ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΠΑΠΑΒΑΣΙΛΕΙΟΥ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΠΑΠΑΒΑΣΙΛΕΙΟΥ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΠΟΥ ΡΥΘΜΙΖΟΥΝ ΤΟ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟ ΤΩΝ ΝΕΦΡΙΚΩΝ ΠΟΔΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΕΠΙ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΑ ΤΟΥ ΝΙΚΟΛΑΟΥ ΤΣΟΤΑΚΟΥ Αθήνα, 2015

2 Στη μητέρα μου. An expert is a person who has made all the mistakes that can be made in a very narrow field. Niels Bohr

3 Ημερομηνία αίτησης: 21 Ιουλίου 2008 Ημερομηνία ορισμού Τριμελούς Επιτροπής: 16 Οκτωβρίου 2008 Ημερομηνία ορισμού θέματος: 10 Απριλίου 2009 Ημερομηνία υποστήριξης διατριβής: 16 Ιουνίου 2015 Μέλη Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής: Αθανάσιος Παπαβασιλείου, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή Δημήτριος Βλαχάκος, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή Φωτεινή Τσιλιμπάρη, Ερευνήτρια Α', ΕΚΕΦΕ Δημόκριτος Μέλη Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής: Περρέα Δέσποινα, Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή Τεντολούρης Νικόλαος, Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική Σχολή Χαρώνης Αριστείδης, Ερευνητής Α', Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών Δροσοπούλου Γαρυφαλιά, Ερευνήτρια Γ', ΕΚΕΦΕ Δημόκριτος iii

4 Ευχαριστίες Η παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας/Παθοβιολογίας Κυττάρου και Εξωκυττάριου Χώρου του Ινστιτούτου Βιολογίας (πλέον Ινστιτούτο Βιοεπιστημών και Εφαρμογών) του Εθνικού Κέντρου Έρευνας Φυσικών Επιστημών (ΕΚΕΦΕ) "Δημόκριτος" σε συνεργασία με το Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας του Μορφολειτουργικού Τομέα στην Ιατρική Σχολή του Εθνικού Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών. Την επίβλεψη της εργασίας είχε η Δρ. Έφη Τσιλιμπάρη, διευθύντρια του Ινστιτούτου Βιοεπιστημών και Εφαρμογών του ΕΚΕΦΕ Δημόκριτος και διευθύντρια ερευνών του Εργαστηρίου Βιοχημείας/Παθοβιολογίας Κυττάρου και Εξωκυττάριου Χώρου, στην οποία θέλω να εκφράσω την ειλικρινή ευγνωμοσύνη μου για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε και για την καθοδήγησή της σε όλη αυτήν την πορεία. Η διαμόρφωση ενός άρτιου επιστημονικού περιβάλλοντος στο εργαστήριό της έχει υπάρξει καταλυτικός παράγοντας για την διαμόρφωση της επιστημονικής μου ιδιότητας και παραμένει κίνητρο για τη συνεχή μου προσπάθεια προς εξέλιξη στο χώρο της έρευνας. Ευχαριστώ ιδιαιτέρως τη Δρ. Γαρυφαλιά Δροσοπούλου, ερευνήτρια Γ' βαθμίδας, για την καθοδήγηση σε ζητήματα ευρέος φάσματος, κυρίως επιστημονικά, αλλά και προσωπικά. Η ακούραστή της διάθεση για μετάδοση των γνώσεών της έχει αποδειχθεί ωφέλιμη αμέτρητες φορές και δεν υπάρχουν αρκετά λόγια που να χωράνε την ευγνωμοσύνη μου. Ήταν τιμή μου που έχω δουλέψει μαζί της και που μπορώ να την αποκαλώ φίλη. Ευχαριστώ τα μέλη της τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής, Δρ. Αθανάσιο Παπαβασιλείου και Δρ. Δημήτριο Βλαχάκο για την καθοδήγηση και κυρίως την καλή και εγκάρδια διάθεσή τους απέναντί μου. iv

5 Ευχαριστώ τα μέλη της επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής για το χρόνο τους στη λεπτομερή επισκόπηση και κριτική ματιά της διατριβής. Ευχαριστώ τα λοιπά μέλη του Εργαστηρίου Βιοχημείας/Παθοβιολογίας Κυττάρου και Εξωκυττάριου Χώρου: την Ελένη Κωτσοπούλου, για τη συνεχή βοήθειά της και την πάντοτε καλή της διάθεση, τη Δρ. Παρασκευή Κίτσιου και τη Δρ. Αθηνά Τζίνια για τις εποικοδομητικές συζητήσεις, καθώς και τους Δρ. Αργύρη Ταλαμάγκα, Δρ. Παναγιώτη Βενιεράτο, Δρ. Ιωάννα Τσαγκαράκη, Δρ. Σοφία Βερούτη, Δρ. Νεφέλη Λαγοπάτη, Θοδωρή Κούτμο και Κατερίνα Καποδίστρια, για την αγαστή συνεργασία, αλλά και γιατί (εν αγνοία τους ίσως) συμμετείχαν στη διαμόρφωση του χαρακτήρα μου ως επιστήμονα. Δε θα είναι ποτέ αρκετές οι ευχαριστίες στην οικογένειά μου, και κυρίως στη μητέρα μου, Παναγιώτα Τσοτάκου, για την ηθική συμπαράσταση και την αγάπη που μου δείχνουν. Φυσικά πρέπει να ευχαριστήσω το Σπύρο, το Χρήστο και το Γιώργο, γιατί είναι πάντα εκεί, να με ακούνε και να με υποστηρίζουνε. Μου λείπετε πολύ. Η παρούσα διατριβή δεν θα είχε πάρει την τελική της μορφή στο χαρτί, χωρίς την υπομονή και επιμονή της καλής μου. Σε ευχαριστώ. Νικόλαος Τσοτάκος Αθήνα, 2015 v

6 ΙΠΠΟΚΡΑΤΕΙΟΣ ΟΡΚΟΣ Ὄμνυμι Ἀπόλλωνα ἰητρὸν, καὶ Ἀσκληπιὸν, καὶ Ὑγείαν, καὶ Πανάκειαν, καὶ θεοὺς πάντας τε καὶ πάσας, ἵστορας ποιεύμενος, ἐπιτελέα ποιήσειν κατὰ δύναμιν καὶ κρίσιν ἐμὴν ὅρκον τόνδε καὶ ξυγγραφὴν τήνδε. Ἡγήσασθαι μὲν τὸν διδάξαντά με τὴν τέχνην ταύτην ἴσα γενέτῃσιν ἐμοῖσι, καὶ βίου κοινώσασθαι, καὶ χρεῶν χρηίζοντι μετάδοσιν ποιήσασθαι, καὶ γένος τὸ ἐξ ωὐτέου ἀδελφοῖς ἴσον ἐπικρινέειν ἄῤῥεσι, καὶ διδάξειν τὴν τέχνην ταύτην, ἢν χρηίζωσι μανθάνειν, ἄνευ μισθοῦ καὶ ξυγγραφῆς, παραγγελίης τε καὶ ἀκροήσιος καὶ τῆς λοιπῆς ἁπάσης μαθήσιος μετάδοσιν ποιήσασθαι υἱοῖσί τε ἐμοῖσι, καὶ τοῖσι τοῦ ἐμὲ διδάξαντος, καὶ μαθηταῖσι συγγεγραμμένοισί τε καὶ ὡρκισμένοις νόμῳ ἰητρικῷ, ἄλλῳ δὲ οὐδενί. Διαιτήμασί τε χρήσομαι ἐπ' ὠφελείῃ καμνόντων κατὰ δύναμιν καὶ κρίσιν ἐμὴν, ἐπὶ δηλήσει δὲ καὶ ἀδικίῃ εἴρξειν. Οὐ δώσω δὲ οὐδὲ φάρμακον οὐδενὶ αἰτηθεὶς θανάσιμον, οὐδὲ ὑφηγήσομαι ξυμβουλίην τοιήνδε. Ὁμοίως δὲ οὐδὲ γυναικὶ πεσσὸν φθόριον δώσω. Ἁγνῶς δὲ καὶ ὁσίως διατηρήσω βίον τὸν ἐμὸν καὶ τέχνην τὴν ἐμήν. Οὐ τεμέω δὲ οὐδὲ μὴν λιθιῶντας, ἐκχωρήσω δὲ ἐργάτῃσιν ἀνδράσι πρήξιος τῆσδε. Ἐς οἰκίας δὲ ὁκόσας ἂν ἐσίω, ἐσελεύσομαι ἐπ' ὠφελείῃ καμνόντων, ἐκτὸς ἐὼν πάσης ἀδικίης ἑκουσίης καὶ φθορίης, τῆς τε ἄλλης καὶ ἀφροδισίων ἔργων ἐπί τε γυναικείων σωμάτων καὶ ἀνδρῴων, ἐλευθέρων τε καὶ δούλων. Ἃ δ' ἂν ἐν θεραπείῃ ἢ ἴδω, ἢ ἀκούσω, ἢ καὶ ἄνευ θεραπηίης κατὰ βίον ἀνθρώπων, ἃ μὴ χρή ποτε ἐκλαλέεσθαι ἔξω, σιγήσομαι, ἄῤῥητα ἡγεύμενος εἶναι τὰ τοιαῦτα. Ὅρκον μὲν οὖν μοι τόνδε ἐπιτελέα ποιέοντι, καὶ μὴ ξυγχέοντι, εἴη ἐπαύρασθαι καὶ βίου καὶ τέχνης δοξαζομένῳ παρὰ πᾶσιν ἀνθρώποις ἐς τὸν αἰεὶ χρόνον. παραβαίνοντι δὲ καὶ ἐπιορκοῦντι, τἀναντία τουτέων. vi

7 ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ Νικόλαος Τσοτάκος ΒΙΟΛΟΓΟΣ Εκπαίδευση 2008 Πτυχίο Βιολογίας Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Τμήμα Βιολογίας, Θεσσαλονίκη, Ελλάδα Εκπόνηση διδακτορικής διατριβής Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών (ΕΚΕΦΕ) "Δημόκριτος", Ινστιτούτο Βιολογίας, Αγία Παρασκευή, Ελλάδα Ερευνητική και σχετική επαγγελματική εμπειρία Επισκέπτης ερευνητής Pennsylvania State University College of Medicine, Department of Pediatrics, Division of Hematology/Oncology, Hershey, PA. Επιβλέπων: Hong-Gang Wang, Ph.D Επιστημονικό αντικείμενο: Ο ρόλος της ενδοφιλίνης Β1 στη δημιουργία του αυτοφαγοσώματος και την καρκινογένεση Επισκέπτης ερευνητής, Pennsylvania State University College of Medicine, Department of Pediatrics, CHILD Research, Hershey, PA. Επιβλέπων: Joanna Floros, Ph.D. Επιστημονικό αντικείμενο: Μεταφραστική ρύθμιση των ανθρώπινων γονιδίων SP-A1 και SP-A2 σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις και η επίδραση των γονιδιακών προϊόντων στον κυτταροσκελετό των κυψελιδικών μακροφάγων Έρευνα προς διδακτορική διατριβή Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών (ΕΚΕΦΕ) "Δημόκριτος", Ινστιτούτο Βιολογίας, Αγία Παρασκευή, Ελλάδα vii

8 Επιστημονικό αντικείμενο: Μηχανισμοί αλλοίωσης των ποδοκυττάρων με τη χρήση αθανατοποιημένης κυτταρικής σειράς ανθρώπινων ποδοκυττάρων υπό έκθεση σε φυσιολογικά και μη φυσιολογικά επίπεδα γλυκόζης 2011 (6 months) Επιστημονικός σύμβουλος SustChem Engineering LTD., Athens, Greece Επιστημονικό αντικείμενο: Προετοιμασία τοξικολογικών προφίλ και αναφορών χημικής και περιβαλλοντικής ασφάλειας προς κατάθεση στο Ευρωπαϊκό Πρακτορείο Χημικών (European Chemicals Agency, ECHA) Βοηθός μικροβιολόγου Ως μέρος της στρατιωτικής θητείας 401 Γενικό Στρατιωτικό Νοσοκομείο Αθηνών και 414 Στρατιωτικό Νοσοκομείο Ειδικών Νοσημάτων Υποτροφίες-Βραβεία Υποτροφία προς εκπόνηση διδακτορικής διατριβής Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών (ΕΚΕΦΕ) "Δημόκριτος", Ινστιτούτο Βιολογίας, Αγία Παρασκευή, Ελλάδα Δημοσιεύσεις σε διεθνή περιοδικά 1. Tsotakos N, Silveyra P, Lin Z, Thomas N, Vaid M, and Floros J. (2015). Regulation of translation by upstream translation initiation codons of surfactant protein A1 splice variants. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 308(1):L doi: /ajplung Silveyra P, Chroneos ZC, DiAngelo SL, Thomas NJ, Noutsios GT, Tsotakos N, Howrylak JA, Umstead TM, Floros J. (2014). Knockdown of Drosha in human alveolar type II cells alters expression of SP-A in culture: a pilot study. Experimental Lung Research. 40(7): doi: / Tsotakos NE, Sagnou M, Kotsopoulou ES, Tsilibary EC and Drossopoulou GI. (2013). Glucose-induced gradual phenotypic modulation of cultured human glomerular epithelial cells may be independent of Wilms' tumor 1 (WT1). BMC Cell Biology. 14:28, doi: / viii

9 4. Drossopoulou GI, Tsotakos NE and Tsilibary EC. (2009). Impaired transcription factor interplay in addition to advanced glycation end products suppress podocalyxin expression in high glucose-treated human podocytes. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 297(3):F , doi: /ajprenal Rabias I, Pratsinis H, Drossopoulou G, Fardis M, Maris T, Boukos N, Tsotakos N, Kletsas D, Tsilibary E and Papavassiliou G. (2007). In vitro studies on ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles coated with gummic acid for T2 MRI contrast agent. Biomicrofluidics. 1(4):44104, doi: / Ανακοινώσεις σε διεθνή συνέδρια 1. N. Tsotakos, P. Silveyra, and J. Floros. "Upstream start codons (uaugs) of Surfactant Protein A1 (SP-A1) splice variants are associated with reduced translational activity". American Thoracic Society International Conference, Philadelphia, Pennsylvania, USA, P. Silveyra, Z. Chroneos, N. Thomas, S. DiAngelo, G. Noutsios, N. Tsotakos, T. Umstead, and J. Floros. "Knock-down of Drosha in human alveolar type 2 cells: a physiologically relevant model to study mirna regulation of SP-A expression". American Thoracic Society International Conference, Philadelphia, Pennsylvania, USA, N. Tsotakos, E. Tsilibary and G. Drossopoulou. "High glucose differentially induces gradual loss of podocytic markers and partial de-differentiation", 50 th European Renal Association - European Dialysis and Transplant Association (ERA-EDTA) Congress, Istanbul, Turkey, N. Tsotakos, P. Silveyra, and J. Floros. "Upstream start codons (uaugs) of the SP-A1 gene are associated with reduced activity of a reporter gene", FASEB Summer Research Conference; The Lung Epithelium in Health and Disease, Saxtons River, Vermont, USA, G. Drossopoulou, N. Tsotakos and E. C. Tsilibary. "High glucose levels may lead human glomerular epithelial cells to dedifferentiation", 22 nd meeting of the European Renal Cell Study Group (ERSCG), Vienna, Austria, N. Tsotakos, G. Drossopoulou, E. Kotsopoulou and E. C. Tsilibary. "Glucose-induced changes of slit diaphragm may be associated with altered WT1-Sp1 binding to the relevant promoter regions and may affect podocalyxin expression", 21 st meeting of the European Renal Cell Study Group (ERCSG), Delphi, Greece, ix

10 7. N. Tsotakos, G. Drossopoulou, E. Kotsopoulou and E. C. Tsilibary. "Glucose-induced changes of slit diaphragm proteins are reversible and may not result in podocytic foot process effacement", 20 th meeting of the European Renal Cell Study Group (ERCSG), Gregynog, United Kingdom, N. Tsotakos, G. Drossopoulou and E. C. Tsilibary. "Long-term exposure of human glomerular epithelial cells to diabetic glucose levels permanently suppresses podocalyxin but not ZO-1 expression: Inhibition of AGE formation prevents suppression of podocalyxin expression", 33 rd FEBS Congress & 11 th IUBMB Conference, Athens, Greece, N. Tsotakos, E. Kotsopoulou, E.C. Tsilibary, and G. Drossopoulou. "Transcriptional regulation of podocalyxin in cultured immortalized human glomerular epithelial cells", XLIV European Renal Association-European Dialysis and Transplant Association (ERA- EDTA) Congress, Barcelona, Spain, Ανακοινώσεις σε ελληνικά συνέδρια 1. T. Koutmos, N. Tsotakos, G. Drossopoulou and E. Tsilibary. "Downregulation of specialized podocytic components induced by long-term exposure to high glucose levels indicates de-differentiation of cultured human glomerular epithelial cells", 61 ο Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρίας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Αλεξανδρούπολη, G. Drossopoulou, N. Tsotakos, E. Kotsopoulou and E. C. Tsilibary. "Transcriptional regulation of matrix anti-adhesin podocalyxin-like protein, PCLP, and the slit diaphragm protein, nephrin, in cultured immortalized human glomerular epithelial cells", 10 η ετήσια συνάντηση Ομάδας Έρευνας Συνδετικού Ιστού και Εξωκυττάριου Χώρου, Πάτρα, G. Drossopoulou, E. Zaimidou, N. Tsotakos, P. Dimitraki, I. Zoidakis, A. Vlahou and E. Tsilibary. "High glucose induces multiple proteomic changes in human glomerular epithelial cells", 60 ο Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρίας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Αθήνα, N. Tsotakos, E. Kotsopoulou, G. Drossopoulou, and E. C. Tsilibary. "Differential modulation of podocalyxin-like protein (PCLP) expression by glucose concentration in human glomerular epithelial cells", 9 η ετήσια συνάντηση Ομάδας Έρευνας Συνδετικού Ιστού και Εξωκυττάριου Χώρου, Αθήνα, G. Drossopoulou, N. Tsotakos, E. Kotsopoulou and E. C. Tsilibary. "Chronic exposure of human glomerular epithelial cells to high glucose permanently suppresses PCLP x

11 expression: Inhibition of AGE formation partially prevents suppression of PCLP expression", 9 η ετήσια συνάντηση Ομάδας Έρευνας Συνδετικού Ιστού και Εξωκυττάριου Χώρου, Αθήνα, N. Tsotakos, G. Drossopoulou, E. Kotsopoulou and E. C. Tsilibary. "CBP transcriptional coactivator is involved in the regulation of expression of the anti-adhesin podocalyxinlike protein (PCLP) in human glomerular epithelial cells", 8 η ετήσια συνάντηση Ομάδας Έρευνας Συνδετικού Ιστού και Εξωκυττάριου Χώρου, Ηράκλειο, G. Drossopoulou, N. Tsotakos and E. C. Tsilibary."Regulation of the anti-adhesin podocalyxin-like protein (PCLP) expression, in human glomerular epithelial cells, is mediated by a functional WT1-p53 association", 57 ο Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρίας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Αθήνα, xi

12 Πίνακας Περιεχομένων Κατάλογος Πινάκων... xvi Κατάλογος Σχημάτων... xvii Κατάλογος Εικόνων... xviii ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ1 1.2 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΠΟΔΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Ανάπτυξη και διαφοροποίηση Δομή Το διάφραγμα διήθησης Η κορυφαία μεμβράνη Βασική μεμβράνη Μεταγραφικοί παράγοντες ΠΑΘΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΝΕΦΡΟΥ Ταξινόμηση σπειραματοπαθειών Ποδοκυτταροπάθειες Μεμβρανώδης νεφροπάθεια Άλλες σπειραματοπάθειες Διαβητική νεφροπάθεια Χαρακτηριστικά της παθοβιολογίας των ποδοκυττάρων Απώλεια των ποδοειδών προσεκβολών/αποπλάτυνση ποδοκυττάρων Ινσουλινοαπόκριση των ποδοκυττάρων ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ...52 xii

13 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 56 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Καλλιέργεια ανθρώπινων κυτταρικών σειρών Διατήρηση-ανάπτυξη κυτταροκαλλιεργειών Αντιστροφή της συγκέντρωσης γλυκόζης Κατάψυξη και απόψυξη κυττάρων Απομόνωση πρωτεϊνών Λύση κυττάρων και εκχύλιση των πρωτεϊνών από τα κύτταρα Κυτταρική κλασμάτωση Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών (δοκιμή Bradford) Ανάλυση κατά Western (Western blotting) Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) Μεταφορά των πρωτεϊνών σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης Ανοσοεντοπισμός των πρωτεϊνών με τη χρήση της χημειοφωταύγειας Ανοσοκατακρήμνιση Κυτταρομετράα ροής Ανοσοφθορισμός Ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης Ανοσοκατακρήμνιση Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωμα αγαρόζης Απομόνωση ολικού RNA Απομόνωση RNA Ποσοτικός προσδιορισμός και έλεγχος της καθαρότητας του ολικού RNA Αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction, PCR) Ποσοτική PCR Σχετική ποσοτικοποίηση (Real-Time Relative qrt-pcr) Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων...90 xiii

14 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΤΩΣΕΩΝ ΥΨΗΛΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΓΛΥΚΟΖΗΣ ΣΤΟΥΣ ΔΕΙΚΤΕΣ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ Προσωρινή καλλιέργεια των HGEC σε υψηλά επίπεδα γλυκόζης οδηγούν σε αντιστρεπτή αυξορρύθμιση της πρωτεϊνικής έκφρασης της βιμεντίνης In vitro καλλιέργεια των HGEC παρουσία υψηλών επιπέδων γλυκόζης οδηγεί σε μόνιμη μειορρύθμιση της έκφρασης του CD10/CALLA ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΤΩΣΕΩΝ ΥΨΗΛΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΓΛΥΚΟΖΗΣ ΣΤΟΥΣ ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΟΥΣ ΑΠΟ ΤΟΝ WT1 ΠΟΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥΣ ΔΕΙΚΤΕΣ Καταστολή της έκφρασης της ποδοκαλυκίνης στα HGEC Η επαγόμενη από τη γλυκόζη μειορρύθμιση της έκφρασης της ποδοκαλυκίνης είναι μόνο εν μέρει αναστρέψιμη Καταστολή της έκφρασης της νεφρίνης Η επαγόμενη από τη γλυκόζη μειορρύθμιση της έκφρασης της νεφρίνης είναι αναστρέψιμη Τα επίπεδα της νεφρίνης στην κυτταρική επιφάνεια είναι αντίστοιχα των ολικών επιπέδων της νεφρίνης στα ποδοκύτταρα ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΤΩΣΕΩΝ ΥΨΗΛΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΓΛΥΚΟΖΗΣ ΣΕ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΟΥΣ ΚΑΙ ΜΗ ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΟΥΣ ΑΠΟ ΤΟΝ WT1 ΠΟΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥΣ ΔΕΙΚΤΕΣ In vitro καλλιέργεια των HGEC παρουσία υψηλής γλυκόζης οδηγεί σε αντιστρεπτή μειορρύθμιση του μεταγράφου και της πρωτεΐνης ΖΟ Η επαγόμενη από τη γλυκόζη μειορρύθμιση της έκφρασης της ιντεγκρίνης α3β1 είναι ταχεία και αναστρέψιμη In vitro καλλιέργεια των HGEC παρουσία υψηλής γλυκόζης οδηγεί σε προσωρινή ελάττωση της έκφρασης της CD2AP ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΥ ΜΕΙΟΡΡΥΘΜΙΣΗΣ ΤΩΝ ΠΟΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ Η μειωμένη έκφραση της ποδοκαλυκίνης παρουσία 25mM γλυκόζης δεν είναι αποτέλεσμα μειωμένων επιπέδων της πρωτεΐνης WT Η μειωμένη έκφραση της ποδοκαλυκίνης παρουσία 25mM γλυκόζης δεν είναι αποτέλεσμα μειωμένων επιπέδων της πρωτεΐνης Sp1116 xiv

15 3.4.3 Τα υψηλά επίπεδα γλυκόζης δεν επηρεάζουν την μετατόπιση του Sp1 ή της πρωτεΐνης CBP στον πυρήνα των ποδοκυττάρων Η αλληλεπίδραση του WT1 με τη CBP διαταράσσεται παρουσία υψηλής γλυκόζης Ο WT1 προσδένεται στον υποκινητή της ποδοκαλυκίνης και η αλληλεπίδραση αυτή αλλοιώνεται παρουσία υψηλών επιπέδων γλυκόζης Η μειορρύθμιση της ποδοκαλυκίνης εξαρτάται από τον WT1, αλλά η δυνατότητα αποκατάστασης των επιπέδων της μπορεί να είναι ανεξάρτητη του WT Η πρόσδεση του WT1 στον υποκινητή της νεφρίνης δεν επηρεάζεται από την παρουσία υψηλής γλυκόζης ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΑΙ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 165 ABSTRACT 167 xv

16 Κατάλογος Πινάκων Πίνακας 1. Μεταβολές στην ποδοκυτταρική γονιδιακή έκφραση σπειραματικών κυττάρων σε καλλιέργεια μετά από υπερέκφραση των γονιδίων των ZHX πρωτεϊνών για 72 ώρες (34)...33 Πίνακας 2. Συμπαράγοντες του WT1 (228, 263, 304) Πίνακας 3. Μεταγραφικοί στόχοι του WT1 και το αποτέλεσμα της μεταγραφικής του δράσης (34, 228, 263, 304) Πίνακας 4. Ταξινόμηση των σπειραματοπαθειών (13, 319) Πίνακας 5. Επίδραση διαφόρων ερεθισμάτων στα ποδοκύτταρα (146)...40 Πίνακας 6. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα ποσοτικής αντίδρασης πολυμεράσης xvi

17 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα 1. Έκφραση της βιμεντίνης και του CD10/CALLA στα ποδοκύτταρα...94 Σχήμα 2. Έκφραση της ποδοκαλυκίνης στα ποδοκύτταρα Σχήμα 3. Δοκιμασία χρόνου για την έκφραση της ποδοκαλυκίνης στα ποδοκύτταρα Σχήμα 4. Κυτταροεπιφανειακή έκφραση της ποδοκαλυκίνης στα ποδοκύτταρα.100 Σχήμα 5. Έκφραση της νεφρίνης στα ποδοκύτταρα Σχήμα 6. Δοκιμασία χρόνου για την έκφραση της νεφρίνης στα ποδοκύτταρα..105 Σχήμα 7. Κυτταροεπιφανειακή έκφραση της νεφρίνης στα ποδοκύτταρα Σχήμα 8. Έκφραση της ΖΟ-1 στα ποδοκύτταρα Σχήμα 9. Έκφραση της α3β1 ιντεγκρίνης στα ποδοκύτταρα Σχήμα 10. Έκφραση και κατανομή της CD2AP στα ποδοκύτταρα Σχήμα 11. Έκφραση του WT1 στα ποδοκύτταρα Σχήμα 12. Έκφραση του Sp1 στα ποδοκύτταρα Σχήμα 13. Έκφραση του Sp1 και της CBP στα ποδοκύτταρα Σχήμα 14. Ανοσοαποτύπωση κατά Western πειραμάτων συνανοσοκατακρήμνισης των HGEC Σχήμα 15. Ανάλυση της πρόσδεσης του WT1 στον υποκινητή του γονιδίου της ποδοκαλυκίνης Σχήμα 16. Χρονική δοκιμασία ανάλυσης ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης για την πρόσδεση του WT1 στον υποκινητή του γονιδίου της ποδοκαλυκίνης Σχήμα 17. Χρονική δοκιμασία ανάλυσης ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης για την πρόσδεση του WT1 στον υποκινητή του γονιδίου της νεφρίνης xvii

18 Κατάλογος Εικόνων Εικόνα 1. Σχηματική αναπαράσταση της ανατομίας του νεφρού....2 Εικόνα 2. Σχηματική αναπαράσταση της δομής του νεφρικού σωματίου και της παρασπειραματικής συσκευής....5 Εικόνα 3. Σχηματική αναπαράσταση της μεμβράνης διήθησης....6 Εικόνα 4. Σχηματισμός του νεφρώνα από το μετανεφρικό παρέγχυμα....9 Εικόνα 5. Σχηματική απεικόνιση της δομής του διαφράγματος διήθησης και της σχέσης μεταξύ της σπειραματικής βασικής μεμβράνης (ΣΒΜ) και του κυτταροσκελετού της ακτίνης στις ποδοειδείς προσεκβολές.16 Εικόνα 6. Διάταξη μικροσκοπίου φθορισμού xviii

19 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ Οι νεφροί είναι δύο όργανα που βρίσκονται στον οπίσθοπεριτοναϊκό χώρο, εκατέρωθεν της σπονδυλικής στήλης και αποτελούνται από κύτταρα υψηλής εξειδίκευσης. Το εξωτερικό στρώμα του νεφρού καλείται φλοιός και το ενδότερο στρώμα καλείται μυελός. Ο μυελός διαιρείται σε πολλαπλές κωνωειδείς μάζες που αποκαλούνται νεφρικές πυραμίδες. Η μικρότερη ανατομική και λειτουργική μονάδα του νεφρού είναι ο νεφρώνας. Κάθε νεφρώνας αποτελείται από το νεφρικό (ή μαλπιγιανό) σωμάτιο, από τo εγγύς εσπειραμένο σωληνάριο, από την αγκύλη Henle, από το άπω εσπειραμένο σωληνάριο και από το σύστημα των αθροιστικών σωληναρίων. Το νεφρικό σωμάτιο σχηματίζεται από το σπείραμα, το οποίο είναι ένας θύσανος από εξειδικευμένα τριχοειδή αγγεία και από το έλυτρο Bowman (Εικόνα 1). Η δομή των σπειραμάτων και των σωληναρίων επιτρέπει την επιτέλεση των λειτουργιών του νεφρού, οι οποίες είναι: η απέκκριση των μεταβολικών παραπροϊόντων και άλλων ουσιών, η ρύθμιση της ισορροπίας ύδατος και ηλεκτρολυτών, η ρύθμιση της συγκέντρωσης των ηλεκτρολυτών και επομένως η οσμορρύθμιση των σωματικών υγρών, η ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης, η ρύθμιση της οξεοβασικής ισορροπίας, η παραγωγή, ο μεταβολισμός και η έκκριση ορμονών, η γλυκονεογένεση. 1

20 Εικόνα 1. Σχηματική αναπαράσταση της ανατομίας του νεφρού. 1: Σπείραμα, 2: Περισωληναριακό δίκτυο τριχοειδών, 3: Εγγύς εσπειραμένο σωληνάριο, 4: Παχύ κατιόν σκέλος της αγκύλης του Henle, 5: Λεπτό κατιόν σκέλος της αγκύλης του Henle, 6: Παχύ ανιόν σκέλος της αγκύλης του Henle, 7: Άπω εσπειραμένο σωληνάριο, 8: Αθροιστικό σωληνάριο, 9: Θηλαίος πόρος. (με τροποποιήσεις από (318)) Κάθε νεφρός φέρει 1-1,3 εκατομμύρια νεφρώνες, πυκνά τοποθετημένους εντός του νεφρικού παρεγχύματος. Με βάση τη θέση του νεφρικού σωματίου κάθε νεφρώνα στο φλοιό, οι νεφρώνες διακρίνονται σε φλοιώδεις και παραμυελικούς. 2

21 Η αιμάτωση κάθε νεφρού γίνεται με τη νεφρική αρτηρία που εκφύεται από την κοιλιακή αορτή, στο ύψος του 2ου οσφυϊκού σπονδύλου αμέσως μετά την έκφυση της άνω μεσεντερίου αρτηρίας. Στη νεφρική πύλη, πριν την είσοδο στο νεφρικό παρέγχυμα, η νεφρική αρτηρία διακλαδίζεται αρχικά στο πρόσθιο και τον οπίσθιο κλάδο και ακολούθως ο πρόσθιος σε τμηματικούς κλάδους, που αιματώνουν επιμέρους νεφρικά τμήματα. Από την διαίρεση των τμηματικών κλάδων προκύπτουν οι μεσολόβιες αρτηρίες που πορεύονται κατά μήκος των νεφρικών στηλών του Bertini, κοντά στις παρακείμενες πυραμίδες. Στο ύψος της βάσης των πυραμίδων, στο φλοιο-μυελώδες όριο, κάμπτονται και δίνουν γένεση στις τοξοειδείς αρτηρίες, από τις οποίες εκφύονται οι μεσολοβίδιες αρτηρίες, που κατευθύνονται παράλληλα προς τις μυελώδεις ακτίνες έως τη νεφρική κάψα. Από τις μεσολοβίδιες αρτηρίες, σε διάφορα επίπεδα, εκφύονται τα προσαγωγά αρτηριόλια που διακλαδιζόμενα (σε 20 έως 40 τριχοειδή) σχηματίζουν τις τριχοειδικές αγκύλες του αγγειώδους σπειράματος, οι οποίες επανενώνονται σχηματίζοντας το απαγωγό αρτηριόλιο. Τα τριχοειδή του σπειράματος σταθεροποιούνται εντός του ελύτρου του Bowman με τη συνδρομή του μεσαγγείου, το οποίο συνιστά έναν εξειδικευμένο περιαγγειακό ιστό. Τα μεσαγγειακά κύτταρα αποτελούν έναν τύπο διαφοροποιημένων λείων μυϊκών κυττάρων που έχουν την ικανότητα σύσπασης-χάλασης και επομένως συμμετέχουν ενεργά στη ρύθμιση του ρυθμού σπειραματικής διήθησης τροποποιώντας τη σπειραματική ροή, την υδροστατική πίεση και την επιφάνεια διήθησης. Σε αντίθεση με άλλα τριχοειδικά δίκτυα, η παρουσία στο νεφρό δυο 'εν σειρά' τριχοειδικών δικτύων (αγγείων αντίστασης), δηλαδή του προσαγωγού και απαγωγού αρτηριολίου, μεταξύ των οποίων παρεμβάλλεται το σπείραμα, αποτελεί ένα μοναδικό χαρακτηριστικό ιστικής αγγείωσης, που επιτρέπει την ανεξάρτητη ρύθμιση της αιμάτωσης από την διήθηση. 3

22 Η δίοδος συστατικών του πλάσματος από την κυκλοφορία στον ουροφόρο χώρο του ελύτρου του Bowman αποτελεί τη σημαντικότερη λειτουργία των νεφρών στην εξασφάλιση της ομοιόστασης του ανθρώπινου οργανισμού. Το αίμα που ρέει στον ενδοαγγειακό χώρο (προσαγωγά τριχοειδή) εξέρχεται στον εξωαγγειακό χώρο (έλυτρο του Bowman), προτού παραληφθεί από τα απαγωγά τριχοειδή (Εικόνα 2). Η ροή αυτή δημιουργεί υψηλή πίεση εντός του σπειράματος, η οποία βοηθάει την υπερδιήθηση του πλάσματος, αφού το νερό και οι ελεύθερα διηθούμενες ουσίες (ηλεκτρολύτες, μικρομόρια κ.α.) πρέπει να διασχίσουν τρία επίπεδα διήθησης ώστε να σχηματιστεί το πρόουρο. Ο ρυθμός διήθησης του αίματος μέσω των σπειραμάτων καλείται ρυθμός σπειραματικής διήθησης (Glomerular Filtration Rate, GFR) και αποτελεί κλινικό δείκτη της νεφρικής λειτουργίας. Σε έναν μέσο ενήλικα, ο ρυθμός αυτός είναι περίπου 125ml/min ή 180L/ημέρα. Ο υψηλός ρυθμός διήθησης οφείλεται στα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του ηθμού διήθησης. 4

23 Εικόνα 2. Σχηματική αναπαράσταση της δομής του νεφρικού σωματίου και της παρασπειραματικής συσκευής. (με τροποποιήσεις από (155)) Ο ηθμός διήθησης (ή σπειραματικός ηθμός) αποτελείται από: α) το θυριδωτό ενδοθήλιο, β) τη σπειραματική βασική μεμβράνη, και γ) το έσω πέταλο του ελύτρου Bowman στον ουροφόρο πόλο του νεφρικού σωματίου, το οποίο αποτελείται από επιθηλιακά κύτταρα, τα ποδοκύτταρα (Εικόνα 3). 5

24 Εικόνα 3. Σχηματική αναπαράσταση της μεμβράνης διήθησης. (α) Απεικόνιση της σχέσης του σπλαγχνικού επιπέδου της σπειραματικής κάψας με τα σπειραματικά τριχοειδή. Το σπλαγχνικό επιθήλιο αναπαρίσταται ατελώς ώστε να απεικονισθούν οι θηρίδες του υποκείμενου τριχοειδικού τοιχώματος. (β) Φωτογραφία από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης του σπλαγχνικού επιπέδου. Διακρίνονται οι οπές διήθησης μεταξύ των ποδοκυτταρικών ποδοειδών προσεκβολών (3000x). (γ) Απεικόνιση τομής της μεμβράνης διήθησης στην οποία αναπαρίστανται τα τρία δομικά στοιχεία. (με τροποποιήσεις από (155)) 6

25 Το ενδοθήλιο των τριχοειδών είναι διάτρητο από χιλιάδες μικρούς πόρους που λέγονται θηρίδες (μέγεθος πόρου nm). Παρά το γεγονός ότι τα ανοίγματα είναι σχετικά μεγάλα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα φέρουν υψηλό αρνητικό φορτίο που παρεμποδίζει τη διέλευση πρωτεϊνών του πλάσματος. Το ενδοθήλιο περιβάλλεται από τη βασική μεμβράνη πάχους nm, η οποία είναι ένα δίκτυο ινών κολλαγόνου και φιμπρονεκτίνης. Οι ίνες αυτές σχηματίζουν τρεις στιβάδες: α) την εσωτερική αραιή στιβάδα (lamina rara interna) προς την πλευρά του ενδοθηλίου που αποτελείται από γλυκοζαμινογλυκάνες, β) τη μεσαία πυκνή στιβάδα (lamina densa) που αποτελείται κυρίως από κολλαγόνο IV και λαμινίνη, και γ) την εξωτερική αραιή στιβάδα (lamina rara externa) προς την ουροφόρο κοιλότητα, η οποία έρχεται σε επαφή με τα ποδοκύτταρα. Η σπειραματική βασική μεμβράνη έχει ανοίγματα αρκετά μεγάλα ώστε να είναι διαπερατά από το νερό και τις μικρομοριακές ουσίες. Επιπλέον, οι πρωτεογλυκάνες φέρουν αρνητικό φορτίο το οποίο παρεμποδίζει τη διέλευση πρωτεϊνών. Τα ποδοκύτταρα έχουν ένα μεγάλο, σφαιρικό κυτταρικό σώμα από το οποίο εκτείνονται μακρές κυτταροπλασματικές προσεκβολές, οι λεγόμενες ποδοειδείς προσεκβολές. Οι ποδοειδείς προσεκβολές καλύπτουν τη βασική μεμβράνη με τη μορφή συμπλεκόμενων δακτύλων που διαχωρίζονται από ανοίγματα που ονομάζονται σχισμές διήθησης. Κάθε σχισμή διήθησης γεφυρώνεται από ένα λεπτό διάφραγμα που περιέχει πόρους διαστάσεων 40 Χ 140Å. Έτσι οι σχισμές διήθησης επιβραδύνουν τη διήθηση ορισμένων πρωτεϊνών και άλλων μακρομορίων τα οποία διαπερνούν το ενδοθήλιο και τη βασική μεμβράνη. Εκτός των ποδοκυττάρων, ένας άλλος τύπος επιθηλιακών κυττάρων απαντάται στο έλυτρο του Bowman, τα τοιχωματικά επιθηλιακά κύτταρα. Τα κύτταρα αυτά είναι 7

26 πλακώδη επιθηλιακά κύτταρα, με επίπεδο κυτταρικό σώμα και καλύπτουν το τοίχωμα του εξωτερικού πετάλου του ουροφόρου χώρου του ελύτρου του Bowman. 1.2 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΠΟΔΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ Κάθε νεφρώνας του ώριμου νεφρού αναπτύσσεται από το μεσεγχυματικό μετανεφρικό βλάστημα μετά από την επαγωγική επίδραση δύο νεοσχηματιζόμενων δομών, των ουρητικών καλύκων, οι οποίοι εκβλαστάνουν από τα περιφερικά τμήματα των μεσονεφρικών πόρων περί την 28η ημέρα της ανάπτυξης. Οι άκρες των διακλαδιζούμενων ουροφόρων σωληναρίων επάγουν τη συνάθροιση μεσεγχυματικών κυττάρων που αποκτούν επιθηλιακό φαινότυπο. Αυτά τα συσσωματώματα κυττάρων υφίστανται πολλαπλούς μιτωτικούς κύκλους και στάδια διαφοροποίησης, συνδέονται με το σωληνάριο και τελικώς δημιουργούν το νεφρώνα. Αρχικά, η όλη διαδικασία είναι επικεντρωμένη στην ανάπτυξη του σπειράματος και σε γενικές γραμμές διαχωρίζεται στα ακόλουθα στάδια: σχηματισμός κυστιδίου, σώματος σε σχήμα S, τριχοειδικής αγκύλης και σπειράματος. Το κυστίδιο είναι η πρώτη επιθηλιακή δομή που αποτελείται από πολωμένα κύτταρα και περιβάλλεται από βασική μεμβράνη. Η μια πλευρά του κυστιδίου συγκλίνει στον ουρητικό κάλυκα και υπάρχει ένας συνεχής αυλός μεταξύ κάλυκα και κυστιδίου. Στην αντίθετη πλευρά του κυστιδίου σχηματίζεται μια πτυχή, δημιουργώντας έτσι το σώμα σχήματος S. Το χείλος κάτω από την πτυχή αυτή καθορίζεται από μια στιβάδα επιθηλιακών κυττάρων σε σχήμα ημισελήνου. Τα κύτταρα αυτά θα διαφοροποιηθούν στα ποδοκύτταρα (Εικόνα 4). 8

