ΑΝΑΛΥΣΗ ΟΣΤΏΝ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑΣ RAMAN. ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΓΙΑ ΤΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Υποβληθείσα στο Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών

Transcript

1 ΑΝΑΛΥΣΗ ΟΣΤΏΝ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑΣ RAMAN ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΓΙΑ ΤΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Υποβληθείσα στο Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών Υπό ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟ Γ. ΚΑΛΟΝΑΚΗ Επιστήμονα των Υλικών Εργαστήριο Ενόργανης Φαρμακευτικής Ανάλυσης Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστήμιο Πατρών ΠΑΤΡΑ, ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ 2007

2 Περιεχόμενα Πίνακας Περιεχομένων Πίνακας περιεχομένων Περίληψη 1 Summary 3 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κεφάλαιο 1 ο 5 Το οστό οστίτης ιστός 5 Τα είδη του οστίτη ιστού 8 Αγγεία και νεύρα οστίτη ιστού 9 Μικροσκοπική ανατομική των μακρών οστών 9 Οστική ανακατασκευή 13 Μεσοκυτταρική ουσία 15 Βιολογικός απατίτης 15 Οι κρύσταλλοι 16 Κολλαγόνο 18 Βιοσύνθεση κολλαγόνου 21 Προκολλαγόνο 21 Σύνθεση κολλαγόνου 22 Δομή των ινιδίων του κολλαγόνου 24 Πλέγμα κολλαγονούχων ινών και κρυστάλλων βιο-απατίτη 25 Κεφάλαιο 2 ο 27 Παθήσεις οστών 27 i

3 Περιεχόμενα Οστεοπόρωση Παθοφυσιολογία 27 Κολλαγόνο και οστεοπόρωση 31 Οστεομαλακία 32 Νόσος Paget 33 Σκορβούτο 33 Ατελής οστεογένεση 34 Οστεοπέτρωση 34 Κεφάλαιο 3 ο 35 Τεχνικές διάγνωσης ασθενειών οστών 35 Μορφομετρικές μέθοδοι 36 Απορρόφηση φωτονίων 37 Απορρόφηση φωτονίων με μια δέσμη (SPA) 37 Απορρόφηση φωτονίων με δύο δέσμες (DPA) 38 Απορρόφηση ακτίνων Χ (DEXA) 38 Ποσοτική αξονική τομογραφία (QCT) 40 Απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού (MRI) 41 Ανάλυση ενεργοποίησης νετρονίων (ΝΑΑ) 42 Βιοψία 43 Κινητική ραδιενεργού ασβεστίου 43 Κεφάλαιο 4 ο 45 Θεωρία αναλυτικών τεχνικών 45 Υπέρυθρη Φασματοσκοπία 45 Σχέση έντασης συγκέντρωσης 46 ii

4 Περιεχόμενα Φασματοσκοπία Υπερύθρου με χρήση μετασχηματισμού Fourier (FT-IR) 46 Περιθλασιμετρία Ακτίνων Χ 47 Σχέση έντασης συγκέντρωσης 49 Φασματοσκοπία Raman 50 Κλασσική προσέγγιση του φαινομένου Raman 52 Σχέση έντασης συγκέντρωσης 53 Φασματοσκοπία Raman με χρήση μετασχηματισμού Fourier (FT- Raman) 53 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κεφάλαιο 5 ο 55 Οργανολογία 55 FT-Raman 55 Περιθλασίμετρο Ακτίνων Χ (XRD) 59 Φασματοσκοπία Ατομικής Απορρόφησης (AAS) 61 Φασματοφωτομετρία Υπεριώδους Ορατού (UV-Vis) 64 Μέθοδος σταθερής προσθήκης (spiking) 67 Παρασκευή διαλύματος La 2 O 3 68 Παρασκευή εμφανιστικού διαλύματος μεταβαναδομολυβδαινικών 69 Κεφάλαιο 6 ο 70 Παρασκευή Προετοιμασία Δειγμάτων 70 Συλλογή δειγμάτων οστών 70 Κολλαγόνο 72 Υδροξυαπατίτης 72 iii

5 Περιεχόμενα Προετοιμασία δειγμάτων Πρωτόκολλα 73 Κεφάλαιο 7 ο 87 Αναλύσεις δειγμάτων 87 Κατασκευή καμπύλης αναφοράς 95 Επαλήθευση αποτελεσμάτων 99 Κεφάλαιο 8 ο 105 Συμπεράσματα 105 Βιβλιογραφία 108 Παράρτημα Α 116 Βιογραφικό 123 iv

6 Ευχαριστίες Ευχαριστίες Σ το σημείο, έπειτα από το πέρας της διπλωματικής αυτής εργασίας και το μικρό αυτό ταξίδι δεν θα μπορούσα να μην αναφερθώ και να ευχαριστήσω όλους αυτούς που στάθηκαν δίπλα μου και με βοήθησαν να ανταπεξέλθω σε αυτή τη δύσκολη προσπάθεια. Πρώτον από όλους θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντά μου κ. Χρίστο Κοντογιάννη, Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Φαρμακευτικής για την εμπιστοσύνη που μου επέδειξε αλλά και για τις συμβουλές και υποδείξεις του καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων. Θα ήθελα επίσης να τον ευχαριστήσω για τις συζητήσεις τις οποίες είχαμε για διάφορα θέματα δημιουργώντας έτσι ένα κλίμα περισσότερο φιλικό. Ο κ. Κοντογιάννης θεωρώ ότι αποτελεί παράδειγμα καταρτισμένου επιστήμονα με ανοιχτούς ορίζοντες και ανήσυχο πνεύμα. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την Λέκτορα του Τμήματος Φαρμακευτικής και πολύτιμο μέλος του εργαστηρίου κ. Μαλβίνα Όρκουλα για την βοήθειά της και συμβολή της στη διεκπεραίωση της διπλωματικής αυτής εργασίας καθώς επίσης και για την συνεχή και απρόσκοπτη παροχή συμβουλών σε κάθε μου έκκληση. Πως μπορώ να μην ευχαριστήσω το συνάδελφους μου αλλά κυρίως φίλους, Κατερίνα Δημητρακοπούλου και Γιάννη Καραμπά για τη συνεργασία τους, την ηθική υποστήριξη και τη συμβολή τους στη δημιουργία ενός ευχάριστου και ζεστού κλίματος στο εργαστήριο. Ευχαριστώ επίσης την Ευαγγελία Προσνικλή για την βοήθειά της αλλά και την υποστήριξή που μου παρείχε. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου για την υλική και ηθική στήριξη που μου παρείχε όλα αυτά τα χρόνια, αλλά και για τις θυσίες που έκαναν για φτάσω ως εδώ πετυχαίνοντας τους στόχους μου. Η αγάπη και η ευγνωμοσύνη μου θα είναι παντοτινή. a

7 Περίληψη Περίληψη Π ερίπου το % της οστεϊκής μάζας αποτελείται από ανόργανα μεταλλικά άλατα και το υπόλοιπο είναι οργανικό υπόστρωμα και νερό. Το κύριο ανόργανο συστατικό είναι ένα μη-στοιχειομετρικό ανάλογο του υδροξυαπατίτη, Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2, (BioHAp) o οποίος απαντάται στην φύση και η οργανική φάση είναι κυρίως (90%) κολλαγόνο τύπου I (COL) ενώ το υπόλοιπο 10 % απαρτίζεται από μια ποικιλία ενώσεων όπως γλυκοπρωτεΐνες, λιπίδια και ένζυμα. Η μελέτη των οστών ως προς της χημική τους σύσταση μπορεί να δώσει χρήσιμα στοιχεία σχετικά με τις ασθένειες των οστών όπως οστεοπόρωση, οστεοπέτρωση, οστεομαλακία, κλπ. αλλά και να βοηθήσει στην αξιόπιστη διάγνωσή τους. Παραδοσιακές αναλυτικές τεχνικές έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση της χημικής σύστασης των οστών, όπως είναι η ηλεκτρονική μικροσκοπία, η περιθλασιμετρία ακτίνων Χ αλλά και η κλασική χημική ανάλυση. Η χρήση αυτών των τεχνικών έχει αποδειχτεί χρονοβόρα, δύσχρηστη και επιπλέον τις περισσότερες φορές είναι καταστρεπτικές για το δείγμα. Η ιδανική αναλυτική τεχνική θα ήταν αυτή που θα απαιτούσε την ελάχιστη προετοιμασία των δειγμάτων χωρίς να υπάρχουν απώλειες στην ποιότητα των πληροφοριών που συλλέγονται από αυτή. Γι αυτούς τους λόγους, η φασματοσκοπία Raman θεωρείται ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο για τη «χαρτογράφηση» και μελέτη της χημικής σύστασης των οστών. Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε αν η φασματοσκοπία Raman, μια μη καταστροφική δονητική τεχνική με δυνατότητα για σημείο-προς-σημείο ανάλυση ενός υλικού, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για αυτό το σκοπό. Από κνημιαία βοοειδή οστά λήφθηκαν φάσματα Raman από το συμπαγές (cortical) και από το σπογγώδες (trabecular) τμήμα του οστού. Για τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν οι χαρακτηριστικές Raman ενεργές δονήσεις στα 960 cm -1 (ν 1 PO 3-4 ) και 2939 cm -1 ν(ch 2 ) για το βιοαπατίτη (BioHAp) και το κολλαγόνο (Col), αντίστοιχα. Τα φάσματα από το συμπαγές και το σπογγώδες τμήμα δεν ήταν άμεσα συγκρίσιμα λόγω της ισχυρής παρουσίας φωσφολιπιδίων και άλλων ουσιών του μυελού των οστών οι οποίες βρίσκονταν στο δικτυωτό τμήμα του οστού. Αναπτύχθηκε πρωτόκολλο απομάκρυνσής τους χωρίς να αλλοιωθεί χημικά το κολλάγονο ή ο βιο-απατίτης, το οποίο διαπιστώθηκε με την 1

