Transcript

1 مجله علوم پزشكي مدرس : ا سيبشناسي زيستي دوره ۱۲ شماره : ۲ از - ۷۳ ۸۲ تابستان ۱۳۸۸ طراحي يك پروموتر كايمريك داراي منطقه پروموتري شبيه به پروموتر سوروايوين (Survivin) بهمنظور رونويسي هدفمند در سلولهاي سرطاني سينه ۴ ۳ * ۲ ۱ ساميلا فرخيمنش فاطمه رهبريزاده عباس كمالي غلامرضا مقدمپور - ۱ كارشناس ارشد گروه بيوتكنولوژي پزشكي دانشكده علوم پزشكي دانشگاه تربيت مدرس تهران ايران - ۲ استاديار گروه بيوتكنولوژي پزشكي دانشكده علوم پزشكي دانشگاه تربيت مدرس تهران ايران - ۳ استاديار گروه ليزر دانشكده دندانپزشكي دانشگاه علوم پزشكي تهران تهران ايران - ۴ پزشك دانشكده علوم پزشكي دانشگاه ا زاد اسلامي واحد تهران شمال تهران ايران دريافت مقاله : ۱۲ ۸۷ / ۱۲ / پذيرش مقاله : ۰۸ ۸۸ / ۰۴ / چكيده هدف : بزرگترين چالش در ژندرماني سرطان دستيابي به بالاترين درجه اختصاصيت و كارايي در هدفگيري سلولهاي سرطاني است. بهدليل اينكه هدف ژندرماني سرطان ريشهكن كردن سلولهاي سرطاني است و بسياري از ژنهاي درماني اگر در سلولهاي طبيعي بيان شوند ميتوانند مضر باشند. استفاده از پروموتر ژنهايي كه بهطور اختصاصي در سلولهاي سرطاني بيان ميشوند يا نسبت به سلولهاي طبيعي بيان بسيار بالاتري دارند در ژندرماني سرطان بسيار مورد توجه قرار گرفته است. در اين تحقيق استفاده از يك پروموتر خاص سرطان با بيان بالا بررسي شد. مواد و روشها : در راستاي تكثير و بهكارگيري پروموتر خاص سرطان بهمنظور ايجاد يك سازه براي مقاصد ژندرماني با استفاده از Nested PCR پروموتري از ژنوم انساني جداسازي شد كه در حدود ۳۴ درصد به پروموتر سوروايوين شباهت داشت. سوروايوين يكي از اعضاي خانواده ژنهاي ضد مرگ برنامهريزي شده سلولي است و در بيشتر سرطانهاي سينه افزايش بيان ا ن مشاهده شده است. اين قطعه ژني براساس بررسيهاي انجام شده در سايتهاي Compel Transfac EPD Promoter Scan و TRRD داراي دو جايگاه اتصال رونويسي مشابه با پروموتر سوروايوين بود كه بهوسيله عوامل رونويسي E2F و STAT1 شناسايي ميشد. اين پروموتر بههمراه بخشهاي پاسخدهنده به شرايط محيطي هيپوكسي و استروژن ) ريزمحيط سلولهاي سرطاني سينه ( و ژن پيشا پوپتوزي tbid در ناقل + pcdna3.1/hygro كلون شد. نتايج : نتايج RT PCR نيمه كم ي سلولهاي سرطاني ترانسفكت شده نشان ميدهد كه اين قطعه ژني ) شبه پروموتر سوروايوين ( داراي توانايي تقريبا برابر پروموتر CMV براي بيان ژن tbid است. نتيجهگيري : استفاده از يك پروموتر كايمريك در هدايت يك ژن پيشا پوپتوزي براي از بين بردن سلولهاي سرطاني ابزاري بسيار اميدواركننده در راستاي درمان سرطان است كه با القاي اختصاصي مرگ برنامهريزي شده در اين سلولها به شكلي طبيعي باعث انهدام اين سلولها ميشود. سازه حاصل در مقايسه با دو سازه كنترل توانايي بالايي در بيان ژن پيشا پوپتوزي از خود نشان ميدهد. كليدواژگان : رونويسي هدفمند پروموتر سوروايوين ژن پيشا پوپتوزي * نشاني مكاتبه : تهران دانشگاه تربيت مدرس دانشكده علوم پزشكي گروه بيوتكنولوژي پزشكي صندوق پستي : ۳۳۱-۱۴۱۱۵ rahbarif@modares.ac.ir ۷۳

2 ه ب طراحي يك پروموتر كايمريك در سلولهاي سرطاني سينه ساميلا فرخيمنش و همكاران ۷۴-۱ مقدمه روشهاي مرسوم درمان سرطان مثل شيميدرماني (Chemotherapy) اشعهدرماني (Radiotherapy) و جراحي اختصاصيت و كارايي بالايي براي درمان سرطان ندارند. در اين ميان ژندرماني (Genetherapy) سرطان با اراي ه انواع مختلفي از روشهاي درماني توجه بسياري از محققان را به خود معطوف كرده است. هر روش ژندرماني داراي سه بخش انتخاب ژن درماني مناسب ابزار مناسب براي انتقال ا ن و هدفگيري اختصاصي بافت مورد نظر است. از اين ميان هدفگيري اختصاصي بافت سرطاني مهمترين بخش هر روش ژندرماني است كه ا ن را از ساير روشهاي درماني متمايز ميكند. سه روش براي هدفگيري بافت بدخيم وجود دارد : - ۱ هدف قرار دادن رونويسي targeting) :(Transcriptional با توجه به اينكه بعضي ژنها در سلولهاي سرطاني بيان بالا و اختصاصي دارند در اين استراتژي با استفاده از پروموتر ژنهاي فوق ميتوان بيان ژن درماني را منحصر به سلول سرطاني كرد. - ۲ هدف قرار دادن روش انتقال targeting) :(Transductional در اين روش با استفاده از مولكولهاي هدفگير در سطح ابزارهاي انتقال ژن ميتوان انتقال ژن درماني مورد نظر را به سلولهاي سرطاني بهصورت هدفمند فراهم نمود. - ۳ سومين روش درماني هدف قرار دادن مسيرهاي سلولي مرتبط با سرطان است ] ۱.