ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΡΙΩΝ ΠΟΛΥΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΩΝ ΦΥΤΩΝ ΣΕ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ

Transcript

1 ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΡΙΩΝ ΠΟΛΥΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΩΝ ΦΥΤΩΝ ΣΕ ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ Α. Μοσχονά, Π. Νάτας και Μ. Λιακοπούλου-Κυριακίδου Εργαστήριο Οργανικής Χημείας, Τομέας Χημείας, Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Α.Π.Θ. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το Goji berry (Lucium barbarum), το ιπποφαές (Hippophae rhamnoides L.) και το ρόδι (Punica granatum) ανήκουν στα πολυλειτουργικά φυτά και γίνεται έρευνα όσον αφορά στις βιολογικές δράσεις των συστατικών των καρπών τους. Στην παρούσα εργασία, οι καρποί εκχυλίστηκαν σε λουτρό υπερήχων με διάφορους διαλύτες και ακολούθησε προσδιορισμός των ολικών φαινολικών στα εκχυλίσματα σύμφωνα με την μέθοδο Folin-Ciocalteu. Παράλληλα έγινε προσδιορισμός της αντιοξειδωτικής δράσης αυτών με τις μεθόδους DPPH και ABTS. Παρατηρήθηκε ότι υπάρχει μια ικανοποιητική συσχέτιση της αντιοξειδωτικής δράσης των εκχυλισμάτων των καρπών και του ολικού περιεχομένου τους σε φαινολικά. Τέλος, από τα πειράματα για την επίδραση των υδατικών εκχυλισμάτων των καρπών στη συγκολλητικότητα των αιμοπεταλίων του ανθρώπου, διαπιστώθηκε ισχυρή αναστολή κυρίως από το υδατικό εκχύλισμα του ιπποφαούς. Η απομόνωση των υπεύθυνων για τις εν λόγω δράσεις, συστατικών βρίσκεται σε εξέλιξη. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το Goji Berry είναι ένας παραδοσιακός κινέζικος θάμνος του οποίου οι καρποί μοιάζουν με μούρα. Είναι κόκκινο αποξηραμένο φρούτο περίπου στο μέγεθος της σταφίδας. Θεωρείται ως μια πλούσια φυσική πηγή θρεπτικών συστατικών. Περιέχει φαινόλες, καροτενοειδή, φλαβονοειδή, πολυσακχαρίτες, καθώς και μια σειρά βιταμινών και αμινοξέα. Έχει μελετηθεί ευρέως για την σπουδαιότητα που έχει τόσο στην ιατρική όσο και στη βιομηχανία τροφίμων. Ενδιαφέρον παρουσιάζουν κυρίως οι σπάνιοι πολυσακχαρίτες του, η ζεαξανθίνη και το β-καροτένιο από τα φλαβονοειδή καθώς και οι φαινολικές ενώσεις που περιέχονται στους καρπούς του. Οι φαινολικές ενώσεις είναι πολύ σημαντικές κυρίως για τις αντιοξειδωτικές τους ιδιότητες. [1]