27 Εικόνα 4. Σχηματισμός του νεφρώνα από το μετανεφρικό παρέγχυμα. Οι νεφροί γεννώνται από προσωληναρικά συσσωματώματα κυττάρων ως απόκριση στον παράγοντα Wnt9b. Πρώιμοι μοριακοί δείκτες των προσωληναριακών συσσωματωμάτων είναι οι Pax8, Fgf8 και Wnt4. O Wnt4 επάγει τον Lhx1 και μετατρέπει το συσσωμάτωμα σε επιθηλιακό κυστίδιο. Το νεφρικό κυστίδιο παρουσιάζει πολωμένη έκφραση γονιδίων. Αύξηση του κυστιδίου οδηγεί τελικά στο σχηματισμό του σώματος σχήματος S. Η σηματοδότηση μέσω του Notch2 είναι απαραίτητη για την εξειδίκευση των εγγύς κυτταρικών τύπων (ποδοκύτταρα και εγγύς σωληναριακά). Οι αγγειοβλάστες εισβάλλουν στην εγγύς πτυχή του σώματος σχήματος S και συνεισφέρουν στο σπειραματικό τριχοειδές. Το άπω τμήμα του σώματος συνενώνεται με τον αθροιστικό πόρο. (με τροποποιήσεις από Melton, Stembook, Στα αρχικά στάδια της οργανογένεσης του σπειράματος, τα σπειραματικά επιθηλιακά κύτταρα που πρόκειται να εξελιχθούν σε ποδοκύτταρα είναι τυπικά πολυγονικά κύτταρα, τοποθετημένα σε μια σειρά και παρουσιάζουν σημαντική ικανότητα κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Συνδέονται μέσω κορυφαίων συνδέσεων. Δομικά οι συνδέσεις αυτές θυμίζουν στενοσυνδέσμους, αλλά περιέχουν και δεσμοσωμικές πρωτεΐνες α. Η έκφραση της ποδοκαλυκίνης και της πρωτεΐνης των στενοσυνδέσμων ZO-1 αρχίζει σε αυτό το στάδιο (232). Καθώς τα ποδοκύτταρα εισέρχονται στο επακόλουθο στάδιο της τριχοειδικής αγκύλης, αρχίζουν να αποκτούν την χαρακτηριστική τους πολύπλοκη αρχιτεκτονική, με το σχηματισμό των ποδοειδών προσεκβολών και της μεμβράνης διήθησης. Σε αυτό το στάδιο οι δεσμοσωμικές πρωτεΐνες χάνονται (77), η ZO-1 μεταφέρεται από την κορυφαία 9

28 μεμβράνη στο βασικό επίπεδο, όπου λαμβάνει χώρα ο σχηματισμός της μεμβράνης διήθησης (115, 233). Στην ίδια φάση της οργανογένεσης, εκφράζονται οι πρωτεΐνες νεφρίνη (115), ποδοσίνη (22) και CD2AP (144). Αυτή η φαινοτυπική μεταβολή σχετίζεται με την απώλεια της μιτωτικής δραστηριότητας (181) και συνοδεύεται από την έκφραση άλλων πρωτεΐνών, όπως της σχετιζόμενης με την ακτίνη συναπτοποδίνης (173), της βασικής επιφανειακής πρωτεΐνης ποδοκαλυκίνης (233), μιας ιστοειδικής μεμβρανικής φωσφατάσης τυροσινών Glepp1 (277), και της βιμεντίνης (181), μιας πρωτεΐνης των ενδιάμεσων ινιδίων του κυτταροσκελετού. Πολλά γονίδια μεταγραφικών παραγόντων έχουν αναγνωριστεί ως εμπλεκόμενα στην επαγωγή του νεφρικού κυστιδίου και της επακόλουθης νεφρογένεσης. Το γονίδιο Pax-2 (paired homeobox-2), κωδικοποιεί ένα μεταγραφικό παράγοντα που είναι απαραίτητος για την μετατροπή των κυττάρων του νεφρικού μεσεγχύματος στο νεφρικό κυστίδιο. Πειράματα αποσιώπησης του γονιδίου δείχνουν ότι η απουσία αυτού του παράγοντα αποτρέπει το σχηματισμό του κυστιδίου (58, 213, 262). Η περαιτέρω διαφοροποίηση αυτών των πρώιμων επιθηλιακών κυττάρων και η ωρίμανσή τους σε ποδοκύτταρα συσχετίζεται με ελάττωση των επιπέδων της πρωτεΐνης PAX-2 και την ταυτόχρονη έκφραση της πρωτεΐνης WT-1 (Wilms' tumor-1). Η μειορρύθμιση του PAX- 2 φαίνεται να είναι προαπαιτούμενη για την διαφοροποίηση των ποδοκυττάρων. Τα πρώιμα κύτταρα στο κυστίδιο και τα εφεξής αναπτυξιακά στάδια εκφράζουν την πρωτεΐνη WT-1 σε υψηλά επίπεδα και η έκφραση αυτή παραμένει ένας ειδικός δείκτης των ποδοκυττάρων στην οντογένεση και στο ώριμο άτομο (174, 176). Επικρατούσες μεταλλαγές του γονιδίου σχετίζονται με τα σύνδρομα Denys-Drash και Frasier, με βασικά συμπτώματα τη σπειραματοπάθεια, τη μεσαγγειακή σκλήρυνση και τον αρσενικό ψευδερμαφροδιτισμό (162). 10

29 Το γονίδιο Lmx-1b (Lim homeobox-1b) εκφράζεται στα πρόδρομα κύτταρα στο σώμα σχήματος S και συνεχίζει να εκφράζεται καθόλη τη νεφρογένεση (28). Ποντίκια ομόζυγα για μεταλλαγές του γονιδίου Lmx-1b παρουσιάζουν ανωμαλίες στα ποδοκύτταρα και τη σπειραματική βασική μεμβράνη κατά τη γέννηση, τονίζοντας το σημαντικό ρόλο του γονιδίου στην ανάπτυξη του σπειράματος (28). Μεταλλαγές στο ανθρώπινο γονίδιο Lmx-1b είναι υπεύθυνες για την ανάπτυξη του ονυχο-επιγονατιδικού συνδρόμου (nail-patella syndrome), το οποίο συχνά σχετίζεται με σπειραματοπάθεια (59). Η πρωτεΐνη Pod-1, μια βασική πρωτεΐνη με δομή έλικας-βρόχου-έλικας, εκφράζεται στα ποδοκύτταρα κατά την ανάπτυξη του σπειράματος και φαίνεται ότι εμπλέκεται στη διαφοροποίηση αυτού του κυτταρικού τύπου (198). Η δομική επιβολή των ποδοκυττάρων κατά την πρώιμη νεφρογένεση αντικατοπτρίζει τον κεντρικό ρόλο που έχει αυτός ο κυτταρικός τύπος στην ανάπτυξη του νεφρικού σωμάτιου. Οι βασικοί παράγοντες που επηρεάζουν αυτήν την διαδικασία είναι αγγειογενείς. Η ανάπτυξη των σπειραματικών τριχοειδών και του μεσαγγείου ξεκινά από κύτταρα που βρίσκονται εντός της πτυχής επάνω από τη στιβάδα των ποδοκυττάρων στο σώμα σχήματος S. Αυτά τα κύτταρα προέρχονται από τα γειτονικά μεσεγχυματικά κύτταρα (223, 226). Διάφορα σηματοδοτικά μονοπάτια συμμετέχουν σε αυτή τη διαδικασία διαφοροποίησης. Αρχικά ενεργοποιείται το μονοπάτι του VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor - Αυξητικός Παράγοντας Αγγειακού Ενδοθηλίου). Ο VEGF εκφράζεται από τα πρόδρομα των ποδοκυττάρων κύτταρα στο σώμα σχήματος S και ο υποδοχέας του VEGFR2 εκφράζεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα της πτυχής και το γειτονικό μεσέγχυμα (123, 270), γεγονός που ίσως ενδυκνύει ότι ο VEGF είναι υπεύθυνος για την εισβολή ενδοθηλιακών 'μίσχων' εντός της πτυχής. Μελέτες που χρησιμοποιούν γενετικές και ανοσολογικές τεχνικές για την παρεμπόδιση του VEGF in 11

30 vivo (79, 123) επιβεβαιώνουν ότι ο VEGF είναι απολύτως απαραίτητος για την αύξηση των σπειραματικών τριχοειδών. Στην επικοινωνία αυτή σημαντικό ρόλο φαίνεται ότι έχει το μικροπεριβάλλον του ιστού, αφού η τοπική υποξία οδηγεί στην έκφραση των ισομορφών του HIF (Hypoxia Inducible Factor - Παράγοντας Επαγόμενος από την Υποξία), που με τη σειρά του επάγει την έκφραση του VEGF (71). Τα ποδοκύτταρα συνεχίζουν να εκφράζουν VEGF και μετά την ολοκλήρωση της νεφρογένεσης, γεγονός που υποδεικνύει ότι ο παράγοντας αυτός μπορεί να παίζει κάποιο ρόλο στη διατήρηση των θηρίδων του ενδοθηλίου. Πέραν του VEGF, οι αγγειοποιητίνες (45) παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των σπειραματικών τριχοειδών (296). Τα νεφρικά ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν τον υποδοχέα TIE-1 (Tyrosine kinase with Immunologlobulin-like and EGFlike domain-1). Οι προσδέτες του είναι οι αγγειοποιητίνες ANG I και ANG II. Φαίνεται ότι η ANG I προέρχεται από τα ποδοκύτταρα και η ANG II από τα μεσαγγειακά κύτταρα. Αμφότερες προσδένονται στον ίδιο υποδοχέα (TIE-1), αλλά η ANG II δεν τον ενεργοποιεί. Επομένως, η ANG II είναι αναστολέας της ANG I (296, 307, 308). Η ANG II, όπως και ο VEGF, επάγεται από υποξικές συνθήκες (71). Ένα άλλο σημαντικό ρυθμιστικό σύστημα στην πρώιμη ανάπτυξη των σπειραματικών τριχοειδών είναι η οικογένεια υποδοχέων Eph/ephrin (286). Η έκφραση της Ephrin-B2 εμφανίζεται στα πρόδρομα των ποδοκυττάρων κύτταρα που γειτνιάζουν με την αγγειακή πτυχή και η Eph-B4 εκφράζεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα (255), ένδειξη ότι η διακυτταρική επικοινωνία παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των σπειραματικών τριχοειδών. Μετά από την στρατολόγηση των ενδοθηλιακών κυττάρων ενεργοποιείται ο άξονας PDGF (Platelet Derived Growth Factor) και του υποδοχέα του, η λειτουργία του οποίου απαιτείται για τον πολλαπλασιασμό και τη στοίχιση των τριχοειδών και του 12

31 μεσαγγείου (18, 142, 247). Η δράση του TGF-β1 (Transforming Growth Factor-β1 επίσης σταθεροποιεί την αγγείωση του σπειράματος (149). Μετά την εγκαθίδρυση της σπειραματικής αγγείωσης, σηματοδοτικά γεγονότα από τα αγγεία προς τα επιθηλιακά κύτταρα είναι απαραίτητα για την τελική ωρίμανση της ποδοκυτταρικής λειτουργίας. Αυτά οδηγούν στην παραγωγή συστατικών της σπειραματικής βασικής μεμβράνης από τα ποδοκύτταρα, όπως ορίζεται από την αντικατάσταση της λαμινίνης-1 από τη λαμινίνη-11 και από την αντικατάσταση των αλύσεων 1 και 2 του κολλαγόνου IV από τις αλυσίδες 3, 4 και 5, χαρακτηριστικές της ώριμης βασικής μεμβράνης του σπειράματος (166, 167). Πειραματικά μοντέλα με μεταλλαγές σε πειραματόζωα δείχνουν ότι απώλεια αυτών των μεταβολών σχετίζονται με παθήσεις σε δομικό και λειτουργικό επίπεδο (38, 92, 166, 168, 185). Όπως αναφέρθηκε, στο στάδιο του σωματίου σχήματος S, τα πρόδρομα κύτταρα των ποδοκυττάρων εκφράζουν δείκτες πολλαπλασιασμού, όπως το πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA, proliferating cell nuclear antigen) και το αντιγόνο Ki-67, καθώς επίσης τις κυκλίνες Α και Β1 (180). Κατά τη μετάβαση στη φάση της τριχοειδικής αγκύλης, ο φαινότυπος των κυττάρων αυτών μεταβάλλεται σε μια πιο ενδιάμεση κατάσταση, κατά την οποία επάγονται μεσεγχυματικά ενδιάμεσα ινίδια, η έκφραση ποδοκυτταρικών δεικτών και η διακλάδωση και των ποδοειδών προσεκβολών. Παράλληλα με τις μεταβολές αυτές αυξορυθμίζονται οι καταστολείς του κυτταρικού κύκλου p27 και p57 (180), των οποίων η έκφραση οδηγεί σε αναστολή του πολλαπλασιασμού των ποδοκυττάρων ακόμη και στο πλήρως ανεπτυγμένο σπείραμα (36). Η ανάπτυξη των ποδοκυττάρων έχει μελετηθεί σε βαθμό τέτοιο που είναι εφικτή η επαγωγή ποδοκυττάρων από πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (111, 246). Τα τοιχωματικά επιθηλιακά κύτταρα προέρχονται από κοινά με τα ποδοκύτταρα προγονικά κύτταρα. Οι δύο τύποι κυττάρων δε διαχωρίζονται παρά μετά το σχηματισμό 13

32 του σωματίου σχήματος S (227). Ταυτόχρονα με τη μετατόπιση των μεσαγγειακών και ενδοθηλιακών κυττάρων εντός του σπειράματος, ο φαινότυπος των τοιχωματικών κυττάρων διαχωρίζεται από αυτόν των ποδοκυττάρων και οι δύο κυτταρικοί τύποι εκφράζουν διαφορετικές αλλά ειδικές πρωτεΐνες (225). Επιπλέον τα τοιχωματικά κύτταρα δε χάνουν την ικανότητα πολλαπλασιασμού ακόμη και σε ώριμα άτομα (83). Ο διαχωρισμός μεταξύ των ποδοκυττάρων και των τοιχωματικών επιθηλιακών κυττάρων δεν είναι πάντοτε εύκολος, αφού έχουν αναφερθεί και κύτταρα με ενδιάμεσο φαινότυπο (9, 239) ΔΟΜΗ Τα ποδοκύτταρα είναι κύτταρα που παρουσιάζουν υψηλού βαθμού διαφοροποίηση. Έχουν ένα ογκώδες κυτταρικό σώμα, ευμεγέθη πυρήνα, πλούσιο σε λυσοσώματα και μιτοχόνδρια, άφθονο ενδοπλασματικό δίκτυο και καλά αναπτυγμένη συσκευή Golgi, όλα ενδεικτικά ενός υψηλά μεταβολικού κυτταρικού τύπου. Το κυτταρικό σώμα βρίσκεται προς την ουροφόρο κοιλότητα (αυλική επιφάνεια), ενώ υπάρχουν και πρωτογενείς κυτταροπλασματικές (ποδοειδείς) προσεκβολές προς τα τριχοειδή αγγεία (πλαγιοβασική επιφάνεια). Αυτές οι προσεκβολές δεν περιέχουν πολλά οργανίδια και διαιρούνται περαιτέρω, σχηματίζοντας τους ποδίσκους (δευτερογενείς ποδοειδείς προσεκβολές). Οι ποδίσκοι γειτονικών ποδοκυττάρων διαπλέκονται στενά μεταξύ τους, αφήνοντας μικρούς χώρους μεταξύ τους, τις σχισμές διήθησης. Αυτές γεφυρώνονται από το διάφραγμα διήθησης (ή ηθμό διήθησης), έναν μοναδικά εξειδικευμένο τύπο κυτταρικής σύνδεσης που παρουσιάζει στοιχεία στενοσυνδέσμου. Οι σχισμές διήθησης είναι τα σημεία σύγκλισης της ροής υγρών διαμέσου του σπλαγχνικού επιθηλίου. 14

33 Τα ποδοκύτταρα είναι πολωμένα επιθηλιακά κύτταρα με κορυφαία (αυλική) και πλαγιοβασική κυτταρική μεμβράνη. Το βασικό τμήμα της κυτταρικής μεμβράνης αντιστοιχεί στα "πέλματα" των ποδοειδών προσεκβολών, τα οποία εμβυθίζονται στην εξωτερική αραιή στιβάδα (lamina rara externa) της σπειραματικής βασικής μεμβράνης. Το όριο μεταξύ της κορυφαίας και της βασικής μεμβράνης είναι η σχισμή διήθησης. Το τμήμα της κυτταρικής μεμβράνης άνωθεν της σχισμής διήθησης αφορίζει την κορυφαία μεμβράνη. Η κορυφαία μεμβράνη και η σχισμή διήθησης καλύπτονται από το γλυκοκάλυκα, μια αρνητικά φορτισμένη στιβάδα, η οποία αποτελείται κυρίως από σιαλογλυκοπρωτεΐνες, όπως η ποδοκαλυκίνη (118), η ποδοεντίνη (101), και η GLEPP-1 (261), οι οποίες ευθύνονται για την αρνητικά φορτισμένη κυτταροεπιφάνεια (101, 224). Η μοναδική αρχιτεκτονική του ποδοκυττάρου και η διατήρηση των ποδοειδών προσεκβολών βασίζονται στην ύπαρξη ενός καλά οργανωμένου κυτταροσκελετικού δικτύου. Στο κυτταρικό σώμα και τις πρωτογενείς προσεκβολές, τα κυρίαρχα κυτταροσκελετικά στοιχεία είναι οι μικροσωληνίσκοι και πρωτεΐνες των ενδιάμεσων ινιδίων, όπως η βιμεντίνη και η δεσμίνη. Μικροϊνίδια ακτίνης βρίσκονται κυρίως στους ποδίσκους. Οι δέσμες των μικροσωληνίσκων και ενδιαμέσων ινιδίων εκτείνονται από το σώμα του κυττάρου μέχρι το τελικό άκρο των πρωτογενών προσεκβολών. Σε αυτές τις περιοχές του κυττάρου τα μικροϊνίδια, που περιέχουν ακτίνη, δημιουργούν ένα λεπτό στρώμα κάτω από την κυτταρική μεμβράνη (57). Στους ποδίσκους ανευρίσκονται πυκνές δέσμες μικροϊνιδίων, οι οποίες εκτείνονται κατά μήκος τους. Οι μικροϊνιδιακές αυτές δέσμες σχηματίζουν αγκύλες, κατά προσέγγιση παράλληλες προς το σημείο καμπής της σχισμής διήθησης, εκτείνονται προς την παρακείμενη δευτερογενή ποδοειδή προσεκβολή του ιδίου κυττάρου και φαίνεται να αγκυροβολούν στο πυκνό κυτταρόπλασμα που συνορεύει με την κυτταρική μεμβράνη (4). Οι γειτονικές ποδοειδείς προσεκβολές 15

34 συνδέονται από μια συσταλτή συσκευή που αποτελείται από ινώδη ακτίνη, μυοσίνη ΙΙ, α- ακτινίνη-4 και συναπτοποδίνη (66, 283) (Εικόνα 5). Εικόνα 5. Σχηματική απεικόνιση της δομής του διαφράγματος διήθησης και της σχέσης μεταξύ της σπειραματικής βασικής μεμβράνης (ΣΒΜ) και του κυτταροσκελετού της ακτίνης στις ποδοειδείς προσεκβολές. Οι διαφορετικές υποπεριοχές της μεμβράνης διακρίνονται: η κορυφαία μεμβράνη (πράσινο χρώμα), το διάφραγμα διήθησης (μπλε χρώμα) και η βασική περιοχή της κυτταρικής μεμβράνης (ροζ χρώμα). (με τροποποιήσεις από (209)) 16

35 Το διάφραγμα διήθησης Οι διαπλεκόμενες δευτερογενείς ποδοειδείς προσεκβολές γεφυρώνονται από το διάφραγμα διήθησης, έναν μοναδικό τύπο κυτταρικής σύνδεσης, που ευθύνεται για την εκλεκτική διαπερατότητα μορίων από την κυκλοφορία προς το πρόουρο. Ο ηθμός διήθησης είναι διαπερατός από το νερό και τις μικρές διαλυμένες ουσίες, αλλά οι πρωτεΐνες, λόγω του μεγέθους τους, δεν διαπερνούν το διάφραγμα διήθησης. Η μορφολογία του διαφράγματος διήθησης ομοιάζει με αυτή του διακυτταρικού συνδέσμου προσκόλλησης (adherens junction), αφού περιλαμβάνει ένα πλατύ κενό μεταξύ των κυττάρων και μια κεντρική ηλεκτρονικά πυκνή ζώνη (208). Πέραν αυτού, η μεμβράνη διήθησης αναπτύσσεται κατά τη σπειραματική ανάπτυξη από ένα στενοσύνδεσμο, και η πρωτεΐνη των στενοσυνδέσμων ZO-1 (zonula occludens-1) βρίσκεται συγκεντρωμένη κατά μήκος της κυτταροπλασματικής επιφάνειας του διαφράγματος διήθησης (232). Η μοριακή αρχιτεκτονική του διαφράγματος διήθησης έχει αποτελέσει αντικείμενο επισταμένης έρευνας τα τελευταία 20 χρόνια και, εκτός της ZO-1, πολλές άλλες πρωτεΐνες συμμετέχουν ως συστατικά του πολυπρωτεϊνικού συμπλόκου. Τέτοιες είναι οι διακυτταρικές νεφρίνη (98), Neph1 (53), FAT-1 (35) και Ρ-καντερίνη (201), η μεμβρανική πρωτεΐνη ποδοσίνη (235), και οι ενδοκυττάριες α-, β- και γ-κατενίνες (201) και CD2AP (144). Ο αριθμός των πρωτεϊνών που συμμετέχουν δομικά ή αλληλεπιδρούν με το διάφραγμα διήθησης συνεχώς αυξάνεται (82). A. ΝΕΦΡΙΝΗ Η νεφρίνη ανακαλύφθηκε το 1998 μέσω κλωνοποίησης γενετικού τόπου, αφού το γονίδιο που κωδικοποιεί τη νεφρίνη (NPHS1) βρέθηκε να φέρει μεταλλαγές που ευθύνονται για την εκδήλωση συγγενούς νεφρωσικού συνδρόμου φινλανδικού τύπου, μιας νόσου που μεταδίδεται με την αυτοσωματική υπολειπόμενη μορφή κληρονομικότητας και εκδηλώνεται με μαζική πρωτεϊνουρία, ήδη πριν τη 17

36 γέννηση (121). Το γονιδιακό προϊόν, η νεφρίνη, είναι μια διαμεμβρανικη πρωτεΐνη με μοριακό βάρος kDa και αποτελείται από ένα μικρό ενδοκυτταρικό τμήμα και ένα μεγαλύτερο εξωκυττάριο τμήμα με οκτώ διακριτές επικράτειες (motifs) τύπου ανοσοσφαιρίνης και μια επικράτεια φιμπρονεκτίνης τύπου ΙΙΙ. Το μήκος ολόκληρου του εξωκυττάριου τμήματος της νεφρινης είναι 35nm. Κάθε επικράτεια ανοσοσφαιρίνης περιέχει δύο κυστεΐνες που σχηματίζουν διασουλφιδικούς δεσμούς με την επαναλαμβανόμενη δομή και με αυτόν τον τρόπο οι επικράτειες αυτές αποκτούν σφαιρικό ή ελλειπτικό σχήμα. Επιπλέον των δύο κυστεϊνών στις επικράτειες τύπου ανοσοσφαιρίνης, υπάρχουν και τρεις ελεύθερες κυστεΐνες στο εξωκυττάριο τμήμα της πρωτεΐνης που θα μπορούσαν να σχηματίζουν δεσμούς με άλλα μόρια νεφρίνης ή άλλες πρωτεΐνες. (190) Με βάση τη δομή και τη θέση της νεφρίνης στο διάφραγμα διήθησης, έχει προταθεί ότι τα μόρια της νεφρίνης αλληλεπιδρούν με ομοφιλικές αλληλεπιδράσεις σχηματίζοντας μια πορώδη δομή εντός του διαφράγματος διήθησης (216, 265). Ανάλυση της δομής του ηθμού με ηλεκτρονική μικροσκοπία υψηλής ανάλυσης έδειξε ότι το διάφραγμα αποτελείται από κυκλοτερείς αλυσίδες που διασχίζουν τη μέση γραμμή του ηθμού και σχηματίζουν πτυχωτές επιφάνειες με πόρους στο μέγεθος της αλβουμίνης (279). Συνολικά τα δεδομένα που υπάρχουν από μοριακές και μικροσκοπικές τεχνικές υποστηρίζουν ένα μοντέλο στο οποίο τα μόρια της νεφρίνης σχηματίζουν μια δομή "φερμουάρ" στον ηθμό και μόρια νεφρίνης από γειτονικές ποδοειδείς προσεκβολές αλληλεπιδρούν μεταξύ τους στο κέντρο του ηθμού (190). Το αμινοτελικό εξωκυττάριο τμήμα γλυκοσυλιώνεται και αυτή η μετα-μεταφραστική τροποποίηση είναι σημαντική για την αναδίπλωση της νεφρίνης και τον εντοπισμό της στην κυτταροπλασματική μεμβράνη του ποδοκυττάρου (302). 18

37 Κατά την ανάπτυξη, η έκφραση της νεφρίνης έχει τεκμηριωθεί στο στάδιο του σχηματισμού της τριχοειδικής αγκύλης και του σπειράματος, κοντά στους διακυτταρικούς συνδέσμους μεταξύ των σχηματιζόμενων ποδοειδών προσεκβολών των ποδοκυττάρων. Η νεφρίνη δεν ανιχνεύεται σε πιο πρώιμες δομές όπως το σώμα σχήματος S. Αντίθετα, η έκφραση της νεφρίνης έχει συσχετιστεί με την πρώτη εμφάνιση του οριστικού διαφράγματος διήθησης κατά την ανάπτυξη (54, 73). Στον άνθρωπο, το mrna της νεφρίνης αρχικά ανιχνεύεται στα όψιμα σώματα σχήματος S εμβρυϊκών νεφρών ηλικίας εβδομάδων. Σε σπειράματα με μεταλλαγές του NPHS1 παρατηρείται απώλεια των διαφραγμάτων διήθησης, ενώ η ΖΟ-1 και η Ρ-καδερίνη, δύο άλλα συστατικά του διαφράγματος διήθησης, εκφράζονται κανονικά. Αυτό σημαίνει ότι ο σχηματισμός του διαφράγματος διήθησης φαίνεται να εξαρτάται από την έκφραση της νεφρίνης, αν και η παρουσία της πρωτεΐνης δεν είναι απαραίτητη για την πρώιμη ανάπτυξη των πρωτεϊνικών συμπλόκων στους διακυτταρικούς συνδέσμους των ποδοκυττάρων στο υπό ανάπτυξη σπείραμα (217). Απενεργοποίηση του NPHS1 σε ποντίκια οδηγεί σε άμεση πρωτεϊνουρία και οίδημα μετά τη γέννηση, προκαλώντας το θάνατο κατά τη διάρκεια της πρώτης ημέρας. Οι νεφροί ποντικιών με ανεπάρκεια του NPHS1 έδειξαν απόσυρση και σύντηξη των ποδοειδών προσεκβολών (foot effacement) και απουσία του διαφράγματος διήθησης (197). Τα ποντίκια με εξουδετερωμένο το γονίδιο της νεφρίνης (knockout) παρουσιάζουν φυσιολογική δομή της σπειραματικής βασικής μεμβράνης και φυσιολογική έκφραση των πρωτεϊνών της βασικής μεμβράνης, τύπου IV κολλαγόνου και λαμινίνης. Η έκφραση των ειδικών για τα ποδοκύτταρα πρωτεϊνών ΖΟ-1, Ρ-καδερίνης και FAT επίσης δε μεταβάλλεται στα 19

38 ποντίκια αυτά. Τα πειράματα αυτά έδειξαν ότι μειωμένα επίπεδα έκφρασης της νεφρίνης σχετίζονται με απώλεια της ακεραιότητας του σπειραματικού ηθμού (197). Εφόσον η ελάττωση στα επίπεδα έκφρασης της νεφρίνης φαίνεται ότι σχετίζεται με πρωτεϊνουρία, έχουν πραγματοποιηθεί κάποιες μελέτες για τον προσδιορισμό της έκφρασης της νεφρίνης σε σπειραματοπάθειες. Με χρήση ποσοτικής αντίδρασης πολυμεράσης σε απομονωμένα σπειράματα, φαίνεται ότι το mrna της νεφρίνης παρουσιάζει ελαττωμένα επίπεδα σε σπειράματα ασθενών με νόσο ελαχίστων αλλοιώσεων και μεμβρανώδη νεφροπάθεια (73). Στη διαβητική νεφροπάθεια, τα επίπεδα της νεφρίνης φαίνεται ότι ελαττώνονται και στον εμπλεκόμενο μηχανισμό συμμετέχει και η αγγειοτενσίνη ΙΙ, αλλά οι λεπτομέρειες του μηχανισμού δεν είναι γνωστές (317). Σε ένα μοντέλο διαβήτη που έχει επαχθεί από στρεπτοζοτοκίνη, τα επίπεδα του mrna και της πρωτεΐνης της νεφρίνης είναι ελαττωμένα (21). Εκτός της δομικής λειτουργικότητας της νεφρίνης στο διάφραγμα διήθησης, η νεφρίνη παίζει σημαντικό ρόλο και στα σηματοδοτικά μονοπάτια του ποδοκυττάρου. Η νεφρίνη αλληλεπιδρά με ένα σημαντικό αριθμό άλλων πρωτεϊνών και μέσω αυτών επιδρά στα σηματοδοτικά μονοπάτια. Μία από τις πρωτεΐνες αυτές είναι η ποδοσίνη, η οποία οδηγεί τη νεφρίνη στις λιπιδικές σχεδίες της κυτταροπλασματικής μεμβράνης και με αυτόν τον τρόπο διευκολύνει την ενεργοποίηση μονοπατιών σηματοδότησης που εμπλέκουν τις MAP κινάσες μέσω της νεφρίνης (103, 235). Εξάλλου ο εντοπισμός της νεφρίνης στις λιπιδικές σχεδίες είναι απαραίτητος για τη σωστή σηματοδότηση από το διάφραγμα διήθησης (230). Είναι γνωστό ότι η νεφρίνη λειτουργεί ως ικρίωμα για τη συγκέντρωση σηματοδοτικών πρωτεϊνών, όπως η κινάση της φωσφατιδυλ- 20

39 ινοσιτόλης (314), η κινάση Fyn και η φωσφολιπάση Cγ1. Κάποιες από τις αλληλεπιδράσεις αυτές διαμεσολαβούνται από την πρωτεΐνη που σχετίζεται με το CD2 (CD2AP), μια πρωτεΐνη που είναι σημαντική για τη διατήρηση του κυτταροσκελετού και της κυτταρικής μορφολογίας (102). Μια άλλη πρωτεΐνηπροσαρμογέας της νεφρίνης στα μικροϊνίδια της ακτίνης είναι η Nck (109, 266). Η οικογένεια των πρωτεϊνών Nck περιλαμβάνουν μια περιοχή SH2, η οποία προσδένεται σε φωσφορυλιωμένες τυροσίνες και τρεις περιοχές SH3, οι οποίες μέσω άλλων πρωτεϊνών, μπορούν να ρυθμίσουν τη δυναμική ισορροπία της ακτίνης. Η νεφρίνη φωσφορυλιώνεται σε τουλάχιστο τρία υπολείμματα τυροσινών που οδηγούν σε πρόσδεση των πρωτεϊνών Nck με τη νεφρίνη. Σε ζωικό μοντέλο πρωτεϊνουρίας, η φωσφορυλίωση της νεφρίνης και η πρόσδεση των Nck πρωτεϊνών οδηγεί σε πολυμερισμό της ακτίνης και αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, δείχνοντας τη σημαντικότητα του μονοπατιού τόσο στην ανάπτυξη όσο και στην αποκατάσταση τραυματισμών (20, 109, 273). Το μονοπάτι φωσφονεφρίνης-nck είναι ενεργό και σε εν ηρεμία ώριμα ποδοκύτταρα. Αυτό σημαίνει ότι η αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών αυτών είναι σημαντική για τη διατήρηση της ακεραιότητας και της λειτουργίας του ποδοκυττάρου (110). B. ΠΟΔΟΣΙΝΗ Η ποδοσίνη ανήκει στην οικογένεια των στοματινών, το γονίδιο της οποίας (NPHS2) είναι μεταλλαγμένο σε μια υπο-ομάδα ασθενών με αυτοσωμικό υπολειπόμενο ανθεκτικό στα κορτικοειδή νεφρωσικό σύνδρομο. Σε αυτήν την υπο-ομάδα, η ασθένεια παρουσιάζεται στην παιδική ηλικία και γρήγορα εξελίσσεται σε νεφρική ανεπάρκεια τελικού σταδίου. Κάποιες μεταλλαγές του γονιδίου σχετίζονται και με σποραδικές περιπτώσεις της ασθένειας με όψιμη 21

40 εμφάνιση κληρονομικής σπειραματοπάθειας (26, 114, 127, 269). Η ποδοσίνη είναι μια πρωτεΐνη με μεμβρανικό εντοπισμό, μεγέθους 42 kda, και προβλέπεται ότι σχηματίζει φουρκέτα έχοντας και τα δύο άκρα (αμινοτελικό και καρβοξυτελικό) στην ενδοκυττάρια πλευρά της κυτταροπλασματικής μεμβράνης (22). Η ποδοσίνη εντοπίζεται στη μεμβράνη των ποδίσκων και πιο συγκεκριμένα σε λιπιδικές σχεδίες του διαφράγματος διήθησης. Αλληλεπιδρά με τη νεφρίνη και τη CD2AP μέσω του καρβοξυτελικού άκρου της (235). Απενεργοποίηση του γονιδίου NPHS2 σε ποντίκια παρουσιάζουν συγγενή πρωτεϊνουρία και νεφρική ανεπάρκεια (212). Αν και τα νεογνά ποντίκια δεν εμφανίζουν μορφολογικά προβλήματα αμέσως μετά τη γέννηση, γρήγορα παρουσιάζουν καθυστέρηση στην ανάπτυξη και πεθαίνουν μέσα στις πρώτες 5 εβδομάδες. Τα ποντίκια αυτά παράγουν φυσιολογική ποσότητα ούρων, αλλά με έντονη πρωτεϊνουρία από τη στιγμή της γέννησής τους. Η ανάπτυξη του νεφρού είναι φυσιολογική, αλλά σε μικροσκοπική εξέταση, τα ποδοκύτταρα δεν εμφανίζουν ποδίσκους και δεν υπάρχουν διαφράγματα διήθησης. Επιπλέον, σε αυτό το μοντέλο η νεφρίνη εκφράζεται σε μικρότερες ποσότητες και εντοπίζεται σε απόσταση από τη βασική μεμβράνη. Οι παρατηρήσεις αυτές εξηγούν τη σημασία της ποδοσίνης στο σχηματισμό και τη διατήρηση της ακεραιότητας του διαφράγματος διήθησης. C. CD2AP Η πρωτεΐνη που σχετίζεται με το CD2 (CD2AP) αρχικά βρέθηκε ως μια πρωτεΐνη που περιέχει SH3 περιοχές για αλληλεπίδραση με άλλες πρωτεΐνες, η οποία προσδεόμενη στην κυτταροπλασματική πλευρά του CD2 ενισχύει τη συσσωμάτωσή του. Αυτή η αλληλεπίδραση διευκολύνει την προσκόλληση των Τ- 22

41 λεμφοκυττάρων στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Το μοριακό μέγεθος της CD2AP είναι 80kDa. Περιέχει μια θέση πρόσδεσης της ακτίνης στο αμινοτελικό άκρο, μια περιοχή πλούσια σε προλίνες και τρεις περιοχές SH3 για αλληλεπίδραση με άλλες πρωτεΐνες (62). Στη φάση του σχηματισμού της τριχοειδικής αγκύλης στα αναπτυσσόμενα ποδοκύτταρα, η έκφραση της CD2AP ακολουθεί χρονικά αυτήν της νεφρίνης. Στο σπείραμα συγκεκριμένα, η CD2AP εκφράζεται μόνο στα ποδοκύτταρα, και μάλιστα στο διάφραγμα διήθησης (241), αλλά βρίσκεται επίσης σε κάποια κύτταρα του εγγύς και του άπω σωληναρίου (144). Στο διάφραγμα διήθησης αλληλεπιδρά με τη νεφρίνη παίζοντας το ρόλο του προσαρμογέα στη σηματοδοτική λειτουργία μεταξύ του ηθμού διήθησης και του κυτταροσκελετού των ποδοκυττάρων (241). Ποντίκια στα οποία έχει απωσιωπηθεί το γονίδιο της CD2AP αναπτύσσουν πρωτεϊνουρία και νεφρική ανεπάρκεια. Σε κάποια από τα σπειράματα ποντικιών ηλικίας 1 εβδομάδας παρατηρείται απώλεια των ποδοειδών προσεκβολών, ενώ στις 2 εβδομάδες όλα τα ποδοκύτταρα έχουν επηρεαστεί. Ταυτόχρονα, σε κάποια σπειράματα υπάρχουν εναποθέσεις μεσαγγειακής μήτρας. Στις 4 εβδομάδες τα σπειράματα παρουσιάζουν σκλήρυνση και τελικά τα ποντίκια πεθαίνουν σε ηλικία 6 έως 7 εβδομάδων (242). Εφόσον τα νεαρά ποντίκια έχουν φυσιολογικές ποδοειδείς προσεκβολές και διαφράγματα διήθησης, και χωρίς μεταβολές στην έκφραση της νεφρίνης, η CD2AP δεν είναι απαραίτητη για το σωστό εντοπισμό της νεφρίνης στο διάφραγμα διήθησης ή για την ανάπτυξη ακέραιων ποδοειδών προσεκβολών. Σε ώριμα σπειράματα του ίδιου μοντέλου, η νεφρίνη δεν είναι ανιχνεύσιμη, γεγονός που σημαίνει ότι η CD2AP χρειάζεται για τη διατήρηση του διαφράγματος διήθησης (144). Έκφραση της CD2AP ειδικά στα ποδοκύτταρα των CD2AP KO ποντικών αποτρέπει τη θνησιμότητα, γεγονός που επιβεβαιώνει 23

42 ότι η απώλεια της πρωτεΐνης ειδικά στα ποδοκύτταρα είναι υπεύθυνη για το φαινότυπο του μοντέλου αυτού (86). Τα πειραματόζωα στα οποία η CD2AP έχει αποσιωπηθεί παρουσιάζουν ελαττώματα στη σηματοδότηση από κινάσες τυροσίνης στα ποδοκύτταρα (264). Πειράματα ανοσοφθορισμού δείχνουν ότι η CD2AP συνεντοπίζεται με την κορτακτίνη και την ινώδη ακτίνη (F-ακτίνη), γεγονός που υποδηλώνει τη συμμετοχή της CD2AP σε λειτουργίες που απαιτούν την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, όπως η ενδοκύτωση, η πρωτεόλυση, η κυτταροπλασματική μεταφορά πρωτεϊνών και η κυτοκίνηση (172, 280, 282, 300). D. ΖΟ-1 Η ΖΟ-1 (zona occludens 1) είναι μια πρωτεΐνη μεγέθους 225 kda που απαντάται στην κυτταροπλασματική πλευρά των διακυτταρικών συνδέσμων. Ανήκει στην οικογένεια πρωτεϊνών MAGUK, οι οποίες ενέχονται στη μεταγωγή σήματος στις κυτταρικές συνάψεις. Η ΖΟ-1 περιέχει τρεις περιοχές PDZ, είναι συγκεντρωμένη στο διάφραγμα διήθησης και έχει δειχθεί να αλληλεπιδρά τόσο με άλλες πρωτεΐνες κυτταροσυνδέσμων (οκκλουδίνη, α-κατενίνη, ΖΟ-2), όσο και με το κυτταροσκελετικό δίκτυο (σπεκτρίνη, F-ακτίνη) (169). Η ΖΟ-1 εντοπίζεται στις ποδοειδείς προσεκβολές των ποδοκυττάρων, όπου εκφράζεται με ακρίβεια και συνεχώς στα σημεία επαφής του διαφράγματος διήθησης με την πλευρική κυτταρική μεμβράνη. Έχει προταθεί ότι το διάφραγμα διήθησης είναι μια εξειδικευμένη παραλλαγή στενοσυνδέσμου (232). Η ΖΟ-1 και η νεφρίνη εμφανίζονται στην ίδια φάση κατά την ανάπτυξη του σπειράματος, στα όψιμα σωμάτια σχήματος S. Σε συμφωνία με το πρότυπο της νεφρίνης, η ΖΟ-1 εντοπίζεται ειδικά σε δομές με δομή "φερμουάρ", αλλά σε αντίθεση με τη 24

