ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ Εφαρμοσμένη Βιοχημεία: Κλινική χημεία, βιοτεχνολογία και αξιολόγηση φαρμακευτικών προϊόντων ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ TGF-β1 ΚΑΙ ΤΟΥ MIF ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ IL-6 ΑΠΟ ΙΝΟΒΛΑΣΤΕΣ ΡΙΝΙΚΟΥ ΠΟΛΥΠΟΔΑ ΚΑΙ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΠΙΘΑΝΗΣ ΣΥΝΕΡΓΕΙΑΣ ΤΟΥΣ ΣΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΓΙΑ ΤΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ ΓΙΑΝΝΟΥ ΝΟΣΗΛΕΥΤΗΣ, ΙΑΤΡΟΣ, MSc ΠΑΤΡΑ 2013

2

3

4

5

6 Ευχαριστίες Θα ήθελα να αναφερθώ στο σημαντικό ρόλο που επιτέλεσε το τμήμα Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών στην ωρίμανση του τρόπου σκέψης, έρευνας, εργασίας και συνεργασίας. Βασικό κομμάτι αυτής της πορείας αποτέλεσε ο επιβλέπων καθηγήτής μου κ. Αλετράς Αλέξιος, Αναπληρωτής καθηγητής του τμήματος Χημείας, ο οποίος βρισκόταν δίπλα μου στην προσπάθεια περάτωσης της διπλωματικής μου εργασίας στα πλαίσια του μεταπτυχιακού διπλώματος ειδίκευσης: Εφαρμοσμένη Βιοχημεία: Κλινική χημεία, βιοτεχνολογία και αξιολόγηση φαρμακευτικών προϊόντων Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον κ. Σταθόπουλο Γεώργιο, του οποίου η πίστη στις δυνατότητες μου αποτέλεσε αρωγό σε όλους τους στόχους και τα όνειρά μου. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Θεοχάρη Αχιλλέα που δέχτηκε να είναι μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στον κ. Prijovic Zeliko και κ. Ψαλλίδα Ιωάννη και για την ανεκτίμητη προσφορά τους και βοήθεια που μου προσέφεραν με τις συμβουλές τους κατά την εκπόνηση της διπλωματικής αυτής εργασίας. Επιπλέον, σημαντική ήταν και η βοήθεια της κ. Μαραζιώτη Αντωνέλλας και του κ. Σαράντη Κωνσταντίνου που μοιράστηκαν μαζί μου την εμπειρία τους σε άγνωστες για μένα τεχνικές. Δεν θα μπορούσα να μην αναφέρω τη σημασία της υποστήριξης που μου προσέφεραν τα μέλη του εργαστηρίου Μοριακής Καρκινογένεσης του Αναπνευστικού: κ. Κανελλάκης Νικόλαος, κ. Αγαλιώτη Θεοδώρα, κ. Μανιάτης Ελευθέριος, κ. Βρέκα Μαλαματή, κ. Αποστολοπούλου Χαρά και έκαναν το χρονικό διάστημα αυτό μία αξέχαστη εμπειρία. Τη μεγαλύτερη ευγνωμοσύνη όμως οφείλω στην οικογένειά μου, στους φίλους μου Γιαννημάρα Δημήτρη και Αφράτη Νίκο. Την παρούσα εργασία αφιερώνω στη Δήμητρα Ζαζάρα για τη συνεχή ηθική υποστήριξη και ενθάρρυνση της. Αναστάσιος Δ. Γιάννου 1

7

8 Στον πνευματικό μου πατέρα

9

10 Πίνακας περιεχομένων Ευχαριστίες... 1 Εισαγωγή Ρινικός Πολύποδας Γενικά Παθομορφολογία του Ρινικού Πολύποδα Παθογένεια του Ρινικού Πολύποδα Χρόνια τοπική μόλυνση Οικογενειακό ιστορικό και γενετική προδιάθεση Αλλεργία Αεροδυναμικοί παράγοντες Παραγωγή κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων και κύτταρα προέλευσης Επιθηλιακά κύτταρα Ινοβλάστες Ηωσινόφιλα Σιτευτικά κύτταρα Μόρια προσκόλλησης Αυξητικοί παράγοντες Αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού β (TGF-β) Η υπεροικογένεια Βιολογική λειτουργία του TGF-β Υποδοχείς του TGF-β και δεσμευτικές πρωτεΐνες TGF-β σηματοδότηση και πρωτεΐνες Smads Επούλωση τραυμάτων Υπερτροφικές ουλές και χηλοειδή Οστικός σχηματισμός και επούλωση Ογκογένεση... 25

11 Περιεχόμενα 2.9. TGF-β και ρινικός πολύποδας Παράγοντας αναστολής της μετανάστευσης των μακροφάγων (MIF) Γενικά Γονίδιο του MIF Ενζυμική δραστικότητα του MIF και ο αναστολέας ISO Μοριακός μηχανισμός δράσης του MIF Υποδοχέας Εμπλοκή του MIF σε σηματοδοτικά μονοπάτια Υποδοχέας της IL Σηματοδότηση Ρύθμιση Υπερπαραγωγή IL-6 και νόσηση Σκοπός Υλικά Μέθοδοι Αποµόνωση κυττάρων τύπου ινοβλάστης και καλλιέργεια αυτών Μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο Neubauer Κατάψυξη κυττάρων Απόψυξη κυττάρων Απομόνωση ολικού RNA από κύτταρα Προσδιορισμός της συγκέντρωσης RNA Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊνικών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης Προσδιορισμός των επιπέδων mrna με τη χρήση συνδυασμένης αντίστροφης μεταγραφής και αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR) Ανοσοενζυµική µέθοδος ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Απομόνωση και καθαρισμός πρωτεΐνης Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου με αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών Western Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από PVDF μεμβράνη (stripping)... 66

12 Περιεχόμενα 14. Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωμάτων και των πηκτωμάτων αγαρόζης με σύστημα ανάλυσης εικόνας Προσδιορισμός των ενδοκυτταρικών επιπέδων ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS) φθορισμομετρικά Προσδιορισμός ολικής πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Αποτελέσματα Επίδραση του TGF-β1 και του MIF στην παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα και μελέτη των μηχανισμών και σηματοδοτικών μονοπατιών τα οποία εμπλέκονται στην επίδραση αυτή Επίδραση του TGF-β1 στην παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα Μελέτη της εμπλοκής των MAP κινασών και της PI3 κινάσης στην επαγόμενη από TGF-β1 και MIF παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα Επίδραση MIF στην έκφραση της φωσφατάσης-1 των ΜΑΡΚ (MKP-1) σε ινοβλάστες ρινικού πολύποδα Επίδραση του TGF-β1 στη παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα για διάφορους χρόνους επώασης και μελέτη των μηχανισμών και σηματοδοτικών μονοπατιών τα οποία εμπλέκονται στην επίδραση αυτή Επίδραση του TGF-β1 στη παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα για διάφορους χρόνους επώασης Διερεύνηση των μηχανισμών και σηματοδοτικών μονοπατιών που εμπλέκονται στην επαγόμενη από TGF-β1 παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα κατά χρονοεξαρτώμενο τρόπο Μελέτη της εμπλοκής ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS) στην επαγόμενη από TGF-β1 παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα Διερεύνηση της πιθανής συνεργειακής δράσης MIF και TGF-β1 στη παραγωγή της IL-6 από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα Συζήτηση Βιβλιογραφία Περίληψη Συντμήσεις

13

14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

15 Εισαγωγή Εισαγωγή 1. Ρινικός Πολύποδας 1.1. Γενικά Ο όρος πολύποδας (Polyp), που έχει επικρατήσει διεθνώς, έχει ελληνική ρίζα και σημαίνει πολλά πόδια. Όσον αφορά το ρινικό πολύποδα (ΡΠ), η ονομασία είναι αρκετά περιγραφική των μορφωμάτων σχήματος δακρύου στις ρινικές κοιλότητες (Σχ. 1). Ο ΡΠ μπορεί να θεωρηθεί όχι ως μία ασθένεια αλλά ως μία παθολογική κατάσταση για την οποία είναι υπεύθυνο ένα σύμπλεγμα παθογενετικών μηχανισμών οι οποίοι εκδηλώνονται κυρίως σε ένα μικρό ποσοστό των ενηλίκων (1-4,3 % στο γενικό πληθυσμό) (Settipane, 1987). Σύμφωνα με τα πιο πρόσφατα επίσημα δημοσιεύματα η πολυποδίαση της ρινός θεωρείται μία υποκατηγορία της χρόνιας ρινοκολπίτιδας (Fokkens et al., 2005). Σχήμα 1. Ρινικοί Πολύποδες (σχήματος δακρύου) στις ρινικές κοιλότητες ( 2010 Foundation for Medical Education and Research). Πιο συγκεκριμένα, ο ΡΠ είναι μία καλοήθης υπερπλασία του ρινικού βλεννογόνου και των παραρρινικών κοιλοτήτων, αποτελούμενη από οιδηματώδη συνδετικό ιστό ο οποίος καλύπτεται από αναπνευστικό επιθήλιο, που έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη χαρακτηριστικών μορφωμάτων και την απόφραξη των ανωτέρων αναπνευστικών οδών 10

16 Εισαγωγή (Σχ. 2). Ο ΡΠ κατά κύριο λόγο απαντάται στο μέσο ρινικό πόρο και το πιο συχνό σημείο προέλευσης του είναι η μεμβράνη στην έξοδο του κόλπου. Σχήμα 2. Σχηματική παράσταση του ΡΠ στο μέσο ρινικό πόρο ( 2010 Mount Nittany Medical Center). Άν και ο ΡΠ είναι πολύ πιο συχνό φαινόμενο στους ενήλικες, μπορεί να εμφανισθεί και κατά την διάρκεια της παιδικής ηλικίας και συνήθως συσχετίζεται με την κυστική ίνωση ή το σύνδρομο δυσκινησίας των κροσσών (σύνδρομο Kartagener) (Pawliczak et al., 2005). Όταν εμφανίζεται στους ενήλικες, είναι συνήθως αποτέλεσμα χρόνιας παραρρινοκολπίτιδας ή ρινίτιδας. Γενικά, από έρευνες φαίνεται ότι ΡΠ εμφανίζεται σε ένα ποσοστό 1% έως 4.3% του πληθυσμού των ανθρώπων (Settipane, 1996), μία συχνότητα (~ 4%) παρόμοια με αυτή εμφανίσεως του άσθματος, του διαβήτη ή της χρόνιας πνευμονικής απόφραξης. Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι το 30-40% των ανθρώπων με ΡΠ δεν έχουν παρουσιάσει ποτέ άλλα συμπτώματα (Larsen and Tos, 2004). Μέχρι σήμερα η διαταραχή περιορίζεται με χορήγηση κορτιζόνης, αλλά συνήθως αντιμετωπίζεται χειρουργικά και κατά κανόνα παρουσιάζει υποτροπές. Ρινικός Πολύποδας μπορεί να εμφανισθεί σε άτομα με ή χωρίς αλλεργία και μέχρι σήμερα δεν υπάρχει καμία απόδειξη ότι η αλλεργία είναι παράγοντας προδιάθεσης για την ανάπτυξη της ρινικής πολυποδίασης. Παρόλο που τα επίπεδα εμφάνισης ΡΠ σε άτομα με αλλεργία κυμαίνονται σε χαμηλά επίπεδα, τουλάχιστον ένα επεισόδιο βρογχόσπασμου ή κλινικά ενεργού άσθματος αναφέρεται στο 33% των ατόμων με ΡΠ. Άτομα με άσθμα, κινδυνεύουν δύο φορές περισσότερο να αναπτύξουν ΡΠ, σε σχέση με άτομα χωρίς άσθμα, όμως θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι πολύποδες είναι πιο συνηθισμένο φαινόμενο σε ασθενείς χωρίς αλλεργικό άσθμα (13%) σε αντίθεση με αυτούς που πάσχουν από αυτό (5%). Έτσι, φαίνεται ότι το βρογχικό άσθμα σε σχέση με την αλλεργία θα μπορούσε να 11

17 Εισαγωγή θεωρηθεί ένας παράγοντας προδιάθεσης (Settipane, 1996). Τέλος, περισσότερο από το 90% των ασθενών με υπερευαισθησία στην ασπιρίνη και βρογχικό άσθμα παρουσιάζουν ρινική πολυποδίαση μεγαλύτερης έκτασης και σοβαρότητας (Kowalski et al., 2000) Παθομορφολογία του Ρινικού Πολύποδα Οι περισσότεροι ΡΠ αποτελούνται από ψευδοπολύστιβο επιθήλιο, πολλούς αδένες και μικρό αριθμό καλυκοειδών κυττάρων. Ενδοσκοπικές ιστολογικές και μορφολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι οι ΡΠ χαρακτηρίζονται από φλεγμονώδη κυτταρική διήθηση, τροποποιήσεις στη διαφοροποίηση του επιθηλίου και καταστροφή αυτού, ανάπλαση ιστού και δημιουργία οιδήματος, πολλαπλασιασμό ινοβλαστών, συσσώρευση εξωκυττάριας ουσίας, κυρίως κολλαγόνου, πάχυνση της βασικής μεμβράνης και ίνωση (Stierna, 1996). Τα περισσότερα από τα φλεγμονώδη κύτταρα είναι ενεργοποιημένα ηωσινόφιλα, η συσσώρευση των οποίων συνεισφέρει σε όλα τα παραπάνω χαρακτηριστικά και μάλιστα χαρακτηρίζει το 90% των ΡΠ σε σχέση με τη φυσιολογική ρινική κόγχη, είτε φυσιολογικών ατόμων, είτε ατόμων με αλλεργική ρινίτιδα (Stoop et al., 1993). Παρόλα αυτά, η συσσώρευση των ηωσινόφιλων δεν φαίνεται να αποτελεί παθογενετικό αίτιο του ΡΠ. Εκτός των ηωσινόφιλων, των ινοβλαστών και των επιθηλιακών κυττάρων, στο ΡΠ απαντώνται σε μικρό ποσοστό ενδοθηλιακά κύτταρα, φαγοκύτταρα, πλασματοκύτταρα, μακροφάγα, λεμφοκύτταρα και σιτευτικά κύτταρα (Pawliczak et al., 2005) Παθογένεια του Ρινικού Πολύποδα Παρά το γεγονός ότι είναι μια συνηθισμένη πάθηση, η παθογένεια του ΡΠ παραμένει ακόμη άγνωστη. Οι παράγοντες όμως οι οποίοι θεωρούνται περισσότερο σημαντικοί σε αυτήν είναι: η χρόνια τοπική μόλυνση, το οικογενειακό ιστορικό και η γενετική προδιάθεση, η ατοπία και η αλλεργία σε περιβαλλοντικά και διατροφικά αλλεργιογόνα, και οι αεροδυναμικοί παράγοντες. Οι παράγοντες αλλά και οι διαδικασίες οι οποίες συμβάλλουν στην παθογένεια του ΡΠ φαίνονται συνοπτικά στο Σχήμα 3. 12

18 Εισαγωγή Χρόνια τοπική μόλυνση Μέχρι σήμερα έχουν γίνει αρκετές προσπάθειες μελέτης της σημασίας της χρόνιας τοπικής μόλυνσης της ρινός ή των παραρρινικών κοιλοτήτων στην παθογένεια του ΡΠ. Στις περισσότερες όμως μελέτες η παρουσία αερόβιων ή αναερόβιων βακτηρίων ήταν λιγότερο από το 50% των περιπτώσεων, χωρίς να υπάρχει οποιαδήποτε συσχέτιση με την έκταση της νόσου ή τον αριθμό των Σχήμα 3. Παράγοντες και διαδικασίες οι οποίες συμβάλουν στην παθογένεια του ΡΠ (Pawliczak et al., 2005). χειρουργικών επεμβάσεων (Dunnette et al., 1986; Dawes et al., 1989). Αξίζει να σημειωθεί ότι άτομα με συνακόλουθο βρογχικό άσθμα φαίνεται να έχουν περισσότερες αερόβιες μολύνσεις στον ιστό του ΡΠ (Dunnette et al., 1986). Σε κάποια έρευνα μεταξύ 104 ατόμων με ΡΠ, η παρουσία βακτηρίων παρατηρήθηκε μόνο στο 15.3%, γεγονός το οποίο υποδεικνύει πως δεν υπάρχει καμία άμεση σχέση μεταξύ της πολυποδίασης και της χρόνιας βακτηριακής, μυκητιακής ή ιογενούς μόλυνσης (Dawes et al., 1989). Αντίστοιχες ενδείξεις υπάρχουν και από μελέτες ζωικών μοντέλων οι οποίες δείχνουν ότι οι ΡΠ μπορούν να δημιουργηθούν χωρίς την παρουσία παραγόντων μόλυνσης. Από την άλλη πλευρά, σε περιπτώσεις ατόμων με χρόνια ρινοκολπίτιδα, η μυκητιακή μόλυνση φαίνεται ότι είναι ικανή να προκαλέσει ηωσινοφιλική φλεγμονή σε αυτούς και κατ επέκταση χρόνια φλεγμονή των αναπνευστικών οδών, ρινική πολυποδίαση και στη συνέχεια συμπτώματα άσθματος. 13

19 Εισαγωγή Από τα δεδομένα αυτά φαίνεται ότι τα παθογόνα μπορούν να παίξουν ένα σημαντικό ρόλο στην αύξηση μίας φλεγμονώδους απάντησης, η οποία όταν δεν ελέγχεται μπορεί να οδηγήσει σε χρόνια φλεγμονή με ανάπλαση του συνδετικού ιστού. Ωστόσο, βακτηριακές ενδοτοξίνες μπορούν να ενεργοποιήσουν λεμφοκύτταρα και επιθηλιακά κύτταρα και αυτά στη συνέχεια να συνθέσουν IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, TGF-β και άλλες κυτταροκίνες οδηγώντας στην έκφραση μορίων προσκόλλησης, στην αδενώδη υπερπλασία και στον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών. Έτσι, η οξεία και / ή η χρόνια μόλυνση μπορεί να θεωρηθεί ένα σημαντικό ερέθισμα για την έναρξη ανοσολογικών διαδικασιών οι οποίες οδηγούν στη ρινική πολυποδίαση (Pawliczak et al., 2005) Οικογενειακό ιστορικό και γενετική προδιάθεση Το 14% των ατόμων με ΡΠ έχει θετικό οικογενειακό ιστορικό και περίπου οι μισοί από αυτούς είχαν τουλάχιστον ένα πρώτου βαθμού συγγενικό μέλος με ΡΠ (Greisner and Settipane, 1996). Υπάρχουν αναφορές από μελέτες οι οποίες δείχνουν πως υπάρχει σχέση ανάμεσα στον ΡΠ και τις πρωτεΐνες των συμπλόκων μέγιστης ιστοσυμβατότητας και πιο συγκεκριμένα τις HLA-A1 B1 και ΗLA-A74, όπου ο φαινότυπος του τελευταίου φαίνεται να παρουσιάζεται με σχετικά μειωμένη συχνότητα (Luxenberger et al., 2000). Παρόλη την αποδοχή γενετικής προδιάθεσης για τη ρινική πολυποδίαση, φαίνεται πως αυτή είναι περιορισμένη λόγω του χαμηλού ποσοστού των ασθενών και ήδη πραγματοποιούνται μελέτες για γενετικές σχέσεις με άλλους κλινικούς φαινοτύπους οι οποίοι σχετίζονται με την παθογένεια του ΡΠ Αλλεργία Παρόλο που ο ΡΠ έχει θεωρηθεί ως μία εκδήλωση αλλεργίας, τα δεδομένα όσον αφορά την ατοπία σε άτομα με ΡΠ δεν έρχονται σε συμφωνία (Caplin et al., 1971). Από συγκεκριμένες μελέτες (Asero and Bottazzi, 2001), έχει δειχθεί ότι το 44% των ατόμων με ΡΠ είχε ειδικές IgE ανοσοσφαιρίνες έναντι ενός συγκεκριμένου αλλεργιογόνου (Candida albicans) καθώς επίσης ότι το 24% παρουσίαζε ευαισθησία στα ακάρεα σκόνης του σπιτιού. Αξίζει να σημειωθεί ότι στην ίδια έρευνα δείχθηκε ότι πάνω από το 70% των ατόμων με ΡΠ ήταν αλλεργικοί σε συνήθη αλλεργιογόνα (όπως τρίχες ζώων, αράχνες). (Asero and Bottazzi, 2001). 14

20 Εισαγωγή Σε αντίθεση με τα προηγούμενα, σε μία έρευνα με 3000 άτομα με αλλεργία, μόνο το 0.5% είχε ΡΠ, όπως διαπιστώθηκε με ρινοσκόπηση (Caplin et al., 1971). Σε πιο πρόσφατες έρευνες η επίπτωση της ατοπίας βρέθηκε να είναι λιγότερο συχνή σε άτομα με ΡΠ από ότι στο γενικό πληθυσμό ή σε ασθενείς με ρινίτιδα. Άτομα με αλλεργική ρινίτιδα και άτομα με ΡΠ είχαν την ίδια ανοσοαπάντηση σε ολοετή και εποχικά αλλεργιογόνα, αλλά οι τελευταίοι παρουσίασαν μικρότερη ευαισθησία στα ολοετή αλλεργιογόνα (Van Lancker et al., 2005). Παρόλα αυτά ο ρόλος των IgE ανοσοσφαιρινών, οι οποίες παράγονται τοπικά μετά από επίδραση αλλεργιογόνων, δεν μπορεί να αποκλεισθεί ως παθογενετικός παράγων του ΡΠ Αεροδυναμικοί παράγοντες Το σύμπλεγμα του μέσου ρινικού πόρου παίζει σημαντικό ρόλο στην κυκλοφορία του αέρα μεταξύ της ρινικής κοιλότητας και των παραρρινικών κοιλοτήτων. Η λειτουργία του βλεννοκροσσωτού επιθηλίου βοηθάει στην απομάκρυνση βακτηρίων και αλλεργιογόνων. Η απόφραξη του συμπλέγματος του μέσου ρινικού πόρου (από οίδημα, φλεγμονή, σκολίωση του ρινικού διαφράγματος ή τραυματισμό του βλεννογόνου) μπορεί να παρεμποδίσει την παραπάνω διαδικασία προκαλώντας φλεγμονή του βλεννογόνου. Όταν αυτή η κατάσταση γίνει χρόνια, μπορεί στο τέλος να οδηγήσει στη δημιουργία ΡΠ (Pawliczak et al., 2005) Παραγωγή κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων και κύτταρα προέλευσης Ανεξάρτητα από την άγνωστη αιτιολογία, η ρινική πολυποδίαση χαρακτηρίζεται από μία εκτεταμένη φλεγμονώδη διαδικασία συνδυασμένη με την παραγωγή διαφόρων μεσολαβητών, κυτταροκινών και αναπτυξιακών παραγόντων τόσο από κύτταρα των παρακείμενων ιστών όσο και φλεγμονώδη κύτταρα από διήθηση. Ο ρόλος των κυττάρων, μεσολαβητών, κυτταροκινών και αναπτυξιακών παραγόντων στη παθογένεια του ΡΠ φαίνεται συνοπτικά στο Σχήμα 4. 15