2 Το ιπποφαές (Hippophae rhamnoides L.) ή sea buckthorn είναι ένας φυλλοβόλος ακανθώδης θάμνος, ο οποίος ανήκει στην οικογένεια Elaeagnaceae, κι έχει κερδίσει σημαντικό έδαφος όσον αφορά στη χρήση του στη διατροφή και τα φαρμακευτικά σκευάσματα. Η αντιοξειδωτική και αντιμικροβιακή δράση του καρπού του ιπποφαούς αποδίδεται κυρίως σε υδρόφιλες και λιπόφιλες ενώσεις, όπως είναι το ασκορβικό οξύ, οι φαινολικές ενώσεις και τα καροτενοειδή. Επίσης, σημαντική είναι και η ανασταλτική δράση του καρπού στη συγκόλληση των αιμοπεταλίων στο αίμα [2]. Η ροδιά (Punica granatum), η οποία ανήκει στην οικογένεια Punicaceae, είναι ένα μικρό φυλλοβόλο δέντρο. Το περικάρπιο του ροδιού παρουσιάζει ενδιαφέρον κυρίως λόγω της ισχυρής αντιοξειδωτικής, αντιμικροβιακής και αντιαιμοπεταλικής δράσης του, οι οποίες οφείλονται κυρίως στην υψηλή περιεκτικότητα του περικαρπίου σε φαινολικές ενώσεις, φλαβονοειδή και ταννίνες. [3] Οι φαινολικές ενώσεις είναι μία μεγάλη κατηγορία ενώσεων με ένα ή περισσότερα υδροξύλια απ ευθείας συνδεδεμένα σε έναν ή περισσότερους αρωματικούς δακτυλίους. Είναι είτε απλά μόρια, όπως φαινολικά οξέα, είτε πολυμερισμένα μόρια, όπως οι ταννίνες. Είναι υπεύθυνες ως ένα βαθμό για τις οργανοληπτικές και διατροφικές ιδιότητες των φυτικών τροφίμων. Είναι ιδιαίτερα ωφέλιμες για τον ανθρώπινο οργανισμό κι αυτό αποδίδεται κυρίως στην αντιοξειδωτική τους δράση αφού λειτουργούν ως δεσμευτές ελευθέρων ριζών. [4] Σκοπός της εργασίας είναι η εκλεκτική εκχύλιση και ο προσδιορισμός των ολικών φαινολικών από τους αντίστοιχους καρπούς του Goji berry, του ιπποφαούς και του φλοιού (περικάρπιο) του ροδιού σε συνδυασμό με τη μελέτη της αντιοξειδωτικής ικανότητας και της ανασταλτικής δράσης τους στη συγκολλητικότητα των αιμοπεταλίων του ανθρώπου in vitro. Παράλληλα, με σκοπό την περαιτέρω αξιοποίηση των φυτών αυτών και των συστατικών των καρπών τους, έγινε προσπάθεια σύγκρισης και συσχέτισης του περιεχομένου τους σε φαινολικά με την αντιοξειδωτική δράση. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ως πρώτη ύλη για τα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν αποξηραμένοι καρποί Goji Berry (Κινεζικής προέλευσης), ιπποφαούς (Ελληνικής προέλευσης) και περικάρπιο φρέσκου ροδιού (Ελληνικής προέλευσης). Τα δείγματα αφού ομογενοποιήθηκαν με τη χρήση αναμεικτήρα (μπλέντερ), έλαβε χώρα εκχύλιση σε λουτρό υπερήχων. Η εκχύλιση πραγματοποιήθηκε με διαλύτες μεθανόλη, χλωροφόρμιο και νερό. Μετά τη φυγοκέντριση, παραλήφθηκε το υπερκείμενο και συμπυκνώθηκε σε περιστροφικό εξατμιστήρα, μέχρι του όγκου των 2 ml.

3 Τα δείγματα που παρελήφθησαν (αρχικά εκχυλίσματα) παρέμειναν στο ψυγείο και χρησιμοποιήθηκαν για τις περαιτέρω αναλύσεις και διαχωρισμούς. Προσδιορισμός ολικών φαινολικών Ο προσδιορισμός των ολικών φαινολικών έγινε σύμφωνα με τη φωτομετρική μέθοδο Folin-Ciocalteu. Η καμπύλη βαθμονόμησης έγινε με τη χρήση του γαλλικού οξέος ως ουσία αναφοράς για συγκεντρώσεις mg ml -1. Το ολικό περιεχόμενο των φαινολικών εκφράζεται σε mg γαλλικού οξέος / 100 g στερεού (ξηρού ή νωπού) δείγματος. [5] Προσδιορισμός αντιοξειδωτικής δράσης Η αντιοξειδωτική δράση των διαφόρων αρχικών εκχυλισμάτων (in vitro) μετρήθηκε κυρίως με τη μέθοδο του DPPH (1,1-διφαινυλο-2-πικρυλυδραζύλιο) [6] και για λόγους σύγκρισης με τη μέθοδο του ABTS (2,2 - αζινο- δις(3-αιθυλβενζο-θειζολίνο-6-σουλφονικό οξύ)). [7] Μέτρηση της αναστολής της συγκολλητικότητας των αιμοπεταλίων Η αναστολής της συγκολλητικότητας των αιμοπεταλίων in vitro ενός εκχυλίσματος μετράται σύμφωνα με την οπτική μέθοδο του Born [8]. Μετρήθηκε η επίδραση των υδατικών εκχυλισμάτων στην αναστολή ή μη της συγκολλητικότητας των αιμοπεταλίων του ανθρώπου (σε πειράματα in vitro), που προκλήθηκε με τη χρήση κολλαγόνου και ADP. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Μετά την εκχύλιση των καρπών με διάφορους διαλύτες ακολούθησε ο προσδιορισμός των ολικών φαινολικών σύμφωνα με τη μέθοδο Folin-Ciocalteu και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον πίνακα 1. Πίνακας 1. Ολικά φαινολικά των δειγμάτων εκφρασμένα σε mg γαλλικού οξέος / 100 g δείγματος Διαλύτης Εκχύλισης Goji berry Ιπποφαές Ρόδι Μεθανόλη Χλωροφόρμιο Νερό Παράλληλα, μετρήθηκε η αντιοξειδωτική ικανότητα των δειγμάτων με δύο μεθόδους (DPPH και ABTS) για λόγους σύγκρισης. Η αντιοξειδωτική δράση των δειγμάτων, σύμφωνα