[ ۲ بهترين روش هدفگيري رونويسي يا بهعبارتي استفاده از پروموترهاي اختصاصي سرطان است چون ابتداييترين سطح بيان ]. پروموترها به چند دسته تقسيم ميشوند : پروموترهاي ژن است ] ۳ ويژه بافتي promoter) (Tissue specific پروموترهاي ويژه توموري promoter) (Tumor specific پروموترهاي قابل القا promoter) (Inducible و پروموترهاي مهندسيشده ] ۴.[ ۵ در اين راستا يافتن ژنهايي كه در سرطانهاي خاص بيان بالايي پيدا ميكنند راهكار بسيار مهمي براي استفاده از پروموتر ا نها در روشهاي هدفگيري بافت توموري ايجاد ميكند. بهعلاوه با استفاده از شرايط ريزمحيطي حاكم بر محيط توموري ] مثل هيپوكسي (Hypoxia) و استروژن [ كه با ريزمحيط سلولهاي طبيعي متفاوت است ميتوان كارايي و اختصاصيت پروموتر ويژه توموري را تقويت و تشديد نمود ] ۶-۸ ]. سيستم هاي پروموتري طبيعي داراي محدوديت هاي زير هستند : - ۱ ميزان بيان يك ژن درماني بهوسيله يك نوع پروموتر اختصاصي بافت در تمام افراد مبتلا يكسان نيست. ۲ - ميزان بيان ژنهاي اختصاصي تومور يا بافت حتي در توده سلولهاي توموري متفاوت است كه اين به سبب ناهمگون بودن سلولهاي سرطاني است. ۳ - هيچ پروموتر منفردي وجود ندارد كه بتواند در تمام ردههاي سلولي توموري در حد كافي سبب هدايت بيان ژن درماني شود و بهصورت همگاني در تمام بيماران مبتلا به يك نوع سرطان خاص كار گرفته شود ] ۹ ]. اين محدوديتها سبب جستجوي راهكارهايي براي بهبود تواليهاي پروموتري شده است كه تحت عنوان پروموترهاي مهندسيشده معرفي ميشود. سادهترين بخش اين روش يافتن پروموترهاي جهشيافتهاي است كه توانايي بيشتري در راهاندازي رونويسي دارند ولي اختصاصيت بافتي - توموري ا نها نسبت به پروموتر نوع طبيعي بالاتر است. روش بهتر ايجاد توالي پروموتر - تشديدگري با كوچكترين اندازه ممكن ) پروموتر مركزي يا هسته پروموتري ( است كه هنوز ويژگيهاي توالي وحشي را حفظ كرده باشد. راهكار ديگر شامل ساخت پروموترهاي كايمريك promoter) (Chimeric متشكل از عناصر تنظيمي پروموترهاي متفاوت با اختصاصيت بافتي است. اين روش بهدنبال بهكارگيري مزاياي هركدام از پروموترها و افزايش اختصاصيت بافتي است ] ۱۰ ]. در اين تحقيق با در نظر گرفتن دو نكته مهم طراحي پروموتر كايمريك صورت گرفت مورد اول نوع بافت منشا تومور و نكته دوم اختصاصات ا ن بافت از قبيل ريزمحيط توموري بود. بنابراين در راستاي ايجاد يك پروموتر كايمريك كه بتواند توده ناهمگون ا دنوكارسينوماي سينه (Lung را هدف قرار داده و ژن adenocarcinome)

3 دوره ۱۲ شماره ۲ تابستان ۱۳۸۸ مجله علوم پزشكي مدرس : ا سيبشناسي زيستي پيش ا پوپتوزي (Proapoptotic) tbid را براي القاي مرگ باكتري اشرشياكلي coli) (Escherichia سوش TG1 برنامهريزي شده سلولي (Apoptosis) در اين سلولها بيان كند بهدنبال انتخاب يك پروموتر ويژه سرطاني بوديم. در اين تحقيق پس از بررسي انواع ژنهايي كه بيانشان در ا دنوكارسينوماي سينه افزايش مييابد ) با استفاده از برنامههاي RefExA Unigene و ( GEO پروموتر ژن سوروايوين انتخاب شد. سوروايوين از اعضاي خانواده مهاركنندگان مرگ برنامهريزي شده سلولي IAP) (Inhibitor of Apoptosis Protein: است كه سبب مهار كاسپازها (Caspases) ميشود. بيان اين ژن در سلولهاي سرطاني سينه تا حدود ۷۰ درصد نسبت به سلولهاي طبيعي افزايش مييابد. براي تسهيل درج اين قطعه پروموتر مركزي اين ژن با استفاده از مقالات مورد استفاده قرار گرفت و بهمنظور افزايش توانايي و ويژگي اين پروموتر از تركيب شبه پروموتر مركزي ژن سوروايوين و دو بخش پاسخدهنده به هيپوكسي و استروژن ) بهعنوان قطعات تشديدگر ( در ساختار نهايي پروموتر كايمريك استفاده شد. از ا نجايي كه هيچ پروموتر منفردي وجود ندارد كه در تمام سلولهاي توده ناهمگون ا دنوكارسينوماي سينه بيان شود در اين تحقيق هدف اصلي طراحي يك پروموتركايمريك يا چند اختصاصيتي بوده كه اگر در يك سلول توموري امكان بهرهوري از يك اختصاصيت پايين بود اختصاصيت ديگر كمك به بيان ژن درماني نمايد. - ۲ مواد و روشها - ۱-۲ مواد رده هاي سلولي انساني ) MCF 7 رده سلولي ا دنوكارسينوماي سينه ) SKBR 3 ) رده سلولي ا دنوكارسينوماي سينه ) سلولهاي ) Hela رده سلولي سرطان دهانه رحم ( و ) AGO رده سلولي غيرتوموري فيبروبلاست پوست ( از بانك سلول انستيتو پاستور ايران خريداري شد. به عنوان ميزبان استفاده شد. ناقل پلاسميدي + pcdna3.1/hygro از شركت ) Invitrogen ا مريكا ( تهيه شد. ا نزيمهاي Taq پليمراز T4 ليگاز ا نزيمهاي محدودكننده داخلي dntps ا گارز انواع پودرهاي محيط كشت باكتري و RPMI 1640 و اتيديوم برومايد bromide) (Ethidium از شركت ) Roche ا لمان ( و ) Sigma ا مريكا ( تهيه شد. - ۲-۲ ساخت سازه - ۱-۲ - ۲ تخليص mrna و ساخت cdna ۱۰ ميليليتر خون انساني بهصورت استريل گرفته شد و با محلول ضدانعقاد (Ethylenediaminetetraacetic acid) EDTA مخلوط شد. سلولهاي لنفوسيت خون محيطي در شرايط استريل با استفاده از محلول فايكول (Ficoll) تخليص شد. استخراج RNA از سلولهاي لنفوسيت بهوس يله كيت NucleoSpin RNA ІІ شركت ) MN ا لمان ( صورت گرفت و سپس cdna با استفاده از ا نزيم رونويسي معكوس M MuLV و اليگومر ۱۹ تايي ) dt ( از شركت ) Fermentas ا لمان ( صورت گرفت. - ۲-۲ - ۲ جداسازي DNA ژنومي از رده سلولي Hela و لنفوسيتهاي انساني كه قبلا جداسازي شده بودند بهعنوان منبع ژنومي براي تكثير قطعه ژني شبه پروموتر سوروايوين promoter) (Survivin like استفاده شد ] ۱۱ [ و با استفاده از كيت NucleoSpin ) Tissue شركت ( MN تخليص شدند. - ۳-۲ تكثير و كلونينگ قطعات ژني - ۱-۳ - ۲ تكثير و كلونينگ ژن tbid ژن ) tbid ۳۲۲ تا ۷۳۲ جفتباز از ژن ( Bid با استفاده از الگوي cdna و ا غازگرهاي (Primers) جلويي و برگشتي ۷۵

4 ساميلا فرخيمنش و همكاران طراحي يك پروموتر كايمريك در سلولهاي سرطاني سينه. Bid for: 5' ACGGGATCCGCCGCCATGGATGGCAACCGCAGCAG 3' و 5' TTCTCTAGATCAGTCCATCCCATTTCTGGCTAAGCTC 3' Bid rev: تكثير شد. ا غازگر Bid for داراي جايگاه شناسايي ا نزيم (Kozak sequence) در انتهاي '5 و توالي كزاك BamHI بهمنظور ترجمه بهينه است. ا غازگر Bid rev داراي جايگاه شناسايي XbaI است. محصول نهايي PCR بهوسيله كيت ) QIAquick Gel Extraction شركت QIAGEN ا لمان ( از ژل ا گارز تخليص و بهوسيله ا نزيمهاي XbaI/BamHI در پلاسميد + pcdna3.1/hygro كلون شد ) پلاسميد ( pc/tb و كلونينگ بهوسيله تعيين توالي ژني با ا غازگرهاي اختصاصي دومين واكنش PCR با استفاده ا غازگرهاي Sur2 for و Sur2 rev روي محصول PCR اول صورت گرفت. Sur2 for: 5' ATCGAAGCTTCTCAAAGTGTTGGGATTAC 3' Sur2 rev: 5' ATAGGGATCCACGTCGGGGCAC 3' ا غازگرهاي Sur2 for و Sur2 rev بهترتيب داراي جايگاههاي شناسايي ا نزيمهاي HindIII و BamHI هستند و محصول نهايي PCR بهوسيله اين ا نزيمها در پلاسميد ۲ كلون شد و حاصل ا ن پلاسميد pc/tb/he/sur نامگذاري شد. در پايان كلونينگ بهوسيله تعيين توالي ژني مورد تا ييد قرار گرفت. شكل ۱ تصوير شماتيك اين سازه را نشان ميدهد. tbid تا ييد شد. - ۲-۳ - ۲ تكثير و كلونينگ بخشهاي پاسخدهنده modules) (Responsive به هيپوكسي و استروژن براي قرار دادن اين بخشها اليگومري شامل سه نسخه از عناصر پاسخ دهنده به هيپوكسي (' 3 '5) TGTCACGTCCTGCACGAC و دو نسخه از عناصر پاسخ دهنده به استروژن (CGTCACAGTGACC) طراحي شد ] ۱۲ [ و براي ساخت به شركت ژن فناوران سفارش داده شد. اين اليگومر با استفاده از ا غازگرهاي زير تكثير شد : Oligo for: 5' TAACACGCGTATTTGTCACGTCCTG 3'. Oligo rev: 5' TAACAAGCTTAGAGGTCACTGTGAC 3' ا غازگرهاي Oligo for و Oligo rev بهترتيب داراي جايگاههاي