mg 33 D-Mannitol mg 34 D-Mannose 0.3 mg 35 Methyl- B-D- Glucopyranoside 0.3 mg 36 Pullulan 0.3 mg 45

46 37 D-raffinose 0.3 mg 38 O/129 Resistance mg 39 Salicin 0.3 mg 40 Saccharose/Sucrose 0.3 mg 41 D-Trehalose 0.3 mg 42 Arginine Dihydrolase mg 43 Optochin Resistance mg Η.3 Γνλνηππηθέο Τερληθέο Η.3.1 Ζιεθηξνθόξεζε ζε Παιιόκελν Ζιεθηξηθό Πεδίν: Gel Electrophoresis (PFGE) Pulsed-Field Αξρή ηεο Μεζόδνπ: Σν νιηθό ρξσκνζσκηθό DNA ηνπ βαθηεξίνπ απνκνλώλεηαη κέζα ζε δίζθνπο αγαξόδεο, πέπηεηαη κε πεξηνξηζηηθό έλδπκν πνπ αλαγλσξίδεη ζπάληεο ζέζεηο δξάζεο θαη αθνινπζεί ειεθηξνθόξεζε ζε παιιόκελν ειεθηξηθό πεδίν, αθνύ ε ηππηθή ειεθηξνθόξεζε δελ κπνξεί λα δηαρσξίζεη κεγάια ηκήκαηα DNA. Σν απνηέιεζκα είλαη ε δεκηνπξγία δσλώζεσλ ραξαθηεξηζηηθώλ γηα θάζε είδνο βαθηεξίνπ. Δπεηδή ρξεζηκνπνηείηαη έλδπκν ζπάληαο ζέζεο πεξηνξηζκνύ, ηα πξόηππα ησλ δσλώζεσλ ηνπ δεκηνπξγνύληαη είλαη ζρεηηθά ζπληεξεκέλα. Σν έλδπκν πνπ ρξεζηκνπνηείηαη είλαη ην SmaI, ην νπνίν πξνέξρεηαη από ηελ Serratia 46

47 marcescens. Αλαγλσξίδεη ηελ αιιεινπρία 5 -CCCGGG-3 θαη πέπηεη ην DNA δεκηνπξγώληαο ιεία άθξα (blunt ends) ζην ζεκείν 5 -CCC / GGG-3 [McParland et al, 1976]. Σν απνηέιεζκα ηεο ειεθηξνθόξηζεο νιηθνύ ρξσκνζσκηθνύ DNA ηνπ εληεξνθόθθνπ ζε παιιόκελν ειεθηξηθό πεδίν θαίλεηαη ζηελ εηθόλα 6. Δηθόλα 6. Ζιεθηξνθόξεζε νιηθνύ ρξσκνζσκηθνύ DNA ηνπ εληεξνθόθθνπ ζε παιιόκελν ειεθηξηθό πεδίν. Ζ πξώηε θαη ε ηειεπηαία ζηήιε είλαη Lambda Ladder PFGE Marker. Πεγή: Δξγαζηήξην Μηθξνβηνινγίαο, Π. Παηξώλ 47

48 48

49 θνπόο θνπόο ηεο παξνύζαο κειέηεο ήηαλ ε κειέηε ησλ θαηλνηππηθώλ θαη γνλνηππηθώλ ραξαθηεξηζηηθώλ ησλ εηδώλ εληεξνθόθθσλ πνπ βξίζθνληαη ζην πεξηβάιινλ ηεο γεσγξαθηθήο πεξηνρήο ηνπ λνκνύ Αραΐαο θαη ε ζπζρέηηζή ηνπο κε ηα είδε εληεξνθόθθσλ πνπ απνκνλώλνληαη από θιηληθά ζηειέρε ηνπ Γεληθνύ Παλεπηζηεκηαθνύ Ννζνθνκείνπ ηνπ Ρίνπ, κε ζηόρν λα δηαπηζησζεί: Ζ νηθνινγία ησλ εληεξνθόθθσλ ζην πεξηβάιινλ ηνπ λνκνύ Ζ πξνέιεπζή ηνπο θαη αλ απηή ζρεηίδεηαη κε ηελ πξνέιεπζε ησλ θιηληθώλ εηδώλ, όπσο θαη ν θύθινο κεηάδνζήο ηνπο Ζ εκθάληζε αληνρήο ζε αληηβηνηηθά θαη ε δηαζπνξά ηνπο ζην πεξηβάιινλ Δάλ νη κεζνδνινγίεο κειέηεο ησλ θιηληθώλ ζηειερώλ είλαη εθαξκόζηκεο ζε πεξηβαιινληηθά δείγκαηα Δάλ κπνξεί ε ζπζρέηηζε απηή λα ζπκβάιιεη ζηελ επηδεκηνινγηθή επηηήξεζε ηνπ πεξηβάιινληνο ηνπ λνκνύ θαη ζηελ δηαζθάιηζε ηεο δεκόζηαο πγείαο. 49