ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΒΙΟΜΕΤΑΤΡΟΠΗ ΑΠΟ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΚΥΤΤΤΑΡΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ

Transcript

1 1η ΑΣΚΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΒΙΟΜΕΤΑΤΡΟΠΗ ΑΠΟ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΜΟΝΤΕΛΟΥ Με την παρούσα άσκηση επιτυγχάνεται η προσομοίωση ενός μικρού βιοχημικού μονοπατιού στο οποίο η ουσία Α μετατρέπεται από μικροβιακά κύτταρα στο προϊόν Β. Η πορεία της διεργασίας απεικονίζεται στο Σχήμα 1. ΚΥΤΤΤΑΡΟ Αex Αin Bin Bex ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ Σχήμα 1. Μετατροπή του υποστρώματος Α σε προϊόν Β από μικροβιακά κύτταρα. Οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι οι ακόλουθες: 1. Αex Ain. Είσοδος του υποστρώματος στο εσωτερικό του κυττάρου (R1) 2. Αin Bin. Ενζυμική μετατροπή του υποστρώματος σε προϊόν (R2) 3. Bin Bex. Έξοδος του προϊόντος από το κύτταρο (R3) όπου Α και Β υπόστρωμα και προϊόν, ενώ οι ενδείξεις in και ex αντιστοιχούν σε εσωκυτταρική και εξωκυτταρική συγκέντρωση, αντίστοιχα. Η μετατροπή του υποστρώματος καταλύεται από ένζυμο το οποίο ακολουθεί κλασική κινητική Michaelis-Menten. Η αντίδραση εισόδου του Α στο κύτταρο περιγράφεται από κινητική πρώτης τάξης (Mass action irreversible), δηλαδή η ταχύτητά της είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του υποστρώματος στο περιβάλλον του κυττάρου (Aex). Ο ίδιος κινητικός τύπος (Mass action irreversible) περιγράφει και την έξοδο του προϊόντος Β από το κύτταρο. 1

2 ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΕΣ Προσδιορισμός του μοντέλου Αρχικά καθορίζονται τα διαμερίσματα (Compartments) του νέου μοντέλου που δημιουργείται. Το συγκεκριμένο μοντέλο περιλαμβάνει δύο διακριτά διαμερίσματα (Κύτταρο - Περιβάλλον), τα οποία και καθορίζονται από την επιλογή των Βιοχημικών Παραμέτρων του μοντέλου (Model -> Biochemical -> Compartments). O αρχικός όγκος (Initial Volume) και στις δύο περιπτώσεις, ορίζεται ίσος με 1 ml. Από τις Βιοχημικές Παραμέτρους του μοντέλου (Model -> Biochemical -> Reactions), εισάγονται οι 3 αντιδράσεις όπως αυτές έχουν περιγραφεί ανωτέρω, ενώ ορίζονται και οι κινητικοί τους τύποι από την επιλογή Rate Law. Οι σταθερές πρέπει να λάβουν τις ακόλουθες τιμές: R1: k1=0.1 (Mass action irreversible) R2: Km=1, V=1 (Henri Michaelis-Menten) R3: k1=0.1 (Mass action irreversible) Αφού οριστούν οι αντιδράσεις, στο μενού Species (Model -> Biochemical -> Species) έχουν καθοριστεί αυτομάτως και οι εμπλεκόμενοι μεταβολίτες. Ορίζονται οι αρχικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών καθώς και το διαμέρισμα στο οποίο εντοπίζονται με βάση τα δεδομένα του παρακάτω πίνακα: Name Compartment Type Initial Concentration (mmol/ml) Aex ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ reactions 10 Ain ΚΥΤΤΑΡΟ reactions 0 Bin ΚΥΤΤΑΡΟ reactions 0 Bex ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ reactions 0 Το μοντέλο αποθηκεύεται (File -> Save as) ώστε να είναι διαθέσιμο για μελλοντική χρήση. Από την επιλογή Model -> Biochemical -> Parameter Overview πραγματοποιείται ο τελικός έλεγχος του μοντέλου που δημιουργήθηκε. Επιλογή εργασιών της διαδικασίας προσομοίωσης Ως τρόπος επίλυσης του μοντέλου ορίζεται η επιλογή Time Course (Tasks -> Time Course). Ο συνολικός χρόνος προσομοίωσης (Duration) ορίζεται στα 10 sec και τα μεσοδιαστήματα δειγματοληψίας (Intervals) σε 50. 2