8 Περίληψη ανάπτυξη πρωτοκόλλων απομόνωσης του βιο-απατίτη και του κολλαγόνου αντίστοιχα. Μετά τον καθαρισμό, λήφθηκε ξανά το φάσμα Raman και χρησιμοποιώντας τους λόγους των δονήσεων BioHAp/Col βρέθηκε ότι ο βιο-απατίτης ήταν περισσότερος στο συμπαγές τμήμα από ότι στο σπογγώδες σε σχέση με το κολλαγόνο. Για την επιβεβαίωση των παραπάνω αποτελεσμάτων μετρήθηκε το ασβέστιο και τα φωσφορικά στα ίδια δείγματα χρησιμοποιώντας τη φασματοσκοπία ατομικής απορρόφησης με χρήση της μεθόδου των σταθερών προσθηκών και τη φασματοφωτομετρία υπεριώδους-ορατού, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα από τις δύο παραπάνω τεχνικές επιβεβαίωσαν ότι το ποσοστό βιο-απατίτη στα συμπαγή οστά είναι μεγαλύτερο σε σχέση με τα σπογγώδη. 2

9 Summary Summary B one is a composite formed by the mineralization of an organic matrix (largely collagen) by the nucleation and growth of a mineral highly resembling calcium hydroxyapatite, Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2, (BioHAp) within the matrix. Seventy percent of mature bone is consisted of the inorganic phase while the organic matrix and water accomplish the rest. The organic phase is predominantly (90%) composed of collagen type I (Col) while a range of other substances such as glycosaminoglycans, glycoproteins, lipids, peptides and enzymes, contribute only to the remaining 10%. Knowledge of the BioHap/Col ratio can permit reliable diagnosis of bone diseases such as osteoporosis, osteopetrosis and osteomalacia. Traditional tools used in assessing the chemical composition of bone include electron microscopy, X-ray diffraction and wet chemical analysis. Usage of such techniques has been proved time-consuming and cumbersome. Furthermore, during the application of these techniques the tissue is exposed to stresses that alter its structure and/or composition. The ideal analytical tool would be one in which minimal tissue preparation is required, whilst allowing no loss of the amount and quality of information derived from the technique. For these reasons the technique of Fourier transform Raman spectroscopy was utilized. In this work Raman spectroscopy, a nondestructive vibrational technique, which permits point-by-point analysis ( mapping ) of a specimen, was applied as a tool for bone chemical analysis. Raman spectra of the cortical and trabecular part of shinbones 3- were recorded. The characteristic Raman vibrations at 960 (v 1 PO 4 ) and 2939 cm -1 v(ch 2 ) for BioHAp and collagen, respectively, were used. In order to avoid overlapping of the Raman bands before recording the spectra a sequestration protocol for cleaning the bones from the lipids and the other substances of bone marrow was developed and applied. In order to testify it, two more protocols of isolation bio-apatite and collagen were developed and applied respectively. It was found that the ratio of the Raman intensities BioHAp/Col for the trabecular bone to be lower than the cortical one. For verification purposes the concentrations of calcium and phosphates in the same samples were determined using atomic absorption spectroscopy and the UV-Vis 3

10 Summary spectroscopy, respectively. It was found that indeed the percentage of bio-apatite in cortical bones is larger than in the trabecular bones. 4

11 Θεωρητικό μέρος

12 Το οστό οστίτης ιστός Κεφάλαιο 1 ο Μ ε τον όρο οστό αναφερόμαστε σε μια οικογένεια υλικών κάθε μια από τις οποίες έχει ένα δικό της ιδιαίτερο μοτίβο, αλλά όλες όμως έχουν την ίδια βασική δομική μονάδα, το σύμπλεγμα της ίνας του κολλαγόνου με το ανόργανο υλικό. Αυτή η οικογένεια υλικών περιλαμβάνει και άλλα μέλη τα οποία, για ιστορικούς λόγους, έχουν διαφορετικές ονομασίες. Μερικά από τα ποιο γνωστά παραδείγματα είναι η οδοντίνη, το υλικό που απαρτίζει τα εσωτερικά στρώματα του δοντιού, η οστεΐνη, το λεπτό στρώμα που συγκρατεί τη ρίζα του δοντιού στη γνάθο και οι ασβεστοποιημένοι τένοντες. Το ανόργανο συστατικό σε αυτή την οικογένεια υλικών είναι ο μη στοιχειομετρικός υδροξυαπατίτης ή διαφορετικά βιολογικός απατίτης ( ( PO CO ) ( OH )) Ca5 4, 3. Το τρίτο κατά σειρά βασικό συστατικό είναι το νερό, και όλα 3 μαζί είναι δομημένα με τέτοιο τρόπο ώστε να σχηματίζουν το σύμπλεγμα της ίνας του κολλαγόνου με το ανόργανο υλικό. Η αναλογία των παραπάνω βασικών συστατικών μπορεί να διαφέρει μεταξύ των διαφόρων μελών της οικογένειας, όπως επίσης και ο τρόπος με τον οποίο οι δομικές μονάδες είναι οργανωμένες σε μεγαλύτερες δομικές τάξεις και στην πραγματικότητα αυτή είναι η βάση της διαφοροποίησης μεταξύ των μελών της οικογένειας των οστών των βιολογικών υλικών. Το βασικό δομικό συστατικό των υλικών που ανήκουν στην οικογένεια των οστών όπως προαναφέραμε είναι το σύμπλεγμα της ίνας του κολλαγόνου με το ανόργανο υλικό. Αυτό αποτελείται από την ινώδη μορφή πρωτεΐνης κολλαγόνου η οποία παρουσιάζει την ίδια δομή με αυτή που έχει στο δέρμα, στους τένοντες και σε αρκετούς άλλους μαλακούς ιστούς. Το κολλαγόνο απαρτίζει το βασικό συστατικό μιας τρισδιάστατης μήτρας μέσα στην οποία, και μερικές φορές πάνω στην οποία, μορφοποιείται το ανόργανο συστατικό [1],[2]. Τα οστά αποτελούν ένα σημαντικό τμήμα του οργανισμού δεδομένου ότι απαρτίζουν το σκελετό, στον οποίο ο άνθρωπος οφείλει το σχήμα του αλλά και τις κινητικές του ιδιότητες. Τα οστά είναι σκληρά ανθεκτικά όργανα, με κύριο συστατικό τους τον οστίτη ιστό. Ο ρόλος του είναι σημαντικός γιατί παρέχει τη μηχανική υποστήριξη, την κινητικότητα και την προστασία των υπολοίπων οργάνων του 5

13 Κεφάλαιο 1 ο οργανισμού, όπως της καρδιάς, του εγκεφάλου και των πνευμόνων. Μέσα στον οστίτη ιστό περιέχεται ο μυελός ο οποίος είναι απαραίτητος για την αναγέννηση των έμμορφων συστατικών του αίματος. Από βιοχημική άποψη ο οστίτης ιστός είναι η αποθήκη του οργανισμού σε ιόντα, των οποίων η διατήρηση σε σταθερά επίπεδα στο εξωκυττάριο υγρό είναι κρίσιμη τόσο για τη ρύθμιση της νευρομυικής διεγερσιμότητας, όσο και μιας σειράς άλλων σημαντικών κυτταρικών λειτουργιών του οργανισμού. Πράγματι, περίπου το 99% του ασβεστίου (Ca), το 85% του φωσφόρου (P), το 40% του νατρίου (Na) και το 60% του μαγνησίου (Mg) του οργανισμού βρίσκονται αποθηκευμένα στα οστά. Από δομική άποψη τα οργανικά συστατικά του οστίτη ιστού, εμποτιζόμενα με κρυστάλλους υδροξυαπατίτη, μετατρέπουν αυτό το μαλακό οργανικό υπόστρωμα σε ένα σκληρό άκαμπτο υλικό, τα οστά, τα οποία παρέχουν τις μηχανικές ιδιότητες, την κινητικότητα και την αντοχή στις δυνάμεις που εφαρμόζονται στο σώμα από τις διάφορες δραστηριότητες του ανθρώπου. Όλες αυτές οι σημαντικές λειτουργίες που οφείλονται στα ανόργανα συστατικά, εξαρτώνται σε μεγάλη έκταση από την ακριβή χημική σύσταση, την κρυσταλλική δομή και τις φυσικοχημικές ιδιότητές τους, οι οποίες μεταβάλλονται με το χρόνο μετά την αρχική τους εναπόθεση. Ο σχηματισμός ποσότητας νέου οστού και η απορρόφηση του παλιού είναι συνεχείς λειτουργίες στα οστά. Αυτό έχει ως συνέπεια να αλλάζει το μέγεθος και η αναλογία του νέου οστού ως προς το παλιό. Η συνεχής αυτή αναδόμηση είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη, για την επιδιόρθωση των μικροβλαβών που λαμβάνουν χώρα από τις καθημερινές πιέσεις και τάσεις που εφαρμόζονται στα οστά αλλά και τη διατήρηση της ομαλής λειτουργίας του οργανισμού. Τα οστά (Σχήμα 1.1) περιβάλλονται εξωτερικά από ένα συνδετικογενή υμένα, το περιόστεο. Ακολουθεί η οστεΐνη αποτελούμενη εξωτερικά από το φλοιώδες ή συμπαγές τμήμα και μέσα στην οποία βρίσκεται το σπογγώδες τμήμα. Μέσα στο σπογγώδες τμήμα του οστού βρίσκεται ο μυελός των οστών. Μέσα στα οστά εμφανίζονται επίσης τα νεύρα και τα αγγεία. Η οστεΐνη περιέχει όλα τα στοιχεία του οστίτη ιστού, όπως τα οστέινα πετάλια, τις οστικές κοιλότητες και σωληνάρια, τα οστικά κύτταρα, τους σωλήνες Havers και Volkmann καθώς και τις διατιτρώσες ίνες. Αν και το φλοιώδες και σπογγώδες 6

