ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Αλληλεπίδραση του γονιδίου wiser με άλλα γονίδια που εμπλέκονται στην ανάπτυξη των φτερών στην Drosophila melanogaster ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Παπαλεωνιδόπουλος Βασίλειος Βιολόγος ΠΑΤΡΑ, Δεκέμβριος 2012

2 Τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Γιαννόπουλος Γεώργιος Καθηγητής Κίλιας Γεώργιος Αναπληρωτής Καθηγητής Στεφάνου Γεωργία Καθηγήτρια Ο Επιβλέπων Καθηγητής Κίλιας Γεώργιος Αναπληρωτής Καθηγητής Η έγκριση της διατριβής για την απόκτηση Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης από το Τμήμα Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. Ν. 5343/1392, άρθρο

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Γενετικής του τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης του Πανεπιστημίου Πατρών κατά το ακαδημαϊκά έτη και αποτελεί τμήμα της έρευνας που πραγματοποιείται στο εργαστήριο αυτό. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Κίλια Γεώργιο για την ευκαιρία που μου έδωσε να ασχοληθώ με κάτι που πραγματικά με ενδιαφέρει, την Γενετική, για όσα με δίδαξε και για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε όλο αυτό το χρονικό διάστημα. Επίσης ευχαριστώ θερμά τον καθηγητή κ. Γιαννόπουλο Γεώργιο για την καθοδήγηση, τις συμβουλές του και την ανεκτίμητη βοήθειά του σε οποιοδήποτε θέμα προέκυπτε, καθώς και την καθηγήτρια κα Στεφάνου Γεωργία για την συμμετοχή της στην τριμελή εξεταστική επιτροπή. Ακόμα θα ήθελα να ευχαριστήσω την καθηγήτρια κα Ζαχαροπούλου Αντιγόνη για την βοήθεια και τις συμβουλές της. Ευχαριστώ τους γονείς μου, Γεώργιο και Ασπασία, για την υποστήριξή τους όλα αυτά τα χρόνια, τόσο υλική όσο και ψυχολογική, χωρίς την οποία δεν θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί κανένας μου στόχος. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω την υποψήφια διδάκτορα Παπαϊωάννου Χαρίκλεια για τις συμβουλές της, για την βοήθεια σε κάποιες πειραματικές πορείες και κυρίως για το ευχάριστο κλίμα που επικρατούσε στο εργαστήριο λόγω της παρουσίας της. Πάτρα, Δεκέμβριος

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ H Drosophila melanogaster ως οργανισμός μοντέλο Βιολογικός κύκλος της Drosophila melanogaster Η ανάπτυξη των εμβρυϊκών δίσκων στη Drosophila melanogaster Ανάπτυξη των φτερών της Drosophila melanogaster Προσδιορισμός του ραχιοκοιλιακού άξονα του φτερού Το σηματοδοτικό μονοπάτι Notch Σχηματισμός του προσθοπίσθιου άξονα Τα Ρ μεταθέσιμα γενετικά στοιχεία ως εργαλεία γενετικής, μοριακής και γονιδιωματικής ανάλυσης στην Drosophila melanogaster Η μετάλλαξη wisertsl του γονίδιο lawc (CG32711) Σκοπός της παρούσας διατριβής ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Βιολογικό υλικό Μέθοδος καλλιέργειας Στελέχη Απομόνωση γονιδιωματικού DNA από ακμαία άτομα Drosophila melanogaster Με τη μέθοδο CTAB Με τη τυποποιημένη συσκευασία απομόνωσης DNA της εταιρίας Macherey Nagel με τη μέθοδο Nucleospin Tissue Απομόνωση ολικού RNA από ακμαία άτομα Drosophila melanogaster Με την τυποποιημένη συσκευασία Nucleospin RNA II kit (Macherey-Nagel) Ποσοτικός προσδιορισμός DNA και RNA μορίων Με φασματοφωτομέτρηση Με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης Απομόνωση DNA από πήκτωμα αγαρόζης Πέψη DNA με ένζυμα περιορισμού Αντίδραση σύνδεσης μορίων DNA 44 4

5 Αντιδράσεις αυτο-σύνδεσης μορίων DNA Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction PCR) PCR Αντίστροφη PCR (Inverse PCR) Αντίστροφη μεταγραφή PCR (Reverse Transcription PCR, RT PCR) Πρωτόκολλο καθαρισμού προϊόντων PCR με τη μέθοδο Nucleospin Extract II, από το kit καθαρισμού προϊόντων PCR της εταιρίας Macherey Nagel (με τροποποιήσεις) Χρώση με X-gal σε εμβρυικούς δίσκους προνυμφών τρίτου σταδίου Διαλύματα ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γενετική αλληλεπίδραση του γονιδίου lawc με το γονίδιο apterous (ap) στην ανάπτυξη των φτερών με τη χρήση της μετάλλαξης wisertsl Γενετική αλληλεπίδραση του γονιδίου lawc με το γονίδιο fringe (fng) Το γονίδιο lawc αλληλεπιδρά γενετικά με το γονίδιο Serrate (Ser) Υπερέκφραση των γονιδίων ap, fng, Ser και Chip με οδηγό το ap-gal4 διασώζουν το φαινότυπο wisertsl στα άτομα του γενοτύπου wisertsl;ap- Gal4/CyO Υπερέκφραση του UAS-apDP00390 (Α) και του διαγονιδίου UAS-osa (Β) με οδηγό το ap-gal4 δίνουν άτομα με παραμορφωμένα φτερά Υπερέκφραση του διαγονιδίου UAS-Dl με οδηγό ap-gal4 δίνει παραμορφωμένα άτομα wisertsl; ap-gal4/ UAS-Dl Συνδυασμένη δράση των μεταλλάξεων wisertsl και Βx1 στην ανάπτυξη των φτερών Ο φαινότυπος wisertsl οφείλεται σε μειωμένη έκφραση του γονιδίου Notch Μοριακή χαρτογράφηση της μετάλλαξης ΝGY ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 75 5.ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

6 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 6

7 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 H Drosophila melanogaster ως οργανισμός μοντέλο Η Drosophila melanogaster (η γνωστή μας ξυδόμυγα ή φρουτόμυγα) πρωτοχρησιμοποίηθηκε ως πειραματόζωο για γενετικές μελέτες από τον Thomas Hunt Morgan το Τα αποτελέσματα των ερευνών του και των συνεργατών οδήγησαν στην ανακάλυψη ότι τα γονίδια βρίσκονται στα χρωμοσώματα, επιβεβαιώνοντας έτσι τη χρωμοσωμική θεωρία της κληρονομικότητας που είχε διατυπωθεί από τους Bovery και Sutton το 1904, και ότι κατέχουν συγκεκριμένες θέσεις πάνω σ αυτά. Ο Morgan επέλεξε την Drosophila melanogaster ως πειραματόζωο γιατί μπορεί να καλλιεργηθεί στο εργαστήριο εύκολα και φθηνά, δεν καταλαμβάνει πολύ χώρο, έχει χρόνο γενιάς 12 ημερών στους 25οC και παράγει μεγάλο αριθμό απογόνων. Ο οργανισμός αυτός έχει και άλλα πλεονεκτήματα που διευκόλυναν τη γενετική ανάλυση. Πιο συγκεκριμένα δεν υπάρχει μειωτικός ανασυνδυασμός (διασκελισμός) στα αρσενικά άτομα, γεγονός που διευκολύνει τη γενετική ανάλυση. Επίσης έχει τέσσερα χρωμοσώματα. Το Χ ή φυλοσύνδετο που είναι ακροκεντρικό, το 2 ο και 3ο που είναι μεσοκεντρικά και το τέταρτο που είναι πολύ μικρό. Το πιο ενδιαφέρον με τα χρωμοσώματα της Drosophila melanogaster είναι ότι στους σιελογόνους αδένες των προνυμφών 3ου σταδίου είναι μεγάλα και πλατιά λόγω του πολυταινισμού που υφίστανται και είναι γνωστά ως γιγάντια ή πολυταινικά χρωμοσώματα. Τα πολυταινικά χρωμοσώματα, είναι εύκολα ορατά στο μικροσκόπιο, με αποτέλεσμα να δημιουργηθούν και χρωμοσωμικοί χάρτες που δείχνουν τη δομή του καθενός που είναι διαφορετική από τη δομή των άλλων. Το γεγονός αυτό βοήθησε στη κυτταρολογική χαρτογράφηση των γονίδιων. Χρωμοσωμικά ελλείμματα, αναστροφές, μετατοπίσεις, μεταθέσεις, γονίδια, αλλά και διαγονίδια (με την τεχνική της in situ υβριδοποίησης) μπορούν εύκολα να γίνουν ορατά στο μικροσκόπιο και να προσδιοριστεί εύκολα η θέση τους. Έτσι μετά τους γενετικούς χάρτες δημιουργήθηκαν και οι κυτταρογενετικοί χάρτες. Η Drosophila, ως έντομο, έχει πολλά εμφανή εξωτερικά χαρακτηριστικά, όπως φτερά, πόδια, μάτια, σμήριγγες κ.λ.π., που μπορούν να επηρεαστούν από μεταλλάξεις και τα μεταλλαγμένα άτομα να παρατηρηθούν στο στερεοσκόπιο. Στη συνέχεια μπορούν να προσδιορισθούν και να μελετηθούν τα γονίδια που μεταλλάχθηκαν. 7

