Ππξεληθνί πνιπεδξηθνί ηνί ιεπηδνπηέξσλ εληόκσλ: κνξηαθόο ραξαθηεξηζκόο θαη ρξήζε ζε εθαξκνγέο βηνηερλνινγίαο

Transcript

1 ΔΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΓΙΣΡΙΑΚΟ ΠΑΝΔΠΙΣΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΥΟΛΗ ΘΔΣΙΚΩΝ ΔΠΙΣΗΜΩΝ ΣΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑ Σνκέαο Βηνρεκείαο θαη Μνξηαθήο Βηνινγίαο Ππξεληθνί πνιπεδξηθνί ηνί ιεπηδνπηέξσλ εληόκσλ: κνξηαθόο ραξαθηεξηζκόο θαη ρξήζε ζε εθαξκνγέο βηνηερλνινγίαο Γζδαηημνζηή Γζαηνζαή Κσλζηαληίλνο Γ. Ισαλλίδεο, MSc Νμζδθεοηήξ Π.Δ. ΑΘΗΝΑ 2016

2 Δηθόλεο εμώθπιινπ από: (Leunis & Ludwig, 1891) (Slack & Arif, 2007) ΑΘΗΝΑ 2016

3 ΔΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΓΙΣΡΙΑΚΟ ΠΑΝΔΠΙΣΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΥΟΛΗ ΘΔΣΙΚΩΝ ΔΠΙΣΗΜΩΝ ΣΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑ Σνκέαο Βηνρεκείαο θαη Μνξηαθήο Βηνινγίαο Ππξεληθνί πνιπεδξηθνί ηνί ιεπηδνπηέξσλ εληόκσλ: κνξηαθόο ραξαθηεξηζκόο θαη ρξήζε ζε εθαξκνγέο βηνηερλνινγίαο Γζδαηημνζηή Γζαηνζαή Κσλζηαληίλνο Γ. Ισαλλίδεο, MSc Νμζδθεοηήξ Π.Δ. ΑΘΗΝΑ 2016

4 ΑΘΗΝΑ 2016

5 NATIONAL & KAPODISTRIAN UNIVERSITY OF ATHENS SCHOOL OF SCIENCE DEPARTMENT OF BIOLOGY Department of Biochemistry & Molecular Biology Lepidopteran Nuclear Polyhedrosis Viruses: molecular characterization and applications in biotechnology Doctorate (PhD) Thesis Konstantinos D. Ioannidis, BSc, MSc Nurse (RN/4-year BSc) ATHENS 2016

6 ATHENS 2016

7 Τριμελήσ ςυμβουλευτική επιτροπή: Δρ. Τςιτήλου Σόνια (επιβλέπουςα καθηγήτρια) Αναπληρώτρια Καθηγήτρια τμήματοσ Βιολογίασ ΕΚΠΑ Δρ. Ιατροφ Κώςτασ Ερευνητήσ Α, Ινςτιτοφτο Βιοεπιςτημών και Εφαρμογών, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτοσ» Δρ. Σίδερησ Διαμάντησ Αναπληρωτήσ Καθηγητήσ τμήματοσ Βιολογίασ ΕΚΠΑ Επταμελήσ εξεταςτική επιτροπή: Δρ. Τςιτήλου Σόνια Αναπληρώτρια Καθηγήτρια τμήματοσ Βιολογίασ ΕΚΠΑ Δρ. Ιατροφ Κώςτασ Ερευνητήσ Α, Ινςτιτοφτο Βιοεπιςτημών και Εφαρμογών, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτοσ» Δρ. Σίδερησ Διαμάντησ Αναπληρωτήσ Καθηγητήσ τμήματοσ Βιολογίασ ΕΚΠΑ Δρ. Luc Swevers Ερευνητήσ Α, Ινςτιτοφτο Βιοεπιςτημών και Εφαρμογών, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτοσ» Δρ. Δημήτριοσ Στραβοπόδησ Επίκουροσ Καθηγητήσ τμήματοσ Βιολογίασ ΕΚΠΑ Δρ. Κωνςταντίνοσ Βοργιάσ Καθηγητήσ τμήματοσ Βιολογίασ ΕΚΠΑ Δρ. Ηρώ Γεωργοφςη Ερευνήτρια Α, Ινςτιτοφτο Βιοεπιςτημών και Εφαρμογών, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτοσ» ΑΘΗΝΑ 2016

8 Ζ έγκπιζη ηηρ διδακηοπικήρ διαηπιβήρ από ηο ημήμα Βιολογίαρ ηηρ Σσολήρ Θεηικών Δπιζηημών ηος Δθνικού και Καποδιζηπιακού Πανεπιζηημίος Αθηνών δεν ςποδηλώνει αποδοσή ηυν γνυμών ηος ζςγγπαθέα. Ν. 5343/1932, Απθπο 202 ΑΘΗΝΑ 2016

9 Πξόινγνο Καζ έηζζ θηάκς θμζπυκ ζηδκ εοηοπή εέζδ κα βνάθς ημκ Πνυθμβμ ηδξ Γζδαηημνζηήξ ιμο Γζαηνζαήξ! Γε βκςνίγς ακ ζοκδείγεηαζ, αθθά αοηυ ημ πνχημ ηείιεκμ ηδξ δζαηνζαήξ πνμζςπζηά ημ είπα αθήζεζ βζα ημ ηέθμξ. Ωξ εη ημφημο δ ζφκεεζή ημο ένπεηαζ πναβιαηζηά κα ζθναβίζεζ ιία απαζηδηζηή, πμθοδαίδαθδ, αθθά ζοκάια ηαζ ζδζαίηενα ζοκανπαζηζηή εηπαζδεοηζηή πμνεία εηχκ ζημ πχνμ ηδξ ένεοκαξ. Μία πμνεία πμο δε εα ήηακ εθζηηή πςνίξ ηαη ανπάξ ηδκ απμδμπή ηαζ επζπθέμκ ηδ δζανηή ηαεμδήβδζδ ημο επζαθέπμκηά ιμο ηαζ δζεοεοκηή ενεοκχκ ζημ ενβαζηήνζμ Μμνζαηήξ Γεκεηζηήξ Δκηυιςκ ηαζ Βζμηεπκμθμβίαξ ημο ΔΚΔΦΔ Γδιυηνζημξ Γν. Κχζηα Ηαηνμφ, απυ ημκ μπμίμ δζδάπεδηα πμθθά αηυια ηαζ ιέζα απυ ηζξ, πάκηα δδιζμονβζηέξ, ζοβηνμφζεζξ ιαξ. Καζ θοζζηά αοηυ ημ δζδαηημνζηυ δε εα ήηακ αοηυ πμο είκαζ πςνίξ ηδκ επίζδξ δζανηή ηαεμδήβδζδ ημο δζεοεοκηή ενεοκχκ ημο ίδζμο ενβαζηδνίμο Γν. Luc Swevers, μ μπμίμξ ήηακ πάκηα μ άιεζμξ ζοιπαναζηάηδξ ηαζ ανςβυξ ιμο ζηα πεζνάιαηα ηαζ ημκ ενεοκδηζηυ ζπεδζαζιυ. αξ εοπανζζηχ πμθφ πμο ιε δζδάλαηε κα δζελάβς ένεοκα! Δοπανζζηχ επζπθέμκ ηδκ επζαθέπμοζα ηδξ δζαηνζαήξ απυ ημκ ημιέα Μμνζαηήξ Βζμθμβίαξ ηαζ Βζμπδιείαξ ημο ηιήιαημξ Βζμθμβίαξ ΔΚΠΑ, ακαπθδνχηνζα ηαεδβήηνζα Γν. υκζα Σζζηήθμο, ηαεχξ ηαζ ημκ ακαπθδνςηή ηαεδβδηή Γν. Γζαιάκηδ ίδενδ, βζα ηδ αμήεεζα ηαζ ηζξ ηνζηζηέξ παναηδνήζεζξ ημοξ. Καζ ζδζαζηένςξ ηδκ Γν. Σζζηήθμο βζα ηδ θεπημιενεζαηή ελέηαζδ ηδξ δζαηνζαήξ ηαζ ηζξ δζμνεχζεζξ ηδξ. Απυ ημ ΔΚΔΦΔ Γδιυηνζημξ ηαζ ημ ηιήια Βζμθμβίαξ εοπανζζηχ ηαζ ηα οπυθμζπα ιέθδ ηδξ 7ιεθμφξ επζηνμπήξ ελέηαζδξ, ηδ δζεοεφκηνζα ενεοκχκ Γν. Ζνχ Γεςνβμφζδ, ημκ επίημονμ ηαεδβδηή Γν. Γδιήηνδ ηνααμπυδδ ηαζ ημκ ηαεδβδηή Γν. Κςκηακηίκμ Βμνβζά βζα ηδ εηηίιδζδ ηδξ δζαηνζαήξ ηαζ ηδκ ελέηαζή ηδξ. Δπίζδξ εοπανζζηχ υθα ηα ιέθδ ημο ενβαζηδνίμο πμο βκχνζζα ηαηά ημ πνυκμ ιμο εηεί: Σδ θμαενή ηεπκζηυ ηα Γήιδηνα ηεθάκμο ιε ηζξ ηθαζζζηέξ ηαθθζηεπκζηέξ ακδζοπίεξ. Πένα απυ ηδκ πναηηζηή αμήεεζα ζε οθζηά ηαζ δζενβαζίεξ, δ εεηζηή πανμοζία ηδξ ηαζ δ επαθή ιμο ιε ημ 3 μ πνυβναιια ηδξ ΔΡΣ ήηακ ειπεζνίεξ ακεηηίιδηεξ (ζδίςξ μζ άνζεξ!). Σδκ αεζηίκδηδ ιεηα-δζδάηημνα Γν. Rodica Efrose, ιε ηδκ εθπίδα υηζ έπεζ πθέμκ παθανχζεζ ηαζ ζηαιάηδζε κα ηνέπεζ. Σδκ εοπανζζηχ βζα οθζηά ηαζ πεζναιαηζηή αμήεεζα, αθθά ηονίςξ βζα ηδκ υιμνθδ αφνα ηδξ. Σδ ιεηα- ΑΘΗΝΑ 2016

10 δζδάηημνα Γν. Γεςνβία Κμηγζά επίζδξ βζα ηδκ πανέα ηδξ. Καζ ηδκ οπενααηζηή δζαννφειζζδ ημο πάβημο ηδξ. Σμκ ιεηα-δζδάηημνα Γν. Κχζηα Κμφζδ βζα ηδ αμήεεζα, ηα ηαοζηζηά ζπυθζα ηαζ ηδκ down to earth approach ιε ηδκ εοπή κα ανεζ ηνυπμ κα παναιείκεζ ζημ Ζκ. Βαζίθεζμ πανά ημ Brexit. Σδ ιεηα-δζδάηημνα Γν. Γεςνβία Κοενεχηδ πμο έηακε ηδ ζφγεολδ πδιείαξ-αζμθμβίαξ. Σδ ιεηα-δζδάηημνα Γν. Πακαβζχηα Σζίημονα βζα ηδκ ήνειδ πανμοζία ηδξ ζημ πχνμ ηαζ ηδ αμήεεζά ηδξ. Σμκ ηεπκζηυ ζφκημια Γν. Υνήζημ Μενζζημφδδ ιε ηδκ εοπή may the Force be with him. Καζ θοζζηά ημκ ιεηα-δζδάηημνα Γν. Άνζ Εςβναθίδδ βζα ηδκ έιπκεοζδ πμο απμηεθεί δ πανμοζία ημο ηαζ μζ εζηαζηζηέξ πανειαάζεζξ ζηδ δζαηυζιδζδ πχνμο. Σδ ζοκοπμρήθζα δζδάηημνα ηαζ κοκ Γν. Υνζζηζάκκα Μαβηνζχηδ, ζίβμονα ηαζ βζα ηζξ ιμοζζηέξ ηαζ αεθδηζηέξ ηδξ πνμηζιήζεζξ. Σδ ζοκ-οπμρήθζα δζδάηημνα ηαζ ζφκημια Γν. Άκκα Κμθζμπμφθμο βζα ηδ αμήεεζα ηαζ ηονίςξ ηδ εεηζηή αηιυζθαζνα πμο είπαιε ζημ ενβαζηήνζμ. Σδ ζοκ-οπμρήθζα δζδάηημνα ηαζ ζφκημια Γν. Νάκηζα δνάθζα βζα ηδ εεηζηή αφνα ηαζ ημκ εοπάνζζημ παναηηήνα ηδξ ιε ηδκ εοπή κα ηεθεζχκεζ βνήβμνα. Σδκ ενεοκήηνζα Β Γν. Μπέζζο Λαιπνμπμφθμο βζα ηδκ ηαθή ζοκενβαζία ιαξ. Καζ ημκ ηεπκζηυ η. Γδιήηνδ Κμπακέθδ βζα ηα πδηηχιαηα αβανυγδξ ηαζ ηονίςξ ηδ ιμκαδζηή πανμοζία ημο. Αθθά ηαζ πένακ ημο ενβαζηδνίμο εοπανζζηχ ηα ιέθδ ημο Ηκζηζημφημο Βζμθμβίαξ ημο ΔΚΔΦΔ Γδιυηνζημξ, κοκ Ηκζηζημφημ Βζμεπζζηδιχκ ηαζ Δθανιμβχκ, βζα ημ ημοθάπζζημκ εκδζαθένμκ ηαζ υιμνθμ ιζηνμπενζαάθθμκ πμο απμηέθεζακ. Δζδζηή ικεία πνέπεζ κα βίκεζ βζα ημοξ ενεοκδηέξ Γν. Αββέθζηα Υνυκδ, Γν. Γενάζζιμ Βμοηζζκά, Γν. Γδιήηνδ Κθέηζα ηαζ Γν. Μανία Πεθεηάκμο πμο ιε δέπηδηακ ζηα ενβαζηήνζά ημοξ ζηα πθαίζζα ηδξ ανπζηήξ εηπαίδεοζήξ ιμο ζημ Ηκζηζημφημ. Καζ επζπθέμκ ζημ ζφκμθμ ηςκ θμζηδηχκ πμο ζοιπμνεοηήηαιε ιαγί. Υαναηηδνζζηδηά εα ακαθένς ημκ Γν. πθέμκ Μάνζμ Ξοδμφξ ηαζ ημκ ζφκημια Γν. Κχζηα Απμζηυθμο βζα ηδκ ηαθή πανέα ηαζ ηζξ ειπκεοζιέκεξ ζογδηήζεζξ ιαξ. Δπίζδξ ηαζ ςξ οπυηνμθμξ-οπμρήθζμξ δζδάηημναξ ημο ΔΚΔΦΔ Γδιυηνζημξ εοπανζζηχ ζδζαζηένςξ υζμοκ ζοκέθααακ ηδκ ζδέα ηαζ επζπθέμκ οθμπμίδζακ ημ πνυβναιια οπμηνμθζχκ ημο Κέκηνμο. Σα πνήιαηα αηυια ηαζ ιε ηδκ αφλδζδ ημο 2008 ήηακ θίβα, αθθά ημοθάπζζημκ οπήνπακ ηαζ επέηνεπακ ιία οπμζηδνζγυιεκδ ιεκ ανηεηά αλζμπνεπή δε εηπυκδζδ δζαηνζαήξ. Δίκαζ εκδζαθένμκ υηζ πθέμκ ημ πνυβναιια οπμηνμθζχκ ανίζηεηαζ ζε επ αυνζζημκ ακαζημθή θυβς δζμζηδηζηχκ επζθμβχκ ααζζζιέκςκ ζε ακηίζημζπεξ ηοαενκδηζηέξ ιεζχζεζξ ημο πνμτπμθμβζζιμφ ηςκ ΑΘΗΝΑ 2016

11 ενεοκδηζηχκ ηέκηνςκ. Οπςζδήπμηε είκαζ ηαηακμδηή δ ακάβηδ βζα πνμζανιμβή ζηζξ ζοκεήηεξ. Όιςξ μ ζηυπμξ πζζηεφς εα έπνεπε κα είκαζ δ αεθηζζημπμίδζδ ηαζ υπζ μ ιδδεκζζιυξ ηαζ εα ήηακ ζηυπζιμ κα οπάνλεζ ιία ηαθφηενδ δζεοεέηδζδ πνμηεναζμηήηςκ ζημ πχνμ ηδξ ένεοκαξ ηαζ βεκζηά. Κθείκμκηαξ αοηυκ ημκ πνυθμβμ εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ηδκ μζημβέκεζά ιμο ημοξ βμκείξ, ηδκ αδεθθή ηαζ ηδ βζαβζά ιμο βζα ηδκ αιένζζηδ ζοιπανάζηαζδ ηαζ αβάπδ ημοξ. Καζ επζπθέμκ ημοξ θίθμοξ ιμο βζα ηδ ζοκηνμθζά ηαζ οπμζηήνζλή ημοξ. Καζ ηέθμξ, υθμοξ υζμοξ πάθερακ ηαζ παθεφμοκ βζα ηδκ ακαγήηδζδ ηδξ βκχζδξ, ηδξ αθήεεζαξ ηαζ ημο ηάθθμοξ ζε μπμζμδήπμηε πθαίζζμ ηαζ πεδίμ ακαθμνάξ. Υςνίξ αοημφξ, αοηυ ημ δζδαηημνζηυ ηαζ μ ηυζιμξ υπςξ ημκ βκςνίγμοιε ζίβμονα δε εα οπήνπε ηαζ ιπμνχ ιυκμ κα εθπίγς υηζ δ υπμζα ζοκεζζθμνά ιμο ζημ ζχια ηδξ επζζηδιμκζηήξ βκχζδξ εα πνμζθένεζ ηάηζ ζε αοηυκ ημκ ανπαίμ αβχκα κα βζκυιαζηε δζανηχξ ηαθφηενμζ. ΑΘΗΝΑ 2016

12 ΑΘΗΝΑ 2016

13 Σηελ νηθνγέλεηά κνπ, ηνπο γνλείο θαη ηελ αδειθή κνπ! Καη ζηελ Κ. Après la nuit Avant le jour..! ΑΘΗΝΑ 2016

14 ΑΘΗΝΑ 2016

15 Πεξηερόκελα 1. Δηζαγσγή Απυδμζδ ζηα εθθδκζηά ημο υνμο baculovirus ημζπεία ζπεηζηά ιε ημκ ιεηαλμζηχθδηα-λεκζζηή Bombyx mori Γμιή ηαζ Κφηθμξ Εςήξ ηςκ Βαηηνμσχκ Σαλζκμιζηή ηςκ Βαηηνμσχκ Μεηαβναθή ηαζ Ακηζβναθή ζημοξ ααηηνμσμφξ Πνχζια βμκίδζα Όρζιμζ πανάβμκηεξ έηθναζδξ (Late Expression Factors, LEFs) Aκηζβναθή ζζημφ DNA Όρζιδ ηαζ πμθφ υρζιδ ιεηαβναθή Ηζηή RNA πμθοιενάζδ πνςηεΐκδ LEF Οζ ααηηνμσμί ςξ θμνείξ έηθναζδξ ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ Ζ ηεπκμθμβία ημο ααηιζδίμο ημπυξ ηδξ δζαηνζαήξ Τιηθά θαη Μέζνδνη Γεκζηά ζημζπεία Βαηηδνζαημί ηφπμζ ηαζ ηαθθζένβεζα ααηηδνίςκ Μεηαζπδιαηζζιυξ ααηηδνίςκ Υδιζηυξ ιεηαζπδιαηζζιυξ (chemical transformation) Ζθεηηνμδζάηνδζδ (electroporation) Βαηιίδζα ηαζ ζμί Απμιυκςζδ ηαζ πνδζζιμπμίδζδ ημο DNA Απμιυκςζδ πθαζιζδζαημφ/ααηιζδζαημφ DNA Ζθεηηνμθυνδζδ, απμιυκςζδ ηιδιάηςκ ηαζ πμζμηζημπμίδζδ ημο DNA Ακάθοζδ, επελενβαζία ημο DNA, ηθςκμπμίδζδ, in silico ακάθοζδ Πθαζιζδζαημί θμνείξ έηθναζδξ ηαζ ιεηαθμνάξ βεκεηζημφ οθζημφ Φμνείξ έηθναζδξ βζα δζάζςζδ ημο ααηιζδίμο Γlef Φμνείξ ιεηαθμνάξ ηαζ έηθναζδξ βζα οπμηαηάζηαζδ ηαζ δζάζςζδ ημο ααηιζδίμο Γlef8 ιέζς μιυθμβμο ακαζοκδοαζιμφ Φμνείξ ιεηάεεζδξ Tn Φμνείξ ιεηαθμνάξ ηαζ έηθναζδξ βζα ηδ δδιζμονβία ηοηηανζηχκ ζεζνχκ δζάζςζδξ ημο ααηιζδίμο Γlef Φμνείξ έηθναζδξ ηδξ θμοζζθενάζδξ βζα εηηίιδζδ ηδξ θεζημονβζηυηδηαξ ηςκ επζθεβιέκςκ οπμηζκδηχκ ηαηαζηεοή εκυξ εθάπζζημο οπμηζκδηή ααζζζιέκμο ζημκ οπμηζκδηή ηδξ ηοηηανμπθαζιαηζηήξ αηηίκδξ Α3 ημο ιεηαλμζηχθδηα Φμνείξ παναβςβήξ δίηθςκμο RNA Σνμπμπμίδζδ ηαζ ηθςκμπμίδζδ ημο βεκεηζημφ οθζημφ ημο BmNPV ζε ααηηήνζα E. coli ιε ημ ζφζηδια ακαζοκδοαζιμφ Red ημο θάβμο θ Καθθζένβεζεξ ηοηηάνςκ εκηυιςκ Πανμδζηή δζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ εκηυιςκ Γζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ εκηυιςκ βζα ηδκ ηαηαζηεοή ηοηηανζηχκ ζεζνχκ ζηαεενήξ έηθναζδξ πνςηεσκχκ Απμιυκςζδ μθζηχκ κμοηθεσηχκ μλέςκ απυ ηφηηανα εκηυιςκ ηαζ παναβςβή cdna ηζηθμδυηδζδ ζζηχκ παναζηεοαζιάηςκ Απμιυκςζδ RNA παναβςβή cdna ΑΘΗΝΑ 2016

16 2.9.2 Σζηθμδυηδζδ ζζηχκ παναζηεοαζιάηςκ Υαναηηδνζζιυξ ααηιζδίςκ Αθοζζδςηή ακηίδναζδ ηδξ πμθοιενάζδξ (PCR) Σεθζημφ ζδιείμο (end point) PCR Πμζμηζηή/πναβιαηζημφ πνυκμο (quantitative/real time) PCR Ακίπκεοζδ ηαζ ακάθοζδ πνςηεσκχκ Απνηειέζκαηα Καηαζηεοή ηαζ δμιζηή επζαεααίςζδ ημο ααηιζδίμο Γlef8 BmNPV Υαναηηδνζζιυξ ημο ααηιζδίμο Γlef Φαζκμηοπζηή ακάθοζδ ημο ααηιζδίμο Γlef Μμνζαηή ακάθοζδ ημο ααηιζδίμο Γlef Ο θαζκυηοπμξ ημο ααηιζδίμο Γlef8 μθείθεηαζ απμηθεζζηζηά ζηδκ απμοζία ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ ημο βμκζδίμο lef Πνμζπάεεζεξ δζάζςζδξ ημο ααηιζδίμο Γlef8 ιε ελςβεκή πανμπή ηδξ πνςηεΐκδξ LEF Φμνείξ έηθναζδξ θοζζηήξ πνςηεΐκδξ LEF8 ηαζ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ δζάζςζδξ Φμνείξ έηθναζδξ ηδξ ζδιαζιέκδξ πνςηεΐκδξ LEF Γζάζςζδ ημο ααηιζδίμο Γlef8 ιε εκδμβεκή πανμπή ηδξ πνςηεΐκδξ LEF οζπέηζζδ ημο βμκζδίμο orf40 ιε ηδ δζάζςζδ ημο εθθεζιιαηζημφ ααηιζδίμο Γlef Καηαζηεοή αεθηζςιέκςκ εθθεζιιαηζηχκ ααηιζδίςκ Γlef Υνδζζιμπμίδζδ θοζζηχκ ζζηχκ αθθδθμοπζχκ βζα έηθναζδ ημο βμκζδίμο orf Υνδζζιμπμίδζδ εηενυθμβμο οπμηζκδηή βζα έηθναζδ ημο βμκζδίμο orf Δπζπθέμκ ιεθέηεξ In silico ιεθέηδ βζα ηδκ ακάδεζλδ ηςκ αθθδθμοπζχκ ημο οπμηζκδηή ημο βμκζδίμο orf Ζ δζάζςζδ ημο ααηιζδίμο hsp70.lef8/polh Γlef8 απυ ηδκ ηςδζηή πενζμπή Cclef Γζάζςζδ ημο Γlef8 ιε ημ θμνέα έηθναζδξ LEF8/ORF40, pplef8 tv.myc-lef Λεζημονβζηυηδηα ηιήιαημξ ημο οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ Α3 ημο B. mori RNAi (RNA interference) βζα ηδκ απμζζχπδζδ ημο βμκζδίμο lef πκπεξάζκαηα-πδήηεζε οκεζζθμνά ζημ επζζηδιμκζηυ πεδίμ φκμρδ οιπενάζιαηα Μεθθμκηζηέξ ηαηεοεφκζεζξ Παξάξηεκα Πεξίιεςε Summary Βηβιηνγξαθία ΑΘΗΝΑ 2016

17 1. Δηζαγσγή

18

19 1. Δηζαγσγή Οζ Βαηηνμσμί (Baculoviruses) ζοκζζημφκ ιία ζδζαίηενδ ηαηδβμνία ζχκ ηςκ ανενυπμδςκ, ιε εονεία ηαηακμιή ζε λεκζζηέξ ηαζ μζημζοζηήιαηα (Slack & Arif, 2007). Γζαεέημοκ βεκεηζηυ οθζηυ ζε ιμνθή μιμζμπμθζηά ηθεζζηήξ, ηοηθζηήξ δίηθςκδξ έθζηαξ DNA (ccc: covalently closed circular/dsdna: double stranded DNA), ιήημοξ ηοιαζκυιεκμο ιεηαλφ 80 ηαζ 180 πζθζάδςκ γεοβχκ αάζεςκ (bp: base pairs), ακάθμβα ιε ημ είδμξ (Jehle et al., 2006), ηαζ μ ηφηθμξ γςήξ ημοξ πενζθαιαάκεζ, ζηζξ πενζζζυηενεξ πενζπηχζεζξ, δφμ δζαηνζημφξ ιμνθμθμβζημφξ ηφπμοξ: ημοξ έβηθεζζημοξ ζμφξ (occluded viruses) ηαζ ημοξ αθαζηζημφξ ζμφξ (budded viruses). Οζ δζαθμνέξ ιεηαλφ ηςκ δφμ ακάβμκηαζ ζηδκ ζδζαίηενδ πνμζανιμζηζηή ζηναηδβζηή ηςκ ααηηνμσχκ βζα ιεβζζημπμίδζδ ηδξ απμηεθεζιαηζηυηδηάξ ημοξ ςξ παναζζηζημί μνβακζζιμί ηαζ εα ακαθοεμφκ ζηδ ζοκέπεζα. Δπζβναιιαηζηά ακαθένμοιε υηζ μ πνχημξ ηφπμξ απμηεθεί ηδ δμιή ιε ηδκ μπμία μζ ζμί ανίζημκηαζ ζημ πενζαάθθμκ, εκχ μ δεφηενμξ ιία δμιή πμο ακαπηφζζεηαζ πανμδζηά ηαηά ηδκ ελέθζλδ ηδξ θμίιςλδξ ημο λεκζζηή. οβηεηνζιέκα βζα ημοξ ζμφξ ηδξ μιμηαλίαξ (class) ηςκ εκηυιςκ, πμο ζοκζζημφκ οπμηαηδβμνία ημο θφθμο (phylum) ηςκ ανενυπμδςκ ηαζ ζφζηδια ιεθέηδξ ηςκ ααηηνμσχκ ζηδκ πανμφζα ενβαζία, δ φπανλδ ηςκ έβηθεζζηςκ ιμνθχκ, πμο επζηνέπμοκ ιαηνά παναιμκή ζημ θοζζηυ πενζαάθθμκ, ίζςξ κα απμηεθεί ηδ ιυκδ θφζδ βζα εκανιυκζζδ ιε ημκ ηφηθμ γςήξ ηςκ εηάζημηε λεκζζηχκ (Slack & Arif, 2007). Κζ αοηυ βζαηί ηα έκημια ιε ηδκ επμπζηή πανμοζία ημοξ ηαζ ημ ζπεηζηά ιζηνυ πνμζδυηζιμ επζαίςζδξ, πνμζθένμοκ ζοκήεςξ ιυκμ ιειμκςιέκα ηοπαία ζοιαάκηα ζοκάκηδζδξ ιε ημοξ ζμφξ, μζ μπμίμζ ςξ εη ημφημο εα πνέπεζ κα δζαεέημοκ ιδπακζζιμφξ βζα κα ακηζιεηςπίζμοκ ηα πζεακχξ ιεβάθα δζαζηήιαηα πανμοζίαξ ηαζ έηεεζδξ ζηζξ πενζααθθμκηζηέξ ζοκεήηεξ (Slack & Arif, 2007). Αοηή δ παναηηδνζζηζηή πνμζανιμβή ηςκ ααηηνμσχκ, απμηεθεί έκα ιυκμ πανάδεζβια ηδξ πμθφπθεονδξ ζφκδεζδξ ιε ημοξ ακηίζημζπμοξ λεκζζηέξ, ζηδκ μπμία ααζίγεηαζ ηαζ δ πθεζμρδθία ηςκ εθανιμβχκ ημοξ ςξ αζμηεπκμθμβζηά ενβαθεία. Ήδδ, εδχ ηαζ δεηαεηίεξ, μζ ααηηνμσμί πνδζζιμπμζμφκηαζ ςξ εκημιμηηυκα βζα ημκ έθεβπμ επζαθααχκ δαζζηχκ ηαζ αβνμηζηχκ πθδεοζιχκ εκηυιςκ (Slack & Arif, 2007) ηαζ απυ ημ 1983 ςξ θμνείξ έηθναζδξ βζα ηδκ παναβςβή ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ ζε ηοηηανμηαθθζένβεζεξ (van Oers et al., 2015) ή/ηαζ πνμκφιθεξ θεπζδμπηένςκ εκηυιςκ 1

20 (Kovaleva & Davis, 2016) ηαζ ηφηηανα εδθαζηζηχκ (Fornwald et al., 2016). Πθέμκ δζαηίεεκηαζ ηοπμπμζδιέκα ζοζηήιαηα αζμ-ακηζδναζηήνςκ ααζζζιέκςκ ζε ααηηνμσμφξ (Chen HC et al., 2006; SH Kadwell & Hardwicke, 2007), εκχ οπάνπεζ έκημκδ ενεοκδηζηή δναζηδνζυηδηα βζα ηδκ εονεία εθανιμβή ακαζοκδοαζιέκςκ ααηηνμσχκ ςξ θμνέςκ βεκεηζημφ οθζημφ ζηα πθαίζζα βμκζδζαηήξ εεναπείαξ, πμο απμηεθεί ιία κέα ηαζ πμθθά οπμζπυιεκδ πνμμπηζηή εκυξ ζδζαίηενα πμθοπνδζηζημφ ζοζηήιαημξ (Kwang et al., 2016). Ζ πανμφζα ενβαζία εζηζάγεζ ζηδ βεκεηζηή ηνμπμπμίδζδ ημο ααηηνμσμφ Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus, BmNPV, πμο πνμζαάθθεζ ημ ιεηαλμζηχθδηα Bombyx mori. Ο ζηυπμξ ηδξ ηνμπμπμίδζδξ είκαζ δζηηυξ ηαζ απμζημπεί αθεκυξ ιεκ ζηδ ιεθέηδ ηαζ ημ παναηηδνζζιυ ηςκ κέςκ ζχκ ηαζ αθεηένμο ζηδκ πζεακή αλζμπμίδζή ημοξ ςξ αζμηεπκμθμβζηά ενβαθεία. ηα πθαίζζα ηδξ πεναζηένς ακάθοζδξ ηςκ παναπάκς, εα πναβιαημπμζδεεί ανπζηά ακαθμνά ζηδ δμιή ηαζ ημκ ηφηθμ γςήξ ηυζμ ημο λεκζζηή μνβακζζιμφ Bombyx mori, υζμ ηαζ ηςκ ααηηνμσχκ, ιε ζδζαίηενδ έιθαζδ ζημκ ζυ BmNPV, δ μπμία, αημθμοεμφιεκδ απυ ιζα εζζαβςβή ζηζξ αζμηεπκμθμβζηέξ πνήζεζξ ηςκ ζχκ, εα ηαηαθήλεζ ιε ηδκ αηνζαή επελήβδζδ ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ, αάζεζ ηδξ οπάνπμοζαξ ζοζζςνεοιέκδξ βκχζδξ. 1.1 Απόδοζη ζηα ελληνικά ηος όπος baculovirus Ο υνμξ Baculovirus ζοκζζηά ζφκεεζδ ηςκ θέλεςκ baculum ηαζ virus (Rohrmann, 2013). Ο θαηζκζηυξ υνμξ virus ζδιαίκεζ δδθδηδνζχδδξ μοζία/δδθδηήνζμ ηαζ απυ ηα ηέθδ ημο 19 μ αζχκα ζοκδέεδηε ιε αηοηηανζημφξ πανάβμκηεξ πμο πνμηαθμφκ αζεέκεζα ςξ έκα ιμθοζιαηζηυ έιαζμ νεοζηυ (contagium vivum fluidum), πμο ιπμνεί κα δζένπεηαζ απυ θίθηνα, ζε ακηζδζαζημθή ιε ηα ααηηήνζα (παναηηδνζγυιεκα ςξ contagium fixum) (Bos, 1999). Ο πθήνδξ παναηηδνζζιυξ ηςκ κέςκ παναζζηζηχκ ηαζ ζοπκά παεμβυκςκ αηοηηανζηχκ ιμνθχκ γςήξ, ςξ ηαηδβμνία δζαθμνεηζηή απυ ηα ααηηήνζα, εδναίςζε ηαζ ημκ υνμ virus βζα ηδκ πενζβναθή ημοξ. Ο υνμξ ζυξ ζδιαίκεζ επίζδξ δδθδηήνζμ ζηδκ ανπζηή ημο ζδιαζία ηαζ είκαζ αηνζαέξ ακηίζημζπμ ημο θαηζκζημφ virus. Ο θαηζκζηυξ υνμξ baculum ιεηαθνάγεηαζ ςξ «νάαδμξ», μπυηε ζοκμθζηά δ πνμθακήξ ιεηαβθχηηζζδ ημο ζφκεεημο Baculovirus εα ήηακ «νααδμσυξ». Γεδμιέκμο υιςξ υηζ μ υνμξ αοηυξ είκαζ ήδδ ζε πνήζδ δδθχκμκηαξ ιία δζαθμνεηζηή μιάδα ζχκ, πνμηείκεηαζ δ ιεηάθναζδ ημο Baculovirus ςξ βαθηξντόο, 2

21 απυ ηδκ ανπαζμεθθδκζηή θέλδ βάθηξν, πμο ζδιαίκεζ επίζδξ «νάαδμξ» ηαζ ακαθένεηαζ ζηδ αζαθζμβναθία ςξ υνμξ αηνζαχξ ακηίζημζπμξ ημο θαηζκζημφ Baculum (Μπαιπζκζχηδξ Γεχνβζμξ, 1998). Ο κέμξ πνμηεζκυιεκμξ υνμξ πνδζζιμπμζείηαζ ζηα πθαίζζα ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ. Γζεοηνζκζζηζηά ζδιεζχκεηαζ υηζ μζ νααδμσμί (Rhabdoviruses), ζε ακηίεεζδ ιε ημοξ ααηηνμσμφξ, είκαζ RNA ζμί, απμηθεζζηζηά ηοηηανμπθαζιαηζημί, ηαζ πνμηαθμφκ αζεέκεζεξ ζε ζδιακηζηά ιεβαθφηενμ εφνμξ λεκζζηχκ, πμο πενζθαιαάκμοκ θοηά, αζπυκδοθα ηαζ ζπμκδοθςηά (Jayakar et al., 2004). Υαναηηδνζζηζηυ πανάδεζβια παεμβυκμο βζα ημκ άκενςπμ νααδμσμφ απμηεθεί μ ζυξ ηδξ θφζζαξ (Rabies virus). 1.2 Σηοισεία ζσεηικά με ηον μεηαξοζκώληκα-ξενιζηή Bombyx mori Ο ιεηαλμζηχθδηαξ, B. mori, απμηεθεί ιέθμξ ηδξ μζημβέκεζαξ Bombycidae ηςκ θεπζδμπηένςκ εκηυιςκ. οκζζηά ημκ μνβακζζιυ-πνυηοπμ ηδξ παναπάκς ηάλδξ ηαζ ημ ιμκαδζηυ πθήνςξ ελδιενςιέκμ έκημιμ, ιε ζζημνία ακενχπζκδξ εηιεηάθθεοζδξ ημοθάπζζημκ 5000 εηχκ (Xia et al., 2009). Λυβς δε ηδξ εηηεηαιέκδξ πνήζδξ ηαζ πεζνζζιμφ ημο απυ ημκ άκενςπμ, πθέμκ απμηεθεί έκα ελανηδιέκμ ηαθθζενβήζζιμ εί- Δηθόλα 1.1 πεδζαβναιιαηζηή απεζηυκζζδ δζαθυνςκ ζηαδίςκ ημο ηφηθμο γςήξ ημο ιεηαλμζηχθδηα, B. mori. Ανζεκζηυξ (473) ηαζ εδθοηυξ (474) εκήθζηαξ ιεηαλμζηχθδηαξ, πνμκφιθδ (475), ημοημφθζ (476) ηαζ κφιθδ (477). (Leunis & Ludwig, 1891) 3

22 Δηθόλα 1.2 Α. Ο ηφηθμξ γςήξ ημο ιεηαλμζηχθδηα, B. mori. Απεζημκίγεηαζ δ ελέθζλδ ημο μνβακζζιμφ απυ ημ ζηάδζμ ημο αοβμφ ζε αοηυ ημο χνζιμο εκηυιμο, ιέζς ηςκ εκδζάιεζςκ θάζεςκ ηδξ πνμκφιθδξ ηαζ ηδξ κφιθδξ. Σα επζιένμοξ πνμκοιθζηά ζηάδζα ακάπηολδξ (5 ζοκμθζηά) παναηηδνίγμκηαζ ςξ ιμνθέξ (instars) ηαζ ημ πέναζια απυ ηδ ιία ζηδκ επυιεκδ πενζθαιαάκεζ έκα βεβμκυξ έηδοζδξ (molt). Ο ακαθενυιεκμξ ανζειυξ διενχκ απμηεθεί έκακ ιέζμ υνμ. Β. Ακηζπνμζςπεοηζηέξ θςημβναθίεξ απυ ηδκ αθθδθμδζαδμπή ηςκ ζηαδίςκ ακάπηολδξ ημο ιεηαλμζηχθδηα. 1. Αοβά, 2. Πνμκφιθδ, 3. πδιαηζζιυξ ημοημοθζμφ ηαζ κφιθδξ, 4. Δκήθζημ έκημιμ. Α. Τξνπνπνίεζε από Β. Αλαηύπωζε από

23 δμξ, ιε αδοκαιία αοηυκμιδξ δζααίςζδξ. Θεςνείηαζ υηζ πνμέηορε απυ ημ άβνζμ είδμξ ιεηαλμζηχθδηα, B. mandarina. Ο ηφηθμξ γςήξ ημο ιεηαλμζηχθδηα υπςξ ηαζ ζηα οπυθμζπα μθμιεηάαμθα έκημια απμηεθείηαζ απυ ιία δζαδμπή ιεηαιμνθχζεςκ, ιε ζδιακηζηέξ αθθαβέξ ζηδ ιμνθή ημο μνβακζζιμφ απυ ημ έκα ζηάδζμ ζημ επυιεκμ (εζη. 1.1/1.2). Ο ηφηθμξ λεηζκά απυ ημ βμκζιμπμζδιέκμ αοβυ, πμο εηημθάπηεηαζ ζε 7-14 διένεξ (ζε εενιμηναζία o C), ηαζ ζοκεπίγεζ ιε ηδκ πνμκφιθδ (larva). Ζ θάζδ ηδξ πνμκφιθδξ δζαηνίκεηαζ ζε 5 ζηάδζα αφλδζδξ ημο εκηυιμο (instars) ηαηά ηα μπμία, ιέζα ζε πενίπμο 45 διένεξ, ημ έκημιμ αολάκεζ ζε ιήημξ απυ 2-3 mm ζε 75 mm (ιέβζζηδ ηζιή) (Encyclopædia-Britannica, 2016). Ζ πνμκφιθδ ηνέθεηαζ ηαηά πνμηίιδζδ ιε θφθθα ιμονζάξ, ηονίςξ ημο είδμοξ ηδξ θεοηήξ ιμονζάξ, Morus alba. Απυ αοηή ηδκ ηνμθζηή πνμηίιδζδ ηαζ ημκ πναηηζηά ιμκμθαβζηυ (monophagous) παναηηήνα ενέρδ απμηθεζζηζηά ιε έκα είδμξ ηνμθήξ ημο μνβακζζιμφ πνμηφπηεζ ηαζ δ μκμιαζία είδμοξ mori, ιζαξ ηαζ Bombyx mori είκαζ πναηηζηά μ ιεηαλμζηχθδηαξ ηδξ ιμονζάξ bombyx είκαζ δ θαηζκζηή ιμνθή ημο εθθδκζημφ αυιαολ, πμο ζοκζζηά ηδκ μκμιαζία ημο ιεηαλμζηχθδηα. Πθέμκ οπάνπμοκ ηνμθέξ πθήνςξ ηαεμνζζιέκδξ ζφζηαζδξ βζα ημκ ηαθφηενμ έθεβπμ ηδξ ενέρδξ ζε επίπεδμ ενβαζηδνίμο ηαζ αζμιδπακίαξ (Saviane et al., 2014). Αημθμφεςξ δ πνμκφιθδ εβηθείεηαζ ζε ημοημφθζ (cocoon) ηαζ ιεηαηνέπεηαζ ζε κφιθδ (pupa), πμο ζοκζζηά ημ ηεθεοηαίμ ζηάδζμ ςνίιακζδξ πνζκ ηδκ παναβςβή ημο χνζιμο γχμο (imago). Ο πνυκμξ πμο απαζηείηαζ βζα ημ πέναζια απυ ηδ ιία θάζδ ζηδκ επυιεκδ ελανηάηαζ απυ ημ ζηέθεπμξ ημο ιεηαλμζηχθδηα (οπάνπμοκ πάκς απυ 1000, (Xia et al., 2009)) ηαζ ηζξ οθζζηάιεκεξ ζοκεήηεξ ακάπηολδξ. Ο εκήθζηαξ ιεηαλμζηχθδηαξ έπεζ άκμζβια θηενχκ 4-5 cm ιε ημ εδθοηυ κα είκαζ ηοπζηά ιεβαθφηενμ ζε δζαζηάζεζξ απυ ημ ανζεκζηυ (εζη. 1.1). Οζ ιεηαλμζηχθδηεξ έπμοκ πάζεζ ηδκ ζηακυηδηα πηήζδξ, αθθά ηα ανζεκζηά πναβιαημπμζμφκ έκακ πμνυ πνμζέθηοζδξ ημο εδθοημφ (flutter dance), πμο πενζθαιαάκεζ ηαπείεξ ηζκήζεζξ ηςκ θηενχκ ακηίζημζπεξ αοηχκ ηδξ πηήζδξ, ζε ακηαπυηνζζδ πνμξ ζπεηζηέξ θενμιυκεξ. Ζ ζοιπενζθμνά αοηή πνδζζιμπμζήεδηε ηαζ ζηδ δζαδζηαζία απμιυκςζδξ ημο πδιζημφ πανάβμκηα ηςκ εδθοηχκ πμο ηδκ πνμηαθεί, ηδξ (E,Z)-10,12-hexadecadienol ή αμιαοηυθδξ (bombykol) (Butenandt et al., 1961). Σα εκήθζηα άημια ζηενμφκηαζ πναηηζηά ααζζηχκ ελανηδιάηςκ ημο ζηυιαημξ ηαζ αδοκαημφκ κα ηναθμφκ. Μεηά ηδκ έλμδυ ημοξ απυ ημ ημοημφθζ ακαπανάβμκηαζ ηαζ επζγμφκ βζα 2-3 διένεξ, πμο ζοκζζηά ηαζ ημ ζφκδεεξ εφνμξ ηδξ εκήθζηδξ γςήξ 5

24 ημοξ. Σα εδθοηά βεκκμφκ αοβά απυ ηα μπμία λεηζκά εη κέμο μ παναπάκς ηφηθμξ γςήξ (Encyclopædia-Britannica, 2016). 1.3 Γομή και Κύκλορ Ευήρ ηυν Βακηποφών Ζ ααζζηή δμιζηή ιμκάδα ηάεε ααηηνμσμφ είκαζ ημ κμοηθεμηαρίδζμ, πμο απμηεθείηαζ απυ έκα ζφιπθμημ DNA ηαζ πνςηεσκχκ ηθεζζιέκμ ιέζα ζε έκα νααδυιμνθμ πνςηεσκζηυ πενίαθδια, απμηεθμφιεκμ ηονίςξ απυ ηδκ ηαρζδζηή ζζηή πνςηεΐκδ, VP39 (εζη. 1.3). Απυ ηδκ επζιήηδ-νααδυιμνθδ ειθάκζζδ αοηήξ ηδξ ιμκάδαξ πνμήθεε ηαζ δ μκμιαζία baculovirus ηαζ ααηηνμσμί, υπςξ ακαθφεδηε ζηδκ πανάβναθμ 1.1. Κάεε κμοηθεμηαρίδζμ πανάβεηαζ ζημκ πονήκα ημο ιμθοζιέκμο ηοηηάνμο ηαζ πενζέπεζ έκα οπενεθζηςιέκμ ηοηθζηυ ιυνζμ DNA, πμο ιε ημ ιέβεεμξ/ιήημξ ημο ζε γεφβδ αάζεςκ ηαεμνίγεζ ηαζ ημ ιήημξ ημο ηαρζδίμο. Γεκζηά μζ εκ θυβς δμιέξ έπμοκ δζάιεηνμ nm (Slack & Arif, 2007), ιήημξ nm ηαζ δζαεέημοκ πμθζηυηδηα, ιζαξ ηαζ ηα δφμ άηνα ημοξ δεκ είκαζ δμιζηά ηαζ θεζημονβζηά ζζμδφκαια (εζη. 1.3). Σα κμοηθεμηαρίδζα πενζαάθθμκηαζ απυ δίζηζαδ θζπζδζηή ιειανάκδ βζα κα δζαιμνθχζμοκ ηα ηεθζηά ιμθοζιαηζηά ζμζχιαηα πμο, υπςξ ακαθένεδηε, δζαηνίκμκηαζ ζε δφμ ηφπμοξ: ηα αθαζηζηά ζμζςιάηζα ή αθαζηζημί ζμί, BV (Budded Viruses) ηαζ ηα ζμζςιάηζα πμο πενζέπμκηαζ ζημοξ έβηθεζζημοξ ζμφξ, OV (Occluded Viruses), ηαζ παναηηδνίγμκηαζ ςξ ζμζςιάηζα/ζμί ηςκ εβηθείζηςκ, ODV (Occlusion Derived Viruses, (Slack & Arif, 2007). Οζ αθαζηζημί ζμί ζοκζζημφκ ηδ ιμνθή ιε ηδκ μπμία μ ζυξ ιεηαδίδεηαζ απυ ηφηηανμ ζε ηφηηανμ ζηα πθαίζζα εκυξ ιμθοζιέκμο μνβακζζιμφ ή ηοηηανμηαθθζένβεζαξ, εκχ μζ έβηθεζζημζ ζμί είκαζ δ ακεεηηζηή ιμνθή ιε ηδκ μπμία μ ζυξ επζαζχκεζ ζημ πενζαάθθμκ ιέπνζ κα πνμζθδθεεί απυ ημκ μνβακζζιυ λεκζζηή ηαζ κα λεηζκήζεζ ηδ ιυθοκζδ. Ζ ακεεηηζηυηδηα ημο έβηθεζζημο ηφπμο ααζίγεηαζ ζηδκ ζζηή πνςηεΐκδ πμθοεδνίκδ (polyhedrin), πμο εβηθείεζ ηα ζμζςιάηζα ζε ιία παναηνοζηαθθζηή πμθοιενή δμιή, πμθοεδνζημφ ζπήιαημξ (Vlak, 1996). Ο έβηθεζζημξ ζυξ μκμιάγεηαζ επζπθέμκ ζςιάηζμ έβηθεζζδξ (OB: Occlusion Body), ζςιάηζμ εκζςιάηςζδξ (IB: Inclusion Body) ή απθμφζηενα πμθφεδνμ (polyhedron), θυβς ηδξ ιζηνμζημπζηήξ δμιήξ ημο (O'Reilly et al., 1994). Κάεε πμθφεδνμ πενζαάθθεηαζ επζπθέμκ απυ ιία δθεηηνμκζαηά ποηκή δμιή, ημκ πμθοεδνζηυ θάηεθμ (PE: Polyhedron envelope), πμο απμηεθείηαζ απυ οδαηάκεναηεξ ηαζ ιία θςζθμνοθζςιέκδ ζζηή πνςηεΐκδ (Rohrmann, 2013). διεζχκεηαζ υηζ ηαζ μζ δφμ ηφπμζ 6

25 Δηθόλα 1.3 Ζ ιμνθή ηαζ ζφζηαζδ εκυξ κμοηθεμηαρζδίμο ααηηνμσμφ (ζοβηεηνζιέκα ημο AcMNPV/αλαιύεηαη παξαθάηω). ημ ανζζηενυ ζηέθμξ απεζημκίγεηαζ ζε ακμζηηή δζαιυνθςζδ ηιήια ημο ζζημφ DNA, ιαγί ιε πνςηεΐκεξ πμο ημ πνμζδέκμοκ (υπςξ δ P6.9, πμο απμηεθεί ημ ηφνζμ ζοζηαηζηυ ηδξ κμοηθεμπνςηεΐκδξ ημο ζμφ) ηαζ άθθεξ ιε δνάζδ ιεηαβναθζημφ εκενβμπμζδηή. Γελζά ακαθένμκηαζ πνςηεΐκεξ ημο ηαρζδζημφ ημζπχιαημξ, ιε ηφνζα ηδκ VP39 πμο απμηεθεί ααζζηυ ζοζηαηζηυ ημο. διεζχκεηαζ επζπθέμκ δ πμθζηυηδηα ημο ηαρζδίμο (apical cap: ημνοθή/base: αάζδ), ηαεχξ ηαζ δ πνςηεΐκδ PP78/83 ζηδ αάζδ ημο, πμο ζοκζζηά ηδ εέζδ πονήκςζδξ ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ βζα ηδκ πνμχεδζδ ημο ηαρζδίμο ζημκ πονήκα, ιεηά ηδ ιυθοκζδ ημο ηοηηάνμο. Οζ «*» δδθχκμοκ πνςηεΐκεξ ηςκ μπμίςκ δ αηνζαήξ εέζδ ζημ ηαρίδζμ δεκ έπεζ πνμζδζμνζζηεί. (Slack & Arif, 2007) ζμζςιάηςκ δζαεέημοκ πναηηζηά ηαοηυζδια κμοηθεμηαρίδζα ηαζ βεκεηζηυ οθζηυ ηαζ υηζ δζαθένμοκ ηονίςξ ζηδ θζπζδζηή ηαζ πνςηεσκζηή ζφζηαζδ ηδξ ιειανάκδξ ημοξ (Slack & Arif, 2007). Σα πμθφεδνα πνμζθαιαάκμκηαζ απυ ημκ εηάζημηε λεκζζηή-πνμκφιθδ δζά ηδξ ζημιαηζηήξ μδμφ (per os), ιαγί ιε ηδκ ηνμθή. ηδ ζοκέπεζα, ιέζς ημο πεπηζημφ ζοζηήιαημξ ηδξ πνμκφιθδξ, ιεηαθένμκηαζ ιέπνζ ημ έκημκα αθηαθζηυ ιεζέκηενμ (midgut, ηζιέξ ph ιέπνζ ηαζ 12, εζη. 1.4/Α), υπμο ημ πμθοιενέξ οθζηυ έβηθεζζδξ ηαζ μ πμθοεδνζηυξ θάηεθμξ δζαθφμκηαζ, οπυ ηδκ επίδναζδ ημο ορδθμφ ph ηαζ ηςκ πεπηζηχκ εκγφιςκ. Σα ζμζχιαηα ηςκ εβηθείζηςκ (ODV) είκαζ ελεζδζηεοιέκα βζα ηδ ιυθοκζδ εκηενζηχκ ηοηηάνςκ, ηδκ μπμία ηαζ πναβιαημπμζμφκ ιεηά ηδκ απεθεοεένςζή ημοξ απυ ημ πμθφεδνμ (εζη. 1.4/Β) (Slack & Arif, 2007). Υαναηηδνζζηζηά μζ ODV ειθακίγμοκ έςξ ηαζ 10 4 θμνέξ ορδθυηενδ απυδμζδ ζηδ ιυθοκζδ εκηενζηχκ ηοηηάνςκ ζε ζπέζδ ιε ημοξ αθαζηζημφξ ζμφξ. Ζ ζηακυηδηά ημοξ 7

26 Α Σνμθή Θέζδ δεζβιαημθδρίαξ Κυπνακα Β Δηθόλα 1.4 Α. Γναθζηή απεζηυκζζδ ηδξ ηθζιάηςζδξ ημο ph ζε δζάθμνεξ εέζεζξ ημο ιεζέκηενμο απυ ηα θεπζδυπηενα είδδ Lichnoptera felina (θύθινη) ηαζ Manduca sexta (ηξίγωλα). οβηνζηζηά ημ ph ηδξ αζιμθέιθμο έπεζ ηζιή 6.7. (Rohrmann, 2013) Β. Ζ ιυθοκζδ δζά ηδξ ζημιαηζηήξ μδμφ (per os) απυ ααηηνμσμφξ. Με αέθδ ηαηαβνάθεηαζ δ πμνεία ηςκ έβηθεζζηςκ ζχκ απυ ημ πενζαάθθμκ, υπμο ανίζημκηαζ, ζηζξ εέζεζξ πνμζαμθήξ, ιέζς ηδξ ηνμθήξ: μζ ζμί δζαζπίγμοκ ημ πνυζεζμ έκηενμ (foregut) ηαζ θεάκμοκ ηεθζηά ζηδκ πενζμπή ημο ιεζεκηένμο ηςκ πνμκοιθχκ, υπμο απεθεοεενχκμοκ ηα ακηίζημζπα ζμζχιαηα. ημ ζπήια θαίκεηαζ δ ακαημιζηή δζάηαλδ ηςκ δζαθυνςκ δμιχκ ημο λεκζζηή, ηαζ ζε θεπημιένεζα, ηα ηοθζκδνζηά ηφηηανα-ζηυπμξ ηςκ ζχκ ηαζ δ δζαδζηαζία δζάθοζδξ ημο πμθφεδνμο (OB) ηαζ ηδξ ζοκαηυθμοεδξ πνμζαμθήξ (θεπημιένεζεξ ακαθένμκηαζ ζημ ηείιεκμ). Τξνπνπνίεζε από (Slack & Arif, 2007). 8

27 αοηή μθείθεηαζ ζηδ δζαθμνεηζηή πνςηεσκζηή ζφζηαζδ ηδξ ιειανάκδξ ημοξ, δ μπμία επζπθέμκ πενζέπεζ έκα ζφκμθμ ζζηχκ πνςηεσκχκ πμο μκμιάγμκηαζ πανάβμκηεξ ιμθοζιαηζηυηδηαξ δζά ημο ζηυιαημξ (PIFs Per os Infectivity Factors) ηαζ απαζημφκηαζ βζα ηδκ απμηεθεζιαηζηή ιυθοκζδ εκηενζηχκ επζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ (Rohrmann, 2013). Οζ ODV, πςνίξ πθέμκ ημ ηάθοιια πμθοεδνίκδξ, είκαζ εοάθςημζ ζε δζάθμνα ακηζ-ζζηά ζοζηαζηζηά ηςκ εκηενζηχκ ποιχκ ηαζ επζπθέμκ ειπμδίγμκηαζ ζηδκ πμνεία ημοξ πνμξ ηα ιεζεκηενζηά ηφηηανα απυ ηζξ πενζηνμθζηέξ ιειανάκεξ (PM: Peritrophic Membranes/εζη. 1.4/Β). Οζ ηεθεοηαίεξ απμηεθμφκ αηοηηανζηέξ δμιέξ απυ βθοημπνςηεΐκεξ, πνςηεμβθοηάκεξ ηαζ ζηα πενζζζυηενα είδδ πζηίκδ, πμο πενζαάθθμοκ ηδκ ηνμθή ζημ εζςηενζηυ ημο εκηενζημφ αοθμφ. Απυ ηδκ παναπάκς ζφζηαζδ είκαζ ζαθέξ υηζ ζοκζζημφκ πενζζζυηενμ έκα ελεζδζηεοιέκμ έηηνζια ημο εκηενζημφ επζεδθίμο πανά ηαε αοηυ ιειανάκεξ οπυ ηδκ έκκμζα ηδξ ηοηηανζηήξ ιειανάκδξ, βεβμκυξ πμο ακηακαηθάηαζ ηαζ ζημ βεκζηυηενμ υνμ πενζηνμθζηή εειέθζα μοζία (matrix), πμο επίζδξ πνδζζιμπμζείηαζ (Peters, 1992). Ζ πνμκφιθδ ημο ιεηαλμζηχθδηα δζαεέηεζ 5 ή παναπάκς ζηζαάδεξ ιειανάκδξ, μζ μπμίεξ πανάβμκηαζ απυ ημ ζφκμθμ ημο ιεζεκηενζημφ επζεδθίμο, ζε ακηζδζαζημθή ιε ημ εκήθζημ έκημιμ, πμο ζηενείηαζ ηέημζςκ δμιχκ. Ο νυθμξ ημοξ θαίκεηαζ κα είκαζ δ πνμζηαζία ημο εκηενζημφ επζεδθίμο απυ ιδπακζηή ηαηαπυκδζδ θυβς ηδξ δζέθεοζδξ ηδξ ηνμθήξ, ηαεχξ ηαζ δ θεζημονβία ημοξ ςξ εηθεηηζηυξ δειυξ πμο ειπμδίγεζ ηδκ πνυζααζδ ζημ εκηενζηυ επζεήθζμ ζε δζάθμνμοξ παεμβυκμοξ πανάβμκηεξ υπςξ ααηηήνζα, ζμφξ ηαζ ιφηδηεξ (Peters, 1992). Ο εκδμπενζηνμθζηυξ πχνμξ (endoperitrophic space), υπμο ανίζηεηαζ δ ηνμθή, απμηεθεί έκα λεπςνζζηυ δζαιένζζια ζε ζπέζδ ιε ημκ ελςπενζηνμθζηυ (ectoperitrophic space), πμο ηενιαηίγεζ ζημ εκηενζηυ επζεήθζμ. Ζ επζημζκςκία ηςκ δφμ βίκεηαζ ιέζς εκυξ ζοζηήιαημξ πυνςκ ζπεηζηά ιζηνήξ δζαιέηνμο (ζε ανηεηά είδδ <36nm), πμο ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδ ζφζηαζδ ηαζ ηαη επέηηαζδ ηζξ θοζζημπδιζηέξ ζδζυηδηεξ ηδξ πενζηνμθζηήξ ιειανάκδξ, εθέβπμοκ απμηεθεζιαηζηά ηδ δζέθεοζδ πδιζηχκ μοζζχκ ηαζ ιεβαθμιμνζαηχκ ζοιπθυηςκ (Hegedus et al., 2009). Έπεζ δεζπεεί υηζ ηα ααηηνμσζηά ζμζχιαηα δζαπενκμφκ ηζξ ιειανάκεξ ζε εέζεζξ ηοπαίαξ θφζδξ ηδξ ζοκέπεζάξ ημοξ. Δπζπθέμκ επάβμοκ αθθαβέξ ζε αοηέξ, δζαζπχκηαξ ηεξ εζηζαηά ιε ηδ πνήζδ ηςκ εκπακζζκχκ (enhancins, ζζηέξ ιεηαθθμπνςηεάζεξ), πμο δζαεέημοκ ζηδκ επζθάκεζά ημοξ ή/ηαζ ζοζηεοαζιέκεξ ζημοξ έβηθεζζημοξ ζμφξ, ή άθθςκ ζζηχκ παναβυκηςκ (Slack & Arif, 2007). 9

28 Δηθόλα 1.5 Ζ δζαδζηαζία πνμζαμθήξ ηςκ εκηενζηχκ ηοηηάνςκ. Απεζημκίγμκηαζ μζ δφμ ιδπακζζιμί δζέθεοζδξ: (1) ηαπεία δζέθεοζδ, πςνίξ πμθθαπθαζζαζιυ ηςκ ODV κμοηθεμηαρζδίςκ δζαιέζμο ημο ηοηηάνμο ηαζ εηαθάζηδζδ ςξ αθαζηζημί ζμί πθέμκ απυ ηδ ααζζηή επζθάκεζα ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ (2) ιεηαθμνά ηςκ ODV κμοηθεμηαρζδίςκ ζημκ πονήκα, πμθθαπθαζζαζιυξ ηαζ εηαθάζηδζδ ηςκ κέςκ παναβυιεκςκ αθαζηζηχκ ζχκ. Υςνίξ πμθθαπθαζζαζιυ, μζ ζμί είκαζ ζε εέζδ κα ιμθφκμοκ πμθφ βνήβμνα (30 min ιεηά ηδ ιυθοκζδ) ζζημφξ ημο εκηυιμο πένα απυ ημ εκηενζηυ επζεήθζμ, εκχ ιε πμθθαπθαζζαζιυ απαζηείηαζ ζδιακηζηά πενζζζυηενμξ πνυκμξ (8-12 h ιεηά ηδ ιυθοκζδ), αθθά ημ ζζηυ θμνηίμ βζα ζοζηδιζηή ιυθοκζδ είκαζ πμθφ ιεβαθφηενμ. διεζχκεηαζ επζπθέμκ δ πμνεία ηςκ κμοηθεμηαρζδίςκ ηαζ ζχκ ακά πενίπηςζδ, ηαεχξ ηαζ δ ανπζηεηημκζηή ηςκ ζζηχκ. Τξνπνπνίεζε από (Slack & Arif, 2007). Ζ δζάποζδ ηςκ ζμζςιάηςκ πνμξ ημ ημίπςια ημο αοθμφ μθμηθδνχκεηαζ ιε ηδ ζφκηδλδ ηδξ ιειανάκδξ ημοξ ιε ηζξ ιζηνμθάπκεξ (microvilli) ηςκ ηοθζκδνζηχκ (columnar) ηοηηάνςκ ηαζ ηδκ απεθεοεένςζδ ημο κμοηθεμηαρζδίμο ζημ ηοηηανυπθαζια. Tμ εθεφεενμ ηαρίδζμ ιπμνεί κα αημθμοεήζεζ δφμ μδμφξ: κα πενάζεζ απθχξ δζαιέζμο ημο ηοηηάνμο ηαζ κα ελέθεεζ απυ ηδ ααζζηή (basal) πενζμπή ημο ιε ζημπυ κα ιμθφκεζ ηεθζηά άθθμοξ ζζημφξ ή κα εζζέθεεζ ζημκ πονήκα, κα απεθεοεενχζεζ ημ βεκεηζηυ ημο οθζηυ ηαζ κα λεηζκήζεζ ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ημο (εζη. 1.5). Έπεζ δεζπεεί υηζ δ απθή δζέθεοζδ απυ ηδκ ημνοθαία (apical: επζθάκεζα εηηεεεζιέκδ ζημκ εκηενζηυ αοθυ) ζηδ ααζζηή επζθάκεζα ηςκ εκηενζηχκ επζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ είκαζ θζβυηενμ πνμκμαυνα. οβηεηνζιέκα πνεζάγεηαζ πενίπμο 30 θεπηά (min) έκακηζ ηςκ 8 12 ςνχκ (h) πμο απαζημφκηαζ βζα ηδκ μθμηθήνςζδ ημο ηφηθμο ημο πμθθαπθαζζαζιμφ, αθθά πανέπεζ ζοβηνζηζηά ζδιακηζηά θζβυηενμοξ αθαζηζημφξ ζμφξ βζα ηδ ιυθοκζδ ηςκ θμζπχκ ζζηχκ ημο εκηυιμο (Slack & Arif, 2007). Δπζπθέμκ πενζμνίγεηαζ ζε μνζζιέκα είδδ ααηηνμσχκ ηςκ θεπζδμπηένςκ, πμο ειθακίγμοκ ηδ παναηηδνζζηζηή ζδζυηδηα κα δζαεέημοκ πενζζζυηενα απυ έκα κμοηθεμηαρίδζα ακά 10

29 ODV ζυζςια (βιέπεηε παξαθάηω) (Slack & Arif, 2007). Απυ αοηά ηα ηαρίδζα, έκαξ ιζηνυξ ανζειυξ εζζένπεηαζ ζημκ πονήκα, πνμηεζιέκμο κα επάβεζ ηδκ παναβςβή ηςκ απαναίηδηςκ ζζηχκ πνςηεσκχκ, βζα ηδκ εηαθάζηδζδ ηςκ οπυθμζπςκ ςξ θεζημονβζηχκ αθαζηζηχκ ζχκ (Slack & Arif, 2007). Ζ ιεηαθμνά ζημκ πονήκα ζε ηάεε πενίπηςζδ πναβιαημπμζείηαζ ιέζς πμθοιενζζιμφ ζκζδίςκ αηηίκδξ ηαζ υπζ ιζηνμζςθδκίζηςκ, υπςξ ζοιααίκεζ ζημοξ πενζζζυηενμοξ ζμφξ. Ζ ζζηή πνςηεΐκδ VP78/83, πμο ανίζηεηαζ ζηδ αάζδ (base) ηςκ κμοηθεμηαρζδίςκ (εζη. 1.3), απμηεθεί ηδ εέζδ πονήκςζδξ βζα ημκ πμθοιενζζιυ ηςκ ζκζδίςκ αηηίκδξ, πμο ηα πνμςεμφκ πνμξ ηδκ ηαηεφεοκζδ ημο πονήκα. ηδ ζοκέπεζα ημ κμοθεμηαρίδζμ πνμζδέκεηαζ ζημ ζφιπθεβια ημο πονδκζημφ πυνμο ηαζ ιέζς ιδπακζζιχκ πμο δεκ έπμοκ πθήνςξ δζεοηνζκζζηεί ιεηαθένεηαζ αοημφζζμ ζημ εζςηενζηυ ημο πονήκα. Ζ πνυζδεζδ ηαζ ανβυηενα δ πανμοζία ημο ηαρζδίμο ζημκ πονήκα έπεζ δζαπζζηςεεί ζε ηφηηανα πμο μζ ααηηνμσμί ιμθφκμοκ πθήνςξ, αθθά δ δζέθεοζδ ημο πυνμο έπεζ θςημβναθδεεί ιυκμ ζηδκ πενίπηςζδ ιζηνμ-έκεζδξ ζχκ (micro-injection) ζε ςμηφηηανα ημο είδμοξ Xenopus laevis (εζη. 1.6). Απυ ηζξ παναπάκς θςημβναθίεξ παναηδνήεδηε δ δθεηηνμκζαηά ποηκή δμιή ημο πυνμο ηαηά ηδκ πνυζδεζδ, υπμο ημ ηακάθζ θνάγεηαζ απυ ηζξ κμοηθεμπμνίκεξ ηαζ ηα ζκίδζα αηηίκδξ ημο ζοιπθέβιαημξ. Δπζπθέμκ, δζαπζζηχεδηε ηαζ δ ιεηάπηςζδ ζηδκ ακμζπηή δζαιυνθςζδ πμο επζηνέπεζ ηδ δζέθεοζδ ημο ανηεηά εοιεβέεμοξ ηαρζδίμο μ πυνμξ θαίκεηαζ πθήνςξ ακμζηηυξ ηαζ παναιέκεζ έκα δζάηεκμ 10 nm ιεηαλφ ηαρζδίμο ηαζ ημζπχιαημξ ημο ηακαθζμφ (Au et al., 2013). διεζχκεηαζ υηζ ηα ςμηφηηανα είκαζ ιεηαβναθζηά ακεκενβά ηαζ επζπθέμκ υηζ μ ζυξ δεκ πμθθαπθαζζάγεηαζ ζε αοηά, μφηε πανέπεζ εκενβυ ιυθοκζδ. Σα ηφηηανα ηδξ εκηενζηήξ επέκδοζδξ είκαζ δζαθμνμπμζδιέκα ηαζ ζε θάζδ G0 ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο. Δπζπθέμκ, δζαεέημοκ ιζηνυ πνυκμ διζγςήξ, ιζαξ ηαζ ακακεχκμκηαζ δζανηχξ απυ αθαζηζηά ηφηηανα ημο επζεδθίμο, μ μπμίμξ ζοκημιεφεηαζ αηυιδ πενζζζυηενμ ζε πενίπηςζδ ζζηήξ ιυθοκζδξ ιέζς ημο πνμζανιμζηζημφ/ αιοκηζημφ ιδπακζζιμφ ηδξ απμιάηνοκζδξ εκηενζηχκ ηοηηάνςκ (midgut cells sloughing). Με αάζδ ηα παναπάκς, ημ ιεζέκηενμ ζηενείηαζ ηζξ πνμδζαβναθέξ βζα παναβςβή ορδθήξ πμζυηδηαξ ζχκ ηαζ επζπθέμκ ζοκζζηά έκα ζπεηζηά αθζθυλεκμ πενζαάθθμκ, βεβμκυξ πμο ακηακαηθάηαζ ηαζ ζηδ πνήζδ ημο απμηθεζζηζηά ςξ εκδζάιεζμ ζηαειυ ζημκ ηφηθμ γςήξ ηςκ πενζζζυηενςκ ααηηνμσχκ (Slack & Arif, 2007). Δπίζδξ εηηζιάηαζ υηζ δ βνήβμνδ δζέθεοζδ ημο ζμφ απυ ημ έκηενμ επζηνέπεζ ηδ δζαηήνδζδ ηδξ θεζημονβζηυηδηάξ ημο, πμο είκαζ ζδιακηζηή βζα ηδκ ηαηά ημ δοκαηυκ 11

30 Δηθόλα 1.6 Δζζαβςβή κμοηθεμηαρζδζμφ ααηηνμσμφ ζημκ πονήκα ςμηοηηάνμο ημο Xenopus laevis δζαιέζμο ζοιπθέβιαημξ πονδκζημφ πυνμο. Ζθεηηνμκζμβναθία (Α) ηαζ ζπδιαηζηή απεζηυκζζδ (C) ηδξ πνυζδεζδξ ημο κμοηθεμηαρζδίμο ζηδκ ηοηηανμπθαζιαηζηή πθεονά ημο πονδκζημφ πυνμο. Ζθεηηνμκζμβναθία (B) ηαζ ζπδιαηζηή απεζηυκζζδ (D) ηδξ δζέθεοζδξ δζαιέζμο ημο πυνμο. Δίκαζ ζαθήξ δ δζάκμζλδ ημο πυνμο ιε ιεηαηυπζζδ ζοζηαηζηχκ ημο πμο θνάγμοκ ημ ηακάθζ (ζφβηνζζδ ηςκ θςημβναθζχκ A/B ηαζ C/D ακηίζημζπα. Ζθεηηνμκζμβναθία πμο δείπκεζ ημ ηαρίδζμ ιέζα ζημκ πονήκα. (Au et al., 2013). ιεβαθφηενδ ζε δζάνηεζα επζαίςζδ ηδξ πνμκφιθδξ ηαζ άνα ηαζ πμθθαπθαζζαζιμφ ημο ζμφ ζε αοηήκ (Slack & Arif, 2007). Οζ ηφνζμζ ζηυπμζ ημο ζμφ είκαζ μζ οπυθμζπμζ ζζημί ηδξ πνμκφιθδξ ηαζ ζδζαίηενα ημ θζπχδεξ ζχια (fat body) (εζη. 1.4/Β). Ο ζοβηεηνζιέκμξ ζζηυξ εκέπεζ εέζδ ήπαημξ βζα ηα έκημια ηαζ ηα πθμφζζα ζε εκένβεζα ηαζ πνχηεξ φθεξ ηφηηανά ημο είκαζ ζδακζηά βζα ηδκ παναβςβή κέςκ ζμζςιάηςκ. 12

31 Δηθόλα 1.7 Σοπζηυξ ηφηθμξ ιυθοκζδξ ααηηνμσμφ. Οζ πνυκμζ ακαθένμκηαζ εζδζηά ζημκ ζυ AcMNPV. Σμ πνμζαεαθδιέκμ ηφηηανμ απμηηά, ιεηά ηδ ιυθοκζδ, ζθαζνζηυ ζπήια, ημ μπμίμ ηαζ δζαηδνεί ιέπνζ ηδ θφζδ ημο. Σα κμοηθεμηαρίδζα ανπζηά αενμίγμκηαζ ζηδκ ηοηηανζηή ιειανάκδ πνμηεζιέκμο κα δχζμοκ βέκεζδ ζε BV (3 μ ηφηηανμ-12 h), εκχ ζηα φζηενα ζηάδζα παναιέκμοκ ζημκ πονήκα πνμξ παναβςβή ηςκ εβηθείζηςκ. Σα ζμζχιαηα αοηχκ ηςκ ζχκ απμηημφκ ημ πενίαθδιά ημοξ απυ ηδκ εζςηενζηή πονδκζηή ιειανάκδ (ΗΝΜ). Δίκαζ ειθακήξ δ ζοκεπήξ δζεφνοκζδ ημο πονήκα, πμο θηάκεζ ηεθζηά κα ηαηαθαιαάκεζ ζπεδυκ ημ ζφκμθμ ημο ηοηηανζημφ υβημο. (Slack & Arif, 2007) Γζα ηα θμζπά ηφηηανα, πθδκ ηςκ εκηενζηχκ, ηαεχξ ηαζ βζα ηζξ ηαθθζένβεζεξ ηοηηάνςκ, μ ηφηθμξ ιυθοκζδξ ημο ζμφ πενζβνάθεηαζ ζηδκ εζηυκα 1.7. Πενίπμο 30 min ιεηά ηδκ είζμδμ ημο ζμφ, ηαζ ιε ημ ζζηυ βεκεηζηυ οθζηυ ήδδ ζημκ πονήκα, ζηα ηφηηανα ανπίγμοκ κα εηθνάγμκηαζ ηα πνχζια βμκίδζα (ΗΔ: Ηmmediate Δarly genes), δζενβαζία δ μπμία πνμδβείηαζ ημο πμθθαπθαζζαζιμφ ημο ζζημφ DNA. Μέπνζ ηζξ 6 h μ πονήκαξ δζεονφκεηαζ ηαζ ζπδιαηίγεηαζ ζημ εζςηενζηυ ημο ημ ζμβεκέξ ζηνχια (virogenic stroma), ιία δθεηηνμκζαηά ποηκή, αηακυκζζημο ζπήιαημξ ημηηζχδδξ πενζμπή, υπμο ζοιααίκεζ μ ακαδζπθαζζαζιυξ ηαζ δ ιεηαβναθή ημο ζζημφ βεκεηζημφ οθζημφ, ηαεχξ ηαζ δ δδιζμονβία ηςκ ηαρζδίςκ. ηζξ 12 h ανπίγεζ δ παναβςβή ηςκ αθαζηζηχκ ιμνθχκ ημο ζμφ, δ μπμία ηαζ ζοκεπίγεηαζ ιέπνζ ηζξ 20 h ιεηά ηδ ιυθοκζδ (post infection, pi) (Slack & Arif, 2007). Οζ αθαζηζημί ζμί είκαζ ζδζαίηενα απμηεθεζιαηζημί βζα ηδ ιυθοκζδ ηςκ ζζηχκ ηδξ πνμκφιθδξ ηαζ ειθακίγμοκ 10 3 θμνέξ ιεβαθφηενδ απυδμζδ ιυθοκζδξ ζε ηοηηανμηαθθζένβεζεξ ζε ζπέζδ ιε ημοξ ODV (Rohrmann, 2013). Πνυηεζηαζ βζα ηδκ ίδζα ιμνθή ζμζςιάηςκ, πμο πανάβεηαζ ηαζ ηαηά ηδκ πνςημβεκή ιυθοκζδ ημο ιεζεκηένμο, ηαζ απμηεθείηαζ απυ ημ κμοηθεμηαρίδζμ ιε ιειανάκδ πνμενπυιεκδ απυ 13