3 Οι παράμετροι προς παρακολούθηση για το συγκεκριμένο μοντέλο είναι ο χρόνος (Time), οι μεταβατικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών (Transient Concentrations) [Ain]t, [Aex]t, [Βin]t και [Βex]t, καθώς και οι ροές των αντιδράσεων (Reaction Fluxes) (R1).Flux, (R2).Flux και (R3).Flux. Η επιλογή Output Assistant προσφέρει την δυνατότητα της δημιουργίας γραφημάτων (Plots) των μεταβατικών συγκεντρώσεων και των ροών σε συνάρτηση με το χρόνο. Η επιλογή μπορεί να γίνει είτε μέσα από ένα σύνολο έτοιμων γραφημάτων, είτε ακόμα και μέσω της δυνατότητας δημιουργίας νέου γραφήματος (Create New), προσαρμοσμένου στις ανάγκες του χρήστη. Στην περίπτωση νέου γραφήματος, ο καθορισμός των παραμέτρων οι οποίες θα απεικονίζονται σε αυτό ρυθμίζεται μέσω της επιλογής Output Specifications -> Plots -> Create New, από όπου μπορούν να προστεθούν και νέα (New) γραφήματα. Μετά τον ορισμό των επιθυμητών γραφημάτων, εκτελείται η προσομοίωση μέσω της επιλογής Run στο menu του Time Course, με βάση τα χαρακτηριστικά του μοντέλου που έχει οριστεί και παρουσιάζονται τα αποτελέσματα (Tasks -> Time Course -> Result) καθώς και τα αντίστοιχα γραφήματα που έχει ορίσει ο χρήστης. Κάθε γράφημα προσφέρει την δυνατότητα αποθήκευσης των αποτελεσμάτων ως εικόνες (Save Image) αλλά και ως αρχεία.txt (Save Data). ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ Ποια η συγκέντρωση των μεταβολιτών σε χρόνο 10 sec; Έχει καταναλωθεί το υπόστρωμα στο χρονικό διάστημα που διαρκεί η προσομοίωση; Αυξήστε το χρόνο της προσομοίωσης τόσο ώστε το σύστημα να βρεθεί σε σταθερή κατάσταση και καταγράψτε τις τιμές των συγκεντρώσεων των μεταβολιτών. Ποια η μορφή της καμπύλης που παριστάνει τη χρονική εξέλιξη της συγκέντρωσης κάθε μεταβολίτη; Για κάθε καμπύλη εξηγείστε τι συμβαίνει στα διάφορα χρονικά σημεία. 3

4 Μελετήστε τις μεταβατικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών Ain, Aex, Bin, και τη ροή (R1).Flux. Παρουσιάζει ομοιότητες η καμπύλη της μεταβολής του (R1).Flux με την καμπύλη κάποιου μεταβολίτη και γιατί; Υπάρχει αντίστοιχη ομοιότητα για τις ροές J(R2) και J(R3) με κάποιον από τους μεταβολίτες Ain, Aex, Bin και Bex; Πώς μπορεί να προσομοιωθεί η συνθήκη στην οποία για κάποιο λόγο το προϊόν σταματά να εξέρχεται από το κύτταρο; Στην περίπτωση αυτή ποιες οι τελικές συγκεντρώσεις του προϊόντος Β στο κύτταρο (Βin) και στο περιβάλλον (Bex); Επαναφέρατε τις τιμές των μεταβλητών και τις παραμέτρους που ίσχυαν πριν την τελευταία δραστηριότητα. Ενεργοποιείστε την προσομοίωση για χρόνο 60 sec. Ποιες οι μέγιστες συγκεντρώσεις των μεταβολιτών Α και Β που παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια της προσομοίωσης στο εσωτερικό του κυττάρου; Συγκρίνετε τις προηγούμενες τιμές με τις αντίστοιχες τιμές που προκύπτουν αν η αντίδραση εξόδου του Β από το κύτταρο είναι διεκολυνόμενη από διαμεμβρανικό ένζυμο που ακολουθεί κινητική Henri Michaelis-Menten με τιμές σταθερών Km=1, V=10. Σχολιάστε. 4