شناسايي ا نزيمهاي MluI و HindIII بودند و بهوسيله اين دو ا نزيم در پلاسميد ۱ كلون شدند ) پلاسميد ( pc/tbid/he و كلونينگ بهوسيله تعيين توالي ژني تا ييد شد. - ۳-۳ - ۲ تكثير و كلونينگ شبه پروموتر سوروايوين اين پروموتر بهوسيله Nested PCR از DNA ژنومي سلولهاي Hela تكثير شد. اولين واكنش PCR با استفاده از ا غازگرهاي زير صورت گرفت : شكل ۱ تصوير شماتيك سازه pc/tb/he/sur - ۴-۲ بررسي بيوانفورماتيكي قطعه ژني شبه پروموتر سوروايوين توالي اين قطعه ژني با استفاده از برنامههاي نرمافزاري و ا نلاين (Online) شامل EPD Map Viewer BLAST TRRD Prosite Comple Promoter Scan TransFac بررسي شد. - ۵-۲ انتقال سازه به سلولهاي يوكاريوتي بهمنظور تعيين فعاليت رونويسي پروموتر كايمريك حاوي شبه پروموتر سوروايوين ) تحت تيمارهاي مختلف ) ۴ ۱۰ ۵ سلول از ردههاي سلولي طبيعي و سرطاني در پليت ۲۴ خانه كشت داده شدند. انتقال سازه با استفاده از ليپوفكتامين ۲۰۰۰ Sur1 for: 5' AGAGAAGTGAGTGGATGTGATG 3'. Sur1 rev: 5' GAATGTAGAGATGCGGTGGTC 3' ۷۶

5 دوره ۱۲ شماره ۲ تابستان ۱۳۸۸ مجله علوم پزشكي مدرس : ا سيبشناسي زيستي (2000 (Invitrogen) (Lipofectamine طبق برنامه شركت توليدكننده انجام شد. در اين ا زمايش ترانسفكشن با يك ميكروگرم از هريك از سازههاي ا زمون و كنترل ) پلاسميد pc/tb و پلاسميد ( pc/tb/he/sur بههمراه ۲ ميكروليتر ليپوفكتامين ۲۰۰۰ صورت گرفت و ميزان القاي مرگ برنامهريزي شده در سلولهاي سرطاني SKBR 3 MCF7 و سلولهاي طبيعي AGO با سازه كايمريك حاوي شبه پروموتر سوروايوين ) پلاسميد ( pc/tb/he/sur و سازه كنترل حاوي پروموتر ) CMV پلاسميد ( pc/tb و تيمارهاي مختلف مقايسه شد. شش ساعت بعد از ترانسفكشن تيمارهاي استروژن و هيپوكسي اعمال شد. براي تيمار استروژن به محيط كشت - 17β استراديول ۲ نانومولار اضافه و براي اعمال تيمار هيپوكسي روي پليت با پارافيلم استريل بسته شد. شكل ۲ نتايج PCR قطعات ژني ستون ( ۱ بخشهاي اليگومري هيپوكسي - استروژن ستون ( ۲ tbid ستون ( ۳ PCR اول شبه پروموتر سوروايوين ستون ( ۴ PCR دوم شبه پروموتر سوروايوين - ۲-۱ - ۳ تا ييد درج قطعات در ناقل محصول اتصال ژني به ناقل در هر مرحله به داخل باكتري منتقل و توالي تمام قطعات بعد از كلون شدن در پلاسميد با تعيين توالي تا ييد شد. ۷۷-۶ - ۲ ارزيابي ميزان بيان mrna ي tbid شانزده ساعت بعد از ترانسفكشن سلولهاي تيمار شده جمعا وري شدند و بعد از تخليص RNA از اين سلولها tbid با استفاده از دو سري ا غازگرهاي اختصاصي cdna و ا غازگرهاي ژن β اكتين RT PCR نيمهكمي انجام شد. β اكتين بهعنوان كنترل داخلي استفاده شد كه ا غازگرهاي ا ن شامل : BA for: 5 AGTAGGCTTTGTGGTTGATG 3. BA rev: 5 CTGTCAGGAAAGGAGAAATC 3. بودند. در پايان محصول PCR بهوسيله برنامه UVitec ا ناليز شد. - ۳ نتايج - ۱-۳ نتايج تهيه سازه - ۱-۱ - ۳ تكثير نواحي ژني شكل ۲ نتايج PCR قطعات ژني tbid بخش هاي اليگومري هيپوكسي - استروژن و شبه پروموتر سوروايوين را نشان ميدهد. - ۲-۳ نتايج بررسي بيوانفورماتيكي قطعه ژني شبه پروموتر سوروايوين توالي اين قطعه ژني كه حدود ۳۴ درصد با توالي پروموتر سوروايوين شباهت داشت بعد از بررسي در پايگاههاي بيوانفورماتيكي و تا ييد وجود مناطق متصلشونده به فاكتورهاي رونويسي در بانك ژن جهاني با ا درس و توالي زير ثبت شد. gi gb EU Homo sapiens BIRC5 like gene, promoter region CTCAAAGTGTTGGGATCACAGGCATCAGCCATC ATGCCCAGCCCTATCCATCATTTTAGGAAGTACC AGGAAACCTGGAAACACAGAAGGTCTCCTACAT AGCTTGACATGGGAAGGGAGTGAGGCCCCTGGG CTGATCTAAGGATGAGGAAGAGGACAAGTCTCA CGCAGAAGTGCCCTCCATCCCTCTGCAGGCAGG ATGTGACAGCAGCTGGAACATTTTATGTCCCTTA TGTTTATTGGGTCTGTCTCCCCAGCCAGCCCAAG AGCTGCTTGTGGGCAGGGACTGTAACTTGTGCAT TATCCACCTCTGTGCCCCAACGT نتايج حاصل از برنامههاي نرمافزاري و ا نلاين نشان ميدهد كه اين قطه ژني داراي نواحي متصلشونده به فاكتورهاي رونويسي E2F و ) STAT1 تواليهاي TTAACCGCCAG و ( CGTTCTTTGAAAGCA است.