32 ηδκ ηοηηανζηή ιειανάκδ ημο ιμθοζιέκμο ηοηηάνμο. Ο ζζηυξ θάηεθμξ πμο πνμηφπηεζ είκαζ ανηεηά παθανυξ, επζηνέπμκηαξ ηάπμζμ πχνμ βφνς απυ ημ κμοηθεμηαρίδζμ ζηζξ πθεονζηέξ πενζμπέξ ημο. Ακηίεεηα ειθακίγεζ ζηεκή ζφκδεζδ ιε ημ ηαρίδζμ ακηίζημζπα πνμξ ηα δφμ άηνα ημο, υπμο επζπθέμκ δ ιειανάκδ θένεζ ιία μδμκηςηή πενζμπή απυ πνμέπμοζεξ δζαιειανακζηέξ πνςηεΐκεξ πμο μκμιάγεηαζ πενζμπή πεπθμιενμφξ (peplomer region) ηαζ είκαζ μοζζχδδξ βζα ηδ ιυθοκζδ κέςκ ηοηηάνςκ (εζη. 1.8/Α). Ζ πανμοζία μδμκηςηήξ δμιήξ απυ ζζηέξ ιειανακζηέξ πνςηεΐκεξ ηαζ ζηα δφμ άηνα ζοκζζηά έκα πνυζθαημ εφνδια (Wang et al., 2016) (εζη. 1.8/Α). Παθαζυηενα εεςνμφκηακ υηζ πενζμπή πεπθμιενμφξ οπάνπεζ ιυκμ ακηίζημζπα πνμξ ηδκ ημνοθαία πενζμπή ημο ηαρζδίμο (Slack & Arif, 2007) (εζη. 1.8/Β). Οζ ααζζηέξ πνςηεΐκεξ ηςκ μδμκηςηχκ πνμελμπχκ, πμο ζοκζζημφκ πανάθθδθα ηαζ ηζξ ηφνζεξ πνςηεΐκεξ ζφκηδλδξ ημο θαηέθμο-πενζαθήιαημξ (EFP: Envelope Fusion Proteins) είκαζ δ GP64 ηαζ δ πνςηεΐκδ F. ημοξ BmNPV ηαζ AcMNPV (Autographa californica MNPV) οπάνπμοκ ηαζ μζ δφμ, αθθά ιυκμ δ GP64 ζοιιεηέπεζ ζηδ ιειανακζηή ζφκηδλδ πμο εζζάβεζ ημ κμοηθεμηαρίδζμ ζημ ηοηηανυπθαζια (Slack & Arif, 2007). Αλίγεζ κα ζδιεζςεεί υηζ δ ζφκηδλδ παναηδνείηαζ ζε εκδμζχιαηα ηαζ υπζ ζε επίπεδμ ηοηηανζηήξ ιειανάκδξ, υπςξ ζημοξ ζμφξ ηςκ εβηθείζηςκ. Σμ ζυζςια εζζένπεηαζ πνχηα ζηα εκδμζχιαηα ιέζς ηοζηζδίςκ ηαθοιιέκςκ ιε ηθαενίκδ (clathrin-coated vesicles), ιε εκδμηφηηςζδ πμο ιεζμθααείηαζ απυ οπμδμπείξ (Receptor-mediated endocytosis) (Long et al., 2006; Rohrmann, 2013; Slack & Arif, 2007). ηδ ζοκέπεζα ηαζ θυβς ηδξ ζφκηδλδξ εκδμζχιαημξ θοζζμζςιάηςκ, πνμηφπηεζ δναζηζηή εθάηηςζδ ημο ph, δ μπμία επάβεζ ηδκ πονμδμημφιεκδ απυ ημ υλζκμ πενζαάθθμκ (acid-triggered) ζφκηδλδ ημο ζζημφ θαηέθμο ιε ηδ ιειανάκδ ηδξ δμιήξ ηαζ ηεθζηά ηδκ απεθεοεένςζδ ημο ηαρζδίμο ζημ ηοηηανυπθαζια (εζη. 1.8/Β). Ο BV είκαζ μ ηφνζμξ ηφπμξ ζμφ πμο πανάβεηαζ ςξ 20 h ιεηά ηδ ιυθοκζδ ηαζ πνδζζιεφεζ ζηδ ιεβζζημπμίδζδ ηδξ ιυθοκζδξ ηςκ ηοηηάνςκ ημο μνβακζζιμφ. Έηημηε υιςξ ηαζ θυβς ηδξ έηθναζδξ ηςκ πμθφ υρζιςκ (very late) ζζηχκ βμκζδίςκ, πμο δίκεζ πνμσυκηα ιε ζδιακηζηυ νυθμ ζηδ ζοβηνυηδζδ ηςκ εβηθείζηςκ (π.π. ημ βμκίδζμ ηδξ πμθοεδνίκδξ, polh, βιέπεηε-βι. παξαθάηω) ηαζ ηδ θφζδ ημο ηοηηάνμο (Hasnain et al., 1997), ανπίγεζ πθέμκ δ ζφκεεζδ ηςκ ζμζςιάηςκ ηα μπμία εα εβηθεζζημφκ ζημκ πνςηεσκζηυ ηνφζηαθθμ. Σα εκ θυβς ζμζχιαηα είκαζ δζαθμνεηζηήξ ζφζηαζδξ ζε ζπέζδ ιε ηα BV. Ακ ηαζ ημ ηαρίδζμ είκαζ ηαοηυζδιμ, δ ιειανάκδ ημο θαηέθμο πνμένπεηαζ απυ εβημθπχζεζξ (invaginations) ηδξ εζςηενζηήξ ηαζ ελςηενζηήξ πονδκζηήξ 14

33 Α Β Δηθόλα 1.8 Γμιή ηςκ BV ηαζ ιδπακζζιυξ πνμζαμθήξ ηςκ ηοηηάνςκ. Α. Ζθεηηνμκζμβναθία εκυξ αθαζηζημφ ζμζχιαημξ ημο ζμφ AcMNPV. Δίκαζ ειθακείξ μζ μδμκηςηέξ πνμελμπέξ ηαζ δ ζηεκή ζφκδεζδ ηδξ ιειανάκδξ ιε ημ κμοηθεμηαρίδζμ ακηίζημζπα πνμξ ηα άηνα ημο. (Wang et al., 2016). B. Γναθζηή απεζηυκζζδ ημο ζμζχιαημξ (ανζζηενά) ηαζ ηδξ δζαδζηαζίαξ ζπδιαηζζιμφ ημο (δελζά-ηάης), ιε έλμδμ ημο ηαρζδίμο απυ εέζεζξ ηδξ ιειανάκδξ υπμο αενμίγμκηαζ πνςηεΐκεξ ζφκηδλδξ. Ζ είζμδμξ ζε ηφηηανμ ζηυπμ επίζδξ πενζβνάθεηαζ (δελζάπάκς), ιε ηδκ εκζςιάηςζδ ζε εκδμζχιαηα ηαζ ηδκ ηεθζηή απεθεοεένςζδ ημο ηαρζδίμο ζημ ηοηηανυπθαζια. διεζχκεηαζ υηζ ζηδκ πανμφζα παθαζυηενδ απεζηυκζζδ, μδμκηςηή πενζμπή οπάνπεζ ιυκμ ακηίζημζπα πνμξ ηδκ ημνοθαία πενζμπή ημο ηαρζδίμο. Τξνπνπνίεζε από (Slack & Arif, 2007). ιειανάκδξ (INM/ONM: Inner/Outer Nuclear Membrane) ηαζ υπζ απυ ηδκ ηοηηανζηή ιειανάκδ, ιε απμηέθεζια κα είκαζ δζαθμνεηζηήξ πνςηεσκζηήξ ηαζ θζπζδζηήξ ζφζηαζδξ ζε ζπέζδ ιε ηςκ αθαζηζηχκ ζχκ (Shi et al., 2015). Οζ εβημθπχζεζξ ζπδιαηίγμοκ ηεθζηά ιζηνμ-ηοζηίδζα (microvesicles) δζαθυνςκ ιεβεεχκ ιε ηα μπμία αθθδθεπζδνμφκ ηα κμοηθεμηαρίδζα βζα ηδ δζαιυνθςζδ ηςκ ζμζςιάηςκ, υπμο δ ιειανάκδ ηοθίβεηαζ ζθζηηά βφνς απυ ημ κμοηθεμπνςηεσκζηυ ζφιπθμημ. Με ηδκ παναβςβή ηςκ ακηίζημζπςκ ζμζςιάηςκ ζε ελέθζλδ, ήδδ ζηζξ 24 hpi παναηδνμφκηαζ ηα πνχηα πμθφεδνα (OB). Aκάθμβα ιε ημ είδμξ ημο ζμφ, ηάεε πμθφεδνμ ιπμνεί κα πενζέπεζ έκα ή πενζζζυηενα ζμζχιαηα. ηδκ πνχηδ πενίπηςζδ ακήημοκ μζ ααηηνμσμί ηφπμο ημηηίςζδξ (GV: Granulosis Virus ή Granulovirus) ηαζ ζηδ δεφηενδ μζ ζμί ηφπμο πονδκζηήξ πμθοέδνςζδξ (NPV: Nucleopolyhedrosis virus ή Nucleopolyhedrovirus) (εζη. 1.9). Οζ ζμί πονδκζηήξ πμθοέδνςζδξ δζαηνίκμκηαζ πεναζηένς ιμνθμθμβζηά ζηδ αάζδ ηδξ πμζυηδηαξ ηαρζδίςκ πμο οπάνπμοκ ακά ιειμκςιέκμ ζυζςια ζηα πμθφεδνα. Δάκ οπάνπμοκ πμθθά ηαρίδζα ακά ζυζςια, ηυηε μ ζυξ ακήηεζ ζηδκ ηαηδβμνία ηςκ πμθθαπθχκ NPV (MNPV: Multiple NPV, υπςξ ζημκ ζυ AcMNPV), εκχ ζηδκ 15

34 Δηθόλα 1.9 πεδζαβναιιαηζηή απεζηυκζζδ ηδξ δμιήξ ηςκ δζαθυνςκ ηφπςκ έβηθεζζηςκ ζχκ, υπμο δζαηνίκμκηαζ μζ ηνεζξ ηφνζεξ θαζκμηοπζηέξ πμζηζθίεξ: μζ δφμ ανζζηενά, δζαεέημκηαξ πμθοεδνζηυ ζπήια, ακήημοκ ζηδκ NPV βεκεαθμβία ηαζ θένμοκ πενζζζυηενα ημο εκυξ ζμζχιαηα ακά έβηθεζζημ, εκχ δ ηεθεοηαία ακαθένεηαζ ζημοξ GV ιε έκα ζυζςια ακά έβηθεζζημ ηαζ ιμνθμθμβία ηάρμοθαξ. Οζ NPV ηαλζκμιμφκηαζ πεναζηένς ζε δφμ επζιένμοξ ηαηδβμνίεξ: ζημοξ SNPV (ηέκηνμ), υπμο ηάεε ζυζςια πενζέπεζ έκα ηαζ ιυκμ ηαρίδζμ ηαζ ζημοξ MNPV (ανζζηενά), υπμο ζζπφεζ ημ ακηίεεημ. (Slack & Arif, 2007) ακηίεεηδ πενίπηςζδ, υηακ οπάνπεζ έκα ηαρίδζμ ακά ζυζςια, μ ζυξ ηαθείηαζ απθυξ/ιμκυξ NPV (SNPV: Single NPV, υπςξ ζημκ ζυ BmSNPV/ βζα θυβμοξ απθυηδηαξ εα παναηηδνίγεηαζ εθελήξ ςξ BmNPV). Οζ παναπάκς πενζπηχζεζξ ακαθένμκηαζ απμηθεζζηζηά ζηα ζμζχιαηα ODV πμο εα εβηθεζζημφκ ζε ηνφζηαθθμ πμθοεδνίκδξ βζα ηδκ παναβςβή πμθφεδνςκ ηαζ εηθνάγμοκ ηδ ιμνθμθμβία ηδξ πθεζμρδθίαξ ηςκ ακηίζημζπςκ ζμζςιάηςκ: δ πθεζμρδθία ηςκ πμθθαπθχκ NPV ζμζςιάηςκ πενζέπμοκ ηαηά ιέζμ υνμ 5-15 ηαρίδζα, εκχ ηα ζμζχιαηα ηςκ ιμκχκ NPV, ζπεδυκ απμηθεζζηζηά 1 ηαρίδζμ ακά ζυζςια (Rohrmann, 2014). Παν υθα αοηά ζε ιυθοκζδ ιε ημκ ζυ AcMNPV αβνίμο ηφπμο παναηδνείηαζ ηαηά ιέζμ υνμ έκα 3% ηςκ ODV ζμζςιάηςκ κα πενζέπμοκ ιυκμ έκα ηαρίδζμ (Rohrmann, 2014). Σα αθαζηζηά ζμζχιαηα ακηίεεηα θαίκεηαζ κα πενζέπμοκ απμηθεζζηζηά έκα κμοηθεμηαρίδζμ ακά ζυζςια. Γεδμιέκμο υηζ δεκ οπάνπεζ ζαθήξ βεκεηζηή αάζδ βζα ημοξ παναπάκς θαζκμηφπμοξ ηςκ έβηθεζζηςκ ζμζςιάηςκ, πμο επζπθέμκ θαίκεηαζ κα επδνεάγμκηαζ ζηδκ ειθάκζζή ημοξ ηαζ απυ ημκ ηοηηανζηυ ηφπμ ηαζ ακαπηολζαηυ 16

35 ζηάδζμ ημο λεκζζηή, οπάνπεζ αιθζζαήηδζδ βζα ηδ ζδιαζία ηδξ ζοβηεηνζιέκδξ δζάηνζζδξ, δ μπμία υιςξ ελαημθμοεεί κα πνδζζιμπμζείηαζ ζηδ αζαθζμβναθία (de A. Zanotto et al., 1993; Rohrmann, 2014). Δπζπθέμκ ηάεε ηαηδβμνία ζμφ θαίκεηαζ κα ζπεηίγεηαζ ιε πζεακά ελεθζηηζηά πθεμκεηηήιαηα πμο πεναζηένς πενζπθέημοκ ηδ ζδιαζία ημο ιμκμφ ηαζ πμθθαπθμφ ηφπμο (Rohrmann, 2014). οβηεηνζιέκα, μ πμθθαπθυξ ηφπμξ πζεακχξ είκαζ μ ιυκμξ πμο πναηηζηά επζηνέπεζ ηδκ απεοεείαξ δζέθεοζδ ODV ζμζςιάηςκ απυ ηα εκηενζηά ηφηηανα, υπςξ ακαθένεδηε, ηαζ ηδκ ηαπεία εβηαείδνοζδ δεοηενμβεκμφξ ιυθοκζδξ ζε άθθμοξ ζζημφξ ηονίςξ ζε βεζημκζηά ηναπεζαηά ηφηηανα (εζη. 1.5). ε ζοκήεεζξ ζοκεήηεξ ιυθοκζδξ ζπάκζα έκα εκηενζηυ ηφηηανμ ιπμνεί κα ιμθοκεεί απυ πενζζζυηενα ημο εκυξ ζμζχιαηα. Ωξ εη ημφημο, έκα πμθθαπθυ ζυζςια ιπμνεί κα πανέπεζ ηαρίδζα πμο εα ιεηααμφκ ζημκ πονήκα, χζηε κα παναπεμφκ μζ πνςηεΐκεξ ημο θαηέθμο ηςκ BV, ηαζ ηαρίδζα πμο απθχξ εα δζαζπίζμοκ ημ ηοηηανυπθαζια, εα αθθδθεπζδνάζμοκ ιε ηζξ πνςηεΐκεξ θαηέθμο ηαζ εα εηαθαζηήζμοκ βζα κα ιμθφκμοκ άιεζα άθθα ηφηηανα. Μία ηέημζα ζηναηδβζηή ιπμνεί κα ακηζιεηςπίζεζ απμηεθεζιαηζηά ημ θαζκυιεκμ ηδξ εκενβδηζηήξ απμιάηνοκζδξ ηςκ εκηενζηχκ ηοηηάνςκ (sloughing), πμο ακαθένεδηε παναπάκς ςξ αιοκηζηυξ ιδπακζζιυξ. ε πενίπηςζδ ηχνα πμο έκαξ ηέημζμξ ιδπακζζιυξ δε θεζημονβεί ζε νοειμφξ πμο εα δδιζμονβμφζακ πνυαθδια ζηδκ παναιμκή ημο ζμφ ζημ επζεήθζμ, μζ ιμκμί NPV ειθακίγμκηαζ πζεακχξ πθεμκεηηζημί δεδμιέκμο υηζ δ ίδζα πμζυηδηα ηαρζδίςκ ιπμνεί κα ιμθφκεζ πμθφ πενζζζυηενα εκηενζηά ηφηηανα (Rohrmann, 2014). Σα ζςιάηζα έβηθεζζδξ (OBs) ηςκ NPV είκαζ ζδιακηζηά ιεβαθφηενα ηςκ ακηίζημζπςκ δμιχκ ηςκ GV, ιε δζάιεηνμ ηδξ ηάλεςξ ηςκ nm. Ζ ηφνζα πνςηεΐκδ ημο ηνοζηαθθζημφ πενζαθήιαημξ μκμιάγεηαζ πμθοεδνίκδ (polyhedrin), ιε ιμνζαηυ αάνμξ 30 kda ςξ ιμκμιενέξ, ηαζ απμηεθεί έκα απυ ηα ηαη ελμπήκ πμθφ υρζια βμκζδζαηά πνμσυκηα ηςκ ζχκ. Σα ιυνζα πμθοεδνίκδξ μνβακχκμκηαζ ςξ μιμηνζιενή πμο ειθακίγμοκ πμκδνζηά δμιή ηφαμο. Σέζζενα μιμηνζιενή αθθδθμζοκδέμκηαζ ιε δζζμοθθζδζημφξ ηαζ άθθμοξ, ιδ μιμζμπμθζημφξ δεζιμφξ ζπδιαηίγμκηαξ έκα ηεηναεδνζηυ δςδεηαιενέξ (12ιενέξ) πμθοεδνίκδξ, ηαζ δφμ δςδεηαιενή ακηίεεηδξ πμθζηυηδηαξ εθανιυγμοκ ιεηαλφ ημοξ ιε ιδ μιμζμπμθζημφξ δεζιμφξ ζπδιαηίγμκηαξ ηδ ααζζηή δμιζηή ιμκάδα ημο ηνοζηάθθμο (crystal unit cell) (εζη. 1.10/A,B,C) (Ji et al., 2010). Σμ ηνοζηαθθζηυ πθέβια δζαιμνθχκεηαζ απυ επακαθήρεζξ ηςκ 12ιενχκ ιμκάδςκ (εζη. 1.10/D) ηαζ δζαηυπηεηαζ απυ ηα έβηθεζζηα ζμζχιαηα, ηαεέκα εη ηςκ μπμίςκ εηημπίγεζ πενίπμο 2x10 4 οπμιμκάδεξ πμθοεδνίκδξ 17

36 Με δηαζπλδεδεκέλν δσδεθακεξέο Δπαλαιακβαλόκελεο κνλάδεο δσδεθακεξώλ ζρεκαηίδνπλ ην θξπζηαιιηθό πιέγκα Βαζηθή δνκηθή κνλάδα θξπζηάιινπ (24κεξέο) Γσδεθακεξέο πνιπεδξίλεο κε δηζνπιθηδηθέο ζπλδέζεηο Δηθόλα 1.10 πδιαηζηή ακαπανάζηαζδ ηδξ δμιζηήξ μνβάκςζδξ ηςκ πμθφεδνςκ. Σα μιμηνζιενή πμθοεδνίκδξ απεζημκίγμκηαζ απθμοζηεοιέκα ςξ ηφαμζ. 12ιενή ακηίεεηδξ πμθζηυηδηαξ (A, C δζαθμνεηζηυ πνχια ηφαςκ ακά πμθζηυηδηα) εθανιυγμοκ ηαζ ζπδιαηίγμοκ ηδκ 24ιενή δμιζηή ιμκάδα ημο ηνοζηάθθμο πμθοεδνίκδξ (B). Οζ δζζμοθθζδζημί δεζιμί ιεηαλφ ηςκ 3ιενχκ ημο εηάζημηε 12ιενμφξ απεζημκίγμκηαζ ςξ ζοιπαβείξ νάαδμζ. Σμ ηνοζηαθζηυ πθέβια ζπδιαηίγεηαζ ζοκμθζηά απυ επακαθαιαακυιεκεξ 12ιενείξ ιμκάδεξ (D). πδιαηζηή ακαπανάζηαζδ ημιήξ πμθφεδνμο: μζ θεπηέξ ημοηίδεξ απεζημκίγμοκ ηδ δζάηαλδ ηςκ δμιζηχκ ιμκάδςκ ζημ ηνοζηαθθζηυ πθέβια ηαζ δζαηυπημκηαζ απυ ημοξ έβηθεζζημοξ ODV (E). Δζηυκα θςημκζημφ ιζηνμζημπίμο πμθφεδνςκ ημο ιεηαθθαβιέκμο ζηεθέπμοξ G25D (F). Τξνπνπνίεζε από (Ji et al., 2010). 18

37 (εζη. 1.10/E). Ζ απμοζία ηςκ οπμιμκάδςκ πζεακχξ επδνεάγεζ ηδ ζηαεενυηδηα ημο ηνοζηαθζημφ πθέβιαημξ, δεδμιέκμο υηζ ιεηαθθαβιέκα ζηεθέπδ πμο δεκ εβηθείμοκ ζμζχιαηα, πανάβμοκ ζοκήεςξ ιεβαθφηενα πμθφεδνα. Υαναηηδνζζηζηυ πανάδεζβια ζοκζζηά δ ιεηάθθαλδ G25D ηδξ πμθοεδνίκδξ ημο ζμφ AcMNPV (εζη. 1.10/F), υπμο ανηεηά πμθφεδνα, ηεκά ζμζςιάηςκ, ειθακίγμοκ ζοκμθζηή δζάζηαζδ (maximum linear dimension) 5-10 ιm υηακ ακηίζημζπα πμθφεδνα αβνίμο ηφπμο δεκ λεπενκμφκ ηα 5 ιm. ηζξ 48 hpi μ πονήκαξ, υπμο ανίζημκηαζ ηα πμθφεδνα, θφεηαζ, βεβμκυξ πμο ζπεηίγεηαζ ζηεκά ιε ηδ ζφκεεζδ ηςκ πνςηεμθοηζηχκ εκγφιςκ ημο ζμφ (Slack & Arif, 2007). Σα ίδζα ιυνζα ηεθζηά νεοζημπμζμφκ ηδκ πνμκφιθδ απεθεοεενχκμκηαξ ζδιακηζηυ ζζηυ θμνηίμ ζημ πενζαάθθμκ. Γεδμιέκμο υηζ μζ ιμθοζιέκμζ λεκζζηέξ εκημπίγμκηαζ ζε πενζμπέξ ηνμθήξ, ιε ηδ θφζδ ημοξ ημπμεεημφκ κέμοξ ιμθοζιαηζημφξ ζμφξ αηνζαχξ εηεί υπμο εα έπμοκ ιεβαθφηενμ ακηίηηοπμ βζα ηδκ πεναζηένς ιεηάδμζδ ηαζ πνμζαμθή δεηηζηχκ λεκζζηχκ. Σμ πνςηεμθοηζηυ έκγοιμ ζζηή ηαεερίκδ, v-cath (ακηίζημζπμ ηςκ ηαεερζκχκ ηςκ εδθαζηζηχκ) ηαζ δ ζζηή πζηζκάζδ, ChiA, απμηεθμφκ ημοξ ααζζημφξ ηεθεζηέξ ηαζ νοειζζηέξ ημο ζηαδίμο ηδξ απεθεοεένςζδξ ηςκ OB (Slack & Arif, 2007) ηαζ ανίζημκηαζ ζημοξ πενζζζυηενμοξ Άθθα ηαζ Βήηα ααηηνμσμφξ (βι. παξαθάηω) (Ishimwe et al., 2015). Ζ θεζημονβία ημοξ είκαζ ζοκημκζζιέκδ, χζηε δ θφζδ ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ ηδξ πνμκφιθδξ ζοκμθζηά κα πνμηφρεζ ιεηά ημ εάκαηυ ηδξ, ιε ζημπυ ηδ ιεβζζημπμίδζδ ηδξ ακαπαναβςβήξ ημο ζμφ (Ishimwe et al., 2015). Βαηηνμσμί πμο δε δζαεέημοκ ηα παναπάκς έκγοια πνδζζιμπμζμφκ δζαθμνεηζηέξ ζηναηδβζηέξ βζα ηδκ έλμδμ ηςκ πμθοέδνςκ ημοξ απυ ηα ηφηηανα. Οζ ααηηνμσμί είκαζ επζπθέμκ βκςζηυ υηζ πνμηαθμφκ αθθαβέξ ζηδ ζοιπενζθμνά ηςκ εκηυιςκ-λεκζζηχκ ημοξ. Δζδζηά βζα ημκ BmNPV έπεζ ανεεεί υηζ πανάβεζ ιία θςζθαηάζδ ηονμζίκδξ απυ ημ βμκίδζμ ptp (protein tyrosine phosphatase), πμο επάβεζ αολδιέκδ ηζκδηζηυηδηα ζηζξ πνμζαεαθδιέκεξ πνμκφιθεξ, ςεχκηαξ ηεξ ζοκήεςξ κα ιεηααμφκ πνμξ ορδθυηενα ζδιεία ημο δέκδνμο (θαζκυιεκμ Wipfelkrankheit ή tree-top disease, (Katsuma et al., 2012)). Σα παναπάκς απμηεθέζιαηα ηδξ ιυθοκζδξ εεςνείηαζ υηζ ακηαπμηνίκμκηαζ ζε έκακ εηηεηαιέκμ θαζκυηοπμ ημο ζμφ (extended phenotype, (Hunter, 2009)), μ μπμίμξ ημο πανέπεζ πθεμκέηηδια επζαίςζδξ ιε ημ κα ηαηεοεφκεζ ηδκ ημπμεέηδζδ ηςκ κέςκ ιμθοζιαηζηχκ έβηθεζζηςκ ζμζςιάηςκ ζε εέζεζξ πμο ελαζθαθίγμοκ ιεβζζημπμίδζδ ηδξ δζαζπμνάξ ημο ζε κέμοξ λεκζζηέξ. Δίκαζ ζδιακηζηυ κα ζδιεζςεεί υηζ δ πθεζμκυηδηα ηςκ ζημζπείςκ πμο παναηέεδηακ ζπεηζηά ιε ηδ δμιή ηαζ ημκ ηφηθμ γςήξ ηςκ ααηηνμσχκ, ακαθένμκηαζ ηαηά αάζδ ζημοξ NPV ζμφξ ηςκ θεπζδυπηενςκ ζημοξ μπμίμοξ ακήηεζ μ BmNPV. 19

38 Δζδζηά μζ πνμκζηέξ θεπημιένεζεξ ημο ηφηθμο έπμοκ θδθεεί απυ ιεθέηεξ ζημκ ζυ AcMNPV (εζη. 1.7). Σμ βμκζδίςια ημο BmNPV, πμο απμηεθείηαζ απυ γεφβδ αάζεςκ, πανμοζζάγεζ ζδιακηζηυ ααειυ μιμθμβίαξ ιε αοηυ ημο AcMNPV (Gomi et al., 1999). O BmNPV βεκζηά πανμοζζάγεζ παιδθυηενμ νοειυ ακάπηολδξ ζε ζπέζδ ιε ημκ AcMNPV, λεηζκχκηαξ ηδκ ακηζβναθή ημο βεκεηζημφ ημο οθζημφ ζηζξ 8 (Okano et al., 1999) ή hpi (Acharya & Gopinathan, 2002), ακηί βζα ηζξ 6 12 h ημο AcMNPV (Acharya & Gopinathan, 2002). Δπζπθέμκ μζ δφμ ζμί δζαεέημοκ δζαηνζημφξ ηαζ δζαθμνεηζημφξ λεκζζηέξ, ιε ημκ πνχημ κα είκαζ παεμβυκμξ απμηθεζζηζηά ζημκ ιεηαλμζηχθδηα B. mori, πνάβια πμο αδοκαηεί κα πνάλεζ μ δεφηενμξ (Gomi et al., 1999), μ μπμίμξ υιςξ δζαεέηεζ ανηεηά εονφηενμ θάζια, ιε πενζζζυηενμοξ ημο εκυξ λεκζζηέξ. 1.4 Ταξινομική ηυν Βακηποφών Ζ μζημβέκεζα ηςκ ααηηνμσχκ πενζθαιαάκεζ ηέζζενα βέκδ πμο ζε ζδιακηζηυ ααειυ ακηακαηθμφκ ηαζ ηδκ ηάλδ ηςκ εκηυιςκ πμο ακηίζημζπα πνμζαάθμοκ: Άθθα ηαζ Βήηα ααηηνμσμί (Alpha/Betabaculovirus), πμο πνμζαάθμοκ ηα θεπζδυπηενα, Γάιια (Gamma), πμο πνμζαάθμοκ ηα οιεκυπηενα, ηαζ Γέθηα (Delta), πμο πνμζαάθμοκ ηα δίπηενα (Rohrmann, 2014) (εζη. 1.11). Οζ Βήηα ααηηνμσμί είκαζ ζμί ημηηίςζδξ (GV), ζε ακηζδζαζημθή ιε υθμοξ ημοξ οπυθμζπμοξ πμο απμηεθμφκ ζμφξ πονδκζηήξ πμθοέδνςζδξ (NPV). Ζ θοθμβεκεηζηή ακάθοζδ ααζίγεηαζ ζε ακηίζημζπδ βεκεηζηή ακάθοζδ ηςκ δζαεέζζιςκ ακαβκςζιέκςκ βμκζδζςιάηςκ ηςκ ζχκ. οιπθδνςιαηζηά πνδζζιμπμζείηαζ ηαζ δ ιεθέηδ ακηζπνμζςπεοηζηχκ μιάδςκ ζδιακηζηχκ ημζκχκ βμκζδίςκ (core genes), πμο ιαγί ιε ηδκ ανπζηεηημκζηή ηαζ ζφζηαζδ ημο βμκζδζχιαημξ ιπμνμφκ κα δχζμοκ αλζυπζζηεξ πθδνμθμνίεξ βζα ηδκ ελεθζηηζηή ζοζπέηζζδ ηςκ επζιένμοξ ζχκ (Herniou & Jehle, 2007). ε πενίπηςζδ πμο οπάνπμοκ δζαεέζζιεξ ιυκμ πενζμνζζιέκεξ βεκεηζηέξ πθδνμθμνίεξ, δ ηαλζκυιδζδ ιπμνεί κα ζηδνζπεεί ζηδ ζφβηνζζδ ηδξ αθθδθμοπίαξ ιειμκςιέκςκ ζοκηδνδιέκςκ βμκζδίςκ, υπςξ ημ βμκίδζμ ηδξ πμθοεδνίκδξ, ηαζ ηαηά πνμηίιδζδ ιεβαθφηενςκ βμκζδίςκ, υπςξ ημ lef8 (ιε ηςδζηή πενζμπή 2.6 kbp, βι. παξαθάηω), δεδμιέκμο υηζ θυβς έηηαζδξ είκαζ πενζζζυηενμ πθδνμθμνζαηά (Herniou & Jehle, 2007). Δκδεζηηζηά, ιε αάζδ ηζξ θοθμβεκεηζηέξ ζοζπεηίζεζξ βμκζδίςκ πμθοεδνίκδξ απυ δζάθμνα είδδ Άθθα ααηηνμσχκ, δζαπζζηχεδηε δ ηαη ανπήκ ηαηάηαλή ημοξ ζε δφμ ηαλζκμιζηέξ ηαηδβμνίεξ: ηζξ μιάδεξ I ηαζ ΗΗ, πμο δζαθένμοκ ςξ πνμξ ημ ααειυ 20

39 Δηθόλα 1.11 Φοθμβεκεηζηή ηαηάηαλδ ααηηνμσχκ ιε αάζδ ηδ ιεθέηδ ημο βμκζδζχιαηυξ ημοξ. Πνυηεζηαζ βζα 29 είδδ βζα ηα μπμία οπάνπεζ δζαεέζζιδ δ πθήνδξ βμκζδζςιαηζηή αθθδθμοπία ημοξ. Ζ ελεθζηηζηή ημοξ ζοζπέηζζδ ααζίγεηαζ ζηδκ ακάθοζδ ηδξ αιζκμλζηήξ αθθδθμοπίαξ ηςκ πνμσυκηςκ απυ ηα 29 ημζκά ζδιακηζηά βμκίδζα πμο δζαεέημοκ. Οζ ζμί BmNPV ηαζ AcMNPV ζδιεζχκμκηαζ ιε αέθδ. Δίκαζ εκδζαθένμκ υηζ ζηδ ζπεηζηή δδιμζίεοζδ δεκ οπάνπμοκ μζ υνμζ Άθθα, Βήηα, Γάιια ηαζ Γέθηα ααηηνμσμί ακηίζημζπα βζα ημοξ ζμφξ πμθοέδνςζδξ ηςκ θεπζδμπηένςκ, ημηηίςζδξ ηςκ θεπζδμπηένςκ ηαζ πμθοέδνςζδξ ηςκ οιεκυπηενςκ ηαζ δίπηενςκ ακηίζημζπα. (Herniou & Jehle, 2007). μιμθμβίαξ ηςκ παναπάκς βμκζδίςκ (de A. Zanotto et al., 1993). Μεηέπεζηα ιεθέηεξ, ζε επίπεδμ βμκζδζχιαημξ, οπμζηδνίλακ ηδκ ανπζηή αοηή δζάηνζζδ, οπμδεζηκφμκηαξ πςξ μζ ζμί μιάδαξ ΗΗ πνδζζιμπμζμφκ ιία ελεθζηηζηά ανπαζυηενδ πνςηεΐκδ ιειανακζηήξ ζφκηδλδξ (ηδκ F-πνςηεΐκδ), ζε ακηίεεζδ ιε αοημφξ ηδξ μιάδαξ Η, πμο δζαεέημοκ ηδ GP64 βζα ημκ ίδζμ νυθμ (Jehle et al., 2006). διεζχκεηαζ υηζ μζ ζμί ηδξ μιάδαξ I δζαεέημοκ ηαζ ηδκ πνςηεΐκδ F, πςνίξ υιςξ κα είκαζ ζαθήξ μ νυθμξ ηδξ ζε επίπεδμ αθαζηζηχκ ζχκ, ιζαξ ηαζ δ ζφκηδλδ θαίκεηαζ κα ιεζμθααείηαζ απμηθεζζηζηά απυ ηδκ πνςηεΐκδ GP64. Δπίζδξ πενζέπμοκ 11 επζπθέμκ βμκίδζα (πένακ ημο gp64), πμο δεκ 21

40 οπάνπμοκ ζε εηείκμοξ ηδξ μιάδαξ ΗΗ (Rohrmann, 2014). Ο ζυξ BmNPV, πμο είκαζ ημ ακηζηείιεκμ ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ, υπςξ ηαζ μ ηαθφηενα ιεθεηδιέκμξ πμθφ ζοββεκζηυξ ημο AcMNPV, ακήημοκ ζηδκ μιάδα I (de A. Zanotto et al., 1993). Πανά ημ βεβμκυξ υιςξ υηζ ζοζπεηίζεζξ ιε αάζεζ ηδκ ανπζηεηημκζηή ημο βμκζδζχιαημξ, ηδκ ακάθοζδ ημζκχκ ζδιακηζηχκ βμκζδίςκ ηαζ παεμθοζζμθμβζηά δεδμιέκα ζαθχξ ηαηαηάζζμοκ ημκ ζυ AcMNPV ζε αοηή ηδκ μιάδα, ημ βμκίδζμ ηδξ πμθοεδνίκδξ ημο είκαζ πενζζζυηενμ ζοββεκζηυ ιε ημ ακηίζημζπμ βμκίδζμ ημο ζμφ Trichoplusia ni SNPV ηδξ μιάδαξ ΗΗ (Herniou & Jehle, 2007). Ζ παναπάκς ακηίθαζδ ακηακαηθά ηζξ αδοκαιίεξ πμο οπάνπμοκ υηακ πνδζζιμπμζμφκηαζ ιειμκςιέκα βμκίδζα. 1.5 Μεηαγπαθή και Ανηιγπαθή ζηοςρ βακηποφούρ Ζ ιεηαβναθή ηςκ ααηηνμσζηχκ βμκζδίςκ ζηα ηφηηανα-λεκζζηέξ πναβιαημπμζείηαζ ζε ηνείξ παναηηδνζζηζηέξ ηαζ πνμκζηά δζαηνζηέξ θάζεζξ ηαζ είκαζ ζηεκά ζοκδεδειέκδ ιε ηδκ ακηζβναθή ημο ζζημφ βμκζδζχιαημξ. Πνχηα ιεηαβνάθμκηαζ απυ ηδκ RNA πμθοιενάζδ ημο λεκζζηή ηα πνχζια ζζηά βμκίδζα (early genes) ηαζ εκ ζοκεπεία απυ ηδκ RNA πμθοιενάζδ ημο ζμφ ηα υρζια (late) ηαζ ηέθμξ ηα πμθφ υρζια (very late) βμκίδζα (Kool et al., 1995; Kovacs et al., 1992; Summers, 2006). Ζ ακηζβναθή ημο ζζημφ βμκζδζχιαημξ ζδιαημδμηεί ηαζ επζπθέμκ ζοκζζηά ακαβηαία ζοκεήηδ βζα ηδκ έκανλδ ηδξ υρζιδξ ιεηαβναθήξ (Rohrmann, 2013). Σα βμκίδζα ηςκ ααηηνμσχκ ιεηαβνάθμκηαζ ηαζ απυ ηζξ δφμ αθοζίδεξ ημο ζζημφ DNA ηαζ ανίζημκηαζ δζάζπανηα ζημ βμκζδίςια πςνίξ κα παναηδνείηαζ ηάπμζα μιαδμπμίδζδ ιε αάζδ ημ πνμκζζιυ έηθναζδξ (Kelly et al., 2007). Οζ ααηηνμσμί επζπθέμκ είκαζ μζ ιυκμζ DNA ζμί εοηανοςηζηχκ ηοηηάνςκ, ιε πονδκζηυ πμθθαπθαζζαζιυ, πμο δζαεέημοκ δζηή ημοξ RNA πμθοιενάζδ (Rohrmann, 2013). Άθθμζ ζμί υπςξ μζ pox δζαεέημοκ ημ παναπάκς παναηηδνζζηζηυ, αθθά παναιέκμοκ ηαζ πμθθαπθαζζάγμκηαζ απμηθεζζηζηά ζημ ηοηηανυπθαζια Πξώηκα γνλίδηα Ωξ πνχζια βμκίδζα μνίγμκηαζ υζα εηθνάγμκηαζ πνζκ ηδκ ακηζβναθή ημο ζζημφ βμκζδζχιαημξ, πμο ανπίγεζ ζηζξ 6 ιε 9 h ιεηά ηδ ιυθοκζδ (Friesen, 1997). Ζ ιεηαβναθή ημοξ βίκεηαζ απυ ηδκ RNA πμθοιενάζδ ημο λεκζζηή ηαζ, υπςξ είκαζ ακαιεκυιεκμ, μζ οπμηζκδηέξ ημοξ πενζέπμοκ ζηδκ πθεζμρδθία ημοξ ηοπζηέξ αθθδθμοπίεξ πμο είκαζ βκςζηυ υηζ ακαβκςνίγμκηαζ απυ ηδκ εκ θυβς πμθοιενάζδ. 22

41 οκήεςξ αοηέξ ζοκίζηακηαζ απυ ιία αθθδθμοπία TATA πμο ζοκδοάγεηαζ ιε ιία ηεηνακμοηθεμηζδζηή εέζδ έκανλδξ ηδξ ιεηαβναθήξ (ηφπμο CAGT ή άθθμο) πενίπμο 30 κμοηθεμηίδζα ηαεμδζηά ηδξ TATA (Rohrmann, 2013). Πνμελάνπμκηα νυθμ ζηζξ πνχζιεξ θάζεζξ ημο ζζημφ ηφηθμο γςήξ δζαδναιαηίγμοκ ζζημί ιεηαβναθζημί εκενβμπμζδηέξ (transcriptional activators) ηαζ εκζζποηέξ (enhancers), πμο ιε ηδ ζοκημκζζιέκδ δνάζδ ημοξ μνβακχκμοκ ημ ζζηυ ιεηαβναθζηυ πνυβναιια, ηαηά ακηζζημζπία ιε υ,ηζ ζοιααίκεζ ηαζ ζε άθθμοξ ζμφξ. Μεηαλφ ηςκ πνχηςκ ζδιακηζηυηενμξ είκαζ δ πνςηεΐκδ IE-1 (Immediate Early-1), πμο επάβεζ ηδκ έηθναζδ άθθςκ ζζηχκ βμκζδίςκ, ηυζμ πνχζιςκ υζμ ηαζ υρζιςκ. Πανάβεηαζ πμθφ ζφκημια ιεηά ηδ ιυθοκζδ (πενίπμο 20 min, ζημκ AcMNPV), οπυ ημκ έθεβπμ ηοηηανζηχκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ηαζ ζε πμζυηδηεξ πμο ζοκεπίγμοκ κα αολάκμκηαζ ηαζ ιεηά ηδκ έκανλδ ακαδζπθαζζαζιμφ ημο DNA, θεάκμκηαξ ηδ ιέβζζηδ ηζιή ημοξ ζε πμθφ υρζια ζηάδζα (Stewart et al., 2005). οκζζηά επζπθέμκ ααζζηυ ζοζηαηζηυ ημο ζοιπθυημο ακηζβναθήξ ημο ζζημφ βεκεηζημφ οθζημφ ηαζ πένα απυ ηδκ ηφνζα δνάζδ ςξ εκενβμπμζδηήξ δζάθμνςκ ζζηχκ ηαζ ιδ βμκζδίςκ (Kovacs et al., 1992; Lu et al., 1996), θαίκεηαζ κα ιπμνεί κα ειπθαηεί ηαζ ζηδ ιεζμ-νφειζζδ βμκζδίςκ (Leisy et al., 1997). ε πεζνάιαηα απεκενβμπμίδζδξ (knock-out) ημο βμκζδίμο ie-1 ημο ααηηνμσμφ AcMNPV, δζαπζζηχεδηε υηζ μζ ιεηαθθαβιέκμζ ζμί δεκ ήηακ ζε εέζδ κα ιμθφκμοκ ηφηηανα Sf9 (πνμένπμκηαζ απυ ημ θεπζδυπηενμ Spodoptera frugiperda) (Invitrogen, 2002) ζε ηαθθζένβεζα, ζε ακηίεεζδ ιε ημκ ζυ αβνίμο ηφπμο. οκμθζηά δεκ ηαηέζηδ εθζηηή δ δζαπίζηςζδ έβηθεζζηςκ ηαζ αθαζηζηχκ ζχκ, ηαζ επζπθέμκ δεκ παναηδνήεδηε ακηζβναθή ημο ζζημφ DNA (Stewart et al., 2005). Ζ ζηακυηδηα ηδξ πνςηεΐκδξ IE-1 κα εκενβμπμζεί ηδ ιεηαβναθή άθθςκ βμκζδίςκ αολάκεηαζ ζδιακηζηά ιε ηδκ πνυζδεζή ηδξ ζε ζοβηεηνζιέκεξ επακαθαιαακυιεκεξ πενζμπέξ ημο ζζημφ βμκζδζχιαημξ, ηζξ μιυθμβεξ πενζμπέξ (hrs: homologous regions), πμο πενζέπμοκ ςξ ηεκηνζηή ιμκάδα ιία αηεθή παθίκδνμιδ αθθδθμοπία (palindrome) (εζη. 1.12). Οζ πενζζζυηενμζ ααηηνμσμί δζαεέημοκ μιυθμβεξ πενζμπέξ, μζ μπμίεξ θεζημονβμφκ ςξ εκζζποηέξ ηδξ ιεηαβναθήξ, ιε ηδ ζοκδνμιή ή υπζ ηδξ IE-1, ηαζ επζπθέμκ ειπθέημκηαζ ζηδκ ακηζβναθή ημο ζζημφ βμκζδζχιαημξ ςξ πζεακέξ εέζεζξ έκανλδξ (origins of replication) (Rohrmann, 2013). Δζδζηά μζ μιυθμβεξ πενζμπέξ ηςκ Άθθα ααηηνμσχκ πενζέπμοκ αθθδθμοπίεξ ηφπμο CRE (camp Response Element) ηαζ TRE (TPA Response Element/ TPA: 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate) (εζη. 1.12), πμο απμηεθμφκ ακηίζημζπα ααζζηά ζοζηαηζηά ζηα ζδιαημδμηζηά ιμκμπάηζα ημο 23

42 ηοηθζημφ AMP (camp) ηαζ ηδξ δζαηοθμ-βθοηενυθδξ (diacyl glycerol: DAG). Οζ αθθδθμοπίεξ αοηέξ ανίζημκηαζ ηαηά πνμηίιδζδ ζοβηεκηνςιέκεξ ζηζξ μιυθμβεξ πενζμπέξ ηαζ επζπθέμκ έπεζ δεζπεεί κα αθθδθεπζδνμφκ ιε ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ ημο λεκζζηή ηαζ κα εκενβμπμζμφκ ηδ ιεηαβναθή (Rohrmann, 2013). Δηθόλα 1.12 Απεζηυκζζδ ηδξ εέζδξ ηςκ μιυθμβςκ πενζμπχκ (hrs: hr1-5) ζημ βμκζδίςια ημο ζμφ AcMNPV. Ο ανζειυξ ζε ηφηθμ δδθχκεζ ημκ ανζειυ ηςκ επακαθαιαακυιεκςκ ιμκάδςκ ημο αηεθμφξ παθίκδνμιμο ακά μιυθμβδ πενζμπή. Ζ αθθδθμοπία ημο αηεθμφξ παθίκδνμιμο ακαθφεηαζ ηάης απυ ημ πάνηδ ημο AcMNPV, υπμο ηαζ ζδιεζχκμκηαζ (οπμβνάιιζζδ) ηα «απμηθίκμκηα» κμοηθεμηίδζα ηαζ ηεκηνζηά δ εέζδ ακαβκχνζζδξ ημο εκγφιμο πενζμνζζιμφ EcoRI (GAATTC). Δπζπθέμκ ακαδεζηκφμκηαζ μζ εέζεζξ CRE ηαζ TRE, πμο εκημπίγμκηαζ ιεηαλφ ηςκ παθίκδνμιςκ. (Rohrmann, 2013) 24

43 Απμηέθεζια ηδξ δνάζδξ ζοκμθζηά ηςκ ζζηχκ ιεηαβναθζηχκ εκενβμπμζδηχκ ηαζ εκζζποηχκ είκαζ δ εκμνπήζηνςζδ ηδξ παναβςβήξ ζζηχκ πνςηεσκχκ απαναίηδηςκ βζα ηδκ ζζηή ακηζβναθή ηαζ πανάθθδθα βζα ημκ επυιεκμ ηφηθμ ζζηήξ ιεηαβναθήξ, πμο εα ααζίγεηαζ πθέμκ ζηδκ ζζηή RNA πμθοιενάζδ. Μεηαλφ άθθςκ, πνχζια βμκίδζα ακαζηέθμοκ ηδκ απυπηςζδ ηςκ ιμθοζιέκςκ ηοηηάνςκ (ππ ιέζς ηδξ ακηζαπμπηςηζηήξ πνςηεΐκδξ P35) ηαζ επζπθέμκ ιπμνεί κα οπμαμδεμφκ ηδκ ηαπφηενδ ελάπθςζδ ηδξ ιυθοκζδξ (Rohrmann, 2013) Όςηκνη παξάγνληεο έθθξαζεο (Late Expression Factors, LEFs) Οζ υρζιμζ πανάβμκηεξ έηθναζδξ απμηεθμφκ ημ εθάπζζημ ζφκμθμ ζζηχκ βμκζδίςκ πμο έπεζ απμδεζπεεί απαναίηδημ βζα ηδκ πανμδζηή (transient) έηθναζδ απυ οπμηζκδηέξ ηδξ υρζιδξ θάζδξ ζε in vitro ζοζηήιαηα ιεηαβναθήξ. Πνυηεζηαζ βζα ηα πνμσυκηα 19 πνχζιςκ βμκζδίςκ ηαζ ζοβηεηνζιέκα ηςκ: ie1, ie2, lef 1-12, 39K, p35, p47, DNApol ηαζ p143. ηα παναπάκς in vitro ζοζηήιαηα, μζ ζζηέξ πνςηεΐκεξ πανέπμκηαζ ιέζς πθαζιζδζαηχκ θμνέςκ έηθναζδξ ηαζ δ επίδναζή ημοξ εθέβπεηαζ ιε έκακ επζπθέμκ θμνέα πμο θένεζ αθθδθμοπία ακαθμνάξ. Ζ ηεθεοηαία απμηεθείηαζ απυ ημκ πνυηοπμ υρζιμ οπμηζκδηή ημο βμκζδίμο vp39 κα εθέβπεζ ηδκ παναβςβή ιίαξ ακηίζημζπδξ πνςηεΐκδξ-ακαθμνάξ (Rapp et al., 1998). Ο πίκαηαξ 1.1 πανμοζζάγεζ ζοκμπηζηά ηα δζαεέζζια ζημζπεία ζπεηζηά ιε ημοξ υρζιμοξ πανάβμκηεξ έηθναζδξ, ηαεχξ ηαζ ηδκ επίδναζδ ηδξ απμοζίαξ ημοξ ζημκ ηφηθμ γςήξ ημο ζμφ. ημκ ίδζμ πίκαηα πενζθαιαάκμκηαζ ηαζ επζπθέμκ ζζηέξ πνςηεΐκεξ, πμο έπεζ δεζπεεί υηζ ειπθέημκηαζ ζηδκ ακηζβναθή ηαζ υρζιδ ιεηαβναθή. Ζ ελάθεζρδ (knock-out/ko) ηςκ πενζζζυηενςκ βμκζδίςκ είκαζ εακαηδθυνμξ (lethal) βζα ημκ ζυ ηαζ εηθνάγεηαζ ιε ηδκ αδοκαιία απμιυκςζδξ ημο ιεηαθθαβιέκμο ζηεθέπμοξ. Παν υθα αοηά ζε μνζζιέκεξ πενζπηχζεζξ οπάνπμοκ πενζζζυηενμ ήπζα ή απθχξ δζαθμνεηζηά απμηεθέζιαηα ιεηαλφ ζχκ απυ ημοξ μπμίμοξ απμοζζάγεζ δ ακηίζημζπδ θεζημονβία ηαζ ηςκ ζοζηδιάηςκ πανμδζηήξ έηθναζδξ, πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ημκ in vitro ανπζηυ πνμζδζμνζζιυ ηςκ παναβυκηςκ υρζιδξ έηθναζδξ, βεβμκυξ πμο ακηακαηθά ημοξ πενζμνζζιμφξ ηςκ in vitro ζοζηδιάηςκ. Σα βμκίδζα lef 1-3, ie1, DNApol ηαζ p143 είκαζ επζπθέμκ απαναίηδηα βζα ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ημο ζζημφ DNA ηαζ ζοκζζημφκ ηδκ οπμμιάδα ηςκ ακαπαναβςβζηχκ υρζιςκ παναβυκηςκ έηθναζδξ (replication/replicative lefs) (Rapp et al., 1998; Rohrmann, 2013). Όπςξ έπεζ ακαθενεεί, δ ακαπαναβςβή ημο ζζημφ βεκεηζημφ οθζημφ 25

44 Καηεγνξία Πξσηεΐλε ΜΒ Λεηηνπξγηθόηεηα Φαηλόηππνο Κ.Ο. Μεηαβναθζημί εκενβμπμζδηέξ IE1 71 Μεηαβναθζηυξ εκενβμπμζδηήξ Αδοκαιία απμιυκςζδξ (πνχζιμζ) IE2 47 Μεηαβναθζηυξ ζοκεκενβμπμζδηήξ Μείςζδ ιμθοζιαηζηυηδηαξ ζε πνμκφιθεξ Ακαζημθείξ απυπηςζδξ P35 35 Ακαζημθέαξ ηαζπάζδξ διακηζηά πενζμνζζιέκδ παναβςβή BV ζε ηφηηανα Sf21* LEF1 31 DNA πνζιάζδ Αδοκαιία απμιυκςζδξ Βαζζημί πανάβμκηεξ ζζηήξ ακηζβναθήξ LEF2 LEF3 P οιπανάβμκηαξ πνζιάζδξ Γέζιεοζδ ιμκυηθςκμο DNA Δθζηάζδ Μδ παναβςβή ιμθοζιαηζηχκ ζχκ Αδοκαιία απμιυκςζδξ Αδοκαιία απμιυκςζδξ DNAPOL 114 DNA πμθοιενάζδ Αδοκαιία απμιυκςζδξ Βμδεδηζημί πανάβμκηεξ ζζηήξ ακηζβναθήξ LEF7 PE-38 LEF Φένεζ ιμηίαα SSB Ρφειζζδ ακηζβναθήξ/ιεηαβναθήξ - Μεζςιέκδ ακηζβναθή Δλανηχιεκεξ απυ ημκ λεκζζηή Απμοζία ακηζβναθήξ/υρ. ιεηαβναθήξ LEF4 54 Πνμζεήηδ ηαθφπηναξ Αδοκαιία απμιυκςζδξ* Τπμιμκάδεξ ζζηήξ RNA LEF8 102 Καηαθοηζηυ ηέκηνμ Αδοκαιία απμιυκςζδξ πμθοιενάζδξ LEF9 55 Καηαθοηζηυ ηέκηνμ Αδοκαιία απμιυκςζδξ P Αδοκαιία απμιυκςζδξ Βαζζημί πανάβμκηεξ υρζιδξ ιεηαβναθήξ LEF5 LEF10 PP31/39K Έκανλδ ηδξ ιεηαβναθήξ - Γέζιεοζδ DNA Αδοκαιία απμιυκςζδξ Αδοκαιία απμιυκςζδξ Μείςζδ υρ. ιεηαβναθήξ/παναβςβήξ BV Βμδεδηζημί πανάβμκηεξ υρζιδξ ιεηαβναθήξ LEF6 LEF12 Mtase I Δκενβυηδηα ιεεοθηνακζθενάζδξ Καεοζηένδζδ υρ. ιεηαβναθήξ Μεζςιέκδ παναβςβή BV* - Πανάβμκηεξ πμθφ υρζιδξ IE0 72 Μεηαβναθζηυξ εκενβμπμζδηήξ Αδοκαιία απμιυκςζδξ ιεηαβναθήξ VLF-1 4 Ηκηεβηνάζδ Γζαηαναπή ηδξ παναβςβήξ ηαρζδίςκ Πίλαθαο 1.1 οκμπηζηή πανμοζίαζδ ζημζπείςκ θεζημονβίαξ ηςκ υρζιςκ παναβυκηςκ έηθναζδξ ηαζ επζπθέμκ ζζηχκ πνςηεσκχκ (italics) πμο ειπθέημκηαζ ζηδκ ζζηή ακηζβναθή ηαζ υρζιδ ιεηαβναθή. Ακαθένμκηαζ ημ Μμνζαηυ Βάνμξ (ΜΒ/ζε kda) ηςκ πνςηεσκχκ, δ θεζημονβία ηαζ μ θαζκυηοπμξ επί ελάθεζρδξ ημο ακηίζημζπμο βμκζδίμο (KO). Ζ πνςηεΐκδ IE1 ζοκζζηά επζπθέμκ ηαζ ζδιακηζηυ πανάβμκηα ζζηήξ ακηζβναθήξ, αθθά βζα ηδκ απθμπμίδζδ ημο πίκαηα ηαηδβμνζμπμζήεδηε ιε αάζδ ηδ ααζζηή ηδξ ζδζυηδηα ςξ ιεηαβναθζημφ εκενβμπμζδηή. Πίλαθαο πξνζαξκνζκέλνο από (Passarelli & Guarino, 2007). * ππνδειώλεη δεδνκέλα από ηνλ ηό AcMNPV ή άιινλ. Η απνπζία «*» δειώλεη παξαηήξεζε κόλν ή θαη ζηνλ BmNPV. 26

45 απμηεθεί ημ βεβμκυξ πμο παναηηδνίγεζ ηδ ιεηάααζδ απυ ηδκ πνχζιδ ζηδκ υρζιδ θάζδ έηθναζδξ. Ζ παναπάκς ζοζπέηζζδ ακηακαηθάηαζ ηαζ ζε ιμνζαηυ επίπεδμ ιε ηα δφμ θαζκυιεκα κα αθθδθμδζαπθέημκηαζ, ιέζς ηδξ ελάνηδζήξ ημοξ απυ ηδκ ίδζα μιάδα ζζηχκ βμκζδίςκ. Αλίγεζ κα ζδιεζςεεί υηζ εκχ δ υρζιδ ζζηή ιεηαβναθή πνμαπαζηεί ηδκ ζζηή ακηζβναθή, δ ίδζα δ ακηζβναθή είκαζ ακελάνηδηδ ηδξ υρζιδξ ιεηαβναθήξ ηαζ πνεζάγεηαζ ιυκμ πνχζια βμκζδζαηά πνμσυκηα βζα κα πναβιαημπμζδεεί Aληηγξαθή ηηθνύ DNA Ζ ακηζβναθή ζημοξ ααηηνμσμφξ θαίκεηαζ κα πναβιαημπμζείηαζ ιέζς ιίαξ δζαδζηαζίαξ ηοθζχιεκμο ηφηθμο (rolling circle) ή/ηαζ ακηζβναθήξ ελανηχιεκδξ απυ ακαζοκδοαζιυ (recombination dependent) (Rohrmann, 2013), πςνίξ υιςξ κα είκαζ ζαθήξ μ αηνζαήξ ιδπακζζιυξ. Οζ μιυθμβεξ πενζμπέξ (hrs), πμο ακαθένεδηακ πνμδβμοιέκςξ ςξ αθθδθμοπίεξ εκίζποζδξ ηδξ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ, έπμοκ ανεεεί επζπθέμκ κα απμηεθμφκ εέζεζξ έκανλδξ ηδξ ακηζβναθήξ, βεβμκυξ πμο είπε επζπνυζεεηα ζοκδοαζηεί ηαζ ιε ηδκ πνςηεΐκδ IE-1 ςξ πζεακυ ζοζηαηζηυ έκανλδξ. Παν υθα αοηά δζαπζζηχεδηε υηζ ςξ εέζεζξ έκανλδξ ιπμνμφκ κα θεζημονβήζμοκ ηαζ ιδ hr πενζμπέξ ημο βμκζδζχιαημξ ηαζ πζεακμθμβείηαζ επζπθέμκ υηζ δ ζζηή ακηζβναθή ιπμνεί κα λεηζκά ζε μπμζαδήπμηε εέζδ οπάνπεζ λεδίπθςια (unfolding) ηδξ δίηθςκδξ αθοζίδαξ DNA ημο ζμφ. Οζ ααηηνμσμί ηςδζημπμζμφκ έκα ζφκμθμ παναβυκηςκ ακηζβναθήξ ημο βεκεηζημφ ημοξ οθζημφ ακηίζημζπμ πνμξ αοηυ πμο δζαεέημοκ μζ ενπδημσμί, ιία άθθδ ιεβάθδ μιάδα DNA ζχκ (εζη. 1.13/Α). Ο ζυξ πανάβεζ δζηή ημο DNA πμθοιενάζδ, πνζιάζδ (primase), πνςηεΐκεξ ζηαεενμπμίδζδξ ιμκυηθςκςκ αθοζίδςκ (SSB: single strand binding proteins), εθζηάζδ ηαζ πνςηεΐκδ πνυζδεζδξ ζηζξ εέζεζξ έκανλδξ ηδξ ακηζβναθήξ πνυηεζηαζ βζα ηδκ IE1, ακαθμνζηά ιε ηδκ έκανλδ απυ ηζξ μιυθμβεξ πενζμπέξ (εζη. 1.13/Β). Δπζπθέμκ, ζημ βμκζδίςια ηςκ ααηηνμσχκ οπάνπμοκ δζάθμνεξ πνςηεΐκεξ, πμο ειθακίγμοκ ζοκμθζηά δναζηζηυηδηα ακαζοκδοαζιμφ ηαζ πςνίξ ηζξ μπμίεξ πανααθάπηεηαζ ζδιακηζηά μ ζζηυξ ηφηθμξ. Απυ ημκ ημιαζηυ νυθμ ηςκ παναπάκς πνςηεσκχκ ζοκάβεηαζ ηαζ δ πζεακή ζοιιεημπή δζενβαζζχκ ακαζοκδοαζιμφ ζηδκ ζζηή ακηζβναθή. Υαναηηδνζζηζηυ πανάδεζβια απμηεθεί μ ζοκδοαζιυξ ηδξ αθηαθζηήξ κμοηθεάζδξ (AN: Alkaline Nuclease) ιε ηδκ πνςηεΐκδ LEF3, πμο θεζημονβμφκ ακηίζημζπα πνμξ ημ ζφζηδια ακαζοκδοαζιμφ Red (Recombination deficient) ημο θάβμο θ (Ohara, 2005; Rohrmann, 2013). Δπζπθέμκ δ ιυθοκζδ απυ ααηηνμσμφξ ζοκμδεφεηαζ ζηαεενά απυ ορδθή ζοπκυηδηα 27

46 ακαζοκδοαζιμφ ζηα ηφηηανα λεκζζηέξ (Crouch & Passarelli, 2002; Farrell, 1998; Hajos et al., 2000; Kamita et al., 2003; Martin & Weber, 1997). A Γνλίδην Βαθηξντνί Δξπεηντνί DNA πμθοιενάζδ + + (UL30) SSB + (LEF3) + (ICP8) πνζιάζδ + (LEF1) + (UL52) ζοιπανάβμκηαξ πνζιάζδξ + (LEF2) + (UL8) εθζηάζδ + (p143) + (UL5) πνυζδεζδ έκανλδξ ακηζβναθήξ + IE1 (?) + (UL9) πνςηεΐκδ ζθζβηηήναξ - UL42 B Δηθόλα 1.13 Α. Σα ζδιακηζηά βζα ηδκ ζζηή ακηζβναθή βμκίδζα ζημοξ ααηηνμ- ηαζ ενπδημ- ζμφξ. Ακαθένεηαζ δ θεζημονβία πμο ελοπδνεημφκ ηαζ δ ακηίζημζπδ πνςηεΐκδ ακά είδμξ ζμφ. Με ελαίνεζδ ηδκ πνςηεΐκδ ζθζβηηήνα (processivity factor/dna clamp), μζ ίδζεξ θεζημονβίεξ ηςδζημπμζμφκηαζ ηαζ απυ ηζξ δφμ μζημβέκεζεξ ζχκ. Β. Πζεακή ημπμεέηδζδ ηςκ ζζηχκ πνςηεσκχκ ακηζβναθήξ ζε εέζεζξ ημο ζζημφ DNA. Ακαθένμκηαζ επζπθέμκ μζ θεζημονβίεξ πμο δεκ ηςδζημπμζμφκηαζ απυ ημκ ζυ (θζβάζδξ/ημπμ-ζζμιενάζδξ) ηαζ πζεακχξ ηαθφπημκηαζ απυ πανάβμκηεξ ημο λεκζζηή. (Rohrmann, 2013) Οζ ααηηνμσμί παν υθα αοηά δε δζαεέημοκ πνςηεΐκεξ ιε θεζημονβία ημπμσζμιενάζδξ (topo-isomerase) ηαζ θζβάζδξ (ligase) (εζη. 1.13/Β). ηδ δεφηενδ πενίπηςζδ οπάνπμοκ ηάπμζα είδδ πμο ηςδζημπμζμφκ πνςηεΐκεξ ιε θεζημονβζηυηδηα θζβάζδξ, αθθά μ νυθμξ ημοξ ζηδκ ακηζβναθή ηαζ ημκ ζζηυ ηφηθμ είκαζ αζαθήξ. Δίκαζ 28

47 πζεακυ θεζημονβίεξ πμο δεκ ηςδζημπμζμφκηαζ απυ ημκ ζυ κα πανέπμκηαζ απυ ακηίζημζπα ηοηηανζηά έκγοια. Σα ζζηά βμκζδζχιαηα πμο πνμηφπημοκ ιε ηδκ ακηζβναθή ειθακίγμκηαζ δζαζοκδεδειέκα ςξ πμθοιενή ιεβαθμιυνζα (concatemers) ηαζ ιε ιήημξ πμθθαπθάζζμ ηδξ ιμκάδαξ ζζημφ βμκζδζχιαημξ. Δπίζδξ εεςνδηζηά ίζςξ κα οπάνπεζ δζαθμνμπμίδζδ ημο παναβυιεκμο βεκεηζημφ οθζημφ ακάθμβα ακ είκαζ πνμμνζζιέκμ βζα εκζςιάηςζδ ζε ηαρίδζα ή απθχξ βζα ιεηαβναθή. ηδκ πνχηδ πενίπηςζδ δ παναβςβή ημο ζζημφ DNA εα ζοκδέεηαζ ζηεκά ηαζ ιε ορδθή αηνίαεζα ιε ηδκ παναβςβή ηςκ κμοηθεμηαρζδίςκ, χζηε ημ βεκεηζηυ οθζηυ κα πνμζηαηεφεηαζ ιε ηδκ έβηθεζζή ημο ςξ κμοηθεμπνςηεΐκδ απυ εκδεπυιεκα ακαζοκδοαζιμφ ηαζ ιεηάθθαλδξ, εκχ ζηδ δεφηενδ εα είκαζ δζαεέζζιμ ζε πμθθαπθά ακηίβναθα ςξ πνυηοπμ βζα ηδκ έκημκδ ιεηαβναθή βμκζδίςκ ηδξ υρζιδξ ηαζ ζδίςξ ηδξ πμθφ υρζιδξ θάζδξ. Υαναηηδνζζηζηά έπεζ ανεεεί υηζ ζε πνμπςνδιέκμ ζηάδζμ ηδξ ιυθοκζδξ πάκς απυ ημ ιζζυ βεκεηζηυ οθζηυ είκαζ εοαίζεδημ ζηδ DNαζδ (DNase) βεβμκυξ εκδεζηηζηυ υηζ δεκ είκαζ ζοζηεοαζιέκμ ζε ηαρίδζα ηαζ ςξ εη ημφημο παναιέκεζ δζαεέζζιμ βζα ιεηαβναθή (Rohrmann, 2013) Όςηκε θαη πνιύ όςηκε κεηαγξαθή Ζ υρζιδ ιεηαβναθή λεηζκά ιε ηδκ έκανλδ ηδξ ζζηήξ ακηζβναθήξ ηαζ δζανηεί πενίπμο απυ ηζξ 6 έςξ ηζξ 24 h ιεηά ηδ ιυθοκζδ. Ακηίζημζπα δ πμθφ υρζιδ θάζδ δζανηεί πενίπμο απυ ηζξ 18 έςξ ηζξ 72 h. Σα παναπάκς πνμκζηά δζαζηήιαηα ακηαπμηνίκμκηαζ ηαηά πνμζέββζζδ ζηζξ θάζεζξ παναβςβήξ ηςκ αθαζηζηχκ ηαζ έβηθεζζηςκ ζχκ ακηίζημζπα (Passarelli & Guarino, 2007). Σα υρζια βμκίδζα πενζέπμοκ ηδκ αθθδθμοπία οπμηζκδηή A/G/T-TAAG ημ πνχημ κμοηθεμηίδζμ ακαβνάθεηαζ ηαηά ζεζνά ζοπκυηδηαξ ειθάκζζδξ δ μπμία ακαβκςνίγεηαζ απυ ηδκ ζζηή RNA πμθοιενάζδ ηαζ ζοκζζηά ηαοηυπνμκα ηαζ ηδ εέζδ έκανλδξ ηδξ ιεηαβναθήξ (transcription start site). Ζ ιεηαβναθή ανπίγεζ ζοβηεηνζιέκα απυ ηδκ πνχηδ αδεκίκδ ηδξ ηεκηνζηήξ αθθδθμοπίαξ TAAG. Έπεζ δζαπζζηςεεί υηζ ηα 18 κμοηθεμηίδζα εηαηένςεεκ ηδξ παναπάκς εέζδξ έκανλδξ, πμο ηαηακέιμκηαζ ςξ 8 κμοηθεμηίδζα ακμδζηά ηαζ 6 κμοηθεμηίδζα ηαεμδζηά ηδξ αθθδθμοπίαξ TAAG, είκαζ ζδιακηζηά ηαζ επανηή βζα κα ηαηεοεφκμοκ ηδκ υρζιδ ιεηαβναθή (Morris & Miller, 1994). ηα υρζια βμκίδζα πενζθαιαάκμκηαζ βμκίδζα ζδιακηζηά βζα ηδκ ηαηαζηεοή ημο κμοηθεμηαρζδίμο ηαζ ηςκ ζμζςιάηςκ, πμο παίγμοκ νυθμ ζηδ ιεηάδμζδ ημο ζμφ ιεηαλφ ηοηηάνςκ ηαζ απυ μνβακζζιυ ζε μνβακζζιυ. 29

48 Σα πμθφ υρζια βμκίδζα πνδζζιμπμζμφκ ηδκ ίδζα αθθδθμοπία οπμηζκδηή ιε ηδ ιμνθή A-TAAG ςξ επζηναηέζηενδ (Passarelli & Guarino, 2007) αθθά επζπθέμκ δζαεέημοκ ιία ζδιακηζηή αθθδθμοπία εκίζποζδξ ακάιεζα ζημκ οπμηζκδηή ηαζ ημ ηςδζηυκζμ έκανλδξ ηδξ ιεηάθναζδξ ATG, πμο πανέπεζ ζδζαίηενα αολδιέκα επίπεδα έηθναζδξ. Ζ αθθδθμοπία οπενεκίζποζδξ (burst sequence), υπςξ παναηηδνίγεηαζ, αθθδθεπζδνά ιε ηδκ υρζιδ πνςηεΐκδ VLF-1 (Very Late Factor-1) πνμηεζιέκμο κα οπάνλεζ αφλδζδ ημο νοειμφ ιεηαβναθήξ (Passarelli & Guarino, 2007). Υαναηηδνζζηζηά ζηζξ 24 h ιεηά ηδ ιυθοκζδ, ηα ιεηάβναθα ηςκ πμθφ υρζιςκ πνςηεσκχκ πμθοεδνίκδ ηαζ p10 είκαζ πθέμκ ηα πενζζζυηενμ πμθοπθδεή ζημ ζοκμθζηυ πθδεοζιυ mrna ημο ιμθοζιέκμο ηοηηάνμο ηαζ ιέπνζ ηζξ 48 h είκαζ 4 θμνέξ πενζζζυηενα ζε ζπέζδ ιε ηδκ αιέζςξ επυιεκδ μιάδα mrna, πμο είκαζ επίζδξ ζζηά (Rohrmann, 2013). ηζξ 48 h ζοκζζημφκ ακηίζημζπα ημ 25 ηαζ 7,5% ακηίζημζπα ηςκ ζοκμθζηχκ mrna. Σα υρζια ζζηά mrna ειθακίγμοκ ηδκ ηοπζηή δμιή ημο χνζιμο εοηανοςηζημφ mrna ιε 5 ηάθοιια (cap) ηαζ 3 πμθο-αδεκοθζηή μονά (tail). Παν υθα αοηά, δ επελενβαζία ημοξ θαίκεηαζ κα πναβιαημπμζείηαζ ελμθμηθήνμο απυ ηδκ ζζηή RNA πμθοιενάζδ, υπςξ ζπμθζάγεηαζ ζηδκ επυιεκδ πανάβναθμ (1.5.5). Σμ ιεηάβναθμ ημο πμθφ υρζιμο βμκζδίμο p10 ιπμνεί επζπθέμκ κα ιεηαβναθεί απμηεθεζιαηζηά πςνίξ κα δζαεέηεζ ηάθοιια, υπςξ δζαπζζηχεδηε ζε in vitro πεζνάιαηα (Scheper et al., 1997). Ζ ιεηάθναζδ ζε αοηή ηδκ πενίπηςζδ θαίκεηαζ κα ζηδνίγεηαζ ζηδκ εοιεβέεδ 5 αιεηάθναζηδ πενζμπή ημο, δ μπμία απμηεθείηαζ ηαηά ~86% απυ A+U. Μία ηέημζα αθθδθμοπία δεκ ιπμνεί κα δχζεζ ηζξ ακχηενεξ παναηηδνζζηζηέξ δμιέξ ηςκ αθθδθμοπζχκ IRES (Internal Ribosome Entry Sites), πμο είκαζ βκςζηυ υηζ αθθδθεπζδνμφκ ιε ηα νζαμζχιαηα ηαζ επάβμοκ ιδ-ελανηχιεκδ απυ ηάθοιια ιεηάθναζδ ιμνίςκ mrna (Passarelli & Guarino, 2007), αθθά ιπμνεί ακελάνηδηα κα επάβεζ επανηή ιεηάθναζδ. Ζ υρζιδ ηαζ πμθφ υρζιδ ιεηαβναθή ελανηχκηαζ απυ ηδκ ζζηή ακηζβναθή ηαζ ηαη επέηηαζδ ημοξ πανάβμκηεξ πμο ηδ νοειίγμοκ. Διπθμηή ηδξ ακηζβναθήξ ιε ακαζημθή ηδξ απυ αθζδζπμθίκδ (aphidicolin) πανειπμδίγεζ ζοκμθζηά ηδκ υρζιδ ιεηαβναθή. Ζ παναπάκς ζφκδεζδ δεκ είκαζ υιςξ αιθίδνμιδ δεδμιέκμο υηζ ζε ιεηαθθαβιέκα ζηεθέπδ ηςκ ααηηνμσχκ ιπμνεί κα οπάνλεζ ακηζβναθή αβνίμο ηφπμο πςνίξ κα αημθμοεείηαζ απυ υρζιδ ιεηαβναθή. Δπζπθέμκ θαίκεηαζ κα οπάνπεζ ζοζπέηζζδ ακάιεζα ζηδ θεζημονβία ηδξ ζζηήξ RNA πμθοιενάζδξ ηαζ ηδκ πανμοζία ζκζδίςκ αηηίκδξ, εθυζμκ πνμζεήηδ ζε ιμθοζιέκα ηφηηανα ηοημπαθαζίκδξ D 30

49 (cytochalasin D), πμο δζαθφεζ ηα ζκίδζα αηηίκδξ, ειπμδίγεζ επζπθέμκ ηαζ ηδκ υρζιδ ιεηαβναθή ημο ζμφ (Passarelli & Guarino, 2007). διεζχκεηαζ υηζ δ έκανλδ ηδξ υρζιδξ ιεηαβναθήξ ζοκδέεηαζ ιε ηδκ παφζδ ηδξ ηοηηανζηήξ ιεηαβναθήξ ηαζ ηδ ζηαδζαηή απμιείςζδ ηςκ mrna ημο λεκζζηή. Παναηδνείηαζ δζαθμνεηζηυξ νοειυξ ελάκηθδζδξ ηςκ παναπάκς mrna πμο πζεακχξ ζπεηίγεηαζ ιε ηδκ ακηίζημζπα δζαθμνεηζηή ζηαεενυηδηά ημοξ (Passarelli & Guarino, 2007). Ζ παφζδ ηδξ ηοηηανζηήξ ιεηαβναθήξ παναιέκεζ αηυιδ έκα ακελζπκίαζημ θαζκυιεκα ζημ μπμίμ υιςξ θαίκεηαζ κα ειπθέημκηαζ μζ ακαπαναβςβζημί υρζιμζ πανάβμκηεξ έηθναζδξ ηαζ δ ζζηή ακηζβναθή ηδκ μπμία νοειίγμοκ (Schultz & Friesen, 2009). Ζ επίδναζδ ιε αθζδζπμθίκδ ζηα ηφηηανα, πμο ακαθένεδηε παναπάκς ςξ πανάβμκηαξ ακαζηαθηζηυξ ηδξ υρζιδξ ιεηαβναθήξ, επίζδξ ειπμδίγεζ ηδκ παφζδ ηδξ ηοηηανζηήξ ιεηαβναθήξ (Passarelli & Guarino, 2007), αθθά οπάνπμοκ ηαζ επζπθέμκ ζημζπεία ζηδ αζαθζμβναθία (βι. παξαθάηω) πμο δδιζμονβμφκ ιία πενζζζυηενμ ζφκεεηδ εζηυκα ακαθμνζηά ιε ηδκ αθθδθεπίδναζδ ααηηνμσχκ ηαζ πνςηεσκμζφκεεζδξ ημο λεκζζηή Ιηθή RNA πνιπκεξάζε πξσηεΐλε LEF8 Σα υρζια ηαζ πμθφ υρζια βμκίδζα εηθνάγμκηαζ απυ ιία RNA πμθοιενάζδ ακεεηηζηή ζηδκ α-αιακζηίκδ. Όπςξ απμδείπεδηε, ημ εκ θυβς έκγοιμ απμηεθείηαζ απυ 4 ζζηέξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ αζαθμφξ θοθμβεκεηζηήξ πνμέθεοζδξ (Rohrmann, 2013) ζοβηεηνζιέκα ημοξ πανάβμκηεξ υρζιδξ έηθναζδξ 4, 8, 9 ηαζ p47 (Acharya & Gopinathan, 2002; Guarino et al., 1998; Okano et al., 2006) ηαζ ζοκζζηά ηδκ ζζηή RNA πμθοιενάζδ, υπμο ηάεε επζιένμοξ οπμιμκάδα θαίκεηαζ κα ζοιιεηέπεζ ιε δφμ ιυνζα, ακά ιυνζμ μθμεκγφιμο (Guarino et al., 1998). Όπςξ ηαζ δ RNA πμθοιενάζδ ημο λεκζζηή, ακήηεζ ζηδκ ηαηδβμνία ηςκ DNA ελανηχιεκςκ RNA πμθοιεναζχκ, αθθά δζαθμνμπμζείηαζ απυ υθεξ ηζξ θμζπέξ ηδξ ηαηδβμνίεξ ζζηέξ, ααηηδνζαηέξ, εοηανοςηζηέξ ζημ υηζ απμηεθείηαζ απυ ιυθζξ 4 οπμιμκάδεξ (Rohrmann, 2013). Ζ ζζηή RNA πμθοιενάζδ ζηενείηαζ επζπθέμκ ηςκ δμιζηχκ ζημζπείςκ πμο εα επέηνεπακ ηδκ αθθδθεπίδναζή ηδξ ιε ημκ ηοηηανζηυ ιδπακζζιυ πμθο-αδεκοθίςζδξ, ιζαξ ηαζ δε δζαεέηεζ ηδκ ελεζδζηεοιέκδ ηαναμλο-ηεθζηή πενζμπή ηδξ ηοηηανζηήξ RNA πμθοιενάζδξ ΗΗ (CTD: Carboxy-terminal Domain) (Passarelli & Guarino, 2007). Παν υθα αοηά υιςξ ειθακίγεζ ζηακυηδηα ιεηαβναθήξ, θήλδξ ηδξ ιεηαβναθήξ, πνμζεήηδξ ηαθφιιαημξ ηαζ πμθοαδεκοθίςζδξ ηςκ υρζιςκ mrna πμο ιεηαβνάθεζ (Passarelli & Guarino, 2007). 31