5 2η ΑΣΚΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΜΕ ΚΙΝΗΤΙΚΗ MICHAELIS-MENTEN ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΜΟΝΤΕΛΟΥ Η άσκηση αυτή έχει ως στόχο την προσομοίωση της κλασικής ενζυμικής κινητικής Michaelis-Menten. Όπως είναι γνωστό, η περίπτωση αυτή προσεγίζεται με τη σύνθεση των δύο διαδοχικών αντιδράσεων που εμφανίζονται στο Σχήμα 2. E + S k1 k2 ES k3 E + P Σχήμα 2. Μοντελοποίηση ενζυμικής αντίδρασης με κινητική Michaelis-Menten. Η πρώτη αντίδραση με την οποία σχηματίζεται το σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος (ES) είναι αμφίδρομη και ακολουθεί κινητική πρώτης τάξης (mass action reversible), ενώ η δεύτερη κατά την οποία παράγεται το προϊόν P είναι μη αντιστρεπτή και ακολουθεί κινητική πρώτης τάξης (mass action irreversible). ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΕΣ Προσδιορισμός του μοντέλου Eισάγονται οι 2 αντιδράσεις όπως αυτές περιγράφονται στο Σχήμα 2, ενώ ορίζονται και οι κινητικοί τους τύποι από την επιλογή Rate Law. Οι αμφίδρομες αντιδράσεις εισάγονται με το σύμβολο =. Οι σταθερές πρέπει να λάβουν τις ακόλουθες τιμές R1: k1=100, k2=1(mass action reversible) R2: k1=1 (Mass action irreversible) Μέσω της επιλογής Global Quantities (Model -> Biochemical -> Global Quantities) ορίζεται η συνάρτηση υπό το όνομα Κm (Simulation Type: assignment) και μαθηματικό τύπο: ({(R1).k2} + {(R2).k1}) / {(R1).k1} 5

6 Η παραπάνω μαθηματική φόρμουλα καθορίζεται μέσω του εικονιδίου select object. Ορίζονται οι αρχικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών (Species) με βάση τα δεδομένα του παρακάτω πίνακα. Η επιλογή Fixed στην περίπτωση του υποστρώματος αντιστοιχεί σε σύστημα στο οποίο υπάρχει μεγάλη περίσσεια S (μπορεί να επιτευχθεί με συνεχή παροχή). Name Compartment Type Initial Concentration (mmol/ml) E compartment reactions 1 ES compartment reactions 0 S compartment fixed 100 P compartment reactions 0 Το μοντέλο αποθηκεύεται (File -> Save as) ώστε να είναι διαθέσιμο για μελλοντική χρήση. Από την επιλογή Model -> Biochemical -> Parameter Overview πραγματοποιείται ο τελικός έλεγχος του μοντέλου που δημιουργήθηκε. Επιλογή εργασιών της διαδικασίας προσομοίωσης Ως τρόπος επίλυσης του μοντέλου ορίζεται η επιλογή Time Course (Tasks -> Time Course). Ο συνολικός χρόνος προσομοίωσης (Duration) ορίζεται στα 10 sec και τα μεσοδιαστήματα δειγματοληψίας (Intervals) σε 50. Οι παράμετροι προς παρακολούθηση για το συγκεκριμένο μοντέλο είναι ο χρόνος (Time), οι μεταβατικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών (Transient Concentrations) [E]t, [ES]t, [S]t, [P]t, οι ροές των αντιδράσεων (Reaction Fluxes) (R1).Flux, (R2).Flux και η Km. Ερωτήσεις Ποιοι από τους μεταβολίτες εμφανίζουν σταθερή συγκέντρωση ως προς το χρόνο; Ποιου μεταβολίτη η σταθερή συγκέντρωση απαιτεί απαραίτητη προϋπόθεση για την υπόθεση Briggs Haldane (quasi steady-state approximation); 6

