2

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ, ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ: ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ Κατεύθυνση: ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ Μηχανισµοί ηχανισµοί αναγέννησης και επούλωσης στο δέρµα. Ο ρόλος των stem κυττάρων ιπλωµατική Εργασία ΚΥΡΙΑΚΟΥ ΓΕΩΡΓΙΑ Α.Μ.: 1330 Ιατρός Επιβλέπουσα Καθηγήτρια: Γεωργία Σωτηροπούλου Σωτηροπούλου-Μπονίκου Μπονίκου

2 2

3 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σωτηροπούλου Μπονίκου Γεωργία Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ανατοµίας Πανεπιστηµίου Πατρών Αρώνη Κυριακή Καθηγήτρια Παθολογικής Ανατοµικής Πανεπιστηµίου Αθηνών Μελαχροινού Μαρία Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παθολογικής Ανατοµικής Πανεπιστηµίου Πατρών 3

4 4

5 Στους ανθρώπους που µε βοήθησαν να φτάσω ως εδώ τους γονείς µου 5

6 6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος 13 Εισαγωγή 15 Κεφάλαιο 1: Το δέρµα 17 Λειτουργίες του δέρµατος 17 οµή του δέρµατος 18 Τύποι δέρµατος 19 Επιδερµίδα 20 Στιβάδες επιδερµίδας 20 Κερατίνη 23 Μελανινοκύτταρα 24 Κύτταρα του Langerhans 25 Κύτταρα του Merkel 27 Χόριο 27 Ίνες του χορίου 28 Κύτταρα του χορίου 28 Αγγεία και νεύρα του χορίου 31 Η χοριο επιδερµιδική συµβολή 33 Υποδόριος ιστός 34 Εξαρτήµατα του δέρµατος 35 Τριχοσµηγµατογόνος συσκευή 35 Ιδρωτοποιοί αδένες 39 Νύχια 40 Εµβρυολογία του δέρµατος 41 Η επιδερµίδα 43 Το χόριο και ο υποδόριος ιστός 43 Τα εξαρτήµατα του δέρµατος 45 7

8 Κεφάλαιο 2: Τα stem ( βλαστικά ) κύτταρα 47 Γεγονότα ορόσηµα στο πεδίο των stem κυττάρων 49 Τύποι stem κυττάρων 50 Εµβρυϊκά stem κύτταρα 51 ιάκριση εµβρυϊκών stem κυττάρων 52 Εµβρυϊκά βλαστοκύτταρα και περιορισµοί 54 Σωµατικά stem κύτταρα 55 Φωλεά των stem κυττάρων 57 Ασύµµετρη διαίρεση 60 Μηχανισµοί ασύµµετρης κυτταρικής διαίρεσης 62 Πολυδυναµία 64 Έλεγχος της πολυδυναµίας από µεταγραφικούς παράγοντες και αυτορρυθµιστικό κύκλωµα 64 Χαρακτηριστικά πρόσδεσης στο DNA των παραγόντων Oct4, Sox2 και Nanog 70 Κυτταρικός επαναπρογραµµατισµός 71 Τα micrornas 75 Επαναπρογραµµατισµός µέσω πυρηνικής µεταφοράς 76 Επαναπρογραµµατισµός µέσω σύµπτυξης µε ES κύτταρα 76 Επαναπρογραµµατισµός επαγόµενος από την καλλιέργεια 77 Χρησιµοποίηση των ips στην Ιατρική 78 Επιγενετική 81 Ορισµός 81 Επιγενετικοί µηχανισµοί 82 Επιγενετική και stem κύτταρα 84 Ένα γενετικό επιγενετικό δίκτυο 87 Συστηµική βιολογία των stem κυττάρων 89 Κεφάλαιο 3: Stem κύτταρα στο δέρµα 93 Stem κύτταρα µεταξύ των τριχοθυλακίων της επιδερµίδας 95 8

9 Stem κύτταρα από την περιοχή bulge των τριχοθυλακίων 100 Πολυδυναµία των bulge stem κυττάρων 105 Σηµατοδότηση στα bulge stem κύτταρα 106 Stem κύτταρα των σµηγµατογόνων αδένων 110 Σηµατοδότηση και stem κύτταρα του σµηγµατογόνου αδένα 111 Μεσεγχυµατικά stem κύτταρα 113 Τι είναι τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα; 113 εδοµένα που υποστηρίζουν την ύπαρξη MSCs στο δέρµα 115 Χαρακτηριστικά των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων 116 Πλαστικότητα των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων του δέρµατος 117 Πιθανή διαφοροποίηση προς επιθήλιο 120 Κριτήρια χαρακτηρισµού των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων 121 είκτες επιφανείας των MSCs 122 Σηµατοδοτικά µονοπάτια και µεταγραφικοί παράγοντες 124 Φωλεά και κυκλοφορία των MSCs 126 Παρακρινής λειτουργία των MSCs 129 Αντιαποπτωτικοί παράγοντες 130 Ανοσορρύθµιση 131 Μείωση της παραγωγής ουλής 131 Υποστήριξη της ανάπτυξης και της διαφοροποίησης των αυτόχθονων stem και προγονικών κυττάρων 132 Αγγειογένεση 133 Χηµειοταξία 134 Κεφάλαιο 4: Μηχανισµοί αναγέννησης στο δέρµα 135 Αναγέννηση του δέρµατος 136 Ανανέωση της επιδερµίδας κατά τη διάρκεια της ζωής του ενήλικα 136 Σηµατοδότηση κατά την διαφοροποίηση στην επιδερµίδα 141 Κοινά χαρακτηριστικά των stem κυττάρων του δέρµατος 151 Ασύµµετρη κυτταρική διαίρεση στο δέρµα 154 Κεφάλαιο 5. Μηχανισµοί επούλωσης στο δέρµα 161 Άµεση αντίδραση 163 9

10 Φάση φλεγµονής 165 Φάση αναγέννησης 176 Αγγειογένεση 176 ηµιουργία κοκκιώδους ιστού 178 Ινοπλασία 180 Επιθηλιοποίηση 182 Συστολή της ουλής 185 Μυοϊνοβλάστες 185 Προέλευση 187 Πρωτο-µυοϊνοβλάστες 190 Μηχανισµός διαφοροποίησης 194 είκτες των µυοϊνοβλαστών και διάκρισή τους από άλλα κύτταρα 196 Τερµατισµός της δράσης των µυοϊνοβλαστών 200 Ωρίµανση και αναδιαµόρφωση της ουλής 204 Λύση της διεργασίας της επούλωσης 206 Κεφάλαιο 6. Επούλωση στο δέρµα και stem κύτταρα 209 Εισαγωγή 210 Ο ρόλος των bulge κυττάρων στην επούλωση 212 Μηχανισµοί επούλωσης από τα bulge stem κύτταρα 218 Πως συνεισφέρουν τα bulge stem κύτταρα στην επανεπιθηλιοποίηση; 220 Μεσεγχυµατικά stem κύτταρα και επούλωση 224 Πιθανοί τρόποι δράσης 225 Η συµµετοχή του µυελού των οστών 225 Τα MSCs συµµετέχουν στη δοµική αποκατάσταση της αρχιτεκτονικής του δέρµατος 228 Τύχη των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων στα τραύµατα 232 Μηχανισµοί λειτουργίας των MSCs στην επούλωση του δέρµατος 235 Παρακρινείς παράγοντες των MSCS στην αναγέννηση και επιδιόρθωση του δέρµατος 236 ιαφοροποίηση των MSCs προς πολλαπλούς κυτταρικούς τύπους του δέρµατος

11 Ο ρόλος των ινοκυττάρων στη φυσιολογική και την παθολογική επούλωση 243 Ρύθµιση από τα MSCs των ανοσολογικών αντιδράσεων και των αντιδράσεων απόρριψης 246 Θεραπευτικές χρήσεις των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων 248 Τρόπος εφαρµογής των εξωγενών µεσεγχυµατικών stem κυττάρων 249 Πιθανές θεραπευτικές εφαρµογές των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων του δέρµατος και χρήση τους στην Αναγεννητική Ιατρική 250 Επίλογος 255 Βιβλιογραφία

12 12

13 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η Ιατρική του µέλλοντος αναµένεται να έχει εντελώς διαφορετική µορφή σε σχέση µε την ιατρική που ασκείται στις µέρες µας η οποία χαρακτηρίζεται από την περιστασιακή αντίδραση στο εκάστοτε πρόβληµα που εµφανίζεται, γεγονός που καταλήγει στο να µην λαµβάνονται υπ' όψιν τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του κάθε ασθενή και η θεραπεία να µην εξατοµικεύεται ως προς τις ανάγκες του. Αντιθέτως, η Ιατρική του µέλλοντος αναµένεται να είναι προβλεπτική, εξατοµικευµένη, προληπτική και συµµετοχική (predictive, preventive, personalized, και participatory - 4Ρ). Θα ασκείται δηλαδή πλέον Εξατοµικευµένη Ιατρική, η οποία θα έχει πολλαπλά οφέλη, τα οποία συµπεριλαµβάνουν µεταξύ άλλων την ελάττωση των φαρµακευτικών παρενεργειών [Gurtner et al., 2007]. Η ανθρώπινη νόσος είναι µια κατάσταση η οποία προκύπτει από την απώλεια της λειτουργίας ενός ή περισσοτέρων οργάνων. Είτε η αιτία αυτής της καταστάσεως είναι η ισχαιµία, η µικροβιακή λοίµωξη και το τραύµα, είτε πρόκειται για συγγενή δυσλειτουργία, την ιδανική θεραπεία θα αποτελούσε η αναγέννηση ενός νέου οργάνου ή ιστού το οποίο δύναται να αντικαταστήσει αυτό το οποίο έχει υποστεί την επίδραση του επιβλαβούς ερεθίσµατος [Alonso et al., 2003]. Η Αναγεννητική Ιατρική επικεντρώνεται στην ανάπτυξη νέων θεραπειών προκειµένου να αντικατασταθούν ή να αποκατασταθούν τα πάσχοντα κύτταρα στο ανθρώπινο σώµα, γεγονός που θα οδηγήσει στην αποκατάσταση της φυσιολογικής λειτουργικότητας. Αυτός ο ιδεατός στόχος αρχίζει να αποκτά σάρκα και οστά µέσω συνεργικών προσπαθειών που αφορούν τη µελέτη τόσο της ανάπτυξης του ανθρώπου, όσο και οργανισµών που δεν ανήκουν στην κατηγορία των θηλαστικών καθώς και την έρευνα της βιολογίας των stem (βλαστικών) κυττάρων, της γενετικής, της επιστήµης των υλικών και της εµβιοµηχανικής. Επί του παρόντος, κυριότερος στόχος παραµένει η κατανόηση των υπαρχόντων µηχανισµών αποκατάστασης στον άνθρωπο και η διερεύνηση της σχετικής αναγεννητικής ικανότητας των ιστών, ενώ η δυναµική είσοδος των stem κυττάρων στο επίκεντρο του ενδιαφέροντος της επιστηµονικής κοινότητας αποτελεί το γεγονός που πυροδοτεί µια αλυσίδα συναρπαστικών ανακαλύψεων [Auffray et al., 2009]. 13

14 Παράλληλα, η Συστηµική Βιολογία αναπτύσσεται µε ραγδαίους ρυθµούς και είναι σχεδιασµένη ώστε να διαχειρίζεται αποτελεσµατικά την πολυπλοκότητα των βιολογικών συστηµάτων και τις συµπεριφορές τους σε όλα τα επίπεδα οργάνωσης (ξεκινώντας από µοριακό επίπεδο και καταλήγοντας σε ολόκληρους οργανισµούς), τόσο υπό φυσιολογικές, όσο και υπό διαταραγµένες συνθήκες. Βασίζεται στην κατανόηση των βιολογικών λειτουργιών ως ιδιοτήτων ενός απαρτιωµένου συστήµατος, γεγονός το οποίο διαφέρει από την εξέταση των µεµονωµένων επιµέρους συνιστωσών. Χαρακτηριστικό της είναι το γεγονός ότι συγκεντρώνει τον τεράστιο όγκο δεδοµένων που έχουν αποκτηθεί µέσω της χρήσης πληθώρας τεχνικών, προκειµένου να αναπτύξει προβλεπτικές µαθηµατικές και υπολογιστικές µεθόδους που αφορούν τα λειτουργικά και ρυθµιστικά βιολογικά δίκτυα. Αυτή η ανάπτυξη ισχυρών υπολογιστικών και µαθηµατικών µέσων, σε συνδυασµό µε τη συστηµική προσέγγιση και αποκρυπτογράφηση του τρόπου λειτουργίας των δυναµικών παθοβιολογικών δικτύων που αφορούν τα stem κύτταρα, αναµένεται να οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων και λίαν αποτελεσµατικών θεραπευτικών στρατηγικών στο εγγύς µέλλον [Auffray et al., 2009]. Εικόνα 1. Η µουσική της ζωής. Το θαύµα της ζωής ενός οργανισµού είναι το αποτέλεσµα της άρτια ενορχηστρωµένης επίδρασης µιας µεγάλης ποικιλίας από επιµέρους βιολογικές συνιστώσες [Noble 2006]. 14

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Όπως αναφέρθηκε, η Αναγεννητική Ιατρική επικεντρώνεται στην ανάπτυξη καινοτόµων θεραπειών οι οποίες στόχο έχουν την αποκατάσταση της φυσιολογικής λειτουργικότητας του ανθρωπίνου σώµατος µέσω της αντικατάστασης των κυττάρων που έχουν υποστεί βλάβη από καινούρια και υγιή. Η έρευνα των stem κυττάρων είναι πολλά υποσχόµενη όσον αφορά την ανάπτυξη τέτοιων θεραπευτικών µεθόδων ενάντια σε πλειάδα νόσων που είτε απειλούν τη ζωή, είτε προκαλούν ποικίλου βαθµού αναπηρία και νοσηρότητα [Alonso et al., 2003]. Τα stem κύτταρα αποτελούν έναν πληθυσµό αυτοανανεούµενων, πολυδύναµων κυττάρων που διαθέτει κάποιες χαρακτηριστικές ιδιότητες. Ανάµεσα σε αυτές ξεχωρίζουν η ικανότητα για αυτοανανέωση καθώς και η δυναµική για διαφοροποίηση προς πολλαπλούς κυτταρικούς τύπους µε σηµαίνοντα ρόλο στην οµοιόσταση του οργανισµού [Alison et al.,2009]. Τα stem κύτταρα διαχωρίζονται στα εµβρυϊκά, τα οποία δύνανται να διαφοροποιηθούν προς κάθε πιθανό κυτταρικό τύπο του είδους από το οποίο προέρχονται, και τα σωµατικά stem κύτταρα, τα οποία έχουν πιο περιορισµένο δυναµικό διαφοροποίησης και λειτουργούν σαν φυσική πηγή κυττάρων για την οµοιόσταση και τη επιδιόρθωση σε έναν οργανισµό [Alonso et al., 2003]. Η επούλωση των τραυµάτων είναι µια ουσιώδους σηµασίας φυσιολογική διεργασία. Οσον αφορά το δέρµα, οι µηχανισµοί της επούλωσης έχουν απασχολήσει πληθώρα µελετητών τα τελευταία 100 χρόνια. Αυτό συµβαίνει σε µεγάλο βαθµό διότι το δέρµα είναι ένας ιδιαίτερα σύνθετος ιστός που οι τραυµατισµοί του επηρεάζουν µια πληθώρα δοµών, κυτταρικών στιβάδων και κυτταρικών σειρών. Το τραύµα προκαλεί επίσης βλάβη ακόµα και σε επίπεδο ανεξάρτητων κυττάρων. Η πληθώρα κυτταρικών τύπων που συµµετέχουν στην επούλωση, η πολυπλοκότητα των µηχανισµών, και ο ιδιαίτερος ρόλος που διαδραµατίζουν τα stem κύτταρα σε αυτή τη διαδικασία αποτελούν ελκυστικό πεδίο έρευνας για τα χρόνια που θα επακολουθήσουν [Shaw et al., 2009 ]. Το δυναµικό χρησιµοποίησης των stem κυττάρων στην Αναγεννητική Ιατρική προϋποθέτει την αποµόνωσή τους από το φυσικό τους περιβάλλον, τον 15

