ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥTΙΚΗΣ. Ανάλυση συστατικών φύλλων Vaccinium corymbosum

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥTΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ & ΧΗΜΕΙΑΣ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΚΑΙ ΤΗΝ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΕ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΟΥΣΙΩΝ ΜΕ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΟ ΕΝΔΙΑΦΕΡΟΝ Ανάλυση συστατικών φύλλων Vaccinium corymbosum ΠΗΝΕΛΟΠΗ ΜΕΡΜΙΓΚΗ Χημικός ΠΑΤΡΑ, 2014

2 Σ ε λ ί δ α ii

3 Ιανουάριος 2014, Πάτρα ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥTΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ & ΧΗΜΕΙΑΣ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΚΑΙ ΤΗΝ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΕ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΟΥΣΙΩΝ ΜΕ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΟ ΕΝΔΙΑΦΕΡΟΝ Ανάλυση συστατικών φύλλων Vaccinium corymbosum Τριμελής εξεταστική επιτροπή Κορδοπάτης Παύλος Καθηγητής Τμήματος Φαρμακευτικής, Πανεπιστημίου Πατρών Τσαρμπόπουλος Αντώνιος Αναπληρωτής Καθηγητής Ιατρικής Σχολής, Εθνικού Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών (Ε.Κ.Π.Α.) Λάμαρη Φωτεινή (επιβλέπουσα καθηγήτρια) Επίκουρη Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών Σ ε λ ί δ α iii

4 Σ ε λ ί δ α iv

5 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Όλα τα πράγματα είναι δύσκολα πρωτού γίνουν εύκολα Thomas Fuller Σ ε λ ί δ α v

6 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Φυσικών Προϊόντων, του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, υπό την επίβλεψη της Επίκουρης Καθηγήτριας Λάμαρη Φωτεινής στo πλαίσιo του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών στην κατεύθυνση «Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Ουσιών με Φαρμακευτικό Ενδιαφέρον» κατά τα έτη Η διεξαγωγή και περαίωση μιας μεταπτυχιακής διατριβής αποτελεί μια σκληρή αλλά συγχρόνως εποικοδομητική εμπειρία. Φθάνοντας στο τέλος της συγγραφής της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής συνειδητοποίησα ότι αποτέλεσε τον καρπό προσωπικού αγώνα, αλλά συγχρόνως και συμβολής και υποστήριξης ορισμένων ανθρώπων, οι οποίοι στάθηκαν αρωγοί σε αυτήν την προσπάθειά μου. Πριν απ όλους θα ήθελα να ευχαριστήσω από καρδιάς την επιβλέπουσα καθηγήτριά μου, κ. Φωτεινή Λάμαρη για την ανάθεση του ενδιαφέροντος θέματος της διπλωματικής μου εργασίας, αλλά και για την εμπιστοσύνη που έδειξε σε μένα από την πρώτη στιγμή. Χωρίς τη δική της στήριξη και κατανόηση, η εκπόνηση αυτής της πτυχιακής μελέτης δε θα ήταν εφικτή. Παρά τον φόρτο εργασίας της ήταν πάντα πρόθυμη να με βοηθήσει στις δυσκολίες που αντιμετώπιζα, ενθαρρύνοντάς με πάντα με αισιοδοξία για το καλύτερο αποτέλεσμα. Θα ήθελα, επίσης, να την ευχαριστήσω για το πραγματικό και ουσιαστικό ενδιαφέρον που έδειξε στο πρόσωπό μου, σε δύσκολες προσωπικές μου στιγμές. Την ευχαριστώ θερμά για τη συνεχή καθοδήγησή της και για την εμπειρία που απέκτησα χάρη σε αυτή. Θερμές ευχαριστίες θέλω να εκφράσω προς τον καθηγητή κ. Παύλο Κορδοπάτη, για την πολύπλευρη συμβολή του. Παρά τις αυξημένες υποχρεώσεις του υπήρξε πάντοτε πρόθυμος να ακούσει τους προβληματισμούς μου και να προτείνει εναλλακτικές, μεταδίδοντας παράλληλα την εμπιστοσύνη και την αισιοδοξία του. Επίσης, τον ευχαριστώ για τις τόσο όμορφες στιγμές που περάσαμε στο εργαστήριο, χάρη στην τόσο ξεχωριστή και φιλική στάση του. Στη συνέχεια, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον καθηγητή κ. Αντώνιο Τσαρμπόπουλο, για τις γνώσεις που μου μετέδωσε, αλλά και για την εμπειρία που μου προσέφερε μέσω της φιλοξενίας του στο Βιοαναλυτικό Εργαστήριο του Ερευνητικού Κέντρου ΓΑΙΑ. Τον ευχαριστώ θερμά για την ευκαιρία που μου έδωσε. Επίσης, οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στα μέλη του Βιοαναλυτικού Εργαστηρίου και συγκεκριμένα στον μεταδιδακτορικό ερευνητή κ. Δημήτριο Αναγνωστόπουλο και στον υποψήφιο Διδάκτωρα του τμήματος Σ ε λ ί δ α vi

7 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Φαρμακευτικής, κ. Νικόλαο-Σταύρο Κουλακιώτη, για την πολύτιμη συμβολή τους στις αναλύσεις κατά τον χειρισμό του φασματομέτρου μάζας, αλλά και για την προθυμία τους να με βοηθήσουν, όποτε το χρειάστηκα. Ακολούθως, θα ήθελα να ευχαριστήσω την καθηγήτρια κ. Βασιλική Μαγκαφά για την αρμονική συνεργασία που αποκτήσαμε και τις σημαντικές συμβουλές της. Είναι πολύ σημαντικό για μένα να ξεχωρίσω και να ευχαριστήσω θερμά την υποψήφια Διδάκτωρα του τμήματος Φαρμακευτικής κ. Αναστασία-Βαρβάρα Φερλέμη, πρώτα για την πολύτιμη εμπειρία που μου μετέδωσε καθ όλη τη διάρκεια της ερευνητικής εργασίας μου και ύστερα για όλες τις στιγμές που περάσαμε εντός και εκτός του εργαστηρίου. Η γνωριμία μου με την Τασούλα, όπως από την πρώτη στιγμή τη φωνάζαμε, αλλά και η στήριξή της όποτε τη χρειαζόμουν, θα είναι πάντα χαραγμένη στο μυαλό μου. Σε αυτό το σημείο, θα ήταν παράλειψή μου να μην ευχαριστήσω τα υπόλοιπα παρόντα και παρελθόντα μέλη του Εργαστηρίου Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, τον κ. Νικόλαο Κονταξή, την κ. Αμαλία Βογιατζόγλου, την κ. Αθανασία Μητροπούλου, την κ. Βασιλική Μερτζιάνη και την κ. Ελευθερία Τσουμάνη για την ευχάριστη συνεργασία, τη στήριξη και συμπαράστασή τους κατά τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μας σπουδών. Ένα θερμό ευχαριστώ αξίζουν η κ. Άρτεμις Διδάχου και η κ. Χριστίνα Φωτεινοπούλου, μέλη του εργαστηρίου, με τις οποίες ανέπτυξα πολύ φιλική σχέση. Φυσικά, δε θα παραλείψω να εκφράσω τις ευχαριστίες μου, στην φίλη μου Άννα Σπανοπούλου, η οποία με παρότρυνε να εκπονήσω τη μεταπτυχιακή μου διατριβή, στο Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, στο οποίο υπήρξε και η ίδια μέλος κατά τη διάρκεια των μεταπτυχιακών της σπουδών. Οι φίλες μου, στο Ναύπλιο, αξίζουν πολλά ευχαριστώ ξεχωριστά η κάθε μία, αλλά όσο αφορά τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής μου, τις ευχαριστώ που ήταν πάντα πρόθυμες να με ακούσουν στο τηλέφωνο. Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω την βαθειά ευγνωμοσύνη στους γονείς μου, Γεώργιο και Παναγιώτα, και στην αδερφή μου Κωνσταντίνα, για την πολύπλευρη και διαρκή υποστήριξη καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου. Χωρίς τη δική τους συμπαράσταση και ενθάρρυνση, αυτή η διπλωματική εργασία δε θα μπορούσε να είχε ολοκληρωθεί. Πάτρα, Ιανουάριος 2014 Πηνελόπη Μερμίγκη Σ ε λ ί δ α vii

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 1 ABSTRACT... 2 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 3 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο Εισαγωγή στα φαρμακευτικά φυτά Τα μούρα Κυανά μύρτιλλα: ιστορικά στοιχεία Βοτανικά χαρακτηριστικά των κυανών μύρτιλλων Vaccinium corymbosum L Η εξέλιξη της καλλιέργειας των κυανών μύρτιλλων ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο Ταξινόμηση των φυτοχημικών ενώσεων Φαινολικά οξέα Φλαβονοειδή Ανθοκυανίνες Φλαβονόλες, φλαβόνες Φλαβανόλες Φλαβανόνες, ισοφλαβλόνες Ταννίνες Στιλβένια Φυτοχημική ποικιλομορφία διαφόρων ειδών μούρων Φυτοχημικές διαφορές μεταξύ των Blueberries και των Bilberries Φυτοχημικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών κυανών μύρτιλλων Φυτοχημική Σύσταση των καρπών του Vaccinium corymbosum Φυτοχημική ανάλυση των φύλλων ειδών Vaccinium ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ο Τα οφέλη στην υγεία από την κατανάλωση των μούρων Bιολογικές ιδιότητες του γένους Vaccinium Αντιοξειδωτική δράση Αντιμικροβιακή δράση Σ ε λ ί δ α viii

9 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Κυτταροτοξική δράση Αντιφλεγμονώδης και αναλγητική δράση Αντιδιαβητική δράση ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο Υλικά, αντιδραστήρια και όργανα Φυτικό υλικό Χημικά αντιδραστήρια και διαλύτες Όργανα και σκεύη Εκχύλιση των φύλλων του Vaccinium corymbosum Ανάλυση του αφεψήματος και των κλασμάτων των φύλλων του Vaccinium corymbosum με Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης (HPLC) Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης (HPLC): Ιστορική αναδρομή Βασικές αρχές Οργανολογία της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης Όξινη υδρόλυση και HPLC ανάλυση του αφεψήματος και των κλασμάτων των φύλλων του Vaccinium corymbosum Ταυτοποίηση των συστατικών στο αφέψημα και στα κλάσματα των φύλλων του Vaccinium corymbosum με Φασματομετρία Μάζας (MS) Φασματομετρία μάζας: ιστορική αναδρομή βασικές αρχές Οργανολογία Σύστημα εισαγωγής δείγματος Πηγή Ιόντων Αναλυτής Ανιχνευτής Τεχνικές ανάλυσης στη Φασματομετρία Μάζας Ποσοτικοποίηση των συστατικών στο αφέψημα και στα κλάσματα των φύλλων του Vaccinium corymbosum με HPLC Μέθοδος HPLC ανάλυσης Ποσοτικος προσδιορισμός ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 Ο Σ ε λ ί δ α ix

10 6.1. Απόδοση του ολικού εκχυλίσματος των φύλλων του Vaccinium corymbosum και παραληφθείσες ποσότητες από την εκχύλισή του HPLC σάρωση συστατικών του αφεψήματος και των κλασμάτων των φύλλων του Vaccinium corymbosum Όξινη υδρόλυση του αφεψήματος και των κλασμάτων των φύλλων του Vaccinium corymbosum και έλεγχος με HPLC ανάλυση Ταυτοποίηση των συστατικών του αφεψήματος και των κλασμάτων των φύλλων του Vaccinium corymbosum και των αντίστοιχων υδρολυμένων δειγμάτων με UPLC-ESI-MS Ταυτοποίηση των συστατικών του αφεψήματος και των κλασμάτων των φύλλων του Vaccinium corymbosum με UPLC-ESI-MS Ταυτοποίηση των συστατικών των υδρολυμένων δειγμάτων: ολικό αφεψήμα των φύλλων του Vaccinium corymbosum και των κλασμάτων με UPLC-ESI-MS Ποσοτικοποίηση των συστατικών στο αφέψημα και στα κλάσματα των φύλλων του Vaccinium corymbosum με HPLC Μέθοδος HPLC ανάλυσης Ποσοτικος προσδιορισμός με HPLC ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 Ο ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Σ ε λ ί δ α x

11 Ιανουάριος 2014, Πάτρα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το Vaccinium corymbosum (Ericaceae) είναι ένας ψηλός θάμνος, ο οποίος καλλιεργείται σε περιοχές της Αμερικής και της Ευρώπης για τους υψηλής διατροφικής αξίας καρπούς του (κυανά μύρτιλλα: blueberries). Στη χώρα μας, καλλιέργεια μύρτιλλων γίνεται κυρίως στην περιοχή της Δράμας. Οι περισσότερες μελέτες εστιάζουν στην ανάλυση των συστατικών των καρπών, ενώ η φυτοχημική σύσταση των φύλλων δεν έχει μελετηθεί εκτενώς. Η παρούσα εργασία, στόχο είχε την ανάλυση των κυριότερων φαινολικών συστατικών των φύλλων του φυτού, με χρήση χρωματογραφικών μεθόδων ανάλυσης. Τα αποξηραμένα φύλλα, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή, προέρχονται από τις ποικιλίες Bluecrop και Patriot, βιολογικής καλλιέργειας στην περιοχή της Δράμας. Προετοιμάστηκε αφέψημα των αποξηραμένων φύλλων, το οποίο στη συνέχεια εκχυλίστηκε διαδοχικά, με οξικό αιθυλεστέρα (AcOEt) και βουτανόλη (BuOH). Κατόπιν και με σκοπό τον εύκολο προσδιορισμό των φαινολικών ενώσεων, πραγματοποιήθηκε όξινη υδρόλυση (90 o C, 2 h, 50% μεθανόλη) όλων των κλασμάτων: Crude (αφέψημα), AcOEt, BuOH και Aqueous. Η ανάλυση των συστατικών πραγματοποιήθηκε με Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης με Ανιχνευτή Συστοιχίας Φωτοδιόδων (HPLC-DAD) και ύστερα με Υγρή Χρωματογραφία Υπερυψηλής Απόδοσης (UPLC-MS) με Φασματόμετρο Μάζας, το οποίο διαθέτει υβριδικό αναλυτή τετραπόλου χρόνου πτήσης (Q-TOF). Για την HPLC-DAD ανάλυση χρησιμοποιήθηκε στήλη αντίστροφης φάσης (Luna C-18), με σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης με τρείς διαλύτες: διάλυμα οξικού αμμωνίου (CH 3 COONH 4-10 mm), ακετονιτρίλιο και μεθανόλη (Μαργιάννη, 2011). Επιπλέον, για την ποσοτικοποίηση των κυριότερων φαινολικών συστατικών χρησιμοποιήθηκε σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης με δύο διαλύτες: διάλυμα CH 3 COONH 4-10 mm και ακετονιτρίλιο (τροποποίηση Tsao et al., 2003). Στην ανάλυση UPLC- ESI-MS χρησιμοποιήθηκε στήλη αντίστροφης φάσης (BEH C18), με σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης με δύο διαλύτες: 0.1% μυρμηκικό οξύ σε H 2 O και ακετονιτρίλιο. Τα αποτελέσματα έδειξαν, αρχικά, ότι κανένα από τα κλάσματα δεν περιέχει ανθοκυανίνες, ενώ το AcOEt κλάσμα είναι περισσότερο εμπλουτισμένο σε φαινολικά συστατικά, σε σχέση με τα άλλα κλάσματα. Με χρήση της UPLC-ESI-MS ανάλυσης, προσδιορίσθηκαν διάφορα συστατικά μεταξύ των οποίων φαινολικά οξέα και φλαβονοειδή. Ενδιαφέρον παρουσίασε το γεγονός ότι το Aqueous κλάσμα περιείχε μόνο φαινολικά οξέα. Η επιλογή της μεθόδου της όξινης υδρόλυσης, φαίνεται να ήταν ικανοποιητική, αφού τα άγλυκα τμήματα των γλυκοζυλιωμένων φλαβονολών, αλλά και τα προϊόντα διάσπασης του εστερικού δεσμού του χλωρογενικού οξέος, προσδιορίσθηκαν εύκολα με την UPLC-ESI-MS ανάλυση. Στα επιμέρους δείγματα ποσοτικοποιήθηκαν, με χρήση HPLC-DAD ανάλυσης τα εξής φαινολικά συστατικά: χλωρογενικό οξύ, ρουτίνη, υπεροζίτης, ισοκερσιτρίνη και κερκετίνη. Συνεπώς, το αφέψημα των καλλιεργούμενων μύρτιλλων είναι μία καλή πηγή φαινολικών συστατικών. Σ ε λ ί δ α 1

12 ABSTRACT Vaccinium corymbosum (Ericaceae) is a tall shrub, which is cultivated in parts of America and Europe for their fruits (blueberries), which possess high nutritional value. In our country, blueberries are mainly cultivated in the area of Drama. Many studies focus on the analysis of the constituents of fruits, while the phytochemical composition of leaves has not been studied in detail. The present study aimed the analysis of the main components of blueberry leaves, using chromatographic techniques. Dried leaves (var Bluecrop and Patriot ) were obtained from the Cooperative Biodrama. The decoction of dried leaves was prepared and then extracted sequentially with ethyl acetate and butanol. In order to easily identify the phenolic compounds, all fractions (Crude or decoction, AcOEt, BuOH and Aqueous) were hydrolysed in acid conditions (90 o C, 2 h, 50% MeOH). The components of the fractions were analyzed firstly by High Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detector (HPLC-DAD) and then with Ultra High Performance Liquid Chromatography (UPLC-MS) with Mass Spectrometry. The mass spectrometer features hybrid quadrupole - time of flight (Q-TOF) analyzer. For the HPLC-DAD analysis a reverse phase column (Luna C-18) was used with a gradient elution system with three solvents: ammonium acetate (CH 3 COONH 4-10 mm), acetonitrile (AcCN) and methanol (MeOH) (Margianni, 2011). Moreover, the quantification of the major phenolic components system was done with a gradient elution system of CH 3 COONH 4-10 mm and AcCN (modified from Tsao et al., 2003). UPLC-ESI-MS was performed on a reverse phase column (BEH C18) with a gradient elution system with two solvents: 0.1% formic acid in H 2 O and AcCN. Firstly, the results showed that none of the fractions contain anthocyanins while AcOEt fraction is more enriched in phenolic compounds, in comparison to the other fractions. Using UPLC-ESI-MS analysis, we identified several components including phenolic acids and various flavonoids. Interestingly, the Aqueous fraction contained only phenolic acids. The choice of the method of acid hydrolysis appears to be satisfactory for identification purposes, since the aglycones of glycosylated flavonols, and the cleavage products of the chlorogenic acid, was determined easily by UPLC-ESI-MS analysis. The phenolic compounds: chlorogenic acid, rutin, hyperoside, isoquercitrin and quercetin were quantified in blueberry leaf decoction using HPLC-DAD. Therefore, the decoction of cultivated blueberries is a good source of phenolic compounds. Σ ε λ ί δ α 2

13 Ιανουάριος 2014, Πάτρα ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σ ε λ ί δ α 3

14 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο 1.1. Εισαγωγή στα φαρμακευτικά φυτά Τα φυτά, αρχικά τα αυτοφυή και κατόπιν τα καλλιεργήσιμα, αποτελούσαν τροφή για τον αρχαίο άνθρωπο. Η συνεχής και αναπόφευκτα αδιάλειπτη επαφή του ανθρώπου με το φυτικό πλούτο σε συνδυασμό με τις διαρκείς μετακινήσεις, του έδωσαν τη δυνατότητα να παρατηρήσει την ποικιλομορφία και την πολυδιάστατη επίδραση των φυτικών αγαθών στον ανθρώπινο οργανισμό. Η παρατήρηση των οικοτόπων και οι εμπειρίες που συσσωρεύονταν επέτρεψαν στον άνθρωπο να διακρίνει τα δηλητηριώδη φυτά, αλλά και παράλληλα να ανακαλύψει τις θεραπευτικές ιδιότητές τους για την αντιμετώπιση των προβλημάτων υγείας. Αρχικά, η μετάδοση της γνώσης γύρω από τα φυτά και τις ιδιότητές τους γινόταν προφορικά, από νομάδα σε νομάδα, μέχρις ότου αρχίσουν οι γραπτές αναφορές σε τοίχους σπηλαίων και ταφών, σε πάπυρους και περγαμηνές. Μόλις το 6000 π.χ., οι Σουμέριοι χάραξαν τις γνώσεις τους για τα αρωματικά και φαρμακευτικά φυτά σε πλάκες αργίλου, και αργότερα ακολούθησαν οι Κινέζοι και οι Έλληνες. Η κινέζικη φαρμακευτική χρονολογείται από το 4000 π.χ. και θεωρείται η πρώτη γραπτή καταγραφή φαρμακευτικών φυτών. Οι Αιγύπτιοι χρησιμοποιούσαν φυτά σε θρησκευτικές τελετές, καθώς και για τη μουμιοποίηση των νεκρών. Πινακίδες που αναφέρονται σε βότανα έχουν βρεθεί στα ανάκτορα της Κνωσού, της Πύλου, των Μυκηνών, ενώ δεν είναι λίγοι οι μύθοι για τη θεραπευτική χρήση του οπλοστασίου της φύσης. Ένας μύθος λέει πως η Αφροδίτη έτρεξε στην Κρήτη και έκοψε δίκταμο για να γιατρέψει το λαβωμένο Αινεία, ενώ αντίστοιχες αναφορές υπάρχουν και στα έργα του Ομήρου. Η ρίζα του φυτού Μανδραγόρας χρησιμοποιείται ήδη από την ομηρική εποχή ως υπνωτικό, αλλά και ως παυσίπονο. Ο Ιπποκράτης, ο πατέρας της Ιατρικής κατέγραψε περίπου 400 είδη βοτάνων που η χρήση τους ήταν γνωστή κατά τον 5ο αιώνα π.χ.. Ο Θεόφραστος έχει μείνει ως ο «Πατέρας της Βοτανολογίας», με γραπτά κείμενα σχετικά με τη μορφολογία, ανάπτυξη και δραστικότητα των φυτών (Περί Φυτών Ιστορίας, Περί Φυτών Αιτιών), τα οποία σώζονται μέχρι σήμερα. Ο επόμενος μελετητής της φύσης ήταν ο Διοσκουρίδης, ο Σ ε λ ί δ α 4

15 Ιανουάριος 2014, Πάτρα «Θεμελιωτής της Φαρμακολογίας», ο οποίος κατά τον 1 ο μ.χ. αιώνα στο βιβλίο του «Περί ύλης ιατρικής» (De material medica) συμπεριέλαβε περίπου 600 φυτά. Ακολούθησαν και άλλοι ιδιαίτερα σημαντικοί άνθρωποι για την εξέλιξη της Ιατρικής Φαρμακευτικής (για πολλούς ακόμη αιώνες δεν υπήρχε σαφής διάκριση ανάμεσα στις δυο επιστήμες), όπως ο Γαληνός και πολύ αργότερα ο Παράκελσος. Ο Παράκελσος πίστευε ότι η υγεία του σώματος βασίζεται στην αρμονία του ανθρώπου (μικρόκοσμος) με τη φύση (μακρόκοσμος). Τελικά, το συνονθύλευμα γραπτών κειμένων, λαϊκής θεραπευτικής, μύθων και εμπειρισμού οδήγησαν στην ανάπτυξη της φαρμακογνωσίας, της επιστήμης που στηρίζεται στη συλλογή φυτών, την απομόνωση του μέρους του φυτού που παρουσιάζει τη φαρμακολογική δράση και την ταυτοποίηση των δραστικών ουσιών. Ακολούθως με τη συνδρομή φαρμακοχημείας, φαρμακευτικής τεχνολογίας και φαρμακολογίας, οι δραστικές ενώσεις υφίστανται τις κατάλληλες χημικές και φαρμακοτεχνικές τροποποιήσεις μέχρι να καταλήξουν σε μορφή σκευασμάτων στα φαρμακεία. Με τον γενικό όρο φαρμακευτικά φυτά χαρακτηρίζονται όλα εκείνα τα φυτά που περιέχουν δραστικές ενώσεις, οι οποίες είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν στην αντιμετώπιση ασθενειών. Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας, ως φαρμακευτικά φυτά ορίζονται τα φυτά εκείνα που περιέχουν ενώσεις που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για θεραπευτικούς σκοπούς ή συνθέτουν μεταβολίτες για την παραγωγή χρήσιμων φαρμάκων. Όλα τα μέρη του φυτού μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην φαρμακευτική, όπως είναι ή ως πρώτη ύλη για την απομόνωση των ενώσεων είτε πρόκειται για άνθη, φύλλα και καρπούς, είτε πρόκειται για τον φλοιό και τις ρίζες του. Το τμήμα του φαρμακευτικού φυτού που εμπεριέχει τις δραστικές ενώσεις και είναι ικανό να επηρεάσει την ανθρώπινη υγεία, ονομάζεται δρόγη. Η σημασία των φαρμακευτικών φυτών και των παραδοσιακών συστημάτων υγείας για την επίλυση των προβλημάτων υγείας αποκτά όλο και μεγαλύτερη προσοχή Τα μούρα Ο όρος μούρα είναι ευρύς και πολυσήμαντος. Από βοτανικής, καθαρά, άποψης πολλά από τα φρούτα που χαρακτηρίζονται ως μούρα, δεν είναι όντως. Το μούρο είναι ένα φρούτο που περιέχει σπόρους και ολόκληρος ο καρπός του είναι βρώσιμος. Στην κοινή γλώσσα, ως μούρο αναφέρεται οποιοδήποτε μικρό φρούτο, που μπορεί να καταναλωθεί ολόκληρο και στερείται από σπόρους. Τα μούρα είναι συνήθως φρούτα, τα οποία έχουν φωτεινό χρώμα και είναι είτε γλυκά, είτε ξινά στη γεύση. Μεταξύ των εμπορικά διαθέσιμων μούρων βρίσκονται: α) οι φράουλες (strawberries), τα σμέουρα (raspberries), τα Σ ε λ ί δ α 5

16 φραγκοστάφυλλα (gooseberries), τα κυανά μύρτιλλα (blueberries), τα cranberries, τα lingonberries, τα βατόμουρα (blackberries), τα μαύρα και κόκκινα φραγκοστάφυλλα (blackcurrants και redcurrants), το σαμπούκο (elderberry), τα gojiberries κ.ά Κυανά μύρτιλλα: ιστορικά στοιχεία Το κυανό μύρτιλλο είναι ένα φυτό αυτοφυές στη Βόρεια Αμερική και είναι γνωστό με την ονομασία blueberry. Όταν ο Σάμιουελ ντε Σαμπλέιν ανακάλυψε τη λίμνη Χιούρον το 1616, βρήκε Ινδιάνους οι οποίου πρόσθεταν τα μύρτιλλα σε διάφορα γεύματά τους. Για παράδειγμα, το γεύμα sautauthig περιείχε αποξηραμένα μύρτιλλα επεξεργασμένα με αραβοσιτάλευρο, μέλι και νερό, και αναφέρεται στο ημερολόγιο του Σάμιουελ ως ένα πολύ νόστιμο γεύμα. Όταν οι Ινδιάνοι επισκέπτονταν τους Προσκυνητές στο Πλίμουθ κρατούσαν μεγάλα ψάθινα καλάθια με αποξηραμένα μύρτιλλα. Επίσης, ένα από τα πρώτα γεύματα, που αντάλλαξαν κατά την Αμερικάνικη αποστολή οι Λιούις και Κλάρκ με τους Ινδιάνους, στη Βορειοδυτική Επικράτεια, ήταν καπνιστό κρέας ελαφιού με μύρτιλλα (Bianco, 1988; Samuel-Peterson, 2013). Κατά τη διάρκεια του 19 ου και του 20 ου αιώνα η συγκομιδή των μύρτιλλων ήταν μια σημαντική μορφή εργασίας που εξασφάλιζε τα προς το ζην στην Ojibwe φυλή στο Μίσιγκαν και το Γουισκόνσιν. Τα μύρτιλλα εξημερώθηκαν στο τέλος του 19 ου αιώνα, όταν μεταφέρθηκαν από το φυσικό τους περιβάλλον σε περιοχές της Νέας Αγγλίας και της Φλόριντας (Hancock et al., 2008). Εικόνα 1. Ο θάμνος των μύρτιλλων (αριστερά) και απεικόνιση του κάτω μέρους του καρπού (σχήμα αστεριού) (δεξιά) [Πηγή: Wikipedia] Διάφοροι ιθαγενείς Αμερικάνοι, στα βορειο-ανατολικά των Η.Π.Α., θεωρούσαν πως το φρούτο αυτό είναι ένα δώρο από το Μεγάλο Πνεύμα. Τιμούσαν τους μικρούς-κυανούς καρπούς, χαρακτηρίζοντάς τους ως μούρα-αστέρια, λόγω του σχήματος αστεριού που βρίσκεται στο κάτω μέρος του καρπού (Εικόνα 1) (Silver & Allen, 2012; Samuel-Peterson, 2013). Έτρωγαν το φρούτο αυτό, έφτιαχναν αφέψημα από τις ρίζες του φυτού, έβαφαν τα ρούχα τους αλλά και το πωλούσαν. Το τσάι μύρτιλλων το χρησιμοποιούσαν για τη θεραπεία του χρόνιου βήχα αλλά και για κοινά συμπτώματα κρυολογήματος. Τα φύλλα των μύρτιλλων χρησιμοποιούνταν στη θεραπεία μολύνσεων του αίματος κατά τη διάρκεια της φροντίδας των πληγών (Silver & Σ ε λ ί δ α 6

17 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Allen, 2012; Samuel-Peterson, 2013; NAED, 2012; Howell, 2009). Άλλες φυλές χρησιμοποιούσαν, επίσης, τα μύρτιλλα για ιατρικούς σκοπούς, όπως η φυλή των Woods Cree, οι οποίοι χρησιμοποιούσαν τα στελέχη των μύρτιλλων για την ανάκαμψη της υγείας των γυναικών μετά το τοκετό, αλλά και για την πρόληψη των αποβολών (Silver & Allen, 2012; Samuel-Peterson, 2013; NAED, 2012). Βέβαια, τα μύρτιλλα αποτελούσαν μέρος των παραδοσιακών διατροφικών συνηθειών των Ευρωπαίων πολύ πριν από την ίδρυση των αποικιών στη Β. Αμερική. Τα μύρτιλλα σερβίρονταν με το γάλα, τη ζάχαρη και τα μπαχαρικά. Τα φρέσκα μύρτιλλα χρησιμοποιούνταν και στην αρτοποιία. Τα αποξηραμένα μύρτιλλα χρησιμοποιούνταν στο ψήσιμο του ψωμιού αλλά και σε κέικ. Τέλος, τη σκόνη αποξηραμένων μύρτιλλων τη χρησιμοποιούσαν ως μείγμα με αποξηραμένα δημητριακά (Trehane, 2004). Εικόνα 2. Με Database] προσδιορίζονται οι καλλιέργειες του Vaccinium corymbosum σε Η.Π.Α. και Καναδά [Πηγή: Plants Σήμερα, τα μύρτιλλα καλλιεργούνται στη Βόρεια Αμερική (Καναδάς, Η.Π.Α.) (Εικόνα 2), στην Κίνα (Wang a et al., 2010), στην Ευρώπη και σε μερικές χώρες στο Νότιο ημισφαίριο, όπως είναι η Χιλή, η Αργεντινή, η Ουρουγουάη, η Νότια Αφρική, η Νέα Ζηλανδία και η Αυστραλία (Lohachoompol et al., 2008; Routray & Orsat, 2011). Στην Ελλάδα, η καλλιέργεια μύρτιλλων είναι περιορισμένη κυρίως στην περιοχή της Βόρειας Ελλάδας, και συγκεκριμένα στο νομό Δράμας. Η καινοτόμος φυτεία των μύρτιλλων εγκαταστάθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα το Βοτανικά χαρακτηριστικά των κυανών μύρτιλλων Τα κυανά μύρτιλλα ανήκουν στην οικογένεια Ericaceae, υποοικογένεια Vacciniaceae, στο γένος Vaccinium (τομέας Cyanococcus), το οποίο αποτελείται σχεδόν από 450 είδη (Silver et al., 2012; Routray & Orsat, 2011). Αρκετά φυτά του γένους Vaccinium καλλιεργούνται τόσο για οικιακή κατανάλωση, όσο και για εμπορική πώληση των μούρων τους (Su, 2012). Μερικά από τα είδη του γένους Vaccinium, παράγουν βρώσιμα μούρα, όπως είναι το blueberry, Σ ε λ ί δ α 7

18 cranberry, sparkleberry, huckleberry, και bilberry (Mazza & Miniati, 1993). Μεταξύ αυτών, τα blueberries και τα cranberries αποτελούν τις μεγαλύτερες εμπορικές καλλιέργειες (Mazza & Miniati, 1993; Hancock et al., 2008). Ο όρος Vaccinium πιθανολογείται πως προέρχεται από τη Λατινική λέξη vacca που σημαίνει αγελάδα, αφού και τα άγρια lingonberry αλλιώς είναι γνωστά ως cowberry, το οποίο υπάρχει άφθονο στη Σουηδία, τον τόπο γέννησης του βοτανολόγου Κάρολου Λινναίου (Trehane, 2004) Τα φυτά της οικογένειας Ericaceae μεγαλώνουν καλύτερα σε όξινα εδάφη (κατάλληλο pη περίπου 5) και ανθίζουν σε κρύες περιόδους κατά τη διάρκεια του χειμώνα. Ωστόσο, τα περισσότερα δεν μπορούν να επιβιώσουν σε θερμοκρασία μεγαλύτερη των -29 Ο C (Mazza & Miniati, 1993). Τα μύρτιλλα φυτρώνουν κοντά σε λίμνες ή έλη που παρέχουν κατάλληλη υγρασία στις ρίζες τους. Τα αργιλώδη και αμμώδη εδάφη δεν είναι κατάλληλα για τα μύρτιλλα. Επίσης, οι λεπτές ρίζες του φυτού δεν μπορούν να διαπεράσουν το σκληρό έδαφος. Αντίθετα, το ελαφρύ χώμα δεν παρέχει αρκετή οργανική ύλη για να εξασφαλίσει τη γονιμότητα του εδάφους. Κατάλληλο θεωρείται το χώμα που είναι πορώδες και έχει υψηλή οξύτητα (Shoemaker, 1978). Τρία είναι τα κύρια είδη κυανών μύρτιλλων: οι χαμηλοί θάμνοι (Vaccinium angustifolium L., Εικόνα 3) οι οποίοι φύονται στο βόρειο τμήμα της Βόρειας Αμερικής (κυρίως στο Μέιν και τον ανατολικό Καναδά), τα rabbiteye (Vaccinium ashei L. Reade γνωστό και ως Vaccinium virgatum Aiton) που βρίσκονται νότια στις Η.Π.Α., και οι ψηλοί θάμνοι (Vaccinium corymbosum L., Εικόνα 3), γνωστοί ως βόρειοι θάμνοι, που φυτρώνουν στα κεντρικά και δυτικά των Η.Π.Α., στη δυτική ακτή και τον Καναδά (Trehane, 2004). Βέβαια, υπάρχουν και διάφορα άλλα είδη και υβρίδια. Εικόνα 3. Vaccinium angustifolium L. (αριστερά) [Πηγή: Oregon State University, OSU, ] και Vaccinium corymbosum L. (δεξιά) [Πηγή: University of Connecticut Plant Database. Copyright Mark Brand, ] 1.5. Vaccinium corymbosum L. Το Vaccinium corymbosum είναι ένας αργά αναπτυσσόμενος φυλλοβόλος θάμνος, ο οποίος είναι μόνοικος. Το ύψος κυμαίνεται από 1.8 ως 3.7 m, σε αντίθεση με το V. angustifolium το Σ ε λ ί δ α 8

19 Ιανουάριος 2014, Πάτρα οποίο ανήκει στους χαμηλούς θάμνους και έχει ύψος το πολύ 0.3 m. Κάθε ένας κύριος βλαστός φέρει δύο ως πέντε κλαδιά. Συχνά βρίσκεται σε πυκνές συστάδες. Οι γλυκοί και χυμώδεις, χρώματος κυανού, καρποί του περιέχουν μικρούς και μαλακούς σπόρους. Το μέγεθος των καρπών και των σπόρων μειώνεται ανάλογα με την ηλικία του θάμνου (Shoemaker, 1978). Ο γλυκός και χυμώδης καρπός του V. corymbosum έχει διάμετρο 6.4 ως 13 χιλιοστά και περιέχει αρκετά σπέρματα διαμέτρου 1 ως 2 mm (Εικόνα 4) (University of Connecticut Plant Database; Lim, 2012). Εικόνα 4. Οι καρποί του Vaccinium corymbosum [Πηγή: Lim T.K., 2012] Τα σκούρα γυαλιστερά πράσινα φύλλα του είναι ελλειπτικά, με οξεία κορυφή και σφηνοειδή βάση. Αυτά έχουν μήκος 4 ως 8 cm, ενώ το πλάτος τους κυμαίνεται από 1.4 ως 4 cm. Το φθινόπωρο, τα φύλλα παίρνουν ένα φωτεινό κόκκινο, πορτοκαλί, κίτρινο, ή και μωβ χρώμα (Εικόνα 5). Εικόνα 5. Τα φύλλα του Vaccinium corymbosum την άνοιξη (αριστερά) και το φθινόπωρο (δεξιά). [Πηγή: University of Connecticut Plant Database. Copyright Mark Brand, ] Τα άνθη του είναι αμφιφυλόφιλα, έχουν σχήμα καμπάνας με χρώμα λευκό ή πολύ ανοιχτό ροζ ως κοκκινωπό, και το μήκος τους φτάνει έως και 8.4 mm (Εικόνα 6). Εικόνα 6. Τα άνθη του Vaccinium corymbosum [Πηγή: University of Connecticut Plant Database; Lim, 2012] Σ ε λ ί δ α 9

20 1.6. Η εξέλιξη της καλλιέργειας των κυανών μύρτιλλων Η καλλιέργεια των κυανών μύρτιλλων είναι σχετικά πρόσφατη και είναι σε ανοδική πορεία (Hancock et al., 2008). Η καλλιέργεια των ψηλών θάμνων (V. corymbosum) ξεκίνησε στις αρχές του 1900 στο Νιού Τζέρσεϊ, με το πρώτο υβρίδιο να αναπτύσσεται το 1908 από τον Φρεντερικ Κόβιλ και το Υπουργείο Γεωργίας των Η.Π.Α.. Αυτός διεύθυνε τις βασικές γεωπονικές μελέτες, σχετικά με το απαιτούμενο ph του εδάφους, τις στρατηγικές κλαδέματος και τον τρόπο πολλαπλασιασμού. Μαζί με την Ελίζαμπεθ Γουάιτ και άλλους, συνέλεξε πολλούς σημαντικούς άγριους κλώνους των V. corymbosum και V. angustifolium, τους οποίους στη συνέχεια, χρησιμοποίησε για την παραγωγή βελτιωμένων τύπων. Πάνω από το 75% των σημερινών εκτάσεων μύρτιλλων αποτελούνται από υβρίδια του Κόβιλ, με πιο σημαντικά τα: Bluecrop, Jersey, Weymouth, Croatan, Blueray, Rubel and Berkeley. Το 1937, ο Τζορτζ Ντάρροου ανέλαβε το πρόγραμμα του Υπουργείου Γεωργίας των Η.Π.Α. όταν ο Κόβιλ πέθανε και συνέβαλε σημαντικά στην εξελικτική πορεία των Vaccinium. Δημιούργησε μεγάλο δίκτυο συνεργασιών που περιελάμβανε ιδιώτες παραγωγούς αλλά και επιστήμονες στη Φλόριντα, τη Γεωργία, το Μέιν, τη Μασαχουσέτη, το Μίσιγκαν, το Νιού Τζέρσεϋ και τη Βόρεια Καρολίνα. Από το 1945 ως το 1961, έστειλε σχεδόν δενδρύλλια σε συνεργάτες του για αξιολόγηση. Από όλα τα καλλιεργούμενα είδη και υβρίδια του γένους Vaccinium, οι ψηλοί θάμνοι μύρτιλλων είναι σημαντικοί ως προς την ικανότητά τους να παρέχουν ικανοποιητικά επίπεδα παραγωγής με ελάχιστες απαιτήσεις. Η καλλιέργεια των ψηλών θάμνων στην Ευρώπη ξεκίνησε μετά το 1920 στην Ολλανδία. Τα επόμενα χρόνια η καλλιέργεια εξαπλώθηκε στην Πολωνία και τη Γερμανία, όπου παρήχθησαν τα πρώτα προϊόντα μύρτιλλων στην Ευρώπη, τα οποία προέρχονταν από διασταυρώσεις γενοτύπων της Βόρειας Αμερικής. Παρόλο αυτά η καλλιέργεια των μύρτιλλων δεν επεκτάθηκε στη Νότιο-ανατολική Ευρώπη μέχρι το Σήμερα, η καλλιέργεια των ψηλών θάμνων μύρτιλλων, στην Ευρώπη, συγκεντρώνεται κυρίως στη Γερμανία, την Πολωνία, τη Γαλλία, την Ολλανδία, τη Λιθουανία, τη Ρουμανία, την Ισπανία και την Ιταλία (Prodorutti et al., 2007). Είναι δύσκολο να εκτιμηθεί η παγκόσμια καλλιέργεια και κατανάλωση των ψηλών θάμνων. Μερικές έρευνες αναφέρουν καλλιέργειες στη Βόρεια Αμερική (Strik, 2006), τη Νότια Αμερική (Banados, 2006), την Ευρώπη (Pliszka, 1997) ή σε άλλες μικρές χώρες. Ενημερωμένες αναφορές, για την καλλιέργεια των ψηλών θάμνων, είναι διαθέσιμες στον Οργανισμό Τροφίμων και Γεωργίας των Ηνωμένων Εθνών (Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAOSTAT - Διεύθυνση URL: Βέβαια παρέχονται πληροφορίες σχετικά με όλα τα είδη των μύρτιλλων μαζί ή με τα μύρτιλλα και τα cranberries. Σύμφωνα με τον Οργανισμό Τροφίμων και Γεωργίας των Ηνωμένων Εθνών, το 2004, η παγκόσμια καλλιέργεια μύρτιλλων έφτασε τους τόνους, με την έκταση συγκομιδής Σ ε λ ί δ α 10