50 Ζ πνςηεΐκδ LEF4 ειθακίγεζ δνάζδ βμοακοθζηήξ ηνακζθενάζδξ (guanylyltransferase) ηαζ RNA ηνζθςζθαηάζδξ (RNA triphosphatase) ηαζ είκαζ έκγοιμ ιε δναζηζηυηδηα ζπδιαηζζιμφ ημο 5 ηαθφιιαημξ ημο mrna. Ζ πανμοζία ηδξ ςξ οπμιμκάδα ηδξ ζζηήξ RNA πμθοιενάζδξ ζοκζζηά ηαζκμημιία δεδμιέκμο υηζ είκαζ ίζςξ δ ιυκδ πενίπηςζδ RNA πμθοιενάζδξ πμο εκζςιαηχκεζ ημ ιδπακζζιυ δζαιυνθςζδξ ηαθφιιαημξ (Li & Guarino, 2008). Δπζπθέμκ ηδξ LEF4 ηαζ ιία άθθδ πνςηεΐκδ, δ PTP/BVP (protein tyrosine phosphatase/baculovirus Phosphatase), ειθακίγεζ δνάζδ RNA ηνζθςζθαηάζδξ ιε ελεζδίηεοζδ ζημ 5 άηνμ ιμκυηθςκςκ ιμνίςκ RNA ηαζ επίζδξ εεςνμφκηακ υηζ πζεακχξ ειπθέηεηαζ ζημκ ίδζμ ιδπακζζιυ. Παν υθα αοηά απμδείπεδηε υηζ ιυκμ δ δναζηζηυηδηα βμοακοθζηήξ ηνακζθενάζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF4 είκαζ ζδιακηζηή βζα ηδ θεζημονβία ημο ζμφ. Ακηίεεηα δ απμοζία ηδξ θεζημονβζηυηδηαξ RNA ηνζθςζθαηάζδξ ηαοηυπνμκα απυ ηζξ δφμ παναπάκς πνςηεΐκεξ δεκ έπεζ επίδναζδ ζημ ζπδιαηζζιυ ημο ηαθφιιαημξ ηςκ υρζιςκ ζζηχκ mrna (Li & Guarino, 2008) ηαζ βεκζηά έπεζ αιεθδηέεξ ζοκέπεζεξ ζημκ ηφηθμ γςήξ ημο ζμφ ζε επίπεδμ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ. Τπεκεοιίγεηαζ υηζ δ πνςηεΐκδ PTP εοεφκεηαζ βζα ηζξ ζοιπενζθμνζηέξ αθθαβέξ πμο εηδδθχκμκηαζ ιε αολδιέκδ ηζκδηζηυηδηα ηςκ ιμθοζιέκςκ πνμκοιθχκ ηαηά ηα ηεθζηά ζηάδζα ηδξ ιυθοκζδξ, υπςξ ζπμθζάζηδηε ζημ ηεθάθαζμ 1.3. Δίκαζ εκδζαθένμκ υηζ ηαζ ζε εηείκδ ηδκ πενίπηςζδ επίζδξ δε θαίκεηαζ κα ειπθέηεηαζ δ παναπάκς εκγοιζηή δναζηζηυηδηα ηδξ πνςηεΐκδξ (Katsuma et al., 2012). Ζ πνςηεΐκδ p47 είκαζ ζδιακηζηή δεδμιέκμο υηζ δ απμοζία ηδξ πανειπμδίγεζ ηδκ υρζιδ ιεηαβναθή, αθθά δεκ ηδξ έπεζ απμδμεεί ηάπμζα ζοβηεηνζιέκδ θεζημονβζηυηδηα. Φένεηαζ κα ειθακίγεζ ιία μνζαηή μιμζυηδηα ιε ηιήιαηα ηςκ α- οπμιμκάδςκ ηδξ ααηηδνζαηήξ RNA πμθοιενάζδξ (Rohrmann, 2013). Ζ πνςηεΐκδ LEF8 ειθακίγεζ πενζμνζζιέκδ μιμθμβία ιε ηδ δεφηενδ ιεβαθφηενδ οπμιμκάδα ααηηδνζαηχκ ηαζ εοηανοςηζηχκ RNA πμθοιεναζχκ (α ) ζηδ ζοκηδνδιέκδ ηαναμλο-ηεθζηή πενζμπή GXKX 4 HG Q / N KG V / I (Titterington et al., 2003) (εζη.1.14/ηάης). Μεθέηεξ ιεηαθθαλζβέκεζδξ ηδξ παναπάκς αθθδθμοπίαξ έπμοκ δείλεζ υηζ δ αθθμίςζή ηδξ ηαηανβεί πναηηζηά ηδκ υρζιδ ιεηαβναθή. Μειμκςιέκεξ δμηζιέξ αθαίνεζδξ κμοηθεμηζδίςκ απυ δζάθμνεξ εέζεζξ ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ επίζδξ μδήβδζακ ζε πανειπυδζζδ ηδξ υρζιδξ ιεηαβναθήξ, βεβμκυξ πμο έδεζλε υηζ οπάνπμοκ πζεακχξ πμθθαπθέξ θεζημονβζηέξ ή/ηαζ ζδιακηζηέξ βζα ηδ δμιζηή αηεναζυηδηα πενζμπέξ ζηδκ πνςηεΐκδ LEF8 πνμηεζιέκμο κα θεζημονβεί επανηχξ (Passarelli & Guarino, 2007; Titterington et al., 2003). Με αάζδ ηδκ παναπάκς 32

51 μιμθμβία, δ πνςηεΐκδ LEF8 εεςνείηαζ υηζ ζοιιεηέπεζ/δζαιμνθχκεζ ημ εκενβυ ηέκηνμ ημο ζοιπθυημο, ιαγί ιε ηδκ πνςηεΐκδ LEF9. Ζ ηεθεοηαία δζαεέηεζ ηδκ πενζμπή NTDCDGD, πμο είκαζ πανυιμζα ιε ηδκ πενζμπή δέζιεοζδξ ιαβκδζίμο (Mg ++ ) NADFDGD ημο ηαηαθοηζημφ ηέκηνμο ηδξ ιεβαθφηενδξ οπμιμκάδα (α) ηςκ RNA πμθοιεναζχκ (Acharya & Gopinathan, 2002; Okano et al., 2006; Rohrmann, 2013) (εζη. 1.14/άκς). Σα 3 ζοκηδνδιέκα ηαηάθμζπα αζπανηζημφ μλέςξ (D) είκαζ ζδιακηζηά βζα ηδ δέζιεοζδ ημο Mg ++ πμο ζοκζζηά απαναίηδημ ζοζηαηζηυ βζα ηδ θεζημονβία ηδξ RNA πμθοιενάζδξ. Παν υθα αοηά, άθθεξ ζδιακηζηέξ πενζμπέξ πμο ειθακίγμκηαζ μιυθμβεξ ζε ακηίζημζπεξ πνςηεσκζηέξ οπμιμκάδεξ απυ δζάθμνμοξ μνβακζζιμφξ δεκ έπμοκ ακηζζημζπία ζηδκ πνςηεΐκδ LEF9, δ μπμία επζπθέμκ είκαζ ηαζ ζοβηνζηζηά ανηεηά ιζηνυηενμο ιεβέεμοξ (Rohrmann, 2013). Σα υρζια βμκίδζα δεκ είκαζ απαναίηδηα βζα ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ημο ζζημφ DNA, εθυζμκ εκενβμπμζμφκηαζ ιαγί ή/ηαζ ιεηά απυ αοηυκ ηαζ επζπθέμκ, δ έηθναζή ημοξ ελανηάηαζ απυ ηδκ DNA πμθοιενάζδ ημο ζμφ. Δίκαζ θμζπυκ εφθμβμ κα Αιιεινπρία δέζκεπζεο Mg ++ Καηαιπηηθή αιιεινπρία Δηθόλα 1.14 Απεζηυκζζδ ηςκ πενζμπχκ μιμζυηδηαξ ζηδκ αθθδθμοπία ηςκ πνςηεσκχκ LEF9 (άκς) ηαζ LEF8 (ηάης) ημο ζμφ AcMNPV ιε ακηίζημζπεξ αθθδθμοπίεξ ηςκ ηαηαθοηζηχκ πενζμπχκ ηδξ ιεβαθφηενδξ (Dm RPB1) ηαζ ιζηνυηενδξ (Dm RPB2) οπμιμκάδαξ ηδξ RNA πμθοιενάζδξ ΗΗ ηδξ Drosophila melanogaster. Οζ ανζειμί ζημ ηέθμξ εηθνάγμοκ ημ ιέβεεμξ ηςκ ακηίζημζπςκ πνςηεσκχκ. Οζ ανζειμί πμο πνμδβμφκηαζ ηςκ μιυθμβςκ αθθδθμοπζχκ δδθχκμοκ ηδ εέζδ έκανλδξ ηςκ αθθδθμοπζχκ. Τπμβναιιίγμκηαζ ηα αιζκμλζηά ηαηάθμζπα πμο δεκ ζοκηδνμφκηαζ. (Rohrmann, 2013) 33

52 οπμεέζμοιε υηζ πςνίξ ηδκ ζζηή RNA πμθοιενάζδ μ ηφηθμξ ιυθοκζδξ δεκ ιπμνεί κα πνμπςνήζεζ πένακ ηδξ ζζηήξ ακηζβναθήξ. Μεθέηδ εενιμεοαίζεδηςκ ιεηαθθάλεςκ ημο ζμφ BmNPV, πμο πνμηαθμφζακ ακαζημθή ημο ζπδιαηζζιμφ έβηθεζζηςκ δμιχκ, μδήβδζακ ζημκ πνμζδζμνζζιυ ιίαξ ιεηαθθαβιέκδξ ιμνθήξ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8, οπεφεοκδξ βζα ημ θαζκυηοπμ αοηυ. Ζ αθθαβή ζηδκ πνςημηαβή δμιή πνμζδζμνίζηδηε ςξ ακηζηαηάζηαζδ ηδξ αθακίκδξ 542 απυ ααθίκδ, ζηδ αάζδ ακηίζημζπδξ ζδιεζαηήξ ιεηάθθαλδξ ηοημζίκδξ ζε εοιίκδ (Shikata et al., 1998). Φαζκμηοπζηά, μζ ιμθοζιέκεξ πνμκφιθεξ δεκ εηδήθςκακ κυζμ ηαζ ζοκέπζγακ κα επζαζχκμοκ θοζζμθμβζηά, ζηδ ιδ παναβςβζηή βζα ζπδιαηζζιυ εβηθείζηςκ εενιμηναζία (non-permissive temperature: 33.5 o C), εκχ μζ πνμκφιθεξ εθέβπμο είπακ ήδδ εακαηςεεί απυ ημ ίδζμ ζηέθεπμξ ημο ζμφ, ζε παναβςβζηή εενιμηναζία (permissive temperature: 25 o C). Με πεναζηένς ιεθέηεξ ζε ηοηηανμηαθθζένβεζεξ δζαπζζηχεδηε υηζ ζημοξ 33.5 o C δεκ πανάβμκηακ αθαζηζηά ζμζχιαηα ηαζ επζπθέμκ υηζ μ ζζηυξ ηφηθμξ πνμπςνμφζε ηακμκζηά ιυκμ ιέπνζ ηδκ ακηζβναθή ημο ζζημφ βεκεηζημφ οθζημφ, δ μπμία πάναοηα πανείπε ακηίζημζπα επίπεδα DNA ιε ημκ ζυ αβνίμο ηφπμο (Farrell, 1998; Shikata et al., 1998). Μυκμ ζε 3 ζηζξ 10 πνμκφιθεξ ημ βεκεηζηυ οθζηυ ήηακ πανυκ, υπςξ δζαπζζηχεδηε ιε απμιυκςζδ DNA ημο ζμφ απυ ημοξ λεκζζηέξ. Οζ εεηζηέξ βζα ημ ζζηυ DNA πνμκφιθεξ οπέηορακ υηακ ιεηαθένεδηακ ζε πενζαάθθμκ 25 o C. Φαίκεηαζ θμζπυκ υηζ δ θεζημονβζηή απμοζία ηδξ οπμιμκάδαξ LEF8 επζηνέπεζ ηδκ ακαπαναβςβή ημο ζζημφ DNA ηαζ ημοθάπζζημκ έκακ ααειυ παναιμκήξ ημο ζηα ηφηηανα, πςνίξ υιςξ κα ηα ηαηαζηνέθεζ ή κα δζαηανάζζεζ ειθακχξ ηδ θεζημονβία ημοξ ζε επίπεδμ μνβακζζιμφ. Αλίγεζ επίζδξ κα ζδιεζςεεί υηζ αοηή είκαζ ίζςξ δ ιυκδ πενίπηςζδ απεκενβμπμίδζδξ βμκζδίμο ηςκ ζχκ BmNPV ηαζ AcMNPV ζηδ αζαθζμβναθία, πμο επζηνέπεζ ηδκ ακαπαναβςβή ημο ζζημφ βεκεηζημφ οθζημφ, πςνίξ κα πανααθάπηεηαζ δ πνςηεσκμζοκεεηζηή ζηακυηδηα ηςκ ηοηηάνςκ-λεκζζηχκ (Partington et al., 1990; Shikata et al., 1998). 1.6 Οι βακηποφοί υρ θοπείρ έκθπαζηρ αναζςνδςαζμένυν ππυηεφνών Ζ πνχηδ εθανιμβή ηςκ ααηηνμσχκ ςξ θμνέςκ έηθναζδξ, BEVs (Baculovirus Expression Vectors), πναβιαημπμζήεδηε ημ 1983 (Smith et al., 1983), υπμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ παναβςβή ακαζοκδοαζιέκδξ α-ζκηενθενυκδξ. Ζ κέα ηεπκμθμβία ααζίζηδηε ζηδ δζαπίζηςζδ υηζ ημ βμκίδζμ ηδξ πμθοεδνίκδξ δεκ είκαζ 34

53 απαναίηδημ βζα ηδκ παναβςβή θεζημονβζηχκ αθαζηζηχκ ζχκ ηαζ υηζ ςξ εη ημφημο μ ζζπονυξ πμθφ υρζιμξ οπμηζκδηήξ ημο εα ιπμνμφζε κα αλζμπμζδεεί βζα ηδ εειεθίςζδ εκυξ ζοζηήιαημξ έηθναζδξ ιεβάθδξ παναβςβζηήξ ζηακυηδηαξ. Πεναζηένς ιεθέηεξ ζπεηζηά ιε ημκ οπμηζκδηή ηδξ πμθοεδνίκδξ ακέλεζλακ ηζξ αθθδθμοπίεξ πμο είκαζ απαναίηδηεξ βζα ηδ ιεβζζημπμίδζδ ηδξ παναβςβήξ πνςηεσκχκ ηαζ επέηνερακ ημ ζπεδζαζιυ εηδυζεςκ ιε αεθηζςιέκα παναηηδνζζηζηά (Johnson et al., 1993; Manohar et al., 2010; Passarelli & Guarino, 2007). Οζ ακηίζημζπμζ εθθεζιιαηζημί ζμί απμδείπεδηακ πθήνςξ ιμθοζιαηζημί ηυζμ ζε ηοηηανμηαθθζένβεζεξ, υζμ ηαζ ακ εβποεμφκ απεοεείαξ ζημ αζιυημζθμ (hemocoel) ηςκ εκηυιςκ-λεκζζηχκ (Summers, 2006) ηαζ μ ιυκμξ πενζμνζζιυξ ημοξ ήηακ δ αδοκαιία ιυθοκζδξ ιέζς ημο βαζηνεκηενζημφ ζοζηήιαημξ, πμο υιςξ δεκ απαζηείηαζ ζηδ ζοβηεηνζιέκδ εθανιμβή. Καηά ημκ ίδζμ ηνυπμ ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί ηαζ μ οπμηζκδηήξ ημο βμκζδίμο p10, πμο είκαζ επίζδξ πμθφ υρζιμ, ζζπονά εηθναγυιεκμ ηαζ πανάβεζ ιία πνςηεΐκδ πμο δεκ απαζηείηαζ βζα ηδκ παναβςβή θεζημονβζηχκ αθαζηζηχκ ζχκ, ιζαξ ηαζ ζπεηίγεηαζ απμηθεζζηζηά ιε ηζξ έβηθεζζηεξ δμιέξ (Summers, 2006). Με πνήζδ ηαζ ηςκ δφμ παναπάκς οπμηζκδηχκ πνμηφπηεζ ηεθζηά ζζπονή έηθναζδ ζηα ηεθζηά ζηάδζα ημο ζζημφ ηφηθμο ακάπηολδξ. Οζ πνμκζηά δζαηνζηέξ θάζεζξ ηδξ ιεηαβναθήξ ζημοξ ααηηνμσμφξ πνμζθένμκηαζ επζπθέμκ ηαζ βζα έηθναζδ πνςηεσκχκ ζε δζαθμνεηζηέξ θάζεζξ ημο ηφηθμο ιυθοκζδξ, πνδζζιμπμζχκηαξ οπμηζκδηέξ δζαθμνεηζηχκ ζηαδίςκ (Summers, 2006). Δπίζδξ ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ ηαζ εηενυθμβμζ οπμηζκδηέξ, θεζημονβζημί ζηα ηφηηαναζηυπμοξ, βζα αηυιδ πζμ θεπημιενή νφειζζδ in vivo (Iatrou & Meidinger, 1990; Johnson R et al., 1992; Summers, 2006). ηα πθαίζζα ηδξ ηεθεοηαίαξ πναηηζηήξ, είκαζ εκδζαθένμοζα δ εθανιμβή ημο οπμηζκδηή ηδξ ηοηηανμπθαζιαηζηήξ αηηίκδξ, Α3, ημο B. mori, πμο πνδζζιμπμζήεδηε επζηοπχξ βζα ηδκ παναβςβή πνςηεσκχκ, υπςξ δ αηεηοθμηνακζθενάζδ ηδξ πθςναιθεκζηυθδξ, CAT (Johnson R et al., 1992), ηαζ δ πνάζζκδ θεμνίγμοζα πνςηεΐκδ, GFP (Iatrou & Swevers, 2005b) ιέζς BEVs. Σμ παναπάκς ζφζηδια επζηνέπεζ ηαπφηενδ πνμκζηά παναβςβή πνμσυκημξ ζε ζπέζδ ιε ημκ οπμηζκδηή ηδξ πμθοεδνίκδξ, αθθά οπμθείπεηαζ ζε ηεθζηή πμζυηδηα (Johnson R et al., 1992). Ζ ηαζέηα έηθναζδξ ηδξ αηηίκδξ, δ μπμία θεζημονβεί ακελάνηδηα απυ ημ βεκεηζηυ ηυπμ ηδξ πμθοεδνίκδξ, ιπμνεί επίζδξ κα εζζαπεεί ηαζ ζε μοδέηενεξ πενζμπέξ ημο BmNPV βμκζδζχιαημξ, ιε απμηέθεζια μζ ακηίζημζπμζ ακαζοκδοαζιέκμζ ζμί κα πανάβμοκ ηαζ έβηθεζζηεξ ιμνθέξ αβνίμο ηφπμο (Iatrou & Swevers, 2005b), ακ αοηυ είκαζ επζεοιδηυ. 35

54 Δίκαζ δεδμιέκμ υηζ δ απυδμζδ ηςκ δζενβαζζχκ ιεηα-ιεηαθναζηζηχκ ηνμπμπμζήζεςκ ηαζ έηηνζζδξ ιεζχκεηαζ ιε ηδκ ελέθζλδ ηδξ ιυθοκζδξ, ηυζμ θυβς ηδξ πνμμδεοηζηήξ αθάαδξ ηαζ πανειπυδζζδξ ηοηηανζηχκ αζμπδιζηχκ ιμκμπαηζχκ απυ ημκ ζυ, υζμ ηαζ θυβς ημνεζιμφ ηςκ παναπάκς ιδπακζζιχκ απυ ηδκ πθδεχνα ζζηχκ ιεηαβναθζηχκ πνμσυκηςκ (Rohrmann, 2013). Ωξ εη ημφημο δ πνήζδ βεκζηά οπμηζκδηχκ πμο θεζημονβμφκ κςνίηενα ηαζ ζδίςξ ζε ανπζηά ζηάδζα ηδξ ιυθοκζδξ πανέπεζ ημ επζπθέμκ πθεμκέηηδια υηζ μζ παναπάκς ιδπακζζιμί είκαζ πενζζζυηενμ επανηείξ ζε ζπέζδ ιε ηδκ πμθφ υρζιδ θάζδ ηαζ ημοξ ζζπονμφξ οπμηζκδηέξ ηδξ. Κάεε ζυξ-ζφζηδια έηθναζδξ ιπμνεί κα πανάβεζ πενζζζυηενεξ απυ ιία ακαζοκδοαζιέκεξ πνςηεΐκεξ απυ δζαθμνεηζηέξ αθθδθμοπίεξ έηθναζδξ, πμο έπμοκ ημπμεεηδεεί ζημ βμκζδίςιά ημο. Σμ νααδυιμνθμ κμοηθεμηαρίδζμ ηςκ ααηηνμσχκ ηαζ ημ ιεβάθμ ιέβεεμξ βμκζδζχιαημξ, ημοξ πανέπεζ ηδ δοκαηυηδηα κα εκζςιαηχκμοκ ιεβάθα εκεέιαηα βεκεηζημφ οθζημφ πςνίξ κα πανααθάπηεηαζ δ θεζημονβία ημοξ, ζδζυηδηα πμο δεκ οπάνπεζ ζε ζμφξ δζαθμνεηζημφ ζπήιαημξ, υπςξ μζ ζμί ιε ηαρίδζα 20 α εδνζηήξ ζοιιεηνίαξ (van Oers et al., 2015). Έηζζ πένα απυ ιειμκςιέκα ιεβάθα πμθοπεπηίδζα, ιπμνμφκ κα πανάβμοκ ηαοηυπνμκα δζαθμνεηζηέξ οπμιμκάδεξ ημο ίδζμο ή δζαθμνεηζηχκ ιμνζαηχκ ζοιπθυηςκ ή επζπθέμκ ηαζ αμδεδηζηέξ πνςηεΐκεξ βζα ηδκ ηαθφηενδ επελενβαζία ηςκ επζεοιδηχκ πνςηεσκχκ-πνμσυκηςκ (van Oers et al., 2015). Καθθζένβεζεξ ηοηηάνςκ εκηυιςκ, ηαεχξ ηαζ ηα ίδζα ηα έκημια ζε ηαηάθθδθεξ θάζεζξ ακάπηολδξ, ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ ςξ λεκζζηέξ ηςκ ζχκ. Ζ πνήζδ ηαθθζενβεζχκ είκαζ δ πθέμκ δζαδεδμιέκδ ηαζ δ ιυκδ πμο εθανιυγεηαζ ζε επίπεδμ ειπμνζηήξ παναβςβήξ πνςηεσκχκ. Σα ηφηηανα ηςκ εκηυιςκ ειθακίγμοκ έκα ζδιακηζηυ θάζια πθεμκεηηδιάηςκ βζα πνήζδ ζε ζοζηήιαηα έηθναζδξ, ιζαξ ηαζ είκαζ εφημθμ κα ηαθθζενβδεμφκ, ζε ιέζα βκςζηήξ ζφζηαζδξ πςνίξ ηδκ πανμοζία μνμφ, ιπμνμφκ κα ακαπηοπεμφκ ζε εονφ θάζια εενιμηναζζχκ ηαζ επζπθέμκ δζαεέημοκ ακαπηοβιέκα ζοζηήιαηα ιεηα-ιεηαθναζηζηχκ ηνμπμπμζήζεςκ ηαζ δδ βθοημγοθίςζδξ, πμο ιπμνμφκ κα πανάβμοκ πνςηεΐκεξ ίδζεξ ή πανυιμζεξ ιε ακηίζημζπεξ ηςκ εδθαζηζηχκ (Harrison & Jarvis, 2016; van Oers et al., 2015). Πανά ηζξ ζδιακηζηέξ μιμζυηδηεξ, οπάνπμοκ ιεηα-ιεηαθναζηζηέξ ηνμπμπμζήζεζξ πμο δεκ ιπμνμφκ κα πναβιαημπμζδεμφκ απυ ηα ηφηηανα εκηυιςκ. Υαναηηδνζζηζηά, μζ Ν- βθοηάκεξ πμο ζοκηίεεκηαζ ζε ηφηηανα εκηυιςκ είκαζ πενζζζυηενμ μιμζυιμνθεξ ηαζ ηαηαθήβμοκ ζε ηαηάθμζπα ιακυγδξ, εκχ μζ ακηίζημζπεξ δμιέξ ηςκ εδθαζηζηχκ ειθακίγμοκ ζοπκά ιεβαθφηενδ πμζηζθυηδηα δζαηθάδςζδξ ηαζ ζοκήεςξ ηαηαθήβμοκ ζε ηαηάθμζπα ζζαθζημφ μλέςξ (εζη. 1.15) (van Oers et al., 2015). Γζα ηδ δδιζμονβία 36

55 ηαηά ημ δοκαηυκ πζμ πζζηχκ ακηζβνάθςκ ηςκ ιμνίςκ ζηυπςκ, βίκεηαζ πνμζπάεεζα κα ηαηαζηεοαζημφκ οανζδζηά αζμπδιζηά ζοζηήιαηα ηνμπμπμίδζδξ ζηα ηοηηάνςκ εκηυιςκ, ιε ηδκ έηθναζδ εηενυθμβςκ παναβυκηςκ πμο θοζζμθμβζηά δεκ οπάνπμοκ ζηα έκημια ηαζ πανέπμοκ ηζξ ιεηα-ιεηαθναζηζηέξ θεζημονβίεξ πμο απμοζζάγμοκ απυ αοηά. Υαναηηδνζζηζηυ πανάδεζβια απμηεθεί δ έηθναζδ ηδξ ακενχπζκδξ πνςηεΐκδξ α- 1,4-βαθαηηυζοθμ-ηνακζθενάζδξ, B4GALT1 (beta-1,4-galactosyltransferase 1), πμο πανάβεζ ακενχπζκμο ηφπμο N-βθοηάκεξ ιε ηεθζηά ηαηάθμζπα βαθαηηυγδξ (Jarvis & Finn, 1996). Δπζπθέμκ, μ πεναζηένς ζοκδοαζιυξ ηδξ B4GALT1 ιε ηδκ επίζδξ ακενχπζκδ α-1,2-ν-αηεηοθμ-βθοημγαιζκμ-ηνακζθενάζδ 2, MGAT2 (mannosyl(alpha Γιπθάλεο εληόκσλ Γιπθάλεο ζειαζηηθώλ Γιπθάλε δειεηεξίνπ κέιηζζαο ύκβνια Δηθόλα 1.15 οβηνζηζηή απεζηυκζζδ παναηηδνζζηζηχκ πνμηφπςκ βθοημγοθίςζδξ ζε έκημια ηαζ εδθαζηζηά. Σα ηφνζα πνμσυκηα βθοημγοθίςζδξ ζηα έκημια απεζημκίγμκηαζ ζηα (a, b), εκχ δ πζμ πμθφπθμηδ ιμνθή πμο έπεζ δζαπζζηςεεί ακαθένεηαζ ζημ δδθδηήνζμ ηδξ ιέθζζζαξ (c). Σα ζπήιαηα (d-g) απμηεθμφκ ακηίζημζπα παναδείβιαηα απυ ηα εδθαζηζηά. Οζ N-βθοηάκεξ ηςκ εκηυιςκ ηαηαθήβμοκ ζοκήεςξ ζε ηαηάθμζπα ιακυγδξ, εκχ ηςκ εδθαζηζηχκ ζε ηαηάθμζπα ζζαθζημφ μλέςξ. Τξνπνπνίεζε από (van Oers et al., 2015). 37

56 -1,6-)-glycoprotein beta-1,2-n-acetylglucosaminyl-transferase), πανάβεζ πενζζζυηενμ πμθφπθμηεξ βθοηάκεξ (Tomiya et al., 2003), εκχ μ ζοκδοαζιυξ ιε ηδκ ακενχπζκδ α- 2,6-ζζαθμηνακζθενάζδ 1, ST6GAL1 (ST6 beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 1), πανέπεζ Ν-βθοηάκεξ πμο ηαηαθήβμοκ ζε ηαηάθμζπα ζζαθζημφ μλέςξ (Seo et al., 2001), πμο υπςξ ακαθένεδηε είκαζ ημ ζφκδεεξ πνμσυκ ηδξ βθοημγοθίςζδξ ζηα εδθαζηζηά (εζη. 1.15). Ο ζηυπμξ είκαζ δ επαβςβή ημοθάπζζημκ ηάπμζμο ααειμφ ακαζφζηαζδξ ηδξ αζμπδιζηήξ ιδπακήξ ηςκ εζδχκ, υπμο δ εηάζημηε πνςηεΐκδ-πνμσυκ θοζζμθμβζηά πανάβεηαζ. Ζ ηςδζημπμίδζδ ηςκ επζπθέμκ πνςηεσκχκ ιπμνεί κα βίκεζ απυ ηα δζαβμκζδζαηά ηφηηανα λεκζζηέξ ή απυ ημκ/ημοξ ααηηνμσμφξ ημο ζοζηήιαημξ έηθναζδξ (Harrison & Jarvis, 2016; van Oers et al., 2015), υπςξ ακαθένεδηε παναπάκς. Ζ παναβςβή ηςκ πνςηεσκχκ ιπμνεί κα βίκεζ ζε μπμζαδήπμηε ηθίιαηα ηαζ επίζδξ ζηα πθαίζζα ενεοκδηζηήξ ή ειπμνζηήξ εθανιμβήξ. Γζα ιζηνή ηαζ ιέζδ ηθίιαηα παναβςβήξ πνδζζιμπμζμφκηαζ ηαθθζένβεζεξ πνμζηυθδζδξ (attachment cultures) ζε δμπεία ηοηηανμηαθθζένβεζαξ, εκχ βζα ιεβαθφηενδ, ηαθθζένβεζεξ εκαζςνήιαημξ (suspension cultures) ζε αζμ-ακηζδναζηήνεξ. ε ηάεε πενίπηςζδ, μ ηοηηανζηυξ ηφπμξ είκαζ ακάθμβμξ ηδξ εθανιμβήξ ηαζ δ ακάπηολδ πναβιαημπμζείηαζ ζε ενεπηζηά ιέζα βκςζηήξ ζφζηαζδξ (defined media), ηοπζηά πςνίξ ζοιπθδνχιαηα μνμφ (απυ έιανοα ιυζπμο ή άθθμ είδμξ, βι. θαη ζηηο κεζόδνπο) (van Oers et al., 2015). Σα ααηηνμσζηά ζοζηήιαηα έηθναζδξ ιπμνμφκ κα πανάβμοκ ηοηηανμπθαζιαηζηέξ, δζαιειανακζηέξ ηαζ εηηνζκυιεκεξ πνςηεΐκεξ, ιε ηζξ δφμ ηεθεοηαίεξ ηαηδβμνίεξ κα πανάβμκηαζ ζε ιζηνυηενεξ πμζυηδηεξ ζε ζπέζδ ιε ηδκ πνχηδ. Μία ηνμπμπμίδζδ πμο έπεζ δμηζιαζηεί επζηοπχξ βζα ηδ αεθηίςζδ ζοκμθζηά ηδξ παναβςβήξ βθοημπνςηεσκχκ είκαζ δ αθαίνεζδ ηςκ πνςηεμθοηζηχκ ζζηχκ εκγφιςκ, πμο θεζημονβμφκ ηαηά ηδκ πμθφ υρζιδ θάζδ ηαζ έπεζ δεζπεεί υηζ πενζμνίγμοκ ηδκ πμζυηδηα πνμσυκημξ. Ζ απμιάηνοκζδ ηδξ ζζηήξ ηαεερίκδξ ηαζ πζηζκάζδξ ηαζ μζ δφμ αενμίγμκηαζ ζημ εκδμπθαζιαηζηυ δίηηομ ηαζ επζπθέμκ δ δεφηενδ εκενβμπμζεί ηδκ ακεκενβή, πνυδνμιδ ιμνθή ηδξ πνχηδξ έπεζ δεζπεεί κα αεθηζχκεζ ζδιακηζηά ηδκ παναβςβή ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ (van Oers et al., 2015). Έπμοκ δμηζιαζηεί επζπθέμκ ιε ηαθά απμηεθέζιαηα ηαζ ζοζηήιαηα δζανηχξ ηνμθμδμημφιεκςκ ακηζδναζηήνςκ (fed-batch systems), υπμο οπάνπεζ πενζμδζηή πνμζεήηδ κέςκ ηοηηάνςκ ή ακακέςζδ ηςκ ενεπηζηχκ οθζηχκ (Meghrous et al., 2009; Zhang et al., 1993). ε ηάεε πενίπηςζδ υιςξ, ηα ζοζηήιαηα έηθναζδξ πάκμοκ ζδιακηζηά ζε απυδμζδ, υηακ εθανιυγμκηαζ ζεζνζαηέξ ιμθφκζεζξ (passages) ιε ημκ 38

57 ίδζμ πθδεοζιυ ζχκ ή επίζδξ ιμθφκζεζξ ιε ορδθέξ ακαθμβίεξ ζμζςιάηςκ πνμξ ηφηηανα, θυβς ηδξ εββεκμφξ αζηάεεζαξ ηςκ ααηηνμσχκ (van Oers et al., 2015). Δίκαζ βκςζηυ υηζ μ πθδεοζιυξ ηςκ ζχκ ζηαδζαηά ακαπηφζζεζ ηαζ ζοζζςνεφεζ ιδ θεζημονβζηέξ ιμνθέξ ζχκ πμο ακηαβςκίγμκηαζ ηδξ θεζημονβζηέξ ηαζ επζηναημφκ ή απθχξ υηζ μζ ακαζοκδοαζιέκμζ ζμί πάκμοκ ηζξ αθθδθμοπίεξ έηθναζδξ (van Oers et al., 2015). Έπμοκ δμηζιαζηεί δζάθμνεξ ηνμπμπμζήζεζξ βζα ηδ αεθηίςζδ ηδξ ζηαεενυηδηαξ ηςκ ζχκ, υπςξ δ απμιάηνοκζδ ιίαξ εέζδξ έκανλδξ ακηζβναθήξ ζε ιδ μιυθμβδ πενζμπή, πμο έπεζ δεζπεεί κα πνμηαθεί αζηάεεζα (non-hr origin or replication) (Pijlman et al., 2002), ή δ πνμζεήηδ ιίαξ επζπθέμκ μιυθμβδξ πενζμπήξ ζημ βμκζδίςια ημο ζμφ (Pijlman et al., 2004). Καζ ζηζξ δφμ πενζπηχζεζξ αεθηζχεδηε δ ζηαεενυηδηα ημο ζζημφ βμκζδζχιαημξ ηαζ ιεζχεδηε/ηαεοζηένδζε δ παναβςβή εθαηηςιαηζηχκ ιμνθχκ. Παν υθα αοηά ημ πνυαθδια ηδξ αζηάεεζαξ παναιέκεζ ηαζ πζεακμθμβείηαζ υηζ ίζςξ κα ειπθέημκηαζ ζε αοηυ ηαζ μζ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ ιζαξ ηαζ ζαθχξ δζαθένμοκ απυ ηζξ θοζζηέξ εέζεζξ ιυθοκζδξ ηςκ ζχκ (van Oers et al., 2015). Οζ εθανιμβέξ ηςκ ααηηνμσζηχκ ζοζηδιάηςκ έηθναζδξ λεπενκμφκ ηαηά πμθφ ηδκ απθή παναβςβή ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ. Ο ααζζηυξ πονήκαξ μπςζδήπμηε παναιέκεζ δ έηθναζδ ιίαξ ή πενζζζυηενςκ πνςηεσκζηχκ πνμσυκηςκ, αθθά ηα ζοζηήιαηα πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα έκα εονφ θάζια εθανιμβχκ, πμο πενζθαιαάκμοκ ζοκεεηζηέξ, ενεοκδηζηέξ ηαζ εεναπεοηζηέξ πνήζεζξ: Παξαγσγή ππνκνλάδσλ παζνγόλσλ νξγαληζκέλσλ ή ηηθώλ αλάινγσλ/κεπαζνγόλσλ ζσκαηίσλ (VLP: Virus like Particles), πνπ απνηεινύλ ηα αλνζνελεξγνπνηεηηθά ζπζηαηηθά εκβνιίσλ. Ήδδ οπάνπμοκ ειπμνζηά δζαεέζζια ειαυθζα βζα ηηδκζαηνζηή ηαζ ακενχπζκδ πνήζδ ιε παναηηδνζζηζηά παναδείβιαηα ηδξ δεφηενδξ ηα FluBlok ηδξ Protein Science Corporation, βζα ηδκ ακμζμπμίδζδ έκακηζ ηδξ επμπζηήξ βνίππδξ ηαζ ημ Cervarix ηδξ GlaxoSmithCline, βζα ηδκ ακμζμπμίδζδ έκακηζ ηςκ ζηεθεπχκ 16 ηαζ 18 ημο ζμφ ημο ακενχπζκμο εδθχιαημξ (HPV: Human Papiloma Virus) (Felberbaum, 2015). Σμ FluBlok είκαζ έκα ηνζζεεκέξ (trivalent, δδθαδή εκάκηζα ζε ηνία παεμβυκα ζηεθέπδ) ειαυθζμ οπμιμκάδςκ ηαζ πενζέπεζ 135 ιg ακαζοκδοαζιέκδξ αζιαβθμοηζκίκδξ (HA: Haemagglutinin) πνυηεζηαζ βζα ηδκ ηφνζα βθοημπνςηεΐκδ επζθακείαξ ημο ζμφ απυ δφμ ζηεθέπδ βνίππδξ ηφπμο Α ηαζ έκα ζηέθεπμξ ηφπμο Β (45 ιg απυ ηάεε πνςηεΐκδ), πμο επζθέβμκηαζ ζηδ αάζδ δεδμιέκςκ επζηήνδζδξ απυ ημκ Παβηυζιζμ Ονβακζζιυ Τβείαξ (Cox & Karl Anderson, 2007; Felberbaum, 2015). Οζ πνςηεΐκεξ πανάβμκηαζ ηαζ ηαεανίγμκηαζ ελμθμηθήνμο ζε ααηηνμσζηυ ζφζηδια 39

58 έηθναζδξ ηαζ ειθακίγμοκ ζδιακηζηά πθεμκεηηήιαηα ζε ζπέζδ ιε παθαζυηενεξ ηεπκζηέξ πμο πνδζζιμπμζμφζακ βμκζιμπμζδιέκα αοβά υνκζεαξ (embryonated chicken eggs) βζα ηδκ ακάπηολδ ηςκ ζχκ. Με ημ ααηηνμσζηυ ζφζηδια ελαζθαθίγεηαζ δ ορδθμφ ααειμφ ηαεανυηδηα ηςκ πνμσυκηςκ, πμο ζοκεπάβεηαζ απμοζία πζεακχκ αθθενβζμβυκςκ, παεμβυκςκ ηαζ δοκδηζηά ημλζηχκ παναβυκηςκ. Σμ ειαυθζμ πενζέπεζ ιυκμ ημ ορδθήξ ηαεανυηδηαξ πνςηεσκζηυ παναζηεφαζια ζε ζηείνμ οδαηζηυ νοειζζηζηυ δζάθοια, πςνίξ ζοκηδνδηζηά (preservatives) ή πανάβμκηεξ ακμζμεκίζποζδξ (adjuvants) (Cox & Karl Anderson, 2007). Ο πνυκμξ παναβςβήξ ζε ζπέζδ ιε ηδκ ηθαζζηή ιέεμδμ είκαζ ζδιακηζηά ιεζςιέκμξ ηαζ ηαεζζηά εθζηηή ηδκ ηαπφηενδ ακηαπυηνζζδ ζε πενζπηχζεζξ, υπμο απαζηείηαζ ηαπεία παναβςβή. Δπζπθέμκ οπάνπεζ αηνίαεζα ζηδκ παναβςβή ημο ακηζβυκμο, ιζαξ ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ δ ακαθθμίςηδ κμοηθεμηζδζηή αθθδθμοπία βζα ηδκ παναβςβή ηδξ ηάεε πνςηεΐκδξ ηαζ ηέθμξ ηαθφηενδ ακμζμπμίδζδ, ιζαξ ηαζ εθανιυγεηαζ ηνεζξ θμνέξ ιεβαθφηενδ πμζυηδηα ακηζβυκμο ζε ζπέζδ ιε ηα ζοιααηζηά ειαυθζα απεκενβμπμζδιέκμο ζμφ (TIV: Trivalent Inactivated Influenza Vaccines). Σμ Cervarix είκαζ δζζεεκέξ ειαυθζμ ηφπμο VLP ηαζ πενζέπεζ ηδκ ηαρζδζηή πνςηεΐκδ L1 ηςκ ζηεθεπχκ HPV 16 ηαζ 18, πμο ειπθέημκηαζ ζηδκ ακάπηολδ ηανηίκμο ημο ηναπήθμο ηδξ ιήηναξ ζε πενζπηχζεζξ πνυκζαξ ιυθοκζδξ. Ζ πνςηεΐκδ L1 αοημ-μνβακχκεηαζ ηαζ πανάβεζ δμιέξ ακηίζημζπεξ ημο ηαρζδίμο ηςκ ζμζςιάηςκ HPV ιε παναηηδνζζηζηή 20 α -εδνζηή ζοιιεηνία (Bryan et al., 2016). Σμ ειαυθζμ έπεζ δεζπεεί ζδζαίηενα απμηεθεζιαηζηυ βζα ηδκ πνυθδρδ ηδξ ιυθοκζδξ απυ ηα παναπάκς ορδθμφ ηζκδφκμο ζηεθέπδ, αθθά υπζ ηαζ ςξ εεναπεοηζηυ ζηεφαζια βζα ήδδ εβηαηεζηδιέκεξ πνυκζεξ ιμθφκζεζξ. Πεναζηένς ιεθέηεξ δείπκμοκ πάναοηα υηζ εα ιπμνμφζε πζεακχξ κα ακαπηοπεεί ηαζ ςξ εεναπεοηζηυξ πανάβμκηαξ ιε ηνμπμπμίδζδ ηδξ ζφζηαζήξ ημο ηαζ δδ ηςκ ακμζμ-εκενβμπμζδηχκ πμο πενζέπεζ (Chen et al., 2011). Παξαγσγή πβξηδηθώλ ηηθώλ κεκβξαληθώλ-εηεξόινγσλ πξσηετλώλ κε ζθνπό ηελ έθζεζε εηεξόινγσλ πεξηνρώλ/αληηγόλσλ ζηελ θπηηαξηθή κεκβξάλε θαη ηελ πεξηνρή πεπινκεξνύο ησλ ηνζσκάησλ (antigen presentation). Γζα ημ ζημπυ αοηυ πνδζζιμπμζμφκηαζ οανίδζα ιε ηδκ πνςηεΐκδ GP64 ημο ζμφ ή εηενυθμβεξ ιειανακζηέξ πνςηεΐκεξ. Ζ έηεεζδ είκαζ πνήζζιδ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ιμνίςκ πμο αθθδθεπζδνμφκ/ζοκδέμκηαζ ιε ηζξ ιεθεημφιεκεξ πενζμπέξ ή βζα ηδκ ςνίιακζδ ζοββέκεζαξ ακηζζςιάηςκ ηαζ θμζπχκ ιμνίςκ (in vitro affinity maturation) (Grabherr & Ernst, 2010). Δπζπθέμκ ιπμνμφκ κα ηαηαζηεοαζημφκ οανζδζηά ιυνζα πμο κα ηνμπμπμζμφκ ημ θάζια λεκζζηχκ ημο ζμφ, κα αεθηζχκμοκ ηδκ απυδμζδ ηδξ ιυθοκζδξ- 40

59 ιεηαβςβήξ ηοηηάνςκ εδθαζηζηχκ ή κα πανέπμοκ κέεξ ζδζυηδηεξ, υπςξ ηδκ απμθοβή ηδξ αδνακμπμίδζδξ απυ ημ ζοιπθήνςια (βι. θαη παξαθάηω) (Airenne et al., 2013). Παξαγσγή ηηθώλ θνξέσλ γνληδηαθήο ζεξαπείαο, όπσο αλαπαξαγσγηθά ειαηησκαηηθώλ, αλαζπλδπαζκέλσλ αδελνζρεηηδόκελσλ ηώλ (raav: recombinant Adeno-Associated Viruses), πνπ θσδηθνπνηνύλ ζην ειιεηκκαηηθό γνληδίσκά ηνπο ηε ζεξαπεπηηθή πξσηεΐλε. Σμ βμκίδζμ βζα ηδκ παναβςβή ηδξ εεναπεοηζηήξ πνςηεΐκδξ δζαεέηεζ ζημζπεία νφειζζδξ ηαηάθθδθα βζα ηα ηφηηαναζηυπμ ηδξ εεναπείαξ ηαζ πενζαάθθεηαζ απυ ηζξ ακάζηνμθεξ ηεθζηέξ επακαθήρεζξ ηςκ AAV (inverted terminal repeat elements), πμο πανμοζία ηςκ ακηίζημζπςκ ζζηχκ εκγφιςκ ακαπαναβςβήξ ηαζ ηςκ πνςηεσκχκ ημο ηαρζδίμο πανάβμοκ ημοξ ηεθζημφξ θμνείξ. Οζ αθθδθμοπίεξ βζα ηδκ παναβςβή ηςκ παναπάκς ανίζημκηαζ ζε ηνεζξ δζαθμνεηζημφξ ααηηνμσμφξ ή δζαθμνεηζηέξ πενζμπέξ ημο βμκζδζχιαημξ εκυξ ζμφ. Με αοηυκ ημκ ηνυπμ μ ηεθζηυξ ακαζοκδοαζιέκμξ AAV είκαζ ακεκενβυξ ιζάξ ηαζ δζαεέηεζ ιυκμ ημ εεναπεοηζηυ βμκίδζμ ηαζ ηζξ ηεθζηέξ επακαθήρεζξ. Σμ εεναπεοηζηυ ζηεφαζια Glybera (alipogene tiparvovec) ηδξ UniQure απμηεθεί ημ πνχημ ειπμνζηά δζαεέζζιμ, πμο ηαηαζηεοάγεηαζ ιε ηδκ παναπάκς ηεπκμθμβία ηαζ απεοεφκεηαζ ζηδ εεναπεία ηδξ μζημβεκμφξ ακεπάνηεζαξ θζπμπνςηεσκζηήξ θζπάζδξ (LPLD: familial lipoprotein lipase deficiency) (Felberbaum, 2015). Φνξείο γνληδηαθήο ζεξαπείαο. Οζ εθανιμβέξ ιεηαθμνάξ εεναπεοηζημφ βεκεηζημφ οθζημφ πενζθαιαάκμοκ ηδκ in vitro, ex vivo ηαζ in vivo πνήζδ ηςκ ααηηνμσζηχκ θμνέςκ βζα έκα εονφ θάζια εθανιμβχκ υπςξ ηδκ ακηζιεηχπζζδ βεκεηζηχκ αζεεκεζχκ, ηδ βεκεηζηή ιδπακζηή ζζηχκ ηαζ μνβάκςκ ηαζ ηδ εεναπεία κεμπθαζζχκ. Οζ ααηηνμσμί δζαεέημοκ έκα ζφκμθμ παναηηδνζζηζηχκ, ζπεηζηά ιε ηδκ ζηακυηδηά ημοξ κα ιμθφκμοκ ηφηηανα ηςκ εδθαζηζηχκ, πμο ημοξ ηαεζζημφκ ζδζαίηενα εθηοζηζημφξ βζα ηζξ παναπάκς πνήζεζξ: α) απμδεδεζβιέκδ δοκαηυηδηα ιυθοκζδξ πμθθχκ ηοηηανζηχκ ηφπςκ, αζπέηςξ ακ ανίζημκηαζ ζε θάζδ δζαίνεζδξ ή υπζ, ζοιπενζθαιαακμιέκμο ηαζ δζαθυνςκ ηφπςκ αθαζηζηχκ ηοηηάνςκ (stem cells), α) αζθάθεζα πνήζδξ ζηδ αάζδ ηδξ απμοζίαξ ζζηήξ ακηζβναθήξ, πμθθαπθαζζαζιμφ, παεμβυκμο δνάζδξ ηαζ επζπθέμκ ηοηηανμημλζηχκ θαζκμιέκςκ αηυιδ ηαζ ζε ορδθέξ δυζεζξ. Δπίζδξ μζ ααηηνμσμί παναιέκμοκ ζε επζζςιαηζηή ιμνθή ηαζ ημ βεκεηζηυ ημοξ οθζηυ δεκ ειθακίγεζ ηάζεζξ έκεεζδξ ζημ οθζηυ ημο ηοηηάνμο-λεκζζηή, β) εοπένζα ηαηαζηεοήξ ηαζ ηνμπμπμίδζδξ, δ) ιεβάθδ πςνδηζηυηδηα, ιζαξ ηαζ ημ βμκζδίςια ηςκ ααηηνμσχκ έπεζ δεζπεεί πεζναιαηζηά υηζ ιπμνεί κα δεπεεί εκεέιαηα ημοθάπζζημκ ιέπνζ 50 kbp, πςνίξ ζοκαηυθμοεα πνμαθήιαηα αζςζζιυηδηαξ ημο ζμφ (Cheshenko et 41

60 al., 2001). Δπζπθέμκ δεκ έπεζ δζαπζζηςεεί ιέπνζ ζηζβιήξ ηάπμζμ ακχηαημ υνζμ ηαζ θαίκεηαζ υηζ μζ ααηηνμσμί ιπμνμφκ κα δεπεμφκ ηαζ ιεβαθφηενεξ ηςκ 50 kbp πνμζεήηεξ βεκεηζημφ οθζημφ, πζεακχξ ιε ακηίζημζπδ αφλδζδ ζημ ιέβεεμξ ημο κμοηθεμηαρζδίμο ημοξ (Cheshenko et al., 2001). Σεπκζηά ειπυδζα ζηδκ εθανιμβή ηςκ ααηηνμσχκ ςξ εεναπεοηζηχκ θμνέςκ είκαζ α) ηα δζαθμνεηζηά επίπεδα έηθναζδξ ημο/ηςκ εεναπεοηζηχκ βμκζδίςκ ακάθμβα ιε ημκ ηοηηανζηυ ηφπμ ηαζ ηζξ ζοκεήηεξ ακάπηολδξ, α) δ πζεακυηδηα κα επάβμοκ εζδζηή ακμζία εκακηίμκ ημοξ, β) δ βνήβμνδ αδνακμπμίδζή ημοξ απυ ημ ιδ εζδζηυ ιδπακζζιυ ημο ζοιπθδνχιαημξ ηαζ δ) δ παναβςβή ηςκ πνχζιςκ βμκζδίςκ ημοξ ζε ηφηηανα εδθαζηζηχκ (Efrose et al., 2010; Kenoutis et al., 2006), ιζαξ ηαζ αοηά ιεηαβνάθμκηαζ απυ ηδκ RNA πμθοιενάζδ II. Γζα ηάεεκα απυ ηα παναπάκς πνμαθδιαηζηά παναηηδνζζηζηά δμηζιάγμκηαζ ήδδ δζάθμνεξ θφζεζξ, πμο ιπμνμφκ κα αεθηζχζμοκ ημ ααζζηυ ζπεδζαζιυ ηςκ θμνέςκ (Airenne et al., 2013). Δπζβναιιαηζηά, δ πνήζδ ηαηάθθδθςκ οπμηζκδηχκ ιπμνεί κα δχζεζ αολδιέκα ηαζ ζηαεενά επίπεδα παναβςβήξ ημο εεναπεοηζημφ πνμσυκημξ ακά πνήζδ ηαζ δ ρεοδμηφπδζδ (pseudotyping) παναβςβή ζχκ ιε εηενυθμβεξ πνςηεΐκεξ επζθακείαξ αεθηζχκεζ ηυζμ ηδκ απυδμζδ ηδξ ιεηαβςβήξ υζμ ηαζ ημ εφνμξ ηςκ πζεακχκ ηοηηανζηχκ ζηυπςκ. Δπζπθέμκ, δ πεναζηένς ρεοδμηφπδζδ ηςκ ζχκ ιε πνςηεΐκεξ πμο επάβμοκ ηδκ απμζημδυιδζδ παναβυκηςκ ημο ζοιπθδνχιαημξ ή/ηαζ δ πνήζδ δζαθοηχκ οπμδμπέςκ ζοιπθδνχιαημξ αμδεά ζηδ δζάζςζδ ηςκ ααηηνμσζηχκ θμνέςκ απυ ηδκ ηαηαζηνεπηζηή επίδναζδ ημο παναπάκς ιδ εζδζημφ αιοκηζημφ ιδπακζζιμφ (van Oers et al., 2015). Σέθμξ δ ηαηαζηεοή θμνέςκ εθθεζιιαηζηχκ ςξ πνμξ ημκ ηεκηνζηυ πνχζιμ ιεηαβναθζηυ εκενβμπμζδηή IE1 πανέπεζ ζδιακηζηά ιεζςιέκα επίπεδα παναβςβήξ ζζηχκ πνςηεσκχκ, δζαιμνθχκμκηαξ ζοζηήιαηα ιε πενζμνζζιέκμ ζζηυ απμηφπςια ζηδκ ηοηηανζηή θεζημονβία (Efrose et al., 2010). 1.7 Ζ ηεσνολογία ηος βακμιδίος Ζ εζζαβςβή ηδξ ηεπκμθμβίαξ ααηιζδίμο* απθμπμίδζε ζδιακηζηά ηζξ δζενβαζίεξ βεκεηζηήξ ηνμπμπμίδζδξ ηςκ ααηηνμσχκ, επζηαπφκμκηαξ ημοξ ακηίζημζπμοξ ημιείξ ααζζηήξ ηαζ εθανιμζιέκδξ ζμθμβζηήξ ένεοκαξ. Σμ ααηιίδζμ είκαζ πναηηζηά έκα πθήνςξ θεζημονβζηυ ζζηυ βμκζδίςια ηνμπμπμζδιέκμ χζηε κα απμηεθεί έκα ηεπκδηυ ααηηδνζαηυ πνςιυζςια (BAC: Bacterial Artificial Chromosome) (Hall et al., 2012), πμο ιπμνεί κα επζθέβεηαζ ηαζ ακαπανάβεηαζ ζε ααηηδνζαηά ηφηηανα. Γζα κα ζοιαεί *βαθκίδην: λενινγηζκόο από ηνπο όξνπο βαθηξνϊόο (baculovirus) θαη πιαζκίδην (plasmid) γηα ηελ απόδνζε ηνπ όξνπ bacmid (=baculovirus+plasmid) 42

61 αοηυ πνμζηίεεκηαζ ζημ βεκεηζηυ ηυπμ ηδξ πμθοεδνίκδξ ημο ααηηνμσζημφ βμκζδζχιαημξ ηα ελήξ: 1. ιία αθθδθμοπία mini-f, πμο πενζέπεζ ααηηδνζαηέξ εέζεζξ έκανλδξ ηδξ ακηζβναθήξ (origin of replication), ιαγί ιε βμκίδζα ηαζ δμιέξ DNA πμο ελαζθαθίγμοκ αθεκυξ ηδ δζαηήνδζδ ημο ααηιζδίμο ζε παιδθυ ανζειυ ακηζβνάθςκ ακά ηφηηανμ (low copy, 1-2 ακηίβναθα) ηαζ αθεηένμο ημκ αηνζαή δζαπςνζζιυ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο ζηα εοβαηνζηά ααηηδνζαηά ηφηηανα ηαηά ηδ ααηηδνζαηή δζπμηυιδζδ. Σμ πθήνεξ mini-f είκαζ ημ εναφζια f5 ηαηά ηδκ ακάθοζδ ημο πθαζιζδίμο F ιε ηδκ εκδμκμοηθεάζδ EcoRI ακηζζημζπεί ζηδκ πενζμπή F ιε F (Helsberg & Eichenlaub, 1986) ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ ζε δζάθμνεξ εηδυζεζξ ημο ςξ ααζζηυ ζοζηαηζηυ ηςκ BAC. ημ ααηιίδζμ πνδζζιμπμζείηαζ ημ ηιήια BamHI EcoRI, πμο είκαζ ηαηά ~2.8 kbp ιζηνυηενμ απυ ημ πθήνεξ εναφζια. 2. ιία ηαζέηα επζθμβήξ πμο πνμζθένεζ ακηίζηαζδ ζημ ακηζαζμηζηυ ηακαιοηίκδ, χζηε κα είκαζ εθζηηή δ επζθμβή ζε επίπεδμ ααηηδνζαηχκ ηθχκςκ ηαζ 3. ιία πενζμπή/εέζδ εζζδμπήξ βζα ιεηάεεζδ ηφπμο Tn7 (Luckow et al., 1993). (βι. ζην θεθάιαην Μεζόδνη θαη Υιηθά γηα πεξηζζόηεξεο πιεξνθνξίεο). Οζ παναπάκς ηνεζξ αθθδθμοπίεξ εζζάβμκηαζ ζημ βεκεηζηυ ηυπμ ηδξ πμθοεδνίκδξ ακηζηαεζζηχκηαξ ημκ οπμηζκδηή ημο βμκζδίμο ηδξ πμθοεδνίκδξ, ηαεχξ ηαζ έκα ηιήια ημο 5 άηνμο ηδξ ακηίζημζπδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ (171 πνχηα κμοηθεμηίδζα) (Luckow et al., 1993). Ωξ άιεζδ ζοκέπεζα ηςκ παναπάκς ηα ααηιίδζα δεκ πανάβμοκ ηδκ πνςηεΐκδ πμθοεδνίκδ (polh-) ηαζ έβηθεζζημοξ ζμφξ (OV-). Σμ βεβμκυξ αοηυ δεκ επδνεάγεζ ηδ θεζημονβζηυηδηα ηςκ παναβυιεκςκ ζχκ ζε επίπεδμ ηαθθζένβεζαξ ηοηηάνςκ, αθθά ζηενεί ηδ δοκαηυηδηα ακαβκχνζζδξ ηδξ μθμηθήνςζδξ ημο ηφηθμο ιυθοκζδξ, υπςξ αοηή ιπμνεί κα δζαπζζηςεεί ιέζς ηδξ ιζηνμζημπζηήξ παναηήνδζδξ ηςκ παναηηδνζζηζηχκ πμθοεδνζηχκ ζπδιαηζζιχκ ηςκ έβηθεζζηςκ ζχκ. Ζ ηεπκμθμβία ααηιζδίμο επζηνέπεζ ηδ δζαηήνδζδ ηαζ ημ πεζνζζιυ ημο ζζημφ βμκζδζχιαημξ ζε ααηηήνζα, εκχ πανάθθδθα αοηυ παναιέκεζ πθήνςξ θεζημονβζηυ. Απμηεθμφκ ιία πθαηθυνια επζθμβήξ βζα ηδ δζαιυνθςζδ ααηηνμσχκ ςξ θμνέςκ έηθναζδξ ζε επίπεδμ ενεοκδηζηήξ ηαζ δμηζιαζηζηήξ πνήζδξ, ιζαξ ηαζ πανέπμοκ ηδ δοκαηυηδηα βνήβμνδξ ηαζ αλζυπζζηδξ ηαηαζηεοήξ ηαζ επζαεααίςζδξ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ θμνέςκ. Σμ πνχημ ααηιίδζμ πμο ηαηαζηεοάζηδηε ήηακ ημο ζμφ AcMNPV (Luckow et al., 1993). Σμ ααηιίδζμ ημο ζμφ BmNPV ηαηαζηεοάζηδηε ανβυηενα ιε ακηίζημζπδ ιεεμδμθμβία (Motohashi et al., 2005). 43

62 1.8. Σκοπόρ ηηρ διαηπιβήρ Σα ζδζαίηενα θεζημονβζηά παναηηδνζζηζηά εκυξ ζμφ/ααηιζδίμο εθθεζιιαηζημφ ςξ πνμξ ημ βμκίδζμ lef8, δδθαδή δ ιυθοκζδ πναηηζηά εθεφεενδ παεμθμβίαξ ηαζ ηονίςξ πςνίξ κα επδνεάγεηαζ δ ηοηηανζηή πνςηεσκμζφκεεζδ, εα ιπμνμφζακ κα απμηεθέζμοκ ζδιακηζηά πθεμκεηηήιαηα βζα ηδκ ηαηαζηεοή εκυξ κέμο ηφπμο θμνέα ιεηαβςβήξ/έηθναζδξ (transduction/expression). Ο θμνέαξ αοηυξ εα εηιεηαθθεφεηαζ ηδκ ορδθή απυδμζδ ιυθοκζδξ ηςκ ααηηνμσχκ βζα ηδ ιεηαθμνά δζαβμκζδίςκ ζηα ηφηηανα λεκζζηέξ ιε ζημπυ ηδκ έηθναζδ ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ, πανειααίκμκηαξ πανάθθδθα εθάπζζηα ζηδκ ηοηηανζηή αζμθμβία. Οζ παναπάκς ζδζυηδηεξ ζε ζοκδοαζιυ ηαζ ιε ηδκ ζηακυηδηα ζζηήξ ακηζβναθήξ ζε επίπεδα αβνίμο ηφπμο, πμο εα πανέπεζ ζδιακηζηή πμζυηδηα πνμηφπςκ βζα ιεηαβναθή, εα ιπμνμφζακ κα δχζμοκ ηαθφηενα πμζμηζηά ηαζ πμζμηζηά απμηεθέζιαηα ζε ζπέζδ ιε ήδδ οπάνπμκηα ζοζηήιαηα έηθναζδξ. Κζ αοηυ βζαηί δ ελαζθάθζζδ εκυξ ηαηά αάζδ θοζζμθμβζημφ ηοηηανζημφ πενζαάθθμκημξ παναβςβήξ ιε επάνηεζα ιεηα-ιεηαθναζηζηχκ ηνμπμπμζήζεςκ, πθδνέζηενδ ελςηοηηάνςζδ ηςκ εηηνζκυιεκςκ πνςηεσκχκ, αθθά ηαζ πενζμνζζιέκδ απμζημδυιδζδ ζζηήξ αζηζμθμβίαξ, ιπμνεί κα αολήζεζ ζδιακηζηά ηδκ απυδμζδ παναβςβήξ, ζδίςξ ζε ζοβηεηνζιέκεξ ηαηδβμνίεξ πνςηεσκχκ. Δπζπθέμκ, δ απμοζία παεμβέκεζδξ εα επζηνέπεζ ηδκ επζαίςζδ ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ ςξ εη ημφημο ιεβαθφηενμ πνυκμ θεζημονβίαξ ημο ζοζηήιαημξ. Δάκ δε ηα ακηίζημζπα ιεηαθθαβιέκα ζμζχιαηα βίκεζ εθζηηυ κα ιμθφκμοκ απμηεθεζιαηζηά βμκαδζηά ηφηηανα ημο ιεηαλμζηχθδηα ιέζς ππ ρεοδμηφπδζδξ ημ ζφζηδια εα ιπμνμφζε επζπθέμκ κα πνδζζιμπμζδεεί ηαζ βζα ηδκ παναβςβή δζαβμκζδζαηχκ εκηυιςκ, παναηάιπημκηαξ ηζξ δοζπενείξ ηεπκζηά εκέζεζξ ζε πνχζια έιανοα, πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ιέπνζ ζηζβιήξ. ημπυξ ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ είκαζ δ ηαηαζηεοή εκυξ ααηιζδίμο BmNPV εθθεζιιαηζημφ ςξ πνμξ ηδκ πνςηεΐκδ LEF8, ημ μπμίμ εα ιπμνεί κα δζαζςεεί ηαζ κα πανάβεζ ιμθοζιαηζηά ζμζχιαηα, πμο πανάθθδθα εα δζαηδνμφκ ημκ εθθεζιιαηζηυ παναηηήνα ηαζ ημ ζφκμθμ ηςκ παναπάκς εοκμσηχκ ζδζμηήηςκ ημο ανπζημφ ιεηαθθαβιέκμο βμκζδζχιαημξ. Ζ δζάζςζδ εα βίκεηαζ ιε ηδκ πανμπή ηδξ απμφζαξ πνςηεΐκδξ LEF8 απυ ελς-ζζημφξ θμνείξ έηθναζδξ/δζάζςζδξ ζε ιμνθή πθαζιζδίμο ή ιυκζια εκζςιαηςιέκμοξ ζημ βμκζδίςια ηοηηανζηχκ ζεζνχκ δζάζςζδξ. Ζ πνήζδ ηδξ εενιμεοαίζεδηδξ ιεηάθθαλδξ ημο βμκζδίμο lef8 (lef8 ts ), πμο πενζβνάθδηε ζηδκ πανάβναθμ 1.5.5, είκαζ αηαηάθθδθδ βζα ημκ κέμ ααηηνμσζηυ θμνέα 44

63 έηθναζδξ, εθυζμκ μπμζαδήπμηε επζζηνμθή ζε παιδθυηενδ εενιμηναζία ακάπηολδξ ηςκ ηοηηάνςκ/εκηυιςκ, δ μπμία είκαζ ακαβηαία βζα ηδκ ηαθφηενδ θεζημονβζηή ακηαπυηνζζή ημοξ, εα μδδβήζεζ ακαπυθεοηηα ζηδκ παναβςβζηή ιυθοκζδ ηαζ ηεθζηά ζημ εάκαημ ηςκ λεκζζηχκ. Γεδμιέκμο αοημφ ημο ζδιακηζημφ πενζμνζζιμφ, δ ηαηαζηεοή εκυξ δμιζηά εθθεζιιαηζημφ ζμφ, ζημκ μπμίμ εα δζαηανάζζεηαζ ημ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ ημο βμκζδίμο lef8, ιε αθαίνεζδ ηιήιαηυξ ημο ή/ηαζ πανειαμθή ελςβεκμφξ οθζημφ, χζηε κα ιδκ πανάβεηαζ θεζημονβζηή πνςηεΐκδ LEF8, εεςνείηαζ δ πνμζέββζζδ επζθμβήξ βζα ηδκ ηαηαζηεοή ημο ζοζηήιαημξ ιεηαβςβήξ. Παθαζυηενεξ πνμζπάεεζεξ ηαηαζηεοήξ ημο θμνέα πναβιαημπμζήεδηακ ζηδ αάζδ ηδξ ακηζηαηάζηαζδξ εκυξ εζςηενζημφ ηιήιαημξ ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ ημο lef8 απυ ιία ηαζέηα-ακαθμνάξ. Ζ δζαδζηαζία υκηςξ ηαεζζημφζε αδφκαηδ ηδκ παναβςβή θεζημονβζηήξ πνςηεΐκδξ LEF8, αθθά ηαηά ηδ δζαδζηαζία «δζάζςζδξ» ηαζ θυβς εηηεηαιέκδξ μιμθμβίαξ, μζ παναιέκμοζεξ ζημκ ζυ αθθδθμοπίεξ lef8 «ηαεμδδβμφζακ» ηδκ επζζηνμθή εκυξ πθήνμοξ ακμζηημφ πθαζζίμο απυ ηδ ζηαεενά δζαιμθοζιέκδ ηοηηανζηή ζεζνά δζάζςζδξ ζημκ ιεηαθθαβιέκμ ζυ ιέζς μιυθμβμο ακαζοκδοαζιμφ. Λυβς αοημφ ημο θαζκμιέκμο, ακαζοκδοαζιέκμζ ζμί ρεοδμ-αβνίμο ηφπμο ζφκημια ακηζηαεζζημφζακ ημοξ εθθεζιιαηζημφξ ηαζ ηαηαθάιαακακ ηδκ ηαθθζένβεζα, ιε απμηέθεζια ηδκ απχθεζα ηδξ ιεηάθθαλδξ (Farrell, 1998). Γζα ηδκ απμθοβή απχθεζαξ ημο εθθεζιιαηζημφ παναηηήνα δμηζιάγεηαζ δ αθαίνεζδ μθυηθδνδξ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο βμκζδίμο lef8 απυ ημ ααηιζδζαηυ βμκζδίςια ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ παναβςβή ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 απυ ελς-ζζηέξ αθθδθμοπίεξ έηθναζδξ/δζάζςζδξ, ααζζζιέκεξ ζε εηενυθμβεξ αθθδθμοπίεξ οπμηζκδηή/πμθοαδεκοθίςζδξ. Με αοηυ ημκ ηνυπμ απμθεφβεηαζ δ δζαηήνδζδ μιμθμβίαξ ιεηαλφ ημο εθθεζιιαηζημφ βμκζδζχιαημξ ηαζ ηςκ θμνέςκ δζάζςζδξέηθναζδξ LEF8, βεβμκυξ πμο ακαιέκεηαζ κα δζαηδνήζεζ ηδ ιεηάθθαλδ. Ζ ηαηαζηεοή ηαζ ιεθέηδ ημο κέμο εθθεζιιαηζημφ ααηιζδίμο απμηεθεί ηδ αάζδ εκυξ κέμο ζοζηήιαημξ έηθναζδξ/ιεηαβςβήξ, ημο μπμίμο δ δμηζιαζηζηή εθανιμβή ζηδκ παναβςβή πνςηεσκχκ εα επζηνέρεζ ηδκ άιεζδ ζφβηνζζή ημο ιε ηα ήδδ οπάνπμκηα ζοζηήιαηα ηαζ ηδ δζαπίζηςζδ ακ υκηςξ απμηεθεί ιία ηαθφηενδ πνυηαζδ ζε ζπέζδ ιε αοηά. 45

64

65 2. Τιηθά θαη Μέζνδνη

66

67 2. Τιηθά θαη Μέζνδνη 2.1 Γενικά ζηοισεία Σμ H 2 O ζε υθεξ ηζξ πενζπηχζεζξ είκαζ απμζηεζνςιέκμ, απεζηαβιέκμ ηαζ απζμκζζιέκμ (sterile, distilled, deionized: sdd), ακηίζηαζδξ 18.3 MΩ, πνμηεζιέκμο κα ελαζθαθζζηεί ορδθή ηαεανυηδηα ηαζ αζδρία. Υαναηηδνίγεηαζ ςξ sddh 2 O. Όθα ηα οθζηά απμζηεζνχκμκηαζ ζε ηθίαακμ απμζηείνςζδξ, οπυ πίεζδ (autoclave), πθδκ εθαπίζηςκ ελαζνέζεςκ, υπμο ακηεκδείηκοηαζ (DMSO ηαζ δζαθφιαηα πμο ημ πενζέπμοκ, δζαθφιαηα ιε αθημυθεξ, παναζηεοάζιαηα εκγφιςκ ηαζ ακηζδναζηδνίςκ εοαίζεδηςκ ζε ορδθέξ εενιμηναζίεξ/πζέζεζξ). Οζ ζοκεήηεξ απμζηείνςζδξ βζα δζαθφιαηα είκαζ 120 μ C ηαζ πίεζδ 1 atm (αηιυζθαζνα), βζα 20 min Γζα δζαθφιαηα πμο δεκ ιπμνμφκ κα απμζηεζνςεμφκ εενιζηά, πνδζζιμπμζμφκηαζ θίθηνα ζφνζββαξ (syringe filters) ιε πυνμοξ 0.2 ιm ηαζ οθζηυ ηοπζηά πμθο-εεενμ-ζμοθθυκδ (PES: polyethersulfone/minisart ηδξ Sartorius ηαζ ακηίζημζπα θμζπχκ ηαηαζηεοαζηχκ). ph ιέηνδζδ ηαζ νφειζζδ ph δζαθοιάηςκ βίκεηαζ πνζκ ηδκ απμζηείνςζδ ιε πνήζδ ζοζηεοήξ ιε δθεηηνυδζμ οάθμο οπυ ακάδεοζδ ημο δζαθφιαημξ, ηοπζηά ζε ιαβκδηζηυ ακαδεοηήνα. Όπμο απαζηείηαζ εένιακζδ δζαθοιάηςκ βζα ηδκ επχαζδ ακηζδνάζεςκ πνδζζιμπμζμφκηαζ οδαηυθμοηνα ηαζ θμζπέξ εενιακηζηέξ ιμκάδεξ πμθθαπθχκ εέζεςκ (heat blocks). Όπμηε είκαζ ζηυπζιμ κα ελαζθαθζζηεί αηνίαεζα ζηδ εενιμηναζία βζα ζοβηεηνζιέκα πνμκζηά δζαζηήιαηα, πνδζζιμπμζμφκηαζ ζςθδκάνζα PCR (PCR tubes/ ml) ζε ζοκδοαζιυ ιε ηζξ ακηίζημζπεξ ζοζηεοέξ. ε ηάεε πενίπηςζδ πμο απαζηείηαζ εενιζηυ ζμη (heat shock), αοηυ πναβιαημπμζείηαζ ζε οδαηυθμοηνμ ή άθθμ ζφζηδια πμο ελαζθαθίγεζ βνήβμνδ αθθαβή ηδξ εενιμηναζίαξ ηδξ ηαθθζένβεζαξ. 2.2 Βακηηπιακοί ηύποι και καλλιέπγεια βακηηπίυν Σα ααηηδνζαηά ζηεθέπδ Escherichia coli (E. coli) DH5a ηαζ DH10b πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδ δζαηήνδζδ, ακαπαναβςβή ηαζ ηνμπμπμίδζδ/πεζνζζιυ πθαζιζδίςκ ηαζ ααηιζδίςκ ακηίζημζπα. Ζ ηαθθζένβεζα οβνήξ θάζδξ πναβιαημπμζήεδηε ζε ενεπηζηυ οθζηυ Lysogeny Broth (LB, (Bertani, 1951)), ζφζηαζδξ 1% w/v ζε ηνοπηυκδ (tryptone: πεπηυκδ απυ εκγοιαηζηή πέρδ ηαγεΐκδξ), 0.5% w/v εηπφθζζια γφιδξ (yeast extract) ηαζ 0.5 1% w/v πθςνζμφπμ κάηνζμ 46

68 (NaCl). Ζ παιδθυηενδ ζοβηέκηνςζδ άθαημξ (0.5% w/v) πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ακηζαζμηζηχκ-επζθμβήξ ιε εοαζζεδζία ζηδ ζοβηέκηνςζδ άθαημξ, υπςξ δ γεμιοηίκδ. Σμ ενεπηζηυ οθζηυ δε νοειίγεηαζ ςξ πνμξ ημ ph. Γζα ηδκ ηαηαζηεοή ημο ααηιζδίμο Γlef8 πνδζζιμπμζήεδηε ςξ ιέζμ ηαθθζένβεζαξ ηαζ ημ εθεφεενμ άθαημξ ενεπηζηυ οθζηυ YENB (Yeast Extract and Nutrient Broth (Sharma & Schimke, 1996)), ζφζηαζδξ 0.75% w/v Bacto yeast extract ηαζ 0.8% w/v Bacto nutrient broth (Difco Laboratories). Σμ YENB πανέπεζ πθεμκεηηήιαηα βζα ηδκ παναζηεοή δεηηζηχκ ηοηηάνςκ βζα δθεηηνμδζάηνδζδ πένακ ημο υηζ δεκ αδνακμπμζεί ηδ γεμιοηίκδ. Ζ ηαθθζένβεζα ζηενεήξ θάζδξ έβζκε ζε άβαν-lb/τδνβ, ιε 1.5% w/v άβαν (Sambrook et al., 1989). Ζ ηαηάθθδθδ πμζυηδηα άβαν ακαιζβκφεηαζ ιε LB/ΤΔΝΒ ηαζ ημ ιίβια απμζηεζνχκεηαζ ζε ηθίαακμ. Ζ δζαδζηαζία θζχκεζ ημ άβαν, δζαιμνθχκμκηαξ έκα μιμβεκέξ οθζηυ, ημ μπμίμ αθμφ ένεεζ ζε εενιμηναζία ~50 μ C ειπθμοηίγεηαζ ιε ηα ακηζαζμηζηά ζηζξ ηαηάθθδθεξ ζοβηεκηνχζεζξ ηαζ ημπμεεηείηαζ ζε ηνοαθία. Οζ ηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ οβνήξ ή ζηενεήξ θάζδξ πναβιαημπμζήεδηακ ζε επςαζηήνεξ εενιμηναζία ακάθμβα ιε ηδκ εθανιμβή απυ 30 μ C έςξ 37 μ C ηαζ ακάδεοζδ ζηζξ 100 ιε 220 ζηνμθέξ/min (rpm) εζδζηά βζα ηζξ ηαθθζένβεζεξ οβνήξ θάζδξ. Ο πνυκμξ επχαζδξ ελανηάηαζ απυ ημκ ηφπμ ημο πεζνάιαημξ/δζενβαζίαξ. Ο ζοκήεδξ πνυκμξ επχαζδξ βζα ηθςκμπμίδζδ πθαζιζδζαημφ DNA ιε ζημπυ ηδκ απμιυκςζδ είκαζ ~16-19 h ηαζ πναβιαημπμζείηαζ ιε μθμκφηηζα επχαζδ. 2.3 Μεηαζσημαηιζμόρ βακηηπίυν Υεκηθόο κεηαζρεκαηηζκόο (chemical transformation) Υνδζζιμπμζήεδηακ δφμ πνςηυημθθα πνμεημζιαζίαξ ηοηηάνςκ βζα πδιζηυ ιεηαζπδιαηζζιυ: έκα ααζζζιέκμ ζε ηαηενβαζία ιε CaCl 2 (Sambrook et al., 1989) ηζ έκα ηαπφηενμ εκυξ αήιαημξ (Chung et al., 1989). Σμ δεφηενμ πενζθαιαάκεζ ηδκ ακάπηολδ ηςκ ηοηηάνςκ ιέπνζ ηδκ πνχζιδ εηεεηζηή θάζδ (O.D ) ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ηαηααφεζζδ ιε θοβμηέκηνδζδ, απμιάηνοκζδ ημο οπενηείιεκμο ηαζ επακεκαζχνδζδ ζε δζάθοια TSS (Transformation and Storage Solution) ζε υβημ ίζμ πνμξ ημ 1/10 ημο ανπζημφ υβημο ηδξ ηαθθζένβεζαξ. Σμ TSS απμηεθείηαζ απυ LB ιε 47