16 πολλαπλασιασµό τους σε καλλιέργεια, την πιθανή τροποποίηση ή επαναπρογραµµατισµό τους, και την τοποθέτησή τους εντός του υπό επιδιόρθωση ιστού. Προκειµένου να συµβεί αυτό, ουσιώδους σηµασίας είναι να κατανοήσουµε µε ποιόν τρόπο τα κύτταρα αυτά αλληλεπιδρούν µε το µικροπεριβάλλον τους, που είναι γνωστό ως φωλεά (niche), το οποίο είναι υπεύθυνο για την επιβίωσή τους και την διατήρηση των ιδιοτήτων τους [Fuchs et al., 2004]. Παρ όλο που ο επαναπρογραµµατισµός των σωµατικών stem κυττάρων που είχαν ληφθεί από ανθρώπινους ιστούς φάνταζε αρχικά ως κάτι εξαιρετικά δύσκολο να επιτευχθεί, τα πειράµατα των Takahashi και Yamanaka το 2006 και 2007 µε κύτταρα ποντικού και ανθρώπου αντίστοιχα, κήρυξαν την επανάσταση στον τοµέα της έρευνας των stem κυττάρων καθώς οι ερευνητές κατάφεραν µέσω χρήσης µικρού αριθµού µεταγραφικών παραγόντων να επαναπρογραµµατίσουν τελικώς διαφοροποιηµένα σωµατικά κύτταρα προκειµένου αυτά να αποκτήσουν χαρακτηριστικές ιδιότητες των stem κυττάρων [Takahashi et al., 2006, Takahashi et al., 2007]. Η χρησιµοποίηση των σωµατικών stem κυττάρων στην Αναγεννητική Ιατρική προϋποθέτει την ολοκληρωµένη κατανόηση των µηχανισµών οι οποίοι υποδεικνύουν στα πολυδύναµα αυτά κύτταρα τον τρόπο µε τον οποίο θα αυτοανανεωθούν και θα διαφοροποιηθούν προς κυτταρικές σειρές των ιστών στους οποίους ανήκουν. Το δέρµα αποτελεί ένα εξαιρετικό µοντέλο συστήµατος για διερεύνηση αυτών των µηχανισµών καθώς τα κερατινοκύτταρα του δέρµατος είναι εύκολα προσβάσιµα και αποτελούν έναν από τους λίγους κυτταρικούς πληθυσµούς των ενηλίκων µε ικανότητα συντήρησης και πολλαπλασιασµού in vitro. Τα stem κύτταρα του δέρµατος έχουν ήδη χρησιµοποιηθεί για την αναπλήρωση της απώλειας δέρµατος σε εγκαυµατικές επιφάνειες και πληθώρα νέων θεραπευτικών εφαρµογών τους βρίσκεται υπό έρευνα [Alonso et al., 2003]. Η παρούσα µελέτη αποτελεί βιβλιογραφική ανασκόπηση η οποία επικεντρώνεται τόσο στους µηχανισµούς αναγέννησης και επούλωσης που λαµβάνουν χώρα στο δέρµα, όσο και στον ρόλο τον οποίο διαδραµατίζουν τα stem κύτταρα στην άρτια επιτέλεση αυτών των βιολογικών φαινοµένων. 16

17 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1. ΤΟ ΕΡΜΑ Το δέρµα είναι το µεγαλύτερο όργανο του σώµατος. Πρόκειται για ένα ιδιαίτερα σύνθετο όργανο το οποίο καλύπτει σχεδόν ολόκληρη την επιφάνεια του σώµατος και συνέχεται µε τους βλεννογόνους περιγράφοντας έτσι τις οπές του σώµατος (στοµατική κοιλότητα, πρωκτός κ.λπ.). Το βάρος του είναι ίσο µε το 15 % του συνολικού βάρους του ανθρωπίνου σώµατος και στον ενήλικα η ελεύθερη επιφάνειά του παρουσιάζει έκταση 1,2 2,3 m 2 [Kanitakis 2002, Junqueira et al., 1989]. Εκτελεί ποικίλες ζωτικές λειτουργίες µε σηµαντικότερες την αλληλεπίδραση µε τον περιβάλλοντα κόσµο καθώς και την προστασία από εξωγενή φυσικά, χηµικά και βιολογικά επιβλαβή ερεθίσµατα, κάτι που καθίσταται δυνατόν µέσω της σύνθετης δοµής του που συνδυάζει στοιχεία από τον επιθηλιακό, συνδετικό, αγγειακό, µυϊκό και νευρικό ιστό. [Kanitakis 2002]. ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΟΥ ΕΡΜΑΤΟΣ Το δέρµα επιτελεί πληθώρα λειτουργιών, εκ των οποίων οι σηµαντικότερες είναι: 1. Προστασία. Το δέρµα παρέχει προστασία απέναντι στα χηµικά, µηχανικά και θερµικά επιβλαβή ερεθίσµατα, καθώς και έναντι της υπεριώδους ακτινοβολίας. 2. Θερµορρύθµιση. Στον άνθρωπο τόσο η διατήρηση όσο και η έκλυση θερµότητας είναι ιδιαίτερης σηµασίας για την επιβίωσή του. Το δέρµα αποτελεί ένα σηµαντικό όργανο θερµορρύθµισης. Η µόνωση του σώµατος έναντι της απώλειας θερµότητας πραγµατοποιείται µέσω της παρουσίας των τριχών και του υποδόριου λίπους, ενώ η απώλεια θερµότητας διευκολύνεται µε την εξάτµιση του ιδρώτα από την επιφάνειά του και µε την αύξηση της αιµατικής ροής µέσω του πλούσιου αγγειακού δικτύου του χορίου [Wheater et al., 2002]. 3. Αισθητικότητα. Το δέρµα περιέχει µια πληθώρα υποδοχέων που σχετίζονται µε το άλγος, τη θερµοκρασία, την αφή και την πίεση και αποτελεί το µεγαλύτερο σε µέγεθος αισθητήριο όργανο του ανθρώπου. 4. Μεταβολικές λειτουργίες. Η βιταµίνη D της επιδερµίδας προέρχεται τόσο από τη σύνθεσή της εντός της ίδιας της επιδερµίδας, όσο και από την πρόσληψη τροφής πλούσιας σε βιταµίνη D, ενώ ο υποδόριος ιστός αποτελεί µια µεγάλη αποθήκη 17

18 ενέργειας, κυρίως µε τη µορφή τριγλυκεριδίων [Kierszenbaum 2007, Wheater et al., 2002]. Εκτός όµως από τις ανωτέρω λειτουργίες οι οποίες είναι και οι σηµαντικότερες, το δέρµα εκτελεί και άλλες όπως: 5. Λειτουργία ως φραγµός ύδατος, 6. Μη ειδική άµυνα απέναντι στους µικροοργανισµούς και, 7. Απέκκριση ηλεκτρολυτών [Kierszenbaum 2007]. ΟΜΗ ΤΟΥ ΕΡΜΑΤΟΣ Το δέρµα αποτελείται από δύο στιβάδες, στέρεα συνδεδεµένες µεταξύ τους: 1. Την εξωτερική επιδερµίδα, που προέρχεται από το εξώδερµα µαζί µε τα σχετιζόµενα εξαρτήµατα (τριχοθυλάκια, ιδρωτοποιοί αδένες). 2. Το χόριο ή δερµίδα, που προέρχεται από το µεσόδερµα και χωρίζεται από την επιδερµίδα µέσω της χοριο - επιδερµικής συµβολής. Το χόριο προσφύεται στους υποκείµενους ιστούς µε ένα στρώµα χαλαρού ιστού που ονοµάζεται υποδόριος ιστός ή υποδερµίδα το οποίο περιέχει ποικίλο ποσό λιπώδους ιστού και αντιστοιχεί στην επιπολής στιβάδα της µακροσκοπικής ανατοµικής [Kanitakis 2002, Kierszenbaum 2007]. Τα τριχοθυλάκια, οι ιδρωτοποιοί αδένες, οι σµηγµατογόνοι αδένες και τα νύχια είναι επιθηλιακές δοµές που ονοµάζονται επιδερµιδικά εξαρτήµατα, αφού εµβρυολογικώς προέρχονται από καταδύσεις του επιδερµιδικού επιθηλίου µέσα στο χόριο και τον υποδόριο ιστό [Wheater et al., 2002]. Εικόνα 1.1. Η ανατοµία του δέρµατος. 1. µελανινοκύτταρο, 2. σµηγµατογόνος αδένας, 3. ανελκτήρας µυς της τρίχας, 4. τρίχα, 5. λίπος,6. σωµάτια Pacini, 7. αρτηρίδιο, 8. τριχοθυλάκιο, 9. ιδρωτοποιός αδένας, 10. επιδερµίδα, 11. χόριο (dermis) και, 12.υποδόριος ιστός (subcutaneous tissue) 18

19 Η δοµή του δέρµατος διαφέρει σηµαντικά από το ένα µέρος του σώµατος στο άλλο και οι διαφορές αυτές αφορούν πληθώρα παραµέτρων όπως είναι το πάχος της επιδερµίδας, το µέγεθος, η ποσότητα και η δραστηριότητα των τριχοθυλακίων, καθώς και το είδος και η πυκνότητα των ιδρωτοποιών αδένων και των αισθητικών υποδοχέων [Wheater et al., 2002]. Τύποι δέρµατος Υπάρχουν δύο κύριοι τύποι δέρµατος: 1. Το άτριχο δέρµα,, το οποίο υπάρχει στις παλάµες και τα πέλµατα, και το οποίο εµφανίζει στην επιφάνειά του µοναδικούς ευδιάκριτους σχηµατισµούς, τις αυλακώσεις, οι οποίες δηµιουργούνται λόγω εναλλασσόµενων ακρολοφιών και αυλάκων. Οι σχηµατισµοί αυτοί είναι γνωστοί ως δερµατογλυφικά ή δακτυλικά αποτυπώµατα. Το δέρµα αυτό είναι παχύ (> 5 mm) και στερείται τριχοθυλακίων και σµηγµατογόνων αδένων [McGrath et al., 2004]. 2. Το τριχωτό δέρµ µα, το οποίο είναι λεπτότερο (1 2 mm), καλύπτει την υπόλοιπη επιφάνεια του σώµατος και διαφέρει στις ιδιότητες του από περιοχή σε περιοχή (εικόνα 1.2) [Junqueira et al., 1989, McGrath et al., 2004]. Εικόνα 1.2. Η δοµή του παχεός και του λεπτού δέρµατος, όπως γίνεται εµφανής µέσω των ιστολογικών τοµών. 19

20 Το δέρµα των ανδρών είναι χαρακτηριστικά παχύτερο από αυτό των γυναικών σε όλες τις ανατοµικές περιοχές, ενώ τα παιδιά έχουν σχετικά λεπτό δέρµα, το οποίο σταδιακά αυξάνει σε πάχος µέχρι την τέταρτη ή πέµπτη δεκαετία της ζωής µετά την οποία αρχίζει να γίνεται πιο λεπτό. Αυτή η αραίωση οφείλεται κατά κύριο λόγο σε αλλαγές που λαµβάνουν χώρα στο χόριο [Junqueira et al., 1989]. Επιδερµίδα Η επιδερµίδα αποτελείται κυρίως από πολύστιβο πλακώδες κερατινοποιηµένο επιθήλιο το οποίο αυτοανανεώνεται διαρκώς. Τα κερατινοποιηµένα επιδερµιδικά κύτταρα ονοµάζονται κερατινοκύτταρα και αποτελούν το 90 95% του κυτταρικού πληθυσµού. Το υπόλοιπο 5 10% συνθέτουν κύτταρα µε δενδριτική µορφολογία και αποτελείται από τους πληθυσµούς των µελανινοκυττάρων, των κυττάρων του Langerhans και των κυττάρων του Merkel [Junqueira et al., 1989]. Επιπλέον, πρόσφατες ανοσοϊστοχηµικές µελέτες έχουν αποκαλύψει ότι η επιδερµίδα περιέχει ελεύθερες νευρικές απολήξεις [Kanitakis 1998]. Η ανθρώπινη επιδερµίδα ανανεώνεται κάθε ηµέρες περίπου, ανάλογα µε την περιοχή του σώµατος, την ηλικία και άλλους παράγοντες [Junqueira et al., 1989]. Στιβάδες επιδερµίδας Από το χόριο προς την εξωτερική επιφάνεια, η επιδερµίδα αποτελείται από πέντε στιβάδες κυττάρων (κερατινοκυττάρων) που παράγουν κερατίνη κι έχουν την ακόλουθη διάταξη: 1. Η βασική (ή βλαστική) στιβάδα (stratum basale). Η στιβάδα αυτή αποτελείται από έναν µονό στίχο βασίφιλων κυλινδρικών ή κυβοειδών κυττάρων, τα οποία στηρίζονται στο βασικό υµένα στη χοριοεπιδερµική συµβολή που διαχωρίζει το χόριο από την επιδερµίδα [Junqueira et al., 1989]. Η βασική επιφάνεια κάθε κυττάρου προσφύεται στη βασική µεµβράνη µε πολυάριθµα ηµιδεσµοσώµατα. Όπως και στα κύτταρα της παρακείµενης ακανθωτής στιβάδας, µικρές κυτταροπλασµατικές προσεκβολές εκτείνονται κατά µήκος των µεσοκυττάριων διαστηµάτων και καταλήγουν σε αντίστοιχες προσεκβολές γειτονικών κυττάρων. Τα σηµεία επαφής αυτών συνδέονται µε δεσµοσώµατα [Wheater et al., 2002]. Η στοιβάδα αυτή χαρακτηρίζεται από έντονη µιτωτική 20

21 δραστηριότητα και είναι υπεύθυνη, σε συνδυασµό µε το αρχικό τµήµα της επόµενης στοιβάδας, για τη συνεχή ανανέωση των επιδερµικών στοιβάδων. 2. Η ακανθωτή στιβάδα (stratum spinosum) που αποτελείται από 5 15 στίχους κυττάρων µε έναν κεντρικά τοποθετηµένο πυρήνα και σχήµα κυβοειδές, πολυγωνικό ή µόλις αποπλατυσµένο [Junqueira et al., 1989]. Τα ευδιάκριτα πυρήνια και η κυτταροπλασµατική βασεοφιλία υποδηλώνουν ενεργό πρωτεϊνοσύνθεση. Μια πρωτεΐνη, η κυτταροκερατίνη που αποτελεί το κύριο προϊόν που συντίθεται από αυτά τα κύτταρα συγκεντρώνεται και σχηµατίζει ενδοκυττάρια ινίδια, τα τονοϊνίδια [Wheater et al., 2002]. Τα κύτταρα της στιβάδας αυτής έχουν αποφυάδες γεµάτες από δέσµες τονοϊνιδίων οι οποίες καταλήγουν στα δεσµοσώµατα, και οι οποίες προσδίδουν στα κύτταρα ακανθώδη εµφάνιση κατά την εξέτασή τους µε το φωτονικό µικροσκόπιο. Σε περιοχές που υπόκεινται σε συνεχή τριβή και πίεση (όπως παραδείγµατος χάριν στα πέλµατα), η ακανθωτή στιβάδα της επιδερµίδας είναι παχύτερη και περιέχει πιο άφθονα τονοϊνίδια και δεσµοσώµατα [Junqueira et al., 1989]. Όλες οι µιτώσεις περιορίζονται στη στιβάδα που συχνά αναφέρεται ως µαλπιγγιανή, η οποία αποτελείται τόσο από τη βασική, όσο και από την ακανθωτή στιβάδα [Wheater et al., 2002]. 3. Η κοκκιώδης στιβάδα (stratum granulosum) (3 5 στίχοι) περιλαµβάνει αποπλατυσµένα πολυγωνικά κύτταρα, των οποίων ο πυρήνας είναι γεµάτος από αδρά βασίφιλα κοκκία που δεν περιβάλλονται από µεµβράνη, τα κοκκία κερατοϋαλίνης [Junqueira et al., 1989]. Η κερατινοποίηση θεωρείται πως αφορά στο συνδυασµό των τονοϊνιδίων και των στοιχείων κερατοϋαλίνης προς σχηµατισµό του ώριµου συµπλέγµατος κερατίνης [Wheater et al., 2002]. Μια άλλη δοµή χαρακτηριστική αυτής της στοιβάδας είναι τα πεταλιώδη κοκκία. Πρόκειται για µικρές δοµές, ωοειδείς ή ραβδοειδείς, που περιέχουν δίσκους σχηµατιζόµενους από λιπιδική διπλοστοιβάδα, οι οποίοι απελευθερούµενοι στα µεσοκυττάρια διαστήµατα δρουν ως φραγµός στη διείσδυση ξένων ουσιών και προσφέρουν στο δέρµα ένα πολύ σηµαντικό στεγανοποιητικό αποτέλεσµα. Ο σχηµατισµός αυτού του φραγµού, ο οποίος πρωτοεµφανίστηκε στα ερπετά, ήταν ένα από τα σηµαντικά γεγονότα της εξέλιξης που επέτρεψαν την ανάπτυξη της ζωής στη γη [Junqueira et al., 1989]. 4. Η διαυγής στιβάδα (stratum lucidum), περισσότερο εµφανής στο παχύ δέρµα, είναι ηµιδιαφανής και αποτελείται από ένα λεπτό στρώµα εξαιρετικά 21

