ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ, ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΔΟΜΗΣ ΝΕΩΝ ΧΑΛΚΟΝΩΝ ΚΑΙ ΩΡΟΝΩΝ ΩΣ ΑΝΑΣΤΟΛΕΩΝ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΤΥΡΟΣΙΝΑΣΗ

Transcript

1 ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ, ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΔΟΜΗΣ ΝΕΩΝ ΧΑΛΚΟΝΩΝ ΚΑΙ ΩΡΟΝΩΝ ΩΣ ΑΝΑΣΤΟΛΕΩΝ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΤΥΡΟΣΙΝΑΣΗ Α. Ο. Χατζηβασιλείου, Μ. Ρουσσάκη, Α. Δέτση Σχολή Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π., Ηρώων Πολυτεχνείου 9, Αθήνα Ε. Κρίτση, Π. Ζουμπουλάκης Ινστιτούτο Βιολογίας, Φαρμακευτικής Χημείας και Βιοτεχνολογίας, Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών, Βασ. Κων/νου 48, Αθήνα B. Petrushevski, Π. Κεφάλας Τμήμα Ποιότητας Τροφίμων και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, Μεσογειακό Αγρονομικό Ινστιτούτο Χανίων/ Centre International de Hautes Etudes Agronomiques Méditerranéennes, Χανιά, Κρήτη ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στο πλαίσιο των ερευνών μας για τη σύνθεση και αξιολόγηση βιολογικής δράσης φυσικών φλαβονοειδών και συνθετικών αναλόγων τους, παρουσιάζεται η έρευνα μοριακών ικριωμάτων χαλκονών και ωρονών ως ενώσεις με πιθανή βιολογική δράση. Αρχικά πραγματοποιήθηκαν in silico μελέτες πρόσδεσης παραγώγων χαλκονών και ωρονών για τον προσδιορισμό της ικανότητάς τους να δράσουν ως αναστολείς της τυροσινάσης. Με βάση τα αποτελέσματα των in silico μελετών πρόσδεσης, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση ο χαρακτηρισμός νέων ωρονικών παραγώγων και η μελέτη της βιολογικής τους δράσης. Ο πλήρης χαρακτηρισμός της δομής τους, έγινε με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού μιας και δύο διαστάσεων (1D και 2D NMR). Επίσης μελετάται η in vitro ικανότητα των ενώσεων να αναστέλλουν τη δράση της τυροσινάσης και τα αποτελέσματα θα συγκριθούν με αυτά της in silico πρόβλεψης. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι χαλκόνες είναι ενώσεις με ανοικτή αλυσίδα, πρόδρομοι των φλαβονοειδών, ευρέως ευρισκόμενες σε βρώσιμα φυτά, ενώ οι ωρόνες είναι πιο σπάνια απαντώμενα και λιγότερο μελετηθέντα φλαβονοειδή, υπεύθυνα για το κίτρινο χρωματισμό στα καλλωπιστικά φυτά. Το κοινό δομικό μοτίβο αυτών των φλαβονοειδών είναι το α, β-ακόρεστο καρβονυλικό σύστημα και η παρουσία δύο αρωματικών δακτυλίων Α και Β (Σχήμα 1) [1]. Σχήμα 1: Γενική δομή των χαλκονών και των ωρονών Η τυροσινάση είναι μια μονοοξυγενάση που περιέχει χαλκό στο ενεργό της κέντρο, και είναι ευρέως διαδεδομένη στη φύση. Η τυροσινάση είναι το ένζυμο-κλειδί που εμπλέκεται στην βιοσύνθεση μελανίνης η οποία καθορίζει το χρώμα του δέρματος και των μαλλιών των θηλαστικών και τα προστατεύει από την υπεριώδη ακτινοβολία. Υπερπαραγωγή και συσσώρευση μελανίνης στο δέρμα μπορεί να οδηγήσει σε ανωμαλίες δυσχρωμιών (μέλασμα, μεταφλεγμονώδης υπερμελάγχρωση, φακίδες κλπ). Η τυροσινάση παίζει σημαντικό ρόλο στη