14 Κεφάλαιο 1 ο τμήμα είναι ίδια από ιστολογική άποψη, τα στοιχεία του οστίτη ιστού είναι διαφορετικά διατεταγμένα σε αυτά [3]. Σχήμα 1.1: Μορφολογία και δομή μακρών οστών. Στην εικόνα διακρίνεται το περιόστεο, το συμπαγές οστό, το σπογγώδες οστό, ο μυελός των οστών αλλά και τα αγγεία του αίματος τα οποία διεισδύουν στο οστό [4]. Το φλοιώδες οστό (cortical bone) που αποτελεί το 80% του σκελετού είναι σκληρό και συμπαγές και συνιστά το εξωτερικό τμήμα των περισσότερων οστών καθώς και του σωληνοειδούς άξονα των επιμηκών οστών. Το υπόλοιπο 20% του σκελετού συνίσταται από το σπογγώδες οστό (cancellous or trabecular or spongy bone) το οποίο συναντάται στην σπονδυλική στήλη καθώς και στο τέλος των επιμηκών οστών. 7

15 Τα είδη του οστίτη ιστού Κεφάλαιο 1 ο Ο οστίτης ιστός ανάλογα με τη διάταξη των κολλαγόνων ινιδίων που τον απαρτίζουν διακρίνεται σε δύο μορφές: α) την αδρή ινώδη μορφή που βρίσκεται στο τοίχωμα των μακρών οστών μέχρι το 1ο ή 2ο έτος της ηλικίας, καθώς και σε μερικά από τα οστά του ενήλικα, όπως είναι τα εγγύς των ραφών τμήματα των οστών του κρανίου, ο οστέινος λαβύρινθος και τα σημεία πρόσφυσης τενόντων και συνδέσμων, και β) την πεταλιώδη μορφή η οποία συναντάται κατ εξοχήν στα οστά του ενήλικα. Στην αδρή ινώδη μορφή τα κολλαγόνα ινίδια του ιστού σχηματίζουν αδρές δεσμίδες ανάμεσά τους, ενώ στην πεταλιώδη μορφή σχηματίζουν λεπτές δεσμίδες των 6-8 ινιδίων, που φέρονται παράλληλα σε ένα επίπεδο και σχηματίζουν τα οστέινα πετάλια. Τα πετάλια αυτά στο σπογγώδες τμήμα του οστού σχηματίζουν μεγαλύτερες δοκίδες, που από την αναστόμωση τους στο χώρο σχηματίζονται οι μυελοκυψέλες που γεμίζουν από μυελό των οστών. Στο σπογγώδες τμήμα των οστών τα πετάλια διατάσσονται σε ομόκεντρους κύκλους γύρω από τα οστικά αγγεία και δημιουργούν με τον τρόπο αυτό τους αγγειώδεις σωλήνες του Havers, οι οποίοι παρουσιάζονται σαν κύλινδροι που αναστομώνονται μεταξύ τους και περιέχουν αγγεία και νεύρα. Μεταξύ των πεταλίων βρίσκονται οι οστικές κοιλότητες και τα οστικά σωληνάρια, που φιλοξενούν τα οστικά κύτταρα και τις κυτταροπλασματικές διακλαδώσεις τους. Αντίστοιχα με την εξωτερική επιφάνεια του οστού, κάτω από το περιόστεο αλλά και κάτω από το ενδόστεο ένας ικανός αριθμός οστικών πεταλίων και οστικών κοιλοτήτων διατάσσεται κυρίως κυκλικά κατά μήκος ολόκληρης της εσωτερικής και εξωτερικής επιφάνειας του μακρού οστού (περιφερικά ή περιμυελικά πετάλια). Τα πετάλια αυτά δεν περιβάλλουν αγγειονευροφόρους σωλήνες. Η ανατομική μονάδα του πεταλιώδους οστίτη ιστού είναι το σύστημα του Havers ή οστεώνας, το οποίο αποτελεί το σύνολο των ομόκεντρων οστικών πεταλίων που περιβάλλουν το σωλήνα του Havers. Σε πολλές θέσεις μεταξύ των οστεώνων βρίσκονται τμήματα ομόκεντρης διάταξης πεταλίων με ποικίλο μέγεθος και σχήμα, που ονομάζονται όμως διάμεσα συστήματα. Υπάρχουν όμως και οι σωλήνες του Volkmann, οι οποίοι είναι αγγειονευροφόρα κανάλια με εγκάρσια ή λοξή διάταξη και οι οποίοι συνδέουν τους σωλήνες του Havers με την εξωτερική επιφάνεια των οστών ή με τον αυλό τους. Στους 8

16 Κεφάλαιο 1 ο σωλήνες του Volkmann τα οστικά πετάλια δεν σχηματίζονται ομόκεντρα γύρω από τα αγγεία, αλλά σε ακανόνιστη διάταξη. Κάθε σύστημα του Havers, αλλά και κάθε διάμεσο σύστημα αφορίζεται από τα γειτονικά με τη θεμέλια γραμμή, μια ζώνη που αποτελείται από θεμέλια ουσία που στερείται κολλαγόνων ινιδίων [5]. Αγγεία και νεύρα του οστίτη ιστού Ο οστίτης ιστός έχει πλούσια αγγείωση με αιμοφόρα αγγεία, που εξορμώνται από το περιόστεο και κατευθύνονται στους σωλήνες του Havers, ενώ άλλα μεγαλύτερα αγγεία διανέμονται στην σπογγώδη ουσία των οστών. Τα νεύρα που πορεύονται στους σωλήνες του Havers προορίζονται για το τοίχωμα των αγγείων. Μικροσκοπική ανατομική των μακρών οστών Όπως προαναφέρθηκε, σε μια εγκάρσια διατομή ενός μακρού οστού παρατηρεί κανείς από τα έξω προς τα μέσα το περιόστεο, το φλοιώδες τμήμα (συμπαγή οστέινη ουσία), το σπογγώδες τμήμα (σπογγώδη οστέινη ουσία), το ενδόστεο και τον αυλό, ο οποίος περιέχει το μυελό των οστών. Το περιόστεο αποτελείται από τρεις στοιβάδες, που είναι ενωμένες μεταξύ τους. Η εξωτερική στοιβάδα αποτελείται κυρίως από πυκνό συνδετικό ιστό που περιέχει λίγα λιπώδη κύτταρα και λίγες ελαστικές ίνες. Οι ίνες του κολλαγόνου σχηματίζουν δέσμες, μερικές από τις οποίες, όπως οι ίνες των τενόντων που προσφύονται στα οστά, εισδύουν σε ορθή γωνία μέσα στο οστό (ίνες του Sharpey). Στη στοιβάδα αυτή φέρονται κυρίως τα αγγεία και τα νεύρα του οστού. Η μεσαία στοιβάδα χαρακτηρίζεται για τη μεγάλη αφθονία σε ελαστικές ίνες και φέρει μικρό αριθμό αγγείων, ενώ συνδέεται στενά με την εξωτερική. Η εσωτερική στοιβάδα ονομάζεται και στοιβάδα των οστεοβλαστών, λόγω του αριθμού των κυττάρων αυτών που περιέχει στη νεαρή ηλικία, διότι στους ενήλικες τα κύτταρα αυτά σπανίζουν και η στοιβάδα αυτή μετατρέπεται σε ινώδη συνδετικό ιστό, καθώς ενσωματώνεται με τη μεσαία. Η σημασία της εσωτερικής στοιβάδας είναι μεγάλη 9

17 Κεφάλαιο 1 ο για τη διάπλαση του οστού, και κυρίως οι οστεοβλάστες προορίζονται για την εξασφάλιση της οστέωσης και της ανάπτυξης του οστού από το περιόστεο. Στους ενήλικες το περιόστεο, λόγω της απώλειας των οστεοβλαστών, δεν εμφανίζει οστεοπλαστικές ικανότητες παρά μόνο σε κατάγματα, όπου επανεμφανίζονται οι οστεοβλάστες στην εσωτερική του στοιβάδα. Τα αγγεία του περιοστέου ενώνονται με αυτά του οστού, συνοδευόμενα από νεύρα, μέρος των οποίων εισδύουν εντός του οστού, ενώ άλλα απολήγουν μέσα στο περιόστεο είτε ελεύθερα, είτε με σωμάτια των Vater- Pacini. Στον αριθμό των νεύρων αυτών οφείλεται και η μεγάλη ευαισθησία του περιοστέου. Η οστέινη ουσία αποτελείται από όλα τα στοιχεία του πεταλιώδη οστίτη ιστού, δηλαδή τα οστέινα πετάλια, τα οστικά κύτταρα, τις οστικές κοιλότητες, τα οστικά σωληνάρια, τους σωλήνες του Havers, τους σωλήνες του Volkmann και τις διατιτρώσες ίνες του Sharpey. Μια από τις διαφορές του σπογγώδους από το συμπαγές τμήμα των οστών είναι ότι διαφέρουν στην διάταξη αυτών των στοιχείων. Στο συμπαγές τμήμα ή φλοιώδες οστό, τα οστέινα πετάλια φέρονται παράλληλα σε ομόκεντρους κύκλους σε τρεις σχηματισμούς συστημάτων, το έξω θεμέλιο, το έσω θεμέλιο και το διάμεσο σύστημα (Σχήμα 1.2). Το έξω θεμέλιο σύστημα αποτελείται από ομόκεντρα πετάλια, τα οποία φέρονται το ένα εντός του άλλου και βρίσκονται τοποθετημένα στην περιφέρεια του οστού. Το σύστημα αυτό διαπερνούν οι σωλήνες του Volkmann και οι ίνες του Sharpey, των τελευταίων η ύπαρξη δεν αποτελεί χαρακτηριστικό της οστέινης ουσίας, που διαπλάσσεται από το περιόστεο και βρίσκονται τόσο στα υμενογενή, όσο και στα χονδρογενή οστά. Το έσω θεμέλιο σύστημα αποτελείται από παράλληλα φερόμενα πετάλια, που φέρονται ομόκεντρα και βρίσκονται περιμυελικά με αποτέλεσμα να αφορίζουν το μυελικό αυλό. Όπως όμως προαναφέρθηκε, στο εσωτερικό των πεταλίων αυτών βρίσκεται μια λεπτότατη στοιβάδα σπογγώδους ουσίας. Μεταξύ των δυο αυτών συστημάτων βρίσκονται τοποθετημένα τα συστήματα του Havers, που αποτελούν και τον κύριο όγκο του συμπαγούς τμήματος. Τα διάμεσα συστήματα αποτελούν υπολείμματα της διαρκούς διαδικασίας αποδόμησης των πεταλίων των δύο άλλων συστημάτων, περιλαμβάνοντας έτσι ακανόνιστα φερόμενα πετάλια. Τέλος, όπως αναφέρθηκε ανωτέρω, μεταξύ των πεταλίων των συστημάτων αυτών καταλείπονται οι οστικές κοιλότητες που περικλείουν τα οστικά κύτταρα. 10