22 αποπλατυσµένων ηωσινόφιλων κυττάρων (εικόνα 1.3). Τα οργανίδια και οι πυρήνες δεν φαίνονται πια, το κυτταρόπλασµα αποτελείται από σφιχτά στοιβαγµένα νηµάτια, ενώ µεταξύ των παρακείµενων κυττάρων εξακολουθούν να υπάρχουν ευδιάκριτα δεσµοσώµατα [Wheater et al., 2002, Kanitakis 2002]. 5. Η κερατίνη στιβάδα (stratum corneum) αποτελείται από στίχους αποπλατυσµένων απύρηνων και κερατινοποιηµένων κυττάρων, των οποίων το κυτταρόπλασµα γεµίζει από µία διπλοθλαστική νηµατοειδή σκληροπρωτεΐνη, την κερατίνη [Junqueira et al., 1989]. Στα βαθύτερα στρώµατα αυτής της στιβάδας τα κερατινοποιηµένα κύτταρα διατηρούν τις ενώσεις δεσµοσωµάτων, ενώ η ενδοκυττάρια κερατίνη έχει οµοιόµορφη κατανοµή. Πλησιάζοντας προς την επιφάνεια, τα δεσµοσώµατα και η εσωτερική δοµή των κυττάρων καταστρέφονται τελείως, µια διαδικασία γνωστή ως αποφολίδωση [Wheater et al., 2002]. Η παραπάνω περιγραφή αντιστοιχεί σε περιοχές όπου η επιδερµίδα είναι πολύ παχιά. Στο λεπτό δέρµα η κοκκιώδης και η διαυγής στοιβάδα συχνά είναι λιγότερο αναπτυγµένες και η κερατίνη στοιβάδα µπορεί να είναι αρκετά λεπτή [Junqueira et al., 1989, Kanitakis 2002]. Εικόνα 1.3. Οι στιβάδες της επιδερµίδας. Στην εικόνα αυτή απεικονίζονται ιστολογικές τοµές παχέος και λεπτού δέρµατος ύστερα από χρώση στις οποίες είναι ορατές οι διάφορες στιβάδες της 22

23 επιδερµίδας. Η ύπαρξη της διαυγούς στιβάδας (stratum lucidum) είναι περισσότερο εµφανής στην τοµή από το παχύ δέρµα [Lutz Slomianka, School of Anatomy and Human Biology - The University of Western Australia]. Κερατίνη Στην πλειονότητά τους, τα ευκαρυωτικά κύτταρα περιέχουν στο κυτταρόπλασµά τους έναν κυτταροσκελετό αποτελούµενο από ενδιάµεσα ινίδια (IF, intermediate filaments) τα οποία είναι µακριά, µη διακλαδιζόµενα και χηµικά πολύ σταθερά ινίδια. Ανάµεσα στις διάφορες οικογένειες και υποοικογένειες των IF πρωτεϊνών, αυτή των κερατινών ξεχωρίζει εξαιτίας της µεγάλης µοριακής της ποικιλότητας [Moll et al., 2008]. Στα επιθηλιακά κύτταρα τα ενδιάµεσα νηµάτια ονοµάζονται τονονηµάτια. Οι κερατίνες αποτελούν το προεξάρχον κυτταροπλασµατικό συστατικό των στρωµατοποιηµένων κερατινοποιηµένων επιθηλίων και δύνανται να αποτελούν έως και το 85 % της συνολικής κυτταρικής πρωτεΐνης στα κερατινοποιηµένα κύτταρα της επιδερµίδας [Presland et al., 2008]. Η οικογένεια γονιδίων των κερατινών είναι η µεγαλύτερη που υπάρχει στον άνθρωπο καθώς αποτελείται από 54 διακριτά λειτουργικά γονίδια [Moll et al., 2008]. Οι κερατίνες διακρίνονται σε τύπου Ι (όξινες, Κ9 Κ20) και τύπου ΙΙ (βασικές ή ουδέτερες, Κ1 Κ8) [Presland et al., 2008]. Η κερατίνη περιλαµβάνει τουλάχιστον έξι διαφορετικά πολυπεπτίδια µε µοριακό βάρος κυµαινόµενο από Τρεις πολυπεπτιδικές αλυσίδες περιελίσσονται µεταξύ τους για να σχηµατίσουν υποµονάδες του τονοϊνιδίου µε µήκος περίπου 47 nm. Τουλάχιστον ένα από τα πολυπεπτίδια της υποµονάδας είναι διαφορετικό από τα υπόλοιπα, γεγονός που καθιστά δυνατές µεγάλες παραλλαγές στη δοµή της κερατίνης. Εννέα τριπλές υποµονάδες στη συνέχεια περιελίσσονται η µία γύρω από την άλλη, σχηµατίζοντας ένα νηµάτιο µε διάµετρο περί τα 10 nm. Η τελικοτελική συνένωση των τριπλών υποµονάδων οδηγεί στην αύξηση του µήκους των τονονηµατίων. Η σύσταση των τονονηµατίων αλλάζει καθώς τα επιδερµικά κύτταρα διαφοροποιούνται. Τα βασικά κύτταρα περιέχουν πολυπεπτίδια χαµηλότερου µοριακού βάρους, ενώ τα περισσότερο διαφοροποιηµένα κύτταρα συνθέτουν πολυπεπτίδια µεγαλύτερου µοριακού βάρους. Τα τονονηµάτια βρίσκονται στοιβαγµένα µέσα σε θεµέλια ουσία, η οποία προέρχεται από τα κοκκία της κερατοϋαλίνης [Junqueira et al., 1989]. 23

24 Μελανινοκύτταρα (MCs) Τα µελανινοκύτταρα είναι διακλαδιζόµενα κύτταρα που εντοπίζονται στη βασική στιβάδα της επιδερµίδας. Προκύπτουν από διαφοροποίηση των µελανοβλαστών, που είναι προγονικά κύτταρα νευροεξωδερµικής προέλευσης [Kierszenbaum 2007, McGrath et al., 2004]. Κατά την ανάπτυξη, µεταναστεύουν προς την επιδερµίδα, και εκεί διασκορπίζονται στη βασική στιβάδα σε επαφή µε τη βασική µεµβράνη [Wheater et al., 2002]. Στην ανθρώπινη επιδερµίδα αλληλεπιδρούν στενά µε τα κερατινοκύτταρα µέσω των δενδριτών τους. Τα µελανινοκύτταρα είναι γνωστά για το ρόλο που διαδραµατίζουν στο χρωµατισµό του δέρµατος µέσω της ικανότητάς τους να παράγουν και να κατανέµουν µελανίνη [Tsatmali et al., 2002]. Κατανέµονται οµοιόµορφα ανάµεσα στα βασικά κερατινοκύτταρα µε αναλογία 1 µελανινοκύτταρο ανά 4 10 κερατινοκύτταρα. Εκτιµάται ότι κατά µέσο όρο κάθε µελανινοκύτταρο έρχεται σε επαφή µε 40 κερατινοκύτταρα. Η πυκνότητά τους κυµαίνεται στα κύτταρα/mm 2 επιδερµίδας µε εντόπιση µέγιστης πυκνότητας τα γεννητικά όργανα [Kanitakis 2002]. Ένα ιδιαίτερα ενδιαφέρον σηµείο αποτελεί το γεγονός ότι ο αριθµός των µελανοκυττάρων είναι σχετικά σταθερός µεταξύ διαφορετικών ατόµων ανεξαρτήτως της φυλής στην οποία ανήκουν. Εποµένως οι διαφορές στο χρώµα του δέρµατος οφείλονται µάλλον στο ποσό της παραγόµενης µελανίνης, παρά στον αριθµό των υπαρχόντων µελανοκυττάρων [Wheater et al., 2002]. Η σύνθεση της µελανίνης (ευµελανίνη ή φαιοµελανίνη) γίνεται σε τέσσερα στάδια στο εσωτερικό των µελανινοκυττάρων µέσω της ενζυµικής δραστηριότητας της τυροσινάσης η οποία µετατρέπει το αµινοξύ τυροσίνη σε µελανίνη µέσω ενδιάµεσων προϊόντων, συµπεριλαµβανοµένης και της διυδροξυφαινυλαλανίνης (DOPA) [Wheater et al., 2002]. Στο εσωτερικό των µελανοκυττάρων η µελανίνη συσσωρεύεται σε ανώριµα εκκριτικά κυστίδια, τα προµελανοσώµατα, τα οποία στη συνέχεια ωριµάζουν προς µελανοσώµατα τα οποία είναι ωοειδή ή σφαιρικά µεµβρανικά οργανίδια. Τα µελανοσώµατα µεταφέρονται µέσω δενδριτών στα περιβάλλοντα κερατινοκύτταρα και διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο στη φωτοπροστασία (εικόνα 1.4) [Costin et al., 2007]. Εποµένως, τα µελαγχρωστικά κύτταρα του δέρµατος είναι τόσο τα µελανινοκύτταρα που συνθέτουν µελανίνη, όσο και τα επιθηλιακά κύτταρα που την προσλαµβάνουν, συνήθως µάλιστα τα τελευταία περιέχουν πολύ περισσότερη µελανίνη από τα ίδια τα µελανοκύτταρα. Ένα άλλο ενδιαφέρον γεγονός είναι ότι στα άτοµα µε ξανθωπό και κοκκινωπό τρίχωµα παρατηρούνται βιοχηµικές αλλαγές στο είδος της παραγόµενης µελανίνης. Η ηλιακή 24

25 ακτινοβολία προάγει τη σύνθεσή της µελανίνης, και επίσης σκουραίνει τη µελανίνη που έχει συντεθεί πρόσφατα. Η σύνθεση της µελανίνης διεγείρεται επιπλέον από την υποφυσιακή ορµόνη MSH (melanocyte stimulating hormone) [Wheater et al., 2002]. Εικόνα 1.4. Το µελανοκύτταρο. Τονίζεται η οµοιότητά του µε νευρικό κύτταρο λόγω των δενδριτών του. Ας σηµειωθεί ότι τα µελανοκύτταρα, όπως και τα νευρικά κύτταρα έχουν νευροεξωδερµική προέλευση. Η µεταφορά των µελανοσωµάτων (πράσινο) προς την περιφέρεια των µελανοκυττάρων επιτελείται µε τη βοήθεια των µικροσωληνίσκων (µπλε) και του κυτταροσκελετού ακτίνης (κόκκινο) [Hume et al., 2001]. Κύτταρα του Langerhans (LCs) Αυτά τα κινητά δενδριτικά κύτταρα προέρχονται από το µυελό των οστών και αντιπροσωπεύουν το 3 6 % όλων των κυττάρων που απαντώνται στην επιδερµίδα [McGrath et al., 2004, Kanitakis 2002]. Υπάρχουν σε µικρό αριθµό σε όλη την επιφάνεια των κατώτερων επιδερµιδικών στιβάδων και κυρίως στην ακανθωτή στιβάδα. Τα κύτταρα αυτά εµφανίζουν µακριές δενδριτικές προσεκβολές οι οποίες εκτείνονται µεταξύ των παρακείµενων κερατινοκυττάρων [Wheater et al., 2002]. Τα κύτταρα του Langerhans θεωρούνται υπεύθυνα για την προώθηση και παρουσίαση δερµατικών αντιγόνων προς τα Τ λεµφοκύτταρα που υπάρχουν στο δέρµα. Στο κυτταρόπλασµά τους περιέχουν χαρακτηριστικά κυτταροπλασµατικά κοκκία µε σχήµα ρακέτας του τένις, τα κοκκία του Birbeck (εικόνα 1.5), τα οποία προέρχονται από την κυτταροπλασµατική µεµβράνη και συµµετέχουν στη διαδικασία της ενδοκύττωσης [Junqueira et al., 1989, Kanitakis 2002]. 25

26 Εικόνα 1.5. Κοκκία του Birbeck εντός του κυτταροπλάσµατος ενός επιδερµιδικού κυττάρου του Langerhans. m: µιτοχόνδριο) [Kanitakis 2002]. Κύτταρα του Merkel (MKCs) Πρόκειται για τροποποιηµένα κερατινοκύτταρα που εντοπίζονται στη βασική στιβάδα της επιδερµίδας και το επιθηλιακό έλυτρο των τριχοθυλακίων, και είναι ιδιαίτερα πολυάριθµα στο παχύ δέρµα των παλαµών και των πελµάτων, και κυρίως στα ακροδάκτυλα. Παρουσιάζουν χαρακτηριστικά τόσο κυττάρων του νευροενδοκρινικού συστήµατος όσο και επιθηλιακών κυττάρων, και η προέλευσή τους δεν είναι σαφώς καθορισµένη (νευρική ακρολοφία ή επιδερµιδικά stem κύτταρα). Τα κύτταρα του Merkel που φαίνεται ότι λειτουργούν ως µηχανοϋποδοχείς, συνδυάζονται µε ελεύθερες νευρικές απολήξεις στο παχύ δέρµα και συνδέονται µε τα παρακείµενα κερατινοκύτταρα µε τη βοήθεια των δεσµοσωµάτων (εικόνα 1.6) [Kierszenbaum 2007, Junqueira et al., 1989, Kanitakis 2002]. Εικόνα 1.6. Κύτταρα του Merkel στη βασική στιβάδα της επιδερµίδας. Τα κύτταρα του Merkel εµφανίζουν χαρακτηριστικά νευροεκκριτικά κοκκία (G), συνάψεις µε νευρικές απολήξεις (A) και δεσµοσώµατα µέσω των οποίων συνδέονται µε τα παρακείµενα κερατινοκύτταρα. T: τονοϊνίδια του κερατινοκυττάρου [Kanitakis 2002]. 26

27 Χόριο (dermis) Το χόριο αποτελεί έναν υποστηρικτικό, ελαστικό συνδετικό ιστό που καθηλώνει την επιδερµίδα πάνω στην υποκείµενη στιβάδα του υποδόριου ιστού. Αποτελείται από κύτταρα, ελαστικές ίνες και ίνες κολλαγόνου, αγγεία, νευρικές απολήξεις και τη θεµέλια ουσία. Το πάχος του ποικίλλει αναλόγως της περιοχής του σώµατος, ενώ και η δοµή του παρουσιάζει διακυµάνσεις ανάλογα µε το βάθος. Το χόριο είναι µια σύνθετη δοµή και αποτελείται από δύο στρώµατα µε µάλλον ασαφή όρια: την επιπολής θηλώδη στιβάδα και την εν τω βάθει δικτυωτή στιβάδα [Kanitakis 2002]. Η θηλώδης στιβάδα παρουσιάζει πολλαπλές προσεκβολές οι οποίες διαπλέκονται µε προσεκβολές της επιδερµίδας (επιδερµιδικές ακρολοφίες) σχηµατίζοντας την χοριοεπιδερµιδική συµβολή (dermal epidermal junction). Αυτά τα µορφώµατα είναι περισσότερο πολυάριθµα στο δέρµα που υπόκειται συχνά σε πιέσεις και θεωρείται ότι αυξάνουν την χοριοεπιδερµική συνοχή, καθώς και ότι καθορίζουν τον τύπο ανάπτυξης της υπερκείµενης επιδερµίδας [Junqueira et al., 1989, Kierszenbaum 2007]. Η θηλώδης στιβάδα ονοµάζεται έτσι γιατί αποτελείται κατά µεγάλο µέρος από τις θηλές του χορίου. Από τη στιβάδα αυτή λεπτές διαπλεκόµενες ίνες κολλαγόνου αγκυροβολούν στο βασικό υµένα της επιδερµίδας. Αυτές οι ίνες θεωρείται πως έχουν µια ειδική λειτουργία, να καθηλώνουν την επιδερµίδα στο χόριο και ονοµάζονται ινίδια αγκυροβολίας [Blanpain et al., 2009, Fuchs et al., 2008α]. Η στιβάδα αυτή είναι σχετικά χαλαρή και αγγειοβριθής. Περιλαµβάνει τα υποθηλώδη αρτηριακά, φλεβικά και λεµφαγγειακά πλέγµατα, και περιέχει επίσης τις λεπτές αξονικές συνδέσεις των αισθητικών απολήξεων της επιδερµίδας [Wheater et al., 2002]. Η δικτυωτή στιβάδα είναι και αυτή που συνιστά τον κύριο όγκο του χορίου. Ονοµάζεται έτσι λόγω της διαπλεκόµενης (δικτυωτής) κατανοµής των ινών κολλαγόνου [Wheater et al., 2002]. Η στιβάδα αυτή είναι παχύτερη και περιέχει λιγότερα κύτταρα σε σχέση µε τη θηλώδη στιβάδα. Αποτελείται από πυκνό συνδετικό ιστό (κυρίως κολλαγόνο τύπου Ι) και περισσότερες ίνες ελαστίνης. Η δικτυωτή στιβάδα περιέχει τα εν τω βάθει τµήµατα των εξαρτηµάτων καθώς και νευρικά πλέγµατα του συµπαθητικού, ενώ παρασυµπαθητική νεύρωση, όπως και στη θηλώδη στιβάδα, δεν υπάρχει. Τα αιµοφόρα αγγεία της συνδέουν τα υποθηλώδη µε τα εν τω βάθει δερµατικά πλέγµατα, τα οποία εντοπίζονται στη συµβολή του χορίου µε τον υποδόριο ιστό [Kanitakis 2002]. 27