2 σύνθεση της νευρομελανίνης στον ανθρώπινο εγκέφαλο και τον νευροεκφυλισμό που σχετίζεται με νόσο του Parkinson. Επιπλέον, αυτό το ένζυμο είναι υπεύθυνο για την ανεπιθύμητη ενζυμική αμαύρωση των φρούτων και λαχανικών. Ως αποτέλεσμα, η τυροσινάση είναι ένα ένζυμο-στόχος από την σκοπιά των επιστημών των φαρμάκων, των καλλυντικών και των τροφίμων [2]. Η μοριακή πρόσδεση (Molecular Docking-MD) ορίζεται ως η in silico πρόβλεψη της δομής ενός συμπλόκου, που προκύπτει από την πρόσδεση ενός μορίου προσδέτη σε ένα μεγαλύτερο μόριο υποδοχέα (στο παρόν: η τυροσινάση). Ένα πρόγραμμα πρόσδεσης χρησιμοποιείται για να τοποθετήσει πολλές διαφορετικές αναπαραστάσεις ενός μικρού μορίου σε μια δομή-στόχο (ή σε ένα τμήμα αυτού, π.χ., το ενεργό κέντρο ενός ενζύμου) σε μία ποικιλία θέσεων και προσανατολισμών. Προκειμένου να προσδιοριστεί η πιο ευνοϊκή πόζα, η κάθε πόζα βαθμολογείται (σκοράρεται) με βάση την συμπληρωματικότητά της ως προς τον στόχο όσον αφορά το σχήμα και τις φυσικοχημικές ιδιότητες όπως οι ηλεκτροστατικές επιδράσεις. Μια καλή βαθμολογία δείχνει ότι το μόριο είναι πιθανώς ένας καλός προσδέτης [3,4]. Μια σημαντική εξέλιξη στο NMR ήταν η εισαγωγή της έννοιας της φασματοσκοπίας NMR δύο διαστάσεων (2D NMR). Σε αυτό το πείραμα παράγεται φάσμα που αναπτύσσεται σε 2 διαστάσεις και η παρουσία σήματος στο δισδιάστατο επίπεδο σηματοδοτεί την συσχέτιση δύο πυρήνων. Κάποια από τα πειράματα συσχέτισης είναι το COSY (συσχέτιση πυρήνων 1 H- 1 H που απέχουν μεταξύ τους 3 δεσμούς), το HSQC (συσχέτιση πυρήνων 1 H- 13 C που απέχουν μεταξύ τους 1 δεσμό) και το HMBC (συσχέτιση πυρήνων 1 H- 13 C που απέχουν μεταξύ τους 2 ή παραπάνω δεσμούς) [4]. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α. Ιn silico μελέτη της ικανότητας πρόσδεσης (docking) βιοδραστικών μορίων στο ενεργό κέντρο του ενζύμου τυροσινάση. Στα πλαίσια των τεχνικών της ορθολογικής ανακάλυψης φαρμάκων πραγματοποιήθηκαν αρχικές in silico μελέτες της ικανότητας πρόσδεσης (docking) των μορίων που περιέχονται στην βιβλιοθήκη ενώσεων του Εργαστηρίου Οργανικής Χημείας για την ανακάλυψη κατηγοριών ενώσεων που παρουσιάζουν τάσεις ισχυρής πρόσδεσης στα ιόντα χαλκού του ενεργού κέντρου της τυροσινάσης. Οι μελέτες μοριακής πρόσδεσης έγιναν μέσω χρήσης των προγραμμάτων LigPrep 2.6 και Glide 5.8 της οικογένειας προγραμμάτων Maestro Schrödinger Suite 2012, με την τυροσινάση του μανιταριού Agaricus Bisporus ως υποδοχέα (Κρυσταλλική δομή μέσω XRD, ανάλυση 2,78Å, PDB ID: 2Y9X). Αυτή η τυροσινάση κρυσταλλώνεται ως διμερές με έκαστο μονομερές να έχει τέσσερις υπομονάδες, δύο υπομονάδες Η, οι οποίες είναι υπεύθυνες για την ενζυμική δράση και δύο υπομονάδες L των οποίων δραστικότητα είναι προς το παρόν αδιευκρίνιστη. Η πρωτεΐνη προετοιμάστηκε τροποποιώντας την αρχική δομή, όπως αυτή παρέχεται από την PDB, αφαιρώντας το ένα μονομερές καθώς και τις δύο L υπομονάδες, αλλά και μια H από το εναπομείναν μονομερές. Όπως και όλες οι τυροσινάσες και το εξεταζόμενο ένζυμο περιέχει δύο ιόντα Cu (II) ως τους κύριους συμπαράγοντες στο ενεργό κέντρο, τα οποία συντονίζονται με 6 αμινοξέα ιστιδίνης. Οι προσδέτες αρχικά προετοιμάστηκαν για πρόσδεση κοντά στο ph βέλτιστης δράσης της τυροσινάσης (ph=6.5) στο πεδίο δυνάμεων OLPS 2005 και κατόπιν εφαρμόστηκαν οι τεχνικές πρόσδεσης απλής ακρίβειας (SP) ή διπλής ακρίβειας (XP) σε άκαμπτο υποδοχέα [2,6,7,8].