21 Ιανουάριος 2014, Πάτρα να φτάνει τα στρέμματα. Οι κυριότερες χώρες ήταν ο Καναδας ( στρέμματα) και οι Η.Π.Α. ( στρέμματα), ενώ στην Ευρωπαϊκή Ένωση (25 κράτη μέλη), η έκταση συγκομιδής ήταν περίπου στρέμματα. Τα δεδομένα που είναι διαθέσιμα σχετικά με την καλλιέργεια και την παραγωγή των μύρτιλλων σε κάθε Ευρωπαϊκή χώρα, είναι σχετικά λίγα. Γι αυτό το λόγο πληροφορίες συλλέγονται και από τις Ενώσεις των παραγωγών. Η εκτιμώμενη επιφάνεια καλλιέργειας μύρτιλλων είναι στρέμματα στη Γερμανία και στρέμματα στην Πολωνία, με την παραγωγή να είναι και τόνοι, αντίστοιχα. Στη Γαλλία, την Ολλανδία και την Ισπανία καλλιεργούνται πάνω από 200 στρέμματα μύρτιλλων, ενώ στην Ιταλία περίπου 200 (Prodorutti et al., 2007). Περίπου το 50% της συγκομιδής μύρτιλλων στις Η.Π.Α. πωλούνται στην αγορά νωπών προϊόντων. Το υπόλοιπο μεταποιείται σε κονσερβοποιημένα τρόφιμα, κατεψυγμένα τρόφιμα, αποξηραμένα τρόφιμα και ποτά (Hancock et al., 2008). Τα λυοφιλοποιημένα μούρα, συχνά, χρησιμοποιούνται προκειμένου να ενισχυθεί η ποιότητα των μύρτιλλων που προορίζονται ως θρεπτικά προϊόντα. Σ ε λ ί δ α 11

22 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο 2.1. Ταξινόμηση των φυτοχημικών ενώσεων Φυτοχημική ένωση είναι ένας ευρύς όρος που περιγράφει ενώσεις οι οποίες βρίσκονται στα φυτά, αλλά δεν έχουν αναγνωριστεί ως απαραίτητα θρεπτικά συστατικά (π.χ. πρωτεΐνες, υδατάνθρακες) (Liu et al., 2004). Η πλειοψηφία αυτών των ενώσεων είναι δευτερογενείς μεταβολίτες των φυτών και συμβάλλουν κυρίως στην ανάπτυξη και στην προστασία αυτών (Kahkonen et al., 1999). Χιλιάδες ενώσεις έχουν προσδιοριστεί και χαρακτηριστεί ως φυτοχημικές ενώσεις και από αυτές αρκετές εκατοντάδες υπάρχουν σε τρόφιμα που συνήθως καταναλώνονται (Erdman et al., 2007). Στο Σχήμα 1 απεικονίζονται οι μεγαλύτερες κατηγορίες φυτοχημικών ενώσεων, οι οποίες καθορίζονται με βάση τη δομή. Ο αριθμός των φυτοχημικών ενώσεων αυξάνεται συνεχώς, καθώς οι επιστήμονες ανακαλύπτουν νέες στα φυτά. Σχήμα 1. Ταξινόμηση των κυριότερων φυτοχημικών ενώσεων Οι φαινολικές ενώσεις είναι ευρέως διαδεδομένες στο βασίλειο των φυτών και είναι οι πιο άφθονοι δευτερογενείς μεταβολίτες που συντίθενται από αυτά (Σχήμα 2). Περισσότερες από 8000 δομές φαινολικών ενώσεων είναι γνωστές. Περιλαμβάνουν τόσο απλά μόρια (φαινολικά οξέα), όσο και υψηλού βαθμού πολυμερισμού ουσίες (ταννίνες) (Dai & Mumper, 2010). Η δομή των φαινολικών ενώσεων αποτελείται από έναν ή περισσότερους αρωματικούς δακτυλίους, οι οποίοι φέρουν μία ή περισσότερες ομάδες υδροξυλίου. Για το λόγο αυτό είναι ευρέως διαδεδομένες με τον όρο φυτικές πολυφαινόλες ή απλώς πολυφαινόλες. Σ ε λ ί δ α 12

23 Ιανουάριος 2014, Πάτρα ΑΛΛΑ 10% ΦΑΙΝΟΛΙΚΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ 45% ΑΛΚΑΛΟΕΙΔΗ 18% ΤΕΡΠΕΝΟΕΙΔΗ & ΣΤΕΡΟΕΙΔΗ 27% Σχήμα 2. Οι μεγαλύτερες ομάδες φυτοχημικών ενώσεων: ποσοστά [Τροποποιημένο σχήμα από Saxena et al., 2013] H πιο απλή φαινόλη είναι μονοϋποκατεστημένη (C 6 H 5 OH) (Σχήμα 3, Ι), ενώ άλλες γνωστές δι- και τρι- υποκατεστημένες φαινόλες αποτελούν η πυροκατεχόλη, η ρεζορκινόλη, η πυρογαλλόλη και η φλορογλυκινόλη (Σχήμα 3, ΙΙ, ΙΙΙ, ΙV, V, αντίστοιχα). (I) (II) (III) (IV) (V) Σχήμα 3. Δομές φαινολών Ο όρος πολυφαινόλες είναι πολυσυζητημένος. Η πρόταση των Βρετανών βιοχημικών Ε. C. Bate-Smith και Tony Swain (1962) για τον ορισμό των πολυφαινολών, περιλάμβανε τις υδατοδιαλυτές ενώσεις με μοριακή μάζα μεταξύ 500 και 3000 D, οι οποίες εκτός από τις συνήθεις χημικές αντιδράσεις των φαινολών, έχουν και την ιδιότητα να καταβυθίζουν αλκαλοειδή, ζελατίνη και άλλες πρωτεΐνες. Ο Βρετανός Edwin Haslam διεύρυνε τον ορισμό, συμπληρώνοντας σε αυτόν τα εξής: οι πολυφαινόλες χαρακτηρίζονται από 12 ως 16 υδροξυλομάδες σε πέντε με επτά αρωματικούς δακτυλίους ανά 1000 D. Βέβαια, περισσότερο διευρυμένος ορισμός για τις πολυφαινόλες, δόθηκε από το Γάλλο Stephane Quideau (2009). Σύμφωνα με αυτόν, πολυφαινόλες ονομάζονται οι φυτικοί δευτερογενείς μεταβολίτες από την οδό του σικιμικού οξέος και /ή των πολυκετιδίων, οι οποίοι έχουν περισσότερους από ένα φαινολικούς δακτυλίους και δεν έχουν χαρακτηριστική ομάδα που να περιέχει άζωτο στη βασική δομή (Quideau, 2011). Η κατηγορία των φλαβονοειδών είναι η μεγαλύτερη ομάδα φαινολικών ενώσεων και διαχωρίζεται περαιτέρω σε ένα ευρύ φάσμα υποκατηγοριών, όπως είναι οι φλαβανόλες, οι φλαβονόλες και οι ανθοκυανιδίνες. Μερικές από αυτές τις κατηγορίες ενώσεων υπάρχουν Σ ε λ ί δ α 13

24 αποκλειστικά σε μία οικογένεια φυτών, όπως είναι οι ισοφλαβόνες που βρίσκονται στους καρπούς της σόγιας και σε κάποια άλλα όσπρια, ενώ άλλες όπως για παράδειγμα οι ανθοκυανίνες βρίσκονται σε όλο το βασίλειο των φυτών (Erdman et al., 2007) Φαινολικά οξέα Τα πιο γνωστά φαινολικά οξέα που βρίσκονται στα φυτά ταξινομούνται είτε στα υδροξυβενζοϊκά οξέα, τα οποία είναι παράγωγα του βενζοϊκού οξέος, είτε στα υδροξυκινναμωμικά οξέα, τα οποία είναι παράγωγα του κινναμωμικού οξέος (Dai & Mumper, 2010; Rice-Evans et al, 1996) (Σχήμα 4). Μερικά από τα κυριότερα υδροξυβενζοϊκά οξέα είναι το σαλικυλικό οξύ, το γαλλικό οξύ και το ελλαγικό οξύ, ενώ μερικά από τα κυριότερα υδροξυκινναμωμικά οξέα είναι το p- κουμαρικό οξύ, το καφεϊκό οξύ και το φερουλικό οξύ (Szajdek & Browska, 2008). Μερικές από αυτές τις ενώσεις παρουσιάζονται σε εστεροποιημένη μορφή. Για παράδειγμα, το καφεϊκό οξύ συνήθως εστεροποιείται με το κινικό οξύ σχηματίζοντας το χλωρογενικό οξύ, το οποίο αποτελεί το κυριότερο συστατικό του καφέ (Dai & Mumper, 2010; Szajdek & Browska, 2008). Υδροξυβενζοϊκά οξέα Γαλλικό οξύ Βενζοϊκό οξύ Ελλαγικό οξύ Υδροξυκινναμωμικά οξέα Φερουλικό οξύ Καφεϊκό οξύ p-κουμαρικό οξύ Σχήμα 4. Μερικές δομές φαινολικών οξέων Σ ε λ ί δ α 14

25 Ιανουάριος 2014, Πάτρα (Συνέχεια Σχήμα 4.) Κινναμωμικό οξύ Καφεοϋλο-κινικό οξύ (Χλωρογενικό οξύ) 2.3. Φλαβονοειδή Η βασική δομή των φλαβονοειδών αποτελείται από 15 άτομα άνθρακα διατεταγμένα σε τρεις δακτυλίους (C6-C3-C6). Συγκεκριμένα η χημική δομή των φλαβονοειδών αποτελείται από δύο αρωματικούς δακτυλίους (Α και Β) και από ακόμα έναν κεντρικό ετεροδακτύλιο (C), ο οποίος φέρει ένα άτομο οξυγόνου (Σχήμα 5). Εξαιτίας του ότι περιέχουν περισσότερους από έναν φαινολικό δακτύλιο, τα φλαβονοειδή μπορούν να χαρακτηριστούν ως πολυφαινόλες. Η κατηγορία των φλαβονοειδών, όπως φάνηκε και στο Σχήμα 1, χωρίζεται περαιτέρω σε έξι υποκατηγορίες (ανθοκυανιδίνες, φλαβονόλες, φλαβανόνες, φλαβόνες, ισοφλαβόνες) ανάλογα με την κατάσταση οξείδωσης του κεντρικού δακτυλίου C ' Σχήμα 5. Βασική δομή ανθρακικού σκελετού των φλαβονοειδών A 5 O 1 C ' 3 ' B 6 ' 4 ' 5 ' Η δομική ποικιλομορφία σε κάθε υποκατηγορία οφείλεται, εν μέρει, στο βαθμό και τον τρόπο της υδροξυλίωσης, μεθοξυλίωσης, πρενυλίωσης ή γλυκοζυλίωσης. Μερικά από τα πιο κύρια φλαβονοειδή είναι: η κερκετίνη, μία φλαβονόλη που βρίσκεται κυρίως στο κρεμμύδι, το μπρόκολο και το μήλο, η κατεχίνη, μία φλαβανόλη που βρίσκεται στο τσάι και σε διάφορα φρούτα, η ναριγκενίνη, μία φλαβανόνη που βρίσκεται κυρίως στο γκρέιπφρουτ, ο γλυκοζίτης της κυανιδίνης, μία ανθοκυανίνη που βρίσκεται στα περισσότερα είδη μούρων (blackcurrant, raspberry, blackberry κ.ά.) και η γενιστείνη, μαζί με την διαδζεΐνη, που αποτελούν τις κύριες ισοφλαβόνες της σόγιας (D'Archivio et al., 2007, Dai & Mumper, 2010) Ανθοκυανίνες Συνολικά, υπάρχουν έξι ανθοκυανιδίνες οι οποίες βρίσκονται στη φύση, όπως φαίνεται και στο Σχήμα 6α. Στα φυτά, οι περισσότερες ανθοκυανιδίνες απατώνται ως Ο-γλυκοζίτες, όπου το Σ ε λ ί δ α 15

26 τμήμα της ανθοκυανιδίνης (άγλυκο τμήμα) συνδέεται με ένα ή περισσότερα σάκχαρα (μονο-, δι- και τρι- σακχαρίτες). Αυτή η γλυκοζυλιωμένη μορφή των ανθοκυανιδινών ονομάζεται ανθοκυανίνη (Σχήμα 6β). Το μεγαλύτερο μέρος των χημικών ενώσεων που δίνουν στα άνθη, τους καρπούς και στα φύλλα το χρώμα τους, είναι οι ανθοκυανίνες. Τα πιο διαδεδομένα σάκχαρα είναι η γλυκόζη, η γαλακτόζη, η ραμνόζη, η αραβινόζη, η ρουτινόζη, η σοφορόζη, η ξυλόζη και η σαμβουβιόζη και συνδέονται μέσω του υδροξυλίου του άνθρακα στη θέση 3 (Σχήμα 6β) (Szajdek & Browska, 2008). Ανθοκυανιδίνη R 1 R 2 Χαρακτηριστικό Χρώμα Πελαργονιδίνη Η H Πορτοκαλί Κυανιδίνη OH H Πορτοκαλί/ Κόκκινο Δελφινιδίνη OH OH Υποκύανο/ Κόκκινο Πεονιδίνη OMe H Πορτοκαλί/ Κόκκινο Πετουνιδίνη OMe OH Υποκύανο/ Κόκκινο Μαλβιδίνη OMe OMe Υποκύανο/ Κόκκινο Σχήμα 6α. Δομή των ανθοκυανιδινών (Su., 2012) Τα σάκχαρα μπορεί να ακυλιωθούν από οργανικά οξέα και σε αυτή την περίπτωση οι ενώσεις αυτές θεωρούνται ακυλιωμένοι γλυκοζίτες των ανθοκυανιδινών ή ακυλιωμένες ανθοκυανίνες (Σχήμα 7). Αυτά τα παράγωγα αξίζει να σημειωθούν, εφόσον οι ερευνητές προτείνουν πως διαφορετικές ανθοκυανίνες έχουν διαφορετικές αποκρίσεις από άποψη σταθερότητας, βιοδιαθεσιμότητας, και πιθανών επιπτώσεων στην υγεία. Το R 3 στη δομή των ανθοκυανινών (Σχήμα 6α)μπορεί να καταλαμβάνεται με ένα από τα παρακάτω σάκχαρα και έτσι να προκύπτει η γλυκοζυλιωμένη μορφή (Σχήμα 6β). Σ ε λ ί δ α 16

27 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Γλυκόζη Γαλακτόζη Ραμνόζη Ξυλόζη Σοφορόζη (Γλυκόζη-Γλυκόζη) Ρουτινόζη (Ραμνόζη-Γλυκόζη) Σαμβουβιόζη (Γλυκόζη-Ξυλόζη) Σχήμα 6β. Δομή των σακχάρων που απαντώνται στις ανθοκυανίνες. Ανθοκυανιδίνη Γλυκόζη Ακετυλ- ομάδα Σχήμα ακετυλο-μαλβιδινο-γλυκόζη (Barnes et al., 2009) Φλαβονόλες, φλαβόνες Οι φλαβονόλες και οι φλαβόνες απατώνται στη φύση συνήθως ως γλυκοζίτες και πιο συγκεκριμένα ως Ο-γλυκοζίτες, με τη ομάδα του σακχάρου να συνδέεται στο υδροξύλιο του άνθρακα που βρίσκεται στη θέση 3 (φλαβονόλες) ή του άνθρακα στη θέση 7 (φλαβόνες). Κύριοι εκπρόσωποι των φλαβονολών στα φυτά είναι η κερκετίνη, η κεμφερόλη, η μυρικετίνη και η ισοραμνετίνη, ενώ των φλαβονολών η λουτεολίνη και η απιγενίνη (Σχήμα 8, Σχήμα 9). Σ ε λ ί δ α 17

28 Φλαβονόλες R 1 R 2 R3 R4 R5 Κερκετίνη OΗ OH OH OH H Μυρικετίνη OH OH OH OH OH Κεμφερόλη OH OH H OH H Ισοραμνετίνη OH OH OΜe OH H Σχήμα8. Δομή των φλαβονολών Απιγενίνη: R 1 =R 3 =R 4 =OH, R 2 =R 5= Η Λουτεολίνη: R 1 =R 3 =R 4 =R 5 =OH, R 2 =Η Σχήμα 9. Δομή φλαβονών Φλαβανόλες Κύριοι εκπρόσωποι την κατηγορίας των φλαβανολών είναι η κατεχίνη και η επικατεχίνη. Τα πιο κοινά οπτικά ισομερή είναι η (+)- κατεχίνη και η (-)- επικατεχίνη (Σχήμα 10). Όταν στο δακτύλιο Β, στη θέση 5 της κατεχίνης και της επικατεχίνης προστεθεί μία ακόμη φαινολική ομάδα (ΟΗ), τότε τα μόρια που σχηματίζονται, ονομάζονται γαλλοκατεχίνη και επιγαλλοκατεχίνη, αντίστοιχα. Κατεχίνη: R 1 =R 2 =R 4 =R 5 =R 6 =OH, R 3 =Η Επικατεχίνη: R 1 =R 2 =R 3 =R 5 =R 6 =OH, R 4 =Η Σχήμα 10. Δομή φλαβανολών Σ ε λ ί δ α 18

29 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Φλαβανόνες, ισοφλαβλόνες Εσπεριδίνη: R 1 =R 2 =OH Ναριγκενίνη: R 1 =OH, R 2 =H Γενιστείνη: R 1 =R 2 =R 3 =OH Διαδζεΐνη: R 1 =R 3 =OH, R 2 =H Σχήμα 11. Κύριες δομές φλαβανόνων και ισοφλαβονών (τροποποιημένο σχήμα από Dai & Mumper, 2010) Οι κύριες φλαβανόνες που βρίσκονται σε ελεύθερη μορφή είναι η ναριγκενίνη στα γκρέιπφρουτ και η εσπεριδίνη στα πορτοκάλια (Σχήμα 11) Γενικά, η περιεκτικότητα των φρούτων σε φλαβανόνες είναι μεγαλύτερη στους διάφορους ιστούς παρά στο χυμό τους. Οι ισοφλαβόνες είναι φλαβονοειδή που έχουν δομικά χαρακτηριστικά τα οποία προσεγγίζουν τα οιστρογόνα, αν και δεν είναι στεροειδή. Η δομή τους μοιάζει με εκείνη του μορίου της οιστραδιόλης (Σχήμα 12). Αυτό τους προσδίδει ψευδοορμονικές ιδιότητες, συμπεριλαμβανομένης και της ικανότητάς τους να συνδέονται στους υποδοχείς οιστρογόνων. Σχήμα 12. Οιστραδιόλη Ταννίνες Οι ταννίνες είναι ενώσεις μεσαίου ως και υψηλού μοριακού βάρους. Είναι υδροξυλιωμένα μόρια, ικανά να σχηματίζουν αδιάλυτα σύμπλοκα με υδατάνθρακες και πρωτεΐνες. Σε αυτή τους την ιδιότητα οφείλεται η στυφή γεύση τροφών πλούσιων σε ταννίνες, καθώς σχηματίζουν ιζήματα με τις πρωτεΐνες του εκκρίματος των σιελογόνων αδένων. Με αυτό τον τρόπο αναστέλλεται η δράση των ενζύμων της σιέλου και έτσι φράσσουν οι βλεννογόνοι και περιορίζεται η εκροή σιέλου. Οι ταννίνες κατηγοριοποιούνται σε δύο μεγάλες ομάδες: τις υδρολυόμενες που αποτελούνται κυρίως από εστέρες του γαλλικού οξέος και του ελλαγικού οξέος με γλυκόζη (γαλλοταννίνες και ελλαγιταννίνες, αντίστοιχα) και τις συμπυκνωμένες που είναι ολιγομερή ή πολυμερή των φλαβονοειδών. Ο όρος συμπυκνωμένες ταννίνες σχετίζεται και με τον όρο Σ ε λ ί δ α 19

30 προανθοκυανιδίνες, ο οποίος περιγράφει την ομάδα ενώσεων εκείνη που περιέχει κάποια από τις φλαβανόλες (κατεχίνη, επικατεχίνη) ως μονομερές και περιέχει τη λέξη κυανιδίνη, διότι κατά την οξειδωτική διάσπαση μιας προανθοκυανιδίνης απελευθερώνονται μόρια κυανιδίνης. Οι προανθοκυανιδίνες ταξινομούνται σε δύο τύπους: Α-τύπου και Β-τύπου προανθοκυανιδίνες. Οι Α-τύπου περιέχουν δύο δεσμούς μεταξύ των φλαβονοειδών, έναν C4- C8 (4β 8) και έναν C2-C7 αιθερικό δεσμό (2β Ο 7) και είναι λιγότερο συνηθισμένες σε σχέση με τις Β-τύπου που περιέχουν μόνο έναν δεσμό C4-C8 ή C4-C6. Παρακάτω φαίνονται δύο εκπρόσωποι των τύπων αυτών, η προκυανιδίνη Α2 (επικατεχίνη-(2β 7,4β 8)- επικατεχίνη) και η προκυανιδίνη Β2 (( )-επικατεχίνη-(4β 8)-( )-επικατεχίνη), οι οποίες έχουν προσδιοριστεί σε διάφορες δρόγες (Σχήμα 13). Η προκυανιδίνη Β2 μπορεί να μετατραπεί στην προκυανιδίνη Α2 με οξείδωση, χρησιμοποιώντας τη ρίζα 2,2-διφαινυλο-1- πικρυλ-υδραζίλιο (DPPH). Σχήμα 13. Προκυανιδίνη Β2 (αριστερά) και Προκυανιδίνη Α2 (δεξιά) Στιλβένια Τα στιλβένια αποτελούνται από δύο φαινυλομάδες, οι οποίες ενώνονται μέσω μιας αλυσίδας δύο ατόμων άνθρακα (C6-C2-C6). Στα φυτά εμφανίζονται σε περιορισμένο βαθμό και χαρακτηρίζονται ως φυτοοιστρογόνες ενώσεις. Χαρακτηριστική ένωση της ομάδας αυτής είναι η ρεσβερατρόλη (3,5,4 - τριυδροξυστιλβένιο), η οποία συναντάται ως cis- και transισομερές (Σχήμα 14). Σχήμα 14. Ρεσβερατρόλη Σ ε λ ί δ α 20

31 Ιανουάριος 2014, Πάτρα 2.4. Φυτοχημική ποικιλομορφία διαφόρων ειδών μούρων Τα μούρα είναι πλούσια σε φυτοχημικές ενώσεις, και ειδικά σε ανθοκυανίνες. Επίσης, περιέχουν ταννίνες, φλαβανόλες, φλαβονόλες, φαινολικά οξέα και στιλβένια. Μεταξύ των πολύχρωμων καρπών, τα μούρα και ειδικά τα blueberries- κυανά μύρτιλλα, τα blackberries- βατόμουρα, τα cranberries, τα raspberries- σμέουρα, τα bilberries, τα elderberries και τα blackcurrants -μαύρα φραγκοστάφυλλα καταναλώνονται ευρέως, καθώς αποτελούν μέρος της ανθρώπινης δίαιτας σε νωπή ή επεξεργασμένη μορφή (μαρμελάδες, αλκοολούχοι ή μη χυμοί, αποξηραμένοι καρποί κ.ά.). Στον Πίνακα 1 φαίνονται συνοπτικά οι φυτοχημικές ενώσεις που βρίσκονται σε μεγαλύτερη αφθονία, στους διάφορους καρπούς μούρων. Σημαντική παρατήρηση είναι πως κύρια συστατικά των καρπών μούρων, αποτελούν οι ανθοκυανίνες (Πίνακας 1). Οι συγκεντρώσεις των φυτοχημικών ενώσεων στα μούρα επηρεάζονται από αρκετούς παράγοντες, όπως είναι οι περιβαλλοντικές συνθήκες, ο βαθμός της ωρίμανσης, η ποικιλία, η τοποθεσία όπου καλλιεργείται το φυτό, η επεξεργασία αλλά και ο χρόνος αποθήκευσης αυτού (Del Rio et al., 2010). Πέρα των ανθοκυανινών οι οποίες αποτελούν τον κύριο εκπρόσωπο των φυτοχημικών ενώσεων, υπάρχουν και άλλα φλαβονοειδή στους καρπούς των μούρων. Η μυρικετίνη, η κερκετίνη και η κεμφερόλη έχουν ποσοτικοποιηθεί σε διάφορα είδη. Η κερκετίνη έχει βρεθεί ως η κυριότερη φλαβονόλη στον καρπό του Vaccinium uliginosum (158 mg/kg ν.β.), ενώ σε ποικιλίες των blackcurrants, κυριότερη είναι η μυρικετίνη (Ribes nigrum 71 mg/kg ν.β.). Γλυκοζυλιωμένες φλαβονόλες που έχουν εντοπιστεί στους καρπούς των μούρων είναι ο 3- γλυκοζίτης της κερκετίνης, ο 3-ρουτινοζίτης της κερκετίνης, ο 3-γαλακτοζίτης της κερκετίνης, ο 3-γλυκοζίτης της μυρικετίνης, ο 3-γαλακτοζίτης της μυρικετίνης, και ο 3-ρουτινοζίτης της μυρικετίνης. Μονομερείς φλαβανόλες (κατεχίνη, επικατεχίνη), αλλά και διμερείς, τριμερείς προανθοκυανιδίνες περιέχονται επίσης στα μούρα. Κυρίως, τα cranberries αποτελούν σημαντική πηγή αυτών των ενώσεων. Εκπρόσωποι των υδροξυβενζοϊκών και υδροξυκινναμωμικών οξέων εντοπίζονται σε όλα τα είδη μούρων (Del Rio et al., 2010) Βέβαια, εκτός από φαινολικές ουσίες, τα μούρα περιέχουν υψηλή συγκέντρωση βιταμίνης C, που ως βιταμίνη κατατάσσεται στις φυσικές οργανικές ενώσεις. Πλούσιες, σε βιταμίνη C είναι οι black και red currants (Borges et al., 2010). Σ ε λ ί δ α 21

32 Πίνακας 1. Τα κυριότερα συστατικά που περιέχονται στα διάφορα είδη μούρων (τροποποιημένος πίνακας από Del Rio et al., 2010). *Επειδή η χρήση των καρπών αυτών στον Ελλαδικό χώρο έχει ξεκινήσει τα τελευταία χρόνια, δεν υπάρχει σωστή απόδοση στην Ελληνική γλώσσα για όλα. Γένος και Είδος Ribes nigrum Ribes rubrum Οικογένεια Grossulariaceae Grossulariaceae Αγγλική ονομασία-ελληνική ονομασία* Blackcurrant- Μαύρο φραγκοστάφυλλο Redcurrant- Κόκκινο φραγκοστάφυλλο Επικρατέστερα Φαινολικά Συστατικά* Del-3-Rut, Cy-3-Rut Cy-3-Xyl-Rut Fragaria x ananassa Rosaceae Strawberry- Φράουλα Pel-3-Glc Rubus spp Rosaceae Blackberry- Βατόμουρο Cy-3-Glc Rubus idaeus Rosaceae Red raspberry- Κόκκινο σμέουρο Vaccinium corymbosum Ericaceae Blueberry- Κυανό μύρτιλλο Cy-3-Sop, Sanguin H-6 Mal-3-Gal, Mal-3- Ara, Del-3-Gal, CA Αναφορές Määttä et al., 2003; Wu et al., 2004; Borges et al., 2010; Gavrilova et al., 2011; Donno et al., 2013 Määttä et al., 2003; Wu et al., 2004; Borges et al., 2010; Gavrilova et al., 2011; Donno et al., 2013 Määttä et al., 2004; Mullen et al., 2008; Aaby et al., 2012; Donno et al., 2013 Cho et al., 2004; Cuevas Rodrigez et al., 2010 Mullen a et al., 2002; Mullen b et al., 2002; Rouanet et al., 2009 Taruscio et al., 2004; Ochmian et al., 2009; Borges et al., 2010; Gavrilova et al., 2011 Vaccinium myrtillus Ericaceae Bilberry Cy-3-Glc, Del-3-Glc Rouanet et al., 2009; Moze et al, 2011 Vaccinium macrocarpum Ericaceae Cranberry Cy-3-Gal, Peo-3-Gal Prior et al., 2001; Borges et al., 2010 Sambucus nigra Caprifoliaceae Elderberry- Σαμπούκο Cy-3-Glc, Cy-3-Sam Wu et al., 2004 *Del: δελφινιδίνη, Cy: Κυανιδίνη, Mal: μαλβιδίνη, Peo: πεονιδίνη, Pet: πετουνιδίνη Rut: ρουτινόζη, Xyl: ξυλόζη, Glc: γλυκόζη, Sop: σοφορόζη, Sanguin H-6: σαγκουίνη, Gal: γαλακτόζη, Ara: αραβινόζη, CA: χλωρογενικό οξύ, Sam:σαμβουβιόζη Σ ε λ ί δ α 22

33 Ιανουάριος 2014, Πάτρα 2.5. Φυτοχημικές διαφορές μεταξύ των Blueberries και των Bilberries Τα κυανά μύρτιλλα και τα bilberries είναι σημαντικές πηγές φλαβονοειδών και ειδικά ανθοκυανινών. Ανήκουν και τα δύο στην οικογένεια Ericaceae και συγκεκριμένα είναι και τα δύο είδη του γένους Vaccinium. Σύγχυση παρατηρείται μεταξύ των όρων blueberry και bilberry, εξαιτίας της μεγάλης ομοιότητάς των καρπών. Το bilberry (V. myrtillus) είναι ένας άγριος θάμνος ο οποίος φύεται σε δάση της Βόρειας και Κεντρικής Ευρώπης, σε αντίθεση με τα κυανά μύρτιλλα (blueberries: V. corymbosum, V. ashei, V. angustifolium), που φύονται στην Αμερική. Τα κυανά μύρτιλλα, σε αντίθεση με τα bilberries, καλλιεργούνται σε πολλές χώρες και προέρχονται συνήθως από ποικιλίες υβριδίων. Παρατηρώντας τους καρπούς και των δύο αυτών φυτών, φαίνεται να έχουν πολύ μεγάλη ομοιότητα. Σημαντικές είναι όμως οι διαφορές τους στη φυτοχημική σύσταση και συγκεκριμένα στο ποσοστό των ανθοκυανινών αλλά και υδροξυκινναμωμικών οξέων. Ο Riihinen και οι συνεργάτες (2008) αναφέρουν πως το περιεχόμενο των bilberries σε ανθοκυανίνες είναι κατά πολύ μεγαλύτερο σε σχέση με το αντίστοιχο των blueberries. Πιο αναλυτικά, εξετάζοντας τη σύσταση των διαφόρων τμημάτων των φυτών (άνθη, επιδερμίδα καρπού, εσωτερικό τμήμα καρπού, φύλλα και ρίζες) παρατήρησαν πως τα bilberries περιέχουν ανθοκυανίνες, όχι μόνο στο φλοιό αλλά και στο εσωτερικό τμήμα του καρπού (Εικόνα 7). Σημαντικό, επίσης, αποτέλεσμα των παραπάνω ερευνητών είναι ότι το περιεχόμενο των υδροξυκινναμωμικών οξέων (p-κουμαρικό οξύ, καφεϊκό οξύ, φερουλικό οξύ) είναι υψηλότερο στα κυανά μύρτιλλα. Η σύσταση του καρπού (φλοιός, εσωτερικό τμήμα) παρουσιάζεται στον Πίνακα 2. Εικόνα 7. (Α) Τομή στον καρπό του bilberry ή οποία δείχνει το έντονο χρώμα του εσωτερικού τμήματος. (Β) Τομή στον καρπό του κυανού μύρτιλλου [Πηγή: Riihinen et al., 2008] Σε άλλη μελέτη (Moze et al., 2011) γίνεται σύγκριση των συστατικών του V. myrtillus και του V. corymbosum. Τα αποτελέσματα, όχι μόνο επιβεβαιώνουν την προηγούμενη μελέτη, αλλά και άλλες μελέτες (Gavrilova et al., 2010 και Taruscio et al, 2004) που αναφέρουν πως το χλωρογενικό οξύ είναι το κύριο φαινολικό συστατικό στα καλλιεργούμενα είδη των κυανών μύρτιλλων (V. corymbosum). Σ ε λ ί δ α 23

34 Πίνακας 2. Περιεχόμενο ανθοκυανινών και υδροξυκινναμωμικών οξέων στους καρπούς των V. myrtillus και V. corymbosum. (Τροποποιημένος πίνακας από Riihinen et al., 2008) Τμήμα Φυτού Ανθοκυανίνες (mg/100g ν.β. * ) V. myrtillus (bilberry) Υδροξυκινναμωμικά οξέα (mg/100g ν.β. * ) Φλοιός καρπού 2.025,6 20,7 Εσωτερικό τμήμα καρπού 104,0 16,3 V. corymbosum x V. angustifolium (blueberry) Φλοιός καρπού 622,3 73,4 Εσωτερικό τμήμα καρπού 1,9 52,9 * ν.β. : νωπό βάρος Συγκεκριμένα, στη μελέτη των Moze και συνεργατών (2011) το συνολικό περιεχόμενο σε ανθοκυανίνες του V. myrtillus υπολογίσθηκε 1.210,3 ± 111,5 mg/100g ν.β., ενώ του V. corymbosum 212,4 ± 14,1 mg/100g ν.β., ενώ το V. corymbosum περιέχει τρεις φορές υψηλότερο περιεχόμενο χλωρογενικού οξέος σε σχέση με το V. myrtillus (70,0 ± 3,4 mg/100g ν.β. και 23,1 ± 1,0 mg/100g ν.β., αντίστοιχα). Επομένως, αν και οι ανθοκυανίνες είναι η κυριότερη ομάδα φαινολικών συστατικών στα κυανά μύρτιλλα (V. corymbosum: 212,4 ± 14,1 mg/100g ν.β.), το χλωρογενικό οξύ (70,0 ± 3,4 mg/100g ν.β.) σε σχέση με κάθε μία από τις περιεχόμενες στο φυτό φαινολικές ενώσεις (συμπεριλαμβανομένων των ανθοκυανινών) αποτελεί το κυριότερο συστατικό. Για παράδειγμα, ενδεικτικά αναφέρεται πως ο γαλακτοζίτης της μαλβιδίνης, που είναι ίσως η πιο σημαντική ανθοκυανίνη των κυανών μύρτιλλων (άρα και του V. corymbosum) βρίσκεται σε συγκέντρωση 34,9 ± 3,1 mg/100g ν.β. (Moze et al., 2011). Η πρόσφατη μελέτη της Gavrilova και των συνεργατών της (2011) ενισχύει την τελευταία παρατήρηση σχετικά με την μεγάλη αφθονία του χλωρογενικού στα καλλιεργούμενα είδη κυανών μύρτιλλων. Στη μελέτη αυτή γίνεται ποσοτικοποίηση των ανθοκυανινών, των φλαβονολών, των φλαβανολών και των υδροξυκινναμωμικών οξέων σε τέσσερις ποικιλίες. Οι ανθοκυανίνες αποτελούν το % των συστατικών (εύρος συγκέντρωσης: 41,99 83,64 mg/100g ν.β.), ενώ τα υδροξυκινναμωμικά οξέα το % (εύρος συγκέντρωσης: 25,97 67,54 mg/100g ν.β.). Βλέποντας, όμως κάθε μία ένωση ανεξάρτητα από τις ολικές τιμές, είναι ξεκάθαρο πως το χλωρογενικό οξύ είναι το κυρίαρχο συστατικό του V. corymbosum. Σημαντικό, είναι επίσης το γεγονός, πως οι συγκεκριμένοι ερευνητές για πρώτη φορά ποσοτικοποίησαν δύο παράγωγα του χλωρογενικού οξέος. Η βιβλιοθήκη Polyphenol Explorer ( αναφέρει πως τα κυανά μύρτιλλα έχουν το τέταρτο κατά σειρά, υψηλότερο ποσοστό χλωρογενικού οξέος (1,312 mg/kg), σε σχέση με τα υπόλοιπα τρόφιμα της βιβλιοθήκης. Σ ε λ ί δ α 24

35 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Συνοπτικά, τα κυανά μύρτιλλα σύμφωνα με τη βιβλιογραφία περιέχουν υψηλά ποσοστά φαινολικών ενώσεων, και παρόλο που μοιάζουν με άλλα είδη του γένους τους (V. myrtillus) διαφέρουν σημαντικά στο φαινολικό περιεχόμενο. Το περιεχόμενο των φαινολικών συστατικών στα κυανά μύρτιλλα ποικίλει ευρέως, ανάλογα με την ποικιλία, την εποχή και τον τόπο καλλιέργειας, ως εκ τούτου είναι δύσκολο να παρέχονται μοναδικά δεδομένα. Διαφορές, επίσης, παρατηρούνται όταν διαφέρει το στάδιο ωρίμανσης των καρπών. Όσο πιο ώριμοι είναι οι καρποί των μύρτιλλων κατά τη συγκομιδή, τόσο πιο αυξημένες είναι οι συγκεντρώσεις των ανθοκυανινών και των ολικών φαινολικών ενώσεων (Jaakola et al., 2002). Υπάρχουν αρκετά δημοσιευμένα στοιχεία (Kalt et al., 2001, Moyer et al., 2002, Prior et al., 1998) που αφορούν κυρίως τις καλλιεργούμενες ποικιλίες των κυανών μύρτιλλων και συγκεκριμένα των ψηλών θάμνων, Vaccinium corymbosum (Giovanelli et al., 2009) Φυτοχημικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών κυανών μύρτιλλων Φυτοχημική ποικιλομορφία υπάρχει και μεταξύ των ειδών που ανήκουν στο ίδιο βοτανικό γένος και τομέα. Τα είδη των κυανών μύρτιλλων: (α) ψηλοί θάμνοι-καλλιεργούμενα μύρτιλλα, (β) χαμηλοί θάμνοι-αυτοφυή μύρτιλλα, και (γ) μύρτιλλα του είδους Rabbiteye ανήκουν στο γένος Vaccinum και τομέα Cyanoccocus. Δημοσιευμένα αποτελέσματα από τους Howard & Hager (2007) αναφέρουν πως τα κυανά μύρτιλλα του είδους Rabbiteye έχουν πολύ μεγαλύτερο ολικό περιεχόμενο σε ανθοκυανίνες και φαινολικές ενώσεις σε σχέση με τα υπόλοιπα είδη (Πίνακας 3). Αυτό μπορεί να σχετίζεται με το μικρότερο μέγεθος αυτών. Στην ίδια μελέτη τα καλλιεργούμενα μύρτιλλα έχουν το μεγαλύτερο εύρος συγκεντρώσεων χλωρογενικού οξέος. Άλλες μελέτες έχουν παρόμοια αποτελέσματα. Πίνακας 3. Σύγκριση του περιεχομένου σε φυτοχημικές ενώσεις στα είδη κυανών μυρτίλλων (mg/100g ν.β.) (Τροποποιημένος πίνακας Howard & Hager, 2007) Είδος μυρτίλλου Αυτοφυή μύρτιλλα Καλλιεργούμενα μύρτιλλα Φαινολικές Ενώσεις Ανθοκυανίνες Φλαβονοειδή Χλωρογενικό Οξύ Είδος Rabbiteye Η Lohachoompol και οι συνεργάτες της (2008) αναφέρουν ένα αρκετά μεγαλύτερο ποσοστό ανθοκυανινών του είδους Rabbiteye σε σχέση με τα καλλιεργούμενα μύρτιλλα. Σε άλλη μελέτη (Prior et al., 1998) όπου εξετάσθηκαν διάφορα είδη κυανών μύρτιλλων συμπεραίνεται πως, παρόλο που τα επίπεδα των φαινολικών είναι αρκετά διαφορετικά ανάμεσα στα είδη rabbiteye και highbush, δεν υπάρχει καμία διαφορά στις περιεχόμενες ολικές ανθοκυανίνες αυτών ή στην αντιοξειδωτική ικανότητά τους. Όπως αποδεικνύεται από το μεγάλο εύρος Σ ε λ ί δ α 25

36 τιμών του Πίνακα 3, φαίνεται να υπάρχει μεγάλη γενετική ποικιλομορφία μεταξύ των ειδών. Αυτό υπάρχει περισσότερο μεταξύ των ειδών highbush τα οποία καλλιεργούνται σε πολλές περιοχές και επομένως υπάρχουν εκατοντάδες ποικιλίες Φυτοχημική Σύσταση των καρπών του Vaccinium corymbosum Οι καρποί των ψηλών θάμνων του V. corymbosum έχουν μελετηθεί αρκετά, και αυτό γιατί είναι πλούσιοι σε πολυφαινόλες και άλλα θρεπτικά συστατικά για τον ανθρώπινο οργανισμό. Η μεγάλη κατανάλωση αυτών ως φρέσκο φρούτο αλλά και σε μορφή χυμού, ποτού (αλκοολούχου ή μη), μαρμελάδων και άλλων μορφών έχει κεντρίσει το ενδιαφέρον των ερευνητών, οι οποίοι στράφηκαν στην φυτοχημική μελέτη αυτού. Στην προηγούμενη ενότητα έγινε αναφορά στο περιεχόμενο του καρπού σε ανθοκυανίνες και υδροξυκινναμωμικά οξέα (κυρίως χλωρογενικό οξύ). Υπάρχει αρκετή βιβλιογραφία που αναφέρεται στη φυτοχημική σύσταση του V. corymbosum. Οι κύριες ανθοκυανίνες που έχουν ανιχνευτεί και ποσοτικοποιηθεί στον καρπό, φαίνονται στους δύο πίνακες που παρατίθενται (Πίνακας 4, Πίνακας 5). Όπως αναφέρθηκε στην προηγούμενη ενότητα (Πίνακας 2) και όπως φαίνεται στις μελέτες που παρουσιάζονται στους πίνακες (Wang et al., 2012; Moze et al., 2011; Gavrilova et al., 2011), ο 3-γαλακτοζίτης της μαλβιδίνης (Σχήμα 15, αριστερά) είναι η κυρίαρχη ανθοκυανίνη του V. corymbosum. Παραπλήσια, αλλά μικρότερη είναι η περιεκτικότητα του καρπού στον 3-αραβινοζίτη της μαλβιδίνης (Σχήμα 15, δεξιά). Σχήμα 15. Δομές των κύριων ανθοκυανινών στους καρπούς του V. corymbosum. Αριστερά: ο 3-γαλακτοζίτης της μαλβιδίνης και δεξιά: ο 3-αραβινοζίτης της μαλβιδίνης Παρατηρείται πως όλες οι ανθοκυανίνες που βρίσκονται στους καρπούς των κυανών μύρτιλλων, περιέχουν ένα μόριο σακχάρου (γλυκόζη, γαλακτόζη, αραβινόζη, ξυλόζη) συνδεδεμένο στον άνθρακα που βρίσκεται στη θέση 3 του δακτυλίου C (Su, 2012; Moze et al., 2011; Giovanelli et al., 2009; Riihinen et al., 2008). Σύμφωνα, με τη Borges και τους συνεργάτες της (2010), έχουν ανιχνευθεί και ακυλιωμένοι γλυκοζίτες της μαλβιδίνης, δελφινιδίνης και πετυνιδίνης. Τέλος, πέρα από τον 3-ακυλιωμένο γλυκοζίτη της μαλβιδίνης, Σ ε λ ί δ α 26