43 νεφρίνη, υπάρχει αφθονότερη κατά την ανάπτυξη στις διακυτταρικές συνδέσεις (217). E. ΑΛΛΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΤΟΥ ΔΙΑΦΡΑΓΜΑΤΟΣ ΔΙΗΘΗΣΗΣ Ένας αριθμός άλλων πρωτεϊνών έχει αναγνωριστεί στο διάφραγμα διήθησης. Πειράματα συγκατακρήμνισης με τη νεφρίνη έδειξαν ότι κάποιες από τις πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με τη νεφρίνη είναι γνωστό ότι συμμετέχουν σε διακυτταρικές συνδέσεις προσκόλλησης, για παράδειγμα οι IQGAP, MAGI-2, CASK, σπεκτρίνες και α-ακτινίνη (141). Οι IQGAP, οι σπεκτρίνες και η α- ακτινίνη αλληλεπιδρούν με καδερίνες άμεσα ή έμμεσα, ενώ η MAGI-2 και η CASK ανήκουν στην οικογένεια πρωτεϊνών MAGUK, όπως και η ΖΟ-1 που αναφέρθηκε παραπάνω. Οι πρωτεΐνες αυτές φαίνεται ότι συμμετέχουν στη συγκέντρωση υποδοχέων και σηματοδοτικών πρωτεϊνών (μεταξύ άλλων) σε ειδικές περιοχές της πλασματικής μεμβράνης, όπως είναι οι στενοσύνδεσμοι και το διάφραγμα διήθησης. Άλλες πρωτεΐνες της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών, πλην της νεφρίνης, που απαντώνται στο διάφραγμα διήθησης είναι οι Neph1 (150), Neph2 (81) και Neph3/φιλτρίνη (105). H Neph1 φαίνεται ότι αλληλεπιδρά με τη νεφρίνη και αυτή η αλληλεπίδραση είναι σημαντική για τη λειτουργία του σπειραματικού ηθμού (80, 150). Η πρωτεΐνη αυτή αλληλεπιδρά και με τη ΖΟ-1 (150). Και οι τρεις Neph πρωτεΐνες έχουν πέντε περιοχές ανοσοσφαιρίνης, ένα διαμεμβρανικό τμήμα και μια κυτταροπλασματική ουρά (236). Η αλληλεπίδραση με τη νεφρίνη φαίνεται ότι έχει ρόλο στη σηματοδότηση από το διάφραγμα διήθησης, αφού παρουσία τέτοιων αλληλεπιδράσεων αυξάνεται η κυτταρική προσκόλληση και ελαττώνεται ο βαθμός φωσφορυλίωσης τυροσινών στο μόριο της νεφρίνης (91). 25

44 Άλλα μόρια που φαίνεται ότι παίζουν ρόλο στη δομή ή/και τη λειτουργία του διαφράγματος διήθησης είναι το κανάλι ιόντων ασβεστίου Trpc6, μεταλλαγές στο γονίδιο του οποίου έχουν χαρτογραφηθεί σε οικογένειες με πρωτεϊνουρικές παθήσεις (202, 287), η FAT-1 και η Ρ-καντερίνη (299), που ανήκουν στην οικογένεια των καντερινών, και κάποιες πρωτεΐνες που απαντώνται στην κυτταροπλασματική πλευρά του διαφράγματος διήθησης, όπως οι Par3, Par6 που σχετίζονται με την πολικότητα του κυττάρου (89), και η δενδρίνη, η οποία συμμετέχει στη μεταγωγή σήματος (5) Η κορυφαία μεμβράνη Η επιφάνεια των ποδοκυττάρων διαχωρίζεται σε δύο τμήματα από το διάφραγμα διήθησης: την αυλική επιφάνεια, προς την ουροφόρο κοιλότητα, και την αντι-αυλική επιφάνεια, η οποία αντιστοιχεί στη βάση των ποδοειδών προσεκβολών προς τη σπειραματική βασική μεμβράνη. Στην αυλική πλευρά τα ποδοκύτταρα διαθέτουν έναν πλήρως αναπτυγμένο γλυκοκάλυκα, ο οποίος περιέχει σιαλογλυκοπρωτεΐνες και άλλα μόρια που υποκατεστημένα με ομάδες θειϊκού οξέος. Αυτό το επιφανειακό στρώμα συμβάλλει στο αρνητικό φορτίο του διαφράγματος διήθησης και αποτελείται κυρίως από την ποδοκαλυκίνη (118) και από την πρωτεΐνη GLEPP-1 (277). A. ΠΟΔΟΚΑΛΥΚΙΝΗ Η ποδοκαλυκίνη κωδικοποιείται από το γονίδιο PODXL, το οποίο εδράζεται στο χρωμόσωμα 7 (7q32-7q33) (120) και είναι μια βαρέως γλυκοζυλιωμένη πρωτεΐνη (Ο-γλυκοζυλιώσεις και σιαλικό οξύ), υπεύθυνη για το αρνητικό φορτίο της κορυφαίας μεμβράνης των ποδοκυττάρων με σπουδαία σημασία για τη διατήρηση της χαρακτηριστικής αρχιτεκτονικής των ποδοκυττάρων (186, 256, 257) καθώς και για την αποτροπή της προσκόλλησης των ποδοκυττάρων στα γειτονικά τοιχωματικά επιθηλιακά κύτταρα (138, 256). Κατά την ανάπτυξη, η 26

45 ποδοκαλυκίνη εμφανίζεται στην κορυφαία μεμβράνη των πρόδρομων ποδοκυττάρων στο στάδιο των σωματίων σχήματος S, επάνω από το επίπεδο των κυτταρικών συνδέσμων αυτού του αναπτυξιακού σταδίου. Στο στάδιο της τριχοειδικής αγκύλης, όταν ο ουροφόρος χώρος ανοίγει και οι κυτταρικοί σύνδεσμοι μετακινούνται από την κορυφή προς στη βάση των κυττάρων, η ποδοκαλυκίνη βρίσκεται κατά μήκος της πλευρικής κυτταρικής μεμβράνης, επάνω από το επίπεδο των μετακινούμενων συνδέσμων. Όταν οι διακυτταρικοί σύνδεσμοι αρχίζουν να μετατρέπονται σε διαφράγματα διήθησης, η ποδοκαλυκίνη απαντάται σε όλες τις επιφάνειες πάνω από τα διαφράγματα διήθησης και ενδοκυτταρικά, κατά μήκος του μονοπατιού εξωκύτωσης, δηλ. στο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο, σε περιπυρηνικά κυστίδια και σε κυστίδια Golgi (233). Αυτό δείχνει πως η σύνθεση της ποδοκαλυκίνης σχετίζεται στενά με την ανάπτυξη των ποδοειδών προσεκβολών και του διαφράγματος διήθησης. Σε πολλές ανθρώπινες σπειραματοπάθειες και στα αντίστοιχα μοντέλα σε πειραματόζωα η νεφρική δυσλειτουργία σχετίζεται με την απώλεια της δομικής ακεραιότητας των ποδοκυττάρων, ένας φαινότυπος που συχνά αποδίδεται σε μη φυσιολογική ποδοκαλυκίνη (63, 257). Σε τέτοιες περιπτώσεις, η πλάτυνση των ποδοειδών προσεκβολών, βασική μορφολογική ανωμαλία σε ασθενείς με νεφρωσικό σύνδρομο (24, 188), συνοδεύεται από μείωση του σπειραματικού σιαλικού οξέος. Προβλήματα στην ενσωμάτωση του σιαλικού οξέος στο μόριο της ποδοκαλυκίνης οδηγούν σε προβλήματα στη ανάπτυξη, διαφοροποίηση και λειτουργία των ποδοκυττάρων (74, 119, 281). Σε ζωικά μοντέλα σπειραματοπάθειας, το αρνητικό φορτίο της ποδοκαλυκίνης εξουδετερώνεται, η αρχιτεκτονική των ποδοειδών προσεκβολών διαταράσσεται και τα διαφράγματα διήθησης αντικαθίστανται από ασυνεχείς 27

46 διακυτταρικούς συνδέσμους με αποτέλεσμα την εκροή πρωτεΐνών στα ούρα (65, 76, 78, 119). Επιπλέον, τα ποντίκια στα οποία έχει αποσιωπηθεί το γονίδιο της ποδοκαλυκίνης παρουσιάζουν λιγότερες πρωτογενείς προσεκβολές και έχουν πλήρη απώλεια των ποδοειδών προσεκβολών και των διαφραγμάτων διήθησης (56). Στα ποντίκια αυτά, το κυτταρικό σώμα των ποδοκυττάρων περιβάλλει τις τριχοειδικές αγκύλες και υπάρχουν πολλαπλοί διακυτταρικοί σύνδεσμοι μεταξύ γειτονικών ποδοκυττάρων (56). Το μοντέλο αυτό χρησιμοποιήθηκε και για λειτουργικές μελέτες, οι οποίες έδειξαν ότι μέσα στο κύτταρο η ποδοκαλυκίνη συνδέεται με τον κυτταροσκελετό της ακτίνης μέσω της εζρίνης και της πρωτεΐνης NHERF2 (Na+/H+ exchanger regulatory factor 2, παράγοντας ρύθμισης της ανταλλαγής Να+/Η+ 2). Η NHERF2 είναι μια πρωτεΐνη PDZ, δηλ. περιέχει τις PSD- 95/Dlg/ZO-1 περιοχές αλληλεπίδρασης με άλλες πρωτεΐνες. Στα φυσιολογικά ποδοκύτταρα, η ποδοκαλυκίνη προσδένεται στην περιοχή PDZ2 της NHERF2 πρωτεΐνης μέσω του C-τελικού άκρου, η NHERF2 προσδένεται στο Ν-τελικό άκρο της εζρίνης μέσω της C-τελικής ERM-προσδεόμενης περιοχής της, και η φωσφορυλιωμένη στο C-τελικό άκρο εζρίνη προσδένεται στον κυτταροσκελετό της ακτίνης (158, 186, 309). Αυτή η αλληλεπίδραση διαταράσσεται στα ποντίκια που δεν παρουσιάζουν έκφραση της ποδοκαλυκίνης (257, 285). Αυτή η διαμόρφωση εξηγεί τις μορφολογικές αλλαγές που παρατηρούνται στα ποδοκύτταρα αυτών των ζώων, τα οποία διατηρούν έναν μη-ώριμο φαινότυπο με συνδέσμους στην κορυφαία μεμβράνη, οι οποίοι δεν μετακινούνται βασεοπλευρικά και δεν μετατρέπονται σε διαφράγματα διήθησης (56). Τα ποδοκύτταρα στα ζώα αυτά δεν επιτρέπουν τη φυσιολογική νεφρική λειτουργία και τα ποντίκια παρουσιάζουν περιγεννητική θνησιμότητα (56). 28

47 Βασική μεμβράνη Η σπειραματική βασική μεμβράνη είναι το μεσαίο ακυτταρικό επίπεδο του ηθμού διήθησης και βρίσκεται ανάμεσα στα δύο κυτταρικά στοιχεία, τα θυριδωτά ενδοθηλιακά κύτταρα και τις διακλαδούμενες ποδοειδείς προσεκβολές των ποδοκυττάρων. Αποτελείται βασικά από τέσσερις τύπους μορίων: λαμινίνη-521, τύπου IV κολλαγόνο α3α4α5, πρωτεογλυκάνες και εντακτίνη (nidogen), που παρέχουν ένα διαπλεκόμενο δίκτυο το οποίο θεωρείται ότι παρέχει εκλεκτική διαπερατότητα μορίων με βάση το μέγεθος και το φορτίο. A. ΛΑΜΙΝΙΝΗ Η λαμινίνη είναι γλυκοπρωτεΐνη με πυρήνα ετεροτριμερούς πρωτεΐνης με α, β και γ αλυσίδες που έχουν δυνατότητα αυτο-συναρμολόγησης σε δίκτυο. Πρόκειται για την αφθονότερη μη κολλαγονική πρωτεΐνη των βασικών μεμβρανών. Στον άνθρωπο υπάρχουν πέντε, τέσσερις και τρεις παραλλαγές των α, β και γ αλύσεων αντίστοιχα (α1-5, β1-3, και γ1-3), που κωδικοποιούνται από αντίστοιχα γονίδια (LAMA1 έως Α5, LAMB1 έως B4 και LAMC1 έως C3). Μεταλλάξεις του γονιδίου της λαμινίνης β2 (LAMB2), που κληρονομούνται με τον αυτοσωματικό υπολειπόμενο τύπο, ευθύνονται για την εμφάνιση συγγενούς νεφρωσικού συνδρόμου με συνοδές οφθαλμικές και νευρολογικές ανωμαλίες, γνωστού ως σύνδρομο Pierson. Η πλειονότητα των ασθενών ταχύτατα οδηγείται σε τελικό στάδιο νεφρικής ανεπάρκειας και καταλήγει κατά την περιγεννητική περίοδο. Οι αλυσίδες α περιέχουν μια χαρακτηριστική περιοχή σφαιρικής λαμινίνης, στην οποία προσδένονται κυτταρικοί υποδοχείς, όπως οι ιντεγκρίνες. Οι ιντεγκρίνες είναι διαμεμβρανικά αβ ετεροδιμερή που παίζουν σημαντικό ρόλο στη σηματοδότηση από και προς τη βασική μεμβράνη, αλλά και μεταξύ γειτονικών κυττάρων. Η ιντεγκρίνη α3β1 είναι η βασική ιντεγκρίνη της βασικής πλευράς των 29

48 ποδοκυττάρων και απώλειά της οδηγεί σε σοβαρή νεφρική δυσλειτουργία κατά την ανάπτυξη (129). Προσδένεται στις λαμινίνες 511 (α5β1γ1) και 521 (α5β2γ1) μέσω της περιοχής σφαιρικής λαμινίνης στην αλυσίδα α5. Η πρόσδεση αυτή είναι απαραίτητη για το σχηματισμό της σπειραματικής τριχοειδικής αγκύλης (129). B. ΚΟΛΛΑΓΟΝΟ ΤΥΠΟΥ IV Κάθε μόριο κολλαγόνου IV αποτελείται από τρεις α αλυσίδες με παρόμοια πρωτοταγή δομή, που σχηματίζουν ελικοειδή τριμερή. Στο ανθρώπινο γονιδίωμα κωδικοποιούνται έξι διαφορετικές α αλυσίδες (α1-6) από αντίστοιχα γονίδια (COL4A1 έως Α6). Οι α αλυσίδες στην περίπτωση της ώριμης σπειραματικής βασικής μεμβράνης είναι κατά κύριο λόγο α3α4α5, η οποία στη φάση της νεφρικής οργανογένεσης αντικαθιστά την πρώιμη α1α1α2 ισομορφή. Σε σύγκριση με τις αλυσίδες α1 και α2, η παρουσία επιπλέον δισουλφιδικών δεσμών τόσο στο εσωτερικό των αλυσίδων α3, α4 και α5 όσο και στο τριμερές α3α4α5 και μεταξύ των τριμερών, εξασφαλίζει στην ώριμη βασική μεμβράνη μια ιδιαίτερα πυκνή δομή η οποία είναι κρίσιμης σημασίας για την δομική ακεραιότητα και λειτουργική επάρκεια του φραγμού σπειραματικής διήθησης. Στο πρωτομερές μόριο του κολλαγόνου IV διακρίνονται τρεις δομικά και λειτουργικά διαφορετικές περιοχές: μια ΝΗ2-τελική περιοχή που ονομάζεται '7S', μήκους ~25 αμινοξέων, μια κεντρική κολλαγονική περιοχή με ~1400 επαναλήψεις Gly-X-Y αλληλουχιών που σχηματίζει με την αλληλεπίδραση των τριών α αλυσίδων τη χαρακτηριστική τριπλή έλικα, η οποία διακόπτεται από βραχείες μη κολλαγονικές περιοχές, και μια μη κολλαγονική COOH-τελική περιοχή μήκους ~230 αμινοξέων η οποία αναδιπλώνεται με αποτέλεσμα τον σχηματισμό σφαιρικής τριτοταγούς δομής, που ονομάζεται NC1 (noncollagenous domain). Στην κεντρική περιοχή, η παρεμβολή των μη κολλαγονικών 30

49 περιοχών οφείλεται στην αντικατάσταση της γλυκίνης στη τριπλέτα Gly-Χ-Υ και προσδίδει επιπλέον ελαστικότητα στη σπειραματική βασική μεμβράνη. Οι ακραίες 7S και NC1 περιοχές αποτελούν θέσεις σχηματισμού σταυροδεσμών (cross-links) με αποτέλεσμα τον σχηματισμό διμερών και τετραμερών μορίων κολλαγόνου, που στη συνέχεια με επιπρόσθετους δεσμούς σχηματίζουν το δίκτυο κολλαγόνου IV. C. ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΕΣ Οι πρωτεογλυκάνες είναι μια ομάδα πρωτεΐνών με χαρακτηριστική γλυκοζυλίωση που κυριώς ανευρίσκονται στην εξωκυττάρια ουσία του συνδετικού ιστού. Όπως και οι γλυκοπρωτεΐνες, περιέχουν Ν- και Ο- συνδεδεμένους ολιγοσακχαρίτες με τη διαφορά ότι περιέχουν πρόσθετες θειωμένες γλυκοζαμινογλυκανικές πλευρικές αλυσίδες. Το Ν- τελικό άκρο της βασικής πρωτεογλυκάνης, αγκρίνης, προσδένεται στη λαμινίνη-521 και το C- τελικό άκρο μπορεί να προσδεθεί σε κυτταροεπιφανειακούς υποδοχείς όπως οι ιντεγκρίνες (84). Οι ιδιότητες αυτές ενδεικνύουν ότι η αγκρίνη θα μπορούσε να παίζει κάποιο ρόλο στην εκλεκτικότητα του ηθμού διήθησης με βάση το φορτίο ή στην προσκόλληση των κυττάρων στη βασική μεμβράνη, αλλά μεταλλαγές στα ποδοκύτταρα του γονιδίου που κωδικοποιεί την αγκρίνη δεν οδήγησαν σε σημαντικές δομικές ή λειτουργικές μεταβολές του ηθμού διήθησης (90). D. ΕΝΤΑΚΤΙΝΗ Η εντακτίνη έχει μοριακό βάρος 150 kda (αναφέρεται και ως nidogen) είναι ένα μικρό ραβδόμορφο μόριο με τρεις σφαιρικές ενεργές περιοχές (G1, G2, G3) που συνδέονται μεταξύ τους με ένα γραμμικό τμήμα. Η εντακτίνη μπορεί να συνδέεται με τη λαμινίνη γ1 και το κολλαγόνο IV, οδηγώντας στην υπόθεση ότι λειτουργεί σα γέφυρα μεταξύ των δύο αυτών δικτύων. Τα σύμπλοκα λαμινίνης- 31

50 εντακτίνης αυτοσυγκροτούνται σε δίκτυο, με μικρότερη όμως τάξη σχετικά με το δίκτυο κολλαγόνου τύπου IV. Η εντακτίνη πιστεύεται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην οργάνωση και την κανονική λειτουργία των βασικών μεμβρανών Μεταγραφικοί παράγοντες Η μεταγραφική ρύθμιση παίζει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση και τη διατήρηση του φαινοτύπου των ποδοκυττάρων. Υπάρχει ένας αριθμός μεταγραφικών παραγόντων που παίζουν σημαντικό ρόλο στα ποδοκύτταρα. Για παράδειγμα, ο παράγοντας Lmx1β (LIM-homeobox transcription factor 1, beta) ρυθμίζει τη μεταγραφή των γονιδίων του κολλαγόνου COL4A3 και COL4A4, καθώς και της ποδοσίνης και της CD2AP. O Pax2 φαίνεται ότι παίζει ρόλο στην ανάπτυξη των ποδοκυττάρων, αλλά η έκφρασή του καταστέλλεται κατά τη διαφοροποίηση και στον ώριμο νεφρό εκφράζεται μόνο στα τοιχωματικά επιθηλιακά κύτταρα. Καλύτερα χαρακτηρισμένη είναι η οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων ΖΗΧ (Zinc fingers and homeobox, δάκτυλοι ψευδαργύρου και ομοιοακολουθία). Οι πρωτεΐνες της οικογένειας αυτής περιέχουν δύο υποπεριοχές δακτύλων ψευδαργύρου του τύπου Cys2-His2 και πέντε υποπεριοχές ομοιοακολουθίας. Και τα τρία γνωστά μέλη της οικογένειας, ΖΗΧ1, ΖΗΧ2 και ΖΗΧ3, εκφράζονται στα ποδοκύτταρα και ρυθμίζουν την έκφραση σημαντικών για αυτά πρωτεΐνών (Πίνακας 1). Ένας ακόμη μεταγραφικός παράγοντας υψηλής σημασίας για τα ποδοκύτταρα είναι ο WT1 (Wilms' tumor 1). 32

51 Πίνακας 1. Μεταβολές στην ποδοκυτταρική γονιδιακή έκφραση σπειραματικών κυττάρων σε καλλιέργεια μετά από υπερέκφραση των γονιδίων των ZHX πρωτεϊνών για 72 ώρες (34). ΖΗΧ1 ΖΗΧ2 ΖΗΧ3 ΖΟ-1 FAT COL4A3 αμινοπεπτιδάση Α δυστρογλυκάνη PAX2 νεφρίνη αγγειοποιητίνη 2 Neph1 CD2AP COL4A4 εντακτίνη αμινοπεπτιδάση Α ποδοκαλυκίνη ιντεγκρίνη β1 WT1 Lmx1b νεφρίνη ΖΟ-1 CD2AP Ρ καντχερίνη καθεψίνη L α-ακτινίνη-4 COL4A3 COL4A4 αμινοπεπτιδάση Α δυστρογλυκάνη αγγειοποιητίνη 2 VEGF-A A. WT1 Ο μεταγραφικός παράγοντας WT1 (Wilms' tumor 1) είναι μια πρωτεΐνη με δακτύλους ψευδαργύρου και είναι ο πλέον πολύπλοκος από τους μεταγραφικούς παράγοντες των ποδοκυττάρων. Το ανθρώπινο γονίδιο WT1 περιέχει 10 εξώνια και καλύπτει 50kb γενωμικού DNA στη χρωμοσωμική περιοχή 11p13. Η πρωτεΐνη που παράγεται από το γονίδιο περιέχει μια Ν-τελική υποπεριοχή πλούσια σε προλίνες και γλουταμίνες και μια C-τελική υποπεριοχή που περιέχει τέσσερις δακτύλους ψευδαργύρου του τύπου Cys2-His2. Το μετάγραφο του γονιδίου υπόκειται σε εναλλακτικό μάτισμα ή/και σε εναλλακτική έναρξη της μετάφρασης, οπότε και δημιουργούνται 24 ισομορφές, από τις οποίες όμως μόνο λίγες είναι πιθανό να εκφράζονται στα ποδοκύτταρα. Οι βασικές ισομορφές είναι τέσσερις και προκύπτουν από την ενσωμάτωση ή μη του εξωνίου 5, καθώς και από τη θέση του ματίσματος στο εξώνιο 9, μεταξύ του τρίτου και του τέταρτου δακτύλου ψευδαργύρου, που οδηγεί στην ενσωμάτωση ή τον αποκλεισμό ενός 33

52 τριπεπτιδίου (λυσίνη-θρεονίνη-σερίνη, KTS). Η αναλογία των ισομορφών +/- εξώνιο 5 ρυθμίζεται με ιστοειδικό τρόπο στο ουρογεννητικό και στο αιμοποιητικό σύστημα. Στο νεφρό, η αναλογία αυτή μεταβάλλεται κατά την ανάπτυξη. Αντίθετα, η αναλογία των ισομορφών +/- KTS παραμένει καλύτερα συντηρημένη, και στους ανθρώπινους ιστούς κυμαίνεται μεταξύ (87, 204). Η παρουσία των δακτύλων ψευδαργύρου στη δομή της πρωτεΐνης WT1 δείχνει ότι η πρωτεΐνη αυτή αλληλεπιδρά με DNA και RNA με τρόπο που εξαρτάται από την αλληλουχία. Στο επίπεδο του DNA, o WT1 (κυρίως οι ισομορφές -KTS) είναι ένας μεταγραφικός ρυθμιστής του οποίου η δράση εξαρτάται από άλλους συμπαράγοντες. Για παράδειγμα στον αναπτυσσόμενο νεφρό ενεργοποιεί την έκφραση του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη Wnt4, προωθώντας έτσι τη διαφοροποίηση από το μεσέγχυμα προς επιθηλιακό φαινότυπο. Στο επικάρδιο της αναπτυσσόμενης καρδιάς όμως, ο WT1 καταστέλλει την έκφραση του ίδιου γονιδίου (64). Ακόμη και κατά την ανάπτυξη του νεφρού ο WT1 αλλάζει ρόλο από ενεργοποιητή σε καταστολέα του Wnt4. Αυτή η ιδιότητα ελέγχεται από συμπαράγοντες που δρουν είτε προς την κατεύθυνση της ενεργοποίησης (CBP/p300) είτε προς αυτήν της καταστολής (BASP) της μεταγραφής γονιδίων. Στο επίπεδο του RNA, o WT1 (και κυρίως οι +KTS ισομορφές) φαίνεται ότι παίζει ρόλο στο μάτισμα μεταγράφων, αφού έχει δειχθεί ότι συνεντοπίζεται με το μηχανισμό του ματίσματος (139) και αλληλεπιδρά με τον παράγοντα ματίσματος U2AF65 (44). Τέλος, φαίνεται ότι ο WT1 παίζει κάποιο ρόλο και στη διαδικασία της μετάφρασης πρωτεΐνών, αφού μετακινείται μεταξύ πυρήνα και κυτοπλάσματος και έχει βρεθεί ότι το κυτταροπλασματικό κλάσμα είναι 34

53 εμπλουτισμένο σε πολυσώματα (184, 271). Ωστόσο, η λειτουργία αυτή δεν έχει μελετηθεί περαιτέρω. Ο WT1 εκφράζεται σε όλα τα στάδια της ανάπτυξης του νεφρού. Φαίνεται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη, αφού μπορεί να επάγει χαρακτηριστικά νεφρικού επιθηλιακού φαινοτύπου σε μεσεγχυματικούς ινοβλάστες (100). Κατά την επικείμενη νεφρογένεση, ο WT1 εκφράζεται στο οπίσθιο (ραχιαίο) τμήμα του νεφρού, ενώ στον ώριμο νεφρό ο WT1 απαντά μόνο στα ποδοκύτταρα (229, 240). Η σχέση διάφορων αναπτυξιακά ρυθμιζόμενων πρωτεϊνών με τον WT1 έχει διευκρινιστεί. Οι μεταγραφικοί παράγοντες Pax2 και Pax8 μπορούν να ενεργοποιήσουν τη μεταγραφή του γονιδίου WT1 (49, 50), ενώ ο WT1 καταστέλλει τη μεταγραφή του γονιδίου του Pax2 (218). Στα πρόδρομα των ποδοκυττάρων κύτταρα η αύξηση της έκφρασης του WT1 συμπίπτει χρονικά με την ελάττωση των επιπέδων του Pax2, γεγονός που δείχνει ότι ο WT1 ρυθμίζει άμεσα τον Pax2 κατά τη νεφρογένεση. Ένας αριθμός άλλων γονιδίων αποτελούν στόχο του WT1 κατά την ανάπτυξη του νεφρού. Αυτά περιλαμβάνουν τo γονίδιο της αμφιρεγουλίνης (140), της συνδεκάνης-1 (37), της Ε-καντχερίνης (99), και της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-2 (94, 161). Η σημασία του WT1 στη νεφρική ανάπτυξη φαίνεται από πειράματα αποσιώπησης του γονιδίου σε ποντίκια, τα οποία αποτυγχάνουν να σχηματίσουν νεφρούς και πεθαίνουν στη μήτρα (130). Όπως αναφέρθηκε, ο WT1 μπορεί να δρα ως μεταγραφικός παράγοντας, μεταγραφικός συμπαράγοντας ή μετα-μεταγραφικός τροποποιητής της γονιδιακής έκφρασης. Ο ρόλος του εξαρτάται από το κυτταρικό περιβάλλον και από την εκάστοτε ισομορφή της πρωτεΐνης. Επιλεγμένοι συμπαράγοντες και μεταγραφικοί στόχοι του WT1 φαίνονται στους Πινακες 2 και 3 αντίστοιχα. 35

54 Πίνακας 2. Συμπαράγοντες του WT1 (228, 263, 304). WT1 Πρωτεΐνη Υποπεριοχή πρόσδεσης στον WT1 180 αμινοξέα στο Ν-τελικό άκρο Παρατηρήσεις Ο ομοδιμερισμός έχει προταθεί ότι είναι προαπαιτούμενος για τη μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων από τον WT1 p53 Δάκτυλα ψευδαργύρου Σταθεροποίηση της πρόσδεσης της p53 στο DNA, καταστολή της επαγόμενης από την p53 απόπτωσης p73 Δάκτυλα ψευδαργύρου Παρεμπόδιση της πρόσδεσης της p73 στο DNA από τον WT1 Par4 Δάκτυλα ψευδαργύρου Παρεμπόδιση μεταγραφικής ενεργοποίησης γονιδίων από τον WT1, ενίσχυση μεταγραφικής καταστολής από τον WT1 Hsp70 N-τελικό άκρο Προωθεί την διακοπή του κυτταρικού κύκλου WTAP C-τελικό άκρο STAT3 281 αμινοξέα στο Ν-τελικό Ενεργοποιεί την κυτταρική επιβίωση άκρο BASP1 Αμινοξέα Ενίσχυση μεταγραφικής καταστολής από τον WT1 CBP Δάκτυλα ψευδαργύρου Eνίσχυση μεταγραφικής ενεργοποίησης από τον WT1 Πίνακας 3. Μεταγραφικοί στόχοι του WT1 και το αποτέλεσμα της μεταγραφικής του δράσης (34, 228, 263, 304). Αμφιρεγουλίνη PDGF TGF-β VEGF Κυκλίνη Ε p21 Pax-2 E-καντχερίνη Συνδεκάνη 1 Bcl-2 Wnt4 Ποδοκαλυκίνη Νεφρίνη Πρωτεΐνη Δράση Ενεργοποίηση Ενεργοποίηση/Καταστολή Καταστολή Ενεργοποίηση Καταστολή Ενεργοποίηση Καταστολή Ενεργοποίηση Ενεργοποίηση Ενεργοποίηση/Καταστολή Ενεργοποίηση Ενεργοποίηση Ενεργοποίηση 36

55 1.3 ΠΑΘΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΝΕΦΡΟΥ Υπάρχουν πολλά διαφορετικά είδη νεφρικών παθήσεων. Η συνήθης εξέλιξη της νεφροπάθειας είναι σταδιακή και για αυτό καλείται χρόνια νεφρική νόσος. Ο όρος χρόνια νεφρική νόσος (ΧΝΝ) γενικά περιλαμβάνει ένα ετερογενές σύνολο ασθενειών που εμφανίζουν δυσμορφία και δυσλειτουργία των νεφρών. Η ανομοιομορφία στην έκφραση της νόσου σχετίζεται εν μέρει με τις αιτίες, την παθολογία, την σοβαρότητα και τον ρυθμό εξέλιξης της νόσου. Τα πρώτα στάδια της ασθένειας είναι συχνά ασυμπτωματικά και η ασθένεια σε αυτό το στάδιο μπορεί να είναι αναστρέψιμη. Ωστόσο, ορισμένες ταχέως εξελισσόμενες ασθένειες μπορούν να οδηγήσουν σε νεφρική ανεπάρκεια μέσα σε λίγους μήνες. Ο καθορισμός των σταδίων της χρόνιας νεφρικής νόσου βασίζεται στην ύπαρξη νεφρικής βλάβης (πρωτεϊνουρία) ή στην μειωμένη νεφρική λειτουργία (ρυθμός σπειραματικής διήθησης (GFR)) για 3 μήνες ή περισσότερο, ανεξάρτητα από την κλινική διάγνωση (2, 272). Οι σπειραματοπάθειες αποτελούν μια ετερογενή ομάδα ασθενειών με ποικίλα αίτια και κλινικές εικόνες που αποτελούν το πλέον συχνό αίτιο της χρόνιας νεφρικής νόσου. Στην πλειοψηφία των σπειραματοπαθειών κεντρικό ρόλο παίζει η βλάβη ή ο τραυματισμός των ποδοκυττάρων ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΣΠΕΙΡΑΜΑΤΟΠΑΘΕΙΩΝ Ποδοκυτταροπάθειες Τα ποδοκύτταρα υφίστανται βλάβες σε πολλές ανθρώπινες και πειραματικές σπειραματοπάθειες, όπως στη νόσο ελαχίστων αλλοιώσεων, την εστιακή τμηματική σπειραματοσκλήρυνση, τη εκφυλιστική σπειραματοσκλήρυνση, τη μεμβρανώδη νεφροπάθεια και τη διαβητική νεφροπάθεια (Πίνακας 4). Η βλάβη των ποδοκυττάρων παίζει κεντρικό ρόλο στο μηχανισμό παθογένεσης κατά το νεφρωσικό σύνδρομο. 37

56 Ως νεφρωσικό σύνδρομο ορίζεται η τριάδα συμπτωμάτων: πρωτεϊνουρία, υπολευκωματιναιμία και οίδημα. Πρόκειται για μια μη ειδική διαταραχή κατά την οποία καταστρέφονται τα νεφρά, προκαλώντας τη διαρροή μεγάλων ποσοτήτων πρωτεΐνης (πρωτεϊνουρία, τουλάχιστον 3,5 gr/ημέρα/1,73m 2 επιφάνειας σώματος) από το αίμα στα ούρα (148). Έχει δειχθεί ότι διάφορα μοριακά γεγονότα που συμβαίνουν σε διάφορα διαμερίσματα των ποδοκυττάρων, όπως στο κυτταρικό σώμα, τις πρωτογενείς προσεκβολές, τον πυρήνα, τους ποδίσκους και, κυρίως, το διάφραγμα διήθησης, μπορούν να οδηγήσουν σε επιπέδωση των ποδοειδών προσεκβολών και πρωτεϊνουρία. Πίνακας 4. Ταξινόμηση των σπειραματοπαθειών (13, 319). Ιστολογική εικόνα Παθολογία Κρίσιμοι παράγοντες παθογένειας Φυσιολογική Νόσος ελαχίστων αλλοιώσεων Δυστρογλυκάνη Ποδοσίνη (μεταλλαγή) Συγγενές νεφρωτικό Νεφρίνη σύνδρομο Διάχυτη μεσαγγειακή Σύνδρομο Denys-Drash WT1 σκλήρυνση Σύνδρομο Frasier WT1 Σύνδρομο Pierson Λαμινίνη β2 Νεφρίνη (μεταλλαγή) Ποδοσίνη (μεταλλαγή) WT1 (μεταλλαγή) Εστιακή τμηματική σπειραματοσκλήρυνση Νεφρίνη (μεταλλαγή) Ποδοσίνη (μεταλλαγή) α-ακτινίνη-4 (μεταλλαγή) CD2AP (μεταλλαγή) TRPC6 (μεταλλαγή) Ολιγομεγαλονεφρία Pax-2 Εκφυλιστική σπειραματοπάθεια Σύνδρομο Alport Κολλαγόνο τύπου IV Διάφοροι ιοί (HIV, Παρβοϊός Β19, SV40;) 38

57 Μια ταξινόμηση των ποδοκυτταροπαθειών μπορεί να γίνει με βάση την ιστολογική εικόνα των ποδοκυττάρων (13) (Πίνακας 4). Εν πρώτοις υπάρχουν ασθένειες των ποδοκυττάρων με φυσιολογική ιστολογική εικόνα. Στη νόσο ελαχίστων αλλοιώσεων ένα ελάττωμα στην έκφραση των δυστρογλυκανών φαίνεται ότι είναι η μοριακή βάση της νόσου. Σε αυτήν την περίπτωση, το νεφρωτικό σύνδρομο και η ποδοκυτταρική βλάβη είναι αναστρέψιμα. Στο συγγενές νεφρωτικό σύνδρομο του φινλανδικού τύπου η πάθηση δεν είναι αναστρέψιμη και εξελίσσεται σε νεφρική ανεπάρκεια. Στη δεύτερη ομάδα ανήκουν τα σύνδρομα με διάχυτη μεσαγγειακή σκλήρυνση, όπως τα σύνδρομα Denys-Drash και Frasier, όπου το ελάττωμα είναι μεταλλαγές του γονιδίου του WT1 (234). Η τρίτη ομάδα ποδοκυτταροπαθειών είναι η εστιακή τμηματική σπειραματοσκλήρυνση. Η βλάβη μπορεί να είναι ιδιοπαθής, να σχετίζεται με μοριακά γεγονότα στο διάφραγμα διήθησης (22, 269), μεταγραφικούς παράγοντες, τον κυτταροσκελετό της ακτίνης, ή να είναι δευτερογενής της μηχανικής πίεσης που ασκείται κατά τη σπειραματική υπερδιήθηση (131, 133, 179). Η τέταρτη κατηγορία περιλαμβάνει τις ασθένειες οι οποίες χαρακτηρίζονται από την κατάρρευση της τριχοειδικής αγκύλης, όπως είναι η σπειραματοπάθεια που σχετίζεται με τον ιό HIV και στις οποίες παρατηρείται αποδιαφοροποίηση των ποδοκυττάρων, όπως διαφαίνεται από την απώλεια δεικτών ωριμότητας, απορρύθμιση, όπως μαρτυρείται από την απώλεια της έκφρασης του WT1 (11, 12), και την εκ νέου έκφραση άλλων κυτταρικών δεικτών, όπως πχ. πρωτεϊνών ειδικών για τα μακροφάγα (10). Η επίδραση που έχουν διάφορα ερεθίσματα στα ποδοκύτταρα φαίνονται στον Πίνακα 5. 39

58 Πίνακας 5. Επίδραση διαφόρων ερεθισμάτων στα ποδοκύτταρα (146) Ερέθισμα Υψηλά επίπεδα γλυκόζης Αγγειοτενσίνη ΙΙ TGF-β Μηχανικό φορτίο (στρες) Επίδραση στα ποδοκύτταρα Επαγωγή υπερτροφίας Αυξημένη παραγωγή αλύσεων α1, α3 και α5 του κολλαγόνου τύπου IV Ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού της κινάσης p38 Αυξημένη παραγωγή VEGF και αγγειοτενσίνης ΙΙ Μειωμένη έκφραση Ρ-καντχερίνης Μειωμένη έκφραση της υπομονάδας α3 της ιντεγκρίνης Ενίσχυση της επαγόμενης από μηχανικό φορτίο εισροής γλυκόζης Επαγωγή υπερτροφίας Αυξημένη παραγωγή αλύσου α3 του κολλαγόνου τύπου IV Ρύθμιση της έκφρασης των πρωτεϊνών του διαφράγματος διήθησης και επαγωγή πρωτεϊνουρίας Επαγωγή απόπτωσης Αυξημένη έκκριση ποδοκυττάρων στα ούρα Απελευθέρωση αυξητικών παραγόντων Ρύθμιση της έκφρασης του CTGF Αυξημένη παραγωγή αλύσου α3 του κολλαγόνου τύπου IV Μειωμένη παραγωγή αλύσεων α1 και α5 του κολλαγόνου τύπου IV Αυξημένη δραστικότητα των μεταλλοπρωτεασών ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 Επαγωγή απόπτωσης Αυξημένη παραγωγή VEGF Αυξημένη εισροή γλυκόζης Επαγωγή υπερτροφίας Μειωμένος πολλαπλασιασμός Ενεργοποίηση ενδοκυτταρικού συστήματος ρενίνης-αγγειοτενσίνης Επαγωγή αναδιοργάνωσης του κυτταροσκελετού της ακτίνης Μεμβρανώδης νεφροπάθεια Η μεμβρανώδης νεφροπάθεια χαρακτηρίζεται από πάχυνση της σπειραματικής βασικής μεμβράνης. Η ιστολογική εικόνα είναι το αποτέλεσμα της συσσώρευσης ανοσοσυμπλεγμάτων που αποτελούνται από ανοσοσφαιρίνη IgG, αντιγονικούς παράγοντες και τον C5b-9 παράγοντα του συμπληρώματος (210). Υπάρχει ιδιοπαθής και δευτερογενής μορφή της νόσου και, αν και η προέλευση των ανοσοσυμπλεγμάτων ποικίλει στην περίπτωση της δευτερογενούς μεμβρανώδους νεφροπάθειας, στην ιδιοπαθή 40