28 Είναι επίσης γνωστό ότι το υποκείµενο χόριο βρίσκεται σε συνεχή διαντίδραση και επικοινωνία µε τα κύτταρα της βασικής στιβάδας της επιδερµίδας συµβάλλοντας στη ρύθµιση του πολλαπλασιασµού τους και της µετακίνησής τους προς ανώτερες στιβάδες [Blanpain et al., 2009, Fuchs et al., 2008α]. Ίνες του χορίου Η µεγάλη πλειοψηφία (90 %) των ινών που ανευρίσκονται στο χόριο αποτελείται από διάµεσο κολλαγόνο, κυρίως τύπου Ι και τύπου ΙΙΙ, που είναι υπεύθυνο για την µηχανική αντοχή του δέρµατος. Οι ίνες αυτές είναι οργανωµένες σε δεσµίδες οι οποίες είναι αραιότερες κοντά στη βασική στιβάδα και γίνονται πυκνότερες στα εν τω βάθει τµήµατα του χορίου. Άλλοι τύποι κολλαγόνου που ανευρίσκονται στο χόριο συµπεριλαµβάνουν το κολλαγόνο τύπου IV (χοριο επιδερµιδική συµβολή και βασική µεµβράνη που επαλείφει τα δερµιδικά εξαρτήµατα, τα αγγεία και τις νευρικές ίνες), καθώς και το κολλαγόνο τύπου VII (ινίδια αγκυροβολίας στη χοριο επιδερµιδική συµβολή) [Kanitakis 2002]. Οι ελαστικές ίνες αποτελούν ένα σηµαντικό συστατικό και των δύο στιβάδων του χορίου. Οι ίνες αυτές σχηµατίζουν ένα λεπτό δίκτυο διαπλεκόµενων ινών στη θηλώδη στιβάδα, ενώ στη δικτυωτή σχηµατίζουν παχιές ίνες µεγάλου µήκους οι οποίες ακολουθούν την πορεία των δεσµίδων του κολλαγόνου [Wheater et al., 2002]. Οι ίνες αυτές είναι υπεύθυνες για την ελαστικότητα του δέρµατος. Με το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο είναι ορατές οι διαφορές που παρουσιάζουν οι ελαστικές ίνες αναλόγως της ηλικίας του ατόµου καθώς και της περιοχής που εξετάζεται (εκτεθειµένη στην ηλιακή ακτινοβολία περιοχή ή όχι). Τέλος, υπάρχουν και οι δικτυωτές ίνες οι οποίες βιοχηµικά αποτελούνται από λεπτές ίνες κολλαγόνου (τύπου Ι και ΙΙΙ) και ινωδονεκτίνη [Kanitakis 2002]. Κύτταρα του χορίου Τα κύτταρα του χορίου είναι κυρίως ινοβλάστες που ευθύνονται για την παραγωγή και έκκριση κολλαγόνου, ελαστίνης και θεµέλιας ουσίας. Επίσης υπάρχουν διάφοροι τύποι λευκών αιµοσφαιρίων, σιτευτικά κύτταρα και ιστικά µακροφάγα που επιτελούν µη ειδικό αµυντικό έργο και λειτουργίες ανοσολογικής επιτήρησης [Wheater et al., 2002]. 28

29 Οι ινοβλάστες είναι τα βασικά κύτταρα του χορίου που είναι υπεύθυνα για τη σύνθεση όλων των τύπων ινών καθώς και για τη σύνθεση της θεµέλιας ουσίας (εικόνα 1.7). Είναι ατρακτοειδή ή αστεροειδή κύτταρα που περιέχουν καλά ανεπτυγµένο αδρό ενδοπλασµατικό δίκτυο. Μπορούν να αναγνωριστούν µε τη χρήση αντισωµάτων που αναγνωρίζουν µεσεγχυµατικούς δείκτες (βιµεντίνη, Te7 αντιγόνο), ένζυµα που συµµετέχουν στη σύνθεση κολλαγόνου (4 υδροξυλάση της προλίνης) καθώς και τα αντιγόνα FibAS που φαίνεται πως είναι ειδικά για τις ινοβλάστες [Saalbach et al., 1996]. Τα ινοκύτταρα είναι µεσεγχυµατικά προγονικά κύτταρα προερχόµενα από το µυελό των οστών. Οι ινοκλάστες είναι ουσιαστικά ινοβλάστες µε φαγοκυτταρική δραστηριότητα όσον αφορά το κολλαγόνο. Τα σιτευτικά κύτταρα προέρχονται από τον µυελό των οστών και είναι διασκορπισµένα στο χόριο κυρίως γύρω από τα αγγεία [Kanitakis 2002]. Οι µυοϊνοβλάστες είναι κύτταρα µε σηµαντικό ρόλο κατά την επούλωση που περιέχουν ειδικά συσταλτικά ινίδια και εκφράζουν την a-smooth muscle ακτίνη. Τα κύτταρα αυτά εξετάζονται αναλυτικά αργότερα [Eyden 2001]. Εικόνα 1.7. Απεικόνιση µιας ίνας ελαστίνης (κόκκινο) σε επαφή µε την ινοβλάστη που την συνθέτει (κίτρινο/µπλε στην ανώτερη αριστερή πλευρά) σε ανθρώπινο συνδετικό ιστό. Πλησίον του κυττάρου υπάρχουν και ίνες κολλαγόνου (στικτό πράσινο). [Porter 2007]. Τα δενδροκύτταρα του χορίου (Dermal dendrocytes DD) αποτελούν έναν ετερογενή πληθυσµό από µεσεγχυµατικά δενδριτικά κύτταρα που αναγνωρίζονται κυρίως µέσω της ανοσοϊστοχηµείας, και συχνά συγχέονταν µε τις ινοβλάστες [Narvaez et al., 1995]. Υπάρχουν τουλάχιστον δύο τύποι δενδροκυττάρων του χορίου. Τα δενδροκύτταρα τύπου Ι είναι παρόντα γύρω από τα αιµοφόρα αγγεία στη θηλώδη στιβάδα του χορίου και τους ιδρωτοποιούς αδένες και αναγνωρίζονται χάρη στην έκφραση του παράγοντα XΙΙΙa (εικόνα 1.8). Εκφράζουν µεσεγχυµατικούς δείκτες (βιµεντίνη, Te7 αντιγόνο), καθώς και κάποια αντιγόνα επιφανείας που είναι 29

30 χαρακτηριστικά για αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (HLe1, HLA DR/DQ, CD14, CD36), αλλά δεν εκφράζουν αντιγόνα χαρακτηριστικά των κυττάρων Langerhans (CD1a, CD207, Lag, πρωτεΐνη S100). Τα δενδροκύτταρα τύπου II χαρακτηρίζονται από την έκφραση του CD34 αντιγόνου. Εκφράζουν επίσης µεσεγχυµατικά αντιγόνα και ενίοτε HLA - DR αντιγόνα. Εντοπίζονται στα µεσαία και εν τω βάθει τµήµατα του χορίου, γύρω από τους µεροκρινείς ιδρωτοποιούς αδένες και τα τριχοθυλάκια στο ύψος της περιοχής bulge [Kanitakis 2002]. Εικόνα 1.8. ενδροκύτταρα του χορίου που εκφράζουν τον παράγοντα XIIIa στην περιαγγειακή περιοχή του θηλώδους χορίου [Kanitakis 2002]. Τα περικύτταρα των αγγείων του χορίου έχουν αποτελέσει πεδίο ιδιαίτερου ενδιαφέροντος για τους µελετητές, διότι πρόσφατα αποκαλύφθηκε οτι σε µια µεγάλη ποικιλία ιστών τα κύτταρα αυτά διαθέτουν την ικανότητα διαφοροποίησης προς πολλαπλές µεσεγχυµατικές κυτταρικές σειρές, γεγονός το οποίο υπονοεί πως πιθανώς λειτουργούν ως µεσεγχυµατικά stem κύτταρα (εικόνα 1.9). Η παρατήρηση αυτή υποστηρίζεται επιπλέον από το γεγονός ότι κύτταρα µε δείκτες των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων εκφράζουν επίσης και δείκτες των περικυττάρων. Μια σειρά πειραµάτων από τους Paquet-Fifield et al., έχει αναδείξει την ύπαρξη µιας σειράς επιπρόσθετων βιολογικών ιδιοτήτων των περικυττάρων όσον αφορά τη ρύθµιση του επιθηλιακού πολλαπλασιασµού και την ιστική επούλωση. Πιο συγκεκριµένα, είναι γνωστό πως όχι µόνο σταθεροποιούν τη δοµή των αιµοφόρων αγγείων αλλά επίσης ρυθµίζουν τον πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων, τη µικροαγγειακή παροχή, καθώς και τη διαπερατότητα µέσω παρακρινούς έκκρισης αγγειοδραστικών παραγόντων και ρυθµιστικών µορίων όπως είναι ο TGF-β [Caplan 2008]. Αν και τα περικύτταρα έχουν πολλές κοινές ιδιότητες µε τα λεία µυϊκά κύτταρα καθώς είναι συσταλτικά κύτταρα που εκφράζουν την πρωτεΐνη ACTA2 (SMA), είναι 30

31 δυνατόν να διακριθούν από αυτά από το γεγονός ότι βρίσκονται εντός µιας εξειδικευµένης φωλεάς η οποία εφάπτεται των ενδοθηλιακών κυττάρων [Paquet-Fifield et al., 2009]. Εικόνα 1.9. Επιµήκης τοµή µικρού αιµοφόρου αγγείου. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα (CD34, πράσινο) περιβάλλονται στενά από τα περικύτταρα (CD146, κόκκινο). Τα περικύτταρα σε κατάλληλες καλλιεργητικές συνθήκες είναι δυνατόν να δώσουν γένεση σε µεσεγχυµατικά stem κύτταρα [Chen et al., 2009]. Αγγεία και νεύρα του χορίου Σε αντίθεση µε την επιδερµίδα που δεν περιέχει αγγεία, το χόριο εµπεριέχει ένα ιδιαίτερα πλούσιο δίκτυο από αιµοφόρα και λεµφικά αγγεία [Junqueira et al., 1989, Kierszenbaum 2007]. Το αγγειακό δίκτυο εκτός από τις τροφικές ανάγκες τις οποίες καλύπτει, συµµετέχει στη θερµορρύθµιση, την επούλωση των τραυµάτων και τις ανοσιακές αντιδράσεις του δέρµατος [Braverman 2000]. Οι αρτηρίες που τροφοδοτούν το δέρµα σχηµατίζουν δύο πλέγµατα, ένα µεταξύ της θηλώδους και της δικτυωτής στιβάδας (υποθηλώδες πλέγµα) και ένα µεταξύ του χορίου και του υποδόριου ιστού (δερµατικό πλέγµα) [Junqueira et al., 1989, Wheater et al., 2002]. Κλάδοι του δερµατικού πλέγµατος πλησίον της χοριο επιδερµιδικής συµβολής τροφοδοτούν τον υποδόριο ιστό, το δικτυωτό χόριο και τα τριχοειδικά δίκτυα που περιβάλλουν τα τριχοθυλάκια, καθώς και τους εν τω βάθει σµηγµατογόνους και ιδρωτοποιούς αδένες. Το υποθηλώδες πλέγµα τροφοδοτεί το ανώτερο χόριο και τα τριχοειδικά δίκτυα γύρω από τα επιπολής εξαρτήµατα. Σχηµατίζει επίσης µία τριχοειδική αγκύλη σε κάθε δερµιδική θηλή [Wheater et al., 2002, Braverman 2000]. Οι φλέβες διατάσσονται σε τρία πλέγµατα. Τα δύο από αυτά βρίσκονται στο ίδιο επίπεδο µε τα αρτηριακά πλέγµατα, ενώ το τρίτο εντοπίζεται στο µέσο του χορίου [Junqueira et al., 1989]. 31

32 Σε αρκετές περιοχές του δέρµατος, το αίµα µπορεί να περάσει κατευθείαν από τις αρτηρίες στις φλέβες διαµέσου των αρτηριοφλεβικών αναστοµώσεων. Αυτές οι αναστοµώσεις εντοπίζονται κυρίως στη δικτυωτή στιβάδα και τον υποδόριο ιστό σε παλάµες, πέλµατα, χείλια, µύτη και αυτιά και παίζουν πολύ σηµαντικό ρόλο στη θερµορρύθµιση, δεδοµένου ότι τα αγγεία του χορίου µπορούν να χωρέσουν περίπου το 4,5 % του συνολικού όγκου του αίµατος [Junqueira et al., 1989, Kierszenbaum 2007]. Εικόνα Ενδοθηλιακά κύτταρα του υποθηλώδους πλέγµατος [Kanitakis 2002]. Το λεµφικό σύστηµα διαδραµατίζει επίσης σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση της πίεσης του διάµεσου υγρού, την αποµάκρυνση του εξωκυττάριου υγρού, ενώ συµµετέχει και στις αντιδράσεις ανοσίας. Τα λεµφικά αγγεία αρχίζουν σαν τυφλοί σάκοι στις θηλές του χορίου και συγκλίνουν για να σχηµατίσουν δύο πλέγµατα αντίστοιχα µε αυτά των αρτηριών [Kanitakis 2002]. Το δέρµα διαθέτει επίσης πολύπλοκη και πλούσια νεύρωση, που συνιστάται τόσο από προσαγωγές όσο και από απαγωγές νευρικές ίνες. Οι προσαγωγές ίνες χρησιµεύουν σε µία από τις σηµαντικότερες λειτουργίες του δέρµατος, δηλαδή την πρόσληψη ερεθισµάτων από το περιβάλλον. Η αισθητική νεύρωσή του συµπεριλαµβάνει, εκτός από τις ελεύθερες νευρικές απολήξεις της επιδερµίδας και των αδένων του δέρµατος, υποδοχείς οι οποίοι υπάρχουν στο χόριο και τον υποδόριο ιστό, και εντοπίζονται συνηθέστερα στις θηλές του χορίου (σωµάτια Wagner- Meissner, Vater-Pacini, Krause) (εικόνα 1.11) [Junqueira et al., 1989, Egan et al., 1998]. Το απαγωγό σύστηµα περιλαµβάνει αµύελες ίνες του συµπαθητικού συστήµατος οι οποίες ρυθµίζουν τη διάµετρο των αιµοφόρων αγγείων, την έκκριση ιδρώτα και την ανόρθωση των τριχών [Egan et al., 1998]. 32

33 Εικόνα ιάφοροι τύποι αισθητικών νευρικών απολήξεων στο δέρµα [Junqueira et al., 1989]. Η χοριο επιδερµιδική συµβολή (DEJ) Η χοριο επιδερµιδική συµβολή (dermal-epidermal junction) (εικόνα 1.12) είναι µία σύνθετη δοµή που δηµιουργείται από τα κερατινοκύτταρα της βασικής στιβάδας και ινοβλάστες του χορίου. ιαδραµατίζει µείζονα ρόλο στην πρόσφυση της επιδερµίδας στο χόριο και επιπλέον ρυθµίζει τη µεταφορά µεταβολικών προϊόντων ανάµεσά τους. Περαιτέρω, δρα υποστηρικτικά στη µετακίνηση κερατινοκυττάρων κατά την επούλωση τραυµάτων και είναι η δίοδος µέσω της οποίας µετακινούνται διάφοροι κυτταρικοί πληθυσµοί (κύτταρα του Langerhans, λεµφοκύτταρα κ.α.) κατά τη διάρκεια ανοσολογικών και φλεγµονωδών διεργασιών [Kanitakis 2002]. Η ευδιάκριτη χοριο επιδερµιδική συµβολή είναι ορατή σε ιστολογικές τοµές ανθρωπίνου δέρµατος. Αυτή η υποδοµή της επιδερµίδας είναι ιδιαίτερη για κάθε περιοχή του σώµατος. Ανάµεσα στη βασική στιβάδα της επιδερµίδας και τη θηλώδη στιβάδα του χορίου µεσολαβεί πάντοτε ένας βασικός υµένας, ο οποίος ακολουθεί το περίγραµµα των εγκολπώσεων και των προσεκβολών αυτών των στιβάδων. Κάτω από το βασικό υµένα υπάρχει ένα λεπτό πλέγµα δικτυωτών ινών που λέγεται 33

34 δικτυωτός υµένας. Ο συνδυασµός του βασικού και του δικτυωτού υµένα χαρακτηρίζεται σαν βασική µεµβράνη και είναι ορατή µε το φωτοµικροσκόπιο [Kanitakis 2002]. Εικόνα Η χοριο επιδερµιδική συµβολή. f: ινίδια αγκυροβολίας, k: βασικό κερατινοκύτταρο, c: ίνες κολλαγόνου, d: χόριο (ηλεκτρονικό µικροσκόπιο) [Kanitakis 2002]. Υποδόριος ιστός (Hypodermis) Ο υποδόριος ιστός (γνωστός και ως επιπολής περιτονία - superficial fascia) συνιστά την εν τω βάθει συνέχεια του χορίου, αποτελείται από χαλαρό συνδετικό ιστό ο οποίος στερεώνει το δέρµα πάνω στα υποκείµενα όργανα και περιέχει λιποκύτταρα σε ποικίλους αριθµούς ανάλογα µε την περιοχή του σώµατος και µε µέγεθος ανάλογο µε τη θρεπτική κατάσταση του ατόµου [Junqueira et al., 1989]. Η σύνθεση του υποδορίου ιστού επιτρέπει στο δέρµα να έχει κινητικότητα και να διολισθαίνει πάνω στα υποκείµενα όργανα ενώ ο λιπώδης ιστός που περιέχει συµβάλλει στη θερµοµόνωση του οργανισµού, παρέχει µηχανική προστασία και λειτουργεί ως αποθήκη ενέργειας (εικόνα 1.13) [Kierszenbaum 2007]. Εικόνα Λιποκύτταρα στον υποδόριο ιστό [Kanitakis 2002]. 34