37 Ιανουάριος 2014, Πάτρα ένας ακυλιωμένος γαλακτοζίτης (6 -ακετυλο-μαλβιδινο-3-γαλακτόζη) εντοπίζεται σε δύο ποικιλίες (Toro, Bluecrop) του Vaccinium corymbosum (Gavrilova et al., 2011). Πίνακας 4. Ανθοκυανίνες που ανιχνεύονται στους καρπούς του Vaccinium corymbosum mg/100g νωπού βάρους Ανθοκυανίνες * Wang et al., 2012 Ποικιλίες καλλιεργούμενες σε περιοχή του Νιου Τζέρσεϊ (Η.Π.Α.) Eliott Duke Bluecrop Del-3-Gal 16,2 16,8 5,40 Del-3-Glc 13,9 1,31 1,20 Cy-3-Gal 16,1 10,3 1,59 Del-3-Ara 18,8 8,24 8,61 Cy-3-Glc 7,47 0,33 0,97 Pet-3-Gal 22,5 10,0 12,2 Pet-3-Glc 18,6 15,1 10,9 Pet-3-Ara 29,0 16,0 9,68 Mal-3-Gal 51,1 38,0 48,8 Mal-3-Glc 28,1 8,47 20,1 Mal-3-Ara 19,3 15,5 16,4 * Del: δελφινιδίνη, Cy: Κυανιδίνη, Mal: μαλβιδίνη, Pet: πετουνιδίνη Gal: γαλακτόζη, Glc: γλυκόζη, Ara: αραβινόζη Σ ε λ ί δ α 27

38 Πίνακας 5. Ανθοκυανίνες που ανιχνεύονται στους καρπούς του Vaccinium corymbosum Ανθοκυανίνες * Moze et al., 2011 Ποικιλία καλλιέργειας σε περιοχή της Σλοβενίας mg/100g νωπού βάρους Gavrilova et al., 2011 Ποικιλίες καλλιεργούμενες σε περιοχή της Π.Γ.Δ.Μ. Toro Legacy Duke Bluecrop Del-3-Gal 23,4 ± 1,4 7,68 ± 1,42 11,44 ± 3,70 14,99 ± 3,97 2,29 ± 0,21 Del-3-Glc 15,4 ± 1, ,21 ± 0,10 Cy-3-Gal 4,2 ± 0,4 1,63 ± 0,09 2,29 ± 0,38 2,83 ± 0,60 0,80 ± 0,10 Del-3-Ara 24,6 ± 1,7 3,99 ± 0,72 4,07 ± 1,15 5,10 ± 1,22 1,66 ± 0,10 Cy-3-Glc 2,6 ± 0, ,56 ± 0,04 Pet-3-Gal 11,7 ± 0,8 6,29 ± 1,05 9,42 ± 2,81 11,17 ± 3,78 2,57 ± 0,20 Cy-3-Ara 3,5 ± 0,3 0,84 ± 0,04 0,96 ± 0,12 1,09 ± 0,15 0,42 ± 0,01 Pet-3-Glc 12,4 ± 0,8 0,70 ± 0,16 0,73 ± 0,10 0,67 ± 0,08 1,29 ± 0,10 Peo-3-Gal 1,8 ± 0,1 1,16 ± 0,12 1,37 ± 0,32 1,63 ± 0,47 0,77 ± 0,05 Pet-3-Ara 9,3 ± 0,6 3,19 ± 0,52 3,34 ± 0,95 4,27 ± 1,27 1,82 ± 0,12 Peo-3-Glc 2,1 ± 0, Mal-3-Gal 34,9 ± 3,1 18,88 ± 4,55 24,79 ± 9,90 30,29 ± 13,76 12,11 ± 0,98 Peo-3-Ara 1,0 ± 0, Mal-3-Glc 31,2 ± 3,4 0,68 ± 0,04 1,37 ± 0,37 1,51 ± 0,35 6,03 ± 0,78 Mal-3-Ara 34,7 ± 3,7 8,88 ± 1,91 8,08 ± 3,26 9,41 ± 4,09 6,77 ± 0,70 Peo-3-Pen - 0,68 ± 0,06 0,69 ± 0,15 0,68 ± 0,09 0,52 ± 0,03 Mal-3-(6 -ac)-gal - 1,74 ± 0, ,99 ± 0,08 Mal-3-(6 -ac)-glc ,63 ± 0,03 Mal-3-Xyl ,56 ± 0,05 * Del: δελφινιδίνη, Cy: Κυανιδίνη, Mal: μαλβιδίνη, Peo: πεονιδίνη, Pet: πετουνιδίνη, Gal: γαλακτόζη, Glc: γλυκόζη, Ara: αραβινόζη, Pen: πεντόζη, ac: ακετυλ-, Xy: ξυλόζη Σ ε λ ί δ α 28

39 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Το V. corymbosum περιέχει επίσης και φαινολικά οξέα: χλωρογενικό οξύ, καφεϊκό οξύ, φερουλικό οξύ, p-κουμαρικό οξύ ελλαγικό οξύ και γαλλικό οξύ (Σχήμα 4). Το χλωρογενικό οξύ έχει ήδη αναφερθεί, ως το ποσοτικά επικρατέστερο συστατικό του V. corymbosum. Εκτός από το χλωρογενικό οξύ, όμως, στους καρπούς του έχουν βρεθεί και παράγωγα του οξέος αυτού. Το 2011, η Gavrilova και οι συνεργάτες της ποσοτικοποίησαν για πρώτη φορά δύο ισομερή του μηλονυλο-καφεοϋλο κουινικού οξέος σε σημαντική συγκέντρωση και ένα σε μικρότερη (Σχήμα 16). Συγκεντρωτικά αποτελέσματα των συγκεντρώσεων των φαινολικών οξέων του V. corymbosum για την αναφερόμενη μελέτη αλλά και για μία ακόμη (Moze et al., 2011), στην οποία εξετάσθηκαν καρποί από καλλιέργεια στη Σλοβενία, παρατίθενται στον Πίνακα 6. Πίνακας 6. Φαινολικά οξέα που ανιχνεύονται στους καρπούς τουvaccinium corymbosum στην Ευρώπη Φαινολικά οξέα Moze et al., 2011 Ποικιλία από περιοχή της Σλοβενίας mg/100g νωπού βάρους Gavrilova et al., 2011 (Ποικιλίες καλλιεργούμενες σε περιοχή της Π.Γ.Δ.Μ) Toro Legacy Duke Bluecrop Καφεϊκό οξύ 0,2 ± 0,0 - * - * - * - * Φερουλικό οξύ 2,2 ± 0,2 - * - * - * - * Γαλλικό οξύ 1,8 ± 0,2 - * - * - * - * Ελλαγικό οξύ 0,1 ± 0,0 - * - * - * - * Γλυκοζίτης του καφεϊκού οξέος - 0,19 ± 0,01 0,22 ± 0,03 0,17 ± 0,01 0,21 ± 0,02 Γλυκοζίτης του φερουλικού οξέος - 1,15 ± 0,17 0,91 ± 0,32 0,64 ± 0,26 1,63 ± 0,38 Χλωρογενικό οξύ 70,0 ± 3,4 31,39 ± 5,03 31,61 ± 5,81 24,87 ± 9,07 64,24 ± 8,55 Μηλονυλο-καφεοϋλο-κινικό οξύ - * - 19,20 ± 4, Μηλονυλο- καφεοϋλο-κινικό οξύ - * - 9,32 ± 1, Μηλονυλο-δι- καφεοϋλο-κινικό οξύ - * - 0,76 ± 0, *Συστατικά τα οποία δεν προσδιορίστηκαν στη συγκεκριμένη μελέτη Σ ε λ ί δ α 29

40 Σχήμα 16. Μηλονυλο-καφεοϋλο-κινικό οξύ (πάνω) και μηλονυλο-δι-καφεοϋλο-κινικό οξύ (κάτω) Πίνακας 7. Φαινολικά οξέα που ανιχνεύονται στους καρπούς του V. corymbosum και του V. angustifolium x corymbosum στις Η.Π.Α. Φαινολικά οξέα mg/100g νωπού βάρους Taruscio et al., 2004 (Ποικιλίες καλλιεργούμενες στις Βορειοδυτικές περιοχές των Η.Π.Α.) Vaccinium angustifolium Vaccinium corymbosum x corymbosum Χλωρογενικό οξύ Bluecrop Bluejay Jersey Northblue Northcountry Northsky 157,6 122,6 98,1 130,4 141,7 152,1 Καφεϊκό οξύ 22,3 17,2 15,2 18,6 13,9 14,6 Φερουλικό οξύ 50,5 49,1 32,1 53,5 42,2 52,0 p-κουμαρικό οξύ 0,53 0,34 0,48 0,52 0,30 0,52 p-υδροξυβενζοϊκό οξύ < 0,10 Ενδιαφέρον, επίσης, παρουσιάζει μελέτη (Taruscio et al., 2004) στην οποία συγκρίνονται διάφορα είδη του είδους Vaccinium, μεταξύ των οποίων συμμετέχουν και ποικιλίες του V. corymbosum, αλλά και υδριδίων αυτού (V. angustifolium x corymbosum). Τα είδη αυτά, είναι ποικιλίες καλλιεργούμενες στα βορειοδυτικά των Η.Π.Α. (Πίνακας 7). Αξιοσημείωτες είναι οι διαφορές στην περιεκτικότητα της ίδιας ποικιλίας σε διαφορετικές εδαφοκλιματικές συνθήκες. Η συγκέντρωση του χλωρογενικού οξέος στην ποικιλία Bluecrop των Η.Π.Α., σε σχέση με εκείνη της αντίστοιχης ποικιλίας στη Σλοβενία είναι τριπλάσια (157,6 και 70 mg/100g νωπού βάρους, αντίστοιχα). Βέβαια, τα ανωτέρω πειράματα φαίνεται να αποκλίνουν από εκείνα νεότερης μελέτης του Wang και των συνεργατών του (2012), σύμφωνα με τους οποίους οι Σ ε λ ί δ α 30

41 Ιανουάριος 2014, Πάτρα ποικιλίες Βluecrop, Duke και Eliott, από καλλιέργειες των Η.Π.Α., περιείχαν χλωρογενικό οξύ σε συγκεντρώσεις 10,3, 13,0 και 33,1 mg/ 100g νωπού βάρους, αντίστοιχα. Πολλές ακόμα πολυφαινόλες έχουν ταυτοποιηθεί στον καρπό του V. corymbosum. Φλαβονόλες που έχουν ποσοτικοποιηθεί είναι η κερκετίνη και η μυρικετίνη (Σχήμα 8) καθώς επίσης και γλυκοζίτες αυτών, όπως είναι η ρουτίνη (3-ρουτινοζίτης της κερκετίνης, Que-3- Rut), η ισοκερσιτρίνη (3-γλυκοζίτης της κερκετίνης), ο υπεροζίτης (3-γαλακτοζίτης της κερκετίνης) (Σχήμα 17) και άλλοι (Taruscio et al., 2004, Borges et al., 2010, Gavrlilova et al., 2011, Moze et al., 2011, Dastmalchi et al.,2011, Wang et al., 2012). Ρουτίνη Ισοκερσιτρίνη Υπεροζίτης Σχήμα 17. Δομές φλαβονολών που έχουν εντοπιστεί στους καρπούς του Vaccinium corymbosum Σχήμα γλυκοζίτης της λαρικετρίνης (αριστερά) και 3-γλυκοζίτης της συρινγκετίνης (δεξιά) Στον Πίνακα 8 όπου είναι συγκεντρωμένα τα αποτελέσματα δύο μελετών (Gavrilova et al., 2011, Moze et al., 2011), παρατηρείται πως η κύρια φλαβονόλη στο V. corymbosum είναι η ρουτίνη. Το πιο ενδιαφέρον σημείο της μελέτης της Gavrilova και των συνεργατών της (2011) είναι πως για πρώτη φορά ανίχνευσαν και ποσοτικοποίησαν και στις τέσσερις ποικιλίες του V. corymbosum, δύο ακόμη γλυκοζίτες. Σ ε λ ί δ α 31

42 Πίνακας 8. Φλαβονόλες που ανιχνεύονται στους καρπούς του Vaccinium corymbosum Φλαβονόλες * Moze et al., 2011 Ποικιλία από περιοχή της Σλοβενίας mg/100g νωπού βάρους Gavrilova et al., 2011 (Ποικιλίες καλλιεργούμενες σε περιοχή της Π.Γ.Δ.Μ.) Toro Legacy Duke Bluecrop Que 0,1 ± 0, Que-3-Rut 3,1 ± 0,1-1,58 ± 0,07 0,78 ± 0,34 3,52 ± 1,25 Que-3-Ara - - 0,58 ± 0, Que-3-Glc - 0,91 ± 0,19 1,59 ± 0,02 1,15 ± 0,26 0,97 ± 0,25 Lar-3-Glc - 0,61 ± 0,02 0,63 ± 0,03 0,65 ± 0,05 0,63 ± 0,05 Syr-3-Glc - 0,77 ± 0,05 0,79 ± 0,07 0,83 ± 0,16 0,97 ± 0,12 * Que: κερκετίνη, Lar: λαρικετρίνη, Syr: συρινγκετίνη, Rut: ρουτινόζη, Ara: αραβινόζη, Glc: γλυκόζη Αυτοί είναι ο 3-γλυκοζίτης της λαρικιτρίνης και ο 3-γλυκοζίτης της συρινγκετίνης (Lar-3-Glc και Syr-3-Glc, αντίστοιχα) (Σχήμα 18), οι οποίοι απαντώνται κυρίως στους καρπούς του Vitis vinifera (Castillo-Muñoz N. et al., 2009). O 3-γλυκοζίτης της λαρικετρίνης προκύπτει από μεθυλίωση του μορίου 3-γλυκοζίτης της μυρικετίνης στη θέση 3. Νεότερη μελέτη (Mikulic- Petkovsek et al., 2012) στην οποία εξετάσθηκαν διάφορα είδη μούρων που συλλέχθηκαν από περιοχές της κεντρικής Σλοβενίας, ανάμεσά τους και το καλλιεργούμενο V. corymbosum, στηρίζει την μελέτη των Gavrilova και συνεργατών. Γλυκοζυλιωμένη λαρικετρίνη και συρινγκεντίνη περιέχονται στους καρπούς του φυτού, όχι μόνο με τη μορφή 3-γλυκοζιτών των αντίστοιχων φλαβονολών, αλλά και ως 3-γαλακτοζίτες και μάλιστα οι 3-γαλακτοζίτες αυτών βρίσκονται σε μεγαλύτερη περιεκτικότητα (0,29 και 0,42 mg/100g νωπού βάρους για τους 3-γαλακτοζίτες λαρικετρίνης και συρινγκετίνης, αντίστοιχα, έναντι 0,11 και 0,12 mg/100g νωπού βάρους για τους 3-γλυκοζίτες αυτών). Σύμφωνα και με άλλα δεδομένα της βιβλιογραφίας, υπάρχει αναφορά, για την ύπαρξη και μυρικετίνης στους καρπούς του φυτού σε συγκεντρώσεις 1,01 ως 1,47 mg/100g νωπού βάρους, ανάλογα με την ποικιλία (Taruscio et al., 2004). Ίχνη μυρικετίνης έχουν βρεθεί και σε υβρίδιο του V. corymbosum (Riihinen et al., 2008). Επίσης, ο 3-αραβινοζίτης της μυρικετίνης έχει βρεθεί σε συγκεντρώσεις 0,69 ως 5,03 mg/100g νωπού βάρους, με την ποικιλία Eliott να περιέχει τα υψηλότερα ποσοστά (Wang et al., 2012) (Σχήμα 19). Οι Mikulic-Petkovsek και συνεργάτες (2012) προσδιόρισαν γλυκοζίτες της μυρικετίνης, της ισοραμνετίνης αλλά και της κεμφερόλης σε καλλιεργούμενη στην κεντρική Σλοβενία, ποικιλία. Συγκριτικά, αξίζει να αναφερθεί ότι, κατά σειρά, οι γλυκοζίτες της μυρικετίνης κατείχαν την υψηλότερη συγκέντρωση (2.2 mg/100g ν.β.), ύστερα οι γλυκοζίτες της ισοραμνετίνης (0,95 mg/100g ν.β.) και τέλος οι γλυκοζίτες της κεμφερόλης (0,25 mg/100g ν.β.). Μεταξύ αυτών των φλαβονολών, η συγκέντρωση του 3- γαλακτοζίτη της μυρικετίνης ήταν η υψηλότερη (1,92 mg/100g ν.β.) (Σχήμα 19). Σ ε λ ί δ α 32

43 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Σχήμα αραβινοζίτης της μυρικετίνης (αριστερά) και 3-γαλακτοζίτης της μυρικετίνης (δεξιά) Η (+)-κατεχίνη και η (-)-επικατεχίνη είναι φλαβανόλες που έχουν βρεθεί στους καρπούς του V. corymbosum (Σχήμα 10) (Πίνακας 9). Σύμφωνα με τα δεδομένα που υπάρχουν, φαίνεται πως οι ποικιλίες που καλλιεργούνται στην Αμερική είναι πιο πλούσιες σε φλαβανόλες σε σχέση με εκείνες των δύο χωρών της Κεντρικής Ευρώπης. Υψηλή συγκέντρωση σε φλαβανόλες έχει η ποικιλία Bluecrop, κάτι το οποίο απορρέει και από τις δύο μελέτες που εξέτασαν τη συγκεκριμένη ποικιλία. Φυσικά, υπάρχουν και άλλες πολυφαινόλες όπου έχουν ποσοτικοποιηθεί, όπως είναι οι προανθοκυανιδίνες (προδελφινιδίνες, προκυανιδίνες). Συγκεκριμένα, η προκυανιδίνη Β2 (Σχήμα 13), μία συμπυκνωμένη ταννίνη, η οποία είναι διμερές της επικατεχίνης (( )- επικατεχίνη-(4β 8)-( )-επικατεχίνη), έχει ποσοτικοποιηθεί στους καρπούς του V. corymbosum και συγκεκριμένα στις ποικιλίες Toro, Legacy, Bluecrop με περιεκτικότητα: 1,94, 1,35 και 3,01 mg/100g νωπού βάρους, αντίστοιχα (Gavrilova et al., 2011). Πίνακας 9. Φλαβανόλες που ανιχνεύονται στους καρπούς του Vaccinium corymbosum Φλαβανόλες mg/100g νωπού βάρους (+)-Κατεχίνη (-)-Επικατεχίνη Moze et al., 2011 Ποικιλία από περιοχή της Σλοβενίας 1,8 ± 0,1 0,5 ± 0,01 Gavrilova et al., 2011 (Ποικιλίες από περιοχή της Π.Γ.Δ.Μ.) Taruscio et al., 2004 (Ποικιλίες από περιοχή Β.Δ. των Η.Π.Α.) Toro 1,94 ± 0,99 - Legacy 1,35 ± 0,13 - Duke - - Bluecrop 3,01 ± 0,84 - Bluecrop 5,83 2,26 Bluejay 4,59 2,52 Jersey 0,78 0,05 Σ ε λ ί δ α 33

44 Η trans-ρεσβερατρόλη (Σχήμα 14) που ανήκει στα στιλβένια έχει βρεθεί στους καρπούς του V. corymbosum που έχει καλλιεργηθεί στο Μίσιγκαν, αλλά σε συγκεντρώσεις πολύ μικρότερες από εκείνες των σταφυλιών και των cranberries (Lyons et al., 2003). Επιπρόσθετα, σε νεότερη μελέτη όπου συγκρίθηκαν καλλιέργειες V. corymbosum δύο χωρών τις Αμερικής, του Όρεγκον (δυτική ακτή των Η.Π.Α.) και του Καναδά (βόρεια Αμερική) βρέθηκαν ποσότητες όχι μόνο trans-ρεσβερατρόλης, αλλά και πικεαταννόλης. Η πικεαταννόλη (Σχήμα 20) είναι ένα μόριο που ανήκει και αυτό στα στιλβένια και μοιάζει πολύ με τη trans-ρεσβερατρόλη, αφού η μόνη διαφορά είναι πως η πικεαταννόλη έχει μία επιπλέον ΟΗ ομάδα. Συγκεκριμένα, τα αποτελέσματα έδειξαν πως οι ποικιλίες του Καναδά είχαν μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε trans-ρεσβερατρόλη έναντι εκείνων του Όρεγκον (1074 και 853 ng/g ξηρού βάρους, αντίστοιχα). Η πικεαταννόλη βρέθηκε μόνο στους καρπούς της καλλιέργειας του Όρεγκον. Αυτές οι διαφορές σύμφωνα με τους ερευνητές, σχετίζονται με τον διαφορετικό τρόπο εκχύλισης των καρπών (Rimando et al., 2004). Την παραπάνω μελέτη έρχεται να στηρίξει ακόμα μία, πιο πρόσφατη (Wang et al., 2012), στην οποία γίνεται λόγος για την ύπαρξη ρεσβερατρόλης σε δείγμα των καρπών του V. corymbosum. Τρείς ποικιλίες καλλιέργειας στο Νιού Τζέρσεϊ, ελέγχθηκαν για την φυτοχημική τους σύσταση και στα αποτελέσματα δίδονται ποσότητες ρεσβερατρόλης, πέρα από τα άλλα φλαβονοειδή και φαινολικά οξέα. Η συγκέντρωση της ρεσβερατρόλης αναφέρεται από 0,06 ως 0,93 mg/100g νωπού βάρους και ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα δεν μπορούν να συσχετιστούν με τις άλλες αναφορές. Σχήμα 20. Πικεαταννόλη Σχήμα 21. Ουρσολικό οξύ (αριστερά) και ολεανολικό οξύ (δεξιά) Σ ε λ ί δ α 34

45 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Πέρα από φαινολικές ενώσεις, δηλαδή φλαβονοειδή και φαινολικά οξέα, στους καρπούς του V. corymbosum της ποικιλίας Βluecrop έχουν ανιχνευθεί παράγωγα ισοπρενίων, όπως ουρσολικό οξύ, ολεανολικό οξύ, β-σιτοστερόλη και α- και β-αμυρίνη (Migas et al., 2005). Τα περισσότερα από τα τερπενοειδή έχουν κυκλικές δομές που διαφέρουν μεταξύ τους λόγω των διαφορετικών λειτουργικών ομάδων και του βασικού σκελετού. Ο βασικός σκελετός είναι το ισοπρένιο και ο μοριακός τύπος τους είναι (C 5 H 8 ) n, όπου n ο αριθμός των ισοπρενικών μονάδων. Σχήμα 22 α. α-αμυρίνη (αριστερά) και β-αμυρίνη (δεξιά) Σχήμα 22 β. β-σιτοστερόλη Η ταξινόμησή τους γίνεται σύμφωνα με τον αριθμό των ισοπρενικών μονάδων. Δηλαδή, σε: μόνο-, σέσκι-, δι-, τρι- και τετρα- τερπενοειδή, τα οποία έχουν 2, 3, 4, 6 και 8 μονάδες ισοπρενίου, αντίστοιχα. Το ουρσολικό οξύ, το ολεανολικό οξύ και η α- και β-αμυρίνη (Σχήμα 21, 22 α) είναι παράγωγα των τριτερπενοειδών, ενώ η β-σιτοστερόλη (Σχήμα 22 β) ανήκει στα τριτερπενοειδή στεροειδή Φυτοχημική ανάλυση των φύλλων ειδών Vaccinium Οι καρποί των μούρων, όπως ήδη περιγράφηκε σε προηγούμενη ενότητα, αποτελούν πηγές πλούσιες σε φαινολικές ενώσεις. Τα βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με τη φυτοχημική σύσταση των φύλλων τους είναι περιορισμένα, και έτσι το ενδιαφέρον για πιο αναλυτική διερεύνηση παραμένει ισχυρό (Oszmianski et al., 2011). Τα φύλλα είναι ουσιαστικά βιομηχανικά παραπροϊόντα, άρα η πιθανότητα να αποτελούν πηγή βιοδραστικών φαινολικών ενώσεων, αποτελεί κίνητρο για να διερευνηθεί εκτενέστερα το φυτοχημικό τους περιεχόμενο. Σ ε λ ί δ α 35

46 Όσον αφορά στον χαμηλό θάμνο του V. angustifolium, το 2007, ο Harris και οι συνεργάτες του εξέτασαν το φυτοχημικό περιεχόμενο διάφορων τμημάτων του φυτού, ανάμεσά τους και τα φύλλα. Ανιχνεύθηκαν διάφορες φαινολικές ενώσεις, ανάμεσά τους φαινολικά οξέα και φλαβονοειδή (Πίνακας 10). Συγκεκριμένα, ανιχνεύθηκαν τα υδροξυκιναμμωμικά οξέα: καφεϊκό οξύ, χλωρογενικό οξύ και ένα ισομερές αυτού. Το χλωρογενικό οξύ είναι το κύριο συστατικό των φύλλων του V. angustifolium, με συγκέντρωση 31,19 mg/g ξηρού βάρους. Πίνακας 10. Φαινολικές ενώσεις που ανιχνεύονται στα φύλλα του V. angustifolium Φαινολικές ενώσεις Συγκέντρωση σε mg/g ξηρού βάρους Καφεϊκό οξύ 0,36 ± 0,02 Χλωρογενικό οξύ 31,19 ± 0,55 Ισομερές του Χλωρογενικού οξέος p-κουμαροϋλ-κινικό οξύ (+)-Κατεχίνη 6,16 ± 0,52 (-)-Επικατεχίνη 7,25 ± 0,35 Que-3-Gal * 1,96 ± 0,05 Que-3-Glc * 3,49 ± 0,08 Que-3-Hex * Que-3-Ara * 2,74 ± 0,06 Que-3-Pen * Que-3-Rha * 1,46 ± 0,05 Kae-3-Rut * Que * 1,24 ± 0,04 * : Que: κερκετίνη, Kae: κεμφερόλη, Gal: γαλακτόζη, Glc: γλυκόζη, Hex: εξόζη, Ara: αραβινόζη, Pen: πεντόζη, Rha: ραμνόζη, Rut:ρουτινόζη : Ουσίες που ανιχνεύθηκαν αλλά δεν ποσοτικοποιήθηκαν Δημοσίευση σχετικά με το φαινολικό περιεχόμενο των φύλλων του V. myrtillus (Witzell & Shevtsova, 2004) αναφέρει υψηλή συγκέντρωση χλωρογενικού οξέος. Επίσης, ίχνη ενός υδροξυκινναμωμικού οξέος, του p-κουμαροϋλo-κινικού οξέος έχουν εντοπιστεί στα φύλλα (Σχήμα 23) (Oszmianski et al., 2011). Σ ε λ ί δ α 36

47 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Σχήμα 23. p-κουμαροϋλo-κινικό οξύ Οι φλαβανόλες (+)-κατεχίνη και (-)-επικατεχίνη (Σχήμα 10) ποσοτικοποιήθηκαν και αποτελούν τη δεύτερη, κατά σειρά περιεκτικότητας, ομάδα μετά τα υδροξυκιναμμωμικά οξέα. Επιπρόσθετα, στα φύλλα του φυτού βρέθηκαν ποσότητες διαφόρων γλυκοζυλιωμένων παραγώγων της κερκετίνης καθώς και ίχνη του 3-ρουτινοζίτη της κεμφερόλης, που ανήκουν στις φλαβονόλες (Σχήμα 24). Σχήμα ρουτινοζίτης της κεμφερόλης Περισσότερα είναι τα βιβλιογραφικά δεδομένα για τo είδος V. myrtillus (bilberry). Κυριότερο φαινολικό συστατικό των φύλλων αυτού του είδους, είναι τα υδροξυκινναμωμικά οξέα (35,52% ξ.β.) και συγκεκριμένα το χλωρογενικό οξύ με ποσοστό 35,06% ξ.β. (Oszmianski et al., 2011). Στη συγκεκριμένη έρευνα το σύνολο των φαινολικών ενώσεων υπολογίσθηκε 39,22% ξηρού βάρους. Εκτός του χλωρογενικού οξέος, ποσοτικοποιήθηκε στα φύλλα του Vaccinium myrtillus και ο εστέρας του 3-κουμαροϋλο-κινικού οξέος (0,46% ξ.β.), αλλά και ο 3-γλυκουρονίδιο της κερκετίνης (3,70% ξ.β.) (Σχήμα 25). Το χλωρογενικό οξύ, ο 3- γαλακτοζίτης της κερκετίνης (υπεροζίτης), ο 3-γλυκοζίτης της κερκετίνης (ισοκερσιτρίνη), ο 3- γλυκουρονίτης της κερκετίνης, ο 3-ραμνοζίτης της κερκετίνης (κερσιτρίνη) και ο 3- αραβινοζίτης της κερκετίνης έχουν προσδιοριστεί στα φύλλα του Vaccinium myrtillus (Fraisse et al., 1996). Έρευνες έχουν δείξει διαφορές μεταξύ των φύλλων που ήταν εκτεθειμένα στην ηλιακή ακτινοβολία (πάνω μέρος φυτού) σε σχέση με εκείνα που ήταν σε σκιερό μέρος (κάτω μέρος φυτού). Τα φύλλα εκείνα που είναι εκτεθειμένα στον ήλιο (κόκκινα φύλλα) έχουν Σ ε λ ί δ α 37

48 Σχήμα γλυκουρονίδιο της κερκετίνης υψηλότερη περιεκτικότητα σε ανθοκυανίνες, υδροξυκιναμμωμικά οξέα, κατεχίνες και φλαβονόλες, σε σχέση με εκείνα που δεν ήταν εκτεθειμένα (πράσινα φύλλα) (Εικόνα 8) (Jaakola et al., 2004, Riihinen et al., 2008). Σε αντίθεση, το περιεχόμενο των προκυανιδινών είναι μικρότερο στα κόκκινα φύλλα απ ότι στα πράσινα. Αυτό συμφωνεί με παρατηρήσεις ότι η αύξηση της περιεκτικότητας των ανθοκυανινών και των φλαβονολών λόγω της έκθεσης τους στην ηλιακή ακτινοβολία, λειτουργεί φωτο-προστατευτικά (Jaakola et al., 2004, Riihinen et al., 2008). Όταν αυξάνεται η παραγωγή των ανθοκυανινών (λόγω της έκθεσης στην ηλιακή ακτινοβολία), μειώνεται η λειτουργία των ενζύμων που είναι υπεύθυνα για την δημιουργία προκυανιδινών (αναγωγάση της ανθοκυανιδίνης και αναγωγάση της λευκοανθοκυανιδίνης) και έτσι προκύπτει το συμπέρασμα, πως οι τελευταίες δεν έχουν κάποιο ρόλο στην προστασία των ιστών των φύλλων από την ηλιακή έκθεση (Jaakola et al., 2004). Εικόνα 8. Κόκκινα και πράσινα φύλλα του είδους V. Myrtillus [Πηγή:Jaakola et al., 2004] Στον Πίνακα 11 φαίνονται οι συγκεντρώσεις των ενώσεων που βρέθηκαν σε μελέτη που πραγματοποιήθηκε στα φύλλα του V. myrtillus (Jaakola et al., 2004). Η ποικιλομορφία της φυτοχημικής σύστασης των φύλλων που παρατηρείται μεταξύ των φυτών που βρίσκονται σε ανοιχτές περιοχές (υψηλή ηλιακή έκθεση) και αυτών που βρίσκονται σε δάση (χαμηλή ηλιακή έκθεση), έχει διαπιστωθεί και σε άλλη μελέτη όπου διαπιστώθηκε πως η σύνθεση και η Σ ε λ ί δ α 38

49 Ιανουάριος 2014, Πάτρα συσσώρευση φλαβονοειδών καθυστερεί στα φυτά που φύονται στα δάση (Martz et al., 2010). Πίνακας 11. Φαινολικές ενώσεις που ανιχνεύονται στα φύλλα του Vaccinium myrtillus Φαινολικές ενώσεις Συγκέντρωση σε μg/g Πράσινα φύλλα Κόκκινα φύλλα Ανθοκυανίνες * Cy-3-Glc - 92 ± 4 Cy-3-Gal - 91 ± 1 Cy-3-Ara - 95 ± 3 Cy ± 1 Κατεχίνες (+)-Κατεχίνη 527 ± ± 74 (-)-Επικατεχίνη ± ± 50 Προανθοκυανιδίνες # Προκυανιδίνες 962 ± ± 35 Προδελφινιδίνες 25 ± 0 46 ± 1 Φλαβονόλες # Κερκετίνη ± ± 43 Κεμφερόλη 171 ± ± 6 Υδροξυκινναμωμικά οξέα Παράγωγα p-κουμαρικού οξέος ± ± 167 Παράγωγα καφεϊκού ή φερουλικού οξέος * : Cy: Κυανιδίνη, Gal: γαλακτόζη, Glc: γλυκόζη, Ara: αραβινόζη ± ± 232 # : Οι προανθοκυανιδίνες και οι φλαβονόλες εκφράζονται σε μg κυανιδίνης Σύγκριση των φαινολικών συστατικών που περιέχονται σε διάφορα τμήματα του Vaccinium myrtillus και ενός υβριδίου, του Vaccinium corymbosum x Vaccinium angustifolium έχει γίνει από τον Riihinen και τους συνεργάτες του (2008). Τα αποτελέσματα συμφωνούν με αυτά της μελέτης των Jaakola και συνεργατών. Σχετικά με τα φύλλα, διερευνήθηκε η σύσταση πράσινων και κόκκινων φύλλων. Τα αποτελέσματα είναι ανάλογα και για τα δύο: V. myrtillus και V. corymbosum x V. angustifolium. Κύρια συστατικά των φύλλων (πράσινα και κόκκινα) αποτελούν τα υδροξυκινναμωμικά οξέα: καφεϊκό ή φερουλικό οξύ. Το χλωρογενικό οξύ δεν εντοπίστηκε, πιθανόν, λόγω διάσπασής του (όξινες συνθήκες στην επεξεργασία των φύλλων). Στα κόκκινα φύλλα εντοπίστηκαν ανθοκυανίνες και συγκεκριμένα μόνο η κυανιδίνη και γλυκοζυλιωμένες μορφές αυτής. Αντιθέτως, στα πράσινα δεν έγινε αναφορά σε ανθοκυανίνες. Επίσης, οι φλαβονόλες που εντοπίστηκαν στα φύλλα (πράσινα και κόκκινα) ήταν κερκετίνη και κεμφερόλη και καθόλου μυρικετίνη. Γλυκοζίτες των φλαβονολών και των προανθοκυανιδινών δεν αναφέρθηκαν, διότι κατά την πειραματική επεξεργασία υφίστανται όξινη υδρόλυση και αποδίδουν τα άγλυκα τμήματα (κερκετίνη, κεμφερόλη, κυανιδίνη). Σημαντική διαφορά μεταξύ Σ ε λ ί δ α 39

50 των κόκκινων και πράσινων φύλλων είναι η μεγάλη περιεκτικότητα των πρώτων σε ανθοκυανίνες, φλαβονόλες και υδροξυκινναμωμικά οξέα. Όσο αφορά τις προδελφινιδίνες, τα κόκκινα φύλλα των μύρτιλλων περιέχουν μικρότερες συγκεντρώσεις σε σχέση με αυτές των πράσινων φύλλων. Για το υβρίδιο (V. corymbosum x V. angustifolium) η συγκέντρωση των προκυανιδινών υπολογίσθηκε 272 και 364 μg/g (εκφρασμένα σε ισοδύναμα κυανιδίνης) για τα κόκκινα και τα πράσινα φύλλα, αντίστοιχα (Riihinen et al., 2008). Θεωρείται πως οι μεταβολικές και καταβολικές διεργασίες που αφορούν τις προανθοκυανιδίνες, υπόκεινται σε σύνθετο ρυθμιστικό μηχανισμό (Jaakola et al., 2004). Πίνακας 12. Φαινολικές ενώσεις που ανιχνεύονται στα φύλλα του Vaccinium corymbosum Φαινολικές ενώσεις Bluecrop Northland Φαινολικά οξέα (mg/100g ξ.β.) * 0,481 0,581 Φλαβονοειδή (mg/100g ξ.β.) * 0,123 0,114 Ανθοκυανίνες (mg/100g ξ.β) * # Ταννίνες % 5,2 7,5 # Αιθέρια έλαια % 0,25 0,35 * : mg/100g ξηρού βάρους # : % ξηρό βάρος φύλλων V. corymbosum To 2005, o Migas και οι συνεργάτες του απομόνωσαν από τα φύλλα της ποικιλίας Bluecrop, του Vaccinium corymbosum τριτερπενοειδή παράγωγα, το ουρσολικό οξύ, το ολεανολικό οξύ και την α- και β- αμυρίνη. Με αυτή την ποικιλία του φυτού, αλλά και με τη Northland, μετά από κάποια χρόνια ασχολήθηκε και άλλη μία ομάδα ερευνητών στην Πολωνία (Janiuk et al., 2013). Τα φύλλα της ποικιλίας Northland χαρακτηρίστηκαν από υψηλότερη περιεκτικότητα σε φαινολικά οξέα, ταννίνες και αιθέρια έλαια, ενώ στα φύλλα της ποικιλίας Bluecrop βρέθηκαν υψηλά ποσοστά ανθοκυανινών και φλαβονοειδών (Πίνακας 12). Συγκεκριμένα, στην ποικιλία Bluecrop η περιεκτικότητα σε ανθοκυανίνες υπολογίσθηκε διπλάσια απ ότι στην Northland. Έχει παρατηρηθεί πως τα υδατικά εκχυλίσματα των φύλλων των κυανών μύρτιλλων έχουν υψηλότερο φαινολικό περιεχόμενο απ ότι τα αντίστοιχα εκχυλίσματα των καρπών. Σύμφωνα με τη μελέτη που διεξήχθη από τον Τurhan (2009) η περιεκτικότητα υδατικών αφεψημάτων των φύλλων σε πολυφαινόλες, εκφρασμένη σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος, ήταν 8,6 % w/w ξηρού βάρους, ενώ των καρπών 2,3 % w/w ξηρού βάρους. Σ ε λ ί δ α 40

51 Ιανουάριος 2014, Πάτρα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ο 3.1. Τα οφέλη στην υγεία από την κατανάλωση των μούρων Τα τελευταία χρόνια πραγματοποιούνται ολοένα και περισσότερες μελέτες σχετικά με τον χαρακτηρισμό και την αξιοποίηση βιοδραστικών ενώσεων που βρίσκονται στα τρόφιμα, όπως είναι τα μούρα (Σχήμα 23.). Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (World Health Organization, WHO) τονίζει τη σημασία των βιοδραστικών ενώσεων, ειδικά εκείνων που βρίσκονται στα μικρά πολύχρωμα φρούτα για την πρόληψη των σημαντικότερων προβλημάτων υγείας, όπως είναι τα καρδιαγγειακά νοσήματα, ο καρκίνος, η παχυσαρκία και ο διαβήτης (Stapleton et al., 2008). Πρόληψη της οξείδωσης των λιπιδίων Επαγωγή ενδογενών αντιοξειδωτικών ενζύμων Ρύθμιση της μεταγωγής σήματος ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΩΝ ΜΟΥΡΩΝ Επίδραση στον κυτταρικό κύκλο Αναστολή των οξειδωτικών διαδικασιών Ενδοκυτταρική επικοινωνία Σάρωση ελευθέρων ριζών Σχήμα 26. Οι ευεργετικές δράσεις των συστατικών των μούρων στον ανθρώπινο οργανισμό (τροποποιημένο σχήμα από Jimenez-Garcia et al., 2012) Η βιοδραστικότητα των ενώσεων εξαρτάται από τη συγκέντρωση του συγκεκριμένου συστατικού στη θέση στόχο. Η απορρόφηση καθορίζει τη βιοδιαθεσιμότητα της ένωσης, η οποία επηρεάζεται από το βαθμό στον οποίο η ένωση φτάνει στο κυκλοφορικό σύστημα και είναι διαθέσιμη στην περιοχή της δράσης καθώς και από την κατανομή της ένωσης στους ιστούς και τα όργανα με τά την απορρόφηση. Η απορρόφηση των φαινολικών ενώσεων, όπως είναι τα φλαβονοειδή, είναι ελάχιστη, εξαιτίας της ύπαρξης της πλειοψηφίας των φλαβονοειδών σε γλυκοζιτική μορφή (Jimenez-Garcia et al., 2012) Bιολογικές ιδιότητες του γένους Vaccinium Τα οφέλη των φυτοχημικών ενώσεων των κυανών μύρτιλλων στην υγεία είναι πολλαπλά. Όλες οι μελέτες, σχετικά με τις δράσεις των μούρων, οδηγούν στο συμπέρασμα ότι ο καθορισμός των συστατικών που ευθύνονται για κάθε μία δράση θεωρείται αρκετά δύσκολος. Τα παρατηρούμενα οφέλη προκύπτουν από διατροφικές, επιδημιολογικές ή παρεμβατικές Σ ε λ ί δ α 41