69 10% w/v PEG 8000 (Polyethylene Glycol/ ιέζμ ιμνζαηυ αάνμξ: 8000), 5% v/v DMSO (Dimethyl Sulfoxide) ηαζ 20 mm MgCl 2 ζε ph 6.5. Καζ ζηζξ δφμ πενζπηχζεζξ δ ηαηενβαζία ηςκ ηοηηάνςκ πναβιαημπμζείηαζ ζημοξ 4 o C, ιε πνδζζιμπμίδζδ ροπυιεκδξ θοβμηέκηνμο ηαζ πάβμο, ηαζ ημ ηοηηανζηυ παναζηεφαζια πμο πνμηφπηεζ ιμζνάγεηαζ ζε δυζεζξ/ιμκάδεξ ηςκ 100 ιl. Όζεξ ιμκάδεξ δεκ πνυηεζηαζ κα πνδζζιμπμζδεμφκ άιεζα ηαηαρφπμκηαζ ηαπέςξ, ηαηά πνμηίιδζδ ιε ειαάπηζζδ ζε οβνυ άγςημ ηαζ απμεδηεφμκηαζ ζημοξ -70 μ C. Ζ δζαδζηαζία ημο ιεηαζπδιαηζζιμφ, πενζθαιαάκεζ απυρολδ ημο ηοηηανζημφ παναζηεοάζιαημξ ζημκ πάβμ, πνμζεήηδ ημο ακηίζημζπμο DNA ζε πμζυηδηα ng, ακάδεοζδ ηαζ παναιμκή ζημκ πάβμ βζα 5 45 min (ιπμνεί κα επεηηαεεί ςξ 1 h). ηδ ζοκέπεζα ημ παναζηεφαζια οθίζηαηαζ εενιζηή πνμζαμθή (heat shock) βζα 1-2 min δεκ εθανιυγεηαζ βζα ηα ηφηηανα ημο πνςημηυθθμο εκυξ αήιαημξ ιεηά ηδκ μπμία πνμζηίεεκηαζ 900 ιl LB ηαζ πναβιαημπμζείηαζ επχαζδ βζα 1 h ζημοξ 37 μ C. Αημθμοεεί επίζηνςζδ εκυξ ηθάζιαημξ ηςκ ηοηηάνςκ ημ 1/200 είκαζ ζοκήεςξ επανηέξ ζε ηνοαθίμ άβαν-lb, υπμο πναβιαημπμζείηαζ επζθμβή ηςκ ααηηδνζαηχκ ηθχκςκ ιε πνήζδ ακηζαζμηζηχκ (Chung et al., 1989; Sambrook et al., 1989). Σα ακηζαζμηζηά γεμιοηίκδ (Invivogen), ηακαιοηίκδ (Applichem), αιπζηζθθίκδ (Applichem), ηεηναηοηθίκδ (Sigma) ηαζ βεκηαιοηίκδ (Applichem) πνδζζιμπμζήεδηακ ζηζξ ηαεμνζζιέκεξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ 25, 50, 100, 10 and 7 µg/ml ακηίζημζπα (Invitrogen, 2004; Sambrook et al., 1989). Σμ πνμθίθ ακεεηηζηυηδηαξ ακά πθαζιίδζμ βεκεηζηυ θμνέα παναηίεεηαζ ζημκ πίκαηα 2.1. Όπμηε πνδζζιμπμζείηαζ δ αιπζηζθθίκδ ςξ ακηζαζμηζηυ επζθμβήξ, ιεηά ηδκ επχαζδ ζημκ πάβμ ηαζ ηδ εενιζηή πνμζαμθή (υπμο εθανιυγεηαζ) ιπμνεί κα αημθμοεήζεζ επχαζδ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα πενίπμο 10 min ηαζ εκ ζοκεπεία άιεζδ επίζηνςζδ ημο ζοκυθμο ηςκ ηοηηάνςκ ζε ηνοαθία επζθμβήξ, πςνίξ απχθεζεξ ζηδκ απμηεθεζιαηζηυηδηα ηδξ ιεευδμο. Ζ ίδζα δζαδζηαζία ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί Πίλαθαο 2.1 Γελεηηθόο θνξέαο ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο ααηιίδζμ Γlef8 ααηιίδζα ιε έκεεια, ηαηυπζκ ιεηάεεζδξ Tn7 pmon7124 pfastbac ηαζ θμζπά πθαζιίδζα Αλζεθηηθόηεηα ηακαιοηίκδ ηακαιοηίκδ, γεμιοηίκδ ηακαιοηίκδ, βεκηαιοηίκδ ηεηναηοηθίκδ αιπζηζθθίκδ Πίλαθαο 2.1 Καηαβναθή ημο πνμθίθ ακεεηηζηυηδηαξ ζε ακηζαζμηζηά ακά ααηιίδζμ/πθαζιίδζμ. 48

70 αζπέηςξ ακ ημ βεκεηζηυ οθζηυ βζα ιεηαθμνά είκαζ πθαζιίδζμ ή πνμσυκ έκςζδξ (ligation, βι. παξαθάηω) ηιδιάηςκ DNA Ηιεθηξνδηάηξεζε (electroporation) Γζα εθανιμβέξ πμο απαζημφκ αολδιέκδ απυδμζδ ιεηαζπδιαηζζιμφ πνδζζιμπμζείηαζ δ ηεπκζηή ηδξ δθεηηνμδζάηνδζδξ, δ μπμία επάβεζ, ιέζς εκυξ δθεηηνζημφ παθιμφ ζοβηεηνζιέκςκ παναηηδνζζηζηχκ, ηδ δναζηζηή αφλδζδ ηδξ δζαπεναηυηδηαξ ημο ααηηδνζαημφ πενζαθήιαημξ ζε ιαηνμιυνζα ηαζ ηδκ είζμδμ ημο επζεοιδημφ βεκεηζημφ οθζημφ ζημ ηφηηανμ (Teissie et al., 2005). Σμ ααηηδνζαηυ πενίαθδια βζα ημ gram-ανκδηζηυ ααηηήνζμ E. coli απμηεθείηαζ ζοκμθζηά απυ ιία ελςηενζηή ηαζ ιία εζςηενζηή δίζηζαδ θζπζδζηή ιειανάκδ, πμο εζςηθείεζ έκα θεπηυ ηοηηανζηυ ημίπςια πεπηζδμβθοηάκδξ. Ζ πνμεημζιαζία ηςκ ηοηηάνςκ πενζθαιαάκεζ ηδκ ακάπηολδ ιέπνζ μνζζιέκδ ποηκυηδηα (Optical Density ζηα 600 nm: O.D ), επχαζδ ζε πάβμ βζα min, ηαηααφεζζδ ιε θοβμηέκηνδζδ (2600 xg βζα 10 min ζημοξ 4 μ C) ηαζ ηδκ έηπθοζή ημοξ ζε ροπνυ δζάθοια 10% βθοηενυθδξ (δφμ θμνέξ). Σα ηφηηανα ηεθζηά ακαδζαθφμκηαζ ζημ 1/200 ημο ανπζημφ ημοξ υβημο ζημ παναπάκς δζάθοια βθοηενυθδξ ηαζ δζαιμζνάγμκηαζ ζε δυζεζξ ηςκ 20 ή 40 ιl. Σμ παναπάκς πνςηυημθθμ (Sharma & Schimke, 1996; Tong-Chuan et al.) είκαζ εκδεζηηζηυ ηδξ δζαδζηαζίαξ, βζα ηδκ μπμία οπάνπμοκ δζάθμνεξ παναθθαβέξ (ππ ιε ιζηνυηενδ ανπζηή ποηκυηδηα ηοηηάνςκ ηαζ έηπθοζδ ζε sddh 2 O (Sharan et al., 2009)). ε ηάεε πενίπηςζδ υιςξ μ ζηυπμξ είκαζ δ εθάηηςζδ ηδξ αβςβζιυηδηαξ ημο ηεθζημφ εκαζςνήιαημξ ηοηηάνςκ, ιέζς απμιάηνοκζδξ, ηαηά ημ δοκαηυκ, ηςκ πενζεπυιεκςκ αβχβζιςκ ζοζηαηζηχκ (ηονίςξ άθαηα) ηαζ δ ζδιακηζηή ζοιπφηκςζδ ημο οθζημφ (ππ 1/200). Δπζπθέμκ, απαζηείηαζ πεζνζζιυξ ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ υθςκ ηςκ ζπεηζηχκ οθζηχκ ζημοξ 4 μ C. Γζα ηδκ δθεηηνμδζάηνδζδ πνδζζιμπμζήεδηακ μζ ζοζηεοέξ ECM 399 (BTX) ηαζ MicroPulser (Bio-Rad), αάζεζ ηςκ μδδβζχκ ημο ηαηαζηεοαζηή. οκμπηζηά, ημ βεκεηζηυ οθζηυ ακαιζβκφεηαζ ιε ηα ηφηηανα ηαζ παναιέκεζ ζημκ πάβμ βζα πενίπμο 1 min. Σμ ιίβια ημπμεεηείηαζ ιεηά ζε παβςιέκεξ ηορεθίδεξ δθεηηνμδζάηνδζδξ δ παιδθή εενιμηναζία είκαζ ζδιακηζηή βζα ηδκ απυδμζδ ηδξ ηεπκζηήξ ιε δζάηεκμ 0.1 ή 0.2 cm, ηαζ, πνμηεζιέκμο βζα πθαζιίδζα, εθανιυγεηαζ δθεηηνζηυξ παθιυξ 25 kv/cm. Αιέζςξ ιεηά ημκ παθιυ πνμζηίεεκηαζ 900 ιl LB απεοεείαξ ζηδκ ηορεθίδα ηαζ ημ ιίβια ηςκ ηοηηάνςκ επςάγεηαζ ζημοξ 37 μ C βζα 1 h, πνζκ ηδκ επίζηνςζδ βζα επζθμβή ζε ηνοαθία άβαν-lb/τδνβ. 49

71 Δζδζηά βζα ηδ ιεηαθμνά ααηιζδίςκ ζε ηφηηανα DH10b, δ δθεηηνμδζάηνδζδ πναβιαημπμζείηαζ ζηα kv/cm (Sheng et al., 1995), ιε πμζυηδηεξ ααηιζδίμο άκς ηςκ 600 ng (έπεζ δμηζιαζηεί ηαζ πμζυηδηα 1.2 ιg ιε ιεβαθφηενδ απυδμζδ). Γζα ηδκ ακάπηολδ ακεεηηζηυηδηαξ, ηα ηφηηανα επςάγμκηαζ ζημοξ 37 μ C βζα 1.5 h ηαζ ιεηά επζζηνχκμκηαζ ζε ηνοαθία άβαν-lb/τδνβ, πμο πενζέπμοκ ηακαιοηίκδ (50 ιg/ml). 2.4 Βακμίδια και ιοί Σμ ααηιίδζμ (Luckow et al., 1993) ζοκζζηά ιία ιμνθή ηεπκδημφ ααηηδνζαημφ πνςιμζχιαημξ ηςκ ααηηνμσχκ, δ μπμία ιπμνεί κα πμθθαπθαζζαζηεί ηυζμ ζε ααηηήνζα E. coli, υζμ ηαζ ζε ηφηηανα εκηυιςκ. Όηακ εζζαπεεί ιέζς δζαιυθοκζδξ ζε ηφηηανα ημο ηαηάθθδθμο εκηυιμο-λεκζζηή, επάβεζ ηδκ παναβςβή ημο ακηίζημζπμο πθήνςξ θεζημονβζημφ ζμφ, ηαηά πθήνδ ακηζζημζπία ιε ημ ηαεανυ ζζηυ DNA (Burand et al., 1980). Κάεε ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο θένεζ ημ πθήνεξ βεκεηζηυ οθζηυ ημο ζμφ αβνίμο ηφπμο Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus (BmNPV, (Motohashi et al., 2005)) ή Autographa californica Nucleopolyhedrovirus (AcMNPV, (Luckow et al., 1993)) εηηυξ ημο βεκεηζημφ ηυπμο ηδξ πμθοεδνίκδξ, μ μπμίμξ αθθμζχκεηαζ ιε ηδκ είζμδμ ηςκ αθθδθμοπζχκ πμο επζηνέπμοκ ηδκ ακαπαναβςβή ζε ααηηήνζα. Οζ αθθδθμοπίεξ αοηέξ πενζθαιαάκμοκ ιία πθαζιζδζαηή εέζδ εθέβπμο/έκανλδξ ηδξ ακηζβναθήξ, ηφπμο mini- F, δ μπμία ηαηεοεφκεζ ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ημο ζζημφ βμκζδζχιαημξ ζε παιδθυ ανζειυ ακηζβνάθςκ (1-2 ακά ηφηηανμ), έκα βμκίδζμ ακεεηηζηυηδηαξ ζηδκ ηακαιοηίκδ ηαζ ιία εέζδ βεκεηζηήξ ιεηάεεζδξ ηφπμο mini-atttn7, βζα ηδκ εζζαβςβή κέμο βεκεηζημφ οθζημφ (Invitrogen, 2004; Rohrmann, 2013). Σα ααηιίδζα δεκ πανάβμοκ πμθφεδνα, δεδμιέκδξ ηδξ αδοκαιίαξ ζφκεεζδξ ηδξ πμθοεδνίκδξ. Σμ ααηιίδζμ BmNPV πμο πνδζζιμπμζήεδηε ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ είκαζ εοβεκζηή πνμζθμνά ηςκ Γν. Maenaka (Πακεπζζηήιζμ Kyushu, Ηαπςκία) ηαζ Γν. Park (Πακεπζζηήιζμ Shizuoka, Ηαπςκία). Δηηυξ απυ ημ ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο ηαζ ημοξ ζμφξ πμο πανάβεζ, πνδζζιμπμζήεδηε ηαζ μ ζυξ BmNPV/A.gfp (Iatrou & Swevers, 2005a). Πνυηεζηαζ βζα έκακ ακαζοκδοαζιέκμ ζυ πμο θένεζ ημ πθήνεξ βμκζδίςια BmNPV ηαζ ιία ηαζέηα παναβςβήξ egfp οπυ ημκ έθεβπμ ημο οπμηζκδηή ηδξ ηοηηανμπθαζιαηζηήξ αηηίκδξ A3 ημο Bombyx mori ζημ βεκεηζηυ ηυπμ ιεηαλφ ηςκ βμκζδίςκ p15 ηαζ p95 (Lu et al., 1998) (βι. θαη ζηελ παξάγξαθν θαη εηθ. 3.14). Ζ ημπμεέηδζδ ηδξ ηαζέηαξ δε δζαηανάζζεζ ηάπμζμ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ ή νοειζζηζηή πενζμπή ηαζ μ ζυξ 50

72 BmNPV/A.gfp ειθακίγεζ ημ ίδζμ δοκαιζηυ αφλδζδξ ιε ημκ ζυ BmNPV αβνίμο ηφπμο (Iatrou & Swevers, 2005a). ε ακηίεεζδ ιε ηα ααηιίδζα, μ ζυξ BmNPV/A.gfp πανάβεζ πμθφεδνα, ιζαξ ηαζ δζαεέηεζ ημκ αβνίμο ηφπμο βεκεηζηυ ηυπμ ηδξ πμθοεδνίκδξ. Υνδζζιμπμζήεδηε εκαζχνδια ημο ζμφ ιε ηίηθμ 10 9 pfu/ml (pfu: plaque forming units/ιμκάδεξ ζπδιαηζζιμφ πθαηχκ). 2.5 Απομόνυζη και σπηζιμοποίηζη ηος DNA Απνκόλσζε πιαζκηδηαθνύ/βαθκηδηαθνύ DNA Ζ απμιυκςζδ πθαζιζδζαημφ DNA πναβιαημπμζήεδηε ιε αθηαθζηή θφζδ (Sambrook et al., 1989), ηαηά ηδκ μπμία ηα ααηηήνζα δζαθφμκηαζ ζε έκημκμ αθηαθζηυ πενζαάθθμκ ιε ηδ αμήεεζα ημο ακζμκζημφ επζθακεζμδναζηζημφ πανάβμκηα SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). Δζδζηά βζα ιζηνήξ ηθίιαηαξ απμιυκςζδ πνμηζιήεδηε δ ιέεμδμξ απμιυκςζδξ ηδξ Invitrogen (Invitrogen, 2004), πμο πανάβεζ πθαζιζδζαηυ/ααηιζδζαηυ DNA, ζε ζδιακηζηυ ααειυ, εθεφεενμ απυ RNA. Σμ πνμηφπημκ DNA είκαζ ανηεηά ηαεανυ χζηε κα πνδζζιμπμζείηαζ ζηδ δζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ εκηυιςκ ηαζ εθανιυγεηαζ ηονίςξ βζα επζθμβή ηθχκςκ ηαζ πνμηαηανηηζηά πεζνάιαηα. Γζα ημκ ηφνζμ υβημ πεζναιάηςκ ημ DNA απμιμκχεδηε ζε ιεζαία ή ιεβάθδ ηθίιαηα ηαζ ηαεανίζηδηε ιε ηφηθμοξ εηπφθζζδξ θαζκυθδξ-πθςνμθμνιίμο (απαζηείηαζ πνμδβμφιεκδ εκγοιζηή απμδυιδζδ ημο RNA), α) ιε πνήζδ ειπμνζηά δζαεέζζιδξ ζηήθδξ ηαεανζζιμφ (πθαζιίδζα: Midi kits, δζάθμνςκ ηαηαζηεοαζηχκ/ ααηιίδζα: Large construct kit, cat. no , Qiagen) ή β) ζε ηθίζδ πθςνζμφπμο ηαζζίμο (CsCl) ιε ανςιζμφπμ αζείδζμ (EtBr) (Sambrook et al., 1989). ε ηάεε πενίπηςζδ ζοβηνζηζηήξ ιεθέηδξ ηςκ ζδζμηήηςκ/απμηεθεζιάηςκ πθαζιζδζαημφ ή ααηιζδζαημφ DNA πνδζζιμπμζήεδηακ απμιμκχζεζξ DNA, πμο πανήπεδζακ ιε ηδκ ίδζα ιέεμδμ, χζηε κα πενζμνζζηεί δ ηεπκζηή πμζηζθυηδηα. Όπμο απαζηήεδηε εκγοιζηή απμδυιδζδ ημο RNA, πναβιαημπμζήεδηε ιε επίδναζδ ημο εκγφιμο RNase Α (Applichem), ζε ζοβηέκηνςζδ 100 ιg/ml ηαζ εενιμηναζία 37 o C βζα πνυκμ επχαζδξ min. Σμ έκγοιμ ιεηά ημ ηέθμξ ηδξ ακηίδναζδξ απμιαηνφκεηαζ ιε ηφηθμοξ εηπφθζζδξ ιε θαζκυθδ-πθςνμθυνιζμ ή ιέζς ηαεανζζιμφ ζε ζηήθδ. Γηαιύκαηα αιθαιηθήο ιύζεο Γζάθοια Η : 50 mm Tris HCl, ph 8/ 10 mm EDTA/ 100 ιg/ml RNase A Γζάθοια ΗΗ : 200 mm NaOH, 1% SDS 51

73 Γζάθοια ΗΗI : 3 M potassium acetate, ph 5.5 Tris HCl: Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid Ζ αθηαθζηή θφζδ πενζθαιαάκεζ ηδκ ηαηααφεζζδ ηςκ ηοηηάνςκ ιε θοβμηέκηνδζδ, ηδκ απμιάηνοκζδ ημο οπενηείιεκμο ενεπηζημφ οθζημφ ηαζ ηδκ επακεκαζχνδζδ ηςκ ηοηηάνςκ ζημ νοειζζηζηυ δζάθοια Η. Δκ ζοκεπεία πνμζηίεεηαζ ημ δζάθοια ΗΗ πμο αθεκυξ δζαθφεζ ηα ηφηηανα ιε ημ SDS πμο πενζέπεζ ηαζ επζπθέμκ απμδζαηάζζεζ ημ ααηηδνζαηυ DNA ζημ έκημκμ αθηαθζηυ πενζαάθθμκ πμο δζαιμνθχκεζ. Σμ δζάθοια ΗΗΗ ελμοδεηενχκεζ ημ αθηαθζηυ πενζαάθθμκ μδδβχκηαξ ζε επακαδζάηαλδ ηςκ ζδιακηζηά ιζηνυηενςκ ζε ζπέζδ ιε ημ ααηηδνζαηυ πνςιυζςια πενζεπυιεκςκ πθαζιζδίςκ. Δπζπθέμκ δδιζμονβεί ζφιπθμηα ιε ημ SDS ηαζ δζάθμνα ηοηηανζηά ζοζηαηζηά/οπμθείιιαηα, χζηε, ιεηά απυ θοβμηέκηνδζδ ημο οθζημφ, ημ πθαζιζδζαηυ DNA κα απμηεθεί ημ ηφνζμ ζοζηαηζηυ ημο οπενηείιεκμο πμο πνμηφπηεζ. Οζ αηνζαείξ πμζυηδηεξ ηςκ δζαθοιάηςκ ελανηχκηαζ απυ ηδκ ηθίιαηα απμιυκςζδξ ηαζ ημ αηνζαέξ πνςηυημθθμ. Δκδεζηηζηά βζα ιζηνήξ ηθίιαηαξ απμιυκςζδ πνδζζιμπμζήεδηακ 300 ιl, βζα ιέζδξ (100 ml υβημξ ηαθθζένβεζαξ) 5 ml ηαζ βζα ιεβάθδξ ηθίιαηαξ (500 ml υβημξ ηαθθζένβεζαξ) 20 ml απυ ηάεε ακηίζημζπμ δζάθοια. Ζ επχαζδ ζημ δζάθοια ΗΗ είκαζ βζα 5 min ζε εενιμηναζία δςιαηίμο (RT: room temperature) ηαζ ζημ δζάθοια ΗΗΗ 10 min ζημκ πάβμ. Ζ ζοιπφηκςζδ δζαθοιάηςκ κμοηθεσηχκ μλέςκ πναβιαημπμζήεδηε ιέζς ηαηααφεζζδξ ιε άθαξ ζε δζάθοια αθημυθδξ, ηαεανζζιυ ηαζ επακαδζάθοζδ ζημκ επζεοιδηυ υβημ ηεθζημφ δζαθφηδ ζοκήεςξ Ζ 2 Ο. Σοπζηά πνδζζιμπμζήεδηε ζζμπνμπακυθδ ζε υβημ % ημο ανπζημφ ηαζ μλζηυ κάηνζμ (CH3COONa, 3 M, ph 5) ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 0.3 Μ ηαζ επχαζδ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο (πεξαηηέξω πιεξνθνξίεο ζηα εγρεηξίδηα (Ausubel; Sambrook et al., 1989)). Δζδζηά βζα ημ πνςηυημθθμ ηαεανζζιμφ ζε ηθίζδ πθςνζμφπμο ηαζζίμο (CsCl) (Sambrook et al., 1989), ιεηά ηδ ζοιπφηκςζδ ημ ίγδια κμοηθεσηχκ μλέςκ ακαδζαθφεηαζ ζε 3 ml Ζ 2 Ο, ιαγί ιε 3.5 gr CsCl ηαζ 250 ιl δζαθφιαημξ ανςιζμφπμο αζεζδίμο (Ethidium Bromide, EtBr) 10 mg/ml. Αημθμοεεί θοβμηέκηνδζδ ζηζξ 8000 rpm βζα 10 min (ή ζηζξ rpm βζα 5 min) βζα ηδκ απμµάηνοκζδ πνςηεσκχκ ηαζ ζαηπάνςκ ηαζ 4 ml ημο οπενηεζµέκμο ιεηαθένμκηαζ εκηυξ ζςθδκανίμο οπενθοβμηέκηνδζδξ (ultra-centrifuge tube), ημ μπμίμ ζθναβίγεηαζ ηαζ θοβμηεκηνείηαζ ζηζξ 10 5 rpm βζα 5 h. 52

74 Οζ γχκεξ ημο DNA δζαιμνθχκμκηαζ ιε αάζδ ηδ ζπεηζηή ημοξ ποηκυηδηαξ (buoyant density), δ μπμία ηαεμνίγεζ ηδκ πθεοζηυηδηά ημοξ (buoyancy) ζηδκ επαβχιεκδ ηθίζδ ηαζζίμο. Σμ EtBr εκζζπφεζ ηδ δζαθμνά ποηκυηδηαξ ηςκ δζάθμνςκ ηφπςκ DNA πνςιμζςιζηυ, πθαζιζδζαηυ ηαζ ηαεζζηά μναηέξ ηζξ γχκεξ ζηδκ οπενζχδδ αηηζκμαμθία. Απυ ηζξ δφμ έκημκεξ γχκεξ βίκεηαζ θήρδ ηδξ ηάης γχκδξ, πμο ακηζζημζπεί ζημ πθαζµζδζαηυ DNA, ιε ηδ αμήεεζα αεθυκαξ δζαιέηνμο ηοπζηά 21G (0.8 mm) ηαζ ζφνζββαξ. Σμ RNA ζοβηεκηνχκεηαζ ζημκ ποειέκα ημο ζςθδκανίμο. Σμ οθζηυ αναζχκεηαζ ζε 1 ml Ζ 2 Ο ηαζ ημ EtBr απμιαηνφκεηαζ ιέζς πθφζεςκ µε εκοδαηςµέκδ αμοηακυθδ (4-6 θμνέξ επανημφκ). ηδ ζοκέπεζα αημθμοεεί κέα ζοιπφηκςζδ ημο ηαεανζζιέκμο πθέμκ DNA ιε άθαξ ζε αθημμθζηυ δζάθοια, υπςξ ακαθένεδηε παναπάκς Ηιεθηξνθόξεζε, απνκόλσζε ηκεκάησλ θαη πνζνηηθνπνίεζε ηνπ DNA Γζα ηδκ δθεηηνμθυνδζδ ηιδιάηςκ DNA πνδζζιμπμζήεδηακ πδηηχιαηα αβανυγδξ ζοβηέκηνςζδξ 0.7-2% w/v ηαζ EtBr ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 5 ιg/ml (Sambrook et al., 1989). Ζ δθεηηνμθυνδζδ πναβιαημπμζείηαζ ζε νοειζζηζηυ δζάθοια ζηδκ πνμηεζιέκδ πενίπηςζδ, TAE, Tris-Acetate, EDTA/ 40 mm Tris-Acetate, 1 mm EDTA ζε ph 8.3. Σμ πήηηςια παναζηεοάγεηαζ επίζδξ ζε TAE. Σα δείβιαηα DNA ακαιζβκφμκηαζ ιε νοειζζηζηυ δζάθοια θυνηςζδξ (loading buffer/50% βθοηενυθδ, 200 mm EDTA-pH 8.3 ηαζ 0,05% bromophenol blue) ηαζ εζζάβμκηαζ ζημ πήηηςια. Σμ δθεηηνζηυ πεδίμ εθανιυγεηαζ ζε έκηαζδ 1-10 V/cm πδηηχιαημξ ηαζ ημ DNA ιεηαηζκείηαζ πνμξ ημ εεηζηυ πυθμ θυβς ημο ανκδηζημφ ημο θμνηίμο. Ζ παναπάκς έκηαζδ ακαθένεηαζ ηονίςξ ζε πενζπηχζεζξ υπμο είκαζ επζεοιδηυξ μ ηαηά ημ δοκαηυκ πθδνέζηενμξ δζαπςνζζιυξ ηςκ ηιδιάηςκ DNA. Δάκ δεκ απαζηείηαζ ηέημζμξ ααειυξ θεπημιένεζαξ (ππ οπάνπεζ ζδιακηζηή δζαθμνά ιεβέεμοξ ηιδιάηςκ) ηυηε δ δθεηηνμθυνδζδ βίκεηαζ απυ ηδκ ανπή ηοπζηά ζηα 100 V. Ζ απμιυκςζδ εοεφβναιιςκ ηιδιάηςκ DNA ιεηά απυ δθεηηνμθμνδηζηυ δζαπςνζζιυ, πναβιαημπμζήεδηε ιε εηημιή ηδξ επζεοιδηήξ γχκδξ ημο πδηηχιαημξ οπυ θςηζζιυ οπενζχδμοξ θςηυξ παιδθήξ έκηαζδξ βζα ηδκ απμθοβή αθααχκ ζημ βεκεηζηυ οθζηυ ηαζ ηδκ απμιυκςζδ ημο οθζημφ ιε ημ ζφζηδια GeneJET Gel Extraction kit (#K0691, Fermentas). οκμπηζηά, ημ ζφζηδια πνδζζιμπμζεί έκα δζάθοια παμηνμπζηχκ παναβυκηςκ πνμηεζιέκμο κα δζαθφζεζ ημ πήηηςια ηαζ κα αολήζεζ ηδ ζοββέκεζα ημο DNA πνμξ ηδ ιειανάκδ δζμλεζδίμο ημο πονζηίμο (silicabased membrane/silica: silicon dioxide), πμο οπάνπεζ ζηδ ζηήθδ ηαεανζζιμφ DNA 53

75 ημο ζοζηήιαημξ. Ζ απμιυκςζδ μθμηθδνχκεηαζ ζε min ιε πμζμζηυ ακάηηδζδξ ηοπζηά 80%+ βζα ηιήιαηα DNA bp. Υνδζζιμπμζήεδηε επζπθέμκ ιέεμδμξ δθεηηνμέηθμοζδξ (electro-elution) ημο DNA ιέζα ζε ιειανάκδ δζαπίδοζδξ ζε ιμνθή ζςθήκα (dialysis tubing): εκ ζοκημιία δ πενζμπή ημο πδηηχιαημξ πμο ακηζζημζπεί ζημ επζεοιδηυ DNA απμηυπηεηαζ, ημπμεεηείηαζ ζηδ ιειανάκδ ιαγί ιε ιζηνή πμζυηδηα νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ δθεηηνμθυνδζδξ, δ ιειανάκδ ζθναβίγεηαζ ζηα δφμ ηδξ άηνα ηαζ ημ πενζεπυιεκμ DNA ελάβεηαζ απυ ηδκ αβανυγδ ιέζς δθεηηνμθυνδζδξ ζηα 80 V βζα min. Ζ πνυμδμξ ηδξ ελυδμο ημο DNA απυ ημ πήηηςια εθέβπεηαζ ηαηά δζαζηήιαηα ζε οπενζχδεξ θςξ ζδιεζχκεηαζ υηζ βζα ηδκ επζαεααίςζδ ηδξ πθδνυηδηαξ έηθμοζδξ ημο DNA, ημ πήηηςια εα πνέπεζ κα ααθηεί (staining) εη κέμο ιε EtBr, βζαηί ηαζ ημ EtBr, ςξ εεηζηά θμνηζζιέκμ, επίζδξ ελένπεηαζ απυ ημ πήηηςια ηαηά ηδκ δθεηηνμθυνδζδ. Όηακ μθμηθδνςεεί δ δζαδζηαζία, δ πμθζηυηδηα ακηζζηνέθεηαζ βζα 10 s, χζηε κα απμιαηνοκεεί ημ DNA απυ ηδ ιειανάκδ. Ζ πμζυηδηα οβνμφ πμο πενζαάθθεζ ημ πήηηςια ηαζ πθέμκ πενζέπεζ ημ DNA αθαζνείηαζ ηαζ ηαεανίγεηαζ ιε ηφηθμοξ θαζκυθδξ-πθςνμθμνιίμο. Ζ απμιυκςζδ μθμηθδνχκεηαζ ζοκμθζηά ζε ~3 h ηαζ ιε ηδκ παναπάκς ιεεμδμθμβία δ ηοπζηή απυδμζδ ήηακ ζοκήεςξ ημκηά ζημ 50%+. Αλίγεζ κα ζδιεζςεεί υηζ ιε πενζζζυηενμ θεπημιενή πνςηυημθθα (δζαθμνεηζημί πνυκμζ ηαζ έκηαζδ πεδίμο έηθμοζδξ ακάθμβα ιε ημ ιέβεεμξ ημο DNA) ιπμνεί κα ειθακίζεζ πμζμζηά ακάηηδζδξ ιέπνζ ηαζ 90% βζα ηιήιαηα DNA ιεβαθφηενα ημο 1 kb (Ausubel). Ζ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ κμοηθεσηχκ μλέςκ πναβιαημπμζείηαζ ηαηά ηδκ δθεηηνμθυνδζδ ιε πνήζδ δεζβιάηςκ-ιανηφνςκ βκςζηήξ πμζυηδηαξ ή ιε ηδ αμήεεζα ηδξ θςημιεηνζηήξ ζοζηεοήξ Nanodrop 1000 (Thermo Scientific). Ζ εηηίιδζδ ημο ιεβέεμοξ ηςκ ηιδιάηςκ DNA ζε γεφβδ αάζεςκ (bp: base pairs), ηαηά ηδκ δθεηηνμθυνδζδ, βίκεηαζ ιε ηδ πνήζδ ηςκ ιανηφνςκ ιμνζαημφ αάνμοξ θ2,3 ηαζ θ3. Ο θ2,3 πενζθαιαάκεζ ηα ηιήιαηα DNA πμο πνμηφπημοκ ιεηά απυ πέρδ ημο βμκζδζχιαημξ ημο θάβμο θ (lambda phage DNA/48502 bp) ιε ηα έκγοια πενζμνζζιμφ HincII(HindII) ηαζ HindIII, εκχ μ θ3 ηα ηιήιαηα ιεηά απυ ακηίζημζπδ πέρδ ιυκμ ιε ημ έκγοιμ HindIII (βι. ζην Παξάξηεκα/εηθ. Π1) Αλάιπζε, επεμεξγαζία ηνπ DNA, θισλνπνίεζε, in silico αλάιπζε Γζα ηδκ ακάθοζδ ηαζ ιμνζαηή ιδπακζηή ημο DNA πνδζζιμπμζμφκηαζ πενζμνζζηζηέξ εκδμκμοηθεάζεξ δζαθυνςκ ηαηαζηεοαζηχκ (NEB, Fermentas, Takara). Ζ αθαίνεζδ πνμελέπμκηςκ ιμκυηθςκςκ άηνςκ απυ ηα ηιήιαηα DNA, πμο εθελήξ εα 54

76 παναηηδνίγεηαζ ςξ άιαθοκζδ (blunting) ηιδιάηςκ DNA, πναβιαημπμζείηαζ ιε πνήζδ ηδξ Σ4 πμθοιενάζδξ (EP0061, Fermentas) ή ημο εναφζιαημξ Klenow ηδξ DNA πμθοιενάζδξ Η (EP0051, Fermentas) ηαζ δδιζμονβεί ιδ ημθθχδδ (ακαθενυιεκα επίζδξ ςξ ηοθθά ή θεία) άηνα. Με αάζδ ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή, δ δζαθμνά ηςκ πμθοιεναζχκ Σ4 ηαζ Klenow έβηεζηαζ ζηδκ 3 >5 δναζηζηυηδηα ελςκμοηθεάζδξ πμο δζαεέημοκ: δ T4 ειθακίγεζ ~200 θμνέξ ιεβαθφηενδ δναζηζηυηδηα ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ ηαηά πνμηίιδζδ βζα ηδκ άιαθοκζδ ηιδιάηςκ DNA ιε πνμελέπμκηα 3 ιμκυηθςκα άηνα (3 -overhangs). Καζ μζ δφμ ζοιπθδνχκμοκ (fill-in) πνμελέπμκηα 5 άηνα (5 -overhangs). Ζ απμθςζθμνοθίςζδ ηιδιάηςκ DNA βίκεηαζ ιε αθηαθζηή θςζθαηάζδ (Calf Intestine Alkaline Phosphatase: CIAP, EF0341, Fermentas). Ζ ζφκδεζδ ηιδιάηςκ DNA βζα ηθςκμπμίδζδ πναβιαημπμζείηαζ ιε ηδκ Σ4 DNA θζβάζδ (T4 ligase (EL0014, Fermentas)). ε υθεξ ηζξ πενζπηχζεζξ αημθμοεήεδηακ μζ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή. οβηεηνζιέκα, δ πμζυηδηα ημο ηιήιαημξ-θμνέα επζθέβεηαζ ζοκήεςξ κα είκαζ ιζηνυηενδ ή ίζδ ηςκ 50 ng ηαζ ημο ηιήιαημξ πνμξ εζζαβςβή πενίπμο 3 6 θμνέξ ιεβαθφηενδ απυ πθεονάξ ιμνζαηυηδηαξ. ε ηάεε πενίπηςζδ πνδζζιμπμζείηαζ 1 u (unit: ιμκάδα) εκγφιμο ακά ακηίδναζδ ηαζ επζπθέμκ πνυζεεηδ πμζυηδηα ATP (1 mm) ζε ηεθζηυ υβημ 10 ιl. Σμ ATP είκαζ απαναίηδημ βζα ηδκ ακηίδναζδ ηαζ πενζέπεηαζ ζημ ακηίζημζπμ νοειζζηζηυ δζάθοια. Ζ επζπθέμκ πμζυηδηα είκαζ βζα κα ηαθφρεζ ηοπυκ απχθεζεξ θυβς αθθεπάθθδθςκ ηφηθςκ ρφλδξαπυρολδξ ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ. ε πενίπηςζδ ζφκδεζδξ θείςκ ηιδιάηςκ πνδζζιμπμζείηαζ επζπθέμκ PEG % w/v, δεδμιέκμο υηζ αεθηζχκεζ ηδκ απυδμζδ ηδξ ζφκδεζδξ, ιέζς ηδξ αφλδζδξ ηδξ εκενβμφ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ ειπθεηυιεκςκ ιαηνμιμνίςκ ηαζ ακηζδναζηδνίςκ. Ζ ακηίδναζδ επςάγεηαζ ζημοξ 22 μ C βζα 1-2 h ή ζημοξ 16 μ C βζα 16 h (μθμκφηηζα επχαζδ). ηδ ζοκέπεζα ημ ζφκμθμ ημο υβημο ηδξ ακηίδναζδξ πνδζζιμπμζείηαζ βζα ημ πδιζηυ ιεηαζπδιαηζζιυ ηοηηάνςκ DH5a. Ζ in silico ακάθοζδ ημο DNA πναβιαημπμζείηαζ ιε ημ πνυβναιια Blast ημο μνβακζζιμφ NCBI (Altschul et al., 1990) ηαζ ημ πνυβναιια BioEdit (Hall, 1999). Σμ ηεθεοηαίμ πνδζζιμπμζήεδηε επζπθέμκ ηαζ βζα ηδκ ηαηαζηεοή βεκεηζηχκ πανηχκ. 2.6 Πλαζμιδιακοί θοπείρ έκθπαζηρ και μεηαθοπάρ γενεηικού ςλικού Οζ πθαζιζδζαημί θμνείξ ptvγlef8 (εζη. 2.1/A, πνυηεζηαζ βζα ημκ θμνέα ptv#2 απυ (Farrell, 1998)), pc6600 (Lu et al., 1998), pea ηαζ peia.myc (Douris V et al., 2006; 55

77 A Farrell, 1998; Invitrogen, 2004; Lu et al., 1998) ηαζ pfastbac dual (pfbd; Invitrogen 2004) έπμοκ πενζβναθεί αθθμφ. Γζα ηδκ έηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 πνδζζιμπμζήεδηακ ηα ακηίζημζπα ακμζηηά πθαίζζα ακάβκςζδξ απυ ημοξ ζμφξ BmNPV [Bmlef8 παναηηδνζγυιεκμ εθελήξ lef8, Gene ID ; (Farrell, 1998)] ηαζ Autographa californica MNPV (Aclef8, Gene ID ; απμιμκχεδηε ιέζς ακηίδναζδξ PCR απυ ημ βμκζδίςια ημο ζμφ AcMNPV, ςξ ηιήια πενζμνζζιμφ BamHI NotI), ηαεχξ ηαζ απυ ηδκ παναζζηζηή ζθήηα Cotesia congregata [Cclef8, GenBank FM ; (Bezier et al., 2009)]. Σμ πθαίζζμ ακάβκςζδξ Aclef8 είκαζ 98% ηαοηυζδιμ (Gomi et al., 1999) ιε ημ lef8, ζε ακηζδζαζημθή ιε ημ ελεθζηηζηά απμιαηνοζιέκμ Cclef8 πμο δεκ πανμοζζάγεζ 5609 SacII ScaI ' lef8 γεηηνληθή πλευρική πεξηνρή περιοχή ( ) ptv 1 Δlef8 > 7016 bp fabaa > 7042 bp ptvδlef bp ptvfabaa bp ' 5 lef8 πλευρική γεηηνληθή πεξηνρή περιοχή ( ) ScaI SacI ' lef8 πλευρική περιοχή ( ) FseI 2668 AvrII 2669 BglII 2675 AflII 2679 AscI 2685 ptvγlef8 ptvfabaa 3' lef8 πλευρική περιοχή B ( ) ScaI MluI ' lef8 πλευρική γεηηνληθή περιοχή πεξηνρή ( ) XcmI 1754 ScaI 1773 MluI 7734 XcmI ptva.yfp/zeo bp bgh pa 3 3' lef8 lef8 γεηηνληθή πλευρική πεξηνρή περιοχή ( ) MluI e-yfp BamHI 3736 EM7 Zeo actin 56

78 Δηθόλα 2.1 A. Απεζηυκζζδ ηςκ πθαζιζδίςκ ptvγlef8 ηαζ ptvfabaa. Οζ δφμ θμνείξ δζαθένμοκ ιυκμ ζηδκ πανμοζία ημο πμθοζοκδέζιμο ζημ ptvfabaa πμο ακηζηαεζζηά ηδ εέζδ ακαβκχνζζδξ SacI, ημο ptvγlef8. Οζ βεζημκζηέξ πενζμπέξ ημο βμκζδίμο lef8 ακηζζημζπμφκ ζηζξ ζοκηεηαβιέκεξ ηαζ (ιε αάζδ ημ πάνηδ ημο ζηεθέπμοξ T3 ημο ζμφ BmNPV (Gomi et al., 1999)) ακηίζημζπα βζα ηδκ 5 ηαζ 3 πενζμπή ηαζ ζημ ζζηυ βμκζδίςια βεζηκζάγμοκ άιεζα ιε ημ πθαίζζμ ακάβκςζδξ lef8. διεζχκμκηαζ επζπθέμκ εέζεζξ εκγφιςκ πενζμνζζιμφ πμο ακαθένμκηαζ ζημ ηείιεκμ. B. Απεζηυκζζδ ημο θμνέα-ιεηαθμνάξ ptva.yfp/zeo. διεζχκμκηαζ ηα επζιένμοξ ζοζηαηζηά ημο εκεέιαημξ A.yfp/zeo, μζ βεζημκζηέξ πενζμπέξ ημο βμκζδίμο lef8, ηαεχξ ηαζ μζ εέζεζξ ακαβκχνζζδξ ηςκ πενζμνζζηζηχκ εκγφιςκ, πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ παναβςβή ηςκ εοεφβναιιςκ θμνέςκ ακαζοκδοαζιμφ (βιέπεηε 2.5) ηαζ ηδκ επζαεααίςζδ ημο ααηιζδίμο Γlef8. μιμζυηδηα ιε ημ lef8. Ο θμνέαξ-ιεηαθμνάξ ptva.yfp/zeo (εζη. 2.1/B) ααζίζηδηε ζημκ θμνέα ptvγlef8 (εζη. 2.1/A), μ μπμίμξ πενζέπεζ ~2 kbp απυ ηζξ 5 - ηαζ 3 - βεζημκζηέξ (flanking) πενζμπέξ ημο βμκζδίμο lef8 ηαζ ζοβηεηνζιέκα ηζξ πενζμπέξ ηαζ (μζ ζοκηεηαβιέκεξ είκαζ ααζζζιέκεξ ζημ πάνηδ ημο ζηεθέπμοξ T3 ημο ζμφ BmNPV (Gomi et al., 1999), ηαζ δζαπςνίγμκηαζ απυ ιία, ιμκαδζηή ζημ θμνέα, εέζδ πενζμνζζιμφ SacI. Μεηά απυ πέρδ ιε ημ έκγοιμ SacI ηαζ άιαθοκζδ ηςκ άηνςκ πμο πνμέηορακ, εζζήπεδ πμθοζφκδεζιμξ πμο πενζέπεζ εέζεζξ ακαβκχνζζδξ βζα ηα έκγοια AscI ηαζ AvrII (ηαζ επζπθέμκ BglII, FseI ηαζ AflII) δζαιμνθχκμκηαξ ημκ θμνέα ptvfabaa (εζη. 2.1/A). Ζ ηαζέηα έηθναζδξ A.yfp, πμο απμηεθείηαζ απυ ημκ οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ Α3 ημο Bombyx mori, ηδκ ηςδζηή πενζμπή ημο βμκζδίμοιάνηονα yfp ηαζ ηδκ πενζμπή πμθοαδεκοθίςζδξ ημο βμκζδίμο bgh (Leonard E. Post et al., 1992), εζζήπεδ ςξ ηιήια AscI, εκχ δ ηαζέηα ακεεηηζηυηδηαξ ζηδ γεμιοηίκδ εζζήπεδ ςξ ηιήια AvrII βζα ηδκ ηαηαζηεοή ημο ηεθζημφ ptva.yfp/zeo (εζη. 2.1/B). Ζ δμιή ηςκ δζαθυνςκ πθαζιζδζαηχκ θμνέςκ εθέβπεηαζ ιε ακηζδνάζεζξ πενζμνζζιμφ, PCR ηαζ δθεηηνμθυνδζδ ηςκ ακηίζημζπςκ πνμσυκηςκ, ηαεχξ ηαζ ιε αθθδθμφπδζδ ηαηάθθδθςκ πενζμπχκ ημοξ Φνξείο έθθξαζεο γηα δηάζσζε ηνπ βαθκηδίνπ Γlef8 Οζ θμνείξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ έηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 ααζίζηδηακ ζημκ οπμηζκδηή ημο βμκζδίμο hsp70 (heat shock protein 70) ηδξ Drosophila melanogaster, ζημκ οπμηζκδηή ηδξ ηοηηανμπθαζιαηζηήξ αηηίκδξ A3 ημο B. mori ή ζε θοζζηέξ αθθδθμοπίεξ ημο ζμφ BmNPV 5 ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ ημο βμκζδίμο lef8, πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ςξ θοζζηέξ αθθδθμοπίεξ οπμηζκδηή ημο βμκζδίμο (εζη. 2.2/A,B,D ακηίζημζπα). Ο οπμηζκδηήξ hsp70 είκαζ εενιμεπαβυιεκμξ (Rapp et al., 1998) ηαζ επάβεηαζ ζζπονά ιεηά απυ εενιζηυ ζμη ζημοξ 42 μ C, αθθά πανμοζζάγεζ επζπθέμκ ηαζ ζοζηαηζηή 57

79 A hsp70 Myc B mac promoter phsp70.myc-lef bp mac3.lef bp sv40t lef8 ORF sv40t lef8 ORF Δηθόλα 2.2 Απεζηυκζζδ ηςκ θμνέςκ έηθναζδξ ηςκ πνςηεσκχκ LEF8 (A, B, D) ηαζ ORF40 (C, D). A) Φμνέαξ ααζζζιέκμξ ζημκ οπμηζκδηή ημο βμκζδίμο hsp70 ηδξ Drosophila ηαζ ημ ζδιαζιέκμ πθαίζζμ ακάβκςζδξ myc-lef8. B) Φμνείξ ααζζζιέκμζ ζε νοειζζηζηέξ αθθδθμοπίεξ ημο βμκζδίμο ηδξ αηηίκδξ Α3 ημο B. mori. (από άλω πξνο θάηω) mac3.lef8: δζαεέηεζ ημ ηιήια -133/+42 ημο βμκζδίμο αηηίκδξ. pea.myclef8: ααζίγεηαζ ζημ ζφζηδια pea ηαζ δζαεέηεζ ιία πθήνδ ηαζέηα αηηίκδξ, ιε αθθδθμοπίεξ οπμηζκδηή (actinp) ηαζ θήλδξ ηδξ ιεηαβναθήξ (actint), πμο επάβεηαζ απυ ημκ ζζηυ εκζζποηή (enhancer) hr3. peia.myc-lef8: ααζίγεηαζ ζημ ζφζηδια peia πμο δζαεέηεζ υ,ηζ ηαζ ημ pea ηαζ επζπθέμκ ιία πθήνδ ηαζέηα έηθναζδξ ηδξ ζζηήξ πνςηεΐκδξ IE1, πμο επάβεζ πεναζηένς ηδκ έηθναζδ. C) Φμνέαξ έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ ORF40 ααζζζιέκμξ ζημ ζφζηδια pea. Ακηίζημζπδ δμιή έπμοκ ηαζ μζ θμνείξ έηθναζδξ ζδιαζιέκδξ ORF40 ιε ηδκ αθθδθμοπία ζήιακζδξ myc άιζκμ- ηαζ ηαναμλοηεθζηά ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ orf40. sv40t: αιιεινπρία ιήμεο ηεο κεηαγξαθήο ηνπ ηνύ sv40, ie1p/t: αιιεινπρίεο ηνπ ππνθηλεηή θαη ιήμεο ηεο κεηαγξαθήο, ie1 ORF: αλνηθηό πιαίζην αλάγλωζεο ηνπ ηηθνύ γνληδίνπ ie lef8 ORF 6567 actint pea.myc-lef bp myc tag actinp hr3 ActinT C actin T lef-8 ORF orf pea.orf bp Myc peia.myc-lef bp ie1t actinp hr3 ActinP 7921 hr ie1p ie1 ORF

80 (constitutive) έηθναζδ ζηα ηφηηανα Bm5, ίζδ πενίπμο ιε ημ 70% ηςκ ακηίζημζπςκ επζπέδςκ έηθναζδξ ημο οπμηζκδηή ηδξ ηοηηανμπθαζιαηζηήξ αηηίκδξ A3 ημο B. mori (βι. ζηελ παξάγξαθν 3.7.4). Ο θμνέαξ phsp70.sv40 πενζέπεζ έκα ηιήια XhoI KpnI 0.43 kbp ημο οπμηζκδηή hsp70 (εθήθεδ απυ ημκ θμνέα pp[sopd] (Benedict et al., 1994) ηαζ ημπμεεηήεδηε ζηζξ εέζεζξ XhoI EcoRV, ιεηά απυ άιαθοκζδ ημο άηνμο KpnI) ηαζ έκα ηιήια NotI SacII 0.13 kbp απυ ηδκ πενζμπή πμθοαδεκοθίςζδξ ημο ζμφ SV40 (ηθςκμπμζήεδηε ιέζς PCR απυ ημκ θμνέα pcdna3, Invitrogen), ζε οπυααενμ pbluescript (pbs). Σμ πθήνεξ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ ημο βμκζδίμο lef8 ιεηαθένεδηε απυ ημκ θμνέα peia.lef8 (Farrell, 1998) ςξ έκα ηιήια BamHI NotI 2.7 kbp ζηζξ ακηίζημζπεξ εέζεζξ ημο θμνέα phsp70.sv40 βζα ηδκ ηαηαζηεοή ημο ηεθζημφ θμνέα έηθναζδξ phsp70.lef8 (εζη. 2.2/A). Οζ θμνείξ έηθναζδξ pea ηαζ peia πενζέπμοκ επζπθέμκ βεκεηζηέξ αθθδθμοπίεξ ημο ζμφ BmNPV, πμο εκζζπφμοκ ηδκ έηθναζδ ηαηά 100 ηαζ 5000 θμνέξ ακηίζημζπα, ζε ζπέζδ ιε ημ ιειμκςιέκμ οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ (Douris V et al., 2006). Γζα ηδκ tr. 5' 5 lef8 πλευρική γεηηνληθή περιοχή πεξηνρή ( ) orf40-tr pplef8.888.lef bp D actint lef8 ORF Δηθόλα 2.2 D) Φμνείξ έηθναζδξ LEF8 ααζζζιέκμζ ζε θοζζηέξ νοειζζηζηέξ αθθδθμοπίεξ ημο βμκζδίμο lef8 ηαζ ηδκ αθθδθμοπία θήλδξ ηδξ ιεηαβναθήξ actint. (άλω) pplef8 888.lef8: δζαεέηεζ ηδκ 5 πθεονζηή πενζμπή lef (888 bp), δ μπμία πενζθαιαάκεζ ηιήια ημο πθαζζίμο ακάβκςζδξ orf40 ημ ιέβεεμξ ημο οπυθμζπμο πθαζζίμο ακάβκςζδξ orf40 ζδιεζχκεηαζ ιε βηνζ πνχια ηαζ αθμνά ζηα 99 ηεθεοηαία κμοηθεμηίδζα (tr.: truncated). (δεμηά) pplef8 tv.myc-lef8: εδχ πνδζζιμπμζείηαζ μθυηθδνδ δ 5 πθεονζηή πενζμπή lef8 ημο θμνέα ptvγlef8, ηαεχξ ηαζ ζδιαζιέκμ πθαίζζμ ακάβκςζδξ lef8 (myc-lef8). Ο εκ θυβς θμνέαξ ιπμνεί κα πανάβεζ LEF8 ηαζ ORF40 οπυ ηςκ έθεβπμ ηςκ θοζζηχκ οπμηζκδηχκ ημοξ. actint pplef8tv.myc-lef bp lef8 ORF 5' 5 lef8 πλευρική γεηηνληθή περιοχή πεξηνρή ( ) orf40 myc 59

81 ηαηαζηεοή ημο θμνέα peia.myc-lef8 (εζη. 2.2/B), δ ηςδζηή πενζμπή lef8 απμιμκχεδηε απυ ημ πθαζιίδζμ phsp70.lef8 ςξ ηιήια BamHI-NotI ηαζ εζζήπεδ ζηζξ ακηίζημζπεξ εέζεζξ ημο θμνέα peia.myc (Douris V et al., 2006). Μεηά ηδ ιεηαθμνά δζαηδνείηαζ ημ πθαίζζμ ακάβκςζδξ ημο lef8 ηαζ δ αθθδθμοπία myc ζοκζζηά ημ 5 άηνμ ηδξ ακαζοκδοαζιέκδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ myc-lef8. Ο θμνείξ phsp70.myc-lef8 (εζη. 2.2/A) ηαζ pea.myc-lef8 (εζη. 2.2/B) ηαηαζηεοάζηδηακ ιε ηδκ εζζαβςβή ημο SmaI NotI myc-lef8 ηιήιαημξ απυ ημκ θμνέα peia.myc-lef8 ζηζξ ακηίζημζπεξ εέζεζξ ηςκ θμνέςκ pea ηαζ phsp70.sv40. Με ηδ πνήζδ ηδξ παναπάκς δζαδζηαζίαξ ηαηαζηεοήξ ελαζθαθίγεηαζ υηζ ημ ίδζμ αηνζαχξ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ, ζδιαζιέκμ ή ιδ, ημο βμκζδίμο lef8 πνδζζιμπμζείηαζ ζε υθμοξ ημοξ θμνείξ. Ο θμνέαξ mac3 (εζη. 2.2/B) πενζέπεζ ημ ηιήια -133/+42 ημο βμκζδίμο ηδξ ηοηηανμπθαζιαηζηήξ αηηίκδξ A3 ημο B. mori ηαζ απμηεθεί ιία ιζηνυηενμο ιεβέεμοξ έηδμζδ (παναηηδνζγυιεκδ ςξ mac3: mini Actin 3) ημο πθήνμοξ οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ, υπςξ αοηυξ πνδζζιμπμζείηαζ ζημοξ θμνείξ pea ηαζ peia (-768/+576 ημο βμκζδίμο ηδξ αηηίκδξ). Ο οπμηζκδηήξ mac3 ειθακίγεζ απυδμζδ ~15% ημο πθήνμοξ οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ ηαζ ηαηαζηεοάζηδηε ζηα πθαίζζα ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ (βι. παξάγξαθν 2.4.5). Οζ θμνείξ πμο πνδζζιμπμζμφκ θοζζηέξ ζζηέξ αθθδθμοπίεξ οπμηζκδηή ημο lef8 ηαηαζηεοάζηδηακ ιε αάζδ ηδκ 5 βεζημκζηή πενζμπή ημο πθαζιζδίμο ptvγlef8 (αθ. εζη. 2.1). Σμ ηιήια ScaI BglII ημο ptvfabaa, πμο πενζθαιαάκεζ ηδκ πενζμπή 1 έςξ ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ lef8 ηθςκμπμζήεδηε ζηζξ εέζεζξ πενζμνζζιμφ SmaI BamHI εκυξ pbs πθαζιζδίμο, ζημ μπμίμ είπε πνμδβδεεί εζζαβςβή ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ lef8 ζοκδεδειέκδξ ιε ηδκ αθθδθμοπία θήλδξ ηδξ ιεηαβναθήξ ημο βμκζδίμο ηδξ ηοηηανμπθαζιαηζηήξ αηηίκδξ A3 ημο B. mori (lef8.actint). Με αοηυκ ημκ ηνυπμ ηαηαζηεοάζηδηε μ θμνέαξ έηθναζδξ pplef8 888.lef8 (εζη. 2.2/D), ζημκ μπμίμ πναηηζηά ακαπανάβεηαζ δ θοζζηή δμιή ημο βμκζδίμο lef8, ιε ελαίνεζδ ηζξ θοζζηέξ αθθδθμοπίεξ θήλδξ ηδξ ιεηαβναθήξ ηαζ πμθοαδεκοθίςζδξ, μζ μπμίεξ ακηζηαηαζηάεδηακ απυ εηενυθμβεξ (actint), χζηε κα πενζμνζζηεί δ μιμθμβία ημο θμνέα έηθναζδξ πνμξ ημ ζζηυ βμκζδίςια. διεζχκεηαζ υηζ ημ ηιήια 1 έςξ 888 ακηζζημζπεί ζηδκ πενζμπή ηαζ ςξ εη ημφημο πενζέπεζ ηιήια ιυκμ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ orf40, ημ μπμίμ ακηζζημζπεί ζηδκ πενζμπή Ακηίζημζπα ηαηαζηεοάζηδηε ηαζ θμνέαξ πμο θένεζ μθυηθδνδ ηδκ 5 βεζημκζηή πενζμπή lef8 ημο θμνέα ptvγlef8 ςξ «οπμηζκδηή» ημο lef8. οβηεηνζιέκα ημ ηιήια SmaI SacII ημο θμνέα peia.myc-lef8, πμο πενζέπεζ ηδκ αθθδθμοπία myc-lef8.actint 60

82 ζοκδέεδηε ζηζξ εέζεζξ SacI SacII ημο θμνέα ptvγlef8. Σμ ηεθζηυ πθαζιίδζμ, pplef8 TV.myc-lef8 (εζη. 2.2/D), θένεζ μθυηθδνμ ημ βμκίδζμ orf40, ηαεχξ ηαζ ημ lef8 πςνίξ ηζξ θοζζηέξ αθθδθμοπίεξ πμθοαδεκοθίςζδξ ηαζ ςξ εη ημφημο ζοκζζηά θμνέα έηθναζδξ ηυζμ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8, υζμ ηαζ ηδξ ORF40 ηαζ ηςκ δφμ οπυ ημκ έθεβπμ ηςκ θοζζηχκ οπμηζκδηχκ ημοξ. Ζ ηαηαζηεοή ηςκ πθαζιζδζαηχκ θμνέςκ έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ ORF40 ααζίζηδηε ζημ θμνέα pea. Καηαζηεοάζηδηακ ζοκμθζηά ηνεζξ θμνείξ βζα ηδκ έηθναζδ ακηίζημζπα ηδξ θοζζηήξ, ηδξ αιζκμ- ηαζ ηδξ ηαναμλοηεθζηά ζδιαζιέκδξ πνςηεΐκδξ ιε επίημπμ Myc. Γζα ημ ζημπυ αοηυ ημ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ ORF40 απμιμκχεδηε ιέζς ακηίδναζδξ PCR ςξ ηιήια BamHI NotI (βζα ηδ θοζζηή ηαζ αιζκμ-ζδιαζιέκδ έηδμζδ) ή BamHI (βζα ηδκ ηαναυλο-ζδιαζιέκδ έηδμζδ), πνδζζιμπμζχκηαξ ημ ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο ςξ οπυζηνςια (template) ιε ηαηάθθδθμοξ εηηζκδηέξ (Bm40, Πίκαηαξ 2.2) ηαζ ημ ακηζδναζηήνζμ HF Platinum Taq (Life Technologies), πμο δζαεέηεζ δναζηζηυηδηα επζδζυνεςζδξ. ε υθεξ ηζξ πενζπηχζεζξ δζαηδνήεδηε δ θοζζηή αθθδθμοπία -1 ιε -4 ακμδζηά ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ (AATT), ιζαξ ηαζ είκαζ πζεακυ κα πενζέπεζ ηδκ αθθδθμοπία ηφπμο Kozak (Kozak, 1986) ημο βμκζδίμο (Αδεκίκδ ζηδ εέζδ -3). διεζχκεηαζ υηζ δ εκ θυβς αθθδθμοπία είκαζ ζδιακηζηή βζα ηδ θοζζηή ηαζ ηαναμλο-ζδιαζιέκδ έηδμζδ, αθθά υπζ ηαζ βζα ηδκ άιζκμ-ζδιαζιέκδ, υπμο μ θμνέαξ pea.myc δζαεέηεζ ηδ δζηή ημο αθθδθμοπία Kozak. Μεηά απυ ηαηάθθδθδ πέρδ, ηα απμιμκςιέκα πθαζζία ακάβκςζδξ orf40 ζοκδέεδηακ ζημοξ θμνείξ pea, pea.n-myc ή pea.c-myc (Douris et al., 2006), βζα κα ηαηαζηεοαζημφκ μζ ακηίζημζπμζ θμνείξ έηθναζδξ pea.orf40 (εζη. 2.2/c), pea.myc-orf40 ηαζ pea.orf40-myc. Γιάζυζη ηος βακμιδίος Γlef8 με εξυγενή παποσή ηηρ ππυηεΐνηρ LEF8 ή/και ORF40 Κφηηανα Bm5 δζαιμθφκεδηακ ιε ημ ααηιίδζμ Γlef8 ηαζ ηαεέκακ απυ ημοξ θμνείξ έηθναζδξ ηςκ πνςηεσκχκ LEF8 ή/ηαζ ORF40 ηαζ ηα απμηεθέζιαηα εθέβπμκηακ ιέζς ιζηνμζημπζηήξ παναηήνδζδξ ή qpcr βζα δζάζηδια 1-2 εαδμιάδςκ. ε δζάθμνα πνμκζηά ζδιεία, οπενηείιεκμ απυ ηζξ παναπάκς ηαθθζένβεζεξ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδ ιυθοκζδ κέςκ ηαθθζενβεζχκ Bm5, ςξ ιέζμ εθέβπμο ηδξ παναβςβήξ ζμζςιάηςκ, ζηδ αάζδ ηδξ παναβςβήξ YFP απυ ημ ζζηυ βμκζδίςια. Πνζκ ηδκ εθανιμβή, ημ οπενηείιεκμ θοβμηεκηνήεδηε (12 krpm βζα 3 min ζε RT) ηαζ ιυκμ ημ ακχηενμ 1/3 61

83 πνδζζιμπμζήεδηε, ηαηυπζκ ακαννυθδζδξ ζε ανβυ νοειυ, χζηε κα απμθεοπεεί ηοπυκ ιεηαθμνά ηοηηάνςκ Φνξείο κεηαθνξάο θαη έθθξαζεο γηα ππνθαηάζηαζε θαη δηάζσζε ηνπ βαθκηδίνπ Γlef8 κέζσ νκόινγνπ αλαζπλδπαζκνύ Οζ θμνείξ ιεηαθμνάξ απμηεθμφκ πανάβςβα ηςκ θμνέςκ ptvγlef8 (εζη. 2.1/A, (Farrell, 1998)) ηαζ pc6600 (εζη. 3.1/A, (Lu et al., 1998)). Οζ θμνείξ, πανάβςβα ημο ptvγlef8 πανέπμοκ εζδζηυηδηα ζηυπεοζδξ πνμξ ημ βεκεηζηυ ηυπμ lef8, εκχ μζ θμνείξ, πανάβςβα ημο pc6600 ηαηεοεφκμοκ ηδκ εκζςιάηςζδ εκεειάηςκ ζηδ εέζδ 65745, ιεηαλφ ηςκ βμκζδίςκ p15 ηαζ p95 (εζη. 2.3/A ηαζ 3.13). Ζ εέζδ αοηή εεςνείηαζ ςξ «μοδέηενδ» πενζμπή ιε δοκαηυηδηα εκζςιάηςζδξ ιεβάθςκ ελςβεκχκ ηιδιάηςκ DNA πςνίξ ηδκ ειθάκζζδ επζπηχζεςκ ζηδκ ακάπηολδ ηαζ παεμβμκζηυηδηα ημο ακηίζημζπμο ααηηνμσμφ (Lu et al., 1998). Γζα ηδκ ηαηαζηεοή ηςκ παναβχβςκ ημο ptvγlef8, μ θμνέαξ ptvγlef8 εοεοβναιιίζηδηε ζηδ ιμκαδζηή εέζδ πενζμνζζιμφ SacI, αιαθφκεδηε ηαζ απμθςζθμνοθζχεδηε ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ηάεε έκεεια (εζη. 2.3/B) ηθςκμπμζήεδηε χζηε κα πνμηφρεζ μ ακηίζημζπμξ θμνέαξ ακαζοκδοαζιμφ. Γζα ηδκ ηαηαζηεοή ηςκ παναβχβςκ ημο pc6600, αημθμοεήεδηε δ ίδζα δζαδζηαζία ιε ηδ δζαθμνά υηζ δ εοεοβνάιιζζδ ημο ιδηνζημφ θμνέα έβζκε ζηδ ιμκαδζηή εέζδ πενζμνζζιμφ StuI. A B myc-lef8 ORF myc-aclef8 ORF p pc bp p15 StuI 3903 (65745) τμήμα ClaI 6,6kb ( ) 9702 bp 9702 bp 9702 bp actinp hsp70 cclef8 ORF lef8 ORF lef8 lef8 ORF 3' flank lef8 3' flank Δηθόλα 2.3 A. Απεζηυκζζδ ημο πθαζιζδίμο pc6600. διεζχκεηαζ ημ ηιήια ClaI ~6.6 kbp απυ ημκ ζυ BmNPV (πενζμπή ), πμο πανέπεζ ηδκ απαναίηδηδ hsp70 μιμθμβία πνμξ ημ βμκζδίςια ημο ζμφ. Ζ μιμθμβία αοηή επζηνέπεζ ηδ «ζηυπεοζδ» ηςκ εκεειάηςκ, πμο ανίζημκηαζ 9702 ζηδ εέζδ bp πενζμνζζιμφ StuI (ακηζζημζπεί lef8 3' flank ζηδ εέζδ ημο ζζημφ βμκζδζχιαημξ), ζηδκ πενζμπή ιεηαλφ ηςκ βμκζδίςκ p15 ηαζ p95. B. Δκεέιαηα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ςξ οπμηαηαζηάηεξ ημο ακμζηημφ actinp πθαζζίμο ακάβκςζδξ ή/ηαζ βμκζδίμο lef8 ακηζηαεζζηχκηαξ 9702 bp ηδκ αθθδθμοπία A.yfp/zeo ζημ ααηιίδζμ Γlef8. sv40t Γζα ημ ζημπυ αοηυ ηθςκμπμζήεδηακ ζηδ lef8 εέζδ 3' flanksaci ημο πθαζιζδίμο ptvγlef8 (βιέπεηε εηθ. 2.1/a). Σμ hsp70.lef8 πνδζζιμπμζήεδηε επζπθέμκ ηαζ ιε ημ θμνέα pc6600. Σμ hsp70 ζφιαμθμ δδθχκεζ εκεέιαηα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ηαζ ηαηά ηζξ δφμ ηαηεοεφκζεζξ. bght lef8 3' flank 62 bght TV2 N-myc sv40t lef8 TV2 N-myc lef8 TV2 N-myc B lef8 5' fl TV2 N-myc lef8 5 TV2 N-myc lef8 sv40t

84 διεζχκεηαζ υηζ δ πέρδ ιε StuI ηέικεζ ηδκ πενζμπή (ζοκηεηαβιέκεξ ζημ πάνηδ ημο ζηεθέπμοξ T3) ημο πθαζιζδίμο ζηδ εέζδ ημκ θμνέα ptvγlef8 εζζήπεδζακ ηα εκεέιαηα myc-lef8 (ηιήια SmaI NotI απυ ημ πθαζιίδζμ peia.myc-lef8), myc-aclef8 (ηιήια SmaI NotI απυ ημκ θμνέα pea.myc-aclef8), cclef8 [ηθςκμπμζήεδηε ιέζς PCR, ςξ ηιήια BamHI-NotI, απυ ααηηδνζαηά ηεπκδηά πνςιμζχιαηα, πμο πενζέπμοκ ηιήιαηα ημο βμκζδζχιαημξ ηδξ Cotesia congregata (εοβεκζηή πνμζθμνά ημο Γν. Jean-Michel Drezen, Πακεπζζηήιζμ ηδξ Tours, Γαθθία)], hsp70.lef8.sv40 (απμιμκχεδηε ςξ ηιήια ApaI SacI απυ ημ θμνέα phsp70.lef8), A.lef8.bgh (πενζέπεζ ηδκ ηςδζηή πενζμπή lef8 απυ ημ θμνέα phsp70.lef8 πμο ηθςκμπμζήεδηε ςξ ηιήια BamHI NotI ζηδκ ηαζέηα Actin.bgh ηδκ ίδζα πμο πνδζζιμπμζείηαζ ζηδκ αθθδθμοπία A.yfp.bgh. Ζ κέα ηαζέηα A.lef8 απμιμκχεδηε εκ ζοκεπεία ςξ ηιήια AscI). Όθα ηα εκεέιαηα οπέζηδζακ άιαθοκζδ πνζκ ηδκ εζζαβςβή ημοξ ζημοξ ακηίζημζπμοξ θμνείξ ακαζοκδοαζιμφ. Ζ εθθεζιιαηζηή ηςδζηή πενζμπή t-cclef8 ηαηαζηεοάζηδηε ιε πέρδ ημο θμνέα ptvcclef8 ιε ημ έκγοιμ AsuII, πμο ηυαεζ ηδκ ηςδζηή πενζμπή Cclef8 ζηζξ εέζεζξ 377 ηαζ 3123 (εζη. 2.4). Ζ επακαηοηθμπμίδζδ ημο θμνέα, ιεηά ηδκ απμιάηνοκζδ ηδξ εζςηενζηήξ πενζμπήξ ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ Cclef8, δζαιυνθςζε ημκ θμνέα ptvt-cclef8. Ζ εθθεζιιαηζηή ηςδζηή πενζμπή t-cclef8 απμηεθείηαζ απυ ηα ηιήιαηα ηαζ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ Cclef8, ηαεχξ ηαζ απυ ηα 79 πθδζζέζηενα κμοηθεμηίδζα ηδξ 3 βεζημκζηήξ πενζμπήξ lef8 ημο θμνέα ακαζοκδοαζιμφ. Σα ηεθεοηαία πνμζηέεδηακ θυβς ηδξ ακαίνεζδξ ημο θοζζημφ ηςδζημκίμο θήλδξ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ Cclef8 ηαηά ηδκ αθαίνεζδ ημο παναπάκς εζςηενζημφ ηιήιαημξ ηαζ Cclef8 AsuII BstBI 3123 AsuII BstBI AsuII BstBI 3123 AsuII BstBI t-cclef bp AsuII BstBI ~out bp Cclef8 Δηθόλα 2.4 Καηαζηεοή ηδξ εθθεζιιαηζηήξ ιμνθήξ t-cclef8 ~out (ηάης) απυ ημ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ Cclef8 (πάκς), ιε πνήζδ ηδξ πενζμνζζηζηήξ ~out εκδμκμοηθεάζδξ AsuII. διεζχκμκηαζ μζ εέζεζξ ακαβκχνζζδξ ημο εκγφιμο ζημ παηνζηυ ηαζ εθθεζιιαηζηυ ακμζηηυ πθαίζζμ. Ζ πενζμπή απμιαηνφκεδηε ηαζ ηα εκαπμιείκακηα ηιήιαηα (1-377 ηαζ ) εκχεδηακ Cclef8 ακαζοκεέημκηαξ ηδκ πενζμπή ακαβκχνζζδξ 468 bp AsuII (377). Με ιπθε πνχια ζδιεζχκεηαζ ημ επζπθέμκ ηιήια πμο «πνμζηέεδηε» θυβς ημο κέμο ηςδζηυκζμο θήλδξ. 63 1

85 ηδκ επακαηοηθμπμίδζδ. Σμ κέμ ηςδζηυκζμ θήλδξ TAA ανίζηεηαζ ζηδ εέζδ ηδξ 3 ιδ ιεηαθναγυιεκδξ πενζμπήξ ημο βμκζδίμο lef8. Γιάζυζη ηος βακμιδίος Γlef8 μέζυ ομόλογος αναζςνδςαζμού και παπαγυγή ηηρ ππυηεΐνηρ LEF8 από ηο γονιδίυμα ηος βακμιδίος Ζ εκδμβεκήξ πανμπή ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 παναβςβή ηδξ LEF8 απυ ημ βμκζδίςια ημο ααηιζδίμο επζδζχπεδηε ιε ζοκδζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ημ ααηιίδζμ Γlef8 ηαζ ηαεέκακ απυ ημοξ θμνείξ μιυθμβμο ακαζοκδοαζιμφ. Οζ εηηεηαιέκεξ μιυθμβεξ πενζμπέξ εηαηένςεεκ ηάεε εκεέιαημξ επάβμοκ ηδ ζηυπεοζδ ζε ακηίζημζπεξ πενζμπέξ ημο ζζημφ βμκζδζχιαημξ. ε πενίπηςζδ ειθάκζζδξ ζδιείςκ ζοιααηχκ ιε εκενβυ ιυθοκζδ (απμηυθθδζδ ηοηηάνςκ απυ ημ οπυζηνςια, ελάπθςζδ ηςκ ζδιάηςκ YFP), ημ ακηίζημζπμ οπενηείιεκμ απμιμκχκεηαζ. ε υθεξ ηζξ πενζπηχζεζξ ζηυπεοζδξ ζημ βεκεηζηυ ηυπμ ημο βμκζδίμο lef8, ηα εκεέιαηα ακηζηαηέζηδζακ ηδκ αθθδθμοπία A.yfp/zeo. Ωξ εη ημφημο δ υπμζα παναηδνμφιεκδ ελάπθςζδ ηςκ ζδιάηςκ YFP εα μθείθεηαζ ζε εοηαζνζαηή ζοιπαναβςβή Γlef8 ζμζςιάηςκ, δεδμιέκμο υηζ μζ δζαζςζιέκμζ ζμί δε εα έπμοκ ζηακυηδηα παναβςβήξ YFP, απμοζία ηδξ ηαζέηαξ A.yfp. Ζ απμιυκςζδ ηςκ δζαζςζιέκςκ ζχκ, ρεοδμ-αβνίμο ηφπμο ααζίζηδηε ζηδκ αδοκαιία ημοξ κα πανάβμοκ YFP. Καεανζζιέκμ οπενηείιεκμ, απυ ηάεε οπμρήθζα πενίπηςζδ, αναζχεδηε δζαδμπζηά (serial dilution) ηαηά 5 ηάλεζξ ιεβέεμοξ ( ) ηαζ μζ επζιένμοξ αναζχζεζξ πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδ ιυθοκζδ κέςκ ηαθθζενβεζχκ ηοηηάνςκ Bm5 ζε πθάηα ηαθθζένβεζαξ (culture plate) 96 εέζεςκ (wells). Οζ ηαθθζένβεζεξ εθέβπεδηακ ιζηνμζημπζηά βζα δζάζηδια έςξ ιίαξ εαδμιάδαξ ηαζ δ ιζηνυηενδ αναίςζδ πμο πανείπε YFP ηαθθζένβεζα, πανμοζία παναηηδνζζηζηχκ εκενβμφ ιυθοκζδξ (ηοηηανζηή απμηυθθδζδ), επζθέπεδηε βζα πεναζηένς πνήζδ: ημ οπενηείιεκμ ηδξ ηαθθζένβεζαξ αθαζνέεδηε ηαζ εθανιυζηδηε ζε κέα ηαθθζένβεζα ηοηηάνςκ Bm5 ζε πθάηα ηαθθζένβεζαξ 24 εέζεςκ. Δάκ μ θαζκυηοπμξ YFP επζαεααζςκυηακ, δ κέα αοηή ηαθθζένβεζα απμηεθμφζε ηδκ 1 δ δζαδμπζηή ιυθοκζδ ιε ημκ ζυ (1 st passage). Ο δμιζηυξ ηαζ ιμνζαηυξ παναηηδνζζιυξ ηςκ κέςκ ζχκ πναβιαημπμζήεδηε απυ ηδκ εκ θυβς ιυθοκζδ ηζ έπεζηα, μπυηε μ ζζηυξ πθδεοζιυξ εεςνμφηακ πθέμκ μιμζμβεκήξ Φνξείο κεηάζεζεο Tn7 Υνδζζιμπμζήεδηακ θμνείξ ηφπμο FastBac dual (pfbd) ημο ζοζηήιαημξ bac-to-bac (Invitrogen). Γζα ηδκ ηαηαζηεοή ημο θμνέα pfbd hsp70.lef8/polh (εζη. 2.5/Α), μ 64

86 θμνέαξ pfbd ηνμπμπμζήεδηε ανπζηά ιε ηδκ εζζαβςβή ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο βμκζδίμο ηδξ πμθοεδνίκδξ ημο ζμφ BmNPV. Ζ παναπάκς πενζμπή εζζήπεδ ςξ ηιήια PCR EcoRI PstI, ηαεμδζηά ημο οπμηζκδηή πμθοεδνίκδξ ημο ζμφ AcMNPV, πμο πενζέπεηαζ ζημ θμνέα, δζαιμνθχκμκηαξ ημ πθαζιίδζμ pfbd.polh. ηδ ζοκέπεζα ημ ηιήια ApaI SacI απυ ημκ θμνέα phsp70.lef8, πμο πενζθαιαάκεζ ηδκ ηαζέηα έηθναζδξ hsp70.lef8.sv40, αιαθφκεδηε ηαζ εζζήπεδ ζηδ ιδ ημθθχδδ ιμκαδζηή εέζδ ακαβκχνζζδξ ηδξ κμοηθεάζδξ SnaBI ημο θμνέα pfbd.polh, δζαιμνθχκμκηαξ ημ ηεθζηυ πθαζιίδζμ, pfbd hsp70.lef8/polh. Ο θμνέαξ pfbd Ppol.Bmpol/p10.egfp (εζη. 2.5/Β) ηαηαζηεοάζηδηε ιε αάζδ ημ πθαζιίδζμ pfbd.polh ιε ηθςκμπμίδζδ ημο πθαζζίμο ακάβκςζδξ egfp ζηδκ ηαζέηα p10 ημο pfbd.polh. Οζ θμνείξ pfbd πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ηνμπμπμίδζδ ααηιζδίςκ αάζεζ ηςκ μδδβζχκ ημο ηαηαζηεοαζηή (Invitrogen, 2004). οκμπηζηά, ηάεε ααηιίδζμ δζαεέηεζ ιία πενζμπή δέηηδ βζα ιεηάεεζδ ηφπμο Tn7 (att-tn7), ζηδκ μπμία ιπμνμφκ κα εζζαπεμφκ βεκεηζηέξ αθθδθμοπίεξ ιε ηδ πνήζδ πθαζιζδίςκ ηφπμο FastBac (pfb (Invitrogen, 2004)), υηακ ζημ ίδζμ ηφηηανμ οπάνπεζ παναβςβή ηδξ εζδζηήξ ιεηαεεηάζδξ. Ζ Tn7 ιεηαεεηάζδ πανάβεηαζ απυ ημ πθαζιίδζμ pmon7124 (Luckow et al., 1993), πμο επίζδξ πανέπεζ ακεεηηζηυηδηα ζηδκ ηεηναηοηθίκδ. Οζ πνμξ ιεηάεεζδ αθθδθμοπίεξ ηθςκμπμζμφκηαζ ζημ θμνέα FastBac ιεηαλφ ηςκ δφμ αθθδθμοπζχκ-ακαβκχνζζδξ/ζηυπεοζδξ Tn7R ηαζ Tn7L (ιε ηυηηζκμ πνχια ζηδκ εζηυκα 2.5/Α), έηζζ χζηε κα δζαηδνείηαζ ημ βμκίδζμ ακεεηηζηυηδηαξ ζε βεκηαιοηίκδ, πμο πνδζζιμπμζείηαζ ηαηά ηδκ επζθμβή ημο ηεθζημφ ηνμπμπμζδιέκμο ααηιζδίμο. Σμ ζφζηδια ιεηάεεζδξ ζπδιαηίζηδηε ζηαδζαηά ιε δζαδμπζηή εζζαβςβή ηςκ Tn7R Α HSV tk sv40 Ppol p10 Bmpolh lef8 ORF sv40 Tn7L pfbd hsp70.lef8/polh 9213 bp hsp Tn7R Β HSV tk egfp p10 Ppol Bmpolh sv40 Δηθόλα 2.5 Α. Απεζηυκζζδ ημο πθαζιζδίμο pfbd hsp70.lef8/polh. Γζαηνίκμκηαζ δ ηαζέηα hsp70.lef8.sv40, ημ πθαίζζμ ακάβκςζδξ Bmpolh ηαζ μζ αθθδθμοπίεξ ηςκ ηαζεηχκ έηθναζδξ πμθοεδνίκδξ Ppol ηαζ p10 ημο θμνέα. Δπζπθέμκ ζδιεζχκμκηαζ ιε ηυηηζκμ πνχια μζ αθθδθμοπίεξ ακαβκχνζζδξ Tn7 L ηαζ R. Β. Λεπημιένεζα ηςκ ηαζεηχκ έηθναζδξ πμθοεδνίκδξ ηαζ egpf ημο πθαζιζδίμο pfbd Ppol.Bmpol/p10.egfp. sv40: αιιεινπρία πνιπαδελπιίωζεο ηνπ ηνύ sv40, HSV tk: αιιεινπρία πνιπαδελπιίωζεο ηεο ζπκηδπιηθήο θηλάζεο, ηνπ απινύ εξπεην-ηνύ, HSV. 65