35 Εξαρτήµατα του δέρµατος Το δέρµα περιέχει µια ποικιλία εξαρτηµάτων, τα οποία εµβρυολογικώς προέρχονται από το επιπολής επιθήλιο (επιδερµίδα). Η κατανοµή, η οργάνωση και η λεπτοµερής υφή των εξαρτηµάτων διαφέρει από το ένα µέρος του δέρµατος στο άλλο, αλλά η γενική δοµή συµβαδίζει µε ένα γενικό πρότυπο. Τριχοσµηγµατογόνος συσκευή Κάθε τριχοθυλάκιο και ο συνοδός ανελκτήρας της τρίχας µυς µαζί µε τους σµηγµατογόνους αδένες αποτελούν την τριχοσµηγµατογόνο συσκευή [Wheater et al., 2002]. Τρίχες. Οι τρίχες είναι επιµήκεις κερατινοποιηµένες δοµές αναδυόµενες µέσα από εγκολπώσεις του επιδερµικού επιθηλίου και απαντώµενες σε όλη την επιφάνεια του σώµατος εκτός από τις παλάµες, τα πέλµατα, τα χείλη και από τµήµατα των γεννητικών οργάνων (βάλανος του πέους, κλειτορίδα και µικρά χείλη του αιδοίου). Η προέλευσή τους είναι από το εξώδερµα. Το χρώµα τους, το µέγεθός τους, η µορφολογία και η κατανοµή τους ποικίλλει ανάλογα µε τη φυλή, την ηλικία, το φύλο και την περιοχή του σώµατος. Σε ορισµένες περιοχές του σώµατος, όπως το τριχωτό της κεφαλής, το πρόσωπο και το εφήβαιο, η αύξηση των τριχών επηρεάζεται έντονα όχι µόνο από τις γεννητικές ορµόνες ιδιαίτερα τα ανδρογόνα αλλά επίσης και από τις ορµόνες των επινεφριδίων και του θυρεοειδούς [Kanitakis 2002, Junqueira et al., 1989]. Κάθε τρίχα εκφύεται από µια επιδερµική εγκόλπωση, το τριχοθυλάκιο (εικόνα 1.14), που αποτελεί ουσιαστικά κυλινδρική κατάδυση του επιπολής επιθηλίου και περιβάλλεται από ινοκολλαγονώδη ιστό [Wheater et al., 2002]. Κάθε τρίχα εµφανίζει δύο τµήµατα, το στέλεχος που εκτείνεται από το σηµείο εκβολής του σµηγµατογόνου αδένα µέχρι το ελεύθερο άκρο, και τη ρίζα που καταλήγει σε µια κωνοειδή διόγκωση, τον βολβό της τρίχας, ο οποίος αποτελείται από ενεργά διαιρούµενα επιθηλιακά κύτταρα που είναι υπεύθυνα για την ανάπτυξη της τρίχας καθώς και από µελανινοκύτταρα τα οποία καθορίζουν και το χρώµα της τρίχας [Kanitakis 2002]. Η βάση του βολβού διαθέτει µια κοίλη κατώτερη επιφάνεια όπου εισχωρεί προσεκβολή του χορίου, τη δερµατική θηλή ή θηλή της τρίχας που είναι εφοδιασµένη µε πολλές εµµύελες και αµύελες νευρικές απολήξεις και πλούσιο αγγειακό δίκτυο καθώς και συνδετικό ιστό που περιέχει ινοβλάστες, και είναι ζωτικής σηµασίας για τη 35

36 διατήρηση του τριχοθυλακίου. Τα επιδερµικά κύτταρα που καλύπτουν τη δερµατική θηλή σχηµατίζουν τη ρίζα της τρίχας η οποία παράγει το στέλεχος που προβάλλει από το δέρµα [Junqueira et al., 1989]. Η τρίχα αποτελείται από µέσα προς τα έξω από τις παρακάτω στιβάδες: (α) το µυελό (medulla), που υπάρχει σε ορισµένους µόνο τύπους τριχών και δηµιουργείται από την κεντρική περιοχής της ρίζας, στην κορυφή της δερµατικής θηλής όπου παράγονται µεγάλα κενοτοπιώδη, µόλις κερατινοποιηµένα κύτταρα, (β) τον φλοιό (cortex), που δηµιουργείται από τα κύτταρα που βρίσκονται περιφερικότερα των προηγουµένων στην κεντρική περιοχή της ρίζας τα οποία πολλαπλασιάζονται και διαφοροποιούνται προς ατρακτοειδή, έντονα κερατινοποιηµένα κύτταρα, και (γ) το επιτρίχιο (cuticle), που σχηµατίζεται από τα κύτταρα που βρίσκονται ακόµα περιφερικότερα, αποτελείται από µία στιβάδα κυττάρων, τα οποία µέχρι το µέσο του βολβού είναι κυβοειδή, στη συνέχεια γίνονται υψηλά και κυλινδρικά και σε ακόµη υψηλότερο επίπεδο αλλάζουν από οριζόντια σε κατακόρυφα, όπου και σχηµατίζουν µια στιβάδα αποπλατυσµένων κυττάρων µε έντονη κερατινοποίηση, τα οποία διατάσσονται όπως τα κεραµίδια της στέγης, καλύπτοντας το φλοιό. Αυτά τα κύτταρα του επιτριχίου αποτελούν την τελευταία διαφοροποιούµενη κυτταρική σειρά του τριχοθυλακίου [Junqueira et al., 1989]. (δ) Τα περιφερικά επιθηλιακά κύτταρα εξελίσσονται επίσης στο εξωτερικό και το εσωτερικό έλυτρο της ρίζας. Το εξωτερικό (outer root sheath) αποτελεί συνέχεια της επιδερµίδας και κοντά στην επιφάνεια παρουσιάζει όλες τις στιβάδες της κανονικής επιδερµίδας, ενώ κοντά στη θηλή παρουσιάζει µόνον αυτή που αντιστοιχεί στη βασική στιβάδα. Τα κύτταρα του εσωτερικού ελύτρου (inner root sheath) εξαφανίζονται στο ύψος της εκβολής των εκφορητικών πόρων των σµηγµατογόνων αδένων [Junqueira et al., 1989]. 36

37 Εικόνα Το τριχοθυλάκιο. Απεικονίζονται οι στιβάδες της τρίχας µε το εσωτερικό και το εξωτερικό της έλυτρο [Junqueira et al., 1989]. Ανάµεσα στο τριχοθυλάκιο και στο χόριο µεσολαβεί µια υαλοειδής στιβάδα χωρίς κύτταρα, ο υαλοειδής υµένας, ο οποίος αντιπροσωπεύει µια πάχυνση του βασικού υµένα. Ο ινώδης θύλακος της τρίχας σχηµατίζεται από το περιβάλλον µεσέγχυµα. Σε αυτό το ινώδες έλυτρο προσφύεται ο ανελκτήρας µυς της τρίχας, ένας λείος µυς, στο ύψος µιας περιοχής που καλείται bulge, ο οποίος κατευθύνεται πλάγια και προς τα πάνω και συµβάλλει στην υποστήριξη του τριχοθυλακίου και του στελέχους της τρίχας. Η συστολή αυτού του µυός µετά από διέγερσή του από νευρικές ίνες του συµπαθητικού συστήµατος, έχει ως αποτέλεσµα την ανόρθωση της τρίχας σε πιο όρθια θέση, κάτι που φαίνεται πως διαδραµατίζει κάποιον ρόλο τόσο στη θερµορρύθµιση, όσο και στην εξώθηση του σµήγµατος από τους σµηγµατογόνους αδένες, οι οποίοι εκβάλλουν επίσης εντός του τριχοθυλακίου και εξετάζονται αργότερα [Kanitakis 2002, Wheater et al., 2002]. Η ανάπτυξή των τριχοθυλακίων όπως φαίνεται στην εικόνα 1.15 είναι κυκλική και επιτελείται σε τρεις διακριτές φάσεις (αναγενής, καταγενής και τελογενής), γεγονός που αντικατοπτρίζεται στις µεταβολές της δοµής του. Κατά την αναγενή φάση η οποία είναι φάση αύξησης, η τρίχα σχηµατίζεται και αναπτύσσεται, τα τριχοθυλάκια διεισδύουν βαθιά µέσα στο χόριο και ο βολβός της τρίχας είναι εµφανής. Κατά την καταγενή φάση η τρίχα προετοιµάζεται για την πτώση της, ενώ κατά την τελογενή φάση που είναι και η φάση ηρεµίας, τα τριχοθυλάκια είναι κοντύτερα και ο βολβός 37

38 της τρίχας είναι µικρότερος χωρίς δερµιδική θηλή. Τα αδρανή τριχοθυλάκια είναι γνωστά και ως club hairs [Wheater et al., 2002, Cotsarelis et al., 2006]. Εικόνα Ο κύκλος της τρίχας. Όταν τα κύτταρα της µήτρας εξαντλήσουν το αναπαραγωγικό τους δυναµικό ή όταν παύσει το διεγερτικό ερέθισµα, η ανάπτυξη της τρίχας παύει. Σε αυτή τη φάση το τριχοθυλάκιο εισέρχεται στη φάση καταστροφής του (καταγενής), γεγονός που οδηγεί στην αποδόµηση των δύο κατώτερων τριτηµορίων του τριχοθυλακίου. Το ανώτερο τριτηµόριο παραµένει άθικτο σαν ένας θύλακας που περιβάλλει το παλαιό στέλεχος της τρίχας. Ο θύλακας αυτός είναι γνωστός σαν περιοχή bulge, η οποία αποτελεί τη φυσική δεξαµενή stem κυττάρων για το τριχοθυλάκιο, απαραίτητη για το σχηµατισµό νέου τριχοθυλακίου. Μετά την καταγενή φάση, τα κύτταρα της bulge περιοχής εισέρχονται σε µια φάση ηρεµίας (τελογενής φάση) κατά την οποία η δερµατική θηλή βρίσκεται πλέον σε µεγάλη εγγύτητα µε τα bulge stem κύτταρα. Ακολουθεί η επανεκκίνηση του κύκλου της τρίχας µε είσοδο στην αναγενή φάση και αναδηµιουργία του τριχοθυλακίου. Η bulge περιοχή ως δοµή αναπτύσσεται όταν η νέα τρίχα αναδύεται από το αρχικό άνοιγµα της επιδερµίδας το οποίο συχνά µοιράζεται µε το στέλεχος της παλαιάς τρίχας. Η συνεχής διαδοχή των κύκλων της τρίχας έχει ως αποτέλεσµα τη σταδιακή επιµήκυνση των τελογενών φάσεων [Blanpain et al., 2006α]. Σµηγµατογόνοι αδένες. Κάθε τριχοθυλάκιο συνοδεύεται από έναν ή περισσότερους σµηγµατογόνους αδένες, οι οποίοι κατασκηνώνουν στο διάστηµα που καθορίζεται από το τριχοθυλάκιο, τον ανελκτήρα µυ της τρίχας και την επιφάνεια του δέρµατος, και εκκρίνουν µια λιπαρή ουσία, το σµήγµα. Το σµήγµα δρα ως 38

39 αδιάβροχος και ενυδατικός παράγοντας για την τρίχα και την επιφάνεια του δέρµατος [Wheater et al., 2002]. Οι σµηγµατογόνοι αδένες κατασκηνώνουν στο χόριο της µεγαλύτερης επιφάνειας του σώµατος µε µέση πυκνότητα 100/cm 2 δέρµατος. Η πυκνότητα αυτή παρουσιάζει µέγιστο στο τριχωτό της κεφαλής ενώ στο παχύ δέρµα των παλαµών και των πελµάτων δεν υπάρχουν σµηγµατογόνοι αδένες [Junqueira et al., 1989]. Αντιθέτως, σε ορισµένες περιοχές του σώµατος όπως τα χείλη, τα βλέφαρα, η βάλανος του πέους, τα µικρά χείλη του αιδοίου και οι θηλές των µαστών, οι σµηγµατογόνοι αδένες βρίσκονται ανεξάρτητα από τα τριχοθυλάκια και εκβάλλουν απευθείας στην επιφάνεια του δέρµατος [Wheater et al., 2002]. Είναι ολοκρινείς αδένες καθώς το προϊόν της έκκρισης απελευθερώνεται µαζί µε υπολείµµατα νεκρών κυττάρων [Kierszenbaum 2007]. Πρόκειται για πολυλοβωτούς αδένες αποτελούµενους από αδενοκυψέλες που καταλήγουν σε έναν βραχύ πόρο ο οποίος συνήθως εκβάλλει στο ανώτερο τµήµα του τριχοθυλακίου, ενώ σε ορισµένες περιοχές όπως είναι η βάλανος του πέους, η κλειτορίδα, οι θηλές και τα χείλη, ο πόρος καταλήγει απευθείας στην επιφάνεια της επιδερµίδας [Kierszenbaum 2007, Kanitakis 2002]. Το εκκριτικό τµήµα αποτελείται από µια βασική στιβάδα κυττάρων που περιέχουν γλυκογόνο και στηρίζονται στον βασικό υµένα. Αυτά τα κύτταρα σταδιακά γεµίζουν τις αδενοκυψέλες καθώς πολλαπλασιάζονται, αυξάνουν σε µέγεθος και αποκτούν σταγονίδια λίπους στο κυτταρόπλασµά τους. Το προϊόν αυτής της διεργασίας είναι το σµήγµα που σταδιακά µεταφέρεται προς την επιφάνεια του δέρµατος [McGrath et al., 2004]. Ιδρωτοποιοί αδένες Οι ιδρωτοποιοί αδένες είναι παρόντες σχεδόν σε ολόκληρο το σώµα, µε µέγιστη πυκνότητα στις παλάµες, τα πέλµατα (300/cm 2 ), τις µασχάλες και το µέτωπο, και εντοπίζονται στο εν τω βάθει χόριο και την χοριο επιδερµιδική συµβολή. Ορισµένες περιοχές όµως, όπως η βάλανος του πέους και οι βλεννογόνοι στερούνται ιδρωτοποιών αδένων [Junqueira et al., 1989, Kanitakis 2002]. ιακρίνονται σε µεροκρινείς (ESG) και αποκρινείς (ASG). Οι µεροκρινείς ιδρωτοποιοί αδένες είναι απλοί πολυέλικτοι σωληνώδεις αδένες των οποίων οι πόροι καταλήγουν στην επιφάνεια του δέρµατος. Οι πόροι τους δεν διακλαδίζονται και είναι λεπτότεροι σε διάµετρο από το εκκριτικό τµήµα [Junqueira 39

40 et al., 1989]. ιαδραµατίζουν θεµελιώδη ρόλο στη διαδικασία της θερµορρύθµισης, ενώ η νεύρωσή τους γίνεται από χολινεργικές ίνες. Το εκκριτικό τµήµα των µεροκρινών αδένων είναι ένας εσπειραµένος σωλήνας που συνιστάται από τρία είδη κυττάρων: τα διαυγή κύτταρα, τα βαθυχρωµατικά και τα µυοεπιθηλιακά κύτταρα, ενώ περιβάλλεται από έναν βασικό υµένα [Kierszenbaum 2007]. Τα βαθυχρωµατικά κύτταρα επενδύουν το µεγαλύτερο ποσοστό της εσωτερικής επιφάνειας του εκκριτικού τµήµατος. Το κυτταρόπλασµά τους περιέχει άφθονα µιτοχόνδρια, άφθονο αδρό ενδοπλασµατικό δίκτυο και σύµπλεγµα Golgi καθώς και ελεύθερα ριβοσωµάτια, ενώ στην κορυφαία περιοχή τους υπάρχουν εκκριτικά κοκκία που περιέχουν γλυκοπρωτεΐνες. Τα διαυγή κύτταρα έχουν ως κύριο ρόλο την διεπιθηλιακή απορρόφηση ιόντων και τη µεταφορά υγρών, ενώ στερούνται κοκκίων. Τέλος, τα µυοεπιθηλιακά κύτταρα που βρίσκονται µεταξύ του βασικού υµένα και των διαυγών κυττάρων διευκολύνουν µέσω της σύσπασης των µυοϊνιδίων τους την αποβολή του εκκρίµατος [Kierszenbaum 2007, Junqueira et al., 1989]. Οι αποκρινείς αδένες απαντούν στη µασχαλιαία περιοχή, την άλω του µαστού και την περινεϊκή χώρα και γίνονται λειτουργικοί µετά την εφηβεία, ενώ στις γυναίκες υφίστανται κυκλικές µεταβολές κάτω από την επίδραση των ορµονών του εµµηνορρυσιακού κύκλου. Είναι πολύ µεγαλύτεροι απ ότι οι µεροκρινείς. Κατασκηνώνουν στον υποδόριο ιστό και οι πόροι τους εκβάλλουν στα τριχοθυλάκια, παρά στην επιφάνεια της επιδερµίδας. Νευρώνονται από αδρενεργικές ίνες και παράγουν ένα ιξώδες έκκριµα που είναι αρχικά άοσµο αλλά αποκτά τη χαρακτηριστική οσµή του µε µικροβιακή ζύµωση [Kierszenbaum 2007, Junqueira et al., 1989, Wheater et al., 2002]. Νύχια Η ραχιαία δερµατική επιφάνεια της τελικής φάλαγγας κάθε δακτύλου των χεριών και των ποδιών σχηµατίζει ένα πολύ εξειδικευµένο εξάρτηµα, το νύχι, αποτελούµενο από µια πυκνή κερατινοποιηµένη πλάκα, την ονυχική πλάκα, η οποία επικάθεται σε ένα πολύστιβο πλακώδες επιθήλιο που ονοµάζεται κοίτη του νυχιού [Wheater et al., 2002]. Το αρχικό τµήµα του νυχιού αποτελεί την ρίζα του νυχιού, η οποία µαζί µε την υποκείµενη κοίτη εκτείνονται βαθιά µέσα στο χόριο και πλησιάζουν την άπω µεσοφαλαγγική άρθρωση, ενώ το χόριο της περιοχής κάτω από την πλάκα του νυχιού προσφύεται στενά στο περιόστεο της τελικής φάλαγγας [Junqueira et al., 1989, Wheater et al., 2002]. Η ονυχική πλάκα αντιστοιχεί στην κερατίνη στιβάδα του 40