18 Κεφάλαιο 1 ο Σχήμα 1.2: Αρχιτεκτονική συμπαγούς τμήματος οστού, στο οποίο είναι εμφανείς οι σωλήνες του Havers [4]. Το εξωτερικό αυτό τμήμα του οστού διακρίνεται για την συνεχή του ανανέωση κατά τη διάρκεια της διαδικασίας του επανασχηματισμού του. Οι ιστοί αναρροφώνται και αναπληρώνονται σε μια χωρικά και χρονικά συνδεδεμένη διαδικασία. Για την διαδικασία επανασχηματισμού του επιφορτίζονται κύτταρα τα οποία ονομάζονται οστεοκλάστες και οστεοβλάστες (Σχήμα 1.3). Η εκκίνηση της διαδικασίας επανασχηματισμού πραγματοποιείται με τους οστεοκλάστες οι οποίοι έχουν σαν στόχο την αποσύνθεση του οστού. Έπειτα οι οστεοβλάστες αναλαμβάνουν την ανασύνθεσή του, με ρυθμό ο οποίος αναδημιουργεί το 60% του οστού πολύ γρήγορα, ενώ το υπόλοιπο 40% με εξαιρετικά αργούς ρυθμούς. 11

19 Κεφάλαιο 1 ο Σχήμα 1.3: Σχηματική απεικόνιση της ανακατασκευαστικής λειτουργίας των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών στο οστό [6]. Το σπογγώδες οστό εντοπίζεται στο τέλος του επιμήκους οστού, στη μετάφυση και το σπόνδυλο. Διαθέτει χαρακτηριστικά τέτοια ώστε η μεγάλη επιφάνειά του να εξασφαλίζει ενισχυμένη κατανομή φορτίου και απορρόφηση κραδασμών. Αποτελείται από οστικά πετάλια και δοκίδες με ποικίλο σχήμα και πάχος, που φέρονται ακανόνιστα στο χώρο κατά μήκος των δυναμικών γραμμών του οστού και αλληλοσυνδέονται ακαθόριστα. Τα πετάλια αυτά αφήνουν μεταξύ τους χώρους, που συμπληρώνονται από ενδόστεο και ονομάζονται μυελοκυψέλες οι οποίες είναι κοιλότητες που περιέχουν μυελό. Η διαδικασία του επανασχηματισμού του (Σχήμα 1.4) γίνεται με ανάλογο τρόπο όπως και στο φλοιώδες οστό [7]. 12

20 Οστική ανακατασκευή Κεφάλαιο 1 ο Τα οστά αποτελούν έναν ιστό με υψηλού βαθμού οργάνωση που έχει παράλληλα αυξημένη ικανότητα ανάπλασης και επιδιόρθωσης. Όπως έχουμε ήδη προαναφέρει, ο οστίτης ιστός αποτελείται από τα οστικά κύτταρα και τη μεσοκυττάρια ουσία που τα περιβάλλει. Οι βασικοί τύποι των οστικών κυττάρων είναι οι οστεοβλάστες, τα οστεοκύτταρα και οι οστεοκλάστες (Σχήμα 1.3). Στοιχειώδεις ποσότητες οστού ανά πάσα στιγμή και σε όλη τη διάρκεια της ζωής, απορροφώνται από τους οστεοκλάστες και επανασυντίθονται από τους οστεοβλάστες κατά τη διαδικασία της οστικής ανακατασκευής (bone remodeling). Για το σκοπό αυτό τα οστικά κύτταρα δέχονται ερεθίσματα μηχανικά ή χημικά από το συστηματικό και τοπικό περιβάλλον ενώ διαθέτουν και μεταξύ τους ικανότητα επικοινωνίας. Η ισόρροπη σύνδεση της οστικής αποδόμησης με την οστική σύνθεση μέσω κυτταρικών μηχανισμών ονομάζεται σύζευξη (coupling) και έχει σαν σκοπό την ομοιόσταση της οστικής μάζας [8],[9]. Σχήμα 1.4: Σχηματική απεικόνιση της οστικής ανακατασκευαστικής λειτουργίας των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών σε τμήμα σπογγώδους οστού [10]. Οι οστεοβλάστες έχουν ως λειτουργία την παραγωγή της μεσοκυττάριας ουσίας του οστίτη ιστού και την εναπόθεση αλάτων ασβεστίου σ αυτόν, με την βοήθεια της 13

21 Κεφάλαιο 1 ο αλκαλικής φωσφατάσης που περιέχουν. Στη συνέχεια, αφού περιβάλλονται από τη θεμέλια ουσία μετατρέπονται σε οστικά κύτταρα. Οι οστεοβλάστες επομένως, βρίσκονται εκεί όπου παράγεται η οστέινη ουσία, έχουν σχήμα κυλινδρικό ή κυβικό, βρίσκονται σε διάταξη, όπως αυτή των επιθηλιακών κυττάρων, και συνδέονται μεταξύ τους με λεπτές αποφυάδες του κυτταροπλάσματος, το οποίο με τη σειρά του είναι άφθονο, περιέχει αρκετά μιτοχόνδρια, συσκευή Golgi και κεντροσωμάτιο και είναι έντονα βασίφιλο λόγω της παρουσίας του RNA που έχει άμεση σχέση με τη σύνθεση των λευκωμάτων της θεμέλιας ουσίας του οστίτη ιστού. Ο πυρήνας των κυττάρων αυτών είναι ευμεγέθης, με σφαιρικό ή ωοειδές σχήμα και περιέχει 1-3 πυρηνίσκους και λίγη χρωματίνη. Οι οστεοκλάστες, που πήραν την ονομασία τους από τον Kolliker το 1873, εμφανίζονται νωρίς στο έμβρυο μαζί με την εμφάνιση των πρώτων πυρήνων οστέωσης και χρησιμεύουν για την αποδόμηση και απορρόφηση της οστέινης ουσίας και του αποτιτανωμένου χόνδρου (χονδροκλάστες) κατά τη διάρκεια της διαρκούς αναδόμησης και ανακατασκευής των οστών, με αποτέλεσμα το σχηματισμό των βοθρίων του Howship (βαθιές σκαφοειδείς κοιλότητες στην οστέινη ουσία). Τα κύτταρα αυτά είναι πολυπύρηνα γιγαντοκύτταρα με ποικίλο σχήμα. Το κυτταρόπλασμά τους είναι ελαφρώς βασίφιλο, περιέχει αρκετά κενοτόπια και εμφανίζει πολλές αποφυάδες. Οι πυρήνες μπορεί να είναι από 2 έως 60 στον αριθμό. Τα οστεοκύτταρα αντιπροσωπεύουν το 95% των κυττάρων του οστού. Ο ρόλος των οστεοκυττάρων είναι η συντήρηση της θεμέλιας ουσίας του οστού, με την παραγωγή μικρών ποσοτήτων θεμέλιας ουσίας και η απελευθέρωση ιόντων ασβεστίου από τη θεμέλια ουσία όταν αυτό απαιτείται. Βρίσκονται σε κοιλότητες μέσα στην θεμέλια ουσία, έχουν ωοειδές σχήμα και αναπτύσσουν προεκβολές που γεμίζουν τις κοιλότητες όπου γίνεται η επικοινωνία με τα άλλα οστεοκύτταρα και οστεοβλάστες της ίδιας οστικής μονάδας. Μικρό ποσοστό των οστεοκυττάρων, που κυμαίνεται στο 1-3%, εκκρίνουν οστεολυτικά ένζυμα και απορροφούν αρκετή ποσότητα αποτιτανωμένης θεμέλιας ουσίας (περιοστεολυτική οστεόλυση). Η καταστροφή των οστεοκυττάρων ακολουθείται από απορρόφηση της θεμέλιας ουσίας. Αυτό αποδεικνύει ότι τα συγκεκριμένα κύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της θεμέλιας ουσίας [11],[12]. 14