87 επζιένμοξ ζοζηαηζηχκ ημο (ηαηά ζεζνά: ααηιίδζμ, pmon7124, pfbd hsp70.lef8/polh ή pfbd Ppol.Bmpol/p10.egfp) ζε ααηηήνζα DH10B, ιέζς ιεηαζπδιαηζζιμφ. Ζ επζθμβή ηςκ επζεοιδηχκ ηθχκςκ ααζίγεηαζ ζε έθεβπμ εκενβυηδηαξ ηδξ α- βαθαηημζζδάζδξ. οβηεηνζιέκα, δ πενζμπή-δέηηδξ att-tn7 ανίζηεηαζ εκζςιαηςιέκδ ζηδκ ηςδζηή πενζμπή βζα ημ α-πεπηίδζμ ηδξ α-βαθαηημζζδάζδξ, έηζζ χζηε κα ιδκ επδνεάγεζ ημ πθαίζζμ ακάβκςζδξ. Σμ α-πεπηίδζμ (πεπηίδζμ-δυηδξ) πανάβεηαζ ζηαεενά ζε ηφηηανα E. coli ηαζ ζημ ζηέθεπμξ DH10B, υπμο οπάνπεζ δζαεέζζιμ ημ ακηίζημζπμ πεπηίδζμ-δέηηδξ, επάβεζ ιέζς α-ζοιπθήνςζδξ (a-complementation) (Juers et al., 2012) ηδκ πθήνδ εκενβυηδηα ηδξ α-βαθαηημζζδάζδξ. Ζ ιεηάεεζδ ζηδ εέζδ att-tn7 ηαηαζηνέθεζ ηδκ ηςδζηή πενζμπή ημο α-πεπηζδίμο ηαζ επμιέκςξ μδδβεί ζε αδοκαιία ημο ααηιζδίμο κα επάβεζ ηδ θεζημονβζηυηδηα ηδξ α-βαθαηημζζδάζδξ, θεζημονβχκηαξ ςξ ιάνηοναξ ηδξ ιεηαθμνάξ βεκεηζημφ οθζημφ/έκεεζδξ (Invitrogen, 2004). Γζα ηδ δμηζιαζία ηδξ α-βαθαηημζζδάζδξ, πνμζηίεεκηαζ ζημ ιίβια ηςκ ιεηαζπδιαηζζιέκςκ ααηηδνίςκ 100 ιl 100 mm IPTG (Isopropyl α-d-1- thiogalactopyranoside) ηαζ 40 ιl 20 mg/ml X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta- D-galacto-pyranoside), πνζκ ηδκ επίζηνςζή ημοξ ζε ηνοαθίμ άβαν-lb, ειπθμοηζζιέκμ ιε ηα ηαηάθθδθα ακηζαζμηζηά (Invitrogen, 2004). Σα ααηηήνζα πμο δε δζαεέημοκ εκενβυηδηα βαθαηημζζδάζδξ ακαπηφζζμοκ θεοηέξ απμζηίεξ, θυβς ηδξ αδοκαιίαξ δζάζπαζδξ ημο πνςιμβυκμο X-Gal, ζε ακηζδζαζημθή ιε ηα οπυθμζπα, ηςκ μπμίςκ μζ απμζηίεξ ειθακίγμοκ παναηηδνζζηζηυ ηοακυ πνχια Φνξείο κεηαθνξάο θαη έθθξαζεο γηα ηε δεκηνπξγία θπηηαξηθώλ ζεηξώλ δηάζσζεο ηνπ βαθκηδίνπ Γlef8 Ο θμνέαξ p3e1.2 hsp.lef8/ea.pac (εζη. 2.6) πενζέπεζ ηδκ ηαζέηα έηθναζδξ LEF8 ζοκδεδειέκδ ιε ηαζέηα επζθμβήξ, πμο πανέπεζ ακεεηηζηυηδηα ζημ ακηζαζμηζηυ πμονμιοηίκδ, ζημ εζςηενζηυ εκυξ ιεηαεεημφ ζημζπείμο piggybac. Γζα ηδκ ηαηαζηεοή αοημφ ημο θμνέα, ημ DNA ημο θμνέα pbac3xp3 EGFPaf (Horn & Wimmer, 2000) επςάζηδηε ιε ηζξ εκδμκμοηθεάζεξ BglII PstI, χζηε κα αθαζνεεεί δ ηαζέηα-ιάνηοναξ egfp, ιαγί ιε πενίπμο 1 kbp ημο πθαζζίμο ακάβκςζδξ ηδξ ιεηαεεηάζδξ piggybac, πμο δεκ απαζηείηαζ βζα ηδκ μθμηθήνςζδ ηδξ ιεηάεεζδξ (Li et al., 2001). Ο ηεθζηυξ θμνέαξ εα πνεζάγεηαζ ηδκ παναβςβή ηδξ ιεηαεεηάζδξ απυ λεπςνζζηυ θμνέα/βεκεηζηυ ζφζηδια ηαζ επζπθέμκ, ιεηά ηδκ ανπζηή εκζςιάηςζδ, ημ έκεεια δε εα ιπμνεί κα ιεηαπδδήζεζ ζε άθθδ εέζδ. 66

88 p3e1.2 hsp70.lef8/ea.pac piggybac 3' sv bp piggybac 5' actint pac lef8 ORF hsp hr3 ActinP Δηθόλα 2.6 Απεζηυκζζδ ημο πθαζιζδίμο p3e1.2 hsp.lef8/ea.pac, υπμο ζδιεζχκμκηαζ μζ ηαζέηεξ έηθναζδξ LEF8 (hsp70.lef8) ηαζ PAC (EA.pac), πμο έπμοκ ημπμεεηδεεί ζε δζάηαλδ 5 πνμξ 5 (head-to-head). διεζχκμκηαζ επζπθέμκ μζ 5 ηαζ 3 αθθδθμοπίεξ ημο ιεηαεεημφ ζημζπείμο piggybac εηαηένςεεκ ηςκ αθθδθμοπζχκ έηθναζδξ, μζ μπμίεξ ηαζ ιεζμθααμφκ ηδ ιεηάεεζδ ζηα ηοηηανζηά πνςιμζχιαηα πανμοζία ηδξ ακηίζημζπδξ ιεηαεεηάζδξ. Σμ οπυθμζπμ ηιήια ημο πθαζιζδίμο pbac3xp3 EGFPaf αιαθφκεδηε ηαζ ζοκδέεδηε ιε ημ ηιήια ApaI SacI hsp70.lef8.sv40 απυ ημκ θμνέα phsp70.lef8, πανάβμκηαξ ημκ θμνέα p3e1.2 hsp.lef8. Ζ ηαζέηα επζθμβήξ ΔA.pac πανέπεζ ακεεηηζηυηδηα ζημ ακηζαζμηζηυ πμονμιοηίκδ (pac: puromycin acetyl-transferase) ηαζ απμιμκχεδηε ςξ ηιήια ApaI BglII απυ ημ θμνέα pea.pac. Μεηά απυ άιαθοκζδ εζζήπεδ ζηδ ιμκαδζηή εέζδ ακαβκχνζζδξ ηδξ κμοηθεάζδξ ClaI (επίζδξ αιαθοιέκδ), αηνζαχξ δίπθα ζηδκ ηαζέηα έηθναζδξ LEF8 βζα κα ζπδιαηίζεζ ημκ ηεθζηυ θμνέα Φνξείο έθθξαζεο ηεο ινπζηθεξάζεο γηα εθηίκεζε ηεο ιεηηνπξγηθόηεηαο ησλ επηιεγκέλσλ ππνθηλεηώλ θαηαζθεπή ελόο ειάρηζηνπ ππνθηλεηή βαζηζκέλνπ ζηνλ ππνθηλεηή ηεο θπηηαξνπιαζκαηηθήο αθηίλεο Α3 ηνπ κεηαμνζθώιεθα Σμ ηιήια 133/+160 ημο βμκζδίμο ηδξ ηοηηανμπθαζιαηζηήξ αηηίκδξ Α3 ημο ιεηαλμζηχθδηα ηθςκμπμζήεδηε ιέζς PCR (γεφβμξ εηηζκδηχκ mac3) απυ ημκ θμνέα pea (Douris V et al., 2006) ηαζ εζζήπεδ ζε θμνέα ημο ζοζηήιαημξ pgem -T Easy (Promega), ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή. Ζ ιέεμδμξ ααζίγεηαζ ζηδκ εηιεηάθθεοζδ ηςκ 3 πνμελέπμκηςκ (overhang/protruding) κμοηθεμηζδίςκ αδεκίκδξ, πμο εκζςιαηχκεζ ηαηά πνμηίιδζδ δ Taq πμθοιενάζδ ζηα πνμσυκηα PCR, ιε ηδ αμήεεζα θμνέςκ πμο δζαεέημοκ 5 πνμελέπμκηα κμοηθεμηίδζα εοιίκδξ ιία ηεπκζηή 67

89 βκςζηή ςξ ηθςκμπμίδζδ TA (Marchuk et al., 1991). Ο οπμρήθζμξ οπμηζκδηήξ απμιμκχεδηε ςξ ηιήια ApaI SalI ηαζ ηθςκμπμζήεδηε ζηζξ ακηίζημζπεξ εέζεζξ ημο θμνέα έηθναζδξ ηδξ θμοζζθενάζδξ, pbs.luc, ζπδιαηίγμκηαξ ημκ θμνέα pbs maci.luc. Ο pbs.luc ηαηαζηεοάζηδηε ιε ηθςκμπμίδζδ ηδξ αθθδθμοπίαξ luc.sv40 απυ ημ θμνέα pgl3 (Promega) ζηζξ εέζεζξ HindIII-BamHI ημο θμνέα pbs ηαζ δεκ έπεζ οπμηζκδηή. Ο pbs maci.luc ιεηά απυ απμιάηνοκζδ ημο ηιήιαημξ SbfI SnaBI, άιαθοκζδ ηαζ επακαηοηθμπμίδζδ δζαιυνθςζε ημκ ηεθζηυ θμνέα pmac3.luc, πμο δζαεέηεζ ςξ οπμηζκδηή ημ ηιήια 133/+41 ημο βμκζδίμο ηδξ αηηίκδξ. Οζ θμνείξ phsp70.luc ηαζ pppu.luc δδιζμονβήεδηακ ακηίζημζπα ιε ηθςκμπμίδζδ ημο οπμηζκδηή hsp70 ηαζ ημο οπμηζκδηή ηδξ πμθομοαζηζηίκδξ (pppu) ημο Tribolium castaneum ζημ πθαζιίδζμ pbs.luc, υπςξ πενζβνάθδηε παναπάκς ηαζ βζα ημκ οπμηζκδηή mac3 (Swevers L., ιδ δδιμζζεοιέκα απμηεθέζιαηα). Ο θμνέαξ pactin.luc έπεζ πενζβναθεί (Kolliopoulou & Swevers, 2013). ημοξ θμνείξ pmac3.luc ηαζ phsp70.luc πνμζηέεδηε δ ζζηή αθθδθμοπία εκίζποζδξ hr3 βζα ηδ δδιζμονβία ηςκ θμνέςκ ζζπονυηενδξ έηθναζδξ phr3-mac3.luc ηαζ phr3- hsp70.luc. Ζ πνμζεήηδ έβζκε ζηδ εέζδ ακαβκχνζζδξ ημο εκγφιμο ApaI πμο εκημπίγεηαζ 5 ηςκ ακηίζημζπςκ οπμηζκδηχκ hsp70 ηαζ mac3. Μεηά απυ πέρδ ιε ApaI ηαζ άιαθοκζδ, πνμζηέεδηε επίζδξ αιαθοιέκμ ημ ηιήια ApaI SacI hr3, πμο εθήθεδ απυ ημ θμνέα pea. Γοκιμαζία παπαγυγήρ ηηρ λοςζιθεπάζηρ Καθθζένβεζεξ ηοηηάνςκ Bm5 δζαιμθφκεδηακ λεπςνζζηά ιε ηαεέκακ απυ ημοξ οπυ ιεθέηδ θμνείξ. Σδκ 3 δ διένα ιεηά ηδ δζαιυθοκζδ (3 dpt: days post transfection), μζ ηαθθζένβεζεξ ζοθθέβμκηαζ ηαζ 100 ιl απυ ηαεειία ημπμεεημφκηαζ ζε πθάηα ηαθθζένβεζαξ 96 εέζεςκ, υπμο ηα ηφηηανα αθήκμκηαζ κα πνμζημθθδεμφκ ζημ οπυζηνςια βζα 1 h ζημοξ 28 o C. Καηυπζκ, ημ ενεπηζηυ οθζηυ αθαζνείηαζ ςξ ηεθζηυ υβημ 30 ιl ηαζ ημ ηνοαθίμ ημπμεεηείηαζ ζημοξ -70 o C βζα 15 min ηαζ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο ή 37 o C βζα 5 min, χζηε κα επζηεοπεεί θφζδ ηςκ ηοηηάνςκ (ηεπκζηή ρφλδξαπυρολδξ: freeze-thaw). Σμ ηεθζηυ ηοηηανζηυ παναζηεφαζια ακαιζβκφεηαζ ιε 20 ιl ακηζδναζηδνίμο Steady-Glo (Promega) ηαζ ιεηά απυ επχαζδ 5 min ζε εενιμηναζία δςιαηίμο ιε ήπζα ακάδεοζδ, ηα δείβιαηα ιεηαθένμκηαζ ζε θεοηή, αδζαθακή πθάηα ιζηνμηζηθμδυηδζδξ (micro-titer plate) 96 εέζεςκ. Ζ ιέηνδζδ ηδξ παναβυιεκδξ πδιεζμθςηαφβεζαξ πναβιαημπμζείηαζ ζε ζοζηεοή ακάβκςζδξ/ιέηνδζδξ TECAN Infinite 200 PRO, πμο θεζημονβεί ιε ημ θμβζζιζηυ i- 68

90 control ημο ηαηαζηεοαζηή. Υνδζζιμπμζμφκηαζ μζ πνμεπζθεβιέκεξ νοειίζεζξ (πνυκμξ μθμηθήνςζδξ-integration time 10 s, πνυκμξ ελζζμννυπδζδξ-settle time 150 ms, αοηυιαηδ πνμζανιμβή εφνμοξ ζήιαημξ-automatic attenuation) Φνξείο παξαγσγήο δίθισλνπ RNA Σμ ηιήια (544 nt/μζ ζοκηεηαβιέκεξ ακαθένμκηαζ ζημ πάνηδ ημο ζηεθέπμοξ Σ3) ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ lef8 ηθςκμπμζήεδηε ιέζς PCR (γεφβμξ εηηζκδηχκ lef8). Μεηά απυ άιαθοκζδ ηαζ θςζθμνοθίςζδ εζζήπεδ ζηδ ιμκαδζηή εέζδ EcoRV ημο θμνέα plitmus 38i (NEB), δζαιμνθχκμκηαξ ημκ θμνέα pl38i.lef8 (εζη. 2.7). Παπαγυγή δίκλυνος RNA (dsrna) και γονιδιακή αποζιώπηζη μέζυ RNAi (RNA interference/rna silencing) Ο θμνέαξ pl38i.lef8-544 ηυπδηε ζηζξ εέζεζξ ακαβκχνζζδξ ηςκ εκγφιςκ BamHI ηαζ HindIII (εζη. 2.7), χζηε κα παναπεμφκ ακηίζημζπα ηα εοεφβναιια ιυνζαοπμζηνχιαηα βζα ηδκ παναβςβή ηςκ επζιένμοξ ιμκυηθςκςκ RNA lef8. Με αοηή ηδ δζαδζηαζία πανάβεηαζ ημ ιεηάβναθμ lef8 πμο ακηζζημζπεί ζημ ηθςκμπμζδιέκμ ηςδζηυ ηιήια, πςνίξ δ ιεηαβναθή κα ζοκεπίγεηαζ ζηζξ πανάπθεονεξ πθαζιζδζαηέξ πενζμπέξ. Οζ δφμ εοεφβναιιεξ ιμνθέξ ημο θμνέα ακαιίπεδηακ ζε ακαθμβία 1:1 (250 ng:250 ng ηαζ 500 ng:500 ng) ηαζ πνδζζιμπμζήεδηακ ιαγί ςξ οπυζηνςια ημο εκγφιμο Σ7 πμθοιενάζδ (EP0111, Fermentas), ιε αάζδ ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή. Δκ ζοκημιία πνδζζιμπμζήεδηε ηεθζηυξ υβημξ ακηίδναζδξ 50 ή 100 ιl ιε ηα κμοηθεμηίδζα ATP/GTP/CTP/UTP ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 2 mm ηαζ βζα πνυκμ ακηίδναζδξ 19 h BamHI 3063 τμήμα lef8 ( ) 2681 HindIII 2498 T7 P 2346 T7 P pl38i.lef bp Δηθόλα 2.7 Απεζηυκζζδ ημο πθαζιζδίμο pl38i.lef διεζχκμκηαζ μζ οπμηζκδηέξ Σ7 εηαηένςεεκ ημο ηιήιαημξ lef8, πμο ακαβκςνίγμκηαζ απυ ηδκ RNA πμθοιενάζδ T7, δ εέζδ ημο ηιήιαημξ ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ lef8, ηαεχξ ηαζ μζ εέζεζξ πενζμνζζιμφ BamHI ηαζ HindIII πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ηδκ εοεοβνάιιζζδ ημο θμνέα ηαηά ηδ δζαδζηαζία παναβςβήξ RNAi. 69

91 (μθμκφηηζα επχαζδ). Ζ πμθοιενάζδ πνδζζιμπμζείηαζ ζε πμζυηδηα 30 u (units: ιμκάδεξ) ακά ιg DNA-οπμζηνχιαημξ ηαζ ημ ιίβια ακαζημθέα RNase, RiboLock TM (E00381, Fermentas) ζηζξ 50 u ακά ιg οπμζηνχιαημξ DNA. Σμ οπυζηνςια DNA απμιαηνφκεηαζ ιεηά ημ πέναξ ηδξ ακηίδναζδξ ιε ηδ πνήζδ 2 u ημο εκγφιμο DNase I (EN0521, Fermentas) ακά ιg DNA. Tμ δζάθοια επςάγεηαζ ζημοξ 37 μ C βζα 15 min ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ηαεανίγεηαζ ιε ηφηθμοξ έηθμοζδξ ιε θαζκυθδ:πθςνμθυνιζμ:ζζμαιοθζηή αθημυθδ (25:24:1). Σμ ηεθζηυ δζάθοια εενιαίκεηαζ ζημοξ 75 o C βζα 10 min ηαζ αθήκεηαζ κα επακέθεεζ ζηαδζαηά ζε εενιμηναζία δςιαηίμο, χζηε κα επζηεοπεεί δ οανζδμπμίδζδ ημο RNA ζε δίηθςκδ ιμνθή (dsrna). Ζ επίδναζδ ημο dsrna εθέβπεδηε ζημκ ηνμπμπμζδιέκμ ζυ BmNPV/Α.gfp ηαζ ζημ ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο. Σμ dsrna έκακηζ ηδξ ααηηδνζαηήξ πνςηεΐκδξ MalE (Duplay et al., 1984) ζηενείηαζ μιμζυηδηαξ ιε ζζηέξ ή ηοηηανζηέξ αθθδθμοπίεξ ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε ςξ dsrna εθέβπμο (εοβεκζηή πνμζθμνά ηδξ ηαξ Κμθθζμπμφθμο Α.). Κφηηανα Bm5 δζαιμθφκεδηακ ιε 100 ng απυ ηάεε dsrna, αάζεζ ημο πεζναιαηζημφ ζπεδζαζιμφ. 2.7 Τποποποίηζη και κλυνοποίηζη ηος γενεηικού ςλικού ηος BmNPV ζε βακηήπια E. coli με ηο ζύζηημα αναζςνδςαζμού Red ηος θάγος λ Σμ ζφζηδια ακαζοκδοαζιμφ Red ημο θάβμο θ επάβεζ μιυθμβμ ακαζοκδοαζιυ ιεηαλφ ημο ααηιζδίμο αβνίμο ηφπμο ηζ εκυξ θμνέα-δυηδ ακαζοκδοαζιμφ, μ μπμίμξ πενζέπεζ ημ βεκεηζηυ οθζηυ πμο πνυηεζηαζ κα ιεηαθενεεί ζημ ααηιίδζμ. Ο θμνέαξ ζε ηάεε πενίπηςζδ είκαζ εοεφβναιιμ, δίηθςκμ ιυνζμ DNA ηαζ εκ πνμηεζιέκς πενζθαιαάκεζ ιία αθθδθμοπία έηθναζδξ ηδξ θεμνίγμοζαξ πνςηεΐκδξ-ιάνηονα YFP (Yellow Fluorescent Protein), οπυ ημκ οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ Α3 ημο B. mori (παναηηδνίγεηαζ ςξ A.yfp), ηαζ ημ ααηηδνζαηυ βμκίδζμ ακεεηηζηυηδηαξ ζηδ γεμιοηίκδ (παναηηδνίγεηαζ ςξ zeo). Δηαηένςεεκ ηςκ αθθδθμοπζχκ έηθναζδξ οπάνπμοκ πενζμπέξ μιμθμβίαξ ιε ηδκ πενζμπή ζηυπμ, πνμηεζιέκμο κα βίκεζ εθζηηυξ μ μιυθμβμξ ακαζοκδοαζιυξ: ζοβηεηνζιέκα βζα ημ lef8, πνδζζιμπμζμφκηαζ εηηεηαιέκεξ αθθδθμοπίεξ ηςκ 5 ηαζ 3 βεζημκζηχκ πενζμπχκ ημο (αθ. εζη. 2.1/Β). Έηζζ, ιε αάζδ ηδκ οθζζηάιεκδ μιμθμβία, δ ηςδζηή πενζμπή ημο βμκζδίμο lef8 ακηζηαείζηαηαζ απυ ηδκ αθθδθμοπία A.yfp/zeo. 70

92 Ζ δζαδζηαζία πναβιαημπμζήεδηε ιέζς ημο ζοζηήιαημξ Red, ημ μπμίμ πενζθαιαάκεζ ηνία βμκίδζα, ηα exo, bet ηαζ gam. Σμ exo ηςδζημπμζεί ιία 5 3 ελςκμοηθεάζδ, ηδκ Redα ή απθχξ α, πμο δνα ζημκ εοεφβναιιμ θμνέα ηαζ πανάβεζ 3 πνμελέπμκηα άηνα. Σμ bet πανάβεζ ηδκ πνςηεΐκδ Redα ή α, δ μπμία ζοκδέεηαζ ιε ηα 3 εθεφεενα άηνα, πμο πανήβαβε δ α, επάβμκηαξ ηδκ ακαβκχνζζδ ηςκ μιυθμβςκ ηιδιάηςκ ηαζ ηδκ ακηζηαηάζηαζδ. Σμ gam ηςδζημπμζεί ηδκ πνςηεΐκδ Gam, δ μπμία απεκενβμπμζεί ηδ ααηηδνζαηή ελςκμοηθεάζδ RecBCD, πμο δζαθμνεηζηά εα ιπμνμφζε κα ηαηαζηνέρεζ ημκ εοεφβναιιμ θμνέα (Datsenko & Wanner, 2000). Καζ ηα ηνία αοηά βμκίδζα ανίζημκηαζ ζημ ααηηδνζαηυ θμνέα pkd46 (Datsenko & Wanner, 2000), οπυ ημκ έθεβπμ οπμηζκδηή επαβυιεκμο απυ ηδκ L-ανααζκυγδ. Ο θμνέαξ pkd46 δζαεέηεζ ηδ εενιμεοαίζεδηδ πενζμπή έκανλδξ ηδξ ακηζβναθήξ orir101 ηαζ δ ακαπαναβςβή ημο πενζμνίγεηαζ δναζηζηά ζημοξ 37 μ C. ε ηαηάθθδθα πνμεημζιαζιέκα ηφηηανα DH10b (βι. παξάγξαθν 2.3) εζζήπεδζακ ηαηά ζεζνά ημ ααηιίδζμ BmNPV αβνίμο ηφπμο (wt), ιε δθεηηνμδζάηνδζδ, μ πθαζιζδζαηυξ θμνέαξ pkd46 ηαζ ηέθμξ μ εοεφβναιιμξ θμνέαξ ακαζοκδοαζιμφ ηαζ ηα δφμ ιε πδιζηυ ιεηαζπδιαηζζιυ εκυξ αήιαημξ. Δζδζηά βζα ημκ θμνέα ακαζοκδοαζιμφ, πνδζζιμπμζήεδηε ηαζ δθεηηνμδζάηνδζδ, πνμηεζιέκμο κα δζαπζζηςεεί ακ οπάνπεζ ηαθφηενδ απυδμζδ ακαζοκδοαζιμφ. Πνζκ ηδκ εζζαβςβή ημο ηεθεοηαίμο πναβιαημπμζήεδηε ζε ηάεε πενίπηςζδ επαβςβή ημο ζοζηήιαημξ ακαζοκδοαζιμφ ιε ηδκ πνμζεήηδ L-ανααζκυγδξ ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 6.4 mm, 1 h πνζκ ηδ ζοθθμβή ηςκ ηοηηάνςκ DH10b wt+/pkd46+ (δζαεέημοκ ημ ααηιίδζμ ηαζ ημ θμνέα pkd46) βζα ιεηαηνμπή ημοξ ζε ζηακά βζα ιεηαζπδιαηζζιυ. διεζχκεηαζ υηζ ιεηά ηδκ εζζαβςβή ημο pkd46 ηαζ ςξ ημ ηέθμξ ηδξ δζαδζηαζίαξ, δ ακάπηολδ ηςκ ηοηηάνςκ πναβιαημπμζήεδηε ζηαεενά ζε εενιμηναζία ςξ 30 μ C, βζα ηδ δζαηήνδζδ ημο θμνέα. Οζ εοεφβναιιμζ θμνείξ ακαζοκδοαζιμφ απμιμκχεδηακ απυ ημκ πθαζιζδζαηυ θμνέα ptva.yfp/zeo ιεηά απυ πέρδ λεπςνζζηά ιε ημοξ ζοκδοαζιμφξ εκδμκμοηθεαζχκ ScaI XcmI ηαζ MluI ScaI (αθ. εζη. 2.1/Β). Οζ δφμ εοεφβναιιμζ θμνείξ πμο πνμέηορακ δζαθένμοκ ςξ πνμξ ημ έκα άηνμ ημοξ, πμο ακηζζημζπεί ζηδκ 3 βεζημκζηή αθθδθμοπία ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο βμκζδίμο lef8. ηδκ πνχηδ πενίπηςζδ (θμνέαξ ScaI XcmI), δ αθθδθμοπία A.yfp/zeo πθαζζζχκεηαζ απυ ηζξ πενζμπέξ ηαζ ημο ζμφ BmNPV, εκχ ζηδ δεφηενδ (θμνέαξ MluI ScaI) δζαηδνείηαζ δ ηαζ ημ άθθμ άηνμ πενζθαιαάκεζ 71

93 ηδκ πενζμπή (μζ ζοκηεηαβιέκεξ ααζίγμκηαζ ζημ πάνηδ ημο ζηεθέπμοξ T3 ημο ζμφ BmNPV (Gomi et al., 1999)). Σα ηφηηανα DH10b wt+/pkd46+ ιεηαζπδιαηίζηδηακ ιε ημοξ εοεφβναιιμοξ θμνείξ ακαζοκδοαζιμφ ζε πμζυηδηεξ 220 ng (MluI ScaI) ηαζ 330 ng (ScaI XcmI). Μεηά απυ επχαζδ βζα 2-3 h ζημοξ 37 μ C μ θμνέαξ pkd46 έπεζ μθμηθδνχζεζ ημ νυθμ ημο ηαζ ιε ηδ εενιμηναζία αοηή επζδζχημοιε ηδκ απμιάηνοκζή ημο ηα 3/4 ημο ζοκμθζημφ υβημο ηοηηάνςκ επζζηνχεδηακ ζε ηνοαθία άβαν-τδνβ, πμο έθενακ ηα ακηζαζμηζηά ηακαιοηίκδ ηαζ γεμιοηίκδ. Θεηζημί ηθχκμζ πνμέηορακ ηαζ ζηζξ 2 πενζπηχζεζξ. Έκαξ ηθχκμξ πμο πνμέηορε ιε ημ θμνέα ScaI XcmI επζθέπεδηε ηοπαία βζα πεναζηένς πνήζδ. Αλίγεζ κα ζδιεζςεεί υηζ δ δθεηηνμδζάηνδζδ ημο θμνέα ακαζοκδοαζιμφ απέδςζε εθαθνχξ πενζζζυηενεξ ηαζ ιεβαθφηενεξ απμζηίεξ Ζ ίδζα δζαδζηαζία πνδζζιμπμζήεδηε ηαζ βζα ηδκ ηαηαζηεοή ημο ααηιζδίμο A.orf40 Γlef8. Ο εοεφβναιιμξ θμνέαξ ακαζοκδοαζιμφ πανήπεδ ιε πέρδ MluI ScaI ημο θμνέα ptva/zeo, πμο είκαζ ηαοηυζδιμξ ημο θμνέα ptva.yfp/zeo ιε ελαίνεζδ ηδκ απμοζία ημο ηιήιαημξ yfp.bgh (αθέπεηε εζη. 2.1/Β βζα ημκ ptva.yfp/zeo ηαζ 2.8 βζα ημ πανάβςβμ πθαζιίδζμ ptva/zeo). Ζ επζθμβή έβζκε ζε ηνοαθία άβαν-lb ιε ηα ακηζαζμηζηά ηακαιοηίκδ ηαζ γεμιοηίκδ ηαζ μζ εεηζημί ηθχκμζ επζαεααζχεδηακ πεναζηένς ιε ακηζδνάζεζξ PCR ηαζ αθθδθμφπδζδξ. Υνδζζιμπμζήεδηακ ηα γεφβδ εηηζκδηχκ 5F_R Α.1, 5F_R mac3f ηαζ ZeoR 3F_R (εζη. 2.8). MluI F_R ScaI ptva/zeo 8917 bp MluI 744 5' 5 πλευρική lef8 γεηηνληθή περιοχή πεξηνρή lef F_F ScaI 1773 orf40 A ' 3 πλευρική lef8 γεηηνληθή περιοχή πεξηνρή lef8 MluI EM7 ZeoR Zeo mac3f Actin P Δηθόλα 2.8 Απεζηυκζζδ ημο πθαζιζδίμο ptva/zeo. διεζχκμκηαζ μζ 5 ηαζ 3 βεζημκζηέξ πενζμπέξ ημο βμκζδίμο lef8, ηαεχξ ηαζ μζ ζπεηζηέξ εέζεζξ ηδξ ηαζέηαξ ακεεηηζηυηδηαξ ζηδ γεμιοηίκδ, ημο οπμηζκδηή αηηίκδξ ηαζ δ εέζδ ημο πθαζζίμο ακάβκςζδξ orf40. Δπζπθέμκ ηαηαβνάθμκηαζ μζ εέζεζξ ηςκ εκγφιςκ MluI ScaI, πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ηαηαζηεοή ημο ακηίζημζπμο εοεφβναιιμο θμνέα ακαζοκδοαζιμφ ηαζ μζ εέζεζξ οανζδζζιμφ ηςκ εηηζκδηχκ PCR 3/5F_R, ZeoR, mac3f ηαζ A.1, ιε ημοξ μπμίμοξ έβζκε δ επζαεααίςζδ ημο ηεθζημφ ααηιζδίμο. 72

94 2.8 Καλλιέπγειερ κςηηάπυν ενηόμυν Γζα ακάπηολδ, πεζνάιαηα ηζκδηζηήξ, παναηηδνζζιμφ ηαζ πνήζδξ ηςκ ααηιζδίςκ BmNPV, πνδζζιμπμζείηαζ δ ηοηηανμζεζνά Bm5, δ μπμία πνμένπεηαζ απυ ηφηηανα ςμεήηδξ ηδξ κφιθδξ ημο B. mori (Grace, 1967) ηαζ ιμθφκεηαζ πθήνςξ απυ ημκ ζυ BmNPV (O'Reilly et al., 1992). Ζ ηοηηανζηή ζεζνά HighFive TM πνμένπεηαζ απυ ηφηηανα ςμεήηδξ ηδξ κφιθδξ ημο Trichoplusia ni (εθελήξ εα ακαθένεηαζ ςξ Hi5 (Wickham et al., 1992)) ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ιεθέηεξ πνςηεσκζηήξ έηθναζδξ (Douris V et al., 2006). Ζ ηαθθζένβεζα πναβιαημπμζείηαζ ζε ενεπηζηυ ιέζμ IPL-41 (Invitrogen), ειπθμοηζζιέκμ ιε 10% μνυ απυ έιανοα ιυζπμο (Fetal Bovine Serum, FBS) (Johnson et al., 1992; Lynn, 2002). Σα πεζνάιαηα δζαιυθοκζδξ πναβιαημπμζήεδηακ ζημ ίδζμ ιέζμ πςνίξ FBS παναηηδνίγεηαζ ςξ ααζζηυ ιέζμ/οθζηυ. Σα ηφηηανα εκηυιςκ ακαπηφζζμκηακ ζε επςαζηήνεξ 28 μ C, ςξ ηαθθζένβεζεξ πνμζηυθθδζδξ (attachment), πνδζζιμπμζχκηαξ δμπεία ηαθθζένβεζαξ 50 ml, ηαεχξ ηαζ πθάηεξ ηαθθζένβεζαξ 6, 12, 24 ηαζ 96 εέζεςκ Παξνδηθή δηακόιπλζε θπηηάξσλ εληόκσλ Υνδζζιμπμζείηαζ ημ ακηζδναζηήνζμ Escort IV (Sigma-Aldrich/ L3287) ηαζ ημ εθανιμγυιεκμ πνςηυημθθμ βζα ηφηηανα Bm5/Hi5 ηαζ πθάηα ηαθθζένβεζαξ 24 εέζεςκ πενζθαιαάκεζ: i. επίζηνςζδ 1.4x10 5 ηοηηάνςκ ακά εέζδ ηαζ μθμκφηηζα επχαζδ ή 1.8 2x10 5 ηοηηάνςκ ηαζ επχαζδ απυ 0.5 έςξ 4 h ζημοξ 28 o C ii. εθανιμβή ηςκ μδδβζχκ ημο ηαηαζηεοαζηή βζα πθάηα ηαθθζένβεζαξ 6 εέζεςκ, πνμζανιμζιέκςκ ακαθμβζηά βζα 24 εέζεςκ (υθεξ μζ ηζιέξ δζαζνμφκηαζ δζά 4). Ακά εέζδ ηδξ πθάηαξ, ημ ενεπηζηυ οθζηυ ηςκ ηοηηάνςκ αθαζνείηαζ ηαζ ηα ηφηηανα λεπθέκμκηαζ ζε 250 ιl ααζζημφ οθζημφ, ημ μπμίμ ηεθζηά ακηζηαείζηαηαζ απυ 200 ιl ααζζημφ οθζημφ. Σμ DNA ηαζ ημ ακηζδναζηήνζμ πνμζηίεεκηαζ πςνζζηά ζε 25 ιl ααζζημφ οθζημφ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ακαιζβκφμκηαζ (ηεθζηυξ υβημξ ενεπηζημφ οθζημφ 50 ιl) ηαζ επςάγμκηαζ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο (RT) βζα min, χζηε κα ζπδιαηζζημφκ ηα ζφιπθμηα DNA-θζπμζςιάηςκ ζημ δζάθοια δζαιυθοκζδξ iii. επίδναζδ ιε ημ δζάθοια δζαιυθοκζδξ βζα ημοθάπζζημκ 5 h (πνςηυημθθμ ιίαξ διέναξ) ή 16 ιε 21 h (πνςηυημθθμ δφμ διενχκ) 73

95 iv. ακηζηαηάζηαζδ ημο παναπάκς δζαθφιαημξ ιε 500 ιl πθήνμοξ ιέζμο ηαθθζένβεζαξ ηφπμο IPL-41, ειπθμοηζζιέκμο ιε 10% FBS. Ζ δζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5 ιε πθαζιίδζα ηαζ ααηιίδζα πναβιαημπμζείηαζ ζε θυβμοξ DNA πνμξ ακηζδναζηήνζμ 100:2 ηαζ 200:3 ng:ιl. Ζ απμηεθεζιαηζηυηδηα δζαιυθοκζδξ βζα ηα ααηιίδζα είκαζ ηαηά ιέζμ υνμ ηδξ ηάλεςξ ημο 7 10% (ιεβαθφηενδ απυδμζδ πμο ιεηνήεδηε: ~13%) ηάης απυ αοηέξ ηδξ ζοκεήηεξ. ε πενζπηχζεζξ ζοκδζαιυθοκζδξ πνδζζιμπμζείηαζ μ θυβμξ ( ):3 ng:ιl ή μ θυβμξ ( ):4 ng:ιl ακηίζημζπα ακ πνυηεζηαζ βζα δζαιυθοκζδ ιε δφμ ηαζ ηνεζξ βεκεηζημφξ θμνείξ Γηακόιπλζε θπηηάξσλ εληόκσλ γηα ηελ θαηαζθεπή θπηηαξηθώλ ζεηξώλ ζηαζεξήο έθθξαζεο πξσηετλώλ Γζα ηδκ ηαηαζηεοή ηοηηανζηχκ ζεζνχκ Bm5, ζηαεενήξ έηθναζδξ δζαβμκζδίςκ, πνδζζιμπμζήεδηακ δφμ πνμζεββίζεζξ: α) ζοκδζαιυθοκζδ ηςκ ηοηηάνςκ ιε θμνείξ έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 ή/ηαζ ORF40, ιαγί ιε θμνέα πμο πανέπεζ ακεεηηζηυηδηα ζημ ακηζαζμηζηυ πμονμιοηίκδ (pea.pac) ζε ζπεηζηή πμζυηδηα ακηίζημζπα 10:1 ηαζ α) ζοκδζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ ιε ημκ θμνέα p3e1.2 hsp.lef8/ea.pac, ιαγί ιε έκακ θμνέα έηθναζδξ ηδξ ιεηαεεηάζδξ ημο ζοζηήιαημξ piggyback, pea.piggybac transposase. Σμ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ ηδξ ιεηαεεηάζδξ απμιμκχεδηε ιέζς ακηίδναζδξ PCR ηαζ ηθςκμπμζήεδηε ζημ θμνέα pea ζηζξ εέζεζξ ακαβκχνζζδξ ηςκ εκγφιςκ HindIII-XhoI (Swevers L., ιδ δδιμζζεοιέκα απμηεθέζιαηα) βζα ηδκ παναβςβή ημο πθαζιζδίμο pea.piggybac transposase. Ακεεηηζημί ηθχκμζ ηοηηάνςκ επζθέβμκηαζ απυ ηδ δεφηενδ διένα ιεηά ηδ δζαιυθοκζδ ηζ έπεζηα, ιε ηδκ εθανιμβή ημο ακηζαζμηζημφ πμονμιοηίκδ (ant-pr-5, Invivogen) ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 15 ιg/ml. Με ζηαδζαηυ ειπθμοηζζιυ ηςκ ακεεηηζηχκ ζημ ακηζαζμηζηυ ηοηηάνςκ πανάβεηαζ ζηαεενά δζαιμθοζιέκδ ηαθθζένβεζα ζε δζάζηδια 3 4 εαδμιάδςκ. Ζ ίδζα ζοβηέκηνςζδ ακηζαζμηζημφ ηςκ 15 ιg/ml πνδζζιμπμζείηαζ ηαζ βζα ηδ ζοκηήνδζδ ηςκ ζηαεενχκ ηοηηανμζεζνχκ. 74

96 2.9 Απομόνυζη ολικών νοςκλεφκών οξέυν από κύηηαπα ενηόμυν και παπαγυγή cdna ηιηλοδόηηζη ιικών παπαζκεςαζμάηυν Γζα ηδκ απμιυκςζδ μθζηχκ κμοηθεσηχκ μλέςκ (DNA ηαζ RNA), ηα ηφηηανα δζαθοημπμζμφκηαζ ζε 500 ιl δζαθφιαημξ θφζδξ: 7 Μ μονία, 2% SDS, 135 mm NaCl, 10 mm Tris (ph 7.5), 1 mm EDTA. Σα κμοηθεσηά μλέα ηαεανίγμκηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιε δφμ ηφηθμοξ εηπφθζζδξ ιε θαζκυθδ:πθςνμθυνιζμ:ζζμαιοθζηή αθημυθδ (25:24:1) ηαζ έκακ ηεθζηυ ιυκμ ιε πθςνμθυνιζμ ηαζ αημθμοεεί ηαηααφεζζδ ιε ζζμπνμπακυθδ, υπςξ έπεζ πενζβναθεί (Sambrook et al., 1989). Σμ ηεθζηυ ίγδια DNA ηαζ RNA ακαδζαθφεηαζ ζε sddh 2 O Απνκόλσζε RNA παξαγσγή cdna Γζα απμιυκςζδ RNA, 1 ιg μθζηχκ κμοηθεσηχκ μλέςκ (DNA+RNA) οθίζηαηαζ ηαηενβαζία ιε DNάζδ I εθεφεενδ RNάζδξ I (EN0521, Thermo Scientific), αάζεζ ηςκ μδδβζχκ ημο ηαηαζηεοαζηή. Υνδζζιμπμζείηαζ 1 ιl εκγφιμο ακά ιg RNA ηαζ επχαζδ βζα 30 min ζημοξ 37 μ C. Ζ DNase I αδνακμπμζείηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιε εένιακζδ ζημοξ 65 μ C, πανμοζία EDTA ζε ζοβηέκηνςζδ 5 mm. Ο ηεθζηυξ υβημξ ιεηά απυ ηδκ αδνακμπμίδζδ είκαζ 11 ιl. ε αοηή ηδ θάζδ 1 ιl απμεδηεφεηαζ βζα εηηίιδζδ ηδξ πανμοζίαξ DNA ζημ δζάθοια, ιέζς PCR. Σμ οπυθμζπμ δζάθοια RNA πνδζζιμπμζείηαζ ςξ οπυζηνςια βζα ηδκ παναβςβή cdna, ιέζς ημο ζοζηήιαημξ (kit) RevertAid (K1631, Fermentas-Thermo Scientific) ιε εηηζκδηέξ oligo-dt, αάζεζ ηςκ μδδβζχκ ημο ηαηαζηεοαζηή. οκμπηζηά 100 pmol (0.5 ιg) εηηζκδηχκ ακαιζβκφμκηαζ ιε ημ RNA ηαζ ημ δζάθοια εενιαίκεηαζ ζημοξ 65 μ C βζα 5 min ηαζ ρφπεηαζ ζημκ πάβμ. Δκ ζοκεπεία πνμζηίεεκηαζ ημ νοειζζηζηυ δζάθοια ηδξ ακηίδναζδξ, dntps ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 1 mm ημ ηαεέκα, 20 u ακαζημθέα RΝάζδξ RiboLock TM ηαζ 200 u ακηίζηνμθδξ ιεηαβναθάζδξ. Αημθμοεεί επχαζδ ζημοξ 42 μ C βζα πενίπμο 1.5 h. ε πενζπηχζεζξ πμο απαζηείηαζ απμιυκςζδ ιυκμ ημο RNA απυ ηα ηφηηανα, αοηή βίκεηαζ ελανπήξ ιε ημ ακηζδναζηήνζμ TRI reagent (MRC) ή TRIzol (Invitrogen), αάζεζ ηςκ μδδβζχκ ημο ηαηαζηεοαζηή. Σα ηφηηανα θφμκηαζ ζε 1 ml ακηζδναζηδνίμο ακά 5-10x10 6 ηφηηανα ιε ηδ πνήζδ πζππέηαξ. Σμ μιμβεκμπμζδιέκμ πνμσυκ αθήκεηαζ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 5 min ηαζ ακαιζβκφεηαζ ιε έκημκδ ακάδεοζδ ιε 200 ιl πθςνμθυνιζμ ακά ml ακηζδναζηδνίμο ηαζ αθήκεηαζ ηαζ πάθζ ζε RT βζα 2-3 min. Αημθμοεεί θοβμηέκηνδζδ ζηζξ xg ζηνμθέξ ζημοξ 2 8 μ C ηαζ ημ RNA 75

97 ηαηακέιεηαζ ςξ επί ημ πθείζημκ ζηδκ οδαηζηή θάζδ (ακχηενδ), δ μπμία θαιαάκεηαζ πνμζεηηζηά ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ απμιυκςζδ. Ο ηαεανζζιυξ ηαζ ζοιπφηκςζδ ημο RNA βίκεηαζ ιε άθαξ ηαζ αθημυθδ, υπςξ έπεζ πενζβναθεί. Δάκ ημ ηεθζηυ RNA πνυηεζηαζ κα πνδζζιμπμζδεεί ζε ακηζδνάζεζξ PCR ακηίζηνμθδξ ιεηαβναθήξ απαζηείηαζ δ πεναζηένς ηαηενβαζία ημο ιε DNάζδ I, πνζκ ηδκ παναβςβή cdna, χζηε κα ελαζθαθζζηεί δ απμοζία DNA ζημ παναζηεφαζια Σηηινδόηεζε ηηθώλ παξαζθεπαζκάησλ Κάεε ζζηυ παναζηεφαζια αναζχκεηαζ 1:20 ή 1:40 ιε sddh 2 O ηαζ 1.4 ιl πνδζζιμπμζμφκηαζ ςξ οπυζηνςια βζα πμζμηζηή ακηίδναζδ PCR εζδζηή βζα ημ ζζηυ βμκίδζμ gp64 (Efrose et al., 2010). Ηζηυ παναζηεφαζια βκςζημφ ηίηθμο (παναζηεφαζια/δείβια ακαθμνάξ) αναζχκεηαζ ζεζνασηά ηαηά 5 ηάλεζξ ιεβέεμοξ ( ) ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ ζε ακηίζημζπεξ ακηζδνάζεζξ PCR βζα ηδκ ηαηαζηεοή ηαιπφθδξ ακαθμνάξ, αάζεζ ηδξ μπμίαξ ηζηθμπμζμφκηαζ ηα άβκςζηα δείβιαηα. Ωξ δείβια ακαθμνάξ πνδζζιμπμζήεδηε παναζηεφαζια ημο ζμφ BmNPV/Α.gfp (Iatrou & Swevers, 2005a) ιε ηίηθμ 10 9 pfu/ml, πμο πνμζδζμνίζηδηε ιε ηεπκζηή δζαδμπζηήξ αναίςζδξ (end point dilution, (O'Reilly et al., 1992)) Χαπακηηπιζμόρ βακμιδίυν Ζ ιζηνμζημπζηή παναηήνδζδ ηοηηάνςκ Bm5 δζαιμθοζιέκςκ ιε ημ ααηιίδζμ Γlef8 πναβιαημπμζήεδηε ιέζς θςημκζημφ ιζηνμζημπίμο Zeiss Axiovert 25, ζε μναηυ θςξ ηαζ θεμνζζιυ, βζα δζάζηδια 1-2 εαδμιάδςκ, ακάθμβα ιε ημ ζπεδζαζιυ. Πνμηεζιέκμο κα δζαηδνδεεί δ πμζυηδηα ηςκ ηοηηάνςκ ζε επίπεδα πμο επζηνέπμοκ ζοκεπζγυιεκδ ακάπηολδ, μζ ηαθθζένβεζεξ ιεηαθένμκηακ ζε ιεβαθφηενα δμπεία απυ ηδκ ανπζηή πθάηα ηαθθζένβεζαξ 24 εέζεςκ ζε δμπείμ 50 ml υπμηε απαζημφκηακ. Ζ πμζυηδηα ηαζ ηαηακμιή ηςκ ηοηηάνςκ YFP + παναημθμοεμφκηακ ζοζηδιαηζηά, ςξ ιάνηοναξ ηδξ πανμοζίαξ ημο ααηιζδίμο Γlef8: δ επέηηαζδ ηςκ ζδιάηςκ YFP εα οπμδείηκοε παναβςβή ζμζςιάηςκ ηαζ ιυθοκζδ κέςκ ηοηηάνςκ, εκχ δ αφλδζδ ηδξ έκηαζήξ ημοξ ζηα ίδζα ηφηηανα εα απμηεθμφζε πζεακχξ έκδεζλδ ακαπαναβςβήξ ημο ζζημφ DNA ηαζ ζοκαηυθμοεδξ αφλδζδξ ηςκ εέζεςκ ιεηαβναθήξ ημο βμκζδίμο eyfp. Ακηζδνάζεζξ PCR πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ακίπκεοζδ ζζηχκ βμκζδίςκ (gp64) ηαζ ιεηαβνάθςκ (gp64, lef8, orf40, vp39). Ζ ακίπκεοζδ ημο ζζημφ βμκζδίμο gp64 έβζκε βζα ηδκ εηηίιδζδ ηςκ ακηζβνάθςκ ζζημφ DNA, ζηδ αάζδ υηζ ηάεε βμκζδίςια πενζέπεζ έκα 76

98 ακηίβναθμ ημο gp64. Οζ ακηζδνάζεζξ PCR ιεηά απυ ακηίζηνμθδ ιεηαβναθή πανείπακ πθδνμθμνίεξ ζπεηζηά ιε ηδκ έηθναζδ ζδιακηζηχκ ζζηχκ βμκζδίςκ ζε δζάθμνεξ θάζεζξ ημο ηφηθμο ιυθοκζδξ. Οζ παναπάκς ηεπκζηέξ πνδζζιμπμζήεδηακ ηονίςξ ζε ζοκδοαζιυ ιε πεζνάιαηα πνμκζηήξ ιεθέηδξ (time course) ιμθφκζεςκ ηαζ δζαιμθφκζεςκ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ααηιίδζα ή/ηαζ πθαζιίδζα. ηζξ ιμθφκζεζξ, δ πνμζεήηδ ημο ζμφ απμηεθεί ημ πνμκζηυ ζδιείμ 0, εκχ ζηζξ δζαιμθφκζεζξ, ημ ηέθμξ ηδξ επχαζδξ ιε ηδκ ακηζηαηάζηαζδ ημο δζαθφιαημξ θζπμζςιάηςκ-dna, απυ ημ πθήνεξ οθζηυ ηαθθζένβεζαξ. ηζξ πενζπηχζεζξ ιυθοκζδξ, ζηζξ 1-2 h ιεηά ηδκ εθανιμβή ημο ζμφ ημ ιέζμ ηαθθζένβεζαξ απμιαηνοκυηακ, αημθμοεμφζε έηπθοζδ ηαζ πνμζεήηδ κέμο ιέζμο ηαθθζένβεζαξ. ε υθεξ ηζξ πενζπηχζεζξ, ημ ανπζηυ ζζηυ βεκεηζηυ οθζηυ (δζαιμθφκζεζξ) ή δ ανπζηή πμζυηδηα ζμζςιάηςκ, υπςξ οπμθμβζγυηακ απυ ημκ ακηίζημζπμ ηίηθμ (ιμθφκζεζξ), ήηακ ηαοηυζδια βζα υθα ηα ζοβηνζκυιεκα ααηιίδζα Αλςζιδυηή ανηίδπαζη ηηρ πολςμεπάζηρ (PCR) Ζ αθοζζδςηή ακηίδναζδ ηδξ πμθοιενάζδξ απμηεθεί ηεπκζηή απμιυκςζδξ ηαζ πμθθαπθαζζαζιμφ αθθδθμοπζχκ DNA ηαζ ζηδνίγεηαζ ζηδ πνήζδ εενιμακεεηηζηχκ πμθοιεναζχκ DNA απυ εενιυθζθα (extremophile/extreme thermophile) ααηηήνζα (Ishino & Ishino, 2014). Ζ ζηαεενυηδηα ηςκ εκ θυβς εκγφιςκ ζε εενιμηναζίεξ απμδζάηαλδξ ηςκ κμοηθεσηχκ μλέςκ επζηνέπεζ ηδ βεςιεηνζηή αφλδζδ εκυξ επζεοιδημφ ηιήιαημξ DNA απθχξ ιε εκαθθαβή εενιμηναζίαξ βζα πμθθαπθμφξ ηφηθμοξ ακηίδναζδξ. Σμ επζθεβιέκμ ηιήια DNA μνζμεεηείηαζ ιε μθζβμκμοηθεμηίδζα ιεβέεμοξ κμοηθεμηζδίςκ, ζοιπθδνςιαηζηά πνμξ ηα άηνα ημο, ηα μπμία μκμιάγμκηαζ εηηζκδηέξ (primers). ε έκα ζηάδζμ ανπζηήξ εενιζηήξ απμδζάηαλδξ ημο DNA, μζ κμοηθεμηζδζηέξ αθοζίδεξ ηδξ πενζμπήξ-ζηυπμο απμιαηνφκμκηαζ ηαζ, ιε ηδ ζοκαηυθμοεδ πηχζδ ηδξ εενιμηναζίαξ, μζ εηηζκδηέξ οανζδμπμζμφκηαζ ζηζξ ζοιπθδνςιαηζηέξ ημοξ εέζεζξ (ζηάδζμ οανζδμπμίδζδξ). Ζ εενιμηναζία ζηαεενμπμζείηαζ ηέθμξ ζηδκ ηαηάθθδθδ ηζιή βζα αέθηζζηδ δναζηζηυηδηα ηδξ εενιμακεεηηζηήξ πμθοιενάζδξ ηαζ αοηή επεηηείκεζ ημοξ εηηζκδηέξ 5 πνμξ 3 ιε οπυζηνςια ημ επζθεβιέκμ DNA (ζηάδζμ επζιήηοκζδξ). Σα δίηθςκα ακηίβναθα πμο πνμηφπημοκ απμδζαηάζζμκηαζ εη κέμο ιε αφλδζδ ηδξ εενιμηναζίαξ ηαζ δ παναπάκς δζαδζηαζία επακαθαιαάκεηαζ δζαδμπζηά. 77

99 Σειηθνύ ζεκείνπ (end point) PCR Οζ ακηζδνάζεζξ πναβιαημπμζμφκηαζ ιε ανπζηή απμδζάηαλδ ζημοξ 94 μ C βζα 3 min ηαζ ζηδ ζοκέπεζα βζα 35 ηφηθμοξ απμδζάηαλδξ ζημοξ 94 μ C (45 s), οανζδμπμίδζδξ ηςκ εηηζκδηχκ ζημοξ 60 μ C (35 s), εηηυξ ακ ακαθένεηαζ δζαθμνεηζηά, ηαζ επζιήηοκζδξ ζημοξ 72 o C (1 min/kb πνμσυκημξ). Μεηά ημ ηέθμξ ηςκ ηφηθςκ πμθθαπθαζζαζιμφ ημο βεκεηζημφ οθζημφ αημθμοεεί έκα ζηάδζμ ηεθζηήξ επζιήηοκζδξ 1-3 min. Ωξ εθάπζζημξ πνυκμξ επζιήηοκζδξ ακά ηφηθμ εεςνμφκηαζ ηα 30 s. Ζ εενιμηναζία οανζδμπμίδζδξ ηςκ εηηζκδηχκ ιε ημ οπυζηνςια ελανηάηαζ απυ ηδκ αθθδθμοπία ηςκ εηηζκδηχκ ηαζ ηδκ εηάζημηε εθανιμβή. Υνδζζιμπμζήεδηακ ηα ακηζδναζηήνζα DreamTaq (Thermo Scientific) ηαζ HyTest Taq πμθοιενάζδ. Ζ ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ ηςκ εηηζκδηχκ (παναηίεεκηαζ ζημκ Πίκαηα 2.2) ήηακ 4 ng/ιl ηαζ ηςκ δεμλοκμοηθεμηζδίςκ datp, dttp, dctp ηαζ dgtp 0.4 mm. Ο ηεθζηυξ υβημξ ακηίδναζδξ είκαζ 25 ιl ηαζ πνδζζιμπμζμφκηαζ 5 u πμθοιενάζδξ. Γζα ηδκ ηθςκμπμίδζδ ηςκ ακμζηηχκ πθαζζίςκ ακάβκςζδξ ηαζ βεκζηά υπμο απαζηείηαζ επζπθέμκ πζζηυηδηα ζηδκ ακαπαναβςβή βεκεηζηχκ ηιδιάηςκ πνδζζιμπμζήεδηε ημ ακηζδναζηήνζμ HF Platinum Taq (Life Technologies), πμο δζαεέηεζ δοκαηυηδηα επζδζυνεςζδξ ζθαθιάηςκ (proof-reading). Ζ ιέεμδμξ πνδζζιμπμζήεδηε ηαζ βζα ζοθθμβή διζπμζμηζηχκ δεδμιέκςκ, ηα μπμία ιεηνχκηαζ απυ ηδ ζπεηζηή έκηαζδ ημο επαβυιεκμο απυ EtBr θεμνζζιμφ, ιεηά απυ δθεηηνμθυνδζδ ηςκ πνμσυκηςκ ζε πήηηςια αβανυγδξ δ έκηαζδ απμηεθεί ζοκάνηδζδ ηδξ πμζυηδηαξ ημο πνμσυκημξ. ε αοηέξ ηζξ πενζπηχζεζξ πναβιαημπμζήεδηε δζενεφκδζδ ημο αέθηζζημο ανζειμφ ηφηθςκ ακηίδναζδξ, χζηε κα είκαζ εθζηηή δ ζφβηνζζδ ηςκ πνμσυκηςκ. Ζ ηθςκμπμίδζδ ηςκ πνμσυκηςκ ηδξ PCR, πςνίξ πεναζηένς επελενβαζία, πναβιαημπμζήεδηε ηαηά πενίπηςζδ ιε ηδ πνήζδ ημο ζοζηήιαημξ pgem -T Easy (Promega), αάζεζ ηςκ μδδβζχκ ημο ηαηαζηεοαζηή. Σμ ζφζηδια αοηυ ααζίγεηαζ ζηδκ ηεπκζηή ηδξ ηθςκμπμίδζδξ TA (T: εοιζδίκδ, Α: αδεκμζίκδ/ TA cloning, (Zhou & Gomez-Sanchez, 2000)), δ μπμία πνδζζιμπμζεί ηα 3 πνμελέπμκηα άηνα αδεκμζίκδξ, πμο ηαηά πνμηίιδζδ πνμζεέηεζ δ Taq DNA πμθοιενάζδ ζηα δίηθςκα ιυνζα DNA. Ζ πνμζεήηδ είκαζ ακελάνηδηδ ηδξ αθθδθμοπίαξ-οπμζηνχιαημξ (non-template dependent) ηαζ ηα πνμσυκηα PCR ιε ηα πνμελέπμκηα άηνα ηθςκμπμζμφκηαζ ζε θμνείξ ιε ζοιπθδνςιαηζηά πνμελέπμκηα άηνα εοιζδίκδξ, απυ υπμο ηαζ δ μκμιαζία TA. 78

100 Πνζνηηθή/πξαγκαηηθνύ ρξόλνπ (quantitative/real time) PCR Οζ ακηζδνάζεζξ πμζμηζηήξ PCR πναβιαημπμζμφκηαζ ιε ανπζηή απμδζάηαλδ ζημοξ 95 μ C βζα 10 min ηαζ εκ ζοκεπεία βζα 40 ηφηθμοξ απμδζάηαλδξ ζημοξ 95 μ C (5 s), οανζδμπμίδζδξ ηςκ εηηζκδηχκ ζημοξ 60 μ C (30 s) ηαζ επζιήηοκζδξ ζημοξ 72 o C (5 s). Υνδζζιμπμζείηαζ ημ ακηζδναζηήνζμ KAPA SYBR Fast (Kapa research), ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδ ζοζηεοή Stratagene Mx3000p ηαζ ημ θμβζζιζηυ ακάθοζδξ MxPro v.4.1 ημο ηαηαζηεοαζηή. Γζα ακηζδνάζεζξ ζε οπυζηνςια DNA, υθα ηα δείβιαηα αναζχκμκηαζ ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 35 ή 50 ng/ιl ηαζ 70 ng πνδζζιμπμζμφκηαζ ςξ οπυζηνςια. Γζα ακηζδνάζεζξ ιε οπυζηνςια cdna (RT-qPCR), υθα ηα δείβιαηα cdna αναζχκμκηαζ 1:20 ηαζ 2 ιl πνδζζιμπμζμφκηαζ ςξ οπυζηνςια. Ζ ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ ηςκ εηηζκδηχκ (παναηίεεκηαζ ζημκ Πίκαηα 2.3) ήηακ 3 ιm ζε ηεθζηυ υβημ ακηίδναζδξ 15 ιl. Ζ επελενβαζία ηςκ δεδμιέκςκ πναβιαημπμζήεδηε ιέζς ημο θμβζζιζημφ LinRegPCR (Ruijter et al., 2009). Με ηδ αμήεεζα ημο θμβζζιζημφ MxPro ηα δεδμιέκα ελάβμκηαζ ζε αηαηένβαζηδ ιμνθή (raw format). Πνμζδζμνίγμκηαζ μζ ηζιέξ Rn δ έκηαζδ θεμνζζιμφ ηδξ πνςζηζηήξ-ιάνηονα SYBR green I ακά δείβια δζαζνμφιεκδ ιε ηδκ ακηίζημζπδ έκηαζδ θεμνζζιμφ ηδξ παεδηζηήξ πνςζηζηήξ εθέβπμο, ROX ηαζ ηνμθμδμημφκηαζ ζημ πνυβναιια LinRegPCR, ιε ημ μπμίμ οπμθμβίγεηαζ δ απυδμζδ ηςκ ακηζδνάζεςκ ακά γεφβμξ εηηζκδηχκ (amplicon group), ηαεχξ ηαζ δ ανπζηή πμζυηδηα πνμηφπμο DNA/cDNA ακά δείβια, εηθναζιέκδ ζε αοεαίνεηεξ/ζπεηζηέξ (arbitrary/relative) ιμκάδεξ θεμνζζιμφ. Σα απμηεθέζιαηα ηακμκζημπμζμφκηαζ (calibration) πνμξ ηζξ ακηίζημζπεξ ηζιέξ βζα ημ ηοηηανζηυ βμκίδζμ ακαθμνάξ Transcription Initiation Factor 3, subunit 4 (TIF, (Wang et al., 2008)). Λυβς ηδξ εθάηηςζδξ παναβςβήξ ημο ιεηάβναθμο TIF ζηα υρζια ζηάδζα ηδξ ζζηήξ ιυθοκζδξ, δεκ ήηακ εθζηηή δ πνήζδ ημο ςξ βμκίδζμ ακαθμνάξ πένακ ηςκ 72hpt ηαζ υθα ηα απμηεθέζιαηα ηδξ ιεθέηδξ ηςκ ιεηαβνάθςκ πανμοζζάγμκηαζ ιέπνζ αοηυ ημ πνμκζηυ ζδιείμ. Ζ παναπάκς ακςιαθία ελδβείηαζ ςξ απμηέθεζια ηδξ ίδζαξ ηδξ ζζηήξ ιυθοκζδξ ηαζ ηδξ ηαηαζηαθηζηήξ επίδναζήξ ηδξ ζηδκ παναβςβή ηοηηανζηχκ ιεηαβνάθςκ. Σα απμηεθέζιαηα πανμοζζάγμκηαζ ηακμκζημπμζδιέκα (calibrated) πνμξ ηζξ ακηίζημζπεξ ηζιέξ ζζηχκ βμκζδζςιαηζηχκ ακηζβνάθςκ ηαζ ιεηαβνάθςκ ημο ααηιζδίμο άβνζμο ηφπμο (wt). Όπμο απαζηείηαζ, έπεζ πναβιαημπμζδεεί έκαξ επζπθέμκ οπμθμβζζιυξ βζα ηδκ έηθναζδ ηςκ ιεηαβνάθςκ ακά ακηίβναθμ ζζημφ βμκζδζχιαημξ: μζ 79

101 Πίλαθαο 2.2 Δθθηλεηέο PCR ηειηθνύ ζεκείνπ (end point) Δθθηλεη ήο Forward Reverse Αλαθνξά 5F 5 CTCGACGGACAACAGACACA 3 5 TTGCCGAAAACATTGTAAAGC 3 Πανυκ 3F 5 GTTGCCAATCACGTTCGAGT 3 5 CGCGCTTACGGCTATTTG 3 Πανυκ lef8 3F 5 ACAAACCACACTGGACACGA 3 Πανυκ lef8 5R 5 AGCGCGTGCCGAATATAACG 3 Πανυκ polh R 5 CGTGTACCTCGTCGCCAACC 3 (Kenoutis et al., 2006) C ATTTTGATGATGGAGGTGCGC 3 5 GACCCTCTCATACAATCGTTG 3 Πανυκ TV2 5 TGTCACCACGTTGGCCATTC 3 5 GCGTTCTATCATCCTGGCAC 3 Πανυκ zeo R 5 GATCGGCGCGCCGCCGTCGGACCGGCGGTGTT 3 (AscI) Πανυκ gfp R 5 ACTTGTACAGCTCGTCCATGCC 3 (Efrose et al., 2010) Α.1 5 GACGAAGAAGTTGCCGCGTTGG 3 (Machado et al., 2007) (Efrose et yfp F 5 CACAACGTCTATATCATGGCCG 3 al., 2010) mac3 5 AGCGTGCGCGTTACCATA 3 5 AGGTAAAGGGACGGAGAACC 3 Πανυκ M13/pUC 5 CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG 3 5 AGCGGATAACAATTTCACACAGG 3 (Invitrogen, 2004) Bm40 Πίλαθαο ATATATGGATCCAATTATGTCTAAACGTGTTC 3 (BamHI) Δθθηλεηέο PCR πξαγκαηηθνύ ρξόλνπ (qpcr) Δθθηλεηήο Forward Reverse 5 ATATATGCGGCCGCATTTACGTGTAAGATTTTAAA G 3 (NotI) Πανυκ 5 ATATATGGATCCCGTGTAAGATTTTAAAGAGT 3 (BamHI) Πίλαθαο 2.2 Οζ αθθδθμοπίεξ ηςκ εηηζκδηχκ PCR βζα ακηζδνάζεζξ ηεθζημφ ζδιείμο. Σοπυκ εέζεζξ ακαβκχνζζδξ πενζμνζζηζηχκ εκδμκμοηθεαζχκ ζδιεζχκμκηαζ ιε οπμβνάιιζζδ ηδξ εέζδξ ηαζ ακαθμνά ημο ακηίζημζπμο εκγφιμο (ζε πανέκεεζδ). ε ηάεε πενίπηςζδ παναηίεεηαζ ηαζ δ ακηίζημζπδ αζαθζμβναθζηή ακαθμνά. Μέγεζνο πξντόληνο (bp) Αλαθνξά Bmlef8n 5 ACCCAAATTGATTGTGTCCC 3 5 GAGTTTATTGTCTCGCACCA Πανυκ Bmorf40 5 AAACCCCATTCCGAAGACG 3 5 ATGTCAATTCGCTGGTTCAC Πανυκ Acvp39 5 GACACACGTGAGCTGGACAGAA 3 5 GGTATCCCAAAAACAGCGGAA 3 (Efrose, Swevers et al. 2010) Acgp64 5 CCACCATGGAGAACACCAAGTT 3 5 CCTTCAGCCATGGAAGTGATGT 3 (Efrose, Swevers et al. 2010) TIF 5 ACTTCAAGTTCAGGGCAGAT 3 5 TTAATTGTTTTGTGGAGGCT (Wang, Xia et al. 2008) Πίλαθαο 2.3 Οζ αθθδθμοπίεξ ηςκ εηηζκδηχκ πμζμηζηήξ PCR. ε ηάεε πενίπηςζδ παναηίεεηαζ ημ ιέβεεμξ ημο πνμσυκημξ ηαζ δ ακηίζημζπδ αζαθζμβναθζηή ακαθμνά. 80

102 ηζιέξ πμο πνμέηορακ ιεηά ηδκ ηακμκζημπμίδζδ πνμξ ημκ άβνζμ ηφπμ δζαζνέεδηακ ιε ημ θυβμ ζζηχκ ακηζβνάθςκ DNA ημο ααηιζδίμο Γlef8 πνμξ ημ ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο, μφηςξ χζηε ηα ηεθζηά απμηεθέζιαηα κα ειπενζέπμοκ/θαιαάκμοκ οπυρδ ηζξ δζαθμνέξ ζε επίπεδμ ζζημφ DNA. Ζ ζπεδίαζδ ηςκ εηηζκδηχκ πναβιαημπμζήεδηε ιε ηδ δζαδζηηοαηή εθανιμβή Primer 3.0 (Rozen & Skaletsky, 2000) ηαζ ημ θμβζζιζηυ ακμζηημφ-ηχδζηα (opensource) PerlPrimer (Marshall, 2004). Όθμζ μζ εηηζκδηέξ εθέβπεδηακ ηαζ δζαζηαονχεδηακ ακαθμνζηά ιε ηδκ εζδζηυηδηά ημοξ in silico ιε ηδ δζαδζηηοαηή εθανιμβή Primer-Blast (Ye et al., 2012). Ζ πμζυηδηα ηςκ ακηζδνάζεςκ qpcr παναημθμοεήεδηε απυ ηζξ ζπεηζηέξ ηαιπφθεξ απμδζάηαλδξ (dissociation curves) ηαζ in silico ιε ηδ πνήζδ ημο θμβζζιζημφ LinRegPCR Ανίσνεςζη και ανάλςζη ππυηεφνών Ζ θφζδ ηςκ ηοηηάνςκ πναβιαημπμζήεδηε ζε cracking buffer (Koelle et al., 1991) ιε αναζιυ βζα min. Ο δθεηηνμθμνδηζηυξ δζαπςνζζιυξ ημο εηάζημηε ηοηηανζημφ παναζηεοάζιαημξ έθααε πχνα ζε ζφζηδια αζοκεπμφξ SDS-PAGE (discontinuous SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) ιε πδηηχιαηα 8 12%, ακάθμβα ιε ημκ πεζναιαηζηυ ζπεδζαζιυ. Σα πδηηχιαηα απμηεθμφκηαζ απυ δφμ ηιήιαηα: έκα εζηίαζδξ (stacking), ζε ηαηάθθδθεξ οπμδμπέξ ημο μπμίμο θμνηχκμκηαζ ηα δείβιαηα, ηαζ έκα δζαπςνζζιμφ (separating), πμο έπεηαζ αοημφ ηδξ εζηίαζδξ. Σμ πνχημ είκαζ οπεφεοκμ βζα ηδκ ζοβηέκηνςζδ (ζημίααλδ) ηςκ πνςηεσκχκ ζηδκ ανπή ημο πδηηχιαημξ δζαπςνζζιμφ, χζηε ηα πμθοπεπηίδζα κα εζζέθεμοκ ηαηά ημ δοκαηυκ ιαγί ζημ δεφηενμ υπμο πναβιαημπμζείηαζ δ ηαεαοηυ ακάθοζδ. Σμ πήηηςια εζηίαζδξ ηαηαζηεοάγεηαζ ακαιζβκφμκηαξ 3.6 ml κενμφ, 0.65 ml 30% acrylamide/bis acrylamide, ml 1 M Tris HCl (ph 6.8), 50 ιl 10% (w/v) SDS, 25 ιl 10% (w/v) APS (ammonium persulfate), 8 ιl TEMED (tetramethylethylene-diamine). Σμ πήηηςια δζαπςνζζµμφ ηαηαζηεοάγεηαζ ακαιζβκφμκηαξ Ζ 2 Ο, 30% acrylamide/bis acrylamide, 1.5 Μ Tris HCl (ph 8,8), 10% (w/v) SDS, 50 ιl 10% (w/v) APS ηαζ 8 ιl TEMED. ε ακηίεεζδ ιε ημ πήηηςια εζηίαζδξ, μζ αηνζαείξ υβημζ ηςκ επζιένμοξ ζοζηαηζηχκ ημο πδηηχιαημξ δζαπςνζζιμφ ελανηχκηαζ απυ ηδκ επζεοιδηή ζοβηέκηνςζδ αηνοθαιίδδξ. Πνζκ ηδ θυνηςζδ, ηα δείβιαηα ακαιζβκφμκηαζ ηαζ ανάγμκηαζ βζα 5 min ζε νοειζζηζηυ δζάθοια θυνηςζδξ πμο πενζέπεζ SDS (βζα ζοιποηκςιέκμ δζάθοια 6x: 375 mm 81

103 Tris HCl ph 6.8, 12% SDS, 60% glycerol, 0.6 M DTT (dithiothreitol), 0.06% bromophenol blue). Μδ ακηζζηνεπηή πνχζδ ηςκ πνςηεσκχκ επζηοβπάκεηαζ ιε ημ ακηζδναζηήνζμ Coomassie blue R-250 ηαζ ακηίζημζπμ πνςηυημθθμ ηαπείαξ εθανιμβήξ (Wong et al., 2000) ή ιε πνχζδ ανβφνμο, πμο εκδείηκοηαζ βζα ακίπκεοζδ πνςηεσκχκ ζε ιζηνυηενεξ πμζυηδηεξ. Ακηζζηνεπηή πνχζδ πναβιαημπμζείηαζ ιε ημ ακηζδναζηήνζμ Ponceau (Sambrook et al., 1989). Σμ πνςηυημθθμ ηαπείαξ εθανιμβήξ πενζθαιαάκεζ ημ δζαδμπζηυ αναζιυ ημο πδηηχιαημξ ζε 4 δζαθμνεηζηά δζαθφιαηα: δζάθοια Α (0.05% Coomassie blue R-250, 25% ζζμπνμπακυθδ, 10% μλζηυ μλφ (acetic acid)), δζάθοια B (0.005% Coomassie blue R-250, 10% ζζμπνμπακυθδ, 10% μλζηυ μλφ), δζάθοια C (0.002% Coomassie blue R-250, 10% μλζηυ μλφ) ηαζ δζάθοια D (10% μλζηυ μλφ). οβηεηνζιέκα ημ πήηηςια αοείγεηαζ ζε 100 ml απυ ημ δζάθοια Α, ανάγεηαζ ζε θμφνκμ ιζηνμηοιάηςκ (πνμηείκεηαζ εένιακζδ βζα 1-2 min ζηα 1000 W ζζπφ) ηαζ ιέκεζ ιε ήπζα ακάδεοζδ ζε RT βζα 5 min. ηδ ζοκέπεζα ημ δζάθοια Α απμννίπηεηαζ, αημθμοεεί έηπθοζδ ζε απζμκζζιέκμ H 2 O ηαζ ημ πήηηςια αοείγεηαζ ζημ δζάθοια B. Μεηά απυ κέμ αναζιυ ημ δζάθοια απμννίπηεηαζ, αημθμοεεί κέα έηπθοζδ ηαζ δ δζαδζηαζία επακαθαιαάκεηαζ βζα ηα δζαθφιαηα C ηαζ D. Ο αναζιυξ ζημ δζάθοια D ιπμνεί κα επακαθδθεεί βζα 2-3 θμνέξ βζα αεθηίςζδ ηδξ ακηίεεζδξ. Σμ πνςηυημθθμ πνχζδξ ανβφνμο πενζθαιαάκεζ ηδ ιμκζιμπμίδζδ (fixation) ηςκ πνςηεσκχκ ζημ πήηηςια ιε επίδναζδ δζαθφιαημξ 50% v/v ιεεακυθδξ ηαζ 5% v/v μλζημφ μλέμξ βζα 20 min. ηδ ζοκέπεζα αημθμοεμφκ πθφζεζξ, βζα 10 min δ ηαεειία, δζαδμπζηά ζε 50% ιεεακυθδ ηαζ ζε απζμκζζιέκμ Ζ 2 Ο. Καζ μζ δφμ πθφζεζξ απμζημπμφκ ζηδκ απμιάηνοκζδ ημο μλζημφ μλέςξ. Σμ πήηηςια εοαζζεδημπμζείηαζ (sensitization) ζε δζάθοια 0.02% w/v εεζμεεζζηυ κάηνζμ (sodium thiosulfate) βζα 1 min ηαζ αθμφ εηπθοεεί δφμ θμνέξ 1 min ηδκ ηαεειία ιε απζμκζζιέκμ παναιέκεζ ζε δζάθοια κζηνζημφ ανβφνμο 0.2% βζα 20 min ζημοξ 4 μ C. Αημθμοεμφκ δφμ πθφζεζξ ιε απζμκζζιέκμ H 2 O ηαζ μζ γχκεξ ηςκ πνςηεσκχκ βίκμκηαζ μναηέξ ιέζς δζαδζηαζίαξ ειθάκζζδξ (development) ζε δζάθοια 0.05% v/v θμνιαθίκδξ (θμνιαθίκδ: ημνεζιέκμ δζάθοια θμνιαθδεΰδδξ ζε H 2 O, ήημζ 37% w/v θμνιαθδεΰδδ), 6% w/v ακεναηζηυ κάηνζμ (sodium carbonate) ηαζ 0.02% εεζμεεζζηυ κάηνζμ. Ζ ειθάκζζδ ζοκεπίγεηαζ ιέπνζ κα επζηεοπεεί δ επζεοιδηή έκηαζδ ηςκ γςκχκ ζημ πήηηςια. Σεθζηά ημ δζάθοια ειθάκζζδξ απμννίπηεηαζ ηαζ ημ πήηηςια εηπθέκεηαζ ιε δζάθοια μλζημφ μλέςξ 10%. Σμ πήηηςια ιπμνεί κα απμεδηεοηεί ζε δζάθοια μλζημφ μλέςξ 1% ζημοξ 4 μ C. 82