7 Τι ποσοστό του ενζύμου βρίσκεται στη μορφή συμπλόκου με το υπόστρωμα (ES); Πώς μεταβάλλεται η τιμή της Km σε συνάρτηση με το χρόνο; Ενεργοποιείστε τη διαδικασία σάρωσης παραμέτρων (Parameter Scan -> Create) για να μελετήσετε τη συμπεριφορά της διεργασίας όταν η αρχική συγκέντρωση του ενζύμου [Εi] πάρει τιμές στο πεδίο (δηλ. min=1, max=100, intervals=1). Επιλεξτε Run από το menu Parameter Scan ώστε να προσομοιωθεί η σάρωση, μελετήστε τα γραφήματα που παράγονται καθώς και τα αντίστοιχα αποτελέσματα σε μορφή.txt (Save Data). o Πώς διαφοροποιούνται οι τελικές συγκεντρώσεις των S, E, P; o Πώς διαφοροποιούνται οι ροές των 2 αντιδράσεων (R1).Flux, (R2).Flux; Αυξήστε τον αριθμό των μεσοδιαστημάτων της σάρωσης (intervals=5) και δημιουργείστε τα αντίστοιχα γραφήματα. Χρησιμοποιώντας τη διαδικασία σάρωσης παραμέτρων (Parameter Scan) βρείτε πώς επηρεάζει την τιμή της Km η μεταβολή (min=1, max=100, intervals=5) καθεμιάς από τις κινητικές σταθερές του μοντέλου [(R1).k1, (R1).k2, (R2).k1]. Ποια σταθερά έχει τη μεγαλύτερη επίδραση; Tip -> Μελετήστε την επίδραση κάθε σταθεράς ξεχωριστά. Η παραγωγή ενός Report που θα περιέχει τις τιμές της Km όπως αυτές διαμορφώνονται με βάση τις τιμές κάθε σταθεράς είναι ιδιαίτερα χρήσιμη. Από την επιλογή Parameter Scan -> Output Assistant μπορείτε να επιλέξετε την εξαγωγή νέου Report (Create New). Eπιλέγξτε τα δεδομένα εξόδου που θα περιέχονται στο Report από το Output Specifications -> Plots -> Create New και τρέξτε την προσομοίωση από το Parameter Scan, αφου πρώτα ορίσετε το όνομα του Report (Parameter Scan -> Report). Επαναλάβετε για κάθε μια από τις σταθερές. Προσομοιώστε την ενζυμική αντίδραση τύπου Michaelis-Menten δημιουργώντας ένα καινούργιο μοντέλο που περιλαμβάνει μια αντίδραση της μορφής S à P και ορίζοντας την κινητική της αντίδρασης από την επιλογή Kinetic types. Οι μεταβλητές που απαιτούνται για το μαθηματικό τύπο της οριζόμενης από το χρήστη κινητικής και η κατηγορία καθεμιάς από αυτές είναι: E modifier k constant S substrate 7

8 Km constant Επιλέγοντας τις ίδιες τιμές για τις παραμέτρους συγκρίνετε τα αποτελέσματα (χρονική εξέλιξη S, P, ροής αντίδρασης) των δύο εναλλακτικών μοντέλων. 8