22 Μεσοκυττάρια ουσία Κεφάλαιο 1 ο Η μεσοκυττάρια ουσία αποτελείται από τη θεμέλια ουσία και τους κρυστάλλους υδροξυαπατίτη. Η θεμέλια ουσία αποτελείται από κολλαγονικές και μη κολλαγονικές πρωτεΐνες. Οι μη κολλαγονικές πρωτεΐνες είναι πρωτεϊνικοί πολυσακχαρίτες, γλυκοπρωτεΐνες και λιπίδια. Βιολογικός απατίτης Ο υδροξυαπατίτης (HAP, ( ( PO ) OH ) Ca5 4 ) αποτελεί τη θερμοδυναμικά 3 σταθερότερη φάση των αλάτων του φωσφορικού ασβεστίου. Είναι ελάχιστα διαλυτός στις περισσότερες συνθήκες και κρυσταλλώνεται στο εξαγωνικό σύστημα. Η ονομασία του προέρχεται από τη λέξη απατώ, λόγω της σύγχυσης που υπήρχε σχετικά με την δομή του, και της ομοιότητας του με άλλα χημικά είδη, όπως ο βερύλιος και ο τουρμαλίνης. Από βιολογικής άποψης, αποτελεί ένωση με μεγάλο ενδιαφέρον, μια και συνιστά το κύριο ανόργανο συστατικό των οστών αλλά και των δοντιών πολλών σπονδυλωτών οργανισμών. Ο υδροξυαπατίτης, παρουσιάζει υποκαταστάσεις των ιόντων του τόσο στα φυσικά όσο και στα βιολογικά συστήματα. Αναφέρουμε χαρακτηριστικά τις υποκαταστάσεις των ιόντων ασβεστίου από ιόντα καλίου, νατρίου και στροντίου, των φωσφορικών ιόντων από ανθρακικά, και των υδροξυλίων από φθόριο και χλώριο. Ο βιολογικός απατίτης απαντάται ως το κύριο συστατικό της ανόργανης φάσης σε φυσιολογικές περιπτώσεις βιολογικής ασβεστοποίησης (σχηματισμός αδαμαντίνης, οδοντίνης, οστών), ενώ συνυπάρχουν με άλλα φωσφορικά ή μη-φωσφορικά άλατα σε παθολογικές περιπτώσεις. Οι βιολογικοί απατίτες παρουσιάζουν μικρότερο μέγεθος κρυστάλλων (σε σχέση με τους ορυκτούς απατίτες) και μεταβλητή σύσταση, δυσχεραίνοντας έτσι την κρυσταλλογραφική ανάλυση και τον προσδιορισμό τους. Ορισμένες από τις διαφορές που παρουσιάζουν είναι: α) μη στοιχειομετρικός λόγος Ca/P, ο οποίος κυμαίνεται από 15

23 Κεφάλαιο 1 ο 1.54 έως 1.73, σε σχέση με το 1.67 του καθαρού υδροξυαπατίτη, β) ύπαρξη ξένων ιόντων όπως: + 2 Na, Mg +, F, Cl, HPO, CO και γ) προΰπαρξη ή συνύπαρξη πρόδρομων φάσεων, όπως διένυδρου φωσφορικού διασβέστιου (DCPD, οκταφωσφορικού ασβεστίου (OCP, H ( ) H O CaHPO 4 2H 2 O ), Ca 8 2 PO4 5 2 ) και άμορφου φωσφορικού ασβεστίου. Οι παραπάνω διαφορές καθιστούν τους βιολογικούς απατίτες διαφορετικούς από τον στοιχειομετρικό υδροξυαπατίτη, καθώς και μεταξύ τους, και αναφέρονται συνήθως ως μη καθαροί υδροξυαπατίτες (impure hydroxyapatites). Λόγω των ιδιαιτεροτήτων που προαναφέρθησαν, πολλές μελέτες οι οποίες σχετίζονται με τους βιολογικούς απατίτες, πραγματοποιούνται χρησιμοποιώντας τον στοιχειομετρικό υδροξυαπατίτη σαν μοντέλο. Κοινό χαρακτηριστικό των βιολογικών απατιτών αποτελεί η υποκατάσταση των φωσφορικών από ανθρακικά ιόντα σε διάφορες αναλογίες. Τα διαφορετικά ποσοστά ανθρακικών που περιέχουν εξηγούν τα διαφορετικά χαρακτηριστικά κρυσταλλικότητας μεταξύ οστού οδοντίνης αδαμαντίνης. Απατίτης με μικρότερο ποσοστό ανθρακικών (αδαμαντίνη) χαρακτηρίζεται από καλύτερη κρυσταλλικότητα (μεγαλύτερο μέγεθος κρυστάλλων) σε σχέση με απατίτη με μεγαλύτερο ποσοστού ανθρακικών (οστό, οδοντίνη) ο οποίος εμφανίζει μικρότερη κρυσταλλικότητα [7]. 6 Οι κρύσταλλοι Οι κρύσταλλοι του ανόργανου συστατικού που υπάρχουν στο οστό είναι από μόνοι τους ένα αίνιγμα. Είναι κρύσταλλοι υδροξυαπατίτη οι οποίοι διαθέτουν υποκατεστημένες ομάδες φωσφορικών από ανθρακικά ιόντα, οι οποίοι διαθέτουν εξαγωνική κρυσταλλογραφική συμμετρία. Παρ όλα αυτά όμως οι κρύσταλλοι αυτοί δεν εμφανίζουν αυτή τη συμμετρία σε μακροσκοπικό σχήμα. Αντί γι αυτό αυτοί αναπτύσσονται σε λεπτές πλάκες ή δισκία (Σχήμα 1.5). Οι c κρυσταλλογραφικοί άξονες βρίσκονται στο επίπεδο του δισκίου και οι δύο μεγάλες πλευρές του είναι η (100) η οποία αντικρίζει την (10). Κανονικά θα περίμενε κανείς ότι και οι έξι (100) πλευρές θα εκφραζόταν με τέτοιο τρόπο ώστε ισοδύναμα να σχηματίζουν ένα ραβδόμορφο ή 16

24 Κεφάλαιο 1 ο βελονοειδές σχήμα. Το σχήμα των πλακών ή δισκίων αυτών θα πρέπει να εκφράζει κάποια εσωτερική ιδιότητα του ανόργανου συστατικού παρά ένα χωρικό περιορισμό ο οποίος επιβάλλεται από τη βιολογία, αφού και οι κρύσταλλοι συνθετικού βιοαπατίτη οι οποίοι σχηματίζονται σε ψευδοφυσιολογικές συνθήκες έχουν το ίδιο σχήμα. Η πιο αληθοφανής εξήγηση γι αυτό είναι ότι το ανόργανο συστατικό το οποίο σχηματίζεται πρωταρχικά μοιάζει με το φωσφορικό οκτασβέστιο (octacalcium phosphate, OCP) παρά με τον βιολογικό απατίτη. Το OCP σε φυσιολογικές συνθήκες σχηματίζει κρυστάλλους σε σχήμα πλάκας, και τα δύο αυτά ανόργανα συστατικά είναι σχεδόν όμοια αν εξαιρέσουμε ότι το OCP έχει ένα ένυδρο επίπεδο παράλληλο στο c άξονα σταθεροποιημένο μέσα στο πλέγμα. Κατά τη διάρκεια της κρυστάλλωσης αυτό το ένυδρο επίπεδο ίσως να μειώνει την ανάπτυξη του κρυστάλλου στις δύο διευθύνσεις, καταλήγοντας στο σχηματισμό μιας πλάκας απατίτη. Στην πραγματικότητα, ανάλυση με υψηλής διακριτικότητας ΤΕΜ έχει δείξει την ύπαρξη ατέλειας ίδιας με αυτή του OCP στο κέντρο των συνθετικών κρυστάλλων του βιολογικού απατίτη [13]. Ο ποιο άμεσος τρόπος για να μετρήσουμε το μέγεθος των κρυστάλλων αυτών είναι με την μικροσκοπία ΤΕΜ παρατηρώντας τους κρυστάλλους κατά την αφαίρεσή τους από το οργανικό πλέγμα. Σχήμα 1.5: Μεμονωμένοι κρύσταλλοι βιολογικού απατίτη από ανθρώπινο οστό [14]. 17

25 Κολλαγόνο Κεφάλαιο 1 ο Το κολλαγόνο και τα διάφορα είδη του είναι μια οικογένεια ινωδών πρωτεϊνών που εμφανίζεται σε όλους τους πολυκύτταρους οργανισμούς. Είναι η πιο άφθονη πρωτεΐνη των θηλαστικών και αποτελεί το ένα τέταρτο της συνολικής πρωτεΐνης του ανθρώπινου οργανισμού. Το κολλαγόνο είναι το βασικό ινώδες συστατικό του δέρματος, των οστών, των τενόντων, του χόνδρου, των αγγείων και των δοντιών. Υπάρχει σε όλα σχεδόν τα όργανα των θηλαστικών και είναι ένα μακρομόριο το οποίο εμφανίζει την ιδιαιτερότητα να φτιάχνει αδιάλυτες ίνες με μεγάλη αντοχή στον εφελκυσμό. Ο ρόλος του στον οργανισμό είναι βασικά δομικός. Δίνει αντοχή και διατηρεί την ακεραιότητα της δομής του συνδετικού ιστού και των οργάνων του σώματος. Βρίσκεται μέσα στο συνδετικό ιστό όχι σαν απομονωμένο μόριο, αλλά ως συστατικό του πολύπλοκου συστήματος του ιστού, που περιλαμβάνει και διάφορα άλλα μακρομόρια όπως ελαστίνη, γλυκοπρωτεΐνες και γλυκολιπίδια. Χρησιμεύει για να συγκρατεί τα κύτταρα σε ευδιάκριτες λειτουργικές κυτταρικές ομάδες. Το κολλαγόνο είναι μια από τις πιο γνωστές επιμήκεις πρωτεΐνες. Η βασική δομική μονάδα του κολλαγόνου αποτελείται από τρεις παράλληλες πολυπεπτιδικές α- αλυσίδες, δηλαδή αλυσίδες που έχουν ελικοειδή διαμόρφωση. Οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες εκτείνονται σε όλο το μήκος του μορίου και έχουν τα αμινοτελικά άκρα τους στην ίδια πλευρά. Οι τρεις αλυσίδες ελίσσονται μεταξύ τους με τη μορφή τριπλής έλικας, βήματος 9nm περίπου σχηματίζοντας ένα άκαμπτο καλώδιο και κάνοντας την ανθεκτικότητα του κολλαγόνου πολύ μεγάλη. Με αυτό τον τρόπο σχηματίζεται ένα μόριο που μοιάζει με ράβδο, μήκους 300nm περίπου, διαμέτρου 1,4 nm, 3,3 αριθμό αμινοξέων ανά περιστροφή της έλικας και μοριακού βάρους (Σχήμα 1.6). 18