8 1.2 Βιολογικός κύκλος της Drosophila melanogaster Η Drosophila melanogaster είναι έντομο ολομετάβολο. Ο κύκλος ζωής της περιλαμβάνει το αυγό, στο οποίο αναπτύσσεται το έμβρυο, τρία προνυμφικά στάδια (προνύμφες 1ου, 2ου, και 3ου σταδίου), το στάδιο της νύμφης και το ακμαίο άτομο (Εικόνα 1.1). Κατά την διάρκεια της νύμφης, συμβαίνει μια πλήρης μεταμόρφωση με όλες σχεδόν τις προνυμφικές δομές να ιστολύονται και να αντικαθίστανται από τις δομές του ακμαίου ατόμου, εκτός από τους εμβρυϊκούς δίσκους όπως θα δούμε παρακάτω. Εικόνα 1.1 Κύκλος ζωής του πειραματικού εντόμου Drosophila melanogaster. Από Η εμβρυική ανάπτυξη είμαι μια συνεχής διαδικασία κατά την οποία συμβαίνουν πολλές τροποποιήσεις του γονιμοποιημένου αυγού σε ένα περιορισμένο χρονικό διάστημα. Παρόλο που η εμβρυική ανάπτυξη είναι μια συνεχής διαδικασία, για την καλύτερη κατανόηση υποδιαιρείται σε στάδια που μας παρέχουν ένα χρονικό πλαίσιο των γεγονότων που λαμβάνουν χώρα σε κάθε στάδιο. Πιο συγκεκριμένα, αμέσως μετά την γονιμοποίηση οι ζυγωτικοί πυρήνες διαιρούνται δεκατρείς φορές πριν συμβεί η κυτταροποίηση του βλαστοδέρματος. Οι επτά πρώτες είναι συγχρονισμένες 8

9 και έχουν ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός συγκυτίου που αποτελείται από 128 πυρήνες, κατανεμημένους το κέντρο της λεκίθου του αυγού. Κατά τη διάρκεια των επόμενων τριών διαιρέσεων οι περισσότεροι πυρήνες μετακινούνται στην περιφέρεια του αυγού για να σχηματίσουν το κυτταρικό βλαστόδερμα. Όμως περίπου 26 πυρήνες παραμένουν στο κέντρο του αυγού μετά τον έβδομο κύκλο και άλλοι 2 με 3 μεταναστεύουν στο οπίσθιο πολικό πλάσμα μετά τον όγδοο κύκλο, για να σχηματίσουν μετά από δύο με τρεις διαιρέσεις τα πολικά κύτταρα. Τα κύτταρα αυτά αποτελούν τα πρόδρομα γεννητικά κύτταρα (γαμέτες). Τα κύτταρα που βρίσκονται στην επιφάνεια του αυγού θα διαιρεθούν, ασύγχρονα πλέον, άλλες δύο με τρεις φορές ώστε οι πυρήνες του συγκυτιακού βλαστοδέρματος να φτάσουν στους (Εικόνα 1.2). Εικόνα 1.2 Διαιρέσεις του πυρήνα και μετανάστευση κατά την εμβρυογένεση της Drosophila melanogaster. Η πρώτη διαίρεση συμβαίνει μετά την σύντηξη των προπυρήνων του ωαρίου και του σπερματοζωαρίου. Τα πολικά κύτταρα (pole cells) σχηματίζονται στο οπίσθιο άκρο του εμβρύου. Μετά το τέλος της 13ης διαίρεσης έχουμε το κυτταροποιημένο έμβρυο. Στη συνέχεια σχηματίζονται οι κυτταρικές μεμβράνες οπότε το έμβρυο θα εισέλθει στο στάδιο του κυτταρικού βλαστοδέρματος, το οποίο θα ολοκληρωθεί αργότερα όταν τα εμβρυϊκά κύτταρα είναι τελείως διαχωρισμένα μεταξύ τους και θα 9

10 έχουν σχηματίσει τα σωματικά κύτταρα. Το κυτταρικό βλαστόδερμα δεν εμφανίζει τοπικές διαφορές στο σχήμα και στο μέγεθος των κυττάρων. Ακολουθεί η γαστριδίωση, δηλαδή, ο σχηματισμός των βλαστικών στιβάδων, με τη σταδιακή εγκόλπωση μιας σειράς κυττάρων που βρίσκονται κατά μήκος της μέσης κοιλιακής γραμμής του εμβρύου και έχει ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό ενός σωλήνα στο εσωτερικό του εμβρύου (Εικόνα 1.3). Η ανάπτυξη συνεχίζεται με την επιμήκυνση της βλαστικής ζώνης (germ band elongation), μιας ομάδας κυττάρων που είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη των μεταμεριδίων του εμβρύου. Εικόνα 1.3 Επισκόπηση της εμβρυογένεσης στη Drosophila melanogaster. Όλα τα έμβρυα είναι σε πλάγια όψη με τη ραχιαία πλευρά προς τα επάνω. Οι ενδείξεις έχουν ως εξής: με κόκκινο χρώμα σημαίνονται το ενδόδερμα και το μεσέντερο, με πράσινο το μεσόδερμα, με μωβ το κεντρικό νευρικό σύστημα, με μπλε το οπίσθιο και το πρόσθιο τμήμα του εντέρου και με κίτρινο τα πολικά κύτταρα. amg: αρχικό μεσέντερο, br: εγκέφαλος, cf: κεφαλική αύλακα, cl: χειλικός χόνδρος, df: ραχιαία αναδίπλωση, dr: ραχιαία κορυφή, es: οισοφάγος, gb: βλαστική ζώνη, go: γονάδες, hg: οπισθέντερο, lb: χειλικό εκβλάστημα, md: εκβλάστημα κάτω γνάθου, mg: μεσέντερο, mg: μαλπιγγιανά σωληνάρια, mx: εκβλάστημα της κάτω γνάθου, pc: πολικά κύτταρα, pmg: οπίσθιο μεσέντερο pnb:νευροβλάστες του προκέφαλου, pro: προκέφαλο, ps: οπίσθια σωληνάρια, sg: σιελογόνοι αδένες, vf: κοιλιακή αύλακα, vnc: κοιλιακή νευρική χορδή. 10

11 Κατά τη διάρκεια της γαστριδίωσης και της επιμήκυνσης της βλαστικής ζώνης, σχηματίζεται η κεφαλική αύλακα που χωρίζει τη μελλοντική κεφαλή (προκεφαλή) από το υπόλοιπο σώμα. Ακολουθεί η ανάπτυξη του νευρικού συστήματος, με πρώτο βήμα το διαχωρισμό των νευροβλαστών από την εξωδερμική κυτταρική στιβάδα. Μετά το διαχωρισμό, οι νευροβλάστες κατανέμονται με ένα συγκεκριμένο πρότυπο στο χώρο και μετά από 9 συνεχείς διαιρέσεις θα δώσουν τα νευρικά κύτταρα. Οι τελευταίες μορφογενετικές κινήσεις που συμβαίνουν στο έμβρυο είναι η σύμπτυξη της βλαστικής ζώνης (germ band shortening) η οποία οδηγεί στην πλήρη ανάπτυξη του πεπτικού σωλήνα, το σχηματισμό των γονάδων, το ραχιαίο κλείσιμο του σώματος του εμβρύου και την κεφαλική εγκόλπωση που θα οδηγήσει τον σχηματισμό των μερών της κεφαλής. 1.3 Η ανάπτυξη των εμβρυϊκών δίσκων στη Drosophila melanogaster Οι εξωτερικές δομές του ακμαίου ατόμου προέρχονται από την ανάπτυξη των εμβρυϊκών δίσκων οι οποίοι σχηματίζονται κατά την εμβρυική ανάπτυξη ως δομές που μοιάζουν με μικρά συσσωματώματα κυττάρων. Τα κύτταρα αυτά διαιρούνται κατά το 1ο προνυμφικό στάδιο και σχηματίζουν μεγάλους επιθηλιακούς σάκους, που παίρνουν την τελική τους μορφή στο στάδιο της προνύμφης τρίτου σταδίου. Υπάρχουν 10 ζευγάρια εμβρυικών δίσκων. Το κάθε ζευγάρι έχει συγκεκριμένο σχήμα και μέγεθος και παίρνει το όνομά του από το μέρος των εξωτερικών δομών σώματος που θα σχηματίσει. Έτσι υπάρχουν οι εμβρυικοί δίσκοι των φτερών, των ποδιών, των ματιών-κεραιών, των αλτήρων κλπ. (Εικόνα 1.4). Οι εμβρυικοί δίσκοι δεν ιστολύονται στο στάδιο της νύμφης, αλλά αναπτύσσονται προοδευτικά και σχηματίζουν τις δομές του ακμαίου ατόμου για τις οποίες προορίζονται. 11