6 ساميلا فرخيمنش و همكاران طراحي يك پروموتر كايمريك در سلولهاي سرطاني سينه ۷۸-۳ - ۳ نتايج RT PCR نيمهكمي پس از انتقال سازه به سلولهاي يوكاريوتي و اعمال تيمارهاي متفاوت جداسازي RNA و سنتز cdna تكثير قطعات tbid و β اكتين با دو سري ا غازگرهاي فوقالذكر صورت گرفت ) شكل ). ۳ شدت هر باند با استفاده از برنامه UVitec تعيين و نسبت شدت خالص ژن tbid به ژن β اكتين اندازهگيري شد كه نمايشگر بيان نسبي tbid در شرايط و تيمارهاي متفاوت بود ) شكل ). ۴ شكل ۳ نتايج RT PCR نيمهكمي الف ( پلاسميد pc/tb ب ( پلاسميد pc/tb/he/sur ستونهاي ( ۷ ۴ ۱ تيمار استروژن ستونهاي ( ۸ ۵ ۲ تيمار استروژن و هيپوكسي ستونهاي ( ۹ ۶ ۳ بدون تيمار شكل ۴ مقايسه نتايج RT PCR نيمهكمي در ردههاي سلولي مختلف ترانسفكته با پلاسميد ] pc/tb حاوي پروموتر [(pcmv) CMV و پلاسميد ] pc/tb/he/sur حاوي شبه پروموتر سوروايوين [(psurvivin like) در شرايط تيمار با استروژن نتايج حاصل از اين ا زمون نشان ميدهد كه ميزان بيان ژن tbid تحت هدايت پروموتر CMV قابل مقايسه با ميزان بيان ا ن تحت هدايت شبه پروموتر سوروايوين است. از ا نجايي كه پروموتر CMV يكي از پروموترهاي قوي براي هدايت بيان ژن است پس نتايج بهدست ا مده نشانگر قدرت بالاي شبه پروموتر سوروايوين است. همچنين تيمار استروژن بهتنهايي تا ثير بيشتري در افزايش بيان ژن tbid تحت هدايت هر دو نوع پروموتر در سلولهاي سرطاني MCF 7 دارد و ميزان بيان سازه حاصل در سلولهاي سرطان سينه MCF7 و SKBR 3 بالاتر از سلولهاي غيرسرطاني AGO است. - ۴ بحث تلاشهاي قابل ملاحظهاي كه در سه دهه اخير براي بهبود روشهاي مرسوم درمان سرطان يعني جراحي اشعهدرماني و شيميدرماني انجام شده است تا ثير زيادي در بهتر شدن نتيجه درمان بهويژه در درجات پيشرفته بيماري نداشته است. بنابراين محققان بهسمت روشهاي جديدي در درمان سرطان از جمله ]. ژندرماني سرطان تحويل ماده ژندرماني روي ا وردند ] ۱۳ ژنتيكي به سلول بدخيم يا ترانسفورمه بهمنظور درمان است. در هر سيستم ژندرماني ايدها ل دو بخش كليدي وجود دارد : - ۱ ترانسژن (Transgene) درماني مناسب كه ميتواند تصحيحكننده كشنده يا تحريككننده ايمني و... باشد و - ۲ بيان اختصاصي ژن درسلولهاي سرطاني ] ۱۴ ]. از ميان ژنهاي كشنده مختلف مواردي كه مرگ برنامهريزي شده سلولي را القا ميكنند بسيار اميدواركننده هستند. مرگ برنامهريزي شده سلولي فرايندي است كه موجودات پرسلولي براي حذف سلولهاي زايد صدمهديده يا مضر بهكار ميبرند. تحريك مسيرهاي داخلي يا خارجي مرگ برنامهريزي شده سلولي منجر به افزايش بيان و فعاليت تنظيمكنندههاي پيشا پوپتوزي شده و مرگ سلولي را القا ميكند. توانايي طبيعي ژنهاي پيشا پوپتوزي براي از بين بردن سلولها ا نها را به گزينهاي ويژه براي ژندرماني سرطان تبديل نموده است. از ميان خانوادههاي ژني دخيل در مرگ برنامهريزي شده سلولي خانواده بزرگ (B cell lymphoma (2 Bcl2 بسيار مورد توجه محققان بوده است كه داراي چندين عضو پيشا پوپتوزي

7 دوره ۱۲ شماره ۲ تابستان ۱۳۸۸ مجله علوم پزشكي مدرس : ا سيبشناسي زيستي ۷۹ است. با اين وجود محدوديت بالقوهاي كه در استفاده از ژنهاي پيش ا پوپتوزي بهعنوان كشنده سلولي وجود دارد اين است كه فعاليت ا نها بهشدت بهوسيله تغييرات پس از ترجمه مانند ( دايمريزاسيون (Dimerization) ) مثل پروتي ين Bax ( ترانسلوكاسيون (Translocation) ) مثل پروتي ين Bim فسفريلاسيون ) مثل پروتي ين ( Bad و شكسته شدن ) مثل پروتي ين ( Bid و... تنظيم ميشود ] ۱۵ ]. بههمين دليل پيدا كردن ژن پيشا پوپتوزي كه براي فعاليت كامل خود نياز به تغييرات اضافي نداشته باشد بسيار مورد توجه بود كه به دلايل زير ژن Bid ميتواند بهصورتي بهكار گرفته شود كه نيازي به تغييرات پس از ترجمه براي فعاليتش نداشته باشد. ۱ - براي اينكه پروتي ين Bid نياز به شكست (Cleavage) ) برداشت بخشي از انتهاي ا مينوي ا ن ( براي فعاليت كامل خود نداشته باشد فقط توالي ژني بخش ۱۵ / ۵ كيلودالتوني Bid ) Bid بريده شده يا ( tbid در پلاسميد مربوطه كلون شد. ۲ - پروتي ين كامل Bid از اعضاي خانواده فقط داراي ناحيه BH3 است كه نسبت به ساير اعضا كه داراي نواحي ديگر ) BH4 BH2 و ( BH1 هستند اندازهاي كوچكتر دارد. - ۳ توالي ا ن پس از شكست بهوسيله كاسپاز ۸ كوچكتر ميشود و در واقع مبدل به يكي از پروتي ينهاي پيش ا پوپتوزي با كوچكترين دومن (Domain) مرگ ميشود كه اين مسي له سبب تسهيل كلون كردن ا ن در ناقل مربوطه ميشود. ۴ - همانطوري كه گفته شد پروتي ين Bid يكي از قدرتمندترين اعضاي پيش ا پوپتوزي بالقوه است كه به محض برداشت ناحيه ممانعتكننده N ترمينال توانايي القاي مرگ برنامهريزي شده سلولي را دارد. با اين وجود براي استفاده از اين ترانسژن كشنده مناسب بايد از روشي استفاده شود كه قادر به هدف قرار دادن سلولهاي بدخيم باشد چون در غير اين صورت سلولهاي طبيعي هم از بين خواهد رفت. همانطور كه پيش از اين گفته شد بهترين روش تنظيم هدف قرار دادن رونويسي و ابزار ا ن پروموتر است. براي انتخاب پروموتر مناسب براي سلولهاي سرطان سينه مطالعات فراواني صورت گرفته است. پاندها (Pandha) و همكاران در سال ۱۹۹۹ از پروموتر ژن Erb B2 براي بيان اختصاصي ترانسژن كشنده HSV tk در سلولهاي سرطاني سينه PPAR gamma 1.[ استفاده كردند كه سبب مرگ ا نها شد ] ۱۶.(Peroxisome proliferator actiated receptor gamma 1) ] توسط وانگ (Wang) و همكاران در سال [ ۲۰۰۴ كه بيان افزايشيافته در سرطان سينه داشت و ميزان بيان ا ن در سرطانهاي ديگري چون سرطان تيروي يد و كولون و ريه نيز افزايش مييافت ] ۱۷.[ ا لفا - لاكتالبومين (α lactalbumin) ] هپاراناز ] توسط لي (Li) و همكاران در سال [ ۲۰۰۵ ] ۱۸ (Heparanase) ] توسط بريندنباچ (Breidenbach) و همكاران [ ماماگلوبين (Mammaglobin) ] توسط در سال [ ۲۰۰۵ ] ۱۹ شي (Shi) و همكاران در سال [ ۲۰۰۶ ] ۲۰ [ و پروموترهاي ديگري چون - L پلاستين (L plastin) و CXCR4 4) (CXC chemokine receptor type توسط محققان ديگر در ردههاي مختلف سلولهاي سرطاني سينه چون MCF 7 MDA MB361 T47D MDA MB4355 و... با استفاده از ترانسژنهاي كشنده مختلف مطالعه شد كه داراي نتايج متفاوتي در ردههاي سلولي سرطان سينه هستند ] ۲۱ ]. ۲۲ پروموتري كه در اين تحقيق بررسي شد شبيه پروموتر ژن سوروايوين است و داراي هسته پروموتري لازم براي بهراه انداختن بيان ژن درماني است و در تركيب با بخشهاي پاسخدهنده استفاده شد. در اين تحقيق چگونگي جداسازي و تكثير يك ناحيه پروموتري از DNA انساني بررسي شد. با توجه به مطالعات كتابخانهاي وسيعي كه انجام شد پروموتر ژن سوروايوين را كه در گزارشها نتايج خيلي خوبي داشت به اين منظور انتخاب شد. بر اين اساس تنها گزارش موجود از توالي اين پروموتر در مقاله لي (Li) و همكاران در سال ] ۱۹۹۹ ۲۳ [ بود و هيچ گزارشي از توالي اين ژن در بانك ژن موجود نبود. بنابراين براساس اطلاعات اين گزارش طراحي ا غازگر انجام شد. چون مناطق پروموتري ژن سوروايوين داراي نواحي غني از GC است با ا غازگرهاي طراحي شده براي PCR ا ن منطقه نتيجهاي بهدست نيامد و در نتيجه Nested PCR و طراحي ا غازگر براي مناطق فرادست و فرودست منطقه پروموتري

8 ي م ه ب ساميلا فرخيمنش و همكاران طراحي يك پروموتر كايمريك در سلولهاي سرطاني سينه انجام شد. براي حدود ۴۰۰ نوكلي وتيد بالاتر از نوكلي وتيد ابتدايي پروموتر و ۳۲۱ نوكلي وتيد پايينتر از نوكلي وتيد انتهايي ا غازگر طراحي شد. منطقه انتخاب شده حاوي ۱۰۴۱ نوكلي وتيد بود كه در نتايج PCR موفق به توليد باندي در همين منطقه وزني شديم. روي اين محصول عمل PCR دوم با استفاده از ا غازگرهاي مكمل ابتدا و انتهاي پروموتر ژن سوروايوين انجام شد و محصول اين PCR قطعه باندي با وزن حدود ۳۲۴ جفتباز و از نظر وزني مطابق ناحيه مورد نظر محققان حاضر بود. قطعه حاصل دو بار براي تعيين توالي ژن ارسال شد ولي در هر دو دفعه توالي ژني فقط در حدود ۳۴ درصد با توالي پروموتر