104 Ζ ακηζζηνεπηή πνχζδ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ημκ έθεβπμ ηδξ πθδνυηδηαξ ηδξ ιεηαθμνάξ ηςκ πνςηεσκχκ απυ ημ πήηηςια πμθοαηνοθαιίδδξ ζηδ ιειανάκδ κζηνμηοηηανίκδξ. Πενζθαιαάκεζ ηδ πνχζδ ηδξ ιειανάκδξ ζε δζάθοια Ponceau S (0,5% Ponseau S ηαζ 1% μλζηυ μλφ ζε Ζ 2 Ο) βζα 5 min. Ζ ιειανάκδ πθέκεηαζ ζηδ ζοκέπεζα ζε H 2 O βζα 2 min. Ζ πνχζδ απμιαηνφκεηαζ πθήνςξ ιε επζπθέμκ 10 min πθφζδξ ζε Ζ 2 Ο. Γζα ηδκ ακμζμακίπκεοζδ ηδξ πνςηεΐκδξ Myc-LEF8, ηφηηανα Bm5 ηαζ Hi5 δζαιμθφκεδηακ ιε ημοξ πθαζιζδζαημφξ θμνείξ έηθναζδξ phsp70.myc-lef8, pea.myclef8 ηαζ peia.myc-lef8. οιπθδνςιαηζηά δείβιαηα εημζιάζηδηακ βζα ημ θμνέα phsp70.myc-lef8 ιε ζημπυ ηδ δζενεφκδζδ ημο επζπέδμο επαβςβήξ ημο απυ εενιζηυ ζμη (heat shock) ηαζ ζηζξ δφμ ηοηηανμζεζνέξ. ηζξ 2 dpt, ιεηά ηδ ζοθθμβή ηςκ θμζπχκ δεζβιάηςκ, μζ ακηίζημζπεξ πθάηεξ ηαθθζένβεζαξ ζθναβίζηδηακ ζε αδζάανμπμοξ θαηέθμοξ ηαζ αθέεδηακ κα επζπθέμοκ ζε οδαηυθμοηνμ 42 o C βζα 30 min. ηδ ζοκέπεζα μζ ηαθθζένβεζεξ ημπμεεηήεδηακ λακά ζημκ επςαζηήνα 28 o C βζα άθθδ ιία χνα πνζκ ηδ ζοθθμβή. Σα ηφηηανα ζε ηάεε πενίπηςζδ εθήθεδζακ ιε θοβμηέκηνδζδ (12 krpm βζα 2 min, RT) ηαζ απμεδηεφηδηακ ζημοξ -70 o C. Πνζκ ηδκ ακάθοζδ ηαηά Western, ηάεε ηαθθζένβεζα οπέζηδ θφζδ ζε cracking buffer (Koelle et al., 1991) ηαζ αναζιυ βζα 30 min. Σα δείβιαηα ακαθφεδηακ ζε πήηηςια πμθοαηνοθαιίδδξ 8% ηαζ ιεηαθένεδηακ ζε ιειανάκδ κζηνμηοηηανίκδξ Hybond ECL. Ζ ηάθορδ ηςκ ιδεζδζηχκ εέζεςκ πνυζδεζδξ πναβιαημπμζήεδηε ζε εενιμηναζία δςιαηίμο (RT) ιε 10% βάθα εθεφεενμ απυ θίπμξ (fat-free) ζε PBS-Tween (0.1% tween) βζα 1 h (PBS: Phosphate-Buffered Saline/ 155 mm NaCl, 1.54 mm Potassium Phosphate monobasic, 2.71 mm Sodium Phosphate dibasic). Γζα ηδκ ακίπκεοζδ ημο επζηυπμο Μyc πνδζζιμπμζήεδηε ακηζ-μyc ιμκμηθςκζηυ ακηίζςια ιουξ (Cell Signalling) ζε ζοβηέκηνςζδ 1:1000 πάθζ ζε 10% βάθα εθεφεενμ απυ θίπμξ (fat-free) ζε PBS-Tween (0,1% tween). Αημθμφεδζε μθμκφηηζα επχαζδ ζημοξ 4 μ C. Σμ δεοηενεφμκ ακηίζςια ειθακίγεζ εζδζηυηδηα βζα ηδ ζηαεενή πενζμπή ηςκ ακμζμζθαζνζκχκ ημο ιουξ (antimouse) ηαζ είκαζ ζογεοβιέκμ ιε ημ έκγοιμ HRP (HRP conjugated). Υνδζζιμπμζήεδηε ζε ζοβηέκηνςζδ 1:5000 ζε PBS-Tween βζα 1 h ζε RT. Οζ ιειανάκεξ ακαθφεδηακ ζε ζοζηεοή Fujifilm LAS-3000, ηαηυπζκ επχαζδξ ιε ημ ακηζδναζηήνζμ Amersham ECL Plus (GE Healthcare Life Sciences), βζα 3 min ζε RT. Γζα ηδκ εηηίιδζδ ημο ιμνζαημφ αάνμοξ πνδζζιμπμζήεδηε μ πνςηεσκζηυξ ιάνηοναξ ιμνζαημφ αάνμοξ PiNK plus prestained marker (GeneDirex), πμο πενζέπεζ 11 πνςηεΐκεξ βκςζημφ ιμνζαημφ αάνμοξ ιε εφνμξ kda. Ζ ίδζα δζαδζηαζία 83

105 ακάθοζδξ (οθζηυ ιυκμ απυ ηδκ ηοηηανζηή ζεζνά Bm5, πμο εηθνάγεζ ζηαεενά ηζξ πνςηεΐκεξ Myc-LEF8 ηαζ ORF40-Myc) αημθμοεήεδηε ηαζ βζα ηδκ ακίπκεοζδ ηδξ πνςηεΐκδξ ORF40-Myc ζε πήηηςια πμθοαηνοθαιζδίμο 12%. In silico ακάθοζδ πνςηεσκχκ πναβιαημπμζήεδηε ιε πνήζδ ηςκ εθανιμβχκ NCBI pblast, Conserved Domains (Marchler-Bauer et al., 2011) ηαζ Superfamily (Wilson et al., 2009). 84

106

107 3. Απνηειέζκαηα

108

109 3. Απνηειέζκαηα A 3.1 Καηαζκεςή και δομική επιβεβαίυζη ηος βακμιδίος Γlef8 BmNPV Σμ ααηιίδζμ Γlef8 BmNPV (εζη. 3.1/A) ηαηαζηεοάζηδηε απυ ημ ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο BmNPV ζε ααηηδνζαηά ηφηηανα DH10b, ιε ημ ζφζηδια ακαζοκδοαζιμφ Red ημο θάβμο θ (Datsenko & Wanner, 2000). Σμ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ ημο βμκζδίμο lef8 ακηζηαηαζηάεδηε ιέζς μιυθμβμο ακαζοκδοαζιμφ απυ ιία ζοζημζπία δφμ ηαζεηχκ έηθναζδξ, εη ηςκ μπμίςκ δ ιία πανάβεζ ζε ηφηηανα εκηυιςκ ηδκ πνςηεΐκδ-ιάνηονα Yellow Fluorescent Protein (YFP) ηαζ δ άθθδ ζε ααηηήνζα ηδκ πνςηεΐκδ ακεεηηζηυηδηαξ ζημ ακηζαζμηζηυ γεμιοηίκδ (εζη. 3.1/A). Ζ παναβςβή ηδξ YFP εθέβπεηαζ απυ ημκ οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ Α3 ημο B. mori ηαζ 5' lef8 πνδζζιεφεζ flank ( ) ζηδ δοκαηυηδηα ακίπκεοζδξ ηδξ πανμοζίαξ 3' ημο lef8 flank ιεηαθθαβιέκμο ( ) ζζημφ ScaI XcmI XcmI ( ) ( ) orf40 ets orf41 ( ) lef8 ORF ( ) odv-e66 ( ) wt 5 γεηηνληθή πεξηνρή 3 γεηηνληθή πεξηνρή 5' lef8 flank ( ) 3' lef8 flank ( ) B ScaI XcmI XcmI ( ) BamHI ( ) orf40 ets 2265 bp orf41 ( ) bght ι3 Γlef8 wt e-yfp actinp Zeo odv-e66 ( ) Γlef8 Δηθόλα 3.1 Α. Απεζηυκζζδ ημο βεκεηζημφ ηυπμο ημο βμκζδίμο lef8 ζημ ααηιίδζμ BmNPV πνζκ (άβνζμξ ηφπμξ/επάλω) ηαζ ιεηά (εθθεζιιαηζηυξ ηφπμξ Γlef8/θάηω) ηδκ ακηζηαηάζηαζδ ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ ημο βμκζδίμο lef8 απυ ημ έκεεια A.yfp/zeo. διεζχκμκηαζ ηα επζιένμοξ ζοζηαηζηά ζημζπεία ημο A.yfp/zeo, δ επζπθέμκ εέζδ πενζμνζζιμφ BamHI πμο εζζάβεζ ζημ ααηιίδζμ, ηαεχξ ηαζ μζ 5 ηαζ 3 βεζημκζηέξ πενζμπέξ ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ lef8, ιε ηα ζζηά ακμζηηά πθαίζζα ακάβκςζδξ πμο πενζέπμοκ (orf-40, orf-41, ets, odv-e66). Δπζπθέμκ ζδιεζχκμκηαζ μζ εέζεζξ πενζμνζζιμφ ScaI ηαζ XcmI, πμο μνζμεεημφκ ημκ πνδζζιμπμζμφιεκμ εοεφβναιιμ θμνέα ακαζοκδοαζιμφ. Οζ ζοκηεηαβιέκεξ ακαθένμκηαζ ζημ βεκεηζηυ πάνηδ ημο ζηεθέπμοξ Σ3 ημο ζμφ BmNPV (Gomi et al., 1999). B. Ακάθοζδ ηιδιάηςκ DNA ιεηά απυ πέρδ ιε ηδκ πενζμνζζηζηή εκδμκμοηθεάζδ BamHI βζα ηα ααηιίδζα αβνίμο ηφπμο (wt) ηαζ Γlef8. Ζ επζπθέμκ εέζδ ακαβκχνζζδξ BamHI πμο εζζάβεζ δ αθθδθμοπία A.yfp/zeo ακαιέκεηαζ κα μδδβήζεζ ζηδκ παναβςβή εκυξ επζπθέμκ πνμσυκημξ ~2.2 kbp (2259 bp), ημ μπμίμ ακζπκεφεηαζ απμηθεζζηζηά ζημ Γlef8. ι3: δείθηεο κνξηαθνύ βάξνπο DNA (βι. παξάξηεκα) 85

110 DNA ζηα ηφηηανα λεκζζηέξ, ηαεχξ ηαζ παναημθμφεδζδξ ηδξ πμνείαξ ημο ζηδκ ηαθθζένβεζα. Ζ ηαζέηα ακεεηηζηυηδηαξ ζηδ γεμιοηίκδ πανέπεζ ηδ δοκαηυηδηα επζθμβήξ ημο ιεηαθθαβιέκμο ααηιζδίμο ζε ααηηήνζα. Ο βεκεηζηυξ ηυπμξ ημο βμκζδίμο lef8 πνζκ ηαζ ιεηά ηδκ ηνμπμπμίδζδ απεζημκίγμκηαζ ζηδκ εζηυκα 3.1/A. Ζ ακηζηαηάζηαζδ επζαεααζχεδηε δμιζηά: α) ιε ακάθοζδ ηιδιάηςκ DNA ιεηά απυ πέρδ ιε ηδκ πενζμνζζηζηή εκδμκμοηθεάζδ BamHI. Ο εκ θυβς ακαζοκδοαζιυξ εζζάβεζ ιία επζπθέμκ εέζδ ακαβκχνζζδξ ηδξ BamHI ζημ ζζηυ βμκζδίςια, δ μπμία μδδβεί ζηδκ παναβςβή εκυξ επζπθέμκ ηιήιαημξ 2265 bp ηαηά ηδκ πέρδ (εζη. 3.1/B), α) ιε ακηζδνάζεζξ PCR βζα ηδκ ακίπκεοζδ ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ ημο βμκζδίμο lef8 (δεκ ακζπκεφεδηε πνμσυκ υπςξ ήηακ ακαιεκυιεκμ), β) ιε ακηζδνάζεζξ PCR βζα ηδκ απυδεζλδ ηδξ ακηζηαηάζηαζδξ ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ ημο 5' lef8 flank ( ) 3' lef8 flank ( ) A ScaI XcmI ( ) BamHI ( ) orf40 ets XcmI 5F_F 5F_R orf41 ( ) TV2 F yfp F bgh pa e-yfp A1 Ac3 R actinp Zeo R Zeo TV2 R 3F_F 3F_R odv-e66 ( ) B ι2,3 wt Γlef8 TV N ι2,3 wt Γlef8 TV N ι2, bp 3250 bp Δηθόλα 3.2 Α. Απεζηυκζζδ ημο βεκεηζημφ ηυπμο ημο βμκζδίμο lef8 ζημ ααηιίδζμ Γlef8, ηαεχξ ηαζ ηςκ ζπεηζηχκ εέζεςκ ηςκ εηηζκδηχκ PCR πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ επζαεααίςζδ ηδξ ακηζηαηάζηαζδξ ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ lef8 απυ ηδκ αθθδθμοπία A.yfp/zeo. Ζ αθθδθμφπδζδ ιε ημοξ εηηζκδηέξ 5F_F/R ηαζ 3F_F/R έδεζλε υηζ μζ εέζεζξ πενζμνζζιμφ ScaI ηαζ XcmI, πμο μνζμεεημφκ ημκ εοεφβναιιμ θμνέα ακαζοκδοαζιμφ, ηαεχξ ηαζ μζ πενζμπέξ εηαηένςεέκ ημοξ, πανέιεζκακ δμιζηά ακαθθμίςηεξ, βεβμκυξ πμο ζοκεπάβεηαζ υηζ μ ακαζοκδοαζιυξ οπήνλε αηνζαήξ. Οζ ακηζδνάζεζξ αθθδθμφπδζδξ ιε ημοξ εηηζκδηέξ TV2 F ηαζ TV2 R επζαεααίςζακ ηδ ζφκδεζδ ιε ηδκ αθθδθμοπία A.yfp/zeo, ηαεχξ ηαζ υηζ μζ άιεζα βεζημκζηέξ ζζηέξ πενζμπέξ παναιέκμοκ ακαθθμίςηεξ. Β. Ακηζδνάζεζξ PCR ιε ηα γεφβδ εηηζκδηχκ 5F_F/yfp F (ανζζηενά/ακαιεκυιεκμ πνμσυκ: 1716 bp) ηαζ 3F_R/Ac3 R (δελζά/ακαιεκυιεκμ πνμσυκ: 3296 bp) επζαεααίςζακ πεναζηένς ημκ ακαζοκδοαζιυ. Ωξ εεηζηυ δείβια εθέβπμο πνδζζιμπμζήεδηε μ πθαζιζδζαηυξ θμνέαξ ptva.yfp/zeo (TV), εκχ ςξ ανκδηζηυ, Ζ 2 Ο (N). Γεκ ακαιέκεηαζ πνμσυκ ζημ ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο (wt). Ακηίζημζπεξ ακηζδνάζεζξ ιε εηηζκδηέξ εζδζημφξ βζα ηδκ ακίπκεοζδ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο lef8 ήηακ ανκδηζηέξ (δελ παξνπζηάδνληαη). ι2,3: δείθηεο κνξηαθνύ βάξνπο DNA (βι. ζην παξάξηεκα) 86

111 βμκζδίμο lef8 απυ ηδκ αθθδθμοπία A.yfp/zeo (εζη. 3.2) ηαζ δ) ιε ηδκ αθθδθμφπδζδ ηςκ πενζμπχκ ζφκδεζδξ ημο εοεφβναιιμο θμνέα ακαζοκδοαζιμφ (μνίγεηαζ απυ ηζξ εέζεζξ πενζμνζζιμφ ScaI ηαζ XcmI/ βι. εηθ. 3.2/Α θαη γηα ηα απνηειέζκαηα ηεο αιιεινύρεζεο, ελδεηθηηθά ζην παξάξηεκα, εηθ. Π2/3) ηαζ ημο ααηιζδίμο, πμο έδεζλε επαηνζαή δζπθυ ακαζοκδοαζιυ. Γζα ηδκ μθμηθήνςζδ ηδξ δμιζηήξ επζαεααίςζδξ πναβιαημπμζήεδηε, επζπθέμκ, ηαζ αθθδθμφπδζδ ηςκ πενζμπχκ ζφκδεζδξ ημο ααηιζδίμο ηαζ ηδξ αθθδθμοπίαξ A.yfp/zeo ιε πνήζδ ηςκ εηηζκδηχκ TV2 F ηαζ TV2 R (εζη. 3.2/Α). Οζ ζοβηεηνζιέκεξ εέζεζξ απμηεθμφκ εζςηενζηά ζοζηαηζηά ημο εοεφβναιιμο θμνέα μιυθμβμο ακαζοκδοαζιμφ, πμο δε εα έπνεπε κα έπμοκ ιεηααθδεεί, βεβμκυξ πμο επζαεααζχεδηε ιε ηδκ παναπάκς αθθδθμφπδζδ (βι. ζην παξάξηεκα, εηθ. Π4/5). 3.2 Χαπακηηπιζμόρ ηος βακμιδίος Γlef Φαηλνηππηθή αλάιπζε ηνπ βαθκηδίνπ Γlef8 Ο θαζκυηοπμξ ιεηά απυ δζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ημ ααηιίδζμ Γlef8 BmNPV εα πνέπεζ κα πανμοζζάγεζ ηα ελήξ παναηηδνζζηζηά ιε αάζδ ηδκ οπυεεζδ ενβαζίαξ: ηα δζαιμθοζιέκα ηφηηανα εα πνέπεζ κα ειθακίγμοκ πνάζζκμ θεμνζζιυ θυβς ηδξ έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ-ιάνηονα YFP. δε εα πνέπεζ κα παναηδνείηαζ παναβςβζηή ιυθοκζδ ζηα ηφηηανα, δεδμιέκμο υηζ δ απμοζία ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 ηαεζζηά αδφκαηδ ηδκ πνυμδμ ηδξ ιυθοκζδξ πένακ ηδξ ακηζβναθήξ ημο ζζημφ DNA, ηαεχξ ηαζ ηδκ παναβςβή ζζηχκ ζςιαηζδίςκ. βζα ημκ ίδζμ θυβμ ιδ παναβςβή ζζηχκ ζςιαηζδίςκ δε εα πνέπεζ κα οπάνπεζ «επέηηαζδ» ημο θεμνίγμκημξ ζήιαημξ ζε ιδ YFP + ηφηηανα. Σμ ααηιίδζμ Γlef8 ζηακμπμζεί υθα ηα παναπάκς ηνζηήνζα βζα ημοθάπζζημκ 14 διένεξ ιεηά ηδ δζαιυθοκζδ (dpt: days post transfection), πμο ζοκζζημφκ ηαζ ημ ιεβαθφηενμ δζάζηδια ζοζηδιαηζηήξ παναηήνδζδξ (εζη. 3.3). Σμ θαζκυιεκμ έπεζ επζαεααζςεεί ζε δφμ δζαηνζηά πεζνάιαηα ηδξ παναπάκς δζάνηεζαξ ηαζ ζδιακηζηυ ανζειυ ακηίζημζπςκ ιεθεηχκ ιζηνυηενδξ δζάνηεζαξ. 87

112 5 dpt 14 dpt Δηθόλα 3.3 Υαναηηδνζζηζηή εζηυκα ηοηηάνςκ Bm5 δζαιμθοζιέκςκ ιε ημ ααηιίδζμ Γlef8, ηδκ 5 δ ηαζ 14 δ διένα ιεηά ηδ δζαιυθοκζδ (dpt). Δίκαζ ειθακήξ δ παναβςβή YFP, ηαεχξ ηαζ δ ιείςζδ ηςκ YFP + ηοηηάνςκ ιε ηδκ πάνμδμ ημο πνυκμο. Ζ ιείςζδ είκαζ ακαιεκυιεκδ δεδμιέκδξ ηδξ αδοκαιίαξ επέηηαζδξ ημο ααηιζδίμο πένα απυ ηα ηφηηανα ζηα μπμία εζζήπεδ ηαηά ηδ δζαιυθοκζδ. Δπζπθέμκ, θυβς ηδξ απμοζίαξ παεμβέκεζδξ, ηα ηφηηανα πμθθαπθαζζάγμκηαζ θοζζμθμβζηά, αολάκμκηαξ ζδιακηζηά ημ θυβμ Γlef8 - /Γlef8 + ηαζ άνα ηαζ YFP - /YFP + ηοηηάνςκ. Παναηήνδζδ ζε ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ πςνίξ (ανζζηενά) ηαζ ιε θεοηυ θςξ (δελζά) Μνξηαθή αλάιπζε ηνπ βαθκηδίνπ Γlef8 Ζ πμζμηζημπμίδζδ ημο εκδμηοηηάνζμο ζζημφ DNA ιεηά απυ δζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ηα ααηιίδζα αβνίμο ηφπμο ηαζ Γlef8 ακηίζημζπα, έδεζλε ηδκ έκημκδ ακηίεεζδ ακάιεζα ζημ ζηαεενά αολακυιεκμ DNA ημο ααηιζδίμο αβνίμο ηφπμο ηαζ ημο Γlef8 ιεηά απυ ηζξ 48 hpt (hours post transfection). Παν υθα αοηά, ηα επίπεδα Γlef8 DNA πανέιεζκακ πναηηζηά αιεηάαθδηα βζα ημοθάπζζημκ ιία εαδμιάδα πανέπμκηαξ έκα πνυηοπμ ακάπηολδξ πανυιμζμ ιε αοηυ ηςκ vlf1 (vlf1: very late expression factor 1/πανάβμκηαξ πμθφ υρζιδξ έηθναζδξ 1) ηαζ an (an: alkaline nuclease/αθηαθζηή κμοηθεάζδ) Knock-Out (KO) AcMNPV ααηιζδίςκ, ηςκ μπμίςκ επίζδξ ημ DNA πμθθαπθαζζάγεηαζ ιυκμ ζηα ανπζηά δζαιμθοζιέκα ηφηηανα (Vanarsdall et al., 2005). Ζ ζηαδζαηή ιείςζδ ημο πθαζιζδίμο peia.myc-lef8 θεζημονβεί ςξ πανάδεζβια ημο πνμηφπμο ιεηααμθήξ εκυξ ιδ πμθθαπθαζζαγυιεκμο βεκεηζημφ θμνέα. Δπζπθέμκ, δ απμοζία δεοηενμβεκμφξ ιυθοκζδξ απυ ημ εθθεζιιαηζηυ Γlef8 δζαιμνθχκεζ ηεθζηά έκα ακχηαημ υνζμ ζζημφ πενζεπμιέκμο ζηδκ ηαθθζένβεζα. Σμ ζζηυ DNA παναιέκεζ ηαζ πμθθαπθαζζάγεηαζ, υζμ είκαζ εθζηηυ, ιυκμ ζημ ζπεηζηά 88

113 ιζηνυ πμζμζηυ (~10%) ηοηηάνςκ ζηα μπμία εζζήπεδ ηαηά ηδ δζαιυθοκζδ, πανέπμκηαξ ηαιπφθεξ ακάπηολδξ υπςξ αοηή ηδξ εζηυκαξ 3.4. Σα παναπάκς απμηεθέζιαηα θαίκμκηαζ αζφιααηα ιε εηείκα ηδξ εενιμεοαίζεδηδξ ιεηάθθαλδξ ημο βμκζδίμο lef8, υπμο δζαπζζηχεδηε πμθθαπθαζζαζιυξ ημο ζζημφ βμκζδζχιαημξ ζημ επίπεδμ ημο αβνίμο ηφπμο (Farrell, 1998; Shikata et al., 1998). Αοηυ υιςξ μθείθεηαζ ζηζξ δζαθμνεηζηέξ πεζναιαηζηέξ πνμζεββίζεζξ. ηδκ πανμφζα ιεθέηδ δ πανμοζία ημο ιεηαθθαβιέκμο ζμφ ήηακ εθζηηή ιυθζξ ζημ ~10% ηςκ ηοηηάνςκ, πμο ακηζζημζπεί ζηδ ιέζδ απυδμζδ ηδξ δζαιυθοκζδξ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ααηιίδζμ, έκακηζ ημο πναηηζηά 100% ηςκ ηοηηάνςκ, πμο ιμθφκμκηαζ ζηδκ πενίπηςζδ ηδξ εενιμεοαίζεδηδξ ιεηάθθαλδξ, υπμο είπε πνδζζιμπμζδεεί ορδθή δυζδ ζμζςιάηςκ (Shikata et al., 1998). Ο θαζκυηοπμξ ημο ααηιζδίμο Γlef8, ιε αάζδ ηα παναπάκς, πανμοζζάγεζ υθα ηα ακαιεκυιεκα παναηηδνζζηζηά εκυξ εθθεζιιαηζημφ βζα ημ βμκίδζμ lef8 BmNPV ααηιζδίμο ηαζ είκαζ ζοιααηυξ ιε ημοξ ακηίζημζπμοξ θαζκυηοπμοξ ηδξ εενιμεοαίζεδηδξ ιεηάθθαλδξ lef8 ts ηαζ ηδξ απμζζχπδζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 ιέζς RNAi, πμο έπμοκ πενζβναθεί (Schultz & Friesen, 2009; Shikata et al., 1998). Δηθόλα 3.4 Ακάθοζδ ηςκ ζπεηζηχκ επζπέδςκ ζζημφ DNA ηαζ ημο πθαζιζδίμο peia.myc-lef8 ιεηά απυ δζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο, Γlef8 ηαζ Γlef8+pEIA.myc-lef8 ιε πμζμηζηή PCR (qpcr). Οζ βναιιέξ ζθάθιαημξ ακηζπνμζςπεφμοκ ηοπζηή απυηθζζδ (Γlef8/wt: N=6, πθαζιίδζμ: N=2). 89

114 3.2.3 Ο θαηλόηππνο ηνπ βαθκηδίνπ Γlef8 νθείιεηαη απνθιεηζηηθά ζηελ απνπζία ηνπ αλνηθηνύ πιαηζίνπ αλάγλσζεο ηνπ γνληδίνπ lef8 Σμ ζφζηδια ακαζοκδοαζιμφ πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή ημο ααηιζδίμο Γlef8 επάβεζ ηδκ αηνζαή ημπμεέηδζδ ημο επζθεβιέκμο εκεέιαημξ ζηδκ πανμφζα πενίπηςζδ A.yfp/zeo ζηδ εέζδ ζηυπεοζδξ. Ζ ακηζηαηάζηαζδ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο βμκζδίμο lef8 απυ ηδκ αθθδθμοπία A.yfp/zeo απμδείπεδηε, πανάθθδθα υιςξ δεκ ήηακ εθζηηυ κα ελεηαζεεί δ ηαηάζηαζδ ημο οπυθμζπμο ζζημφ βμκζδζχιαημξ, βζα ηοπυκ αθθαβέξ ζε άθθεξ εέζεζξ, μζ μπμίεξ εα ιπμνμφζακ κα ζοιαάθμοκ ή/ηαζ κα πνμηαθμφκ ημκ παναηδνμφιεκμ θαζκυηοπμ ημο εθθεζιιαηζημφ ααηιζδίμο. Γζα ηδκ επζαεααίςζδ ηδξ θεζημονβζηήξ αηεναζυηδηαξ ημο ααηιζδίμο Γlef8, εηηυξ ημο βμκζδίμο lef8, ηαηαζηεοάζηδηε θμνέαξ ακαζοκδοαζιμφ πμο θένεζ ηδκ ηςδζηή πενζμπή lef8 ζδιαζιέκδ ιε αθθδθμοπία ηφπμο myc ζημ 5 άηνμ ηδξ ηαζ ημπμεεηδιέκδ ακάιεζα ζηδκ 5 ηαζ 3 βεζημκζηή πενζμπή lef8 ημο θμνέα ptvγlef8 (εζη. 2.1/A) ζε δφμ ηαηεοεφκζεζξ: ηδ θοζζηή, υπμο ημ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ έπεζ ηδ θμνά ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ lef8 αβνίμο ηφπμο ζε ζπέζδ ιε ηζξ βεζημκζηέξ πενζμπέξ θνξέαο ptv.myc-lef8 ηαζ ηδκ ακηίζηνμθδ, πμο έπεζ ηδκ ακηίζηνμθδ θμνά θνξέαο ptv.myc-lef8 reverse. Ζ ζοκδζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ημ Γlef8 ηαζ ημοξ παναπάκς θμνείξ ακαζοκδοαζιμφ ακαιεκυηακ κα μδδβήζεζ ζηδκ παναβςβή ημο ααηιζδίμο myc-lef8 myc-lef8 ORF orf41 orf40 bght actinp ets odv-e66 Bmlef8 ORF 9702 bp e-yfp myc-lef8 ORF lef8 3' flank rev Zeo Γlef8 TV2 N-myc Bmlef8 lef8 5' flank Δηθόλα 3.5 πδιαηζηή απεζηυκζζδ ηδξ ακηζηαηάζηαζδξ ημο εκεέιαημξ A.yfp/zeo ζημ ααηιίδζμ Γlef8 απυ ηδ ζδιαζιέκδ ηςδζηή πενζμπή myc-lef8 ζε δφμ ηαηεοεφκζεζξ. Μυκμ δ θοζζηή θμνά εκζςιάηςζδξ (myc-lef8 ORF) δζέζςζε ημ εθθεζιιαηζηυ ααηιίδζμ. διεζχκμκηαζ επζπθέμκ δ ακηίζηνμθδ ηαηεφεοκζδ εκζςιάηςζδξ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ lef8 (myc-lef8 ORF rev) ηαζ μζ ηςδζηέξ πενζμπέξ βμκζδίςκ πμο ανίζημκηαζ ζηζξ βεζημκζηέξ πενζμπέξ lef8 (απυ ανζζηενά πνμξ δελζά: orf41, orf40, ets ηαζ odv-e66). TV2S FABAA A.yfp/zeo bp 90

115 BmNPV (εζη. 3.5), θυβς ηδξ εηηεηαιέκδξ μιμθμβίαξ, πμο μθείθεηαζ ζηζξ βεζημκζηέξ πενζμπέξ. ε αοηυ, δ αθθδθμοπία A.yfp/zeo εα είπε ακηζηαηαζηαεεί ιέζς μιυθμβμο ακαζοκδοαζιμφ απυ ημ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ myc-lef8. Ζ πνδζζιμπμίδζδ ημο πθαζιζδίμο ptv.myc-lef8 μδήβδζε ζηδκ παναβςβή ιμθοζιαηζημφ ζμφ, μ μπμίμξ πνμηάθεζε αφλδζδ ηςκ ηοηηάνςκ YFP + (εζη. 3.6) εζηυκα εκδεζηηζηή εκενβμφ ιυθοκζδξ ηαζ ακάπηολδ ηοηηανζηήξ παεμθμβίαξ, υπςξ δζαπζζηχκεηαζ απυ ηδκ απμηυθθδζδ ηοηηάνςκ απυ ημ οπυζηνςια. Τπενηείιεκμ απυ ηδκ ανπζηή ηαθθζένβεζα ακαπανήβαβε ημκ θαζκυηοπμ ηαζ ζε ακελάνηδηδ ηαθθζένβεζα ηοηηάνςκ Bm5. Ο κέμξ ζυξ εα πνέπεζ επζπθέμκ κα είκαζ YFP, δεδμιέκμο υηζ μ ακαζοκδοαζιυξ ακηζηαεζζηά ηδκ αθθδθμοπία A.yfp/zeo ιε ημ ζδιαζιέκμ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ lef8. Δπμιέκςξ δ παναηδνμφιεκδ αφλδζδ ηςκ YFP + ηοηηάνςκ μθείθεηαζ ζε εοηαζνζαηή ζοκ-παναβςβή Γlef8 ζμζςιάηςκ (πμο πανάβμοκ YFP) θυβς ημο δζαζςζιέκμο ζμφ. Ζ απμιυκςζδ ημο ηεθεοηαίμο έβζκε ιε ιεεμδμθμβία δζαδμπζηήξ αναίςζδξ ζηδ αάζδ ηδξ απμοζίαξ YFP. Ο κέμξ ζυξ-ααηιίδζμ myc-lef8 επζαεααζχεδηε δμιζηά ιε ακηζδνάζεζξ PCR (εζη. 3.7) ηαζ αθθδθμφπδζδ ημο βεκεηζημφ ηυπμο lef8. Ακηίζημζπδ πνδζζιμπμίδζδ ημο πθαζιζδίμο ptv.myc-lef8 reverse δεκ πανήβαβε θαζκυηοπμ ζοιααηυ ιε ηδκ παναβςβή ιμθοζιαηζημφ ζμφ, ζοκεπχξ ζυξ ιε ημ myc-lef8 κα έπεζ εζζαπεεί ζε ηαηεφεοκζδ ακηίζηνμθδ ηδξ θοζζηήξ δεκ απμιμκχεδηε. 4 dpt 6 dpt Δηθόλα 3.6 Καθθζένβεζα ηοηηάνςκ Bm5, δζαιμθοζιέκδ ιε ημ ptv.myc-lef8 (θοζζηή θμνά) ηαζ ημ ααηιίδζμ Γlef8, ζηζξ 4 ηαζ 6 διένεξ ιεηά ηδ δζαιυθοκζδ (dpt). Δίκαζ ειθακήξ δ αφλδζδ ηςκ ηοηηάνςκ YFP +, εκδεζηηζηή ηδξ επζηοπμφξ δζάζςζδξ ημο ααηιζδίμο Γlef8. 91

116 λ2,3 R wt N λ2,3 wt R N 500 bp 500 bp Δηθόλα 3.7 Σα πνμσυκηα ακηζδνάζεςκ PCR ιε ηα γεφβδ εηηζκδηχκ TV2 R lef8 ORF 3F (ανζζηενά) ηαζ TV2 F lef8 ORF 5R (δελζά) βζα ημ ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο (wt) ηαζ ημ myc-lef8 (R: rescued). Σα ακηίζημζπα ιεβέεδ είκαζ: 458 bp (wt)/ 462 bp (R) ηαζ 459 bp (wt)/ 515 bp (R). Γζα ημ ανκδηζηυ δείβια εθέβπμο (Ν) πνδζζιμπμζήεδηε Ζ 2 Ο ςξ οπυζηνςια. Οη ζέζεηο ηωλ εθθηλεηώλ ζεκεηώλνληαη ζηελ εηθ 1/Α. ι2,3: δείθηεο κνξηαθνύ βάξνπο DNA Σα παναπάκς εονήιαηα απμδεζηκφμοκ υηζ μ εθθεζιιαηζηυξ θαζκυηοπμξ ημο Γlef8 μθείθεηαζ απμηθεζζηζηά ηαζ ιυκμ ζηδκ έθθεζρδ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο βμκζδίμο lef8 ηαζ επζπθέμκ υηζ ημ ζδιαζιέκμ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ myc-lef8 είκαζ θεζημονβζηυ. Ζ αδοκαιία παναβςβήξ ιμθοζιαηζημφ ζμφ ιε ημ πθαζιίδζμ ακηίζηνμθδξ θμνάξ οπμζηδνίγεζ πεναζηένς ηδκ εζδζηυηδηα ημο απμηεθέζιαημξ, ιε ηδ Δηθόλα 3.8 Ακάθοζδ ημο νοειμφ ακαπαναβςβήξ ημο ααηιζδίμο myc-lef8, ιεηά απυ ιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5. Σα απμηεθέζιαηα πανμοζζάγμκηαζ ηακμκζημπμζδιέκα ςξ πνμξ ηα ακηίζημζπα απυ ιυθοκζδ ιε ηδκ ίδζα πμζυηδηα ζμζςιάηςκ ααηιζδίμο αβνίμο ηφπμο. Ζ ηζιή 1 ζζμδοκαιεί ιε ημ 100% ηςκ ακηζβνάθςκ αβνίμο ηφπμο. Οζ παναπάκς ιεηνήζεζξ ακαθένμκηαζ ζηδκ εκδμηοηηάνζα πμζυηδηα ζζηχκ ακηζβνάθςκ. Οζ βναιιέξ ζθάθιαημξ ακηζπνμζςπεφμοκ ηοπζηή απυηθζζδ (N=2). 92

117 δζαθμνά ακάιεζα ζηδ δζάζςζδ ή ιδ ημο ααηιζδίμο Γlef8 κα απμηεθεί άιεζδ ζοκάνηδζδ ηδξ θμνάξ εκζςιάηςζδξ ημο myc-lef8 ζε αοηυ. Ο κέμξ ζυξ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδ ιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5. Ζ ιεθέηδ ημο πμθθαπθαζζαζιμφ ημο DNA ημο ιε ηεπκζηέξ qpcr έδεζλε υηζ ακαπανάβεηαζ ηαηά ηνυπμ ακηίζημζπμ ημο αβνίμο ηφπμο (εζη. 3.8). 3.3 Πποζπάθειερ διάζυζηρ ηος βακμιδίος Γlef8 με εξυγενή παποσή ηηρ ππυηεΐνηρ LEF8 Ζ ειθάκζζδ ημο εθθεζιιαηζημφ θαζκυηοπμο ηεηιδνζχεδηε ζαθχξ ζηδκ πνμδβμφιεκδ πανάβναθμ ςξ απυννμζα ηδξ απμοζίαξ ημο βμκζδίμο lef8 ηαζ άνα ηδξ ακηίζημζπδξ πνςηεΐκδξ. Με αοηυ ςξ δεδμιέκμ ελεηάζαιε εάκ δ ελςβεκήξ πανμπή ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 εα ιπμνμφζε κα επακαθένεζ ηδ ιμθοζιαηζηή ζηακυηδηα ζημ ααηιίδζμ Γlef8. οκμπηζηά μ θαζκυηοπμξ δζάζςζδξ εα πνέπεζ κα παναηηδνίγεηαζ απυ: αφλδζδ ηςκ ηοηηάνςκ YFP + θυβς ηδξ παναβςβήξ ζμζςιάηςκ, ιέζς ηςκ μπμίςκ εα ελαπθχκεηαζ δ ιυθοκζδ ηαηάζηαζδ θαζκμηοπζηά ακηίζημζπδ ηδξ εζημκζγυιεκδξ ζηδκ εζηυκα 3.6. ηοηηανζηή απμηυθθδζδ ηαζ θφζδ, θυβς πνμυδμο ημο ηφηθμο ιυθοκζδξ ημο ζμφ. ειθάκζζδ ηοηηάνςκ YFP + ιε ιεηαθμνά οπενηείιεκμο ενεπηζημφ οθζημφ ζε κέα ηαθθζένβεζα ηοηηάνςκ Bm5, θυβς ηςκ πενζεπυιεκςκ ζμζςιάηςκ ζημ οπενηείιεκμ. Γεδμιέκμο υιςξ υηζ ζηα κέα ηφηηανα εα απμοζζάγεζ δ πνςηεΐκδ LEF8 δε εα πνέπεζ κα παναηδνδεεί εκενβυξ ιυθοκζδ. Γζα ημκ έθεβπμ ηςκ παναπάκς ηαηαζηεοάζηδηακ θμνείξ έηθναζδξ θοζζηήξ ηαζ ζδιαζιέκδξ ιε επίημπμ Myc υπςξ ζηδκ πανάβναθμ πνςηεΐκδξ LEF8. Γεδμιέκδξ ηδξ ορδθήξ ζοπκυηδηαξ ακαζοκδοαζιμφ ηαηά ηδ δζάνηεζα ααηηνμσζηχκ ιμθφκζεςκ, υθμζ μζ θμνείξ έηθναζδξ ηαηαζηεοάζηδηακ, χζηε κα ιδκ πανμοζζάγμοκ πενζμπέξ μιυθμβεξ πνμξ ημ βμκζδίςια ημο ζμφ εηαηένςεεκ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο lef8. Ζ ηαηηζηή αοηή, ιαγί ηαζ ιε ηδκ πθήνδ αθαίνεζδ ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ lef8, αημθμοεήεδηε χζηε κα απμθεοπεεί δ επακεζζαβςβή ημο lef8 ζημ εθθεζιιαηζηυ ααηιίδζμ ηαζ δ ζοκαηυθμοεδ παναβςβή ζχκ ρεοδμ-αβνίμο ηφπμο. 93

118 Οζ πενζπηχζεζξ πνδζζιμπμίδζδξ ηδξ θοζζηήξ ζζηήξ αθθδθμοπίαξ, πμο πενζθαιαάκεζ ημκ οπμηζκδηή ημο βμκζδίμο lef8, απμηέθεζακ ηζξ ιυκεξ ελαζνέζεζξ. Καζ ζε αοηέξ υιςξ οπήνλε ιένζικα δ μιμθμβία κα πενζμνίγεηαζ ζημ έκα άηνμ, ιε ηδ πνδζζιμπμίδζδ εηενυθμβςκ αθθδθμοπζχκ πμθοαδεκοθίςζδξ, πμο δεκ ειθακίγμοκ μιμθμβία πνμξ ζζηέξ αθθδθμοπίεξ. Τπεκεοιίγεηαζ υηζ μ οπμηζκδηήξ ημο βμκζδίμο lef8 δεκ έπεζ πνμζδζμνζζηεί (Acharya & Gopinathan, 2002) Φνξείο έθθξαζεο θπζηθήο πξσηεΐλεο LEF8 θαη θπηηαξηθέο ζεηξέο δηάζσζεο Ζ ζοκδζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ημ ααηιίδζμ Γlef8 ηαζ ηαεέκακ απυ ημοξ θμνείξ έηθναζδξ: phsp70.lef8 pjc dsred/ea.lef8 ppb hsp70.lef8/ea.pac pfbd hsp70.lef/polh pplef8 888.lef8 δεκ μδήβδζε ζε θαζκυηοπμ εκδεζηηζηυ ηδξ δζάζςζδξ βζα δζάζηδια παναηήνδζδξ απυ ιία έςξ δφμ εαδμιάδεξ. Οζ ηαζέηεξ dsred/ea.lef8 ηαζ hsp70.lef8/ea.pac, απυ ηα παναπάκς ζοζηήιαηα έηθναζδξ, πνδζζιμπμζήεδηακ επζπθέμκ ηαζ βζα ηδκ ηαηαζηεοή ηοηηανζηχκ ζεζνχκ δζάζςζδξ, πμο πανάβμοκ ζηαεενά ηδκ πνςηεΐκδ LEF8. ηδκ πνχηδ πενίπηςζδ (ζφζηδια dsred/ea.lef8) δ ηαζέηα επζθμβήξ, πμο πνμζδίδεζ ακεεηηζηυηδηα ζημ ακηζαζμηζηυ πμονμιοηίκδ, πανέπεηαζ απυ λεπςνζζηυ πθαζιίδζμ, εκχ ζηδ δεφηενδ είκαζ ζοκδεδειέκδ ιε ηδκ ηαζέηα έηθναζδξ LEF8 χζηε κα είκαζ πενζζζυηενμ πζεακή δ ηαοηυπνμκδ πανμοζία ημοξ ζηα ηφηηανα. ηδ δεφηενδ πενίπηςζδ (ζφζηδια hsp70.lef8/ea.pac) πνδζζιμπμζήεδηε επζπθέμκ ημ ζφζηδια ιεηάεεζδξ piggybac βζα ηδ ιεηαθμνά ηςκ αθθδθμοπζχκ έηθναζδξ ζημ βεκεηζηυ οθζηυ ηςκ ηοηηάνςκ (βι. ζην θεθάιαην Μέζνδνη θαη Υιηθά). Παν υθα αοηά, δ δζαιυθοκζδ ηςκ παναπάκς ηοηηανζηχκ ζεζνχκ ζηαεενήξ έηθναζδξ LEF8 ιε ημ ααηιίδζμ Γlef8 δεκ μδήβδζε ζε θαζκυηοπμ εκδεζηηζηυ δζάζςζδξ ζε δζάζηδια παναηήνδζδξ έςξ δφμ εαδμιάδεξ, υπςξ αηνζαχξ ζοκέαδ ηαζ υηακ μζ ακηίζημζπεξ ηαζέηεξ έηθναζδξ πνδζζιμπμζήεδηακ ζε πανμδζηέξ δζαιμθφκζεζξ. 94

119 ε ηάεε πενίπηςζδ πμο επζπεζνήεδηε δζάζςζδ, οπενηείιεκμ απυ ηζξ δζαιμθοζιέκεξ ηαθθζένβεζεξ ιεηαθενυηακ ζε κέεξ. Δάκ είπε οπάνλεζ παναβςβή θεζημονβζηχκ εθθεζιιαηζηχκ ζμζςιάηςκ Γlef8 ηαηά ηδ δζάζςζδ, ηυηε ακαιεκυηακ παναβςβή YFP ζηα κέα ηφηηανα ιεηά ηδ ιυθοκζή ημοξ, ηάηζ πμο δεκ παναηδνήεδηε ζε ηαιία πενίπηςζδ. Σμ βεβμκυξ αοηυ έδεζλε υηζ δεκ οπάνπμοκ θεζημονβζηά ζμζχιαηα ζημ οπενηείιεκμ ηςκ ηαθθζενβεζχκ δζάζςζδξ Φνξείο έθθξαζεο ηεο ζεκαζκέλεο πξσηεΐλεο LEF8 Καηαζηεοάζηδηακ θμνείξ έηθναζδξ ηδξ ζδιαζιέκδξ πνςηεΐκδξ LEF8, πμο ααζίζηδηακ ζημ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ myc-lef8, πνμηεζιέκμο κα ιπμνεί κα ακζπκεοεεί δ παναβςβή ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8. Σμ ζδιαζιέκμ πθαίζζμ πνδζζιμπμζήεδηε ζε ζοκδοαζιυ ιε ημ ζφζηδια έηθναζδξ peia (Douris et al., 2006), ημ ζφζηδια pea, ηαεχξ ηαζ ημκ οπμηζκδηή ημο βμκζδίμο ηδξ πνςηεΐκδξ ημο εενιζημφ ζμη 70 (heat shock protein 70, hsp70) ηδξ Drosophila. Σα ζοζηήιαηα peia ηαζ pea ειθακίγμοκ 5000 ηαζ 100 θμνέξ ακηίζημζπα ορδθυηενδ έηθναζδ ζε ζπέζδ ιε ημκ οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ Α3 ημο B. mori, εκχ μ οπμηζκδηήξ hsp70 πενίπμο 70% ηδξ παναβςβήξ ημο ίδζμο A3 οπμηζκδηή (Κ. Ηςακκίδδξ, ιδ δδιμζζεοιέκα απμηεθέζιαηα). Δπζπθέμκ, μ οπμηζκδηήξ hsp70 ιπμνεί κα επαπεεί ιε εενιζηυ ζμη βζα αολδιέκα επίπεδα έηθναζδξ. οκμθζηά, ηα παναπάκς ζοζηήιαηα έηθναζδξ ηαθφπημοκ έκα ζδιακηζηυ εφνμξ επζπέδςκ έηθναζδξ, βεβμκυξ πνήζζιμ βζα ηδ δζενεφκδζδ ηςκ αέθηζζηςκ ζοκεδηχκ βζα δζάζςζδ ημο ααηιζδίμο Γlef8. Δζζαβςβή ηςκ παναπάκς θμνέςκ έηθναζδξ ζε ηφηηανα Bm5 ηαζ Hi5 έδεζλε υηζ ιυκμ μ θμνέαξ peia πανέπεζ ακζπκεφζζια επίπεδα ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 ηαζ υηζ δ παναβςβή απυ ηα ηφηηανα Bm5 είκαζ ζδιακηζηά ιζηνυηενδ ζε ζπέζδ ιε αοηή ηςκ Hi5 (εζη. 3.9). Με πνμζεήηδ ημο ακαζημθέα πνςηεαζχιαημξ (protease inhibitor: PI) B PI PI PI + 95 kda Bm5 Hi5 70 kda Δηθόλα 3.9 Ακίπκεοζδ ηδξ παναβςβήξ Myc-LEF8: ιυκμ μ θμνέαξ έηθναζδξ peia.myc-lef8 πανήβαβε ακζπκεφζζια επίπεδα πνςηεΐκδξ. Ζ έηθναζδ είκαζ πενζζζυηενμ ειθακήξ ζηα ηφηηανα Hi5 ζε ζπέζδ ιε ηα Bm5. Γζα ηα δεφηενα, οπήνλε ιεβαθφηενμξ πνυκμξ έηεεζδξ ηδξ εζηυκαξ χζηε ημ ζήια κα είκαζ εοηνζκέξ. Ζ ακαζημθή ημο πνςηεμζχιαημξ εκίζποζε ηα ακζπκεφζζια επίπεδα ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 (ιεθεηήεδηε ιυκμ ζηα ηφηηανα Hi5). PΗ +/- δδθχκεζ ηδκ πανμοζία ηαζ απμοζία, ακηίζημζπα, ακαζημθέα ημο πνςηεαζχιαημξ. 95

120 ποςότητα επί τησ παραγωγήσ wt MG132 αολάκμκηαζ ηα επίπεδα ηδξ ακζπκεουιεκδξ πνςηεΐκδξ, βεβμκυξ πμο οπμδδθχκεζ ειπθμηή ημο ζπεηζημφ ιδπακζζιμφ ζηδκ απμδυιδζδ ηδξ Myc-LEF8. Οζ θμζπμί θμνείξ δεκ πανείπακ ακζπκεφζζιεξ πμζυηδηεξ ηδξ πνςηεΐκδξ ζηδκ πενίπηςζδ ημο hsp70 επζπθέμκ, μφηε ηαηυπζκ εενιζημφ ζμη, πμο εκενβμπμζεί ζζπονά ημ ζπεηζηυ οπμηζκδηή, μφηε ηαζ πανμοζία ημο ακαζημθέα ημο πνςηεαζχιαημξ. Σμ δεφηενμ εφνδια οπμδδθχκεζ υηζ δ αδοκαιία εκημπζζιμφ μθείθεηαζ ιάθθμκ ζε έθθεζρδ επανημφξ παναβςβήξ πανά ζηδκ απμδυιδζδ ηδξ πνςηεΐκδξ. Σα επίπεδα ημο παναβυιεκμο ιεηαβνάθμο lef8 αλζμθμβήεδηακ ιεηά απυ ζοκδζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ημοξ θμνείξ phsp70.myc-lef8 ή peia.myc-lef8 ηαζ ημ ααηιίδζμ Γlef8. Ο θμνέαξ ηφπμο pδα δε ιεθεηήεδηε εδχ, δεδμιέκμο υηζ δ παναβςβζηή ημο ζηακυηδηα έπεζ ήδδ ζοζπεηζζεεί ιε αοηή ημο pδηα, υπςξ ακαθένεδηε παναπάκς. Οζ ηζιέξ πμο πνμέηορακ ζοβηνίεδηακ ιε ακηίζημζπεξ πμο πανάπεδηακ ιεηά απυ δζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο ηαζ ιε αοηυκ ημκ ηνυπμ ηαηαζηεοάζηδηε έκα ζοβηνζηζηυ δζάβναιια παναβςβήξ ημο ιεηαβνάθμο lef8, ιέζς ακηίδναζεςκ πμζμηζηήξ PCR (RT-qPCR) (εζη. 3.10). Απυ αοηυ δζαπζζηχεδηε υηζ ημ επίπεδμ έηθναζδξ απυ ημοξ θμνείξ ήηακ ζε ηάεε πενίπηςζδ ορδθυηενμ θζβυηενμ ιε ημ ζφζηδια phsp70 ηαζ πενζζζυηενμ ιε ημ peia, υπςξ ήηακ ακαιεκυιεκμ απυ ηδκ εκδμβεκή παναβςβή ημο ααηιζδίμο αβνίμο peia.myc-lef8 phsp70.myc-lef hpt Δηθόλα 3.10 Μεθέηδ ηςκ επζπέδςκ παναβςβήξ ημο ιεηαβνάθμο lef8 απυ ημοξ πθαζιζδζαημφξ θμνείξ έηθναζδξ phsp70.myc-lef8 ηαζ peia.myc-lef8 πανμοζία ημο ααηιζδίμο Γlef8 ιεηά απυ ζοκδζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5. Σα απμηεθέζιαηα πανμοζζάγμκηαζ ηακμκζημπμζδιέκα ςξ πνμξ ηδκ παναβςβή ιεηαβνάθςκ lef8 απυ ημ ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο, ακά πνμκζηυ ζδιείμ. Δίκαζ ειθακέξ υηζ δ παναβςβή απυ ημοξ θμνείξ έηθναζδξ λεπενκά ηδκ αβνίμο ηφπμο ιέπνζ ηζξ 71 hpt. Οζ βναιιέξ ζθάθιαημξ ακηζπνμζςπεφμοκ ηοπζηή απυηθζζδ (N=2). 96

121 ηφπμο ςξ ηζξ 71 hpt. οιπεναζιαηζηά ημ επίπεδμ παναβςβήξ ιεηαβνάθςκ εα ιπμνμφζε κα οπμζηδνίλεζ ηδ δζάζςζδ ημο ααηιζδίμο Γlef8. Γζα ηδκ πεναζηένς δζενεφκδζδ ηδξ ζηακυηδηαξ ηςκ θμνέςκ έηθναζδξ κα δζαζχζμοκ ημ εθθεζιιαηζηυ ααηιίδζμ, ιεθεηήεδηε δ επίδναζδ ηδξ ελςβεκμφξ πανμπήξ Myc-LEF8 ζηα επίπεδα θεζημονβζηυηδηαξ ημο υρζιμο οπμηζκδηή ημο βμκζδίμο vp39, δ μπμία ελανηάηαζ άιεζα απυ ηδκ πανμοζία ηαζ δνάζδ ηδξ ζζηήξ RNA πμθοιενάζδξ. Γζαπζζηχεδηε υηζ πανμοζία ηςκ θμνέςκ έηθναζδξ ηαζ άνα ηδξ πνςηεΐκδξ Myc-LEF8 οπάνπεζ ζδιακηζηή αφλδζδ ζηδκ έηθναζδ ημο βμκζδίμο vp39 (εζη. 3.11), πμο ακ ηαζ δε θηάκεζ ζηα επίπεδα αβνίμο ηφπμο, οπμδδθχκεζ πάναοηα υηζ δ ελςβεκήξ παναβςβή ηδξ Myc-LEF8 ζοιαάθθεζ ζηδ ζφκεεζδ θεζημονβζηήξ ζζηήξ RNA πμθοιενάζδξ. Σέθμξ, ιεθεηήεδηε ιε ακηζδνάζεζξ qpcr δ πμζυηδηα ηςκ εκδμηοηηάνζςκ ακηζβνάθςκ DNA Γlef8 πανμοζία ηαζ απμοζία ηςκ θμνέςκ hsp70.myc-lef8 ηαζ peia.myc-lef8, ζε ζπέζδ ιε ηα ακηίζημζπα ακηίβναθα ημο ααηιζδίμο αβνίμο ηφπμο, επίζδξ ιεηά απυ δζαιυθοκζδ. Οζ ιεηνήζεζξ πναβιαημπμζήεδηακ ζημ οθζηυ πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ παναβςβήξ ημο ιεηαβνάθμο myc-lef8 απυ ημοξ παναπάκς θμνείξ. Γζαπζζηχεδηε υηζ δ πμζυηδηα Γlef8 δεκ επδνεάγεηαζ πναηηζηά απυ ηδκ ελςβεκή παναβςβή Myc-LEF8: δ ζφβηνζζδ ηδξ πμζυηδηαξ ακηζβνάθςκ Γlef8 πανμοζία ηαζ απμοζία ηςκ θμνέςκ έηθναζδξ δεκ έδεζλε ηάπμζα Δηθόλα 3.11 Ακάθοζδ ιε πμζμηζηή PCR (RT-qPCR) ηςκ ζπεηζηχκ επζπέδςκ ημο ιεηαβνάθμο vp39 ζε ηφηηανα Bm5, ιεηά απυ δζαιυθοκζδ αοηχκ ιε ααηιίδζμ Γlef8 πανμοζία ηαζ απμοζία θμνέςκ έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ Myc-LEF8. Σα απμηεθέζιαηα πανμοζζάγμκηαζ ηακμκζημπμζδιέκα ςξ πνμξ ηδκ πμζυηδηα ηςκ ιεηάβναθςκ vp39 αβνίμο ηφπμο (wt) ηαζ είκαζ επζπθέμκ ηακμκζημπμζδιέκα ηαζ ιε αάζδ ημ θυβμ ηδξ πμζυηδηαξ ζζηχκ βμκζδζςιάηςκ Γlef8 πνμξ wt, πμο πανμοζζάγεηαζ ζηδκ εζη Ζ ηεθεοηαία ηακμκζημπμίδζδ εηθνάγεζ ηα ιεηάβναθα vp39 ακά ιμκάδα ζζημφ βμκζδζχιαημξ ηαζ είκαζ ζδιακηζηή βζα ηδκ εθαπζζημπμίδζδ ζθαθιάηςκ θυβς ημο δζαθμνεηζημφ ανζειμφ ζζηχκ ακηζβνάθςκ, πμο είκαζ δζαεέζζια βζα ιεηαβναθή ζημοξ δφμ αοημφξ ηφπμοξ ααηιζδίςκ. Οζ βναιιέξ ζθάθιαημξ ακηζπνμζςπεφμοκ ηοπζηή απυηθζζδ (N=2). 97

122 Δηθόλα 3.12 Ακάθοζδ ιε πμζμηζηή PCR (qpcr) ηςκ ζπεηζηχκ επζπέδςκ ημο ααηιζδίμο Γlef8 πανμοζία ηαζ απμοζία θμνέςκ έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ Myc-LEF8 ζε δζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5. Σα απμηεθέζιαηα πανμοζζάγμκηαζ ηακμκζημπμζδιέκα ςξ πνμξ ηα ζζηά ακηίβναθα ααηιζδίμο αβνίμο ηφπμο (wt) ηςκ ακηίζημζπςκ πνμκζηχκ ζδιείςκ. Δίκαζ ειθακέξ υηζ δεκ οπάνπεζ αεθηίςζδ ημο ακαπαναβςβζημφ δοκαιζημφ ημο ααηιζδίμο Γlef8 ιε ηδ πνδζζιμπμίδζδ ηςκ θμνέςκ έηθναζδξ. Οζ βναιιέξ ζθάθιαημξ ακηζπνμζςπεφμοκ ηοπζηή απυηθζζδ (N=2). ιεηνήζζιδ δζαθμνά (εζη. 3.12). Σα παναπάκς απμηεθέζιαηα ζε ζοκδοαζιυ ιε ακηίζημζπεξ παναηδνήζεζξ, υπμο δεκ οπήνπε ειθακήξ εζηυκα ιυθοκζδξ, έδεζλακ υηζ δ ελςβεκήξ πανμπή ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 δεκ ανηεί βζα ηδκ ακαζηνμθή ημο εθθεζιιαηζημφ θαζκμηφπμο. Ζ αφλδζδ υιςξ ηςκ επζπέδςκ υρζιδξ ιεηαβναθήξ πανμοζία ηδξ ελςβεκμφξ πνςηεΐκδξ LEF8 μδήβδζε ζημ ζοιπέναζια υηζ δ απμοζία δζάζςζδξ εα πνέπεζ κα απμδμεεί ζε άθθμοξ πανάβμκηεξ, πμο πζεακυκ επδνεάζηδηακ απυ ηδκ αθαίνεζδ ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ ημο βμκζδίμο lef8. Θα πνέπεζ κα ζδιεζςεεί υηζ ιεηά ηζξ 71 hpt παναηδνήεδηε ιείςζδ ζηδκ ακηζπνμζχπεοζδ ημο ιεηαβνάθμο ακαθμνάξ TIF βζα ηα δείβιαηα ημο ααηιζδίμο αβνίμο ηφπμο, ιε απμηέθεζια κα ιδκ είκαζ εθζηηή δ επελενβαζία ημοξ ιαγί ιε ηα οπυθμζπα. Σμ θαζκυιεκμ ημο απμηθεζζιμφ ηςκ ηοηηανζηχκ ιεηαβνάθςκ ηαηά ηδκ πνυμδμ ηδξ ιυθοκζδξ έπεζ ήδδ πενζβναθεί (Nobiron et al., 2003; Ooi & Miller, 1988). Δίκαζ επζπθέμκ εκδεζηηζηυ υηζ δεκ παναηδνήεδηε ηέημζμ πνυαθδια ζηα δείβιαηα ημο ααηιζδίμο Γlef8, υπμο δεκ οπάνπεζ εηδήθςζδ παεμβέκεζαξ. οιπεναζιαηζηά, απμηεθέζιαηα ζπεηζηά ιε ιεηάβναθα βμκζδίςκ ηαηά ηδ δζάνηεζα εκενβμφ ιυθοκζδξ πανμοζζάγμκηαζ ςξ ηαζ ηζξ 71 hpt. 98

123 3.4 Γιάζυζη ηος βακμιδίος Γlef8 με ενδογενή παποσή ηηρ ππυηεΐνηρ LEF8 Γζα ηδκ πεναζηένς δζενεφκδζδ πζεακχκ απαναίηδηςκ αθθδθμοπζχκ βζα ηδ δζάζςζδ, εζζήπεδζακ ζηδ εέζδ ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ ημο lef8 δζάθμνεξ ηαηαζηεοέξ (constructs) πμο πανάβμοκ θοζζηέξ, μιυθμβεξ ή ηνμπμπμζδιέκεξ ιμνθέξ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 οπυ ημκ έθεβπμ θοζζηχκ ή εηενυθμβςκ οπμηζκδηχκ, ςξ ακηζηαηαζηάηεξ ηδξ αθθδθμοπίαξ A.yfp/zeo (εζη. 3.13/Α). ε ηάεε πενίπηςζδ επζηοπμφξ δζάζςζδξ ημ ακηίζημζπμ ιμθοζιαηζηυ ααηιίδζμ απμιμκςκυηακ ηαζ ηα εκδμηοηηανζηά επίπεδα ημο βεκεηζημφ ημο οθζημφ ζοβηνίκμκηακ ιε αοηά ημο ααηιζδίμο αβνίμο ηφπμο, ιεηά απυ ιυθοκζδ κέςκ ηοηηάνςκ. ε υθεξ ηζξ πενζπηχζεζξ δ ακηζηαηάζηαζδ ημο A.yfp/zeo έβζκε ιε μιυθμβμ ακαζοκδοαζιυ ιέζς δζαιυθοκζδξ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ημ ααηιίδζμ Γlef8 ηαζ θμνείξ ακαζοκδοαζιμφ ααζζζιέκμοξ ζημ πθαζιίδζμ ptvγlef8 (Farrell, 1998). Σμ ηεθεοηαίμ δζαεέηεζ ζζηέξ αθθδθμοπίεξ πμο ηαηεοεφκμοκ ηδ ζηυπεοζδ ηςκ επζεοιδηχκ αθθδθμοπζχκ ζημ βεκεηζηυ ηυπμ ημο βμκζδίμο lef8. Ζ ακηζηαηάζηαζδ ηδξ αθθδθμοπίαξ A.yfp/zeo απυ ημ myc ζδιαζιέκμ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ ημο βμκζδίμο lef8 ημο ζμφ AcMNPV είπε ςξ απμηέθεζια ηδ δζάζςζδ ημο ααηιζδίμο Γlef8. Σμ βεβμκυξ αοηυ ήηακ ακαιεκυιεκμ δεδμιέκδξ ηδξ ορδθήξ μιμθμβίαξ ηςκ βμκζδίςκ Bm ηαζ Ac lef8 (94% ηαοηυηδηα, (Gomi et al., 1999)). Ζ αφλδζδ ηςκ ηοηηάνςκ YFP + ηαηά ηδκ ελέθζλδ ηδξ ιυθοκζδξ (εζη. 3.15) μθείθεηαζ ζηδ ζοβηονζαηή παναβςβή ζμζςιάηςκ Γlef8 ιε ηδ αμήεεζα ημο δζαζςζιέκμο ζμφ, υπςξ ζοκέαδ ακηίζημζπα ηαζ ηαηά ηδκ ηαηαζηεοή ημο ααηιζδίμο myc-lef8. Σμ δζαζςζιέκμ ααηιίδζμ myc-aclef8 απμιμκχεδηε ςξ ζυξ YFP - ηαζ ειθακίγεζ πνυηοπμ ιεηααμθήξ ηςκ εκδμηοηηανζηχκ επζπέδςκ DNA ακηίζημζπμ ιε αοηυ ημο BmNPV αβνίμο ηφπμο (Δζη. 3.13/Β). Ακηίεεηα δ πνήζδ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ lef8 απυ ηδκ παναζζηζηή ζθήηα Cotesia congregata (Cclef8) δεκ επέηνερε ηδ δζάζςζδ. Ζ Cclef8 εεςνείηαζ υηζ πανάβεζ πζεακή οπμιμκάδα ζζηήξ RNA πμθοιενάζδξ ηαζ είκαζ ελεθζηηζηά απμιαηνοζιέκδ ζοββεκήξ ηδξ Bmlef8. Οζ ακηίζημζπεξ πνςηεΐκεξ ειθακίγμοκ αλζμζδιείςηδ μιμζυηδηα ζε δφμ ιυκμ πενζμπέξ πενζμνζζιέκμο ιεβέεμοξ, εη ηςκ μπμίςκ υιςξ δ ιία πενζθαιαάκεζ ηδκ ηαηαθοηζηή αθθδθμοπία HGQKGV ηδξ BmLEF8 HGQKAI ζηδ CcLEF8 (Bezier et al., 2009) (εζη. 3.16). 99

124 A myc-lef8 ORF myc-aclef8 ORF cclef8 ORF Bmlef8 ORF Bmlef8 ORF bp orf41 lef8 3' flank 9702 orf40 bp bght actinp TV2 N-myc ets Bmlef8 odv-e bp lef8 5' flank TV2 N-myc Bmlef8 e-yfp lef8 3' flank Zeo lef8 5' flank hsp70 lef8 3' flank TV2 N-myc Bmlef8 lef8 5' flank hsp70 lef8 ORF sv40t sv40t actinp lef8 ORF bght B Bmlef8 ORF C sv40 Tn7L 02 bp lef8 3' flank Ppol 9702 bp p10 HSV tk sv40 TV2S lef8 5' flank FABAA actinp A.yfp/zeo TV2 N-myc Bmlef8 bght Bmpolh polh R bp pfbd hsp70.lef8/polh 3' flank 9213 bp TV2 N-myc B lef8 5' f Tn7R lef8 ORF lef8 5R hsp70 Δηθόλα 3.13 A. Απεζηυκζζδ ηςκ εκεειάηςκ πμο δμηζιάζηδηακ ςξ ακηζηαηαζηάηεξ ηδξ αθθδθμοπίαξ A.yfp/zeo βζα ηδ δζάζςζδ ημο ααηιζδίμο Γlef8. Σμ ζφιαμθμ δδθχκεζ εκεέιαηα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ηαζ ηαηά ηζξ δφμ ηαηεοεφκζεζξ. Πενζθαιαάκεηαζ ηαζ ημ έκεεια myc-lef8 ηδξ παναβνάθμο 3.2.3, βζα θυβμοξ πθδνυηδηαξ. B. Πμζμηζηή PCR (qpcr) ηςκ εκδμηοηηανζηχκ επζπέδςκ DNA ηςκ δζαζςζιέκςκ ακαζοκδοαζιέκςκ ζχκ ζε ζπέζδ ιε ηα ακηίζημζπα επίπεδα ημο ααηιζδίμο αβνίμο ηφπμο, ιε αάζδ ηδκ ακίπκεοζδ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο βμκζδίμο gp64. Γείβιαηα απυ ηαθθζένβεζεξ ηοηηάνςκ Bm5 ιμθοζιέκςκ ζε MOI (Multiplicity of Infection) 6. Οζ βναιιέξ ζθάθιαημξ ακηζπνμζςπεφμοκ ηοπζηή απυηθζζδ (N=2). C. Ο θμνέαξ ακαζοκδοαζιμφ pfbd hsp70.lef8/ polh ζημπεφεζ ηδκ ηαζέηα hsp70.lef8/ polh ζηδ εέζδ mini-atttn7 ημο ααηιζδίμο Γlef8 (βι. εηθ. 3.13). διεζχκμκηαζ μζ εέζεζξ οανζδζζιμφ ηςκ εηηζκδηχκ lef8 5R ηαζ polh R. gp64 ORF ( ) Δηθόλα 3.14 Υάνηδξ ημο ααηιζδίμο αβνίμο ηφπμο. διεζχκμκηαζ μζ ηνεζξ εέζεζξ ζηζξ μπμίεξ ζημπεφεδηε δ ηαζέηα hsp70.lef80 ζηα πθαίζζα ηδξ πνμζπάεεζαξ δζάζςζδξ ημο ααηιζδίμο Γlef8 (ηυηηζκα αέθδ) lef4 ORF ( ) vp39 ORF ( ) p15 ORF ( ) mini-f replicon mini-f replicon 1 BmNPV (T3) bp mini-atttn7 mini-atttn7 * lacz lacz Kan lacz lacz Kan Polyhedrin ORF (1-738) hr3 ( ) insertion site (65745) p95 ORF( ) *νη ζέζεηο ηωλ εθθηλεηώλ M13-pUC R θαη M13 (-20) ή M13-pUC forward F βξίζθνληαη εθαηέξωζελ ηεο ζέζεο έλζεζεο p47 ORF ( ) lef8 ORF ( ) 5' lef8 flank ( ) lef9 ORF ( ) 3' lef8 flank ( ) 100

125 4 dpt 6 dpt Δηθόλα 3.15 Διθάκζζδ ηαθθζένβεζαξ ηοηηάνςκ Bm5, ζοκδζαιμθοζιέκδξ ιε ημ ptvmyc-aclef8 (θοζζηή θμνά) ηαζ ημ ααηιίδζμ Γlef8, ζηζξ 4 ηαζ 6 dpt. Δίκαζ ειθακήξ δ αφλδζδ ηςκ ηοηηάνςκ YFP +. διεζχκεηαζ επίζδξ υηζ ημ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ ημο βμκζδίμο Cclef8 δεκ πανμοζζάγεζ μιμζυηδηα ιε ημ ακηίζημζπμ ακμζηηυ πθαίζζμ lef8 ημο ζμφ BmNPV ζε κμοηθεμηζδζηυ επίπεδμ, βεβμκυξ πμο εα ιπμνμφζε κα είκαζ ζδζαίηενα ζδιακηζηυ βζα ηδ δζάζςζδ ζχκ εθθεζιιαηζηχκ ςξ πνμξ ημ βμκίδζμ lef8. Δάκ δ CcLEF8 είπε απμδεζπηεί επανηήξ ςξ ακηζηαηαζηάηδξ ηδξ BmLEF8, ηυηε δ απμοζία μιμθμβίαξ εα ιπμνμφζε κα επζηνέρεζ απθμφζηενμοξ ζπεδζαζιμφξ βζα ηδ δδιζμονβία lef8 εθθεζιιαηζηχκ ζχκ, εθυζμκ πθέμκ δε εα ήηακ ακαβηαία δ αθαίνεζδ μθυηθδνδξ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ lef8 βζα ηδ δζαηήνδζδ ημο εθθεζιιαηζημφ βμκυηοπμο. Απυ πθεονάξ αθθδθμοπζχκ έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8, δ ηαζέηα A.lef8.bgh δζέζςζε ημ ααηιίδζμ Γlef8, ιυκμ υιςξ υηακ πνδζζιμπμζήεδηε ηαηά ηδ θοζζηή θμνά LEF8 CcLEF8 LEF8 CcLEF8 E-value: 8e-05 27% ταυτότητα/ 50% θετικά E-value: % ταυτότητα/ 50% θετικά Δηθόλα 3.16 Ζ ζφβηνζζδ ηςκ πνςημηαβχκ δμιχκ ηςκ πνςηεσκχκ LEF8 ηαζ CcLEF8 δείπκεζ ζδιακηζηή (E-value < 0,05) μιμζυηδηα ζηζξ παναπάκς δφμ πενζμπέξ. Δίκαζ εκδζαθένμκ υηζ δ δεφηενδ πενζθαιαάκεζ ηδ παναηηδνζζηζηή αθθδθμοπία HGQKGV, πμο ανίζηεηαζ ζηδκ πνςηεΐκδ LEF8, ηαεχξ ηαζ ζε β οπμιμκάδεξ RNA πμθοιεναζχκ απυ δζάθμνεξ πδβέξ, ηαζ θαίκεηαζ κα είκαζ πανμφζα ηαζ ζηδ CcLEF8, ακ ηαζ ζε απμηθίκμοζα ιμνθή άβκςζηδξ θεζημονβζηυηδηαξ. 101

126 ι2,3 ι2,3 ~900 bp ~2100 bp Δηθόλα 3.17 Δπζαεααίςζδ ηδξ ιεηάεεζδξ ηδξ αθθδθμοπίαξ hsp70.lef8/polh ζημ ααηιίδζμ hsp70.lef8/polh Γlef8. Έκα πνμσυκ PCR ~1000 bp ακαιέκεηαζ ιε ημοξ εηηζκδηέξ polh R/M13-pUC R (ανζζηενά), εκχ έκα πνμσυκ ~2200 bp ακηίζημζπα ιε ημοξ εηηζκδηέξ lef8 5R/M13 (-20) F (δελζά). Σα πνμσυκηα επζαεααζχεδηακ ηαζ ιε αθθδθμφπδζδ (βι. ζην παξάξηεκα). Οζ ιζηνέξ δζαθμνέξ πμο παναηδνμφκηαζ ακάιεζα ζημ εεςνδηζηυ ηαζ ημ ιεηνμφιεκμ ιέβεεμξ ηςκ πνμσυκηςκ μθείθμκηαζ ζηδ πνήζδ ημο ιίβιαημξ ηδξ ακηίδναζδξ βζα ηδκ δθεηηνμθυνδζδ, ακηί βζα ηαεανζζιέκα πνμσυκηα. Ο εηηζκδηήξ M13(-20) Forward πνδζζιμπμζήεδηε ζηδ εέζδ ημο M13-pUC forward. Οη ζέζεηο ηωλ εθθηλεηώλ ζεκεηώλνληαη ζηηο εηθ. 3.12/C θαη ημο πθαζζίμο lef8 (εζη. 3.13/A, B). Ζ ηαζέηα hsp70.lef8.sv40 επίζδξ δζέζςζε ημ Γlef8 (εζη. 3.13/A, B). Σα παναπάκς ζημζπεία έδεζλακ υηζ δ έηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 ηαζ απυ ηα δφμ αοηά ζοζηήιαηα έηθναζδξ είκαζ επανηήξ βζα ημκ ηφηθμ γςήξ ημο ααηιζδίμο BmNPV. Σέθμξ ελεηάζηδηε δ δοκαηυηδηα δζάζςζδξ ιε έκεεζδ ηδξ ηαζέηαξ hsp70.lef8.sv40 ζε δφμ δζαθμνεηζηέξ εέζεζξ ημο βμκζδζχιαημξ ημο ααηιζδίμο ηαζ ζοβηεηνζιέκα: α) ζημ βεκεηζηυ ηυπμ ηδξ πμθοεδνίκδξ, ιε ηδ πνήζδ ημο ζοζηήιαημξ ιεηάεεζδξ Tn7, ζε ζοκδοαζιυ ιε ημ πθαζιίδζμ pfbd hsp70.lef8/polh (εζη. 3.13/C ηαζ 3.14), ηαζ α) ζημκ μοδέηενμ βεκεηζηυ ηυπμ ακάιεζα ζηζξ ηςδζηέξ πενμπέξ ηςκ βμκζδίςκ p15 ηαζ p95 (Iatrou & Swevers, 2005a) (εζη. 3.14), πνδζζιμπμζχκηαξ ημκ πθαζιζδζαηυ θμνέα pc6600 hsp70.lef8. Καζ ζηζξ δφμ πενζπηχζεζξ υιςξ δεκ παναηδνήεδηε δζάζςζδ. ηδκ πνχηδ πανήπεδ ημ ααηιίδζμ hsp70.lef8/polh Γlef8, πμο ειθάκζγε επίζδξ εθθεζιιαηζηυ θαζκυηοπμ, εκχ ζηδ δεφηενδ δεκ ηαηέζηδ εθζηηή δ απμιυκςζδ ζμφ. Ζ έκεεζδ ηδξ αθθδθμοπίαξ hsp70.lef8/polh ζημ ααηιίδζμ hsp70.lef8/polh Γlef8 επζαεααζχεδηε ιε ακηζδνάζεζξ PCR (εζη. 3.17) ηαζ αθθδθμφπδζδ ιε ηαηάθθδθμοξ εηηζκδηέξ. Ήηακ ζαθέξ απυ ηα παναπάκς απμηεθέζιαηα υηζ οπάνπεζ ζοζπέηζζδ ιεηαλφ ηδξ εέζδξ έκεεζδξ ηαζ ηδξ δζάζςζδξ, ιε ηζξ ίδζεξ βεκεηζηέξ αθθδθμοπίεξ κα πανέπμοκ δζάζςζδ ιυκμ ηαηά ηδ ιία θμνά έκεεζδξ ηαζ επζπθέμκ ιυκμ υηακ ανίζημκηαζ ζημ βεκεηζηυ ηυπμ lef8 ηαζ υπζ ζε άθθα ζδιεία ημο ζζημφ βμκζδζχιαημξ. 102