4 με τη μέθοδο του DPPH, δίνεται στον πίνακα 2 και με τη μέθοδο ABTS στον πίνακα 3. Τα αποτελέσματα και στους δύο πίνακες εκφράζονται ως το ποσοστό της ικανότητας δέσμευσης (% Ι.Δ.) του DPPH και ABTS αντίστοιχα, από τα δείγματα, το οποίο προκύπτει από την παρακάτω σχέση: % Ι.Δ.= όπου: Α control η απορρόφηση του διαλύματος DPPH και ABTS αντίστοιχα, Α sample η απορρόφηση του δείγματος (εκχύλισμα μαζί με διάλυμα DPPH) μετά το πέρας των εξήντα λεπτών και Α sample η απορρόφηση του δείγματος (εκχύλισμα μαζί με διάλυμα ΑΒΤS) μετά το πέρας επτά λεπτών Πίνακας 2. Αντιοξειδωτική δράση των εκχυλισμάτων με τη μέθοδο DPPH Διαλύτης Εκχύλισης Goji berry Ιπποφαές Ρόδι Μεθανόλη Χλωροφόρμιο <1 Υδατικό Πίνακας 3. Αντιοξειδωτική δράση των εκχυλισμάτων με τη μέθοδο ABTS Διαλύτης Εκχύλισης Goji berry Ιπποφαές Ρόδι Μεθανόλη Χλωροφόρμιο Υδατικό Με βάση τους παραπάνω πίνακες 1-3, φαίνεται ότι στην περίπτωση του Goji berry και του περικαρπίου του ροδιού, η μεθανόλη και το νερό εκχυλίζουν το μεγαλύτερο ποσοστό φαινολικών σε σχέση με το χλωροφόρμιο. Από τα αποτελέσματα φαίνεται επίσης, να υπάρχει απευθείας σχέση του περιεχομένου των φαινολικών με την αντιοξειδωτική δράση. Σύμφωνα με τον πίνακα 1, διαπιστώνεται ότι η περιεκτικότητα σε φαινολικά του περικαρπίου του ροδιού είναι χαμηλή σε σχέση με τα άλλα δύο φυτά. Επίσης, από τον ίδιο πίνακα προκύπτει ότι για το ιπποφαές τα περισσότερα φαινολικά εκχυλίζονται με το χλωροφόρμιο. Στο χλωροφορμικό εκχύλισμα του ιπποφαούς παρατηρείται μια απόκλιση των αποτελεσμάτων