59 μορφή φαίνεται ότι τα ανοσοσυμπλέγματα σχηματίζονται επί τόπου, επαγόμενα από ποδοκυτταρικά ερεθίσματα (195, 211). Το ζωικό μοντέλο μελέτης της μεμβρανώδους νεφροπάθειας είναι η νεφρίτιδα Heymann των αρουραίων, στην οποία ως αντιγόνο-στόχος των ανοσοσφαιρινών έχει αναγνωριστεί η μεγαλίνη, μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη της βασικής περιοχής της κυτταρικής μεμβράνης των ποδοκυττάρων. Στους ανθρώπους φαίνεται ότι αντίστοιχο ρόλο παίζει η ουδέτερη ενδοπεπτιδάση (NEP ή CD10 ή CALLA) (47, 48). Ο παράγοντας του συμπληρώματος C5b-9 οδηγεί σε επαγωγή της παραγωγής συστατικών της θεμέλιας ουσίας από τα ποδοκύτταρα, γεγονός που οδηγεί στην πάχυνση της σπειραματικής βασικής μεμβράνης (116, 117). Ταυτόχρονα, παρατηρούνται αλλοιώσεις στην αρχιτεκτονική του ποδοκυττάρου. Σε ασθενείς με μεμβρανώδη νεφροπάθεια έχει παρατηρηθεί μειωμένη έκφραση και κοκκώδης κατανομή της νεφρίνης, αλλά και αποσύνδεσή της από τον κυτταροσκελετό της ακτίνης και διεύρυνση των διαφραγμάτων διήθησης με αποτέλεσμα την πρωτεϊνουρία (222) Άλλες σπειραματοπάθειες Η ποδοκυτταρική βλάβη είναι σημαντικό στοιχείο της παθογένειας άλλων νεφρικών νόσων, όπως είναι η IgA νεφροπάθεια. Η IgA νεφροπάθεια χαρακτηρίζεται από την εναπόθεση παθογόνου πολυμερούς ανοσοσφαιρίνης IgA στο μεσάγγειο, υπερπλασία των μεσαγγειακών κυττάρων, αυξημένη παραγωγή συστατικών της θεμέλιας ουσίας και φλεγμονώδη αντίδραση. Στην πορεία της νόσου παρατηρείται απόπτωση των ποδοκυττάρων, η οποία επιβεβαιώνεται κλινικά με την ανίχνευση ποδοκυττάρων στα ούρα. Ασθενείς που πάσχουν από IgA νεφροπάθεια παρουσιάζουν μειωμένη έκφραση νεφρίνης (136). 41

60 Διαβητική νεφροπάθεια Οι ασθενείς με διαβήτη τύπου Ι ή ΙΙ παρουσιάζουν μικροαγγειακές επιπλοκές, μια εκ των οποίων είναι και η διαβητική νεφροπάθεια. Η διαβητική νεφροπάθεια είναι μια νόσος με βραδεία εξέλιξη και ο γλυκαιμικός έλεγχος με τις σημερινές φαρμακευτικές θεραπείες καθυστερεί, αλλά δεν αναστέλλει πλήρως, την εξέλιξη της νόσου σε νεφροπάθεια τελικού σταδίου. Η διαβητική νεφροπάθεια αποτελεί τη συχνότερη αιτία νεφρικής νόσου τελικού σταδίου και θεραπείας υποκατάστασης της νεφρικής λειτουργίας σε πολλές αναπτυγμένες χώρες (143, 203, 214, 289). Στα αρχικά στάδια της εξέλιξης της νόσου, η διαβητική νεφροπάθεια χαρακτηρίζεται από μεταβολές στο νεφρικό σπείραμα, όπως υπερτροφία, πάχυνση της μεσαγγειακής θεμέλιας ουσίας με συσσώρευση πρωτεϊνών της εξωκυττάριας μήτρας, όπως ινονεκτίνης, λαμινίνης και κολλαγόνου, καθώς και πάχυνση της σπειραματικής βασικής μεμβράνης. Έχει διαπιστωθεί ότι η σπειραματική υπερδιήθηση και η αυξημένη έκκριση αλβουμίνης στα ούρα (μικροαλβουμινουρία, λιγότερο από 300mg/ημέρα) αποτελούν πρώιμες εκδηλώσεις νεφρικής βλάβης σε διαβητικούς ασθενείς. Κατά την εξέλιξη της νόσου η νεφρική λειτουργία προοδευτικά επιδεινώνεται, οδηγώντας σε μακροαλβουμινουρία (περισσότερο από 300mg/ημέρα). Στα τελικά στάδια, η διαβητική νεφροπάθεια οδηγεί σε μη αναστρέψιμες καταστάσεις όπως σπειραματοσκλήρυνση, ίνωση, υπέρταση, νεφρωσικό σύνδρομο και νεφρική νόσο τελικού σταδίου (60, 113, 293). Το μέγεθος των νεφρών είναι αυξημένο στους διαβητικούς ασθενείς ακόμη και κατά τη διάγνωση (15). Η αύξηση αυτή οφείλεται κυρίως σε υπερτροφία του σπειράματος και των σωληναρίων, αλλά άλλοι παράγοντες, όπως διείσδυση μακροφάγων και λοιπών κυττάρων φλεγμονής, πάχυνση της σπειραματικής βασικής μεμβράνης και αιμοδυναμικοί παράγοντες (294). Εφόσον ένα από τα πρώτα συμπτώματα της διαβητικής 42

61 νεφροπάθειας είναι η συσσώρευση εξωκυττάριας μήτρας και η σπειραματική υπερτροφία, εξετάστηκε η επίδραση της υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης στα μεσαγγειακά κύτταρα, τα οποία συνθέτουν εξωκυττάρια ουσία. Στο διαβητικό σπείραμα παρατηρείται έντονος πολλαπλασιασμός των μεσαγγειακών κυττάρων, ο οποίος ακολουθείται από υπερτροφία (294). Σε συνθήκες υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης ο κυτταρικός κύκλος των μεσαγγειακών κυττάρων αναχαιτίζεται στη G1/S φάση με αποτέλεσμα την υπερτροφία. Σημαντικό ρόλο στην αναχαίτιση του κυτταρικού κύκλου παίζει ο αναστολέας των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών p27kip1, η έκφραση του οποίου επάγεται από τα υψηλά επίπεδα γλυκόζης σε καλλιεργούμενα μεσαγγειακά κύτταρα αρουραίου (291) και σε δύο μοντέλα διαβήτη σε ποντίκια (290, 292). Στη διαδικασία αυτή συμμετέχει ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού β1 (Transforming Growth Factor-β, TGF-β1). Ο παράγοντας αυτός παράγεται από τα μεσαγγειακά κύτταρα και δρα αυτοκρινώς, αφού ο υποδοχέας του εκφράζεται επίσης από τα μεσαγγειακά κύτταρα. Η αυξημένη εναπόθεση εξωκυττάριας μήτρας από τα μεσαγγειακά κύτταρα επάγεται επίσης από τον ίδιο παράγοντα, ο οποίος ενεργοποιεί την παραγωγή κολλαγόνου, ινονεκτίνης και λαμινίνης και παρεμποδίζει πρωτεΐνες που επάγουν την αποσύνθεση της εξωκυττάριας μήτρας (316). Σε αντίθεση με τα μεσαγγειακά κύτταρα, τα ώριμα ποδοκύτταρα δεν πολλαπλασιάζονται. Παρά το γεγονός αυτό, σε διαβητικές συνθήκες παρουσιάζουν φαινόμενα υπερτροφίας παρόμοια με αυτά των μεσαγγειακών κυττάρων (171). Έχει προταθεί ότι η ποδοκυτταρική υπερτροφία σχετίζεται με την απώλεια ποδοκυττάρων σε διαβητικούς ασθενείς, με τα εναπομείναντα ποδοκύτταρα να αυξάνουν τον όγκο και την επιφάνειά τους ώστε να καλύψουν τον κενό χώρο (188). Πέραν της κυτταρικής υπερτροφίας, η συσσώρευση συστατικών της εξωκυττάριας μήτρας οδηγεί σε σπειραματική υπερτροφία (294). Η μεσαγγειακή θεμέλια ουσία και η σπειραματική βασική μεμβράνη υπόκεινται σε ποσοτικές και ποιοτικές αλλαγές κατά τη διαβητική 43

62 νεφροπάθεια. Η συσσώρευση της εξωκυττάριας μήτρας είναι το αποτέλεσμα μιας ανισορροπίας μεταξύ της παραγωγής και της αποδόμησης των συστατικών της. Στη διαβητική νεφροπάθεια η αυξημένη παραγωγή και εναπόθεση κολλαγόνου και η ταυτόχρονη ελάττωση της έκφρασης και της λειτουργίας των μεταλλοπρωτεϊνασών διαμορφώνουν το φαινότυπο (7, 124). Υψηλά επίπεδα γλυκόζης επάγουν την έκφραση κολλαγόνου α1(iv), α3(iv) και α5(iv) σε καλλιέργεια ποδοκυττάρων ποντικού (104) καθώς και στη μειορρύθμιση της μεταλλοπρωτεϊνάσης ΜΜΡ-9 (8). Εκτός από τα προαναφερθέντα γεγονότα, ένας πρώιμος δείκτης της διαβητικής νεφροπάθειας είναι και η παρουσία πρωτεΐνης στα ούρα, γεγονός ενδεικτικό βλάβης στο σπειραματικό ηθμό διήθησης. Όντως, η έναρξη της πρωτεϊνουρίας σχετίζεται με μεταβολές στη δομή, τη μορφολογία και την πυκνότητα των ποδοκυττάρων (237, 288). Αυτή η ποδοκυτταροπάθεια εκδηλώνεται με την πλάτυνση των ποδοειδών προσεκβολών, την ποδοκυτταρική υπερτροφία, και την ελάττωση του αριθμού των ποδοκυττάρων (ποδοκυτταροπενία). Εφόσον τα ποδοκύτταρα έχουν μειωμένο δυναμικό πολλαπλασιασμού και αντικατάστασης, δεν υπάρχει μεγάλη δυνατότητα αντιστάθμισης της απώλειας αυτής (156). Η απώλεια των ποδοκυττάρων κατά τη διαβητική νεφροπάθεια αποτελεί πιθανώς το αποτέλεσμα συνδυασμού της αποκόλλησης των κυττάρων από τη σπειραματική βασική μεμβράνη, της απόπτωσης των ποδοκυττάρων, καθώς και της επιθηλιο-μεσεγχυματικής μετάβασης (107). Υπάρχουν πολλαπλές αναφορές ποδοκυτταροπενίας σε μελέτες διαβητικής νεφροπάθειας. Ο αριθμός των ποδοκυττάρων μειώνεται στα σπειράματα ασθενών με διαβήτη τύπου Ι όλων των ηλικιών ακόμη και σε σύντομο χρονικό διάστημα μετά την έναρξη του διαβήτη (249). Επιπλέον, βιοψίες νεφρών ασθενών με διαβήτη τύπου ΙΙ από τη φυλή Ινδιάνων Πίμα έδειξαν μείωση του αριθμού των ποδοκυττάρων στην υποομάδα των ασθενών που παρουσίαζαν διαβητική νεφροπάθεια σε σύγκριση με τους ασθενείς 44

63 χωρίς νεφροπάθεια (188). Υπάρχει στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ της πρωτεϊνουρίας και του αριθμού ή/και της πυκνότητας των ποδοκυττάρων ανά σπείραμα σε ασθενείς με διαβήτη τύπου ΙΙ (284) και έχει προταθεί ότι ο αριθμός των ποδοκυττάρων ανά σπείραμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την μακροχρόνια πρόγνωση της πρωτεϊνουρίας (165). Ποδοκύτταρα μπορούν να ανιχνευθούν στο ίζημα ούρων ασθενών με διαβητική νεφροπάθεια σε αντίθεση με αυτό των μη ασθενών, και ο αριθμός τους είναι μεγαλύτερος σε ασθενείς με μακροαλβουμινουρία σε σχέση με τους ασθενείς με μικροαλβουμινουρία (183). Η απώλεια των ποδοκυττάρων μπορεί να αποδοθεί σε αυξημένη αποκόλλησή τους από τη βασική μεμβράνη, στην οποία προσκολλώνται μέσω της ιντεγκρίνης α3β1 και πρωτεογλυκανών. Μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση της ιντεγκρίνης α3β1 είναι μειωμένη σε ασθενείς με διαβητική νεφροπάθεια και σε μοντέλα επίμυων με επαγόμενη από στρεπτοζοτοσίνη διαβητική νεφροπάθεια, οδηγώντας σε εστιακή αποκόλληση των ποδοκυττάρων από τη σπειραματική βασική μεμβράνη (29, 199). Επιπλέον φαίνεται ότι τα υψηλά επίπεδα γλυκόζης καταστέλλουν την έκφραση της υπομονάδας α3 της ιντεγκρίνης σε καλλιεργούμενα ποδοκύτταρα (29, 125). Πέραν της αποκόλλησης από τη βασική μεμβράνη, η απόπτωση είναι ένας σημαντικός παράγοντας απώλειας ποδοκυττάρων κατά τη διαβητική νεφροπάθεια. Η ποδοκυτταρική απόπτωση αυξάνεται στα αρχικά στάδια της υπεργλυκαιμίας σε ζωικά μοντέλα διαβήτη τύπου Ι και ΙΙ (253). Στην ίδια μελέτη παρατηρήθηκε ότι η αυξημένη εξωκυττάρια γλυκόζη παράγει δραστικές μορφές οξυγόνου (reactive oxygen species) ενδοκυτταρικά, σε μια διαδικασία που μεσολαβείται από την οξειδάση του ανηγμένου φωσφορικού νικοτιναμιδο-αδενινο-δινουκλεοτιδίου (NADPH) και από ένα μιτοχονδριακό σηματοδοτικό μονοπάτι. Καθοδικά στη διαδικασία ενεργοποιείται η προαποπτωτική κινάση p38 (κινάση που ενεργοποιείται από μιτογόνο) και η κασπάση-3, 45

64 οδηγώντας τα ποδοκύτταρα σε απόπτωση, τόσο στην καλλιέργεια όσο και σε μύες db/db (253). Η ίδια κινάση p38 ενεργοποείται και μετά από χορήγηση του αυξητικού παράγοντα μετασχηματισμού β (TGF-β, Transforming Growth Factor-β) (231, 275) και αυξάνει τα επίπεδα του αναστολέα των κυκλινο-εξερτώμενων κινασών p21 (134, 275). Αντίστοιχα, χορήγηση του αντιοξειδωτικού λιποϊκού οξέος αποτρέπει την ελάττωση του αριθμού των ποδοκυττάρων σε διαβητικά μοντέλα μυών και επίμυων (244). Υψηλές συγκεντρώσεις ή αυξημένη δραστηριότητα της αγγειοτενσίνης ΙΙ παρατηρούνται σε καλλιέργειες ποδοκυττάρων σε υπεργλυκαιμικό περιβάλλον και μπορούν επίσης να επάγουν απόπτωση στα ποδοκύτταρα (306). Σε αυτήν τη διαδικασία εμπλέκεται ο τύπου Ι υποδοχέας της αγγειοτενσίνης ΙΙ (61) και ο TGF-β1 (52) Τα υψηλά επίπεδα του TGFβ1 επάγουν την απόπτωση μέσω του Smad7 παρεμποδίζοντας την μετατόπιση του υπεύθυνου για την κυτταρική επιβίωση μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ στον πυρήνα (231). Από την άλλη πλευρά, η μορφογενετική πρωτεΐνη των οστών 7 (ΒΜΡ7, bone morphogenetic protein 7) προστατεύει τα ποδοκύτταρα από την απόπτωση που προκαλείται από τα υψηλά επίπεδα γλυκόζης και ο Smad5 είναι απαραίτητος για τη δράση της BMP7 (46, 170). Μια άλλη πιθανή διαδικασία που οδηγεί στην απώλεια των ποδοκυττάρων είναι η επιθηλιο-μεσεγχυματική μετάβαση. Κατά τη διαδικασία αυτή, τα επιθηλιακά κύτταρα υπόκεινται σε μορφολογικές αλλαγές, οι οποίες οδηγούν σε απώλεια των διακυτταρικών επαφών, μεταβολές στην κυτταρική πολικότητα και αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Τα κύτταρα χάνουν τα στοιχεία που τα χαρακτηρίζουν και αποκτούν έναν πρώιμο μη διαφοροποιημένο φαινότυπο, που θυμίζει προηγούμενα στάδια διαφοροποίησης. Ο TGF-β, που επάγει την επιθηλιο-μεσεγχυματική μετάβαση, αυξορυθμίζεται στη διαβητική νεφροπάθεια (106, 301). Ο τύπου ΙΙ υποδοχέας του TGFβ, ΤβR-II, παρουσιάζει αυξημένη έκφραση στα ποδοκύτταρα μυών db/db, που είναι 46

65 μοντέλο διαβήτη τύπου ΙΙ. Όταν ποδοκύτταρα επωαστούν με TGF-β1, χάνεται η έκφραση επιθηλιακών πρωτεϊνών, όπως Ρ-καντχερίνης, ΖΟ-1 και νεφρίνης με ταυτόχρονη επαγωγή μεσεγχυματικών δεικτών, όπως η δεσμίνη, το κολλαγόνο τύπου Ι και η ινονεκτίνη (147). Επομένως, τα ποδοκύτταρα στη διαβητική νεφροπάθεια μπορεί να παρουσιάζουν ένα φαινότυπο επιθηλιο-μεσεγχυματικής μετάβασης και να αποκολλώνται από τη βασική μεμβράνη οδηγώντας σε ποδοκυτταροπενία ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΗΣ ΠΑΘΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΩΝ ΠΟΔΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Απώλεια των ποδοειδών προσεκβολών/αποπλάτυνση ποδοκυττάρων Η αποπλάτυνση των ποδοκυττάρων οφείλεται στη βαθμιαία απώλεια των ποδοειδών προσεκβολών. Ως παθολογικό εύρημα δεν περιορίζεται σε μια ασθένεια, αλλά σε πολλές σπειραματοπάθειες με ή χωρίς πρωτεϊνουρία. Φαίνεται ότι μπορεί να προκληθεί από: 1. αλλαγές στις πρωτεΐνες του διαφράγματος διήθησης (διαφραγματικού ηθμού), 2. αλλοιώσεις της σπειραματικής βασικής μεμβράνης ή στις αλληλεπίδραση του ποδοκυττάρου με αυτήν, 3. ανωμαλίες στον κυτταροσκελετό της ακτίνης, και 4. μεταβολές στην κορυφαία μεμβράνη των ποδοκυττάρων (175). Σε ό,τι αφορά το διάφραγμα διήθησης, πλάτυνση των ποδοειδών προσεκβολών παρατηρείται ομοιόμορφα σε ασθενείς με μεταλλαγές στα γονίδια της νεφρίνης, της ποδοσίνης, ή της CD2AP (22, 121, 122). Σε επίμυες με επαγόμενη από στρεπτοζοτοσίνη διαβητική νεφροπάθεια, τα επίπεδα του μεταγράφου και της πρωτεΐνης της νεφρίνης ελαττώνονται 32 εβδομάδες μετά την επαγωγή του διαβήτη (21). Επιπλέον, βιοψίες ασθενών με νεφροπάθεια λόγω διαβήτη τύπου Ι και ΙΙ παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα νεφρίνης και μεταβολές στον εντοπισμό της (21, 55). Αυτές οι αλλαγές στην έκφραση 47

66 της νεφρίνης βελτιώνονται μετά από παρεμπόδιση της σηματοδότησης της πρωτεϊνικής κινάσης Ca (164) ή του συστήματος ρενίνης-αγγειοτενσίνης (137). Παρόμοιες μεταβολές στην έκφραση της νεφρίνης έχουν παρατηρηθεί σε καλλιεργούμενα ποδοκύτταρα που εκτίθενται σε γλυκοζυλιωμένη αλβουμίνη και αγγειοτενσίνη ΙΙ (55). Το σύστημα ρενίνης-αγγειοτενσίνης παίζει σημαντικό ρόλο στη διαβητική νεφροπάθεια. Παρεμπόδιση του συστήματος αυτού γίνεται με χρήση αναστολέων του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης (ACE, angiotensin converting enzyme) ή ανταγωνιστών του υποδοχέα τύπου Ι της αγγειοτενσίνης ΙΙ. Η θεραπεία αυτή ελαττώνει την αρτηριακή πίεση και την πρωτεϊνουρία, και καθυστερεί την εξέλιξη της νεφρικής νόσου που σχετίζεται με το διαβήτη (85, 95, 143). Φαίνεται ότι υπάρχει ένα τοπικό σύστημα ρενίνης αγγειοτενσίνης στα ποδοκύτταρα, αφού τόσο το μετάγραφο όσο και η πρωτεΐνη του αγγειοτενσινογόνου και της του υποδοχέα τύπου Ι της αγγειοτενσίνης ΙΙ παρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα έκφρασης σε ποδοκύτταρα που καλλιεργούνται σε υψηλά επίπεδα γλυκόζης. Αντίθετα, η δραστικότητα της ρενίνης και τα επίπεδα του ACE και του υποδοχέα τύπου ΙΙ της αγγειοτενσίνης ΙΙ δε μεταβάλλονται (306). Το μετατρεπτικό ένζυμο της αγγειοτενσίνης 2 (ACE2) εκφράζεται στα ποδοκύτταρα και μελέτες αποσιώπησης και υπερέκφρασης δείχνουν ότι παίζει νεφροπροστατευτικό ρόλο (177, 245, 295). Το ACE2 μετατρέπει την αγγειοτενσίνη ΙΙ στο πεπτίδιο Ang-(1-7), το οποίο λειτουργεί ανταγωνιστικά στη σηματοδότηση της αγγειοτενσίνης ΙΙ (72, 221, 252). Ο κυτταροεπιφανειακός υποδοχέας των τελικών προϊόντων γλυκοζυλίωσης (RAGE, receptor for advanced glycation endproducts) εκφράζεται στα φυσιολογικά ποδοκύτταρα και αυξορυθμίζεται σε διαβητικά ποδοκύτταρα (55, 258). Παρεμπόδιση του RAGE αποτρέπει διάφορες επιπλοκές του διαβήτη, μεταξύ των οποίων και την απώλεια της νεφρίνης από τα ποδοκύτταρα (55). 48

67 Λίγες μελέτες έχουν διεξαχθεί για τη διερεύνηση των επιπέδων των υπόλοιπων πρωτεϊνών του διαφράγματος διήθησης κατά τη διαβητική νεφροπάθεια (16, 126, 207, 299). Φαίνεται πάντως ότι οι μεταβολές της νεφρίνης είναι ανεξάρτητες αυτών της CD2AP και της ποδοσίνης (16). Η πάχυνση της σπειραματικής βασικής μεμβράνης αποτελεί ένα από τα πρώιμα γεγονότα της διαβητικής νεφροπάθειας (68). Η βιοσύνθεση του κολλαγόνου τύπου IV και της λαμινίνης-11 αυξάνεται στο διαβήτη, κατά τρόπο εξαρτώμενο από τον TGF-β1 (104, 112, 254, 303). Αντίθετα, οι πρωτεογλυκάνες φαίνεται ότι μειορρυθμίζονται σε διαβητικές συνθήκες (203). Όπως αναφέρθηκε νωρίτερα, η α3β1 ιντεγκρίνη είναι η βασική ιντεγκρίνη που εκφράζεται από τα ποδοκύτταρα και κυτταροειδική διαγραφή της α3 υπομονάδας της ιντεγκρίνης στα ποδοκύτταρα μυών οδηγεί σε πρωτεϊνουρία, αποδιάταξη της σπειραματικής βασικής μεμβράνης και πλάτυνση των ποδοειδών προσεκβολών (219). Επιλεκτική διαγραφή της υπομονάδας β1 οδηγεί σε περιγεννητική πρωτεϊνουρία, σταδιακή απώλεια ποδοκυττάρων, καταστροφή του μεσαγγείου και νεφρική ανεπάρκεια (196). Οι μελέτες αυτές δείχνουν ότι αλλαγές στην έκφραση των ιντεγκρινικών υπομονάδων στα ποδοκύτταρα συνοδεύονται από μεταβολές στην αρχιτεκτονική των ποδοκυττάρων που οδηγούν σε δυσλειτουργία του διαφράγματος διήθησης. Οι αλληλεπιδράσεις των ποδοκυττάρων με τη σπειραματική βασική μεμβράνη σε φυσιολογικές και υπεργλυκαιμικές συνθήκες παρουσιάζουν διαφορές. Τα ποδοκύτταρα που καλλιεργούνται παρουσία αυξημένων συγκεντρώσεων γλυκόζης παρουσιάζουν μειωμένη προσκόλληση στο κολλαγόνο τύπου IV σε σύγκριση με αυτά που καλλιεργούνται παρουσία φυσιολογικών επιπέδων γλυκόζης. Σε φυσιολογικές συνθήκες, η αλληλεπίδραση με το κολλαγόνο τύπου IV διαμεσολαβείται κυρίως από τις ιντεγκρίνες α3β1 και α2β1 και λιγότερο από την α5β1. Σε υψηλά επίπεδα γλυκόζης, η έκφραση της 49

68 α3β1 ιντεγκρίνης ελαττώνεται, αλλά αυξάνεται η έκφραση των αvβ3 και α5β1 (29, 125, 132, 199). Επομένως, σε διαβητικούς ασθενείς με νεφροπάθεια και σε ποδοκύτταρα που καλλιεργούνται σε υψηλά επίπεδα γλυκόζης οι υπομονάδες α3, α2, και β1 ελαττώνονται και οι α5 και β3 αυξάνονται. Τα ευρήματα αυτά αποτελλούν αποδείξεις ότι η γλυκόζη προκαλεί μεταβολές στην έκφραση των ιντεγκρινών και ότι συνοδεύεται από μεταβολές στη σπειραματική βασική μεμβράνη που οδηγούν σε απώλεια των ποδοκυττάρων, πιθανόν λόγω μεωμένης προσκόλλησης ως αποτέλεσμα της αλλοίωσης έκφρασης ιντεγκρινών. Στο ώριμο σπείραμα, τα ποδοκύτταρα αποτελούν έναν από τους τύπους κυττάρων που εκφράζουν μεταλλοπρωτεάσες. Οι μεταλλοπρωτεάσες ανήκουν σε μια οικογένεια ενδοπεπτιδασών, οι οποίες εξαρτώνται από την παρουσία ιόντων ασβεστίου και ψευδαργύρου, και που συμμετέχουν στη ρύθμιση και την αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας μήτρας. Οι μεταλλοπρωτεάσες (metalloproteinases: MMP) -2 και -9 (ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, αντίστοιχα) αποδομούν τα κολλαγόνα τύπου IV, V, VII και ΙΧ, τη ζελατίνη, την ελαστίνη και την ινονεκτίνη της εξωκυττάριας ουσίας (157, 178). Ρυθμιστές της δραστικότητας των μεταλλοπρωτεασών είναι οι ιστικοί αναστολείς των μεταλλοπρωτεασών (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases, TIMPs) (157, 178), αλλά και οι ιντεγκρίνες (268). Η παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων γλυκόζης ελαττώνει τα επίπεδα της ΜΜΡ-2 και αυξάνει αυτά του ΤΙΜΡ-2 (125). Βασικό ρόλο στη συντήρηση του σχήματος των ποδοκυττάρων παίζει ο κυτταροσκελετός της ακτίνης και οι συνδεόμενες με αυτόν πρωτεΐνες, όπως η α- ακτινίνη-4 και η συναπτοποδίνη (191). Πρόσφατα, παρατηρήθηκε ότι ενεργοποίηση της κινάσης p38 στα ποδοκύτταρα σε διαβητικές συνθήκες (τόσο in vitro όσο και in vivo) επάγει τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης θερμικού σοκ hsp25 (Heat Shock Protein 25), η οποία προσδένεται και σταθεροποιεί τα μικροϊνίδια της ακτίνης, διατηρώντας το 50

69 κυτταρικό σχήμα. Η α-ακτινίνη-4 είναι μια πρωτεΐνη που σταθεροποιεί τα ινίδια της ακτίνης και τα επίπεδα του μεταγράφου της είναι αυξημένα σε ένα μοντέλο διαβητικών μυών (154). Η συναπτοποδίνη συνδέεται με την ακτίνη και την α-ακτινίνη-4 και επιμηκύνει τα μικροϊνίδια που έχουν σταθεροποιηθεί από την α-ακτινίνη-4 (6). Σε παχύσαρκους επίμυες Zucker παρατηρείται μια τάση ελάττωσης των επιπέδων της συναπτοποδίνης στο σπείραμα, αλλά η ελάττωση αυτή δεν είναι στατιστικά σημαντική (19). Σε ό,τι αφορά το γλυκοκάλυκα της κορυφαίας μεμβράνης, παρεμπόδιση της ποδοκαλυκίνης με ειδικό αντίσωμα αυξάνει την προσκόλληση και την εξάπλωση των ποδοκυττάρων, οδηγώντας σε μια "πεπλατυσμένη" εμφάνιση. Στην ίδια μελέτη παρατηρήθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης του μεταγράφου και της πρωτεΐνης της ποδοκαλυκίνης καταστέλλονται πλήρως παρουσία υψηλών επιπέδων γλυκόζης και ότι η ποδοκαλυκίνη είναι ελαττωμένη στο σπείραμα διαβητικών επίμυων (63). Επιπλέον, όταν τα ποδοκύτταρα καλλιεργούνται σε υπόστρωμα λαμινίνης ή ανθρώπινης σπειραματικής βασικής μεμβράνης, αλλά όχι κολλαγόνου τύπου IV, η έκφραση της ποδοκαλυκίνης αυξάνεται (63). Αυτές οι παρατηρήσεις οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η παρουσία της ποδοκαλυκίνης μπορεί να συμβάλλει σε μεταβολές της δομής και της λειτουργίας των ποδοκυττάρων στο διαβήτη Ινσουλινοαπόκριση των ποδοκυττάρων Τα ποδοκύτταρα είναι κύτταρα που εκφράζουν τους μεταφορείς γλυκόζης GLUT- 1 και GLUT-4 και έκθεση αθανατοποιημένων ποδοκυττάρων σε ινσουλίνη αυξάνει την εισροή γλυκόζης στα κύτταρα, κυρίως μέσω του GLUT-4 και λιγότερο μέσω του GLUT- 1 (40). Αυτό σημαίνει ότι τα ποδοκύτταρα παρουσιάζουν ινσουλινοαπόκριση. Έχει βρεθεί ότι η νεφρίνη είναι το μόριο που είναι υπεύθυνο για τη δράση της ινσουλίνης στα ποδοκύτταρα, αφού κυτταρική σειρά με μεταλλαγές στο γονίδιο της νεφρίνης 51

70 παρουσιάζει ινσουλινοαντοχή και αποκατάσταση της νεφρίνης μέσω εκτοπικής έκφρασης του γονιδίου αποκαθιστά την απόκριση στην ινσουλίνη (39). Η νεφρίνη είναι απαραίτητη για τη σύντηξη των κυστιδίων που φέρουν τους μεταφορείς GLUT-1 και GLUT-4 με την κυτταροπλασματική μεμβράνη. Διατάραξη του κυτταροσκελετού της ακτίνης παρεμποδίζει τη μεταφορά αυτή και οδηγεί σε απώλεια της πρόσληψης γλυκόζης από τα ποδοκύτταρα (40). Υπάρχουν δεδομένα που δείχνουν ότι η ποδοκυτταρική ευαισθησία στην ινσουλίνη είναι μειωμένη ή και χάνεται στην περίπτωση του διαβήτη. Ένα μοντέλο μελέτης του διαβήτη είναι οι μύες db/db, οι οποίοι αναπτύσσουν πρωτεϊνουρία σε ηλικία 12 εβδομάδων, χωρίς να παρουσιάζουν άλλα χαρακτηριστικά της διαβητικής νεφροπάθειας. Στην ηλικία των 12 εβδομάδων η φωσφορυλίωση της Akt είναι ελαττωμένη στα σπειράματα των db/db ζώων σε σχέση με αυτή των db/+ ζώων και αυτό το ελάττωμα σχετίζεται με την ανικανότητα των ποδοκυττάρων να αποκριθούν στην ινσουλίνη (259). 1.4 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Τα ποδοκύτταρα αποτελούν το εξώτερο στρώμα της συσκευής σπειραματικής διήθησης. Το διάφραγμα διήθησης είναι ένας εξειδικευμένος τύπος κυτταρικής σύνδεσης που κρατά τις ποδοειδείς προεκβολές διασυνδεδεμένες μεταξύ τους (201, 209). Η απώλεια των ειδικών για τα ποδοκύτταρα πρωτεϊνών προσομοιάζει σε διαδικασία αποδιαφοροποίησης, ή ακόμη και επιθηλιο-μεσεγχυματικής μετάβασης (ΕΜΤ) (152). Παρομοίως, καλλιεργούμενα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα υφίστανται αποδιαφοροποίηση in vitro μετά από επώαση με TGF-β (205). Διαφορετικά ερεθίσματα τραυματισμού ενεργοποιούν διαφορετικές κυτταρικές αποκρίσεις, που μπορεί να συμπεριλαμβάνουν ένα ή περισσότερα από τα παρακάτω: υπερτροφία, αποκόλληση από την βασική μεμβράνη, ή απόπτωση (152). Υπό αυτές τις παθολογικές συνθήκες τα 52

71 παρατηρείται απώλεια των εξειδικευμένων χαρακτηριστικών και του φυσιολογικού φαινότυπου των ποδοκυττάρων, ενώ ταυτόχρονα παρατηρείται έκφραση μεσεγχυματικών δεικτών (147, 152). Αυτό έχει παρατηρηθεί στη νεφροπάθεια που οφείλεται στον ιό HIV και για τη εκφυλιστική σπειραματοπάθεια (14), καθώς επίσης και για τον ποδοκυτταρικό τραυματισμό που οφείλεται στον TGF-β (93). Ένας βασικός ποδοκυτταρικός δείκτης είναι η αντιπροσκολλητική πρωτεΐνη ποδοκαλυκίνη. Η ποδοκαλυκίνη είναι μια μεμβρανική πρωτεΐνη των ποδοειδών προεκβολών των ποδοκυττάρων, που εκφράζεται κυρίως στην κορυφαία και στις πλάγιες επιφάνειες τους. Είναι μια σιαλοπρωτεΐνη μεγέθους 140kDa, της οποίας οι θειϊκές ομάδες προσδίδουν στην πρωτεΐνη το αρνητικό της φορτίο, το οποίο έχει προταθεί ότι διατηρεί ανοιχτούς τους ηθμούς διήθησης (186, 256, 257) λόγω της άπωσης των αρνητικών φορτίων των πλάγιων επιφανειών των ποδοκυττάρων. Ποντίκια με αποσιώπηση του γονιδίου που ρυθμίζει την έκφραση της ποδοκαλυκίνης πεθαίνουν μετά τη γέννηση ενώ ελλείπουν παντελώς οι ποδοειδείς προεκβολές στα ποδοκύτταρα (56). Στον άνθρωπο, η ποδοκαλυκίνη εκφράζεται στα αγγειακά ενδοθήλια, τα αιμοποιητικά κύτταρα και τα αιμοπετάλια. Ένας δεύτερος ποδοκυτταρικός δείκτης είναι η διαμεμβρανική πρωτεΐνη νεφρίνη, η οποία εντοπίζεται στο διάφραγμα διήθησης και εμπλέκεται στην παθοφυσιολογία της πρωτεϊνουρίας (265, 267). Η γλυκόζη μπορεί επίσης να επάγει ελάττωση της έκφρασης νεφρίνης στα HGEC, γεγονός που σχετίζεται με την παρουσία αυξημένων ποσών γλυκοζυλιωμένης αλβουμίνης και άλλων προϊόντων μη ενζυματικής γλυκοζυλίωσης (16). Η ενδοκυτταρική υποπεριοχή της νεφρίνης αλληλεπιδρά με τη CD2AP, μια πρωτεΐνη-προσαρμογέα που παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση του φαινοτύπου των ποδοκυττάρων μέσω αλληλεπιδράσεων με τον κυτταροσκελετό (312). 53

72 Η έκφραση της ποδοκαλυκίνης στον ανθρώπινο νεφρό ρυθμίζεται από τον μεταγραφικό παράγοντα WT1 (189). Ταυτόχρονα η μεταγραφική ρύθμιση της ποδοκαλυκίνης φαίνεται ότι βασίζεται σε θέσεις πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Sp1 (23). Η πρόσδεση του WT1 σε συντηρημένα στοιχεία του εγγύς υποκινητή στο γονίδιο της ποδοκαλυκίνης οδηγεί σε έντονη μεταγραφική ενεργοποίηση. Επιπλέον, ο WT1 ελέγχει μεταγραφικά και το γονίδιο της νεφρίνης (276). Ζωικά μοντέλα δείχνουν ότι δυσλειτουργία του γονιδίου του WT1 μπορεί να οδηγεί σε ανάπτυξη σπειραματοσκλήρυνσης (128, 130). Ο μοριακός μηχανισμός της επίδρασης υψηλών συγκεντρώσεων γλυκόζης στα ποδοκύτταρα δεν έχει διαλευκανθεί, αν και υπάρχουν αρκετές υποθέσεις, μεταξύ των οποίων διερευνάται και ο ρόλος του WT1. Υπάρχουν αρκετοί συμπαράγοντες του WT1, οι οποίοι θεωρείται ότι προσδίδουν εξειδίκευση στις λειτουργίες του WT1 και καθορίζουν αν ο WT1 λειτουργεί ως ενεργοποιητής ή καταστολέας της μεταγραφής του εκάστοτε γονιδίου. Διάφοροι συμπαράγοντες έχουν αναγνωριστεί. Για παράδειγμα, η πρωτεΐνη WTIP (WT1 interacting protein, πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με τον WT1) θεωρείται ότι λειτουργεί ως αισθητήρας της δομής του διαφράγματος διήθησης και λειτουργεί ως μεταγραφικός συγκαταστολέας του WT1 (248). Επιπλέον, η BASP1 (brain acid soluble protein 1, όξινη διαλυτή πρωτεΐνη του εγκεφάλου) έχει αναγνωριστεί ως ένας ακόμη μεταγραφικός συγκαταστολέας του WT1 (27). Η πρόσδεση του WT1 σε συντηρημένα στοιχεία του υποκινητή του γονιδίου της ποδοκαλυκίνης φαίνεται ότι παίζει ρόλο στη νεφρική ανάπτυξη, αλλά οι μοριακοί μηχανισμοί που θα εξηγούσαν τη διατήρηση των επιπέδων της ποδοκαλυκίνης στους νεφρούς ώριμων ατόμων δεν έχουν διερευνηθεί. Ένας επιπλέον δείκτης της διαφοροποίησης του νεφρικού επιθηλίου είναι το αντιγόνο CALLA (common acute lymphoblastic leukemia antigen, ή CD10, ή NEP, ουδέτερη ενδοπεπτιδάση) (41, 51). Σε ό,τι αφορά τους δείκτες αποδιαφοροποίησης, η 54

73 βιμεντίνη, μια πρωτεΐνη των ενδιάμεσων ινιδίων, είναι χαρακτηριστική των κυττάρων μεσεγχυματικού φαινοτύπου (25, 75, 311). Αυξορρύθμιση της έκφρασής της θεωρείται βασικό κριτήριο για την ΕΜΤ και για τον τραυματισμό των ποδοκυττάρων (318). Με βάση τα παραπάνω δεδομένα έγινε χρήση μιας κυτταρικής σειράς αθανατοποιημένων ποδοκυττάρων (HGEC, Human Glomerular Epithelial Cells) τα οποία διατηρούν το φαινότυπο των πατρικών ποδοκυττάρων και έχουν χρησιμοποιηθεί σε λειτουργικές μελέτες (51, 63, 125, 132). Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι να χαρακτηριστεί ο βαθμός διαφοροποίησης και ο φαινότυπος των ποδοκυττάρων μετά από ένα χρόνιο ερέθισμα, όπως είναι η καλλιέργεια των κυττάρων σε υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης, μια κατάσταση που προσομοιάζει στο διαβήτη τύπου ΙΙ. Είναι γνωστό από προηγούμενες μελέτες ότι τα HGEC που καλλιεργούνται μονίμως υπό την παρουσία υψηλών επιπέδων γλυκόζης εκφράζουν πολύ χαμηλά επίπεδα ποδοκαλυκίνης σε σχέση με τα κύτταρα που καλλιεργούνται παρουσία φυσιολογικών επιπέδων γλυκόζης (63). Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν διαδοχικές εναλλαγές της συγκέντρωσης της γλυκόζης σε αυτό το in vitro σύστημα ώστε να χαρακτηριστεί χρονικά η μειορρύθμιση αυτή. Ταυτόχρονα, το χρονικό πρότυπο της μειορρύθμισης παραλληλίζεται με τη μεταβολή της έκφρασης της νεφρίνης, η οποία είναι ο άλλος WT1-εξαρτώμενος ποδοκυτταρικός δείκτης και διερευνάται ο ρόλος του WT1 στις μεταβολές αυτές. 55