52 μελέτες. εφόσον. Το γεγονός αυτό δυσχεραίνει τις μελέτες που σκοπό έχουν την ανακάλυψη ενώσεων που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στη θεραπευτική. Οι περισσότερες από τις μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί in vitro, και στις περισσότερες περιπτώσεις δεν είναι γνωστό αν οι συγκεντρώσεις στις οποίες παρατηρούνται οι προαναφερθείσες δράσεις είναι επιτεύξιμες στον άνθρωπο. Καθώς πολύ λίγες φαρμακοκινητικές μελέτες πραγματοποιούνται, κανείς δεν γνωρίζει αν τα μελετώμενα φαινολικά συστατικά φθάνουν στο υποτιθέμενο σημείο δράσης στην αρχική τους δομή και σε ικανοποιητικές συγκεντρώσεις. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο τόσα λίγα φάρμακα βασιζόμενα σε φαινολικά συστατικά χρησιμοποιούνται στην θεραπευτική. Μελλοντικές έρευνες απαιτούνται σχετικά με τις βιοδραστικές ουσίες των κυανών μύρτιλλων και σχετικά με το κατά πόσο οι μεταβολίτες που σχηματίζονται in vivo, συσσωρεύονται μέσα στους ιστούς-στόχους και ασκούν βιολογικές επιπτώσεις σε αυτούς. Στα επόμενα εδάφια αναπτύσσονται συνοπτικά οι κυριότερες βιολογικές δράσεις των μούρων: α) αντιοξειδωτική δράση, β) αντιμικροβιακή δράση, γ) κυτταροτοξική δράση, δ) αντιφλεγμονώδης και αναλγητική δράση και ε) αντιδιαβητική δράση Αντιοξειδωτική δράση Οι δραστικές μορφές οξυγόνου και οι ελεύθερες ρίζες παράγονται σε ένα ευρύ φάσμα των φυσιολογικών διεργασιών. Το οξειδωτικό στρες είναι μία ανισορροπία μεταξύ της παραγωγής των δραστικών μορφών οξυγόνου και της αντιοξειδωτικής άμυνας του οργανισμού, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε οξειδωτική βλάβη. Αυτή η βιολογική κατάσταση μπορεί να προκύψει από την ανεπάρκεια των αντιοξειδωτικών μηχανισμών άμυνας, της έντονης παραγωγής των δραστικών μορφών οξυγόνου και εμπλέκεται στη γήρανση και στην παθολογία πολλών χρόνιων παθήσεων, όπως είναι ο καρκίνος, οι καρδιαγγειακές παθήσεις, οι φλεγμονές, ο διαβήτης, η νόσος του Πάρκινσον, η νόσος του Αλτσχάιμερ. Πέρα από τους μη-ενζυμικούς και ενζυμικούς μηχανισμούς που παρέχονται από το σώμα (ενδογενείς μηχανισμοί), υπάρχουν και άλλοι παράγοντες που προέρχονται από τη διατροφή (εξωγενείς παράγοντες) και ενεργοποιούνται φυσιολογικά για τη διατήρηση της οξειδοαναγωγικής ισορροπίας (Paredes- López et al., 2010, Jimenez-Garcia et al., 2012). Τα εξωγενή αντιοξειδωτικά περιλαμβάνουν φαινολικά οξέα, φλαβονοειδή, στιλβένια και ταννίνες. Αυτές οι φαινολικές ενώσεις παρουσιάζουν πολλούς σημαντικούς μηχανισμούς δράσης, όπως είναι η απομάκρυνση και η αποτοξίνωση των δραστικών μορφών οξυγόνου, και η παρεμπόδιση παραγωγής αυτών, επηρεάζοντας έτσι τον κυτταρικό κύκλο, την καταστολή των όγκων, τη ρύθμιση μεταγωγής σήματος, την απόπτωση και το μεταβολισμό. Η αντιοξειδωτική δράση των συστατικών των μούρων έχει μελετηθεί χρησιμοποιώντας in vitro δοκιμασίες, μετρώντας την ικανότητά τους να μειώνουν και να παγιδεύουν τις ελεύθερες Σ ε λ ί δ α 42

53 Ιανουάριος 2014, Πάτρα ρίζες. Συγκεκριμένα, τα κυανά μύρτιλλα είναι μία από τις κυριότερες πηγές συστατικών με υψηλή αντιοξειδωτική ικανότητα. Σε μελέτη όπου συγκρίθηκε η αντιοξειδωτική ικανότητα διαφόρων καλλιεργούμενων ποικιλιών του Vaccinium corymbosum με το Vaccinium myrtillus, ξεχωριστά στο εσωτερικό και εξωτερικό τμήμα των καρπών, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι φλοιοί των καρπών διακρίνονται από την ισχυρότερη αντιοξειδωτική δράση. Αυτό πιθανόν να οφείλεται στην υψηλότερη περιεκτικότητα σε ανθοκυανίνες και φαινολικές ενώσεις (Burdulis et al., 2009). Την υψηλότερη αντιοξειδωτική ικανότητα, μεταξύ των καρπών, είχε η ποικιλία Berkeley του V. corymbosum,ενώ μεταξύ των εξωτερικών τμημάτων η ποικιλία Ama. Το V. myrtillus έδειξε μικρότερη αντιοξειδωτική δράση. Σε άλλη μελέτη, στην οποία αξιολογείται η αντιοξειδωτική ικανότητα τριάντα έξι ποικιλιών Rabbiteye (Vaccinium ashei Reade), τριών υβριδίων του V. ashei και τριών V. corymbosum έναντι των ελευθέρων ριζών, οι διαφορές είναι σημαντικές (Wang a et al., 2011). Τα αποτελέσματα έδειξαν πως οι ποικιλίες του είδους Rabbiteye ( Early May, Centurion, Bluegem, Clara, Owen, Climax, Aliceblue, Myers και Baldwin ) είχαν υψηλότερη αντιοξειδωτική ικανότητα σε σύγκριση με τα υβρίδια και τις τρεις ποικιλίες V. corymbosum. Μεταξύ των ποικιλιών των ψηλών θάμνων του βορρά ( Elliott, Bluecrop και Duke ), η Elliott έδειξε την καλύτερη αντιοξειδωτική δράση. Το 2001, οι Ehlenfeldt και Prior διερεύνησαν την αντιοξειδωτική δράση, μέσω της ικανότητας σάρωσης ριζών οξυγόνου, των καρπών και των φύλλων αρκετών ποικιλιών του V. corymbosum. Ενδιαφέρον αποτέλεσμα της μελέτης ήταν ότι τα εκχυλίσματα των φύλλων παρουσιάζουν αρκετά μεγαλύτερη ικανότητα σάρωσης των ριζών οξυγόνου σε σχέση με αυτά των καρπών. Η αντιοξειδωτική ικανότητα και το φαινολικό περιεχόμενο των αφεψημάτων φύλλων που παρασκευάστηκαν από έξι καλλιεργούμενες ποικιλίες V. corymbosum (Jersey, Bluetta, Bluecrop, Berkeley, Burlington και Coville), από το V. myrtillus και από ένα εμπορικά διαθέσιμο μίγμα των γονότυπων εξετάσθηκαν από ομάδα ερευνητών στην Κροατία (Piljiac-Zegarac et al., 2009). Η δυναμική της εκχύλισης αντιοξειδωτικών πολυφαινολών εξετάσθηκε για διάρκεια 30 λεπτών. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, τα αφεψήματα που παρασκευάσθηκαν (χρόνος εκχύλισης: 30 λεπτά) κατατάσσουν τα φύλλα των κυανών μύρτιλλων σε υψηλή θέση στον κατάλογο των διατροφικών πηγών αντιοξειδωτικών. Συγκεκριμένα, τα αφεψήματα των ποικιλιών Berkeley, Burlington, καθώς και του V. myrtillus έδειξαν ότι: α) δεσμεύουν σημαντικά τις ελεύθερες ρίζες και β) έχουν πλούσιο φαινολικό περιεχόμενο, σε σχέση με τα υπόλοιπα αφεψήματα. Την αντιοξειδωτική ικανότητα υδραλκοολικών εκχυλισμάτων των φύλλων Vaccinium corymbosum εξέτασαν πρόσφατα οι Pervin και συνεργάτες (2013). Η αντιοξειδωτική ικανότητα των φύλλων διερευνήθηκε μέσω διαφόρων in vitro δοκιμασιών: α) ικανότητα σάρωσης ριζών (DPPH, ABTS), β) ικανότητα σχηματισμού χηλικών συμπλόκων, γ) η Σ ε λ ί δ α 43

54 οξειδωαναγωγική δύναμη, δ) η αναστολή της λιπιδικής υπεροξείδωσης, ε) η αύξηση των αντιοξειδωτικών ενζύμων και στ) η ικανότητα πρόληψης της οξειδωτικής καταστροφής του DNA. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως η χορήγηση του αφεψήματος των φύλλων του V. corymbosum μπορεί να ενισχύσει την δράση των αντιοξειδωτικών ενζύμων (δισμουτάση του σουπεροξειδίου, καταλάση και υπεροξειδάση της γλουταθειόνης) στο κυτταρικό σύστημα. Η αντιοξειδωτική ικανότητα του αφεψήματος πιθανόν σχετίζεται με το φαινολικό περιεχόμενο αλλά, περισσότερη έρευνα χρειάζεται για τον προδιορισμό των συγκεκριμένων βιοδραστικών ενώσεων (Pervin et al., 2013). Σε μία τυχαιοποιημένη μελέτη, όπου συμμετείχαν δέκα υγιείς άντρες διερευνήθηκε η ικανότητα των καρπών του V. corymbosum να αναστέλλουν την εξωγενή και ενδογενή οξειδωτική κατστροφή του DNA μονοπύρηνων κυττάρων. Από τα αποτελέσματα φάνηκε πως η κατανάλωση μίας δόσης του V. corymbosum (300 g) μπορεί να προστατεύσει το DNA των κυττάρων, έναντι της εξωγενούς οξειδωτικής καταστροφής, όπως αποδείχθηκε με τη χρήση της μεθόδου επαγωγής οξειδωτικού στρες μέσω της ρίζας του υπεροξειδίου του υδρογόνου (H 2 O 2 ). Η προστατευτική δράση του, σε αντίθεση με το εικονικό φάρμακο, ήταν στατιστικώς σημαντική μία ώρα μετά την κατανάλωση, αλλά όχι μετά τις δύο ώρες, γεγονός που πιθανόν να οφείλεται στην μεμονωμένη ή συνεργιστική δράση των συστατικών των καρπών (Del Bo et al., 2013) Αντιμικροβιακή δράση Η αντιμικροβιακή δράση των συστατικών των μούρων, ειδικά των φλαβονοειδών, μελλοντικά μπορεί να τους προσδώσει σημαντικές εφαρμογές, ως φυσικοί αντιμικροβιακοί παράγοντες στη βιομηχανία τροφίμων καθώς και στο πεδίο της ιατρικής. Ιδιαίτερη αντιμικροβιακή δράση έχουν διάφορες φαινολικές ενώσεις των μούρων (cranberry, bilberry, φράουλες, σμέουρα) έναντι της σαλμονέλας και του σταφυλοκόκκου (Burdulis et al., 2009). Τα εκχυλίσματα των καρπών των καλλιεργούμενων ποικιλιών Vaccinium corymbosum Herbert, Coville και Toro έχουν αντιμικροβιακές ιδιότητες. Το Citrobacter freundii (ATCC 8090) και το Enterococcus faecalis (ATCC29212) ήταν τα πιο ευαίσθητα μεταξύ των οκτώ Gram θετικών και Gram αρνητικών βακτηρίων όπου εξετάσθηκαν, ενώ τα οκτώ είδη ζυμομυκήτων έδειξαν αντοχή στα εκχυλίσματα των κυανών μύρτιλλων. Ο μεγάλος αριθμός των ζυμομυκήτων στα φυτά και τα μούρα, ίσως αιτιολογεί την μεγάλη αντοχή τους (Burdulis et al., 2009). Αιθανολικά εκχυλίσματα (75:25 αιθανόλη:νερό v/v) τεσσάρων ποικιλιών του Vaccinium corymbosum ( Elliott, Darrow, Bluecrop, και Duke ), έδειξαν να έχουν δοσοεξαρτώμενη παρεμποδιστική δράση έναντι των καλλιεργειών Listeria monocytogenes and Salmonella enteritidis (Shen et al., 2014). Η λιστέρια (L. monocytogenes) παρουσίασε σημαντική ευαισθησία στην αντιμικροβιακή δράση των τεσσάρων εκχυλισμάτων (συγκέντρωσης 900 mg/ml) σε σχέση με τη σαλμονέλα (Salmonella enteritidis). Μεταξύ των ποικιλιών, η Elliott ήταν η πιο δραστική έναντι των παθογόνων βακτηρίων. Το συνολικό φαινολικό περιεχόμενο Σ ε λ ί δ α 44

55 Ιανουάριος 2014, Πάτρα της ποικιλίας αυτής, μετρήθηκε ως το υψηλότερο ανάμεσα στα εκχυλίσματα και μάλιστα το υψηλότερο μεταξύ άλλων ποικιλιών Elliott που καλλιεργούνται σε άλλες χώρες. Οι ίδιοι ερευνητές εξέτασαν κάποια απομονωμένα συστατικά (κερκετίνη, 3-γαλακτοζίτης της κερκετίνης, ελλαγικό οξύ και χλωρογενικό οξύ) από τα εκχυλίσματα και κατέληξαν ότι η κερκετίνη, ο 3-γαλακτοζίτης της κερκετίνης και το ελλαγικό οξύ σε συγκέντρωση 200 μg/ml ήταν πολύ δραστικά έναντι των δύο βακτηρίων. Η αντιμικροβιακή δράση αιθανολικού εκχυλίσματος (75:25 αιθανόλη:νερό v/v) φύλλων του V. corymbosum, έναντι επτά ειδών βακτηρίων, έχει επίσης αξιολογηθεί (Pervin et al., 2013). Όλα τα βακτήρια έδειξαν μεγάλη ευαισθησία στο εκχύλισμα των φύλλων, με αποτέλεσμα τα φύλλα να αποτελούν μία πολύ σημαντική πηγή αντιμικροβιακών ενώσεων, η οποία θα μπορούσε μελλοντικά να αντικαταστήσει συνθετικούς αντιμικροβιακούς παράγοντες, ορισμένων προϊόντων Κυτταροτοξική δράση Έχει αποδειχθεί πως η κατανάλωση πλούσιων σε αντιοξειδωτικά φρούτων και λαχανικών, μειώνει σημαντικά τον κίνδυνο εμφάνισης πολλών μορφών καρκίνου. Κατά συνέπεια ο προσδιορισμός τέτοιων ενώσεων, αποτελεί μεγάλο μέρος της πειραματικής έρευνας για τον καρκίνο (Dai & Mumper, 2010). Υπάρχουν αρκετές in vitro αναφορές σχετικά με τα βιοδραστικά συστατικά των κυανών μύρτιλλων, τα οποία βοηθούν στην πρόληψη αρκετών μορφών καρκίνου όπως είναι ο καρκίνος του μαστού, του παχέος εντέρου, του οισοφάγου, του ήπατος, των ωοθηκών και του προστάτη (Samuel-Peterson, 2013). Οι καρποί των μούρων έχει δειχθεί να αναστέλλουν τις δραστηριότητες των ενζύμων, τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στη μετάσταση του καρκίνου, όπως είναι οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs). Σε μελέτη του 2005 (Matchett et al.) σημειώθηκε η ικανότητα των φλαβονοειδών του V. angustifolium να μειώνουν σημαντικά τη δράση των ΜΜPs στην κυτταρική σειρά DU145, καρκινικών κυττάρων προστάτη ανθρώπου. Η μείωση των MMPs από το εμπλουτισμένο με προανθοκυανιδίνες κλάσμα, ήταν υψηλότερη σε σχέση με το εμπλουτισμένο με ανθοκυανίνες κλάσμα και με το αρχικό κλάσμα. Σε άλλη μελέτη (Zu et al., 2010) αποδεικνύεται πως οι ανθοκυανίνες του V. uliginosum, έδειξαν κυτταροτοξική δράση στις κυτταρικές σειρές DLD-1 και COLO205, καρκινικών -από άνθρωπο- κυττάρων του παχέος εντέρου και ορθοκολικού, επάγοντας τον αποπτωτικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων. Η in vitro κυτταροτοξική δράση έχει εξετασθεί σε τρία διαφορετικά εκχυλίσματα φύλλων: Fragaria x ananassa, Rubus Ideus και V. corymbosum. Από την παραπάνω μελέτη δείχθηκε πως το εκχύλισμα φύλλων του V. corymbosum ήταν σχεδόν δύο φορές πιο δραστικό, σε σχέση με τα άλλα δύο εκχυλίσματα, έναντι της προμυελοκυτταρικής σειράς HL60 (Skupien et al., 2006). Σε άλλη έρευνα των Bunea και συνεργατών (2013) ταυτοποιήθηκαν οι ανθοκυανίνες που περιέχονται σε εκχυλίσματα των καρπών του V. corymbosum (Bluegold, Nui, Darrow, Legacy, Nelson, Hannah s Choice, Toro) και αξιολογήθηκε η δράση τους έναντι Σ ε λ ί δ α 45

56 των Β16-F10 μεταστατικών κυττάρων μελανώματος από επίμυες. Την υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση είχε η ποικιλία Toro, αποτέλεσμα το οποίο συνάδει με την υψηλότερη συγκέντρωση σε ανθοκυανίνες της ποικιλίας αυτής. Οι ανθοκυανίνες σχετίζονται, πιθανόν, με την αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του μελανώματος και την επαγωγή της απόπτωσης που έδειξε να έχει η ποικιλία Τoro Αντιφλεγμονώδης και αναλγητική δράση Υδραλκοολικά εκχυλίσματα του V. corymbosum έχουν δείξει αντιφλεγμονώδη και αναλγητική δράση σε in vivo πείραμα σε επίμυες, στους οποίους χορηγήθηκε ένωση (ισταμίνη, καραγενάνη) που προκάλεσε οίδημα στο πέλμα. Αυτές οι δράσεις είναι πολύ σημαντικές για τη θεραπεία φλεγμονωδών διαταραχών (Torri et al.,2007) Αντιδιαβητική δράση Διάφορα είδη του γένους Vaccinium, συμπεριλαμβανομένων του V. myrtillus (bilberry) και του V. macrocarpon Ait. (cranberry) φημίζονται για τις αντιδιαβητικές τους ιδιότητες και για τη χρήση τους ως παραδοσιακά φάρμακα για τη θεραπεία των διαβητικών συμπτωμάτων. Επίσης, το V. angustifolium Ait. συνίσταται ως αντιδιαβητικό φυτό, στο Κεμπέκ, από παραδοσιακούς πρακτικούς, όπως και το μοσχοσίταρο. Ο σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2 ή μη ινσουλινοεξαρτώμενος διαβήτης είναι μια χρόνια μεταβολική διαταραχή που σχετίζεται με τη μειωμένη έκκριση ινσουλίνης και τη μειωμένη ευαισθησία των κυττάρων στη δράση της (ινσουλινοαντοχή), οι οποίες οδηγούν σε χρόνια υπεργλυκαιμία, αύξηση του οξειδωτικού στρες και γλυκοζυλίωσης της αιμογλοβίνης (HB A1c), που προκαλείται με μη ενζυμικό τρόπο. Μια in vitro μελέτη αποκάλυψε πως τα αιθανολικά εκχυλίσματα διαφόρων τμημάτων του V. angustifolium (φύλλα, καρποί, ρίζες, στελέχη) αυξάνουν τον πολλαπλασιασμό των β TC-tet κυττάρων του παγκρέατος και προστατεύουν τα κύτταρα έναντι της τοξικότητας της γλυκόζης (Martineau et al., 2006). Τόσο το υδατικό όσο και το αιθανολικό εκχύλισμα φύλλων του V. bracteatum Thunb έχουν δείξει υπογλυκαιμική δράση σε in vivo μελέτη σε διαβητικούς μύες (επαγόμενος από στρεπτοζοτοκίνη διαβήτης), βελτιώνοντας το βάρος του σώματος των μυών αλλά και τα επίπεδα της γλυκόζης, της ινσουλίνης, και των λιπιδίων στο πλάσμα (Wang b et al., 2010). Αυξημένη έκκριση ινσουλίνης παρατηρήθηκε σε παγκρεατικά και καρδιακά κύτταρα διαβητικών επίμυων Wistar. Τα συγκεκριμένα κύτταρα απομονώθηκαν από τους διαβητικούς μύες, οι οποίοι υπέστησαν αγωγή με εκχύλισμα V. Arctostaphylos. Επίσης, στην ίδια μελέτη, η από του στόματος χορήγηση του αιθανολικού εκχυλίσματος, αύξησε τη συγκέντρωση της καταλάσης, της σουπεροξειδικής δισμουτάσης και της υπεροξειδάσης της Σ ε λ ί δ α 46

57 Ιανουάριος 2014, Πάτρα γλουταθειόνης στα ερυθρά αιμοσφαίρια των επίμυων, συμβάλλοντας στην μείωση του οξειδωτικού στρες (Feshani et al., 2011). Το εμπλουτισμένο με ανθοκυανίνες κλάσμα, σε in vivo μελέτη σε C57B6 διαβητικούς μύες, παρουσίασε μεγαλύτερη υπογλυκαιμική δράση (51% μείωση των επιπέδων γλυκόζης στο αίμα) σε σύγκριση με εκχύλισμα πλούσιο σε φαινολικές ενώσεις (33% μείωση των επιπέδων γλυκόζης στο αίμα) (Grace et al., 2009). Σε άλλη μελέτη όπου συμμετείχαν αρσενικοί C57BL/6J μύες δείχθηκε αυξημένη λειτουργία των β-κυττάρων, μετά από 75 ημέρες κατανάλωσης νερού, που ήταν εμπλουτισμένο με ανθοκυανίνες μύρτιλλων (0,2 mg/ml) (Prior et αl., 2010). Σε μία διπλά τυφλή, ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο και τυχαιοποιημένη μελέτη, όπου συμμετείχαν τριάντα δύο γυναίκες και άντρες, διερευνήθηκε η αντιδιαβητική ικανότητα σκόνης αποξηραμένων κυανών μύρτιλλων δύο ποικιλιών (Tifblue -V. ashei και Rubel -V. corymbosum, 50:50) που δόθηκε σε μορφή φρουτοχυμού (Stull et al., 2010). Τα αποτελέσματα έδειξαν πως οι βιοδραστικές ενώσεις των κυανών μύρτιλλων ενίσχυσαν την ευαισθησία στην ινσουλίνη χωρίς σημαντικές αλλαγές στην παχυσαρκία, στην πρόσληψη ενέργειας, και σε φλεγμονώδεις βιοδείκτες. Η % μεταβολή της ευαισθησίας στην ινσουλίνη ήταν μεγαλύτερη στην ομάδα των ανθρώπων που έλαβαν το φρουτοχυμό των κυανών μύρτιλλων, από ό, τι στην ομάδα που έλαβε το εικονικό φάρμακο. Σ ε λ ί δ α 47

58 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Σ ε λ ί δ α 48

59 Ιανουάριος 2014, Πάτρα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο Τα εκχυλίσματα των φύλλων κερδίζουν ολοένα μεγαλύτερη σημασία ως πηγές πλούσιες σε φυτοχημικές ενώσεις, αποκτώντας ιδιαίτερη σημασία στην ανάπτυξη βιολειτουργικών τροφίμων, συμπληρωμάτων διατροφής και φυτικών φαρμακευτικών προϊόντων. Οι καρποί των μύρτιλλων είναι πλούσια πηγή πολυφαινολικών ενώσεων. Η δυνατότητα παραπροϊόντων, όπως είναι τα φύλλα των μύρτιλλων, να αποτελέσουν πηγή πολύτιμων βιοδραστικών ενώσεων, είναι ιδιαίτερα ελκυστική στη βιομηχανία τροφίμων και φαρμάκων και χρήζει μελέτης. Πολλές είναι οι αναφορές σχετικά με τις βιολογικές δράσεις των καρπών των κυανών μύρτιλλων, συμπεριλαμβανομένης της αντιοξειδωτικής ικανότητας, της κυτταροτοξικής δράσης, της αντιδιαβητικής ικανότητας και άλλων. Τα φύλλα των κυανών μύρτιλλων έχουν χρησιμοποιηθεί, παραδοσιακά, με τη μορφή αφεψήματος για τη θεραπεία του διαβήτη. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι τα φύλλα των μύρτιλλων έχουν ισχυρή αντιοξειδωτική, αντιδιαβητική, αλλά και αντιλευχαιμική δράση. Ωστόσο, η φυτοχημική σύσταση των φύλλων δεν έχει ακόμα διευκρινιστεί εκτενώς. Ο σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής είναι η ανάλυση των κυριότερων φαινολικών συστατικών των φύλλων Vaccinium corymbosum ελληνικής βιολογικής καλλιέργειας, με χρωματογραφικές τεχνικές ανάλυσης, όπως είναι η Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης σε σύζευξη με Ανιχνευτή Συστοιχίας Φωτοδιόδων (HPLC-DAD) και η Υγρή Χρωματογραφία Υπερυψηλής Απόδοσης συνδεδεμένη με Φασματόμετρο Μάζας (UPLC-MS). Για την εκχύλιση των αποξηραμένων φύλλων μύρτιλλων ακολουθήθηκε η εκχύλιση με θερμό νερό, χημική διεργασία κατά την οποία τα συστατικά μεταφέρονται από την φυτική πρώτη ύλη στην υγρή φάση, και είναι κοινή και διαδεδομένη πρακτική στην παραδοσιακή θεραπευτική (αφέψημα). Η κλασμάτωση των συστατικών του αφεψήματος των φύλλων πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της εκχύλισης υγρού υγρού. Η μέθοδος αυτή, η οποία βασίζεται στην κατανομή μιας διαλυμένης ένωσης μεταξύ δύο πρακτικά μη αναμιγνυόμενων υγρών, είναι εύκολη και αποδοτική. Η αναλυτική τεχνική HPLC-DAD, με χρήση στήλης αντίστροφης φάσης (Luna C-18), αποτελεί μία αρκετά δυναμική χρωματογραφική τεχνική διαχωρισμού. Η υψηλή ευαισθησία, η επαναληψιμότητα, η διαχωριστική ικανότητα και φυσικά η δυνατότητα ποιοτικού και ποσοτικού προσδιορισμού είναι κάποιοι από τους λόγους στους οποίους οφείλεται η ευρεία εφαρμογή της. Η εξαιρετικά ευαίσθητη αναλυτική τεχνική MS, συζευγμένη με UPLC, λόγω της υψηλής ακρίβειας προσδιορισμού μάζας, της επαναληψιμότητας, αλλά και της υψηλής διαχωριστικής ικανότητας του υβριδικού αναλυτή μάζας τετραπόλου χρόνου πτήσης (Q-TOF), χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των φαινολικών συστατικών του ολικού εκχυλίσματος Σ ε λ ί δ α 49

60 των φύλλων (Crude) και των κλασμάτων (AcOEt, BuOH, Aqueous). Η μέθοδος της όξινης υδρόλυσης είναι μία από τις πιο διαδεδομένες τεχνικές, οι οποίες χρησιμοποιούνται για την απελευθέρωση του άγλυκου τμήματος από τα φαινολικά συστατικά φυτικών εκχυλισμάτων. Τέτοιες ενώσεις, συνήθως βρίσκονται σε γλυκοζυλιωμένη μορφή (γλυκοζιτικοί δεσμοί) ή φέρουν εστερικούς δεσμούς. Η όξινη υδρόλυση χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό τέτοιων ενώσεων. Συνοπτικά, στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή χρησιμοποιήθηκαν αναλυτικές τεχνικές με σκοπό τον χρωματογραφικό διαχωρισμό των φαινολικών συστατικών που περιέχονται στο ολικό υδατικό εκχύλισμα των φύλλων Vaccinium corymbosum, αλλά και στα κλάσματα που προέκυψαν από την κλασμάτωση αυτού με οργανικούς διαλύτες. Κατόπιν, πέρα από το διαχωρισμό των περιεχόμενων φαινολικών συστατικών πραγματοποιήθηκε και ποσοτικός προσδιορισμός των κυριότερων από αυτά σε κάθε δείγμα. Σ ε λ ί δ α 50

61 Ιανουάριος 2014, Πάτρα ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σ ε λ ί δ α 51

62 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο 5.1. Υλικά, αντιδραστήρια και όργανα Φυτικό υλικό Στην πειραματική διαδικασία χρησιμοποιήθηκαν τα αποξηραμένα φύλλα του Vaccinium corymbosum, τα οποία ήταν μια ευγενική χορηγία από τον παραγωγό και βιοκαλλιεργητή στο Νομό Δράμας, κ. Νικόλαο Παπουτσή. Συγκεκριμένα τα φύλλα ήταν από τις ποικιλίες Bluecrop και Patriot του καλλιεργούμενου θάμνου. Οι ποικιλίες αυτές του V. corymbosum, αναπτύσσονται στις βιολογικές καλλιέργειες των αγροτικών περιοχών Καλαμπάκι και Κουδούνια του Νομού Δράμας. Η συλλογή έγινε κατά το στάδιο ωρίμανσης του φυτού (έτος 2011) και η τυποποίηση των φύλλων V. corymbosum έγινε κατά το ίδιο έτος, από τον Συνεταιρισμό Βιοκαλλιεργητών του Νομού Δράμας με διακριτικό τίτλο Βιοδράμα (Εικόνα 9). Εικόνα 9. Τα αποξηραμένα φύλλα Vaccinium corymbosum (εμπορικά διαθέσιμα από τη Βιοδράμα ) Χημικά αντιδραστήρια και διαλύτες Η μεθανόλη [CH 3 OH], καθαρότητας αναλυτικού βαθμού, ήταν από την εταιρεία Merck (Γερμανία). Ο οξικός αιθυλεστέρας [CH 3 COOCH 2 CH 3 ], καθαρότητας αναλυτικού βαθμού (>99,5%), ήταν από την εταιρεία Poch (Πολωνία). Η βουτανόλη [C 4 H 10 O], καθαρότητας αναλυτικού βαθμού (>99,5%), ήταν από την εταιρεία Carlo Erba - SDS (Γαλλία). Η μεθανόλη [CH 3 OH] και το ακετονιτρίλιο [AcCN], υψηλής καθαρότητας αναλυτικού βαθμού HPLC ( 99,9%), ήταν της εταιρείας Panreac (Ισπανία) και Honeywell (Γερμανία), αντίστοιχα. Το υδροχλωρικό οξύ [HCl, 37,0%] ήταν της εταιρείας Merck (Γερμανία). Το μυρμηκικό οξύ [CH 2 O 2 ] (ή φορμικό οξύ, FA) καθαρότητας 99,5% ήταν της εταιρείας Ficher Scientific (Η.Π.Α.). Επιπλέον χρησιμοποιήθηκε υπερκαθαρό νερό (αγωγιμότητα <18ΜΩ) από τη συσκευή παραγωγής υπερκαθαρού νερού της εταιρείας Labconco (Η.Π.Α.). Σ ε λ ί δ α 52

63 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Σχετικά με τα στερεά αντιδραστήρια, το άνυδρο θειικό νάτριο [Na 2 SO 4, >99,0% καθαρότητα] και το οξικό αμμώνιο [CH 3 COONH 4, 99,0% καθαρότητα] ήταν από την εταιρεία Merck (Γερμανία). Το άνυδρο οξικό νάτριο [CH 3 COONa, >99,0% καθαρότητα] ήταν της εταιρείας Panreac (Ισπανία). To βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο (ΒΗΤ) [C 15 H 24 O, 99,0%] ήταν από την εταιρεία Sigma - Aldrich (Γερμανία). Οι πρότυπες πολυφαινόλες, χλωρογενικό οξύ (3-καφεοϋλο-κινικό οξύ) [C 16 H 18 O 9, καθαρότητα 99,0%, αριθμός καταλόγου: 4991 S, LOT: ], ρουτίνη [C 27 H 30 O 16, καθαρότητα 99,0%, αριθμός καταλόγου: 1139 S, LOT: ], υπεροζίτης [C 21 H 20 O 12, καθαρότητα 98,0%, αριθμός καταλόγου: 1027 S, LOT: ], ισοκερσιτρίνη, [C 21 H 20 O 12, καθαρότητα 99,0%, αριθμός καταλόγου: 1327 S, LOT: ] και κερκετίνη [C 15 H 10 O 7, καθαρότητα 99,0%, αριθμός καταλόγου: 1135 S, LOT: ] ήταν από την εταιρεία Extrasynthense (Γαλλία) Όργανα και σκεύη Κατά την εκχύλιση των συστατικών από τα φύλλα των κυανών μύρτιλλων πραγματοποιήθηκε εκχύλιση με κάθετο ψυκτήρα, στην οποία χρησιμοποιήθηκε σφαιρική φιάλη (500 ml), πάνω στην οποία εφαρμόσθηκε κάθετος ψυκτήρας. Η παραπάνω διάταξη ήταν τοποθετημένη σε θερμαντικό μανδύα και ο ψυκτήρας ήταν συνδεδεμένος με παροχή νερού. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε διαχωριστική χοάνη για το διαχωρισμό των δύο φάσεων. Για τη συμπύκνωση των οργανικών φάσεων χρησιμοποιήθηκε συσκευή συμπύκνωσης υπό κενό (rotavapor R-200) με θερμαντικό λουτρό B-490 της εταιρείας Buchi (Η.Π.Α.). Για την ξήρανση των υδατικών φάσεων χρησιμοποιήθηκε συσκευή λυοφιλοποίησης Freeze dry system, Freezone 6, της εταιρείας Labconco Corp (Η.Π.Α.). Κατά την όξινη υδρόλυση των κλασμάτων πραγματοποιήθηκε εκχύλιση με κάθετο ψυκτήρα, στην οποία χρησιμοποιήθηκε σφαιρική φιάλη (10mL), πάνω στην οποία εφαρμόσθηκε κάθετος ψυκτήρας. Η διάταξη ήταν τοποθετημένη σε θερμαντικό υδατόλουτρο της εταιρείας Β-490 της εταιρείας Buchi (Η.Π.Α.) και ο ψυκτήρας ήταν συνδεδεμένος με παροχή νερού. Η ξήρανση των υδρολυθέντων δειγμάτων πραγματοποιήθηκε σε συσκευή φυγοκεντρικής συμπύκνωσης υπό κενό (Speed Vacuum, Centrivap Concentrator και Centrivap Cold Trap) από την εταιρεία Labconco Corp (Η.Π.Α.). Οι αναλύσεις των εκχυλισμάτων (υδρολυθέντων και μη δειγμάτων) έγιναν με Σύστημα Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης σε σύζευξη με Ανιχνευτή Συστοιχίας Φωτοδιόδων (High Performance Liquid Chromatography Diode Array Detector, HPLC Σ ε λ ί δ α 53

64 DAD) (Εικόνα 10): α) αντλία παλινδρόμησης τεσσάρων διαλυτών Ultimate 3000 Pump (Pump LPG-3400 A) της εταιρείας Dionex Corporation (Η.Π.Α.), β) θερμοστατούμενος χώρος Column compartment TCC-3100 και γ) βαλβίδα έγχυσης 8125 της εταιρείας Rheodyne (Η.Π.Α.) με βρόγχο 20 μl. Ο ανιχνευτής συστοιχίας φωτοδιόδων Diode Array Detector, υπεριώδους-ορατού (Ultraviolent Visual, UV Vis), Ultimate DAD-3000 ήταν από την εταιρεία Dionex Corporation (Η.Π.Α.). Η χρωματογραφική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν αντίστροφης φάσης Luna C-18 (100 Å, 250mm x 4.6mm, 5μm) της εταιρείας Phenomenex (Η.Π.Α) και ήταν συνδεδεμένη με προστατευτική στήλη (Εικόνα 11). To λογισμικό που χρησιμοποιήθηκε για την επεξεργασία των αποτελεσμάτων ήταν το Chromeleon v.6.80 από την εταιρεία Dionex Corporation (Η.Π.Α.). Οι αναλύσεις διεξήχθησαν στο Τμήμα Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Εικόνα 10. Σύστημα Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης ULTIMATE 3000-SR DIONΕΧ (Α: αντλία, Β: θερμοστατούμενος χώρος στήλη, Γ: Ανιχνευτής Εικόνα 11. Αναλυτική στήλη αντίστροφης φάσης RP (Α) και προστατευτική στήλη (Β), Luna C-18 (100 Å, 250mm x 4.6mm, 5μm) της εταιρείας Phenomenex Επιπρόσθετα, για τις αναλύσεις των εκχυλισμάτων (υδρολυμένων και μη δειγμάτων) χρησιμοποιήθηκε Σύστημα Υγρής Χρωματογραφίας Υπερυψηλής Απόδοσης, συνδεδεμένης με Φασματόμετρο Μάζας (Ultra Performance Liquid Chromatography, Mass Spectometry, UPLC-MS) της εταιρείας Waters Corporation (Η.Π.Α.) (Εικόνα 12). Το φασματόμετρο μάζας διέθετε υβριδικό αναλυτή τετραπόλου - χρόνου πτήσης (Quadrupole Time of Flight, Q- TOF). Τα φάσματα MS ελήφθησαν με την τεχνική του ηλεκτροψεκασμού (Electron Spray Ionization, ESI). Η χρωματογραφική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν αντίστροφης φάσης Σ ε λ ί δ α 54

65 Ιανουάριος 2014, Πάτρα BEH C18 (130 Å, 2.1 mm x 100 mm, 1,7 μm), της εταιρείας Waters Corporation (Η.Π.Α) (Εικόνα 13). Το λογισμικό που χρησιμοποιήθηκε για την επεξεργασία των αποτελεσμάτων ήταν το MassLynx V4.1 από την εταιρεία Waters Corporation (Η.Π.Α.). Οι αναλύσεις διεξήχθησαν στο Βιοαναλυτικό Εργαστήριο του Ερευνητικού Κέντρου ΓΑΙΑ, που βρίσκεται στο μουσείο Γουλανδρή Φυσικής Ιστορίας στην Κηφισιά. Εικόνα 12. Σύστημα Υγρής Χρωματογραφίας Υπερυψηλής Απόδοσης (αριστερά) συνδεδεμένης με Φασματομετρία Μάζας (Ultra Performance Liquid Chromatography, Mass Spectometry, UPLC-MS) της εταιρείας Waters Εικόνα 13. Αναλυτική στήλη αντίστροφης φάσης BEH C-18 (130 Å, 2.1 mm x 100 mm, 1,7 μm) της εταιρείας Waters Κατά τις πειραματικές διαδικασίες χρησιμοποιήθηκαν: αναλυτικός ζυγός της εταιρείας Kern (Γερμανία) πεχάμετρο (Consort C830) της εταιρείας Consort (Βέλγιο) για την κατάλληλη ρύθμιση του ph θερμαινόμενος μαγνητικός αναδευτήρας από την εταιρεία Cat (Γερμανία) φυγόκετρος της εταιρείας J. P. Selecta (Ισπανία) λουτρό υπερήχων (Ultrasonic water bath) της εταιρείας Branson 2200 (Η.Π.Α) φίλτρα 0,45 mm, RC και CA type, της εταιρείας Macherey Nagel (Γερμανία) για την διήθηση των διαλυτών υπό κενό μικροσύριγγες με φίλτρο, RC Membrane διαμέτρου πόρων 0,2 μm, της εταιρείας Phenomenex (Η.Π.Α.) για τη διήθηση των δειγμάτων πριν την ανάλυση μικροσύριγγες ακριβείας της εταιρείας Labnet International (Η.Π.Α.) Σ ε λ ί δ α 55

66 Στις πειραματικές πορείες χρησιμοποιήθηκαν, επίσης, τα ακόλουθα: σφαιρικές φιάλες, κωνικές φιάλες, ογκομετρικοί κύλινδροι, ποτήρια ζέσεως, υάλινα χωνιά, υάλινα φιαλίδια, πλαστικά φιαλίδια (eppedorfs και falcons), διηθητικό χαρτί, πιπέτες Pasteur και αλουμινόχαρτο Εκχύλιση των φύλλων του Vaccinium corymbosum Αρχή της μεθόδου Η εκχύλιση είναι μια από τις παλαιότερες χημικές διεργασίες του ανθρώπου. Η παρασκευή ενός αφεψήματος (τσάι), αλλά και η παραλαβή μιας δραστικής φαρμακευτικής ουσίας από μια φυτική πρώτη ύλη, στηρίζονται στις διαδικασίες εκχύλισης, όπου το επιθυμητό συστατικό με τη χρήση συνήθως θερμού νερού ή οργανικού διαλύτη μεταφέρεται από την φυτική πρώτη ύλη στην υγρή φάση. Το εκχυλιστικό μέσο βέβαια δεν θα πρέπει να αντιδρά με την εκχυλιζόμενη ουσία. Η απλούστερη περίπτωση διαχωρισμού με εκχύλιση είναι η διαλυτοποίηση ενός ή περισσοτέρων συστατικών μείγματος στερεών με κατάλληλο διαλύτη. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για την παρασκευή διαφόρων φαρμακοτεχνικών παρασκευασμάτων όπως είναι τα εκχυλίσματα φυτικών ή ζωικών δρογών, τα οποία παραλαμβάνονται μετά από εκχύλιση με διάφορους διαλύτες και τα βάμματα, τα οποία παραλαμβάνονται με εκχύλιση φυτικών κυρίως δρογών με αλκοόλη ή υδατοαλκοολικά διαλύματα (Κορδοπάτης και Μαγκαφά, 2013). Η εκχύλιση υγρού υγρού χρησιμοποιείται για την απομόνωση ενώσεων και βασίζεται στην κατανομή μιας διαλυμένης ουσίας μεταξύ δύο πρακτικά μη αναμιγνυόμενων υγρών. Στις περισσότερες των περιπτώσεων το ένα εκ των δύο υγρών είναι το νερό (υδατική φάση), ενώ το άλλο ένας οργανικός διαλύτης (οργανική φάση). Επειδή τα υγρά είναι μη μιγνυόμενα μεταξύ τους σχηματίζουν δύο στιβάδες με το πυκνότερο υγρό να αποτελεί την κάτω στιβάδα. Η επιλογή του εκχυλιστικού μέσου του δείγματος είναι σημαντικό να γίνεται με βάση τα εξής κριτήρια: το εκχυλιστικό μέσο να μην αντιδρά με την εκχυλιζόμενη ένωση τα δύο υγρά να διαφέρουν σημαντικά ως προς την πυκνότητά τους η εκχυλιζόμενη ένωση να ανακτάται εύκολα από το εκχυλιστικό μέσο η αμοιβαία διαλυτότητα των δύο υγρών να είναι αμελητέα οι δύο φάσεις να μην εμφανίζουν τάση σχηματισμού γαλακτωμάτων η διαλυτότητα της εκχυλιζόμενης ένωσης στο εκχυλιστικό μέσο να είναι η μεγαλύτερη δυνατή, ενώ η διαλυτότητα των ανεπιθύμητων ουσιών όσο το δυνατόν μικρότερη και το εκχυλιστικό μέσο να μην είναι τοξικός και εύφλεκτος διαλύτης. Σ ε λ ί δ α 56