21 Εισαγωγή Επιθηλιακά κύτταρα Τα επιθηλιακά κύτταρα του ρινικού βλεννογόνου θεωρούνται τα πρωτογενή κύτταρα τα οποία ενεργοποιούνται από παράγοντες του περιβάλλοντος και είναι ικανά να ξεκινήσουν έναν καταρράκτη διαδικασιών φλεγμονής, οι οποίες μπορεί να οδηγήσουν στη δημιουργία πολύποδα. Στους ΡΠ τα επιθηλιακά κύτταρα παράγουν μια ποικιλία από κυτταροκίνες και αυξητικούς παράγοντες όπως IL-8, GM-CSF, IL-6, IL-1β, TNF-α, VEGF, RANTES (Mullol et al., 1995; Wittekindt et al., 2002) και εοταξίνη (Rankin et al., 2000). Οι παράγοντες αυτοί μπορούν να προσελκύουν ηωσινόφιλα και λεμφοκύτταρα από την περιφερική κυκλοφορία, να ενεργοποιούν κύτταρα, να αυξάνουν την επιβίωση τους και συνεπώς να συνεισφέρουν στην ανάπτυξη της τοπικής φλεγμονής. Σχήμα 4. Ρόλος των κυττάρων, μεσολαβητών, κυτταροκινών και αναπτυξιακών παραγόντων, που σχετίζονται με την παθογένεια του ΡΠ (Pawliczak et al., 2005). 16

22 Εισαγωγή Ινοβλάστες Οι ινοβλάστες είναι ο τύπος των κυττάρων που παίζουν το σημαντικότερο ρόλο στην ανάπλαση του εξωκυτταρικού χώρου (ECM) (Eckes et al., 1999). Μετά από την ενεργοποίηση και τον πολλαπλασιασμό τους από διάφορους παράγοντες είναι υπεύθυνες για την υπερβολική εναπόθεση εξωκυτταρικού υλικού, κυρίως κολλαγόνου τύπου-ι το οποίο είναι το κυριότερο συστατικό του ECM, με αποτέλεσμα την αλλαγή στην αρχιτεκτονική του ιστού και παθολογική κατάσταση, η οποία χαρακτηρίζεται από ίνωση (Trojanowska et al., 1998). Οι ινοβλαστών στον ΡΠ είναι επίσης υπεύθυνες για την παραγωγή και έκκριση κυτταροκινών, όπως IL-1β, IL-8, GM-CSF, RANTES και εοταξίνη, που η έκφραση των γονιδίων τους αυξορυθμίζεται από βακτηριακές ενδοτοξίνες και τον TNF-α. Στους ΡΠ, ο TNF-α φαίνεται να εκκρίνεται περισσότερο από ουδετερόφιλα, μονοκύτταρα και ηωσινόφιλα (Finotto et al., 1994) Ηωσινόφιλα Τα ηωσινόφιλα στο ΡΠ είναι μία ισχυρή πηγή μεσολαβητών φλεγμονής (MBP, EPO και LTC4), ικανών να επάγουν την αγγειακή διαπερατότητα και την εξοίδηση του πλάσματος, βοηθώντας στην έναρξη της φλεγμονώδους διαδικασίας. Επιπροσθέτως, τα ηωσινόφιλα είναι υπεύθυνα για την σημαντική παραγωγή αναπτυξιακών παραγόντων, όπως ο TNF-α, η MIP-1α, ο TGF-β1, 2 και 3 καθώς και ο TGF-α. Η έκφραση του TGF-β (κυρίως του TGF-β1) έχει βρεθεί ότι είναι αυξημένη στους ΡΠ σε σχέση με το φυσιολογικό ρινικό βλεννογόνο, όπως επίσης ότι ο ρόλος του είναι πολύ σημαντικός στην ανάπλαση του ιστού του ΡΠ (Ohno et al., 1992). Ο TGF-β1 μπορεί να επάγει την τροποποίηση των ινοβλαστών και επιθηλιακών κυττάρων και την αυξορύθμιση του VEGF, συνεισφέροντας στην παθογένεια του ΡΠ. Η έκφραση του TGF-β βρέθηκε ότι είναι 3.2 φορές μεγαλύτερη σε άτομα με χρόνια ρινοκολπίτιδα και ΡΠ από αυτή των ασθενών με χρόνια ρινοκολπίτιδα μόνο. Επίσης, άτομα με χρόνια ρινοκολπίτιδα και ΡΠ παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση σε απόκκριση της χορήγησης IL-4, γεγονός το οποίο υποδηλώνει ότι ένας μηχανισμός εξαρτώμενος από τα Th2 κύτταρα μπορεί να είναι υπεύθυνος για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του στρώματος και την δημιουργία του ΡΠ (Bradley et al., 2005). Τα ηωσινόφιλα εκφράζουν επίσης σε σημαντικό βαθμό GM-CSF (Ohno et al., 1991), IL-5 (κυρίως για μη αλλεργικά άτομα) (Bachert et al., 1997) και IL-4, η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στα αγγεία του ρινικού βλεννογόνου 17

23 Εισαγωγή αυξάνοντας την έκφραση του VCAM-1 (Bachert et al., 1997). Τέλος, για την συσσώρευση των ηωσινόφιλων ο κύριος παράγοντας προσέλκυσης είναι η εοταξίνη, η οποία αναφέρεται στη συνέχεια Σιτευτικά κύτταρα Τα σιτευτικά κύτταρα θεωρούνται ότι είναι η κύρια πηγή του VEGF και του bfgf στο ΡΠ (Norlander et al., 2001). Η άλλη σημαντική πηγή του VEGF είναι οι ινοβλάστες (Wittekindt et al., 2002). Αυτοί οι δυο αυξητικοί παράγοντες μπορούν να συνεισφέρουν στην παθογένεια του ΡΠ αυξάνοντας τον αριθμό των αγγείων και επάγοντας τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών Μόρια προσκόλλησης Μόρια προσκόλλησης, όπως VCAM-1, Ε-Σελέκτίνη και ICAM-1 εκφράζονται στο ΡΠ από τα επιθηλιακά κύτταρα. Η έκφραση του VCAM-1 είναι πολύ μεγαλύτερη στα αγγεία του ΡΠ σε σχέση με το βλεννογόνο της ρινικής κόγχης. Τέλος, ο αριθμός των ενδοθηλιακών κυττάρων τα οποία εκφράζουν τον VCAM-1 σχετίζεται με κύτταρα στα οποία υπάρχει διέγερση της έκφρασης του TNF-α αλλά και με τον αριθμό των ηωσινόφιλων (Jahnsen et al., 1997) Αυξητικοί παράγοντες Συγκριτικά με το ρινικό βλεννογόνο, στο ΡΠ εκφράζονται από τα επιθηλιακά κύτταρα σε πολύ μεγάλο ποσοστό αυξητικοί παράγοντες όπως ο VEGF, του οποίου η έκφραση ρυθμίζεται από τον TGF-β1, καθώς επίσης και οι υποδοχείς του EGF. Επίσης, διάφοροι άλλοι μεσολαβητές και κυτταροκίνες έχουν βρεθεί στον ιστό του ΡΠ σε πολύ υψηλά επίπεδα σε σχέση με τη ρινική κόγχη, όπως η τρυπτάση 1β, η συνθάση της προσταγλανδίνης D2, η IL-1β, η εοταξίνη και η εοταξίνη-2 (Fritz et al., 2003). Η εοταξίνη, που παράγεται πρωτογενώς από τις ινοβλάστες, είναι ένας πολύ σημαντικός χημειοτακτικός παράγοντας, ο οποίος πιθανά παίζει σημαντικό ρόλο στη παθογένεια του ΡΠ (Nonaka et al., 1999). Η παραγωγή της ρυθμίζεται από τον TNF-α, την IL-1β και τη βακτηριακή ενδοτοξίνη και επίπεδα έκφρασής της σχετίζονται με τα επίπεδα της ECP και 18

24 Εισαγωγή με την ιστική ηωσινοφιλία, συμβάλλοντας στην πολύ μεγάλη χημειοτακτική δραστικότητα του μεσοκυττάριου υγρού του ΡΠ για τα ηωσινόφιλα. 2. Αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού β (TGF-β) (Chin D. et al., 2003) Ο TGF-β ανακαλύφθηκε χάριν στην ικανότητα του να «μεταμορφώνει» ινοβλάστες ποντικών, από ερευνητές που μελετούσαν τον αυξητικό παράγοντα των αιμοπεταλίων (PDGF) και τους επιδερμικούς αυξητικούς παράγοντες (EGF, TGF-α), το Αρχικά, ο παράγοντας που ανευρέθηκε ονομάστηκε παράγοντας ανάπτυξης σαρκώματος (SGF) και αργότερα, διαπιστώθηκε ότι αποτελείται από δυο ξεχωριστούς παράγοντες: TGF-α και TGF-β. ο TGF-α σήμερα ονομάζεται EGF και σε γενικές γραμμές, ενισχύει την ανάπτυξη ποικίλων επιθηλιακών κυτταρικών τύπων. Ο TGF-β είναι μια εξωκυττάρια πρωτεΐνη η οποία παράγεται, κατά κύριο λόγο, από μια υποομάδα T- κυττάρων, αλλά εκφράζεται σε όλα τα κύτταρα. Επιπρόσθετες σημαντικές πηγές του TGF-β αποτελούν τα αιμοπετάλια, τα μακροφάγα, τα ουδετερόφιλα, τα οστά και οι μαλακοί ιστοί, όπως ο πλακούντας, οι νεφροί, το ενδομήτριο, και διάφορα κακοήθη κύτταρα. Στα θηλαστικά, έχουν αναγνωριστεί, έως τώρα, τρεις ισομορφές του TGF-β. Και οι τρεις αυτές πρωτεΐνες (TGF-β 1-3) μοιράζονται εκτεταμένες παρόμοιες περιοχές στην αλληλουχία των αμινοξέων τους. Κάθε ισομορφή προκύπτει από διαφορετικό γονίδιο και χρωμόσωμα. Το γονίδιο του TGF-β1 εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 19q και παράγει μια μεγάλη ομοδιμερή πρωτεΐνη (25 kda). Η πρωτεΐνη TGF-β εκκρίνεται από τα κύτταρα ως πρωτεϊνικό σύμπλοκο υψηλού μοριακού βάρους, το οποίο αποτελείται από τρεις πρωτεΐνες, το ώριμο TGF-β διμερές, το TGF-β διμερές προπεπτίδιο ή LAP (latency associated protein), και τη δεσμευτική πρωτεΐνη (LTBP). O TGF-β ενεργοποιείται με διάσταση του LAP πεπτιδίου από το ώριμο TGF-β διμερές. Η πρώτη ισομορφή που ανακαλύφθηκε ήταν ο TGF-β Η υπεροικογένεια O ΤGF-β ανήκει σε μια ομάδα πρωτεϊνών, η οποία συνολικά χαρακτηρίζεται ως «υπεροικογένεια του TGF-β», τα μέλη της οποίας ρυθμίζουν την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση, την κινητικότητα, την οργάνωση, την απόπτωση και την ογκογένεση των 19

25 Εισαγωγή επιθηλιακών κυττάρων. Οι ρόλοι των περισσότερων από αυτές τις πρωτεΐνες δεν έχουν σαφώς αναγνωριστεί, όμως ορισμένες, όπως οι μορφογενετικές πρωτεΐνες των οστών (bone morphogenetic proteins, BMP), οι παράγοντες ανάπτυξης και διαφοροποίησης (GDF), οι ακτιβίνες, οι ινχιμπίνες και ο παράγοντας αναστολής της μετανάστευσης των μακροφάγων (MIF), είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν την ανάπτυξη των κυττάρων. H υπεροικογένεια του TGF-β περιλαμβάνει, μέχρι στιγμής, εκατό πρωτεΐνες, οι οποίες διαθέτουν τουλάχιστον μια περιοχή παρόμοιας αλληλουχίας αμινοξέων (ομόλογη περιοχή), συνήθως στο καρβοξυτελικό άκρο. Ορισμένες από αυτές τις πρωτεΐνες συμμετέχουν στη διαμόρφωση του σώματος κατά την εμβρυογένεση, άλλες ελέγχουν τον σχηματισμό του αρθρικού χόνδρου, των οστών και των γεννητικών οργάνων, καταστέλλουν την ανάπτυξη των επιθηλιακών κυττάρων, ενισχύουν την επούλωση των τραυμάτων, ή ρυθμίζουν σημαντικές ανοσολογικές και ενδοκρινικές λειτουργίες Βιολογική λειτουργία του TGF-β Ο TGF-β ασκεί ρυθμιστική δράση σε ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών τύπων. Ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση, τον σχηματισμό των οστών, την αγγειογένεση, την αιμοποίηση, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και την κυτταρική μετανάστευση. Όλες οι παραπάνω διεργασίες είναι σημαντικές για την ανάπτυξη των ιστών και την επούλωση των τραυμάτων. Επίσης, ο TGF-β ρυθμίζει ποικίλους ενδοκυττάριους διακόπτες. Δρα τόσο ως διεγέρτης όσο και ως αναστολέας της κυτταρικής αντιγραφής και ελέγχει την παραγωγή της εξωκυττάριας ουσίας. Ο TGF-β διεγείρει την σύνθεση κολλαγόνου, ινονεκτίνης, πρωτεογλυκανών, τενασκίνης, θρομβοσποντίνης, αναστολέα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου 1 (PAI-1) και ιστικού αναστολέα μεταλλοπρωτεϊνασών 1 (TIMP-1). O TGF-β διεγείρει κύτταρα μεσεγχυματικής προέλευσης και αναστέλλει τον επιθηλιακό πολλαπλασιασμό (αντιμιτογόνος δράση). Επάγει την απόπτωση και ελέγχει την μορφογένεση συμβάλλοντας στην εναπόθεση εξωκυττάριας ουσίας και στην ανάπλαση ιστού. Ο TGF-β είναι, ακόμη, μια νευροπροστατευτική πρωτεΐνη. Διεγείρει την σύνθεση του παράγοντα ανάπτυξης νευρικού ιστού σε καλλιέργειες αστροκυττάρων και σε νεογνικούς εγκεφάλους in vivo και παρεμποδίζει την εκφύλιση και το θάνατο μεμονωμένων νευρώνων σε καλλιέργεια. 20

26 Εισαγωγή 2.3. Υποδοχείς του TGF-β και δεσμευτικές πρωτεΐνες Όλα τα κύτταρα του ανθρώπινου σώματος έχουν υποδοχείς για τον TGF-β. Μέχρι στιγμής, έχουν αναγνωριστεί εννέα μεμβρανικοί πρωτεϊνικοί υποδοχείς. Υπάρχουν πολλοί τύποι επιφανειακών υποδοχέων οι οποίοι συνδέονται με διαφορετικά μόρια TGF-β με διαφορετική συγγένεια κάθε φορά. Οι πιο διαδεδομένοι είναι οι TGF- β υποδοχείς Ι και ΙΙ με μοριακή μάζα 53 και 70 kda, αντίστοιχα (Σχ. 5). Η απώλεια των υποδοχέων τύπου Ι ή τύπου ΙΙ σχετίζεται με απώλεια της κυτταρικής απάντησης στον TGF-β. Διαφορετικοί τύποι κυττάρων μπορεί να έχουν διαφορετικό υπότυπο υποδοχέα. Αντίθετα με τους υποδοχείς των EGF, PDGF και FGF παραγόντων, όλοι οι TGF-β υποδοχείς διαθέτουν εγγενή δραστικότητα κινάσης σερίνης/θρεονίνης και επομένως, επάγουν διακριτούς καταρράκτες μεταγωγής σήματος TGF-β σηματοδότηση και πρωτεΐνες Smads (Liu R. et al., 2010) Μετά από δέσμευση με τους επιφανειακούς υποδοχείς τους, οι TGF-β πρωτεΐνες μεταδίδουν το σήμα σε μια ενδοκυττάρια πρωτεΐνη η οποία ονομάζεται Smad (Σχ. 5). Οι πρωτεϊνες Smad πήραν το όνομα τους από τις ομόλογες με τους TGF-β/BMP περιοχές που βρίσκονται στις ασκαρίδες C.elegans και στη drosophila. Όλα τα μέλη της υπεροικογένειας του TGF-β επάγουν σηματοδότηση μέσω πρωτεϊνών Smad. Ο ακριβής τρόπος με τον οποίο τα μέλη της υπεροικογένειας του TGF-β ρυθμίζουν τόσο διαφορετικές και σημαντικές αναπτυξιακές διεργασίες όπως η μεσεγχυματική διαφοροποίηση, η οστική μορφογένεση και η ανάπτυξη του δέρματος, ήταν άγνωστος μέχρι την ανακάλυψη των συγκεκριμένων ενδοκυττάριων πρωτεϊνών πριν από αρκετά χρόνια. Μετάλλαξη των Smad πρωτεϊνών ή των επιφανειακών υποδοχέων, μεμονωμένα ή σε συνδυασμό, σχετίζεται με καρκινογένεση και άλλες παθολογικές καταστάσεις. Εκτός του μονοπατιού Smad, φαίνεται ότι και άλλα μονοπάτια τα οποία περιλαμβάνουν πρωτεϊνικές κινάσες που ενεργοποιούνται από μιτογόνα (MAPKs) είναι επίσης σημαντικά στην σηματοδότηση του TGF-β. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι ο TGF-β αυξάνει την παραγωγή των ενεργών ειδών οξυγόνου και αζώτου (ROS και RNS), κάτι που ενεργοποιεί τα μονοπάτια των MAPK σε ποικίλους κυτταρικούς τύπους. Οι οξειδοαναγωγικά ευαίσθητοι στόχοι στα μονοπάτια σηματοδότησης του TGF-β και των MAPK δεν έχουν ακόμη αναγνωριστεί. Οι ΜΑP κινάσες ενεργοποιούνται με 21

27 Εισαγωγή φωσφορυλίωση καταλοίπων θρεονίνης και τυροσίνης από κινάσες των MAP κινασών, οι οποίες έχουν και αυτές φωσφορυλιωθεί και ενεργοποιηθεί από κινάσες των κινασών των MAP κινασών. Οι ενεργοποιημένες MAP κινάσες μπορούν να απενεργοποιηθούν με αποφωσφορυλίωση καταλοίπων θρεονίνης, καταλοίπων τυροσίνης ή και των δυο, αντίδραση που καταλύεται από την ειδική για θρεονίνη και σερίνη φωσφατάση των MAP κινασών (MKPs),την ειδική για τυροσίνη MKPs, και τη διπλής ειδικότητας MKPs, αντίστοιχα. Παρότι δεν έχει ξεκαθαριστεί ακόμα εάν τα ROS/RNS μπορούν να ενεργοποιήσουν άμεσα τις MAP κινάσες, υπάρχουν στοιχεία τα οποία υποστηρίζουν ότι πολλές από τις φωσφατάσες των MAP κινασών, ιδιαίτερα οι διπλής ειδικότητας MΚΡs, οι οποίες περιέχουν ένα οξειδοαναγωγικά ευαίσθητο μοτίβο κυστεΐνης στα ενεργά τους κέντρα, παρουσιάζουν ευαισθησία σε οξειδωτική απενεργοποίηση από τα ROS/RNS. Σε διάφορες μελέτες, έχει διαπιστωθεί ότι ο TGF-β1 διεγείρει την παραγωγή ROS σε ινοβλάστες εμβρύων ποντικού (κύτταρα ΝΙΗ3Τ3) κάτι που οδηγεί σε ενεργοποίηση των JNK και p38 MAPKs και σε επαγωγή του αναστολέα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου 1 (PAI-1), μιας ανασταλτικής πρωτεάσης που κατέχει σημαντικό ρόλο σε ποικίλες παθολογικές καταστάσεις συμπεριλαμβανομένης της ίνωσης. Οι οξειδάσες NADPH (Noxs) είναι μια οικογένεια πρωτεϊνών που περιέχουν αίμη και δρουν μεταφέροντας ηλεκτρόνια από το NAD(P)H στο μοριακό O2 με αποτέλεσμα την παραγωγή ROS. Παρότι οι βιολογικές τους λειτουργίες παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες, υπάρχουν αποδείξεις ότι η οικογένεια των ενζύμων Nox συνεισφέρουν σημαντικά στην παραγωγή των ROS τόσο στα φαγοκύτταρα όσο και σε άλλα κύτταρα που δεν διαθέτουν φαγοκυτταρική δράση. Έχουν αναγνωριστεί επτά μέλη της οικογένειας των Nox/Dual οξειδασών (Duox, οι οποίες έχουν ομόλογη περιοχή υπεροξειδάσης και αντίστοιχη περιοχή οξειδάσης): Nox1, Nox2, Nox3, Nox4, Nox5,Duox1, και Duox2. Διαφορετικές Nox/Duox πρωτεϊνες εκφράζονται σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων ή ιστών, εκλυόμενες από διαφορετικά ερεθίσματα. Έχει αναφερθεί ότι ο TGF-β αυξάνει ειδικά την έκφραση της Nox4 και την παραγωγή ROS σε πολλούς τύπους κυττάρων, όπως τα λεία μυικά κύτταρα, τα ηπατοκύτταρα και οι ινοβλάστες, με αποτέλεσμα την επαγωγή του πολλαπλασιασμού των λείων μυικών κυττάρων, της ηπατοκυτταρικής απόπτωσης και της διαφοροποίησης των μυοϊνοβλαστών από τον TGF-β. Ο τρόπος με τον οποίο η επαγωγή της Nox4 και η παραγωγή των ROS εμπλέκονται στις δράσεις του TGFβ, καθώς και οι κρίσιμοι μοριακοί στόχοι των ROS στο μονοπάτι σηματοδότησης του TGF-β παραμένουν ασαφείς (Liu R. et al., 2010). 22

28 Εισαγωγή Σχήμα 5. Σχηματική παράσταση της πορείας δέσμευσης του TGF-β1 στις υπομονάδες του υποδοχέα του, και της πορείας της περαιτέρω κυτταρικής σηματοδότησης Επούλωση τραυμάτων O TGF-β φαίνεται να ενισχύει την αποκατάσταση των τραυματισμένων ιστών σε πολλές μελέτες. Μετά από τοπική εφαρμογή του, παρατηρείται βελτίωση της επούλωσης σε ποικίλους τύπους τραυμάτων, όπως τα χειρουργικά τραύματα και τα έλκη. Η συστηματική χορήγηση μιας μόνο δόσης TGF-β πριν τον τραυματισμό, έχει, επίσης, διαπιστωθεί ότι αυξάνει την ιστική ανάπλαση. Επιπλέον, o TGF-β παίζει σημαντικό ρόλο στην αποκατάσταση των οστών. Σε μοντέλο ποντικών, η χορήγηση δόσης TGF-β μικρότερης του ενός μικρογραμμαρίου οδήγησε στην σύγκλειση τραύματος του κρανίου το οποίο, υπό άλλες συνθήκες, δεν θα επουλωνόταν. Σε τυχαιοποιημένη, τυφλή μελέτη που περιελάμβανε 270 ασθενείς με έλκη κατακλίσεως και τοπική εφαρμογή TGF-β3 παρατηρήθηκε ότι οι ασθενείς που έλαβαν θεραπεία εμφάνισαν στατιστικά σημαντικό όφελος σε σχέση με αυτούς που έλαβαν placebo. 23