12 Εικόνα 1.4 Εμβρυϊκοί δίσκοι και οι δομές που προκύπτουν από αυτούς στο ακμαίο άτομο. Αριστερά: Προνύμφη τρίτου σταδίου και οι θέσεις όλων των εμβρυικών δίσκων στο εσωτερικό της. Στη μέση, φαίνονται όλοι οι εμβρυικοί δίσκοι σε μεγέθυνση. Δεξιά: Το σώμα της ώριμης μύγας όπου διακρίνεται το κυρίως σώμα και τα εξωτερικά τμήματά του που προέρχονται από κάθε δίσκο 1.4 Ανάπτυξη των φτερών της Drosophila melanogaster Τα φτερά της Drosophila melanogaster αναπτύσσονται από τους εμβρυϊκούς δίσκους των φτερών. Ο εμβρυϊκός δίσκος του φτερού αποτελεί ένα σημαντικό πειραματικό σύστημα για τη μελέτη των αρχών που διέπουν τη μορφογένεση και την οργανογένεση κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Στους νεοσχηματιζόμενους ιστούς, τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται και μπορούν να αναμιχθούν ελεύθερα. Όμως, σε ορισμένους ιστούς, τα κύτταρα και οι απόγονοί τους, προκειμένου να υπάρξει σωστή ανάπτυξη, περιορίζονται σε συγκεκριμένες περιοχές που ονομάζονται διαμερίσματα (compartments). Το σημείο στο οποίο συναντώνται δύο συμπληρωματικά διαμερίσματα, ονομάζεται όριο διαμερίσματος (compartment boundary). Ένα χαρακτηριστικό των ορίων είναι ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην οργάνωση του ιστού, διαχωρίζοντας τον σε ξεχωριστές περιοχές. Στην κάθε περιοχή συμβαίνει η 12

13 σύνθεση ενός διαφορετικού μορφογόνου παράγοντα, που καθορίζει την περαιτέρω διαφοροποίηση των κυττάρων σε κάθε διαμέρισμα, όπως θα αναλύσουμε παρακάτω. Εικόνα 1.5 Διαμερισματοποίηση και έκφραση γονιδίων στο αναπτυσσόμενο φτερό. Α: εμπρόσθιο διαμέρισμα (anterior), Ρ: οπίσθιο διαμέρισμα (posterior), D: ραχιαίο διαμέρισμα (dorsal), V: κοιλιακό διαμέρισμα (ventral), margin: περιφέρεια φτερού, wing blade: περιοχή πτέρυγας, en: engrailed (μπλε) ap: apterous (κίτρινο). Η έκφραση του γονιδίου apterous καθορίζει το ραχίαιο διαμέρισμα του εμβρυϊκού δίσκου του φτερού, ενώ η έκφραση του γονιδίου engrailed είναι υπεύθυνη για τον καθορισμό του οπισθίου διαμερίσματος του δίσκου. Ο σχηματισμός του εμβρυϊκού δίσκου του φτερού ρυθμίζεται από οργανωτές που εντοπίζονται στο ραχιαίο και στο οπίσθιο διαμέρισμα. Οι οργανωτές είναι ομάδες κυττάρων με καθορισμένη θέση στα διαμερίσματα, οι οποίοι εκκρίνουν σηματοδοτικά μόρια που μπορούν να δρουν σε κάποια απόσταση από τον οργανωτή. Τα όρια που σχηματίζονται μεταξύ του ραχιαίου και κοιλιακού διαμερίσματος και του πρόσθιου και του οπίσθιου, αποτελούν τους αντίστοιχους άξονες του φτερού, το ραχιοκοιλιακό και τον προσθοπίσθιο. Ο καθορισμός των διαμερισμάτων είναι αποτέλεσμα της περιορισμένης έκφρασης του γονιδίου καθοριστή (selector gene) σε κάθε διαμέρισμα. Το γονίδιο καθοριστής εκφράζεται μόνο στην ομάδα κυττάρων που θα αποτελέσει το συγκεκριμένο διαμέρισμα αλλά όχι στο συμπληρωματικό του, δρώντας έτσι σαν ένας δυαδικός διακόπτης που ελέγχει την ταυτότητα των κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα στο 13

14 ραχιαίο διαμέρισμα εκφράζεται το γονίδιο καθοριστής apterous, ενώ στο οπίσθιο διαμέρισμα εκφράζεται το γονίδιο καθοριστής engrailed (Εικόνα 1.5). Ο έλεγχος της έκφρασης γονιδίων έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό συγκεκριμένων δομών του ενήλικου ατόμου από το κάθε διαμέρισμα, αλλά και την παρεμπόδιση των κυττάρων του κάθε διαμερίσματος να αναμιχθούν με κύτταρα του συμπληρωματικού του διαμερίσματος και να εμποδίσουν τη σωστή ανάπτυξη του φτερού. 1.5 Προσδιορισμός του ραχιοκοιλιακού άξονα του φτερού Τα κυριότερα γονίδια που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του φτερού, είναι το apterous (ap), το vestigial (vg), το engrailed (en), τα γονίδια που εμπλέκονται στα σηματοδοτικά μονοπάτια Notch (N), Decapentaplegic (Dpp), Wingless (Wg) και Hedgehog (Hh) καθώς και όλα τα γονίδια, γνωστά και άγνωστα, τα οποία όταν υποστούν κάποια μετάλλαξη, επηρεάζουν την κανονική ανάπτυξη του φτερού. Ο ραχιοκοιλιακός άξονας, που διαιρεί τον εμβρυικό δίσκο του φτερού στο ραχιαίο και το κοιλιακό διαμέρισμα, καθορίζεται από το γονίδιο apterous (ap), που εκφράζεται μόνο στα κύτταρα του ραχιαίου διαμέρισματος (Εικόνα 1.6). Η έκφραση του ap στο ραχιαίο διαμέρισμα του φτερού εξαρτάται από το σηματοδοτικό μονοπάτι του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF), που καθορίζεται από την πρόσδεση της πρωτεΐνης Vein. Η πρωτεΐνη Ap ανήκει στην οικογένεια των LIM-HD μεταγραφικών παραγόντων και για την εκδήλωση της δράσης της χρειάζεται να σχηματίσει ένα σύμπλοκο με τον παράγοντα της οικογένειας LDB (Lim Domain Binding), που στη Drosophila είναι η πρωτεΐνη Chip. Οι πρωτεΐνες Ap και Chip σχηματίζουν ένα λειτουργικό τετραμερές σύμπλοκο της μορφής Ap-Chip-Chip-Ap (Εικόνα 1.7). Επίσης για τον σωστό και λειτουργικό σχηματισμό του τετραμερούς συμπλόκου συμμετέχει και η πρωτεΐνη Ssdp, η οποία προσδένεται στην πρωτεΐνη Chip και σταθεροποιεί το σύμπλοκο που σχηματίζει με την πρωτεΐνη Ap, αποτρέποντας την αποικοδόμησή του από το πρωτεάσωμα. 14

15 Εικόνα 1.6 a) Ο καθορισμός του ορίου του πρόσθιου (Α) και του οπίσθιου (Ρ) διαμερίσματος εξαρτάται από τους παράγοντες EN: Engrailed, HH: Hedgehog, DPP: Decapentaplegic. b) Ο καθορισμός του ορίου του ραχιαίου (D) και του κοιλιακού (V) διαμερίσματος εξαρτάται από την έκφραση των παραγόντων AP: Apterous, SER: Serrate, DL: Delta, WG: Wingless. Με την πρωτεΐνη Chip αλληλεπιδρά και η πρωτεΐνη dlmo (Lim-Only), η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο Beadex (Bx). Η πρωτεΐνη Bx ανταγωνίζεται την πρωτεΐνη Ap για την πρόσδεση στον συμπαράγοντα Chip και έτσι μειώνει, μέσω της δημιουργίας του διμερούς dlmo-chip, τον αριθμό των τετραμερών Ap-Chip-ChipAp και επομένως και την ένταση της δράσης της πρωτεΐνης Ap. Μέσω αυτών των αλληλεπιδράσεων ελέγχεται η σωστή δράση της πρωτεΐνης Ap κατά την ανάπτυξη του φτερού, αλλά και της dlmo. Στο 2ο προνυμφικό η πρωτεΐνη Αp αυξάνει τη έκφραση της πρωτεΐνης dlmo. Η δράση του παράγοντα Apterous στην ανάπτυξη του φτερού στην Drosophila ρυθμίζεται και από το σύμπλοκο των παραγόντων Osa και Brm. Το γονίδιο osa ανήκει στην οικογένεια των γονιδίων trithorax και κωδικοποιεί μία μεγάλη πρωτεΐνη, η οποία αλληλεπιδρά με περιοχές του DNA που είναι πλούσιες σε αδενίνη και θυμίνη. Η πρωτεΐνη Osa αποτελεί μέρος του συμπλόκου Brahma (Brm) που έχει την ιδιότητα να τροποποιεί τη δομή της χρωματίνης. Πιο συγκεκριμένα το παραπάνω σύμπλοκο υδρολύει ATP και καταλύει μία αντίδραση κατά την οποία τροποποιούνται τα νουκλεοσώματα που βρίσκονται προσδεδεμένα στο DNA, με τέτοιο τρόπο που να 15