67 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Στην πιο απλή περίπτωση η εκχύλιση διεξάγεται με τη βοήθεια της διαχωριστικής χοάνης, όπου, αρχικά, φέρεται το διάλυμα που περιέχει την εκχυλιζόμενη ένωση και ύστερα προστίθεται ο δεύτερος διαλύτης. Η χοάνη πωματίζεται και ανακινείται έντονα, έτσι ώστε να αυξηθεί η επιφάνεια επαφής μεταξύ των φάσεων. Κατά τη διάρκεια της ανακίνησης πραγματοποιούνται συχνές εκτονώσεις για την απομάκρυνση των παραγόμενων αερίων, που δημιουργούνται εξαιτίας της υψηλής πίεσης που προκαλείται από το σύστημα. Η χρησιμοποίηση διαδοχικών εκχυλίσεων με μικρούς όγκους διαλύτη εκχύλισης είναι πάντοτε περισσότερο αποδοτική από μία και μόνη εκχύλιση με το σύνολο του όγκου του διαλύτη (Κορδοπάτης και Μαγκαφά, 2013). Πειραματική διαδικασία Για την απομόνωση των συστατικών από τα αποξηραμένα φύλλα των μύρτιλλων χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της εκχύλισης με θερμό νερό. Η αναλογία δρόγης προς διαλύτη ήταν 30 g ανά 300 ml, σύμφωνα με τους Wang b και συνεργάτες (2010). Η συνολική ποσότητα του φυτικού υλικού ήταν 114 g. Για να εκχυλιστεί όλη η ποσότητα, η διαδικασία της εκχύλισης με υπερκαθαρό νερό πραγματοποιήθηκε σε 4 στάδια (30g σε 300 ml επί 3 φορές και 24g σε 240 ml). Τα αποξηραμένα φύλλα θρυμματίστηκαν και ύστερα τοποθετήθηκαν εντός σφαιρικής φιάλης, στην οποία προσαρμόστηκε κάθετος ψυκτήρας, προκειμένου να υγροποιούνται οι ατμοί του διαλύτη και να επιστρέφουν στην φιάλη, προς αποφυγή εξάτμισης του διαλύτη. Το όλο σύστημα βρισκόταν εντός θερμαντικού μανδύα (Εικόνα 14) και η διαδικασία διήρκησε 2 ώρες στο σημείο ζέσεως του διαλύτη (100 ο C) και απουσία φωτός, με σκοπό την αποφυγή οξείδωσης των περιεχόμενων συστατικών. Έπειτα, τα στερεά υπολείμματα (μεγάλα κομμάτια νωπών φύλλων) απομακρύνθηκαν με απόχυση του διαλύτη και ακολούθησε διήθηση του εκχυλίσματος με τη βοήθεια διηθητικού χαρτιού. Εικόνα 14. Εκχύλιση των αποξηραμένων φύλλων V. corymbosum με θερμό νερό Μικροσκοπικά στερέα που υπήρχαν στο εκχύλισμα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση στις 420 RPM για 7 min. Μέρος από το βαθύ κόκκινο-καφέ διηθήμα συμπυκνώθηκε μέχρι ξηρού Σ ε λ ί δ α 57

68 στη συσκευή λυοφιλοποίησης, με σκοπό να υπολογισθεί η % απόδοση του ξηρού εκχυλίσματος των φύλλων μύρτιλλων. Η ξηρή ποσότητα, που συλλέχθηκε, αποθηκεύθηκε στην κατάψυξη (-20 O C) μέχρι την περαιτέρω ανάλυσή της. Ο υπόλοιπος όγκος του διηθήματος, λυοφιλοποιήθηκε μέχρι να ελαττωθεί ο όγκος του, με σκοπό την εκχύλισή του. Εκχύλιση υγρού υγρού πραγματοποιήθηκε στο τελευταίο (V= 320 ml), με σκοπό το διαχωρισμό των περιεχομένων συστατικών (Εικόνα 15). Η επιλογή τω δύο οργανικών διαλυτών έγινε, ύστερα από μία σειρά δοκιμών βασισμένων σε βιβλιογραφικές αναφορές. Η εκχύλιση είχε δύο στάδια: Α) εξαντλητική εκχύλιση του υδατικού αφεψήματος με οργανικό διαλύτη, οξικό αιθυλεστέρα και Β) διαδοχική εκχύλιση της υδατικής φάσης, που προέκυψε από την προηγηθείσα εκχύλιση, με οργανικό διαλύτη βουτανόλη. Κατά το πρώτο στάδιο της εκχύλισης, 320 ml υδατικού αφεψήματος προστέθηκαν στην διαχωριστική χοάνη και πραγματοποιήθηκε εκχύλιση με 4500 ml, συνολικό όγκο οξικού αιθυλεστέρα (AcOEt). Οι εκχυλίσεις που πραγματοποιήθηκαν ήταν πολλές και ο προστιθέμενος όγκος AcOEt, κάθε φορά, ήταν μικρός (200 ml). Στο δεύτερο στάδιο, η υδατική φάση που παραλήφθηκε από την προηγηθείσα εκχύλιση, προστέθηκε στη διαχωριστική χοάνη και εκχυλίστηκε εκ νέου με 1800 ml βουτανόλη (BuOH) (200 ml / φορά). Πάνω στοιβάδα: Οργανική φάση Κάτω στοιβάδα: Υδατική φάση Εικόνα 15. Κλασμάτωση του υδατικού αφεψήματος των φύλλων V. corymbosum με οργανικούς διαλύτες Μετά το τέλος των εκχυλίσεων παραλήφθηκαν 3 κλάσματα, δύο οργανικά και ένα υδατικό. Οι οργανικές φάσεις συλλέχθηκαν ξεχωριστά και ξηράνθηκαν με άνυδρο θειικό νάτριο. Ακολούθησε διήθηση αυτών με πτυχωτό ηθμό, για την απομάκρυνση του προστιθέμενου ξηραντικού υλικού, και συμπύκνωση σε περιστροφικό εξατμιστήρα με εφαρμογή κενού. Το υδατικό κλάσμα λυοφιλοποιήθηκε μέχρι ξηρού. Όλα τα κλάσματα αποθηκεύθηκαν στην κατάψυξη (-20 O C) Ανάλυση του αφεψήματος και των κλασμάτων των φύλλων του Vaccinium corymbosum με Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης (HPLC) Σ ε λ ί δ α 58

69 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης (HPLC): Ιστορική αναδρομή Βασικές αρχές Ο όρος χρωματογραφία επινοήθηκε από τον ρώσο βοτανολόγο Mikhail Tswett ( ) το Ο Tswett απέδειξε ότι όταν ένα φυτικό εκχύλισμα εκλουστεί με πετρελαϊκό αιθέρα μέσω μιας στήλης που αποτελείται από ένα υάλινο σωλήνα γεμάτο με σκόνη ανθρακικού ασβεστίου (CaCO 3 ), πραγματοποιείται διαχωρισμός των περιεχόμενων, στο φυτικό εκχύλισμα, χρωστικών ουσιών. Την αναλυτική αυτή μέθοδο την ονόμασε χρωματογραφία, διότι οι διαφορετικές ζώνες που σχηματίσθηκαν στη στήλη και οφείλονταν στις διαφορετικές χρωστικές ήταν έγχρωμες. Εικόνα 16. Σχηματική απεικόνιση του πειράματος του Tswett Οι πρώτες εμπορικά διαθέσιμες, χρωματογραφικές μέθοδοι εμφανίστηκαν στη δεκαετία του Η Χρωματογραφία Ανοιχτής Στήλης, η Χρωματογραφία Χάρτου και η Χρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδας αποτέλεσαν τις πρώτες χρωματογραφικές τεχνικές επιτυγχάνοντας αρχικά ένα σημαντικό αριθμό χρωματογραφικών διαχωρισμών. Οι συγκεκεριμένες τεχνικές αν και βοήθησαν καταλυτικά στους χρωματογραφικούς διαχωρισμούς παρουσίαζαν μια σειρά σημαντικών μειονεκτημάτων, με βασικότερο το γεγονός ότι ήταν ανεπαρκείς για τον προσδιορισμό κάποιων ενώσεων και για το διαχωρισμό παρόμοιων συστατικών. Η Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography) αποτελεί εξέλιξη της κλασικής χρωματογραφίας στήλης. Αναπτύχθηκε στα μέσα της δεκαετίας του 1970 και η ταχύτατη εδραίωσή της στο χώρο της ενόργανης ανάλυσης βασίστηκε στην ανακάλυψη νέων υλικών πλήρωσης της στήλης, καθώς και στην ευκολία που παρείχαν οι συνδεμένοι σε σειρά ανιχνευτές. Στη δεκαετία του 1980 εμφανίστηκαν νέες τεχνικές στην Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης οι οποίες βελτίωσαν το διαχωρισμό, την ανίχνευση, τον ποιοτικό και τον ποσοτικό διαχωρισμό των ενώσεων, ενώ παράλληλα η ανάπτυξη των υπολογιστών διευκόλυνε ουσιαστικά την αυτοματοποίηση της συγκεκριμένης τεχνικής. Το γεγονός αυτό καθιέρωσε την HPLC ως μια ιδιαίτερα δημοφιλή τεχνική, καθώς θεωρείται η πλέον κατάλληλη για τον ακριβή και επαναλήψιμο προσδιορισμό ενός μεγάλου εύρους ενώσεων τόσο οργανικών όσο και ανόργανων. Σ ε λ ί δ α 59

70 Στην Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης ο διαχωρισμός αποτελεί αποτέλεσμα πολλαπλής αλληλεπίδρασης μιας στατικής (stationary phase) και μιας κινητής φάσης (mobile phase). Η στατική φάση αποτελείται από ένα υλικό καθηλωμένο σε μία στήλη ή σε μία στερεή επιφάνεια. Το υλικό πλήρωσης αποτελείται από σωματίδια μεγέθους 2 ως 10 μm, με σφαιρικό ή ακανόνιστο σχήμα. Συνήθως χρησιμοποιούνται στήλες στις οποίες το πληρωτικό υλικό είναι η σίλικα, πάνω στην επιφάνεια της οποίας είναι δεσμευμένα αλκύλια C-18. Ως κινητή φάση χρησιμοποιείται ένα υγρό, το οποίο μπορεί να είναι νερό, ρυθμιστικό διάλυμα ή οργανικός διαλύτης. Ανάλογα με την πολικότητα της κινητής φάσης διακρίνουμε δύο τύπους χρωματογραφίας: α) την κανονική (Normal Phase, NP), κατά την οποία η στατική φάση είναι πολική (όπως siliaca gel SiO 2 ή AlO 3 ) και η κινητή φάση σχετικά μη πολική (όπως n-εξάνιο) και χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό πολικών ενώσεων και β) την αντίστροφη (Reversed Phase, RP), όπου η στατική φάση είναι μη πολική (υδρόφοβη, SiO 2 συζευγμένο με αλκύλια) και η κινητή φάση πολική (όπως μείγματα διαλυτών μεθανόλης ή ακετονιτριλίου με υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα ή νερό) και χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό μη πολικών ενώσεων. Κατά την αντίστροφη φάση, η ισχύς έκλουσης αυξάνει με την μείωση της πολικότητας του διαλύτη, διότι έτσι ελαττώνεται η συγκράτηση μιας ένωσης στη στατική φάση. Στην περίπτωση ενώσεων που μπορούν να υποστούν ιονισμό, μια αλλαγή στο ph μπορεί να επηρεάσει τη συγκράτηση και την εκλεκτικότητά τους. Το δείγμα εισάγεται στη στήλη και με τη βοήθεια της κινητής φάσης τα συστατικά μετακινούνται με τη μορφή ζωνών και τελικά εκλούονται το ένα μετά το άλλο. Οι ενώσεις κατανέμονται μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης, με αποτέλεσμα να μετακινούνται με διαφορετικές ταχύτητες κατά μήκος της στήλης. Στη συγκεκριμένη τεχνική είναι δυνατή η χρήση μίγματος διαλυτών, καθώς και η βαθμιαία μεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης. Όταν για το διαχωρισμό των συστατικών χρησιμοποιείται κινητή φάση σταθερής σύστασης, η έκλουση χαρακτηρίζεται ισοκρατική (isocratic elution), ενώ όταν η σύσταση μεταβάλλεται χαρακτηρίζεται βαθμιδωτή (gradient elution). Ο επαρκής διαχωρισμός των συστατικών σε ένα εύλογο χρονικό διάστημα, είναι ζητούμενο στην ανάπτυξη μιας μεθόδου HPLC. Η στήλη (μήκος και πληρωτικό υλικό), η θερμοκρασία, η ροή και κυρίως η σύσταση της κινητής φάσης είναι παράμετροι που επηρεάζουν το βαθμό διαχωρισμού. Θα πρέπει παράλληλα να σημειωθεί ότι στην HPLC είναι εφικτή η χρησιμοποίηση στηλών σε σειρά, ούτως ώστε να επιτυγχάνεται καλύτερος διαχωρισμός των συστατικών του εξεταζόμενου μίγματος Οργανολογία της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης Ένα τυπικό σύστημα ΗPLC αποτελείται από: α) τα δοχεία αποθήκευσης των διαλυτών, β) το σύστημα παροχής της κινητής φάσης, γ) το σύστημα εισαγωγής του δείγματος, δ) τη χρωματογραφική στήλη, ε) τον ανιχνευτή και στ) το σύστημα συλλογής και καταγραφής των αποτελεσμάτων (Εικόνα 17). Σ ε λ ί δ α 60

71 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Ένα σύγχρονο σύστημα HPLC είναι εφοδιασμένο με ένα ή περισσότερα υάλινα ή ανοξείδωτα δοχεία, καθένα από τα οποία περιέχει 200 έως 1000 ml διαλύτη. Τα δοχεία είναι συχνά εφοδιασμένα με μέσα απομάκρυνσης των διαλυμένων αερίων, συνήθως οξυγόνου και αζώτου, και παρεμποδίζουν τον σχηματισμό φυσαλίδων στη στήλη και στον ανιχνευτή των συστημάτων. Οι φυσαλίδες αυτές προκαλούν διεύρυνση των κορυφών και εμποδίζουν την ακριβή καταγραφή από τον ανιχνευτή. Η απαέρωση και η απομάκρυνση αιωρούμενων σωματιδίων γίνεται πριν την εισαγωγή τους στο δοχείο, με διήθηση των διαλυτών μέσω μικροπορώδους φίλτρου με εφαρμογή κενού και τον υπερηχητικό καθαρισμό τους. Εικόνα 17. Αποτελούμενα μέρη και διάταξη ενός HPLC συστήματος. Το σύστημα παροχής κινητής φάσης αποτελείται από μία αντλία υψηλής πίεσης και μία διάταξη για τη βαθμιαία αλλαγή της σύστασης της κινητής φάσης. Υπάρχουν τρεις τύποι αντλιών: α) παλινδρομικές, β) σύριγγας ή εκτόπισης και γ) πνευματικές ή σταθερής πίεσης. Το σύστημα εισαγωγής δείγματος αποτελείται από μία περιστρεφόμενη βαλβίδα υψηλής πίεσης με βρόχο. Η ειδική βαλβίδα έχει την δυνατότητα να κινείται μεταξύ δύο θέσεων. Στη θέση φόρτωσης (load), η κινητή φάση προωθείται προς τη στήλη χωρίς να διέρχεται από το βρόχο, ο οποίος δύναται να πληρωθεί με το προς ανάλυση διάλυμα του δείγματος. Στη θέση εισαγωγής (inject), η κινητή φάση παρασύρει ποσοτικά τον όγκο του δείγματος και το προωθεί προς τη στήλη. Ο όγκος διαλυμένου δείγματος, ο οποίος χωράει στο βρόχο είναι συγκεκριμένος και εξαρτάται από τα χαρακτηριστικά του βρόχου. Οι χρησιμοποιούμενες αναλυτικές στήλες είναι ευθύγραμμοι σωλήνες, μήκους 10 ως 30 cm και εσωτερικής διαμέτρου 4 10 mm, από ανοξείδωτο χάλυβα. Λόγω των υψηλών πιέσεων που ασκούνται (ως 5000 psi), ως πληρωτικά υλικά χρησιμοποιούνται τα πολυμερή διοξειδίου του πυριτίου (silica) ή αλούμινας (alumina). Σήμερα, η πιο συνηθισμένη στήλη έχει μήκος 25 cm, εσωτερική διάμετρο 4,6 mm και υλικό πλήρωσης με σωματίδια μεγέθους 5 μm. Συνήθως πριν την αναλυτική στήλη, παρεμβάλλεται επιπλέον μια μικρότερου μήκους στήλη, η οποία Σ ε λ ί δ α 61

72 ονομάζεται προστατευτική στήλη (guard column) ή προ-στήλη (pre-column). Η σύσταση του υλικού πλήρωσης της προστήλης πρέπει να είναι παρόμοια με αυτό της αναλυτικής στήλης. Η χρήση προστήλης αυξάνει το χρόνο ζωής της αναλυτικής στήλης και όταν ρυπαίνεται αντικαθίσταται. Οι ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται πρέπει να έχουν υψηλή ευαισθησία, χαμηλά όρια ανίχνευσης, ελάχιστα επίπεδα θορύβου και να μην επηρεάζονται από μεταβολές της θερμοκρασίας και του ρυθμού ροής της κινητής φάσης. Οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενοι ανιχνευτές είναι: α) δείκτη διαθλάσεως, β) υπεριώδους ορατού, γ) φθορισμού, δ) υπερύθρου, ε) ηλεκτροχημικοί και στ) φασματομετρίας μάζας. Οι διατάξεις με ανιχνευτές συστοιχίας φωτοδιόδων (Diode Array Detector, DAD) αποτελούν τους αποδοτικότερους φασματοφωτομετρικούς ανιχνευτές υπεριώδους. Με αυτούς πραγματοποιείται η συλλογή δεδομένων ενός πλήρους φάσματος απορρόφησης σε πολύ μικρό χρόνο (1s). Η απόκριση του ανιχνευτή για καθένα από τα συστατικά του δείγματος είτε καταγράφεται σε χαρτί, είτε απεικονίζεται στην οθόνη ηλεκτρονικού υπολογιστή και αποτελεί το χρωματογράφημα του διαχωρισμού, ενώ ταυτόχρονα τα αναλυτικά δεδομένα αποθηκεύονται στον ηλεκτρονικό υπολογιστή (Χατζηιωάννου και Κουππάρης, 2005). Πειραματική διαδικασία Για την ανάλυση του ολικού εκχυλίσματος φύλλων Vaccinium corymbosum και των κλασμάτων: οξικού αιθυλεστέρα, βουτανολικού και υδατικού κλάσματος χρησιμοποιήθηκε η τεχνική HPLC σε στήλη αντίστροφης φάσης. Η αναλυτική μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε είχε αναπτυχθεί για την ανάλυση των φαινολικών συστατικών του εκχυλίσματος Hypericum perforatum, και αποτέλεσε μέρος μεταπτυχιακής διατριβής που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων (Μαργιάννη, 2011). Ο διαχωρισμός των συστατικών πραγματοποιήθηκε με χρήση στήλης αντίστροφης φάσης Luna C-18, μήκους 250 mm, εσωτερικής διαμέτρου 4,6 mm και μεγέθους σωματιδίων 5 μm (Phenomenex, Η.Π.Α.). Η έκλουση ήταν βαθμιδωτή με τρεις διαλύτες και ο συνολικός χρόνος διεξαγωγής της χρωματογραφικής ανάλυσης ήταν 60 min (Πίνακας 13). Αναλυτικά, ο διαλύτης Α ήταν ρυθμιστικό διάλυμα οξικού αμμωνίου (CH 3 COONH 4 ) 10 mm, ph=4,5 (ρύθμιση του ph με HCl 1M), ο διαλύτης Β ήταν ακετονιτρίλιο (CH 3 CN) και ο διαλύτης Γ ήταν μεθανόλη (CH 3 OH). Η χρήση ρυθμιστικού διαλύματος αυξάνει την ιονική ισχύ της κινητής φάσης συνεισφέροντας έτσι στη δημιουργία χρωματογραφικών κορυφών μικρού εύρους. Η ροή ρυθμίστηκε στο 1 ml/min και η θερμοκρασία στο χώρο της στήλης ήταν 30 C. Η θερμοκρασία της στήλης διατηρείται σταθερή με τη βοήθεια θερμοστατούμενου κλιβάνου, γεγονός που συνεισφέρει στην επαναληψιμότητα της ανάλυσης και στη βελτίωση του σχήματος των κορυφών. Η ανίχνευση των εκλουόμενων συστατικών πραγματοποιήθηκε με Σ ε λ ί δ α 62

73 Ιανουάριος 2014, Πάτρα ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων, υπεριώδους ορατού, στα εξής μήκη κύματος: α) 300 nm, β) 350 nm και γ) 590 nm. Πίνακας 13. Σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης κατά την HPLC Χρόνος (min) A (%): CH 3 COONH 4, 10 mm, ph=4, Β (%):CH 3 CN Γ (%):CH 3 OH Το ξηρό ολικό εκχυλίσμα αλλά και τα υπόλοιπα κλάσματα, τα οποία φυλάσσονταν στην κατάψυξη (-20 C) επαναδιαλυτοποιήθηκαν στις αρχικές συνθήκες του συστήματος διαλυτών και πραγματοποιήθηκε διήθησή τους με μικροσύριγγες με φίλτρο. Η τελική συγκέντρωση των δειγμάτων ήταν 5 mg/ml και 20 μl από το καθένα χρησιμοποιήθηκαν για την χρωματογραφική ανάλυση Όξινη υδρόλυση και HPLC ανάλυση του αφεψήματος και των κλασμάτων των φύλλων του Vaccinium corymbosum Αρχή μεθόδου Γενικά με τον όρο υδρόλυση χαρακτηρίζεται τόσο στη Χημεία όσο και στη Βιοχημεία η χημική αντίδραση κατά την οποία διασπώνται οι χημικοί δεσμοί μιας χημικής ένωσης υπό την επίδραση του νερού. Η υδρόλυση μπορεί να πραγματοποιηθεί με τρεις τρόπους: σε α) όξινες συνθήκες (όξινη υδρόλυση), β) αλκαλικές συνθήκες (αλκαλική υδρόλυση ή σαπωνοποίηση) και γ) με τη χρήση ενζύμου (ενζυμική υδρόλυση). Τα φαινολικά οξέα αλλά και τα φλαβονοειδή που περιέχονται στα φυτικά εκχυλίσματα βρίσκονται κυρίως σε γλυκοζυλιωμένη μορφή. Με την όξινη υδρόλυση των γλυκοζιτικών δεσμών των φαινολικών συστατικών ενός εκχυλίσματος πραγματοποιείται απελευθέρωση του άγλυκου τμήματος και είναι δυνατή η απομάκρυνση των σακχάρων. Ο διαλύτης, το οξύ και η συγκέντρωση αυτού, η θερμοκρασία και η διάρκεια της υδρόλυσης είναι οι παράγοντες που πρέπει να εξετάζονται για επιτυγχάνονται όσο το δυνατόν μεγαλύτερες αποδόσεις. Ο πιο κοινός διαλύτης για την υδρόλυση φαινολικών οξέων και φλαβονοειδών σε εκχυλίσματα είναι η μεθανόλη. Πέρα από τη μεθανόλη, για την εκχύλιση των φλαβονοειδών, έχουν χρησιμοποιηθεί και άλλοι διαλύτες, όπως είναι η αιθανόλη, η ακετόνη, το ακετονιτρίλιο και το νερό (Biesaga et al., 2011; Luo et al., 2013). Συνήθως, προστίθεται ποσότητα νερού στον οργανικό διαλύτη, διότι τόσο οι γλυκοζίτες όσο και το τμήμα του σακχάρου είναι υδατοδιαλυτά μόρια. Αντίθετα, το άγλυκο τμήμα του γλυκοζυλιωμένου μορίου δεν είναι υδατοδιαλυτό και διαλύεται σε οργανικούς διαλύτες. Σ ε λ ί δ α 63

74 Ανόργανα οξέα όπως είναι το υδροχλωρικό οξύ (HCl), το θειικό οξύ (H 2 SO 4 ), το φωσφορικό οξύ (H 3 PO 4 ) χρησιμοποιούνται για να επιτευχθούν οι όξινες συνθήκες, ενώ οι συγκεντρώσεις αυτών κυμαίνονται από 0,3 έως 2 Ν (Hertog et al., 1992; Häkkinen a et al., 1998; Häkkinen b et al., 1998; Häkkinen c et al., 1998; Wang b et al., 2011). Μία επιπλέον παράμετρος που παίζει σημαντικό ρόλο είναι η θερμοκρασία. Σύμφωνα με βιβλιογραφικά δεδομένα, η θερμοκρασία μπορεί να είναι χαμηλή (θερμοκρασία δωματίου, 25 ο C) ή λιγότερο χαμηλή (35 ο C), αλλά μπορεί να φτάνει και σε συνθήκες βρασμού (70 90 ο C). Τέλος, ο χρόνος διεξαγωγής της υδρόλυσης αποτελεί μία παράμετρο η οποία σχετίζεται άμεσα με τη θερμοκρασία και ρυθμίζεται ανάλογα με αυτή. Ο συνολικός χρόνος περαίωσης της αντίδρασης μπορεί να είναι από 30 λεπτά ως 20 ώρες ανάλογα με την επιλεχθείσα θερμοκρασία (Hertog et al., 1992; Häkkinen a et al., 1998; Häkkinen b et al., 1998; Häkkinen c et al., 1998; Nuutila et al., 2002; Wang b et al., 2011). Οι όξινες υδρολύσεις μπορούν να λάβουν μέρος χωρίς (Häkkinen a et al., 1998; Nuutila et al., 2002) ή με την παρουσία αντιοξειδωτικού μέσου, το οποίο συνήθως μπορεί να είναι είτε φυσικό αντιοξειδωτικό (ασκορβικό οξύ) (Häkkinen c et al., 1998; Häkkinen a et al., 1998; Nuutila et al., 2002), είτε συνθετικό αντιοξειδωτικό όπως είναι: α) η tert- βουτυλουδροκινόνη (ΤΒΗQ) (Hertog et al., 1992; Häkkinen b et al., 1998; Nuutila et al., 2002), β) η βουτυλιωμένη υδροξυανισόλη (BHA) (Justesen et al., 1998) και γ) το βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο (ΒΗΤ) (Proestos et al, 2005, Proestos et al., 2008). Για να αποφευχθεί οξείδωση από ένζυμα, όπως οι φαινυλοξειδάσες, η υδρόλυση των φυτικών πολυφαινολών προτιμάται να πραγματοποιείται με ζέοντες οργανικούς διαλύτες (βρασμός με κάθετο ψυκτήρα), όπως είναι οι αλκοόλες. Για τον ίδιο λόγο η διεξαγωγή όλης της διαδικασίας λαμβάνει χώρα απουσία φωτός και σε αδρανές συνθήκες (αέριο άζωτο, Ν 2 ) (Harborne, 1998). Η υδρόλυση έχει χρησιμοποιηθεί για την απλοποίηση των χρωματογραφικών δεδομένων, ιδίως σε περιπτώσεις που τα κατάλληλα πρότυπα είναι διαθέσιμα (Antolovich, 2000). Ο υψηλός αριθμός των γλυκοζιτών κάθε ένωσης καθιστά δύκολο τον διαχωρισμό και τον προσδιορισμό αυτών (Licodiedoff et al., 2013). Πειραματική διαδικασία Για την υδρόλυση των γλυκοζιτικών δεσμών των φαινολικών ενώσεων, τόσο του ολικού εκχυλίσματος των φύλλων Vaccinium corymbosum, όσο και των κλασμάτων: οξικού αιθυλεστέρα, βουτανολικού και υδατικού κλάσματος, επιλέχθηκε η μέθοδος της όξινης υδρόλυσης. Η εφαρμοζόμενη μεθοδολογία επιλέχθηκε ύστερα από μία σειρά πιλοτικών πειραμάτων βασισμένων σε βιβλιογραφικές αναφορές. Η πειραματική πορεία, η οποία εφαρμόσθηκε στο ολικό εκχύλισμα φύλλων Vaccinium corymbosum (αφέψημα) και στα κλάσματα ήταν τροποποίηση της μελέτης των Proestos et Σ ε λ ί δ α 64

75 Ιανουάριος 2014, Πάτρα al., Η συγκεκριμένη μελέτη είχε βασιστεί στην παλαιότερη και καθοριστική μελέτη των Hertog et al., 1992, σχετικά με την ποσοτική ανάλυση των φλαβονολών, φλαβονών, φλαβανονών σε φρούτα και λαχανικά με χρήση χρωματογραφικών μεθόδων. Η διερεύνηση για την επιλογή των βέλτιστων συνθηκών της υδρόλυσης των δειγμάτων καταγράφεται στον Πίνακα 14. Οι συνθήκες στο τελικό διάλυμα της υδρόλυσης, σε όλες τις τροποποιήσεις, αναφέρονται σε C δείγματος = 10 mg/ml. Κατά την 1 η Τροποποίηση, εξετάσθηκε ο χρόνος της υδρόλυσης. Γι αυτό το λόγο παρασκευάσθηκαν τέσσερα δείγματα, όγκου 300 μl το καθένα. Το 1 ο παραλήφθηκε τη χρονική στιγμή t=0 h (δηλαδή αμέσως μετά την παρασκευή του τελικού διαλύματος, όπου ο χρόνος της αντίδρασης της υδρόλυσης θεωρήθηκε πρακτικά μηδέν), ενώ τα 2 ο, 3 ο και 4 ο στις 2, 4 και 8 ώρες, αντίστοιχα. Το προς ανάλυση δείγμα προέκυψε ύστερα από διήθηση και αραίωση με ίσο όγκο μεθανόλης. Κατά τη 2 η Τροποποίηση, το δείγμα μετά το τέλος της αντίδρασης φυγοκεντρήθηκε και το υπερκείμενο διηθήθηκε. Ύστερα, ακολούθησε συμπύκνωση του υπερκείμενου διαλύματος μέχρι ξηρού και εκχύλιση αυτού, δύο φορές, με διαλύτη H2O:AcOEt 1:1 v/v. Τελικά, οι δύο οργανικές φάσεις που προέκυψαν, συνενώθηκαν, ξηράνθηκαν με άνυδρο Na 2 SO 4 και ο διαλύτης απομακρύνθηκε με συμπύκνωση υπό κενό. Το προς ανάλυση δείγμα επαναδιαλύθηκε σε διαλύτη MeOH:CH 3 COONH 4. Η παραπάνω διαδικασία έχει περιγραφεί από τους Proestos και συνεργάτες (2008), ως επεξεργασία που πραγματοποιείται στα δειγμάτα, που προορίζονται για συλυλίωση ακολουθούμενη από Αέρια Χρωματογραφική ανάλυση. Στην 3 η Τροποποίηση της μεθόδου έγινε αλλαγή του διαλύτη κρατώντας τις άλλες συνθήκες ίδιες με την 2 η Τροποποίηση. Το ίδιο συνέβη και στην τελευταία τροποποίηση (4 η Τροποποίηση), όπου οι παράμετροι οι οποίες μεταβλήθηκαν ήταν η θερμοκρασία και ο χρόνος. Η πιο ήπια θερμοκρασία οδήγησε στην αύξηση του χρόνου. Σ ε λ ί δ α 65

76 Πίνακας 14. Οι τροποποιήσεις που πραγματοποιήθηκαν για την επιλογή των συνθηκών της όξινης υδρόλυσης Proestos et al., 2008 Διαλύτης T Μέσο οξίνισης t Αντιοξειδωτικό Επεξεργασία πριν την HPLC 50% υδατική μεθανόλη 90 o C 2N HCl 2 h BHT 0,4 mg/ml Αραίωση με ίσο όγκο MeOH Cτελ.=5mg/mL 1 η Τροποποίηση 50% υδατική μεθανόλη 90 o C 2N HCl 0-8 h BHT 0,4 mg/ml Αραίωση με ίσο όγκο MeOH Cτελ.=5mg/mL 2 η Τροποποίηση 50% υδατική μεθανόλη 90 o C 2N HCl 2 h BHT 0,4 mg/ml Εκχύλιση με AcOEt:H2O 1:1 v/v Cτελ.=5mg/mL 3 η Τροποποίηση 60% υδατική ακετόνη 90 o C 2N HCl 2 h BHT 0,4 mg/ml Εκχύλιση με AcOEt:H2O 1:1 v/v Cτελ.=5mg/mL 4 η Τροποποίηση 50% υδατική μεθανόλη 37 o C 2N HCl 2 h και 16 h BHT 0,4 mg/ml Εκχύλιση με AcOEt:H2O 1:1 v/v Cτελ.=5mg/mL Σ ε λ ί δ α 66

77 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Τελικά, η μεθοδολογία που εφαρμόσθηκε ήταν η εξής: Σε σφαιρική φιάλη προστέθηκαν 50 mg ξηρού δείγματος και κατόπιν, αφού αναμίχθηκαν με 4 ml 62,5% MeOH, τα οποία περιείχαν 1 g/l ΒΗΤ, το διάλυμα αναδεύθηκε (Διάλυμα 1). Λόγω της δυσκολίας διάλυσης του ΒΗΤ σε υδατικό διάλυμα, η στερεή ποσότητα αυτού διαλύθηκε, αρχικά, σε 2,5 ml 100% MeOH και εν συνεχεία προστέθηκαν τα 1,5 ml νερού. Ύστερα, στο Διάλυμα 1 προστέθηκε από το HCl 10 Ν, όγκος ίσος με 1 ml. Η συγκέντρωση του ξηρού δείγματος στο τελικό διάλυμα ήταν 10 mg/ml, σε Η 2 Ο:MeOH 1:1 v/v και το HCl είχε τελική συγκέντρωση 2 Ν. Τελικά, στη σφαιρική φιάλη προσαρμόστηκε κάθετος ψυκτήρας, προκειμένου να υγροποιούνται οι ατμοί του διαλύτη και να επιστρέφουν στην φιάλη. Το όλο σύστημα τοποθετήθηκε σε θερμοστατούμενο υδατόλουτρο στους 90 O C και η διαδικασία διήρκησε 2 ώρες. Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας της όξινης υδρόλυσης και αφού τα δείγματα ήρθαν σε θερμοκρασία δωματίου, πραγματοποιήθηκε ξήρανση αυτών. Τα υδρολυμένα δείγματα που φυλάσσονταν στην κατάψυξη (-20 O C), αναλύθηκαν με την HPLC μέθοδο που χρησιμοποιήθηκε για το αφέψημα και τα κλάσματα των φύλλων μύρτιλλων. Βέβαια, κατά την επαναδιαλυτοποίηση των δειγμάτων πριν την HPLC, επειδή ήταν αναμενόμενο να μην υπάρξει πλήρης διάλυση, αντί για τις ακριβείς αρχικές συνθήκες (CH 3 COONH 4 :ACCN, 85:15), επιλέχθηκε ο διαλύτης CH 3 COONH 4 :(CH 3 ) 2 CO, 70:30. Το μικρό ποσοστό (30%) ακετόνης βοήθησε σημαντικά τη διάλυση των κλασμάτων: οξικού αιθυλεστέρα και βουτανόλης. Για το ολικό εκχύλισμα των φύλλων μύρτιλλων και το υδατικό κλάσμα, τα οποία δεν διαλύθηκαν πλήρως στις συνθήκες αυτές, ακολούθησε η τοποθέτησή τους στο λουτρό υπερήχων για περίπου 1-2 min. Πριν τη χρωματογραφική ανάλυσή τους, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και διηθήθηκαν με μικροσύριγγες με φίλτρο. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για την χρωματογραφική ανάλυση των υδρολυμένων δειγμάτων ήταν η ίδια με εκείνη που χρησιμοποιήθηκε στο εδάφιο Η τελική συγκέντρωση των δειγμάτων ήταν 5 mg/ml και 20 μl από το καθένα χρησιμοποιήθηκαν για την χρωματογραφική ανάλυση. Το διάλυμα επαναδιάλυσης ήταν φρέσκο κάθε φορά Ταυτοποίηση των συστατικών στο αφέψημα και στα κλάσματα των φύλλων του Vaccinium corymbosum με Φασματομετρία Μάζας (MS) Φασματομετρία μάζας: ιστορική αναδρομή βασικές αρχές Η θεμελιώδης απαρχή της φασματομετρίας μάζας (Mass Spectrometry, MS), τέθηκε με την εργασία του J. J. Thomson, στα Εργαστήρια Cavendish, στο Πανεπιστήμιο του Κέιμπριτζ. Μαζί με το βοηθό του Everett, σχεδίασε μία διάταξη για τη μαγνητική εκτροπή των καθοδικών ακτινών. Ο Thomson ανακάλυψε το ηλεκτρόνιο (1897) και μπόρεσε να Σ ε λ ί δ α 67

78 μετρήσει, έμμεσα, τη μάζα του, καθορίζοντας το λόγο μάζας προς το φορτίο του (m/z). Για την εργασία του, το 1906, έλαβε το βραβείο Νόμπελ στη Φυσική (Macoll, 1999; Griffiths, 2008). Κατά την πρώτη δεκαετία του 20 ου αιώνα (1912), ο Thomson με τη βοήθεια πάλι του Everett, προχώρησε στην κατασκευή του πρώτου φασματομέτρου μάζας (τότε ονομαζόταν παραβολικός φασματογράφος) για τον προσδιορισμό του λόγου της μάζας προς το φορτίο των ιόντων. Σε αυτό το όργανο τα ιόντα που παράγονται στους σωλήνες χαμηλής πίεσης, περνούν μέσα σε ηλεκτρικά και μαγνητικά πεδία, τα οποία ανάγκαζουν τα ιόντα να κινούνται σε παραβολική τροχιά. Κατόπιν, οι ακτίνες ανιχνεύονταν σε μία φθορίζουσα οθόνη ή σε μία φωτογραφική πλάκα. Με αυτό το φασματόμετρο μάζας ελήφθησαν τα φάσματα των Ο 2, Ν 2, CO, CO 2, και COCl 2 (1912). Ο Thomson, στη συνέχεια ενθάρρυνε την εργασία του ερευνητή Francis W. Aston, στα Εργαστήρια Cavendish. Ωστόσο η έρευνά του διακόπηκε από τον πόλεμο και έτσι το έργο του δεν είχε δημοσιευθεί μέχρι το Ο προστατευόμενος του Thomson, ανέπτυξε το πρώτο φασματόμετρο μάζας για τη μελέτη ισοτόπων, αποδεικνύοντας την ύπαρξη πλήθους ισοτόπων μη ραδιενεργών στοιχείων (βραβείο Νόμπελ στη Χημεία, 1922). Αξίζει να σημειωθεί ότι ο Aston χρησιμοποίησε ηλεκτροστατικά και μαγνητικά πεδία για να διαχωρίσει ισοτοπικά ιόντα σύμφωνα με τις μάζες τους και να τα συγκεντρώσει πάνω σε μία φωτογραφική πλάκα (Macoll, 1999). Ο Καναδός, Α. J. Dempster, στο Πανεπιστήμιο στο Σικάγο, ανέπτυξε την πρώτη πηγή ιονισμού με πρόσκρουση ηλεκτρονίων (electron impact, EI) και το πρώτο φασματόμετρο μαγνητικής εστίασης (1918) (Εικόνα 18). Μία θεμελιώδης διαφορά μεταξύ των οργάνων των Aston και Dempster, είναι ότι με το όργανο του Aston τα φάσματα λαμβάνονται ακαριαία, ενώ σε εκείνο του Dempster πρέπει να σαρωθούν. Αυτό μπορεί να πραγματοποιηθεί, απλά, με δύο τρόπους: α) με σάρωση του ηλεκτρικού πεδίου σε σταθερό μαγνητικό πεδίο ή β) με σάρωση του μαγνητικού πεδίου σε σταθερό ηλεκτρικό πεδίο (Macoll, 1999). Τα επόμενα χρόνια, πολλοί επιστήμονες ασχολήθηκαν με την πρόδρομη ανάπτυξη της MS, μεταξύ των οποίων o Herzog, o Bainbridge και ο Nier. Στο τέλος του 1930 η MS αποτελούσε ένα αρκετά χρήσιμο εργαλείο για το διαχωρισμό των ατομικών ιόντων σύμφωνα με τη μάζα τους. Μία δυσκολία ήταν πως οι μέχρι τότε συσκευές, ήταν πολύ περίπλοκες για έναν χημικό σε αντίθεση με ένα φυσικό. Η εφαρμογή της φασματομετρίας μάζας στην χημεία έπρεπε ουσιαστικά να αναμένει την εμπορική παραγωγή των μέσων αυτών. Η ώθηση ήρθε τη δεκαετία του 1940, όταν κατά τη διάρκεια του πολέμου υπήρξε ανάγκη ταχείας και ακριβούς ανάλυσης των υδρογονανθράκων για τον αεροπορικό στόλο. Το πρώτο εμπορικά διαθέσιμο φασματόμετρο μάζας κατασκευάστηκε το 1948, έχοντας πηγή ιονισμού τύπου ΕΙ (electron impact). Ωστόσο, βασικά μειονεκτήματα του ήταν το περιορισμένο εύρος μάζας (< 300 D) και η περιορισμένη διακριτική ικανότητα. Σ ε λ ί δ α 68