29 Εισαγωγή 2.6. Υπερτροφικές ουλές και χηλοειδή Σε άτομα με γενετική προδιάθεση, η επούλωση των τραυμάτων μπορεί να οδηγήσει σε σχηματισμό υπερτροφικής ουλής ή χηλοειδούς, με χαρακτηριστικά μεγάλη εναπόθεση εξωκυττάριας ουσίας. Πρόσφατα, διαπιστώθηκε ότι οι υπερτροφικές ουλές συνοδεύονται από ανώμαλη διαφοροποίηση και πολλαπλασιασμό των κερατινοκυττάρων, καθώς και σημαντικά αυξημένη ακάνθωση, σε σύγκριση με τις φυσιολογικές ουλές. Σε μελέτη που αφορούσε ουλές σχηματιζόμενες μετά από επεμβάσεις μείωσης μεγέθους του στήθους, παρατηρήθηκε ότι η διαφορά στις ισομορφές του TGF-β τόσο της επιδερμίδας όσο και του δέρματος, ρυθμίζει την ανάπτυξη φυσιολογικών και υπερτροφικών ουλών. Η παθογένεια των χηλοειδών παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Τα χηλοειδή αντιπροσωπεύουν μια απορυθμισμένη απάντηση σε τραυματισμό του δέρματος η οποία οδηγεί σε υπερβολική συσσώρευση εξωκυττάριας ουσίας, ιδιαίτερα κολλαγόνου. Ο TGF-β παίζει κρίσιμο ρόλο στην παθογένεια του χηλοειδούς και της υπερτροφικής ουλής μέσω διακριτών μοριακών μηχανισμών. Οι τρεις ισομορφές του TGF-β έχουν διαφορετικές βιολογικές δραστικότητες όσον αφορά στην αποκατάσταση των τραυμάτων. Ο TGF-β1 και o TGF-β2 θεωρείται ότι προάγουν την ίνωση και τον σχηματισμό ουλής, ενώ ο TGF-β3 δεν επάγει αλλά ούτε μειώνει την ουλοποίηση. Η συγκέντρωση των TGF-β1 και TGF-β2 είναι υψηλότερη σε καλλιέργειες ινοβλαστών χηλοειδούς από ότι σε καλλιέργειες φυσιολογικών ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών Οστικός σχηματισμός και επούλωση Τα οστεοκύτταρα υπόκεινται σε ρύθμιση από συστηματικούς (ορμόνες) και τοπικούς (προερχόμενους από τα οστά) παράγοντες. Τα αποτελέσματα της δράσης των ορμονών είναι γνωστά, όμως οι τοπικοί αυξητικοί παράγοντες των οστών αναγνωρίστηκαν και χαρακτηρίστηκαν μόλις την τελευταία δεκαετία. Τα οστά αποτελούν την μεγαλύτερη αποθήκη αυξητικών παραγόντων του σώματος και πρωτίστως συντίθενται από τους οστεοβλάστες. Τόσο ο TGF-β όσο και οι οστικές μορφογενετικές πρωτεΐνες (BMPs) συμβάλλουν σημαντικά στο σχηματισμό και την αποκατάσταση των οστών. Η ομάδα των BMPs είναι ένα ακόμα μέλος της υπεροικογένειας του TGF-β. Έως τώρα, έχουν αναγνωριστεί είκοσι ισομορφές BMP. Οι πρωτεϊνες BMP-2,4 και 7 είναι 24

30 Εισαγωγή απαραίτητες για τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών, την ανάπτυξη και τη διαμόρφωση των οστών. Η τοπική χορήγηση TGF-β, in vivo, αυξάνει τον οστικό σχηματισμό και τη χονδρογένεση. Ο TGF-β, επίσης, μεταβάλλει την έκφραση πολλών γονιδίων άμεσα σχετιζόμενων με την οστεοβλαστική δραστηριότητα. Επιπρόσθετα, όπως και σε πολλούς άλλους ιστούς, ο TGF-β επάγει την σύνθεση διαφόρων πρωτεϊνών της θεμέλιας ουσίας, όπως η οστεοποντίνη και η οστεονεκτίνη, από τα οστεοκύτταρα Ογκογένεση Ο ρόλος του TGF-β στην ογκογένεση είναι περίπλοκος. Ο TGF-β ασκεί αντιμιτογόνο δράση και καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου στα αρχικά στάδια της ογκογένεσης. Παρόλ αυτά, η συγκεκριμένη ανασταλτική δράση χάνεται καθώς ο όγκος εξελίσσεται. Αντίθετα, η ικανότητα του TGF-β να προάγει την αγγειογένεση, την καταστολή των ανοσολογικών μηχανισμών και την σύνθεση εξωκυττάριας ουσίας επιτρέπει τη διαμόρφωση ενός κατάλληλου μικροπεριβάλλοντος για την ταχεία ανάπτυξη και επέκταση του όγκου. O TGF-β επηρεάζει τόσο τα κύτταρα όσο και το περιβάλλον του όγκου. Ο όγκος και τα στρωματικά κύτταρα εκκρίνουν TGF-β σε υψηλά επίπεδα τα οποία, μέσω της προσέλκυσης περισσότερων κυττάρων που εκλύουν TGF-β όπως τα μακροφάγα και τα ουδετερόφιλα, διατηρούνται υψηλά. Όπως περιγράφηκε παραπάνω, η σηματοδότηση του TGF-β πραγματοποιείται με τη βοήθεια επιφανειακών υποδοχέων και των κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών Smad. Μεταβολές αυτών των υποδοχέων ή της έκφρασης των πρωτεϊνών Smad φαίνεται να εμπλέκονται στην καρκινογένεση και σε άλλες διαταραχές του ανθρώπινου σώματος. Ελάττωση του αριθμού των υποδοχέων TGF-β τύπου ΙΙ έχει αναφερθεί στον καρκίνο του στομάχου, του παχέος εντέρου, στο ρετινοβλάστωμα, σε δερματικό Τ-κυτταρικό λέμφωμα και σε HNSCC. Παρομοίως, μείωση των επιπέδων των «ογκοκατασταλτικών» πρωτεϊνών Smad2 και 4 έχει συσχετιστεί με τον καρκίνο του μαστού και του λεπτού εντέρου. Ο TGF-β διαδραματίζει σπουδαίο ρόλο στην ρύθμιση της σύνθεσης, της αποικοδόμησης και της ανάπλασης της εξωκυττάριας ουσίας. Οι παραπάνω δράσεις έμμεσα ενισχύουν την εξέλιξη του όγκου και την απόκτηση διεισδυτικής και μεταστατικής συμπεριφοράς. Ο TGF-β διεγείρει την παραγωγή κολλαγόνου, ινονεκτίνης, πρωτεογλυκανών, τενασκίνης, θρομβοσπονδίνης, αναστολέα ενεργοποιητή του 25

31 Εισαγωγή πλασμινογόνου 1 (PAI-1) και ιστικού αναστολέα μεταλλοπρωτεϊνασών-1 (TIMP-1), ουσίες σχετικές με την καρκινική διείσδυση και μετάσταση TGF-β και ρινικός πολύποδας Ο TGF-β1 εκφράζεται στο ρινικό πολύποδα (ΡΠ) από διάφορα κύτταρα, μεταξύ των οποίων, περιλαμβάνονται τα ηωσινόφιλα, τα μακροφάγα και οι ινοβλάστες, και συνδέεται με τη χημειοταξία και ενεργοποίηση των ινοβλαστών, την αυξημένη παραγωγή των συστατικών του εξωκυττάριου υλικού και την αναστολή ενζύμων τα οποία αποικοδομούν συστατικά του εξωκυττάριου υλικού, όπως μεταλλοπρωτεάσες και ηπαρινάση. Σε μερικές μελέτες αναφέρεται ότι αυτός υπερεκφράζεται στο ΡΠ σε σχέση με το φυσιολογικό ρινικό βλεννογόνο και θεωρείται υπεύθυνος για την ίνωση του στρώματος, την αγγειογένεση, την υπερπλασία του επιθηλίου και τη λέπτυνση της βασικής μεμβράνης, τα οποία χαρακτηρίζουν τη ρινική πολυποδίαση (Elovic A et al., 1994, Ohno I et al., 1992, Serpero L et al., 2006, Zaravinos A et al., 2008, Coste A et al., 1998). Από την άλλη μεριά σε άλλες μελέτες αναφέρεται ότι η έκφρασή του στο ΡΠ είναι μειωμένη σε σχέση με το φυσιολογικό ρινικό βλεννογόνο και έχει διατυπωθεί η άποψη ότι ο TGF-β1 είναι απαραίτητος για τη διατήρηση της ακεραιότητας του φυσιολογικού ρινικού βλεννογόνου, και τα υψηλά του επίπεδα εκεί μειώνουν το χρόνο ζωής των ηωσινόφιλων και αναστέλλουν το σχηματισμό του ΡΠ (Figueiredo CR et al., 2007, Hirschberg A. et al., 2003, Figueiredo CR et al., 2008). 3. Παράγοντας αναστολής της μετανάστευσης των μακροφάγων (MIF) 3.1. Γενικά Η ιδιότητα της αναστολής της μετανάστευσης των μακροφάγων πρωτομελετήθηκε την δεκαετία του 1950 και αποδόθηκε σε ένα μη ταυτοποιημένο παράγοντα συσχετιζόμενο με την δράση των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος. Ο παράγοντας αυτός ταυτοποιήθηκε τελικά το 1966, ταυτόχρονα από δύο ανεξάρτητες ερευνητικές ομάδες, ως μια διαλυτή πρωτεΐνη στο μέσο καλλιέργειας ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων (Bloom BR & Bennett B., 1966, David JR et al., 1966) και ονομάστηκε παράγοντας αναστολής της μετανάστευσης των μακροφάγων (Macrophage migration 26

32 Εισαγωγή inhibitory factor) MIF, από την προαναφερθείσα ιδιότητά του. Μετά την ανακάλυψή του η δράση του συνδέθηκε με γενικότερες λειτουργίες ενεργοποίησης των μακροφάγων όπως η προσκόλληση, η φαγοκυττάρωση και η ογκοκατασταλτική δράση (Nathan CF et al., 1971, 1973, Churchill WH et al., 1975). Με την κλωνοποίηση του μοναδικού cdna για τον MIF ανθρώπου το 1989 (Weiser WY et al., 1989) καθώς και με την ακόλουθη παραγωγή γενετικά ανασυνδυασμένου MIF και ειδικών αντισωμάτων που εξουδετερώνουν τη δράση του, έγινε δυνατή η διερεύνηση και ανάλυση των βιολογικών, βιοχημικών και βιοφυσικών ιδιοτήτων του. Ο παράγοντας αναστολής της μετανάστευσης των μακροφάγων (MIF) είναι ένα σημαντικό συστατικό της άμυνας του ξενιστή εναντίον των μικροβίων και της απάντησης στο stress, το οποίο προάγει την προφλεγμονώδη δράση των εγγενών και επίκτητων μηχανισμών ανοσίας. Ο MIF παίζει σπουδαίο ρόλο στην παθογένεια των οξέων και χρόνιων φλεγμονωδών ή αυτοάνοσων διαταραχών, όπως η σήψη, το σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας, το άσθμα, η ρευματοειδής αρθρίτιδα, και οι φλεγμονώδεις παθήσεις του εντέρου. Οι πολυμορφισμοί του ανθρώπινου γονιδίου του MIF (όπως η αντικατάσταση γουανίνης από κυτοσίνη στη θέση 173 ή η επανάληψη του τετραπεπτιδίου CATT στη θέση 794) έχουν συσχετιστεί με αυξημένη ευαισθησία ή σοβαρότητα νεανικής ιδιοπαθούς αρθρίτιδας και ρευματοειδούς αρθρίτιδας των ενηλίκων, ελκωτικής κολίτιδας, ατοπίας, ή σαρκοείδωσης. Το εγγενές ανοσοποιητικό σύστημα κατέχει καθοριστική θέση στην φυσική άμυνα του ξενιστή εναντίον των μικροβίων. Η αντίληψη των μικροβιακών παθογόνων, εντοπιζόμενων είτε στους ιστούς σε επαφή με το περιβάλλον του ξενιστή, είτε στην συστηματική κυκλοφορία μετά την εισβολή στη ροή του αίματος, πραγματοποιείται από τα μακροφάγα, τα δενδριτικά κύτταρα, τα κύτταρα φυσικούς φονείς, το κοκκιοκύτταρα, και τα μονοκύτταρα, τα οποία δρουν ως φρουροί της εγγενούς ανοσίας. Η σύνδεση των μικροβιακών προϊόντων με μόρια αναγνώρισης των παθογόνων ενεργοποιεί ποικίλα σηματοδοτικά μονοπάτια και την μεταγραφή γονιδίων εμπλεκόμενων στους ανοσιακούς μηχανισμούς, με αποτέλεσμα την έκφραση συνδιεγερτικών μορίων στην κυτταρική επιφάνεια και την απελευθέρωση ανοσορυθμιστικών παραγόντων στον εξωκυττάριο χώρο. Η αποτυχία αναγνώρισης των παθογόνων στα αρχικά στάδια της εισβολής, λόγω, παραδείγματος χάριν, γενετικού ελλείμματος στην ικανότητα των μακροφάγων να αντιλαμβάνονται και να εξουδετερώνουν μικροβιακά παθογόνα, επιτρέπει ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των μικροβίων και ανάπτυξη σοβαρών, ενδεχομένως απειλητικών για τη 27

33 Εισαγωγή ζωή, λοιμώξεων. Μεταξύ των πολυάριθμων μορίων που συμμετέχουν στην άμυνα του οργανισμού απέναντι στα διάφορα παθογόνα, οι κυτταροκίνες κατέχουν πρωταρχική θέση καθώς πυροδοτούν την φλεγμονώδη απόκκριση και συντονίζουν τους μηχανισμούς κυτταρικής και χυμικής ανοσίας με στόχο την εξάλειψη ή τον περιορισμό του εισερχόμενου παθογόνου. Η αυξημένη ευαισθησία στην μόλυνση που εμφανίζουν διαγονιδιακά ζώα με ποσοτικές ή ποιοτικές διαταραχές της δράσης των κυτταροκινών, εξαιτίας μεταλλάξεων ή απαλειφών γονιδίων κυτταροοκινών ή των υποδοχέων τους, αποτελεί απόδειξη του κρίσιμου ρόλου των συγκεκριμένων μορίων στην άμυνα του οργανισμού. Παρόλ αυτά, η υπερβολική παραγωγή προφλεγμονωδών μεσολαβητών μπορεί επίσης να σχετίζεται με απειλητικές για τη ζωή καταστάσεις, όπως η σοβαρή σήψη και το σηπτικό σοκ, κάτι που σημαίνει ότι ο αυστηρός έλεγχος της παραγωγής των κυτταροοκινών είναι απαραίτητος για ισορροπημένη ανοσολογική απόκκριση. Μελέτες σχετικά με την καθυστερημένη αντίδραση υπερευιασθησίας τύπου IV που πραγματοποιήθηκαν πριν από 40 χρόνια οδήγησαν στην ταυτοποίηση του παράγοντα αναστολής της μετανάστευσης των μακροφάγων (MIF), μιας από τις πρώτες κυτοκίνες που αναγνωρίστηκαν. Αρχικά, περιγράφηκε ως ένας παράγοντας που απελευθερώνεται από ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα και αναστέλλει την τυχαία μετανάστευση εξιδρωματικών κυττάρων. Η ενδιαφέρουσα παρατήρηση ότι ο MIF είναι ένας νευροενδοκρινικός μεσολαβητής ο οποίος ενισχύει την απόκριση του ξενιστή απέναντι στα μικροβιακά προϊόντα (ενδοτοξίνες) υποδηλώνει ότι ο MIF αποτελεί σημείο συνάντησης του ενδοκρινικού και του ανοσοποιητικού συστήματος. Επίσης, αποκαλύπτει την ικανότητα του μορίου να προάγει τις προφλεγμονώδεις ανοσολογικές λειτουργίες. Φαίνεται ότι ο MIF ρυθμίζει παλίνδρομα την ανοσοκατασταλτική δράση των γλυκοκορτικοειδών, ενεργοποιεί το μονοπάτι των ERK-1/2 κινασών της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών που ενεργοποιούνται από μιτογόνα, αναστέλλει τη δραστηριότητα του JAB-1/CSN5, ενός συνδιεγέρτη της ενεργοποιητικής πρωτεϊνης -1 (activator protein- 1, AP-1), αυξάνει την έκφραση των Toll-like υποδοχέων 4, διευκολύνει την αναγνώριση βακτηρίων που παράγουν ενδοτοξίνες, και συντηρεί την προφλεγμονώδη λειτουργία των μακροφάγων αναστέλλοντας την εξαρτώμενη από το p53 απόπτωση. Ως προφλεγμονώδης παράγοντας, ο MIF έχει διαπιστωθεί ότι συμμετέχει στην παθογένεση της σοβαρής σήψης και της σηπτικής καταπληξίας, του συνδρόμου οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας και άλλων σοβαρών φλεγμονωδών και αυτοάνοσων νοσημάτων, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η σπειραματονεφρίτιδα, και οι φλεγμονώδεις παθήσεις του εντέρου. 28

34 Εισαγωγή 3.2. Γονίδιο του MIF Έχει ανευρεθεί ένα μοναδικό γονίδιο για τον παράγοντα MIF στο ανθρώπινο γονιδίωμα, εντοπιζόμενο στο χρωμόσωμα 22q11.2. Η περιοχή αυτή εμφανίζει ομολογία με μια περιοχή του χρωμοσώματος 10 του γονιδιώματος των ποντικών στην οποία εδράζεται το αντίστοιχο γονίδιο MIF. Το ανθρώπινο γονίδιο MIF είναι μικρού μεγέθους, αποτελούμενο από τρία εξόνια με 205,173 και 183 ζεύγη βάσεων αντίστοιχα και δυο ιντρόνια με 189 και 95 ζεύγη βάσεων το καθένα. Γονίδια με υψηλού βαθμού ομολογία με το γονίδιο Mif του ανθρώπου και του ποντικού έχουν αναγνωριστεί στο γονιδίωμα διαφόρων άλλων θηλαστικών (αρουραίοι, βοοειδή, χοίροι και gerbils), όπου εκφράζονται ως μοναδικό αντίγραφο σε απλοειδικό γονιδίωμα. Σε αντίθεση με το γονιδίωμα άλλων θηλαστικών, το γονιδίωμα του ποντικού περιέχει επίσης διάφορα επεξεργασμένα (χωρίς ιντρόνια) ψευδογονίδια. Ομόλογα του γονιδίου του MIF, που κωδικοποιούν πρωτεϊνες με αλληλουχία αμινοτελικού άκρου παρόμοια με αυτή του MIF, έχουν βρεθεί σε κοτόπουλα, ψάρια, παράσιτα, φυτά, κρότωνες και κυανοβακτήρια. Ο υψηλός βαθμός συντήρησης της MIF πρωτεΐνης μεταξύ των διαφορετικών ειδών ζώων υποδηλώνει ότι πιθανά το συγκεκριμένο μόριο επιτελεί σημαντικές βιολογικές λειτουργίες. Ο MIF θεωρείται μια πλειοτροπική κυτταροκίνη με ορμονικές και ενζυμικές ιδιότητες και παρά το ότι ο ακριβής μηχανισμός δράσης του δεν έχει ακόμα πλήρως διαλευκανθεί, είναι γενικά αποδεκτό πως αποτελεί ένα κομβικό μεσολαβητή της έμφυτης και επίκτητης ανοσολογικής απόκρισης. Αν και αρχικά ο MIF περιγράφηκε ως ένα παράγωγο των Τ λεμφοκυττάρων (1966) και αργότερα ως ένας παράγοντας εκκρινόμενος από τα κύτταρα της υπόφυσης (1993), στη πορεία βρέθηκε ότι παράγεται από πληθώρα κυττάρων εκτός αυτών του ανοσοποιητικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένων διαφόρων περιφερικών ιστών. Εκτενείς in vivo μελέτες έδειξαν ότι τα κύτταρα του φλοιού της υπόφυσης, τα μακροφάγα και τα Τ λεμφοκύτταρα είναι οι κύριες πηγές του. Ο MIF εκφράζεται επίσης από ηωσινόφιλα, ενδοθηλιακά κύτταρα, διάφορους τύπους επιθηλιακών κυττάρων, ινοβλάστες, μυικά κύτταρα, και συγκεκριμένα κύτταρα του ενδοκρινικού συστήματος (Baugh JA et al., 2002, 2003). 29

35 Εισαγωγή 3.3. Ενζυμική δραστικότητα του MIF και ο αναστολέας ISO-1 Η τρισδιάστατη δομή του MIF δεν μοιάζει με καμιάς άλλης κυτταροκίνης ή ορμόνης παραγόμενης από την υπόφυση, κατατάσσοντάς τον σε μια νέα υπερομάδα πρωτεϊνών. Οι μοναδικές γνωστές πρωτεΐνες που παρουσιάζουν δομικές ομοιότητες με τον MIF είναι η ταυτομεράση της ντοπαχρώμης και τα προκαρυωτικά ένζυμα: ταυτομεράση του 4-οξαλοξοκροτονικού (4-ΟΗ), ισομεράση του 5-καρβοξυ-μεθυλο-2- υδροξυβλεννικού (CHMI) και μουτάση του χορισμικού (Sugimoto H et al., 1997, Rosengren E et al., 1996). Ο MIF έχει αναφερθεί ότι διαθέτει ενζυμικές δραστικότητες: ταυτομεράσης της D- ντοπαχρώμης, κετο-ενολο-ισομεράσης του πυροσταφυλικού (και υδρόξυ πυροσταφυλικού) οξέος και οξειδοαναγωγάσης θειολοπρωτεϊνών. Μια κρυσταλλογραφική μελέτη του συμπλόκου MIF-π-υδροξυφαινυλοπυροσταφυλικού οξέος, έδειξε πως το υπόστρωμα δεσμεύεται στην υδρόφοβη κοιλότητα του Ν-τελικού άκρου αλληλεπιδρώντας με τα κατάλοιπα Pro1, Lys32 και Ile64 μιας υπομονάδας και με τα κατάλοιπα Tyr95 και Asn97 μιας γειτονικής υπομονάδας. Η καταλυτική Pro του Ν- τελικού τμήματος είναι κοινή και για τις δομικά ομόλογες βακτηριακές ταυτομεράσες 4- ΟΗ και CHMI. Παρόμοια αποτελέσματα έδειξαν και μελέτες σύνδεσης με άλλα υποστρώματα μαρτυρώντας πως η Pro παίζει το ρόλο της βάσης κατά τον καταλυτικό μηχανισμό καθώς το pka της ελαττώνεται κατά σχεδόν 4 μονάδες από το περιβάλλον της υδρόφοβης κοιλότητας (Baugh JA et al., 2002, Lolis E & Bucala R., 2003). Επίσης η πιθανή σχέση του καταλυτικού κέντρου του MIF με τη βιολογική του δράση έχει μελετηθεί τα τελευταία χρόνια και με τη χρήση μικρομοριακών αναστολέων που έχουν σχεδιαστεί βάση των μελετών σύνδεσης του MIF με τα γνωστά υποστρώματά του. Το πιο γνωστό μόριο που έχει μελετηθεί είναι ο ISO-1 [(S,R)-3-(4-υδροξυφαινύλο)- 4,5-διϋδρο-5-ισοξαζολο οξικός μεθυλεστέρας] μια ισοξαζολίνη. H δέσμευση του ISO-1 στο καταλυτικό κέντρο του MIF επιτυγχάνεται μέσω των ίδιων καταλοίπων όπως και στην περίπτωση της δέσμευσης του π-υδροξυφαινυλοπυροσταφυλικού οξέος (Lubetsky JB et al., 2002). Η μελέτη του ανασταλτικού δυναμικού του ISO-1 πάνω στις βιολογικές δράσεις του MIF έδειξε πως αυτός αναστέλλει δοσοεξαρτώμενα τη ρύθμιση της δράσης των γλυκοκορτικοειδών, καθώς σε μονοκύτταρα που επωάστηκαν με λιποπολυσακχαρίτη (LPS), MIF και δεξαμεθαζόνη, τα επίπεδα του TNF-α ελαττώθηκαν σημαντικά σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. Ακόμη στο ίδιο πείραμα παρουσία ISO-1 βρέθηκε ότι αναστέλλεται η παραγωγή κυκλοοξυγονάσης-2 (COX-2) και προσταγλανδίνης E2 (PGE2). 30