16 μπορούν να προσδεθούν πάνω του μεταγραφικοί παράγοντες. Μέσω αυτού του μηχανισμού επάγουν ή καταστέλλουν τη δράση πολλών γονιδίων. Εικόνα 1.7 A) Σχηματισμός του τετραμερούς συμπλόκου Ap-Chip-Chip-Ap που δρα ως μεταγραφικός παράγοντας. B) Tο τετραμερές σύμπλοκο Ap-Chip μειώνεται όταν δεν υπάρχει περίσσεια του παράγοντα Ap, με αποτέλεσμα τη μείωση της ενεργότητας της πρωτεΐνης Ap. Για παράδειγμα, καταστέλλουν την έκφραση των γονιδίων στόχων του παράγοντα Wingless αλλά είναι και θετικοί ρυθμιστές της δράσης του παράγοντα Apterous. Η θετική ρύθμιση επιτυγχάνεται από την πρόσδεση του Osa στον παράγοντα Chip, που με την βοήθεια και άλλων παραγόντων προσδένονται σε ρυθμιστικές περιοχές γονιδίων όπως το dlmo και καταστέλλουν την δράση του. Η καταστολή της δράσης της dlmo επιτρέπει την κανονική δράση της πρωτεΐνης Ap, καθότι δε μειώνεται ο αριθμός των τετραμερών Ap-Chip-Chip-Ap που αναφέραμε παραπάνω. Το σύμπλοκο Brahma παίζει σημαντικό ρόλο και στην μεταγραφή γονιδίων που μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση ΙΙ, οπότε ο παράγοντας Osa έχει αντίκτυπο σε όλα τα γονίδια που εκφράζονται κατά την ανάπτυξη του φτερού. Σπουδαίος θεωρείται ο ρόλος του παράγοντα Osa και στην διαδικασία σηματοδότησης μέσω του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (μονοπάτι Epidermal Growth Factor Receptor-EGFR) κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του φτερού και ιδιαίτερα κατά των σχηματισμό των φλεβών τους, καθώς είναι υπεύθυνος για την τροποποίηση των ρυθμιστικών περιοχών των γονιδίων να αποκρίνονται ή όχι σε μεταγραφικούς παράγοντες. 16

17 Εικόνα 1.8 Σχηματική παράσταση του εμβρυικού δίσκου του φτερού σε προνύμφες τρίτου σταδίου (α) και του φτερού σε ενήλικο άτομο (β). Τα χρώματα αντιστοιχούν στις διάφορες δομές και στα δύο αναπτυξιακά στάδια. 1.6 Το σηματοδοτικό μονοπάτι Notch Στη Drosophila melanogaster το γονίδιο Notch πρωτανακαλύφθηκε και μελετήθηκε γενετικά από το Morgan το Πήρε το όνομά του από την εγκοπή (notch) που έχουν στην άκρη τα φτερά των ατόμων που φέρουν τη μετάλλαξη. Η μοριακή του ανάλυση και η αλληλούχηση του έγιναν την δεκαετία του 1980, ανεξάρτητα, από τους Spyros Artavanis-Tsakonas και τον Michael W. Young. Είναι γονίδιο φυλοσύνδετο και χαρτογραφείται γενετικά στη θέση και κυτταρολογικά στη θέση 3C. Το γονίδιο Notch κωδικοποιεί μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη η οποία λειτουργεί ως υποδοχέας (receptor) διακυτταρικών σημάτων σε πολλές αναπτυξιακές πορείες των μεταζώων. Είναι ένα συντηρημένο γονίδιο που είναι απαραίτητο για τη σωστή 17

18 ανάπτυξή τους. Η δράση του γονιδίου Notch επηρεάζει τη διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τα αποπτωτικό προγραμματισμό, παρέχοντας ένα γενικό αναπτυξιακό εργαλείο που επηρεάζει το σχηματισμό των οργάνων και τη μορφογένεση. Στη Drosophila melanogaster το γονίδιο Notch μεταξύ άλλων εμπλέκεται και στην ανάπτυξη των φτερών. Ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων των εμβρυικών δίσκων του φτερού, τη σωστή διαφοροποίηση των φλεβών και το σχηματισμό της περιφέρειας του φτερού. Η ενεργοποίηση του γονιδίου Notch στο φτερό, και κατ επέκταση του σηματοδοτικού μονοπατιού Notch, γίνεται από δύο πρωτεΐνεςπροσδέτες (ligands) τις Delta και Serrate. Οι πρωτεΐνες αυτές είναι διαμεμβρανικές και προσδένονται στον υποδοχέα Notch. Ο Notch υποδοχέας είναι και αυτός διαμεμβρανικός, διαπερνάει την κυτταρική μεμβράνη μία φορά και αποτελείται από τρεις περιοχές: την εξωκυττάρια, τη διαμεμβρανική και την ενδοκυττάρια. Η έκφραση των γονιδίων Serrate και fringe επάγεται από την έκφραση του γονιδίου ap στο ραχιαίο διαμέρισμα του εμβρυϊκού δίσκου του φτερού όπως αναφέραμε παραπάνω. Εικόνα 1.9 a) Διαγραμματική απεικόνιση του σηματοδοτικού μονοπατιού Notch, b) Η σηματοδότηση Notch καθορίζει την παρυφή του φτερού στη μύγα, c) Φτερό ατόμου του γενοτύπου Notch55e11. Η ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού Notch στην Drosophila melanogaster αρχίζει με την δέσμευση του υποδοχέα Notch σε έναν από τους δύο διαμεμβρανικούς προσδέτες του, Delta ή Serrate (Εικόνα 1.9a). Αυτό οδηγεί σε μια σειρά από ειδικές διασπάσεις της πρωτεΐνης Notch από πρωτεάσες όπως οι Kuzbanian, Furin και Πρεσενιλίνη στις εξωκυτταρικές και διαμεμβρανικές περιοχές, και στη συνέχεια στην απελευθέρωση της κυτταροπλασματικής περιοχής του υποδοχέα Notch. Μετά την απελευθέρωση, η ενδοκυτταρική περιοχή του υποδοχέα 18

19 Notch περνάει στον πυρήνα, όπου προσδένεται σε αυτήν η πρωτεΐνη Suppressor of Hairless (Su(Η)). Το σχηματιζόμενο σύμπλοκο στη συνέχεια ενεργοποιεί την έκφραση των γονιδίων-στόχων, συμπεριλαμβανομένων των βασικών έλικα-θηλιάέλικα (bhlh) γονίδιων, όπως αυτών του συμπλόκου Εnhancer of split [E(spl)]. Οι παράγοντες bhlh επηρεάζουν τη ρύθμιση άλλων γονιδίων όπως το σύνολο γονιδίων Achaete-Scute, καθώς και τα γονίδια vestigial (vg), wingless (wg) και cut (ct). Για να εκφραστεί το γονίδιο Νotch πρέπει τα παρακείμενα κύτταρα να κωδικοποιούν τους προσδέτες Delta και Serrate. Το γονίδιο fringe, του οποίου η έκφραση επάγεται από την πρωτεΐνη Αp, κωδικοποιεί την πρωτεΐνη Fringe, μία UDP-γλυκοζυλοτρανσφεράση, η οποία γλυκοζυλιώνει την εξωκυττάρια περιοχή του υποδοχέα Notch στο ραχιαίο διαμέρισμα του φτερού, όπου εκφράζεται και το γονίδιο fringe. Ο γλυκοζυλιωμένος υποδοχέας Notch αντιδρά με τον προσδέτη Delta, που εκφράζεται στο κοιλιακό διαμέρισμα του εμβρυικού δίσκου, αλλά όχι με τον προσδέτη Serrate που εκφράζεται στο ραχιαίο διαμέρισμα (Εικόνα 1.9b). Αυτό δημιουργεί μία αμφίδρομη σηματοδότηση κατά μήκος του περιθωρίου του φτερού, κατά την οποία η έκφραση του Notch επάγεται παραπλεύρως του ραχιαίου-κοιλιακού ορίου από το Dl, και παραπλεύρως του ραχιοκοιλιακού όριου από το Serrate. Με αυτόν τον μηχανισμό το γονίδιο Notch εκφράζεται σε δύο σειρές κύτταρων εκατέρωθεν του μελλοντικού περιθωρίου του φτερού του ακμαίου ατόμου. Στη συνέχεια η σηματοδότηση Notch επάγει την έκφραση του γονιδίου wingless (wg) στα κύτταρα που βρίσκονται στο όριο μεταξύ του ραχιαίου και κοιλιακού διαμερίσματος. Πιο συγκεκριμένα, η πρωτεΐνη Wg επάγει την έκφραση των πρωτεϊνών Serrate στα κύτταρα του ραχιαίου και του Delta στα κύτταρα του κοιλιακού διαμερίσματος, που βρίσκονται σε επαφή με τα κύτταρα που παράγουν την πρωτεΐνη Wg. Οι πρωτεΐνες Serrate και Delta με την σειρά τους, όπως αναφέραμε παραπάνω, ενεργοποιούν τον υποδοχέα Notch και έτσι διατηρείται σταθερή η παραγωγή των πρωτεϊνών Wg και Cut κατά μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα που είναι απαραίτητες για τη σωστή ανάπτυξη του φτερού. Η πρωτεΐνη Wg είναι απαραίτητη και για την ανάπτυξη του ραχιοκοιλιακού άξονα. 1.7 Σχηματισμός του προσθοπίσθιου άξονα 19