41 δέρµατος ενώ η κοίτη του νυχιού, αποτελείται µόνο από τη βασική και την ακανθωτή στιβάδα (εικόνα 1.16). Το επιθήλιο της κοίτης του νυχιού προέρχεται από τη µήτρα του νυχιού, της οποίας το κεντρικό άκρο εντοπίζεται βαθιά στη ρίζα, ενώ το περιφερικό άκρο της εκτείνεται ως το εξωτερικό άκρο του µηνίσκου που είναι µια λευκή ηµισέληνος, ο µηνίσκος, στο αρχικό τµήµα του νυχιού [Kanitakis 2002, Kierszenbaum 2007]. Η αύξηση του νυχιού πραγµατοποιείται µε πολλαπλασιασµό και διαφοροποίηση του επιθηλίου της µήτρας, ενώ η πλάκα του νυχιού ολισθαίνει προς τα έξω. Το δέρµα που καλύπτει τη ρίζα του νυχιού ονοµάζεται ονυχική πτυχή, και το έντονα κερατινοποιηµένο ελεύθερο άκρο του λέγεται επωνύχιο [Wheater et al., 2002]. Το περιφερικό άκρο καλύπτει το υπονύχιο, µια πυκνή δοµή που δηµιουργείται από την κερατίνη στιβάδα και που έχει ως ρόλο την προστασία από την είσοδο µικροοργανισµών στη µήτρα του νυχιού [Kierszenbaum 2007]. Εικόνα Η ανατοµία του νυχιού. Παρατηρούνται όλες οι δοµές του όνυχος. Ας σηµειωθεί ότι, όπως απεικονίζεται και στην εικόνα, η ονυχική πλάκα αποτελεί την συνέχεια της κερατίνης στιβάδας του δέρµατος [ htm]. ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΕΡΜΑΤΟΣ Το δέρµα έχει διττή προέλευση καθώς η επιπολής στιβάδα του, η επιδερµίδα, αναπτύσσεται από το επιπολής εξώδερµα και η εν τω βάθει στιβάδα του, το χόριο, αναπτύσσεται από το υποκείµενο µεσέγχυµα. Η πορεία που πρόκειται να ακολουθηθεί εξαρτάται από τους αντιπαρατιθέµενους ρόλους που διαδραµατίζουν οι σηµατοδοτικές οδοί Notch και Wnt, µε το µονοπάτι του Sonic hedgehog, τις BMP πρωτεΐνες, τη β-κατενίνη, τον Lef1 και το Notch πεπτίδιο να διαδραµατίζουν επίσης σηµαντικούς ρόλους [McGrath et al., 2004]. Πιο 41

42 συγκεκριµένα, η Wnt σηµατοδότηση εµποδίζει την ικανότητα του εξωδέρµατος να ανταποκρίνεται στους FGFs (fibroblast growth factors). Επί απουσίας της FGF σηµατοδότησης, τα κύτταραα εκφράζουν τις ΒΜΡ πρωτεΐνες (bone morphogenetic proteins) και δεσµεύονται να εξελιχθούν στα κύτταρα της επιδερµίδας. Αντίστροφα, η δέσµευση προς εξέλιξη σε νευρικά κύτταρα επέρχεται όταν, επί απουσίας Wnt σηµατοδότησης, επιδρά το Sonic hedgehog µονοπάτι, και το εξώδερµα δύναται να δεχθεί διεγερτικά σήµατα από τους FGFs, τα οποία κατόπιν µειώνουνν τη ΒΜΡ σηµατοδότηση µέσω ανασταλτικών σηµάτων (εικόνα 1.17). Η εµβρυϊκή επιδερµίδα που προκύπτει από αυτή τη διαδικασία αποτελείται από µια µονοκύτταρη στιβάδα πολυδύναµων επιθηλιακών κυττάρων [Fuchs et al., 2007]. Εικόνα ιαφοροποίηση του δέρµατος. Επί απουσίας της Wnt σηµατοδότησης, τα εξωδερµικά προγονικά κύτταρα ανταποκρίνονται στους FGFs, και προχωρούν προς την κατεύθυνση της νευρογένεσης. Η Wnt σηµατοδότηση αναστέλλει την ικανότητα των πρώιµων εξωδερµικών προγονικών κυττάρων να ανταποκρίνονται στους FGFs, ενώ αντίθετα τους επιτρέπει να ανταποκρίνονται στη BMP σηµατοδότηση και να δεσµεύονταιι προς διαφοροποίηση προς επιδερµιδικά κύτταρα. Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, η µονόστιβη εµβρυϊκή επιδερµίδα εκφράζει Wnts. Κάποια κύτταρα αποτυγχάνουν να ανταποκριθούν στα Wnts, και αυτά είναι τα κύτταρα τα οποία οδεύουν προς διαφοροποίηση σε επιδερµιδικά κύτταρα υπό την επίδραση της BMP, EGF και Notch σηµατοδότησης. Αντιθέτως, τα κύτταρα τα οποία ανταποκρίνονται στη Wnt σηµατοδότηση, δέχονται επίσης την επίδραση FGF και BMP ανασταλτικών σηµάτων από το µεσέγχυµα, και ο συνδυασµός αυτός οδηγεί στη διαφοροποίησή τους προς εξάρτηµα του δέρµατος [Fuchs et al., 2007]. Μετά τη δηµιουργία του γαστριδίου κατά την τρίτη εβδοµάδα της κυήσεως, το έµβρυο καλύπτεται από µία µονοκύτταρη στιβάδα από κύτταρα προερχόµενα από το νευροεξώδερµα. Από τη στιβάδα αυτή θα προέλθει το νευρικό σύστηµ µα και η 42

43 επιδερµίδα. Η µονή αυτή στιβάδα επιµένει από την εµβρυϊκή ηµέρα 9.5 (E9.5) έως και την E12.5. Καθώς τα µεσεγχυµατικά κύτταρα αρχίζουν να αποικίζουν το δέρµα, µεταδίδουν σήµατα τα οποία προκαλούν τόσο τη στιβαδοποίηση της επιδερµίδας όσο και την έναρξη της µορφογένεσης των τριχοθυλακίων. Σε συνεργασία µε το µεσέγχυµα, η εσωτερική, ή αλλιώς βασική στιβάδα του δέρµατος παράγει και οργανώνει την υποκείµενη βασική µεµβράνη [Blanpain et al., 2009]. Η επιδερµίδα Η επιδερµίδα λοιπόν βρίσκεται προσκολληµένη στη βασική µεµβράνη η οποία λειτουργεί όχι µόνο προωθώντας την αύξηση αλλά και δρώντας ως φυσικό όριο µεταξύ του επιθηλίου και του χορίου. Όπως είδαµε λοιπόν, το έµβρυο αρχικά καλύπτεται από µονοκύτταρη στιβάδα εξωδερµικών κυττάρων. Στην αρχή του δεύτερου µήνα αυτό το επιθήλιο διαιρείται και στην επιφάνειά του προστίθεται µια στιβάδα αποπλατυσµένων και στενά συνδεδεµένων µεταξύ τους κυττάρων, το περιδέρµιο, ή επιτρίχιο, που αποτελεί µια καθαρά εµβρυϊκή δοµή, µοναδική στους ανθρώπους [Fuchs et al., 2007, Sadler 1999]. Με περαιτέρω πολλαπλασιασµό των κυττάρων της βασικής στιβάδας, έχουµε το σχηµατισµό και µιας τρίτης, ενδιάµεσης στιβάδας και έτσι, στο τέλος του τέταρτου µήνα η επιδερµίδα αποκτά την τελική µορφή της µε τις τέσσερεις, ή κατά τόπους πέντε στιβάδες της (βασική ή βλαστική, ακανθωτή, κοκκιώδης, διαυγής και κερατίνη) [Sadler 1999]. Τα κύτταρα του περιδερµίου συνήθως αποπίπτουν κατά τη διάρκεια του δευτέρου ηµίσεως της ενδοµήτριας ζωής και είναι δυνατή η ανίχνευσή τους στο αµνιακό υγρό, ενώ τα υπόλοιπα κύτταρα της επιδερµίδας κατά την µετάβασή τους προς την επιφάνεια, υφίστανται µια πληθώρα τροποποιήσεων ώστε να δηµιουργήσουν τις διακριτές στιβάδες του δέρµατος [Sadler 1999, Blanpain et al., 2009]. Το χόριο και ο υποδόριος ιστός Αντιθέτως, τόσο το χόριο, όσο και ο υποδόριος ιστός, προέρχονται από µεσεγχυµατικά κύτταρα που µεταναστεύουν από άλλες περιοχές µεσοδέρµατος. Αυτά τα µεσεγχυµατικά κύτταρα δίνουν γένεση σε ένα µεγάλο αριθµό κυττάρων του 43

44 αίµατος και του συνδετικού ιστού συµπεριλαµβανοµένων των ινοβλαστών και των mast κυττάρων του χορίου, καθώς και των λιποκυττάρων του υποδορίου ιστού [McGrath et al., 2004]. Κατά τη διάρκεια του τρίτου και του τέταρτου µήνα της ανάπτυξης, το χόριο σχηµατίζει πολλούς ακανόνιστους θηλώδεις σχηµατισµούς, της θηλές του χορίου, οι οποίες εισχωρούν στην υπερκείµενη επιδερµίδα [Sadler 1999]. Το εµβρυϊκό χόριο είναι αρχικά κυτταροβριθές, και κατά τη διάρκεια του δεύτερου µήνα της κύησης δεν είναι δυνατό να διακριθεί από τον υποκείµενο υποδόριο ιστό. Ινώδεις σχηµατισµοί κάνουν σύντοµα την εµφάνισή τους, και οι τυπικές δεσµίδες κολλαγόνων ινών είναι εµφανείς έως το τέλος του τρίτου µήνα της εµβρυϊκής ζωής. Αργότερα, τόσο η θηλώδης όσο και η δικτυωτή στιβάδα γίνονται εµφανείς και είναι διακριτές µεταξύ τους, ενώ κατά τη διάρκεια του πέµπτου µήνα έχουµε το σχηµατισµό των ινωδών θυλάκων που περιβάλλουν τα τριχοθυλάκια. Οι ελαστικές ίνες κάνουν την εµφάνισή τους περί την 22 η εβδοµάδα (εικόνα 1.18) [McGrath et al., 2004]. Eικόνα Σχηµατική απεικόνιση του σχηµατισµού του δέρµατος σε διάφορα στάδια της ανάπτυξης. Α. την 4η εβδοµάδα. Β. Την 7η εβδοµάδα. C. Την 11η εβδοµάδα. D. Στο νεογνό [Sadler 1999]. 44

45 Τα εξαρτήµατα του δέρµατος Τρίχες. Οι πρώτες ενδείξεις εµφάνισης τριχών κατά την εµβρυϊκή ζωή είναι κατά τη διάρκεια της ένατης εβδοµάδας στις περιοχές του οφρύος, του άνω χείλους και της κάτω σιαγόνας. Οι ενδείξεις αυτές περιλαµβάνουν µια πύκνωση από πυρήνες στη βασική στιβάδα της επιδερµίδας, η οποία συµβαίνει ως ανταπόκριση σε διεγερτικά µηνύµατα προερχόµενα από το παρακείµενο µεσέγχυµα [McGrath et al., 2004]. Οι τρίχες εµφανίζονται ως συµπαγείς παχύνσεις της επιδερµίδας, οι οποίες καταδύονται στο υποκείµενο χόριο. Στα τελικά τους άκρα οι βολβοί των τριχών κοιλαίνονται και αυτές οι κοιλάνσεις, οι θηλές των τριχών σύντοµα γεµίζουν µε µεσέγχυµα στο οποίο αναπτύσσονται νευρικές απολήξεις και αγγεία. Αργότερα, τα κύτταρα στο κέντρο του βολβού της τρίχας γίνονται ατρακτοειδή και κερατινοποιούνται σχηµατίζοντας το στέλεχος της τρίχας ενώ τα περιφερικά κύτταρα γίνονται κυβοειδή σχηµατίζοντας τον επιθηλιακό θύλακο της τρίχας [Sadler 1999]. Ο ινώδης θύλακος ο οποίος περιβάλλει τη ρίζα της τρίχας σχηµατίζεται από το περιβάλλον µεσέγχυµα. Συνεχής πολλαπλασιασµός των κυττάρων στη βάση του στελέχους ωθεί την τρίχα προς τα άνω και οδηγεί στην εµφάνιση των πρώτων τριχών στις περιοχές που προαναφέραµε. Αυτές οι τρίχες, το χνούδι (lanugo) αποπίπτουν περί την περίοδο του τοκετού και αργότερα αντικαθίστανται από αδρότερες τρίχες οι οποίες αναδύονται από νέα τριχοθυλάκια [Sadler 1999]. Νύχια, σµηγµατογόνοι και ιδρωτοποιοί αδένες. Οι τρίχες και οι σµηγµατογόνοι αδένες σχηµατίζονται ταυτόχρονα κατά τη διάρκεια του σχηµατισµού της τριχοσµηγµατογόνου συσκευής. Ο επιθηλιακός θύλακος της τρίχας παρουσιάζει συνήθως µια µικρή συµπαγή εκβλάστηση, την καταβολή του σµηγµατογόνου αδένα, η οποία εισχωρεί στο περιβάλλον µεσόδερµα. Τα κύτταρα περιέχουν µέτριες ποσότητες γλυκογόνου, αλλά σύντοµα τα κύτταρα του κέντρου αποβάλλουν το γλυκογόνο, αυξάνουν σε µέγεθος και γίνονται αφρώδη ενώ ταυτόχρονα συσσωρεύουν σταγονίδια λιπιδίων. Οι σµηγµατογόνοι αδένες διαφοροποιούνται περί την 13 η 15 η εβδοµάδα οπότε είναι ευµεγέθεις και λειτουργικοί. Μετά τη γέννηση το µέγεθός τους µειώνεται ραγδαία για να αυξηθεί εκ νέου µετά την εφηβεία. Οι όνυχες αρχίζουν να αναπτύσσονται κατά τη διάρκεια του τρίτου µήνα της κυήσεως. Από την άλλη, οι ιδρωτοποιοί αδένες ξεκινούν να 45

46 αναπτύσσονται στα πέλµατα και τις παλάµες περίπου κατά τον τρίτο µήνα εµβρυϊκής ζωής, αλλά η ανάπτυξή τους στο υπόλοιπο σώµα ολοκληρώνεται κατά τον πέµπτο µήνα [Sadler 1999, McGrath et al., 2004]. 46

47 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2. ΤΑ STEM (ΒΛΑΣΤΙΚΑ) ΚΥΤΤΑΡΑ Τα stem κύτταρα (βλαστοκύτταρα) είναι κύτταρα που χαρακτηρίζονται από δύο µοναδικές ιδιότητες: την ικανότητά τους για αυτοανανέωση (self-renewal) µέσω µιτωτικής κυτταρικής διαίρεσης, καθώς και τη δυνατότητα διαφοροποίησής τους προς ένα µεγάλο εύρος κυτταρικών τύπων πολυδυναµία (pluripotency) [Alison et al.,2009]. Πιο αναλυτικά, ως αυτοανανέωση αναφέρεται η ικανότητά τους να υφίστανται πολυάριθµους κύκλους κυτταρικής διαίρεσης διατηρούµενα ταυτόχρονα σε αδιαφοροποίητη κατάσταση. Αυτό επιτυγχάνεται µέσω επαναλαµβανόµενων κύκλων κυτταρικής διαίρεσης αποτέλεσµα των οποίων είναι η παραγωγή τουλάχιστον ενός θυγατρικού κυττάρου οµοίου µε το µητρικό, το οποίο µπορεί εν δυνάµει να διαφοροποιηθεί. Αυτή είναι και η κυριότερη ιδιότητα που χαρακτηρίζει τα stem κύτταρα [Smith 2006]. Όσον αφορά την πολυδυναµία (pluripotency), ο όρος αναφέρεται στο φάσµα επιλογών προς διαφοροποίηση που διαθέτει ένα κύτταρο. Η αυστηρή έννοια απαιτεί τα stem κύτταρα να είναι είτε totipotent (πανδύναµα) ή pluripotent (πολυδύναµα) ώστε να είναι ικανά να δώσουν γένεση σε κάθε κυτταρικό τύπο, στη πράξη όµως τα multipotent (πολυδύναµα) ή και unipotent (µονοδύναµα) προγονικά κύτταρα αποκαλούνται συχνά stem κύτταρα [Smith 2006]. Όπως γίνεται κατανοητό, τα stem κύτταρα έχουν ποικίλα επίπεδα δυναµικότητας (εικόνα 2.1). ιακρίνουµε δηλαδή τα: * Totipotent (αλλιώς omnipotent) stem κύτταρα, τα οποία έχουν τη δυνατότητα διαφοροποίησης τόσο σε εµβρυϊκούς, όσο και εξωεµβρυϊκούς κυτταρικούς τύπους όπως είναι η τροφοβλάστη. Τέτοιου είδους κύτταρα µπορούν να συνθέσουν έναν πλήρη και βιώσιµο οργανισµό. Σε αυτή την κατηγορία εντάσσεται το ζυγωτό καθώς και τα κύτταρα των πρώτων κυτταρικών διαιρέσεων του ζυγωτού. * Pluripotent stem κύτταρα, που είναι οι άµεσοι απόγονοι των totipotent κυττάρων και µπορούν να διαφοροποιηθούν προς όλα σχεδόν τα κύτταρα που προέρχονται και από τις τρεις βλαστικές στιβάδες, όχι όµως και να σχηµατίσουν έµβρυο καθώς δεν είναι ικανά να σχηµατίσουν τον πλακούντα και τους 47