36 Εισαγωγή Επίσης έχει βρεθεί ότι η χορήγηση του ISO-1 αυξάνει το χρόνο επιβίωσης σε επίμυες στους οποίους έχει επαχθεί τεχνητά σήψη με χορήγηση LPS (Al Abed Y et al., 2005), (Baugh JA et al., 2002, Lolis E & Bucala R., 2003). Μια άλλη ενζυμική δραστικότητα που αποδίδεται στον MIF είναι η δραστικότητα οξειδοαναγωγάσης μέσω θειολών κυστεΐνης. Ο MIF διαθέτει μια χαρακτηριστική CXXC αλληλουχία η οποία είναι παρούσα στη θειορεδοξίνη, γλουταρεδοξίνη, αναγωγάση της θειορεδοξίνης, αναγωγάση της γλουταρεδοξίνης, και αφυδρογονάση του διϋδρολιποαμιδίου, που όλες τους παίζουν ρόλο σε οξειδοαναγωγικές κυτταρικές διαδικασίες. Πρόσφατα βρέθηκε πως ο ΜΙF αλληλεπιδρά με την θειολο-ειδική αντιοξειδωτική πρωτεΐνη PAG με αποτέλεσμα την μείωση της δραστικότητας ταυτομεράσης. Άλλος βιολογικός ρόλος της δραστικότητας οξειδοαναγωγάσης δεν έχει βρεθεί προς το παρόν και μένει να διευκρινιστεί ο ακριβής μηχανισμός της (Baugh JA et al., 2002, Lolis E & Bucala R., 2003). Τα δομικά και βιοχημικά ευρήματα για τις καταλυτικές δραστικότητες του MIF δεν έχουν καθορίσει ακόμα τη φυσική σημασία αυτών των ενζυμικών ιδιοτήτων του. Επιπρόσθετα πειράματα απαιτούνται για να διευκρινιστεί αν η ενζυμική δραστικότητα ταυτομεράσης εμπλέκεται άμεσα με τη βιολογική δράση ή το καταλυτικό κέντρο λειτουργεί ως σημείο δέσμευσης για κάποιον υποδοχέα. Επίσης δεν έχει ακόμη αναγνωριστεί ένα πειστικό φυσικό υπόστρωμα για την ενζυμική δραστικότητα του MIF Μοριακός μηχανισμός δράσης του MIF Υποδοχέας Συνήθως οι υποδοχείς των κυτταροκινών ανακαλύπτονται λίγο μετά την κλωνοποίηση των αντιστοίχων κυτταροκινών. Παρότι όμως ο MIF κλωνοποιήθηκε το 1989, μέχρι σήμερα δεν έχει αναγνωρισθεί ο υποδοχέας του. Απόπειρες για απομόνωση διαλυτού ή μεμβρανικού υποδοχέα από τα ούρα ασθενών με σήψη δεν στέφθηκαν από επιτυχία, όπως συνέβη και με τις προσπάθειες για αναγνώριση πρωτεϊνών της κυτταρικής επιφάνειας με υψηλή συγγένεια για τον MIF. Σχετικά πρόσφατα περιγράφηκε στη βιβλιογραφία η αλληλεπίδρασή του με την εξωκυτταρική περιοχή της διαμεμβρανικής πρωτεΐνης του ΜHC-II, CD74 η οποία είναι απαιτούμενη για την επαγωγή του μονοπατιού των ERK/MAP κινασών, του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της 31

37 Εισαγωγή παραγωγής PGE2 σε μακροφάγα (Leng L et al., 2003). Παρότι όμως δεν έχει περιγραφεί με σαφήνεια ένας υποδοχέας, ο μηχανισμός δράσης του MIF έχει μελετηθεί ενδελεχώς Εμπλοκή του MIF σε σηματοδοτικά μονοπάτια Ο μοριακός μηχανισμός δράσης του MIF είναι ιδιάζων και μοναδικός ανάμεσα στις κυτταροκίνες. Σε πολλές μελέτες προτείνεται η αλληλεπίδρασή του με έναν άγνωστο μεμβρανικό υποδοχέα των κυττάρων στόχων, του οποίου όμως η μοριακή ταυτότητα δεν έχει διελευκανθεί. Ο MIF, όπως προαναφέρθηκε, αφενός παρουσιάζει μια ευθέως προφλεγμονώδη δράση και αφετέρου παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση τόσο της έναρξης όσο και της κατεύθυνσης της φλεγμονώδους απόκρισης με την αντίστροφη ρύθμιση της δράσης των γλυκοκορτικοειδών. Παρόλο λοιπόν που δεν έχει ακόμα αναγνωρισθεί ένας διαμεμβρανικός υποδοχέας του, υπάρχουν πολλά δεδομένα πάνω στην μεσολαβούμενη από τον MIF μεταγωγή σήματος. Ο Mitchell RA και συνεργάτες (1999) έδειξαν πως ο εξωγενώς προστιθέμενος ή ο ενδογενώς παραγόμενος MIF, ως απόρροια διέγερσης με ορό, διεγείρει τον πολλαπλασιασμό ηρεμούντων ινοβλαστών μέσω της ενεργοποίησης των p42/p44 ERK (Extracellular signal regulated kinases), υποοικογένειας των MAP κινασών (mitogen activated protein kinases). Η απόκριση αυτή ήταν εξαρτώμενη από την πρωτεϊνική κινάση Α. Επιπλέον, ο Lue H και συνεργάτες (2006) απέδειξαν ότι ο MIF προκαλεί και την πρόσκαιρη ενεργοποίηση του μονοπατιού των ERK μέσω ενός διαφορετικού μηχανισμού, που περιλαμβάνει τη συμμετοχή μιας κινάσης τυροσίνης της οικογένειας των SRC και επίσης τη συμμετοχή της κυτταροπλασματικής ή πυρηνικής πρωτεΐνης JAB1/CSN5. Ο ρόλος της τελευταίας στη μεταγωγή του σήματος του MIF είναι ρυθμιστικός καθώς, ενώ απαιτείται η παρουσία του για την ενεργοποίηση του μονοπατιού, όταν τα επίπεδα του MIF ξεπερνούν ένα ορισμένο επίπεδο γίνεται μέρος μιας κατασταλτικής διαδικασίας. Το μονοπάτι των ERKs οδηγεί στη φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση συγκεκριμένων πρωτεϊνών του κυτταροδιαλύματος όπως το c myc και η κυτταροπλασματική φωσφολιπάση Α2 (cpla2). Ως γνωστόν η cpla2 αποτελεί βασικό μεσολαβητή των φλεγμονωδών αποκρίσεων, ενώ το προϊόν δράσης της το αραχιδονικό οξύ είναι το πρόδρομο των προσταγλανδινών και των λευκοτριενίων. Νέες μελέτες απέδειξαν ότι ο MIF προκαλεί τη φωσφορυλίωση και τη διέγερση της cpla2 μέσω του μονοπατιού των ERKs και όχι αυτού της p38 MAP κινάσης (Mitchell RA et al., 1999). 32

38 Εισαγωγή Αξίζει να σημειωθεί όμως ότι πρόσφατα ο MIF βρέθηκε πως επάγει την έκφραση της κυκλοοξυγονάσης-2 (COX-2) και της IL-6 μέσω ενεργοποίησης της p38 σε κύτταρα τύπου ινοβλάστης αρθρικού υμένα ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα (PA) (Santos LL et al., 2004). Ένας εναλλακτικός μηχανισμός μέσω του οποίου ο MIF μπορεί να τροποποιεί τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις είναι η επίδραση του στη δραστικότητα του μεταγραφικού παράγοντα ΝF-κΒ. Στο παρελθόν έχει προταθεί πως τα γλυκοκορτικοειδή αναστέλλουν την παραγωγή φλεγμονωδών παραγόντων όπως ο TNF-α μέσω ελέγχου της δραστικότητας του ΝF-κΒ. Αυτό επιτυγχάνεται με την παρεμπόδιση της δέσμευσης της p65 υπομονάδας του στον υποκινητή των γονιδίων στόχων και της επαγωγής της παραγωγής του αναστολέα ενεργοποίησης του ΝF-κΒ, ΙκΒ. Η αύξηση των επιπέδων του κυτταροπλασματικού ΙκΒ αναστέλλει την δυνατότητα του NF-κΒ να μεταναστεύει στον πυρήνα, ενώ η αναστολή δέσμευσης της p65 υπομονάδας στο DNA παρεμποδίζει ευθέως την μεταγραφή των γονιδίων στόχων. Πρόσφατες έρευνες λοιπόν, έδειξαν πως η κατεργασία με MIF μονοπύρηνων κυττάρων του περιφερικού αίματος, που είχαν διεγερθεί με LPS, κατέστειλε την ικανότητα των γλυκοκορτικοειδών να αναστέλλουν τη σύνθεση του ΙκΒ. Επομένως σύμφωνα με τα παραπάνω ο MIF ευνοεί τη μετανάστευση του NF-κΒ στον πυρήνα όπου ενεργοποιεί την έκφραση γονιδίων κυτταροκινών και μορίων προσκόλλησης (Baugh JA et al., 2002, Lolis E & Bucala R., 2003, Lue H et al., 2002). 33

39 Εισαγωγή Σχήμα 6. Προτεινόμενοι μηχανισμοί μέσω των οποίων ο MIF ρυθμίζει την παροδική και την παρατεταμένη διέγερση των ERKs και αναπαράσταση του ρόλου της πρωτεΐνης JAB1/CSN. Τα μόρια του μονοπατιού της ERK φαίνονται με πράσινο χρώμα. (Lue H et al., 2006). Η δράση του MIF ανταγωνίζεται την ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 (Leech M et al., 2003). Ειδικότερα έχει δειχθεί ότι είτε υπερεκφραζόμενος, είτε εξωγενώς προστιθέμενος γενετικά ανασυνδυασμένος MIF, αντισταθμίζει τις επαγόμενες από p53 γήρανση και απόπτωση των μακροφάγων, καταστέλλοντας την p53 εξαρτώμενη μεταγραφική ενεργοποίηση. Η απόπτωση των μακροφάγων έχει προταθεί πως συμβάλλει σημαντικά στην ελάττωση της ανοσολογικής απόκρισης του ξενιστή στα προχωρημένα στάδια της σήψης. Επίσης κατά τη σήψη έχει διαπιστωθεί υψηλός βαθμός απόπτωσης των Τ-λεμφοκυττάρων που πιστεύεται ότι επίσης συμβάλλει στη μειωμένη ανοσολογική απόκριση. Από τα παραπάνω φαίνεται πως η προαγωγή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού ίσως να είναι ένας σημαντικός μηχανισμός μέσω του οποίου ο MIF συμμετέχει στην παθογένεια φλεγμονωδών ασθενειών. Επιπρόσθετα έχει δειχθεί ότι η επαγόμενη από προσκόλληση έκκριση MIF από ινοβλάστες προάγει την εξαρτώμενη από ιντεγκρίνες ενεργοποίηση της MAP κινάσης, της κυκλίνης D1 και της σύνθεσης DNA (Liao H et al., 2003). H κυκλίνη D1 αποτελεί ένα σημαντικό ανοδικό τροποποιητή της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης ρετινοβλάστωμα 1 (Rb), η φωσφορυλίωση της οποίας με τη σειρά της αποδεσμεύει τον μεταγραφικό παράγοντα Ε2F και επακόλουθα επάγει την έκφραση κρίσιμων ενζύμων της S φάσης του κυτταρικού κύκλου. O Liao H και συνεργάτες, (2003) αναφέρουν ότι ο MIF παίζει σημαντικό ρόλο στην μεσολαβούμενη από ιντεγκρίνες πρόοδο του κυτταρικού κύκλου μέσω επαγωγής της φωσφορυλίωσης της 34

40 Εισαγωγή Rb και της δραστικότητας του Ε2F. Ένα πιθανό σενάριο για τη δράση του ΜΙF τον θεωρεί ρυθμιστή της διήθησης, επαγωγέα της ενεργοποίησης και προαγωγέα της επιβίωσης των φλεγμονωδών κυττάρων. Ο Kleemann R και συνεργάτες, (2000) ανέφεραν ότι ο MIF προάγει τη δράση του μέσω ενός ασυνήθιστου μονοπατιού που δεν απαιτεί την ύπαρξη διαμεμβρανικού υποδοχέα. Μετά από ενδοκυττάρωση, δεσμεύεται στην κυτταροπλασματική πρωτεΐνη JΑΒ1, που όπως προειπώθηκε συμμετέχει στην πρόσκαιρη ενεργοποίηση του μονοπατιού των ERK (Σχ. 6). Η πρωτεΐνη JΑΒ1 επάγει τόσο τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης c-jun όσο και τη δραστικότητα του μεταγραφικού παράγοντα AP-1 (Activator protein-1), o οποίος ενεργοποιεί την έκφραση γονιδίων προφλεγμονωδών παραγόντων. Η JΑΒ1 επίσης, δεσμεύεται και προάγει την αποδόμιση της κυκλίνης p27kip1 που είναι μια πρωτεΐνη που αναστέλλει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Ο MIF δεσμευόμενος πάνω στην JΑΒ1 παρεμποδίζει τη δράση της, επιτρέποντας την αύξηση των επιπέδων της p27kip1, όπως φαίνεται και από τη μείωση που προκαλεί, όταν υπερεκφράζεται, στην αυξητική επίδραση της JΑΒ1 σε ινοβλάστες. Εκτός από αυτό η αλληλεπίδραση του MIF με την JΑΒ1 ίσως να αποτελεί και ένα μηχανισμό ρύθμισης του AP-1. Αυτή η θεώρηση έρχεται σε αντίθεση με το προφλεγμονώδες προφίλ που παρουσιάζει ο MIF (Bucala R., 2000). Εντούτοις σε διάφορες ιδιότητες του ΜIF, όπως στην αναστολή της μετανάστευσης μακροφάγων, η επίδρασή του σε σχέση προς τη συγκέντρωσή του ακολουθεί μια χαρακτηριστική κωδωνόσχημη καμπύλη. Κάτι τέτοιο σημαίνει πως πιθανώς υψηλές συγκεντρώσεις του MIF αναστέλλουν αρκετές βιολογικές διεργασίες (Baugh JA et al., 2002, 2003, Lolis E & Bucala R., 2003, Lue H et al., 2002). Η βιβλιογραφία για τον βιολογικό ρόλο του MIF στους ρινικούς πολύποδες είναι περιορισμένη. Σε προηγούμενες μελέτες χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημικές μεθόδους, βρέθηκε πως ο MIF εκφράζεται από ηωσινόφιλα και επιθηλιακά κύτταρα στην αλλεργική ρινίτιδα και τον ρινικό πολύποδα (Nakamaru Y et al., 2004, Delbrouck C et al., 2004). Σε πρόσφατη μελέτη έχει δειχθεί ότι ο MIF εκφράζεται στους ρινικούς πολύποδες σε υψηλά επίπεδα και εξασθενίζει την κατασταλτική επίδραση της δεξαμεθαζόνης στην παραγωγή της IL-6 σε καλλιέργειες ιστού πολύποδα (Stathas Th.,et al., 2013). 4. Ιντερλευκίνη 6 (IL-6) Η ιντερλευκίνη 6 είναι μέλος μιας υπεροικογένειας κυτταροκινών και εμφανίζει τόσο προ- όσο και αντιφλεγμονώδεις δράσεις. Σημαντικότερες, η ενεργοποίηση της 35

41 Εισαγωγή έμφυτης ανοσίας και η ρύθμιση του αιμοποιητικού συστήματος. Παράγεται από πολλούς κυτταρικούς τύπους. Οι κύριες πηγές της είναι τα διεγερμένα μακροφάγα, οι ινοβλάστες και τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Παράγεται ακόμα από Τ- και Β-λεμφοκύτταρα, κοκκιοκύτταρα, λεία μυϊκά κύτταρα, ηωσινόφιλα, χονδροκύτταρα, οστεοβλάστες και διεγερμένα κερατινοκύτταρα (Heinrich et al., 1990; Helle et al., 1988). Την παραγωγή της από τα παραπάνω κύτταρα επάγουν άλλες κυτταροκίνες, όπως η IL-1 και ο TNF-α, ενώ η ίδια δρα κατασταλτικά στην έκφραση των IL-1 και TNF-α. Ο TGF-β φαίνεται να διεγείρει την παραγωγή της σε ινοβλάστες πνεύμονα και αρθρικού υμένα (Eickelberg et al., 1999a), ενώ η ίδια επάγει την έκφραση του TIMP- 1 σε χονδροκύτταρα και ινοβλάστες από άνθρωπο και καταστέλλει την κολλαγονολυτική δράση της της IL-1β (Silacci et al., 1998). Στη ρευματοειδή αρθρίτιδα, τα επίπεδα της IL-6 είναι υψηλά και σχετίζονται με τη σοβαρότητα της νόσου, αν και παραμένει αδιευκρίνιστο το αν συμμετέχει στην εξέλιξη και παθογένεια της ή αν δρα ως ένας ενδοκρινής μεσολαβητής των αποκρίσεων της ρευματοειδούς αρθρίτιδας, όπως η ηπατική απόκριση οξείας φάσης. (Robak et al., 1998; Eickelberg et al., 1999b) Υποδοχέας της IL-6 Η IL-6 μεταδίδει το σήμα της μέσω ενός ετερομερούς συμπλόκου με τον υποδοχέα της. Δέσμευση της IL-6 στον υποδοχέα της σχηματίζει ένα σύμπλοκο IL-6/IL-6R το οποίο ενώνεται με μια πρωτεΐνη μεταγωγής σήματος, την gp130. Το σχηματισθέν σύμπλοκο IL- 6/IL-6R/gp130 δεσμεύεται σε ένα δεύτερο οπότε και πραγματοποιείται μεταγωγή του σήματος. Με δεδομένο ότι ο IL-6R δεν διαθέτει ενδοκυτταρική περιοχή μεταγωγής σήματος δεν είναι απαραίτητο να συνδέεται στη μεμβράνη. Αντίθετα, ο διαλυτός IL-6R μπορεί να δεσμεύει την IL-6 και να δρα μέσω της gp Σηματοδότηση Η πρωτεΐνη gp130 αποτελεί χαρακτηριστικό μέλος της οικογένειας των υποδοχέων της IL-6. Η διέγερσή της οδηγεί σε ενεργοποίηση των JAK κινασών που φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν τους STAT μεταγραφικούς παράγοντες, ιδιαιτέρως τους STAT3 και STAT1. Οι τελευταίοι προσδένονται σε αντίστοιχα ρυθμιστικά στοιχεία και επηρεάζουν τη μεταγραφή. Η ενεργοποίηση των JAK φαίνεται επίσης να επικοινωνεί 36

42 Εισαγωγή με το μονοπάτι των πρωτεϊνών Ras. Μέσω αυτού πραγματοποιείται φωσφορυλίωση των MEK και MAP κινασών οι οποίες ενεργοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες όπως ο Elk-1 και ο NF-IL-6 (C/EBP-beta). Τα παραπάνω, σε συνδυασμό με την ενεργοποίηση του AP- 1 και SRF, προκαλούν τις διαφορετικές δράσεις της IL-6 (Σχ. 7). Σχήμα 7. Σηματοδοτικά μονοπάτια της IL-6 ( Ρύθμιση Η IL-6 παίζει καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης. Παρόλ αυτά, υπερπαραγωγή της συγκεκριμένης κυτταροκίνης οδηγεί σε φλεγμονή και εμφάνιση διαφόρων ασθενειών (όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η νεανική ιδιοπαθής αρθρίτιδα και η νόσος Crohn). Επομένως, η δράση της κυτταροκίνης θα πρέπει να υπόκειται σε έλεγχο, ώστε να ρυθμίζεται τόσο το μέγεθος όσο και η διάρκεια της ανοσιακής απάντησης. Το σύστημα σηματοδότησης της IL-6 υπόκειται σε αρνητική 37