127 3.5 Σςζσέηιζη ηος γονιδίος orf40 με ηη διάζυζη ηος ελλειμμαηικού βακμιδίος Γlef8 Ζ ακάβηδ βζα πθήνδ αθαίνεζδ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο lef8, πνμηεζιέκμο κα ηαηαζηεοαζηεί ημ εθθεζιιαηζηυ ααηιίδζμ, πνμέηορε απυ ηα θαζκυιεκα επακεζζαβςβήξ ημο βμκζδίμο lef8 απυ ημοξ θμνείξ ελςβεκμφξ παναβςβήξ LEF8 ζημ DNA ημο ααηιζδίμο, ιέζς μιυθμβμο ακαζοκδοαζιμφ, πμο ηαηεοεφκεηαζ απυ ηδκ μιμθμβία ηςκ αθθδθμοπζχκ lef8 ημο ααηιζδίμο ηαζ θμνέςκ δζάζςζδξ. Με δεδμιέκδ ηδ ιεβάθδ εββφηδηα ηςκ βμκζδίςκ ζημ ζζηυ βμκζδίςια υιςξ, δ πθήνδξ αθαίνεζδ εα ιπμνμφζε κα έπεζ επζπηχζεζξ ζε βεζημκζηά βμκίδζα ημο lef8. Ακάθοζδ ημο βεκεηζημφ ηυπμο lef8 ακέδεζλε ηδκ φπανλδ δφμ βμκζδίςκ ζε ημκηζκή απυζηαζδ, ηςκ orf40 ηαζ ets (Bm38) (εζη. 3.1). Σμ orf40 έπεζ ακαθενεεί ςξ ζδιακηζηυ βζα ηδκ ζζηή θεζημονβία: ιεηάθθαλδ πμο ειπμδίγεζ ηδ θεζημονβία ημο, αηονχκεζ ηδ δοκαηυηδηα δεοηενμβεκμφξ ιυθοκζδξ ημο ζμφ αδοκαιία παναβςβήξ ζμζςιάηςκ (Ono et al., 2012). Δπζπθέμκ ημ orf40, πμο ανίζηεηαζ ζημ 5 άηνμ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο lef8, ιεηαβνάθεηαζ πνμξ ηδκ ακηίεεηδ ηαηεφεοκζδ ηαζ δ απυζηαζδ ιεηαλφ ηςκ ηςδζηχκ πενζμπχκ ηςκ δφμ βμκζδίςκ είκαζ ιυθζξ 27 nt. Σα ζημζπεία αοηά ηαεζζημφκ ημ orf40 ηφνζμ οπμρήθζμ βζα ημ βμκίδζμ πμο δ έηθναζή ημο ιπμνεί κα επδνεαζηεί ανκδηζηά απυ ηδκ απμιάηνοκζδ ημο lef8. Α Β Γlef8 wt 272 bp Δηθόλα 3.18 Α. Δηηίιδζδ ηδξ παναβςβήξ ημο ιεηαβνάθμο orf40 3 dpt ιεηά ηδ δζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ηα ααηιίδζα Γlef8 ηαζ wt, ιέζς ακάθοζδξ PCR ηεθζημφ ζδιείμο. Ακζπκεφεηαζ ιεηάβναθμ ζηδ δζαιυθοκζδ ημο Γlef8. Β. Δηηίιδζδ ημο πνμηφπμο παναβςβήξ ηςκ ιεηάβναθςκ orf40 ηαζ gp64 βζα πενίμδμ 71 h ιεηά απυ δζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ηα ααηιίδζα Γlef8 ηαζ wt, ιέζς πμζμηζηήξ PCR. ημ ααηιίδζμ Γlef8 δ έηθναζδ ημο gp64 θαίκεηαζ ακηίζημζπδ αοηήξ ημο orf40. Σα απμηεθέζιαηα πανμοζζάγμκηαζ ηακμκζημπμζδιέκα ιε ηα ακηίζημζπα αβνίμο ηφπμο ηαζ επζπθέμκ ιε αάζδ ημ θυβμ ααηιζδζαηχκ ακηζβνάθςκ Γlef8:wt. Οζ βναιιέξ ζθάθιαημξ ακηζπνμζςπεφμοκ ηοπζηή απυηθζζδ (N=2). 103

128 Πνμηαηανηηζηή ιεθέηδ ηδξ έηθναζδξ ημο βμκζδίμο orf40 ζε ηφηηανα Bm5 δζαιμθοζιέκα ιε ααηιίδζμ Γlef8 (εζη. 3.18/Α, Β) έδεζλε υηζ ημ orf40 ιεηαβνάθεηαζ, αθθά ζε επίπεδα ζδιακηζηά παιδθυηενα ζε ζπέζδ ιε ηα επίπεδα ημο ααηιζδίμο αβνίμο ηφπμο ηαζ ζοβηεηνζιέκα 40% (22 hpt) ιε 95% (71 hpt) παιδθυηενα (εζη. 3.18/Β). Παν υθα αοηά, δ ζοιπενζθμνά ημο orf40 ειθακζγυηακ πανυιμζα ιε αοηή ημο δζθαζζηά ιεηαβναθυιεκμο ηαζ ημπμθμβζηά ακελάνηδημο βμκζδίμο gp64 (εζη. 3.18/Β). Δπμιέκςξ, δ παιδθυηενδ έηθναζή ημο θαζκυηακ κα μθείθεηαζ ζηδκ απμοζία υρζιδξ ιεηαβναθήξ ηαζ υπζ ζε βεκζηή απεκενβμπμίδζδ θυβς ηδξ απμιάηνοκζδξ ηδξ 5 βεζημκζηήξ πενζμπήξ, πμο ανίζηεηαζ ζημ 5 άηνμ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο lef8 ηαζ δεκ οπάνπεζ ζημ Γlef8. Όιςξ, δ ακαβηαζυηδηα βζα ηαηάθθδθμ πνμζακαημθζζιυ ηςκ αθθδθμοπζχκ δζάζςζδξ ζημ βεκεηζηυ ηυπμ ημο lef8, χζηε κα οπάνλεζ δζάζςζδ, οπέδεζλε ηδκ ακάβηδ επακεηηίιδζδξ ηδξ πζεακήξ ειπθμηήξ ημο orf40 ζηδ δζάζςζδ ημο ααηιζδίμο Γlef8. Γζα ημ ζημπυ αοηυ πνδζζιμπμζήζαιε ημ θμνέα pea.orf40, μ μπμίμξ ηαηεοεφκεζ ζοζηαηζηή έηθναζδ ημο orf40. Ο ζπεδζαζιυξ ημο θμνέα επζηνέπεζ μιυθμβμ ακαζοκδοαζιυ ιε ημ Γlef8, ηαηά ημκ μπμίμ δ αθθδθμοπία A.orf40 ακηζηαεζζηά ηδκ αθθδθμοπία yfp.bgh ηαζ ηαεζζηά ημ ααηιίδζμ YFP, υπςξ απεζημκίγεηαζ ζηδκ εζηυκα Ζ ζδζυηδηα αοηή πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ πεναζηένς ιεθέηδ ηδξ ζοκεζζθμνάξ ηδξ πνςηεΐκδξ ORF40 ζημ θαζκυηοπμ Γlef8, ζημ πθαίζζμ ημο ααηιζδίμο hsp70.lef8/polh Γlef8, ημ μπμίμ θένεζ ηδκ αθθδθμοπία έηθναζδξ hsp70.lef8 ζημ βεκεηζηυ ηυπμ ηδξ πμθοεδνίκδξ (ιεηάεεζδ Tn7, εζη. 3.14). Δάκ δ εζζαβςβή ηδξ θεζημονβζηήξ ηαζέηαξ ORF40 ζημ βεκεηζηυ ηυπμ lef8 ήηακ ζηακή κα δδιζμονβήζεζ έκακ ρεοδμ-αβνίμο ηφπμο ζυ, αοηυξ εα ήηακ εφημθμ κα ακαβκςνζζηεί ηαζ κα απμιμκςεεί απυ ηδκ παναβςβή πμθφεδνςκ (OB + ) ηαζ ηδκ απμοζία θεμνζζιμφ YFP. Ζ παναβςβή εκυξ ηέημζμο ζμφ εα απμηεθμφζε επίζδξ 5' lef8 flank ( ) 3' lef8 flank ( ) ScaI XcmI ( ) ( ) orf40 ets XcmI orf41 ( ) TV2 F bght e-yfp A1 actinp Zeo TV2 R odv-e66 ( ) γενεηικόρ ηόπορ lef8 ηος Γlef8 actint orf40 actinp hr3 pea.orf40 Δηθόλα 3.19 Τπμεεηζηυξ μιυθμβμξ ακαζοκδοαζιυξ ιεηαλφ ημο ααηιζδίμο Γlef8 ηαζ ημο θμνέα έηθναζδξ ORF40, pea.orf40. Λυβς ηδξ εηηεηαιέκδξ μιμθμβίαξ είκαζ πζεακή δ ακηζηαηάζηαζδ ημο ζημζπείμο yfp.bgh απυ ημ A.orf40 ηαεζζηχκηαξ ημ πνμηφπημκ ααηιίδζμ A.orf40 + /yfp. 104

129 Α απυδεζλδ υηζ μ θαζκυηοπμξ Γlef8 είκαζ απυννμζα ηδξ ηαοηυπνμκδξ έθθεζρδξ ηαζ ηςκ δφμ οπυ ιεθέηδ θεζημονβζχκ, ηςκ LEF8 ηαζ ORF40. Γζα ημκ έθεβπμ ηδξ παναπάκς οπυεεζδξ, δζαιμθφκεδηακ ηφηηανα Bm5 ιε ημ ααηιίδζμ hsp70.lef8/polh Γlef8 (i) ιυκμ ημο (ανκδηζηυ δείβια εθέβπμο), (ii) ιαγί ιε ημ pea.orf40, (iii) ιαγί ιε ημ peia.myc-lef8 ηαζ (iv) ιαγί ιε pea.orf40 ηαζ ημ peia.myc-lef8. ηζξ 6 dpt (days post transfection), οπενηείιεκμ απυ ηζξ ακηίζημζπεξ ηαθθζένβεζεξ ιεηαθένεδηε ζε ηφηηανα εθέβπμο Bm5, ηα μπμία δεκ πανάβμοκ LEF8 ή/ηαζ ORF40. ηζξ 5 dpi (days post infection) δ ιυθοκζδ ιε ημ οπενηείιεκμ ηδξ πενίπηςζδξ (iii) δεκ πενζείπε πμθφεδνα (OB ) ηαζ ειθάκζγε ηδκ ίδζα εζηυκα υπςξ ηαζ ημ ανκδηζηυ δείβια εθέβπμο (i). Ακηίεεηα μζ ιμθφκζεζξ ηςκ πενζπηχζεςκ (ii) ηαζ (iv) πανήβαβακ ηφηηανα YFP + θυβς ηδξ εοηαζνζαηήξ ζοιπαναβςβήξ ηαζ εθθεζιιαηζηχκ ζμζςιάηςκ Γlef8 ηαζ επζπθέμκ πενζείπακ πμθφεδνα (OB + ) (εζη. 3.20/A). Γεδμιέκμο υηζ πμθφεδνα εα ιπμνμφζακ κα παναπεμφκ ιυκμ απυ έκακ πθήνςξ θεζημονβζηυ ζυααηιίδζμ ρεοδμ-αβνίμο ηφπμο μζ παναπάκς δφμ πενζπηχζεζξ OB + οπμδδθχκμοκ ηδκ παναβςβή ηέημζςκ ζχκ. Οζ ηεθεοηαίμζ απμιμκχεδηακ ιέζς ηεπκζηήξ δζαδμπζηήξ αναίςζδξ ιε αάζδ ημκ θαζκυηοπυ ημοξ OB + /YFP. Β ,4 3,5 2,4 3,15 0,3 Δηθόλα 3.20 Α. Σοπζηή εζηυκα έβηθεζζηςκ ζχκ (OB + ) ζε ιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ηαεανυ OB + /YFP ζυααηιίδζμ. Β. Δπζαεααίςζδ ημο ακαζοκδοαζιμφ ιέζς ακηζδνάζεςκ PCR. Ανζζηενά, ηα απμηεθέζιαηα ηδξ ακίπκεοζδξ ιε ημοξ εηηζκδηέξ TVF-A1 (βι. εηθ. 3.19) ζε μθζηυ DNA απυ ηφηηανα Bm5 ιμθοζιέκα ιε ακαζοκδοαζιέκμ ααηιίδζμ, πμο πανήπεδ ηαηά ηζξ δζαιμθφκζεζξ ααηιζδίμο hsp70.lef8/polh Γlef8 ηαζ pea.orf40 ή pea.orf40/peia.myc-lef8 (δζαδνμιέξ 1 ηαζ 2, ακηίζημζπα). Ωξ εεηζηυ δείβια εθέβπμο πνδζζιμπμζήεδηε μ θμνέαξ pea.orf40 (δζαδνμιή 4), ιζαξ ηαζ μ ακαιεκυιεκμξ ακαζοκδοαζιυξ εζζάβεζ ζημ ααηιίδζμ ημ ζοκδοαζιυ ηςκ αθθδθμοπζχκ A.orf40 υπςξ ανίζημκηαζ ζημ θμνέα (εηθ. 3.19). Οζ ακηζδνάζεζξ απέδςζακ ημ πνμαθεπυιεκμ πνμσυκ ιήημοξ 0.3 kbp απυ ημοξ ακαζοκδοαζιέκμοξ ζμφξ-ααηιίδζα ηαζ ημ πθαζιίδζμ-εθέβπμο, εκχ ημ επίζδξ πνμαθεπυιεκμ πνμσυκ ιήημοξ 1.4 kbp πνμέηορε ιε ιήηνα ημ ααηιίδζμ Γlef8, ζημ μπμίμ πενζέπεηαζ δ αθθδθμοπία A.yfp/zeo (δζαδνμιή 3). Γελζά πανμοζζάγμκηαζ ηα ακηίζημζπα απμηεθέζιαηα βζα ημοξ εηηζκδηέξ TVF-TVR (εηθ. 3.19). Σμ ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο (wt) πνδζζιμπμζείηαζ ακηί βζα ημκ θμνέα pea.orf40, ςξ ανκδηζηυ δείβια εθέβπμο. Έκα πνμσυκ 2.4 kbp ακαιέκεηαζ απυ ημοξ ακαζοκδοαζιέκμοξ ζμφξ (δζαδνμιέξ 1 ηαζ 2), έκα 3.5 kbp βζα ημ Γlef8 (δζαδνμιή 3) ηαζ έκα 3.15 kbp βζα ημ ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο (δζαδνμιή 5). ε υθεξ ηζξ πενζπηχζεζξ οπήνλε παναβςβή ηςκ ακαιεκυιεκςκ πνμσυκηςκ, πμο επζαεααίςζε ημκ ακαζοκδοαζιυ. 105

130 ποςότητα επί των ιικών αντιγράφων wt Απμιυκςζδ μθζηχκ κμοηθεσηχκ μλέςκ απυ ηαθθζένβεζεξ ηοηηάνςκ Bm5 ιμθοζιέκςκ ιε ηαεανυ ζυ-ααηιίδζμ OB + /YFP εθέβεδηακ ιε ακηζδνάζεζξ PCR βζα ημκ πνμηεζκυιεκμ ακαζοκδοαζιυ. Σα απμηεθέζιαηα επζαεααίςζακ ηδκ πανμοζία ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ orf40 3 ημο οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ ζημ δζαζςζιέκμ ζυ (εζη. 3.20/Β, δηαδξνκέο 1 θαη 2). Γεδμιέκμο υηζ μ εκ θυβς οπμηζκδηήξ ιπμνεί απμδεδεζβιέκα κα οπμζηδνίλεζ ηδκ έηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ ORF40, δ έθθεζρδ ζδιακηζηχκ αθθδθμοπζχκ νφειζζδξ ημο βμκζδίμο orf40 απυ ημ ααηιίδζμ Γlef8 ζοκζζηά ιία ζδιακηζηή πανάιεηνμ ημο παναηδνμφιεκμο εθθεζιιαηζημφ θαζκυηοπμο. Ζ ακαπαναβςβζηή ζηακυηδηα ημο κέμο δζαζςζιέκμο πανάβςβμο Γlef8 ααηιίδζμ hsp70.lef8/polh A.orf40 ανέεδηε κα είκαζ πανυιμζα ιε αοηή ημο ααηιζδίμο αβνίμο ηφπμο, υπςξ πνμηφπηεζ απυ ηζξ ζπεηζηέξ ακηζδνάζεζξ qpcr (εζη. 3.21). Καηαζηεοάζηδηακ επζπθέμκ ηαζ θμνείξ υπμο δ ηςδζηή πενζμπή orf40 ήηακ ζδιαζιέκδ 5 ή 3 ιε ηδκ αθθδθμοπία myc, ιε ζημπυ κα οπάνπεζ δοκαηυηδηα ακίπκεοζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ ORF40. ε πεζνάιαηα δζαιυθοκζδξ ηφηηανςκ Bm5 ιε ημοξ θμνείξ έηθναζδξ ORF40, ζδιαζιέκδξ ή ιδ, ιαγί ιε θμνείξ έηθναζδξ Myc- LEF8 ηαζ ημ ααηιίδζμ Γlef8 δζαπζζηχεδηε υηζ, ιε ελαίνεζδ ηδκ 5 ζήιακζδ, οπήνλε παναβςβή ζμζςιάηςκ Γlef8 ζε υθεξ ηζξ πενζπηχζεζξ (εζη. 3.22/Α). Όιςξ δ παναπάκς παναβςβή δεκ ζοκδοαγυηακ ηαζ ιε αεθηίςζδ ζηδκ εκδμηοηηανζηή πμζυηδηα ημο ζζημφ DNA (εζη. 3.23), βεβμκυξ πμο ζοκεπάβεηαζ παιδθή απυδμζδ δζάζςζδξ. Καζ ζε αοηή ηδκ πενίπηςζδ δ πανμπή ηδξ αιζκμηεθζηά ζδιαζιέκδξ πνςηεΐκδξ ORF40 (Myc- 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, hsp70.lef8/polh - A.orf40 bacmid hpi Δηθόλα 3.21 Ακάθοζδ ιε πμζμηζηή PCR ηςκ εκδμηοηηανζηχκ επζπέδςκ ημο δζαζςζιέκμο ααηιζδίμο hsp70.lef8/polh A.orf40 ζε ζπέζδ ιε ηα ακηίζημζπα επίπεδα ημο ααηιζδίμο αβνίμο ηφπμο, ιε αάζδ ηδκ ακίπκεοζδ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο βμκζδίμο gp64. Ζ ακάθοζδ πναβιαημπμζήεδηε ζε δείβιαηα απυ ηαθθζένβεζεξ ηοηηάνςκ Bm5 πμο είπακ ιμθοκεεί ζε MOI 6. Οζ βναιιέξ ζθάθιαημξ ακηζπνμζςπεφμοκ ηοπζηή απυηθζζδ (N=2). 106

131 μεταβολή ιικών αντιγράφων Α Β Myc-LEF8 90 kda ORF40-Myc 40 kda Δηθόλα 3.22 Α. Παναβςβή YFP ζε ηφηηανα Bm5 ιεηά απυ ιυθοκζδ ιε οπενηείιεκμ απυ ηαθθζένβεζα δζαιμθοζιέκδ ιε Γlef8 ηαζ θμνείξ έηθναζδξ Myc-LEF8 ηαζ ORF40 (ακηίζημζπα ήηακ ηα απμηεθέζιαηα ηαζ ιε ηδκ πνςηεΐκδ ORF40-Myc). Ζ πανμοζία ηδξ πνςηεΐκδξ-ιάνηονα είκαζ εκδεζηηζηή ηδξ φπανλδξ θεζημονβζηχκ ζμζςιάηςκ, πμο επάβμοκ ηδ ζφκεεζδ YFP. Ακηίζημζπεξ εζηυκεξ πνμέηορακ ηαζ ιε ιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5 ιε οπενηείιεκμ απυ ηδ δζαιυθοκζδ ηδξ ηοηηανζηήξ ζεζνάξ δζάζςζδξ ιε Γlef8. Β. Ακίπκεοζδ ηςκ πνςηεσκχκ Myc-LEF8 ηαζ ORF40-Myc ζε ηοηηανζηή ζεζνά δζάζςζδξ Bm5, πμο πανάβεζ ζηαεενά ηζξ παναπάκς πνςηεΐκεξ ιε ηα ζοζηήιαηα EIA.myc-lef8 ηαζ EA.orf40-myc (MB: δείθηεο κνξηαθνύ βάξνπο). ORF40) δε θάκδηε κα μδδβεί ζε δζάζςζδ, ζοιπέναζια ζημ μπμίμ ζοκδβμνεί δ παιδθυηενδ πμζυηδηα ζζημφ DNA πμο ακζπκεφηδηε (εζη. 3.23). Σα παναπάκς ζοκζζημφκ εκδείλεζξ υηζ μ επίημπμξ Myc ζημ αιζκμηεθζηυ άηνμ επδνεάγεζ ανκδηζηά ηδ θεζημονβζηυηδηα ηδξ πνςηεΐκδξ. Σέθμξ ηαηαζηεοάζηδηε ηοηηανζηή ζεζνά δζάζςζδξ Bm5 δ μπμία εηθνάγεζ ζηαεενά Myc-LEF8, ιε ημ ζφζηδια EIA, ηαζ ORF40-Myc, ιε ημ ζφζηδια ΔΑ. Γζαιυθοκζδ αοηήξ ηδξ ζεζνάξ ιε ημ ααηιίδζμ Γlef8 έδςζε απμηεθέζιαηα πανυιμζα 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 + peia.myc-lef8 + pea.orf40 + peia.myc-lef8 + pea.myc-orf40 + phsp70.myc-lef8 + pea.orf hpt Δηθόλα 3.23 Δηηίιδζδ ηδξ ιεηααμθήξ ημο ανζειμφ ακηζβνάθςκ Γlef8 πανμοζία ηςκ θμνέςκ έηθναζδξ Myc-LEF8 ηαζ ORF40 (θοζζηή ηαζ αιζκμηεθζηά ζδιαζιέκδ). Με αάζδ ηδ ζφβηνζζδ ιε ημ νοειυ ιεηααμθήξ ηςκ ααηιζδίςκ αβνίμο ηφπμο ηαζ Γlef8 είκαζ ειθακέξ πςξ δ εκ θυβς οπμηαηάζηαζδ πναηηζηά δεκ ακαζηνέθεζ ημ ακαπαναβςβζηυ έθθεζιια ημο Γlef8. 107

132 ιε ηζξ ζπεηζηέξ πανμδζηέξ δζαιμθφκζεζξ: οπήνλε παναβςβή ζμζςιάηςκ, αθθά ζε παιδθμφξ ηίηθμοξ ηαζ πςνίξ ειθακή αφλδζδ ζηδκ πμζυηδηα ζζημφ DNA. Ζ πανμοζία ηαζ ηςκ δφμ ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ ζηα ηφηηανα δζαπζζηχεδηε ιε ακίπκεοζδ ηαηά western (εζη. 3.22/Β). οκμθζηά ηα δεδμιέκα πμο παναηέεδηακ οπμζηδνίγμοκ υηζ μζ παναβχιεκεξ απυ εηενυθμβα ζοζηήιαηα έηθναζδξ ζζηέξ πνςηεΐκεξ ORF40/LEF8 ιπμνμφκ κα δζαζχζμοκ ημκ εθθεζιιαηζηυ θαζκυηοπμ ιε ιζηνή απυδμζδ, υηακ πανέπμκηαζ ελςβεκχξ. 3.6 Καηαζκεςή βεληιυμένυν ελλειμμαηικών βακμιδίυν Γlef Υξεζηκνπνίεζε θπζηθώλ ηηθώλ αιιεινπρηώλ γηα έθθξαζε ηνπ γνληδίνπ orf40 Γεκ οπάνπμοκ ζημζπεία ζπεηζηά ιε ημκ οπμηζκδηή ημο βμκζδίμο orf40, αθθά δ ιεθέηδ ημο βμκζδίμο orf51, πμο απμηεθεί μιυθμβμ ημο orf40 ζημκ ζυ AcMNPV, έδεζλε υηζ δ εέζδ έκανλδξ ηδξ ιεηαβναθήξ ανίζηεηαζ ζηδ εέζδ -162, δ μπμία ακηζζημζπεί ζηδ 2 δ αδεκίκδ ημο ιμηίαμο υρζιδξ ιεηαβναθήξ ATAAG (Chen et al., 2013). Oζ ζμί BmNPV ηαζ AcMNPV ειθακίγμοκ 96% ηαοηυηδηα αθθδθμοπίαξ ζηδκ πενζμπή -1 ιε ςξ πνμξ ηδκ ηςδζηή πενζμπή orf40/orf51, πμο πενζθαιαάκεζ ημ παναπάκς ιμηίαμ, μπυηε είκαζ δυηζιμ κα οπμεέζμοιε υηζ δ εέζδ έκανλδξ ηδξ ιεηαβναθήξ ημο orf40 ανίζηεηαζ ζηδκ ίδζα εέζδ (-162). Τπμεέζαιε επίζδξ υηζ μ οπμηζκδηήξ ημο βμκζδίμο orf40 εκημπίγεηαζ 5 ηδξ εέζδξ -162 ηαζ υηζ έκα ιεβαθφηενμ ηιήια ηδξ αθθδθμοπίαξ 5 ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ orf40 εα ημκ πενζέπεζ. Γζα κα ηαηαζηεοάζμοιε έκα κέμ ααηιίδζμ, ημ μπμίμ εα είκαζ εθθεζιιαηζηυ ιυκμ ςξ πνμξ ημ βμκίδζμ lef8, επζθέπεδηε κα παναιείκεζ ζημ ααηιίδζμ ημ ηιήια +1 ιε +485 ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο lef8 ςξ «οπμηζκδηήξ» ημο orf40 οπεκεοιίγμοιε υηζ ημ +1 ημο lef8 είκαζ ημ 27 ςξ πνμξ ημ orf40. Με αοηυκ ημκ ηνυπμ επζπθέμκ, δ ηαηαζηεοή ημο ηεθζημφ θμνέα ακαζοκδοαζιμφ δζαιυνθςκε έκα πνυςνμ ηςδζηυκζμ θήλδξ ημο ηφπμο TAA βζα ημκ ηενιαηζζιυ ημο ηιήιαημξ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ lef8, ηέημζμο χζηε δ ιεηάθναζδ κα θήβεζ ιεηά απυ ηα 162 θοζζηά αιζκμηεθζηά αιζκμλέα ηδξ LEF8, πμο ηςδζημπμζμφκηαζ ζημ ηιήια +1 ιε +485 (εζη. 3.24). Καηά ηδκ ηαηαζηεοή ημο κέμο εθθεζιιαηζημφ ζμφ πνδζζιμπμζήεδηε ηαζ πάθζ δ ηαζέηα ακαθμνάξ A.yfp/zeo αοηή ηδ θμνά υιςξ βζα ηδκ ακηζηαηάζηαζδ ημο ηιήιαημξ 108

133 TV2S FABAA lef8 NheI A.yfp/zeo REV ScaI F_F orf40 lef8' TAA Actin P yfpr bght ets PvuI 8063 orf41 TV2 F zeo zeor e-yfp odv-e66 Δηθόλα 3.24 πδιαηζηή απεζηυκζζδ ημο βεκεηζημφ ηυπμο ημο βμκζδίμο lef8 ζημ ααηιίδζμ A.yfp/zeo lef8 Γ( ) BmNPV. Ο βεκεηζηυξ ηυπμξ είκαζ ηαοηυζδιμξ ιε αοηυκ ημο ααηιζδίμο Γlef8 ιε ιυκεξ δζαθμνέξ, ηδκ 5' ακηίζηνμθδ lef8 flank θμνά ηδξ αθθδθμοπίαξ A.yfp/zeo ηαζ ηδ δζαηήνδζδ ηδξ πενζμπήξ ημο lef8. διεζχκεηαζ ημ ζοκεεηζηυ ηςδζηυκζμ θήλδξ TAA, ζημ μπμίμ θήβεζ ημ εθθεζιιαηζηυ πθαίζζμ lef8, μζ 3' lef8 flank εέζεζξ ακαβκχνζζδξ ηςκ εκγφιςκ πενζμνζζιμφ (ScaI/PvuI), πμο μνζμεεημφκ ημκ εοεφβναιιμ θμνέα ακαζοκδοαζιμφ, πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ παναβςβή ημο εθθεζιιαηζημφ ααηιζδίμο, ηαζ μζ εέζεζξ εηηζκδηχκ PCR, πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδ δμιζηή επζαεααίςζδ ιε ημο ακμζηημφ πθαζζίμο lef8 (εζη. 3.24). Ζ εκαπμιείκμοζα πενζμπή lef8 ζοκζζηά μπςζδήπμηε ιία εέζδ μιμθμβίαξ ιε ημοξ θμνείξ έηθναζδξ LEF8, πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ηδ δζάζςζδ ημο εθθεζιιαηζημφ ζμφ, ηαζ ςξ εη ημφημο ιία πζεακχξ πνμαθδιαηζηή εέζδ. Ήηακ υιςξ ζηυπζιμ κα δμηζιαζηεί ηαζ δ εκ θυβς ιέεμδμξ ζπεδζαζιμφ, πνμηεζιέκμο κα δζαπζζηςεεί ακ ιία εέζδ μιμθμβίαξ, ζπεηζηά ιζηνμφ ιεβέεμοξ, εα ιπμνμφζε κα ζοιαάθεζ ζηδκ απμθοβή θαζκμιέκςκ ιυκζιδξ επακαθμνάξ ημο βμκζδίμο lef bp βακμίδιο A.yfp/zeo lef8 Γ( ) BmNPV Ζ δδιζμονβία ημο ακαζοκδοαζιέκμο ζμφ επζαεααζχεδηε ιέζς ακηζδνάζεςκ PCR (εζη. 3.25) ιε ηαηάθθδθα γεφβδ εηηζκδηχκ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ηφηηανα Bm5 δζαιμθφκεδηακ ιε ημ κέμ ααηιίδζμ ηαζ ημοξ θμνείξ έηθναζδξ LEF8 peia.myc-lef8 ή hsp70.myc-lef8. Καηά ηδ δζαιυθοκζδ παναηδνήεδηε δζάζςζδ ημο εθθεζιιαηζημφ ααηιζδίμο ιε ειθακή εκενβυ ιυθοκζδ. Όιςξ, δ ιεηαθμνά οπενηείιεκμο ζε κέα Α λ2,3 Α λ2,3 877 bp 2100 bp TV2-F/yfp-R lef8 5F_F/zeo-R Δηθόλα 3.25 PCR ιε ημοξ εηηζκδηέξ TV2-F/yfp-R (ανζζηενά) ηαζ lef8 5F_F/zeo-R (δελζά) ζημ ααηιίδζμ A.yfp/zeo lef8 Γ( ). Ακαιέκμκηαζ ακηίζημζπα πνμσυκηα 877 bp ηαζ ~2100 bp, ηα μπμία εθήθεδζακ (δζαδνμιή Α) ηαζ ειθακίγμκηαζ ηαοηυζδια ιε ηα εεηζηά δείβιαηα εθέβπμο (P). Ωξ ιήηνα βζα ηα ηεθεοηαία πνδζζιμπμζήεδηε ημ παηνζηυ πθαζιίδζμ ημο θμνέα ακαζοκδοαζιμφ, πμο δίκεζ ημ ίδζμ πνμσυκ ιε ημ ηεθζηυ ακαζοκδοαζιέκμ, εθθεζιιαηζηυ ααηιίδζμ. Ωξ ανκδηζηυ δείβια εθέβπμο (Ν) πνδζζιμπμζήεδηε Ζ 2 Ο. Οζ εέζεζξ ηςκ εηηζκδηχκ ζδιεζχκμκηαζ ζηδκ εζηυκα 3.24/ θ2,3: δείηηδξ ιμνζαημφ αάνμοξ. 109

134 ηαθθζένβεζα ηοηηάνςκ Bm5, πμο δεκ πενζείπακ LEF8, έδεζλε ηαζ πάθζ εκενβυ ιυθοκζδ, επζαεααζχκμκηαξ ηδκ πανμοζία ζχκ ρεοδμ-αβνίμο ηφπμο. Όθμζ μζ θμνείξ δζάζςζδξ πενζέπμοκ ημ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ ημο lef8 ηαζ ςξ εη ημφημο ειθακίγμοκ μιμθμβία πνμξ ημ βεκεηζηυ ηυπμ lef8 ημο ζοβηεηνζιέκμο εθθεζιιαηζημφ ζμφ. Ζ παναβςβή ρεοδμ-αβνίμο ηφπμο ζχκ επμιέκςξ απμδεζηκφεζ υηζ δ φπανλδ ιίαξ εέζδξ μιμθμβίαξ, ιε ηδ δζαηήνδζδ ηδξ πενζμπήξ ημο lef8 ζηδ θοζζηή ηδξ εέζδ ζημ ζζηυ βμκζδίςια, είκαζ ζηακή ζοκεήηδ βζα ηδκ απχθεζα ημο εθθεζιιαηζημφ βμκυηοπμο πανμοζία θμνέςκ δζάζςζδξ. οκεπχξ μ ζπεδζαζιυξ, πμο πνδζζιμπμζεί ηδκ αθθδθμοπία ημο θοζζημφ οπμηζκδηή orf40, είκαζ αηαηάθθδθμξ βζα ημοξ ζημπμφξ ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ Υξεζηκνπνίεζε εηεξόινγνπ ππνθηλεηή γηα έθθξαζε ηνπ γνληδίνπ orf40 Ο οπμηζκδηήξ ηδξ αηηίκδξ είκαζ ζηακυξ κα οπμηαηαζηήζεζ ηδ θεζημονβία ημο θοζζημφ οπμηζκδηή ημο βμκζδίμο orf40, υπςξ δζαπζζηχεδηε απυ ημκ ιμθοζιαηζηυ θαζκυηοπμ ημο ααηιζδίμο hsp70.lef8/polh-a.orf40. Με αάζδ αοηή ηδκ παναηήνδζδ πναβιαημπμζήεδηε δ ηαηαζηεοή εκυξ κέμο, εθθεζιιαηζημφ ςξ πνμξ ημ lef8, ααηιζδίμο, ημ μπμίμ ακαπανάβεζ ηδ δμιή ημο δζαζςζιέκμο ααηιζδίμο hsp70.lef8/polh-a.orf40 ζημ βεκεηζηυ ηυπμ ημο lef8 (βι. εηθ. 3.19), ιε ημκ οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ ζε άιεζδ βεζηκίαζδ ιε ηδ ιεηαθναγυιεκδ πενζμπή ημο orf40. Γζα ημ ζημπυ αοηυ αλζμπμζήεδηε μ θμνέαξ ακαζοκδοαζιμφ πμο είπε Α ScaI F_F orf40 Actin P zeor MluI 5048 ets 3F_R Β orf bp A.1 gfpr mac3f Ppol Zeo odv-e66 βακμίδιο A.orf40 Γlef8 βακμίδιο polh/gfp A.orf40 Γlef8 Bmpolh sv40 HSV tk egfp p10 polhr 5' lef8 flankpfbd Ppol.Bmpol/p10.egfp Δηθόλα 3.26 Α. πδιαηζηή απεζηυκζζδ ημο βεκεηζημφ 3' lef8 flank ηυπμο ημο βμκζδίμο lef8 ζημ ααηιίδζμ A.orf40 Γlef8 ηαζ ζημ πανάβςβμ αοημφ, polh/gfp A.orf40 Γlef8. Ζ βεκεηζηή ζφζηαζδ είκαζ αοηή ημο ααηιζδίμο Γlef8 πςνίξ ηδκ αθθδθμοπία yfp.bgh ιε απμηέθεζια μ οπμηζκδηήξ EM7 ηδξ αηηίκδξ κα ημπμεεηείηαζ ζε εέζδ ηαηάθθδθδ βζα ηδ θεζημονβζηή ακαπθήνςζδ ημο βμκζδίμο orf40. διεζχκμκηαζ μζ εέζεζξ ακαβκχνζζδξ ηςκ εκγφιςκ πενζμνζζιμφ TV2S-SacI πμο μνζμεεημφκ A/zeo ημκ εοεφβναιιμ θμνέα ακαζοκδοαζιμφ πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ παναβςβή ημο εθθεζιιαηζημφ ααηιζδίμο ηαζ μζ εέζεζξ ηςκ εηηζκδηχκ PCR βζα ηδκ επζαεααίςζδ ημο ηεθζημφ ααηιζδίμο. Β. Λεπημιένεζα ημο θμνέα pfbd Ppol.Bmpol/p10.egfp πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδ ιεηάεεζδ ηςκ αημθμοεζχκ Ppol.Bmpol/p10.egfp ζημ ααηιίδζμ A.orf40 Γlef8 πνμηεζιέκμο κα ηαηαζηεοαζηεί ημ πανάβςβμ ααηιίδζμ polh/gfp A.orf40 Γlef8. διεζχκμκηαζ επίζδξ μζ εέζεζξ ηςκ εηηζκδηχκ PCR. 110

135 πνδζζιμπμζδεεί βζα ηδκ ηαηαζηεοή ημο Γlef8 απυ ημκ μπμίμ υιςξ είπε αθαζνεεεί δ αθθδθμοπία yfp.bgh, χζηε κα επζηεοπεεί δ δμιή A.orf40 ζημ θμνέα ηαζ ηαη επέηηαζδ ζημ ηεθζηυ ααηιίδζμ (εζη. 3.26/A). Ο ζοβηεηνζιέκμξ ζπεδζαζιυξ αθαζνμφζε ημκ θεμνίγμκηα ιάνηονα (eyfp), αθθά ήηακ απυ ημοξ απθμφζηενμοξ ηαζ εοπενέζηενα οθμπμζήζζιμοξ ιε αάζδ ηα δζαεέζζια οθζηά. Ζ ηαηαζηεοή ημο κέμο εθθεζιιαηζημφ ααηιζδίμο, A.orf40 Γlef8 επζαεααζχεδηε ιέζς ακηζδνάζεςκ PCR ιε ηαηάθθδθα γεφβδ εηηζκδηχκ (εζη. 3.27/Α). Σμ ααηιίδζμ A.orf40 Γlef8 ελμπθίζηδηε ιε δφμ ηαζέηεξ ακαθμνάξ πμο θεζημονβμφκ ηαηά ηδκ πμθφ υρζιδ (very late) θάζδ έηθναζδξ ημο ζμφ, βζα ηδκ εοπενέζηενδ παναημθμφεδζδ ηδξ ζοιπενζθμνάξ ημο: ιία ηαζέηα παναβςβήξ ηδξ πμθοεδνίκδξ ηαζ ιία παναβςβήξ ηδξ GFP οπυ ημκ έθεβπμ ηςκ οπμηζκδηχκ ηδξ πμθοεδνίκδξ ηαζ p10 ακηίζημζπα (εζη. 3.26/Β). Οζ παναπάκς οπμηζκδηέξ είκαζ απυ ημκ ζυ AcMNPV, υπςξ αοημί πενζέπμκηαζ ζημ θμνέα ιεηάεεζδξ Tn7 pfastbac dual (ζφζηδια bac-to-bac, Invitrogen). Oζ δφμ βεκεηζηά ζοκδεδειέκεξ ηαζέηεξ έηθναζδξ ιεηαηέεδηακ ζηδ εέζδ εζζαβςβήξ Tn7 (mini-atttn7) ημο ααηιζδίμο, δζαδζηαζία πμο επζαεααζχεδηε ιέζς ακηζδνάζεςκ PCR ιε ηαηάθθδθα γεφβδ εηηζκδηχκ (εζη. 3.27/Β). Κφηηανα Bm5 δζαιμθφκεδηακ ιε ημ ηεθζηυ ααηιίδζμ polh/gfp A.orf40 Γlef8 ηαζ θμνείξ έηθναζδξ LEF8, μπυηε ηαζ δζαπζζηχεδηε πενζμνζζιέκδ παναβςβή GFP ηαζ πμθφεδνςκ, ζημζπείςκ πμο απμδεζηκφμοκ ηδκ μθμηθήνςζδ ημο ηφηθμο ιυθοκζδξ ηαζ ηαη επέηηαζδ ηδκ επζηοπή δζάζςζδ ημο εθθεζιιαηζημφ ααηιζδίμο. Γζα ηδ δμηζιή δζάθμνςκ ζοκεδηχκ δζάζςζδξ πνδζζιμπμζήεδηακ θμνείξ έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 ιε δζαθμνεηζηυ δοκαιζηυ παναβςβήξ α) παιδθυ, ιε πνήζδ ημο οπμηζκδηή mac3 (m: minimum πνυηεζηαζ βζα εθάπζζημ οπμηζκδηή πμο ειθακίγεζ παναβςβζηή ζηακυηδηα πενίπμο ίζδ ιε ημ 1/7 αοηήξ ημο πθήνμοξ οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ Α3 ημο Bombyx mori βι. ζηελ παξάγξαθν 3.7.3), α) ιέζμ, ιε πνήζδ ημο οπμηζκδηή hsp70 ηαζ β) ορδθυ ιε πνήζδ ημο ζοζηήιαημξ EIA ηαζ επζπθέμκ ζε πμζηίθεξ πμζυηδηεξ ηαηά ηδ δζαιυθοκζδ (62.5/ 125/ 250/ 500 ng), χζηε κα ελεηαζεεί ηαηά πυζμκ δ δζαθμνεηζηή ακά πενίπηςζδ ηαηακμιή ηςκ ακηίζημζπςκ ιμνίςκ ζηα ηφηηανα έπεζ ακηίηηοπμ ζηδ δζάζςζδ per se. Γε δζαπζζηχεδηε υιςξ ηάπμζα αφλδζδ ηςκ ειθακχξ ιμθοζιέκςκ ηοηηάνςκ ηαζ ηα επίπεδα δζάζςζδξ πανέιεζκακ παιδθά. Τπενηείιεκμ, εθεφεενμ απυ ηφηηανα, απυ ηζξ παναπάκς δζαιμθφκζεζξ πμο είπε ζοθθεβεί ζηζξ 10 dpt πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδ ιυθοκζδ κέςκ ηαθθζενβεζχκ Bm5, πμο είηε είπακ εη ηςκ πνμηένςκ δζαιμθοκεεί ιε θμνείξ έηθναζδξ LEF8 είηε απμηεθμφζακ ηαθθζένβεζεξ εθέβπμο πςνίξ LEF8. Όπςξ δζαπζζηχεδηε, ζηδκ πνχηδ πενίπηςζδ 111

136 παναηδνήεδηακ πμθφεδνα ηαζ θεμνζζιυξ (εζη. 3.28), εκχ ζηδ δεφηενδ υπζ, βεβμκυξ πμο ζοκεπάβεηαζ μθμηθήνςζδ ημο ζζημφ ηφηθμο γςήξ ιυκμ πανμοζία ελςβεκμφξ LEF8 ηαζ ςξ εη ημφημο επζαεααζχκεζ: ηδκ πανμοζία εθθεζιιαηζηχκ ζμζςιάηςκ ζημ οπενηείιεκμ ηδξ δζαιυθοκζδξ, ηδ δζάζςζδ ηςκ παναπάκς ζμζςιάηςκ απμηθεζζηζηά απυ ηδκ LEF8, πμο, ακ Α X P P X λ2,3 N N X P λ2,3 N 1853 bp 1174 bp 2356 bp 5F_F/A.1 5F_F/mAc3F 3F_R/zeoR B N λ2,3 P X X λ2,3 N 2400 bp 1000 bp M13 R/polh M13 R/gfp R Δηθόλα 3.27 Α. Δπζαεααίςζδ ημο ακαζοκδοαζιμφ ζημ ααηιίδζμ A.orf40 Γlef8. Όθμζ μζ ηθχκμζ πμο ελεηάζηδηακ πενζείπακ ιυκμ ημ ααηιίδζμ. (ανζζηενά) PCR ιε ημοξ εηηζκδηέξ 5F_F/mAc3F ηαζ 5F_F/A.1. Δθήθεδζακ ηα ακαιεκυιεκα πνμσυκηα 1853 ηαζ 1174 bp (δζαδνμιή Υ), ηα μπμία ηαζ ειθακίγμκηαζ ηαοηυζδια ιε ηα εεηζηά δείβιαηα εθέβπμο (P). (δελζά) PCR ιε ημοξ εηηζκδηέξ 3F_R/zeoR. Δθήθεδ ημ ακαιεκυιεκμ πνμσυκ 2356 bp (δζαδνμιή Υ), ηo μπμίo ηαζ ειθακίγεηαζ ηαοηυζδιμ ιε ημ εεηζηυ δείβια εθέβπμο (P). Ωξ πνυηοπμ βζα ημ ηεθεοηαίμ πνδζζιμπμζήεδηε ημ πθαζιίδζμ ημο θμνέα ακαζοκδοαζιμφ, πμο δίκεζ ημ ίδζμ πνμσυκ ιε ημ ηεθζηυ ακαζοκδοαζιέκμ, εθθεζιιαηζηυ ααηιίδζμ. Β. Δπζαεααίςζδ ηδξ ιεηάεεζδξ Tn7 βζα ηδκ ηαηαζηεοή ημο ααηιζδίμο polh/gfp A.orf40 Γlef8. PCR ιε ημοξ εηηζκδηέξ M13-pUC R/polh (ανζζηενά) ηαζ M13-pUC R/gfp-R (δελζά). Ακαιέκμκηαζ πνμσυκηα ~1000 ηαζ ~2400 bp ακηίζημζπα, ηα μπμία εθήθεδζακ (δζαδνμιή Υ). Σμ εεηζηυ δείβια εθέβπμο (P)-ανζζηενά πνδζζιμπμζεί ςξ οπυζηνςια ημ ααηιίδζμ hsp70.lef8/polh Γlef8. Ωξ οπυζηνςια βζα ηα ανκδηζηά δείβιαηα εθέβπμο πνδζζιμπμζήεδηε Ζ 2 Ο ζε ηάεε πενίπηςζδ. Οζ εέζεζξ ηςκ εηηζκδηχκ ζδιεζχκμκηαζ ζηδκ εζη

137 Δηθόλα 3.28 Παναβςβή GFP απυ ημκ οπμηζκδηή p10 [ανζζηενυ γεφβμξ θςημβναθζχκ εκυξ ιειμκςιέκμο πεδίμο, ιε (ανζζηενά) ηαζ πςνίξ (δελζά) θεμνζζιυ] ηαζ πμθφεδνςκ (θςημβναθία ανζζηενά ηαζ επζπθέμκ δφμ πεδία, δελζά), πμο ηεηιδνζχκμοκ ηδκ μθμηθήνςζδ ημο ζζημφ ηφηθμο ζε ηφηηανα Bm5 ζοκδζαιμθοζιέκα ιε ημ ααηιίδζμ polh/gfp/a.orf40 Γlef8 ηαζ ημκ θμνέα έηθναζδξ LEF8, phsp70.myc-lef8. ηαζ ιε παιδθή απυδμζδ, απμδεζηκφεζ υηζ δ ελςβεκήξ πανμπή ηδξ LEF8 ζοκζζηά ακαβηαία ηαζ ζηακή ζοκεήηδ βζα ηδ δζάζςζδ ημο εθθεζιιαηζημφ ζμφ ηδκ απμοζία ζχκ ρεοδμ-αβνίμο ηφπμο πμο εα ιπμνμφζακ κα μθμηθδνχζμοκ ημκ ηφηθμ ημοξ ηαζ πςνίξ ηδκ πανμπή LEF Δπιπλέον μελέηερ In silico κειέηε γηα ηελ αλάδεημε ησλ αιιεινπρηώλ ηνπ ππνθηλεηή ηνπ γνληδίνπ orf40 In silico ιεθέηδ ηςκ πνχηςκ κμοηθεμηζδίςκ 5 (ακμδζηά) ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο orf40 ζημ ααηιίδζμ BmNPV αβνίμο ηφπμο (πνδζζιμπμζήεδηε δ αθθδθμοπία ημο ζηεθέπμοξ T3, (Gomi et al., 1999)) απμηάθορε ιία πμζηζθία ααηηνμσζηχκ αθθδθμοπζχκ οπμηζκδηή: α) ιία αθθδθμοπία πνχζιδξ ιεηαβναθήξ ηφπμο TATA ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ αθθδθμοπία έκανλδξ ηδξ ιεηαβναθήξ CATT, α) ιία επζπθέμκ αθθδθμοπία TATA ιαγί ιε ηδκ πζεακή αθθδθμοπία έκανλδξ TATT (είκαζ ζοιααηή ιε ακηίζημζπεξ ζοκαζκεηζηέξ (consensus) αθθδθμοπίεξ απυ ημκ οπμηζκδηή hsp70 ηδξ Drosophilla (Kogan et al., 1995)) ηαζ β) δφμ αθθδθμοπίεξ υρζιδξ ιεηαβναθήξ TTAAG ηαζ ATAAG (εζη. 3.29/Α). Πανυιμζα δζάηαλδ αθθδθμοπζχκ ανίζηεηαζ ηαζ ζημκ οπμηζκδηή ημο δζθαζζημφ εηθνάγεηαζ πνχζια ηαζ υρζια βμκζδίμο gp64 ημο ζμφ Orgyia pseudotsugata MNPV (OpMNPV) ιε ιία αθθδθμοπία TATA ζοκδεδειέκδ ιε έκα CAGT ηαζ δφμ αθθδθμοπίεξ υρζιδξ ιεηαβναθήξ, TTAAG and ATAAG (εζη. 3.29/Β) (Chang & Blissard, 1997; Kogan et al., 1995; Rahman & Gopinathan, 2003). Ο οπμηζκδηήξ ημο βμκζδίμο gp64 ημο BmNPV θαίκεηαζ κα πενζέπεζ ηδκ ίδζα αθθδθμοπία TATA, αθθά 113

138 ζημ ζηέθεπμξ T3 ηαζ ζε άθθα δεκ οπάνπεζ ζοκδεδειέκδ αθθδθμοπία έκανλδξ (Rahman & Gopinathan, 2003), πανά ιυκμ ιία αθθδθμοπία υρζιδξ ιεηαβναθήξ TTAAG, ακμδζηά ηδξ TATA (εζη. 3.29/Β). Ακηίζημζπδ ακάθοζδ πναβιαημπμζήεδηε ηαζ βζα ημ ααηιίδζμ Γlef8 ηαζ ηα πανάβςβά ημο, πμο δζαζχεδηακ ιε ηδκ εζζαβςβή ηαζέηαξ έηθναζδξ LEF8 (hsp70.lef8 ηαζ A.lef8) ζημ βεκεηζηυ ηυπμ ημο βμκζδίμο lef8. Σα ααηιίδζα πμο δζαζχεδηακ ιε ηδκ εζζαβςβή ηςδζηήξ πενζμπήξ lef8 (myc-lef8 ηαζ myc-aclef8) δζαθένμοκ ηονίςξ ζημ ηιήια πμο ακηζζημζπεί ζημκ επίημπμ ζήιακζδξ (ζοκμθζηά πενίπμο 50 nt ελςβεκμφξ αθθδθμοπίαξ) ηαζ δε εεςνήεδηε ζηυπζιμ κα ιεθεηδεμφκ πεναζηένς, ιζαξ ηαζ μζ αθθδθμοπίεξ οπμηζκδηή ζε αοηά δεκ ακαιέκεηαζ κα δζαθμνμπμζμφκηαζ απυ ηζξ θοζζηέξ. Σέθμξ ακαθφεδηε δ οπμεεηζηή δμιή απυ δφμ ααηιίδζα πμο δεκ ηαηέζηδ εθζηηή δ δζάζςζδ ηαζ απμιυκςζή ημοξ ηαζ ζοβηεηνζιέκα ηςκ A.lef8 reverse ηαζ Cclef8. Σμ πνχημ εα απμηεθμφζε ημ πνμσυκ ηδξ δζάζςζδξ ιε ημ θμνέα ptva.lef8 reverse ηαζ ημ δεφηενμ ακηίζημζπα ιε ημ θμνέα ptvcclef8 (βι. εηθόλα 3.13/Α θαη παξάγξαθν 3.4). Ζ αθαίνεζδ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο lef8 ζημ ααηιίδζμ Γlef8 ζοκεπάβεηαζ ηδκ απμιάηνοκζδ μθυηθδνδξ ηδξ ακμδζηήξ πενζμπήξ ημο orf40, 5 ηδξ εέζδξ -26. Με αοηυκ ημκ ηνυπμ έπεζ αθαζνεεεί ημ ζφκμθμ ηςκ πζεακχκ αθθδθμοπζχκ ημο οπμηζκδηή ημο orf40 ιε ελαίνεζδ ιία πζεακή εέζδ έκανλδξ ηδξ ιεηαβναθήξ ζηδ εέζδ -15 (εζη. 3.29/Β). Ζ έκεεζδ ηδξ αθθδθμοπίαξ A.yfp/zeo δζαιυνθςζε ιία κέα δζάηαλδ πζεακχκ ζημζπείςκ νφειζζδξ, ιε έκακ ανζειυ επζπθέμκ δοκδηζηχκ εέζεςκ έκανλδξ ηδξ ιεηαβναθήξ ζε απυζηαζδ ημοθάπζζημκ 52 nt απυ ιία απμιαηνοζιέκδ εέζδ -325 αθθδθμοπία TATA. Σδκ ίδζα δμιή, πναηηζηά αοημφζζα ειθακίγεζ ηαζ ημ ιδ δζαζςζιέκμ ααηιίδζμ A.lef8 reverse (εζη. 3.29/Β). Ακηζεέηςξ, υθα ηα ααηιίδζα πμο δζαζχεδηακ ειθακίγμοκ οπμρήθζεξ αθθδθμοπίεξ οπμηζκδηή πθδζζέζηενα ζηδκ ηςδζηή πενζμπή ημο orf40 πνζκ ηδ εέζδ ηαζ επζπθέμκ δζαεέημοκ ζοκδοαζιμφξ αθθδθμοπζχκ TATA ηαζ εέζεςκ έκανλδξ ηδξ ιεηαβναθήξ ζε απυζηαζδ ιζηνυηενδ/ίζδ ηςκ 30 nt (εζη. 3.29/Β). Σμ ααηιίδζμ Cclef8 είκαζ ημ ιυκμ πμο θαίκεηαζ κα δζαθμνμπμζείηαζ απυ ημ παναπάκς πνυηοπμ, ιζαξ ηαζ ζοβηνζηζηά θαίκεηαζ κα δζαεέηεζ αθθδθμοπίεξ οπμηζκδηή ζε απμζηάζεζξ ακηίζημζπεξ αοηχκ πμο έπμοκ παναηδνδεεί ζε δζαζςζιέκμοξ ζμφξ, υπςξ ημ ααηιίδζμ A.lef8, αθθά παν υθα αοηά δεκ επάβεζ θαζκυηοπμ δζάζςζδξ. Σμ εέια αοηυ δζενεοκάηαζ ζηδκ επυιεκδ πανάβναθμ (3.7.2). 114

139 A tgttcattaagagcgcaacacaaataagacttgcgttcttgaatagccccaaaaagtatacgttcattgttgttgtttgtagcacaatcaaaagtatat -26 orf40 tttaatttgtatttattttcaattttatcgtacaactcgttgaaatcttgaactacgtccgtcatcgtaaagcgattattgcacactaattatg lef8 Β Δηθόλα 3.29 Α. Τπμρήθζεξ ααηηνμσζηέξ αθθδθμοπίεξ οπμηζκδηή ημο βμκζδίμο orf40 ζηδκ πενζμπή ημο βεκεηζημφ ηυπμο lef8 orf40. πεδυκ υθεξ ιε ελαίνεζδ ηδκ αθθδθμοπία TATT ζηδ εέζδ -15 απμηεθμφκ ηιήια ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο βμκζδίμο lef8 ηαζ ςξ εη ημφημο απμοζζάγμοκ απυ ημ ααηιίδζμ Γlef8 ζημ μπμίμ δ πενζμπή 5 ηδξ εέζδξ -26 έπεζ ακηζηαηαζηαεεί απυ ηδκ ηαζέηα A.yfp/zeo. Β. οβηνζηζηή πανμοζίαζδ πζεακχκ αθθδθμοπζχκ οπμηζκδηή ημο βμκζδίμο orf40 ζηα ααηιίδζα αβνίμο ηφπμο, Γlef8 ηαζ ζηα δζαζςζιέκα (πνάζζκμ πνχια) ηαζ ιδ (ηυηηζκμ πνχια) πανάβςβα ημο Γlef8 ηαζ ζφβηνζζδ ιε ηζξ ακηίζημζπεξ αθθδθμοπίεξ ηςκ βμκζδίςκ gp64 απυ ημοξ ζμφξ BmNPV ηαζ Orgyia pseudotsugata MNPV (OpMNPV). Οζ δοκδηζηέξ αθθδθμοπίεξ οπμηζκδηή ημο orf40 αβνίμο ηφπμο ειθακίγμοκ μιμζυηδηα, ηυζμ ζημ πενζεπυιεκμ υζμ ηαζ ζηδ δζάηαλδ, ιε ηoοξ ακηίζημζπμοξ οπμηζκδηέξ ημο βμκζδίμο gp64 ηυζμ ημο ζμφ BmNPV υζμ ηαζ ημο OpMNPV (Kogan et al., 1995). Σμ ααηιίδζμ A.lef8 reverse πανμοζζάγεζ πναηηζηά ηδκ ίδζα αθθδθμοπία ιε ημ ααηιίδζμ Γlef8, 5 ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο orf40. Οζ δοκδηζηέξ αθθδθμοπίεξ οπμηζκδηή ημο ααηιζδίμο Cclef8 ειθακίγμοκ πανυιμζα δζάηαλδ ιε ακηίζημζπεξ αθθδθμοπίεξ δζαζςζιέκςκ ζχκ. Ζ ανίειδζδ ζηζξ αθθδθμοπίεξ πναβιαημπμζήεδηε ιε ημ A ημο ηςδζηυκζμο έκανλδξ ATG ηςκ orf40/gp64 κα απμηεθεί ημ +1. ηδκ πενίπηςζδ ηςκ Γlef8 ηαζ A.lef8 reverse, δ ιεθέηδ επεηηάεδηε ιέπνζ ηδ εέζδ - 351, επεζδή δε ανέεδηε αθθδθμοπία TATA ιέπνζ ηδ εέζδ -300 ηδξ ανπζηήξ ακαγήηδζδξ. 115

140 Αλίγεζ κα ζδιεζςεεί υηζ δ εέζδ έκανλδξ ηδξ ιεηαβναθήξ ημο μιυθμβμο βμκζδίμο orf51 ημο ζμφ AcMNPV ανίζηεηαζ ζηδ εέζδ -162, δ μπμία ακηζζημζπεί ζηδ δεφηενδ αδεκίκδ (Α) ιίαξ υρζιδξ αθθδθμοπίαξ ATAAG (Chen et al., 2013) (εζη. 3.29/Β θόθθηλν βέινο). Όπςξ ζπμθζάζηδηε ηαζ ζηδκ πανάβναθμ 3.6.1, θυβς ημο ορδθμφ ααειμφ ηαοηυηδηαξ ηςκ δφμ βμκζδίςκ πνμηείκεηαζ υηζ δ εέζδ έκανλδξ ζημκ ζυ BmNPV ανίζηεηαζ ζηδκ ακηίζημζπδ υρζιδ αθθδθμοπία. Όιςξ δ ηαηαζηεοή ημο δζαζςζιέκμο ζμφ-ααηιζδίμο hsp70.lef8, πμο ζηενείηαζ αθθδθμοπζχκ ηδξ υρζιδξ ιεηαβναθήξ ςξ ηαζ ηδ εέζδ -301 απμηεθεί ζαθή έκδεζλδ υηζ ιπμνεί κα οπάνλμοκ ηαζ άθθεξ ιεηαβναθζηά θεζημονβζηέξ επζθμβέξ Η δηάζσζε ηνπ βαθκηδίνπ hsp70.lef8/polh Γlef8 από ηελ θσδηθή πεξηνρή Cclef8 Ζ αδοκαιία δζάζςζδξ ημο εθθεζιιαηζημφ ααηιζδίμο Γlef8 ιε πνήζδ ημο ελεθζηηζηά απμιαηνοζιέκμο πθαζζίμο ακάβκςζδξ ημο βμκζδίμο Cclef8 ιπμνεί κα ενιδκεοεεί ζηα πθαίζζα: α) ηδξ αδοκαιίαξ ηδξ πνςηεΐκδξ CcLEF8 κα θεζημονβήζεζ απμηεθεζιαηζηά ςξ ακηζηαηαζηάηδξ ηδξ εκδμβεκμφξ LEF8 ή/ηαζ α) ηδξ αδοκαιίαξ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ Cclef8 κα πανέπεζ αθθδθμοπίεξ οπμηζκδηή βζα ημ βμκίδζμ orf40. Ζ ιεθέηδ in silico βζα ηδκ ακάδεζλδ δοκδηζηχκ αθθδθμοπζχκ οπμηζκδηή ημο βμκζδίμο orf40 είπε δείλεζ πζεακέξ αθθδθμοπίεξ νφειζζδξ ζηδκ 5 πενζμπή ημο Cclef8 ηαζ ιάθζζηα ζε βεςιεηνία ηαζ ζπεηζηέξ απμζηάζεζξ ακηίζημζπεξ αοηχκ πμο οπάνπμοκ ζημ δζαζςζιέκμ ζυ-ααηιίδζμ A.lef8 (βι. παξάγξαθν 3.4). Ωξ εη ημφημο είπε εκδζαθένμκ κα εθέβλμοιε ακ υκηςξ ημ Cclef8 ιπμνεί κα απμηαηαζηήζεζ ηδκ ακεπάνηεζα ημο orf40. Γζα ημ ζημπυ αοηυ, μ θμνέαξ ptvcclef8 ζοκδζαιμθφκεδηε ιε ημ ααηιίδζμ hsp70.lef8/polh Γlef8 πμο απμδεδεζβιέκα δζαεέηεζ απμηεθεζιαηζηή εκδμβεκή παναβςβή LEF8 απυ ηδκ ηαζέηα hsp70.lef8. Δάκ ημ πθήνεξ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ ημο βμκζδίμο Cclef8 ιπμνμφζε κα απμηαηαζηήζεζ ηδ δοζθεζημονβία ημο orf40 ηυηε εα οπήνπε παναβςβζηή ιυθοκζδ ηςκ ηοηηάνςκ ιε ζοκαηυθμοεδ παναβςβή πμθφεδνςκ ηαζ ηοηηανζηυ εάκαημ, υπςξ ηαζ παναηδνήεδηε. Απμιυκςζδ ημο κέμο ζμφ, hsp70.lef8/polh/cclef8 Γlef8, έδεζλε υηζ ειθακίγεζ ημκ ακαιεκυιεκμ θαζκυηοπμ YFP /polh +, εκχ δ ακηζηαηάζηαζδ ηδξ ηαζέηαξ A.yfp/zeo απυ ηδκ ηςδζηή πενζμπή ημο Cclef8 ζηδκ μπμία μθείθεηαζ μ θαζκυηοπμξ YFP επζαεααζχεδηε ιέζς ηαηάθθδθςκ ακηζδνάζεςκ PCR (εζη. 3.31) ηαζ αθθδθμφπδζδξ ηςκ πενζμπχκ ζφκδεζδξ Cclef8 ηαζ ααηιζδίμο. 116

141 t-cclef AsuII BstBI ~out -1 1 x: TATA : ζέζε έλαξμεο κεηαγξαθήο CATT // TAGT // TATT : ζέζε έλαξμεο όςηκεο κεηαγξαθήο T // G TAAG hsp70.lef8/polh/cclef8 ή t-cclef8 Γlef8 468 bp Δηθόλα 3.30 πεδζάβναιια ηςκ εέζεςκ εκηυπζζδξ πζεακχκ αθθδθμοπζχκ οπμηζκδηή βζα ηδκ αθθδθμοπία πμο ακηζζημζπεί ζηδκ πενζμπή -1 ιε -351 ςξ πνμξ ημ πθαίζζμ ακάβκςζδξ orf40 (1-351 ημο Cclef8/t-Cclef8) ζηα δζαζςζιέκα ααηιίδζα hsp70.lef8/polh/cclef8 ηαζ t-cclef8 Γlef8. (Γηα ην ειιεηκκαηηθό πιαίζην αλάγλωζεο t-cclef8 βιέπεηε θαη ζηελ εηθόλα 2.4). Γζα ηδκ πεναζηένς ιεθέηδ ημο Cclef8 ηαηαζηεοάζηδηε ιζα εθθεζιιαηζηή ιμνθή ημο, μνζγυιεκδ ςξ t-cclef8, απυ ηδκ μπμία απμοζζάγεζ δ πενζμπή απυ ζφκμθμ 3135 κμοηθεμηζδίςκ (εζη Βι. επηπιένλ εηθ. 2.4 θαη παξάγξαθν ζην θεθάιαην Μέζνδνη θαη Υιηθά). Με αοηυ ημκ ηνυπμ δζαηδνήεδηακ ηα κμοηθεμηίδζα ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ, υπμο δ ιεθέηδ in silico ηδξ πνμδβμφιεκδξ παναβνάθμο είπε οπμδείλεζ οπμρήθζεξ αθθδθμοπίεξ οπμηζκδηή βζα ημ orf40 (εζη. 3.29/Β). Σμ ακαζοκδοαζιέκμ t-cclef8 πνδζζιμπμζήεδηε υπςξ ηαζ ημ παηνζηυ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ Cclef8 ζε πεζνάιαηα ζοκδζαιυθοκζδξ ημο θμνέα ptvt-cclef8 ιε ημ ααηιίδζμ hsp70.lef8/polh Γlef8. ε αοηά πανείπε ημκ δζαζςζιέκμ ζυ, 1 2 Γ wt ι2, bp 3488 bp 3142 bp 913 bp Δηθόλα 3.31 Δπζαεααίςζδ ημο ακαζοκδοαζιμφ ζηα ρεοδμ-αβνίμο ηφπμο ααηιίδζα hsp70.lef8/polh/cclef8 Γlef8 ηαζ hsp70.lef8/polh/t-cclef8 Γlef8. PCR ιε ημοξ εηηζκδηέξ TVF/R (βι. ζηηο εηθ.3.2/α θαη 3.19) πανείπε ηα ακαιεκυιεκα πνμσυκηα 3142 bp βζα ημ ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο (wt), 3488 bp βζα ημ Γlef8 (Γ), 913 bp βζα ημ t- Cclef8 (1) ηαζ 3659 bp βζα ημ Cclef8 (2) ρεοδμ-αβνίμο ηφπμο ααηιίδζμ. 117

142 hsp70.lef8/polh/t-cclef8 Γlef8, ιε επίζδξ θαζκυηοπμ εκδεζηηζηυ δζάζςζδξ παναβςβή πμθοέδνςκ ηαζ ζμζςιάηςκ. Ζ ακηζηαηάζηαζδ ηδξ ηαζέηαξ A.yfp/zeo απυ ηδκ ηςδζηή πενζμπή t-cclef8 επζαεααζχεδηε ιέζς ηαηάθθδθςκ ακηζδνάζεςκ PCR (εζη. 3.31). Ζ 5 πενζμπή ημο ελεθζηηζηά απμιαηνοζιέκμο ακμζηημφ πθαίζζμ ακάβκςζδξ Cclef8 ιπμνεί, αάζεζ ηςκ παναπάκς, κα θεζημονβήζεζ ςξ εηενυθμβμξ οπμηζκδηήξ ημο βμκζδίμο orf40 ηαζ κα δζαζχζεζ ημ εθθεζιιαηζηυ ααηιίδζμ hsp70.lef8/polh Γlef8, υπςξ πνμηάεδηε ηαζ απυ ηδκ ακηίζημζπδ ιεθέηδ in silico (πανάβναθμξ 3.7.1). Απυ ημ βεβμκυξ αοηυ θαίκεηαζ πςξ δ αδοκαιία ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ Cclef8 κα δζαζχζεζ ημ ααηιίδζμ Γlef8 μθείθεηαζ πζεακχξ ζηδκ πνςηεΐκδ CcLEF8 ηαζ ηδκ ακηίζημζπδ αδοκαιία ηδξ κα οπμηαηαζηήζεζ θεζημονβζηά ηδ LEF8 ζηα πθαίζζα ηδξ ζζηήξ ιυθοκζδξ Γηάζσζε ηνπ Γlef8 κε ην θνξέα έθθξαζεο LEF8/ORF40, pplef8 tv.myc-lef8 Υνδζζιμπμζήεδηε επίζδξ μ θμνέαξ pplef8 tv.myc-lef8, πμο δζαεέηεζ μθυηθδνδ ηδκ 5 βεζημκζηή πενζμπή lef8 ημο θμνέα ptvγlef8 (πενζμπή ημο ζμφ BmNPV, εζη. 2.2/D) 5 ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ myc-lef8 ηαζ επμιέκςξ εηθνάγεζ ηζξ πνςηεΐκεξ Myc-LEF8 ηαζ ORF40 απυ ημοξ θοζζημφξ οπμηζκδηέξ lef8 ηαζ orf40 ακηίζημζπα. Ζ εκ θυβς δζάηαλδ ακαπανάβεζ ηδ δμιή ημο βεκεηζημφ ηυπμο lef8-orf40 ιε ηζξ ελήξ δζαθμνέξ: α) οπάνπεζ πανειαμθή ηδξ αθθδθμοπίαξ ζήιακζδξ myc ακάιεζα ζηζξ ηςδζηέξ πενζμπέξ ηςκ lef8 ηαζ orf40, δ μπμία έπεζ απμδεζπεεί υηζ δεκ επδνεάγεζ ηδ θεζημονβζηυηδηα ημο ζμφ, ηαζ α) έπεζ ακηζηαηαζηαεεί δ 3 βεζημκζηή πενζμπή lef8 απυ ηδκ αθθδθμοπία πμθοαδεκοθίςζδξ ηδξ αηηίκδξ A3. Ζ πνήζδ ηδξ εηενυθμβδξ αθθδθμοπίαξ πμθοαδεκοθίςζδξ έβζκε ιε ζημπυ ημκ πενζμνζζιυ ηδξ μιμθμβίαξ ημο δζπθμφ θμνέα έηθναζδξ ζηδ ιία ιυκμ πθεονά ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ lef8, βζα εθάηηςζδ ηδξ πζεακυηδηαξ ακαζοκδοαζιμφ ηαηά ηδ δζάζςζδ. Κφηηανα Bm5 δζαιμθφκεδηακ ιε ημ ααηιίδζμ Γlef8 ηαζ ημ θμνέα pplef8 tv.myclef8 ηαζ ζηζξ 2 ηαζ 3 dpt παναηδνήεδηε εηηεηαιέκδ πανμοζία ηοηηάνςκ YFP +, ζοιααηή ιε δζάζςζδ ημο ααηιζδίμο (εζη. 3.32/Α). Μεηαθμνά οπενηεζιέκμο εθεφεενμο απυ ηφηηανα ζε κέα ηαθθζένβεζα πμο δεκ πανάβεζ LEF8 πανείπε επίζδξ ηφηηανα YFP + εκδεζηηζηά ηδξ πανμοζίαξ ζμζςιάηςκ (εζη. 3.32/Β). Παν υθα αοηά ζηζξ 5.5 dpi παναηδνήεδηε εζηυκα ημπζηήξ επέηηαζδξ ηοηηάνςκ YFP + (εζη. 3.32/Β άκς), δ μπμία είκαζ ζοιααηή ιε εκενβυ πμθθαπθαζζαζιυ απυ ημπζηή εζηία θαζκυιεκμ εκδεζηηζηυ ηδξ πανμοζίαξ ζχκ-ααηιζδίςκ ρεοδμ-αβνίμο ηφπμο. Δπζπθέμκ ιζηνμζημπζηή παναηήνδζδ ηαζ έθεβπμξ ιε ακηζδνάζεζξ PCR πανεί- 118

143 Α 2dpt 3dpt Β 5,5dpi 8,5dpi Δηθόλα 3.32 A. Κφηηανα Bm5 δζαιμθοζιέκα ιε ημ ααηιίδζμ Γlef8 ηαζ ημκ θμνέα pplef8 tv.myc-lef8 ζηζξ 2 ηαζ 3 dpt. Δίκαζ ειθακήξ δ πανμοζία YFP + ηοηηάνςκ. Β. Κφηηανα Bm5 ιμθοζιέκα ιε οπενηείιεκμ απυ ηδ δζαιυθοκζδ πμο απεζημκίγεηαζ ζημ (Α). Ζ εζηυκα ηςκ ηαθθζενβεζχκ ζηζξ 5.5 (άκς) ηαζ 8.5 (ηάης) dpi είκαζ εκδεζηηζηή ηδξ πανμοζίαξ ζμζςιάηςκ yfp + ζημ οπενηείιεκμ. 119

144 πακ αζαθή απμηεθέζιαηα. Ωξ πανάδεζβια, πανά ηδ θαζκμιεκζηά ημπζηή επέηηαζδ ηςκ ηοηηάνςκ YFP + ζηζξ 5.5 dpi, ζηζξ 8.5 dpi δ ηαθθζένβεζα δεκ ειθάκζγε ζαθή ιαηνμζημπζηά ζδιεία ιυθοκζδξ (ηοηηανζηή απμηυθθδζδ/εάκαημξ) ηαζ πανείπε δζάζπανηα ζήιαηα YFP ζε οπυααενμ ζδιακηζημφ ανζειμφ ηοηηάνςκ YFP -. οιπεναζιαηζηά, δ εηηεηαιέκδ ακ ηαζ ιμκυπθεονδ μιμθμβία ημο θμνέα pplef8 tv.myc-lef8 πνμξ ημ ζζηυ βμκζδίςια ημκ ηαεζζημφκ αηαηάθθδθμ βζα ηδ δζάζςζδ ημο ααηιζδίμο Γlef Λεηηνπξγηθόηεηα ηκήκαηνο ηνπ ππνθηλεηή ηεο αθηίλεο Α3 ηνπ B. mori Ο οπμηζκδηήξ ηδξ αηηίκδξ (Α), μ μπμίμξ ζηα πθαίζζα ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ απμηεθεί ηδ αάζδ ηςκ πενζζζυηενςκ ζοζηδιάηςκ έηθναζδξ, πενζθαιαάκεζ ηδκ πενζμπή ημο βμκζδίμο ηδξ ηοηηανμπθαζιαηζηήξ αηηίκδξ Α3 ημο ιεηαλμζηχθδηα B. mori. Με δεδμιέκμ υηζ δ πνήζδ ιζηνυηενςκ βεκεηζηχκ ηαηαζηεοχκ πανμοζζάγεζ ιεβαθφηενδ εοεθζλία, έβζκε πνμζπάεεζα κα ηαηαζηεοαζηεί ιία εθάπζζηδ αθθδθμοπία πμο κα ιπμνεί κα ακηζηαηαζηήζεζ ημκ ήδδ πνδζζιμπμζμφιεκμ οπμηζκδηή. Γζα ημ ζημπυ αοηυ επζθέπεδηε δ αθθδθμοπία , δ μπμία θήβεζ ζημ πνχημ ελχκζμ ηδξ αηηίκδξ. Ζ επζθμβή ααζίζηδηε ζηδκ ήδδ ιεθεηδιέκδ αθθδθμοπία (Mange et al., 1997), απυ ηδκ μπμία αθαζνέεδηε ημ πνχημ εζχκζμ ημο βμκζδίμο βζα πεναζηένς εθάηηςζδ ημο ζοκμθζημφ ιεβέεμοξ. Ο ιζηνυηενμο ιήημοξ οπμηζκδηήξ παναηηδνζγυιεκμξ εθελήξ mac3 δμηζιάζηδηε βζα ηδκ ζηακυηδηά ημο κα επάβεζ ηδκ έηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ-ιάνηονα θμοζζθενάζδξ (lusiferase) ιεηά απυ δζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5. Ζ πμζυηδηα ηδξ πνςηεΐκδξ εηηζιήεδηε ιέζς ηδξ παναβυιεκδξ πδιεζμθςηαφβεζαξ. Σα απμηεθέζιαηα (εζη. 3.33) απμδεζηκφμοκ ηδ θεζημονβζηυηδηα ημο κέμο οπμηζκδηή, δ μπμία υιςξ ανίζηεηαζ πενίπμο ζημ 1/7 ημο επζπέδμο εκενβυηδηαξ ημο πθήνμοξ οπμηζκδηή (~13,65%), ηαεχξ ηαζ ημο οπμηζκδηή πμθομοαζηζηίκδξ (Ub) ημο Tribolium castaneum (Lorenzen et al., 2002), ηαζ ζημ 1/4 ηδξ εκενβυηδηαξ ημο οπμηζκδηή hsp70 (~23,79%). Απυ ηα ίδζα πεζνάιαηα πνμέηορε πςξ μ οπμηζκδηήξ hsp70 πανμοζζάγεζ ζοζηαηζηυ επίπεδμ έηθναζδξ ίζμ πενίπμο ιε ημ 57% ηδξ εκενβυηδηαξ ημο οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ (Α). Ζ ιεθέηδ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ οπμηζκδηχκ mac3 (εζη. 3.33/Α) ηαζ hsp70 (εζη. 3.33/Β) πανμοζία ημο ζζημφ εκζζποηή hr3 έδεζλε ζοζηαηζηά επαβυιεκδ εκενβυηδηα ίζδ ιε ημ 70% ηαζ 10πθάζζα ακηίζημζπα, ζε ζπέζδ ιε ημκ πθήνδ οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ ( ). Σα επίπεδα αοηά 120

145 μονάδεσ φωταφγειασ ακηζζημζπμφκ ζε 6απθάζζα ηαζ 20απθάζζα αφλδζδ ακηίζημζπα ζε ζπέζδ ιε ημοξ οπμηζκδηέξ πςνίξ ημκ εκζζποηή. οβηνζηζηά, μ οπμηζκδηήξ ηδξ αηηίκδξ ειθακίγεζ 100πθάζζα εκενβυηδηα πανμοζία ημο hr3 (Douris et al., 2006). Ο οπμηζκδηήξ mac3 πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή εκυξ κέμο θμνέα έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8, πμο ιε αάζδ ηα παναπάκς πεζνάιαηα θςηαφβεζαξ, A μονάδεσ φωταφγειασ B A.luc hsp70.luc hr3-hsp70.luc Δηθόλα 3.33 A. Μεηνήζεζξ πδιεζμθςηαφβεζαξ ιεηά απυ δζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ηάεε έκα απυ ηα επζιένμοξ ζοζηήιαηα έηθναζδξ ηδξ θμοζζθενάζδξ. B. Σα απμηεθέζιαηα βζα ημ hr3-hsp70.luc πανμοζζάγμκηαζ ζε λεπςνζζηυ δζάβναιια, χζηε κα ειθακίγμκηαζ ιε ζαθήκεζα μζ ζπεηζηέξ δζαθμνέξ ηςκ επζιένμοξ ζοζηδιάηςκ έηθναζδξ. Οζ βναιιέξ ζθάθιαημξ ακηζπνμζςπεφμοκ ηοπζηή απυηθζζδ (N=2 βζα ηα bs.luc/ub.luc/hr3-hsp70.luc, Ν=4 βζα ηα hsp70.luc/hr3-mac3.luc, N=5 βζα ημ Bm5-ιδ δζαιμθοζιέκα, Ν=6 βζα ημ A.luc, N=8 βζα ημ mac3.luc. Ο θμνέαξ pbs.luc πενζέπεζ ηαζέηα έηθναζδξ ηδξ θμοζζθενάζδξ πςνίξ οπμηζκδηή ηαζ ιαγί ιε ηα ιδ δζαιμθοζιέκα ηφηηανα Bm5 ζοκζζημφκ ηα ανκδηζηά δείβιαηα εθέβπμο). 121