20 Όσον αφορά στον προσθοπίσθιο άξονα του εμβρυϊκού δίσκου του φτερού, αυτός καθορίζεται από την έκφραση των γονιδίων engrailed (en) και invected (inv). Τα κύτταρα που εκφράζουν τα συγκεκριμένα γονίδια, θα αποτελέσουν το οπίσθιο διαμέρισμα του εμβρυϊκού δίσκου του φτερού (Εικόνα 1.6a). Η έκφραση των παραπάνω γονιδίων ενεργοποιούν την έκφραση του σηματοδοτικού μορίου Hedgehog (Hh) και εμποδίζουν την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Cubitus Interruptus (Ci), που είναι απαραίτητος για την μεταγωγή του σήματος της πρωτεΐνης Hh. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τα κύτταρα του οπίσθιου διαμερίσματος να παράγουν αλλά να μην αποκρίνονται στη δράση της πρωτεΐνης Hh. Τα κύτταρα που βρίσκονται στο πρόσθιο διαμέρισμα του εμβρυϊκού δίσκου του φτερού, δεν εκφράζουν τα γονίδια en και inv, οπότε μπορούν να εκφράσουν την πρωτεΐνη Ci, γεγονός που τους δίνει την ικανότητα να αποκρίνονται στη δράση της πρωτεΐνης Hh, η οποία εκκρίνεται από κύτταρα του οπίσθιου διαμερίσματος. Επειδή η πρωτεΐνη Hh είναι ένα σηματοδοτικό μόριο με μικρή εμβέλεια, θα αποκριθεί σε αυτήν μόνο μία σειρά πρόσθιων κυττάρων που βρίσκονται στο όριο μεταξύ του πρόσθιου και του οπίσθιου διαμερίσματος. Στη συνέχεια τα κύτταρα που θα αποκριθούν στην πρωτεΐνη Hh, θα παράγουν το μορφογόνο μόριο Decapentaplegic (Dpp) καθώς και την πρωτεΐνη Wingless (Wg) που ανήκει στην οικογένεια των Wnt παραγόντων. Το Dpp είναι μέλος της οικογένειας των TGF-β παραγόντων και επάγει την έκφραση γονιδίων στόχων με τρόπο που εξαρτάται από την συγκέντρωσή του. 1.8 Τα Ρ μεταθέσιμα γενετικά στοιχεία ως εργαλεία γενετικής, μοριακής και γονιδιωματικής ανάλυσης στην Drosophila melanogaster Τα μεταθέσιμα γενετικά στοιχεία (ΜΓΣ) είναι αυτόνομες αλληλουχίες DNA, οι οποίες μπορούν να μετατίθενται σε διάφορες θέσεις του γονιδιώματος, χωρίς να χρειάζεται ομολογία ανάμεσα σ αυτά και στη θέση ένθεσης. Ανακαλύφθηκαν από την Barbara McClintock, τη δεκαετία του 1940, η οποία με κλασικές γενετικές μελέτες στο καλαμπόκι, παρατήρησε το φαινόμενο της γενετικής αστάθειας, το οποίο απέδωσε στη μετάθεση ορισμένων «γονιδίων» και ήταν αυτή που εισήγαγε την έννοια της μεταθεσιμότητας γενετικών στοιχείων. Ως τότε τα γονίδια, με βάση τα αποτελέσματα της γενετικής τους χαρτογράφησης που υπήρχαν, θεωρούνταν ότι κατείχαν σταθερές θέσεις στο γονιδίωμα. Αυτός βέβαια είναι ο κανόνας, αλλά πάντα υπάρχουν και εξαιρέσεις. 20

21 Τα μεταθέσιμα γενετικά στοιχεία (ΜΓΣ) με βάση το μηχανισμό μετάθεσής τους διακρίνονται στα RNA ΜΓΣ (ομάδα Ι ή ρετροτρανσποσόνια) και στα DNA ΜΓΣ (ομάδα ΙΙ ή τρανσποσόνια). Τα πρώτα (ομάδα Ι) μετατίθενται μέσω ενός ενδιάμεσου μορίου RNA με τη βοήθεια της αντίστροφης μεταγραφάσης που κωδικοποιούν. Τα στοιχεία της ομάδας ΙΙ, μετατίθενται με το μηχανισμό cut and paste (αποκοπή και επικόλληση) με τη μεσολάβηση των τρανσποζασών που κωδικοποιούν. Δηλαδή, το DNA των τρανσποζονίων αποκόπτεται από την αρχική του θέση με τη δράση των τρανσποζασών και ενσωματώνεται σε νέες θέσεις του γονιδιώματος, πάλι με τη βοήθεια των τρανσποζασών. Τα τρανσποσόνια φέρουν στα άκρα τους μικρές ανεστραμμένες αλληλουχίες (Inverted Repeats=IRs), οι οποίες είναι απαραίτητες για την μετάθεσή τους, καθώς αναγνωρίζονται από τις αντίστοιχες τρανσποζάσες που κωδικοποιούν. Με βάση τη λειτουργικότητα τους, διακρίνονται στα πλήρως λειτουργικά (ή αυτόνομα) και τα ελλειμματικά. Τα δεύτερα μετατίθενται μόνο παρουσία των αντίστοιχών λειτουργικών (πλήρων) στοιχείων. Η Drosophila melanogaster έχει 50 περίπου οικογένειες ΜΓΣ που ανήκουν σε όλες τις κατηγορίες. Τα πιο γνωστά και τα καλύτερα μελετημένα είναι τα P και hobo ΜΓΣ. Όμως πιο χρήσιμα για τη γενετική, μοριακή και γονιδιωματική ανάλυση της D. melanogaster αποδείχτηκαν τα Ρ ΜΓΣ που ανήκουν στα DNA τρανσποζόνια. Τα πλήρη Ρ στοιχεία έχουν μήκος 2907 bp και φέρουν στα άκρα τους ανεστραμμένες επαναλήψεις (Inverted Repeats=IRs) 31 bp και 11 bp εσωτερικά από αυτές. Οι επαναλήψεις αυτές είναι απαραίτητες για τη μετάθεσή τους. Εσωτερικά υπάρχουν κι άλλες επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες άγνωστης λειτουργίας, καθώς και το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη τρανσποζάση, που είναι απαραίτητη για τη μετάθεση τους. Το γονίδιο της τρανσποζάσης αποτελείται από 4 εξώνια (0, 1, 2, 3) και 3 εσώνια διαφορετικού μεγέθους και κωδικοποιεί μια τρανσποζάση μεγέθους 87 kd (Εικόνα 1.10). Τα Ρ ΜΓΣ μετατίθενται μόνο στα γεννητικά κύτταρα. Στα σωματικά κύτταρα δεν μετατίθενται και αυτό οφείλεται στο ότι δεν γίνεται αποκοπή του 3ου εσωνίου, το οποίο φέρει ένα κωδικόνιο λήξης της μετάφρασης. Οπότε κατά τη μετάφραση παράγεται μία μικρότερη πρωτεΐνη 66 kd, η οποία δε λειτουργεί ως τρανσποζάση, αλλά ως καταστολέας της μετάθεσης και στην οποία οφείλεται ο Ρ κυτταρότυπος. Η μετάθεση των Ρ στοιχείων γίνεται με το μηχανισμό «αποκοπή και επικόλληση» και στη νέα θέση ένθεσης δημιουργείται διπλασιασμός 8 βάσεων λόγω της τρανσποζάσης που κόβει κλιμακωτά το DNA στη θέση ένθεσης. 21

22 Εικόνα 1.10 Πάνω: Δομή ενός πλήρους Ρ ΜΓΣ. Οι γαλάζιες γραμμές αντιπροσωπεύουν τα εσόνια και τα ροζ κουτιά τα εξόνια. Οι ανεστραμμένες (ακραίες) επαναλήψεις (Inverted Repeats) παριστάνονται με πορτοκαλί βέλη. Κάτω: Μοριακή δομή του τροποποιημένου Ρ στοιχείου Ρ[Δ2-3]. Κύριο χαρακτηριστικό των Ρ μεταθέσιμων γενετικών στοιχείων, όπως και των άλλων τρανσποζονίων, είναι η ικανότητα μετάθεσης σε νέες θέσεις του γονιδιώματος παρουσία ενεργής Ρ τρανσποσάσης και ανέπαφων ακραίων επαναλήψεων. Τα Ρ στοιχεία έχουν την τάση να ενσωματώνονται στη 5 ρυθμιστική περιοχή των γονιδίων και κατά τη μετάθεσή τους να μετακινούνται σε γειτονικές θέσεις. Το μειονέκτημα τους είναι ότι δεν ενσωματώνονται με την ίδια συχνότητα σε όλο το γονιδίωμα. Τα ελλειμματικά Ρ στοιχεία προκύπτουν από τα πλήρη με τη δημιουργία εσωτερικών ελλειμμάτων, που προκύπτουν κατά την πορεία της μετάθεσή τους. Διατηρώντας ανέπαφα τα άκρα τους, αυτά τα ελλειμματικά Ρ στοιχεία μπορούν να μετατεθούν σε νέες θέσεις παρουσία μιας πηγής Ρ τρανσποζάσης. Οι Rubin και Spradling (1982) αξιοποιώντας αυτή την ιδιότητα, χρησιμοποίησαν τα Ρ στοιχεία για τη δημιουργία διαγονιδιακών ατόμων. Πιο συγκεκριμένα, εισήγαγαν με μικροσύριγγα, ένα τροποποιημένο Ρ στοιχείο, το οποίο έφερε το κανονικό γονίδιο rosy (r+), σε μεταλλαγμένα rosy- έμβρυα και πήραν στην F 2 γενεά 22