9 3η ΑΣΚΗΣΗ ΣΥΝΑΓΩΝΙΣΤΙΚΗ ΚΑΙ ΜΗ ΣΥΝΑΓΩΝΙΣΤΙΚΗ ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΕΝΖΥΜΩΝ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΜΟΝΤΕΛΟΥ Σκοπός της παρούσας άσκησης είναι η μοντελοποίηση και σύγκριση δύο βιοχημικών οδών όπου ασκείται συναγωνιστική (competitive) και μη συναγωνιστική (non competitive) παρεμπόδιση της ενζυμικής δράσης. Και στις δύο περιπτώσεις ισχύει η ακολουθία των αντιδράσεων που παρουσιάζεται στο Σχήμα 3. A - B C Σχήμα 3. Βιοχημικό μοντέλο με παρεμπόδιση της ενζυμικής δράσης. Οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι οι ακόλουθες: 1. Α = Β. Ενζυμική μετατροπή του υποστρώματος Α στο ενδιάμεσο προϊόν Β 2. Β = C. Ενζυμική μετατροπή του ενδιάμεσου Β σε τελικό προϊόν C Όπως απεικονίζεται στο σχήμα, το τελικό προϊόν C ασκεί παρεμποδιστική δράση στη μετατροπή του Α σε Β. Η αμφίδρομη αντίδραση μετατροπής του Α σε Β υφίσταται συναγωνιστική παρεμπόδιση στην πρώτη περίπτωση και μη συναγωνιστική παρεμπόδιση στη δεύτερη. Και στις δύο περιπτώσεις η αντίδραση μετατροπής του Β σε τελικό προϊόν C είναι αμφίδρομη και ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten. ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΕΣ Προσδιορισμός του μοντέλου συναγωνιστικής παρεμπόδισης Eισάγονται οι 2 αντιδράσεις όπως αυτές περιγράφονται παραπάνω, ενώ ορίζονται και οι κινητικοί τους τύποι από την επιλογή Rate Law. Οι σταθερές πρέπει να λάβουν τις ακόλουθες τιμές. Ορίζεται αρχικά η R2 για πρακτικούς λόγους. 9

10 R1: Kms=1, Kmp=10, Vf=1, Vr=1, Ki=0.1, Inhibitor=C (Competitive inhibition reversible) R2: Kms=1, Kmp=10, Vf=1, Vr=1 (Reversible Michaelis-Menten) Ορίζονται οι αρχικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών (Species) με βάση τα δεδομένα του παρακάτω πίνακα. Name Compartment Type Initial Concentration (mmol/ml) A compartment reactions 10 B compartment reactions 0 C compartment reactions 0 Το μοντέλο αποθηκεύεται (File -> Save as) ώστε να είναι διαθέσιμο για μελλοντική χρήση. Η προσομοίωση της μη συναγωνιστικής παρεμπόδισης απαιτεί την δημιουργία και δεύτερου μοντέλου, συνεπώς ο διαχωρισμός των δύο μοντέλων και η αποθήκευση κάθε ενός ξεχωριστά μπορεί να διευκολύνει την σύγκριση ανάμεσα στα δύο είδη παρεμπόδισης. Από την επιλογή Model -> Biochemical -> Parameter Overview πραγματοποιείται ο τελικός έλεγχος του μοντέλου που δημιουργήθηκε. Προσδιορισμός μοντέλου μη συναγωνιστικής παρεμπόδισης Για το μοντέλο μη συναγωνιστικής παρεμπόδισης αρκεί μια μικρή τροποποίηση στο αρχείο που έχει ήδη δημιουργηθεί για τη συναγωνιστική παρεμπόδιση. Η τροποποίηση αυτή έγκειται στον ορισμό της κινητικής της πρώτης αντίδρασης (R1) ως Noncompetitive inhibition reversible (Model -> Biochemical -> Reactions -> Rate Law). Αφού λοιπόν δημιουργηθεί αρχικά το πρώτο μοντέλο και αποθηκευτεί, πραγματοποιείται η μετατροπή για την R1, διαμορφώνεται το όνομα του νέου μοντέλου και το μοντέλο αποθηκεύεται εκ νέου με διαφορετικό όνομα αρχείου. Επιλογή εργασιών της διαδικασίας προσομοίωσης 10