74 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΣΕΙΡΩΝ Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά σπειραματικών σπλαγχνικών επιθηλιακών κυττάρων (ποδοκυττάρων) (εφεξής HGEC, Human Glomerular Epithelial Cells) (51). Τα κύτταρα αυτά είναι αθανατοποιημένα με το αντιγόνο Τ του ιού SV40. Μια αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά προέρχεται από έναν πληθυσμό πρωτογενών κυττάρων, στο γονιδίωμα των οποίων μια μεταλλαγή επιτρέπει την παράκαμψη της κυτταρικής γήρανσης. Με αυτόν τον τρόπο τα κύτταρα μπορούν να πολλαπλασιάζονται για εκτεταμένα χρονικά διαστήματα. Τα ιδανικά αθανατοποιημένα κύτταρα έχουν παρόμοιο γονότυπο και φαινότυπο με τα πατρικά κύτταρα. Η συγκεκριμένη κυτταρική σειρά προήλθε από νεφρό ηλικίας ενός μηνός και για την αθανατοποίηση χρησιμοποιήθηκαν το αντιγόνο Τ του ιού SV40 και το ογκογονίδιο H- Ras (51). Ο μηχανισμός της αθανατοποίησης μέσω του αντιγόνου Τ είναι καλά μελετημένος (108), αλλά αρκετές φορές η υπερέκφραση του αντιγόνου Τ δεν αρκεί για την αθανατοποίηση. Με τη μέθοδο αυτή μεταβάλλεται η σηματοδότηση σε αρκετά μονοπάτια μεταγωγής σήματος στα κύτταρα, όπως είναι αυτά στα οποία παίζει ρόλο η πρωτεΐνη p53 (3, 315) Διατήρηση-ανάπτυξη κυτταροκαλλιεργειών Τα κύτταρα αναπτύσσονται σε επωαστήρα κυττάρων ατμόσφαιρας 5% (v/v) CO2 σε αέρα και θερμοκρασίας 37 ο C και ελέγχεται η ανάπτυξη τους στο μικροσκόπιο. Για τη διατήρηση της καλλιέργειας, τα κύτταρα καλλιεργούνται σε φιάλες καλλιέργειας των 75cm 2 ή 25cm 2. Το θρεπτικό μέσο της καλλιέργειας αποτελείται από DMEM/HAM's F12 (1:1), 15mM ρυθμιστικό διάλυμα HEPES, 1% θερμικά απενεργοποιημένο ορό από έμβρυο μόσχου (Fetal Calf Serum - FCS), 2 mm γλουταμίνη, 100U/ml πενικιλίνη, 56

75 100mg/ml στρεπτομυκίνη, 5 mg/ml ανθρώπινη τρανσφερίνη, 5 mg/ml ινσουλίνη, 5 mg/ml σεληνιώδες νάτριο, 50 nm δεξαμεθαζόνη, 25mg/ml αμφοτερισίνη, 5mM ή 25mM γλυκόζη σε δοχεία καλλιέργειας 75 cm 2. Τα κύτταρα αυτά εκφράζουν τους εξής ποδοκυτταρικούς δείκτες: νεφρίνη, ποδοκαλυκίνη, WT1, CD10 (CALLA). Όταν αναπτυχθούν στο 90% της κατάστασης συμβολής, ανακαλλιεργούνται με θρυψινοποίηση (κάθε 3 ημέρες). Συγκεκριμένα, αφαιρείται το παλιό θρεπτικό μέσο και τα κύτταρα επωάζονται σε 2mL διαλύματος θρυψίνης 0.05% (w/v)/na 2 EDTA 0.02% (w/v) ανά φιάλη καλλιέργειας 75cm 2 για 3 λεπτά στους 37 ο C. Στη συνέχεια προστίθεται ίσος όγκος ορού εμβρύου μόσχου (FCS) και το εναιώρημα των κυττάρων μεταφέρεται σε σωλήνα τύπου falcon 15mL. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 300g για 10min, απόχυση του υπερκείμενου των κυττάρων υγρό, αναδιασπορά των κυττάρων σε καθορισμένο όγκο φρέσκου πλήρους θρεπτικού υλικού και μοίρασμα των κυττάρων σε νέες φιάλες καλλιέργειας. Στις νέες φιάλες καλλιέργειας μοιράζεται συνήθως το 1/4 του αρχικού κυτταρικού πληθυσμού. Κατά τη διαδικασία της θρυψινοποίησης, η θρυψίνη πέπτει τις πρωτεΐνες προσκόλλησης που συμμετέχουν στις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-επιφάνειας φιάλης. Το EDTA είναι χηλικός παράγοντας των ιόντων ασβεστίου και μαγνησίου, τα οποία οι ιντεγκρίνες χρειάζονται για να αλληλεπιδράσουν με άλλες πρωτεΐνες για κυτταρική προσκόλληση. Ο ορός, ο οποίος περιέχει αναστολείς της θρυψίνης (π.χ. α1-αντιθρυψίνη), απενεργοποιεί τη θρυψίνη Αντιστροφή της συγκέντρωσης γλυκόζης Τα κύτταρα HGEC που καλλιεργούνται μόνιμα παρουσία 5mM γλυκόζης αποθηκεύονται σε δοχείο υγρού αζώτου (βλ. "Κατάψυξη και απόψυξη κυττάρων") κατά τη δεύτερη ανακαλλιέργεια. Ακολούθως, τα κύτταρα αυτά χρησιμοποιούνται για το χαρακτηρισμό των επιπέδων έκφρασης ποδοκυτταρικών δεικτών κατά τη συνεχή καλλιέργεια παρουσία 25mM γλυκόζης. Κατά τη διαδικασία αυτή, 4-5*10 5 κύτταρα 57

76 καλλιεργούνται παρουσία θρεπτικού υλικού που περιέχει 25mM γλυκόζης σε δοχεία καλλιέργειας επιφάνειας 75cm 2 έως το σημείο κάλυψης του 80-85% της κατάστασης συμβολής. Σε αυτό το χρονικό διάστημα (τυπικά περίπου 1 εβδομάδα), το θρεπτικό υλικό αντικαθίσταται κάθε 48 ώρες με φρέσκο θρεπτικό υλικό που περιέχει 25mM γλυκόζης. Η διαδικασία αυτή συνεχίζεται έως τις 18 εβδομάδες. Κάθε 2 εβδομάδες δημιουργείται στοκ κατεψυγμένων κυττάρων. Στο τέλος της κάθε εβδομάδας, τα κύτταρα αποκολλώνται από το δοχείο καλλιέργειας μέσω θρυψινοποίησης και χρησιμοποιούνται για τις εκάστοτε μελέτες. Επιπλέον, κυτταρικές καλλιέργειες που ολοκληρώνουν μια περίοδο 6 ή 18 εβδομάδων καλλιέργειας σε 25mM γλυκόζης καλλιεργούνται παρουσία 5mM γλυκόζης για 4 επιπρόσθετες εβδομάδες. Σε αυτό το χρονικό διάστημα, το θρεπτικό υλικό αντικαθίσταται κάθε 48 ώρες με φρέσκο θρεπτικό υλικό που περιέχει 5mM γλυκόζης και τα κύτταρα αναδιασπείρονται όταν φτάσουν το 80-85% της κατάστασης συμβολής. Στο τέλος της εκάστοτε εβδομάδας τα κύτταρα αποκολλώνται από το δοχείο καλλιέργειας μέσω θρυψινοποίησης και χρησιμοποιούνται για τις σχετικές μελέτες. Τα κύτταρα HGEC που καλλιεργούνται μόνιμα παρουσία 25mM γλυκόζης αποθηκεύονται σε δοχείο υγρού αζώτου (βλ. "Κατάψυξη και απόψυξη κυττάρων") κατά την τέταρτη ανακαλλιέργεια. Ακολούθως, τα κύτταρα αυτά χρησιμοποιούνται για το χαρακτηρισμό των επιπέδων έκφρασης ποδοκυτταρικών δεικτών κατά τη συνεχή καλλιέργεια παρουσία 5mM γλυκόζης. Κατά τη διαδικασία αυτή, 4-5*10 5 κύτταρα καλλιεργούνται παρουσία θρεπτικού υλικού που περιέχει 5mM γλυκόζης σε δοχεία καλλιέργειας επιφάνειας 75cm 2 έως το σημείο κάλυψης του 80-85% της κατάστασης συμβολής. Σε αυτό το χρονικό διάστημα (τυπικά περίπου 1 εβδομάδα), το θρεπτικό υλικό αντικαθίσταται κάθε 48 ώρες με φρέσκο θρεπτικό υλικό που περιέχει 5mM γλυκόζης. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται για εβδομάδες. Κάθε 2 εβδομάδες 58

77 δημιουργείται στοκ κατεψυγμένων κυττάρων. Στο τέλος της κάθε εβδομάδας, τα κύτταρα αποκολλώνται από το δοχείο καλλιέργειας μέσω θρυψινοποίησης και χρησιμοποιούνται για τις εκάστοτε μελέτες Κατάψυξη και απόψυξη κυττάρων Για τη δημιουργία στοκ κατεψυγμένων κυττάρων, κύτταρα HGEC που έχουν αναπτυχθεί μέχρι συμβολής αποκολλώνται από την επιφάνεια της φιάλης καλλιέργειας με θρυψινοποίηση, όπως περιγράφηκε παραπάνω. Το εναιώρημα των κυττάρων μεταφέρεται σε σωλήνα τύπου falcon 15mL και φυγοκεντρείται στα 300g για 10 min. Ακολουθεί απόχυση του υπερκείμενου των κυττάρων υγρό, αναδιασπορά των κυττάρων σε 3mL 90% FBS (v/v) /10% (v/v) διμεθυλο-σουλφοξείδιο (DMSO) και μοίρασμα των κυττάρων σε ειδικά αποστειρωμένα φιαλίδια (1 ml κυττάρων ανά φιαλίδιο). Στο κάθε φιαλίδιο μοιράζεται το 1/3 των κυττάρων από φιάλη καλλιέργειας 75cm 2 που βρίσκονταν σε συμβολή πριν από τη κατάψυξη. Το DMSO προστίθεται στο διάλυμα κατάψυξης των κυττάρων ως κρυοπροστατευτικός παράγοντας για την ελάττωση της καταστροφής των κυττάρων από το σχηματισμό ενδοκυτταρικών κρυστάλλων και για ωσμωτικούς λόγους. Το κάθε φιαλίδιο με εναιώρημα των κυττάρων τοποθετείται σε κουτί το οποίο φυλάσσεται στους -80 C για 48 ώρες. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται αργός ρυθμός κατάψυξης (ιδανικά η θερμοκρασία πρέπει να μειώνεται 1 ο C ανά λεπτό). Κατόπιν τα φιαλίδια τοποθετούνται σε δοχείο υγρού αζώτου, όπου και φυλάσσονται. Τα κύτταρα μπορούν να διατηρηθούν στους ατμούς του υγρού αζώτου (-196 C) για μεγάλο χρονικό διάστημα. Έτσι διατηρούνται στην κατάσταση που βρίσκονται κατά την στιγμή της κατάψυξης. Κατά την απόψυξη των κυττάρων απαιτείται απότομο πέρασμα των κυττάρων από τους -196 στους 37 o C ώστε η απόψυξη των κρυστάλλων να τραυματίσει όσο το δυνατόν λιγότερο τα κύτταρα. Τα φιαλίδια που περιέχουν τα κατεψυγμένα κύτταρα 59

78 ανασύρονται από το υγρό άζωτο, αποψύχονται αμέσως σε υδατόλουτρο στους 37 ο C και το περιεχόμενό τους αναμιγνύεται με 3mL θρεπτικού υλικού και φυγοκεντρείται στα 300g για 5 λεπτά. Μετά από απόχυση του υπερκείμενου υγρού, τα κύτταρα αναδιασπείρονται σε 10-12mL πλήρους θρεπτικού υλικού και μεταφέρονται σε φλάσκες καλλιέργειας. Μετά από ώρες ελέγχεται στο μικροσκόπιο η βιωσιμότητα των κυττάρων και ο βαθμός προσκόλλησης τους στον πυθμένα της φιάλης. 2.2 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Λύση κυττάρων και εκχύλιση των πρωτεϊνών από τα κύτταρα Κατά την απομόνωση πρωτεϊνών, σημαντικό ρόλο έχει η μέθοδος λύσης των κυττάρων που θα χρησιμοποιηθεί. Αυτή πρέπει να διαλυτοποιεί τις πρωτεΐνες σε τέτοια μορφή, ώστε να παραμένουν ανοσοδραστικές και να μην έχουν υποστεί αποικοδόμηση. Σημαντικό ρόλο διαδραματίζουν το είδος και η συγκέντρωση του απορρυπαντικού που χρησιμοποιείται, το ph και η ιονική ισχύς του διαλύματος κυτταρικής λύσης καθώς επίσης η παρουσία δισθενών κατιόντων και άλλων συμπαραγόντων. Η εκχύλιση υδρόφοβων και διαμεμβρανικών πρωτεϊνών επηρεάζεται λίγο από την ιονική ισχύ. Πολλές μέθοδοι, κυρίως αυτές που χρησιμοποιούν μηχανική καταστροφή των κυττάρων, προκαλούν την απελευθέρωση ενδοκυτταρικών πρωτεασών που μπορεί να αποικοδομήσουν τις πρωτεΐνες. Η ευκολία αποικοδόμησης των πρωτεϊνών διαφέρει. Οι διαμεμβρανικές και εκκρινόμενες πρωτεΐνες είναι σε γενικές γραμμές πιο ανθεκτικές από τις ενδοκυτταρικές. Για να μειωθεί η πρωτεολυτική ενεργότητα στα κυτταρικά εκχυλίσματα, θα πρέπει όλες οι διαδικασίες να γίνονται σε χαμηλές θερμοκρασίες και να περιέχονται στα διαλύματα λύσης αναστολείς πρωτεασών. Η λύση των κυττάρων HGEC γίνεται με κατάλληλα τροποποιημένο διάλυμα RIPA (radioimmunoprecipitation assay buffer) κυτταρικής λύσης. Η σύσταση του διαλύματος διαφέρει αναλόγως με την 60

79 καθοδική μελέτη. Για την ανίχνευση της ποδοκαλυκίνης χρησιμοποιείται διάλυμα φωσφορικών αλάτων (phosphate buffered saline, PBS) που περιέχει 1% Triton X-100 και μίγμα αναστολέων πρωτεασών. Για την ανίχνευση της νεφρίνης χρησιμοποιείται διάλυμα RIPA εμπλουτισμένο με αναστολείς πρωτεασών, ενώ για την ανίχνευση της α3β1 ιντεγκρίνης χρησιμοποιείται PBS εμπλουτισμένο με 1% Triton X-100 και 1mM CaCl2 και αναστολείς πρωτεασών. Το διάλυμα RIPA περιέχει συνδυασμό των απορρυπαντικών Nonidet P-40 (octyl phenoxylpolyethoxylethanol), το οποίο είναι ένα μη-ιοντικό/μη-αποδιατακτικό απορρυπαντικό κατάλληλο για την απομόνωση κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών αφού διασπάει την κυτταρική μεμβράνη χωρίς ταυτόχρονα να επηρεάζει την πυρηνική μεμβράνη, και του ιοντικού απορρυπαντικού δεοξυχολικού νατρίου (3α,12α-διυδροξυ- 5β-χολαν-24-οϊκό οξύ). Στο διάλυμα επίσης χρησιμοποιήθηκε ο αναστολέας πρωτεασών σερίνης PMSF (φαινυλομεθανοσουλφονυλοφθόριο), ο οποίος προσδένεται ειδικά στο ενεργό κατάλοιπο σερίνης της πρωτεάσης, χωρίς ωστόσο να προσδένεται σε οποιοδήποτε άλλο κατάλοιπο σερίνης στην πρωτεΐνη, καθώς και μείγμα αναστολέων πρωτεασών ευρείας εξειδίκευσης (Sigma P8340) όπως 4-(2- αμινοαιθυλ)βενζενοσουλφονυλοφθορίου (AEBSF), πεπστατίνης, βεστατίνης, λευπεπτίνης και απροτινίνης που είναι κατάλληλες για την αναστολή πρωτεασών σερίνης, κυστεΐνης, ασπαρτικού οξέος, καθώς και αμινοπεπτιδασών. Με σκοπό τη διατήρηση της φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών στο κυτταρικό λύμα, ιδιαίτερη προσοχή δόθηκε στην αναστολή ενδογενών κυτταρικών φωσφατασών. Για το σκοπό αυτό το διάλυμα κυτταρικής λύσης περιέχει τους αναστολείς φωσφατασών πυροφωσφορικό νάτριο (Na 4 P 2 O 7 ) και φθοριούχο νάτριο (NaF), καθώς και ορθοβαναδικό νάτριο (Na 3 VO 4 ) το οποίο αναστέλλει την δράση φωσφατασών τυροσίνης (όπως επίσης αναστέλλει την δράση αλκαλικών φωσφατασών καθώς και ορισμένων ATPασών) μέσω 61

80 αναστρέψιμης πρόσδεσης των ιόντων VO 3-4 στην ενεργή περιοχή του ενζύμου έχοντας δράση φωσφορικού αναλόγου. Τέλος, το διάλυμα κυτταρικής λύσης περιέχει τον χειλικό παράγοντα Na 2 EDTA (αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ, (HO 2 CCH 2 ) 2 NCH 2 CH 2 N(CH 2 CO 2 H) 2 ) με σκοπό την απενεργοποίηση ενζύμων εξαρτώμενα από ιόντα μετάλλων καθώς επίσης καθορισμένη συγκέντρωση αλάτων και Tris-HCl (ph 7.4) (τρις(υδροξυμεθυλ)αμινομεθάνιο, (HOCH 2 ) 3 CNH 2 ) για διατήρηση κατάλληλης αλατότητας και ph. Το απορρυπαντικό είναι απαραίτητο για την διαλυτοποίηση των μεμβρανών, ενώ τα άλατα διαμορφώνουν κατάλληλο ph και κατάλληλη ιονική ισχύ στο διάλυμα λύσης, ώστε να παραμείνουν διαλυτές οι κυτταρικές πρωτεΐνες. Οι αναστολείς των πρωτεασών σε συνδυασμό με τη χαμηλή θερμοκρασία λύσης, παρεμποδίζουν τη δράση ενδοκυτταρικών πρωτεασών που απελευθερώνονται κατά τη λύση, αποτρέποντας έτσι την αποικοδόμηση των κυτταρικών πρωτεϊνών. Κατά τη διαδικασία, αφού τα κύτταρα αποκολλώνται από το δοχείο καλλιέργειας με θρυψινοποίηση, ακολουθούν 3 πλύσεις με ψυχρό (4 ο C) ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων PBS με επακόλουθες φυγοκεντρήσεις για 5 λεπτά σε 300g στους 4 ο C. Μετά την τελευταία φυγοκέντρηση ακολουθεί προσθήκη του διαλύματος κυτταρικής λύσης στους σωλήνες συλλογής των κυττάρων σε συγκέντρωση ~100μl διαλύματος/10 6 κύτταρα και παραμονή τους για μία ώρα στους 4 ο C υπό ήπια ανακίνηση. Οι σωλήνες με το εναιώρημα φυγοκεντρούνται για 30 λεπτά στα g στους 4 C. Το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης μεταφέρεται σε καθαρούς σωλήνες eppendorf και φυλάσσεται στους -20 ο C για περαιτέρω πειραματική χρήση, ενώ σε δείγμα του γίνεται ποσοτικός προσδιορισμός ολικής πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford όπως περιγράφεται στη συνέχεια. 62

81 2.2.2 Κυτταρική κλασμάτωση Μετά την παραλαβή των κυττάρων με θρυψίνη, τα κύτταρα εκπλένονται με PBS και φυγοκεντρούνται στα 1200g για 10 λεπτά, δυο φορές. Στη συνέχεια μετρώνται με αιμοκυτταρόμετρο και υπολογίζεται ο αριθμός τους. Το ίζημα των κυττάρων επαναιωρείται σε υποτονικό διάλυμα Α και τα κύτταρα επωάζονται στον πάγο υπό ελαφρά ανακίνηση για 10 λεπτά. Ακολούθως προστίθεται ΝΡ-40 σε τελική συγκέντρωση 10% (v/v). Μετά από φυγοκέντρηση 16000g για 10 λεπτά στους 4 C συλλέγεται το υπερκείμενο το οποίο περιέχει τις υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες (κυτταροπλασματικό κλάσμα). Στο ίζημα των πυρήνων προστίθεται διάλυμα λύσης πυρήνων και το εναιώρημα επωάζεται στον πάγο υπό ελαφρά ανακίνηση για 30 λεπτά. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 10000g για 30 λεπτά στους 4 C, το υπερκείμενο της οποίας περιέχει τις υδατοδιαλυτές πυρηνικές πρωτεΐνες και συλλέγεται ως το πυρηνικό κλάσμα. Τα παραληφθείσα δείγματα αποθηκεύονται για λίγες ημέρες στους -20 C ή για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα στους -80 C Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών (δοκιμή Bradford). Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης διαλύματος πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε μια τροποποίηση της μεθόδου Bradford. Η μέθοδος αποτελεί φασματοφωτομετρική μέθοδο προσδιορισμού πρωτεϊνών με την χρήση του αντιδραστηρίου Coomassie Brilliant Blue. Η χρωστική Coomassie προσδένεται σε αμινοξέα που φέρουν βασικές ή αρωματικές πλευρικές ομάδες. Συγκεκριμένα, δύο είδη αλληλεπιδράσεων λαμβάνουν χώρα: η ελεύθερη μορφή της χρωστικής δίνει ένα ελεύθερο ηλεκτρόνιο σε ιονική ομάδα της πρωτεΐνης (κυρίως κατάλοιπα αργινίνης, καθώς επίσης ιστιδίνης, λυσίνης, τυροσίνης, τρυπτοφάνης και φαινυλαλανίνης), προκαλώντας διαταραχή της φυσικής διαμόρφωσης της πρωτεΐνης, εκθέτωντας τα υδρόφοβα κατάλοιπα. Αυτά τα υδρόφοβα κατάλοιπα προσδένονται μέσω δυνάμεων van 63

82 der Waals στις μη πολικές περιοχές του μορίου της χρωστικής, φέρνοντας σε εγγύτητα τις κατιονικές αμινικές ομάδες με τα ανιόντα της χρωστικής. Η αλληλεπίδραση ενισχύεται από τις ηλεκτροστατικές δυνάμεις που αναπτύσσονται μεταξύ αυτών των ομάδων. Η πρόσδεση της πρωτεΐνης προκαλεί μια μετατόπιση στο φάσμα απορρόφησης. Η προσδεμένη στην πρωτεΐνη μορφή παρουσιάζει μέγιστο απορρόφησης στα 595nm. Η αύξηση της απορρόφησης σε αυτό το μήκος κύματος είναι ανάλογη της ποσότητας της προσδεμένης σε πρωτεΐνη χρωστικής και επομένως στη συγκέντρωση της πρωτεΐνης στο δείγμα. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε έτοιμο αντιδραστήριο Coomassie Brilliant Blue (Coomassie Plus Protein Assay Reagent) (PIERCE, Rockford, Illinois, US) και ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο της εταιρίας, με ευαισθησία ανίχνευσης από μg πρωτεΐνης ανά ml διαλύματος. Συνοπτικά, δείγματα από τα διαλύματα πρωτεϊνών άγνωστης συγκέντρωσης, που εκχυλίστηκαν από τα κύτταρα, αραιώθηκαν με Η 2 Ο μέχρι όγκου 1 ml και σε αυτά προστέθηκε 1 ml αντιδραστηρίου. Τα δείγματα αφού ανακινήθηκαν, μετρήθηκε η απορρόφηση τους στα 595 nm. Σαν τυφλό χρησιμοποιήθηκε 1ml Η 2 Ο στο οποίο είχε προστεθεί 1 ml αντιδραστηρίου. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης έγινε με αντιπαράθεση σε πρότυπο καμπύλη απορρόφησης σταθερών συγκεντρώσεων αλβουμίνης βόειου ορού (bovine serum albumin, BSA). 2.3 ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΤΑ WESTERN (WESTERN BLOTTING). Η μέθοδος βασίζεται στην ανίχνευση συγκεκριμένων πρωτεϊνών ακινητοποιημένων σε φίλτρα νιτροκυτταρίνης μέσα από μίγμα μεγάλου αριθμού άλλων πρωτεϊνών προερχόμενου από δείγματα κυτταρικής λύσης, υπερκειμένου καλλιεργειών κτλ. με την βοήθεια ειδικών αντισωμάτων. Συνοπτικά, οι πρωτεΐνες του μίγματος διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικό πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και στην συνέχεια μεταφέρονται και ακινητοποιούνται επάνω σε φύλλα νιτροκυτταρίνης, 64

83 επιτρέποντας στις ακινητοποιημένες πρωτεΐνες να διατηρούν όλες τους τις ιδιότητες. Κατ' αυτό τον τρόπο όταν επωαστούν με ειδικά αντισώματα που τις αναγνωρίζουν, αυτά προσδένονται στις πρωτεΐνες και ο εντοπισμός τους είναι δυνατός με την χρήση κατάλληλων ιχνηθετών. Η μέθοδος εκτελείται σε τρία στάδια: το διαχωρισμό των πρωτεϊνών ενός μίγματος με ηλεκτροφόρηση, τη μεταφορά των διαχωρισμένων πρωτεϊνών στα φίλτρα νιτροκυτταρίνης και την εντόπιση των πρωτεϊνών με την βοήθεια ειδικών, επισημασμένων αντισωμάτων Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) Ολική πρωτεΐνη από λύματα κυττάρων αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου παρουσία του απορρυπαντικού SDS (δωδεκυλ-θειϊκό νάτριο, sodium dodecyl sulfate). Τα πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου αποτελούνται από αλυσίδες πολυμερισμένου ακρυλαμιδίου που διασυνδέονται μεταξύ τους με τη βοήθεια του Ν,Ν'-μεθυλενοδισακρυλαμιδίου. O πολυμερισμός γίνεται με την παρουσία υπερθειϊκού αμμωνίου (ammonium persulfate, APS), το οποίο κατά τη διάλυσή του στο νερό παρέχει ελεύθερες ρίζες, και επιταχύνεται με την προσθήκη Ν,Ν,Ν',Ν'- τετραμεθυλοδιαμίνης (TEMED), που καταλύει το σχηματισμό τους. Η διαδικασία αυτή έχει σαν αποτέλεσμα την δημιουργία πόρων στο πήκτωμα. Το μέγεθος των πόρων καθώς και το αποτελεσματικό εύρος διαχωρισμού του πηκτώματος εξαρτώνται από την συγκέντρωση του πολυακρυλαμιδίου. Το πολυακρυλαμίδιο υπερτερεί άλλων ουσιών που σχηματίζουν πηκτώματα, εξαιτίας της χημικής του αδράνειας, της μεγαλύτερης αντοχής του στην υψηλή θερμοκρασία και της επαναληψιμότητας των αποτελεσμάτων. Η τελική συγκέντρωση πολυακρυλαμιδίου στο πήκτωμα καθορίζεται από το μέγεθος των πρωτεϊνών που αναλύονται με ηλεκτροφόρηση. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται κάτω από συνθήκες που εξασφαλίζουν την αποδιάταξη των πρωτεϊνών στις πολυπεπτιδικές 65

84 υπομονάδες έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ο διαχωρισμός τους βάσει μοριακού βάρους και όχι βάσει τριτοταγούς ή τεταρτοταγούς δομής των πρωτεϊνών. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιείται το δωδέκυλ-θειϊκό νάτριο (SDS), ένα ισχυρό ανιονικό απορρυπαντικό. Το SDS σε συνδυασμό με το βρασμό προωθεί την αποδιάταξη των πρωτεϊνών. Το αρνητικά φορτισμένο SDS προσδένεται στις αποδιαταγμένες πολυπεπτιδικές αλυσίδες σε αναλογία μάζας 1.4:1, προσδίδοντας τους αρνητικό φορτίο. Η παρουσία αναγωγικού παράγοντα, συνήθως μερκαπτοαιθανόλης ή διθειοθρεϊτόλης (DTT, dithiothreitol) βοηθάει στην αποδιάταξη μιας πρωτεΐνης καταστρέφοντας τους δισουλφιδικούς δεσμούς. Με την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου, οι φορτισμένες πολυπεπτιδικές αλυσίδες κινούνται μέσα στους πόρους του πηκτώματος προς την κάθοδο με διαφορική κινητικότητα η οποία καθορίζεται από το μοριακό τους βάρος. Η διαφορετική κινητικότητα των πρωτεϊνών στο πήκτωμα επιτρέπει το διαχωρισμό τους. Δύο συστήματα διαλύματος είναι γνωστά στην SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση, το συνεχές και το ασυνεχές. Στο πρώτο, τα δείγματα τοποθετούνται σε ενιαίο πήκτωμα στο οποίο γίνεται ο διαχωρισμός. Το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται για τα δείγματα, το πήκτωμα και την συσκευή ηλεκτροφόρησης. Αντίθετα, στο ασυνεχές σύστημα χρησιμοποιούνται διαφορετικά ρυθμιστικά διαλύματα, ως προς τη σύσταση και το ph, στο πήκτωμα και στη συσκευή ηλεκτροφόρησης. Τα δείγματα τοποθετούνται σε πήκτωμα μεγάλων πόρων, το πήκτωμα επιστοίβαξης (stacking gel) το οποίο πολυμερίζεται πάνω σε πήκτωμα μικρότερων πόρων, το πήκτωμα διαχωρισμού (resolving/separating gel). Στο ασυνεχές σύστημα μπορούν να χρησιμοποιηθούν σχετικά μεγάλοι όγκοι πρωτεϊνικών δειγμάτων στο πήκτωμα διατηρώντας πολύ καλή ανάλυση των συστατικών τους. Αυτό συμβαίνει γιατί, οι πρωτεΐνες επιστοιβάζονται κατά την διάρκεια της μετακίνησής τους υπό την επίδραση ηλεκτρικού φορτίου μέσα στο πήκτωμα επιστοίβαξης, σχηματίζοντας μια μικρή ζώνη πριν την είσοδό τους στο 66

85 πήκτωμα διαχωρισμού. Στο ασυνεχές σύστημα το οποίο χρησιμοποιείται πιο συχνά, τα δείγματα και το πήκτωμα επιστοίβαξης περιέχουν Tris-HCl (ph 6.8), το πήκτωμα διαχωρισμού Tris-HCl (ph 8.8) και το διάλυμα ηλεκτροφόρησης Tris-γλυκίνη (ph 8.3), ενώ όλα περιέχουν 0.1% w/v SDS. Συγκεκριμένα, ισόποσα πρωτεϊνικά δείγματα κυτταρικών λυμάτων, αναδιαλύονται σε διάλυμα φόρτωσης Laemmli (Laemmli sample buffer) παρουσία 5% β- μερκαπτοαιθανόλης (αναγωγικές συνθήκες ηλεκτροφόρησης). Εκτός των αποδιατακτικών παραγόντων που αναφέρονται παραπάνω, το διάλυμα φόρτωσης περιέχει την χρωστική κυανό της βρωμοφαινόλης ως δείκτη κατά την διαδικασία φόρτωσης των πρωτεϊνών και ως ένδειξη της πορείας τους καθώς το μέτωπο της χρωστικής προπορεύεται των πρωτεϊνών στο πήκτωμα. Το διάλυμα φόρτωσης περιέχει επίσης γλυκερόλη με σκοπό την αύξηση της πυκνότητας του δείγματος, έτσι ώστε αυτό να επικάθεται στην βάση του πηγαδιού φόρτωσης και να ελαχιστοποιείται η απώλεια πρωτεϊνών μέσω διάχυσης στο ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης. Τα δείγματα τοποθετούνται στα φρεάτια του πηκτώματος επιστοίβαξης (5% ακρυλαμίδιο) έπειτα από βρασμό για 5 λεπτά στους 90 C-100 C. Τα δείγματα των πρωτεϊνικών διαλυμάτων αναλύθηκαν σε πήκτωμα διαχωρισμού περιεκτικότητας σε πολυακρυλαμίδιο 7.5%, 10%, 12% ή 15% που καθορίζεται βάσει του μοριακού βάρους της κατά περίπτωση υπό μελέτη πρωτεΐνης. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σε ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης, με σταθερή εφαρμοζόμενη τάση 80 Volts σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης, απομακρύνθηκε το πήκτωμα επιστοίβαξης και το πήκτωμα διαχωρισμού χρησιμοποιήθηκε για την μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Για την ταυτοποίηση του μεγέθους της ζώνης της πρωτεΐνης που εντοπίζεται μετά την ανοσοαποτύπωση, χρησιμοποιήθηκε μίγμα πρωτεϊνικών δεικτών 67

86 γνωστών μοριακών βαρών και ποσότητας το οποίο αναλύεται παράλληλα στο ίδιο πήκτωμα Μεταφορά των πρωτεϊνών σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης. Με σκοπό την αύξηση προσβασιμότητας των διαχωρισμένων πρωτεϊνών στα ειδικά αντισώματα κατά την διαδικασία ανίχνευσής τους, είναι απαραίτητη η μεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σε ειδική μεμβράνη ή φίλτρο νιτροκυτταρίνης το οποίο έχει την ιδιότητα να δεσμεύει πρωτεΐνες με μη-ειδικό τρόπο. H δέσμευση των πρωτεϊνών επάνω στην μεμβράνη επιτυγχάνεται μέσω υδρόφοβων και ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ της πρωτεΐνης και της νιτροκυτταρίνης. Η μεταφορά των πρωτεϊνικών ζωνών από το πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου στο φίλτρο νιτροκυτταρίνης γίνεται με επίδραση ηλεκτρικού πεδίου αφού προηγουμένως απομακρυνθεί το SDS από το πήκτωμα. Η απομάκρυνση του SDS από το πήκτωμα γίνεται με επώαση του τελευταίου σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς που περιέχει μεθανόλη. Η παραμονή του αρνητικά φορτισμένου SDS στις πρωτεϊνικές ζώνες του πηκτώματος, ενώ διευκολύνει την μεταφορά τους, μετριάζει την ικανότητα πρόσδεσης στο φίλτρο. Η μεθανόλη απομακρύνει το SDS από το πήκτωμα και αυξάνει την ικανότητα πρόσδεσης των πολυπεπτιδικών αλυσίδων. Το ph του ρυθμιστικού διαλύματος μεταφοράς είναι αρκετά αλκαλικό (~8.3) και έτσι το φορτίο των πρωτεϊνών παραμένει αρνητικό αφού γενικά το pi των πρωτεϊνών είναι < 8.3. Η επίδραση του ηλεκτρικού πεδίου προκαλεί την κίνηση των ζωνών προς την κάθοδο (θέση στην οποία έχει τοποθετηθεί το φίλτρο νιτροκυτταρίνης). Συγκεκριμένα μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης το πήκτωμα και το φίλτρο νιτροκυτταρίνης παρέμειναν για 20 λεπτά στο ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς. Ακολούθησε η ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνικών ζωνών στο φίλτρο νιτροκυτταρίνης για 2 ώρες με εφαρμοζόμενο ρεύμα έντασης 390 ma στους 4 ο C υπό συνεχή ανάδευση. Η ανίχνευση των πρωτεϊνών έγινε με την χρήση 68

87 χημειοφωταύγειας. Η ηλεκτρoμεταφορά των πρωτεϊνών έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες του εργαστηριακού οδηγού της AMERSHAM BIOSCIENCES (Pittsburgh, Pennsylvania, US) και της BIO-RAD (Hercules, California, US) που δίνονται συμπληρωματικά με τη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και τη συσκευή ηλεκτρομεταφοράς αντίστοιχα Ανοσοεντοπισμός των πρωτεϊνών με τη χρήση της χημειοφωταύγειας. Ο εντοπισμός της υπό εξέταση πρωτεΐνης στο φίλτρο νιτροκυτταρίνης, γίνεται έμμεσα με μονοκλωνικό ή πολυκλωνικό αντίσωμα που συνδέεται με την πρωτεΐνηαντιγόνο και με δεύτερο μονοκλωνικό αντίσωμα το οποίο αναγνωρίζει και προσδένεται στο Fc τμήμα (fragment crystallizable region) της σταθερής περιοχής του πρώτου αντισώματος. Το δεύτερο μονοκλωνικό αντίσωμα είναι συζευγμένο με υπεροξειδάση ρεπανιού (HRP, horseradish peroxidase). Η HRP οξειδώνεται παρουσία του Η 2 Ο 2 και η αντίδραση του οξειδωμένου ενζύμου με το υπόστρωμα λουμινόλη (luminol) προκαλεί την εκπομπή φωτονίων που αποτυπώνεται σαν μαύρη ζώνη σε φιλμ αυτοραδιογραφίας ή μετά από έκθεση σε φωτογραφική μηχανή με διάταξη συζευγμένου φορτίου (chargecoupled device, CCD camera). Στην περίπτωση του φιλμ, η θέση αποτύπωσης της ζώνης στο φιλμ, αντιστοιχεί στη θέση του σχηματιζόμενου συμπλόκου αντιγόνου-αντισώματος στη μεμβράνη. Η πυκνότητα της ζώνης επηρεάζεται από τη ποσότητα του αντιγόνου. Έτσι, μεταβολές της πυκνότητας των ζωνών που αντιστοιχούν στο ίδιο αντιγόνο, ανάμεσα σε δυο ισόποσα δείγματα ολικής πρωτεΐνης που αναλύονται με ανοσοαποτύπωση, αντιστοιχούν σε σχετική μεταβολή της ποσότητας του αντιγόνου. Επειδή το φίλτρο νιτροκυτταρίνης έχει την ιδιότητα να δεσμεύει αδιακρίτως όλα τα είδη πρωτεϊνών, χρειάζεται μέριμνα ώστε να αποφευχθεί η μη ειδική διασύνδεση του αντισώματος πάνω στο φίλτρο. Πριν την επώαση με το πρώτο αντίσωμα, γίνεται επώαση με αραιό διάλυμα πρωτεΐνης όπως BSA ή άπαχο γάλα παρουσία μικρής ποσότητας ενός 69

88 ήπιου απορρυπαντικού, όπως το Tween-20. Οι παράγοντες αυτοί αποκλείουν αυτή την πρόσδεση μέσω κορεσμού όλων των μη-ειδικών θέσεων πρόσδεσης της μεμβράνης. Η διαδικασία αυτή (blocking) έχει ως αποτέλεσμα την μείωση του "θορύβου" στο τελικό προϊόν της ανοσοαποτύπωσης όπως επίσης και την αποφυγή ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων. Παρουσία άπαχου γάλακτος γίνονται επίσης όλες οι επωάσεις με τα αντισώματα. Ο ανοσοεντοπισμός της υπό εξέταση πρωτεΐνης έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες του εργαστηριακού οδηγού της PIERCE που δίνεται συμπληρωματικά με τη σειρά έτοιμων αντιδραστηρίων χημειοφωταύγειας. Συγκεκριμένα, μετά την μεταφορά των πρωτεϊνικών ζωνών από το πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου στο φίλτρο νιτροκυτταρίνης, αυτό επωάζεται για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με διάλυμα κορεσμού. Η μεμβράνη πλένεται τρεις φορές για 10 λεπτά με το διάλυμα πλύσης. Στη συνέχεια η μεμβράνη επωάζεται για ώρες σε θερμοκρασία δωματίου υπό ήπια ανακίνηση, με το διάλυμα επώασης στο οποίο προστίθεται, σε κατάλληλη αραίωση, το ειδικό αντίσωμα έναντι της υπό εξέταση πρωτεΐνης. Μετά το τέλος της επώασης ακολουθούν διαδοχικές πλύσεις της μεμβράνης με το διάλυμα πλύσης. Η μεμβράνη επωάζεται για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου υπό ήπια ανακίνηση με το διάλυμα επώασης στο οποίο προστίθεται το δεύτερο αντίσωμα. Το δεύτερο αντίσωμα είναι συζευγμένο με το ένζυμο HRP. Ακολουθούν διαδοχικές πλύσεις της μεμβράνης με το διάλυμα πλύσης και επώαση για 5 λεπτά με το μίγμα έτοιμων αντιδραστηρίων χημειοφωταύγειας που περιέχουν H 2 Ο 2 και λουμινόλη. Η HRP οξειδώνεται παρουσία H 2 O 2, αντιδρά με την λουμινόλη (προκαλώντας την οξείδωσή της) και προκαλεί την εκπομπή φωτονίων, η διάρκεια της οποίας ενισχύεται με την παρουσία κάποιου ενισχυτή αυξάνοντας με τον τρόπο αυτό την ευαισθησία του συστήματος. Η έκθεση της μεμβράνης έγινε είτε σε φιλμ αυτοραδιογραφίας είτε σε CDD διάταξη, οπότε και η φωτογραφία αποθηκεύεται στο συνδεδεμένο ηλεκτρονικό υπολογιστή. O χρόνος 70