23 μύγες με κανονικά μάτια r+ (σκούρα κόκκινα). Τα μεταλλαγμένα r-/r- άτομα έχουν ροδοειδή χρώμα ματιών. Η επέμβαση αυτή μπορεί να θεωρηθεί ως η πρώτη επιτυχημένη δημιουργία διαγονιδιακών ατόμων. Οι ενέσεις γίνονται στον οπίσθιο πόλο προβλαστοδερμικών εμβρύων. Από τότε, τα P στοιχεία έχουν ευρέως διασκευασθεί και τροποποιηθεί, εφοδιάζοντας τους γενετιστές με μια πλειάδα λειτουργικών εργαλείων για τη γενετική και γονιδιωματική ανάλυση της Drosophila melanogaster. Τα τροποποιημένα Ρ στοιχεία χρησιμοποιούνται ευρέως σαν παραδοσιακοί μεταλλαξιγόνοι παράγοντες και αποτελούν τον κορμό προγραμμάτων που στοχεύουν στη δημιουργία ενθέσεων σε κάθε προβλεπόμενο γονίδιο του γονιδιώματος της Drosophila melanogaster. Εκτός από αυτές παραδοσιακές γενετικές προσεγγίσεις έχει δημιουργηθεί μια ποικιλία τροποποιημένων Ρ στοιχείων για ένα ευρύ φάσμα διαγονιδιακών εφαρμογών, όπως της παγίδευσης ενισχυτών, παγίδευσης γονίδιων, παγίδευσης πρωτεϊνών και τέλος την αντικατάσταση γονιδίων μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού. Επίσης, τροποποιημένα Ρ στοιχεία φέρουν το σύστημα FLP/FRT της ζύμης Saccharomyces cerevisiae, όπου το ένζυμο φλιπάση (ανασυνδυάση) προκαλεί διασκελισμό σε ειδικές θέσεις στόχους (FRT). Το παραπάνω σύστημα χρησιμοποιείται ευρέως για την πρόκληση μιτωτικού ανασυνδυασμού, που δίνει τη δυνατότητα για το μοριακό σημάδεμα των μιτωτικών κλώνων για μωσαϊκή ανάλυση, επεκτείνοντας έτσι τη χρησιμοποίηση αυτού του ισχυρού γενετικού εργαλείου σε όλους σχεδόν τους τομείς της αναπτυξιακής βιολογίας. Επίσης, Ρ φορείς (vectors) βασιζόμενοι στο σύστημα FLP/FRT χρησιμοποιούνται για την πρόκληση μοριακά χαρακτηρισμένων ελλειμμάτων και διπλασιασμών. Ένα άλλο πολύ σημαντικό σύστημα για τη μελέτη της Drosophila melanogaster και όχι μόνο είναι το δυαδικό σύστημα GAL4/UAS του Saccharomyces cerevisiae που αναπτύχθηκε από τους Brand και Perrimon (1993). Χρησιμοποιείται για στοχευόμενη εκτοπική έκφραση και υπερέκφραση γονιδίων, για τη μελέτη γονιδιακών αλληλεπιδράσεων και όχι μόνον. Το γονίδιο GAL4 κωδικοποιεί τον παράγοντα μεταγραφής GAL4, ο οποίος ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων GAL1 και GAL10 στο ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae. Τα γονίδια αυτά εκφράζονται όταν ως θρεπτικό μέσο χρησιμοποιείται γαλακτόζη, μέσω της πρόσδεσης του παράγοντα GAL4 σε μία ανοδική αλληλουχία ενεργοποίησης (Upstream Activating Sequence - UAS), που είναι ανάλογη με τους ενισχυτές των ευκαρυωτικών οργανισμών. 23

24 Εικόνα 1.11 Διαγραμματική απεικόνιση του συστήματος GAL4-UAS. Στο σύστημα αυτό το ένα διαγονιδιακό στέλεχος (γονικό) φέρει τον παράγοντα μεταγραφής της ζύμης GAL4, του οποίου η έκφραση ρυθμίζεται από τη ρυθμιστική περιοχή ενός συγκεκριμένου γονιδίου (Εικόνα 1.11). Στην περίπτωση αυτή ο παράγοντας GAL4 εκφράζεται στους ιστούς που εκφράζεται το συγκεκριμένο γονίδιο του οποίου οι ρυθμιστικές αλληλουχίες ελέγχουν τη δράση του. Στο άλλο στέλεχος βρίσκεται η αλληλουχία UAS ανοδικά του επιθυμητού γονιδίου, το οποίο θέλουμε να εκφράσουμε εκτοπικά ή να υπερεκφράσουμε. Όταν τα δύο στελέχη διασταυρώνονται, οι απόγονοι εκφράζουν το γονίδιο που βρίσκεται καθοδικά του UAS στους ιστούς, όπου εκφράζεται και ο GAL4 παράγοντας. Έχουν δημιουργηθεί πολλές τροποποιήσεις και βελτιώσεις του συστήματος αυτού προκειμένου να βελτιωθεί η ιστοειδικότητά του καθώς και ο ακριβής χρόνος έκφρασης του. Η δημιουργία ενός τροποποιημένου UAS στοιχείου απόκρισης, του ΕΡ, από την Rorth και τους συνεργάτες της, έδωσε τη δυνατότητα να δημιουργηθούν χιλιάδες στελέχη, που το καθένα φέρει και μια ΕΡ ένθεση σε διαφορετική θέση του γονιδιώματος. Εάν η ΕΡ ένθεση είναι ενσωματωμένη στη αρχή ενός γονιδίου και το στέλεχος αυτό διασταυρωθεί με ένα GAL4 στέλεχος που βρίσκεται υπό τον έλεγχο ενός γνωστού γονιδίου, για παράδειγμα του apterous (στέλεχος ap-gal4) τότε το 24

25 γονίδιο αυτό εκφράζεται στο ραχιαίο διαμέρισμα του εμβρυικού δίσκου του φτερού, όπου δηλαδή εκφράζεται και το apterous. Αν υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο γονιδίων τότε τα άτομα θα έχουν διαφορετικό σε σχέση με τον κανονικό φαινότυπο. Το σύστημα GAL4/UAS χρησιμοποιείται επίσης για την επαγωγή της RNA παρεμβολής (RNA interference, RNAi) που δίνει τη δυνατότητα της απενεργοποίησης συγκεκριμένων γονιδίων, των οποίων δε γνωρίζουμε τη δράση τους. Με την τεχνική της RNA παρεμβολής δεν χρειάζεται να προκαλέσουμε DNA μεταλλάξεις σε άγνωστα γονίδια για να τα μελετήσουμε, καθώς αυτή η διαδικασία παρεμποδίζει την μετάφραση των mrnas επάγοντας την αποικοδόμησή τους και κατά συνέπεια σταματώντας την έκφρασή τους. Για την επαγωγή της RNA παρεμβολής πρέπει τα UAS-RNAi (RNAi knockdown) στελέχη για τα επιθυμητά γονίδια, να διασταυρωθούν με τα ανάλογα στελέχη GAL4. Όταν τα δύο στελέχη διασταυρωθούν, η έκφραση του κανονικού γονίδιου μειώνεται σημαντικά ή εκμηδενίζεται λόγω της RNA παρεμβολής, οπότε μπορεί να διερευνηθεί η δράση του γονιδίου από το φαινότυπο που θα προκύψει, χωρίς να χρειαστεί να μεταλλάξουμε το γονίδιο. Μια τράπεζα UAS-RNAi knockdown στελεχών, η οποία καλύπτει περίπου το 90% του συνόλου του γονιδιώματος της μύγας, υπάρχει στο ερευνητικό κέντρο Vienna Drosophila Research Center στη Βιέννη, από την οποία οποιοσδήποτε ερευνητής μπορεί να προμηθευθεί το στέλεχος που επιθυμεί με την καταβολή κάποιου μικρού σχετικά χρηματικού ποσού. Οι παραπάνω διαγονιδιακές κατασκευές (constructs) δημιουργούνται in vitro. Στην ουσία είναι τροποποιημένα ελλειμματικά Ρ στοιχεία, που φέρουν ανέπαφες τις τερματικές ανεστραμμένες επαναλήψεις (IRs), αλλά το γονίδιο της τρανσποζάσης έχει αντικατασταθεί από άλλα γονίδια ή αλληλουχίες DNA, με αποτέλεσμα την αδυναμία αυτόνομης μετάθεσης. Έτσι οι ενθέσεις αυτές είναι σταθερές απουσία ενεργής τρανσποζάσης, αλλά μπορούν να μετατεθούν παρουσία ενεργής Ρ τρανσποζάσης από το πλασμίδιο-φορέα στο γονιδίωμα της μύγας. Έτσι από ένα στέλεχος που φέρει μια ένθεση σε μια ορισμένη θέση του γονιδιώματος, μπορεί με τις επανειλημμένες μεταθέσεις του να δημιουργηθεί πλειάδα στελεχών, που το καθένα θα φέρει μία ένθεση σε διαφορετική θέση. Γενικά, η Ρ τρανσποσάση παρέχεται με ταυτόχρονη μικροένεση της μεταθέσιμης Ρ κατασκευής μαζί με ένα P στοιχείο που παράγει τρανσποζάση, αλλά δεν μπορεί να μετατεθεί από το πλασμίδιο, γιατί του λείπουν οι τερματικές ανεστραμμένες επαναλήψεις (helper plasmid) ή κάνοντας 25