3 Β. Σύνθεση χαλκονών και ωρονών Η σύνθεση των υπό εξέταση χαλκονών πραγματοποιήθηκε μέσω αντίδρασης συμπύκνωσης τύπου Claisen-Schmidt μεταξύ κατάλληλα υποκατεστημένων 2-υδροξυ-ακετοφαινονών 1 και βενζαλδεϋδών 2 (Σχήμα 2). Η αντίδραση λαμβάνει χώρα σε βασικό περιβάλλον (αιθανόλη- 20% υδατικό διάλυμα ΚΟΗ) σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Μετά το τέλος της αντίδρασης, το μίγμα οξινίζεται με υδατικό διάλυμα HCl 10% οπότε παραλαμβάνονται οι χαλκόνες 3a-g. Σχήμα 2: Σύνθεση των χαλκονών 3a-g. Οι ωρόνες 4a-g παρασκευάστηκαν μέσω αντίδρασης οξειδωτικής κυκλοποίησης των αντίστοιχων χαλκονών 3a-g, χρησιμοποιώντας ως καταλύτη οξικό υδράργυρο σε διαλύτη πυριδίνη, σε θερμοκρασία 110 o C (Σχήμα 3). Μετά το τέλος της αντίδρασης, οι επιθυμητές ωρόνες παραλαμβάνονται με οξίνιση με υδατικό διάλυμα HCl 10% και εκχύλιση με διχλωρομεθάνιο. Σχήμα 3: Σύνθεση των ωρονών 4a-g. Προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της παρουσίας φαινολικών υδροξυλίων στη βιολογική δράση των ωρονών, πραγματοποιήθηκε απομάκρυνση της μεθυλο-ομάδας από τους μεθοξυ-υποκαταστάτες των ωρονών 4a-c. Η αντίδραση λαμβάνει χώρα υπό την επίδραση τριβρωμιούχου βορίου σε διαλύτη διχλωρομεθάνιο, και παρέχει τα τελικά προϊόντα 5a-c σε καθαρή μορφή, μετά από κατάλληλη επεξεργασία (Σχήμα 4). Σχήμα 4: Σύνθεση των ωρονών 5a-c.