26 Κεφάλαιο 1 ο Σχήμα 1.6: Σχηματική αναπαράσταση της διαμόρφωσης μιας ίνας κολλαγόνου [15]. Το μέγεθος και η σύνθεση των αλυσίδων εξαρτάται από τον τύπο του κολλαγόνου. Οι ζώντες οργανισμοί περιέχουν διάφορες μορφές κολλαγόνου που κατατάσσονται σε πάνω από δώδεκα χαρακτηριστικούς τύπους, των οποίων η μοριακή δομή και η κατανομή στο σώμα φαίνονται στον πίνακα 1.1. Πιο πολύ έχει μελετηθεί το κολλαγόνο τύπου Ι, γιατί είναι ο πιο συχνά εμφανιζόμενος τύπος στα ανώτερα σπονδυλωτά. Το μόριο του κολλαγόνου τύπου Ι αποτελείται από δύο ίδιες α1(ι) * αλυσίδες και μια α2(ι) αλυσίδα η οποία έχει διαφορετική αλληλουχία αμινοξέων. Οι άλλοι τύποι κολλαγόνου όπως ο τύπος ΙΙΙ έχουν τρεις ίδιες αλυσίδες, ενώ ο τύπος V μπορεί να περιέχει και δύο διαφορετικές αλυσίδες. * Η α1(ι) αλυσίδα του περιέχει 1055 αμινοξέα, εκ των οποίων τα 1014 βρίσκονται στην περιοχή της τριπλής έλικας και επαναλαμβάνονται με τη μορφή Gly-X-Y, τα 16 στο αμινοτελικό άκρο και τα 25 στο καρβοξυτελικό άκρο. Η α2(ι) αλυσίδα του περιέχει 1029 συνολικά αμινοξέα με λιγότερα στο αμινοτελικό και στο καρβοξυτελικό άκρο της. Η απόσταση D, είναι η απόσταση μεταξύ των αμινοξέων σε αξονική διεύθυνση και είναι D=0,29nm. 19

27 Κεφάλαιο 1 ο Πίνακας 1.1 Μοριακή δομή και κατανομή στο σώμα των διαφόρων τύπων κολλαγόνου. Τύπος κολλαγόνου Πολυπεπτιδικές αλυσίδες Κατανομή στο σώμα I α1(ι), α2(ι) Δέρμα, τένοντες, οστά, κ.λ.π. II α1(ii) Χόνδρος III α1(iii) Μεγάλα αγγεία αίματος IV α1(ιv), α2(ιv), α3(iv), α4(iv), α5(iv), α6(iv) Βασική μεμβράνη V α1(v), α2(v), α3(v) Εμβρυϊκές μεμβράνες VI α1(vi), α2(vi), α3(vi) Δέρμα, χόνδρος, αγγεία VII α1(vii) Μεμβράνη του επιθηλιακού ιστού VIII α1(viii), α2(viii) Descemet s μεμβράνη IX α1(ιx), α2(ιx), α3(ix) Χόνδρος, υαλοειδές υγρό οφθαλμού X α1(x) Οδοντοστοιχία XI α1(xi), α2(xi), α3(xi) Χόνδρος, οστά, πλακούντας XII α1(xii) Δέρμα, εμβρυϊκός τένοντας XIII α1(xiii) Διάφοροι ιστοί XIV α1(xiv) Εμβρυϊκό δέρμα και τένοντες XV α1(xv) Ινοβλάστες XVI α1(xvi) Ινοβλάστες XVII α1(xvii) Επιθηλιακά ημιδεσμοσωμάτια XVIII α1(xviii) Ήπαρ, πνεύμονες 20

28 Βιοσύνθεση κολλαγόνου Κεφάλαιο 1 ο Τα κύτταρα που παράγουν κολλαγόνο είναι οι ινοβλάστες, οι οστεοβλάστες, οι χονδροβλάστες και οι οδοντοβλάστες. Το κολλαγόνο δημιουργείται ενδοκυτταρικά από μια σειρά αντιδράσεων. Πρώτα σχηματίζονται οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες και στη συνέχεια γίνεται η υδροξυλίωση της προλίνης και της λυσίνης. Αυτό γίνεται γιατί η υδροξυπρολίνη και η υδροξυλυσίνη δεν προστίθενται στην πολυπεπτιδική αλυσίδα με το συνηθισμένο τρόπο πρωτεϊνοσύνθεσης. Στις υδροξυλυσίνες που δημιουργήθηκαν προστίθενται ενζυμικά, σάκχαρα όπως η γλυκόζη και η γαλακτόζη. Οι υδατάνθρακες αυτοί συνδέονται ομοιοπολικά με το κολλαγόνο. Αφού οι ανώριμες πολυπεπτιδικές αλυσίδες υδροξυλιώνονται και γλυκοξυλιώνονται, τότε σχηματίζεται η τριπλή έλικα. Το προϊόν της σύνθεσης αυτής ονομάζεται προκολλαγόνο και είναι μια πρωτεΐνη αρκετά μεγαλύτερη από το κολλαγόνο. Η σύνθεση του προκολλαγόνου γίνεται στα ριβοσωμάτια και είναι το πρόδρομο μόριο του κολλαγόνου. Οι δέσμες του προκολλαγόνου εκκρίνονται στον εξωκυττάριο χώρο όπου οι πρωτεάσες κόβουν τα μη ελικοειδή άκρα που είναι χαρακτηριστικά για το προκολλαγόνο. Τα μόρια του κολλαγόνου που προκύπτουν συγκροτούνται σε σειρές μετατοπισμένες η μια προς την άλλη και δίνουν τις ίνες του κολλαγόνου, οι οποίες συναθροίζονται και σχηματίζουν τα ινίδια. Εδώ σχηματίζονται και οι χιαστοί δεσμοί. Το ασυνήθιστο χαρακτηριστικό που έχει το κολλαγόνο σε σχέση με άλλες πρωτεΐνες είναι το ότι συντίθενται από έναν πρόδρομο, το προκολλαγόνο το οποίο υφίστανται μια σειρά από τροποποιήσεις για να σχηματιστεί το τελικό μόριο που είναι το κολλαγόνο. Προκολλαγόνο Οι τρεις αλυσίδες του προκολλαγόνου (προ α-αλυσίδες) είναι μακρύτερες από τις α αλυσίδες του κολλαγόνου γιατί περιέχουν πρόσθετα πεπτίδια στα αμινοτελικά άκρα τους. Τα μη ελικοειδή αμινοτελικά άκρα ξεχωρίζουν από τα καρβοξυτελικά, επειδή περιέχουν δισουλφιδικούς δεσμούς μέσα στην ίδια την αλυσίδα. Επίσης είναι δομικά πιο 21

29 Κεφάλαιο 1 ο πολύπλοκα καθώς περιέχουν ένα τμήμα μικρής τριπλής έλικας, σφαιρικές περιοχές και ένα μικρό μη ελικωτό τμήμα αμινοξέων. Οι μη ελικωτές προεκτάσεις του μορίου του προκολλαγόνου είναι πιθανόν να παίζουν καθοριστικό ρόλο στην πορεία εξέλιξης και δημιουργίας του τελικού μορίου. Οι ελικωτές προεκτάσεις μπορεί να είναι απαραίτητες για την ευθυγράμμιση των αλυσίδων και το σωστό σχηματισμό της τριπλής έλικας. Σύνθεση του κολλαγόνου Το προκολλαγόνο εκκρίνεται στον εξωκυττάριο χώρο, όπου οι προ α-αλυσίδες διασπώνται από ειδικές πρωτεάσες που λέγονται πεπτιδάσες. Για κάθε τύπο κολλαγόνου υπάρχει μια για το αμινοτελικό άκρο και μια άλλη για το καρβοξυτελικό άκρο. Στο καρβοξυτελικό άκρο τα τρία πεπτίδια αποσπώνται ως ένα, για να δώσουν το μόριο του κολλαγόνου επειδή συνδέονται με δισουλφιδικούς δεσμούς (Σχήμα 1.7). Σχήμα 1.7: Σχηματικό διάγραμμα της μετατροπής του προκολλαγόνου σε κολλαγόνο. Οι καρβοξυτελικές περιοχές των τριών αλυσίδων του προκολλαγόνου συνδέονται με δισουλφιδικούς δεσμούς [16]. 22

30 Κεφάλαιο 1 ο Τα μόρια κολλαγόνου που σχηματίζονται, συγκεντρώνονται σε ίνες κολλαγόνου. Η διεργασία σταθεροποίησης του κολλαγόνου γίνεται στα νεοσχηματιζόμενα ινίδια, με το σχηματισμό των χιαστών δεσμών (cross links) [17],[18]. Οι χιαστοί δεσμοί είναι ομοιοπολικοί δεσμοί, δημιουργούνται τόσο μέσα στις αλυσίδες, όσο και ανάμεσα στα γειτονικά μόρια του κολλαγόνου και σχηματίζονται από τα αμινοξέα της λυσίνης και της υδροξυλυσίνης. Με αυτόν τον τρόπο οι αλυσίδες και τα γειτονικά μόρια συνδέονται μεταξύ τους και σχηματίζεται ένα πλέγμα το οποίο αυξάνει την αντοχή και τη χημική αντίσταση του κολλαγόνου (Σχήμα 1.8). Σχήμα 1.8: Σχηματική αναπαράσταση των χιαστών δεσμών ανάμεσα στις αλυσίδες και ανάμεσα στα μόρια του κολλαγόνου [19]. 23