43 Εισαγωγή παλίνδρομη ρύθμιση από καταστολείς του σήματος των κυτταροκινών (SOCS) και από τους πρωτεϊνικούς αναστολείς των ενεργοποιημένων STATs (PIAS). Η αλληλεπίδραση της IL-6 με τον υποδοχέα της οδηγεί σε ενεργοποίηση του STAT3, το οποίο στη συνέχεια στοχεύει το SOCS-1. Το SOCS-1 με την σειρά του δεσμεύεται στην JAK τυροσινική κινάση και προκαλεί αρνητική ρύθμιση της μετάδοσης σήματος από την gp130. Τα μόρια SOCS-1, SOCS-2 και SOCS-3 επάγονται από διάφορες κυτταροκίνες όπως η IL-6, η IFNγ, η IL-4,ο G-CSF και πολλοί άλλοι παράγοντες, και αναστέλλουν τα ενεργοποιούμενα από κυτταροκίνες JAK/STAT μονοπάτια σηματοδότησης. Το SOCS-1 αλληλεπιδρά άμεσα με τις JAKs και αναστέλλει την καταλυτική τους δράση, ενώ το μόριο SOCS 3 αναστέλλει την σηματοδότηση των κυτταροκινών συνδεόμενο στο σύμπλοκο του υποδοχέα. Ποντίκια τα οποία στερούνται το SOCS-1 εμφανίζουν ακέραιη την οδό σηματοδότησης της IL-6, κάτι που υποδηλώνει ότι το SOCS-3 ενδεχομένως δρα ως καθοριστικός αναστολέας της συγκεκριμένης οδού in vivo. Οι πρωτεΐνες PIAS συγκροτούν μια οικογένεια μορίων αναστολής των STATs. O αναστολέας PIAS-3 σχετίζεται ειδικά με το ενεργοποιημένο μόριο STAT3, αλλά όχι με τον STAT1, με αποτέλεσμα τον αποκλεισμό της μεταγραφής όλων των γονιδίων όπου συμμετέχει ο STAT3. Ο PIAS-3 είναι γνωστός ως αναστολέας της σηματοδότησης της IL-6 στις Μ1 κυτταρικές σειρές (κυτταρική σειρά ποντικών με μυελοειδή λευχαιμία) (Kishimoto Τ., 2006) Υπερπαραγωγή IL-6 και νόσηση Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερπαραγωγή της IL-6 συμβάλλει στην εμφάνιση ποικίλων αυτοάνοσων και φλεγμονωδών ασθενειών. Η συμμετοχή της IL-6 στην αυτοανοσία προτάθηκε για πρώτη φορά μετά την παρατήρηση ότι ασθενείς με καρδιακό μύξωμα συχνά εκδηλώνουν συμπτώματα αυτοανοσίας και ότι τα κύτταρα του μυξώματος παράγουν IL-6. Επίσης, το αρθρικό υγρό που προέρχεται από ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα περιέχει υψηλά επίπεδα IL-6. Η IL-6 ως κυτταροκίνη εμπλέκεται στην παθογένεια των κακοηθών καταστάσεων των Β-λεμφοκυττάρων, της νόσου του Castleman, των πλασματοκυτταρικών δυσκρασιών όπως το πολλαπλούν μυέλωμα και αρκετών φλεγμονωδών νοσημάτων όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η νόσος του Crohn, ο ερυθηματώδης λύκος και το άσθμα (Hirano T et al., 1988, Atreya R et al., 2000, Polgar A et al., 2000). Αρκετές μελέτες μέχρι σήμερα χρησιμοποιώντας RT-PCR και 38

44 Εισαγωγή ανοσοϊστοχημικές μεθόδους έδειξαν ότι η έκφραση της IL-6 είναι αυξημένη στην χρόνια ρινοκολπίτιδα (Gaffar O et al., 1998, Bradley DT & Kountakis SE., 2005, Min YG et al., 1999, Lennard CM et al., 2000). Μεταγενέστερη μελέτη κατέδειξε αυξημένη IL-6 σε ιστό από ρινικό πολύποδα σε σύγκριση με ιστό από μέση ρινική κόγχη στους ίδιους ασθενείς που έπασχαν από χρόνια ρινοκολπίτιδα και ρινική πολυποδίαση (Danielsen A et al., 2006). Μακροφάγα, ηωσινόφιλα και ινοβλάστες ήταν οι κύριες πηγές παραγωγής της IL-6 (Gaffar O et al., 1998). Σύμφωνα με τον Liu CM και συνεργάτες (2002) στούς παθογενετικούς μηχανισμούς σχηματισμού των ρινικών πολυπόδων συμπεριλαμβάνεται και η παραγωγή της IL-6 από κύτταρα τα οποία ρυθμίζουν την ανοσοαπάντηση, προάγοντας τον σχηματισμό πλασματοκυττάρων, την σύνθεση συστατικών του στρώματος, την εναπόθεση κολλαγόνου και την ανάπλαση ιστού. Επιπρόσθετα, η IL-6 είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη πειραματικά επαγόμενων αυτοάνοσων παθήσεων όπως η επαγόμενη από αντίσωμα αρθρίτιδα, η πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα που οφείλεται στην πρωτεΐνη των ολιγοδενδοκυττάρων. Αυτά τα ευρήματα, σε συνδυασμό με αποτελέσματα πολλών κλινικών ερευνών, υποδεικνύουν ότι τα εξαρτώμενα από την IL-6 μονοπάτια σηματοδότησης εμπλέκονται στην παθογένεση των πειραματικά επαγόμενων αλλά και των φυσικά εμφανιζόμενων αυτοάνοσων διαταραχών. Παρόλ αυτά, ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο η IL-6 δρα οδηγώντας στην εμφάνιση αυτών των παθήσεων παραμένει αδιευκρίνιστος. Με βάση τα όσα περιγράφονται παραπάνω, ο αποκλεισμός της οδού σηματοδότησης της IL-6 θα μπορούσε να αποτελέσει λογική θεραπευτική στρατηγική. Μια προσέγγιση που έχει δοκιμαστεί ήταν η αναστολή του ίδιου του μορίου της IL-6. Παρόλ αυτά, η χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων εναντίον της ανθρώπινης IL-6 δεν έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα. Η χορήγηση ενός μονοκλωνικού αντισώματος κατά της IL-6 οδηγεί σε συσσώρευση της κυτταροκίνης στην κυκλοφορία στην μορφή ανοσοσυμπλέγματος, με αύξηση του χρόνου ημίσειας ζωής της IL-6. Επομένως, ένα μόνο αντίσωμα δεν καταφέρνει να εξουδετερώσει τα αποτελέσματα της χρόνιας υπερπαραγωγής IL-6. Στα ποντίκια, η χρήση ενός μίγματος μονοκλωνικών αντισωμάτων που στόχευαν τους διαφορετικούς επιτόπους της IL-6 μείωσε την εμφάνιση του παραπάνω φαινομένου. Πειραματικές ενδείξεις υποστηρίζουν ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην πνευμονική ίνωση. Αν και είχε τεκμηριωθεί πλήρως η παραγωγή της IL-6 από ινοβλάστες πνευμόνων, δεν ήταν γνωστό αν όλες οι ινοβλάστες του πνεύμονα (ποντικών) εκκρίνουν IL-6 ή μόνο ένα 39

45 Εισαγωγή μέρος αυτών. Ακόμη έχουν γίνει μελέτες όσον αφορά στην απελευθέρωση της IL-6, της IL-8 και των CSFs από επιθηλιακά κύτταρα των ανώτερων αναπνευστικών οδών, αλλά και όσον αφορά τη διερεύνηση της εμπλοκής των παραπάνω στην κυστική ίνωση. Η κυστική ίνωση χαρακτηρίζεται από μία δραματική στρατολόγηση μακροφάγων, από επαναλαμβανόμενες μολύνσεις από ψευδομονάδες στους πνεύμονες. Εχει δειχθεί ότι η IL- 6 με το διαλυτό της υποδοχέα επάγει την έκφραση του TIMP-1 σε ινοβλάστες αρθρικού υμένα και χονδροκύτταρα αρθρικού χόνδρου (Lotz M & Guerne P-A., 1991, Silacci P et al., 1998), καθώς και ότι ο TGF-β1 επάγει την παραγωγή τις IL-6 από τις ινοβλάστες πνεύμονα (Eickelberg O et al., 1999). 40

46 ΣΚΟΠΟΣ

47 Σκοπός Σκοπός H ρινική πολυποδίαση, οι αρθρίτιδες, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα και η οστεοαρθρίτιδα, και η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια ή το άσθμα αποτελούν νόσους που ταλαιπωρούν εκατομμύρια ανθρώπων δημιουργώντας σοβαρά προβλήματα στην καθημερινή τους ζωή. Για το λόγο αυτό υπάρχει τεράστιο ερευνητικό ενδιαφέρον όσον αφορά στην παθογένεια και την αντιμετώπιση των παθήσεων αυτών. Κοινό χαρακτηριστικό στην παθογένεια όλων είναι η φλεγμονώδη κυτταρική διήθηση, τροποποίηση στη διαφοροποίηση του επιθηλίου και καταστροφή αυτού, ανάπλαση ιστού και δημιουργία οιδήματος, συσσώρευση εξωκυττάριας ουσίας, κυρίως κολλαγόνου, διόγκωση της βασικής μεμβράνης και ίνωση. Διάφοροι μεσολαβητές, όπως κυτταροκίνες, χημειοκίνες, αυξητικοί παράγοντες, μόρια συγκόλησης, πρωτεολυτικά ένζυμα και άλλες πρωτεΐνες έχουν ταυτοποιηθεί, οι οποίοι συμμετέχουν σε διάφορες διαδικασίες που εμπλέκονται στη χρόνια φλεγμονή. Μεταξύ αυτών περιλαμβάνονται ο TGF-β1, ο MIF, η IL-6. Τόσο η παθογένειά της όσο και η συντηρητική-φαρμακευτική αλλά και η χειρουργική αντιμετώπισή τους συνεχίζουν να αποτελούν σήμερα αντικείμενο έρευνας. Ωστόσο, υπό διερεύνηση παραμένει ο ακριβής μηχανισμός και τα ενδοκυτταρικά μονοπάτια που σηματοδοτούν, αφού φαίνεται να υπάρχουν διαφορές τόσο στα διάφορα είδη κυττάρων ενός οργανισμού, όσο και στο ίδιο είδος κυττάρων και ίδιας προέλευσης αλλά από διαφορετικό οργανισμό, ακόμη δε και στο ίδιο είδος κυττάρων διαφορετικής προέλευσης του ίδιου οργανισμού. Η εμπλοκή της IL-6 στους μηχανισμούς της φλεγμονώδους διαδικασίας και της ίνωσης είναι καλά τεκμειριωμένη. Στην έκφραση των παραγόντων αυτών είναι γνωστός ο διεγερτικός ρόλος του MIF και TGF-β1. Ο MIF είναι μια προφλεγμονώδης κυτταροκίνη, και παρά το ότι ο ακριβής μηχανισμός δράσης του δεν έχει ακόμα πλήρως διαλευκανθεί, είναι γενικά αποδεκτό πως αποτελεί ένα βασικό μεσολαβητή της ανοσολογικής απόκκρισης, ο οποίος ανταγωνίζεται τη δράση των γλυκοκορτικοειδών και εξασθενίζει την επαγόμενη από αυτά καταστολή διαφόρων φλεγμονωδών παραγόντων. Βιοχημικές και ανοσοϊστοχημικές μελέτες έχουν δείξει ότι ο MIF εκφράζεται στο ρινικό πολύποδα, με κύριο εκφραστή τα ηωσινόφιλα. Τόσο ο MIF όσο και ο TGF-β1, οι οποίοι όπως αναφέρθηκε παραπάνω εμπλέκονται σε διαδικασίες ίνωσης, υπερεκφράζονται σε ιστούς ΡΠ και ινοβλάστες πνεύμονα. 42

48 Σκοπός Έτσι σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν: α) η μελέτη της επίδρασης του MIF και του TGF-β1 στην παραγωγή IL-6 στο ΡΠ, καθώς και των μηχανισμών και σηματοδοτικών μονοπατιών τα οποία εμπλέκονται στην επίδραση αυτή β) η μελέτη της πιθανής συνέργειας του MIF και του TGF-β1 στην παραγωγή IL-6 στο ΡΠ και σε ινοβλάστες πνεύμονα, καθώς και των μηχανισμών οι οποίοι εμπλέκονται στην διαδικασία αυτή, χρησιμοποιώντας εκλεκτικούς αναστολείς σηματοδοτικών μονοπατιών. Τα παραπάνω εντάσσονται σε ένα μακροπρόθεσμο στόχο διελεύκανσης των παθογενετικών μηχανισμών των παθήσεων που σχετίζονται με χρόνια φλεγμονή και ίνωση. 43

49

50 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

51 Υλικά και Μέθοδοι Υλικά Η προμήθεια χημικών, αντιδραστηρίων και άλλων υλικών έγινε από τις εμπορικές πηγές που αναγράφονται παρακάτω: Μέσο καλλιέργειας DMEM από την BioChrom AG (Berlin, Germany). Πλάκες πολυστυρολίου των 96 κελίων για ELISA, φιάλες και πλάκες καλλιέργειας κυττάρων των 6, 12, 24 και 96 κελίων, και πλάκες μέτρησης φθορισμού των 96 κελίων με επίπεδο διαφανή πυθμένα και αδιαφανή τοιχώματα (μαύρα), από την Greiner (Frickenhausen, Germany). U0126, LY294002, 2,7 -dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) από την Sigma Aldrich Chemical Co (St Louis, MO). SP από Biomol Research Laboratories (Pennsylvania, PA). SB από Calbiochem (San Diego, CA). Πρότυπες ανασυνδιασμένες πρωτεΐνες MIF και TGF-β1 ανθρώπου, goat anti-rabbit IgG σημασμένα με υπεροξειδάση και στρεπταβιδίνη σημασμένη με υπεροξειδάση από την Chemicon (Temecula, CA). Ζεύγος αντισωμάτων έναντι της IL-6 (μονοκλωνικό αντίσωμα δέσμευσης και πολυκλωνικό αντίσωμα ανίχνευσης σημασμένο με βιοτίνη) από την ImmunoTools (Germany).. Μεμβράνες ανοσοαποτύπωσης απλής νιτρικής κυτταρίνης (Immobilon-NC) από τη Millipore (Billerica, MA). Διάλυμα πρότυπων πρωτεϊνών γνωστής μοριακής μάζας για ηλεκτροφόρηση SDS- PAGE (markers) από τη NIPPON Genetics EUROPE GmbH (Dueren, Germany). Kit χημειοφωταύγειας (ECL) από την Pierce (Rockford, IL). Kit απομόνωσης ολικού RNA (RNeasy spin mini-column) από την εταιρία Macherey Nagel. (Germany). kit one step RT-PCR ανάλυσης (PrimeScript TM One Step RT-PCR kit Ver.2), πρότυπα ζεύγη βάσεων DNA (DNA MW Standard Marker, 100bp DNA Ladder) και διάλυμα χρωστικής φόρτωσης προϊόντων PCR από την TAKARA Bio Inc. (Shiga, Japan). Εκκινητές RT-PCR για IL-6, MKP1 και GAPDH από την MWG Biotech AG (Ebersberg, Germany). 46

52 Υλικά και Μέθοδοι Διάλυμα βαφής νουκλεϊνικών οξέων στο πήγμα αγαρόζης (GelRed TM Nucleic Acid Gel Stain) από την Biotium (Hayward, CA). Όλα τα υπόλοιπα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικού βαθμού καθαρότητας. Aντισώματα για Ρ-ERK Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) Antibody #9101 (Cell signaling) P44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody #9102 (Cell signaling) Μέθοδοι 1. Αποµόνωση κυττάρων τύπου ινοβλάστης και καλλιέργεια αυτών Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα τα οποία προέρχονταν από ρινικούς πολύποδες από ασθενείς µε χρόνια ρινίτιδα και πολυποδίαση και δείγµατα φυσιολογικού πνεύµονα κατά τη διάρκεια επέµβασης αφαίρεσης καρκίνου του πνεύµονα. Τα δείγµατα συλλέχθηκαν από την Ωτορινολαρυγγολογική Κλινική και το Θωρακοχειρουργικό Τµήµα της Χειρουργικής Κλινικής, αντίστοιχα, του Τµήµατος Ιατρικής του Πανεπιστηµίου Πατρών, και χρησιµοποιήθηκαν για την αποµόνωση κυττάρων τύπου ινοβλάστης, όπως περιγράφεται παρακάτω. Τα δείγµατα ρινικού πολύποδα και πνεύµονα τεµαχίζονταν σε µικρά τµήµατα και διασπείρονταν κατευθείαν, χωρίς προηγούµενη επεξεργασία µε κολλαγονάση, σε πλαστικές φιάλες όπου και καλλιεργούνταν σε DMEM-10% FCS µέχρι την εµφάνιση και ανάπτυξη ινοβλαστών (εικόνα Μ1) γύρω από τα τεµαχίδια του ιστού. Στην συνέχεια το µέσο καλλιέργειας µε τα µικροτεµαχίδια αποµακρύνονταν και η καλλιέργεια συνεχίζονταν σε DMEM-10% FCS µέχρι την ολοκλήρωση της κυτταρικής µονοστοιβάδας. Μετά την πλήρη ανάπτυξη της κυτταρικής µονοστoιβάδας, τα κύτταρα συλλέγονταν ύστερα από ήπια πέψη µε θρυψίνη, αραιώνονταν 1:3 και επανακαλλιεργούνταν στο ίδιο µέσο. Αναλυτικά η διαδικασία αυτή περιλάµβανε τα εξής στάδια: Έκπλυση των κυττάρων µε PBS (2 φορές). Επεξεργασία των κυττάρων µε θρυψίνη-edta (0,05% και 0,02%, αντίστοιχα) στους 37 o C για ~5 min. 47

53 Υλικά και Μέθοδοι Τερµατισµός της αντίδρασης µε DMEM-10% FCS και συλλογή των κυττάρων µε φυγοκέντρηση στις 1400rpm για 4 min. Αιώρηση των κυττάρων σε DMEM-10% FCS και διασπορά τους σε πλαστικές φιάλες καλλιέργειας τριπλάσιας επιφάνειας σε σχέση µε την προηγούµενη καλλιέργεια. Προκειµένου να ληφθεί οµοιογενής πληθυσµός κυττάρων τύπου ινοβλάστης, η διαδικασία αυτή επαναλαµβάνονταν δύο ή τρεις ακόµη φορές, δηλαδή. µέχρι 3η ή 4η γενιά (passage). Όλα τα πειράµατα έγιναν µε κύτταρα 3ης ή 4ης γενιάς. Τα κύτταρα καλλιεργούνταν σε πλάκες 6 κελίων µε DMEM-10% FCS µέχρι την πλήρη ανάπτυξη της κυτταρικής µονοστoιβάδας και στη συνέχεια το µέσο αποχύνονταν και τα κύτταρα παρέµεναν για 24h απουσία ορού σε DMEM-0.2% υδρόλυµα λακταλβουµίνης (DMEM-0.2% LH). Ακολουθούσε καλλιέργεια των κυττάρων εις τριπλούν, απουσία ή παρουσία διαφόρων παραγόντων ή συνδυασµού αυτών στο ίδιο µέσο καλλιέργειας για διάφορους χρόνους. Η διάρκεια της καλλιέργειας, όπως και η συγκέντρωση του κάθε παράγοντα που χρησιµοποιήθηκε θα αναφέρονται κατά την έκθεση των αποτελεσµάτων. Μετά το πέρας της καλλιέργειας συλλέγονταν το µέσο καλλιέργειας και φυλάσσονταν στους- 20 ο C, ενώ οι πλάκες µε τα προσκολληµένα κύτταρα φυλάσσονταν στους -80 ο C για την αποµόνωση ολικού RNA και τη χρήση του σε RT-PCR ανάλυση ή για άλλη χρήση. Η απουσία του FCS απαιτείται προκειµένου να αποφευχθούν οι επιδράσεις κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων, που υπάρχουν σε αυτό. Τέλος, όλες οι διαδικασίες έγιναν σε στείρες συνθήκες και τα διαλύµατα των κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων που χρησιµοποιήθηκαν αποστειρώθηκαν µε τη βοήθεια ειδικών φίλτρων (διάµετρος πόρων 0,2µm).Στο θρεπτικό μέσο που χρησιμοποιήθηκε προστέθηκε το ακόλουθο αντιβιοτικό: πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη 100 U/ml. Όλες οι καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε συνθήκες 37 ο C, 5% CO2 και 100% υγρασία. Εικόνα Μ1. Κύτταρα τύπου ινοβλάστης σε καλλιέργεια 48

54 Υλικά και Μέθοδοι 2. Μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο Neubauer Η μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο (Eικόνα Μ2) είναι η πιο άμεση, απλή και αποδοτική μέθοδος μέτρησης κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρημα. Το αιματοκυτταρόμετρο είναι μια τροποποιημένη αντικειμενοφόρος πλάκα που έχει δυο κατάλληλα επεξεργασμένες λείες επιφάνειες. Σε κάθε μια από αυτές διακρίνεται μια διαγράμμιση σε μορφή τετραγωνισμένου πλέγματος, το οποίο αποτελείται από 9 κύρια τετράγωνα με μήκος πλευράς 1 mm (εμβαδόν τετραγώνου 1 mm 2 ). Το κάθε τετράγωνο ορίζεται από τρεις παράλληλες γραμμές που απέχουν μεταξύ τους 2.5 μm, και οι οποίες χρησιμεύουν για το καθορισμό της θέσης των κυττάρων εντός ή εκτός του πλέγματος. Σε κάθε ένα από τα αρχικά τετράγωνα περιέχονται επιπλέον διαβαθμίσεις για διευκόλυνση της μέτρησης των κυττάρων. Το αιματοκυτταρόμετρο εμφανίζει δυο ίσου μεγέθους, λείες, προεξέχουσες επιφάνειες, με επίπεδο παράλληλο με τις διαγραμμισμένες, που ονομάζονται «ράχες», και στις οποίες στηρίζεται η καλυπτρίδα. Οι διαγραμμισμένες επιφάνειες βρίσκονται 0.1 mm χαμηλότερα από τις «ράχες». Μεταξύ της εξωτερικής πλευράς κάθε τετραγωνισμένης επιφάνειας και των σημείων που στηρίζεται η καλυπτρίδα υπάρχει μια κοίλη επιφάνεια. Στην κοίλη αυτή επιφάνεια τοποθετείται το κυτταρικό εναιώρημα, το οποίο με τριχοειδικά φαινόμενα απλώνεται στην τετραγωνισμένη επιφάνεια. 49

55 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα Μ2. Αιματοκυτταρόμετρο Neubauer. Παρουσιάζεται σχηματικά και ο τρόπος υπολογισμού των κυττάρων. Ο όγκος του κυτταρικού εναιωρήματος που θα καλύπτει ένα από τα εννέα τετράγωνα είναι 0.1 mm 3 (1 mm x 0.1 mm) ή 10-4 ml. Έτσι η συγκέντρωση των κυττάρων στο κυτταρικό εναιώρημα (κύτταρα/ml) είναι: Αριθμός κυττάρων στο ένα από τα κύρια τετράγωνα x Κατάψυξη κυττάρων Η διατήρηση των κυττάρων για μεγάλο διάστημα είναι δυνατή με την αποθήκευσή τους σε υγρό άζωτο σε θερμοκρασίες μεταξύ -195 ο C και -210 ο C. Για μικρότερο χρονικό διάστημα (λίγους μήνες), μπορούν να διατηρηθούν και σε θερμοκρασία -80 ο C. Για την επιτυχή διατήρησή τους είναι απαραίτητη η καλή μεταβολική τους κατάσταση πριν την ψύξη; για το λόγο αυτό, η διαδικασία κατάψυξης των κυττάρων πραγματοποιείται όταν αυτά έχουν καλύψει το 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου. Για την επιτυχή κατάψυξή τους είναι απαραίτητη και η βαθμιαία ψύξη τους (περίπου 1 ο C ανά ώρα), μέχρι ένα κρίσιμο σημείο θερμοκρασίας, -20 ο C. Η βαθμιαία ψύξη επιτυγχάνεται με τη χρήση μιας συσκευής με υποδοχές η οποία περιέχει ισοπροπανόλη. Προκειμένου να αποφευχθεί ο σχηματισμός πάγου στο εσωτερικό τους και να ελαχιστοποιηθεί η απώλεια νερού χρησιμοποιείται διμεθυλο-σουλφοξείδιο (DMSO). 50