4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η δομή όλων των ενώσεων που παρασκευάστηκαν ταυτοποιήθηκε με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού ( 1 H και 13 C NMR) σε διαλύτη DMSO-d 6. Για τον πλήρη χαρακτηρισμό των ωρονών 5a-c, ελήφθησαν φάσματα NMR δύο διαστάσεων (COSY, HSQC και HMBC). Ενδεικτικά παρουσιάζεται τμήμα της μεθοδολογίας πλήρους χαρακτηρισμού της ωρόνης 5b μέσω των φασμάτων NMR αυτής: 1 Σχήμα 5: Η ωρόνη 5b Στα πειράματα 1-D NMR που διεξήχθησαν παρατηρήθηκαν τα εξής σήματα: Πίνακας 1: Σήματα 1 Η της 5b Σήμα 1 Η Χημική μετατόπιση (ppm) Ολοκλήρωση/πολλαπλότητα Α 9,760 1Η, s Β 9,228 1Η, s Γ 7,757 2Η, m Δ 7,484 2Η, m Ε 7,298 2Η, m ΣΤ 6,849 1Η, d Ζ 6,789 1Η, s Πίνακας 2: Σήματα 13 C της 5b Σήμα 13 C Χημική μετατόπιση (ppm) Σήμα 13 C Χημική μετατόπιση (ppm) α 186 θ 126,7 β 168 ι 126,3 γ 151 ια 124,4 δ 148 ιβ 121,3 ε 147 ιγ 119,3 στ 140 ιδ 117 ζ 128,2 ιε 116 η 127,3 Βάσει των σημάτων που παράγονται από τα φάσματα 1 Η και 13 C, αλλά και μέσω των 2D φασμάτων της (Εικόνα 1), μπορεί να ξεκινήσει η ανάλυση-ταυτοποίηση ως εξής: Δεδομένης της χημικής μετατόπισης των σημάτων A και B αλλά και λόγω του γεγονότος πως στο πείραμα HSQC δεν παρουσιάζουν καμία συσχέτιση με σήματα ανθράκων, προκύπτει πως αυτά ανήκουν στα πρωτόνια των δυο υδροξυλίων (αυτών που συνδέονται στους 3 και 4, δηλαδή τα 1 και 2 ). Στο πείραμα HMBC τα σήματα Α και Β συσχετίζονται με τις κορυφές γ,δ,ιγ και γ,δ,ιβ αντίστοιχα. Συνεπώς προκύπτει πως οι κορυφές γ και δ αντιστοιχούν στους άνθρακες των θέσεων 3 και 4 και τα ιβ, ιγ σε άνθρακες των θέσεων 2 και 5. Το γεγονός 2

5 πως τα σήματα ιβ και ιγ συσχετίζονται στο HSQC με τα σήματα Δ και ΣΤ, αλλά πως μόνο στην θέση 2 αναμένεται διπλή κορυφή στο φάσμα 1 Η (όπως η ΣΤ) οδηγεί στο συμπέρασμα πως στις θέσεις 1, 2, 5 και 2 αντιστοιχούν τα σήματα Β, Α, ΣΤ & ιγ και Δ & ιβ αντιστοίχως. Επειδή το Α συσχετίζεται ισχυρότερα με το δ παρά με το γ και επειδή το Β συσχετίζεται ισχυρότερα με το γ παρά με το δ θεωρείται πως οι κορυφές γ και δ αντιστοιχούν στις θέσεις 3 και 4 αντιστοίχως. Εικόνα 1: Τα φάσματα 1 Η (άνω αρ.), COSY (άνω δεξ.), HSQC (κάτω αρ.) και HMBC (κάτω δεξ.) της ωρόνης 5b Συνεχίζοντας την μεθοδολογία που αναπτύχθηκε ανωτέρω για όλα τα δεδομένα που ελήφθησαν από τα φάσματα NMR γίνεται η ταυτοποίηση της ωρόνης 5b ως εξής: Πίνακας 3: Αντιστοιχήσεις σημάτων NMR σε θέσεις στο μόριο της 5b Θέση Σήμα/Σήματα Θέση Σήμα/Σήματα 2 ε 1 ι 3 α 2 Δ & ιβ 4 Γ & στ 3 γ 5 Δ & ιε 4 δ 6 Γ & η 5 ΣΤ & ιγ 7 Ε & θ 6 Ε & ζ 8 ια 1 Β 9 β 2 Α 10 Ζ & ιδ Με παρόμοιο τρόπο γίνεται η ταυτοποίηση και των 5a και 5c.