146 ακαιέκεηαζ κα ηαθφρεζ επίπεδα έηθναζδξ παιδθυηενα απυ αοηά ημο οπμηζκδηή hsp70. Αοηή δ δοκαηυηδηα εκδεπμιέκςξ κα έπεζ εθανιμβέξ ζηδ αεθηζζημπμίδζδ ηςκ ζοζηδιάηςκ δζάζςζδξ ημο ααηιζδίμο Γlef RNAi (RNA interference) γηα ηελ απνζηώπεζε ηνπ γνληδίνπ lef8 Ζ απμζζχπδζδ ιέζς RNAi εθανιυζηδηε ςξ εκαθθαηηζηυξ ηνυπμξ αθαίνεζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8, πμο ααζίγεηαζ ζηδκ ηαηαζηνμθή ηςκ ιεηαβνάθςκ ημο βμκζδίμο lef8 ηαζ υπζ ζηδ δμιζηή απμιάηνοκζδ ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ lef8. ηα πθαίζζα ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ημκ έθεβπμ ημο εθθεζιιαηζημφ θαζκυηοπμο πμο πνμηφπηεζ υηακ ημ βμκίδζμ lef8 δζαηδνείηαζ ιεκ αηέναζμ, αθθά απμοζζάγεζ δ πνςηεΐκδ LEF8. H παναβςβή dsrna, ιε 1 ιg DNA ςξ οπυζηνςια βζα ηδκ παναβςβή RNA 500 ng απυ ηάεε επζιένμοξ εοεφβναιιμ θμνέα μδήβδζε ζε αδοκαιία πθήνμοξ απμιάηνοκζδξ ημο οπμζηνχιαημξ DNA ιεηά ηδ θήλδ ηδξ ακηίδναζδξ, πςνίξ ζδζαίηενδ αφλδζδ ζημ παναβυιεκμ dsrna, υπςξ πνμηφπηεζ απυ ηδκ εζηυκα Ωξ εη ημφημο πνμηζιήεδηε δ πεναζηένς πνδζζιμπμίδζδ ημο dsrna πμο πανάπεδηε ιε ηδ ιζηνυηενδ πμζυηδηα οπμζηνχιαημξ DNA. Ζ επίδναζδ ημο dsrna ζηδκ πμνεία ηδξ ζζηήξ ιυθοκζδξ ζηαειίζηδηε ανπζηά 1 ι2,3 2 ι2,3 1 ι2,3 544 bp Δηθόλα 3.34 Απεζημκίγμκηαζ ηα δίηθςκα ιυνζα lef8 RNA, υπςξ πανήπεδζακ ιε 500 ng (1) ηαζ 1 ιg (2) ζοκμθζημφ οπμζηνχιαημξ DNA ακηίζημζπα (ανζζηενά/2 ιl απυ ζοκμθζηυ υβημ ακηίδναζδξ 50 ιl). διεζχκμκηαζ ηα οπμθείιαηα DNA (ηυηηζκμ αέθμξ), ηαεχξ ηαζ ηα δίηθςκα ιυνζα (ιαφνα αέθδ). Ζ δζπθάζζα πμζυηδηα οπμζηνχιαημξ θαίκεηαζ υηζ μδήβδζε ζηδκ παναβςβή ιίαξ μνζαηά αολδιέκδξ πμζυηδηαξ δίηθςκμο RNA. Γελζά απεζημκίγεηαζ ημ δίηθςκμ RNA (1) ιεηά ημκ ηαεανζζιυ ιε θαζκυθδ/πθςνμθυνιζμ (2 ιl απυ ζοκμθζηυ υβημ 40 ιl). Δίκαζ ειθακήξ ιία πενζμπή απμζημδμιδιέκμο RNA, πμο ηαηά ηα θαζκυιεκα μθείθεηαζ ζηδ δζαδζηαζία ηαεανζζιμφ. ι2,3: δείθηεο κνξηαθνύ βάξνπο DNA (βι. ζην παξάξηεκα) 122

147 Α ρσξίο dsrna lef8 dsrna male dsrna πλδηακόιπλζε Μόιπλζε κεηά Μόιπλζε πξηλ B χωρίς άνευ dsrna αντι-lef8 lef8 dsrna dsrna male + αντι-male dsrna dsrna Δηθόλα 3.35 Α. Παναηίεεκηαζ θςημβναθίεξ μπηζηχκ πεδίςκ παναηηδνζζηζηχκ ηδξ ζοκμθζηήξ εζηυκαξ ηςκ ηαθθζενβεζχκ ιε ηαζ πςνίξ ηδκ επίδναζδ ημο εζδζημφ (lef8) ηαζ ιδ εζδζημφ (male) δίηθςκμο ιμνίμο RNA, ηαηά ηδκ ηνίηδ διένα ιεηά ηδ ιυθοκζδ/δζαιυθοκζδ. Μεθεηήεδηακ ηνεζξ ηνυπμζ πμνήβδζδξ ημο RNA: ιαγί ιε ημ ζζηυ DNA ζε ζοκδζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5, ιεηά ηδ ιυθοκζδ (δζαιυθοκζδ ημο dsrna ζηδκ 1 dpi) ηαζ πνζκ ηδ ιυθοκζδ (ιυθοκζδ αιέζςξ ιεηά ημ πέναξ ηδξ δζαιυθοκζδξ ιε dsrna). Β. Ακάθοζδ ιε PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ηςκ ακηίζημζπςκ εκδμηοηηανζηχκ επζπέδςκ ημο ζμφ BmNPV/A.gfp. ηδκ πενίπηςζδ ηδξ ζοκδζαιυθοκζδξ οπήνλε ηαεοζηένδζδ ζηδκ αφλδζδ ημο ζζημφ DNA. Σα απμηεθέζιαηα εηθνάγμοκ ζπεηζηά εηηζιχιεκα επίπεδα ζζημφ DNA (N=1) ηαζ είκαζ απθχξ εκδεζηηζηά. 123

148 ςχετικόσ αριθμόσ ιικών αντιγράφων 1,4 ςχετικόσ αριθμόσ μεταγράφων LEF8 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, lef8 αντι-lef8 dsrna dsrna male αντι-male dsrna dsrna hpt 12 ςχετικόσ αριθμόσ μεταγράφων VP lef8 αντι-lef8 dsrna dsrna male αντι-male dsrna dsrna hpt lef8 αντι-lef8 dsrna dsrna male αντι-male dsrna dsrna hpt Δηθόλα 3.36 Ακάθοζδ ιε πμζμηζηή PCR ηςκ επζπέδςκ ηςκ ιεηαβνάθςκ lef8 (επάκς) ηαζ vp39 (ιέζδ) ζημ ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο, ηαεχξ ηαζ ηςκ ακηίζημζπςκ επζπέδςκ ζζημφ DNA (ηάης) πανμοζία ημο εζδζημφ (lef8) ηαζ ιδ εζδζημφ (male) δίηθςκμο ιμνίμο RNA, ιέπνζ ηζξ 71 hpt. Σμ εζδζηυ dsrna θαίκεηαζ κα μδδβεί ζε πανειπυδζζδ ηδξ παναβςβήξ ηςκ δφμ ιεηαβνάθςκ ηαζ ηδξ ζζηήξ ακαπαναβςβήξ ζημ πανυκ πνμκζηυ πθαίζζμ. Οζ βναιιέξ ζθάθιαημξ ακηζπνμζςπεφμοκ ηοπζηή απυηθζζδ (N=2). 124

149 ιε ημκ ακαζοκδοαζιέκμ ζυ BmNPV/Α.gfp ζε ηνεζξ δζαηνζηέξ πενζπηχζεζξ: ιε δζαιυθοκζδ ημο dsrna αηνζαχξ πνζκ (α) ηαζ ιία διένα ιεηά (α) ηδ ιυθοκζδ ιε ημκ ζυ, ηαεχξ ηαζ ιε ζοκδζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ζζηυ DNA ηαζ dsrna (β). Ζ ιζηνμζημπζηή παναηήνδζδ ηαηά ηδκ 3 δ διένα ιεηά ηδ ιυθοκζδ/δζαιυθοκζδ πανείπε εκδείλεζξ βζα θζβυηενα ηφηηανα YFP + πανμοζία ημο lef8 dsrna, ηονίςξ ζηδκ πενίπηςζδ (β), ιε ηδκ (α) κα ειθακίγεζ επίζδξ ιία ζπεηζηή ιείςζδ ηαζ ηδ (α) κα θαίκεηαζ ακεπδνέαζηδ (εζη. 3.35/Α). Ζ ζφβηνζζδ πναβιαημπμζήεδηε ιεηαλφ ηαθθζενβεζχκ πμο είπακ δζαιμθοκεεί ιε lef8 dsrna ηαζ ηςκ ακηίζημζπςκ ηαθθζενβεζχκ εθέβπμο (πςνίξ dsrna ή ιε δζαιυθοκζδ ιε male dsrna) (εζη. 3.35/Α). Ακηίζημζπδ ακάθοζδ ιέζς ακηζδνάζεςκ qpcr πανείπε εκδείλεζξ βζα ιζηνυηενδ πμζυηδηα ζζημφ DNA απμηθεζζηζηά ζηδκ πενίπηςζδ ηδξ ζοκδζαιυθοκζδξ (εζη. 3.35/Β). διεζχκεηαζ υηζ δ ιζηνμζημπζηή εζηυκα ζοκδβμνεί οπέν ιίαξ ηαεοζηένδζδξ ηδξ ζζηήξ ιυθοκζδξ ηαζ υπζ ιυκζιδξ ακαζημθήξ, δεδμιέκμο υηζ ιε ηδκ πάνμδμ ημο πνυκμο υθεξ μζ επζιένμοξ ηαθθζένβεζεξ πανμοζίαζακ ηεθζηά ηδκ ίδζα ειθάκζζδ βεκζηεοιέκδξ ιυθοκζδξ. Σα πνμηαηανηηζηά εονήιαηα ιε ημκ ζυ BmNPV/A.gfp επζαεααζχεδηακ ηαζ ζοιπθδνχεδηακ πεναζηένς ιε ηδ ζοκδζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ημ ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο ηαζ dsrna. Όπςξ πνμέηορε, ηαηά ηδκ ηνίηδ διένα ιεηά ηδ δζαιυθοκζδ οπήνλε πθήνδξ πανειπυδζζδ ηυζμ ηδξ παναβςβήξ ιεηαβνάθςκ lef8, υζμ ηαζ ιεηαβνάθςκ ημο υρζιμο βμκζδίμο vp39 (εζη. 3.36/άκς-ιέζδ), βεβμκυξ πμο ζοκδβμνεί οπέν ηδξ ακαιεκυιεκδξ απμοζίαξ υρζιδξ ιεηαβναθήξ, πμο μθείθεηαζ ζηδκ ακηίζημζπδ απμοζία θεζημονβζηήξ ζζηήξ RNA πμθοιενάζδξ. Ακηίζημζπα παναηδνήεδηε ζδιακηζηά ιεζςιέκδ πμζυηδηα ζζημφ βεκεηζημφ οθζημφ πανμοζία ημο lef8 dsrna (εζη. 3.36/ηάης). Ζ εκ θυβς εζηυκα είκαζ ζοιααηή ιε ηδκ πανειπυδζζδ ηδξ δεοηενμβεκμφξ ιυθοκζδξ, δ μπμία, ιαγί ιε ηδκ απμοζία υρζιδξ ιεηαβναθήξ, είκαζ βκςζηά επαηυθμοεα ηδξ απμοζίαξ LEF8. 125

150

151 4. πδήηεζε

152

153 4. πκπεξάζκαηα-πδήηεζε 4.1 Σςνειζθοπά ζηο επιζηημονικό πεδίο Οζ ααηηνμσμί απμηεθμφκ παεμβυκμοξ πανάβμκηεξ-ιμκηέθα βζα ηδ ιεθέηδ ημο ζζημφ ηφηθμο γςήξ ηαζ ηςκ αθθδθεπζδνάζεχκ ημοξ ιε ηα ανενυπμδα-λεκζζηέξ ηαζ ζοκζζημφκ επζπθέμκ ζδιακηζηά αζμηεπκμθμβζηά ενβαθεία. Δπμιέκςξ, δ ηαθφηενδ ηαηακυδζδ ηδξ θεζημονβίαξ ηαζ δ αεθηίςζδ ηςκ πνμμπηζηχκ αλζμπμίδζήξ ημοξ είκαζ ζδιακηζηή βζα ηδ πνδζζιμπμίδζή ημοξ ζε δζάθμνα πεδία ααζζηήξ ηαζ ιεηαθναζηζηήξ/ εθανιμζιέκδξ αζμθμβζηήξ ένεοκαξ. ηα πθαίζζα ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ δζενεοκήεδηε δ δοκαηυηδηα ηαηαζηεοήξ εκυξ ααηηνμσζημφ θμνέα ιεηαβςβήξ βεκεηζημφ οθζημφ, πμο δε εα είκαζ παεμβυκμξ βζα ηα ηφηηανα-λεκζζηέξ πμο πνμζαάθθεζ, εκχ πανάθθδθα εα δζαεέηεζ πθήνδ δοκαηυηδηα ιυθοκζδξ ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ ακηζβναθήξ ημο ζζημφ DNA. Ζ ιεθέηδ αοηή έδεζλε υηζ δ παναβςβή εκυξ ηέημζμο ζμφ/ααηιζδίμο είκαζ εθζηηή ιε ηδκ ελάθεζρδ (knock-out) ημο ζδιακηζημφ ζζημφ βμκζδίμο lef8. Ζ απμοζία εκδμβεκμφξ παναβςβήξ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 ιπμνεί κα οπμηαηαζηαεεί ιε ελςβεκή πμνήβδζδ ηδξ θοζζηήξ ή αιζκμηεθζηά ζδιαζιέκδξ ιε επίημπμ Myc ακαζοκδοαζιέκδξ πνςηεΐκδξ LEF8. Ζ οπμηαηάζηαζδ μδδβεί ζε μθμηθήνςζδ ημο ηφηθμο γςήξ ημο ζμφ ηαζ ηδ δδιζμονβία εθθεζιιαηζηχκ ζμζςιάηςκ, πςνίξ παναβςβή ακεπζεφιδηςκ ιμνθχκ ρεοδμ-αβνίμο ηφπμο, υπςξ ζοκέαδ ζε παθαζυηενεξ πνμζπάεεζεξ. Ο εθθεζιιαηζηυξ ζυξ εα ιπμνμφζε κα απμηεθέζεζ ιία ηαθφηενδ πνυηαζδ ςξ ζφζηδια έηθναζδξ ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ, εθυζμκ ςξ ιδ παεμβυκμξ εα επζηνέπεζ ηδκ επζαίςζδ ηςκ ηοηηάνςκ-λεκζζηχκ ηαζ ηδ θεζημονβία ηδξ πνςηεσκμζοκεεηζηήξ ιδπακήξ ημοξ, εκχ ςξ εθθεζιιαηζηυξ βζα ηδκ πνςηεΐκδ LEF8 δε εα πανάβεζ ηζξ υρζιεξ πνςηεΐκεξ ημο ζμφ ηαζ εα δζαηδνεί ακέπαθδ ηδκ ακηζβναθή ημο ζζημφ DNA. Με αοηυκ ημκ ηνυπμ ημ ζζηυ DNA εα πμθθαπθαζζάγεηαζ πανέπμκηαξ επανηείξ πμζυηδηεξ ζζηχκ βμκζδζςιάηςκ ςξ οπμζηνχιαηα βζα έηθναζδ ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ. οβηνζηζηά, ηα ήδδ οπάνπμκηα ααηηνμσζηά ζοζηήιαηα έηθναζδξ, πμο ααζίγμκηαζ ζε θοηζηέξ ιμνθέξ ηςκ ζχκ ηαζ πμθφ υρζιμοξ οπμηζκδηέξ βζα ηδκ έηθναζδ ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ, πανειπμδίγμοκ ζδιακηζηά ημοξ ηοηηανζημφξ ιδπακζζιμφξ πνςηεσκμζφκεεζδξ ηαζ ειθακίγμοκ ιεζςιέκδ απυδμζδ βζα δζάθμνεξ ηαηδβμνίεξ πμθοπεπηζδίςκ. Πνμηαηανηηζηά απμηεθέζιαηα έδεζλακ υηζ μ 126

154 εθθεζιιαηζηυξ ζυξ πανάβεζ ηδκ πνςηεΐκδ-ιάνηονα YFP ιε ημκ οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ Α3 ημο ιεηαλμζηχθδηα ηαζ ιε εηενυθμβδ αθθδθμοπία πμθοαδεκοθίςζδξ. Ζ δζενεφκδζδ ηςκ ζοκεπεζχκ πμο έπεζ δ μθζηή αθαίνεζδ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο lef8 ζηδ θεζημονβία ημο ζμφ, έδεζλε υηζ αοηή επδνεάγεζ έκα ζδιακηζηυ βεζημκζηυ βμκίδζμ, ημ orf40, ημ μπμίμ ιεηαβνάθεηαζ πνμξ ηδκ ακηίεεηδ ηαηεφεοκζδ ηαζ δ ηςδζηή ημο πενζμπή ανίζηεηαζ πμθφ ημκηά ζε αοηήκ ημο lef8 (απυζηαζδ 26 nt). ηα πθαίζζα ηδξ δζαηνζαήξ πνμζδζμνίζηδηε ηαζ έκα ζφκμθμ εηενυθμβςκ αθθδθμοπζχκ, πμο, ακ ηαζ δζαθένμοκ απυ ηδ θοζζηή 5 ιδ ιεηαθναγυιεκδ πενζμπή ηςκ βμκζδίςκ orf40 ηαζ lef8, ιπμνμφκ κα οπμηαεζζημφκ ηζξ ιεηαβναθζηέξ θεζημονβίεξ ηςκ ακηίζημζπςκ θοζζηχκ πενζμπχκ. Σμ βεβμκυξ αοηυ επέηνερε ηδκ ηαηαζηεοή πθήνςξ θεζημονβζηχκ ζχκ ιε ηα δφμ βμκίδζα δζαπςνζζιέκα ζημ ζζηυ βμκζδίςια. Δπζπθέμκ επέηνερε ηδκ ηαηαζηεοή εθθεζιιαηζηχκ ζχκ ςξ πνμξ ημ lef8, πμο ιπμνμφκ κα δζαζςεμφκ ηαζ κα πανάβμοκ ζμζχιαηα ιε ελςζζηή πμνήβδζδ LEF8, ORF40 ή ηαζ ηςκ δφμ ιαγί, ακάθμβα ιε ημ ζπεδζαζιυ ημο πεζνάιαημξ. Σα απμηεθέζιαηα αοηά, εηηυξ απυ ημ βεβμκυξ υηζ είκαζ ζδιακηζηά βζα ημκ ζπεδζαζιυ βεκεηζηά ηνμπμπμζδιέκςκ ζχκ, ζοκεζζθένμοκ κέα βκχζδ ζπεηζηά ιε ηδ βμκζδζαηή νφειζζδ ζημοξ ααηηνμσμφξ ηαζ κέεξ ζηναηδβζηέξ πνδζζιμπμίδζήξ ημοξ ζε αζμηεπκμθμβζηέξ εθανιμβέξ. 4.2 Σύνοτη Σςμπεπάζμαηα Ζ ηαηαζηεοή εκυξ ζμφ BmNPV ζε ιμνθή ααηιζδίμο, μ μπμίμξ ιπμνεί κα ιμθφκεζ απμηεθεζιαηζηά ηφηηανα-λεκζζηέξ ηαζ κα πμθθαπθαζζάγεζ ημ βεκεηζηυ ημο οθζηυ ζε αοηά πςνίξ υιςξ κα πνμηαθεί παεμβυκμ θαζκυηοπμ, ααζίζηδηε ζηδκ αθαίνεζδ ημο ζδιακηζημφ βμκζδίμο lef8. Ήηακ ήδδ βκςζηυ ζηδ αζαθζμβναθία υηζ δ απμοζία ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 είηε ιέζς εενιμεοαίζεδηδξ ιεηάθθαλδξ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο lef8 (Shikata et al., 1998) είηε ιέζς απμζζχπδζδξ RNAi (Schultz & Friesen, 2009), ειθακίγεζ ημκ παναπάκς θαζκυηοπμ ηαζ επζπθέμκ θαίκεηαζ κα επζηνέπεζ ζε ζδιακηζηυ ααειυ ηδ θεζημονβία ηδξ πνςηεσκμζοκεεηζηήξ ιδπακήξ ηςκ ηοηηάνςκ λεκζζηχκ (Shikata et al., 1998). οβηνζηζηά, έκα ααηιίδζμ εθθεζιιαηζηυ βζα ημ βμκίδζμ ie1 (Efrose et al., 2010), επζηνέπεζ ηδκ ηοηηανζηή πνςηεσκμζφκεεζδ ηαζ δεκ είκαζ παεμβυκμ, αθθά επίζδξ δεκ ακηζβνάθεζ ημ βεκεηζηυ ημο οθζηυ ιε απμηέθεζια κα οπάνπεζ έκαξ πμθφ πενζμνζζιέκμξ ανζειυξ ζζηχκ βμκζδζςιάηςκ βζα ηδκ έηθναζδ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ. 127

155 Έκαξ ζυξ BmNPV απυ ημκ μπμίμ απμοζζάγεζ ημ βμκίδζμ lef8 εα ιπμνμφζε επμιέκςξ κα απμηεθέζεζ ιία ηαθφηενδ πνυηαζδ βζα ηδκ ακάπηολδ εκυξ ζοζηήιαημξ έηθναζδξ πνςηεσκχκ, δεδμιέκμο υηζ εα επέηνεπε: α) ιεβαθφηενμοξ πνυκμοξ παναβςβήξ ηαζ ζδιακηζημφξ ανζειμφξ ζζηχκ βμκζδζςιάηςκ βζα επανηή έηθναζδ πνςηεσκχκ, εθυζμκ ηα ηφηηανα εα επζαζχκμοκ πενζζζυηενμ, εκχ ημ ζζηυ βμκζδίςια εα ακηζβνάθεηαζ ζημ εζςηενζηυ ημοξ, α) ιεηα-ιεηαθναζηζηέξ ηνμπμπμζήζεζξ ιε ορδθή απυδμζδ ηαζ β) έηηνζζδ ηςκ πνςηεσκζηχκ πνμσυκηςκ, πμο ιε ηα οπάνπμκηα ζοζηήιαηα είκαζ ζοπκά παιδθμφ επζπέδμο (van Oers et al., 2015). Δπζπθέμκ δ απμοζία υρζιδξ ζζηήξ ιεηαβναθήξ εα ζοκεπάβεηαζ ηαζ ηδκ απμοζία ηςκ υρζιςκ πνςηεμθοηζηχκ εκγφιςκ ημο ζμφ, πμο ειπθέημκηαζ ζηδκ εθθζπή επελενβαζία ηαζ ζηδκ απμζημδυιδζδ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ. διεζχκεηαζ επίζδξ υηζ δ ιεηάθθαλδ ημο lef8 είκαζ δ ιυκδ ηνμπμπμίδζδ ζζημφ βμκζδίμο πμο έπεζ ακαθενεεί ιέπνζ ζηζβιήξ κα δζαηδνεί ηαζ ημκ ζζηυ πμθθαπθαζζαζιυ ηαζ ηδκ ηοηηανζηή πνςηεσκμζφκεεζδ. Ζ παναβςβή ηςκ θεβυιεκςκ ακαπαναβςβζηχκ υρζιςκ παναβυκηςκ έηθναζδξ (replicative lefs/βι. παξάγξαθν 1.5.2), πμο βίκεηαζ ηαηά ηδκ πνχζιδ θάζδ ηδξ ζζηήξ ιυθοκζδξ, ηαζ δ ακαπαναβςβή ημο ζζημφ βμκζδζχιαημξ ειπθέημκηαζ ζηδκ «πενζεςνζμπμίδζδ» ηδξ ηοηηανζηήξ πνςιαηίκδξ (chromatin segregation) ηαζ ζηδ ζηαδζαηή πανειπυδζζδ ηαζ ηεθζηά δζαημπή ηδξ πνςηεσκμζφκεεζδξ ημο λεκζζηή (Schultz & Friesen, 2009). Έπμοκ παναηδνδεεί δζαθμνμπμζήζεζξ ζημ θαζκυηοπμ ιεθεηδιέκςκ ιεηαθθάλεςκ, ηονίςξ ςξ πνμξ ημκ πνυκμ ιείςζδξ ηαζ δζαημπήξ ηδξ ηοηηανζηήξ πνςηεσκμζφκεεζδξ, αθθά ιέπνζ ζηζβιήξ δ ιυκδ ιεηάθθαλδ βζα ηδκ μπμία ακαθένεηαζ δ δζαηήνδζδ ηδξ παναβςβήξ πνςηεσκχκ είκαζ δ αθαίνεζδ ηδξ θεζημονβίαξ ηδξ LEF8 (Shikata et al., 1998). Με αάζδ αοηά ηα δεδμιέκα έβζκε πνμζπάεεζα κα ηαηαζηεοαζηεί έκα ααηιίδζμ BmNPV εθθεζιιαηζηυ βζα ημ βμκίδζμ lef8. Ζ επζθμβή κα ιδ πνδζζιμπμζδεεί δ εενιμεοαίζεδηδ ιεηάθθαλδ lef8 ts έβζκε πνμηεζιέκμο μ εθθεζιιαηζηυξ ζυξ κα ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί απμδμηζηά ζηδ αέθηζζηδ εενιμηναζία βζα ηδκ ακάπηολδ ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ ηδκ παναβςβή ηςκ επζεοιδηχκ ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ. Δπζπθέμκ, ιε ηδ εενιμεοαίζεδηδ ιεηάθθαλδ μπμζαδήπμηε επζζηνμθή ζε παιδθυηενδ εενιμηναζία, ζε ζπέζδ ιε ηδ ιδ-παναβςβζηή (non-permissive) εενιμηναζία, εα μδδβμφζε ζηδκ επακαθμνά ηδξ ιμθοζιαηζηυηδηαξ ημο ζμφ, πμο ιε αοηυκ ημκ ηνυπμ εα έπακε ημ πθεμκέηηδια ηδξ έθθεζρδξ παεμβέκεζαξ. Ζ αθαίνεζδ ημο βμκζδίμο lef8 έβζκε ιε ηέημζμ ηνυπμ χζηε κα ιδκ οπάνπεζ δοκαηυηδηα δδιζμονβίαξ ζχκ ρεοδμ-αβνίμο ηφπμο ιε μιυθμβμ ακαζοκδοαζιυ, υπςξ 128

156 ζοκέαδ ζε παθαζυηενεξ πνμζπάεεζεξ αδνακμπμίδζδξ ημο lef8, ιέζς εζζαβςβήξ ζημ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ ή/ηαζ ιενζηήξ ακηζηαηάζηαζήξ ημο απυ εηενυθμβεξ αθθδθμοπίεξ (Farrell, 1998). ε υθεξ ηζξ παναπάκς πενζπηχζεζξ ημ πνυαθδια είπε εκημπζζηεί ζηδ δζαηήνδζδ μιυθμβςκ αθθδθμοπζχκ ηιδιάηςκ ημο ακμζηημφ πθαζζίμο ακάβκςζδξ ημο lef8 ζημ ζζηυ βμκζδίςια, πμο ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ πθήνδ ηςδζηή πενζμπή lef8 ζηα ζοζηήιαηα δζάζςζδξ μδδβμφζε ζηδκ επακαθμνά εκυξ θεζημονβζημφ βμκζδίμο lef8 ζηδ θοζζηή ημο εέζδ ιέζα ζημ ζζηυ βμκζδίςια ηαζ ζηδκ απχθεζα ημο εθθεζιιαηζημφ παναηηήνα. Οθυηθδνμ ημ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ ημο lef8 αθαζνέεδηε βζα κα απμθεοπεεί ημ παναπάκς εκδεπυιεκμ ηαζ επζπθέμκ πνδζζιμπμζήεδηακ θμνείξ δζάζςζδξ, πμο επζηνέπμοκ ηδκ έηθναζδ ημο βμκζδίμο lef8 ιε ζοκδοαζιμφξ εηενυθμβςκ οπμηζκδηχκ ηαζ αθθδθμοπζχκ πμθοαδεκοθίςζδξ. Ζ ηαηηζηή αοηή ζοκζζηά ιία ανηεηά κέα πνμζέββζζδ ζε ζπέζδ ιε ηδ πνδζζιμπμίδζδ ημο θοζζημφ βμκζδίμο, δ μπμία ζοκήεςξ εθανιυγεηαζ βζα δζάζςζδ ζηζξ πενζζζυηενεξ ιεθέηεξ εθθεζιιαηζηχκ ααηηνμσχκ (ελδεηθηηθά (Lung et al., 2003)). Δίκαζ επζπθέμκ ίζςξ δ ιυκδ πμο ελαζθαθίγεζ υηζ ηα απμηεθέζιαηα δεκ μθείθμκηαζ ζε επζιυθοκζδ ιε ζμφξ ρεοδμ-αβνίμο ηφπμο πμο πανάβμκηαζ ζοβηονζαηά ηαηά ηδ δζάζςζδ. ηα πθαίζζα ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ, επζπεζνήεδηε επίζδξ ηαζ δ απμζζχπδζδ ημο βμκζδίμο lef8 ιέζς RNAi, ιε ζημπυ ηδ ζφβηνζζδ ημο θαζκυηοπμο απμζζχπδζδξ ζε ζπέζδ ιε αοηυκ ηδξ αθαίνεζδξ ημο βμκζδίμο. Ζ απμζζχπδζδ ήηακ επζηοπήξ ηυζμ ςξ πνμξ ηδκ πανειπυδζζδ ηδξ υρζιδξ ιεηαβναθήξ, υζμ ηαζ ηδξ δεοηενμβεκμφξ ιυθοκζδξ. Σα απμηεθέζιαηα ήηακ ακηίζημζπα ιε εηείκα ηδξ αθαίνεζδξ ημο βμκζδίμο lef8, πμο δζαιυνθςζε ημ ααηιίδζμ Γlef8 ηαζ επζπθέμκ ηδξ απμζζχπδζδξ ιέζς RNAi ημο μιυθμβμο βμκζδίμο lef8 ημο ζμφ AcMNPV (Schultz & Friesen, 2009). Όιςξ, μ πανμδζηυξ παναηηήναξ ηδξ απμζζχπδζδξ ανέεδηε υηζ ηαεζζηά ηδ ιέεμδμ επίζδξ αηαηάθθδθδ βζα ηδ δζαιυνθςζδ εκυξ εθθεζιιαηζημφ ζοζηήιαημξ, πμο εα ακηζηαεζζημφζε ημ εενιμεοαίζεδημ ζηέθεπμξ ηαζ δε εα πνεζαγυηακ ηδκ απμιάηνοκζδ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ lef8. Ο ζοζηδιαηζηυξ δμιζηυξ έθεβπμξ βζα ηδκ επζαεααίςζδ ηδξ ακηζηαηάζηαζδξ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ lef8 ζημ ααηιίδζμ Γlef8 έδεζλε υηζ αοηή ήηακ επζηοπήξ. Ζ δζάζςζδ ημο Γlef8, υηακ δ ηςδζηή πενζμπή myc-lef8 ακηζηαηέζηδζε ηδκ ηαζέηα A.yfp/zeo ηαηά ηδ θοζζηή ηαζ υπζ ηαηά ηδκ ακηίζηνμθδ θμνά, απέδεζλε υηζ δεκ οπήνλακ άθθεξ ηνμπμπμζήζεζξ ζημ βμκζδίςια ημο ααηιζδίμο ιε ειθακή επίπηςζδ ζηδ θεζημονβία ημο. Δπζπθέμκ δ επζηοπία ηδξ ζδιαζιέκδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ myc-lef8 έδεζλε υηζ δ ζήιακζδ myc δε δζαηανάζζεζ ηδ θεζημονβία ημο βμκζδίμο ηαζ ηδξ παναβυιεκδξ 129

157 πνςηεΐκδξ, βεβμκυξ ζδιακηζηυ βζα ηδ δοκαηυηδηα ακίπκεοζδξ ηαζ παναημθμφεδζδξ ηδξ LEF8 ιε ακηίζςια ακηζ-myc. Ζ αδοκαιία εκημπζζιμφ ηδξ πνςηεΐκδξ ζε ιυθοκζδ ηοηηάνςκ Bm5 ιε ημκ δζαζςζιέκμ ζυ myc-lef8 είκαζ απυννμζα ηδξ ηαηά ηα θαζκυιεκα παιδθήξ εηπνμζχπδζήξ ηδξ, εθυζμκ ημ ζζπονυ ζφζηδια έηθναζδξ ΔΗΑ έδςζε έκα ζπεηζηά αζεεκέξ αθθά εοηνζκέξ ζήια ζε ακηίζημζπμ ανζειυ ηοηηάνςκ. Σα ηαθφηενα απμηεθέζιαηα ζε ηφηηανα Hi5 είκαζ ζφιθςκα ιε ημ ορδθυηενμ δοκαιζηυ παναβςβήξ ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ ζημκ ζοβηεηνζιέκμ ηοηηανζηυ ηφπμ (Sander & Harrysson, 2007), εκχ δ αφλδζδ ζηα επίπεδα ηδξ ακζπκεουιεκδξ Myc-LEF8 ιε ημκ ακαζημθέα ημο πνςηεαζχιαημξ είπε επίζδξ δζαπζζηςεεί ηαζ βζα ηδκ ελςβεκή παναβςβή ηδξ ζδιαζιέκδξ πνςηεΐκδξ AcLEF8 απυ ζφζηδια έηθναζδξ ιε εηενυθμβεξ αθθδθμοπίεξ οπμηζκδηή ηαζ πμθοαδεκοθίςζδξ (Titterington et al., 2003). Σμ εθθεζιιαηζηυ ααηιίδζμ ειθάκζγε ημκ επζεοιδηυ ιδ παεμβυκμ θαζκυηοπμ ιε ζζηή ακηζβναθή ηαζ απμοζία δεοηενμβεκμφξ ιυθοκζδξ. Δπζπθέμκ πνδζζιμπμζήεδηε επζηοπχξ ςξ ζφζηδια έηθναζδξ βζα ηδκ πνμηαηανηηζηή παναβςβή ηδξ πνςηεΐκδξιάνηονα YFP ιε ημκ οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ Α3 ημο ιεηαλμζηχθδηα ηαζ ιε εηενυθμβδ αθθδθμοπία πμθοαδεκοθίςζδξ. Ζ οπμηαηάζηαζδ ηαζ δζάζςζδ ημο ααηιζδίμο Γlef8, ιέζς ελςζζηήξ πανμπήξ ηδξ πνςηεΐκδξ Myc-LEF8, μδήβδζακ ζε ζδιακηζηή αφλδζδ ηςκ επζπέδςκ υρζιδξ ιεηαβναθήξ υπςξ αοηή εηηζιάηαζ απυ ηδκ αφλδζδ ηςκ ιεηαβνάθςκ ημο πνυηοπμο υρζιμο βμκζδίμο vp39 υιςξ δεκ παναηδνήεδηε μθμηθήνςζδ ημο ζζημφ ηφηθμο ηαζ παναβςβή ζμζςιάηςκ. Δκημφημζξ, δ εεηζηή επίδναζδ ζηδκ υρζιδ ιεηαβναθή επζαεααίςζε υηζ δ ελςζζηά πανεπυιεκδ LEF8 είκαζ θεζημονβζηή. ηα πθαίζζα ηδξ δζενεφκδζδξ ηδξ αδοκαιίαξ δζάζςζδξ, πανά ηδ ιενζηή απμηαηάζηαζδ ηδξ υρζιδξ ιεηαβναθήξ, δμηζιάζηδηε δ δοκαηυηδηα δζάζςζδξ ιε ηδκ ημπμεέηδζδ ηςκ ηαζεηχκ έηθναζδξ LEF8, A.lef8.bgh ηαζ hsp70.lef8.sv40, ζημ βμκζδίςια ημο ααηιζδίμο Γlef8 ηαζ ζοβηεηνζιέκα ζημ βεκεηζηυ ηυπμ ημο lef8 ή/ηαζ ζε άθθεξ, ακελάνηδηεξ εέζεζξ. Με αοηυκ ημκ ηνυπμ εα ιπμνμφζε κα ελεηαζηεί πεναζηένς ηυζμ δ επάνηεζα ηςκ παναπάκς ζοζηδιάηςκ έηθναζδξ ζπεηζηά ιε ηδκ ζηακυηδηά ημοξ κα οπμηαηαζηήζμοκ ημ θοζζηυ βμκίδζμ lef8 ηαζ κα δζαζχζμοκ ημ ααηιίδζμ Γlef8, υζμ ηαζ δ πζεακυηδηα υηζ δ εέζδ ημοξ ζημ βμκζδίςια επζδνά ζηδκ απυδμζή ημοξ. Σμ ζφζηδια έηθναζδξ ιε ημκ απθυ οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ πνμηζιήεδηε ζε ζπέζδ ιε ημκ πμθφ ζζπονυηενμ EIA, εθυζμκ ηάεε ααηιίδζμ εα έθενε εκζςιαηςιέκδ ηδκ αθθδθμοπία έηθναζδξ. Ο αζεεκέζηενμξ οπμηζκδηήξ hsp70, πμο ειθακίγεζ ~70% ηδξ ζζπφμξ ημο οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ (βι. ζρεηηθά πεηξάκαηα θωηαύγεηαο, παξάγξαθνο 130

158 3.7.4), πανάβεζ ιεβαθφηενδ πμζυηδηα ιεηάβναθμο lef8 ζε ζπέζδ ιε ημ ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο ηαζ άνα ημκ θοζζηυ οπμηζκδηή lef8. οιπεναζιαηζηά, δ πνήζδ ηςκ οπμηζκδηχκ ημο hsp70 ηαζ ηδξ αηηίκδξ ζηα πθαίζζα εκδμσζηήξ/εκδμβεκμφξ παναβςβήξ LEF8 πμζμηζηά εα οπενηάθοπηε ηζξ ακάβηεξ ακάπηολδξ ημο ααηιζδίμο. Ζ ηαζέηα A.lef8.bgh δζαεέηεζ εοιεβέεεζξ εηενυθμβεξ αθθδθμοπίεξ οπμηζκδηή ηαζ πμθοαδεκοθίςζδξ, πμο δζαπςνίγμοκ ηδκ ηςδζηή πενζμπή ημο lef8 απυ ημ πενζαάθθμκ ζζηυ βμκζδίςια ηαζ ζοβηεηνζιέκα απυ ηζξ θοζζηέξ 5 ηαζ 3 βεζημκζηέξ πενζμπέξ ημο lef8. Δπμιέκςξ, δ παναηδνμφιεκδ δζάζςζδ ημο ααηιζδίμο Γlef8 μθείθεηαζ ζηδκ παναβςβή LEF8 απυ ηδκ ίδζα ηδκ ηαζέηα, δ μπμία πνμθακχξ πανάβεζ επανηείξ πμζυηδηεξ πνςηεΐκδξ LEF8 βζα ημκ ηφηθμ γςήξ ημο ζμφ ηαζ άνα ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί ςξ θμνέαξ δζάζςζδξ. Ακηίζημζπα δ ηαζέηα hsp70.lef8.sv40 επίζδξ επάβεζ δζάζςζδ ιε ηδκ εκδμβεκή παναβςβή ηδξ. Πανά ηδκ επάνηεζα ηαζ ηςκ δφμ αθθδθμοπζχκ έηθναζδξ βζα ηδ δζάζςζδ ημο εθθεζιιαηζημφ ααηιζδίμο υιςξ, θαζκυηακ κα οπάνπεζ ηάπμζμ απνμζδζυνζζημ θαζκυιεκμ «εέζδξ», ζδιακηζηυ βζα ηδ θεζημονβία ημο ζμφ, πμο επέηνεπε ηδκ ακάηηδζδ θεζημονβζηυηδηαξ ιυκμ υηακ μζ παναπάκς αθθδθμοπίεξ επακεζζάβμκηακ ζημ βεκεηζηυ ηυπμ lef8 ηαζ, εζδζηά βζα ηδκ ηαζέηα A.lef8.bgh, ιε ζοβηεηνζιέκδ ηαηεφεοκζδ. Σμ παναπάκς θαζκυιεκμ μδήβδζε ζηδκ επακεηηίιδζδ ηδξ πζεακήξ ειπθμηήξ βεζημκζηχκ βμκζδίςκ ζημ θαζκυηοπμ ημο Γlef8. Ζ αθαίνεζδ βεκεηζημφ οθζημφ, υπςξ αοηή μθυηθδνδξ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο lef8, πμο ζοκζζηά ιία απυ ηζξ ιεβαθφηενεξ ημο ζζημφ βμκζδζχιαημξ, ήηακ πζεακυ κα έπεζ επζπηχζεζξ ζηδ θεζημονβία ημο ααηιζδίμο. Ζ εββφηδηα ηαζ ζε ανηεηέξ πενζπηχζεζξ, αθθδθμεπζηάθορδ βμκζδίςκ ζημ ζζηυ βμκζδίςια ηαεζζημφζε πζεακυ κα οπάνπμοκ ιέζα ζημ lef8 αθθδθμοπίεξ νφειζζδξ βεζημκζηχκ βμκζδίςκ ηαζ ζοβηεηνζιέκα ημο orf40, πμο είκαζ απαναίηδημ βζα ημκ ηφηθμ γςήξ ημο ζμφ (Ono et al., 2012) ηαζ πθδνμί ααζζηέξ πςνμηαλζηέξ πνμτπμεέζεζξ ηαηεφεοκζδ ιεηαβναθήξ, απυζηαζδ απυ ημ ακμζηηυ πθαίζζμ ακάβκςζδξ ημο lef8 χζηε κα ιπμνεί κα επδνεαζηεί απυ ηδκ αθαίνεζδ ημο lef8. Ζ πνςηεΐκδ ORF40 πενζθαιαάκεζ ιία πενζμπή πνυζδεζδξ RNA (RBD: RNA binding domain (Clery et al., 2008)) άβκςζηδξ θεζημονβζηυηδηαξ. Δπζπθέμκ εεςνείηαζ υηζ ακήηεζ ζηδκ μζημβέκεζα ηςκ πνςηεσκχκ DnaJ (Rohrmann, 2013), δ μπμία πενζθαιαάκεζ πνςηεΐκεξ-ζοκμδμφξ (molecular chaperones), πμο ειπθέημκηαζ ζημ ιδπακζζιυ δζαπείνζζδξ ημο εενιζημφ ζμη (μζημβέκεζα DnaJ/HSP40) (Pang et al., 2001). Ζ πνςηεσκζηή πενζμπή DnaJ πενζθαιαάκεζ πενίπμο 70 αιζκμλζηά ηαηάθμζπα, ζοκήεςξ πθδζζέζηενα ζημ αιζκμηεθζηυ άηνμ (Hennessy et al., 2000). Δκχ υιςξ δ 131

159 μιυθμβδ πνςηεΐκδ SpltORF39 ημο ζμφ Spodoptera litura MNPV (SpltMNPV) δζαεέηεζ ιία ζαθή πενζμπή DnaJ (Wang et al., 2002), μζ ακηίζημζπεξ πνςηεΐκεξ ORF40 ηαζ ORF51 ηςκ ζχκ BmNPV ηαζ AcMNPV δεκ ακαβκςνίγμκηαζ πναηηζηά ςξ DnaJ ζε ζπεηζηή ακάθοζδ (NCBI Conserved Domains (Marchler-Bauer et al., 2011)). Πνςηεΐκεξ μιυθμβεξ ηδξ ORF40 ανίζημκηαζ ζε υθμοξ ημοξ ζμφξ πονδκζηήξ πμθοέδνςζδξ ηςκ θεπζδμπηένςκ (Wang et al., 2002; Xu et al., 2006) ηαζ πανά ημ βεβμκυξ υηζ μ νυθμξ ηδξ παναιέκεζ αζαθήξ, είκαζ πζεακή δ ζφκδεζή ηδξ ιε ηδκ παναβςβή ζμζςιάηςκ, επεζδή ακζπκεφεηαζ ςξ ζοζηαηζηυ ηςκ αθαζηζηχκ ηαζ έβηθεζζηςκ ζχκ (Wang et al., 2002; Xu et al., 2006). Ζ παιδθή απυδμζδ δζάζςζδξ, πμο παναηδνήεδηε βζα πνχηδ θμνά υηακ θμνείξ έηθναζδξ θοζζηήξ ηαζ ηαναμλοηεθζηά ζδιαζιέκδξ ORF40 πνδζζιμπμζήεδηακ ζε ζοκδοαζιυ ιε θμνείξ Myc-LEF8 βζα ηδκ οπμηαηάζηαζδ ημο ααηιζδίμο Γlef8, απέδεζλε υηζ υκηςξ δ παναβςβή ηδξ ORF40 ειπθέηεηαζ ζημκ εθθεζιιαηζηυ θαζκυηοπμ. Μεθέηεξ ζημοξ ζμφξ BmNPV (Xue et al., 2012) ηαζ AcMNPV (Chen et al., 2013) είπακ δείλεζ υηζ δ αβνίμο ηφπμο παναβςβή ηςκ ιεηαβνάθςκ orf40 (orf51 ζημκ AcMNPV), είκαζ απυ ηζξ παιδθυηενεξ ζημκ ηφηθμ γςήξ ημο ζμφ. Δκημφημζξ, δ παναηδνδεείζα ιεζςιέκδ ιεηαβναθή απυ ημ ααηιίδζμ Γlef8 είκαζ πνμθακχξ ακεπανηήξ. Ζ αιζκμηεθζηά ζδιαζιέκδ ORF40 δεκ έδςζε εεηζηά απμηεθέζιαηα, πζεακχξ θυβς ειπθμηήξ ηδξ αθθδθμοπίαξ ζήιακζδξ ζηδ θεζημονβία ηδξ πνςηεΐκδξ. Πεναζηένς επζαεααίςζδ βζα ηδκ ειπθμηή ημο βμκζδίμο orf40 ήνεε απυ ηα πεζνάιαηα δζάζςζδξ ημο εθθεζιιαηζημφ ααηιζδίμο hsp70.lef8/polh Γlef8. Ζ πνδζζιμπμίδζδ ζε αοηά θμνέςκ έηθναζδξ ηδξ ORF40, πανείπε ζυ ρεοδμ-αβνίμο ηφπμο, ζημκ μπμίμ μ οπμηζκδηήξ ηδξ αηηίκδξ ανζζηυηακ ζε άιεζδ βεζηκίαζδ ιε ηδκ ηςδζηή πενζμπή orf40. Δθυζμκ έκαξ εηενυθμβμξ οπμηζκδηήξ βζα ημ βμκίδζμ orf40 μδήβδζε ζε δζάζςζδ ήηακ ζαθέξ υηζ ζημ πανάβςβμ εθθεζιιαηζηυ ααηιίδζμ hsp70.lef8/polh Γlef8 ηαζ άνα ηαζ ζημ Γlef8 εα πνέπεζ κα απμοζζάγμοκ ζδιακηζηέξ αθθδθμοπίεξ νφειζζδξ ημο orf40. Ακηίζημζπα ηαζ μζ δζάθμνεξ αθθδθμοπίεξ έηθναζδξ LEF8 πμο δζέζςζακ ημ Γlef8 υηακ ημπμεεηήεδηακ ηαηάθθδθα ζημ βεκεηζηυ ηυπμ lef8 πνμθακχξ ιπμνμφζακ κα επάβμοκ επανηή παναβςβή ηδξ πνςηεΐκδξ ORF40 εηηυξ ηδξ LEF8, βεβμκυξ πμο δεκ ίζποε υηακ μζ ίδζεξ αθθδθμοπίεξ εζζήπεδζακ ιε ακηίεεηδ θμνά ή ζε εηημπζηέξ εέζεζξ (βι. εηθ. 3.29). Σμ βεβμκυξ υηζ ηαζ ηα δφμ βμκίδζα, lef8 ηαζ orf40, ιπμνμφκ κα θεζημονβήζμοκ απμηεθεζιαηζηά ιε εηενυθμβμοξ οπμηζκδηέξ ηαζ εηενυθμβεξ αθθδθμοπίεξ πμθοαδεκοθίςζδξ ήηακ ζδζαίηενδξ ζδιαζίαξ βζα ηδ βεκεηζηή ηνμπμπμίδζδ ημο ααηηνμσμφ BmNPV. 132

160 Ζ ιεθέηδ in silico ηςκ αθθδθμοπζχκ 5 ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο orf40 ζε ααηιίδζα αβνίμο ηφπμο, ηαεχξ ηαζ ζε δζαζςζιέκα πανάβςβα εθθεζιιαηζηχκ ααηιζδίςκ, έδεζλε ηδκ πανμοζία ηοπζηχκ ααηηνμσζηχκ αθθδθμοπζχκ νφειζζδξ ζε ζοβηεηνζιέκδ δζάηαλδ, πμο δζέθενε απυ αοηήκ ηςκ ααηιζδίςκ πμο δεκ ιπμνμφζακ κα δζαζςεμφκ. ημ ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο ηαζ ζηα δζαζςζιέκα πανάβςβα ημο Γlef8, δζαπζζηχεδηακ αθθδθμοπίεξ TATA ιαγί ιε ιζα πζεακή αθθδθμοπία έκανλδξ ηδξ ιεηαβναθήξ ηαεμδζηά ημο TATA (βι. εηθ. 3.29), ζε εέζεζξ πμο ακηαπμηνίκμκηακ αηνζαχξ ζηδκ ηοπζηή δζάηαλδ ηςκ αθθδθμοπζχκ ημο οπμηζκδηή πνχζιςκ ααηηνμσζηχκ βμκζδίςκ (Rohrmann, 2013). Δίκαζ επζπθέμκ εκδζαθένμκ υηζ δ εέζδ έκανλδξ ηδξ ιεηαβναθήξ βζα ημ μιυθμβμ βμκίδζμ orf51 ημο ζμφ AcMNPV ανίζηεηαζ ζηδ εέζδ -162 (ςξ πνμξ ηδκ ανπή ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ orf51), ιέζα ζε αθθδθμοπία υρζιδξ ιεηαβναθήξ πμο εκημπίγεηαζ ζημ 5 άηνμ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ Aclef8 (Chen et al., 2013). Λυβς ημο ορδθμφ ααειμφ ηαοηυηδηαξ ηςκ βμκζδίςκ lef8 ηαζ orf40 ζημοξ δφμ ζμφξ πνμηείκεηαζ υηζ δ εέζδ έκανλδξ ζημκ ζυ BmNPV ανίζηεηαζ ζηδκ ακηίζημζπδ αθθδθμοπία (βι. εηθ. 3.39/Β). Τπεκεοιίγεηαζ επίζδξ υηζ δ μιυθμβδ ηςδζηή πενζμπή Aclef8 δζέζςζε απμηεθεζιαηζηά ημ εθθεζιιαηζηυ ααηιίδζμ. Όιςξ δ ηαηαζηεοή ημο δζαζςζιέκμο ζμφ-ααηιζδίμο hsp70.lef8, πμο ζηενείηαζ αθθδθμοπζχκ οπμηζκδηή ηδξ υρζιδξ ιεηαβναθήξ ςξ ηαζ ηδ εέζδ -301, απμηεθεί έκδεζλδ υηζ ιπμνεί κα οπάνλμοκ ηαζ άθθεξ ιεηαβναθζηά θεζημονβζηέξ επζθμβέξ. Σμ 5 άηνμ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ Cclef8 πενζείπε επίζδξ ιία πανειθενή δζάηαλδ αθθδθμοπζχκ δοκδηζημφ οπμηζκδηή, ακηίζημζπδ ιε αοηήκ ημο δζαζςζιέκμο ζμφ A.lef8. Δπμιέκςξ, ιε αάζδ ηδκ παναπάκς ιεθέηδ in silico, ακαιεκυηακ υηζ ιπμνεί κα επάβεζ ηδκ επανηή θεζημονβία ημο βμκζδίμο orf40. Σεθζηά ηυζμ μθυηθδνδ δ ηςδζηή πενζμπή Cclef8, υζμ ηαζ ημ +1 ιε +380 ηιήια ηδξ επακέθενακ ημκ παεμβυκμ θαζκυηοπμ ζημ ααηιίδζμ hsp70.lef8/polh Γlef8, υηακ ημπμεεηήεδηακ 5 ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο βμκζδίμο orf40 (βι. παξάγξαθν θαη εηθ. 2.4 θαη 3.30). Σμ ααηιίδζμ hsp70.lef8/polh Γlef8 έπεζ εηημπζηή έηθναζδ LEF8 απυ ηδκ αθθδθμοπία hsp70.lef8, εκχ ακηίεεηα ημ Γlef8 δεκ πανάβεζ ηαευθμο LEF8. οκεπχξ δ δζάζςζδ ιυκμ ημο ααηιζδίμο hsp70.lef8/polh Γlef8 ηαζ υπζ ηαζ ημο Γlef8 απυ ηδκ ηςδζηή πενζμπή Cclef8 δείπκεζ υηζ υκηςξ ιπμνεί κα απμηαηαζηήζεζ ηδ θεζημονβία ημο βμκζδίμο orf40. Ακηίεεηα υιςξ δ παναβυιεκδ πνςηεΐκδ CcLEF8 δεκ ιπμνεί κα ακηζηαηαζηήζεζ ηδ LEF8, βεβμκυξ πμο πζεακχξ μθείθεηαζ ζηδ ζδιακηζηή απυηθζζδ ηςκ δφμ αθθδθμοπζχκ. 133

161 Ζ ηςδζηή πενζμπή Cclef8 πνδζζιμπμζήεδηε αηνζαχξ θυβς ηδξ ζδιακηζηήξ απυηθζζήξ ηδξ απυ ηδκ αθθδθμοπία ηδξ lef8 (βι. εηθ. 3.16), δ μπμία ηαεζζηά δφζημθμ ημκ μιυθμβμ ακαζοκδοαζιυ ημοξ. Ωξ εη ημφημο ιία ηαζέηα έηθναζδξ CcLEF8 εα ιπμνμφζε κα πνδζζιμπμζδεεί βζα ηδ δζάζςζδ αηυια ηαζ εθθεζιιαηζηχκ lef8 ζχκ/ααηιζδίςκ πμο δζαηδνμφκ ηιήιαηα ημο ακμζηημφ πθαζζίμο lef8, πςνίξ κα παναηδνείηαζ παναβςβή ζχκ ρεοδμ-αβνίμο ηφπμο. Σμ βεβμκυξ αοηυ εα ηαεζζημφζε πζμ εφημθμ ηαζ απμδμηζηυ ημ ζπεδζαζιυ ημο εθθεζιιαηζημφ ααηιζδίμο, ημ μπμίμ π.π εα ιπμνμφζε κα δζαηδνεί ημ 5 άηνμ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο lef8, πμο υπςξ απμδείπεδηε είκαζ απαναίηδημ βζα ηδ θεζημονβία ημο βμκζδίμο orf40. Όιςξ δ αδοκαιία ηδξ πνςηεΐκδξ CcLEF8 κα ακηζηαηαζηήζεζ ηδκ LEF8 δεκ επζηνέπεζ ηδκ πνδζζιμπμίδζδ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο Cclef8 βζα ημκ παναπάκς ζημπυ. Αλίγεζ υιςξ κα ζδιεζςεεί υηζ ημ 5 άηνμ ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο Cclef8 ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί ςξ εηενυθμβμξ οπμηζκδηήξ ημο βμκζδίμο orf40 ζε ακηζηαηάζηαζδ ημο οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ ηαηά ημ ζπεδζαζιυ κέςκ ιμνθχκ εθθεζιιαηζηχκ ααηιζδίςκ ςξ πνμξ ημ lef8. Σα παναπάκς απμηεθέζιαηα δείπκμοκ επζπθέμκ υηζ ηα ζοιπενάζιαηα ηδξ ακάθοζδξ in silico πνδζζιμπμζήεδηακ επζηοπχξ βζα κα πνμαθέρμοκ ιία κέα, άβκςζηδ ηαζ εηενυθμβδ αθθδθμοπία ςξ ηαηάθθδθδ βζα οπμηζκδηή ημο βμκζδίμο orf40. Σμ βεβμκυξ αοηυ πανέπεζ εκδείλεζξ βζα ηδκ μνευηδηα ηδξ οπυεεζδξ in silico. Πεζνάιαηα ιεηαθθαλμβέκεζδξ ηςκ οπμεεηζηχκ αθθδθμοπζχκ οπμηζκδηή ηαζ ημο πνμζδζμνζζιμφ ηςκ εέζεςκ έκανλδξ ηδξ ιεηαβναθήξ ζηα ααηιίδζα αβνίμο ηφπμο, ζημ Γlef8 ηαζ ζηα δζαζςζιέκα πανάβςβά ημο ακαιέκεηαζ κα δζαθεοηάκμοκ ηδ δμιή ημο οπμηζκδηή ημο orf40. Με ημκ οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ μοζζαζηζηά ακαπανήπεδ δ δμιή ημο δζαζςζιέκμο ααηιζδίμο hsp70.lef8/polh A.orf40 ζημ βεκεηζηυ ηυπμ ημο lef8 ημο κέμο εθθεζιιαηζημφ ααηιζδίμο polh/gfp A.orf40 Γlef8 (βι. εηθ. 3.36/Α). Σμ κέμ ααηιίδζμ δζαζχεδηε ιε ηδκ ελςζζηή παναβςβή ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 ζε ηφηηανα Bm5 ηαζ επζπθέμκ δζαηήνδζε ηδ δμιζηή ημο αηεναζυηδηα, πςνίξ κα πνμηφρμοκ ζμί ρεοδμαβνίμο ηφπμο. Ζ πνμζεηηζηή απμθοβή ηδξ φπανλδξ μιμθμβίαξ ιεηαλφ ημο εθθεζιιαηζημφ ααηιζδίμο ηαζ ηςκ θμνέςκ δζάζςζδξ απμδείπεδηε ζδιακηζηή βζα ηδ δζαζθάθζζδ ηδξ απμοζίαξ ζπδιαηζζιμφ ιυκζια δζαζςζιέκςκ ζχκ. Ηδζαίηενδ ζδιαζία θάκδηε κα έπεζ δ μιμθμβία πνμξ ηιήιαηα ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο lef8 ηαζ ημο orf40, ηαεχξ ηαζ ζοκδοαζιχκ ημοξ ιε εηενυθμβεξ αθθδθμοπίεξ οπμηζκδηή ή/ηαζ 134

162 πμθοαδεκοθίςζδξ, υηακ ζοκμθζηά ιπμνμφζακ κα δζαιμνθχζμοκ ζημ βμκζδίςια ημο ζμφ θεζημονβζηά βμκίδζα πμο πανάβμοκ ηζξ πνςηεΐκεξ LEF8 ηαζ ORF40. Ζ αολδιέκδ πζεακυηδηα μιυθμβμο ακαζοκδοαζιμφ ημο ααηιζδίμο ζηα ηφηηαναλεκζζηέξ ήηακ εκημφημζξ ζδζαίηενα πνήζζιδ βζα ηδ ιεθέηδ ηδξ ζπεηζηήξ ζηακυηδηαξ δζαθυνςκ αθθδθμοπζχκ κα οπμηαηαζηήζμοκ ηδκ ηςδζηή πενζμπή ή ζοκμθζηά ημ βμκίδζμ lef8, ζημπεφμκηαξ ηζξ αθθδθμοπίεξ ζημ βεκεηζηυ ηυπμ ημο lef8 ηαζ αθθμφ. Δίκαζ ζαθέξ υηζ δ ίδζα ιεεμδμθμβία ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί βζα πεναζηένς δζενεφκδζδ θαζκμιέκςκ ζπεηζηχκ ιε ημ βμκίδζμ lef8 ή επζπθέμκ βζα μπμζμδήπμηε ζδιακηζηυ βμκίδζμ ημο ζμφ, ημο μπμίμο δ απμοζία πανειπμδίγεζ ηδκ ελέθζλδ ημο ζζημφ ηφηθμο. Με ημ παναπάκς ζφζηδια, πμο θεζημονβεί μοζζαζηζηά ζηδ αάζδ ηδξ ακάηηδζδξ θεζημονβζηυηδηαξ (gain of function), δ ηαηάθθδθδ δζάηαλδ ζζηχκ αθθδθμοπζχκ ζε πθαζιίδζα/θμνείξ ιεηαθμνάξ επάβεζ ηδκ εζζαβςβή βεκεηζημφ οθζημφ ζημ ζζηυ βμκζδίςια ιε ή πςνίξ ηδκ ηαοηυπνμκδ απμιάηνοκζδ ζζημφ βεκεηζημφ οθζημφ. Ακ ημ ελςβεκέξ οθζηυ ιπμνεί κα οπμηαηαζηήζεζ ηδκ απμοζία ημο οπυ ιεθέηδ βμκζδίμο, δζαιμνθχκεηαζ έκαξ ζυξ ρεοδμ-αβνίμο ηφπμο ηαζ δ δζάζςζδ ημο ιεηαθθαβιέκμο ααηιζδίμο/ζμφ είκαζ εφημθα μναηή απυ ημ θοηζηυ ηφηθμ πμο αημθμοεεί. Ζ ηαηαζηεοή ηoο ηεθζημφ εθθεζιιαηζημφ ααηιζδίμο επμιέκςξ ήηακ επζηοπήξ ηαζ ακηζιεηχπζζε απμηεθεζιαηζηά ημ πνυαθδια δζάζςζδξ ημο ανπζημφ ααηιζδίμο Γlef8. Σμ ίδζμ ημ Γlef8 επζπθέμκ, πανά ηδκ πνμαθδιαηζηή δζάζςζδ, θεζημφνβδζε πνμηαηανηηζηά ςξ ζφζηδια έηθναζδξ, πανάβμκηαξ ηδκ ακαζοκδοαζιέκδ πνςηεΐκδιάνηονα YFP. Δκημφημζξ δεκ ηαηέζηδ εθζηηή ηαζ δ αεθηίςζδ ηδξ απυδμζδξ δζάζςζδξ. Ζ ζπεηζηή πνμζπάεεζα επζηεκηνχεδηε βφνς απυ ημκ πνμζδζμνζζιυ ημο επζπέδμο ελςβεκμφξ πανμπήξ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 υπςξ αοηυ εηηζιήεδηε απυ ηδκ πμζυηδηα ιεηαβνάθςκ ημο lef8 πμο εα ιπμνμφζε κα επζηνέρεζ απμηεθεζιαηζηά ηδκ ακάπηολδ ημο ζμφ, ιε ζδιείμ ακαθμνάξ ηδκ παναβςβή LEF8 απυ ημ ααηιίδζμ αβνίμο ηφπμο. Ζ εκδμβεκήξ παναβςβή ηυζμ ημο ιεηάβναθμο υζμ ηαζ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 θαίκεηαζ κα είκαζ ανηεηά παιδθή ζε ζπέζδ ιε ηα επίπεδα πμο πανάβμκηαζ αηυιδ ηαζ απυ ημκ αζεεκέζηενμ εηενυθμβμ οπμηζκδηή πμο πνδζζιμπμζήεδηε, ημ πανάβςβμ ημο οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ Α3, mac3. Σμ βμκίδζμ lef8 θαίκεηαζ κα ειθακίγεζ έκα ιέζμ πνμξ παιδθυ επίπεδμ ιεηαβναθήξ, ζε ζπέζδ ιε ημ ζφκμθμ ηςκ βμκζδίςκ ημο BmNPV (Xue et al., 2012). Ακηίζημζπα είκαζ ηαζ ηα απμηεθέζιαηα απυ ημκ ζυ AcMNPV (Chen et al., 2013). Παν υθα αοηά δναζηζηυηδηα ζζηήξ RNA πμθοιενάζδξ παναηδνήεδηε 135

163 υηακ δ πνςηεΐκδ LEF8 πανήπεδ απυ ημοξ ζζπονυηενμοξ εηενυθμβμοξ οπμηζκδηέξ, ηυζμ ελςβεκχξ υζμ ηαζ απυ ημ βμκζδίςια ημο ζμφ. ηδ δεφηενδ πενίπηςζδ οπήνλε ηαζ πθήνδξ δζάζςζδ ημο εθθεζιιαηζημφ θαζκυηοπμο ιε επίπεδα ακαπαναβςβήξ ημο εηάζημηε ααηιζδίμο ακηίζημζπα ιε αοηά ημο αβνίμο ηφπμο. Ζ παιδθή απυδμζδ δζάζςζδξ ηεθζηά θαίκεηαζ κα μθείθεηαζ ζε πνμαθήιαηα ιεζςιέκςκ πμζμζηχκ ηοηηάνςκ πμο δζαιμθφκμκηαζ ιε ηα πθαζιίδζα έηθναζδξ ηδξ LEF8. Ο πενζμνζζιυξ ηδξ δζάζςζδξ ημο εθθεζιιαηζημφ ααηιζδίμο ζε ιειμκςιέκα ηφηηανα δδιζμονβεί ηδκ ακάβηδ κα οπάνπεζ έηθναζδ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 ζε υζμ ημ δοκαηυκ πενζζζυηενα ηφηηανα, ζδακζηά δε ζε υθα. Οζ ηεπκζηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ιέπνζ ζηζβιήξ δεκ απμδείπεδηακ αέθηζζηεξ βζα ημ ζημπυ αοηυ. Ο ζπεδζαζιυξ ηαζ δ ηαηαζηεοή ηοηηανζηχκ ζεζνχκ ζηαεενήξ έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 ιε αάζδ ηαεειία απυ ηζξ εηενυθμβεξ αθθδθμοπίεξ έηθναζδξ, απμηεθεί ηδκ πνχηδ ηίκδζδ ζηα πθαίζζα ηδξ δμηζιήξ εκαθθαηηζηχκ ιεευδςκ δζάζςζδξ. ε ηάεε ζεζνά εα οπάνπεζ δζαεεζζιυηδηα ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 ζηδκ πθεζμρδθία ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ έηζζ εα ιπμνεί ζηδ ζοκέπεζα κα απμζαθδκζζεεί πμζμ ζφζηδια έηθναζδξ είκαζ ηαηαθθδθυηενμ χζηε ημ εθθεζιιαηζηυ ααηιίδζμ κα πανάβεηαζ ζε ορδθμφξ ηίηθμοξ. Πνμηείκεηαζ επζπθέμκ κα πνδζζιμπμζδεεί πεναζηένς ηαζ ημ ζφζηδια ιεηάεεζδξ piggybac, πμο δμηζιάζηδηε πενζμνζζιέκα ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ. Βζαθζμβναθζηά δεδμιέκα οπμζηδνίγμοκ υηζ, ιε ηδ πνήζδ ακάθμβμο ζοζηήιαημξ ιεηάεεζδξ, 80% ηςκ ακεεηηζηχκ ηοηηάνςκ ζημ ακηζαζμηζηυ επζθμβήξ, πενζέπμοκ ημ βμκίδζμ ιάνηονα (αθθδθμοπία έηθναζδξ GFP) ιεηά απυ έκα ιήκα επζθμβήξ (Xue et al., 2009). Ζ πνδζζιμπμίδζδ ηδξ δζηήξ ιαξ εηδμπήξ ημο θμνέα piggybac έδςζε ιία πθήνςξ ακεπηοβιέκδ ηαθθζένβεζα ακεεηηζηχκ ηοηηάνςκ ιεηά απυ 3-4 εαδμιάδεξ επζθμβήξ, δδθαδή 1-2 εαδμιάδεξ κςνίηενα ζε ζπέζδ ιε ηδ ζοκδζαιυθοκζδ ηςκ ηοηηάνςκ λεπςνζζηά ιε θμνέα έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 ηαζ θμνέα επζθμβήξ (ηεπκζηή δφμ πθαζιζδίςκ). Με ημ ζφζηδια πμο πνδζζιμπμζήεδηε δεκ ιπμνμφιε κα βκςνίγμοιε ημ πμζμζηυ ηςκ ακεεηηζηχκ ηοηηάνςκ πμο πανάβμοκ ηδκ πνςηεΐκδ LEF8, αθθά είκαζ πζεακυ κα είκαζ ορδθυηενμ ζε ζπέζδ ιε ηα απμηεθέζιαηα ηδξ ηεπκζηήξ δφμ πθαζιζδίςκ, θυβς ηδξ βεκεηζηήξ ζφκδεζδξ ηςκ αθθδθμοπζχκ έηθναζδξ LEF8 ηαζ επζθμβήξ. Δπζπθέμκ, ιε αθθδθμοπίεξ IRES (Internal Ribosome Entry Sites, (Jan, 2006)), πμο παίγμοκ νυθμ ζηδ ιεηάθναζδ ιμνίςκ mrna πμο δεκ ελανηάηαζ απυ ημ ηαθφιια (cap-independent) (Hennecke et al., 2001), ιπμνεί κα δμηζιαζηεί ηαζ δ 136

164 έηθναζδ ηδξ LEF8 ηαζ ηδξ πνςηεΐκδξ επζθμβήξ απυ έκα ιυκμ, δζζζζηνμκζηυ ιεηάβναθμ. Με ηδ ιεεμδμθμβία ημο piggybac εα ιπμνμφζακ επίζδξ κα ηαηαζηεοαζημφκ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ πμο εα πανάβμοκ ζηαεενά ηαζ ιε ορδθά επίπεδα μιμζμβέκεζαξ lef8 dsrna. Ζ ιυθοκζή ημοξ ιε ημ ααηιίδζμ BmNPV αβνίμο ηφπμο ακαιέκεηαζ κα ειθακίζεζ ακηίζημζπμ εθθεζιιαηζηυ θαζκυηοπμ ιε αοηυκ ημο ααηιζδίμο Γlef8 ηαζ επζπθέμκ πςνίξ ημκ πενζμνζζιυ ηδξ πανμδζηυηδηαξ πμο παναηηδνίγεζ ηδ δζαιυθοκζδ ηοηηάνςκ ιε dsrna. 4.3 Μελλονηικέρ καηεςθύνζειρ Πνμηεναζυηδηα βζα ηδ ζοκέπζζδ ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ είκαζ δ αεθηζζημπμίδζδ ηςκ ζοκεδηχκ δζάζςζδξ ημο εθθεζιιαηζημφ ααηιζδίμο, χζηε ηα ζμζχιαηά κα πανάβμκηαζ ζε επανηείξ ηίηθμοξ. Ήδδ ακαθένεδηακ ζοβηεηνζιέκεξ ηαηεοεφκζεζξ πνμξ ηζξ μπμίεξ εα ηζκδεεί δ ζπεηζηή ένεοκα ιε ηδ δδιζμονβία ηοηηανζηχκ ζεζνχκ δζάζςζδξ, ζηαεενήξ έηθναζδξ ηδξ πνςηεΐκδξ LEF8 ιε αάζδ ηζξ δζάθμνεξ αθθδθμοπίεξ έηθναζδξ πμο ιεθεηήεδηακ. Ζ ηοηηανζηή ζεζνά lef8 dsrna ιπμνεί επίζδξ κα ηαηαζηεοαζηεί ηαζ κα πνδζζιμπμζδεεί βζα ηδ ζηαεενή απμζζχπδζδ ημο βμκζδίμο lef8 ιε ιυθοκζδ ιε ημ ααηιίδζμ BmNPV αβνίμο ηφπμο. Σμ επζπθέμκ αοηυ ζφζηδια εθθεζιιαηζημφ θαζκμηφπμο εα ιπμνεί ζηδ ζοκέπεζα κα ζοβηνζεεί ιε ημ ααηιίδζμ Γlef8. Κνίκεηαζ ζηυπζιμ επζπθέμκ κα ηαηαζηεοαζηεί ημ ααηιίδζμ t-cclef8 Γlef8, ιε ημ ηιήια +1 ιε +380 ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο βμκζδίμο Cclef8 ή έκα ιζηνυηενμ 5 ηιήια, πμο κα πενζέπεζ ηζξ πζεακέξ αθθδθμοπίεξ οπμηζκδηή κα πνδζζιμπμζείηαζ ςξ οπμηζκδηήξ ημο βμκζδίμο orf40, ημπμεεηδιέκμ ακμδζηά ηδξ ηςδζηήξ πενζμπήξ ημο. Ζ παναπάκς δζάηαλδ εα απμδεζιεφζεζ ημκ οπμηζκδηή ηδξ αηηίκδξ, χζηε κα ιπμνεί εη κέμο κα πνδζζιμπμζδεεί ςξ ζοζηαηζηυ ηδξ αθθδθμοπίαξ έηθναζδξ-ιάνηονα A.yfp, ιέζα απυ έκακ πενζζζυηενμ εοέθζηημ ηαζ απθυ ζπεδζαζιυ. Ζ παναβςβή εθθεζιιαηζηχκ ζμζςιάηςκ ζε επανηείξ ηίηθμοξ εα απμηεθέζεζ ηδ αάζδ εκυξ κέμο ζοζηήιαημξ έηθναζδξ. Σμ κέμ εθθεζιιαηζηυ ααηιίδζμ εα πενζέπεζ επίζδξ ακαζοκδοαζιέκα βμκίδζα ιε οπμηζκδηέξ, πμο εα επάβμοκ ορδθά επίπεδα έηθναζδξ ζε ηφηηανα Bm5, ηαζ εα πανάβεηαζ ζε ορδθμφξ ηίηθμοξ βζα κα ιμθφκεζ ηαθθζένβεζεξ ηοηηάνςκ. Σέθμξ εα είκαζ επίζδξ ζηυπζιμ κα δμηζιαζηεί ηαζ δ παναβςβή πνςηεσκχκ πμο θένμοκ αθθδθμοπίεξ έηηνζζδξ, ηαεχξ ηαζ πνςηεσκχκ πμο 137

165 απαζημφκ ιεηα-ιεηαθναζηζηέξ ηνμπμπμζήζεζξ, ιε ζημπυ ημκ έθεβπμ ηδξ επάνηεζαξ ηςκ ακηίζημζπςκ ηοηηανζηχκ ιδπακζζιχκ. Με αάζδ ηδκ οπυεεζδ ενβαζίαξ ιαξ ηαζ ηα απμηεθέζιαηα πμο πανμοζζάζηδηακ, ημ κέμ ζφζηδια έηθναζδξ ιπμνεί κα απμηεθέζεζ ιία πνήζζιδ πνμζεήηδ ηαζ πζεακχξ ιία ηαθφηενδ πνυηαζδ ζε ζπέζδ ιε ηα ήδδ οπάνπμκηα ααηηνμσζηά ζοζηήιαηα έηθναζδξ ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ. 138

166

167 Παξάξηεκα ι3 ι2,3 Δηθόλα Π1 Οζ δείηηεξ ιμνζαημφ αάνμοξ DNA θ2,3 (ανζζηενά/ιεβέεδ ζε kbp) ηαζ θ3 (δελζά/ιεβέεδ ζε bp). 139

168 Δηθόλα Π2 Aθθδθμφπδζδ ηδξ πενζμπήξ ζφκδεζδξ ημο εοεφβναιιμο θμνέα ακαζοκδοαζιμφ ηαζ ημο ααηιζδζαημφ βμκζδζχιαημξ ζηδκ 5 βεζημκζηή πενζμπή lef8 ημο Γlef8. Ζ αθθδθμοπία ημο πνμσυκημξ PCR ιε ημ γεφβμξ εηηζκδηχκ 5F_F/5F_R ακαβκχζηδηε (lef8 5F_F/R seq.) ηαζ ζημζπίζηδηε (alignment) ιε ηα ακηίζημζπα ηιήιαηα αθθδθμοπίαξ ημο θμνέα ptva.yfp/zeo ηαζ ημο ζηεθέπμοξ Σ3 ημο ζμφ BmNPV. Ζ πθήνδξ ηαφηζζδ ηςκ αθθδθμοπζχκ δείπκεζ υηζ μ ακαζοκδοαζιυξ ήηακ επαηνζαήξ. διεζχκμκηαζ μζ εέζεζξ ακαβκχνζζδξ ηςκ εκγφιςκ πενζμνζζιμφ ScaI ηαζ XcmI, πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ηαηαζηεοή ημο εοεφβναιιμο θμνέα ακαζοκδοαζιμφ. Ζ εέζδ ScaI απμηεθεί ημ 5 άηνμ ημο παναπάκς θμνέα ηαζ ημ υνζμ ιεηαλφ ημο εκεέιαημξ A.yfp/zeo ηαζ ημο βμκζδζχιαημξ ημο ααηιζδίμο. 140

169 Δηθόλα Π3 Aθθδθμφπδζδ ηδξ πενζμπήξ ζφκδεζδξ ημο εοεφβναιιμο θμνέα ακαζοκδοαζιμφ ηαζ ημο ααηιζδζαημφ βμκζδζχιαημξ ζηδκ 3 βεζημκζηή πενζμπή lef8 ημο Γlef8. Ζ αθθδθμοπία ημο πνμσυκημξ PCR ιε ημ γεφβμξ εηηζκδηχκ 3F_F/3F_R ακαβκχζηδηε (lef8 3F_F/R seq.) ηαζ ζημζπίζηδηε ιε ηα ακηίζημζπα ηιήιαηα αθθδθμοπίαξ ημο θμνέα ptva.yfp/zeo ηαζ ημο ζηεθέπμοξ Σ3 ημο ζμφ BmNPV. Ζ πθήνδξ ηαφηζζδ ηςκ αθθδθμοπζχκ δείπκεζ υηζ μ ακαζοκδοαζιυξ ήηακ επαηνζαήξ. διεζχκεηαζ δ εέζδ ακαβκχνζζδξ ημο εκγφιμο πενζμνζζιμφ XcmI, πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή ημο εοεφβναιιμο θμνέα ακαζοκδοαζιμφ ηαζ απμηεθεί ημ 3 άηνμ ημο θμνέα ηαζ ημ υνζμ ιεηαλφ ημο εκεέιαημξ A.yfp/zeo ηαζ ημο βμκζδζχιαημξ ημο ααηιζδίμο. 141

170 Δηθόλα Π4 Aθθδθμφπδζδ ηδξ πενζμπήξ ζφκδεζδξ ημο ααηιζδίμο Γlef8 ηαζ ηδξ αθθδθμοπίαξ A.yfp/zeo ιε πνήζδ ημο εηηζκδηή TV2 F. Ζ αθθδθμοπία πμο ακαβκχζηδηε (TV2 F seq.) ζημζπίζηδηε (alignment) ιε ηα ακηίζημζπα ηιήιαηα αθθδθμοπίαξ ημο θμνέα ptva.yfp/zeo ηαζ ημο ζηεθέπμοξ Σ3 ημο ζμφ BmNPV. Γεκ οπήνλε ιεηααμθή ζηδκ αθθδθμοπία ηδξ πενζμπήξ. διεζχκεηαζ ημ υνζμ ιεηαλφ ηδξ 5 βεζημκζηήξ πενζμπήξ ημο βμκζδίμο lef8 ηαζ ηδξ ζφζημζπδξ πενζμπήξ ηδξ αθθδθμοπίαξ A.yfp/zeo. 142

171 Δηθόλα Π5 Aθθδθμφπδζδ ηδξ πενζμπήξ ζφκδεζδξ ημο ααηιζδίμο Γlef8 ηαζ ηδξ αθθδθμοπίαξ A.yfp/zeo ιε πνήζδ ημο εηηζκδηή TV2 R. Ζ αθθδθμοπία πμο ακαβκχζηδηε (TV2 R seq.) ζημζπίζηδηε ιε ηα ακηίζημζπα ηιήιαηα αθθδθμοπίαξ ημο θμνέα ptva.yfp/zeo ηαζ ημο ζηεθέπμοξ Σ3 ημο ζμφ BmNPV. Γεκ οπήνλε ιεηααμθή ζηδκ αθθδθμοπία ηδξ πενζμπήξ. διεζχκεηαζ ημ υνζμ ιεηαλφ ηδξ 3 βεζημκζηήξ πενζμπήξ ημο βμκζδίμο lef8 ηαζ ηδξ ζφζημζπδξ πενζμπήξ ηδξ αθθδθμοπίαξ A.yfp/zeo. 143