سوروايوين كه در مقاله لي گزارش شده بود شباهت داشت. محققان حاضر با جستجو در برنامههاي ا نلاين (EPD, TransFac, Promoter Scan, Comple, TRRD). Prosite, موفق شدند كه نواحي متصلشونده به فاكتورهاي رونويسي E2F و STAT1 را كه بهترتيب به تواليهاي TTAACCGCCAG و CGTTCTTTGAAAGCA متصل شوند در اين توالي پيدا كنند و از طرفي مطالعات عملكردي اين پروموتر در سازه HRE ERE psur tbid pcdna و مقايسه ا ن با سازه tbid pcdna نشاندهنده بيان بالا و اختصاصي اين ژن در سلولهاي سرطاني است. با توجه به نتايج فوق اين پروموتر جديد كه در كروموزوم شماره ۸ قرار دارد و شباهت زيادي از نظر توالي با پروموتر سوروايوين دارد پروموتر شبه سوروايوين ناميده شد. نتايج حاصل از اين پروموتر در RT PCR نشان ميدهد كه اين پروموتر با قابليت بسيار بالا و در حد پروموتر CMV قادر به بيان ژن پيش ا پوپتوزي tbid است. در مورد عناصر پاسخدهنده به هيپوكسي بايد خاطرنشان كرد كه بسياري از تومورهاي جامد واجد ريزمحيط هيپوكسيك هستند. در اين شرايط سلولها يك فاكتور رونويسي تحت عنوان فاكتور قابل القا بهوسيله هيپوكسي يا (Hypoxia inducible factor) HIF بيان ميكنند كه بيان تعدادي از ژنها را در پاسخ به هيپوكسي فعال ميكند. HIF به تواليهاي مورد توافقي تحت عنوان عناصر پاسخدهنده به هيپوكسي يا (Hypoxia responsive elements) HRE در پروموتر اين ژنها متصل ميشود ] ۲۴ ]. عناصر پاسخدهنده به استروژن نيز بهوسيله گيرنده استروژن شناسايي شدند. اين گيرنده بهعنوان فاكتور رونويسي براي فعال كردن بيان بعضي ژنها در حضور استروژن عمل ميكند. حدود ۷۰ درصد از سرطانهاي سينه گيرندههاي استروژن را بيان ميكنند و در صورتي كه پروموتر داراي عناصر پاسخدهنده به استروژن باشد در حضور استروژن فعال ميشود. علاوه استفاده از عناصر پاسخدهنده به استروژن امكان تنظيم خارجي بيان ژن كشنده را بهوسيله داروهاي ضداستروژني مثل تاموكسيفن (Tamoxifen) فراهم ]. نتايج نشان ميدهد كه استفاده از شبه پروموتر ميا ورد ] ۲۵ ۲۶ سوروايوين با شرايط گفته شده براي هدايت بيان يك ژن پيشا پوپتوزي سبب القاي مرگ سلولي بهصورت اختصاصي با كارايي بالا در توده سلولهاي سرطاني ناهمگون ميشود. اميد است كه بهكارگيري سازه حاصل بتواند به شكل مو ثري راهگشاي درمان سرطان سينه باشد. - ۵ تشكر و قدرداني اين گزارش حاصل بخشي از تحقيق پاياننامه كارشناسي ارشد ساميلا فرخيمنش به راهنمايي دكتر فاطمه رهبريزاده عضو هيا ت علمي دانشگاه تربيت مدرس گروه بيوتكنولوژي است. - ۶ منابع [1] Wu L, Johnson M, Sato M. Transcriptionally targeted gene therapy to detect and treat cancer. Trends Mol Med 2003; 9(10): [2] Dorer DE, Nettelbeck DM. Targeting cancer by transcriptional control in cancer gene therapy and viral oncolysis. Adv Drug Deliv ۸۰

9 دوره ۱۲ شماره ۲ تابستان ۱۳۸۸ مجله علوم پزشكي مدرس : ا سيبشناسي زيستي Rev 2009; 61(7 8): [3] B rown T.A. Genomes 3. Third edition, Garland Science, [4] Smale ST, Carey M. Transcriptional regulation in eukaryotes. Laboratory press; Cold Spring Harbor, [5] Robson T, Hirst DG. Transcriptional Targeting in Cancer Gene Therapy. J Biomed Biotechnol 2003; 2003(2): [6] Harrington KJ, Linardakis E, Vile RG. Transcriptional control: an essential component of cancer gene therapy strategies? Adv Drug Deliv Rev 2000; 44(2 3): [7] Wang GL, Semenza GL. Characterization of hypoxia inducible factor 1 and regulation of DNA binding activity by hypoxia. J Biol Chem 1993; 268(29): [8] Clackson T. Controlling mammalian gene expression with small molecules. Curr Opin Chem Biol 1997; 1(2): [9] Kazhdan I, Long L, Montellano R, Cavazos DA, Marciniak RA. Targeted gene therapy for breast cancer with truncated Bid. Cancer Gene Ther 2006; 13(2): [10]Stein