6 Πραγματοποιήθηκαν επίσης μελέτες πρόσδεσης των ενώσεων, οι οποίες είχαν προετοιμαστεί για την μελέτη πρόσδεσης όπως και ανωτέρω, στον υποδοχέα της τυροσινάσης. Ως πιθανοί υποδοχείς χρησιμοποιήθηκαν η τυροσινάση του μανιταριού Agaricus Bisporus (PDB ID: 2Y9X), η τυροσινάση από τον Streptomyces castaneoglobisporus σε σύμπλοκο με μια caddie protein (η οποία αφαιρέθηκε) (PDB ID: 1WX2), και η τυροσινάση από τον Bacillus megaterium (PDB ID: 3ΝΜ8), μετά από κατάλληλη προετοιμασία. Οι τεχνικές πρόσδεσης που χρησιμοποιήθηκαν ήταν (α) αυξημένης ακρίβειας σε άκαμπτο υποδοχέα (XP), (β) κβαντικά-πολωμένης πρόσδεσης σε άκαμπτο υποδοχέα (quantum-polarized ligand docking- QLPD), (γ) επαγόμενης πρόσδεσης σε εύκαμπτο υποδοχέα. Από τα αποτελέσματα της in silico μελέτης, προέκυψε πως, από τις ενώσεις που εξετάστηκαν, η ένωση 5b (Εικόνα 2) παρουσίαζε τα καλύτερα αποτελέσματα πρόσδεσης στην τυροσινάση. Καλά αποτελέσματα πρόσδεσης ελήφθησαν και για άλλες ενώσεις, όπως τις 5a, 4f και 4g. Ως καλό αποτέλεσμα πρόσδεσης νοείται αυτό στο οποίο κάποιας ομάδας του εξεταζόμενου μορίου-προσδέτη (λ.χ. τα υδροξύλια στο κατεχολικό σύστημα της ένωσης 5b) προσεγγίζει τουλάχιστον ένα από τα ιόντα Cu του ενεργού κέντρου της τυροσινάσης σε απόσταση μικρότερη των 3Å, ούτως ώστε να μπορούν να δημιουργήσουν σύμπλοκο με τα ιόντα, πιθανώς παρεμποδίζοντας το ένζυμο της τυροσινάσης. Σημειώνεται πως μια πόζα πρόσδεσης θεωρείται καλύτερη αν παρατηρείται η ανάπτυξη δεσμών υδρογόνου μεταξύ ομάδων του προσδέτη και πλευρικών αμινοξέων του ενζύμου, καθώς τέτοιοι δεσμοί ενισχύουν την σταθερότητα του συμπλόκου προσδέτη-υποδοχέα, οδηγώντας πιθανώς σε καλύτερη παρεμπόδιση της τυροσινάσης. Εικόνα 2. Πρόσδεση της ένωσης 5b στο ενεργό κέντρο της τυροσινάσης 2Y9X. Τρισδιάστατο μοντέλο και διάγραμμα αλληλεπιδράσεων. Παρατηρήθηκε οι ενώσεις που παρουσιάζουν κατεχολικό σύστημα στον Β δακτύλιο να παρουσιάζουν ισχυρή τάση πρόσδεσης, αλλά η ομάδα του καρβοξυλικού οξέος παρουσίασε ακόμα μεγαλύτερη τάση προσέγγισης του ενεργού κέντρου του ενζύμου, δηλαδή οι

7 προσδέσεις στο ενεργό κέντρο μέσω αυτής της ομάδας παράγονταν πιο συχνά και είχαν καλύτερη βαθμολογία πρόσδεσης. Επίσης, παρατηρήθηκε πως, σε γενικές γραμμές οι χαλκόνες είχαν καλύτερες πόζες πρόσδεσης από τις αντίστοιχες ωρόνες τους, πιθανότατα λόγω της μεγαλύτερης ευκαμψίας που παρουσιάζουν τα μόριά τους [8]. Διεξάγονται in vivo βιολογικές έρευνες παρεμπόδισης του ενζύμου της τυροσινάσης για να προσδιοριστεί η ακρίβεια των αποτελεσμάτων της in silico μελέτης. Τα τελικά αποτελέσματα των ερευνών δεν είναι ακόμα διαθέσιμα. Επίσης στα πλαίσια των ερευνών έγιναν και προτάσεις βελτίωσης της δομής των ωρονών που παρουσίασαν τα καλύτερα αποτελέσματα πρόσδεσης και υποβολή των τροποποιημένων μορίων