11 Ως τρόπος επίλυσης του μοντέλου και στην μια και στην άλλη περίπτωση ορίζεται η επιλογή Time Course (Tasks -> Time Course) αλλά και η προσέγγιση Steady State (Tasks -> Steady State). Για την επίλυση time course: Ο συνολικός χρόνος προσομοίωσης (Duration) ορίζεται στα 300 sec και τα μεσοδιαστήματα δειγματοληψίας (Intervals) σε 50. Οι παραμέτροι προς παρακολούθηση για το συγκεκριμένο μοντέλο είναι ο χρόνος (Time), οι μεταβατικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών (Transient Concentrations) [A]t, [B]t, [C]t, οι ροές των αντιδράσεων (Reaction Fluxes) (R1).Flux, (R2).Flux. Για την επίλυση steady state: Οι παράμετροι προς παρακολούθηση είναι οι συγκεντρώσεις μόνιμης κατάστασης (steady state concentrations) [Α]ss, [Β]ss, [C]ss. Ερωτήσεις Συγκρίνοντας τις τελικές τιμές των συγκεντρώσεων των μεταβολιτών (επίλυση time course) με τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις της επίλυσης steady state, μπορείτε να συμπεράνετε αν στο χρονικό διάστημα που διαρκεί η προσομοίωση το σύστημα έχει φτάσει σε μόνιμη κατάσταση; Απαντήστε και για τα 2 είδη παρεμπόδισης. Συγκρίνετε τις συγκεντρώσεις των μεταβολιτών στη μόνιμη κατάσταση για τα δύο είδη παρεμπόδισης. Να συγκρίνετε τις συγκεντρώσεις που έχουν οι μεταβολίτες στο τέλος της προσομοίωσης της συναγωνιστικής παρεμπόδισης (δηλ. μετά από 300 sec) με τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις στην περίπτωση της μη συναγωνιστικής παρεμπόδισης. Σε ποιο από τα δύο είδη είναι πιο έντονο το φαινόμενο της παρεμπόδισης; Επαναλάβετε την προσομοίωση και για τα δύο είδη παρεμπόδισης χρησιμοποιώντας αυξημένη συγκέντρωση υποστρώματος (μεταβάλλετε τη συγκέντρωση του Α από 10 σε 100). Πώς συγκρίνονται σ αυτήν την περίπτωση οι τελικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών μεταξύ συναγωνιστικής και μη 11

12 συναγωνιστικής παρεμπόδισης; Τι συμπέρασμα εξάγετε για την επίδραση της συγκέντρωσης του υποστρώματος; Επαναφέρετε τη συγκέντρωση του Α στην αρχική τιμή (10) και επαναλάβετε την προσομοίωση και για τα δύο είδη παρεμπόδισης χρησιμοποιώντας αυξημένη συγκέντρωση τελικού προϊόντος C (μεταβάλλετε τη συγκέντρωση του C από 0 σε 2). Πώς συγκρίνονται σ αυτήν την περίπτωση οι τελικές συγκεντρώσεις του υποστρώματος μεταξύ συναγωνιστικής και μη συναγωνιστικής παρεμπόδισης; Τι συμπέρασμα εξάγετε για την επίδραση της συγκέντρωσης του τελικού προϊόντος; Επαναφέρετε τη συγκέντρωση του C στην αρχική τιμή (0) και επαναλάβετε την προσομοίωση και για τα δύο είδη παρεμπόδισης δίνοντας αυξημένη τιμή στη σταθερά παρεμπόδισης (μεταβάλλετε την τιμή του Κi από 0.1 σε 1). Πώς συγκρίνονται σ αυτήν την περίπτωση οι τελικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών μεταξύ συναγωνιστικής και μη συναγωνιστικής παρεμπόδισης; Τι συμπέρασμα εξάγετε για την επίδραση της τιμής του Ki; 12