31 Δομή των ινιδίων του κολλαγόνου Κεφάλαιο 1 ο Τα μόρια του κολλαγόνου, όπως αναφέραμε, συγκεντρώνονται και σχηματίζουν τα ινίδια των οποίων η δομή σταθεροποιείται με τη βοήθεια των χιαστών δεσμών. Αν εξετάσουμε τα ινίδια του κολλαγόνου στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο κατά μήκος του άξονά τους, θα παρατηρήσουμε ότι αποτελούνται από επαναλαμβανόμενα τμήματα μήκους D [20]. Τα μόρια στο ινίδιο διατάσσονται με την ίδια διεύθυνση και φορά και είναι προσανατολισμένα έτσι ώστε να είναι σχεδόν παράλληλα με τον άξονα του ινιδίου (Σχήμα 1.9). Σχήμα 1.9: Τα βέλη στο παραπάνω σχήμα είναι η διαγραμματική απεικόνιση των μορίων του κολλαγόνου. Τα μόρια μιας σειράς έχουν μετακινηθεί κατά το ένα τέταρτο του μήκους τους σε σχέση με την προηγούμενη. Οι κενοί χώροι μιας σειράς που είναι οι περιοχές έλλειψης μορίων πιθανολογείται ότι απαρτίζουν τις θέσεις πυρήνωσης κατά τον σχηματισμό των οστών [3]. 24

32 Κεφάλαιο 1 ο Πλέγμα κολλαγονούχων ινών και κρυστάλλων βιοαπατίτη Πιθανολογείται ότι οι κρύσταλλοι του βιολογικού απατίτη σχηματίζονται στα μιτοχόνδρια και στις κυψελίδες της θεμέλιας ουσίας. Οι κρύσταλλοι αυτοί αρχικά εναποτίθενται μέσα στις κολλαγονούχες ίνες και έχουν μεταξύ τους κάποια απόσταση. Ο κρύσταλλος του βιολογικού απατίτη έχει σχήμα σχεδόν παραλληλόγραμμου [1],[21]. Με τη βοήθεια της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας και της περίθλασης ακτίνων Χ, παρατηρήθηκε ότι οι κατά μήκος άξονες των κρυστάλλων που είναι τοποθετημένοι μέσα στην ίνα κολλαγόνου είναι παράλληλοι τόσο μεταξύ τους, όσο και με τον άξονα της ίνας μέσα στην οποία είναι τοποθετημένοι (Σχήμα 1.10). Με το πέρασμα του χρόνου όλο και περισσότεροι κρύσταλλοι εναποτίθενται τόσο στις κολλαγονούχες ίνες όσο και στο γύρω περιβάλλον, με αποτέλεσμα να επιτυγχάνεται σταδιακά η ασβεστοποίηση του οστίτη ιστού σε συνάρτηση με το χρόνο (Σχήμα 1.11). Σχήμα 1.10: Σχηματική απεικόνιση α) συμπλέγματος ινιδίων κολλαγόνου στο οποίο είναι ευδιάκριτες οι περιοχές έλλειψης και οι περιοχές αλληλοεπικάλυψης και β) του συμπλέγματος αυτού με εναποτιθέμενους κρυστάλλους υδροξυαπατίτη σε παράλληλη διαμόρφωση [14]. 25

33 Κεφάλαιο 1 ο Σχήμα 1.11: Αναπαράσταση ανάπτυξης κρυστάλλων βιολογικού απατίτη κατά μήκος μιας ίνας κολλαγόνου κατά το πέρας του χρόνου [22]. 26

34 Παθήσεις οστών Κεφάλαιο 2 ο Η διατήρηση των βιολογικών και μηχανικών ιδιοτήτων του σκελετού επιτυγχάνεται με τη συνέργεια πολλών ρυθμιστικών παραγόντων. Τα οστά έχουν προφανείς εμβιομηχανικές λειτουργίες: την προστασία και υποστήριξη των μαλακών μορίων και τη μεταφορά φορτίων από το ένα σημείο του σώματος στο άλλο. Ο οστίτης ιστός είναι επίσης υπεύθυνος για την για την ομοιοστασία του ασβεστίου και των άλλων μεταλλικών ιόντων. Παρά την μηχανική του σταθερότητα, το οστούν βρίσκεται σε μια διαρκή δυναμική κατάσταση, μεταβάλλοντας τόσο την εσωτερική του δομή όσο και το σχήμα του, ανταποκρινόμενο στις συνεχείς μεταβολές των φορτίων και των απαιτήσεων του μεταβολισμού των μετάλλων. Όλες αυτές οι ανακατανομές της σύνθεσης και της δομής των οστών γίνονται με τη δράση ειδικών κυττάρων, που υπόκεινται σε ορμονικούς αλλά και τοπικούς μηχανισμούς ρύθμισης όπως έχουμε ήδη αναφέρει λεπτομερώς σε παραπάνω εδάφιο. Οι τοπικοί μηχανισμοί με τη σειρά τους ρυθμίζονται από τις μεταβολές των συγκεντρώσεων των ιόντων των μεταλλικών στοιχείων. Στο κεφάλαιο αυτό θα γίνει απαρίθμηση και περιγραφή των μεταβολικών νοσημάτων των οστών, δηλαδή των συστηματικών διαταραχών του σκελετού, που οφείλονται στην απορρύθμιση του πολύπλοκου μηχανισμού ομοιόστασης του ασβεστίου και παραγωγής απορρόφησης οστίτη ιστού και διαταραχές ανάπτυξης του σκελετού [23]. Οστεοπόρωση Παθοφυσιολογία Μια από τις πιο διαδεδομένες νόσους των οστών είναι η οστεοπόρωση. Τι είναι όμως η οστεοπόρωση και ποιοι οι παράγοντες εκείνοι που την καθιστούν ως τη σιωπηλή ασθένεια των οστών; Η επικρατούσα άποψη για την οστεοπόρωση (Σχήμα 2.1) είναι ότι αποτελεί μια διαταραχή που αφορά στην ποσότητα της οστέινης ουσίας και την κατανομή της στο 27

35 Κεφάλαιο 2 ο σκελετό. Δεδομένης της συνεχούς ανακατασκευαστικής δραστηριότητας του οστίτη ιστού, η ποσοτική διαταραχή προκύπτει από αυξημένη οστική απώλεια ή από ελαττωμένη εναπόθεση οστέινης ουσίας φυσιολογικής σύστασης. Η διαταραχή του ισοζυγίου σύνθεσης απορρόφησης (remodeling imbalance), οφείλεται σε δυσλειτουργία της σύζευξης μεταξύ οστεοβλαστικής και οστεοκλαστικής δραστηριότητας λόγω μεταβολών στην έκλυση κυτοκινών και συστηματικών ορμονών. Σχήμα 2.1: Απεικόνιση α)φυσιολογικού και β)οστεοπορωτικού τμήματος σπογγώδους οστού [24]. Σύμφωνα με τη θεωρία της στοιχειώδους οστικής ανακατασκευής, οι μηχανισμοί με τους οποίους αυξάνεται η οστική απώλεια, είναι η αύξηση της συχνότητας ενεργοποίησης και/ή η αύξηση του στοιχειώδους οστικού ελλείμματος κατά το τέλος κάθε κύκλου ανακατασκευής. Λέγοντας όμως συχνότητα ενεργοποίησης (activation frequency) εννοούμε το μέσο χρονικό διάστημα που μεσολαβεί μεταξύ δύο διαδοχικών κύκλων οστικής ανακατασκευής στην ίδια θέση της οστικής επιφάνειας. Η συχνότητα ενεργοποίησης είναι ο καλύτερος ιστολογικός δείκτης του ρυθμού της οστικής ανακατασκευής σε μια επιφάνεια και ο κύριος παράγοντας που προσδιορίζει την οστική εναλλαγή (bone turnover). Ως οστική εναλλαγή ορίζεται ο όγκος του οστίτη ιστού που αποδομείται και αντικαθίσταται κατά την ανακατασκευή. Εξαρτάται από τη συχνότητα 28

36 Κεφάλαιο 2 ο ενεργοποίησης και από το λόγο επιφάνειας οστού προς τον όγκο του. Έτσι η οστική εναλλαγή είναι μεγαλύτερη στο σπογγώδες τμήμα του οστού, το οποίο χαρακτηρίζεται από μεγαλύτερη οστική επιφάνεια ανά μονάδα όγκου, σε σύγκριση με το συμπαγές τμήμα. Η συχνότητα ενεργοποίησης εξαρτάται από το ρυθμό εμφάνισης νέων βασικών μικροκατασκευαστικών μονάδων (BSU) αλλά και από την απόσταση στην οποία εκτείνεται η προϊούσα απορρόφηση σε μια ορισμένη μονάδα. Αυξημένη πρόοδος ή βάθος οστικής απορρόφησης ή αυξημένη εμφάνιση ενεργών θέσεων απορρόφησης που συνεπάγεται αυξημένη οστική εναλλαγή και αυξημένη απορρόφηση, ή χαμηλή οστική εναλλαγή με ελαττωμένη εναπόθεση νέου οστού από τους οστεοβλάστες, οδηγούν σε οστική απώλεια [25]. Η οστεοπόρωση χαρακτηρίζεται συνήθως από αυξημένη οστική εναλλαγή. Το βάθος απορρόφησης θεωρείται ότι δεν αυξάνεται, μολονότι η οιστρογονική ανεπάρκεια προκαλεί καθυστερημένη απόπτωση οστεοκλαστών. Ασθενείς με οστεοπορωτικά κατάγματα και χαμηλή οστική πυκνότητα εμφανίζουν αυξημένη συχνότητα ενεργοποίησης, παράταση της προόδου της απορρόφησης και αρνητικό ισοζύγιο ανακατασκευής που οφείλεται σε ανεπαρκή οστική σύνθεση. Η σταδιακή μείωση της παραγωγής οιστρογόνων από τις ωοθήκες κατά την εμμηνόπαυση προκαλεί αύξηση στην προσέλευση προγονικών οστεοκλαστικών κυττάρων και στη διαφοροποίησή τους, και επαγωγή της ενεργοποίησης των ανενεργών οστεοκλαστών. Αυτά έχουν ως αποτέλεσμα την αύξηση της προόδου της απορρόφησης και της συχνότητας ενεργοποίησης. Επίσης προκαλεί μείωση της απόπτωσης με αποτέλεσμα αύξηση της προόδου και του βάθους απορρόφησης. Για πολλούς λόγους η αύξησης του ρυθμού οστικής απορρόφησης δεν συνοδεύεται από αντίστοιχη ισόποση αύξηση της οστικής σύνθεσης. Είναι πιθανόν ότι η πρόοδος της ηλικίας προδιαθέτει σε ελάττωση του αριθμού των πολυδύναμων στρωματικών κυττάρων που διαφοροποιούνται σε οστεοβλάστες κι αυτό οδηγεί σε μείωση της οστικής σύνθεσης. Επιπλέον υπάρχουν ενδείξεις ότι η οστεοπόρωση συνοδεύεται και από ποιοτική διαταραχή της ανακατασκευής. Από έρευνες που έχουν γίνει [26] έχει βρεθεί σε οστεοπορωτικούς ασθενείς ότι το κλάσμα ανόργανης ουσίας ανά γραμμάριο οστίτη ιστού είναι ελαττωμένο, ενώ η σύνθεση της ανόργανης ουσίας είναι διαφορετική, με την 29