εκ νέου σε μελέτες πρόσδεσης για να δώσει νέες προοπτικές για τον ορθολογικό σχεδιασμό επιπλέον αναλόγων ωρονών, αλλά και για ελεγθεί ο ρόλος της ομάδας του καρβοξυλικού οξέος ως υποκαταστάτη [8]. Παρατηρήθηκε πως ενώ συνήθως οι ομάδες που περιέχονται στον B δακτύλιο μιας ωρόνης παίζουν κυριότερο ρόλο στον τρόπο πρόσδεσης αυτής στην τυροσινάση, εισαγωγή ομάδας καρβοξυλικού οξέος στον Α δακτύλιο ως υποκαταστάτη οδηγεί σε αποτελέσματα πρόσδεσης στα οποία η ένωση σε όλες τις παραγόμενες πόζες στρέφει τον Α δακτύλιο αντί του Β προς το ενεργό κέντρο, ακόμα και αν στον Β δακτύλιο υπάρχει κατεχολικό σύστημα, το οποίο οδηγεί σε καλή πόζα πρόσδεσης (Εικόνα 3). Από το ανωτέρω συμπεραίνεται η σημασία που ίσως έχει η καρβοξυλομάδα ως υποκαταστάτης σε ωρόνες ή χαλκόνες με σκοπό την παρεμπόδιση της τυροσινάσης. Εικόνα 3. Παράδειγμα πρόσδεσης στην τυροσινάση 2Y9X ωρόνης η οποία είναι δομικό ανάλογο της 5b ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Βάσει πρωταρχικών in silico μελετών πρόσδεσης αναλόγων φλαβονοειδών στην τυροσινάση συντέθηκαν νέα ανάλογα χαλκονών και ωρονών και έγινε ταυτοποίησή τους μέσω φασματοσκοπίας NMR 1D και σε κάποιες περιπτώσεις 2D. Έγιναν περαιτέρω in silico μελέτες πρόσδεσης των συντεθιμένων ενώσεων και παραλλαγών πάνω σε αυτές και ελήφθησαν ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Αναμένονται τα αποτελέσματα της μελέτης in vitro

8 ικανότητας παρεμπόδισης της τυροσινάσης ούτως ώστε να συγκριθούν με την αυτά της in silico μελέτης. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] A. Detsi, M. Majdalani, Kontogiorgis C.A., Hadjipavlou-Litina D., Kefalas P.,, Natural and synthetic 2'-hydroxy-chalcones and aurones: Synthesis, characterization and evaluation of the antioxidant and soybean lipoxygenase inhibitory activity, Bioorganic & Medicinal Chemistry 17: (2009) [2] T.-S. Chang, An Updated Review of Tyrosinase Inhibitors, Int. J. Mol. Sci. 10: (2009) [3] Μαυρομούστακος, Θ., Ζουμπουλάκης, Π., 2008, Μοριακή Μοντελοποίηση Εφαρμογές στην Οργανική και Φαρμακευτική Χημεία, Ιατρικές Εκδόσεις Γιάννης Β. Παρισιάνος [4] P.F.W. Stouten, R.T. Kroemer, 2007, Docking and Scoring, in "Comprehensive Medicinal Chemistry II", ed. John B. Taylor and David J. Triggle, p.p , Elsevier, Oxford [5] Balci, M., 2005, "Basic 1 H- and 13 C-NMR Spectroscopy", Elsevier [6] Glide, version 5.8, Schrödinger, Inc., New York, NY, 2012 [7] Friesner, R. A., Banks, J. L., et al. J. Med. Chem. 2004, 47, [8] O. Chatzivasiliou, M. Roussaki, E. Kritsi, A. Detsi, P. Zoumpoulakis, Exploring the potential of flavonoids as tyrosinase inhibitors: molecular docking studies of natural and synthetic chalcones and aurones, International Conference on Chemistry for Health, Athens (2012), p.106