56 Υλικά και Μέθοδοι Υλικά και διαλύματα Διμεθυλο-σουλφοξείδιο (DMSO) Πρέπει να είναι ειδικό για κυτταροκαλλιέργειες (cell culture grade). Πλήρες θρεπτικό μέσο Ορός εμβρύου βοός (FBS) Ειδικά φιαλίδια για την ψύξη των κυττάρων (cryovials) Δοχείο ψύξης κυττάρων με ισοπροπανόλη Δοχείο Dewar με υγρό άζωτο Πειραματική πορεία 1. Αποκόλληση των κυττάρων με τρυψίνη (όπως αναφέρεται στη διαδικασία της ανακαλλιέργειας). Τα κύτταρα από 1 τρυβλίο 100 mm αποθηκεύονται σε ένα φιαλίδιο. 2. Φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 λεπτά στους 26 ο C. 3. Σημειώνονται στο φιαλίδιο το όνομα της κυτταρικής σειράς, η ημερομηνία κατάψυξης και η γενιά των κυττάρων. 4. Αφαιρείται το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο. 5. Το ίζημα των κυττάρων επαναιωρείται σε 900 μl ορού. 6. Μεταφορά του εναιωρήματος των κυττάρων στο ειδικό φιαλίδιο για την ψύξη των κυττάρων. 7. Προσθήκη 100 μl DMSO. Την προσθήκη του DMSO ακολουθεί γρήγορη ανάδευση με πιπέτα και άμεση μεταφορά στο δοχείο ψύξης των κυττάρων με ισοπροπανόλη. Οι κινήσεις πρέπει να είναι σύντομες, γιατί το DMSO είναι τοξικό για τα κύτταρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η προσθήκη του μειώνει τη δημιουργία κρυστάλλων νερού στο εσωτερικό των κυττάρων, αλλά η τελική συγκέντρωση του DMSO δεν πρέπει να υπερβαίνει το 20% στο τελικό διάλυμα για να αποφευχθούν προβλήματα τοξικότητας. 8. Τοποθέτηση του δοχείου ψύξης των κυττάρων στους -80 ο C για 24 ώρες. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η σταδιακή μείωση της θερμοκρασίας (περίπου 1 ο C ανά ώρα). 9. Τοποθέτηση του φιαλιδίου για την ψύξη των κυττάρων σε ειδική υποδοχή βυθισμένη σε υγρό άζωτο στο δοχείο Dewar. 51

57 Υλικά και Μέθοδοι 10. Καταγραφή στο τετράδιο του δοχείου Dewar της θέσης που βρίσκεται το φιαλίδιο, του είδους των κυττάρων, της ημερομηνίας και της γενιάς που θα έχουν τα κύτταρα όταν ξεπαγώσουν. 4. Απόψυξη κυττάρων Με τη διαδικασία αυτή, κύτταρα που βρίσκονται παγωμένα ακόμα και για μεγάλο χρονικό διάστημα, είναι δυνατό να οδηγηθούν σε καλλιέργεια. Λόγω της τοξικότητας του DMSO, οι χειρισμοί στη διαδικασία αυτή, όπως και στην κατάψυξη, πρέπει να είναι γρήγορες. Υλικά και διαλύματα Θρεπτικό μέσο Πλήρες θρεπτικό μέσο Πειραματική πορεία 1. Σε δοκιμαστικό σωλήνα των 15 ml προστίθενται 9 ml απλού θρεπτικού μέσου των συγκεκριμένων κυττάρων. 2. Αφαίρεση των κυττάρων από το υγρό άζωτο. 3. Σύντομο ξεπάγωμα με ανακίνηση σε υδατόλουτρο στους 37 ο C. 4. Μεταφορά των κυττάρων στo σωλήνα με τα 9 ml και γρήγορη ανάδευση. Το στάδιο αυτό αποσκοπεί στην αραίωση του DMSO στο θρεπτικό μέσο που βρίσκονται τα κύτταρα. 5. Φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 λεπτά στους 26 ο C. 6. Απόρριψη του υπερκειμένου με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 7. Επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων σε 3 ml θρεπτικού μέσου στο δοκιμαστικό σωλήνα. Προσθήκη θρεπτικού μέσου μέχρι όγκου 10 ml. 8. Φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 λεπτά στους 26 ο C. 9. Απόρριψη του υπερκειμένου με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 10. Επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων σε 3 ml πλήρους θρεπτικού μέσου στο δοκιμαστικό σωλήνα. Προσθήκη πλήρους θρεπτικού μέσου μέχρι όγκου 10 ml. 11. Μεταφορά των κυττάρων σε τρυβλίο καλλιέργειας. 52

58 Υλικά και Μέθοδοι 12. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. 13. Μεταφορά του τρυβλίου στον επωαστικό θάλαμο. 14. Αλλαγή πλήρους θρεπτικού μέσου κάθε 3-4 ημέρες μέχρι τα κύτταρα να φθάνουν σε βαθμό επικάλυψης του τρυβλίου 80-90%. 5. Απομόνωση ολικού RNA από κύτταρα Χρησιμοποιήθηκε το ολοκληρωμένο σύστημα απομόνωσης RNA, DNA και πρωτεΐνης NucleoSpin TriPrep της εταιρείας Macherey-Nagel (Germany). Διαλύματα RA1 για λύση κυττάρων DTT συγκέντρωσης 1M Αιθανόλη 70% DNA Wash για αφαλάτωση DNA DNA Elute για έκλουση του DNA Διάλυμα DNάσης RA2 για αναστολή της DΝάσης RA3 για έκλουση υπολειμάτων DNA RNase-free Η2Ο Πειραματική πορεία 1. Λύση των κυττάρων (~4Χ10 6 ) και έντονη ανάδευση με 350 μl διαλύματος λύσης (RA1), στο οποίο έχει προστεθεί DTT συγκέντρωσης 1M (σε αναλογία 1:100). 2. Μεταφορά του εκχυλίσματος των κυττάρων σε στήλη χρωματογραφίας (violet ring) που φέρει φίλτρο και συλλογή του διαλύματος των νουκλεϊκών οξέων μετά από φυγοκέντρηση στα g για 1 λεπτό. Απόρριψη της στήλης και προσθήκη 350 μl αιθανόλης 70% κ.ό. στο διάλυμα που έχει συλλεγεί. Ακολουθεί έντονη ανάδευση. 3. Μεταφορά του διαλύματος σε νέα στήλη (light blue ring) και φυγοκέντρηση στα g για 30 δευτερόλεπτα. Στο στάδιο αυτό τα νουκλεϊνικά οξέα προσροφούνται 53

59 Υλικά και Μέθοδοι στο φίλτρο της στήλης και οι πρωτεΐνες διέρχονται από τη στήλη και συλλέγονται σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρου (ακολουθεί διαδικασία περαιτέρω καθαρισμού της πρωτεΐνης, όπως περιγράφεται παρακάτω). 4. Αφαλάτωση του φίλτρου της στήλης με προσθήκη 500 μl διαλύματος αφαλάτωσης (DNA Wash) και φυγοκέντρηση στα g για 1 λεπτό. Ακολουθεί και δεύτερο πλύσιμο της μεμβράνης με 500 μl DNA Wash και φυγοκέντρηση στα g για 1 λεπτό. 5. Στέγνωμα της μεμβράνης για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Προσθήκη 100 μl διαλύματος DNA Elute και φυγοκέντρηση στα g για 1 λεπτό. 7. Συλλογή DNA, καθαρού για κάθε διαδικασία. 8. Προσθήκη διαλύματος DNάσης στην επιφάνεια του φίλτρου και επώαση για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 9. Προσθήκη 200 μl διαλύματος αναστολής της DNάσης (RA2) στην επιφάνεια του φίλτρου. Φυγοκέντρηση στα g για 30 δευτερόλεπτα και μεταφορά της στήλης σε νέο σωληνάριο μικροφυγοκέντρου. 10. Προσθήκη 600 μl διαλύματος έκλουσης DNA (RA3). Φυγοκέντρηση στα g για 30 δευτερόλεπτα, απόρριψη του εκλούματος, προσθήκη στην επιφάνεια του φίλτρου εκ νέου 250 μl από το διάλυμα RA3 και φυγοκέντρηση στις ίδιες συνθήκες. 11. Μεταφορά της στήλης σε νέο σωληνάριο μικροφυγοκέντρου και έκλουση του RNA με προσθήκη 60 μl αποστειρωμένου RNase-free Η2Ο στην επιφάνεια του φίλτρου. 12. Φυγοκέντρηση στα g για 1 λεπτό και διατήρηση του διαλύματος RNA στους -80 ο C. 13. Στο διάλυμα ολικού RNA, προκειμένου να χρησιμοποιηθεί σε περαιτέρω αναλύσεις, πραγματοποιείται προσδιορισμός της συγκέντρωσης ολικού RNA με φασματοφωτομετρική μέθοδο. Επίσης, προκειμένου να ελεγχθεί η ποιότητά του, πραγματοποιείται ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% κ.β. 54

60 Υλικά και Μέθοδοι 6. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης RNA Διαλύματα Αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό Διάλυμα RNA Πειραματική πορεία 1. 1μl αποστειρωμένου νερού χρησιμοποιείται ως τυφλό για το μηδενισμό του Nanodrop. 2. 1μl δείγματος RNA φωτομετρείται στη συνέχεια. Ο λόγος της οπτικής απορρόφησης στα 260nm ως προς την οπτική απορρόφηση στα 280nm αποτελεί δείκτη της καθαρότητας του δείγματος. Αν ο λόγος αυτός είναι μικρότερος του 1,8, τότε η περιεκτικότητα του δείγματος σε πρωτεΐνες είναι υψηλή, κάτι που μπορεί να προκαλέσει προβλήματα στις περαιτέρω αναλύσεις. 7. Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊνικών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης (Sellner et al., 1992; Brooks et al., 1995) Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης είναι η κύρια μέθοδος που χρησιμοποιείται για την ανάλυση νουκλεϊνικών οξέων. Στα πηκτώματα αγαρόζης, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα γραμμικών μορίων είναι αντιστρόφως ανάλογη του λογάριθμου του μοριακού τους βάρους. Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα εξαρτάται επίσης και από τη συγκέντρωση της αγαρόζης στο πήκτωμα. Στα πειράματα της παρούσας εργασίας, χρησιμοποιήθηκαν πηκτώματα αγαρόζης 0,8% για την ανάλυση DNA και πηκτώματα 2% για την ανάλυση ολικού RNA και των δειγμάτων PCR. Διαλύματα 5Χ TBE 0,45 M Tris-base 0,45 M Βορικό οξύ 0,01 Μ EDTA ph 8,0 Διάλυμα Βρωμιούχου αιθιδίου 10 mg/ml 6X διάλυμα δειγμάτων 0,25% κ.β κυανούν της βρωμοφαινόλης 55

61 Υλικά και Μέθοδοι 30% κ.ό γλυκερόλη σε Η2Ο Πειραματική πορεία Σε μια μικρή κωνική φιάλη προστίθεται ζυγισμένη ποσότητα αγαρόζης, σε συγκεκριμένο όγκο διαλύματος ηλεκτροφόρησης 0,5Χ TBE (για 2% πήκτωμα αγαρόζης θέλουμε 25 ml 0,5Χ TBE και 0,5 g αγαρόζη). Το διάλυμα θερμαίνεται σε φούρνο μικροκυμάτων μέχρι να διαλυθεί όλη η ποσότητα της αγαρόζης. (Προσοχή: δεν πρέπει να μείνει παραπάνω, γιατί εξατμίζεται ο διαλύτης και το πήκτωμα είναι πιο πυκνό). Όταν η θερμοκρασία του διαλύματος της αγαρόζης φτάσει στους 50 o C, προστίθεται βρωμιούχο αιθίδιο σε τελική συγκέντρωση 1 μg/ml. Το διάλυμα αγαρόζης αποχύνεται στον ειδικό φορέα (μήτρα). Στα δείγματα των νουκλεϊνικών οξέων προστίθεται διάλυμα δειγμάτων 6Χ σε αναλογία 1:5. Όταν πολυμεριστεί η αγαρόζη, τα προς ανάλυση δείγματα μεταφέρονται με πιπέτα στις ειδικές εγκοπές του πηκτώματος. Εφαρμόζεται ομοιογενές ηλεκτρικό πεδίο (50 V) και τα νουκλεϊνικά οξέα αναλύονται με βάση το μέγεθος τους. Η ανάλυση των δειγμάτων γίνεται σε οριζόντια συσκευή ηλεκτροφόρησης. Η παρατήρηση των πηκτωμάτων γίνεται με χρήση διερχόμενου υπεριώδους φωτός. 8. Προσδιορισμός των επιπέδων mrna με τη χρήση συνδυασμένης αντίστροφης μεταγραφής και αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR) Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν IL-6 (Eickelberg O et al., 1999), MKP-1 (Kojima et al., 2000) και GAPDH, η θερμοκρασία σύνδεσης των εκκινητών (T ο C) (θερμοκρασία επαναδιάταξης) και το μέγεθος των προϊόντων της PCR (ζεύγη βάσεων) (bp), φαίνονται παρακάτω: IL-6 5 Primer (forward): 5 -GCC-CAG-CTA-TGA-ACT-CCT-TCT-C-3 3 Primer (reverse): 5 -GAG-TTG-TCA-TGT-CCT-GCA-GCC-3 Μέγεθος του προϊόντος: 560 bp και θερμοκρασία σύνδεσης εκκινητών: 58 ο C. 56

62 Υλικά και Μέθοδοι MKP-1 5 Primer (forward): 5 -GCT-GTG-CAG-CAA-ACAGTC-GA-3 3 Primer (reverse): 5 -CGA-TTA-GTC-CTC-ATA-AGG-TA-3 Μέγεθος του προϊόντος: 431 bp και θερμοκρασία σύνδεσης εκκινητών: 52 ο C. GAPDH 5 -ACA-TCA-TCC-CTG-CCT-CTA-CTG-G-3 5 -AGT-GGG-TGT-CGC-TGT-TGA-AGT-C-3 Μέγεθος του προϊόντος: 263 bp και θερμοκρασία σύνδεσης εκκινητών: 60 ο C. Πειραματική πορεία Η μέθοδος της RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) περιλαμβάνει ένα πρώτο στάδιο σύνθεσης του συμπληρωματικού DNA (cdna), χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο το RNA, με τη δράση του ενζύμου της αντίστροφης μεταγραφάσης. Στη συνέχεια, ο πολλαπλασιασμός του cdna ακολουθεί τα παραπάνω στάδια. Χρησιμοποιήθηκε το PrimeScript TM One Step RT-PCR kit Ver.2 της εταιρίας TAKARA. Ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιήθηκε αυτό της αφυδρογονάσης της 3- φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (GAPDH). Η ποσότητα ολικού RNA, η οποία χρησιμοποιήθηκε ανά δοκιμή ήταν 15 ng για την IL-6, 60 ng για την MKP-1 και 4ng για τη GAPDH. Σε ειδικό σωλήνα των 0,2ml, το μίγμα αντίδρασης περιείχε το ολικό RNA, 15 pmol από τον κάθε εκκινητή (νοηματικό και αντινοηματικό), 25μL 2Χ1 step buffer και 2μL από το μίγμα ενζύμων (αντίστροφη μεταγραφάση και DNA πολυμεράση) PrimeScript TM 1 step Enzyme Mix. Τέλος, ο όγκος του κάθε δείγματος συμπληρωνόταν μέχρι τα 50μL με νερό ελεύθερο από ριβονουκλεάσες και ο σωλήνας τοποθετήθηκε στην ειδική συσκευή (thermocycler) όπου πραγματοποιούνταν η αντίστροφη μεταγραφή για 30min στους 50 ο C. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης γινόταν σε 30 κύκλους, ο καθένας των οποίων περιελάμβανε τα παρακάτω στάδια: Αποδιάταξη των αλυσίδων του DNA στους 95 ο C για 1 min. Σύνδεση των εκκινητών στις αλυσίδες του DNA (annealing) σε κατάλληλη θερμοκρασία για 1min. 57

63 Υλικά και Μέθοδοι Επιμήκυνση των αλυσίδων στους 72 ο C για 1min. Μετά τον τελευταίο κύκλο, επώαση για επιπλέον 10min στους 72 ο C Τέλος, τα δείγματα ψύχονταν στους 4 ο C και παραλαμβάνονταν από τη συσκευή. Μετά το τέλος της PCR, 5μL από το μίγμα αντίδρασης του προς μελέτη μορίου και 5μL από το μίγμα αντίδρασης του μορίου αναφοράς GAPDH για κάθε δείγμα, ηλεκτροφορούνταν μαζί, έπειτα από την προσθήκη 5μL διαλύματος βαφής φόρτωσης προϊόντων PCR (10μL τελικός όγκος), σε 2% πήγμα αγαρόζης παρουσία 0,01% διαλύματος βαφής νουκλεϊνικών οξέων Midori. Ο προσδιορισμός της έντασης των ζωνών πραγματοποιούνταν με χρήση του προγράμματος (Scion) Image PC software (Velleman, 1995) και ακολουθούσε σύγκριση με την ένταση της ζώνης του δείγματος αναφοράς της GAPDH. 9. Ανοσοενζυµική µέθοδος ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Η ELISA, κύριος εκπρόσωπος των ανοσοενζυµικών αναλυτικών µεθόδων, αποτελεί µία µέθοδο η οποία, στηριζόµενη στην εξειδικευµένη αντίδραση αντιγόνου αντισώµατος, επιτρέπει τόσο τον ποιοτικό όσο και τον ποσοτικό προσδιορισµό διαφόρων ουσιών που κατά την πειραµατική διαδικασία κατέχουν το ρόλο αντιγόνου. Υπάρχουν διάφορες κατηγορίες, που αναλύονται παρακάτω, οι οποίες στηρίζονται στην ίδια αρχή και διαφοροποιούνται από τη σειρά µε την οποία προστίθενται στην ειδική πλάκα πολυστυρολίου τα αντισώµατα και το αντιγόνο. Σα βασικά βήματα που ακολουθούνται στη sandwich ELISA είναι τα εξής (Εικόνα Μ3): 1. Γίνεται η προσκόλληση αντισωμάτων, ειδικών για την κυτταροκίνη-αντιγόνο που θέλουμε να ανιχνεύσουμε, στα κελία του πιάτου της ELISA. 2. Προσθέτουμε τα δείγματα στα κελία και γίνεται η δέσμευση των αντιγόνων στα αντισώματα. Επειδή τα αντισώματα αυτά είναι ειδικά για τη συγκεκριμένη κυτταροκίνη δεσμεύονται στο αντιγόνο τους με υψηλή συγγένεια, ακόμα κι όταν αυτό βρίσκεται σε μικρή συγκέντρωση. 3. Προσθέτουμε το πρώτο αντίσωμα που αναγνωρίζει έναν διαφορετικό επίτοπο του αντιγόνου. 4. Προσθέτουμε δεύτερο αντίσωμα, το οποίο αναγνωρίζει το πρώτο αντίσωμα πάνω στο οποίο είναι δεσμευμένο ένα ένζυμο. 58

64 Υλικά και Μέθοδοι 5. Tέλος, προσθέτουμε το υπόστρωμα του ένζυμου και η αντίδραση ένζυμουυποστρώματος μετατρέπει το υπόστρωμα σε ανιχνεύσιμη μορφή χρώματος που μπορεί να μετρηθεί με τη χρήση φωτόμετρου. Εικόνα Μ3. Τα βασικά βήματα της sandwich ELISA. O προσδιορισμός της IL-6 έγινε με το Human IL-6 ELISA kit της εταιρείας Peprotech, στο οποίο χρησιμοποιείται sandwich ELISA. Ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για την IL-6 είναι δεσμευμένο μέσα στα κελία του πιάτου του ELISA kit. Tοποθετούμε στα κελιά 100μl από τα δείγματα, συμπεριλαμβανομένων των δειγμάτων με standard και άγνωστες συγκεντρώσεις 50μl biotinylated αντίσωμα έναντι της IL-6 και επωάζουμε σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Μετά την επώαση ξεπλένουμε για την απομάκρυνση του μη δεσμευμένου αντισώματος. Έπειτα προσθέτουμε 100μl Streptavidin-HRP, η οποία αναγνωρίζει και δεσμεύεται στο biotinylated αντίσωμα, και επωάζουμε για 30λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επώαση ξεπλένουμε, προσθέτουμε 100μl ΣΜΒ που περιέχει το υπόστρωμα της ΗRP, επωάζουμε για κάποια λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου και σταματάμε την αντίδραση υποστρώματος-hrp με την προσθήκη 100μl Η2SΟ4. Η αλλαγή χρώματος στα πηγαδάκια οφείλεται στη μετατροπή του υποστρώματος από την HRΡ. Μετά μεταφέρουμε το πιάτο σε φωτόμετρο για ELISA και μετράμε την οπτική απορρόφηση στα 450nm. 59

65 Υλικά και Μέθοδοι 10. Απομόνωση και καθαρισμός πρωτεΐνης Χρησιμοποιήθηκε το σύστημα απομόνωσης RNA, DNA και πρωτεΐνης NucleoSpin TriPrep της εταιρείας Macherey-Nagel (Germany), με τη χρήση ειδικής στήλης χρωματογραφίας. Διαλύματα PP (protein precipitator) για καθίζηση πρωτεΐνης Αιθανόλη 50% PSB-TCEP (Protein Solving buffer, containing reducing agent) με αναγωγικές ιδιότητες Πειραματική πορεία 1. Σε 350 μl από το διάλυμα που προέκυψαν από το βήμα 8.3 στην απομόνωση του RNA, προστίθενται 350 μl διαλύματος PP (protein precipitator). 2. Ακολουθεί έντονη ανάδευση και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. 3. Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα g. 4. Απομάκρυνση υπερκειμένου με πιπέτα. 5. Προσθήκη 500 μl αιθανόλης 50% στο ίζημα της πρωτεΐνης που έχει κατακρημνιστεί. 6. Φυγοκένρηση για 1 λεπτό στα g. 7. Απομάκρυνση υπερκειμένου με πιπέτα όσο καλύτερα γίνεται. 8. Ξήρανση του ιζήματος για 5-10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 9. Προσθήκη 100 μl διαλύματος PSB-TCEP (Protein Solving buffer, containing reducing agent). 10. Επώαση για 3-5 λεπτά στους ο C για πλήρη διάλυση του ιζήματος. 11. Τοποθέτηση του δείγματος στους -20 ο C. 11. Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου με αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970; Neville, 1971) Υλικά και Διαλύματα Διάλυμα ακρυλαμιδίου 30% κ.β. (ακρυλαμίδιο/μεθυλεν-δις-ακρυλαμίδιο 30/1) 60