89 έκθεσης εξαρτάται από την ένταση της ζώνης του συμπλέγματος, που καθορίζεται τόσο από τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης, όσο και από την συγγένεια που παρουσιάζει το χρησιμοποιούμενο πρωτογενές αντίσωμα με την πρωτεΐνη. Προκειμένου να επιβεβαιωθεί το ισόποσο φόρτωμα μεταξύ των δειγμάτων, μετά την πρώτη εμφάνιση του φιλμ ή την αποθήκευση των ψηφιακών φωτογραφιών, η μεμβράνη επωάζεται για 20 λεπτά με έτοιμο αντιδραστήριο απομάκρυνσης αντισωμάτων (Re-Blot Plus Western Blot Stripping Solution, Chemicon Intenational, πλέον Millipore, Billerica, Massachusetts, US) και ανοσοαποτυπώνεται με αντίσωμα έναντι της τουμπουλίνης με την ίδια διαδικασία ξεκινώντας από το στάδιο του κορεσμού. Η ποσότητα της τουμπουλίνης, που εμφανίζεται στο φιλμ αυτοραδιογραφίας για κάθε δείγμα, αποτελεί την ποσότητα αναφοράς για την κανονικοποίηση των ποσοτήτων της υπό εξέταση πρωτεΐνης στα δείγματα που αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωση. 2.4 ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της συν-ανοσοκατακρήμνισης (co- immunoprecipitation ή Co-IP) προκειμένου να μελετηθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ της πρωτεΐνης WT1 και του συν-ενεργοποιητή της CBP (CREB-binding protein). Η μέθοδος επιτρέπει το διαχωρισμό ενός πρωτεϊνικού μορίου ή συμπλόκου πρωτεϊνικών μορίων από μίγμα πρωτεϊνών. Η βασική αρχή της μεθόδου βασίζεται στην δημιουργία συμπλόκου αντιγόνου-αντισώματος και εν συνεχεία κατακρήμνιση του ανοσοσυμπλόκου. Η κατακρήμνιση του ανοσοσυμπλόκου ανάλογα με το είδος του αντισώματος μπορεί να γίνει μέσω πρωτεϊνών Α και G ακινητοποιημένων σε σφαιρίδια αγαρόζης ή σεφαρόζης. Οι πρωτεΐνες Α και G είναι πρωτεΐνες βακτηριακής προέλευσης και αποτελούνται από μια πολυπεπτιδική αλυσίδα η οποία φέρει τουλάχιστον δυο περιοχές υψηλής συγγένειας για το Fc (fragment crystallizable) τμήμα των ανοσοσφαιρινών και αρκετές περιοχές δέσμευσης για το Fab (fragment antigen binding) 71

90 τμήμα αυτών. Η αποδέσμευση των ανοσοσυμπλόκων από την ακινητοποιημένη πρωτεΐνη Α ή G μπορεί να επιτευχθεί με βρασμό, αναγωγικές συνθήκες, ή όξινες τιμές ph. Η μέθοδος αυτή εμφανίζει μεγάλη εξειδίκευση και ευαισθησία, δεδομένου ότι μπορεί να ανιχνεύσει μικρές ποσότητες μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης (~100 pg). Σε μια σειρά πειραμάτων ανοσοκατακρήμνισης του συμπλόκου WT1/CBP πραγματοποιείται κυτταρική λύση και προσδιορισμός της συγκέντρωσης συνολικής πρωτεΐνης με την μέθοδο Bradford όπως περιγράφεται πιο πάνω. Στη συνέχεια δείγματα κυτταρικού λύματος συνολικής πρωτεΐνης ~0,4 mg, επωάζονται για 12 ώρες με 2μg μονοκλωνικού αντί-wt1 αντισώματος στους 4 C υπό ήπια ανακίνηση. Στην συνέχεια πραγματοποιείται επώαση των δειγμάτων με εναιώρημα σφαιριδίων σεφαρόζης - πρωτεΐνης Α, τα οποία είχαν προηγουμένως υποστεί πλύση με τροποποιημένο διάλυμα RIPA, στους 4 C για 2 ώρες υπό ήπια ανακίνηση. Η έκλουση των ανοσοσυμπλόκων πραγματοποιείται με βρασμό των σφαιριδίων της σεφαρόζης σε διάλυμα φόρτωσης Laemmli (2x) το οποίο περιέχει 5% μερκαπτοαιθανόλη. Στα ανακτώμενα ανοσοσύμπλοκα έγινε ανάλυση σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης και ανοσοαποτύπωση με πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού έναντι των CBP και WT1. Σε μια δεύτερη σειρά πειραμάτων, πραγματοποιείται κυτταρική λύση και προσδιορισμός της συγκέντρωσης συνολικής πρωτεΐνης με την μέθοδο Bradford όπως περιγράφεται πιο πάνω. Στη συνέχεια δείγματα κυτταρικού λύματος συνολικής πρωτεΐνης ~0,4 mg, επωάζονται για 12 ώρες με 2μg πολυκλωνικού αντί-cbp αντισώματος στους 4 C υπό ήπια ανακίνηση. Στην συνέχεια πραγματοποιείται επώαση των δειγμάτων με εναιώρημα σφαιριδίων σεφαρόζης - πρωτεΐνης Α, τα οποία είχαν προηγουμένως υποστεί πλύση με τροποποιημένο διάλυμα RIPA, στους 4 C για 2 ώρες υπό ήπια ανακίνηση. Η έκλουση των ανοσοσυμπλόκων πραγματοποιείται με βρασμό των σφαιριδίων της σεφαρόζης σε διάλυμα φόρτωσης Laemmli (2x) το οποίο περιέχει 5% 72

91 μερκαπτοαιθανόλη. Στα ανακτώμενα ανοσοσύμπλοκα έγινε ανάλυση σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης και ανοσοαποτύπωση με πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού έναντι των CBP και WT ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ Η κυτταρομετρία ροής είναι μια τεχνική που εκμεταλλεύεται την μέτρηση ορισμένων βιοχημικών και βιοφυσικών παραμέτρων μεμονομένων κυττάρων, όταν αυτά βρίσκονται σε εναιώρημα εντός υγρού που ρέει σε νηματοειδή ροή. Με την χρήση πολυπαραμετρικών δεδομένων από την σκέδαση του φωτός ως αποτέλεσμα της επαφής μιας ακτίνας λέιζερ με το κάθε κύτταρο και της εκπομπής ακτινοβολίας από φθορίζοντα μόρια η τεχνική αυτή μπορεί να δώσει πληροφορίες σχετικά με την έκφραση κυτταροεπιφανειακών ή/και ενδοκυττάριων μορίων. Στην βασική της μορφή, μια συσκευή ανάλυσης κυτταρομετρίας ροής αποτελείται από μία πηγή εκπομπής λέιζερ συγκεκριμένου μήκους κύματος, διαμέσου της οποίας ρέει εναιώρημα κυττάρων. Η επαφή της ακτινοβολίας λέιζερ με κάθε κύτταρο ξεχωριστά έχει ως αποτέλεσμα την σκέδαση του φωτός ανάλογα με τα φυσικά χαρακτηριστικά του κυττάρου, ή/και την απορρόφησή του από φθορίζοντα μόρια με τα οποία έχουν επισημανθεί κάποια συστατικά του κυττάρου. Η εκπομπή ή σκέδαση του φωτός από κάθε κύτταρο ανιχνεύεται είτε από έναν ανιχνευτή ευθυγραμμισμένο με την ακτίνα φωτός, ο οποίος καταγράφει την εμπρόσθια σκέδαση (forward scatter ή FSC), είτε από αριθμό ανιχνευτών τοποθετημένους σε κάθετη διάταξη σε σχέση με την ακτίνα φωτός οι οποίοι καταγράφουν την πλάγια σκέδαση (side scatter ή SSC), καθώς και από έναν ή περισσότερους ανιχνευτές φθορισμού. Οι πληροφορίες που συλλέγονται από τους ανιχνευτές του οργάνου μεταφράζονται με χρήση κατάλληλου λογισμικού στην οθόνη ενός υπολογιστή με μορφή η οποία επιτρέπει την ανάλυση των δεδομένων από τον χρήστη για την εξαγωγή συμπεράσματος. 73

92 Η χρήση κυτταρομετρίας ροής παρέχει την δυνατότητα δύο τύπων μετρήσεων. Ο πρώτος τύπος μέτρησης αφορά στην ποσοτική ανάλυση κάποιου κυτταρικού συστατικού σε έναν κυτταρικό πληθυσμό μέσω σήμανσης ενός κυτταρικού συστατικού (π.χ. ενός μεμβρανικού υποδοχέα ή πυρηνικό DNA) από ειδικό χρωμοφόρο μόριο το οποίο όταν διεγερθεί από ακτινοβολία συγκεκριμένης συχνότητας από την πηγή λέιζερ, εκπέμπει σε συγκεκριμένο μήκος κύματος το οποίο καταγράφεται από τον ανιχνευτή του οργάνου. Ο δεύτερος τύπος μετρήσεων σχετίζεται με την ανάλυση της σκέδασης του φωτός ως αποτέλεσμα της επαφής της ακτίνας λέιζερ με το κύτταρο. Το πρότυπο σκέδασης φέρει διαφορετικά χαρακτηριστικά διάχυσης, διάθλασης και ανάκλασης ανάλογα με κάποια φυσικά χαρακτηριστικά του κυττάρου, όπως το μέγεθος, η πυκνότητα και η ομαλότητα της κυτταρικής μεμβράνης. Ο συνδυασμός των δύο τύπων μέτρησης ονομάζεται πολυπαραμετρικός και επιτρέπει την ταξινόμηση κυττάρων ενός ανομοιογενούς πληθυσμού με βάση οποιοδήποτε από τα προαναφερθέντα βιοχημικά ή φυσικά χαρακτηριστικά των κυττάρων. Τα κύτταρα καλλιεργούνται όπως αναφέρθηκε παραπάνω και ανασηκώνονται από τα δοχεία καλλιέργειας με τη χρήση θρυψίνης. Ακολουθεί έκπλυση με PBS και μέτρηση των κυττάρων. Μετά από εξισορρόπηση των κυττάρων σε ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρομετρίας, τα κύτταρα φυγοκεντρούνται στα 2500 g στους 4 C για 5 λεπτά. Μετά την απομάκρυνση του υπερκειμένου τα κύτταρα επωάζονται για 12 ώρες στους 4 C με την κατάλληλη συγκέντρωση αντισώματος έναντι της ποδοκαλυκίνης, της νεφρίνης, ή του αντιγόνου CALLA σε ρυθμιστικό διάλυμα ή επωάστηκαν με σκέτο ρυθμιστικό διάλυμα. Ακολουθούν εκπλύσεις των κυττάρων με ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρομετρίας και διαδοχικές φυγοκεντρήσεις και επώαση με κατάλληλο αντίσωμα συζευγμένο με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (σε αραίωση 1:1000) για 1 ώρα στους 4 C. Μετά από τρεις επιπλέον εκπλύσεις γίνεται μονιμοποίηση των κυττάρων με 70% αιθανόλη σε PBS. 74

93 Η ανάλυση γίνεται με τη χρήση του λογισμικού Cell Quest του FACScan (Becton Dickinson). Ο φθορισμός καθορίζεται σε μια λογαριθμική κλίμακα 4 τάξεων μεγέθους και το ποσοστό των θετικών κυττάρων από το σύνολο των μετρήσεων υπολογίστηκε από την περιοχή του ιστογράμματος που επιλέχθηκε με τη βοήθεια του δείκτη Μ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ Ο ανοσοφθορισμός είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται με μικροσκόπιο φθορισμού και χρησιμοποιεί την εξειδίκευση των αντισωμάτων έναντι στα αντιγόναστόχους τους με σκοπό την σήμανση συγκεκριμένων βιομορίων εντός του κυττάρου με φθορίζουσες ουσίες και παρατήρησή της διανομής τους εντός του κυττάρου. Στον έμμεσο ανοσοφθορισμό χρησιμοποιούνται δύο αντισώματα: το πρωτογενές δεν είναι σημασμένο και αναγνωρίζει την πρωτεΐνη-στόχο, ενώ το δευτερογενές είναι συζευγμένο με φθορίζον μόριο και αναγνωρίζει το πρωτεογενές αντίσωμα. Για την παρατήρηση των δειγμάτων χρησιμοποιούνται κυρίως μικροσκόπια επιφθορισμού (ευρέος πεδίου) και συνεστιακά μικροσκόπια, αλλά μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλοι τύποι μικροσκοπίων, π.χ. με ικανότητα υπερ-ανάλυσης (super resolution). Το σημαντικότερο πλεονέκτημα του συνεστιακού μικροσκοπίου, έναντι του μικροσκοπίου ευρέος πεδίου, είναι ότι σε αυτό ελαττώνονται κατά πολύ τα μηνύματα από τα μη εστιασμένα σημεία του παρασκευάσματος με αποτέλεσμα να ενισχύονται οι αντιθέσεις (contrast) του παρασκευάσματος. Αυτό το χαρακτηριστικό επιτρέπει τη σάρωση του παρασκευάσματος όχι μόνο ως προς τους άξονες x και y αλλά και ως προς τον z (βάθος) με αποτέλεσμα να παίρνουμε καλά εστιασμένες τρισδιάστατες εικόνες που όμως δεν παρατηρούνται άμεσα, αλλά μέσω υπολογιστή με ειδικά προγράμματα (software) που κάνουν ψηφιοποίηση και ανακατασκευή της εικόνας (187). 75

94 Το συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με ακτίνες laser αποτελείται από: πολλαπλές πηγές φωτός laser, μικροσκόπιο φθορισμού, την κεφαλή σάρωσης με οπτικά και ηλεκτρονικά στοιχεία, ηλεκτρονικό υπολογιστή, λογισμικό και οθόνες για συλλογή, επεξεργασία και ανάλυση της εικόνας. Το laser παρέχει τη φωτεινή δέσμη η οποία υπό τον έλεγχο ηλεκτρονικού υπολογιστή «σαρώνει» το παρασκεύασμα. Η κεφαλή σάρωσης κατευθύνει τα φθορίζοντα σήματα από το παρασκεύασμα σε μία μικρή οπή μεταβλητής διαμέτρου όσο η κεφαλή καρφίτσας (ίριδα ανίχνευσης, pinhole) και τον φωτοπολλαπλασιαστή. Η εικόνα συνεστίασης δεν δημιουργείται στο μικροσκόπιο και μπορούμε να τη δούμε μόνο στην οθόνη του ηλεκτρονικού υπολογιστή. Τα βασικά τμήματα ενός τέτοιου μικροσκοπίου είναι τα ακόλουθα: Φωτεινή πηγή - παρέχει ενέργεια υπό μορφή φωτονίων (laser). Διεγερτικός ηθμός - επιτρέπει τη διέλευση αποκλειστικά της ακτινοβολίας με μήκος κύματος που διεγείρει το φθορίζον μόριο. Πυκνωτής - κατευθύνει και εστιάζει το επιλεγμένο φως που εκπέμπεται από το παρασκεύασμα. Αντικειμενικός φακός - συγκεντρώνει το φως που εκπέμπεται από το παρασκεύασμα. Διχροϊκό κάτοπτρο - επιτρέπει τη διέλευση των επιλεγμένων μηκών κύματος προς μια μόνο κατεύθυνση. Ηθμός φραγμού - επιτρέπει τη διέλευση του φθορισμού μόνο. Προσοφθάλμιος φακός - μεγεθύνει και καθιστά ορατό το φθορισμό του δείγματος. Στην Εικόνα 6 το laser παρέχει την ακτινοβολία διέγερσης, η οποία αφού διέλθει από το διεγερτικό ηθμό αντανακλάται στο διχροϊκό κάτοπτρο και στη συνέχεια μέσω μιας σειράς από οριζόντια και κάθετα, κινούμενα, σαρωτικά κάτοπτρα (μικροσκόπιο) 76

95 προσπίπτει στο δείγμα σημείο προς σημείο. Η φθορίζουσα ουσία στο δείγμα διεγείρεται από την προσπίπτουσα ακτινοβολία και εκπέμπει ακτινοβολία φθορισμού, η οποία μέσω των ίδιων κατόπτρων περνά το διχροϊκό κάτοπτρο και εστιάζεται στην ίριδα ανίχνευσης. Η ύπαρξη της ίριδας ανίχνευσης μας δίνει τη δυνατότητα δημιουργίας οπτικών τομών στο δείγμα, καθώς απορρίπτονται οι ακτίνες που δεν προέρχονται από το σημείο εστίασης. Τελικά, όση ακτινοβολία περάσει το μικρό αυτό άνοιγμα εισέρχεται στον φωτοπολλαπλασιαστή και οπτικοποιείται στον ηλεκτρονικό υπολογιστή (187). Εικόνα 6. Διάταξη μικροσκοπίου φθορισμού. Συνοπτικά, HGEC προσκολλημένα σε καλυπτρίδες μονιμοποιούνται σε διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 3,6% που περιείχε 2% D-σουκρόζη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και εκπλένονται με PBS. Στα πειράματα που έγιναν για τον εντοπισμό της νεφρίνης και της ποδοκαλυκίνης δεν πραγματοποιήθηκε διάνοιξη των μεμβρανών. Ωστόσο στην περίπτωση της CD2AP οι μεμβράνες των κυττάρων έγιναν διαπερατές με τη χρήση διαλύματος HEPES/Triton X-100 (20mM HEPES, 300mM D-σουκρόζη, 50mM NaCl, 3mM MgCl 2, 0.5% Triton X-100) για 5 λεπτά στους 4 o C. Ακολουθεί επώαση με διάλυμα ορού αλόγου (για την νεφρίνη) ή βοός (για την ποδοκαλυκίνη) έτσι ώστε να αποφευχθεί η μη ειδική πρόσδεση του αντισώματος. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για μια νύχτα στους 4 o C με τα αντίστοιχα πρωτογενή αντισώματα. Μετά 77

96 από τρεις εκπλύσεις με PBS οι καλυπτρίδες επωάστηκαν με τα κατάλληλα δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με τη χρωστική Alexa Fluor 488 (μήκος κύματος μέγιστης διέγερσης: 495nm, μήκος κύματος μέγιστης εκπομπής: 519nm) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Σε συγκεκριμένα πειράματα, οι καλυπτρίδες επωάστηκαν με διάλυμα 100nM φαλλαντοΐνης, ώστε να επιτευχθεί χρώση της ινώδους (πολυμερισμένης) ακτίνης. Μετά από εκπλύσεις, οι καλυπτρίδες σταθεροποιήθηκαν με το Vectashield mounting medium (Vector Laboratories) πάνω σε αντικειμενοφόρους πλάκες και αρχικά εξετάστηκαν σε ανάστροφο μικροσκόπιο επιφθορισμού Carl Zeiss, ενώ οι φωτογραφίες λήφθηκαν με τη χρήση της συνεστιακής μικροσκοπίας σε συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με laser κρυπτού-αργού (Bio-Rad MRC 1024ES). 2.7 ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ Η ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης είναι ένας εξειδικευμένος τύπος ανοσοκατακρήμνισης που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών με ειδικές γενωμικές αλληλουχίες στο κύτταρο. Στην τεχνική αυτή, τα κύτταρα κατεργάζονται με φορμαλδεΰδη για τη δημιουργία σταυροσυνδέσεων μεταξύ μορίων (πρωτεΐνες-πρωτεΐνες και DNA-πρωτεΐνες) που βρίσκονται in vivo σε εγγύτητα με τη χρωματίνη. Ακολουθεί κατακερματισμός της χρωματίνης με υπερηχοβόληση και ανοσοκατακρήμνιση με ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει την πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος. Με τον τρόπο αυτό οι DNA ακολουθίες που σταυροσυνδέονται άμεσα ή έμμεσα με συγκεκριμένη πρωτεΐνη είναι εμπλουτισμένες στο ανοσοκατακρηνισμένο δείγμα. Η αντιστροφή των σταυροσυνδέσεων με θέρμανση επιτρέπει την ποσοτική ανάλυση του ανοσοκατακρημνισμένου DNA. Η ποσότητα των ειδικών DNA αλληλουχιών στο δείγμα μάρτυρα και στο ανοσοκατακρημνισμένο δείγμα προσδιορίζεται με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (real time PCR). Η σύγκριση των επιπέδων μεταξύ του δείγματος μάρτυρα και του ανοσοκατακρημνισμένου δείγματος 78

97 παρέχει πληροφορίες σχετικά με το επίπεδο της αλληλεπίδρασης ανάμεσα στην πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος και τις διαφορετικές γενωμικές περιοχές Ανοσοκατακρήμνιση Τα κύτταρα HGEC καλλιεργούνται μέχρι το 85-90% της κατάστασης συμβολής. Οι σταυροσυνδέσεις δημιουργούνται με την προσθήκη διαλύματος φορμαλδεΰδης 1% για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η αντίδραση σταματά με την προσθήκη γλυκίνης σε τελική συγκέντρωση 0,125Μ και τα κύτταρα συλλέγονται από το δοχείο καλλιέργειας παρουσία αναστολέων πρωτεασών. Αφού φυγοκεντρηθούν στα 2000g για 5 λεπτά στους 4 o C, τα κύτταρα λύονται με υποτονικό διάλυμα κυτταρικής λύσης (150mM NaCl, 50mM Tris-HCl, ph 8.0, 5mM EDTA, 1% Triton X-100 και 0,5% ΝΡ-40). Οι πυρήνες συλλέγονται με φυγοκέντρηση στα 12000g για 5 λεπτά στους 4 o C και επαναιωρούνται σε διάλυμα υπερηχοβόλησης (50mM HEPES, 140mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% δεοξυχολικό νάτριο και 0,1% SDS). Τα δείγματα ακολούθως υπερηχοβολούνται με τη χρήση συσκευής υπερήχων (Sonics Vibra-Cell VCX-750, Sonics & Materials Inc.) ώστε η χρωματίνη να κατακερματιστεί σε θραύσματα μέσου μήκους 500 ζευγών βάσεων. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 15000g για 15 λεπτά στους 4 o C ώστε να απομακρυνθεί το δυσδιάλυτο υλικό και το υπερκείμενο επωάζεται με 1,2μg πολυκλωνικού αντισώματος αντι-wt1, 1μg αντισώματος αντι-rna πολυμεράσης ή απουσία αντισώματος για 12 ώρες. Μικρή ποσότητα μη δεσμευμένου DNA (1%) φυλάσσεται ως μάρτυρας του αρχικού κλάσματος. Μετά από την επώαση με το αντίσωμα τα ανοσοσυμπλέγματα συλλέγονται με προσθήκη σφαιριδίων σεφαρόζης - πρωτεΐνης G και επώαση για 2 ώρες στους 4 o C. Το ανοσοκατακρήμνισμα εκπλένεται και τα ανοσοσυμπλέγματα συλλέγονται με διέλευση διαλύματος 1% SDS/100mM NaHCO 3. Ακολουθεί αναστροφή των σταυροσυνδέσεων με θέρμανση (65 o C για 12 ώρες), πέψη των πρωτεϊνών και του RNA με πρωτεϊνάση Κ και RNαση Α, αντίστοιχα, και 79

98 καθαρισμός του DNA μέσω στηλών δέσμευσης DNA. Το έκλουσμα των στηλών υπόκειται σε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωμα αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης επιτρέπει το διαχωρισμό των νουκλεϊκών οξέων ανάλογα με το μέγεθος και το είδος τους (γραμμικό, κυκλικό, υπερελικωμένο). Η ηλεκτροφόρηση γίνεται σε μη αποδιατακτικές συνθήκες και τα νουκλεϊκά οξέα κινούνται προς την άνοδο εξαιτίας του αρνητικού φορτίου των φωσφορικών τους ομάδων. Τα μικρότερα μόρια διέρχονται μέσα από τους πόρους του πηκτώματος ταχύτερα από μεγαλύτερα μόρια.η πυκνότητα της αγαρόζης εξαρτάται από το μέγεθος των μορίων που πρόκειται να αναλυθούν. Μόρια DNA με μέγεθος από 100 ζεύγη βάσεων έως μερικές χιλιάδες ζεύγη βάσεων μπορούν να διαχωριστούν σε πήκτωμα αγαρόζης 1%. Η οπτικοποίηση των ζωνών γίνεται με τη χρήση βρωμιούχου αιθιδίου. Η ουσία αυτή έχει την ικανότητα να παρεμβάλλεται μεταξύ των βάσεων της διπλής έλικας, με αποτέλεσμα η συγκέντρωσή της να αυξάνεται στις ζώνες του DNA κατά την ηλεκτροφόρηση. Επιπροσθέτως, το βρωμιούχο αιθίδιο φθορίζει με αποτέλεσμα να είναι εφικτή η οπτικοποίηση των ζωνών με τη βοήθεια υπεριώδους ακτινοβολίας. Το πήκτωμα αγαρόζης παρασκευάζεται με την προσθήκη 1g αγαρόζης σε 100mL διαλύματος ΤAΕ (Tris-Acetate-EDTA) και θερμαίνεται υπό ανάδευση εώς ότου η αγαρόζη διαλυτοποιηθεί πλήρως. Ακολούθως αφήνεται να ψυχθεί σε θερμοκρασία δωματίου και όταν η θερμοκρασία του διαλύματος είναι μικρότερη από 60 C, αποχύνεται σε ειδικό καλούπι. Όταν ολοκληρωθεί η πήξη, το πήκτωμα μεταφέρεται εντός της συσκευής ηλεκτροφόρησης και επικαλύπτεται με διάλυμα ηλεκτροφόρησης ΤΑΕ. Τα δείγματα αναμιγνύονται με διάλυμα φόρτωσης και τοποθετούνται στα φρεάτια επιστοίβαξης. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σε θερμοκρασία δωματίου με εφαρμοζόμενη τάση 5-10 Volt/cm πηκτώματος. 80

99 2.8 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΟΛΙΚΟΥ RNA Το ολικό RNA απομονώθηκε με τη χρήση του αντιδραστηρίου TRIzol (32, 33). Το ολικό RNA απομονώνεται από κύτταρα καλλιέργειας HGEC με τη μέθοδο ενός σταδίου. Σε αυτή τη μέθοδο το αντιδραστήριο TRIzol, το οποίο είναι ένα μονοφασικό διάλυμα φαινόλης και ισοθειοκυανικού άλατος γουανιδίνης (C 2 H 6 N 4 S), αναστέλλει ισχυρά τη δράση των RNAσων και διασπά τα σύμπλοκα που σχηματίζουν οι νουκλεοπρωτεΐνες αφήνοντας άθικτο το RNA επιτρέποντας με αυτό τον τρόπο την απελευθέρωση του στο διάλυμα. Το άθικτο RNA καθαρίζεται περαιτέρω από τις προσμίξεις με εκχύλιση με φαινόλη-χλωροφόρμιο. Το RNA εκλεκτικά πηγαίνει στην υδατική φάση, ελεύθερο από το DNA και τις πρωτεΐνες και στη συνέχεια καταβυθίζεται εύκολα με ισοπροπανόλη και εκπλένεται με αιθανόλη Απομόνωση RNA Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε πλακίδιο 6 πηγαδιών. Πριν την εκχύλιση του RNA τα κύτταρα εκπλένονται δύο φορές με παγωμένο ρυθμιστικό φωσφορικών (PBS). Προστίθεται 1ml TRIzol σε κάθε θέση και τα κύτταρα συλλέγονται με διαδοχικές αναρροφήσεις και εκρροφήσεις με αυτόματη πιπέττα. Οι κυτταρικές μεμβράνες διαρρηγνύονται μέσω επαναλαμβανόμενων περασμάτων από σύριγγα ινσουλίνης. Στη συνέχεια προστίθεται χλωροφόρμιο, τα δείγματα ανακινούνται και αφήνονται σε ηρεμία για 3 λεπτά στον πάγκο εργασίας. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα g για 15 λεπτά στους 4 o C. Η υπερκείμενη υδατική φάση αποτελεί περίπου το 60% του αρχικού όγκου του TRIzol και συλλέγεται. Προστίθεται ισοπροπανόλη και το μίγμα μετά την προσθήκη αναδεύεται ήπια και αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για λεπτά. Στη συνέχεια φυγοκεντρείται στα g για 10 λεπτά στους 4 C και αφού αφαιρεθεί το υπερκείμενο στο ίζημα προστίθεται 75% κρύα αιθανόλη και το δείγμα αποθηκεύεται για ώρες στους -20 C. Την επόμενη ημέρα το δείγμα φυγοκεντρείται στα 7.500g για 5 λεπτά 81

100 στους 4 C. Μετά την φυγοκέντρηση αφαιρείται το υπερκείμενο και το ίζημα παραμένει για 2-3 λεπτά προκειμένου να στεγνώσει και αναδιαλύεται σε 20μL νερό ελεύθερο ριβονουκλεασών Ποσοτικός προσδιορισμός και έλεγχος της καθαρότητας του ολικού RNA Η καθαρότητα και η συγκέντρωση του απομονωμένου ολικού RNA καθορίστηκε με μέτρηση της οπτικής πυκνότητας του διαλύματος. Σύμφωνα με τον νόμο Beer- Lampert η απορρόφηση φωτός μίας χημικής ένωσης (Absorbance, A) ισούται με το γινόμενο της σταθεράς απόσβεσης της ένωσης σε συγκεκριμένο μήκος κύματος (extinction coefficient, ε) επί την συγκέντρωση της χημικής ένωσης στο διάλυμα (concentration, c) επί το μήκος διαδρομής του φωτός διαμέσου του δείγματος (length, l):. Η οπτική πυκνότητα του διαλύματος στα 260nm επιτρέπει τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του DNA ή RNA στο δείγμα. Οπτική πυκνότητα ίση με 1 αντιστοιχεί σε συγκέντρωση 50 μg/ml διαλύματος DNA ή 40 μg/ml διαλύματος RNA. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας για τα νουκλεϊκά οξέα, τις πρωτεΐνες (κυρίως των αρωματικών αμινοξέων) και άλλων ουσιών όπως φαινόλη, TRIzol κτλ. πραγματοποιείται στα 260nm, 280nm και 230nm αντιστοίχως. Ο λόγος (λ) μεταξύ των οπτικών πυκνοτήτων στα 260nm και στα 280nm δείχνει την καθαρότητα των διαλυμάτων νουκλεϊκών οξέων από υπολείμματα πρωτεϊνών και πρέπει να είναι περίπου 2.0. Ο λόγος μεταξύ των οπτικών πυκνοτήτων στα 260nm και στα 230nm δείχνει την καθαρότητα των διαλυμάτων νουκλεϊκών οξέων από υπολείμματα χημικών ενώσεων που χρησιμοποιούνται κατά την διαδικασία απομόνωσης των νουκλεϊκών οξέων και πρέπει να είναι μεγαλύτερος από 2.0. Μικρότερες τιμές στους ανωτέρω λόγους υποδηλώνουν μη καθαρό διάλυμα και περαιτέρω βήματα καθαρισμού είναι απαραίτητα για την απομόνωση των νουκλεϊκών οξέων. Οι πρωτεΐνες εμποδίζουν τον ακριβή υπολογισμό της συγκέντρωσης του RNA και παρεμποδίζουν την RT-PCR. Ο λόγος Α 260 /Α

101 επηρεάζεται σημαντικά από το ph. H ελάττωση του ph οδηγεί σε χαμηλότερο λόγο Α 260 /Α 280. Για αυτό το λόγο προτείνεται η μέτρηση της απορρόφησης να πραγματοποιείται σε ρυθμιστικό διάλυμα 10mM Tris-ΗCl ph 7.5. Για τη μέτρηση της συγκέντρωσης και της καθαρότητας του RNA με το φασματοφωτόμετρο Nanodrop ND-1000 απαιτούνται 1-2μl δείγματος τα οποία και φορτώνονται στο άκρο μιας ινώδους οπτικής ίνας (ινώδες λήψης). Ένα δεύτερο ινώδες οπτικό καλώδιο έρχεται τότε σε επαφή με το υγρό δείγμα και το υγρό δημιουργεί μια γέφυρα μεταξύ των άκρων των δυο οπτικών ινών. Το κενό ρυθμίζεται στο 1mm. Το μηχάνημα ελέγχεται από το λειτουργικό πρόγραμμα ND-1000 V3.1.0 ενός υπολογιστή, με τον οποίο είναι συνδεδεμένο και τα δεδομένα αποθηκεύονται στον υπολογιστή. Πριν τη μέτρηση του δείγματος το όργανο μηδενίζεται με 1-2 μl ρυθμιστικού διαλύματος με αυτό στο οποίο βρίσκεται το RNA (τυφλό). 2.9 ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ Η αντίστροφη μεταγραφή του αγγελιοφόρου RNA (mrna) προς συμπληρωματικό DNA πραγματοποιήθηκε με το ImProm-II Reverse Transcription System της εταιρίας Promega. Το σύστημα βασίζεται στη δράση της αντίστροφης μεταγραφάσης για την δημιουργία αλύσεων (first-strand DNA) μονόκλωνου συμπληρωματικού DNA (complimentary DNA, cdna) χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο ολικό RNA, συνθετικά μετάγραφα RNA ή mrna με πολυ(α) ουρά. Σε αντίθεση με το ριβοσωμικό RNA (ribosomal RNA, rrna), τα μικρά πυρηνικά RNA (small nuclear RNA, snrna), το μεταφορικό RNA (transfer RNA, trna) και τα μη κωδικά RNA, το mrna των ευκαρυωτικών οργανισμών φέρει μία αλληλουχία 80 με 250 καταλοίπων αδενίνης [πολυ(α) ουρά] στο 3' άκρο του. Κατά την διαδικασία της πολυαδενυλίωσης, το ένζυμο πολυαδενυλική πολυμεράση καταλύει την προσθήκη της πολυαδενυλικής ουράς στο 3' άκρο του mrna. Η προσθήκη της πολυαδενυλικής ουράς έχει σκοπό τη 83

102 σταθεροποίηση και προστασία του μορίου από την δράση ριβονουκλεασών του κυτταροπλάσματος. Υπάρχει πληθώρα πειραματικών τεχνικών που εκμεταλλεύεται την ύπαρξη της πολυαδενυλικής ουράς με σκοπό τον διαχωρισμό του mrna από τα υπόλοιπα είδη RNA του κυττάρου. Στην παρούσα εργασία ως πρότυπο αντίστροφης μεταγραφής χρησιμοποιήθηκε ολικό RNA εκ του οποίου μόνο οι αλληλουχίες mrna μεταγράφηκαν σε cdna με την χρήση των ειδικών ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών δεοξυθυμιδίνης [ολιγο(dt)] σύμφωνα με τις οδηγίες της εταιρίας. Το συγκεκριμένο σύστημα είναι σχεδιασμένο για την σύνθεση cdna από καθαρισμένο RNA. Η απόδοση της σύνθεσης του cdna αυξάνει με την προσθήκη στο μίγμα της αντίδρασης του ανασυνδυασμένου αναστολέα των RNασών RNasin. Σε κατάλληλο όγκο διαλύματος ολικού RNA που περιέχει 1μg RNA προστίθενται 0,5μg εναρκτηρίων ολιγονουκλεοτιδίων θυμίνης. Ακολουθεί επώαση στους 70 o C για 5 λεπτά και ψύξη σε πάγο για 5 λεπτά. Με τη διαδικασία αυτή, θέρμανσης και ψύξης, καταστρέφονται τυχόν συσσωματώματα ή δευτεροταγείς δομές που θα μπορούσαν να εμποδίσουν την έναρξη σχηματισμού του cdna. Στη συνέχεια προστίθεται διάλυμα αντίστροφης μεταγραφής που περιέχει τις κατάλληλες συγκεντρώσεις αντίστροφης μεταγραφάσης, χλωριούχου μαγνησίου, δεοξυριβονουκλεοτιδίων και RNasin σύμφωνα με το πειραματικό πρωτόκολλο της εταιρίας. Το δείγματα μεταφέρονται σε θερμικό κυκλοποιητή και επωάζονται στους 25 ο C για 5 λεπτά και ακολούθως στους 42 ο C για 60 λεπτά. Σε αυτό το στάδιο δρα η αντίστροφη μεταγραφάση και άρα κατασκευάζεται το cdna. Η αντίδραση τερματίζεται με επώαση του δείγματος στους 70 ο C για 15 λεπτά, όπου αποδιατάσσονται τα υβρίδια RNA-cDNA και απενεργοποιείται η αντίστροφη μεταγραφάση. Το cdna είτε χρησιμοποιείται αμέσως στην αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) είτε φυλάσσεται στους -20 ο C. 84

103 2.10 ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ ΣΕ ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟ ΧΡΟΝΟ (QUANTITATIVE REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION, PCR) Με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) είναι δυνατός ο πολλαπλασιασμός μιας περιοχής του DNA, που βρίσκεται ανάμεσα σε δύο τμήματα γνωστής αλληλουχίας βάσεων. Ο πολλαπλασιασμός αυτός επιτυγχάνεται με τη χρήση εναρκτήριων μορίων γνωστής αλληλουχίας βάσεων (εκκινητές), τα οποία είναι συμπληρωματικά ως προς τα άκρα μίας ορισμένης περιοχής του DNA. Αρχικά, το DNA εκμαγείο αποδιατάσσεται σε θερμοκρασία 95 ο C, ακολουθεί υβριδοποίηση των εκκινητών στις κατάλληλες περιοχές και επέκτασή τους με την επίδραση DNA πολυμεράσης, παρουσία δεοξυριβονουκλεοτιδίων, σε κατάλληλες συνθήκες αντίδρασης. Έτσι, συντίθενται νέοι κλώνοι DNA συμπληρωματικοί των αρχικών κλώνων εκμαγείων. Σε αυτό το στάδιο, τα μόρια του DNA υφίστανται ως δίκλωνα μόρια. Νέα σύνθεση επέρχεται με θερμικό διαχωρισμό των δύο κλώνων, ανασύνδεση των εκκινητών στο DNA, ψύξη του μίγματος σε κατάλληλη θερμοκρασία και επέκταση των εκκινητών με επίδραση της DNA πολυμεράσης. Κάθε τέτοια επανάληψη αποτελεί και έναν κύκλο της PCR. Κάθε νέος κλώνος που συντίθεται αποτελεί εκμαγείο για τη σύνθεση νέου DNA με αποτέλεσμα τα αντίγραφα της αρχικής περιοχής του DNA να αυξάνονται εκθετικά ανά κύκλο. H ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου είναι μια γρήγορη, αξιόπιστη και ευαίσθητη μέθοδος, η οποία επιτρέπει την ποσοτικοποίηση συγκεκριμένων αλληλουχιών-στόχων. Καθ' όλη τη διάρκεια της αντίδρασης μετράται η ποσότητα του παραγόμενου προϊόντος μέσω της παρακολούθησης της αύξησης του φθορισμού κάποιας φθορίζουσας ουσίας που δεσμεύεται στο DNA. Η αύξηση του σήματος φθορισμού είναι ανάλογη του συντιθέμενου προϊόντος και σχετίζεται άμεσα με την ποσότητα του αρχικού υποστρώματος. Ο φθορισμός μετράται σε κάθε κύκλο της PCR, με αποτέλεσμα να προκύπτει μια καμπύλη ενίσχυσης (amplification plot). Η καμπύλη ενίσχυσης 85

104 διακρίνεται σε τρεις φάσεις: την εκθετική, τη γραμμική και τη φάση κορεσμού. Κατά την εκθετική φάση (exponential phase), σε κάθε κύκλο της αντίδρασης πραγματοποιείται ακριβής διπλασιασμός του προϊόντος, καθώς όλα τα απαραίτητα για την PCR συστατικά (π.χ. dntps, εκκινητές, πολυμεράση) βρίσκονται σε περίσσεια. Καθώς συνεχίζεται η αντίδραση, επέρχεται η γραμμική (linear) φάση κατά την οποία κάποια από τα αντιδραστήρια αρχίζουν να εξαντλούνται. Στη συγκεκριμένη φάση, η αντίδραση της ενίσχυσης επιβραδύνεται, καθώς μειώνεται η αποδοτικότητα της και τελικά σταματάει εντελώς, οπότε η καμπύλη φθορισμού φτάνει σε σημείο κορεσμού (plateau). To σήμα στη Real Time PCR ανιχνεύεται στην εκθετική φάση της αντίδρασης και όχι με ανάλυση "τελικού σημείου", όπως συμβαίνει με τη συμβατική μέθοδο PCR. Ως αναλυτικό σήμα καταγράφεται η τιμή Ct (threshold cycle). Πρόκειται για τον αριθμό των κύκλων της αντίδρασης ενίσχυσης που απαιτούνται ώστε η τιμή του παρατηρούμενου φθορισμού να υπερβεί ένα συγκεκριμένο ουδό (threshold). Η τιμή του ουδού αυτού ορίζεται πάνω από την αντίστοιχη του μη-ειδικού σήματος (background). Η τιμή Ct είναι αντιστρόφως ανάλογη της αρχικής ποσότητας του υποστρώματος: όσο μικρότερη είναι η τιμή Ct τόσο υψηλότερη είναι η συγκέντρωση του αρχικού υποστρώματος (135, 194) Ποσοτική PCR Στην παρούσα μελέτη, η αντίδραση πραγματοποιήθηκε με χρήση της φθορίζουσας ουσίας SYBR Green Ι. H SYBR Green I είναι μια ασύμμετρη χρωστική κυανίνης η οποία χρησιμοποιείται ως ασφαλέστερη και πιο ισχυρή εναλλακτική λύση σε σχέση με το βρωμιούχο αιθίδιο. Η χρωστική SYBR Green I προσδένεται ισχυρά με μη ειδικό τρόπο στην μικρή έλικα δίκλωνου DNA. Έχει μέγιστο απορρόφησης και εκπομπής στα 497nm και 520nm αντιστοίχως. Όπως συμβαίνει και με το βρωμιούχο αιθίδιο, η ένταση φθορισμού της αυξάνεται σημαντικά κατά την πρόσδεσή της στο DNA, με αποτέλεσμα να επιτρέπει την ανίχνευση συσσώρευσης δίκλωνου προϊόντος κατά την 86