48 υποστηρικτικούς του ιστούς. Τέτοια κύτταρα είναι τα εµβρυϊκά stem κύτταρα [Mitalipov et al., 2009].. * Multipotent stem κύτταρα, που δύνανται να διαφοροποιηθούν προς έναν αριθµό κυτταρικών σειρών που όµως ανήκουν στον ίδιο ιστό ή ιστούς. Ένα τέτοιο παράδειγµα αποτελούν τα αιµοποιητικά stem κύτταρα. * Oligopotent (ολιγοδύναµα) stem κύτταρα, που είναι ικανά να διαφοροποιηθούν προς µια ή δύο κυτταρικές σειρές εντός ενός ιστού. Χαρακτηριστικό παράδειγµα αποτελούν τα νευρικά stem κύτταρα τα οποία δίνουν γένεση είτε σε νευρικά κύτταρα, είτε σε κύτταρα γλοίας. * Unipotent κύτταρα, τα οποία έχουν την ικανότητα να διαφοροποιηθούν προς έναν µόνο κυτταρικό τύπο, τον δικό τους, όµως παράλληλα διατηρούν και τη δυνατότητα της αυτοανανέωσης, στοιχείο που τα διακρίνει από τα non-stem κύτταρα. Ως παράδειγµα αναφέρουµε τα σπερµατογόνια στον όρχι [Smith, 2006]. Εικόνα 2.1. Stem κύτταρα και διαφοροποίηση. Η οντογένεση του ανθρώπου ξεκινά από ένα και µοναδικό κύτταρο, το ζυγωτό. Τόσο το ζυγωτό, όσο και κάθε βλαστοµερίδιο στο πρώιµο έµβρυο είναι totipotent, διαθέτουν δηλαδή την ικανότητα δηµιουργίας ενός ολόκληρου οργανισµού. Με την πάροδο του χρόνου και την ανάπτυξη του οργανισµού, το δυναµικό διαφοροποίησης των βλαστοµεριδίων 48

49 σταδιακά ελαττώνεται, γεγονός που καταλήγει εν τέλει στη δηµιουργία pluripotent, multipotent, unipotent, και τελικώς διαφοροποιηµένων σωµατικών κυττάρων. Παρ όλ αυτά, το δυναµικό διαφοροποίησης των σωµατικών κυττάρων µπορεί να επανέλθει στα αρχικά επίπεδα µέσω των µεθόδων επαναπρογραµµατισµού που εξετάζονται αργότερα [Mitalipov et al., 2009]. Κατά τη διαδικασία της ανάπτυξης ενός οργανισµού, δεξαµενές αυτοχθόνων stem κυττάρων οργανώνονται εντός κάθε οργάνου µε σκοπό την διατήρηση της φυσιολογικής οµοιόστασης του οργάνου αυτού παρά τις αλλαγές που θα υφίσταται κατά τη διάρκεια της ζωής του. Ένα stem κύτταρο αποκαθιστά την ισορροπία µέσω µιας σειράς λειτουργιών του µόνο µία από τις οποίες είναι η αντικατάσταση των δυσλειτουργικών ή γηρασµένων κυττάρων. Οι υπόλοιπες λειτουργίες περιλαµβάνουν την τροποποίηση του εξωκυττάριου περιβάλλοντος ή ακόµα και την αποκατάσταση της µοριακής ισορροπίας ενδοκυττάρια σε κύτταρα τα οποία το stem κύτταρο είναι σχεδιασµένο να συνοδεύει και να αλληλεπιδρά µαζί τους [Singec et al., 2007]. ΓΕΓΟΝΟΤΑ ΟΡΟΣΗΜΑ ΣΤΟ ΠΕ ΙΟ ΤΩΝ STEM ΚΥΤΤΑΡΩΝ 1961: πειραµατικά δεδοµένα από τους Till και McCulloch αποδεικνύουν την ύπαρξη των multipotent αιµοποιητικών stem κυττάρων (HSCs). 1977: οι Salmon and Hamburger δηµοσιεύουν τη µελέτη τους όπου χρησιµοποίησαν µαλακό άγαρ προκειµένου να εκτιµηθεί η ανάπτυξη αποικιών από ανθρώπινα καρκινικά stem κύτταρα. 1978: εκφράζεται η πρόταση ύπαρξης εξειδικευµένου µικροπεριβάλλοντος, της φωλεάς, που στεγάζει και ρυθµίζει την ανάπτυξη των αιµοποιητικών stem κυττάρων, από τον Schofield. 1981: περιγράφεται η αποµόνωση πολυδύναµων εµβρυϊκών stem κυττάρων από την έσω κυτταρική µάζα (ICM) από δύο ανεξάρτητες ερευνητικές οµάδες σε βλαστοκύστες επιµύων. 1994: οι Sell and Pierce προτείνουν ότι το µπλοκάρισµα της διαφοροποίησης (ή αλλιώς, η παύση της ωρίµανσης - maturation arrest ) είναι ένας από τους µηχανισµούς που προκαλούν τον πολλαπλασιασµό των καρκινικών stem κυττάρων και την ανάπτυξη όγκων [Alison 2009]. 1996: κλωνοποίηση της Dolly από τους Ian Wilmut και Keith Campbell. 49

50 1998: αποµόνωση πολυδύναµων εµβρυϊκών stem κυττάρων από την έσω κυτταρική µάζα ανθρώπινων βλαστοκύστεων από την ερευνητική οµάδα του Thomson [Thomson et al., 1998]. 2004: η πρώτη τράπεζα stem κυττάρων στον κόσµο αποτελεί πλέον πραγµατικότητα, εδράζεται στο Ηνωµένο Βασίλειο και «αποθηκεύει» κυτταρικές σειρές ανθρώπινων εµβρυϊκών stem κυττάρων. 2006: η οµάδα των Takahashi και Yamanaka αποδεικνύει πως σωµατικά κύτταρα ενήλικων ποντικών είναι δυνατόν να «επαναπρογραµµατιστούν» προς πολυδύναµα stem κύτταρα µε την προσθήκη τεσσάρων παραγόντων, επιτυγχάνοντας µε αυτό τον τρόπο τη δηµιουργία επαγόµενων πολυδύναµων stem κυττάρων (induced pluripotent stem cells ips) [Alison 2009]. ΤΥΠΟΙ STEM ΚΥΤΤΑΡΩΝ Οι δύο τύποι stem κυττάρων που ανευρίσκονται στα θηλαστικά είναι: (1) τα εµβρυϊκά βλαστοκύτταρα (embryonic stem cells), τα οποία αποµονώνονται από την έσω κυτταρική µάζα της βλαστοκύστης (εικόνα 2.2), και, (2) τα σωµατικά βλαστοκύτταρα (adult stem cells) τα οποία ανευρίσκονται εντός των ενηλίκων ιστών. Στο αναπτυσσόµενο έµβρυο, τα εµβρυϊκά stem κύτταρα έχουν τη δυνατότητα διαφοροποίησης προς όλους τους εξειδικευµένους κυτταρικούς τύπους του οργανισµού. Στους ενήλικες οργανισµούς, τα stem κύτταρα και τα προερχόµενα από αυτά προγονικά κύτταρα δρουν, όπως είδαµε, ως σύστηµα επιδιόρθωσης του οργανισµού επανατροφοδοτώντας τον µε εξειδικευµένα κύτταρα, αλλά επίσης διατηρούν τις συνθήκες φυσιολογικής οµοιόστασης σε ιστούς και όργανα µε µεγάλη αναγεννητική ικανότητα όπως είναι δέρµα, το αίµα, και τα όργανα του γαστρεντερικού συστήµατος [Nelson et al., 2009]. Εικόνα 2.2. Η έσω κυτταρική µάζα. Τοµή παραφίνης από βλαστοκύστη επίµυος στην οποία διακρίνεται η έσω κυτταρική µάζα (inner cell mass- ICM) από την οποία αποµονώνονται τα εµβρυϊκά stem κύτταρα [Sellheyer et al., 2009]. 50

51 Εµβρυϊκά stem κύτταρα (ESCs) Όπως αναφέρθηκε νωρίτερα, τα εµβρυϊκά stem κύτταρα είναι πολυδύναµα κύτταρα που προέρχονται από την έσω κυτταρική µάζα της προεµφυτευτικής βλαστοκύστης. Τα κύτταρα αυτά δύνανται να δώσουν γένεση σε όλους τους ιστούς που ανήκουν στο είδος [Nelson et al., 2009, Smith 2006]. Η βλαστοκύστη είναι ουσιαστικά ένα πρώιµου σταδίου έµβρυο κατά προσέγγιση 4 5 ηµερών στους ανθρώπους, το οποίο αποτελείται από κύτταρα [Sadler et al., 1999]. Τα εµβρυϊκά stem κύτταρα είναι πολυδύναµα και καλύπτουν όλο το φάσµα των παραγώγων του εξωδέρµατος, µεσοδέρµατος και ενδοδέρµατος, έχοντας τη δυνατότητα να διαφοροποιηθούν σε όλους τους κυτταρικούς τύπους που ανευρίσκονται στον ενήλικα, κάτω από την επίδραση επαρκούς ερεθίσµατος που τα διεγείρει προς διαφοροποίηση προς ένα συγκεκριµένο κυτταρικό τύπο (εικόνα 2.3). ε συµµετέχουν όµως στη δηµιουργία των εξωεµβρυϊκών µεµβρανών και του πλακούντα. Πολλαπλές κυτταρικές σειρές έχουν αποµονωθεί από µια µεγάλη ποικιλία ειδών, από το ποντίκι έως και τον άνθρωπο [Nelson et al., 2009]. Τα ανθρώπινα εµβρυϊκά stem κύτταρα αποµονώθηκαν για πρώτη φορά πριν από µία δεκαετία περίπου [Thomson et al., 1998]. Εικόνα 2.3. ηµιουργία και διαφοροποίηση των εµβρυϊκών stem κυττάρων. Το ζυγωτό που προέρχεται από τη γονιµοποίηση ενός ωαρίου από ένα σπερµατοζωάριο, διαιρείται προς σχηµατισµό της βλαστοκύστης, η έσω κυτταρική µάζα (inner cell mass) της οποίας δίνει γένεση στο έµβρυο. Τα κύτταρα της έσω κυτταρικής µάζας, γνωστά και ως εµβρυϊκά stem κύτταρα (ES cells) µπορούν να 51

52 διατηρηθούν σε συνθήκες καλλιέργειας και έχουν τη δυνατότητα επαγωγής προς διαφοροποίηση προς διάφορες κυτταρικές σειρές. Στο έµβρυο, τα πολυδύναµα stem κύτταρα διαιρούνται ώστε να παραµένει η δεξαµενή τους σταθερή και ταυτόχρονα διαφοροποιούνται προς τις τρεις βλαστικές στιβάδες, που αργότερα θα σχηµατίσουν ολόκληρο το σώµα [Robbins et al., 2009]. Τα βασικά χαρακτηριστικά που πρέπει να πληρούνται προκειµένου να χαρακτηριστούν κύτταρα προερχόµενα από πρωτεύοντα θηλαστικά ως εµβρυϊκά stem κύτταρα είναι: (i) προέλευση από το προεµφυτευτικό ή περιεµφυτευτικό έµβρυο, (ii) παρατεταµένη αναπαραγωγή χωρίς σηµεία διαφοροποίησης, και (iii) σταθερό αναπτυξιακό δυναµικό για δηµιουργία και των τριών βλαστικών στιβάδων ακόµα και µετά από παρατεταµένη καλλιέργεια [Thomson et al., 1998]. ιάκριση εµβρυϊκών stem κυττάρων Χαρακτηριστικά των ανθρώπινων εµβρυϊκών stem κυττάρων είναι η µοναδική τους ικανότητα να αυτοανανεώνονται απεριόριστα σε κυτταρικές καλλιέργειες, το µεγάλο µήκος του τελοµεριδίου τους, ο υψηλός λόγος του πυρήνα προς το κυτταρόπλασµα, καθώς και η απαράµιλλη ικανότητα για διαφοροποίηση που διαθέτουν [Nelson et al., 2009]. Ένα ανθρώπινο εµβρυϊκό βλαστοκύτταρο διακρίνεται επίσης µέσω της παρουσίας συγκεκριµένων µεταγραφικών παραγόντων και πρωτεϊνών κυτταρικής επιφανείας (εικόνα 2.4). Οι µεταγραφικοί παράγοντες Oct4, Nanog, και Sox2 σχηµατίζουν το κύριο ρυθµιστικό δίκτυο που καταστέλλει την έκφραση των γονιδίων που οδηγούν σε διαφοροποίηση και εξασφαλίζουν τη διατήρηση της πολυδυναµίας. Ιδιαίτερα σηµαντικός στη διατήρηση της αδιαφοροποίητης κατάστασης φαίνεται να είναι ο παράγοντας Oct4 όταν συζεύγνυται µε τους Sox2 και E1A και αυτό το επιτυγχάνει µέσω διαφόρων σηµατοδοτικών µονοπατιών, όπως είναι αυτά που διαµεσολαβούνται από τους FGF-4 (fibroblast growth factor-4), Wnt, και TGF-β (transforming growth factor-β). Η πολυδυναµία στα εµβρυϊκά stem κύτταρα ποντικών διατηρείται µέσω ενός µηχανισµού που εξαρτάται από το µόριο STAT-3, ο µηχανισµός αυτός όµως δεν είναι διατηρηµένος και στους ανθρώπους όπου η πολυδυναµία είναι εξαρτώµενη από µία Src οικογένεια κινασών, και παρακολουθείται µέσω της έκφρασης µιας ποικιλίας δεικτών όπως είναι η αλκαλική φωσφατάση, ο Oct3/4, ο Nanog, ο Cripto/TDGF1, οι πρωτεογλυκάνες TRA-1-60/81, GCTM-2, και τα εµβρυϊκά αντιγόνα SSEA3 και SSEA4. Τα πλέον συχνά κυτταρικά αντιγόνα επιφανείας ως προς την χρησιµοποίηση 52

53 για αναγνώριση των hes cells είναι τα γλυκολιπίδια SSEA3 και SSEA4 και οι πρωτεογλυκάνες Tra-1-60 και Tra-1-81 [Adewumi et al., 2007]. Τα εµβρυϊκά stem κύτταρα των ποντικών εκφράζουν επίσης το αντιγόνο SSEA1 ενώ δεν εκφράζουν τα SSEA3 και SSEA4, γεγονός που τονίζει την ύπαρξη βασικών διαφορών ανάµεσα στα είδη όσον αφορά τα πρώιµα στάδια ανάπτυξης [Thomson et al., 1998]. Η πρώιµη δέσµευση προς διαφοροποίηση παρακολουθείται επίσης µέσω κάποιων δεικτών όπως είναι ο Sox1 για το νευροεξώδερµα, ο Pdx-1 για το ενδόδερµα και ο Flk-1 αντίστοιχα για το µεσόδερµα [Nelson et al., 2009]. Εικόνα 2.4. Έκφραση κυτταρικών δεικτών στα ανθρώπινα εµβρυϊκά stem κύτταρα. (A) Αλκαλική φωσφατάση. (B) SSEA1. Αδιαφοροποίητα κύτταρα αποτυγχάνουν να χρωσθούν για το αντιγόνο SSEA1 (µεγάλη αποικία, αριστερά). Περιστασιακή εµφάνιση αποικιών αποτελούµενων από µη χρωσµένα κεντρικά τοποθετηµένα αδιαφοροποίητα κύτταρα που περιβάλλονται από ένα πλαίσιο χρωσµένων, διαφοροποιηµένων επιθηλιακών κυττάρων (µικρή αποικία, δεξιά). (C) SSEA3. Μερικές µικρές αποικίες έχουν χρωσθεί οµοιόµορφα για το SSEA3 (αριστερή και κεντρική αποικία), αλλά οι περισσότερες περιέχουν µια µείξη από µερικά ασθενώς χρωµατισµένα κύτταρα και µια πλειοψηφία από µη χρωσµένα κύτταρα (δεξιά αποικία) ( D) SSEA4. (E) TRA (F) TRA-1-81 [Thomson et al., 1998]. Η ρύθµιση του κυτταρικού κύκλου (εικόνα 2.5) αποτελεί ένα ακόµα µοναδικό χαρακτηριστικό το οποίο διαχωρίζει τα εµβρυϊκά stem κύτταρα από τα διαφοροποιηµένα κύτταρα. Η διάρκεια του κυτταρικού κύκλου των ES κυττάρων είναι πολύ µικρότερη από αυτή του κυτταρικού κύκλου διαφοροποιηµένων κυττάρων και το γεγονός αυτό οφείλεται κατά κύριο λόγο στη µείωση της χρονικής διάρκειας της φάσης G1. Στις εµβρυϊκές ινοβλάστες ποντικών (mouse embryonic fibroblasts MEFs), η φάση G1 διαρκεί 15 έως 20 ώρες που αντιστοιχεί σε περισσότερο από το 80 % του κυτταρικού κύκλου. Αντιθέτως, τόσο στα εµβρυϊκά stem κύτταρα ποντικών, 53