66 Υλικά και Μέθοδοι 30 g Ακρυλαμίδιο 1 g Μεθυλεν-δις-ακρυλαμίδιο Απεσταγμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 100 ml Tris-HCl 1.5M, ph ,165 g Tris-base Απεσταγμένο νερό Αρχική προσθήκη 80 ml απεσταγμένου νερού, ρύθμιση του διαλύματος σε ph=8.8 και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι τελικού όγκου 100 ml. Tris-HCl 0.5M, ph 6.8 6,055 g Tris-base Απεσταγμένο νερό Αρχική προσθήκη 80 ml απεσταγμένου νερού, ρύθμιση του διαλύματος σε ph=6.8 και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι τελικού όγκου 100 ml. Διάλυμα δωδεκακυλοθειικού νατρίου (SDS) 10% κ.β. 10 g SDS Απεσταγμένο νερό Αρχική προσθήκη 90 ml απεσταγμένου νερού, θέρμανση στους 68 ο C, ρύθμιση του διαλύματος σε ph=7,9 και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι τελικού όγκου 100 ml. Διάλυμα υπερθειϊκού αμμωνίου (AMPS) 20% κ.β. Ν,Ν,Ν,Ν -Τετραμεθυλ-αιθυλεν-διαμίνη (TEMED) Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων (2x) 0.05 M Tris-HCl ph 6, M Δωδεκακυλοθειϊκό Νάτριο (SDS) 10% κ.ό.γλυκερόλη 2% κ.ό.κυανούν της βρωμοφαινόλης 10% κ.ό. β-μερκαπτοαιθανόλη Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων (5x) (Running Buffer) 2Μ Γλυκίνη 0.25M Tris-base 0.02M Δωδεκακυλοθειϊκό Νάτριο (SDS) Αραίωση του διαλύματος με απεσταγμένο νερό 1:5 πριν τη χρήση του. Στην παρούσα εργασία, η ανάλυση των πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου πραγματοποιήθηκε παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων (SDS, DTT). Η πορεία που ακολουθείται έχει ως εξής: 1. Συναρμολόγηση της συσκευής του πηκτώματος. 2. Παρασκευή του πηκτώματος διαχωρισμού. Ανάλογα με το μοριακό βάρος της υπό εξέταση πρωτεΐνης, παρασκευάζεται πήκτωμα διαχωρισμού με συγκεκριμένη συγκέντρωση ακρυλαμιδίου. Η συγκέντρωση ακρυλαμιδίου αυξάνει όσο μειώνεται το 61

67 Υλικά και Μέθοδοι μοριακό βάρος της υπό μελέτη πρωτεΐνης. H σύσταση του πηκτώματος που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία παρατίθεται στον Πίνακα Μ1. 3. Την παρασκευή του πηκτώματος και την προσθήκη του στη συσκευή ακολουθεί η προσθήκη 1-2 ml απεσταγμένου νερού. Το υπερκείμενο νερό διευκολύνει τη συμπαγή δομή του πηκτώματος και σταθεροποιεί την επάνω επιφάνειά του. Απομακρύνεται μετά τον πολυμερισμό του πηκτώματος και πριν την παρασκευή του πηκτώματος συμπύκνωσης. 4. Προσθήκη εξαρτήματος (χτενάκι) που χρησιμεύει στη δημιουργία θέσεων προσθήκης του δείγματος στο πήκτωμα συμπύκνωσης. Πίνακας Μ1. Σύσταση του πηκτώματος διαχωρισμού. Πυκνότητα πηκτώματος 12% Απεσταγμένο H2O 4.6 ml Ακρυλαμίδιο 30% 2.7 ml Tris-HCl 1.5M ph 8,8 2.5 ml 10% SDS 100 μl 20% AMPS 100 μl TEMED 4 μl 5. Παρασκευή του πηκτώματος συμπύκνωσης. Η συγκέντρωσή του εξαρτάται από τη συγκέντρωση του πηκτώματος διαχωρισμού. Η σύστασή του παρατίθεται στον Πίνακα Μ2. 6. Προσθήκη του πηκτώματος συμπύκνωσης στη συσκευή και αναμονή για τον πολυμερισμό του (20-30 λεπτά). 7. Σε αυτό το χρονικό διάστημα είναι εφικτή η προετοιμασία των δειγμάτων. Τα δείγματα συνήθως φυλάσσονται στους -20 o C. 8. Θέρμανση των δειγμάτων στους 100 ο C για χρόνο 5 λεπτά. 9. Φυγοκέντρηση στα 5000g για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 62

68 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας Μ2. Σύσταση πηκτωμάτος επιστοίβαξης Πυκνότητα πηκτώματος 4% Απεσταγμένο H2O 4.1 ml Ακρυλαμίδιο 30% 1 ml Tris-HCl 0.5M ph 6, ml 10% SDS 6 μl 20% AMPS 6 μl TEMED 6 μl Με την ολοκλήρωση του χρόνου πολυμερισμού του πηκτώματος επιστοίβαξης, απομακρύνεται το χτενάκι και μεταφέρεται η συσκευή του πηκτώματος στη συσκευή ηλεκτροφόρησης. 10. Μεταφορά καθορισμένης ποσότητας ολικής πρωτεΐνης από κάθε δείγμα στις θέσειςυποδοχές που έχουν σχηματισθεί στο πήκτωμα συμπύκνωσης. 11. Εφαρμογή σταθερής τάσης 100 Volt, με αποτέλεσμα τη μετακίνηση των δειγμάτων από τον αρνητικό στο θετικό πόλο του συστήματος. Η απόσταση που διανύει η κάθε πρωτεΐνη στο πήκτωμα διαχωρισμού είναι αντιστρόφως ανάλογη της μοριακής μάζας της. 12. Με την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, οι πρωτεΐνες μεταφέρονται από το πήκτωμα σε μεμβράνη PVDF. 12. Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών Western (Towbin et al, 1979) Υλικά και Διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα για τη συσκευή μεταφοράς πρωτεϊνών 0.04 Μ Γλυκίνη 0.05 M Tris-base 1 mm Δωδεκακυλοθειϊκό Νάτριο (SDS) 20% κ.ό. Μεθανόλη (απόλυτη) 63

69 Υλικά και Μέθοδοι Ρυθμιστικό διάλυμα TBS ph 7,6 (10x) 0.2 M Tris-base 1.36 M NaCl Απεσταγμένο νερό Ρύθμιση του διαλύματος σε ph=7,6 και αραίωση του διαλύματος με απεσταγμένο νερό 1:10 πριν τη χρήση του. Ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Tween 20, ph 7,6 (TBS-T) Ρυθμιστικό διάλυμα TBS (1x) 0.05% κ.ό. Tween-20 Μεμβράνη PVDF (polyvinylidene fluoride) Millipore Immobilon-P Transfer Membrane Άπαχο γάλα σε σκόνη (Regilait) Αλβουμίνη ορού βοός (Bovine Serum Albumin, BSA) Σύστημα χημειοφωταύγειας Χρησιμοποιείται το ολοκληρωμένο σύστημα χημειοφωταύγειας από την Pierce (ECL detection kit) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι: Πρώτο αντίσωμα (cell signaling) Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) Antibody #9101 p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody #9102 Δεύτερο αντισώμα (cell signaling) Anti-rabbit HRP Στον Πίνακα Μ5 παρατίθενται οι συνθήκες για κάθε αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία. Πίνακας Μ5. Παράθεση των συνθηκών των αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση κατά Western. Στις στήλες από αριστερά αναγράφεται η πρωτεΐνη, οι συνθήκες παρεμπόδισης της μη ειδικής δέσμευσης και επώασης του 1 ου και του 2 ου αντισώματος. Πρωτεΐνη Παρεμπόδιση μη ειδικής δέσμευσης 1 ο Αντίσωμα 2 ο Αντίσωμα 3% BSA σε TBS-T 0,05% 1:5.000 σε 0,05% a-goat 1:7.500 σε 64

70 Υλικά και Μέθοδοι 5% άπαχο γάλα σε TBS-T (2 ώρες) TBS-T 1:3.000 σε TBS-T 0,1% με 3% άπαχο γάλα 0,05% TBS-T Anti-mouse 1:5.000 σε TBS-T με 3% άπαχο γάλα 1. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης ακολουθεί τοποθέτηση του πηκτώματος διαχωρισμού σε κατάλληλη συσκευή, για τη μεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωμα σε μεμβράνη PVDF. 2. Η μεταφορά πραγματοποιείται με εφαρμογή ομοιογενούς ηλεκτρικού πεδίου (ηλεκτρομεταφορά). Το πήκτωμα και η μεμβράνη εμβαπτίζονται σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς και εφαρμόζεται σταθερή ένταση ρεύματος 400 ma για χρόνο 3-4 ώρες, με τέτοιο τρόπο, ώστε οι αρνητικά φορτισμένες πρωτεΐνες οι οποίες βρίσκονται στο πήκτωμα να μεταφερθούν στη μεμβράνη PVDF. Ο χρόνος της μεταφοράς είναι ανάλογος με το μοριακό μέγεθος των πρωτεϊνών που είναι να μεταφερθούν. 3. Μετά το τέλος της μεταφοράς ακολουθεί εμβάπτιση της μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T. Πραγματοποιούνται δυο ξεπλύματα των 5 λεπτών το καθένα υπό ανακίνηση, σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Ακολουθεί κορεσμός των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης των αντισωμάτων με επώαση της μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T με 3% BSA ή 5% άπαχο γάλα, ανάλογα με το πρώτο αντίσωμα. Η μεμβράνη και στις δυο περιπτώσεις επωάζεται υπό ανακίνηση για δυο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. 5. Ακολουθεί απόχυση του παραπάνω διαλύματος και η μεμβράνη υφίσταται 3 ξεπλύματα των 5 λεπτών με διάλυμα TBS-T σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Επώαση πρώτου αντισώματος: Η μεμβράνη επωάζεται με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T που περιέχει το πρώτο αντίσωμα σε κατάλληλη αραίωση. Η επώαση πραγματοποιείται υπό ανακίνηση στους 4 ο C για 16 ώρες (overnight επώαση). 7. Απόχυση του διαλύματος του πρώτου αντισώματος (το διάλυμα φυλάσσεται στους - 20 ο C και μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί). Η μεμβράνη υφίσταται 3 ξεπλύματα των 5 λεπτών με διάλυμα TBS-T σε θερμοκρασία δωματίου. 65

71 Υλικά και Μέθοδοι 8. Επώαση δευτέρου αντισώματος: Η μεμβράνη επωάζεται με ρυθμιστικό διάλυμα TBS- T που περιέχει το δεύτερο αντίσωμα σε κατάλληλη αραίωση. Η επώαση πραγματοποιείται υπό ανακίνηση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. 9. Απόχυση του διαλύματος του δευτέρου αντισώματος. Η μεμβράνη υφίσταται 5 ξεπλύματα των 5 λεπτών με TBS-T και 2 ξεπλύματα με TBS (για να απομακρυνθεί το Tween). 10. Το ανοσοαποτύπωμα της πρωτεΐνης στη μεμβράνη εμφανίζεται στο φιλμ με τη χρήση του συστήματος χημειοφωταύγειας (ECL). 13. Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από PVDF μεμβράνη (stripping) (Kain et al, 1994) Η διαδικασία της ανοσοαποτύπωσης western των πρωτεϊνών παρέχει τη δυνατότητα επαναχρησιμοποίησης των μεμβρανών για επώαση με διαφορετικά αντισώματα. Με τη διαδικασία της αποδέσμευσης των αντισωμάτων (stripping) πραγματοποιείται αποκόλληση από τη μεμβράνη των συμπλόκων πρώτου και δεύτερου αντισώματος, ενώ παραμένουν προσκολλημένες στη μεμβράνη οι ισχυρά δεσμευμένες (με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις) σε αυτήν πρωτεΐνες από την ηλεκτρομεταφορά. Έτσι μπορεί να χρησιμοποιηθεί 1 ο και 2 ο αντίσωμα για ακτίνη και να ποσοτικοποιηθεί η πρώτη πρωτεΐνη σε σύγκριση με την ακτίνη. Υλικά και Διαλύματα Διάλυμα αποδέσμευσης των αντισωμάτων από τη μεμβράνη 62.5 mm Tris-HCl ph 6,8 2% κ.β. Δωδεκακυλοθειϊκό νάτριο (SDS) 100 mm β-μερκαπτοαιθανόλη Ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Tween 20, ph 7,6 (TBS-T) Ρυθμιστικό διάλυμα TBS (1x) 0.05% κ.ό. Tween Μετά την έκθεση της μεμβράνης στο φιλμ ακολουθούν 3 επωάσεις των 5 λεπτών στη μεμβράνη υπό ανακίνηση με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T. 66

72 Υλικά και Μέθοδοι 2. Επώαση της μεμβράνης στο διάλυμα αποδέσμευσης των αντισωμάτων για 30 λεπτά σε θερμοκρασία ο C υπό ανακίνηση. 3. Ακολουθούν 6 επωάσεις των 5 λεπτών στη μεμβράνη υπό ανακίνηση με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T. 4. Πραγματοποιείται επώαση για την κάλυψη των ελεύθερων θέσεων της μεμβράνης και επαναλαμβάνεται η διαδικασία ανάλυσης των πρωτεϊνών κατά Western. 14. Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωμάτων και των πηκτωμάτων αγαρόζης με σύστημα ανάλυσης εικόνας Προκειμένου να εξαχθούν ποσοτικά συμπεράσματα από ανοσοαποτυπώματα και πηκτώματα αγαρόζης γίνεται ποσοτικοποίηση των ζωνών με τη χρήση συστήματος ανάλυσης εικόνας. Τα ανοσοαποτυπώματα ψηφιοποιούνται με χρήση σαρωτή (HP Scanjet G3010) και οι ψηφιακές φωτογραφίες αναλύονται με το πρόγραμμα Scion Image (Scion Corporation). Το λογισμικό είναι ρυθμισμένο κατάλληλα, ώστε για κάθε ζώνη που περιγράφεται, να καταγράφεται αυτόματα σε ένα λογιστικό φύλλο η επιφάνεια της ζώνης και η μέση έντασή της. Το γινόμενο των δυο αυτών παραμέτρων είναι ανάλογο της ποσότητας της πρωτεΐνης που αντιστοιχεί σε κάθε ζώνη και χρησιμοποιείται περαιτέρω για ποσοτικές αναλύσεις. 15. Προσδιορισμός των ενδοκυτταρικών επιπέδων ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS) φθορισμομετρικά Τα ενδοκυτταραικά επίπεδα των ROS μετρήθηκαν με τη χρήση της φθορίζουσας χρωστικής 2,7 -dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA). Η χρωστική DCFH-DA είναι μιά υδρόφοβη ένωση που εύκολα διαπερνά τις κυτταρικές μεμβράνες και διαχέεται μέσα στα κύτταρα, όπου αυτή υδρολύεται από εστεράσες στο μή φθορίζον πολικό παράγωγο DCFH το οποίο και εγκλωβίζεται εντός των κυττάρων (Bae et al. 1997). Παρουσία ενός οξειδωτικού, η DCFH οξειδώνεται και μετατρέπεται στην πολύ φθορίζουσα 2,7 dichlorofluorescin (DCF), η οποία ανιχνεύεται από το ειδικό φθορισμόμετρο. 67

73 Υλικά και Μέθοδοι Κύτταρα τύπου ινοβλάστης διασπείρονταν σε μαύρες πλάκες φθορισμού 96 κελίων (5-10x10 3 κύτταρα/κελίο) σε DMEM-10% FCS μέχρι την ολοκλήρωση της κυτταρικής μονοστοιβάδας και στη συνέχεια το μέσο αποχύνονταν και τα κύτταρα παρέμεναν για 24h απουσία ορού σε DMEM- 0.2% LH. Έπειτα το μέσο αποχύνονταν και ακολουθούσε έκπλυση των κυττάρων με Hank s. Στη συνέχεια προστίθονταν διάλυμα 50μM DCFH-DA (διαλυμένο σε DMSO) σε Hank s (50μL/κελίο) και ακολουθούσε επώαση σε ατμόσφαιρα 95% αέρα - 5% CO2 για 30min σε σκοτάδι. Μετά την προσθήκη διαλύματος TGF-β σε Hank s (30μL/κελίο), σε συγκέντρωση τέτοια ώστε να προκύψει τελική συγκέντρωση 1ng/mL (Wu et al., 2002), η πλάκα τοποθετούταν στο ειδικό φθορισμόμετρο (TECAN) σε θερμοκρασία 37 ο C και πραγματοποιούνταν λήψεις μετρήσεων για διάφορους χρόνους, χρησιμοποιώντας ως μήκος κύματος διέγερσης τα 488nm και ως μήκος κύματος εκπομπής τα 530nm. Το πείραμα πραγματοποιούνταν εις τριπλούν. Για κάθε χρόνο, η μέτρηση λαμβάνονταν σε 3 κελία που περιείχαν τον TGF-β1 και σε 2 κελία που χρησιμοποιούνταν ως τυφλό (απουσία παραγόντων), η μέση τιμή των οποίων αφαιρούταν από τη τιμή κάθε ενός από τα άλλα 3 κελία. 16. Προσδιορισμός ολικής πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford Ο προσδιορισμός της ολικής πρωτεΐνης πραγματοποιούνταν με την χρωματομετρική μέθοδο Bradford (Bradford MM et al., 1976), η οποία στηρίζεται στο σχηματισμό έγχρωμων συμπλόκων ιοντικής φύσεως μεταξύ των θετικά φορτισμένων πλευρικών αμινομάδων των πρωτεϊνών και της αρνητικά φορτισμένης χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250, όταν οι πρωτεΐνες βρεθούν σε όξινο ph. Το μέγιστο μήκος κύματος (λmax) της απορρόφησης των συμπλόκων αυτών είναι στα 595nm. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης στα δείγματα γινόνταν ύστερα από μέτρηση της απορρόφησης στα 595nm με τη χρήση πρότυπης καμπύλης κατασκευασμένης με BSA. 17. Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Τα αποτελέσματα εξήχθησαν από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη χρήση του unpaired t- 68

74 Υλικά και Μέθοδοι test ή του test ANOVA. Οι συγκρίσεις (μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα) έγιναν μεταξύ της κάθε πειραματικής ομάδας και του αντίστοιχου μάρτυρα. Επιπλέον, σε ορισμένες περιπτώσεις, μελετήθηκε η μεταβολή σε σχέση με συγκεκριμένη πειραματική ομάδα. 69

75 70

76 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

77 Αποτελέσματα Αποτελέσματα 1. Επίδραση του TGF-β1 και του MIF στην παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα και μελέτη των μηχανισμών και σηματοδοτικών μονοπατιών τα οποία εμπλέκονται στην επίδραση αυτή 1.1 Επίδραση του TGF-β1 στην παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα Από τη βιβλιογραφία ήταν γνωστό ότι η IL-6 παίζει ένα σπουδαίο ρόλο στους παθογενετικούς μηχανισμούς της φλεγμονώδους διαδικασίας και της ίνωσης, όπως η προοδευτική συστημική σκλήρωση και η πνευμονική και κυστική ίνωση (Bedard et al., 1993; Feghali et al., 1994; Gurram et al., 1994; Shahar et al., 1996). Η IL-6 παράγεται κυρίως από κύτταρα, όπως διεγερμένα μακροφάγα, ινοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα (Kishimoto and Hirano, 1988). Τα κύτταρα αυτά, μαζί με τα επιθηλιακά κύτταρα, τα ηωσινόφιλα και τα σιτευτικά κύτταρα, χαρακτηρίζουν την παθομορφολογία του ΡΠ (Pawliczak et al., 2005). Ήταν γνωστό ότι TGF-β1 προκαλεί την αύξηση της IL-6 σε ινοβλάστες πνεύμονα ανθρώπου (Thannickal and Fanburg, 1995, Eickelberg et al., 1999). Επίσης, ο TGF-β1 θεωρείται ότι προάγει την ίνωση με άμεση ενεργοποίηση των παρόντων μεσεγχυματικών κυττάρων, όπως οι ινοβλάστες και τα επιθηλιακά κύτταρα, τα οποία διαφοροποιούνται σε μυοϊνοβλάστες με αποτέλεσμα να παράγουν κολλαγόνο (Wynn, 2008). Με βάση τα παραπάνω, και προκειμένου να διαπιστωθεί εάν στην αυξημένη έκφραση και παραγωγή IL-6, η οποία παρατηρήθηκε τόσο στους ιστούς όσο και τους ινοβλάστες ΡΠ, συμβάλουν ο TGF-β1 και MIF, των οποίων η έκφραση επίσης είναι αυξημένη στο ΡΠ, μελετήθηκε η επίδραση των δύο αυτών παραγόντων στην έκφραση και παραγωγή της IL-6 από ινοβλάστες ΡΠ. Ινοβλάστες ΡΠ καλλιεργήθηκαν απουσία και παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων TGF-β1 (0,01, 0,1 και 1 ng/ml) και MIF (1, 10 και 100ng/mL) για 48h. Στο μέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα IL-6 με ELISA (Σχ. 1). 72

78 Αποτελέσματα B Σχήμα 1. Επίδραση του TGF-β1 (Α) και του MIF (Β) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις στην παραγωγή της IL-6 από ινοβλάστες ΡΠ (n=2). Οι ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν, απουσία ορού, για 48h απουσία και παρουσία TGF-β1 (0,01, 0,1 και 1 ng/ml) ή MIF (1, 10 και 100 ng/ml) και στο μέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της IL-6 με ELISA. Κάθε καλλιέργεια πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγματος έγινε εις διπλούν. Απεικονίζεται η μέση τιμή ± η τυπική απόκλιση για κάθε πείραμα. Control: δείγμα ελέγχου απουσία TGF-β1 ή MIF. (*)P<0,05, (**)P<0,01 και (***)P<0,001 στατιστικά σημαντική αύξηση σε σχέση με το control. MIF Όπως φαίνεται στο σχήμα 1, τόσο ο TGF-β1 όσο και ο MIF προκάλεσαν δοσοεξαρτώμενη αύξηση των επιπέδων της IL-6, η οποία ήταν μεγαλύτερη, σε σχέση με το control, στις υψηλές συγκεντρώσεις TGF-β1 (1ng/mL) και MIF (100ng/mL) και για χρόνο επωάσεως 48h. Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν και με RT-PCR ανάλυση. Ολικό RNA απομονώθηκε από τους ινοβλάστες ΡΠ, οι οποίοι καλλιεργήθηκαν για 48h, απουσία και παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων TGF-β1 και MIF και χρησιμοποιήθηκε σε RT-PCR ανάλυση με ειδικούς εκκινητές για την IL-6 και τα προϊόντα της ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης (Σχ. 2). Από τη σύγκριση της έντασης των ζωνών των προϊόντων για το γονίδιο της IL-6, με αυτή των προϊόντων του γονιδίου αναφοράς της GAPDH, φαίνεται ότι τόσο ο TGF-β1 όσο και ο MIF προκάλεσαν μία δόσο-εξαρτώμενη διέγερση της έκφρασης του mrna, η οποία όπως και στην ELISA, ήταν μεγαλύτερη για την υψηλότερη συγκέντρωση των παραγόντων. 73