37 Κεφάλαιο 2 ο περιεκτικότητα σε άνθρακα και την αναλογία ασβεστίου/φωσφόρου να είναι ελαττωμένα, ενώ η περιεκτικότητα νατρίου και μαγνησίου αυξημένη. Θεωρητικά, οποιοσδήποτε παράγοντας τοπικός ή συστηματικός που επηρεάζει τη διαφοροποίηση και το μεταβολισμό των οστικών κυττάρων, μπορεί να οδηγήσει σε οστεοπόρωση. Είναι πάντως γενικά αποδεκτό ότι οι τοπικοί παράγοντες παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της οστεοπόρωσης, δρώντας απευθείας αλλά και ως μεσολαβητές μέσω των οποίων επιτυγχάνεται και η δράση των συστηματικών ορμονών, όπως για παράδειγμα των οιστρογόνων. Έτσι, η οστεοπόρωση σε κυτταρικό επίπεδο, είναι αποτέλεσμα της τροποποίησης κάποιων τοπικών παραγόντων που ελέγχουν τη διαδικασία της κυτταρικής διαφοροποίησης και της αλληλεπίδρασης μεταξύ κυττάρων και θεμέλιας ουσίας κατά την οστική ανακατασκευή. Σύμφωνα με αυτά, είναι πιθανό διαφορετικοί ασθενείς να παρουσιάζουν διαφορετικές κυτταρικές και βιοχημικές διαταραχές που έχουν ως κοινή εκδήλωση την ευθραυστότητα του σκελετού. Η ασθένεια της οστεοπόρωσης δεν είναι εμφανής γιατί είναι ανώδυνη, έως τη στιγμή που εκδηλώνεται με αιφνιδιαστικά κατάγματα στην σπονδυλική στήλη, στο γοφό και τον καρπό του χεριού, που είναι και ο ποιο κοινός τρόπος εμφάνισής της (Σχήμα 2.2). Είναι ασθένεια κυρίως των γυναικών και μάλιστα προχωρημένης ηλικίας. Η νόσος αυτή εμφανίζεται και στον ανδρικό πληθυσμό, αλλά όχι τόσο συχνά και συνήθως οφείλεται στην έλλειψη των ανδρικών ορμονών (τεστοστερόνης) και σε χρόνιο αλκοολισμό. Σχήμα 2.2: Αντιπαραβολή μεταξύ υγιές και οστεοπορωτικού οστού στην σπονδυλική στήλη, στο γοφό και τον καρπό του χεριού αντίστοιχα [27],[28],[29]. 30

38 Κεφάλαιο 2 ο Οι κυριότερες αιτίες που προκαλούν οστεοπόρωση στις γυναίκες είναι η έλλειψη οιστρογόνων που ακολουθεί μετά την εμμηνόπαυση, η πρόωρη εμμηνόπαυση, η αφαίρεση των ωοθηκών (ωοθηκεκτομή) πριν την ηλικία των 45 ετών. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι, παρά το γεγονός ότι όλες οι μεταεμμηνοπαυσιακές γυναίκες έχουν μειωμένα επίπεδα οιστρογόνων, γυναίκες μεταεμμηνοπαυσιακές με οστεοπόρωση είναι πιθανό να έχουν κάποιο ελάττωμα στη διατήρηση του ασβεστίου στα νεφρά, το οποίο και συμβάλει επιπρόσθετα σε μεγαλύτερο ρυθμό οστικής απορρόφησης και είναι η αιτία της οστεοπόρωσής τους. Άλλοι παράγοντες που ενθαρρύνουν την εμφάνιση της νόσου είναι ο αλκοολισμός, το κάπνισμα, οι κακές διατροφικές συνήθειες, οικογένεια με ιστορικό στην ασθένεια, η δίαιτα που είναι χαμηλή σε ασβέστιο, η έντονη αθλητική δραστηριότητα σε σημείο που να προκαλεί την παύση της έμμηνου ρύσης, η έλλειψη σωματικής άσκησης, οι ορμονικές ανωμαλίες όπως υπερπαραθυροειδισμός, οι φαρμακευτικές αγωγές με κορτικοστεροειδή και η μικρή σωματική διάπλαση [11],[30],[31],[32],[33,]. Κολλαγόνο και οστεοπόρωση Είναι γνωστό από πολλούς ερευνητές ότι η ποσότητα κολλαγόνου του δέρματος και η οστική πυκνότητα μειώνονται κατά τη γήρανση στις γυναίκες, καθώς επηρεάζονται από την έλλειψη παραγωγής οιστρογόνων από τις ωοθήκες [34],[35]. Καθώς το δέρμα και τα οστά είναι συνδετικοί ιστοί που το κύριο οργανικό συστατικό τους είναι κολλαγόνο τύπου Ι, υποστηρίζεται ότι η λέπτυνση του δέρματος και η οστική απώλεια που επέρχονται με τη γήρανση, οφείλονται σε κοινούς γενετικούς μηχανισμούς. Υπάρχουν ενδείξεις ότι το κολλαγόνο τύπου Ι σε μερικούς οστεοπορωτικούς ασθενείς μπορεί να είναι μη φυσιολογικό. Μελέτες σε οστεοπορωτικούς ασθενείς νεαρής ηλικίας, με μεγάλη τάση σε κατάγματα, έδειξαν ότι μπορεί να υπάρχουν μεταλλαγές στα γονίδια του κολλαγόνου τους, ενώ περαιτέρω έρευνα έδειξε ότι οι μεταλλαγές αυτές συναντώνται στους τύπους Ι, ΙΙ ή ΙΙΙ. Οι μεταλλαγές των γονιδίων του κολλαγόνου στους τύπους Ι, ΙΙ, ΙΙΙ, ΙΧ, Χ και ΧΙ μπορούν να προκαλέσουν μια σειρά από ασθένειες των οστών και ανάμεσά τους οστεοπόρωση [36]. 31

39 Κεφάλαιο 2 ο Από πολλούς ερευνητές διαπιστώθηκε, κυρίως με μετρήσεις βιοχημικών δεικτών, ότι η νόσος της οστεοπόρωσης συνδέεται στενά με την αλλοίωση του κολλαγόνου του οργανισμού. Το επίπεδο της ουρικής απέκκρισης αμινοξέων χιαστών δεσμών κολλαγόνου τύπου Ι, καθορίζει τον οστικό μετασχηματισμό και είναι πολύ καλός δείκτης της οστικής απορρόφησης στην οστεοπόρωση [37],[38]. Αξίζει στο σημείο αυτό να τονιστεί ότι στο συμπαγές αλλά και στο σπογγώδες τμήμα οστών οστεοπορωτικών γυναικών παρατηρήθηκε υπερυδροξυλίωση της λυσίνης στο κολλαγόνο τύπου Ι [39]. Επίσης μελέτη των χιαστών δεσμών του κολλαγόνου στην οστεοπόρωση έδειξε ότι υπάρχει μείωση της συγκέντρωσης των χιαστών δεσμών διυδροξυλυσινορλευκίνης στα οστά που οδηγεί σε αυξημένο κίνδυνο καταγμάτων, παρά το γεγονός ότι η πυκνότητα του κολλαγόνου τους δεν διαφέρει από αυτή των αντίστοιχων φυσιολογικών ατόμων [40]. Μεταβολές στην υδροξυλίωση της λυσίνης και στη σταθεροποίηση των χιαστών δεσμών του κολλαγόνου των οστών έχουν παρατηρηθεί με την οστεοπόρωση και είναι πιθανόν οι μεταβολές αυτές να παίζουν κάποιο ρόλο στην παθογένεση της ασθένειας. Επίσης κατά την οστεοπόρωση παρατηρήθηκε μια μικρή μεταβολή στην αναλογία του κολλαγόνου τύπου Ι και σε μερικές περιπτώσεις σημαντική μείωση του κολλαγόνου τύπου VI [41]. Οστεομαλακία Η οστεομαλακία είναι η νόσος εκείνη των οστών η οποία χαρακτηρίζεται από ανεπαρκή ασβεστοποίηση των οστών με συνέπεια τη μαλάκυνσή τους. Αυτό μπορεί να οφείλεται σε έλλειψη ασβεστίου, εκσεσημασμένη υποφωσφαταιμία ή έλλειμμα στο μεταβολισμό της βιταμίνης D, που μπορεί να οφείλεται στη διατροφή, στην ανεπαρκή έκθεση στον ήλιο, στo σύνδρομo δυσαπορρόφησης, στην ελαττωμένη 25-υδροξυλίωση (ηπατική νόσος, αντιεπιληπτική αγωγή) και στην ελαττωμένη 1 α υδροξυλίωση (νεφρική νόσος, νεφρεκτομή, έλλειψη 1 α -υδροξυλάσης). Στις περιπτώσεις αυτές ο οστικός μεταβολισμός επιβραδύνεται και μη ασβεστοποιημένο οστεοειδές εναποτίθεται [23],[42]. 32