U, Walther W, Shoemaker RH. Vincristine induction of mutant and wild type human multidrug resistance promoters is cell typespecific and dose dependent. J Cancer Res Clin Oncol 1996; 122(5): [11]Hoffman WH, Biade S, Zilfou JT, Chen J, Murphy M. TTranscriptional repression of the anti apoptotic survivin gene by wild type p53. J Biol Chem 2002; 277(5): [12]Hernandez Alcoceba R, Pihalja M, Nunez G, Clarke MF. Evaluation of a new dual specificity promoter for selective induction of apoptosis in breast cancer cells. Cancer Gene Ther 2001; 8(4): [13]Harrington KJ, Bateman AR, Melcher AA, Ahmed A, Vile RG. Cancer gene therapy: Part 1. Vector development and regulation of gene expression. Clin Oncol (R Coll Radiol) 2002; 14(1): [14]Curiel DT, Douglas JT. Cancer Gene therapy. First edition, Human Press Inc, [15]Zinkel S, Gross A, Yang E. BCL2 family in DNA damage and cell cycle control. Cell Death Differ 2006; 13(8): [16]Pandha HS, Martin LA, Rigg A, Hurst HC, Stamp GW, Sikora K, Lemoine NR. Genetic prodrug activation therapy for breast cancer: A phase I clinical trial of erbb 2 directed suicide gene expression. J Clin Oncol 1999; 17(7): [17]Wang X, Southard RC, Kilgore MW. The increased expression of peroxisome proliferatoractivated receptor gamma1 in human breast cancer is mediated by selective promoter usage. Cancer Res 2004; 64(16): [18] Li X, Zhang J, Gao H, Vieth E, Bae KH, Zhang YP, Lee SJ, Raikwar S, Gardner TA, Hutchins GD, VanderPutten D, Kao C, Jeng MH. Transcriptional targeting modalities in breast cancer gene therapy using adenovirus vectors controlled by alpha lactalbumin promoter. Mol Cancer Ther 2005; 4(12): [19]Breidenbach M, Rein DT, Schöndorf T, Khan KN, Herrmann I, Schmidt T, Reynolds PN, Vlodavsky I, Haviv YS, Curiel DT. A new targeting approach for breast cancer gene ۸۱

10 ساميلا فرخيمنش و همكاران طراحي يك پروموتر كايمريك در سلولهاي سرطاني سينه therapy using the heparanase promoter. Cancer Lett 2006; 240(1): [20]Shi CX, Graham FL, Hitt MM. A convenient plasmid system for construction of helperdependent adenoviral vectors and its application for analysis of the breast cancerspecific mammaglobin promoter. J Gene Med 2006; 8(4): [21]Chung I, Schwartz PE, Crystal RG, Pizzorno G, Leavitt J, Deisseroth AB. Use of L plastin promoter to develop an adenoviral system that confers transgene expression in ovarian cancer cells but not in normal mesothelial cells. Cancer Gene Ther 1999; 6(2): [22] Stoff Khalili MA, Stoff A, Rivera AA, Banerjee NS, Everts M, Young S, Siegal GP, Richter DF, Wang M, Dall P, Mathis JM, Zhu ZB, Curiel DT. Preclinical evaluation of transcriptional targeting strategies for carcinoma of the breast in a tissue slice model system. Breast Cancer Res 2005; 7(6): R [23]Li F, Altieri DC. Transcriptional analysis of human survivin gene expression. Biochem J 1999; 344 Pt 2: [24] Kizaka Kondoh S, Tanaka S, Harada H, Hiraoka M. The HIF 1 active micro environment: an environmental target for cancer therapy. Adv Drug Deliv Rev 2009; 61(7 8): [25]Lee M. Hypoxia targeting gene expression for breast cancer gene therapy. Adv Drug Deliv Rev [Epub ahead of print] [26]Ekena K, Katzenellenbogen JA, Katzenellenbogen BS. Determinants of ligand specificity of estrogen receptor alpha: estrogen versus androgen discrimination. J Biol Chem 1998; 273(2): ۸۲