79 Αποτελέσματα IL-6 (560bp) GAPDH (263bp) IL-6 (560bp) GAPDH (263bp) TGF-β1 - ng/ml MIF ng/ml Σχήμα 2. Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης των προϊόντων της RT-PCR ανάλυσης, με τη χρήση ειδικών εκκινητών για την IL-6 ανθρώπου (560bp) και την GAPDH (263bp), και ολικού RNA που απομονώθηκε από ινοβλάστες ΡΠ οι οποίες καλλιεργήθηκαν για 48h, απουσία ορού, και απουσία (Control) ή παρουσία (Α) TGF-β1 (0,01, 0,1 και 1 ng/ml) και (Β) MIF (1, 10 και 100 ng/ml). Απεικονίζεται επίσης η σχετική ένταση των ζωνών των προϊόντων για την IL-6 (560bp) ως προς την ένταση των αντίστοιχων ζωνών των προϊόντων για την GAPDH (263bp) (n=2). (*)P<0,05, (**)P<0,01 και (***)P<0,001 στατιστικά σημαντική αύξηση σε σχέση με το Control. MIF 1.2. Μελέτη της εμπλοκής των MAP κινασών και της PI3 κινάσης στην επαγόμενη από TGF-β1 και MIF παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα Από τη βιβλιογραφία είναι γνωστό ότι ο TGF-β1 εκτός από τη μετάδοση σήματος μέσω των Smads, ενεργοποιεί και άλλα μονοπάτια, όπως αυτά των MAPK κινασών (Yamaguchi et al., 1999; Yue and Mulder, 2000). Προκειμένου να διευκρινιστεί ο ρόλος των MAPK και ΡΙ3-Κ στην επαγόμενη από TGF-β1 και MIF παραγωγή της IL-6, ινοβλάστες ΡΠ καλλιεργήθηκαν με TGF-β1 (1ng/mL) ή MIF (100 ng/ml) για 48h, 74

80 Αποτελέσματα απουσία και παρουσία αναστολέων των MAPΚ και της PI3-Κ, και στο μέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της IL-6 με ELISA (Σχ. 3). B Σχήμα 3. Επίδραση αναστολέων ΜΑΡΚ και ΡΙ3-Κ στην επαγόμενη από TGF-β1 (A) και MIF (B) παραγωγή της IL-6 από ινοβλάστες ΡΠ (n=2). Οι ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν, απουσία ορού, με TGF-β1 (1ng/mL) ή MIF (100ng/mL) απουσία και παρουσία των αναστολέων για 48h και στο μέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της IL-6 με ELISA. Κάθε καλλιέργεια πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγματος έγινε εις διπλούν. Απεικονίζεται η μέση τιμή ± η τυπική απόκλιση της συγκέντρωσης IL-6 για κάθε πείραμα. Control: δείγμα ελέγχου απουσία TGF-β1 ή MIF, U0126 (10μM), SP: SP (20μM), SB: SB (10μM), LY: LY (10μΜ). (**)P<0,01 και (***)P<0,001 στατιστικά σημαντική μείωση σε σχέση με τον TGF-β1 ή τον MIF. Από τα παραπάνω πειράματα βρέθηκε ότι στις ινοβλάστες ΡΠ η επαγόμενη από TGF-β1 ή MIF παραγωγή της IL-6 μειώθηκε παρουσία του LY (αναστολέας της PI3 κινάσης). Η μείωση αυτή ήταν στατιστικά σημαντική σε κάθε περίπτωση. Πιο συγκεκριμένα ο αναστολέας LY προκάλεσε 54,6% και 27,5% μείωση της επαγόμενης από TGF-β1 ή MIF, αντίστοιχα, παραγωγή της IL-6 (Σχ. 3). Ο U0126 (αναστολέας των MAP κινασών MEK) προκάλεσε επίσης στατιστικά σημαντική μείωση στην επαγόμενη από TGF-β1 παραγωγή της IL-6 (Σχ. 3Α), ενώ δεν προκάλεσε στατιστικά σημαντική μεταβολή στην στην επαγόμενη από MIF παραγωγή της IL-6 (Σχ. 3Β). Συγκεκριμένα αυτός προκάλεσε 44% μείωση της επαγόμενης από TGF-β1 παραγωγής της IL-6 (Σχ. 3Α). Ο SB (αναστολέας των MAP κινασών p38) προκάλεσε στατιστικά σημαντική μείωση στην επαγόμενη από TGF-β1 παραγωγή της IL-6 κατά 65,6% (Σχ. 3Α), ενώ δεν είχε καμία επίδραση στην επαγόμενη από MIF παραγωγή της IL-6 (Σχ. 3B). 75

81 Αποτελέσματα Τέλος, παρουσία του SP (αναστολέας των MAP κινασών JNK), παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση της επαγόμενης από TGF-β1 και MIF παραγωγής της IL-6 κατά 70% και 30%, αντίστοιχα (Σχ. 3Α, Β). Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν και με RT-PCR ανάλυση. Ολικό RNA απομονώθηκε από τις ινοβλάστες ΡΠ οι οποίες καλλιεργήθηκαν με TGF-β1 ή MIF για 48h, απουσία και παρουσία αναστολέων MAP κινασών και της PI3 κινάσης και χρησιμοποιήθηκε σε RT-PCR με ειδικούς εκκινητές για την IL-6 και τα προϊόντα της ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης (Σχ. 4). Από τη σύγκριση της έντασης των ζωνών των προϊόντων για το γονίδιο της IL-6 με αυτή των προϊόντων του γονιδίου αναφοράς της GAPDH, φαίνεται ότι ο αναστολέας της PI3 κινάσης, LY294002, προκάλεσε στατιστικά σημαντική μείωση της επαγόμενης από TGF-β1 και MIF έκφρασης της IL-6 κατά 40%. (Σχ. 4). Ο αναστολέας των MAP κινασών MEK, U0126, προκάλεσε επίσης στατιστικά σημαντική μείωση της επαγόμενης από TGF-β1 έκφρασης της IL-6 κατά 25% (Σχ. 4A). Αντίθετα, αυτός δεν προκάλεσε στατιστικά σημαντική μεταβολή της επαγόμενης από MIF έκφρασης της IL-6. (Σχ. 4Β). 76

82 Αποτελέσματα A B IL-6 (560 bp) GAPDH (263bp) IL-6 (560 bp) GAPDH (263bp) ** Σχήμα 4. Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης των προϊόντων της RT-PCR ανάλυσης, με τη χρήση ειδικών εκκινητών για την IL-6 ανθρώπου (560bp) και την GAPDH (263bp), και ολικού RNA που απομονώθηκε από ινοβλάστες ΡΠ οι οποίες καλλιεργήθηκαν, απουσία ορού, με (Α) TGF-β1 (1ng/mL) και (Β) MIF (100ng/mL) για 48h απουσία και παρουσία αναστολέων των MAP κινασών και PI3 κινάσης. Απεικονίζεται επίσης η σχετική ένταση των ζωνών των προϊόντων για την IL-6 (560bp) ως προς την ένταση των αντίστοιχων ζωνών των προϊόντων για την GAPDH (263bp) (n=2). Control: δείγμα ελέγχου απουσία TGF-β1 ή MIF, U0126 (10μM), SP: SP (20μM), SB: SB (10μM), LY: LY (10μΜ). (*)P<0,05 και (***)P<0,001 στατιστικά σημαντική μείωση σε σχέση με τον TGF-β1 ή τον MIF. Παρουσία του αναστολέα των MAP κινασών p38, SB203580, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση κατά 21% της επαγόμενης από TGF-β1 έκφρασης της IL-6 (Σχ. 4Α), ενώ αυτός δεν είχε καμία επίδραση στην επαγόμενη από MIF. (Σχ. 4B). Τέλος, παρουσία του αναστολέα των MAP κινασών JNK, SP600125, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση της επαγόμενης από TGF-β1 και MIF παραγωγής της IL-6 κατά 17% και 30%, αντίστοιχα (Σχ. 4Α, Β). 77

83 Αποτελέσματα 2. Επίδραση MIF στην έκφραση της φωσφατάσης-1 των ΜΑΡΚ (MKP- 1) σε ινοβλάστες ρινικού πολύποδα Από προηγούμενες πειραματικές μελέτες έχουν διευκρινισθεί οι μηχανισμοί μέσω των οποίων ο MIF ανταγωνίζεται τις ανοσοκατασταλτικές δράσεις των γλυκοκορτικοειδών. Στους μηχανισμούς αυτούς περιλαμβάνονται η καταστολή της επαγόμενης από γλυκοκορτικοειδή έκφρασης του ΙκΒα, ο οποίος είναι ένας κυτταροπλασματικός αναστολέας ενεργοποίησης του NF-κB, όπως επίσης και η καταστολή της επαγόμενης από γλυκοκορτικοειδή έκφρασης της ΜΚΡ-1, η οποία μέσω της υδρόλυσης των φωσφορικών ομάδων καθιστά ανενεργά τα ισχυρά προφλεγμονώδη μονοπάτια των ΕRK1/2, JNK και p38 ΜΑΡ κινασών (Duan JM and Cannon KG, 2000, Roger T et al., 2005, Aeberli D et al., 2006b). Η αναστολή του μονοπατιού των ΜΑΡ κινασών αλλά και άλλων σηματοδοτικών μονοπατιών, η οποία φαίνεται ότι διαμεσολαβείται αφενός από την αυξημένη έκφραση της φωσφατάσης-1 των ΜΑΡ κινασών (MKP-1) και αφετέρου από τη μειωμένη αποποικοδόμηση αυτής από το πρωτεόσωμα, που προκαλούν (Pelaia G et al., 2003). Επιπλέον είναι γνωστό ότι ο MIF έχει ανασταλτική δράση στην επαγόμενη από δεξαμεθαζόνη έκφραση της MKP-1 μακροφάγα RAW (Thierry Roger et al., 2005). Προκειμένου να διαπιστωθεί εάν και στους ινοβλάστες ΡΠ ο MIF έχει την ικανότητα αναστολής της έκφρασης της MKP-1, ινοβλάστες ΡΠ καλλιεργήθηκαν με MIF, σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και προσδιορίσθηκαν τα επίπεδα έκφρασης της MKP-1. Ολικό RNA απομονώθηκε από ινοβλάστες ΡΠ που καλλιεργήθηκαν για 48h παρουσία MIF σε διαφορετικές συγκεντρώσεις, και χρησιμοποιήθηκε σε RT-PCR ανάλυση με τη χρήση ειδικών εκκινητών για την ΜΚΡ-1 ανθρώπου, τα προϊόντα της οποίας ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης (Σχ. 5). Όπως φαίνεται στο σχήμα 5, ο MIF σε συγκεντρώσεις (1-100ng/ml) προκάλεσε στατιστικά σημαντική αλλά μικρή μείωση της έκφρασης της ΜΚΡ-1, η οποία είναι παρόμοια και στις 3 συγκεντρώσεις, που υποδηλώνει ότι στους ινοβλάστες ΡΠ ο MIF έχει μικρή επίδραση στην έκφραση της ΜΚΡ-1. 78

84 Αποτελέσματα MKP1 (431bp) GAPDH (263bp) MIF ng/ml MIF ng/ml Σχήμα 5. Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης των προϊόντων της RT-PCR ανάλυσης, με τη χρήση ειδικών εκκινητών για την ΜΚΡ-1 ανθρώπου (431bp) και την GAPDH (263bp), και ολικού RNA που απομονώθηκε από ινοβλάστες ΡΠ οι οποίες καλλιεργήθηκαν απουσία ορού για 48h με MIF σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (1-100ng/ml). Απεικονίζεται επίσης η σχετική ένταση των ζωνών των προϊόντων για την ΜΚΡ-1 (431bp) ως προς την ένταση των αντίστοιχων ζωνών των προϊόντων για την GAPDH (263bp) (n=2). (***)P<0,001 στατιστικά σημαντική μείωση σε σχέση με το control παρουσία MIF. 3. Επίδραση του TGF-β1 στη παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα για διάφορους χρόνους επώασης και μελέτη των μηχανισμών και σηματοδοτικών μονοπατιών τα οποία εμπλέκονται στην επίδραση αυτή 3.1 Επίδραση του TGF-β1 στη παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα για διάφορους χρόνους επώασης Ινοβλάστες ΡΠ καλλιεργήθηκαν παρουσία TGF-β1 1 ng/ml για 10 διαφορετικές χρονικές περιόδους (0, 0.1, 0.25, 0.30, 1, 2, 12, 24, 48, 72 ώρες) για να διερευνηθεί αν η παραγωγή της IL-6 επηρεάζεται από τον χρόνο. Στο μέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν 79

85 Αποτελέσματα τα επίπεδα IL-6 με ELISA (Σχ. 6). Όπως φαίνεται στο σχήμα 6, ο TGF-β1 προκάλεσε χρονο-εξαρτώμενη αύξηση των επιπέδων της IL-6 μέχρι τις 2h, και στη συνέχεια αυτά παρέμειναν σταθερα εως τις 72h. TGF-β1 (1ng/ml) Σχήμα 6. Επίδραση του TGF-β1 σε διαφορετικά χρονικά σημεία στην παραγωγή της IL-6 από ινοβλάστες ΡΠ (n=2). Οι ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν, απουσία ορού, παρουσία TGF-β1 (1 ng/ml) και στο μέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της IL-6 με ELISA για 10 διαφορετικά χρονικά σημεία (0, 0.1, 0.25, 0.30, 1, 2, 12, 24, 48, 72 ώρες). Κάθε καλλιέργεια πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανάλυση κάθε δείγματος έγινε εις διπλούν. Απεικονίζεται η μέση τιμή ± η τυπική απόκλιση για κάθε πείραμα. Control: δείγμα ελέγχου απουσία TGF-β1. (**)P<0,01 και (***)P<0,001 στατιστικά σημαντική αύξηση σε σχέση με το control. Η επίδραση του TGF-β1 στην έκφραση της IL-6 μελετήθηκε και με RT-PCR ανάλυση. Ολικό RNA απομονώθηκε από τους ινοβλάστες ΡΠ, οι οποίοι καλλιεργήθηκαν για διαφορετικούς χρόνους, παρουσία TGF-β1 1ng/ml και χρησιμοποιήθηκε σε RT-PCR ανάλυση με ειδικούς εκκινητές για την IL-6 και τα προϊόντα της ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης (Σχ. 7). Από τη σύγκριση της έντασης των ζωνών των προϊόντων για το γονίδιο της IL-6, με αυτή των προϊόντων του γονιδίου αναφοράς της GAPDH, φαίνεται ότι ο TGF-β1 προκάλεσε διέγερση της έκφρασης του mrna της IL-6, η οποία ήταν στατιστικά σημαντική μετά την 0.5h επώασης των ινοβλαστών παρουσία του TGF-β1 με σταθερή έκφραση από αυτό το χρονικό σημείο ως τις 72h. 80

86 Αποτελέσματα IL-6 (560bp) GAPDH (263bp) TGF-β1 (1ng/ml) Σχήμα 7. Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης των προϊόντων της RT-PCR ανάλυσης, με τη χρήση ειδικών εκκινητών για την IL-6 ανθρώπου (560bp) και την GAPDH (263bp), και ολικού RNA που απομονώθηκε από ινοβλάστες ΡΠ οι οποίες καλλιεργήθηκαν, απουσία ορού, παρουσία TGF-β1 (1ng/mL). Απεικονίζεται επίσης η σχετική ένταση των ζωνών των προϊόντων για την IL-6 (560bp) ως προς την ένταση των αντίστοιχων ζωνών των προϊόντων για την GAPDH (263bp) (n=2) για 10 διαφορετικά χρονικά σημεία (0, 0.1, 0.25, 0.30, 1, 2, 12, 24, 48, 72 ώρες). Control: δείγμα ελέγχου απουσία TGF-β1 (***)P<0,001 στατιστικά σημαντική αύξηση σε σχέση με τον TGF-β Διερεύνηση των μηχανισμών και σηματοδοτικών μονοπατιών που εμπλέκονται στην επαγόμενη από TGF-β1 παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα κατά χρονοεξαρτώμενο τρόπο Είναι γνωστό από την βιβλιογραφία ότι η MKP-1 για να ενεργοποιηθεί απαιτεί ώρες μετά την επίδραση TGF-β1 (McMullen et al., 2005). Η μακράς διάρκειας επίδραση του TGFβ1 προκαλεί επιλεκτικά στις εγκεφαλικές αρτηρίες αναστολή της δράσης της p38 MAPK μέσω επαγωγής της έκφρασης της MKP-1. Μέσω των υποδοχέων του TGF-β1 (Smad μονοπατιού) είναι γνωστό ότι επηρεάζεται η έκφραση της MKP-1(Jono et al., 2003) και 81

87 Αποτελέσματα βρέθηκε από ερευνητική ομάδα ότι στον μηχανισμό αυτό εμπλέκεται ένας καταρράκτης διεργασιών μέσω αναστολής της p38 MAPK σε λεία μυικά κύτταρα των αγγείων του εγκεφάλου. Στην παρούσα εργασία διερευνούμε αν στους ρινικούς πολύποδες επηρεάζεται η έκφραση της MKP-1 από τον TGF-β1. Η επίδραση του TGF-β1 στην έκφραση της MKP-1 μελετήθηκε με RT-PCR ανάλυση. Ολικό RNA απομονώθηκε από τους ινοβλάστες ΡΠ, οι οποίοι καλλιεργήθηκαν για διαφορετικούς χρόνους, παρουσία TGF-β1 1ng/ml και χρησιμοποιήθηκε σε RT-PCR ανάλυση με ειδικούς εκκινητές για την MKP-1 και τα προϊόντα της ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης (Σχ. 8). Από τη σύγκριση της έντασης των ζωνών των προϊόντων για το γονίδιο της MKP-1, με αυτή των προϊόντων του γονιδίου αναφοράς της GAPDH, φαίνεται ότι ο TGF-β1 προκάλεσε διέγερση της έκφρασης του mrna της MKP-1, η οποία ήταν στατιστικά σημαντική την 0.5h επώασης των ινοβλαστών παρουσία του TGFβ1 και στη συνέχεια αύξηση της έκφρασής της με μέγιστη τιμή στις 24h (αύξηση 600%). Από τις 24h έως τις 72h παρουσίασε φθίνουσα πορεία των επιπέδων έκφρασης. Προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση του MIF στη παρατηρούμενη διέγερση της έκφρασης της MKP-1 από τον TGF-β1 για παρατεταμένους χρόνους επώασης, ινοβλάστες ΡΠ καλλιεργήθηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις MIF (1-100 ng/ml) παρουσία TGF-β1 (1 ng/ml) για για 48h, ολικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα και χρησιμοποιήθηκε σε RT-PCR ανάλυση με ειδικούς εκκινητές για την MKP-1 τα προϊόντα της οποίας ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης (Σχ. 9). Όπως φαίνεται στο σχήμα 9 ο TGF-β1 προκάλεσε αύξηση στην έκφραση της MKP-1, η οποία δεν επηρεάστηκε σημαντικά από τον MIF σε οποιαδήποτε συγκέντρωση αυτός χρησιμοποιήθηκε. 82

88 Αποτελέσματα MKP1 (431bp) GAPDH (263bp) Σχήμα 8. Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης των προϊόντων της RT-PCR ανάλυσης, με τη χρήση ειδικών εκκινητών για την MKP-1 ανθρώπου (560bp) και την GAPDH (263bp), και ολικού RNA που απομονώθηκε από ινοβλάστες ΡΠ οι οποίες καλλιεργήθηκαν, απουσία ορού, παρουσία TGFβ1 (1ng/mL). Απεικονίζεται επίσης η σχετική ένταση των ζωνών των προϊόντων για την MKP-1 (560bp) ως προς την ένταση των αντίστοιχων ζωνών των προϊόντων για την GAPDH (263bp) (n=2) για 10 διαφορετικά χρονικά σημεία (0, 0.1, 0.25, 0.30, 1, 2, 12, 24, 48, 72 ώρες). Control: δείγμα ελέγχου απουσία TGF-β1 (***)P<0,001 στατιστικά σημαντική αύξηση σε σχέση με τον TGF-β1. 83

89 Αποτελέσματα MKP-1 (431bp) GAPDH (263bp) *** Σχήμα 9. Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης των προϊόντων της RT-PCR ανάλυσης, με τη χρήση ειδικών εκκινητών για την MKP-1 ανθρώπου (560bp) και την GAPDH (263bp), και ολικού RNA που απομονώθηκε από ινοβλάστες ΡΠ οι οποίες καλλιεργήθηκαν, απουσία ορού, σε διάφορες συγκεντρώσεις MIF (1-100 ng/ml) παρουσία TGF-β1 (1ng/mL). Απεικονίζεται επίσης η σχετική ένταση των ζωνών των προϊόντων για την MKP-1 (560bp) ως προς την ένταση των αντίστοιχων ζωνών των προϊόντων για την GAPDH (263bp) (n=2). Control: δείγμα ελέγχου απουσία TGF-β1 και MIF (***) P<0,001 στατιστικά σημαντική αύξηση σε σχέση με τον TGF-β1. Από εργασία άλλης ερευνητικής ομάδας είναι γνωστό ότι ο TGF-β1 επάγει την φωσφορυλίωση της p38 και της Erk σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Η φωσφορυλίωση της p38 πραγματοποείται μετά την πρώτη ώρα και επιστρέφει στην αρχική κατάσταση στις 24 ώρες. Αντίθετα, η φωσφορυλίωση της Erk είναι ταχεία και τα επίπεδα της φωσφορυλίωσης επιστρέφουν στα αρχικά επίπεδα μετά την 1 ώρα. Προκειμένου στην 84

90 Αποτελέσματα παρούσα εργασία να μελετηθεί η επίδραση του TGF-β1 στην φωσφορυλίωση της Erk, χρησιμοποιήθηκε η ανοσοαποτύπωση western. Ινοβλάστες ρινικού πολύποδα επωάστηκαν με TGF-β1 (1ng/mL) για 10 διαφορετικές χρονικές περιόδους (0, 0.1, 0.25, 0.30, 1, 2, 12, 24, 48, 72 ώρες), και ακολούθησε λύση των κυττάρων και απομόνωση της πρωτεΐνης, όπως αναφέρθηκε στις Μεθόδους. Από το σχήμα 10 φαίνεται ότι ο TGF-β1 προκαλεί στατιστικά σημαντική αύξηση της φωσφορυλίωσης της Erk από 0,25-1h με μέγιστη αύξηση στη 0,5h, η οποία στη συνέχεια έπεσε στα επίπεδα του μάρτυρα ως τις 72h. p-erk 44/42 kda total Erk 44/42 kda Σχήμα 10. Επίδραση του TGF-β1 στα επίπεδα φωσφορυλιώσης της Erk σε ινοβλάστες ΡΠ. Ανοσοαποτύπωμα της p-erk από ινοβλάστες ΡΠ, στους οποίους έχει γίνει επίδραση για για 10 διαφορετικά χρονικά σημεία (0, 0.1, 0.25, 0.30, 1, 2, 12, 24, 48, 72 ώρες) TGF-β1. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μεταβολή του λόγου p-erk/total Erk σε σχέση με κύτταρα στα οποία δεν έχουμε επιδράσει με τον παράγοντα (μάρτυρας). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το μάρτυρα. (***)P<0,001. Η εικόνα είναι αντιπροσωπευτική από τρία ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα. 85