79 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Το επόμενο μεγάλο βήμα ήρθε τη δεκαετία του 1950, όταν έγινε αντιληπτό ότι εκτός από την ποσοτική ανάλυση, η MS θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την ποιοτική ανάλυση των οργανικών ενώσεων. Το 1953, οι Paul W. και Steiwedel H.S. περιγράφουν τον τετραπολικό αναλυτή και την παγίδα ιόντων σε πατέντα, ενώ το 1955 οι Wiley και McLaren αναβαθμίζουν τον γραμμικό αναλυτή χρόνου πτήσης (time of flight, TOF). Εικόνα 18.Το πρώτο φασματόμετρο μάζας Το 1956 έλαβε χώρα το πρωτοποριακό επίτευγμα της σύνδεσης της φασματομετρίας με την αέρια χρωματογραφία από τους MacLafferty και Gohkle, επιτρέποντας την ανάλυση μιγμάτων ενώσεων, χωρίς να προηγείται χειρωνακτικός διαχωρισμός. Μόλις το 1974, οι Arpino, Baldwin και MacLafferty συνέδεσαν την HPLC με την MS. Οι νέες τεχνικές ιονισμού, που αναπτύχθηκαν αργότερα, έκαναν τη φασματομετρία μάζας να αποτελεί σημαντικό εργαλείο για την ανάλυση πολλών κατηγοριών ενώσεων, μιας και οι μάζες που μπορούν να καταγραφούν σήμερα εκτείνονται στην περιοχή των MD. Τα ιόντα στη φασματομετρία μάζας διαχωρίζονται σύμφωνα με το λόγο της μάζας προς το φορτίο τους (m/z) και ανιχνεύονται ανάλογα με την αφθονία τους. Το συνολικό φορτίο των ιόντων q, δίνεται από την εξίσωση q=z e, όπου e είναι το στοιχειώδες φορτίο του ηλεκτρονίου (1, Coulomb) και z, ο αριθμός των φορτίων του ιόντος. Όταν η μάζα δίνεται σε Dalton (D) και το φορτίο σε αριθμό ηλεκτρονιακών φορτίων, ο λόγος m/z δίνεται σε Thomson (Th). Φάσμα μάζας μιας ένωσης ονομάζεται το διάγραμμα της έντασης του σήματος κάθε ιόντος της ένωσης έναντι του λόγου m/z. Ως μοριακό ιόν (molecular ion) ορίζεται το ιόν που σχηματίζεται, όταν ο αναλύτης αποβάλει ένα ηλεκτρόνιο και αντιστοιχεί στο μοριακό του βάρος. Εάν ο αναλύτης προσβάλει ένα πρωτόνιο, τότε δημιουργείται το λεγόμενο ψευδομοριακό ιόν (pseudomolecular ion) και το m/z ισούται με Μ+1. Σε ένα φάσμα μάζας, Σ ε λ ί δ α 69

80 η υψηλότερη κορυφή ονομάζεται βασική κορυφή (base peak) και η ένταση των υπολοίπων κορυφών εκφράζεται ως το % ποσοστό της έντασης της βασικής κορυφής. Στις κορυφές κάθε φάσματος μάζας, πέρα από τις παραπάνω κορυφές, υπάρχουν και οι ισοτοπικές κορυφές (isotopic peaks), οι οποίες προκύπτουν από τα ισότοπα (δηλαδή άτομα που έχουν ίδιο ατομικό αριθμό, αλλά διαφορετικό μαζικό). Επιπρόσθετα, στο φάσμα μάζας μπορούν να εμφανιστούν και ευρείες κορυφές, οι οποίες αντιστοιχούν σε μετασταθή ιόντα, η μελέτη των οποίων παρέχει σημαντική πληροφορία σχετικά με τη δομή του αναλύτη που εξετάζεται. Μετασταθή ιόντα ονομάζονται τα ιόντα που έχουν α) μικρή περίσσεια εσωτερικής ενέργειας, β) χρόνους ζωής που κυμαίνονται μεταξύ ~10-6 και ~10-7 s και γ) αργό ρυθμό θραυσματοποίησης. Παραγόμενα ή θυγατρικά ιόντα μπορούν να σχηματιστούν, όταν συγκρουστούν τα δραστικά ηλεκτρόνια με τα μόρια του αναλύτη, διαδικασία η οποία μεταφέρει αρκετή ενέργεια στα μόρια και οδηγεί στη δημιουργία ιόντων μικρότερης μάζας Οργανολογία Ένα τυπικό φασματόμετρο μάζας αποτελείται από τα εξής επιμέρους τμήματα: Σύστημα εισαγωγής δείγματος Πηγή ιόντων Αναλυτής μάζας Ανιχνευτής Σύστημα κενού Σύστημα επεξεργασίας δεδομένων Στο σύστημα εισαγωγής δείγματος γίνεται η εισαγωγή μικρών ποσοτήτων δείγματος το οποίο βρίσκεται είτε σε υγρή, είτε σε αέρια μορφή. Τα συστατικά εισέρχονται στην πηγή ιόντων και μετατρέπονται σε ιόντα, είτε με βομβαρδισμό με ηλεκτρόνια, ιόντα, μόρια ή φωτόνια, είτε με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου ή υψηλής θερμοκρασίας. Σε πολλές περιπτώσεις το σύστημα εισαγωγής δείγματος και η πηγή ιόντων συνδυάζονται σε μία ενιαία μονάδα και το ρεύμα ιόντων (θετικά ή αρνητικά φορτισμένων), που δημιουργείται, επιταχύνεται και εισέρχεται στον αναλυτή μάζας. Σχήμα 27. Σχηματικό διάγραμμα των τμημάτων ενός φασματομέτρου μάζας (τροποποιημένο σχήμα από Van Bramer, 1998) Σ ε λ ί δ α 70

81 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Στον αναλυτή, τα ιόντα διαχωρίζονται σύμφωνα με το λόγο m/z που φέρουν. Στη συνέχεια, τα διαχωρισμένα αυτά ιόντα, εισέρχονται στον ανιχνευτή και μετατρέπονται σε ηλεκτρικό σήμα, το οποίο επεξεργάζεται με ειδικό λογισμικό σε ηλεκτρονικό υπολογιστή. Στο Σχήμα 27 δίνεται ένα διάγραμμα των τμημάτων ενός τυπικού φασματομέτρου μάζας Σύστημα εισαγωγής δείγματος Η προετοιμασία του δείγματος για την εισαγωγή του στο χώρο ιονισμού, κάτω από συνθήκες σταθερής ροής και σε αέρια κατάσταση γίνεται στο σύστημα εισαγωγής δείγματος. Συχνά ένα σύστημα εξαέρωσης στερεών ή υγρών δειγμάτων συνδέεται στο τμήμα αυτό. Η εξαέρωση διευκολύνεται με θέρμανση σε συνθήκες υψηλού κενού. Το υψηλό κενό ελαχιστοποιεί τις συγκρούσεις μεταξύ των παραγόμενων ιόντων (Van Bramer, 1998). Τέτοιες συγκρούσεις θα προκαλούσαν εκτροπή των ιόντων από τη τροχιά τους και αποφόρτισή τους πάνω στα τοιχώματα του οργάνου ή ακόμη και ανεπιθύμητες αντιδράσεις μοριών ιόντων, οι οποίες θα περιέπλεκαν κατά πολύ το λαμβανόμενο φάσμα. Η απλούστερη μέθοδος εισαγωγής δείγματος είναι η άμεση εισαγωγή αερίου. Ο αέριος αναλύτης εισάγεται απευθείας στην πηγή ιονισμού διαμέσου μιας βελονοειδούς βαλβίδας. Τα δείγματα με χαμηλή τάση ατμών θερμαίνονται με σκοπό την αύξηση της τάσης ατμών. Η αέρια χρωματογραφία (Gas Chromatography, GC) είναι ίσως η πιο κοινή τεχνική για την εισαγωγή δειγμάτων σε ένα φασματόμετρο μάζας. Πολύπλοκα μείγματα διαχωρίζονται με αέρια χρωματογραφία και φασματομετρία μάζας, με σκοπό τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό των επιμέρους συστατικών. Τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά του συγκεκριμένου τρόπου εισαγωγής δείγματος είναι η ποσότητα του φέροντος αερίου και η ποσότητα του αναλύτη που εισέρχονται στο φασματόμετρο μάζας. Αν μεγάλη ροή του φέροντος αερίου εισέρχεται στο φασματόμετρο μάζας, η πίεση στην περιοχή της πηγής αυξάνεται. Διατήρηση της απαιτούμενης πίεσης στην πηγή ιονισμού απαιτεί ακριβές αντλίες κενού. Ιδανικά όλη η ποσότητα του αναλύτη (και καθόλου του φέροντος αερίου) θα πρέπει να εισέλθει στην πηγή. Η εισαγωγή δείγματος με υγρή χρωματογραφία χρησιμοποιείται για την εισαγωγή θερμικά ασταθών ενώσεων, τα οποία δε διαχωρίζονται εύκολα με αέρια χρωματογραφία. Επειδή οι ενώσεις είναι θερμικά ευαίσθητες,το δείγμα ιονίζεται απευθείας από την συμπυκνωμένη φάση. Οι τεχνικές αυτές συζητούνται στο εδάφιο που αφορά την πηγή ιόντων. Η άμεση εισαγωγή δείγματος με δειγματολήπτη χρησιμοποιείται ευρέως για την εισαγωγή υγρών χαμηλής τάσης ατμών, αλλά και στερεών. Αυτός ο τρόπος εισαγωγής δείγματος χρησιμοποιείται σε υψηλότερες θερμοκρασίες από ό, τι συμβαίνει με την άμεση εισαγωγή αερίου. Για τις ενώσεις που είτε αποσυντίθενται όταν θερμαίνονται, είτε δεν έχουν σημαντική τάση ατμών, γίνεται εισαγωγή με άμεσο ιονισμό από τη συμπυκνωμένη φάση. Αυτές οι τεχνικές, όπως ήδη αναφέρθηκε, χρησιμοποιούνται για την υγρή χρωματογραφία συνδεδεμένη με φασματομετρία μάζας (Van Bramer, 1998). Σ ε λ ί δ α 71

82 Πηγή Ιόντων Η επιλογή της τεχνικής ιονισμού, η οποία θα εφαρμοσθεί, παίζει σημαντικό ρόλο για την ανάλυση που θα ακολουθήσει. Οι περισσότερες τεχνικές ιονισμού διεγείρουν το ουδέτερο μόριο του αναλύτη, το οποίο στη συνέχεια αποβάλει ένα ηλεκτρόνιο για να σχηματίσει μία κατιονική ρίζα (Μ + ) *. Άλλες τεχνικές περιλαμβάνουν αντιδράσεις μεταξύ ιόντος - μορίου, όπου παράγονται ιόντα προσθήκης (ΜΗ + ) **. Τα πιο σημαντικά ζητήματα είναι η φυσική κατάσταση του αναλύτη και η ενέργεια ιονισμού. Οι τεχνικές ιονισμού κατατάσσονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες: τις α) τεχνικές αέριας φάσης, όπου τα δείγματα πρώτα εξαερώνονται και μετά ιονίζονται (π.χ. ιονισμός πρόσκρουσης ηλεκτρονίων, χημικός ιονισμός) και β) τεχνικές εκρόφησης, όπου υγρά ή στερεά δείγματα μετατρέπονται σε αέρια κατάσταση (π.χ. ιονισμός με ροή ατόμων μεγάλης ταχύτητας, ηλεκτροψεκασμός, ιονισμός εκρόφησης υποβοηθούμενος από υλικό μήτρας και Laser) (Watson et al., 2007). Η ενέργεια ιονισμού ελέγχει το ποσοστό της θραυσμάτωσης, που παρατηρείται στο φάσμα μάζας. Ένας, ακόμα, διαχωρισμός των τεχνικών ιονισμού μπορεί να γίνει μεταξύ μαλακών και σκληρών τεχνικών. Ως σκληρές τεχνικές καλούνται οι τεχνικές στις οποίες χρησιμοποιείται υψηλή ενέργεια κατά τον ιονισμό ενός αναλύτη, προκαλώντας διάσπαση αυτού σε θυγατρικά ιόντα. Ωστόσο, στις μαλακές τεχνικές απαιτούνται χαμηλότερες ενέργειες και προκαλείται μικρή ή καθόλου διάσπαση του αναλύτη. Αν και η θραυσμάτωση περιπλέκει το φάσμα μάζας, παρέχει δομικές πληροφορίες για την ταυτοποίηση αγνώστων ενώσεων. Υπάρχουν διάφορες τεχνικές ιονισμού, όπως: α) ο ιονισμός πρόσκρουσης ηλεκτρονίων (Electron Ionization, EI), β) ο χημικός ιονισμός (Chemical Ionization, CI), γ) ο ιονισμός με ροή ατόμων μεγάλης ταχύτητας (Fast Atom Bombardment, FAB), δ) ηλεκτροψεκασμός (Electrospray Ionization, ESI) και ε) ο ιονισμός εκρόφησης υποβοηθούμενος από υλικό μήτρας και Laser (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI) (Van Bramer, 1998). Βέβαια, πέρα από αυτές τις τεχνικές ιονισμού υπάρχουν και διάφορες άλλες. Μερικές από αυτές ανήκουν στις τεχνικές αέριας φάσης: θερμοψεκασμός (Τhermospray), ο οποίος έχει πλέον αντικατασταθεί από τον ηλεκτροψεκασμό και το χημικό ιονισμό, αλλά και ο χημικός ιονισμός υπό ατμοσφαιρική πίεση (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI). Επιπρόσθετα, ο ιονισμός πεδίου (Ionization Field, IF) και ο φωτοϊονισμός ανήκουν στις τεχνικές εκρόφησης. Στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή κρίνεται σκόπιμο να δοθεί έμφαση στη τεχνική * Μ + : το μοριακό ιόν που παράγεται μετά την απομάκρυνση ενός ηλεκτρονίου, προς σχηματισμό μιας κατιονικής ρίζας. Μ: το μόριο, +: το φορτίο του κατιόντος και : το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο της ρίζας. ** ΜΗ + : το ιόν προσθήκης που παράγεται από χημική αντίδραση μεταξύ ενός ιόντος και ενός ουδέτερου μορίου. Πολλές από αυτές τις αντιδράσεις προκαλούν την προσθήκη ενός πρωτονίου (Η + ) στο μόριο (Μ) και έτσι παράγεται το ιόν προσθήκης (ΜΗ). Σ ε λ ί δ α 72

83 Ιανουάριος 2014, Πάτρα ιονισμού, η οποία χρησιμοποιήθηκε, δηλαδή στον ηλεκτροψεκασμό. Ιονισμός μέσω ηλεκτροψεκασμού Όταν το δείγμα ιονίζεται υπό ατμοσφαιρική πίεση (Atmospheric Pressure Ionization, API), η απόδοση είναι πολύ μεγαλύτερη από την αντίστοιχη μιας πηγής ιονισμού πρόσκρουσης ηλεκτρονίων ελαττωμένης πίεσης. Αυτή η τεχνική χρησιμοποιείται για να ιονίσει θερμικώς ασταθή δείγματα, όπως πρωτείνες, πεπτίδια και πολυμερή, άμεσα, από τη συμπυκνωμένη φάση. Ας σημειωθεί ότι ο ηλεκτροψεκασμός είναι η πιο κοινή εφαρμογή του ΑPI. Ωστόσο, η συγκεκριμένη τεχνική βρίσκει εφαρμογή, πέρα από τον ESI και στο xημικό ιονισμό υπό ατμοσφαιρική πίεση (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI). Τα τελευταία χρόνια έχει σημειωθεί αξιοσημείωτη ανάπτυξη στη τεχνική ESI και χρησιμοποιείται συχνά για την υγρή χρωματογραφία συζευγμένη με φασματόμετρο μάζας. Κατά την τεχνική αυτή το διάλυμα του αναλύτη διέρχεται μέσω ενός τριχοειδούς, στο οποίο εφαρμόζεται υψηλό δυναμικό. Εξαιτίας του υψηλού ηλεκτρικού πεδίου και καθώς το διάλυμα εξέρχεται από το τριχοειδές, παράγεται ένα νέφος υψηλά φορτισμένων σταγόνων. Παράλληλα με τον τριχοειδή υπάρχει και εξωτερικός σωλήνας μέσα από τον οποίο διαβιβάζεται αέριο (ή αλλιώς εκνεφωτικό αέριο, nebulizer gas) που σκοπό έχει τη δημιουργία του εκνεφώματος στην άκρη του τριχοειδούς. Συνήθως το αέριο αυτό είναι ένα αδρανές αέριο, όπως το N 2. Στη συνέχεια, οι σταγόνες διέρχονται από βαθμιδωτό δυναμικό και πίεση. Ανάλογα με την πολικότητα του δυναμικού που εφαρμόζεται στο τριχοειδές, η επιφάνεια των σταγόνων που σχηματίζονται φορτίζονται είτε θετικά είτε αρνητικά. Σχήμα 28. Σχηματική διάταξη ψεκασμού σε ηλεκτρικό πεδίο (Gates, 2004) Οι σταγόνες συρρικνώνονται, καθώς εξατμίζεται ο διαλύτης, και η πυκνότητα στην επιφάνεια των σταγονιδίων αυξάνεται, με αποτέλεσμα το σχηματισμό πλήρως αποδιαλυτωμένων ιόντων. Τα ιόντα προκύπτουν εξαιτίας του ότι η άπωση των θετικών φορτίων που βρίσκονται στην επιφάνεια και η έλξη του ηλεκτρικού πεδίου, υπερνικούν την επιφανειακή τάση του υγρού και διαστέλλουν το υγρό προς σχηματισμό ενός κώνου, του κώνου Taylor. Τα σταγονίδια υφίστανται σχάσεις (Κουλομπική έκρηξη - Coulomb explosion), λόγω της εξάτμισης του διαλύτη και τα παραγόμενα ιόντα εισέρχονται τελικά στον αναλυτή (analyser) του Σ ε λ ί δ α 73

84 φασματομέτρου μάζας διαμέσου μίας διάταξης αποκορυφωτή (skimmer) (Σχήμα 28 και Σχήμα 29). Σχήμα 29. Σχηματισμός ιόντων κατά τον ψεκασμό σε ηλεκτρικό πεδίο (Gates, 2004) Ένα τυπικό φάσμα ΕSI δείχνει μία κατανομή μοριακών ιόντων με διαφορετικά φορτία. Επειδή ο ηλεκτροψεκασμός παράγει πολλαπλώς φορτισμένα ιόντα, δείγματα υψηλού μοριακού βάρους παρατηρούνται σε χαμηλότερη m/z. Για παράδειγμα ένα πολυ-πεπτίδιο με σχετική μοριακή μάζα 5000 Da, φορτιζόμενο σε 10 σημεία στο μόριο, εμφανίζει κορυφή με m/z 500 και αναλύεται εύκολα με ένα οικονομικό τετραπολικό αναλυτή Αναλυτής Ο αναλυτής μάζας χρησιμεύει σε ό,τι και ο μονοχρωμάτορας στα φασματόμετρα οπτικών τεχνικών. Η βασική λειτουργία σε ένα φασματόμετρο μάζας είναι να διαχωρίσει τα ιόντα, που παράγονται στην πηγή ιονισμού, ανάλογα με τις διαφορετικές τιμές του λόγου m/z. Ο διαχωρισμός είναι απαραίτητος, έτσι ώστε το μετρούμενο ιονικό ρεύμα στον ανιχνευτή ιόντων, που ακολουθεί τον αναλυτή μάζας, να αντιστοιχεί σε ιόντα με συγκεκριμένο λόγο m/z. Από τον τύπο του αναλυτή μάζας εξαρτάται η διαχωριστική ικανότητα του οργάνου, που είναι το σπουδαιότερο χαρακτηριστικό ποιότητας ενός φασματομέτρου μάζας. Η διαχωριστική ικανότητα (ή διακριτική ικανότητα) (Resolution, R) ορίζεται από τη σχέση R= m/δm όπου m: η μάζα της πρώτης κορυφής και Δm: η διαφορά μάζας δύο διαδοχικών κορυφών Κατά συνθήκη, ικανοποιητικός διαχωρισμός θεωρείται ότι επιτυγχάνεται, όταν δύο περίπου ισοϋψείς κορυφές επικαλύπτονται σε ύψος, που δεν υπερβαίνει το 10% του ύψους των κορυφών. Τα φασματόμετρα μάζας διακρίνονται σε φασματόμετρα χαμηλής και υψηλής διακριτικής ικανότητας. Τα πρώτα έχουν διακριτική ικανότητα που κυμαίνεται από 100 έως 1000 και τα διάφορα ιόντα διακρίνονται με βάση την ονομαστική μάζα (norminal mass), που Σ ε λ ί δ α 74

85 Ιανουάριος 2014, Πάτρα αντιστοιχεί στην πλησιέστερη ακέραιη τιμή προς το μοριακό βάρος. Αντίθετα, στα φασματόμετρα υψηλής διακριτικής ικανότητας (R= ) μπορούν να διαχωριστούν ιόντα με την ίδια ονομαστική μάζα, αλλά με διαφορετικές τιμές ακριβούς μάζας (exact mass), που διαφέρουν στο τρίτο ή και στο τέταρτο δεκαδικό ψηφίο (Χατζηιωάννου και Κουππάρης, 2005). Ένα άλλο χαρακτηριστικό των αναλυτών μάζας είναι η ακρίβεια μάζας (mass accuracy), η οποία ορίζεται ως η διαφορά μεταξύ της πειραματικής και θεωρητικής μάζας. Είναι εύκολο να υπολογισθεί σε ppm, από την σχέση Mass accuracy=[(m πειραματική m θεωρητική )/m θεωρητική ] όπου m θεωρητική : η μάζα που υπολογίζεται από το συντακτικό τύπο της ένωσης Οι αναλυτές μάζας, συνήθως, διαχωρίζονται σε δύο κατηγορίες: συνεχείς και παλμικοί. Στους συνεχείς αναλυτές περιλαμβάνονται οι α) τετραπολικοί αναλυτές ή φίλτρα μάζας (Quadrupole Analyser ή Mass Filters) και β) μαγνητικοί τομείς (Magnetic Sectors), οι οποίοι μοιάζουν με ένα φίλτρο ή μονοχρωμάτορα που χρησιμοποιούνται στην οπτική φασματοσκοπία. Οι συνεχείς αναλυτές διαβιβάζουν ένα και μόνο επιλεγμένο m/z στον ανιχνευτή, με αποτέλεσμα ιόντα με διαφορετικό λόγο m/z να χάνονται. Οι παλμικοί αναλυτές είναι λιγότερο συχνοί, αλλά έχουν ένα πλεονέκτημα: συλλέγουν ένα ολόκληρο φάσμα μάζας από ένα και μόνο παλμό των ιόντων. Στους παλμικούς αναλυτές περιλαμβάνονται οι εξής: γ) χρόνου πτήσης (Time Of Flight, TOF), δ) τετραπολική παγίδα ιόντων (Quadrupole Ion Trap,) και ε) ιοντικός κυκλοτρονικός συντονισμός με μετασχηματισμό Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron, FT ICR) (Van Bramer, 1998). Υπάρχουν επίσης και αρκετά υβριδικά συστήματα φασματομέτρου μάζας, τα οποία συνδυάζουν διαφορετικούς αναλυτές, όπως μαγνητικό/τετράπολο/τετράπολο (ΒQq), μαγνητικό/τετράπολο/παγίδα ιόντων (B-QIT), τετράπολο/τετράπολο/αναλυτής χρόνου πτήσης (QqTOF) κτλ.. Στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή θα γίνει αναφορά στον υβριδικό αναλυτή τετραπόλου - χρόνου πτήσης (Quadrupole Time Of Flight, Q TOF), ο οποίος χρησιμοποιήθηκε. Υβριδικός αναλυτής τετραπόλου - χρόνου πτήσης Ο τετραπολικός αναλυτής λειτουργεί ανάλογα με τα οπτικά φίλτρα επιτρέποντας τα ιόντα μιας μόνο τιμής m/z να περάσουν και να φτάσουν στον ανιχνευτή. Όλα τα άλλα ιόντα εξουδετερώνονται και απομακρύνονται. Για το λόγο αυτό, ο τετραπολικός αναλυτής ονομάζεται συχνά και φίλτρο μάζας. Οι τετραπολικοί αναλυτές μάζας αποτελούνται από τέσσερις παράλληλες μεταλλικές ράβδους (πόλους), που είναι συμμετρικά τοποθετημένες, ως προς τη δέσμη των ιόντων, και διαγωνίως συνδέονται ηλεκτρικά μεταξύ τους. Στο σύστημα εφαρμόζεται με διαφορά φάσης 180 μοίρες Σ ε λ ί δ α 75

86 για καθένα ζεύγος, εναλλασσόμενο ρεύμα υψηλής συχνότητας (ραδιοσυχνότητα). Τα ιόντα, αφού επιταχυνθούν σε δυναμικό 5-15 V, εισέρχονται στο τετράπολο. Η σάρωση των τιμών m/z σε ένα τετραπολικό αναλυτή πετυχαίνεται, είτε μεταβάλλοντας την εφαρμοζόμενη συχνότητα και διατηρώντας σταθερές τις τιμές των V 1 και V 2, είτε διατηρώντας σταθερή τη συχνότητα και μεταβάλλοντας τις τιμές των V 1 και V 2, έτσι ώστε ο λόγος V 1 /V 2 να διατηρείται σταθερός. Η σάρωση αυτή των δυναμικών επηρεάζει την κίνηση των ιόντων με τρόπο που ορίζεται από περίπλοκες διαφορικές εξισώσεις. Η κίνηση των ιόντων είναι ελικοειδής μέσα στο τετράπολο (Σχήμα 30). Βασικό, πλεονέκτημα των τετραπολικών αναλυτών είναι, ότι επιτρέπουν τη λήψη φάσματος μάζας μέσα σε λίγα χιλιοστά του δευτερολεύπτου, ιδιότητα που τους καθιστά ιδανικούς σε συνδυασμούς χρωματογραφίας με φασματομετρία μάζών (Χατζηιωάννου και Κουππάρης, 2005). Οι μάζες που μπορούν να αναλυθούν σε τέτοια όργανα, έχουν μέγιστο στη τιμή m/z=3000. Συχνά, χρησιμοποιούνται πάνω από ένας αναλύτης μάζας. Πλεονέκτημα του συστήματος αυτού είναι η δυνατότητα δίδυμης ή διαδοχικής φασματομετρίας μάζών (Tandem Mass Spectometry), γνωστή και ως MS/MS ή MS 2. Δύο, τρεις ή και τέσσερις αναλυτές μπορεί να ενσωματωθούν σε σειρά. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι αναλυτές δεν είναι απαραίτητο να είναι του ίδιου τύπου. Όταν συμβαίνει αυτό, το όργανο ονομάζεται υβριδικό. Σχήμα 30. Τετραπολικός αναλυτής (Gates, 2004) Ο τριπλός τετραπολικός αναλυτής αποτελεί συνδυασμό τριών τετραπόλων (Q1, Q2, Q3). Αρχικά στο Q1 επιλέγεται μόνο ένα ιόν, το οποίο οδηγείται στο Q2. Εκεί γίνεται σύγκρουση με περίσσεια αδρανούς αερίου και το ιόν διασπάται παράγοντας θυγατρικά ιόντα. Ακριβώς επειδή στο Q2 γίνονται οι συγκρούσεις, αυτό ονομάζεται κυψελίδα συγκρούσεων (collision cell). Στο Q3, τελικά διαχωρίζονται και μετρώνται τα θυγατρικά ιόντα. Οργανολογικά, ο υβριδικός αναλυτής μάζας τετραπόλου χρόνου πτήσης (Q-TOF) μπορεί να θεωρηθεί ως η προσθήκη ενός τετραπόλου σε ενα TOF ή ως η αντικατάσταση του Q3 ενός τριπλού τετραπόλου με ένα TOF. Τα ιόντα που παράγονται στην πηγή, μεταφέρονται στον αναλυτή του κώνου διαγράφοντας μία κίνηση σχήματος Ζ, ενώ τα ουδέτερα και τα μόρια του διαλύτη ακολουθούν Σ ε λ ί δ α 76

87 Ιανουάριος 2014, Πάτρα ευθεία κίνηση. Κατάλληλη ρύθμιση της πίεσης στην πηγή και των δυναμικών στον κώνο, επιτρέπει την αποδιαλύτωση και τη θραυσματοποίηση στην πηγή. Σχήμα 31. Υβριδικός αναλυτής τετραπόλου χρόνου πτήσης (Q-TOF) Στο Q-TOF η επιλογή της δέσμης των ιόντων γίνεται στο τετράπολο (Q) και πραγματοποιείται θραυσμάτωση των ιόντων στην κυψελίδα συγκρούσεων, παρουσία περίσσειας αδρανούς αερίου (φέρον αέριο: N 2 ή He). Αποτέλεσμα αυτής της διαδικασίας είναι η διάσπαση των ιόντων προς σχηματισμό θυγατρικών ιόντων, τα οποία εισέρχονται στον αναλυτή χρόνου πτήσης. Εκεί πραγματοποιείται διαχωρισμός και μέτρηση των ιόντων ανάλογα με το χρόνο πτήσης τους. Στον αναλυτή TOF, ο προωθητής παρέχει πολύ μικρούς παλμούς (της τάξης των νανοδευτερολέπτων), με σκοπό να στείλει συγκεκριμένα ιόντα, μέσω του ανακλαστήρα, στον ανιχνευτή. Τα ιόντα που εισέρχονται στον ανακλαστήρα, επιβραδύνονται, σταματούν και ύστερα ανακλώνται. Στον αναλυτή TOF, υπάρχει δυνατότητα V και W κίνησης των θυγατρικών ιόντων. Η διαφορά μεταξύ των δύο λειτουργιών είναι το μήκος που έχει να διανύσει το κάθε ιόν. Όσο αυξάνεται το μήκος της διαδρομής αυξάνεται και η διαχωριστική ικανότητα της ανάλυσης, αφού αυτή εξαρτάται από το χρόνο πτήσης. Αυτό περιγράφεται στη σχέση όπου L: το μήκος της διαδρομής u: η ταχύτητα των ιόντων TOF= L/u= L (m/2zev) 1/2 Στην περίπτωση του V η διαχωριστική ικανότητα είναι >10.000, ενώ στου W περίπου > Από την άλλη, όταν χρησιμοποιείται η λειτουργία W, η ευαισθησία του οργάνου είναι μικρότερη σε σχέση με εκείνη που επιτυγχάνεται με τη λειτουργία V. Σ ε λ ί δ α 77

88 Ανιχνευτής Ο ανιχνευτής ιόντων παράγει στην έξοδό του ηλεκτρικό σήμα (συνήθως ηλεκτρικό ρεύμα) ανάλογο με τον αριθμό ιόντων και το φορτίο τους. Οι κυριότεροι ανιχνευτές ιόντων είναι α) το φαρανταϊκό κύπελλο (Faraday Cell), β) ο ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστής (Electron Multiplier) και γ) η φωτογραφική πλάκα (φίλμ) (Photographic Plate): α) Τα ιόντα που προσπίπτουν στο κύπελλο, εκφορτίζονται και το ρεύμα, που διέρχεται από την αντίσταση (ιονικό ρεύμα), προκαλεί την ανάπτυξη ωμικής πτώσης τάσεως στα άκρα της ή οδηγείται σε κατάλληλο κύκλωμα μετατροπέα i/v. Πλεονεκτήματα αυτού του είδους ανιχνευτή είναι η απλή κατασκευή και η αξιοπιστία του, ενώ κύριο μειονέκτημά του είναι η ανάγκη χρησιμοποιήσεως ενός ενισχυτή υψηλής εμπεδήσεως, γεγονός που περιορίζει τη ταχύτητα σάρωσης του φάσματος β) Η δέσμη των ιόντων προσπίπτει σε μία δύνοδο και προκαλεί την εκπομπή δευτερογενών ηλεκτρονίων, που προσπίπτουν στην επόμενη δύνοδο κ.ο.κ.. Με τους ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστές μπορούν να μετρηθούν ιονικά ρεύματα, που αντιστοιχούν σε πρόσπτωση στον ανιχνευτή μερικών δεκάδων ιόντων το δευτερόλεπτο. γ) Η φωτογράφιση είναι η παλαιότερη και πλέον ευαίσθητη μέθοδος αποτυπώματος και καταγραφής των φασμάτων μάζας, με μεγάλη διαχωριστική ικανότητα, συγχρόνως όμως είναι και λιγότερο εύχρηστη λόγω του ότι είναι χρονοβόρα η εμφάνιση του φίλμ. Οι φωτογραφικές πλάκες χρησιμοποιούνται κυρίως στην ποιοτική ανάλυση, γιατί στην ποσοτική απαιτούνται και μετρήσεις της οπτικής πυκνότητας των φασματικών γραμμών, μετά την εμφάνιση της πλάκας, που δεν είναι τόσο ακριβείς, όσο οι μετρήσεις εντάσεως με άλλους ανιχνευτές (Χατζηιωάννου και Κουππάρης, 2005). Στη συνέχεια καταγράφονται τα δεδομένα σε ηλεκτρονικό υπολογιστή, ο οποίος είναι συνδεδεμένος με το φασματόμετρο μάζας. Τα δεδομένα που λαμβάνονται έχουν τη μορφή χρωματογραφήματος, στο οποίο απεικονίζεται το συνολικό ρεύμα ιόντων (Total Ion Current, TIC) και μπορούν να συγκριθούν με βάσεις δεδομένων προκειμένου να γίνει η ταυτοποίηση κάθε κορυφής Τεχνικές ανάλυσης στη Φασματομετρία Μάζας Οι τεχνικές ανάλυσης που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην Φασματομετρία Μάζας είναι: α) η τεχνική πλήρους σάρωσης (Full Scan), β) η τεχνική της επιλεκτικής παρακολούθησης ιόντων (Single Ion Monitoring, SIM) και γ) η τεχνική της δίδυμης Φασματομετρίας Μάζας, η οποία διακρίνεται σε υποκατηγορίες τεχνικών σάρωσης. Αναφορικά, οι υποκατηγορίες είναι οι εξής: α) τεχνική σάρωσης παραγόμενων ιόντων, (Product Ion Scan), β) τεχνική σάρωση πρόδρομου ιόντος (Precursor Ion Scan), γ) τεχνική σάρωσης για την ανίχνευση απώλειας ή πρόσληψης Σ ε λ ί δ α 78

89 Ιανουάριος 2014, Πάτρα ουδέτερου μορίου (Constant Neutral Loss Scan, CNL) και δ) τεχνική επιλεκτικής παρακολούθησης αντιδράσεων θραυσματοποίησης ιόντων (Multiple Reaction Monitoring, MRM). Στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της πλήρους σάρωσης, η οποία επιλεκτικά περιγράφεται συνοπτικά στη συνέχεια. Τεχνική Πλήρους Σάρωσης Στη συγκεκριμένη τεχνική λαμβάνονται πλήρη φάσματα μεταξύ δύο ακραίων τιμών m/z για καθορισμένο χρόνο. Ας σημειωθεί ότι αυξάνοντας τον χρόνο σάρωσης, αυξάνεται η ευαισθησία της ανάλυσης, καθώς αυξάνεται ο συνολικός αριθμός των ιόντων που καταλήγουν στον ανιχνευτή. Επιπλέον, η αναλυτική ευαισθησία ενισχύεται από τη μείωση του εύρους μάζας. Ωστόσο, η μεγάλη αύξηση του χρόνου σάρωσης μπορεί να οδηγήσει σε μικρότερο όγκο πληροφοριών και η μεγάλη μείωση του εύρους μάζας μπορεί να οδηγήσει στη λήψη ενός μη άρτιου φάσματος. Πειραματική διαδικασία Για την ταυτοποίηση, τόσο των περιεχόμενων στο ολικό εκχύλισμα φύλλων Vaccinium corymbosum και στα κλάσματα (ΑcOEt, BuOH, Aqueous) ενώσεων, όσο και των αντίστοιχων υδρολυθέντων κλασμάτων, χρησιμοποιήθηκε η συζευγμένη τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υπερυψηλής απόδοσης φασματομετρίας μάζας (Ultra Performance Liquid Chromatography Mass Spectometry, UPLC-MS). Ο διαχωρισμός των συστατικών πραγματοποιήθηκε με χρήση στήλης αντίστροφης φάσης ΒΕΗ C18, μήκους 100 mm, εσωτερικής διαμέτρου 2,1 mm, μεγέθους σωματιδίων 1,7 μm και μεγέθους πόρων 130 Å, της εταιρείας Waters Corporation (Η.Π.Α). Η έκλουση της κινητής φάσης ήταν βαθμιδωτή με δύο διαλύτες και ο συνολικός χρόνος διεξαγωγής της χρωματογραφικής ανάλυσης ήταν 25 min (Πίνακας 17). Αναλυτικά, ο διαλύτης Α ήταν διάλυμα 0,1% μυρμηκικού οξέος (HCOOH) (ή φορμικού οξέος, FA) σε νερό και ο διαλύτης Β ήταν ακετονιτρίλιο (CH 3 CN). Για να αναλυθούν τα συστατικά με RP χρωματογραφία και να ιονισθούν αρνητικά με ESI, χρείαζεται η κινητή φάση να είναι ελαφρώς όξινη (με κάποιο διάλυμα οξεός, σε ποσοστό 0,1-0,01%. Στη UPLC MS, με ιονισμό ΕSI, δεν χρησιμοποιούνται ρυθμιστικά διαλύματα, διότι τα ιόντα της κινητής φάσης θα ανταγωνίζονταν τα ιόντα των συστατικών κατά τη διαδικασία της αποδιαλύτωσης. Για το λόγο αυτό στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκε ο διαλύτης Α (Πίνακας 15). Η πειραματική πορεία, που ακολουθήθηκε, χωρίζεται σε δύο βήματα: Όλα τα προς ανάλυση δείγματα φυλάσσονταν στην κατάψυξη (-20 O C) Σ ε λ ί δ α 79

90 Βήμα 1 ο : Για τα μη υδρολυμένα δείγματα, παρασκευάσθηκαν διαλύματα παρακαταθήκης (stock solutions) σε μεθανόλη με συγκέκτρωση 6 mg/ml. Στη συνέχεια, αραιώθηκαν στις αρχικές συνθήκες του συστήματος διαλυτών, έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 1 mg/ml. Βήμα 2 ο : Για τα υδρολυμένα δείγματα, παρασκευάσθηκαν διαλύματα παρακαταθήκης σε μεθανόλη με συγκέκτρωση 5 mg/ml. Στη συνέχεια, αραιώθηκαν στις αρχικές συνθήκες του συστήματος διαλυτών, έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 0,5 mg/ml. Πίνακας 15. Σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης κατά την UPLC-MS Χρόνος (min) A (%): 0,1 % FA Β (%): CH 3 CN Οι υψηλής καθαρότητας διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν είχαν διηθηθεί και απαερωθεί, πριν τη χρήση τους. Ύστερα από δοκιμές που πραγματοποιήθηκαν σχετικά με την επιλογή του θετικού (+ESI) ή αρνητικού (-ESI) ιονισμού των συστατικών, για τη λήψη των αντίστοιχων φασμάτων μάζας ESI πλήρους σάρωσης, παρατηρήθηκε ότι αυτές ιονίζονται αποδοτικότερα στον αρνητικό ιονισμό. Επομένως, όλα τα φάσματα μάζας που προέκυψαν από τη λειτουργία του αρνητικού ιονισμού, για κάθε δείγμα, επεξεργάσθηκαν με σκοπό τον προσδιορισμό των περιέχοντων φαινολικών συστατικών. Οι τυπικές παράμετροι της πηγής ιονισμού ρυθμίστηκαν, κατάλληλα, προκειμένου να επιτευχθεί όσο το δυνατό καλύτερη ευαισθησία κατά τον ηλεκτροψεκασμό των αναλυτών. Η ροή ρυθμίστηκε 0,4 ml/min, ενώ το δυναμικό στο μεταλλικό τριχοειδές, στον κώνο δειγματοληψίας και στο κώνο εκχύλισης τέθηκε 1,4, 30, και 1 kv, αντίστοιχα. H θερμοκρασία στην πηγή και κατά την αποδιαλύτωση ήταν 120 και 400 ο C, αντίστοιχα. Η ροή του αερίου αποδιαλύτωσης ρυθμίστηκε 500 L/h, ενώ το αέριο θραυσμάτωσης είχε ροή 0,22 ml/min. Η ενέργεια στην κυψελίδα συγκρούσεων ήταν 2 ev (Function 1). Επιπρόσθετα, τέθηκαν ακόμη τρεις λειτουργίες, κατά τις οποίες η ενέργεια στην κυψελίδα συγκρούσεων ήταν μεγαλύτερη από 2 ev. Πιο συγκεκριμένα, η τιμή της ενέργειας που εφαρμόσθηκε σε κάθε λειτουργία (Function 2, 3, 4) ήταν 30, 60 και 100 ev, αντίστοιχα. Κάθε ανάλυση δείγματος πραγματοποιήθηκε ταυτόχρονα και για τις τέσσερις λειτουργίες, σε ένα εύρος μάζας από 85 έως 1000 m/z. Πρέπει, επίσης, να σημειωθεί ότι όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με ψεκασμό με πρότυπο αναφοράς (lock spray) για να εξασφαλιστεί η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα. Η Leu-εγκεφαλίνη, ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο πεπτίδιο (m/z= 554,2615), χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο αναφοράς. Σ ε λ ί δ α 80

91 Ιανουάριος 2014, Πάτρα 5.6. Ποσοτικοποίηση των συστατικών στο αφέψημα και στα κλάσματα των φύλλων του Vaccinium corymbosum με HPLC Ο ποσοτικός προσδιορισμός των κυριότερων φαινολικών συστατικών των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με αναλυτική μεθοδολογία, διαφορετική από εκείνη που χρησιμοποιήθηκε στην αρχική ανάλυση των δειγμάτων (εδάφιο 5.3.) Μέθοδος HPLC ανάλυσης Η μεθοδολογία, που χρησιμοποιήθηκε, αναπτύχθηκε ύστερα από πιλοτικά πειράματα, τα οποία βασίστηκαν στην μεθοδολογία των Tsao et al.,2003, και σκοπό είχαν την εύρεση των καταλληλότερων συνθηκών για τον α) καλό διαχωρισμό και β) ποσοτικό προσδιορισμό των περιεχόμενων συστατικών στα μη υδρολυθέντα κλάσματα. Οι βέλτιστες συνθήκες της χρωματογραφικής ανάλυσης επιτεύχθηκαν ύστερα από την εφαρμογή διάφορων HPLC μεθόδων στην ανάλυση του ολικού εκχυλίσματος των φύλλων μύρτιλλων. Η 1 η προσπάθεια αποτέλεσε τροποποίηση της μεθόδου που είχε εφαρμοσθεί κατά την ανάλυση των δειγμάτων στο εδάφιο 5.3. και ήταν μέθοδος που είχε χρησιμοποιηθεί για την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση της πόας του υπερικού (Μαργιάννη, 2011). Σκοπός αυτής της τροποποίησης ήταν ο καλύτερος διαχωρισμός των κορυφών, έτσι ώστε να πραγματοποιηθεί εύκολα ο ποσοτικός προσδιορισμός των κυριότερων συστατικών. Στη μέθοδο της Μαργιάννη (2011), είχε παρατηρηθεί συνέκλουση των συστατικών στα πρώτα λεπτά (0-5 min) και όχι τόσο καλός διαχωρισμός για τα φλαβονοειδή στην περιοχή min. Επίσης, το γεγονός ότι μετά το 35 min δεν είχε εκλουστεί καμία ένωση, οδήγησε στην πιο απότομη (βαθμιαία) αλλαγή του συστήματος διαλυτών. Οι αλλαγές που πραγματοποιήθηκαν αφορούσαν μόνο το σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης, καθώς καμία άλλη παράμετρος δεν υπέστη μεταβολή. Έτσι επιλέχθηκε η μέθοδος που φαίνεται στον Πίνακα 16. Η ανίχνευση των εκλουομένων συστατικών πραγματοποιήθηκε με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων, υπεριώδους ορατού, στα εξής μήκη κύματος: α) 280 nm, β) 320 nm και γ) 350 nm. Η τελική συγκέντρωση του δείγματος ήταν 2 mg/ ml. Στη 2 η προσπάθεια χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των Tsao και συνεργατών (2003), η οποία είχε αναφερθεί κατάλληλη για διαχωρισμό, αλλά και ποσοτικοποίηση, πέντε μεγάλων πολυφαινολικών ομάδων (υδροξυκινναμωμικά οξέα, υδροξυβενζοϊκά οξέα, φλαβανόλες, φλαβονόλες, ανθοκυανίνες και χαλκόνες) που απατώνται σε καρπούς όπως είναι τα μήλα, οι φράουλες, τα κεράσια και τα μύρτιλλα. Επιπλέον, σημαντικό παράγοντα στην επιλογή του συγκεκριμένου πρωτοκόλλου έπαιξε ότι στη μελέτη των Tsao και συνεργατών (2003) είχε χρησιμοποιηθεί η αναλυτική στήλη Luna C- Σ ε λ ί δ α 81