26 μικροένεση της μεταθέσιμης κατασκευής σε ένα στέλεχος που φέρει ένα λειτουργικό Ρ στοιχείο, το pp[ry+, Δ2-3] (Εικόνα 1.10) το οποίο παράγει Ρ τρανσποζάση και είναι μόνιμα ενσωματωμένο (δεν μπορεί να μετατεθεί) στην χρωμοσωμική περιοχή 99Β του 3R βραχίονα του στελέχους (Δ2-3), λόγω κάποιας μετάλλαξης που φέρει. Τα τροποποιημένα (τεχνητά Ρ) στοιχεία εκτός από το επιθυμητό γονίδιο ή αλληλουχία DNA που θέλουμε να μελετήσουμε, φέρουν και γονίδια (δείκτες) επιλογής, τα οποία μας επιτρέπουν να επιλέγουμε τα μετασχηματισθέντα άτομα καθώς και γονίδια αναφοράς, με τα οποία ελέγχουμε την έκφραση του εισαγόμενου γονιδίου. Ως δείκτης επιλογής χρησιμοποιείται κυρίως το mini-white (mini-w+), ένα τροποποιημένο κανονικό αλληλόμορφο του γονιδίου white, του οποίου του λείπουν οι αλληλουχίες έκφρασης στα μαλπιγγιανά σωληνάρια και στους όρχεις, αλλά όχι στα μάτια. Στην περίπτωση αυτή τα άτομα στα οποία γίνεται η μικροένεση πρέπει να έχουν λευκά (white) μάτια. Τα μετασχηματισμένα άτομα, λόγω του mini-w+ που φέρουν, θα έχουν χρώμα ματιών από αχνό κιτρινωπό μέχρι σκούρο κεραμιδί λόγω του φαινομένου του αποτελέσματος θέσης (position effect) που είναι αποτέλεσμα της διαφορετικής θέσης ένθεσης του τροποποιημένου Ρ στοιχείου στο γονιδίωμα. Εκτός από το mini-w+ ως δείκτης επιλογής χρησιμοποιείται και ένα τροποποιημένο κανονικό αλληλόμορφο του γονιδίου yellow (y). Στην περίπτωση αυτή οι ενέσεις γίνονται σε έμβρυα στελέχους yellow των οποίων τα ενήλικα άτομα έχουν κίτρινο σώμα. Τα γονίδια y και w είναι φυλοσύνδετα. Ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιείται κυρίως το γονίδιο lacz της E.coli που παράγει το ένζυμο της β-γαλακτοζιδάσης, το οποίο βρίσκεται υπό τον έλεγχο ασθενούς υποκινητή και υπόκειται στις επιδράσεις γειτονικών ενισχυτών. Έτσι η ανίχνευση της β-γαλακτοσιδάσης με χρώση Χ-gal, αντικατοπτρίζει και την έκφραση των γειτονικών ως προς την ένθεση γονιδίων. Ως γονίδια αναφοράς χρησιμοποιούνται και τα γονίδια GFP της μέδουσας Aequorea victoria και της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας Photinus pyralis. 26

27 Εικόνα 1.12 Τεχνητά τρανσποσόνια που χρησιμοποιούνται για τη μεταλλαξιγένεση και την παγίδευση ενισχυτών στην Drosophila melanogaster. Οι διαγονιδιακές κατασκευές χρησιμοποιούνται για πρόκληση μεταλλάξεων σε συγκεκριμένα γονίδια ή γενικά στο γονιδίωμα. Στην πρώτη περίπτωση, προκαλούνται μεταλλάξεις σε γονίδια άγνωστης λειτουργίας με την ένθεση των στοιχείων στη ρυθμιστική ή την κωδική περιοχή τους ή με τη δημιουργία ελλειμμάτων λόγω ανώμαλης αποκοπής. Για το σκοπό αυτό μετατίθενται τα στοιχεία εκείνα που έχουν ενσωματωθεί κοντά στα γονίδια-στόχους, καθώς όπως προαναφέρθηκε, τα Ρ στοιχεία έχουν την τάση να μετατίθενται σε γειτονικές θέσεις. Στη δεύτερη περίπτωση, όταν γίνει μετάθεση της Ρ ένθεσης, ανιχνεύονται μεταλλάξεις συγκεκριμένου τύπου που να επηρεάζουν το νευρικό σύστημα, τη γονιμότητα, τη βιωσιμότητα, ή φαινοτυπικά 27

28 χαρακτηριστικά που επηρεάζουν το σώμα, τα φτερά, τα πόδια, τα μάτια κ.λ.π. Με τον τρόπο αυτό δημιουργήθηκαν χιλιάδες στελέχη που το καθένα φέρει και μια διαφορετική ένθεση σε όλα τα χρωμοσώματα της (Χ, 2 ο, 3ο, και 4ο που είναι πολύ μικρό) που επηρεάζουν τα περισσότερα γονίδια της Drosophila melanogaster. Στην Εικόνα 1.12 παρουσιάζεται μια σειρά τροποποιημένων Ρ στοιχείων που χρησιμοποιούνται για την πρόκληση μεταλλάξεων και την παγίδευση ενισχυτών. Η θέση των ενθέσεων στα χρωμοσώματα βρίσκεται με in situ υβριδοποίηση ενώ η θέση τους στo DNA προσδιορίζεται, κυρίως, με inverse PCR. Επειδή τα Ρ στοιχεία δεν ενσωματώνονται σε ορισμένες περιοχές του γονιδίωματος της Drosophila melanogaster, για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται ΜΓΣ που προέρχονται από άλλους οργανισμούς και τα οποία ενσωματώνονται με την ίδια συχνότητα σε όλες τις περιοχές του γονιδίωματος της. Τέτοια είναι το piggybac, που απομονώθηκε από ένα λεπιδόπτερο, του οποίου η κάμπια παρασιτεί στο λάχανο και ονομάζεται Trichoplusia ni, και το Minos που απομονώθηκε από την Drosophila hydei. Και τα δύο αυτά τρανσποσόνια δουλεύουν καλά ως φορείς (vectors) στο γονιδίωμα της Drosophila melanogaster και χρησιμοποιούνται για πρόκληση ενθέσεων σε όλο γονιδίωμα της. Η ανάπτυξη των παραπάνω τεχνικών σε συνδυασμό με την ανάπτυξη έξυπνων υπολογιστικών προγραμμάτων έχουν καταστήσει τη Drosophila melanogaster ως οργανισμό μοντέλο για τη μελέτη ανθρώπινων παθήσεων. Μετά την αλληλούχηση των γονιδιωμάτων του ανθρώπου και της Drosophila melanogaster και τη σύγκριση των αλληλουχιών τους, διαπιστώθηκε ότι μεταξύ των δύο οργανισμών υπάρχουν συντηρημένα πολλά γονίδια αρκετά από τα οποία είναι γνωστό ότι προκαλούν αρρώστιες στον άνθρωπο. Τα 197 από τα 287, γονίδια που προκαλούν ασθένειες στον άνθρωπο, βρέθηκε να έχουν ορθόλογα στη Drosophila melanogaster. Η Drosophila melanogaster χρησιμοποιείται ήδη ως οργανισμός μοντέλο για την μελέτη νευροεκφυλιστικών ασθενειών, όπως Alzheimer και Parkinson λόγω των συντηρημένων σηματοδοτικών μονοπατιών αλλά και του καρκίνου. Και αυτό γιατί μπορούμε να διερευνήσουμε ευκολότερα τους μηχανισμούς που είναι υπεύθυνοι για την κυτταρική αύξηση και διαφοροποίηση, καθώς η Drosophila melanogaster είναι πιο απλός οργανισμός. Αρκετές πρόσφατες έρευνες έχουν ασχοληθεί με τις διεργασίες που καταστέλλουν την μεταστατική συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων και τις προϋποθέσεις που πρέπει να πληρεί το μικροπεριβάλλον ώστε τα 28

29 καρκινικά κύτταρα να πολλαπλασιαστούν και να εισβάλουν σε άλλους ιστούς (μετάσταση). Τα παραπάνω τροποποιημένα στελέχη και όχι μόνο, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εργαλεία για να δημιουργηθούν εύκολα και γρήγορα μοντέλα ανθρώπινων ασθενειών, μέσω μεταλλάξεων, γενετικής απενεργοποίησης, ή λάθος έκφρασης των γονιδίων της μύγας που είναι ορθόλογα ανθρώπινων γονιδίων και προκαλούν ασθένειες (στον άνθρωπο) ή γονιδίων ανθρώπινων ασθενειών που δεν υπάρχουν στη μύγα. Το δεύτερο, επιτυγχάνεται με τη δημιουργία διαγονιδιακών ατόμων της μύγας που φέρουν ανθρώπινα γονίδια που προκαλούν ασθένειες, τα οποία στη συνέχεια μεταχειρίζονται όπως τα ορθόλογα γονίδια. Με όλα τα παραπάνω πλεονεκτήματα, η Drosophila melanogaster άρχισε τελευταία να χρησιμοποιείται και ως οργανισμός δοκιμής θεραπευτικών ενώσεων. Η σύγκριση γονιδιωμάτων μεταξύ της Drosophila melanogaster και άλλων οργανισμών, των οποίων έγινε η αλληλούχιση των γονιδιωμάτων και η πρόβλεψη των γονιδίων τους, έδειξε ότι πολλές αναπτυξιακές διεργασίες, όπως ο καθορισμός του ραχιαίο-κοιλιακού άξονα, ο σχηματισμός των άκρων κ.λ.π. έχουν κοινά χαρακτηριστικά που ελέγχονται από ορθόλογα γονίδια παρά το γεγονός ότι τα είδη αυτά διαχωρίστηκαν εξελικτικά μεταξύ τους πριν από περίπου 700 εκατομμύρια χρόνια. 1.9 Η μετάλλαξη wisertsl του γονίδιο lawc (CG32711) Η μετάλλαξη wisertsl (wings scalloped eyes rough) είναι μια υποτελής φυλοσύνδετη θερμοευαίσθητη μετάλλαξη που οφείλεται σε ένθεση ενός φυσικού P στοιχείου στην 5 ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου (CG32711), στη Drosophila melanogaster. Προέκυψε από μια δυσγενική διασταύρωση με το 23.5 hobo MRF στέλεχος. Στην επιτρεπτική θερμοκρασία των 19 οc συμπεριφέρεται ως υποτελής ορατή και επηρεάζει τα φτερά (φαγωμένα στην περιφέρεια και συχνότερα στην πίσω πλευρά) και τα μάτια (μικρότερα και σκουρότερα από τα κανονικά και με ελαφρώς αδρή επιφάνεια) (Εικόνα 1.15) απ όπου πήρε και το όνομά της. Στους 29 οc τα άτομα πεθαίνουν στα στάδια της προνύμφης και της νύμφης, λίγο πριν ή κατά την εκκόλαψη του ακμαίου ατόμου. 29