5 της αντιοξειδωτικής δράσης που ελήφθησαν με τις δύο μεθόδους. Αυτό πιθανόν να οφείλεται στην παρουσία φαινολικών τα οποία αντιδρούν με το ABTS και όχι με το DPPH. Από τη μελέτη της αντιαιμοπεταλιακής δράσης των υδατικών εκχυλισμάτων, (σχήμα 1), φαίνεται ότι μόνο το διάλυμα του ιπποφαούς αναστέλλει σημαντικά τη συγκολητικότητα των αιμοπεταλίων που προκλήθηκε με κολλαγόνο. Ανάλογα αποτελέσματα προέκυψαν και όταν χρησιμοποιήθηκε ADP για τη συγκόλληση των αιμοπεταλίων. Σχήμα 1. Επίδραση των υδατικών εκχυλισμάτων των τριών καρπών στη συγκολλητικότητα των αιμοπεταλίων που προκλήθηκε με κολλαγόνο ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Στο Goji berry και στο ρόδι φαίνεται ότι τόσο η μεθανόλη, όσο και το νερό εκχυλίζουν το μεγαλύτερο ποσοστό των ολικών φαινολικών σε σχέση με το εκχύλισμα του χλωροφορμίου. Παράλληλα, η μέτρηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας των παραπάνω εκχυλισμάτων έδειξε, ότι το χλωροφορμικό εκχύλισμα με τη μικρότερη περιεκτικότητα σε ολικά φαινολικά εμφανίζει και τη μικρότερη αντιοξειδωτική ικανότητα και με τις δύο μεθόδους DPPH και ABTS που χρησιμοποιήθηκαν. Για το ιπποφαές, στο χλωροφορμικό εκχύλισμα, το ολικό περιεχόμενο των φαινολικών ενώσεων φαίνεται να υπερτερεί σε σχέση με τους άλλους δύο διαλύτες. Το ενδιαφέρον είναι ότι η αντιοξειδωτική ικανότητα του χλωροφορμικού εκχυλίσματος παρουσιάζει αποκλίσεις με τις δύο μεθόδους, γεγονός το οποίο πιθανόν οφείλεται είτε στην

6 παρουσία και άλλων ισχυρών αντιοξειδωτικών ενώσεων π.χ. φλαβονοειδών, πέραν των φαινολικών, είτε στην παρουσία φαινολικών τα οποία αντιδρούν με το ABTS και όχι με το DPPH. Επίσης, το ρόδι, παρά τη μικρή περιεκτικότητα σε φαινολικά σε σχέση με τα άλλα δύο φυτά εμφανίζει σημαντική αντιοξειδωτική ικανότητα κυρίως με τη μέθοδο του ABTS. Από τα προκαταρκτικά αυτά πειράματα προέκυψαν ενδιαφέροντα αποτελέσματα και αποτελούν οδηγό για την απομόνωση φαινολικών και άλλων βιολογικά δραστικών ενώσεων από τους καρπούς αυτούς με σκοπό την περαιτέρω αξιοποίησή τους. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Wang, C.C., Chang, S.C., Inbaraj, B. S., Chen, B.H., Isolation of carotenoids, flavonoids and polysaccharides from Lycium barbarum L. and evaluation of antioxidant activity, Food Chemistry 120 (2010) pp [2] Michel, T., Destandau, E., Le Floch, G., Lucchesi, M.E., Elfakir, C., Antimicrobial, antioxidant and phytochemical investigations of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) leaf, stem, root and seed, Food Chemistry 131 (2012) pp [3] Panichayupakaranant, P., Tewtrakul, S., Yuenyongsawad, S., Antibacterial, anti inflammatory and anti-allergic activities of standardized pomegranate rind extract, Food Chemistry 123 (2010) pp [4] Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., and Jimenez, L., Polythenols: food sources and bioavailability, American Journal of Clinical Nutrition. 79:5 (2004) pp [5] Arnnok, P., Ruangviriyachai, C., Mahachai, R., Techawongstien, S., Chanthai, S., Determination of total phenolics and anthocyanin contents in the pericarp of hot chilli pepper (Capsicum annuum L.), International Food Research Journal 19:1 (2012) p [6] Bernardo-Gil, G.M., Roquea, R., Roseiro, L. B., Duarte, L.C., Girio, F., Esteves, P., Supercritical extraction of carob kibbles (Ceratonia siliqua L.), The Journal of Supercritical Fluids 59 (2011) pp

7 [7] Arnao, M. B., Cano, A., Acosta, M., The hydrophilic and lipophilic contribution to total antioxidant activity, Food Chemistry 73:2 (2001) pp [8] Born, G.V.R., and Cross, D.M.J., The aggregation of blood platelets, Journal of Physiology 168 (1963) pp