92 18, μήκους 250 mm, εσωτερικής διαμέτρου 4,6 mm και μεγέθους σωματιδίων 5 μm και μεγέθους πόρων 100 Å. Πίνακας 16. Σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης κατά την ΗPLC Χρόνος (min) A (%): CH 3 COONH 4, 10 mμ, ph= 4, Β (%):CH 3 CN Γ (%):CH 3 OH Η κινητή φάση ήταν συνδυασμός βαθμιδωτής έκλουσης δύο διαλυτών Α και Β: 6% οξικό οξύ, σε διάλυμα οξικού νατρίου συγκέντρωσης 2 mμ και ακετονιτρίλιο, αντίστοιχα. Για να παρασκευασθεί ο διαλύτης Α αναμιγνύεται κατάλληλος όγκος διαλύματος CH 3 COONa με κατάλληλη ποσότητα οξικού οξέος, με σκοπό το τελικό διάλυμα να περιέχει CH 3 COOH 6% v/v και CH 3 COONa 2 mμ. Το σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης παρουσιάζεται στον Πίνακα 17. Η ροή ρυθμίστηκε στο 1 ml/min και η θερμοκρασία στο χώρο της στήλης ήταν 30 C. Πίνακας 17. Σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης κατά την ΗPLC Χρόνος (min) A (%): CH 3 COOH 6% (v/v) σε CH 3 COONa, 2 mμ Β (%):CH 3 CN Η ανίχνευση των εκλουομένων συστατικών πραγματοποιήθηκε με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων, υπεριώδους ορατού, στα εξής μήκη κύματος: α) 280 nm, β) 320 nm και γ) 350 nm. Η τελική συγκέντρωση του δείγματος ήταν 2 mg/ ml. Κατά την 3 η προσπάθεια, χρησιμοποιήθηκε το πρωτόκολλο που προαναφέρθηκε με τη μόνη διαφορά ότι ο διαλύτης Α ήταν ο διαλύτης Α της μεθόδου της Μργιάννη (2011), δηλαδή το οξικό αμμώνιο 10 mm, με ph= 4,5. Η 4 η και τελευταία προσπάθεια, που επιχειρήθηκε, ήταν αυτή που κρίθηκε κατάλληλη για την ανάλυση όλων των δειγμάτων. Οι συνθήκες που επιλέχθηκαν ήταν βαθμιδωτή έκλουση σε χρόνο 72 min, με σύστημα δύο διαλυτών (Πίνακας 18). Η ανίχνευση των εκλουόμενων συστατικών πραγματοποιήθηκε με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων, υπεριώδους ορατού, στα εξής μήκη κύματος: α) 320 nm, β) 350 nm. Η τελική συγκέντρωση των δειγμάτων ήταν η εξής: C Crude = 2,5 mg/ml, C AcOEt = 1,5 mg/ ml, C BuOH = 1,5 mg/ml και C Aqueous = 6 mg/ml. Οι συγκεκριμένες συγκεντρώσεις προέκυψαν βάσει της εικόνας που λήφθηκε στα αρχικά πειράματα (εδάφιο 5.3.). Σ ε λ ί δ α 82

93 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Πίνακας 18. Σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης κατά την ΗPLC Χρόνος (min) A (%): CH 3 COONH 4 10 mm, ph= 4, Β (%): CH 3 CN Για το δείγμα AcOEt, για παράδειγμα, επειδή ήταν εμπλουτισμένο σε φαινολικά συστατικά, σε σχέση με τα υπόλοιπα δείγματα, επιλέγχθηκε η σχετικά χαμηλή συγκέντρωση των 1,5 mg/ml. Ποσότητα ίση με 20 μl χρησιμοποιήθηκε για την χρωματογραφική ανάλυση κάθε δείγματος. Η σειρά έκλουσης των συστατικών πιστοποιήθηκε με: α) την εξέταση των UV-Vis φασμάτων των εκλουόμενων κορυφών, β) τη σύγκριση των χρόνων έκλουσης με πρότυπα διαλύματα και γ) τη ταυτόχρονη εισαγωγή προτύπων και εκχυλίσματος [χρήση εμβολιασμένων δειγμάτων (spiked samples)] Ποσοτικος προσδιορισμός Για τον ποσοτικό προσδιορισμό του φαινολικού περιεχομένου των δειγμάτων (μη υδρολυθέντων) κατασκευάσθηκαν καμπύλες αναφοράς των προτύπων ενώσεων για χαμηλές και υψηλές συγκεντρώσεις, μέσω των οποίων προσδιορίσθηκε η συγκέντρωσή τους στα δείγματα. Οι υψηλής καθαρότητας ενώσεις: χλωρογενικό οξύ, ρουτίνη, υπεροζίτης, ισοκερσιτρίνη, και κερκετίνη διαλύθηκαν σε μεθανόλη, με αρχική συγκέντρωση 0,5 mg/ml. Στη συνέχεια, αραιώθηκαν στις αρχικές συνθήκες του συστήματος διαλυτών, στις τελικές συγκεντρώσεις που επιλέχθηκαν. Το εύρος συγκεντρώσεων ήταν διαφορετικό για κάθε ένωση. Για την κάθε πρότυπη ένωση εξετάσθηκαν οι εξής τιμές συγκεντρώσεων: Χλωρογενικό οξύ: 25, 50, 100 και 200 μg/ml Ρουτίνη:5, 10, 18, 50 και 100 μg/ml Υπεροζίτης: 5, 10, 18, 50 και 100 μg/ml Ισοκερσιτρίνη: 5, 10, 18, 50 και 100 μg/ml Κερκετίνη: 2, 5, 7, 25 και 50 μg/ml Τα εμβαδά κορυφής του χλωρογενικού οξέος καταγράφηκαν σε μήκος κύματος 320 nm, ενώ τα αντίστοιχα για τη ρουτίνη, τον υπεροζίτη, την ισοκερσιτρίνη και την κερκετίνη στα 350 nm. Σ ε λ ί δ α 83

94 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Σ ε λ ί δ α 84

95 Ιανουάριος 2014, Πάτρα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 Ο 6.1. Απόδοση του ολικού εκχυλίσματος των φύλλων του Vaccinium corymbosum και παραληφθείσες ποσότητες από την εκχύλισή του Το ολικό εκχύλισμα των φύλλων μύρτιλλων λυοφιλοποιήθηκε και η απόδοση ήταν 56,21% κ.β.. Οι ποσότητες που παρελήφθησαν, μετά το τέλος των εκχυλίσεων του ολικού εκχυλίσματος φύλλων (όγκου V= 320 ml), ήταν οι εξής: κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα (AcOEt): 5,1455 g κλάσμα βουτανόλης (BuOH): 5,8623 g υδατικό κλάσμα (Aqueous): 15,9529 g 6.2. HPLC σάρωση συστατικών του αφεψήματος και των κλασμάτων των φύλλων του Vaccinium corymbosum Η αναλυτική μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε, είχε αναπτυχθεί για την ανάλυση των φαινολικών συστατικών του εκχυλίσματος Hypericum perforatum (Μαργιάννη, 2011). Κατά την μεταπτυχιακή διατριβή σχετικά με την πόα του υπερικού, αναπτύχθηκε μέθοδος ανάλυσης με χρήση Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης, η οποία ήταν απλή και κατάλληλη για ποιοτικό και ποσοτικό χαρακτηρισμό των περιεχόμενων συστατικών. Οι προς ανάλυση ουσίες άνηκαν σε ένα ευρύ φάσμα πολικότητας (φαινολικά οξέα, ναφθοδιανθρόνες) και μερικά από αυτά είχαν, ιδιαίτερα, λεπτές διαφορές στη δομή τους (γλυκοζίτες φλαβονοειδών). Σύμφωνα με βιβλιογραφικά δεδομένα, τα φύλλα διαφόρων ποικιλιών του γένους Vaccinium (:myrtillus, angustifolium και υβριδίων όπως το corymbosum x angustifolium) είναι πλούσια σε φαινολικά συστατικά όπως φαινολικά οξέα και φλαβονοειδή. Πιο συγκεκριμένα, έχει αποδειχθεί πως το κυριότερο φαινολικό συστατικό είναι ένα υδροξυκινναμωμικό οξύ, το χλωρογενικό οξύ. Φλαβονοειδή, όπως η κερκετίνη, η ρουτίνη, ο υπεροζίτης και η ισοκερσιτρίνη, έχουν επίσης προσδιορισθεί στις παραπάνω ποικιλίες. Επιπρόσθετα, ανθοκυανίνες έχουν εντοπισθεί στα κόκκινα φύλλα των μύρτιλλων (Harris et al., 2007; Witzell & Shevtsova, 2004; Fraisse, 1996; Jaakola et al., 2004; Riihinen et al., 2008; Oszmianski et al., 2011). Μάλιστα, μελέτη (Janiuk et al., 2013) στην οποία πραγματοποιήθηκε ανάλυση των ποικιλιών Bluecrop και Northland του V. corymbosum κάνει λόγο για την ύπαρξη ανθοκυανινών στα φύλλα. Η ανίχνευση των εκλουόμενων συστατικών πραγματοποιήθηκε στα εξής μήκη κύματος: α) 300 nm, β) 350 nm και γ) 590 nm, όπως και στη μελέτη της Μαργιάννη, Η επιλογή των 590 nm, στη παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή, αποδείχθηκε χρήσιμη για τον έλεγχο της ύπαρξης ανθοκυανινών στο ολικό υδατικό εκχύλισμα των φύλλων (μίγμα των ποικιλιών Bluecrop και Patriot ) και στα κλάσματα που προέκυψαν από την εκχύλιση αυτού. Σ ε λ ί δ α 85

96 Απορρόφηση (mau) Απορρόφηση (mau) Στο Σχήμα 33, απεικονίζεται το HPLC χρωματογράφημα του ολικού εκχυλίσματος των φύλλων (Crude) στα 350 nm, ενώ στο Σχήμα 34 απεικονίζονται όλα τα HPLC των τεσσάρων δειγμάτων: Crude, κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα (AcOEt), κλάσμα βουτανόλης (BuOH) και υδατικό κλάσμα (Aqueous) στα 350 nm (δεξιά) Χλωρογενικό οξύ (1) Ρουτίνη (2) Υπεροζίτης (3) Ισοκερσιτρίνη (4) Crude Χρόνος (min) Σχήμα 33. HPLC του ολικού εκχυλίσματος των φύλλων του V. corymbosum (crude) στα 350 nm σε στήλη αντίστροφης φάσης Luna C-18 (100 Å, 250mm x 4.6mm, 5μm) και με σύστημα έκλουσης που περιγράφεται στον Πίνακα 13. Η συγκέντρωση του δείγματος είναι 5 mg/ml AcOEt Crude BuOH Aqueous Χρόνος (min) Σχήμα 34. HPLC όλων των δειγμάτων στα 350 nm με σύστημα έκλουσης που περιγράφεται στον Πίνακα 13. Η συγκέντρωση κάθε δείγματος είναι 5 mg/ml Βάσει των HPLC χρωματογραφημάτων που λήφθηκαν, συμπεραίνεται πως σε όλα τα δείγματα εκλούονται κάποιες ενώσεις στην αρχή (στα πρώτα 5 min της μεθόδου) και περισσότερες ενώσεις στα min. Σύμφωνα με το χρόνο έκλουσης του χλωρογενικού οξέος (3.8 min) Σ ε λ ί δ α 86

97 Απορρόφηση (mau) Ιανουάριος 2014, Πάτρα και το φάσμα απορρόφησής του, φαίνεται πως τα χρωματογραφήματα των 4 δειγμάτων των φύλλων μύρτιλλων περιέχουν την ένωση αυτή. Επιπλέον, σύμφωνα με την προγενέστερη μελέτη της Μαργιάννη (2011), τους χρόνους έκλουσης και τα φάσματα απορρόφησης, οι ενώσεις ρουτίνη, υπεροζίτης και ισοκερσιτρίνη εντοπίζονται στο ολικό εκχύλισμα των φύλλων. Αξιόλογο αποτέλεσμα είναι ότι το κλάσμα AcOEt είναι περισσότερο εμπλουτισμένο (σε σχέση με τα υπόλοιπα κλάσματα) σε φαινολικά συστατικά, κάτι το οποίο φαίνεται από την ένταση των κορυφών (Απορρόφηση, άξονας y του διαγράμματος) στο αντίστοιχο HPLC AcOEt 300 Crude 200 BuOH 100 Aqueous Χρόνος (min) Σχήμα 35. HPLC όλων των δειγμάτων στα 590 nm με σύστημα έκλουσης που περιγράφεται στον Πίνακα 13. Η συγκέντρωση κάθε δείγματος είναι 5 mg/ml Η εξαντλητική εκχύλιση του αρχικού ολικού εκχυλίσματος των φύλλων μύρτιλλων, που πραγματοποιήθηκε με τους οργανικούς διαλύτες AcOEt και BuOH, αποτυπώνεται στα χρωματογραφήματα μέσω της απουσίας κάποιων (βλ. BuOH) ή όλων των κορυφών (βλ. Aqueous) σε σχέση με το αρχικό ολικό εκχύλισμα των φύλλων μύρτιλλων, Crude. Επιπλέον, σημαντική πληροφορία εξάγεται από τα HPLC των δειγμάτων στα 350 και στα 590 nm (Σχήμα 35). Ύστερα από την επεξεργασία των φασμάτων απορρόφησης, διαπιστώθηκε η απουσία ανθοκυανινών από όλα τα δείγματα. Οι ανθοκυανίνες λόγω της δομής τους, αν περιέχονταν στα δείγματα, θα απορροφούσαν στην περιοχή nm και θα αποτυπώνονταν στο HPLC. Το συγκεκριμένο αποτέλεσμα μπορεί, αρχικά, να φαίνεται περίεργο μιας και τα φύλλα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή ήταν σε κάποιο βαθμό κόκκινου χρώματος, αλλά μπορεί να αιτιολογηθεί. Ο τρόπος εκχύλισης (διαλύτης, χρόνος, θερμοκρασία και μέθοδος εκχύλισης) της ξηρής δρόγης μπορεί να ευθύνεται για τις ουσίες που, τελικά, προσδιορίζονται. Η εκχύλιση των ανθοκυανινών απαιτεί πολικό διαλύτη (συνήθως ακετόνη, μεθανόλη, ακετονιτρίλιο) σε ποσοστό που κυμαίνεται από 50 έως 100%, καθώς και όξινες συνθήκες, ενώ στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε μόνο νερό. Σ ε λ ί δ α 87

98 Επιπρόσθετα, οι ανθοκυανίνες είναι δραστικές ενώσεις και ευαίσθητες στις αλλαγές του ph, αλλά και σε υψηλές συνθήκες θερμοκρασίας (Barnes et al., 2009). Η υψηλή θερμοκρασία (90 ο C) κατά τη διάρκεια της εκχύλισης, στην παρούσα διατριβή, πιθανόν να προκάλεσε την αποικοδόμηση αυτών των μορίων. Γενικά, πάντως, η σύσταση των περιεχόμενων συστατικών στα φύλλα μεταβάλλεται ανάλογα με την ποικιλία, τις συνθήκες και τη περιοχή καλλιέργειας, αλλά και το κλίμα. Αξίζει να σημειωθεί ότι είναι η πρώτη φορά που αναλύονται τα φύλλα των μύρτιλλων από καλλιέργεια της χώρα μας. Το συγκεκριμένο πρωτόκολλο ανάλυσης στην HPLC, έδωσε σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τη φυτοχημική εικόνα των ενώσεων που περιέχονται στα δείγματα (φαινολικά οξέα και φλαβονοειδή). Ωστόσο, δεν θεωρήθηκε κατάλληλο για ποσοτικό προσδιορισμό αυτών, εξαιτίας του πλήθους των συστατικών που συνεκλούονται στην περιοχή των 5 min και στα min. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι τα συγκεκριμένα συστατικά έχουν μεγάλο βαθμό συγγένειας και διαφέρουν μεταξύ τους ελάχιστα (πιθανόν ισομερή ή γλυκοζυλιωμένα φλαβονοειδή που διαφέρουν στο τμήμα του σακχάρου) Όξινη υδρόλυση του αφεψήματος και των κλασμάτων των φύλλων του Vaccinium corymbosum και έλεγχος με HPLC ανάλυση Η HPLC ανάλυση, η οποία πραγματοποιήθηκε παρείχε σημαντικά αποτελέσματα για την εικόνα των 4 δειγμάτων. Τα κλάσματα (Crude, AcOEt και BuOH) ήταν πλούσια σε φαινολικά οξέα και φλαβονοειδή. Βιβλιογραφικά (Gavrilova et al., 2011; Oszmianski et al., 2011; Harris et al., 2007; Fraisse et al., 1996), τα φλαβονοειδή και τα φαινολικά οξέα, τα οποία περιέχονται σε εκχυλίσματα των καρπών αλλά και των φύλλων μύρτιλλων, βρίσκονται κυρίως με τη μορφή γλυκοζυλιωμένων παραγώγων. Η όξινη υδρόλυση σκοπό είχε τη διάσπαση των γλυκοζιτικών δεσμών των φαινολικών συστατικών των δειγμάτων για διευκόλυνση του διαχωρισμού και της ταυτοποίησης αυτών, καθώς και τον μετέπειτα ποσοτικό προσδιορισμό τους με HPLC. Διάφοροι Ο-γλυκοζίτες μίας και μόνο αγλυκόνης καθώς και η ελεύθερη αγλυκόνη, μετά από την όξινη υδρόλυση, θα αποτυπωθούν με μία και μόνο κορυφή στην ΗPLC (Antolovich, 2000). Οι συνθήκες της όξινης υδρόλυσης μελετήθηκαν διεξοδικά. Κατά την 1 η Τροποποίηση στη μέθοδο των Proestos et al., 2008, μεταβλήθηκε ο χρόνος της υδρόλυσης. Οπτική παρατήρηση: σχηματισμός ιζήματος, στις 2, 4 και 8 ώρες, ο οποίος ήταν ανάλογος με τη διάρκεια αντίδρασης. Τα υδρολυμένα δείγματα (t=0 h, t=2 h, t=4 h, t=8 h) αναλύθηκαν με μέθοδο HPLC (Μαργιάννη, 2011), η οποία περιγράφηκε στον Πίνακα 13. Σ ε λ ί δ α 88

99 Απορρόφηση (mau) Ιανουάριος 2014, Πάτρα Σύμφωνα με την ΗPLC ανάλυση (Σχήμα 36 και Σχήμα 37), το χρωματογράφημα που αντιπροσωπεύει την υδρόλυση για t=0 h, δείχνει πως η διαδικασία έχει ήδη ξεκινήσει αμέσως μετά την προσθήκη όλων των αντιδραστηρίων και μόλις σε θερμοκρασία δωματίου (πριν τοποθετηθεί το δείγμα στο υδατόλουτρο με Τ=90 ο C), μιας και νέες κορυφές εμφανίζονται μετά τα 30 min, που πιθανώς αντιπροσωπεύουν τα σχηματισθέντα άγλυκα. [Για παράδειγμα, η κορυφή Q στο 32 min δεν ανιχνεύεται στο δείγμα του ολικού εκχυλίσματος μύρτιλλων (Σχήμα 33) και λαμβάνοντας υπόψη το χρόνο έκλουσης προτύπου ενώσεως και το φάσμα απορρόφησης (Σχήμα 38) είναι η κερκετίνη]. Όμως, ο χρόνος αυτός δεν ήταν ικανοποιητικός για την πλήρη υδρόλυση όλων των συστατικών, διότι η παρουσία των γλυκοζιτών των φλαβονοειδών είναι εμφανής στην περιοχή min. Μεταξύ των χρωματογραφημάτων για t=4 h και t=8 h, δεν υπήρχαν ουσιαστικές διαφορές t=0 h t=2 h t=4 h t=8 h Χρόνος (min) Σχήμα 36. HPLC του υδρολυμένου σε διάφορες χρονικές στιγμές, Crude στα 300 nm. Το σύστημα έκλουσης περιγράφεται στον Πίνακα 13 και η συγκέντρωση του δείγματος είναι 5 mg/ml Παρατηρώντας τα χρωματογραφήματα (Σχήμα 37), το ύψος της κορυφής (άξονας y) της κερκετίνης, στην υδρόλυση για t= 2 h, είναι παρόμοιο με τα αντίστοιχα των HPLC που απεικονίζουν την υδρόλυση για t=4 h και t=8 h. Οι κορυφές περίπου στα 20 και 30 min αντιστοιχούν (σύμφωνα με τα φάσματα απορρόφησης) σε φαινολικά οξέα, τα οποία προέκυψαν κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Το γεγονός ότι στις 4 h, η μία κορυφή (20 min) απουσιάζει, έδειξε πως η υδρόλυση στις 4 ώρες, ήταν καταστρεπτική για κάποια συστατικά. Για το λόγο αυτό, αλλά και για το ότι μετά το τέλος των υδρολύσεων μεγαλύτερης διάρκειας (4 h και 8 h) είχε καθιζάνει περισσότερο ίζημα (δυσκολία ποσοτικής ανάλυσης), η υδρόλυση για t=2 h κρίθηκε πιο ικανοποιητική από τις άλλες δύο. Ωστόσο, αξιόλογη παρατήρηση της συγκεκριμένης διερεύνησης ήταν ότι η ένωση Q, στο HPLC για 0 h, είχε μεγαλύτερη ένταση συγκριτικά με εκείνη που αποτυπώθηκε στο HPLC για 2 h. Σ ε λ ί δ α 89

100 % % Απορρόφηση (mau) Q Q: κερκετίνη Q Q Q t=0 h t=2 h t=4 h t=8 h Χρόνος (min) Σχήμα 37. HPLC του υδρολυμένου σε διάφορες χρονικές στιγμές, Crude στα 350 nm. Το σύστημα έκλουσης περιγράφεται στον Πίνακα 13 και η συγκέντρωση του δείγματος είναι 5 mg/ml Μήκος κύματος (nm) Μήκος κύματος (nm) Σχήμα 38. Τα φάσματα απορρόφησης UV-VIs της κερκετίνης (Q) όταν αυτή αναλύεται μόνη της (δεξιά) και στο υδρολυμένο εκχύλισμα (t=2h, αριστερά) Η πιθανότερη εξήγηση, για αυτό το αποτέλεσμα, είναι ότι ο χρόνος υδρόλυσης των φαινολικών συστατικών είναι διαφορετικός για κάθε συστατικό και όταν αυτός είναι μεγαλύτερος από τον ιδανικό για καθένα από αυτά, μπορεί να είναι καταστρεπτικός για τα σχηματιζόμενα μόρια (αγλυκόνες). Έτσι, θεωρείται δύσκολη η ταυτόχρονη υδρόλυση πολλών φαινολικών συστατικών, εφόσον καθένα από αυτά αποδομείται σε διαφορετικές συνθήκες (χρόνος, θερμοκρασία, ph). Είναι, επίσης, γνωστό ότι η ισχύς των γλυκοζιτικών δεσμών ποικίλει. Η φύση του σακχάρου και της θέσης πρόσδεσης στο βασικό σκελετό των φλαβονοειδών είναι τα δύο χαρακτηριστικά που καθορίζουν την ευαισθησία αυτών των δεσμών. Για παράδειγμα, οι δεσμοί στα γλυκουρονίδια είναι πιο ανθεκτικοί στις όξινες συνθήκες σε σχέση με τους γλυκοζιτικούς. Οι C- Σ ε λ ί δ α 90

101 Απορρόφηση (mau) Ιανουάριος 2014, Πάτρα γλυκοζιτικοί δεσμοί παραμένουν ανέπαφοι παρά τις δομικές αναδιατάξεις που μπορεί να συμβούν με τα ζέοντα οξέα (Antolovich, 2000). Στην 2 η Τροποποίηση στη μέθοδο των Proestos et al., 2008, μεταβλήθηκε το τελικό στάδιο, δηλαδή η επεξεργασία του δείγματος πριν την έγχυσή του στην HPLC. Ο χρόνος της αντίδρασης ήταν οι 2 ώρες που επιλέχτηκαν κατά την 1 η τροποποίηση. Οπτική παρατήρηση: σχηματισμός ιζήματος, κατά το τέλος της αντίδρασης, αλλά και στην υδατική φάση κατά την εκχύλιση υγρού υγρού με AcOEt. Σκοπός της παραπάνω αλλαγής στην επεξεργασία του δείγματος ήταν ο εμπλουτισμός του με τα άγλυκα για την, μετέπειτα, ευκολότερη ποσοτικοποίηση αυτών. Εκχυλίζοντας με σύστημα οργανικού διαλύτη και νερό, επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός των άγλυκων από τα σάκχαρα και από άλλα παραπροϊόντα της αντίδρασης που τυχόν υπήρχαν, λόγω του ιζήματος που σχηματίσθηκε στην υδατική φάση. Στο Σχήμα 39 παρατίθενται τα δύο χρωματογραφήματα: 1 η τροποποίηση στη μέθοδο (κάτω) και 2 η τροποποίηση στη μέθοδο (πάνω). Το συστατικό Q (κερκετίνη) που εκλούσθηκε περίπου στο 32 min, αποτυπώθηκε στο χρωματογράφημα με κορυφή πολύ μεγαλύτερης έντασης σε σύγκριση με την 1 η Τροποποίηση Εκχύλιση με AcOEt Αραίωση με MeOH Χρόνος min) Σχήμα 39. HPLC του Crude από την 1 η τροποποίηση, σε σχέση με το εμπλουτισμένο μετά την υδρόλυση Crude στα 350 nm. Το σύστημα έκλουσης περιγράφεται στον Πίνακα 13 και η συγκέντρωση του δείγματος είναι 5 mg/ml Η τροποποίηση αυτή βοήθησε γενικότερα στην εκχύλιση περισσότερων συστατικών ενδιαφέροντος, αφού πέρα της κορυφής αυτής εμφανίστηκαν και άλλες κορυφές στην περιοχή εκείνη του χρωματογραφήματος. Σ ε λ ί δ α 91

102 Απορρόφηση (mau) Κατά την 3 η Τροποποίηση στη μέθοδο των Proestos και συνεργατών (2008), η αλλαγή πραγματοποιήθηκε στο διαλύτη. Ως διαλύτης όξινης υδρόλυσης επιλέχθηκε η υδατική ακετόνη. Οπτική παρατήρηση: σχηματισμός ιζήματος, κατά το τέλος της αντίδρασης, αλλά και στην υδατική φάση κατά την εκχύλιση με AcOEt. Το ίζημα στο τέλος της αντίδρασης ήταν πολύ λιγότερο σε σχέση με την 2 η τροποποίηση. Σκοπός αυτής της τροποποίησης ήταν η ελαχιστοποίηση ή ακόμα και η εξαφάνιση του ιζήματος. Η ακετόνη θεωρήθηκε ικανός διαλύτης για την διάλυση του δείγματος. Επιπλέον, δοκιμές διάλυσης του ιζήματος με διάφορους διαλύτες: α) διμεθυλοφορμαμίδιο (πολικότερος διαλύτης σε σχέση με τη μεθανόλη και β) ακετόνη (ίδια πολικότητα με τη μεθανόλη) ή μεταβάλλοντας το ph από όξινο σε βασικό με προσθήκη καυστικού νατρίου, στην 2 η Τροποποίηση, έδειξαν πως η ακετόνη είχε την ικανότητα να διαλύσει πλήρως το ίζημα % Μεθανόλη 60% Ακετόνη Χρόνος (min) Σχήμα 40. HPLC του υδρολυμένου Crude με μεθανόλη (πάνω) και ακετόνη (κάτω) Crude στα 350 nm. Το σύστημα έκλουσης περιγράφεται στον Πίνακα 13 και η συγκέντρωση του δείγματος είναι 5 mg/ml Η υδατική ακετόνη όπως και η υδατική αιθανόλη έχουν χρησιμοποιηθεί ως διαλύτες εκχύλισης καρπών πλουσίων σε φλαβονοειδή (Licodiedoff et al., 2013). Στο Σχήμα 40 απεικονίζεται το χρωματογράφημα μετά την όξινη υδρόλυση με υδατική ακετόνη σε σχέση με εκείνο της 2 ης τροποποίησης (υδρόλυση με υδατική μεθανόλη). Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, επιλέχθηκε η τεχνική της εκχύλισης με οργανικό διαλύτη προς εμπλουτισμό των άγλυκων. Παρόλο που η χρήση της ακετόνης ως διαλύτης φάνηκε πιο ικανοποιητική (σχηματισμός μικρότερης ποσότητας ιζήματος), τα συστατικά που εκλούσθηκαν ήταν λιγότερα (περιοχή min). Γι αυτό το λόγο, η μέθοδος απορρίφθηκε και έχοντας ως επιλεγμένο διαλύτη την υδατική μεθανόλη πραγματοποιήθηκε αλλαγή σε άλλη παράμετρο των συνθηκών της υδρόλυσης. Σ ε λ ί δ α 92

103 Απορρόφηση (mau) Ιανουάριος 2014, Πάτρα Η αλλαγή της θερμοκρασίας ήταν η τελευταία τροποποίηση που πραγματοποιήθηκε (4 η Τροποποίηση). Επιλέχτηκαν ήπιες συνθήκες υδρόλυσης, με χαμηλή θερμοκρασία (37 o C) για δύο, αλλά και για 16h. Εφόσον η επιλεχθείσα θερμοκρασία ήταν χαμηλή, κρίθηκε λογικό να αυξηθεί ο χρόνος της αντίδρασης. Άλλωστε ήπιες συνθήκες έχουν χρησιμοποιηθεί για την υδρόλυση γλυκοζυλιωμένων φλαβονολών (Häkkinen c et al., 1998; Nuutila et al., 2002). Παρατήρηση: σχηματισμός ιζήματος, κατά το τέλος της αντίδρασης και στην υδατική φάση κατά την εκχύλιση υγρού υγρού με AcOEt. Το ίζημα στο τέλος της αντίδρασης ήταν πολύ λιγότερο σε σχέση με την 2 η και 3 η τροποποίηση. Μέσω της χρωματογραφικής απεικόνισης των υδρολύσεων (Σχήμα 41), φαίνεται πως η υδρόλυση που είχε διάρκεια 16 ώρες ήταν περισσότερο ικανοποιητική σε σχέση με εκείνη που διήρκησε 2 ώρες, στις ίδιες συνθήκες (37 o C). Επομένως, η αντίδραση που έλαβε χώρα για 2 ώρες στους 37 o C απορρίφθηκε. Όσο αφορά την όξινη υδρόλυση των 16 ωρών, δεν ήταν πλήρης για όλα τα περιεχόμενα συστατικά, αν και οι ήπιες συνθήκες βοήθησαν στην εμφάνιση πολύ λιγότερης ποσότητας ιζήματος μετά το τέλος της αντίδρασης. Στην περιοχή min παρατηρήθηκαν χαμηλής έντασης κορυφές, οι οποίες προσδιορίζουν μη υδρολυμένα φαινολικά συστατικά τα οποία δεν υδρολύθηκαν (γλυκοζίτες των φλαβονοειδών) (Μαργιάννη, 2011). Όπως χαρακτηριστικά διαπιστώνεται μέσω του Σχήματος 41, το συγκεκριμένο αποτέλεσμα παρατηρείται σε μεγαλύτερο βαθμό στην υδρόλυση των 2 ωρών t=16 h t=2 h Χρόνος (min) Σχήμα 41. HPLC του υδρολυμένου Crude για 2h (κάτω) και 16h (πάνω) στα 350 nm. Το σύστημα έκλουσης περιγράφεται στον Πίνακα 13 και η συγκέντρωση του δείγματος είναι 5 mg/ml Με σκοπό την συντόμευση της διαδικασίας και λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω ποιοτικά δεδομένων υιοθετήθηκε η μέθοδος των Proestos και συνεργατών (2008). Η εκχύλιση με Σ ε λ ί δ α 93

104 Απορρόφηση (mau) οργανικό διαλύτη, που στόχο είχε τον εμπλουτισμό των άγλυκων ήταν πολυπλοκότερη και μειονεκτούσε στο ότι υπήρχε καθίζηση ιζήματος σε δύο στάδια (μετά την υδρόλυση και μετά την εκχύλιση υγρού υγρού με οξικό αιθυλεστέρα). Παρά τις σχετικές αναφορές στη βιβλιογραφία, ποσοτική ανάλυση δεν κατέστη δυνατή με την επιλεχθείσα μέθοδο, λόγω της παρουσίας του ιζήματος. Εντούτοις, θεωρήθηκε καλή μέθοδος για τον ποιοτικό χαρακτηρισμό του πολύπλοκου εκχυλίσματος. Η προσέγγιση μας επιβεβαιώνεται και άλλους ερευνητές (Antolovich, 2000), οι οποίοι αναφέρουν ότι οι μέθοδοι υδρόλυσης είναι ιδιαίτερα χρήσιμες για τον χαρακτηρισμό και τη δομική διαλεύκανση αγνώστων φλαβονοειδών. Τα αποτελέσματα της HPLC ανάλυσης, από την όξινη υδρόλυση στις συνθήκες επιλογής (50% ΜeOH, 2 h, 90 o C), για τα τέσσερα δείγματα, αποτυπώνονται στο Σχήμα 42 και στο Σχήμα 43. Στα Σχήματα 42 και 43 φαίνονται τα συστατικά που σχηματίσθηκαν μετά το τέλος της όξινης υδρόλυσης στα 350 και 300 nm, αντίστοιχα. Τα συστατικά που εκλούσθηκαν στην αρχή φέρουν μέγιστο απορρόφησης στα 300 nm (Σχήμα 43), ενώ αυτά που εκλούσθηκαν στην περιοχή min στα 350 nm (Σχήμα 42). Η απουσία των κορυφών που εκπροσωπούσαν γλυκοζίτες φλαβονοειδών και υπήρχαν στα δείγματα πριν την υδρόλυση (Σχήμα 34) είναι η απόδειξη της επιτυχίας της προόδου της αντίδρασης της όξινης υδρόλυσης AcOEt Crude BuOH Aqueous Χρόνος (min) Σχήμα 42. HPLC όλων των υδρολυμένων δειγμάτων στα 350 nm. Το σύστημα έκλουσης περιγράφεται στον Πίνακα 13 και η συγκέντρωση του δείγματος είναι 5 mg/ml Είναι καλό να διευκρινιστεί ότι η έντονη κορυφή που βρίσκεται στο 5 min, στα 300 nm, είναι η απορρόφηση της ακετόνης (μέγιστο απορρόφησης στα 264 nm), η οποία χρησιμοποιήθηκε για τη διάλυση των δειγμάτων. Σ ε λ ί δ α 94

105 Απορρόφηση (mau) Ιανουάριος 2014, Πάτρα Για την υδρόλυση δεν έχει αναπτυχθεί καμία τελική μέθοδος που να χρησιμοποιείται. Παρά το γεγονός ότι το πρόσθετο στάδιο της όξινης υδρόλυσης δημιουργεί νέα ερωτήματα σχετικά με την προετοιμασία του δείγματος, τη σταθερότητα, και τη δυνατότητα ανάκτησης του αναλύτη, η διάσπαση των εστερικών και γλυκοζιτικών δεσμών απλοποιεί σημαντικά την ανάλυση, μειώνοντας το πλήθος των συστατικών. Η ανάπτυξη μιας μεθοδολογίας υδρόλυσης, κατά την οποία ο ταυτόχρονος αλλά και ποσοτικός προσδιορισμός όλων των συστατικών είναι εφικτός, θα αποτελούσε σημαντική βοήθεια για τη ανάλυση δειγμάτων με χρωματογραφικές τεχνικές (Antolovich, 2010) AcOEt Crude BuOH Aqueous Χρόνος (min) Σχήμα 43. HPLC όλων των υδρολυμένων δειγμάτων στα 300 nm. Το σύστημα έκλουσης περιγράφεται στον Πίνακα 13 και η συγκέντρωση του δείγματος είναι 5 mg/ml 6.3. Ταυτοποίηση των συστατικών του αφεψήματος και των κλασμάτων των φύλλων του Vaccinium corymbosum και των αντίστοιχων υδρολυμένων δειγμάτων με UPLC-ESI-MS Με την Υγρή Χρωματογραφία Υπερυψηλής Απόδοσης συζευγμένη με MS αναλύθηκε τόσο το ολικό εκχύλισμα φύλλων μύρτιλλων, όσο και τα κλάσματα που προέκυψαν από την εξαντλητική εκχύλιση αυτού. Επιπλέον, UPLC MS ανάλυση πραγματοποιήθηκε στα δείγματα που προέκυψαν μετά την όξινη υδρόλυση αυτών. Η εφαρμογή της συγκεκριμένης, με μεγάλη ευαισθησία, αναλυτικής τεχνικής σκοπό είχε την ταυτοποίηση των συστατικών που βρίσκονται στα προαναφερθέντα δείγματα. Συγκεκριμένα, στόχος των πειραμάτων UPLC-MS ήταν να ταυτοποιηθούν, οι κορυφές που είχαν βρεθεί με την HPLC, μέσω των μοριακών ιόντων και πιθανών χαρακτηριστικών θραυσμάτων για την κάθε υπό εξέταση ένωση. Στην αρχή των πειραματικών διαδικασιών,δοκιμάσθηκε η τεχνική τόσο του θετικού (ESI+), όσο και του αρνητικού (ESI-) ιονισμού στο υδρολυμένο και μη υδρολυμένο δείγμα του ολικού Σ ε λ ί δ α 95

106 εκχυλίσματος φύλλων (Crude). Η συγκεκριμένη διερεύνηση είχε σκοπό τον έλεγχο της δυνατότητας ιονισμού των συστατικών που περιέχονται στα επιμέρους δείγματα. O αρνητικός ιονισμός επιλέχθηκε εφόσον τα συστατικά ιονίσθηκαν αποδοτικότερα, κρίνοντας από το πλήθος και την ένταση των κορυφών που αποτυπώθηκαν στο TIC χρωματογράφημα. Η συμπεριφορά αυτή των συστατικών μπορεί να θεωρηθεί λογική, εφόσον οι φαινολικές ενώσεις είναι συστατικά που φέρουν στη δομή τους καρβοξυλικές και φαινολικές ομάδες, οι οποίες μπορούν εύκολα να αποπρωτονιωθούν. Η ταυτοποίηση των συστατικών πραγματοποιήθηκε με βάση τα μοριακά ιόντα που καταγράφηκαν στα φάσματα μάζας για κάθε δείγμα και σε συνδυασμό με τα βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με τα συστατικά των φύλλων των ειδών Vaccinium. Η υψηλή διαχωριστική ικανότητα του υβριδικού αναλυτή, Q-TOF, προσέφερε τη δυνατότητα διαχωρισμού ιόντων με τιμές ακριβούς μάζας, με ακρίβεια ως το τέταρτο δεκαδικό ψηφίο. Επιπλέον, η λειτουργία της διαδοχικής αύξησης της ενέργειας (2 ev, 30 ev, 60 ev, 100 ev), στη κυψελίδα συγκρούσεων, βοήθησε στην ανίχνευση θραυσμάτων των κύριων κορυφών στο φάσμα μάζας. Μέσω των θραυσμάτων, ο δομικός προσδιορισμός των συστατικών καθίσταται πιο εύκολος και επιτυγχάνεται η μεταβολομική προσέγγιση του εκχυλίσματος των φύλλων V. corymbosum. Η ηλεκτρονική βιβλιοθήκη Mass Bank ( λειτούργησε ως βοηθητικό εργαλείο στην διεξαγωγή των αποτελεσμάτων. Σε τέτοιες βιβλιοθήκες βρίσκονται καταχωρημένα τα φάσματα μάζας πολλών ενώσεων Ταυτοποίηση των συστατικών του αφεψήματος και των κλασμάτων των φύλλων του Vaccinium corymbosum με UPLC-ESI-MS Στο συγκεκριμένο εδάφιο παρουσιάζονται τα φαινολικά συστατικά, τα οποία εντοπίστηκαν και ταυτοποιήθηκαν στο ολικό εκχύλισμα φύλλων του Vaccinium corymbosum και στα επιμέρους κλάσματα. Στον Πίνακα 19 παρουσιάζονται τα φαινολικά συστατικά τα οποία προσδιορίσθηκαν τόσο στο ολικό εκχύλισμα φύλλων μύρτιλλων, όσο και στα κλάσματα (AcOEt, BuOH, Aqueous). Αναφέρονται τα μοριακά ιόντα που εντοπίστηκαν σε κάθε δείγμα και οι χρόνοι κατακράτησης αυτών. Επιπρόσθετα, αναγράφονται τα θραύσματα, τα οποία προέκυψαν ύστερα από την αύξηση της ενέργειας στην κυψελίδα θραυσματοποίησης και έδωσαν πολύ σημαντικές δομικές πληροφορίες. Στην τελευταία στήλη του πίνακα δίνεται η ακρίβεια μάζας υπολογισμένη σε ppm. Μεταξύ των συστατικών που ανιχνεύθηκαν, περιλαμβάνονται φαινολικά οξέα και φλαβονοειδή. Αξίζει να σχολιαστεί το γεγονός, ότι δεν προσδιορίσθηκαν καθόλου Σ ε λ ί δ α 96