105 αντίδραση σε πραγματικό χρόνο καθώς ο φθορισμός της SYBR Green I μεταβάλλεται ανάλογα με το στάδιο της αντίδρασης. Συγκεκριμένα, κατά το στάδιο της αποδιάταξης, τα μόρια του DNA που συμμετέχουν στην αντίδραση είναι μονόκλωνα με αποτέλεσμα ο φθορισμός να ελαττώνεται. Κατά το στάδιο του υβριδισμού οι εκκινητές προσδένονται στις συμπληρωματικές τους θέσεις στην αλληλουχία στόχο με αποτέλεσμα την δημιουργία δίκλωνου DNA, όπου η χρωστική μπορεί να προσδεθεί οδηγώντας στην αύξηση του φθορισμού η οποία συνεχίζεται καθώς η ποσότητα δίκλωνου DNA αυξάνεται κατά το στάδιο της επιμήκυνσης όπου και μεγιστοποιείται για τον συγκεκριμένο κύκλο. Η μεταβολή του σήματος φθορισμού από την SYBR Green I ανάλογα με το στάδιο της αντίδρασης απεικονίζεται σε πραγματικό χρόνο στην καμπύλη ενίσχυσης σήματος (amplification plot) μέσω του ειδικού λογισμικού του συστήματος. Με βάση τα δεδομένα της καμπύλης αυτής γίνεται δυνατή η ποσοτικοποίηση του αρχικού αριθμού αντιγράφων της αλληλουχίας-στόχου με βάση το Ct. Η μέθοδος εφαρμόστηκε για να μελετηθούν τα επίπεδα των μεταγράφων διαφόρων ποδοκυτταρικών δεικτών σε διαφορετικές συγκεντρώσεις γλυκόζης, καθώς και ο εμπλουτισμός στην πρόσδεση του WT1 στους υποκινητές των γονιδίων της ποδοκαλυκίνης και της νεφρίνης. Ως γονίδιο ελέγχου χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο της αφυδρογονάσης της 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (GAPDH), η οποία εκφράζεται σταθερά από τα κύτταρα και τους ιστούς (ιδιοσυστατικό γονίδιο - housekeeping gene). Επειδή η SYBR Green I προσδένεται αδιακρίτως σε δίκλωνο DNA, πρέπει να δοθεί ιδιαίτερη προσοχή σε ψευδείς μετρήσεις φθορισμού προερχόμενες από μή ειδικά προϊόντα της αντίδρασης. Εκτός από τον πολύ προσεκτικό σχεδιασμό των εκκινητών όπως περιγράφεται πιο κάτω, η χρήση της SYBR Green I σε συνδυασμό με το λογισμικό του κυκλοποιητή Mx3000P παρέχει την δυνατότητα ελέγχου καθαρότητας των προϊόντων της αντίδρασης μέσω της καμπύλης αποδιάταξης (dissociation curve). Κατά 87

106 την διαδικασία δημιουργίας της καμπύλης αποδιάταξης, τα δείγματα της PCR υπόκεινται σε σταδιακή αύξηση της θερμοκρασίας από τους 55 C στους 95 C. Η ένταση φθορισμού μετράται συνεχώς σε αυτό το στάδιο. Αυξανομένης της θερμοκρασίας, τα προϊόντα κάθε δείγματος αποδιατάσσονται ανάλογα με την σύνθεσή τους (διαφορετικά σημεία τήξης Τm). Αν υπάρχουν μη ειδικά προϊόντα ή διμερή εκκινητών, θα αποδιαταχθούν σε διαφορετική θερμοκρασία από τα ειδικά προϊόντα της PCR. Με αυτόν τον τρόπο, μελετώντας τις κορυφές του διαγράμματος αποδιάταξης, μπορεί να καθοριστεί ο αριθμός και η σύνθεση (ειδικά ή μη ειδικά) των προϊόντων κάθε κύκλου PCR. Το συγκεκριμένο σύστημα παρέχει επίσης ειδική χρωστική αναφοράς (Rox) με μέγιστο απορρόφησης και εκπομπής στα 584nm και 612nm αντιστοίχως. Η ένταση φθορισμού της χρωστικής αναφοράς παραμένει σταθερή καθόλη την διάρκεια της αντίδρασης και εξαρτάται μόνο από την ποσότητά της στο δείγμα, αποτελώντας έτσι σημείο αναφοράς για την κανονικοποίηση διακυμάνσεων του φθορισμού μεταξύ δειγμάτων διαφορετικού όγκου. Οι συνθήκες για τις αντιδράσεις PCR που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι ακόλουθες: Ένα βήμα αποδιάταξης για 10 λεπτά στους 95 C, ακολουθούμενο από 50 κύκλους θερμικής εναλλαγής, που περιλάμβαναν φάση αποδιάταξης (95 C/30 sec), φάση υβριδισμού (58 C/30sec) και φάση επιμήκυνσης (72 C/45 sec). Κατά τις αντιδράσεις χρησιμοποιήθηκαν οι ειδικοί συνθετικοί ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές (Metabion, Martinsried, Γερμανία) όπως φαίνονται στον Πίνακα 6. 88

107 Πίνακας 6. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα ποσοτικής αντίδρασης πολυμεράσης. Γονίδιο/Γενωμική Προσανατολισμός Αλληλουχία (5'-3') περιοχή podxl Κωδικός CTGAAGGACAAATGGGATG Αντικωδικός ACGATGGTGATGATGAGG nphs1 Κωδικός AGTTCTGCCACCCTCCAC Αντικωδικός GCTGATGCTGACAAGTTGAATG tjp1 Κωδικός TGAAAAATGGCTTCGGGGCAAG Αντικωδικός TCTCAAACGGCTGGTGGCAATC Υποκινητής podxl Κωδικός TTAATAGATTGGCACAGTTAGG Αντικωδικός GAGAGAAGTTTGGAGAAATACC Υποκινητής nphs1 Κωδικός CGCCCAGTCTCTTTATCTTTC Αντικωδικός GACAAGGAGCAGGAGTGAG gapdh Κωδικός GAGTCCACTGGCGTCTTC Αντικωδικός GCATTGCTGATGATCTTGAGG Σχετική ποσοτικοποίηση (Real-Time Relative qrt-pcr) Με τη σχετική ποσοτικοποίηση προσδιορίζονται οι αλλαγές των επιπέδων του mrna ενός γονιδίου σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης ενός εσωτερικού γονιδίου αναφοράς. Συνεπώς το επίπεδο έκφρασης όλων των δειγμάτων εκφράζεται σαν λόγος ως προς το γονίδιο αναφοράς και εν συνεχεία συγκρίνονται οι λόγοι για τα επίπεδα του ίδιου μεταγράφου στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας. Το γονίδιο αναφοράς συνήθως είναι ένα ιδιοσυστατικό (housekeeping) γονίδιο. Τα ιδιοσυστατικά γονίδια είναι παρόντα σε όλα τα γονιδιώματα, αφού είναι υπεύθυνα για ζωτικές λειτουργίες του κυττάρου. Η σύνθεση mrna αυτών των γονιδίων θεωρείται ότι παραμένει σταθερή ανεξάρτητα από τις συνθήκες στις οποίες εκτίθεται το κύτταρο, γι αυτό και χρησιμοποιούνται για τη μελέτη της έκφρασης γονιδίων κάτω από διάφορες συνθήκες. Όπως αναφέρθηκε, στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο της GAPDH ως γονίδιο αναφοράς. Η σχετική ποσοτικοποίηση βασίζεται στο λόγο των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου-στόχο 89

108 ως προς το γονίδιο αναφοράς. Για το υπολογισμό αυτού του λόγου κυρίως εφαρμόζεται η μέθοδος του 2 -ΔΔCt. Η μέθοδος αυτή είναι κατάλληλη για αντιδράσεις με παρεμφερή τιμή απόδοσης (efficiency, E), καθώς δεν περιλαμβάνει εξομάλυνση των αποδόσεων. Οι λόγοι έκφρασης υπολογίζονται από την εξίσωση, όπου ΔCt,sample είναι η διαφορά στην τιμή Ct μεταξύ του γονιδίου στόχου και του ιδιοσυστατικού γονιδίου GAPDH για ένα συγκεκριμένο πειραματικό δείγμα, και ΔCt,control είναι η διαφορά στην τιμή Ct μεταξύ του γονιδίου στόχου και του ιδιοσυστατικού γονιδίου GAPDH για ένα δείγμα αναφοράς (153). Άλλα μαθηματικά μοντέλα προβλέπουν εξομάλυνση των αποδόσεων των διαφορετικών αντιδράσεων (70). Θεωρητικά, μετά από κάθε κύκλο της αντίδρασης ο αριθμός των μορίων που χρησιμοποιούνται ως εκμαγεία διπλασιάζεται. Ως απόδοση μιας αντίδρασης ορίζεται ο λόγος του αριθμού των μορίων στον κύκλο ν+1 προς τον αριθμό των μορίων στον κύκλο ν (215). Εξ ορισμού μια αντίδραση με απόδοση 100% θα έχει Ε=2. Για τον υπολογισμό της τιμής του Ε στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε η κλίση (slope) μιας πρότυπης καμπύλης και η εξίσωση E =10-1/slope (70). Η τιμή Ε για το κάθε γονίδιο εισήχθη στο λογισμικό του κυκλοποιητή Mx3000P και με βάση την τιμή αυτή έγινε ο σχετικός υπολογισμός για τα επίπεδα του κάθε μεταγράφου ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε κατ' ελάχιστον 4 φορές. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται ως μέσοι όροι ± τυπικό σφάλμα. Για τη σύγκριση των μέσων όρων των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε η ανάλυση διασποράς ενός παράγοντα (analysis of variance, ANOVA). Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε η εκ των υστέρων δοκιμασία Newman-Keuls για τη σύγκριση των τιμών επιλεγμένων δειγμάτων. Η ανάλυση έγινε με τη χρήση των λογισμικών SPSS και GraphPad Prism. 90

109 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΤΩΣΕΩΝ ΥΨΗΛΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΓΛΥΚΟΖΗΣ ΣΤΟΥΣ ΔΕΙΚΤΕΣ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ Προσωρινή καλλιέργεια των HGEC σε υψηλά επίπεδα γλυκόζης οδηγούν σε αντιστρεπτή αυξορρύθμιση της πρωτεϊνικής έκφρασης της βιμεντίνης Η βιμεντίνη είναι ένας καλά χαρακτηρισμένος μεσεγχυματικός δείκτης και θεωρείται ένας σημαντικός δείκτης αποδιαφοροποίησης (75) και τραυματισμού των ποδοκυττάρων (318). Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, τα HGEC που καλλιεργούνται σε 25mM γλυκόζης παρουσιάζουν σχεδόν πλήρη καταστολή ποδοκαλυκίνης σε σύγκριση με τα HGEC που καλλιεργούνται παρουσία 5mM γλυκόζης (63). Με βάση αυτό το γεγονός, εξετάστηκε αν αυτή η μεταβολή μπορεί να αποδοθεί σε απορρύθμιση του ποδοκυτταρικού φαινοτύπου, όπως αυτή διαφαίνεται από αυξημένη έκφραση της βιμεντίνης. Ανάλυση κατά Western έδειξε ότι η έκφραση της βιμεντίνης είναι αυξημένη στα κύτταρα που καλλιεργούνται παρουσία 25mM γλυκόζης (Σχήμα 1Α, διαδρομή 2 και Σχήμα 1Β). Τα αυξημένα επίπεδα βιμεντίνης παρατηρήθηκαν στις 6 εβδομάδες καλλιέργειας σε υψηλά επίπεδα γλυκόζης (Σχήμα 1Α, διαδρομή 4 και Σχήμα 1Β), ενώ τα μέγιστα επίπεδα της έκφρασης παρατηρήθηκαν μετά από 18 εβδομάδες καλλιέργειας (με διαδοχικές ανακαλλιέργειες) σε 25mM γλυκόζης (Σχήμα 1Α, διαδρομή 5 και Σχήμα 1Β), γεγονός που υπονοεί ότι η ρύθμιση των ποδοκυτταρικών χαρακτηριστικών συμβαίνει σταδιακά με την πάροδο του χρόνου. Με σκοπό να καθοριστούν τα χρονικά σημεία στα οποία συμβαίνουν οι μεταβολές της βιμεντίνης και άλλων σημαντικών για τα ποδοκύτταρα μορίων, τα HGEC καλλιεργούνται παρουσία 25mM γλυκόζης για 1, 2, 3, 4, 6 και 18 εβδομάδες. Από αυτή τη χρονική πορεία επελέγησαν ένα πρώιμο (6 εβδομάδες) και ένα όψιμο (18 εβδομάδες) χρονικό σημείο με σκοπό να διερευνηθεί αν η επίδραση της γλυκόζης στα κύτταρα είναι αντιστρεπτή. Το πρώιμο χρονικό σημείο επελέγη επειδή δηλοποιεί σημαντική αύξηση των επιπέδων της βιμεντίνης και το όψιμο χρονικό σημείο 91

110 επελέγη επειδή σε αυτό η μεταβολή αυτή είναι η μέγιστη. Επομένως, εξετάστηκε αν οι παρατηρούμενες αλλαγές στην έκφραση της βιμεντίνης μπορούν να ανατραπούν με μεταφορά των κυττάρων παρουσία φυσιολογικών επιπέδων γλυκόζης (5mM) μετά το πρώιμο ή όψιμο χρονικό σημείο. Τα HGEC που καλλιεργήθηκαν για 6 εβδομάδες ή 18 εβδομάδες σε 25mM γλυκόζης μεταφέρθηκαν σε καλλιέργεια με παρουσία 5mM γλυκόζης για 4 επιπλέον εβδομάδες. Και για τα δύο χρονικά σημεία η βιμεντίνη επανέρχεται σε φυσιολογικά χαμηλότερα επίπεδα (Σχήμα 1Α, διαδρομές 6 και 7 και Σχήμα 1Β) In vitro καλλιέργεια των HGEC παρουσία υψηλών επιπέδων γλυκόζης οδηγεί σε μόνιμη μειορρύθμιση της έκφρασης του CD10/CALLA Εξετάστηκε αν η έκφραση του CD10/CALLA με τρόπο παρόμοιο με τη βιμεντίνη. Πειράματα κυτταρομετρίας ροής έδειξαν ότι τα φυσιολογικά ποδοκύτταρα εκφράζουν CD10/CALLA (Σχήμα 1Γ). Αντίθετα, τα κύτταρα που καλλιεργούνται σε υψηλά επίπεδα γλυκόζης παρουσιάζουν μειωμένα κυτταροεπιφανειακά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης (Σχήμα 1Γ, πλαίσιο "25mM" και Σχήμα 1Δ). Η σημαντική μείωση των κυτταροεπιφανειακών επιπέδων του CD10/CALLA καθιερώνεται μετά από 2 εβδομάδες καλλιέργειας σε 25mM γλυκόζης (Σχήμα 1Γ, πλαίσιο "5-25mM/2wk" και Σχήμα 1Δ) και τα επίπεδα παραμένουν μειορρυθμισμένα ακόμη και 18 εβδομάδες καλλιέργειας σε 25mM γλυκόζης (Σχήμα 1Γ, πλαίσιο "5-25mM/18wk" και Σχήμα 1Δ). Τα κυτταροεπιφανειακά επίπεδα του CD10/CALLA παραμένουν σημαντικά ελαττωμένα μετά από έκθεση των κυττάρων που δεν εκφράζουν ποδοκαλυκίνη σε φυσιολογικά επίπεδα γλυκόζης για 18 εβδομάδες (Σχήμα 1Γ, πλαίσιο "25-5mM/18wk" και Σχήμα 1Δ). Ακολούθως, εξετάστηκε αν η παρατηρούμενη μειορρύθμιση μπορεί να ανατραπεί μετά το πρώιμο (6 εβδομάδες) ή μετά το όψιμο (18 εβδομάδες) χρονικό σημείο σε κύτταρα που μεταφέρονται σε 5mM γλυκόζης. Και για τα δύο χρονικά σημεία το CD10/CALLA 92

111 παραμένει μειωμένο, υποδεικνύοντας μια μόνιμη, επαγόμενη από τη γλυκόζη, μειορρύθμιση της έκφρασής του. 93

112 Σχήμα 1. Έκφραση της βιμεντίνης και του CD10/CALLA στα ποδοκύτταρα. Α. Ανοσοαποτύπωση κατά Western της έκφρασης της βιμεντίνης στα HGEC. Ολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από κύτταρα που καλλιεργούνταν σε 5mM (διαδρομή 1) ή 25mM γλυκόζη (διαδρομή 2). Διαδρομή 3: έκφραση της βιμεντίνης σε HGEC που καλλιεργούνταν συνεχώς σε 25mM γλυκόζης και μεταφέρθηκαν σε 5mM γλυκόζης για 18 εβδομάδες (HGEC:25-5mM/18w), διαδρομές 4 και 5: έκφραση της βιμεντίνης σε HGEC που καλλιεργούνταν συνεχώς σε 5mM γλυκόζης και μεταφέρθηκαν σε 25mM γλυκόζης για 6 και 18 εβδομάδες αντίστοιχα (HGEC:5-25mM/6w και HGEC:5-25mM/18w), διαδρομές 6 και 7: έκφραση της βιμεντίνης σε HGEC που καλλιεργούνταν σε 25mM γλυκόζης για 6 ή 18 εβδομάδες και μεταφέρθηκαν σε 5mM γλυκόζης για 4 εβδομάδες, αντίστοιχα (HGEC:25mM/6w-5mM/4w και HGEC:25mM/18w-5mM/4w). Για την ποσοτικοποίηση χρησιμοποιήθηκε η ζώνη στα 57kDa. Οι μεμβράνες εκδύθηκαν και επανεπωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της τουμπουλίνης για την επιβεβαίωση του πρωτεϊνικού φορτίου. Β. Η πυκνομετρική ανάλυση έγινε με κανονικοποίηση έναντι των ποσοτήτων της τουμπουλίνης. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με ανάλυση διασποράς (ANOVA). Γ. Αντιπροσωπευτικά πειράματα κυτταρομετρίας ροής για την κυτταροεπιφανειακή έκφραση του CD10/CALLA. Οι έντονες γκρίζες γραμμές αντιπροσωπεύουν τα HGEC:5mM (μάρτυρας), οι λεπτές γκρίζες γραμμές αντιπροσωπεύουν τον αρνητικό μάρτυρα (αντίσωμα ελέγχου του ισοτύπου) και οι μαύρες γραμμές αντιπροσωπεύουν την συνθήκη καλλιέργειας, όπως αναγράφεται στο αντίστοιχο πλαίσιο. Δ. Τα ποσοστά των CD10/CALLA θετικών κυττάρων υπολογίστηκαν για το τμήμα του ιστογράμματος που σημειώνεται ως Μ1. **Ρ<0.01 σε σχέση με τα HGEC:5mM. 3.2 ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΤΩΣΕΩΝ ΥΨΗΛΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΓΛΥΚΟΖΗΣ ΣΤΟΥΣ ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΟΥΣ ΑΠΟ ΤΟΝ WT1 ΠΟΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥΣ ΔΕΙΚΤΕΣ Καταστολή της έκφρασης της ποδοκαλυκίνης στα HGEC Τα HGEC που καλλιεργούνται υπό τη συνεχή παρουσία 5mM γλυκόζης (φυσιολογικά επίπεδα) εκφράζουν ποδοκαλυκίνη (Σχήμα 2Α, διαδρομή 1 και Σχήμα 2Β) (63). Τα επίπεδα τόσο του μεταγράφου όσο και της πρωτεΐνης είναι έντονα μειωμένα μετά από 14 εβδομάδες καλλιέργειας των κυττάρων σε 25mM γλυκόζης (Σχήμα 2Α, διαδρομή 6 και Σχήμα 2Β). Αντίθετα, τα HGEC που καλλιεργούνται υπό τη συνεχή 94

113 παρουσία 25mM γλυκόζης (υψηλά -διαβητικά- επίπεδα) δεν εκφράζουν ποδοκαλυκίνη (Σχήμα 2Α, διαδρομή 2 και Σχήμα 2Β). Πειράματα που πραγματοποιήθηκαν με L- γλυκόζη έδειξαν ότι η μειορύθμιση αυτή δεν οφείλεται σε οσμωτικά φαινόμενα. Με σκοπό να εξεταστεί αν η αποκατάσταση των επιπέδων της ποδοκαλυκίνης είναι μια αντίστοιχα αργή διαδικασία, τα κύτταρα που δεν εκφράζουν ποδοκαλυκίνη εκτέθηκαν σε φυσιολογικά επίπεδα γλυκόζης (5mM). Πειράματα ανοσοαποτύπωσης (Σχήμα 2Α και 2Β) και αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Σχήμα 2Γ) δείχνουν ότι μετά από 12 εβδομάδες καλλιέργειας σε 5mM γλυκόζης, τα επίπεδα της ποδοκαλυκίνης δεν έχουν αποκατασταθεί. Επομένως, η αποκατάσταση των φυσιολογικών επιπέδων γλυκόζης είναι μια παρατεταμένη διαδικασία. 95

114 Σχήμα 2. Έκφραση της ποδοκαλυκίνης στα ποδοκύτταρα. Α. Ανοσοαποτύπωση κατά Western για την έκφραση της ποδοκαλυκίνης στα ποδοκύτταρα (HGEC). Προετοιμάστηκαν εκχυλίσματα ολικής πρωτεΐνης από κύτταρα που καλλιεργήθηκαν είτε υπό τη συνεχή παρουσία 5mM γλυκόζης (διαδρομή 1) ή 25mΜ γλυκόζης (διαδρομή 2). Διαδρομές 3-5: έκφραση της ποδοκαλυκίνης σε HGEC που καλλιεργούνταν συνεχώς σε 25mM γλυκόζης και μεταφέρθηκαν σε 5mM γλυκόζης για 12, 20 και 24 εβδομάδες αντίστοιχα (HGEC:25-5mM/12w, HGEC:25-5mM/20w και HGEC:25-5mM/24w), διαδρομή 6: έκφραση της ποδοκαλυκίνης σε HGEC που καλλιεργούνταν συνεχώς σε 5mM γλυκόζης και μεταφέρθηκαν σε 25mM γλυκόζης για 14 εβδομάδες (HGEC:5-25mM/14w). Ίσες ποσότητες συνολικής πρωτεΐνης αναλύθηκαν στην ηλεκτροφόρηση και ανοσοαποτυπώθηκαν με αντίσωμα έναντι της ποδοκαλυκίνης. Οι μεμβράνες επανεπωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της τουμπουλίνης για την επιβεβαίωση του πρωτεϊνικού φορτίου. Β. Η πυκνομετρική ανάλυση έγινε με κανονικοποίηση έναντι των ποσοτήτων της τουμπουλίνης. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση από 4 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με ανάλυση διασποράς (ANOVA). Λευκές ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 5mM γλυκόζης, σκιασμένες ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 25mM γλυκόζης. ***Ρ<0.001, **Ρ<0.01 με βάση την ANOVA. Γ. Ανάλυση με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου για την έκφραση του μεταγράφου της ποδοκαλυκίνης στα HGEC. Η έκφραση της ποδοκαλυκίνης μετρήθηκε σε HGEC που καλλιεργούνταν στις ως άνω συνθήκες. Η GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς (ιδιοσυστατικό). Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση από 4 ανεξάρτητα πειράματα. Λευκές ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 5mM γλυκόζης, σκιασμένες ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 25mM γλυκόζης. ***Ρ<0.001, *Ρ<0.05 με βάση την ANOVA Η επαγόμενη από τη γλυκόζη μειορρύθμιση της έκφρασης της ποδοκαλυκίνης είναι μόνο εν μέρει αναστρέψιμη Εφόσον τα HGEC:25mM παρουσιάζουν μόνιμη καταστολή της έκφρασης της ποδοκαλυκίνης, πραγματοποιήθηκε δοκιμασία για την πορεία της καταστολής ώστε να διαπιστωθεί το χρονικό σημείο στο οποίο λαμβάνει χώρα η ρύθμιση. Πειράματα ανοσοαποτύπωσης δείχνουν ότι η επαγόμενη από τη γλυκόζη ελάττωση της ποδοκαλυκίνης αρχικά παρατηρείται μετά από 2 εβδομάδες καλλιέργειας σε υψηλά 96

115 επίπεδα (25mM) γλυκόζης (HGEC:5-25mM/2w) και η μέγιστη καταστολή παρατηρείται μετά από 18 εβδομάδες καλλιέργειας στις συνθήκες αυτές (HGEC:5-25mM/18w) (Σχήμα 3Α, διαδρομές 4-7 και Σχήμα 3Β). Ο βαθμός της ελάττωσης είναι στατιστικά σημαντικός για τα HGEC:5-25mM/2w και HGEC:5-25mM/6w, αλλά τα επίπεδα της πρωτεΐνης σε αυτά τα χρονικά σημεία παραμένουν υψηλότερα από αυτά στα HGEC:25mM (Σχήμα 3Α, διαδρομές 5-6 και Σχήμα 3Β). Στα HGEC:5-25mM/18w, η πρωτεϊνική έκφραση παρουσιάζει το μεγαλύτερο βαθμό καταστολής (Σχήμα 3Α, διαδρομή 7 και Σχήμα 3Β). Αντίστοιχα αποτελέσματα ελήφθησαν και για τα κυτταροεπιφανειακά επίπεδα της ποδοκαλυκίνης, όπως αυτά μετρήθηκαν με πειράματα ανοσοφθορισμού και κυτταρομετρίας ροής (Σχήμα 4). Σε ό,τι αφορά τα κύτταρα που καλλιεργήθηκαν για 6 εβδομάδες (πρώιμο χρονικό σημείο) σε 25mM γλυκόζης και μεταφέρθηκαν σε καλλιέργεια με παρουσία 5mM γλυκόζης για 4 επιπλέον εβδομάδες (HGEC:25mM/6w- 5mM/4w), τα επίπεδα της ποδοκαλυκίνης αποκαθίστανται ούτως ώστε δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά με τα HGEC:5mM (Σχήμα 3Α, διαδρομή 8 και Σχήμα 3Β). Αντίθετα, στα κύτταρα που μεταφέρθηκαν σε φυσιολογικά επίπεδα γλυκόζης για το ίδιο χρονικό διάστημα μετά το όψιμο χρονικό σημείο των 18 εβδομάδων (HGEC:25mM/18w-5mM/4w) δεν παρατηρήθηκε επαναφορά των επιπέδων της ποδοκαλυκίνης (Σχήμα 3Α, διαδρομή 9 και Σχήμα 3Β). Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν και με απεικονιστική μέθοδο και κυτταρομετρία ροής (Σχήμα 4). 97

116 Σχήμα 3. Δοκιμασία χρόνου για την έκφραση της ποδοκαλυκίνης στα ποδοκύτταρα. Α. Ανοσοαποτύπωση κατά Western για την έκφραση της ποδοκαλυκίνης στα ποδοκύτταρα (HGEC). Προετοιμάστηκαν εκχυλίσματα ολικής πρωτεΐνης από κύτταρα που καλλιεργήθηκαν είτε υπό τη συνεχή παρουσία 5mM γλυκόζης (διαδρομή 1) ή 25mΜ γλυκόζης (διαδρομή 2). Διαδρομή 3: έκφραση της ποδοκαλυκίνης σε HGEC που καλλιεργούνταν συνεχώς σε 25mM γλυκόζης και μεταφέρθηκαν σε 5mM γλυκόζης για 18 εβδομάδες (HGEC:25-5mM/18w), διαδρομές 4-7: έκφραση της ποδοκαλυκίνης σε HGEC που καλλιεργούνταν συνεχώς σε 5mM γλυκόζης και μεταφέρθηκαν 98

117 σε 25mM γλυκόζης για 1, 2, 6 και 18 εβδομάδες αντίστοιχα (HGEC:5-25mM/1w, HGEC:5-25mM/2w, HGEC:5-25mM/6w και HGEC:5-25mM/18w), διαδρομές 8 και 9: έκφραση της ποδοκαλυκίνης σε HGEC που καλλιεργούνταν σε 25mM γλυκόζης για 6 ή 18 εβδομάδες και μεταφέρθηκαν σε 5mM γλυκόζης για 4 εβδομάδες, αντίστοιχα (HGEC:25mM/6w-5mM/4w και HGEC:25mM/18w-5mM/4w). Ίσες ποσότητες συνολικής πρωτεΐνης αναλύθηκαν στην ηλεκτροφόρηση και ανοσοαποτυπώθηκαν με αντίσωμα έναντι της ποδοκαλυκίνης. Οι μεμβράνες επανεπωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της τουμπουλίνης για την επιβεβαίωση του πρωτεϊνικού φορτίου. Β. Η πυκνομετρική ανάλυση έγινε με κανονικοποίηση έναντι των ποσοτήτων της τουμπουλίνης. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση από 4 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με ανάλυση διασποράς (ANOVA). Λευκές ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 5mM γλυκόζης, σκιασμένες ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 25mM γλυκόζης. *Ρ<0.05, **Ρ<0.01 σε σχέση με τα HGEC:5mM, #P<0.05 σε σχέση με τα HGEC:25mM με βάση την ANOVA. 99

118 Σχήμα 4. Κυτταροεπιφανειακή έκφραση της ποδοκαλυκίνης στα ποδοκύτταρα. Α. Ανάλυση συνεστιακής μικροσκοπίας (x600) για την κατανομή της ποδοκαλυκίνης στα HGEC. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και επωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της ποδοκαλυκίνης και με συζευγμένο με το φθορίζον μόριο Alexa Fluor 488 δευτερογενές αντίσωμα. Β. Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για την κυτταροεπιφανειακή έκφραση της ποδοκαλυκίνης στα ποδοκύτταρα. Οι έντονες γκρίζες γραμμές 100

119 αντιπροσωπεύουν τα HGEC:5mM (μάρτυρας), οι λεπτές γκρίζες γραμμές αντιπροσωπεύουν τον αρνητικό μάρτυρα (αντίσωμα ελέγχου του ισοτύπου) και οι μαύρες γραμμές αντιπροσωπεύουν την συνθήκη καλλιέργειας, όπως αναγράφεται στο αντίστοιχο πλαίσιο. Γ. Τα ποσοστά των θετικών σε ποδοκαλυκίνη κυττάρων υπολογίστηκαν για το τμήμα του ιστογράμματος που σημειώνεται ως Μ1. *Ρ<0.05, **Ρ<0.01 σε σχέση με τα HGEC:5mM, #Ρ<0.05 σε σχέση με τα HGEC:25mM Καταστολή της έκφρασης της νεφρίνης Εκτός του γονιδίου της ποδοκαλυκίνης, ο WT1 μπορεί να προσδεθεί και να ενεργοποιήσει τον υποκινητή της νεφρίνης και η πρόσδεση αυτή είναι απαραίτητη για την ποδοκυτταρο-ειδική έκφραση της νεφρίνης in vivo (276). Για να καθοριστεί αν η παρατηρούμενη μειορρύθμιση της ποδοκαλυκίνης λαμβάνει χώρα και σε άλλους στόχους του WT1, εξετάστηκαν τα επίπεδα έκφρασης της νεφρίνης με το ίδιο σύστημα καλλιεργειών. Η έκφραση της νεφρίνης (τόσο του μεταγράφου όσο και της πρωτεΐνης) είναι σημαντικά ελαττωμένη σε κύτταρα που καλλιεργούνται σε 25mM γλυκόζης και επομένως δεν εκφράζουν ποδοκαλυκίνη (Σχήμα 5Α-Γ). Επιπλέον, η αποκατάσταση της έκφρασης της νεφρίνης απαιτεί αρκετό χρόνο, αφού τα επίπεδά της δεν αποκαθίστανται μετά από 12 εβδομάδες επαναφοράς των φυσιολογικών επιπέδων γλυκόζης (5mM) στην καλλιέργεια (Σχήμα 5Α-Γ). 101

120 102

121 Σχήμα 5. Έκφραση της νεφρίνης στα ποδοκύτταρα. Α. Ανοσοαποτύπωση κατά Western για την έκφραση της νεφρίνης στα ποδοκύτταρα (HGEC). Προετοιμάστηκαν εκχυλίσματα ολικής πρωτεΐνης από κύτταρα που καλλιεργήθηκαν είτε υπό τη συνεχή παρουσία 5mM γλυκόζης (διαδρομή 1) ή 25mΜ γλυκόζης (διαδρομή 2). Διαδρομή 3: έκφραση της ποδοκαλυκίνης σε HGEC που καλλιεργούνταν συνεχώς σε 25mM γλυκόζης και μεταφέρθηκαν σε 5mM γλυκόζης για 12 εβδομάδες (HGEC:25-5mM/12w). Η εξειδίκευση της ζώνης που αντιστοιχεί στη νεφρίνη επιβεβαιώθηκε μετά από προεπώαση του αντισώματος με το ειδικό αντιγονικό πεπτίδιο (διαδρομή 4). Ίσες ποσότητες συνολικής πρωτεΐνης αναλύθηκαν στην ηλεκτροφόρηση και ανοσοαποτυπώθηκαν με αντίσωμα έναντι της νεφρίνης. Οι μεμβράνες επανεπωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της τουμπουλίνης για την επιβεβαίωση του πρωτεϊνικού φορτίου. Β. Η πυκνομετρική ανάλυση έγινε με κανονικοποίηση έναντι των ποσοτήτων της τουμπουλίνης. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με ανάλυση διασποράς (ANOVA). Λευκές ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 5mM γλυκόζης, σκιασμένες ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 25mM γλυκόζης. **Ρ<0.01 με βάση την ANOVA. Γ. Ανάλυση με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου για την έκφραση του μεταγράφου της νεφρίνης στα HGEC. Η έκφραση της νεφρίνης μετρήθηκε σε HGEC που καλλιεργούνταν υπό τα εξής επίπεδα γλυκόζης: 5mM, 25mM, 25mM με επακόλουθη καλλιέργεια σε 5mM για 6 εβδομάδες και 25mM με επακόλουθη καλλιέργεια σε 5mM για 12 εβδομάδες. Η GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς (ιδιοσυστατικό). Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Λευκές ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 5mM γλυκόζης, σκιασμένες ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 25mM γλυκόζης. ***Ρ<0.001 με βάση την ANOVA Η επαγόμενη από τη γλυκόζη μειορρύθμιση της έκφρασης της νεφρίνης είναι αναστρέψιμη Εφόσον η αποκατάσταση της έκφρασης της νεφρίνης στα HGEC είναι μια χρόνια διαδικασία, πραγματοποιήθηκε χρονική δοκιμασία για την πορεία της καταστολής ώστε να διαπιστωθεί το χρονικό σημείο στο οποίο λαμβάνει χώρα η ρύθμιση. Πειράματα ανοσοαποτύπωσης δείχνουν ότι η επαγόμενη από τη γλυκόζη ελάττωση της νεφρίνης παρατηρείται μετά από 4 εβδομάδες καλλιέργειας σε υψηλά επίπεδα (25mM) γλυκόζης 103

122 (HGEC:5-25mM/4w). Ταυτόχρονα, αυτό το χρονικό σημείο αντιστοιχεί στη μέγιστη μειορρύθμιση της νεφρίνης, αφού τα επίπεδα δεν είναι σημαντικά διαφορετικά από αυτά των HGEC:25mM (Σχήμα 6Α, διαδρομές 4-5 και Σχήμα 4Β). Ο βαθμός της μειορρύθμισης δεν είναι στατιστικά σημαντικός για τα HGEC:5-25mM/1w και HGEC:5-25mM/2w, αφού τα επίπεδα της πρωτεΐνης σε αυτά τα χρονικά σημεία παραμένουν αντίστοιχα με αυτά στα HGEC:5mM (Σχήμα 6Α, διαδρομές 1-3 και Σχήμα 6Β). Σε ό,τι αφορά τα κύτταρα που καλλιεργήθηκαν για 6 εβδομάδες (πρώιμο χρονικό σημείο) σε 25mM γλυκόζης και μεταφέρθηκαν σε καλλιέργεια με παρουσία 5mM γλυκόζης για 4 επιπλέον εβδομάδες (HGEC:25mM/6w-5mM/4w), τα επίπεδα της νεφρίνης αποκαθίστανται ούτως ώστε δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά με τα HGEC:5mM (Σχήμα 6Α, διαδρομή 7 και Σχήμα 6Β). Αντίστοιχα, στα κύτταρα που μεταφέρθηκαν σε φυσιολογικά επίπεδα γλυκόζης για το ίδιο χρονικό διάστημα μετά το όψιμο χρονικό σημείο των 18 εβδομάδων (HGEC:25mM/18w-5mM/4w), παρατηρήθηκε επαναφορά των επιπέδων της νεφρίνης (Σχήμα 6Α, διαδρομή 8 και Σχήμα 6Β) σε επίπεδα αντίστοιχα με αυτά των HGEC:5mM. 104

123 Σχήμα 6. Δοκιμασία χρόνου για την έκφραση της νεφρίνης στα ποδοκύτταρα. Α. Ανοσοαποτύπωση κατά Western για την έκφραση της νεφρίνης στα ποδοκύτταρα (HGEC). Προετοιμάστηκαν εκχυλίσματα ολικής πρωτεΐνης από κύτταρα που καλλιεργήθηκαν είτε υπό τη συνεχή παρουσία 5mM γλυκόζης (διαδρομή 1) ή 25mΜ γλυκόζης (διαδρομή 5). Διαδρομές 2-4: έκφραση της ποδοκαλυκίνης σε HGEC που καλλιεργούνταν συνεχώς σε 5mM γλυκόζης και μεταφέρθηκαν σε 25mM γλυκόζης για 1, 2, ή 4 εβδομάδες, αντίστοιχα (HGEC:5-25mM/1w, HGEC:5-25mM/2w και HGEC:5-25mM/4w), διαδρομή 6: έκφραση της ποδοκαλυκίνης σε HGEC που καλλιεργούνταν συνεχώς σε 25mM γλυκόζης και μεταφέρθηκαν σε 5mM γλυκόζης για 18 εβδομάδες (HGEC:25-5mM/18w), διαδρομές 7 και 8: 105

124 έκφραση της νεφρίνης σε HGEC που καλλιεργούνταν σε 25mM γλυκόζης για 6 ή 18 εβδομάδες και μεταφέρθηκαν σε 5mM γλυκόζης για 4 εβδομάδες, αντίστοιχα (HGEC:25mM/6w-5mM/4w και HGEC:25mM/18w- 5mM/4w). Ίσες ποσότητες συνολικής πρωτεΐνης αναλύθηκαν στην ηλεκτροφόρηση και ανοσοαποτυπώθηκαν με αντίσωμα έναντι της ποδοκαλυκίνης. Οι μεμβράνες επανεπωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της τουμπουλίνης για την επιβεβαίωση του πρωτεϊνικού φορτίου. Β. Η πυκνομετρική ανάλυση έγινε με κανονικοποίηση έναντι των ποσοτήτων της τουμπουλίνης. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση από 4 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με ανάλυση διασποράς (ANOVA). Λευκές ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 5mM γλυκόζης, σκιασμένες ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 25mM γλυκόζης. *Ρ<0.05 σε σχέση με τα HGEC:5mM με βάση την ANOVA Τα επίπεδα της νεφρίνης στην κυτταρική επιφάνεια είναι αντίστοιχα των ολικών επιπέδων της νεφρίνης στα ποδοκύτταρα Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, τα HGEC που καλλιεργούνται παρουσία 25mM γλυκόζης παρουσιάζουν σημαντικά μειωμένα επίπεδα νεφρίνης σε σχέση με αυτά που καλλιεργούνται παρουσία φυσιολογικών επιπέδων γλυκόζης. Η έκφραση της νεφρίνης παραμένει υπό καταστολή ακόμη και μετά από 12 εβδομάδες καλλιέργειας των κυττάρων σε 5mM γλυκόζης (Σχήμα 5 και Σχήμα 6). Εφόσον η σχετιζόμενη με την κυτταρική επιφάνεια (όχι η συνολική κυτταρική) νεφρίνη παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη πρωτεϊνουρικών παθήσεων (54), εξετάστηκαν τα επίπεδα της νεφρίνης στην κυτταρική επιφάνεια με ανοσοφθορισμό και κυτταρομετρία ροής, ώστε να επιβεβαιωθούν οι παρατηρηθείσες στα πειράματα ανοσοαποτύπωσης τάσεις. Στα HGEC:5mM-25mM/4w, τα επίπεδα της επιφανειακής νεφρίνης είναι μειορρυθμισμένα (Σχήμα 7Γ, τέταρτη ράβδος) και παραμένουν χαμηλά στα HGEC:5mM-25mM/6w και HGEC:5mM-25mM/18w καθώς και στα HGEC:25mM-5mM/18w (Σχήμα 7Γ, πέμπτη και έβδομη ράβδος). Παρά το γεγονός αυτό, στα HGEC:25mM-6w/5mM-4w και στα HGEC:25mM-18w/5mM-4w, η σχετιζόμενη με την κυτταρική επιφάνεια νεφρίνη 106