30 A D B E C Εικόνα 1.13 Φαινότυποι που οφείλονται στη μετάλλαξη wisertsl περιλαμβάνουν τσιμπημένα/φαγωμένα φτερά στην κοιλιακή (Α,Β) και κοιλιακή και ραχιαία πλευρά (C) και αδρά μάτια (D), κανονικό μάτι (Ε). Η μετάλλαξη wisertsl οφείλεται στο διαφορετικό πρότυπο έκφρασης της πρωτεΐνης lawc κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Το γονίδιο CG32711 (lawc)* στο στάδιο του εμβρύου εκφράζεται στα πολικά κύτταρα, στο πεπτικό σύστημα, στην κοιλιακή νευρική χορδή, στο περιφερικό νευρικό σύστημα, στα γλοία κύτταρα, τα αιμοκύτταρα, στο τραχειακό σύστημα και στους σιελογόνους αδένες. Στα ακμαία άτομα εκφράζεται στα τροφοκύτταρα των ωοθήκων. Επίσης εμπλέκεται στη μορφογένεση των φτερών, των ποδιών και των ματιών και είναι απαραίτητο για τη βιωσιμότητα των ατόμων 30

31 Εικόνα 1.14 Χάρτης της περιοχής του γονιδίου lawc στον οποίο φαίνονται οι θέσεις ένθεσης των Ρ στοιχείων που είναι υπεύθυνες για τις μεταλλάξεις wisertsl, lawcp1 και PL26. Από Η πρωτεΐνη Lawc εντοπίζεται σε ζώνες πολυταινικών χρωμοσωμάτων σιελογόνων αδένων προνυμφών 3ου σταδίου, αλληλεπιδρά με το ρυθμιστή του πυρηνικού πρωτεασώματος dregγ και συνεντοπίζεται με την RNA πολυμεράση IIo (Pol IIo) και με το ρυθμιστή του πυρηνικού πρωτεασώματος dregγ μετά τον πρώτο κύκλο μεταγραφής. Το υπεύθυνο P στοιχείο για τη μετάλλαξη wisertsl χαρτογραφείται στην περιοχή 7Ε του Χ-χρωμοσώματος και απέχει 490bp από το σημείο έναρξης της μεταγραφής και 610bp από το κωδικό έναρξης της μετάφρασης του γονιδίου lawc (CG32711). Στην περιοχή 7Ε χαρτογραφείται και η θανατογόνος μετάλλαξη PL26, η οποία οφείλεται σε ένθεση του στοιχείου P[lacW] 394bp ανοδικά του σημείου έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου lawc (CG32711). Στους 29οC οι δύο μεταλλάξεις wisertsl και PL26 δεν δείχνουν συμπληρωματικότητα, γεγονός που δηλώνει ότι είναι αλληλόμορφα του ίδιου γονιδίου. Έλεγχος της τελευταίας, 5 ης έκδοσης (release), της αλληλούχησης ολόκληρου του Χ- χρωμοσώματος της Drosophila melanogaster του ινστιτούτου NCBI δεν άλλαξε τις θέσεις των παραπάνω ενθέσεων. Το Ρ στοιχείο της μετάλλαξης lawcp1 χαρτογραφήθηκε 400 bp ανοδικά του *Οι Brandt και Corces το 2008, βασιζόμενοι στο φαινότυπο της μετάλλαξης lawcp1 (leg arista wing complex) που μελέτησαν, ονόμασαν το προβλεπόμενο γονίδιο CG32711 ως lawc. Επειδή το CG32711 είναι κατατεθειμένο στη FlyBase ως γονίδιο lawc και προς αποφυγή παρανοήσεων, ονομάζουμε τώρα και εμείς το γονίδιο CG32711 αντί για wiser ως lawc και θεωρούμε τη tsl γονιδίου. Οι μετάλλαξηlawc wiser(cg32711) ως μετάλλαξη τουθέσεις γονιδίουτων lawc.τριών μεταλλάξεων παρουσιάζονται στην Εικόνα

32 Tο γονίδιο lawc (CG32711) έχει μέγεθος 2089bp, αποτελείται από 4 εξώνια και 3 εσώνια και μεταγράφεται σε δυο mrnas, το προβλεπόμενο μεγέθους 1070nt και ένα άλλο 1330nt (Εικόνα 1.15). Το μικρότερο προκύπτει από τη συρραφή των τεσσάρων εξωνίων (όπως προβλέπεται από τη FlyBase). Το μεγαλύτερο μετάγραφο προέρχεται από τη μη χρησιμοποίηση της πρώτης θέσης συρραφής, αλλά μιας δεύτερης που υπάρχει μέσα στο 1ο εσώνιο και περιέχει επιπλέον τις 260 πρώτες βάσεις του πρώτου εσωνίου. Και τα δυο μετάγραφα κωδικοποιούν μια πρωτεΐνη 73 αμινοξέων, διότι η μεταφραζόμενη περιοχή του CG32711 εντοπίζεται στο πρώτο εξώνιο που είναι ίδιο και στα δυο ώριμα μετάγραφα. Η προβλεπόμενη πρωτεΐνη έχει μέγεθος 8 kda, όμως στους ιστούς της Drosophila ανιχνεύεται και μια δεύτερη ισομορφή μεγέθους 9 kda. Η μεγαλύτερη ισομορφή ενδεχομένως να οφείλεται σε γλυκοζυλίωση ή/και φωσφορυλίωση του πολυπεπτιδίου διότι στην αμινοξική αλληλουχία υπάρχουν προβλεπόμενες θέσεις γλυκοζυλίωσης και φωσφορυλίωσης Εικόνα 1.15 Η δομή του γονιδίου lawc (wiser) και των μεταγράφων του. Νεότερα αποτελέσματα με τη μελέτη της μετάλλαξης wisertsl αποκάλυψαν ότι το γονίδιο lawc εμπλέκεται στον προσδιορισμό του ραχιοκοιλιακού άξονα του φτερού και στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό του φτερού. Η πρόκληση μιτωτικών κλώνων σε εμβρυικούς δίσκους φτερού 3ου προνυμφικού σταδίου αποκάλυψε ότι οι ομοζυγωτικοί wiserpl26/ wiserpl26 κλώνοι, είναι μικρότερου μεγέθους στο θύλακα του φτερού από τους δίδυμους +/+ κλώνους. Αυτό δείχνει ότι το γονίδιο lawc εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Επίσης το γονίδιο lawc επηρεάζει το πρότυπο έκφρασης των fng-lacz, wg-lacz, mβ-lacz, m8-lacz, Dll -lacz και vg-lacz οπότε εμπλέκεται στον προσδιορισμό του ραχιοκοιλιακού άξονα και συμμετέχει στο σχηματισμό του προσθοπίσθιου άξονα του φτερού. 32

33 1.10 Σκοπός της παρούσας διατριβής Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να μελετηθεί περαιτέρω η λειτουργία του γονιδίου lawc με τη χρησιμοποίηση της μετάλλαξης wisertsl. Η μετάλλαξη wisertsl, όπως αναφέραμε παραπάνω επηρεάζει την ανάπτυξη των φτερών. Η σωστή ανάπτυξη των φτερών εξαρτάται από τη σωστή έκφραση του γονιδίου apterous στο ραχιαίο διαμέρισμα του εμβρυικού δίσκου των φτερών και την σωστή έκφραση των γονιδίων στόχων του, Serrate (Ser) και fringe (fng) καθώς και του γονιδίου Delta (Dl). Όσον αφορά το γονίδιο ap η σωστή έκφραση του εξαρτάται, μεταξύ άλλων, από τα γονίδια Beadex, Chip, και osa. Προκειμένου να διερευνήσουμε το μηχανισμό εμπλοκής του γονιδίου lawc στην ανάπτυξη των φτερών, μελετήσαμε την αλληλεπίδραση της μετάλλαξης wisertsl με μεταλλάξεις των παραπάνω γονιδίων στην ανάπτυξη των φτερών. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η μετάλλαξη wisertsl συμπεριφέρεται παρόμοια με τη μετάλλαξη Bx1 και ότι το γονίδιο lawc πρέπει να εμπλέκεται στη ρύθμιση της έκφραση της πρωτεΐνης Apterous στην ανάπτυξη των φτερών. 33