107 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Πίνακας 19. Συστατικά που ανιχνεύθηκαν στο ολικό εκχύλσιμα φύλλων (Crude) και στα κλάσματα (AcOEt, BuOH, Aqueous) με UPLC-MS Α/Α Συστατικό* Χημική Δομή [M-H]- θεωρητικό Δείγματα R t (min) [Μ-Η]- πειραματικό και πιθανά θραύσματα ppm RI** 1 QA C 7 H 12 O Crude , AcOEt 0, ,8 199 BuOH , Aqueous 0, , Procy-B1/B2 C 30 H 26 O AcOEt 1, (425/407/289) -3, (3 ή 4)CQA+ (5)CQA C 16 H 18 O CA C 9 H 8 O Kand-A1/A2 C 39 H 32 O My-3-Rut 7α 7β 8 My-3-Glc +My-3-Gal My-3-Ara/ My-3-Xyl Crude (191) -5, AcOEt (191) -12, ,10+2,21 BuOH (191) -10, Aqueous (191) -4, Crude (135) -3, ,41 AcOEt (135) -11, BuOH 2, (135) -10,6 97 Crude (289) 4, ,73 AcOEt (289) 10,2 786 C 27 H 30 O Crude 2, (316) BuOH 2, (316) -3,0 249 Crude (316) -1, C 21 H 20 O AcOEt 2,80+2, (316) 1, C 20 H 18 O , Que-3-Rut C 27 H 30 O α 10β Que-3-Glc+ Que-3-Gal C 21 H 20 O Kae-3-Rut C 27 H 30 O α 12β Que-3-Ara+ Que-3-Xyl C 20 H 18 O Que-3-Rha C 21 H 20 O Cinch-Ia/Ib C 30 H 26 O Que-3-(6 - ac)-glc) C 23 H 22 O Que C 15 H 10 O BuOH (316) 2,9 463 Crude (316) 4, AcOEt (316) 1,1 185 Crude (300) -0, AcOEt 3, (300) 3, BuOH (300) -2, Crude 3,23+3, (300/271) -1, AcOEt 3,21+3, (300/271) 6, BuOH 3,23+3, (300) -9,1 215 Crude (285) 0, ,45 AcOEt (285) 12,8 530 BuOH 3, (285) -8,8 194 Crude 3,49+3, (300/271) 3, AcOEt 3,49+3, (300/271) 7, Crude (300) -0, ,63 AcOEt (300) 14,3 617 Crude , ,70 AcOEt , Crude , ,75 AcOEt (300) 6, Crude , ,76 AcOEt (271/151) 5, *QA: κινικό οξύ, Procy-Β: προκυανιδίνη τύπου Β, CQA: χλωρογενικό οξύ, CA: καφεϊκό οξύ, Kand: καντελίνη, My: μυρικετίνη, Que: κερκετίνη, Cinch: κινχοναΐνη, Glc: γλυκόζη, Gal: γαλακτόζη, Rut: ρουτινόζη, Ara: αραβινόζη, Xyl: ξυλόζη, Rha: ραμνόζη, ac: ακετυλ **RI: σχετική ένταση (Relative Intensity) Σ ε λ ί δ α 97

108 ανθοκυανίνες, γεγονός το οποίο επιβεβαιώνει την HPLC ανάλυση που είχε γίνει και περιγράφηκε στο εδάφιο Οι ενώσεις 1, 3 και 4 ανήκουν στην κατηγορία των φαινολικών οξέων και πιο συγκεκριμένα στα υδρόξυκινναμωμικά οξέα. Το κινικό οξύ (1) και το καφεϊκό οξύ (4) αποτελούν τους δομικούς λίθους του χλωρογενικού οξέους (3). Για το κινικό οξύ ανιχνεύθηκε το θραύσμα με m/z= 135, το οποίο αντιστοιχεί σε απώλεια COΟ - (m/z= 44) (Σχήμα 44). Η κορυφή στο m/z= 191, η οποία υποδεικνύει απώλεια C 7 H 12 O 6, οδήγησε στο χαρακτηρισμό του χλωρογενικού οξέος (Σχήμα 45). Ιδιαίτερη ήταν η συμπεριφορά του χλωρογενικού οξέος, μιας και υπήρξαν δύο κορυφές σε χρόνους: 2,10 και 2,21 min. Οι κορυφές αυτές, χαρακτηρίσθηκαν ως ισομερή μεταξύ τους, εφόσον παρουσίασαν όμοια χρωματογραφική συμπεριφορά, έχοντας κοινό θραύσμα κατά την αύξηση της ενέργειας. Σύμφωνα με τις εντάσεις των κορυφών των συστατικών στα TIC χρωματογραφήματα, φαίνεται ότι η ένωση 3 αποτελεί το κυριότερο συστατικό όλων των δειγμάτων. Το δύο δείγματα: AcOEt και BuOH είχαν μεγαλύτερη ένταση σε σχέση με το ολικό εκχύλισμα (Crude). Ας σημειωθεί ότι ο όρος χλωρογενικό οξύ αναφέρεται στο 5-Ο- καφεοϋλο- κινικό οξύ και όχι σε όλη την οικογένεια των ισομερών. Στο MS, εκτός από το ιόν [Μ-Η] -, παρατηρήθηκε και ένα άλλο ιόν στο m/z= 707 το οποίο αποδόθηκε στο διμερές του χλωρογενικού οξέος [2Μ-Η]. Οι πιθανές δομές του οξέος (3) είναι δύο από τα παρακάτω: α) 3-Ο-καφεοϋλο- κινικό οξύ ή χλωρογενικό οξύ, β) 4-Ο-καφεοϋλο- κινικό οξύ ή κρυπτοχλωρογενικό οξύ, γ) το 5-Οκαφεοϋλο- κινικό οξύ ή νεοχλωρογενικό οξύ. Γενικά, το χλωρογενικό οξύ έχει ταυτοποιηθεί στα φύλλα άλλων ειδών Vaccinium (Harris et al., 2007; Hokkanen et al., 2009; Matsuo et al., 2010; Oszmianski et al., 2011). Για το Vaccinium corymbosum, σε μελέτη σχετικά με το εκχύλισμα των καρπών του (Gavrilova et al., 2011), έχουν ταυτοποιηθεί δύο ισομερή, αποτέλεσμα που συμφωνεί και με το εκχύλισμα των φύλλων στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή. Οι Kim και συνεργάτες (2010), επίσης, έχουν απομονώσει το χλωρογενικό οξύ από τα φύλλα του V. corymbosum. Η ένωση 2, η οποία ταυτοποιήθηκε, ανήκει στην κατηγορία των προανθοκυανιδινών και πιο συγκεκριμένα στις προκυανιδίνες. Είναι διμερές Β-τύπου και μπορεί να είναι είτε η προκυανιδίνη Β1, είτε η Β2. Τα δύο μόρια έχουν κοινά θραύσματα και έτσι κατέστη δύσκολος ο ακριβής προσδιορισμός της ένωσης που εκλούσθηκε στο 1,85 min. Η κορυφή m/z= 289 υποδεικνύει την απώλεια του ενός εκ των δύο μονομερών. Η εμφάνιση του ιόντος [M-H- C 3 H 8 O 3 ] - στο m/z= 425, από απώλεια 152 amu, προήλθε από μετάθεση Retro Diels Alder του ετεροκυκλικού δακτυλίου. Στη συνέχεια, και με απώλεια ενός μορίου νερού (18 amu), δημιουργήθηκε το ιόν [M-H-170] - στο m/z= 407 (Rodriguez-Medina et al., 2009). Στα στελέχη, του Vaccinium angustifolium, έχουν εντοπιστεί η προκυανιδίνη Β1 και Β2 (Harris et al., 2007), Στην ίδια μελέτη, κατά την οποία εξετάσθηκαν και τα φύλλα του φυτού, δεν εντοπίστηκαν τα συγκεκριμένα μόρια. Σχετικά με το Vaccinium corymbosum, για το οποίο Σ ε λ ί δ α 98

109 Ιανουάριος 2014, Πάτρα έχουν εξετασθεί οι καρποί του (Gavrilova et al., 2011), έχει εντοπιστεί η προκυανιδίνη Β2 στις ποικιλίες Toro, Legacy, Bluecrop. Το εκχύλισμα, στην παρούσα εργασία, παρασκευάσθηκε από τα φύλλα των ποικιλιών Bluecrop και Patriot και έτσι η δομή που προσδιορίσθηκε, είναι πολύ πιθανό να ανήκει στην προκυανιδίνη Β2 και όχι στη Β1. Αν και η συγκεκριμένη ένωση, εντοπίζεται πρώτη φορά στα φύλλα του είδους V. corymbosum (είδος: ψηλός θάμνος ή highbush), στα φύλλα του V. ashei (είδος: rabbiteye) έχουν εντοπιστεί και οι δύο προκυανιδίνες σε πρόσφατη μελέτη των Matsuo και συνεργατών (2010). Σ ε λ ί δ α 99

110 Ένωση 3 Ένωση 4 Σχήμα 44. Φάσματα μάζας πλήρους σάρωσης (FS) της ένωσης 3 στο δείγμα Crude και της ένωσης 4 στο δείγμα AcOEt, στις τέσσερις διαφορετικές λειτουργίες (1: 2 ev, 2: 30 ev, 3: 60 ev, 4: 100 ev) Σ ε λ ί δ α 100

111 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Στην τελευταία μελέτη, πέρα από τις διμερείς προκυανιδίνες, ανιχνεύθηκαν και υποκατεστημένες με φαινυλοπροπανοειδή μονάδα, κατεχίνες με την ονομασία κινχοναΐνες (κινχοναΐνη Ια και Ιβ). Βάσει της υψηλής ακρίβειας μάζας αλλά και βάσει της προαναφερθείσας βιβλιογραφίας, η ένωση 14, με μοριακό ιόν [Μ-Η] - = 451, θεωρήθηκε ότι ανήκει σε μία από τις δύο κινχοναΐνες. Η φαινυλοπροπανοειδής μονάδα σχετίζεται με το καφεϊκό οξύ, που με τη σειρά του σχετίζεται με τη συνύπαρξη στα δείγματα υψηλών συγκεντρώσεων καφεοϋλο- κουνικών οξέων. In vitro βιομιμητική σύνθεση των κινχοναϊνών έχει πραγματοποιηθεί έχοντας αρχικά μόρια την κατεχίνη και το καφεϊκό οξύ (Chen et al., 1993). Επιπρόσθετα, οι Matsuo και συνεργάτες (2010) εντόπισαν στα φύλλα του V. ashei τις προκυανιδίνες καντελίνη Α-1 και Α-2, οι οποίες είναι διμερή που απαρτίζονται από τα μονομερή κινχοναΐνη και κατεχίνη [κινχοναΐνη-1α-(4β->8)-κατεχίνη και κινχοναΐνη-1α-(4β- >8)-επικατεχίνη, αντίστοιχα]. Η ένωση 5 χαρακτηρίσθηκε ως ένα από τα δύο αυτά μόρια, με χαρακτηριστικό θραύσμα m/z= 289, το οποίο αντιπροσωπεύει την κατεχίνη ή την επικατεχίνη. Στο δείγμα AcOEt η συγκεκριμένη κορυφή (m/z= 739) είχε μεγαλύτερη % απορρόφηση απ ότι στο Crude, γεγονός που επισημαίνει την πλούσια πολυφαινολική σύσταση του συγκεκριμένου δείγματος. Τέτοια συστατικά ανιχνεύθηκαν για πρώτη φορά στα φύλλα του V. myrtillus το 2009, από τους Hokkanen και συνεργάτες. Σχήμα 45. Ονοματολογία θραυσμάτων που εφαρμόζεται στους Ο- γλυκοζίτες (Domon and Costello., 1988) Όλες οι υπόλοιπες ενώσεις (6 13 και 15 16) ανήκουν στην κατηγορία των φλαβονολών. Οι ενώσεις 6 13 και η 15 είναι εκπρόσωποι γλυκοζυλιωμένων φλαβονολών, ενώ η ένωση 16 είναι μη γλυκοζυλιωμένη φλαβονόλη. Η 6 χαρακτηρίσθηκε ως ο 3- ρουτινοζίτης της μυρικετίνης με [M-H] - = 625. Η παρουσία του ιόντος [Μ-2Η-308] - στο m/z= 316, κατά την αύξηση της ενέργειας, έδειξε την απώλεια αποπρωτονιωμένου ρουτινοζίτη και αποδόθηκε στην μυρικετίνη, που αποτελεί το άγλυκο τμήμα της 6. Τα σάκχαρα μπορούν να συνδέονται στην ίδια θέση στην αγλυκόνη, σχηματίζοντας ένα δισακχαρίτη (Ο- διγλυκοζίτης), είτε σε δύο διαφορετικές θέσεις (δι-ο- γλυκοζίτης). Η ταυτόχρονη απώλεια μίας εξόζης και μίας δεοξυεξόζης, θα χαρακτήριζε ένα δι-ο- γλυκοζυλιωμένο ισομερές. Όμως, όταν κατά τον Σ ε λ ί δ α 101

112 αρνητικό ιονισμό, παρατηρούνται πολλά θραύσματα Υ ο και καθόλου θραύσματα Υ 1, είναι προφανής η παρουσία ενός Ο- διγλυκοζυλιωμένου ισομερούς με 1->6 δεσμό, μεταξύ των δύο σακχάρων (Vukics et al., 2008; Pinheiro et al., 2012) (Σχήμα 45). Η απώλεια μίας γλυκόζης (162 amu) και μίας ραμνόζης (146 amu), από τις οποίες αποτελείται ο δισακχαρίτης ρουτινόζη, εξηγούν την απώλεια 308 amu. Απώλειες όπως 132, 162 και 146 amu είναι χαρακτηριστικές για τις πεντόζες (ξυλόζη ή αραβινόζη), τις εξόζες (γλυκόζη ή γαλακτόζη) και τη δεοξυεξόζη (ραμνόζη), αντίστοιχα (Saldanha et al., 2013). H ένωση 7 χαρακτηρίσθηκε ως γλυκοζυλιωμένη μυρικετίνη με το τμήμα του σακχάρου να είναι μία εξόζη, λόγω του ότι η παρουσία του ιόντος [Μ-2Η-162] -, στο m/z= 316 υποδηλώνει απώλεια μίας εξόζης, η οποία μπορεί να είναι είτε η γλυκόζη, είτε η γαλακτόζη (Σχήμα 46). Λαμβάνοντας υπόψη ότι η ένωση 7, εμφανίσθηκε με τη μορφή διπλής κορυφής στο χρωματογράφημα, σε πολύ κοντινούς χρόνους, θεωρήθηκε ότι τα δείγματα περιέχουν και τις δυό φλαβονόλες: 3-Ο- γλυκοζίτης της μυρικετίνης (7α) και 3-Ο- γαλακτοζίτης της μυρικετίνης (7β). Σχήμα 46. Φάσμα μάζας πλήρους σάρωσης (FS) της ένωσης 7 στο δείγμα Crude, στις τέσσερις διαφορετικές λειτουργίες (1: 2 ev, 2: 30 ev, 3: 60 ev, 4: 100 ev) Το ίδιο συνέβη και για την γλυκοζυλιωμένη ένωση 8, για την οποία το τμήμα του σακχάρου ήταν μία πεντόζη. Ο χαρακτηρισμός της εν λόγω ένωσης έγινε λόγω της παρουσίας του ιόντος [Μ-2Η-132] -, στο m/z= 316. Βέβαια, στη θέση της πεντόζης μπορεί να είναι, είτε η ξυλόζη, Σ ε λ ί δ α 102

113 Ιανουάριος 2014, Πάτρα είτε η αραβινόζη, επομένως η ένωση 8 χαρακτηρίσθηκε είτε ως 3-Ο -αραβινοζίτης της μυρικετίνης ή ως 3-Ο- ξυλοζίτης της μυρικετίνης. Οι ενώσεις 9, 10, 12, 13 και 14 χαρακτηρίσθηκαν, και κοινό σημείο αυτών ήταν η ύπαρξη ενός ιόντος στο m/z= 300 και όχι το αναμενόμενο μοριακό ιόν m/z= 301. Η συγκεκριμένη συμπεριφορά της κερκετίνης, αλλά και άλλων άγλυκων, έχει παρατηρηθεί ξανά. Πρόσφατη μελέτη των Luo και συνεργατών (2013), οι οποίοι ανέλυσαν με LC ESI MS το εκχύλισμα φύλλων της γλυκοπατάτας, αναφέρει ως θυγατρικό ιόν, ύστερα από MS/MS του μοριακού ιόντος αποπρωτονιωμένων γλυκοζιτών κερκετίνης, το m/z= 300. Βέβαια, στη μελέτη αλλά και στην παρούσα διατριβή υπάρχει και το ιόν στο m/z= 301, αλλά σε μικρότερη % απορρόφηση. Το συγκεκριμένο φαινόμενο αποδόθηκε στον πιθανό σχηματισμό ανιόντος κινόνης. Αυτό το ιόν είναι διαγνωστικό για γλυκοζίτες κερκετίνης, καθώς και για την ελεύθερη κερκετίνη (Luo et al., 2013). Για την ένωση 9 παρουσιάστηκε στο φάσμα μάζας το ιόν [M-2H-308] -, για την 10 το [M-2H-162] -, την 12 το [M-2H-132] -, τη 13 το [M-2H-146] - και για τη 14 το [Μ-2H ] -. Όσο αφορά τη τελευταία ένωση, η απώλεια ( )= 204 amu, οδήγησε στο συμπέρασμα ότι η ένωση περιείχε ακετυλο ομάδα (42 amu) συνδεδεμένη σε μία εξόζη. Επιπλέον, στην ένωση 10 και στη 12, παρουσιάσθηκε ένα ακόμη ιόν στο m/z= 271, το οποίο είναι χαρακτηριστικό για 3-Ο- γλυκοζίτες φλαβονολών, εφόσον προέρχεται από απώλεια 30 amu, από το προκύπτον μοριακό ιόν της αγλυκόνης (Saldanha et al., 2013) (Σχήμα 47). Μόνο στην ένωση 10, παρατηρήθηκε η ύπαρξη διμερούς [2Μ-Η] - στο m/z= 927 (Σχήμα 48). Έτσι, οι ενώσεις ταυτοποιήθηκαν ως εξής: 3-Ο- ρουτινοζίτης της κερκετίνης (ρουτίνη) (9), 3-Ογλυκοζίτης της κερκετίνης (ισοκερσιτρίνη) (10α) και 3-Ο-γαλακτοζίτης της κερκετίνης (υπεροζίτης) (10β) (λόγω έκλουσης διπλής κορυφής), 3-Ο- αραβινοζίτης της κερκετίνης (12α) και 3-Ο- ξυλοζίτης της κερκετίνης (12β) (λόγω έκλουσης διπλής κορυφής), 3-Οραμνοζίτης της κερκετίνης (13) και 3-Ο- ακετυλο- γλυκοζίτης της κερκετίνης (14). Σχήμα 47. Δομή και μονοπάτια θραυσματοποίησης κατά τον αρνητικό ιονισμό φλαβονολών ESI MS (Tiberti et al., 2007) Η ένωση 16 ταυτοποιήθηκε ως το άγλυκο τμήμα των ανωτέρω φλαβονολών, δηλαδή ως κερκετίνη με μοριακό ιόν στο m/z= 301. Χαρακτηριστικό θραύσμα της παραπάνω αγλυκόνης, Σ ε λ ί δ α 103

114 στο δείγμα AcOEt, ήταν το m/z= 151, το οποίο προκύπτει ύστερα από απώλεια με 150 amu [M-H ] - (Σχήμα 47). Σχήμα 48. Φάσμα μάζας πλήρους σάρωσης (FS) της ένωσης 10 στο δείγμα Crude, στις τέσσερις διαφορετικές λειτουργίες (1: 2 ev, 2: 30 ev, 3: 60 ev, 4: 100 ev). Το m/z= 927 ανήκει στο αποπρωτονιωμένο διμερές της ένωσης 10. Η ένωση 11 προσδιορίσθηκε ως 3-Ο- ρουτινοζίτης της κεμφερόλης λόγω της δημιουργίας του ιόντος [M-H-308] -, στο m/z= 285, το οποίο ανήκει στη αποπρωτονιωμένη κεμφερόλη. Το συγκεκριμένο ιόν έδειξε την ύπαρξη της κεμφερόλης στη δομή και προέκυψε από την απώλεια ενός ρουτινοζίτη (308 amu). Πρέπει να σημειωθεί ότι, όπου υπήρχαν διπλές κορυφές επεξεργάσθηκαν μαζί (ολοκλήρωση συνολικού εμβαδού της περιοχής κάτω από τη διπλή κορυφή). Επομένως, τα αποτελέσματα των δύο τελευταίων στηλών του Πίνακα 21, προέκυψαν με αυτόν το τρόπο. Κατά τη χρωματογραφική ανάλυση των δειγμάτων σε μερικές από τις ενώσεις που προσδιορίσθηκαν, ανιχνεύθηκαν και διμερή αυτών. Πιθανόν ο διμερισμός να πραγματοποιήθηκε κατά την αποδιαλύτωση στην πηγή. Το φαινόμενο αυτό μπορεί να παρατηρηθεί εάν η συγκέντρωση του αναλύτη είναι υψηλή. Κατά τον ηλεκτροψεκασμό μπορούν να σχηματισθούν τέτοια παραπροϊόντα, γεγονός που μπορεί να δυσχεράνει την επεξεργασία των αποτελεσμάτων. Σ ε λ ί δ α 104

115 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Για παράδειγμα, στην παρούσα εργασία η κερκετίνη στο δείγμα AcOEt, εντοπίστηκε σε τέτοια συγκέντρωση που, πιθανόν, ήταν κατάλληλη να προκαλέσει διμερισμό, φαινόμενο το οποίο δεν παρατηρήθηκε στο δείγμα Crude. Βιβλιογραφικά έχουν προσδιοριστεί στα φύλλα διαφόρων ειδών Vaccinium, αρκετοί γλυκοζίτες τις κερκετίνης και λιγότεροι της κεμφερόλης και τις μυρικετίνης. Οι Gavrilova και συνεργάτες (2011) δεν χαρακτήρισαν καμία από τις ανωτέρω φλαβονόλες στα φύλλα του V. myrtillus, σε αντίθεση με άλλη μελέτη σχετικά με τα φύλλα του ίδιου φυτού (και του (Hokkanen et al., 2009) στα οποία ανιχνεύθηκαν οι ενώσεις 10α, 10β, 12α, και 16. Επιπρόσθετα, στο εκχύλισμα των φύλλων V. angustifolium (Harris et al., 2007) έχει γίνει αναφορά για τις ενώσεις 10α, 10β, 11, 12α, 13, 14. Στο Σχήμα 49 παρουσιάζονται οι δομές των ενώσεων που ταυτοποιήθηκαν στα δείγματα. Σχήμα 49. Δομές ενώσεων(1-8) που ταυτοποιήθηκαν στα δείγματα (Crude, AcOEt, BuOH, Aqueous) με UPLC MS Σ ε λ ί δ α 105

116 Συνέχεια Σχήμα 49 Δομές ενώσεων (9-16) Σ ε λ ί δ α 106

117 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Ταυτοποίηση των συστατικών των υδρολυμένων δειγμάτων: ολικό αφεψήμα των φύλλων του Vaccinium corymbosum και των κλασμάτων με UPLC-ESI-MS Η ανάλυση των υδρολυμένων δειγμάτων με την Υγρή Χρωματογραφία Υπερυψηλής Απόδοσης, συνδεδεμένη με Φασματομετρία Μάζας, αποτέλεσε σημαντικό εργαλείο στον έλεγχο της αντίδρασης της όξινης υδρόλυσης αλλά και στον ποιοτικό χαρακτηρισμό των αρχικών δειγμάτων. Κατά την ταυτοποίηση των συστατικών, δεν βρέθηκε καμία γλυκοζυλιωμένη ή εστεροποιημένη ένωση, γεγονός που έδειξε πως η επιλογή των συνθηκών στην υδρόλυση ήταν επιτυχής. Ανιχνεύθηκαν κυρίως αγλυκόνες (υδρόλυση γλυκοζυλιωμένων φλαβονολών), Πίνακας 20. Συστατικά που ανιχνεύθηκαν στα υδρολυμένα δείγματα: Crude, AcOEt, BuOH, Aqueous με UPLC-MS ( Α/Α Συστατικό* Χημική Δομή [M-H]- θεωρητικό Δείγματα R t (min) [Μ-Η]- πειραματικό και πιθανά θραύσματα ppm RI** Η1 QA C 7 H 12 O Η2 CA C 9 H 8 O Η3 M-1-CQA/ M-5-CQA C 17 H 20 O Η4 VA C 8 H 8 O Η5 My C 15 H 10 O Η6 FA C 10 H 10 O Η7 Que C 15 H 10 O Η8 Kae C 15 H 10 O Η9 Rha C 16 H 12 O AcOEt ,7 145 BuOH 0, ,4 136 Aqueous ,0 144 Crude (135) 2,2 675 AcOEt (135) 0, ,42 BuOH (135) 9,5 235 Aqueous (135) 1,1 101 Crude 3, (179/135) -6, AcOEt (179/161/135) -4,1 172 BuOH 3, (179/135) 4,1 372 Aqueous (179/135) 12,3 110 Crude 3, ,6 502 AcOEt , BuOH 3, ,3 388 Aqueous ,0 300 Crude (287/151) 4,7 165 AcOEt (287/179/151) -0, ,93 BuOH (287/179/151) 3,8 515 Aqueous (287) 5,0 52 Crude (133) -2, AcOEt (133) -6, ,21 BuOH (133) 3, Aqueous (133) -1,0 773 Crude (271/179/151) 2, AcOEt 4, (271/179/151) -8, BuOH (271/179/151) 2, Aqueous 4, (271/151-1,3 319 Crude (243/151) -1, ,50 AcOEt (243/151) 0, BuOH 5, (243/151) -5,3 365 Crude (300) -1,0 215 AcOEt 5, (300) 4,8 672 BuOH (300) 6,3 283 *QA: κινικό οξύ, CA: καφεϊκό οξύ, M-1-CQA: μεθυλο-1- καφεοϋλο- κινικό οξύ, M-5-CQA: μεθυλο-5- καφεοϋλο- κινικό οξύ, VA: βανιλλικό οξύ, My: μυρικετίνη, FA: φερουλικό οξύ, Que: κερκετίνη, Rha: ραμνετίνη **RI: σχετική ένταση (Relative Intensity) Σ ε λ ί δ α 107

118 αλλά και ελεύθερα φαινολικά οξέα (Πίνακας 20). Η ένωση Η1 είχε το ίδιο χρόνο κατακράτησης με την ένωση Η1 στον Πίνακα 19, και μάλιστα το μοριακό ιόν ήταν το ίδιο στο m/z= 191. Η ένωση, χωρίς αμφιβολία χαρακτηρίσθηκε ως κινικό οξύ. Η ένταση της κορυφής στο χρωματογράφημα, που απεικονίζει το ολικό ρεύμα ιόντων (Total Ion Current, TIC), πριν την υδρόλυση ήταν 4041 (Crude), ενώ μετά 145. Η παρατηρούμενη αυτή μείωση των ιόντων που μετρήθηκαν από τον ανιχνευτή, ήταν άξια σχολιασμού, διότι κατά την υδρόλυση θα αναμενόταν διάσπαση του εστεροποιημένου οξέος (:χλωρογενικό οξύ) προς σχηματισμό κουινικού οξέος. Το αποτέλεσμα αποδόθηκε στην ευαισθησία, κατά την υδρόλυση, των υδροξυκινναμωμικών οξέων, η οποία έχει αναφερθεί στη βιβλιογραφία (Nuutila et al., 2002; Hakkinen et al., 1998). Όπως αναφέρθηκε και στο εδάφιο σχετικά με την όξινη υδρόλυση, κάθε ένωση έχει διαφορετική συμπεριφορά ως προς τις συνθήκες της υδρόλυσης και κατέστη δύσκολος ο αποδοτικότερος και ταυτόχρονος προσδιορισμός όλων (Luo et al., 2013). Ίδια συμπεριφορά είχε και η ένωση Η2, η οποία με την ίδια λογική χαρακτηρίσθηκε ως καφεϊκό οξύ. Οι ενώσεις Η4 και Η6 χαρακτηρίσθηκαν ως βανιλλικό και φερουλικό οξύ, αντίστοιχα. Για το φερουλικό οξύ, μάλιστα, υπήρξε σχηματισμός ιόντος στο m/z= 134 αλλά και στο m/z= 133. Σχήμα 50. Φάσμα μάζας πλήρους σάρωσης (FS) της ένωσης Η6 στο δείγμα Crude, στις τέσσερις διαφορετικές λειτουργίες (1: 2 ev, 2: 30 ev, 3: 60 ev, 4: 100 ev). Το m/z= 387 ανήκει στο αποπρωτονιωμένο διμερές της ένωσης Τα ιόντα αυτά προέκυψαν από την ταυτόχρονη απώλεια ενός μεθυλίου (15 amu) και ενός - COO - (44 amu) (m/z= 134) ή -COOH (45 amu) (m/z= 133), από το αποπρωτονιωμένο Σ ε λ ί δ α 108

119 Ιανουάριος 2014, Πάτρα μοριακό ιόν. Τέτοια ιόντα αναφέρονται και στη διαδικτυακή βιβλιοθήκη MassBank αλλά και βιβλιογραφικά (Sanchez-Rabaneda et al., 2003). Η παρουσία αυτών των δύο οξέων στα υδρολυμένα δείγματα ήταν καθοριστική, για περαιτέρω διερεύνηση, διότι τα συστατικά αυτά δεν προσδιορίστηκαν στα δείγματα πριν την όξινη υδρόλυση. Μάλιστα, κρίνοντας από τον αριθμό των ιόντων που εκπροσωπούν τις ουσίες αυτές και χαρακτηρίζουν την ένταση της κορυφής, ήταν ουσίες που βρίσκονταν σε υψηλή περιεκτικότητα. Επομένως, ήταν λογική η παρατήρηση στο φάσμα μάζας των αποπρωτονιομένων διμερών [2M-H] - στο m/z= 335 και [2M-H] - στο m/z= 387 για την ένωση Η4 και Η6 (Σχήμα 50), αντίστοχα. Ύστερα από βιβλιογραφική διερεύνηση σχετικά με τα προϊόντα υδρόλυσης, όξινης αλλά και ενζυμικής, συμπεραίνεται ότι οι ουσίες αυτές είναι προϊόντα μεταβολισμού των καφεοϋλο- κουνικών οξέων. Το χλωρογενικό οξύ, που ταυτοποιήθηκε στα δείγματα των φύλλων μύρτιλλων, είναι ένα τέτοιο οξύ. Η απώλειά του στα υδρολυμένα δείγματα συνδυάστηκε με την παρουσία των δύο αυτών φαινολικών οξέων μέσω μίας πιθανής πορείας σχηματισμού αυτών από το οξύ (Σχήμα 51, Rechner et al., 2001). Σχήμα 51. Πιθανή πορεία σχηματισμού του φερουλικού οξέος και του βανιλλικού οξέος (τροποποιημένο σχήμα Rechner et al., 2001) Επιπρόσθετα, η ένωση Η3, παρουσίασε ανάλογο ενδιαφέρον, μιας και ήταν αποκλειστικά προϊόν υδρολύσης των δειγμάτων. Ο χαρακτηρισμός της ουσίας αυτής, σύμφωνα με την εικόνα της στο MS, αρχικά, οδήγησε στο φαινολικό οξύ: 3- φερουλοϋλο- κινικό οξύ. Όμως το οξύ αυτό θα αναμενόταν να είχε ως θραύσματα τα m/z- 193 και m/z= 134. Αντίθετα, η ένωση Σ ε λ ί δ α 109

120 Η3 παρουσίασε, πέρα από το μοριακό ιόν m/z= 367 και τα θραύσματα m/z= 135 και m/z= 179. Για το λόγο αυτό ως δομή της ένωσης αυτής προτάθηκε η εξής: μεθυλο-5- καφεοϋλοκινικό οξύ ή μεθυλο-1- καφεοϋλο- κινικό οξύ (Σχήμα 52). Η ένωση αυτή έχει προσδιοριστεί βιβλιογραφικά στον καφέ, πηγή πλούσια σε υδροξυκινναμωμικά οξέα (Mullen et al., 2011). Η συγκεκριμένη ουσία πιθανόν σχηματίσθηκε κατά την υδρόλυση, εφόσον ως διαλύτης της αντίδρασης χρησιμοποιήθηκε 50 % υδατική ΜeOH. Πιο αναλυτικά πιστεύεται πως η καρβοξυλομάδα του κουινικού οξέος μπορεί να σχηματίσει εστερικό δεσμό με τη μεθανόλη που υπάρχει στο διάλυμα. Οι πληροφορίες που παρείχε το φάσμα MS της ένωσης Η3 ήταν πολύ σημαντικές. Μέσω του φάσματος μάζας, προέκυψε ότι το καφεϊκό οξύ είναι συνδεδεμένο στη θέση 1 ή 5 του κουινικού οξέος και όχι στις θέσεις 3 ή 4. Οι Jaiswal και Kuhnert (2011), πρώτη φορά, ταυτοποίησαν με χρήση LC MS, δύο από αυτούς τους μεθελεστέρες του χλωρογενικού οξέος. Σχήμα 52. Φάσμα μάζας πλήρους σάρωσης (FS) της ένωσης Η3 στο δείγμα Crude, στις τέσσερις διαφορετικές λειτουργίες (1: 2 ev, 2: 30 ev, 3: 60 ev, 4: 100 ev). Το m/z= 735 ανήκει στο αποπρωτονιωμένο διμερές της ένωσης Στη σχετική τους δημοσίευση αναφέρεται η πορεία θραυσματοποίησης των αντίστοιχων υποκατεστημένων οξέων 1, 3, 4, 5. Τα ισομερή μεθυλο-3- καφεοϋλο- κινικό οξύ και μεθυλο- 4- καφεοϋλο- κινικό οξύ κατά την εφαρμογή MS/MS του μοριακού ιόντος [M-H] - = 367, σχηματίζουν θραύσματα στο m/z= 135 ([καφεϊκό οξύ-co 2 -H + ] )και στο m/z= 161 ([καφεϊκό οξύ-h2o-h + ] - ). Σε αντίθεση με τα προηγούμενα ισομερή, το μεθυλο-1- καφεοϋλο- κινικό οξύ Σ ε λ ί δ α 110

121 Ιανουάριος 2014, Πάτρα και μεθυλο-3- καφεοϋλο- κινικό οξύ, στο MS/MS, παρέχουν τα θραύσματα: m/z= 135, m/z= 161, m/z= 179, m/z= 191 και m/z= 297 (Σχήμα 53). Επειδή, το θυγατρικό ιόν στο m/z= 135 ήταν κοινό, η παρουσία του m/z= 179 έπαιξε καθοριστικό ρόλο στην ταυτοποίηση της ένωσης Η3. Σχήμα 53. Προτεινόμενη πορεία θραυσματοποίησης των ισομερών: μεθυλο-1 καφεοϋλο- κινικό οξύ και μεθυλο-5- καφεοϋλο- κινικό οξύ (Jaiswal και Kuhnert et al., 2011) Οι ενώσεις Η5, Η7, Η8 και Η9 χαρακτηρίστηκαν ως φλαβονόλες και πιο συγκεκριμένα ως άγλυκα τμήματα γλυκοζυλιωμένων φλαβονολών. Κατά σειρά, και σύμφωνα με τους χρόνους κατακράτησης, οι φλαβονόλες αυτές ήταν οι εξής: μυρικετίνη, κερκετίνη, καεμφερόλη και ραμνετίνη. Η διαφορά μεταξύ των μορίων αυτών είναι ο αριθμός των υδροξυλομάδων που είναι συνδεδεμένες στο δακτύλιο Β. Η κερκετίνη ήταν η μόνη από τις ενώσεις αυτές, η οποία ανιχνεύτηκε και πριν και μετά την υδρόλυση των δειγμάτων. Οι υπόλοιπες τρεις προέκυψαν από την διάσπαση των γλυκοζιτικών δεσμών. Συγκεκριμένα για την κερκετίνη παρατηρήθηκε αύξηση στον αριθμό των ιόντων που μετρήθηκαν, στα υδρολυμένα δείγματα, γεγονός που Σ ε λ ί δ α 111

122 υποδεικνύει την δημιουργία της κατά την υδρόλυση. Για παράδειγμα στο δείγμα AcOEt, πρίν την υδρόλυση η ένταση ήταν 1349 και ύστερα από αυτήν Μάλιστα στα δείγματα BuOH και Aqueous δεν ανιχνεύθηκε καν η κερκετίνη πριν την υδρόλυση. Η παρατήρηση αυτή, συνδέεται άμεσα με τα αποτελέσματα της HPLC ανάλυσης των δειγμάτων. Αυτές οι πληροφορίες δείχνουν ότι οι συνθήκες υδρόλυσης ήταν ικανοποιητικές για τη διάσπαση του γλυκοζιτικού δεσμού, αλλά και για την απελευθέρωση και διατήρηση του άγλυκου τμήματος στα δείγματα. Για τις φλαβονόλες ανιχνεύθηκαν ιόντα σε κοινά m/z κάτι το οποίο ήταν αναμενόμενο, σύμφωνα και με τη βιβλιογραφία (Σχήμα 47). Για τη μυρικετίνη και την κερκετίνη ανιχνεύθηκαν τα ιόντα [M-H-122] -, [M-H ] - στο m/z= 179 και m/z= 151, αντίστοιχα. Επιπλέον, για τις δύο φλαβονόλες ανιχνεύθηκε το ιόν [M-H-30] -, στο m/z= 271 (κερκετίνη) και στο m/z= 287 (μυρικετίνη, Σχήμα 54), δηλώνοντας απώλεια -CH 2 O από την κάθε μία. Στο MS της κερκετίνης, του δείγματος ΑcOEt, παρουσιάσθηκε, πέρα από το διμερές, το τριμερές της ένωσης (Σχήμα 55). Όσο αφορά την κεμφερόλη εντοπίστηκαν τα ιόντα [M-C 2 H 2 O] -, [M-H ] - στο m/z= 243 και m/z= 151. Σχήμα 54. Φάσμα μάζας πλήρους σάρωσης (FS) της ένωσης Η5 στο δείγμα BuOH, στις τέσσερις διαφορετικές λειτουργίες (1: 2 ev, 2: 30 ev, 3: 60 ev, 4: 100 ev). Σ ε λ ί δ α 112

123 Ιανουάριος 2014, Πάτρα Τα παραπάνω αποτελέσματα σχετικά με τη θραυσματοποίηση των φλαβονολών, συμφωνούν με βιβλιογραφικά δεδομένα που προτείνουν το σχηματισμό τέτοιων θραυσμάτων μέσω συγκεκριμένης Retro- Diels- Alder πορείας (Fabre et al., 2001). Για την ένωση Η16 έγινε χαρακτηρισμός μέσω του μοριακού ιόντος [Μ-Η] - = 315, αλλά και του θρεύσματος στο m/z= 300, το οποίο προέκυψε από απώλεια μιας CH 3 ομάδας. Σχήμα 55. Φάσμα μάζας πλήρους σάρωσης (FS) της ένωσης Η7 στο δείγμα AcOEt, στις τέσσερις διαφορετικές λειτουργίες (1: 2 ev, 2: 30 ev, 3: 60 ev, 4: 100 ev). To m/z= 603 ανήκει στο αποπρωτονιωμένο διμερές της ένωσης και το m/z= 905 στο αποπρωτονιωμένο τριμερές Οι δομές όλων των ενώσεων, οι οποίες ανιχνεύθηκαν με LC MS παρουσιάζονται, στη συνέχεια, στο Σχήμα 56. Σχήμα 56. Δομές ενώσεων(η1-η3) που ταυτοποιήθηκαν στα υδρολυμένα δείγματα (Crude, AcOEt, BuOH, Aqueous) με UPLC MS Σ ε λ ί δ α 113

124 Σχήμα 56. Δομές ενώσεων(η4-η9) 6.4. Ποσοτικοποίηση των συστατικών στο αφέψημα και στα κλάσματα των φύλλων του Vaccinium corymbosum με HPLC Μέθοδος HPLC ανάλυσης Διερεύνηση για την επιλογή κατάλληλης HPLC μεθόδου Η χρωματογραφική μέθοδος η οποία χρησιμοποιήθηκε στον ποσοτικό προσδιορισμό τω δειγμάτων, προέκυψε ύστερα από διερεύνηση και εφαρμογή διαφόρων μεθόδων. Κατάλληλη μέθοδος χαρακτηρίζεται μία μέθοδος όταν μπορεί να προσδιορίζει και να διαχωρίζει πλήρως συστατικά διαφόρων κατηγοριών και πολικότητας. Η επιλογή του συστήματος διαλυτών, αλλά και του ph, είναι πολύ σημαντικoί παράγοντες για την επίτευξη σωστού χρωματογραφικού διαχωρισμού. Πρώτο βήμα στην εύρεση κατάλληλης χρωματογραφικής μεθόδου ήταν η τροποποίηση της μεθόδου που είχε ήδη χρησιμοποιηθεί και πιο συγκεκριμένα της μεθόδου της Μαργιάννη (2011). Η προσπάθεια για βελτίωση του προγράμματος δεν απέδωσε τα αναμενόμενα αποτελέσματα (Σχήμα 57). Όπως φαίνεται και στα χρωματογραφήματα στα διάφορα μήκη κύματος, η προσπάθεια για διεύρυνση των κορυφών στα πρώτα λεπτά δεν κατέστη δυνατή, διότι οι κορυφές των συστατικών περίπου στην περιοχή 0-10 min, δεν διαχωρίστηκαν. Κατά τη 2 η προσπάθεια χρησιμοποιήθηκε το πρωτόκολλο των Tsao και συνεργατών (2003), το οποίο διέφερε από το προηγούμενο στο διαλύτη Α, ο οποίος ήταν 6% οξικό οξύ σε οξικό νάτριο συγκέντρωσης 2 mm. Σ ε λ ί δ α 114