125 αποκαθίσταται στα φυσιολογικά επίπεδα, παρόμοια με αυτά των HGEC:5mM (Σχήμα 7Γ, όγδοη και ένατη ράβδος). 107

126 Σχήμα 7. Κυτταροεπιφανειακή έκφραση της νεφρίνης στα ποδοκύτταρα. Α. Ανάλυση συνεστιακής μικροσκοπίας (x600) για την κατανομή της νεφρίνης στα HGEC. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και επωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της νεφρίνης και με συζευγμένο με το φθορίζον μόριο Alexa Fluor 488 δευτερογενές αντίσωμα. Β. Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για την κυτταροεπιφανειακή έκφραση της νεφρίνης στα ποδοκύτταρα. Οι έντονες γκρίζες γραμμές αντιπροσωπεύουν τα HGEC:5mM (μάρτυρας), οι λεπτές γκρίζες γραμμές αντιπροσωπεύουν τον αρνητικό μάρτυρα (αντίσωμα ελέγχου του ισοτύπου) και οι μαύρες γραμμές αντιπροσωπεύουν την συνθήκη καλλιέργειας, όπως αναγράφεται στο αντίστοιχο πλαίσιο. Γ. Τα ποσοστά των θετικών σε ποδοκαλυκίνη κυττάρων υπολογίστηκαν για το τμήμα του ιστογράμματος που σημειώνεται ως Μ1. **Ρ<0.01 σε σχέση με τα HGEC:5mM. 3.3 ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΤΩΣΕΩΝ ΥΨΗΛΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΓΛΥΚΟΖΗΣ ΣΕ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΟΥΣ ΚΑΙ ΜΗ ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΟΥΣ ΑΠΟ ΤΟΝ WT1 ΠΟΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥΣ ΔΕΙΚΤΕΣ In vitro καλλιέργεια των HGEC παρουσία υψηλής γλυκόζης οδηγεί σε αντιστρεπτή μειορρύθμιση του μεταγράφου και της πρωτεΐνης ΖΟ-1 Με σκοπό να μελετηθεί αν οι φαινοτυπικές μεταβολές που παρατηρούνται στα ποδοκύτταρα μετά από καλλιέργεια σε υψηλά επίπεδα γλυκόζης, μελετήθηκε η έκφραση ανεξάρτητων του WT1 πρωτεϊνικών δεικτών του επιθηλίου και του ποδοκυτταρικού φαινοτύπου. Η ΖΟ-1, μια πρωτεΐνη των στενοσυνδέσμων, απαντάται και στα διαφράγματα διήθησης, όπου συνεντοπίζεται με την Ρ-καδερίνη και αλληλεπιδρά με τη Neph1 (97). Αν και δεν υπάρχουν ενδείξεις ότι η μεταγραφή του γονιδίου της ΖΟ-1 ελέγχεται από τον WT1, έχει δειχθεί ότι η πρωτεΐνη ΖΟ-1 αλληλεπιδρά με έναν συμπαράγοντα του WT1 μετά από τραυματισμό των ποδοκυττάρων (206). Για να διαπιστωθεί αν η παρατηρούμενη επαγόμενη από τη γλυκόζη καταστολή είναι ειδική για την ποδοκαλυκίνη, εξετάστηκαν τα επίπεδα έκφρασης της ΖΟ-1 υπό αντίστοιχες συνθήκες. Ανοσοαποτύπωση κατά Western έδειξε ότι η ΖΟ-1 μειορρυθμίζεται από την παρουσία υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης στο θρεπτικό υλικό των κυττάρων και εντός 4 108

127 εβδομάδων παρατηρούνται τα ελάχιστα επίπεδα έκφρασης (Σχήμα 8Α, διαδρομή 4 και Σχήμα 8Β). Η έκφραση της ΖΟ-1 σε κύτταρα που δεν εκφράζουν ποδοκαλυκίνη (HGEC:25mM) μπορεί να αποκατασταθεί μετά από 8 εβδομάδες καλλιέργειας σε φυσιολογικά επίπεδα (5mM) γλυκόζης (Σχήμα 8Α, διαδρομή 3 και Σχήμα 8Β). Επιπλέον, η ποσοτική αντίδραση πολυμεράσης έδειξε ότι η έκφραση του mrna της ΖΟ-1 σε HGEC που δεν εκφράζουν ποδοκαλυκίνη είναι μειωμένη κατά ~50% (Σχήμα 8Γ). Τα φυσιολογικά επίπεδα τόσο του mrna όσο και της πρωτεΐνης αποκαθίστανται μετά από 12 εβδομάδες καλλιέργειας σε 5mM γλυκόζης. 109

128 Σχήμα 8. Έκφραση της ΖΟ-1 στα ποδοκύτταρα. Α. Ανοσοαποτύπωση κατά Western για την έκφραση της ΖΟ-1 στα ποδοκύτταρα (HGEC). Προετοιμάστηκαν εκχυλίσματα ολικής πρωτεΐνης από κύτταρα που καλλιεργήθηκαν είτε υπό τη συνεχή παρουσία 5mM γλυκόζης (διαδρομή 1) ή 25mΜ γλυκόζης (διαδρομή 2). Διαδρομή 3: έκφραση της ποδοκαλυκίνης σε HGEC που καλλιεργούνταν συνεχώς σε 25mM γλυκόζης και μεταφέρθηκαν σε 5mM γλυκόζης για 8 εβδομάδες (HGEC:25-5mM/8w), διαδρομή 4: έκφραση της ποδοκαλυκίνης σε HGEC που καλλιεργούνταν συνεχώς σε 5mM γλυκόζης και μεταφέρθηκαν σε 25mM γλυκόζης για 4 εβδομάδες (HGEC:5-25mM/4w). Ίσες ποσότητες συνολικής πρωτεΐνης αναλύθηκαν στην ηλεκτροφόρηση και ανοσοαποτυπώθηκαν με αντίσωμα έναντι της ΖΟ-1. Οι μεμβράνες εκδύθηκαν και επανεπωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της τουμπουλίνης για την επιβεβαίωση του πρωτεϊνικού φορτίου. Β. Η πυκνομετρική ανάλυση έγινε με κανονικοποίηση έναντι των ποσοτήτων της τουμπουλίνης. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση από 4 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με ανάλυση διασποράς (ANOVA). Λευκές ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 5mM γλυκόζης, σκιασμένες ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 25mM γλυκόζης. **Ρ<0.01, *Ρ<0.05 με βάση την ANOVA. Γ. Ανάλυση με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου για την έκφραση του μεταγράφου της ΖΟ-1 στα HGEC. Η έκφραση της ΖΟ-1 μετρήθηκε σε HGEC που καλλιεργούνταν στις εξής συνθήκες γλυκόζης: 5mM, 25mM, 25mM με επακόλουθη επαναφορά σε 5mM για 8 ή 12 εβδομάδες. Η GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς (ιδιοσυστατικό). Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση από 4 ανεξάρτητα πειράματα. Λευκές ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 5mM γλυκόζης, σκιασμένες ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 25mM γλυκόζης. *Ρ<0.05 με βάση την ANOVA Η επαγόμενη από τη γλυκόζη μειορρύθμιση της έκφρασης της ιντεγκρίνης α3β1 είναι ταχεία και αναστρέψιμη Η έκφραση της α3β1 ιντεγκρίνης, μιας πρωτεΐνης σημαντικής για την προσκόλληση των ποδοκυττάρων στη βασική μεμβράνη, αλλά και για την κυτταρική σηματοδότηση, μεταβάλλεται από την υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης (125). Με σκοπό να διαπιστωθεί αν το πρότυπο έκφρασης είναι αντίστοιχο με αυτό της ποδοκαλυκίνης (εν μέρει αντιστρεπτή καταστολή από τα υψηλά επίπεδα γλυκόζης) ή όχι (ταχέως αντιστρεπτή μειορρύθμιση), διερευνήθηκε η έκφραση των αλύσεων α3 και β1 της 110

129 ιντεγκρίνης με ανοσοαποτύπωση κατά Western. Και στις δύο περιπτώσεις η μειορρύθμιση είναι ταχεία (εντός 96 ωρών από την έναρξη της καλλιέργειας σε 25mM γλυκόζης) και αντιστρεπτή εξίσου ταχέως, εντός 96 ωρών από την καλλιέργεια σε φυσιολογικά επίπεδα (5mM) γλυκόζης (Σχήμα 9Α και Β). 111

130 Σχήμα 9. Έκφραση της α3β1 ιντεγκρίνης στα ποδοκύτταρα. Α. Ανοσοαποτύπωση κατά Western για την έκφραση των ιντεγκρινικών αλύσεων α3 και β1 στα ποδοκύτταρα (HGEC). Προετοιμάστηκαν εκχυλίσματα ολικής πρωτεΐνης από κύτταρα που καλλιεργήθηκαν είτε υπό τη συνεχή παρουσία 5mM γλυκόζης (διαδρομή 1) ή 25mΜ γλυκόζης (διαδρομές 2 και 4). Διαδρομή 3: έκφραση της ποδοκαλυκίνης σε HGEC που καλλιεργούνταν συνεχώς σε 5mM γλυκόζης και μεταφέρθηκαν σε 25mM γλυκόζης για 96 ώρες (4 ημέρες) αντίστοιχα (HGEC:25-5mM/96 ώρες), διαδρομή 5: έκφραση της ποδοκαλυκίνης σε HGEC που καλλιεργούνταν συνεχώς σε 25mM γλυκόζης και μεταφέρθηκαν σε 5mM γλυκόζης για 96 ώρες (HGEC:25-5mM/96 ώρες). Ίσες ποσότητες συνολικής πρωτεΐνης αναλύθηκαν στην ηλεκτροφόρηση και ανοσοαποτυπώθηκαν με αντίσωμα έναντι της α3 ή έναντι της β1 αλύσεως της ιντεγκρίνης. Οι μεμβράνες επανεπωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της τουμπουλίνης για την επιβεβαίωση του πρωτεϊνικού φορτίου. Β. Η πυκνομετρική ανάλυση έγινε με κανονικοποίηση έναντι των ποσοτήτων της τουμπουλίνης. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση από 4 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με ανάλυση διασποράς (ANOVA). Λευκές ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 5mM γλυκόζης, σκιασμένες ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 25mM γλυκόζης. *Ρ<0.05, σε σχέση με τα HGEC:5mM, #Ρ<0.05 σε σχέση με τα HGEC:25mM In vitro καλλιέργεια των HGEC παρουσία υψηλής γλυκόζης οδηγεί σε προσωρινή ελάττωση της έκφρασης της CD2AP Η πρωτεΐνη CD2AP αποτελεί μια πρωτεΐνη-προσαρμογέα του διαφράγματος διήθησης στον κυτταροσκελετό, παίζοντας έτσι σημαντικό ρόλο στη μεταγωγή σήματος από το εξωκυττάριο περιβάλλον στο εσωτερικό των ποδοκυττάρων. Πειράματα ανοσοαποτύπωσης κατά Western και ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι η κυτταροεπιφανειακή έκφραση της CD2AP δεν επηρεάζεται από τα επίπεδα της γλυκόζης στις 2 εβδομάδες (HGEC:5-25mM/2w) (Σχήμα 10Α, δεύτερο πλαίσιο, Σχήμα 10Β, διαδρομή 2 και Σχήμα 2Γ). Τα HGEC:5mM και τα HGEC:25mM παρουσιάζουν διάστικτη κατανομή της CD2AP (Σχήμα 10Α, πρώτο και τέταρτο πλαίσιο). Σημαντικά ελαττωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης παρατηρούνται μετά από 18 εβδομάδες καλλιέργειας σε 25mM γλυκόζης (HGEC:5-25mM/18w) (Σχήμα 10Β, διαδρομή 3 και Σχήμα 10Γ). 112

131 Παρά το γεγονός αυτό, τα επίπεδα της CD2AP στα HGEC:25mM είναι αντίστοιχα με αυτά των HGEC:5mM (Σχήμα 10Β). Επιπλέον, αν και η έκφραση της CD2AP δεν επηρεάζεται, ο κυτταροσκελετός της ακτίνης φαίνεται αποδιοργανωμένος στα HGEC:25mM μετά από χρώση με φαλλοϊντίνη (Σχήμα 10Δ). Τα ινίδια της ακτίνης αποκτούν τη φυσιολογική κατανομή τους μετά από έκθεση των HGEC:25mM σε φυσιολογικά επίπεδα γλυκόζης για 96 ώρες (Σχήμα 10Δ). 113

132 Σχήμα 10. Έκφραση και κατανομή της CD2AP στα ποδοκύτταρα. Α. Ανάλυση συνεστιακής μικροσκοπίας (x600) για την κατανομή της CD2AP στα HGEC. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και επωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της CD2AP και με συζευγμένο με το φθορίζον μόριο Alexa Fluor 488 δευτερογενές αντίσωμα. B. Ανοσοαποτύπωση κατά Western για την έκφραση της CD2AP στα ποδοκύτταρα (HGEC). Προετοιμάστηκαν εκχυλίσματα ολικής πρωτεΐνης από κύτταρα που καλλιεργήθηκαν είτε υπό τη συνεχή παρουσία 5mM γλυκόζης (διαδρομή 1) ή 25mΜ γλυκόζης (διαδρομή 4). Διαδρομές 2 και 3: έκφραση της CD2AP σε HGEC που καλλιεργούνταν συνεχώς σε 5mM γλυκόζης και μεταφέρθηκαν σε 25mM γλυκόζης για 2 και 18 εβδομάδες αντίστοιχα (HGEC:25-5mM/2w και HGEC:25-5mM/18w), διαδρομή 5: έκφραση της CD2AP σε HGEC που καλλιεργούνταν συνεχώς σε 25mM γλυκόζης και μεταφέρθηκαν σε 5mM γλυκόζης για 18 εβδομάδες (HGEC:25-5mM/18w). Ίσες ποσότητες συνολικής πρωτεΐνης αναλύθηκαν στην ηλεκτροφόρηση και ανοσοαποτυπώθηκαν με αντίσωμα έναντι της CD2AP. Οι μεμβράνες επανεπωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της τουμπουλίνης για την επιβεβαίωση του πρωτεϊνικού φορτίου. Γ. Η πυκνομετρική ανάλυση έγινε με κανονικοποίηση έναντι των ποσοτήτων της τουμπουλίνης. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με ανάλυση διασποράς (ANOVA). *Ρ<0.05, σε σχέση με τα HGEC:5mM. Δ. Ανάλυση συνεστιακής μικροσκοπίας (x600) για τον συνεντοπισμό CD2AP και ινώδους ακτίνης (F-ακτίνης) στα HGEC. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και επωάστηκαν με αντίσωμα ειδικό για την CD2AP και συζευγμένη με τη χρωστική Texas Red φαλλοϊντίνη. 3.4 ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΥ ΜΕΙΟΡΡΥΘΜΙΣΗΣ ΤΩΝ ΠΟΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ Η μειωμένη έκφραση της ποδοκαλυκίνης παρουσία 25mM γλυκόζης δεν είναι αποτέλεσμα μειωμένων επιπέδων της πρωτεΐνης WT1 Έχει αναφερθεί ότι ο WT1 παλινδρομεί μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος και ότι ένα σημαντικό κλάσμα του κυτταρικού WT1 είναι κυτταροπλασματικό (184). Με βάση αυτές τις αναφορές, εξετάστηκε η ενδοκυτταρική κατανομή αυτής της πρωτεΐνης στα HGEC. Ανάλυση κατά Western πυρηνικών και κυτταροπλασματικών λυμάτων από HGEC που καλλιεργούνται παρουσία 5mM ή 25mM γλυκόζης έδειξε ότι ο WT1 είναι 114

133 κυρίως πυρηνικός (Σχήμα 11Α και 11Β). Επιπλέον, και τα δύο κυτταροπλασματικά κλάσματα είναι θετικά για τον WT1 (Σχήμα 11Α, διαδρομές 2 και 4). Η πυκνομετρική ανάλυση έδειξε ότι το κυτταροπλασματικό κλάσμα του WT1 είναι περίπου ίσο με το 1/8 του συνολικού κυτταρικού WT1 και για τις δύο συνθήκες καλλιέργειας (Σχήμα 11Β). Δε διαπιστώθηκε διαφορά στα πυρηνικά πρωτεϊνικά επίπεδα της πρωτεΐνης μεταξύ των δύο συνθηκών, γεγονός που υποδεικνύει ότι η μειορρύθμιση της ποδοκαλυκίνης είναι ανεξάρτητη του WT1 (Σχήμα 11Β). Σχήμα 11. Έκφραση του WT1 στα ποδοκύτταρα. Α. Ανοσοαποτύπωση κατά Western για την έκφραση του WT1 στα HGEC. Πυρηνικά (διαδρομές 1 και 3) και κυτταροπλασματικά (διαδρομές 2 και 4) κλάσματα απομονώθηκαν από τα HGEC. Διαδρομές 1 και 2, έκφραση του WT1 σε HGEC υπό την παρουσία 5mM γλυκόζης, διαδρομές 3 και 4, έκφραση του WT1 σε HGEC υπό την παρουσία 25mM γλυκόζης. Ίσες ποσότητες συνολικής πρωτεΐνης αναλύθηκαν στην ηλεκτροφόρηση και ανοσοαποτυπώθηκαν με αντίσωμα έναντι του WT1. Οι μεμβράνες επανεπωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της τουμπουλίνης για την επιβεβαίωση του πρωτεϊνικού φορτίου. Β. Η πυκνομετρική ανάλυση έγινε με κανονικοποίηση έναντι των ποσοτήτων της τουμπουλίνης. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση από 5 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με μονοπαραγοντική ανάλυση διασποράς (ANOVA). Τα πυρηνικά επίπεδα του WT1 είναι σημαντικά υψηλότερα από τα κυτταροπλασματικά. Λευκές ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 5mM γλυκόζης, σκιασμένες ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 25mM γλυκόζης. **Ρ<0.01 με βάση την ANOVA. 115

134 3.4.2 Η μειωμένη έκφραση της ποδοκαλυκίνης παρουσία 25mM γλυκόζης δεν είναι αποτέλεσμα μειωμένων επιπέδων της πρωτεΐνης Sp1 Το γονίδιο για την ανθρώπινη ποδοκαλυκίνη έχει κλωνοποιηθεί και χαρτογραφηθεί στη χρωμοσωμική περιοχή 7q32-q33 (120). Στον υποκινητή του γονιδίου έχουν αναγνωριστεί στοιχεία πρόσδεσης του Sp1, τα οποία είναι απαραίτητα για τη διατήρηση της μεταγραφής της ποδοκαλυκίνης (23). Ανάλυση κατά Western ολικών λυμάτων από HGEC που καλλιεργούνται συνεχώς παρουσία 5mM ή 25mM γλυκόζης έδειξε ότι τα επίπεδα του Sp1 δε μεταβάλλονται μεταξύ των δύο συνθηκών (Σχήμα 12). Σχήμα 12. Έκφραση του Sp1 στα ποδοκύτταρα. Α. Ανοσοαποτύπωση κατά Western για την έκφραση του Sp1 στα ποδοκύτταρα (HGEC). Προετοιμάστηκαν εκχυλίσματα ολικής πρωτεΐνης από κύτταρα που καλλιεργήθηκαν είτε υπό τη συνεχή παρουσία 5mM γλυκόζης (διαδρομή 1) ή 25μΜ γλυκόζης (διαδρομή 2). Ίσες ποσότητες συνολικής πρωτεΐνης αναλύθηκαν στην ηλεκτροφόρηση και ανοσοαποτυπώθηκαν με αντίσωμα έναντι της ποδοκαλυκίνης. Οι μεμβράνες επανεπωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της τουμπουλίνης για την επιβεβαίωση του πρωτεϊνικού φορτίου. Β. Η πυκνομετρική ανάλυση έγινε με κανονικοποίηση έναντι των ποσοτήτων της τουμπουλίνης. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με ανάλυση διασποράς (ANOVA). Δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά στα επίπεδα του Sp1 μεταξύ των HGEC που καλλιεργούνται υπό 5mM γλυκόζης και αυτών υπό 25mM γλυκόζης. 116

135 3.4.3 ΤΑ ΥΨΗΛΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΓΛΥΚΟΖΗΣ ΔΕΝ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗ ΤΟΥ SP1 Η ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ CBP ΣΤΟΝ ΠΥΡΗΝΑ ΤΩΝ ΠΟΔΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Ο Sp1 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που είναι ενεργός όταν βρίσκεται στον πυρήνα. Με σκοπό να αναλυθεί αν υπάρχει διαφορά στον πυρηνικό εντοπισμό του Sp1 μεταξύ των κυττάρων που εκφράζουν ποδοκαλυκίνη (HGEC:5mM) και αυτών που δεν εκφράζουν ποδοκαλυκίνη (HGEC:25mM), πραγματοποιήθηκε ανάλυση κατά Western πυρηνικών και κυτταροπλασματικών κλασμάτων από τα κύτταρα αυτά. Η ανάλυση έδειξε ότι ο Sp1 βρίσκεται τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα. Η αναλογία πυρηνικού προς ολικό κυτταρικό Sp1 είναι περίπου ίση με 2/3 (Σχήμα 13Α και 13Β). Παρά τις διαφορές στα επίπεδα της ποδοκαλυκίνης, τα επίπεδα του πυρηνικού και του κυτταροπλασματικού Sp1 στα HGEC που καλλιεργούνται παρουσία 5mM και 25mM δεν παρουσιάζουν διαφορές. Η CBP είναι μια πρωτεΐνη που συμμετέχει στη μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων από τον WT1 ως συμπαράγοντας στη διαδικασία (278). Για να διαπιστωθεί ο πιθανός ρόλος της πρωτεΐνης αυτής στη ρύθμιση του γονιδίου της ποδοκαλυκίνης, πραγματοποιήθηκε ανάλυση κατά Western σε κυτταροπλασματικά και πυρηνικά κλάσματα HGEC που καλλιεργούνται συνεχώς υπό την παρουσία 5mM (HGEC:5mM) ή 25mM (HGEC:25mM) γλυκόζης. Η ανάλυση επιβεβαίωσε ότι η CBP βρίσκεται τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα. Η αναλογία πυρηνικής προς ολική CBP στα HGEC είναι περίπου ίση με 2/5 (Σχήμα 13Α και 13Β). Παρά τις διαφορές στα επίπεδα της ποδοκαλυκίνης, τα επίπεδα της πυρηνικής και της κυτταροπλασματικης CBP δεν παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των HGEC που εκφράζουν ποδοκαλυκίνη και αυτών που δεν εκφράζουν την πρωτεΐνη. 117

136 Σχήμα 13. Έκφραση του Sp1 και της CBP στα ποδοκύτταρα. Α. Ανοσοαποτύπωση κατά Western για την έκφραση της CBP και του Sp1 στα HGEC. Πυρηνικά (διαδρομές 1 και 3) και κυτταροπλασματικά (διαδρομές 2 και 4) κλάσματα απομονώθηκαν από τα HGEC. Διαδρομές 1 και 2, έκφραση της CBP και του Sp1 σε HGEC υπό την παρουσία 5mM γλυκόζης, διαδρομές 3 και 4, έκφραση της CBP και του Sp1 σε HGEC υπό την παρουσία 25mM γλυκόζης. Ίσες ποσότητες συνολικής πρωτεΐνης αναλύθηκαν στην ηλεκτροφόρηση και ανοσοαποτυπώθηκαν με αντίσωμα έναντι της CBP και του Sp1. Οι μεμβράνες εκδύθηκαν και επανεπωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της τουμπουλίνης για την επιβεβαίωση του πρωτεϊνικού φορτίου. Β. Η πυκνομετρική ανάλυση έγινε με κανονικοποίηση έναντι των ποσοτήτων της τουμπουλίνης. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με μονοπαραγοντική ανάλυση διασποράς (ANOVA). Τα πυρηνικά επίπεδα της CBP και του Sp1 είναι σημαντικά υψηλότερα από τα κυτταροπλασματικά. Λευκές ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 5mM γλυκόζης, σκιασμένες ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 25mM γλυκόζης. *Ρ<0.05 με βάση την ANOVA. 118

137 3.4.4 Η αλληλεπίδραση του WT1 με τη CBP διαταράσσεται παρουσία υψηλής γλυκόζης Στον υποκινητή του γονιδίου της ποδοκαλυκίνης έχουν αναγνωριστεί στοιχεία πρόσδεσης του WT1 (182, 189). Είναι επίσης γνωστό ότι η μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων-στόχων του WT1 από τη CBP προαπαιτεί την αλληλεπίδραση των δύο αυτών πρωτεϊνών (278). Εφόσον η CBP μπορεί να μεταβάλλει τη μεταγραφική ρύθμιση που ασκεί ο WT1 στα γονίδια-στόχους του, εξετάστηκε η αλληλεπίδρασή του με τη CBP στα HGEC παρουσία 5mM ή 25mM γλυκόζης. Η έκφραση του WT1 και της CBP επιβεβαιώθηκε με ανοσοαποτύπωση τόσο στα κυτταροπλασματικά όσο και στα πυρηνικά κλάσματα των κυττάρων στις δύο διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας (Σχήμα 11 και Σχήμα 13). Πειράματα στα οποία πραγματοποιήθηκε εκχύλιση πρωτεΐνης από ολικά κυτταρικά λύματα, ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα που στοχεύει το C-τελικό άκρο του WT1 και ανοσοαποτύπωση με αντι-cbp έδειξαν ότι οι δύο αυτές πρωτεΐνες συνανοσοκατακρημνίζονται (Σχήμα 14Α). Αντίστοιχα, ανοσοκατακρήμνιση με αντι-cbp και ανοσοαποτύπωση με αντι-wt1 έδειξε συγκατακρήμνιση του WT1 με την ενδογενή CBP (Σχήμα 14Δ). Η εξειδίκευση της τεχνικής επιβεβαιώθηκε με τους κατάλληλους μάρτυρες για τη δοκιμασία (Σχήμα 14Γ και 14ΣΤ). Σύγκριση των ποσοτήτων του συγκατακρημνισμένου WT1 ή της συγκατακρημνισμένης CBP με τις ποσότητες των συνολικών πρωτεΐνών που κατακρημνίστηκαν άμεσα από τα κυτταρικά λύματα (CBP και WT1, αντίστοιχα) δείχνει ότι ~10% της ολικής κυτταρικής CBP συγκατακρημνίζεται με τον WT1 σε HGEC που καλλιεργούνται σε 5mM γλυκόζης (φυσιολογικά επίπεδα), ενώ το αντίστοιχο ποσοστό στα HGEC που καλλιεργούνται παρουσία 25mM γλυκόζης (υψηλά επίπεδα) είναι μόνο 6% (Σχήμα 14Β και 14Ε). Επομένως η αλληλεπίδραση του WT1 με τη CBP ελαττώνεται κατά 40% στα HGEC που καλλιεργούνται παρουσία 25mM γλυκόζης σε σχέση με αυτά που καλλιεργούνται παρουσία 5mM. 119

138 Σχήμα 14. Ανοσοαποτύπωση κατά Western πειραμάτων συνανοσοκατακρήμνισης των HGEC. Α. Ίσες ποσότητες κυτταρικών λυμάτων από HGEC που καλλιεργούνταν υπό την παρουσία 5mM ή 5mM γλυκόζης ανοσοκατακρημνίστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του WT1 και ακολούθησε ανοσοαποτύπωση με αντίσωμα έναντι της CBP. Οι μεμβράνες επωάστηκαν επίσης με πολυκλωνικό αντι-wt1 αντίσωμα για την επιβεβαίωση του φορτίου ανοσοκατακρήμνισης, έναντι του οποίου κανονικοποιήθηκαν τα δεδομένα. Β. Ποσοτικοποίηση του πρωτεϊνικού περιεχομένου σε CBP και WT1 μέσω πυκνομετρικής ανάλυσης. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση από 7 ανεξάρτητα πειράματα. Λευκές ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 5mM γλυκόζης, σκιασμένες ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 25mM γλυκόζης. *Ρ<0.05 με βάση την ANOVA. Γ: Αρνητικοί μάρτυρες. Ίσες ποσότητες κυτταρικών λυμάτων των HGEC που καλλιεργούνταν υπό τη συνεχή παρουσία 5mM ή 25mM γλυκόζης ανοσοκατακρημνίστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του 120

139 WT1, χωρίς αντίσωμα, και αντίσωμα έναντι ιντεγκρίνης β1 (τα δύο τελευταία είναι αρνητικοί μάρτυρες) και ακολούθησε ανοσοαποτύπωση με πολυκλωνικό αντι-wt1 αντίσωμα. Δ. Ίσες ποσότητες κυτταρικών λυμάτων από HGEC που καλλιεργούνταν υπό την παρουσία 5mM ή 5mM γλυκόζης ανοσοκατακρημνίστηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της CBP και ακολούθησε ανοσοαποτύπωση με αντίσωμα έναντι της CBP. Οι μεμβράνες επωάστηκαν επίσης με πολυκλωνικό αντι-cbp αντίσωμα για την επιβεβαίωση του φορτίου ανοσοκατακρήμνισης, έναντι του οποίου κανονικοποιήθηκαν τα δεδομένα. E. Ποσοτικοποίηση του πρωτεϊνικού περιεχομένου σε CBP και WT1 μέσω πυκνομετρικής ανάλυσης. Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση από 7 ανεξάρτητα πειράματα. Λευκές ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 5mM γλυκόζης, σκιασμένες ράβδοι: HGEC που καλλιεργούνται υπό 25mM γλυκόζης. *Ρ<0.05 με βάση την ANOVA. ΣΤ: Αρνητικοί μάρτυρες. Ίσες ποσότητες κυτταρικών λυμάτων των HGEC που καλλιεργούνταν υπό τη συνεχή παρουσία 5mM ή 25mM γλυκόζης ανοσοκατακρημνίστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της CBP, χωρίς αντίσωμα, και αντίσωμα έναντι ιντεγκρίνης β1 (τα δύο τελευταία είναι αρνητικοί μάρτυρες) και ακολούθησε ανοσοαποτύπωση με πολυκλωνικό αντι-cbp αντίσωμα Ο WT1 προσδένεται στον υποκινητή της ποδοκαλυκίνης και η αλληλεπίδραση αυτή αλλοιώνεται παρουσία υψηλών επιπέδων γλυκόζης Για να διαπιστωθεί αν ο WT1 προσδένεται άμεσα στον υποκινητή της ποδοκαλυκίνης, πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης με αντι-wt1. Στα HGEC που καλλιεργούνται σε 5mM γλυκόζης το ανοσοκατακρήμνισμα είναι εμπλουτισμένο στην ειδική αλληλουχία του υποκινητή της ποδοκαλυκίνης (Σχήμα 15Β) σε σχέση με το ανοσοκατακρήμνισμα με μη ειδικό αντίσωμα (ανοσοσφαιρίνη μυός). Το DNA που ανακτήθηκε από τις δοκιμασίες ανοσοκατακρήμνισης πολλαπλασιάστηκε με PCR με εκκινητές ειδικούς για τον υποκινητή της ποδοκαλυκίνης. Το προϊόν της αντίδρασης πολυμεράσης ανιχνεύεται στη δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης με αντι-wt1, αλλά όχι στην αντίστοιχη με ανοσοσφαιρίνη μυός (Σχήμα 15Β). Το αποτέλεσμα αυτό δείχνει ότι ο WT1 προσδένεται στον υποκινητή της ποδοκαλυκίνης σε κύτταρα που καλλιεργούνται παρουσία 5mM γλυκόζης (Σχήμα 15Β). Η αντίστοιχη δοκιμασία 121

140 ανοσοκατακρήμνισης μονιμοποιημένης χρωματίνης από κύτταρα που καλλιεργούνται παρουσία 25mM γλυκόζης έδειξε ότι η αλληλουχία του υποκινητή της ποδοκαλυκίνης είναι εμπλουτισμένη στο ανοσοκατακρήμνισμα με αντι-wt1, αλλά το προϊόν της αντίδρασης πολυμεράσης είναι σημαντικά ελαττωμένο σε σχέση με το αντίστοιχο των κυττάρων που αναπτύσσονται παρουσία 5mM γλυκόζης (Σχήμα 15Β). Επομένως, οι δοκιμασίες ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης δείχνουν ότι η μειωμένη αλληλεπίδραση WT1-CBP οδηγεί σε ελαττωμένη πρόσδεση του WT1 στον υποκινητή της ποδοκαλυκίνης, που με τη σειρά του οδηγεί σε ελάττωση της μεταγραφικής ενεργοποίησης των γονιδίων-στόχων του WT1. 122

141 Σχήμα 15. Ανάλυση της πρόσδεσης του WT1 στον υποκινητή του γονιδίου της ποδοκαλυκίνης. HGEC που καλλιεργούνται συνεχώς υπό την παρουσία 5mM ή 25mM γλυκόζης μονιμοποιήθηκαν με φορμαλδεΰδη. Απομονώθηκε η σταυρο-συνδεδεμένη χρωματίνη και ανοσοκατακρημνίστηκε με αντίσωμα έναντι του WT1 (αντι-wt1), της RNA πολυμεράσης ΙΙ (κλώνος CTD448: αντι-rna πολυμεράση ΙΙ) και ανοσοσφαιρίνης IgG μυός (αντι-igg ποντικού). Α. Χρώση βρωμιούχου αιθιδίου του πηκτώματος ηλεκτροφόρησης που ενδεικνύει το μέγεθος των θραυσμάτων του DNA μετά την υπερηχοβόληση. Οι διαδρομές φορτώθηκαν με 2.5% από το 123

142 αρχικό υλικό της δοκιμασίας για κάθε συνθήκη καλλιέργειας μετά από επώαση με πρωτεϊνάση Κ. Β. Ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης των ανοσοκατακρημνισμάτων με εκκινητές ειδικούς για τον υποκινητή του γονιδίου της ποδοκαλυκίνης και τον αντίστοιχο της GAPDH. Σε όλες τις περιπτώσεις το ανοσοκατακρήμνισμα επαναιωρήθηκε σε 30μl ελεύθερου νουκλεασών Η2Ο και το αρχικό υλικό αραιώθηκε σε τελική συγκέντρωση 2%. Τα προϊόντα της PCR ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 2% και ακολούθησε χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο Η μειορρύθμιση της ποδοκαλυκίνης εξαρτάται από τον WT1, αλλά η δυνατότητα αποκατάστασης των επιπέδων της μπορεί να είναι ανεξάρτητη του WT1 Εφόσον η αρχική δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης με αντι-wt1 έδειξε ότι η πρόσδεση του WT1 στην περιοχή του υποκινητή της ποδοκαλυκίνης στα HGEC:25mM είναι μειωμένη σε σχέση με τα HGEC:5mM (Σχήμα 15Β), η δοκιμασία επαναλήφθηκε σε σύζευξη με ποσοτική αντίδραση πολυμεράσης με σκοπό να ποσοτικοποιηθεί η πρόσδεση του WT1 στον υποκινητή του γονιδίου podxl, αλλά και να διαπιστωθεί το χρονικό σημείο στο οποίο η πρόσδεση αυτή υφίσταται βλάβη. Η πρόσδεση του WT1 στον εγγύς υποκινητή του podxl στα HGEC:25mM αντιστοιχεί στο 50% της αντίστοιχης πρόσδεσης στα HGEC:5mM (Σχήμα 16). Σε συμφωνία με την παρατηρηθείσα ελάττωση των επιπέδων της ποδοκαλυκίνης, η πρόσδεση του WT1 στα HGEC:25-5mM/18w, τα οποία καλλιεργούνται για 18 εβδομάδες σε 5mM γλυκόζης και δεν εκφράζουν ποδοκαλυκίνη, είναι επίσης μειωμένη (Σχήμα 16). Σε αυτά τα κύτταρα, η πρόσδεση του WT1 στον υποκινητή της ποδοκαλυκίνης είναι σχετικά αυξημένη σε σχέση με τα HGEC:25mM, αλλά η αύξηση αυτή δεν είναι στατιστικά σημαντική. Επιπλέον, η πρόσδεση της RNA πολυμεράσης II στον ίδιο υποκινητή είναι μειωμένη στα HGEC:25-5mM/18w. Τα κύτταρα που έχουν εκτεθεί σε υψηλά επίπεδα γλυκόζης (25mM) για 6 εβδομάδες, HGEC:5-25mM/6w, παρουσιάζουν μείωση της πρόσδεσης του WT1 στον υποκινητή κατά περίπου 50% (Σχήμα 16), επίπεδα αντίστοιχα των HGEC:25mM και HGEC:25-5mM/18 (Σχήμα 16). Ακολούθως εξετάστηκε αν η 124

143 μειωμένη πρόσδεση του WT1 στον υποκινητή του γονιδίου της ποδοκαλυκίνης μπορεί να αποκατασταθεί μετά το πρώιμο (6 εβδομάδες) και το όψιμο (18 εβδομάδες) σημείο καλλιέργειας. Παρά το γεγονός ότι η έκφραση της ποδοκαλυκίνης μετά το πρώιμο χρονικό σημείο (25mM/6w-5mM/4w) έχει αποκατασταθεί, η πρόσδεση του WT1 στον υποκινητή του γονιδίου δεν επανέρχεται (Σχήμα 16). Στο όψιμο χρονικό σημείο παρατηρείται μερική, αλλά όχι στατιστικά σημαντική, αύξηση της πρόσδεσης του WT1 στο σχετικό υποκινητή, η οποία όμως δε σχετίζεται με αποκατάσταση των επιπέδων έκφρασης (Σχήμα 16). Σχήμα 16. Χρονική δοκιμασία ανάλυσης ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης για την πρόσδεση του WT1 στον υποκινητή του γονιδίου της ποδοκαλυκίνης. Μονιμοποιημένα με φορμαλδεΰδη θραύσματα χρωματίνης ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντι-wt1 (WT-1), αντι-rna πολυμεράση ΙΙ (RNA pol II) ή ανοσοσφαιρίνη μυός (IgG ποντικού) ως αρνητικός μάρτυρας. Τα προϊόντα της κατακρήμνισης αναλύθηκαν με ποσοτική PCR με τη χρήση εκκινητών ειδικών για τον εγγύς υποκινητή του γονιδίου podxl. Για την κανονικοποίηση χρησιμοποιήθηκε ένα θραύσμα DNA χωρίς γνωστά στοιχεία πρόσδεσης του WT1 στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου gapdh. **Ρ<0.01, *Ρ<0.05, σε σχέση με τα HGEC:5mM, #Ρ<0.05 σε σχέση με τα HGEC:25mM. 125

144 3.4.7 Η πρόσδεση του WT1 στον υποκινητή της νεφρίνης δεν επηρεάζεται από την παρουσία υψηλής γλυκόζης Εκτός του υποκινητή του γονιδίου της ποδοκαλυκίνης, ο WT1 προσδένεται και στον υποκινητή του γονιδίου της νεφρίνης, nphs1, ενεργοποιώντας την έκφραση του γονιδίου (276). Δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης με επακόλουθη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου έδειξε ότι η πρόσδεση του WT1 στον υποκινητή του γονιδίου της νεφρίνης είναι σημαντικά ελαττωμένη όταν τα HGEC:25mM, τα οποία δεν εκφράζουν ποδοκαλυκίνη ή νεφρίνη, καλλιεργηθούν σε φυσιολογικά επίπεδα γλυκόζης για 18 εβδομάδες (HGEC:25-5mM/18w) (Σχήμα 17). Παρά το γεγονός αυτό, δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των HGEC:5mM και των HGEC:25mM. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι η μειορρύθμιση και αποκατάσταση των κυτταροεπιφανειακών επιπέδων της νεφρίνης δε σχετίζονται με μεταβολές στην πρόσδεση του WT1 στον υποκινητή της νεφρίνης (Σχήμα 17). 126

145 Σχήμα 17. Χρονική δοκιμασία ανάλυσης ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης για την πρόσδεση του WT1 στον υποκινητή του γονιδίου της νεφρίνης. Μονιμοποιημένα με φορμαλδεΰδη θραύσματα χρωματίνης ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντι-wt1 (WT-1), αντι-rna πολυμεράση ΙΙ (RNA pol II) ή ανοσοσφαιρίνη μυός (IgG ποντικού) ως αρνητικός μάρτυρας. Τα προϊόντα της κατακρήμνισης αναλύθηκαν με ποσοτική PCR με τη χρήση εκκινητών ειδικών για τον εγγύς υποκινητή του γονιδίου nphs1. Για την κανονικοποίηση χρησιμοποιήθηκε ένα θραύσμα DNA χωρίς γνωστά στοιχεία πρόσδεσης του WT1 στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου gapdh. *Ρ<0.05, σε σχέση με τα HGEC:5mM, #Ρ<0.05 σε σχέση με τα HGEC:25mM. 127