54 όσο και σε αυτά των ανθρώπων, η φάση G1 διαρκεί 2 έως 4 ώρες που αντιστοιχεί µόνο στο 15 20% της χρονικής διάρκειας του κυτταρικού κύκλου [Zhao et al., 2008]. Εικόνα 2.5. Ο κυτταρικός κύκλος. Απεικονίζονται οι φάσεις του κυτταρικού κύκλου (G0, G1, G2, S, και M), καθώς και οι διεργασίες που λαµβάνουν χώρα σε έκαστη από αυτές. Τα διαφοροποιηµένα κύτταρα από ταχέως ανανεούµενους ιστούς όπως το δέρµα εισέρχονται διαρκώς σε νέους κύκλους διαίρεσης [Kumar et al., 2009]. Εµβρυϊκά βλαστοκύτταρα και περιορισµοί Η πολυδυναµία των εµβρυϊκών stem κυττάρων είναι η ιδιότητα η οποία προκαλεί και τους περιορισµούς για τη χρήση τους στην Αναγεννητική Ιατρική καθώς απαιτούνται εξειδικευµένα σήµατα προκειµένου τα κύτταρα αυτά να οδηγηθούν προς την επιθυµητή διαφοροποίηση. Ειδάλλως, εάν µεταφερθούν απευθείας σε έναν οργανισµό, διαφοροποιούνται προς πληθώρα κυτταρικών τύπων προκαλώντας την εµφάνιση τερατώµατος. Ένα άλλο πρόβληµα αποτελούν τα ηθικά διλήµµατα που εγείρονται από τη χρησιµοποίηση εµβρύων. Επιπλέον, καθώς τα ESCs προέρχονται από ιστούς εκτός του ιδίου οργανισµού, η µεταφορά τους σε έναν ενήλικα οργανισµό θεωρείται ως αλλογενής µεταµόσχευση. Παρ όλ αυτά, έχει παρατηρηθεί πως τα κύτταρα αυτά έχουν τη δυνατότητα ενσωµάτωσης µετά από χαµηλού επιπέδου ανοσοκαταστολή, πιθανώς λόγω πολύ χαµηλής έκφρασης των πρωτεϊνών MHC-1. Μία άλλη εξήγηση είναι η ύπαρξη ενός µηχανισµού παρακρινούς έκκρισης του TGFβ που αναστέλλει τοπικά τη λειτουργία των Τ-κυττάρων [Nelson et al., 2009]. Η ελεγχόµενη διαφοροποίηση των εµβρυϊκών stem κυττάρων και η αποφυγή της απόρριψής τους από τον ξενιστή είναι µόνο κάποια από τα προβλήµατα που έχουν να αντιµετωπίσουν οι ερευνητές, και για αυτό το λόγο οι θεραπευτικές εφαρµογές τους 54

55 έχουν παραµείνει µέχρι ώρας σε προκλινικό στάδιο. Μολαταύτα, λόγω των τεράστιας έκτασης δυνατοτήτων που διαθέτουν παραµένουν ένα πολύ σηµαντικό πεδίο έρευνας όσον αφορά την Αναγεννητική Ιατρική [Thomson et al., 1998]. Σωµατικά stem κύτταρα Ο όρος σωµατικό stem κύτταρο αναφέρεται σε κύτταρο που ανευρίσκεται σε έναν πλήρως ανεπτυγµένο οργανισµό και διαθέτει τις ιδιότητες της πολυδυναµίας και της αυτοανανέωσης. Τα κύτταρα αυτά είναι λίγα σε αριθµό και είναι δύσκολο να ανιχνευθούν, αλλά η ύπαρξή τους εξακριβώνεται σε µια πληθώρα ιστών. Τα περισσότερα σωµατικά stem κύτταρα είναι multipotent και αναφερόµαστε σε αυτά µε βάση την ιστική τους προέλευση (παραδείγµατος χάριν µεσεγχυµατικά stem κύτταρα, ενδοθηλιακά stem κύτταρα κ.ο.κ.) [Nelson et al., 2009, Alison et al., 2009]. Σωµατικά stem κύτταρα έχουν αποµονωθεί από διάφορους ιστούς µετά τη γέννηση, µεταξύ των οποίων ο λιπώδης ιστός και οι ορογόνοι υµένες, καθώς και το περιφερικό αίµα αλλά και το αίµα του οµφαλίου λώρου [Nelson et al., 2009]. Τα σωµατικά stem κύτταρα θεωρούνται ιδανικοί υποψήφιοι για χρήση στην Αναγεννητική Ιατρική λόγω της ευκολίας πρόσβασης σε αυτά, του αναπαραγωγικού τους δυναµικού και της αυτόλογης κατάστασης που βρίσκονται όσον αφορά το σύστηµα ανοσίας του οργανισµού [Behfar et al., 2008]. Παρά το γεγονός ότι πλέον είµαστε γνώστες του αναγεννητικού δυναµικού των stem κυττάρων που προέρχονται από το λιπώδη ιστό, καθώς και των αυτοχθόνων stem κυττάρων που συνδέονται µε την εγγενή ικανότητα επιδιόρθωσης των ώριµων ιστών, η παρούσα εµπειρία που διαθέτουµε βασίζεται κατά κύριο λόγο στα stem κύτταρα που προέρχονται από το µυελό των οστών [Nelson et al., 2009]. Ικανά να επαναδηµιουργούν όλα τα κύτταρα του αίµατος και να παρέχουν µεσεγχυµατικά κύτταρα µε µη αιµοποιητικό δυναµικό διαφοροποίησης, τα προερχόµενα από τον µυελό των οστών stem κύτταρα αποτελούν τον ακρογωνιαίο λίθο των εφαρµογών της Αναγεννητικής Ιατρικής στις µέρες µας καθώς έχουν χρησιµοποιηθεί επιτυχώς στη θεραπεία κυρίως αιµατολογικών νοσηµάτων µέσω της µεταµόσχευσης µυελού των οστών (εικόνα 2.6) [Alison et al., 2009, Nelson et al., 2009]. 55

56 Εικόνα 2.6. Σωµατικά stem κύτταρα. Τα σωµατικά stem κύτταρα είναι δυνατό να αποµονωθούν από µια µεγάλη ποικιλία ιστών όπως είναι ο λιπώδης ιστός, ο µυελός των οστών και το περιφερικό αίµα. Τα κύτταρα αυτά θεωρείται πως είναι multipotent, όπως φαίνεται στο παράδειγµα της εικόνας µε τα προερχόµενα από το µυελό των οστών stem κύτταρα τα οποία µπορεί να είναι είτε αιµοποιητικά προγονικά κύτταρα, ή µεσεγχυµατικά stem κύτταρα. Τα αιµοποιητικά stem κύτταρα δίνουν γένεση σε µια µεγάλη ποικιλία από απογόνους όπως φαίνεται στην εικόνα και χρησιµοποιούνται για τη θεραπεία αιµατολογικών νοσηµάτων. Το δυναµικό διαφοροποίησης των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων περιλαµβάνει επίσης ένα ευρύ φάσµα από ιστούς όπως είναι τα οστά, οι µύες, οι χόνδροι, τα κύτταρα του µυοκαρδίου, τα ηπατοκύτταρα και οι νευρώνες [Nelson et al., 2009]. Η χρήση των σωµατικών stem κυττάρων στην έρευνα και την Αναγεννητική Ιατρική δεν είναι τόσο αµφιλεγόµενη όσο αυτή των εµβρυϊκών stem κυττάρων, και αυτό διότι η παραγωγή τους δεν απαιτεί την καταστροφή εµβρύου. Επιπρόσθετα, επειδή σε κάποιες περιπτώσεις τα κύτταρα αυτά µπορεί να λαµβάνονται από το ίδιο άτοµο που τα έχει παράγει (ταύτιση δότη και δέκτη), ο κίνδυνος απόρριψης είναι ουσιαστικά µηδαµινός. Γίνεται πιο εκτεταµένη αναφορά στα κύτταρα αυτά αργότερα, όταν θα µελετηθούν τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα που αποτελούν υποπληθυσµό τους [Alison et al., 2009]. 56

57 ΦΩΛΕΑ ΤΩΝ STEM ΚΥΤΤΑΡΩΝ Όπως είδαµε προηγουµένως, τα stem κύτταρα εδρεύουν εντός όλων των ιστών του σώµατος, όπου είναι υπεύθυνα για τη διατήρηση των οµοιοστατικών συνθηκών, είτε σε κατάσταση ηρεµίας, είτε µετά την επίδραση επιβλαβούς ερεθίσµατος. Στην επίτευξη αυτής της προσπάθειάς τους βοηθούνται από το µικροπεριβάλλον τους, το οποίο επιδρά σε αυτά µέσω υποστηρικτικών και ρυθµιστικών σηµάτων που τους µεταδίδει [Walker et al., 2009]. Στους ενήλικες, τα stem κύτταρα εδρεύουν εντός ενός ανατοµικά προσδιορισµένου και εξειδικευµένου περιβάλλοντος που καλείται φωλεά (niche), το οποίο δρα υποστηρικτικά ως προς τα βλαστικά κύτταρα αλλά ποικίλλει ως προς τη φύση και την θέση αναλόγως του ιστού στον οποίον ευρίσκεται. Η φωλεά είναι η συνισταµένη όλων των παραγόντων, κυτταρικών και µοριακών, που διαντιδρούν και ρυθµίζουν το stem κύτταρο [Li et al., 2006]. Στην απλούστερη µορφή της, η φωλεά αποτελείται από ένα και µοναδικό κύτταρο, όπως στην περίπτωση του σκώληκα Caenorhabditis elegans, ή µπορεί να αποτελείται από µία οµάδα κυττάρων όπως στην περίπτωση των γεννητικών κυττάρων της Drosophila melanogaster. Πολύ µεγαλύτερη πολυπλοκότητα χαρακτηρίζει το µικροπεριβάλλον των stem κυττάρων που υπάρχουν εντός των ιστών διαφόρων συστηµάτων όπως είναι το νευρικό, το γαστρεντερικό, το αιµοποιητικό στους ανώτερους οργανισµούς (εικόνα 2.7) [Walker et al., 2009]. Εικόνα 2.7. Παραδείγµατα φωλεών stem κυττάρων σε διάφορους ιστούς. ANG1: angiopoietin-1, BMP: bone morphogenetic protein, CBC: crypt base columnar cell, C. Elegans: Caenorhabditis elegans, CPC: cyst progenitor cell (somatic stem cells), DPP: Decapentaplegic, D. 57

58 Melanogaster: Drosophila melanogaster, ECM: extracellular matrix, ESC: escort stem cell, FSC: follicle stem cell, GDNF: glial cell-line-derived neurotrophic factor, GSC: germline stem cell, HSC: haematopoietic stem cell, ISC: intestinal stem cell, JAK: Janus kinase, NI: none identified; OPN: osteopontin, SGZ: subgranular zone, Shh: sonic hedgehog, SLF: steel factor, SSC: spermatogonial stem cell, STAT: signal transducer and activator of transcription, SVZ: subventricular zone [Jones et al., 2008]. Ο µεγάλος αριθµός µελετών που έχει ως αντικείµενο αυτή τη δοµή και έχει πραγµατοποιηθεί τόσο σε θηλαστικά, όσο και στους οργανισµούς που προαναφέραµε, µας επιτρέπει να εξάγουµε κάποια ασφαλή συµπεράσµατα. Τα φυσιολογικά stem κύτταρα χρειάζονται µια συγκεκριµένη φωλεά ή µικροπεριβάλλον προκειµένου να αναπτυχθούν και να επιβιώσουν. Η φωλεά των stem κυττάρων εξυπηρετεί στο να ρυθµίζει τον αριθµό των stem κυττάρων και την λειτουργία τους, όπως επίσης και να προσαρµόζει τα stem κύτταρα σε αλλαγές συνθηκών. Είναι µια ανατοµική δοµή στην οποία τα stem κύτταρα αγκυροβολούν, και πληθώρα προσκολλητικών µορίων συµµετέχει τόσο στην αλληλεπίδραση µεταξύ stem κυττάρων και φωλεάς, όσο και µεταξύ stem κυττάρων και εξωκυττάριας ουσίας [Li et al., 2006]. Οι φωλεές των stem κυττάρων µπορούν να διακριθούν σε κυτταρικές, µη κυτταρικές και φωλεές καρκινικών stem κυττάρων, όπως φαίνεται στην εικόνα 2.8 [Xie et al., 2007]. Εικόνα 2.8. Τα stem κύτταρα και οι φωλεές τους. (A) Τα υποστηρικτικά κύτταρα (πράσινα) που βρίσκονται σε µια κυτταρική φωλεά, παρέχουν ένα προστατευτικό περιβάλλον στα stem κύτταρα (ροζ). Η φωλεά αποτελείται από διαφοροποιηµένους κυτταρικούς τύπους που τόσο µέσω της διακυτταρικής επαφής, όσο και µέσω εκκρινόµενων παραγόντων (πορτοκαλί βέλος) βοηθούν στη 58

59 διατήρηση των stem κυττάρων σε µια κατάσταση ηρεµίας. (B) Μη κυτταρικές φωλεές έχουν επίσης αναγνωρισθεί, όπως για παράδειγµα η ακυτταρική φωλεά στην ωοθήκη της Drosophila melanogaster. Σε αυτού του τύπου τις φωλεές, τα stem κύτταρα (ροζ) εδράζονται εντός µιας βασικής µεµβράνης και τα σήµατα τα οποία προωθούν την αυτοανανέωση προέρχονται από την εξωκυττάρια ουσία (ECM, κίτρινο). (C) Ο καρκίνος περιλαµβάνει κύτταρα µε ιδιότητες stem κυττάρων (cancer stem cells CSCs, κόκκινο) ένα σπάνιο πληθυσµό από αυτοανανεούµενα, πολυδύναµα, ογκοπαραγωγά κύτταρα. εν είναι πλήρως ξεκαθαρισµένο το πώς προκύπτουν τα καρκινικά stem κύτταρα, παρ όλ αυτά πιθανώς να προέρχονται, εν µέρει, από φυσιολογικά stem κύτταρα τα οποία έχουν συγκεντρώσει έναν αριθµό µεταλλάξεων. Οι µεταλλάξεις αυτές είναι πιθανόν να υποβοηθούν το καρκινικό stem κύτταρο να διαφεύγει του ελέγχου της φωλεάς του (µπλε). Εναλλακτικά, υπεύθυνες µπορεί να είναι αλλαγές στα σήµατα που δίνονται από την ίδια τη φωλεά [Xie et al., 2007]. Τα σήµατα τα οποία δέχεται το ευρισκόµενο εντός της φωλεάς stem κύτταρο µπορεί να είναι απότοκα της άµεσης αλληλεπίδρασής του µε τα κύτταρα της φωλεάς, µε µόρια της εξωκυττάριας ουσίας, ή µε διαλυτούς αυτοκρινείς, παρακρινείς, και ενδοκρινείς παράγοντες, η ισορροπία µεταξύ των οποίων παρέχει την εξασφάλιση της σωστής ρύθµισης του stem κυττάρου (εικόνα 2.9). Η φωλεά πρέπει να είναι ιδιαίτερα εξειδικευµένη και να παρέχει συγκεκριµένη οργάνωση όσον αφορά τον έλεγχο της αυτοανανέωσης ή της διαφοροποίησης των stem κυττάρων [Walker et al., 2009]. Κατά συνέπεια, η ίδια η φωλεά παράγει µόρια που ελέγχουν και ρυθµίζουν τον αριθµό, την αυτοανανέωση και τον προσδιορισµό της κατεύθυνσης διαφοροποίησης του κυττάρου. Πολλά ρυθµιστικά σηµατοδοτικά µόρια στα οποία περιλαµβάνονται τα Ηedgehog, Wnts, BMPs, FGFs, και ο Notch, έχει αποδειχθεί ότι διαδραµατίζουν σηµαντικότατο ρόλο τόσο στο να ρυθµίζουν την αυτοανανέωση, όσο και στο να ελέγχουν τη διαφοροποίηση, ούτως ώστε να διατηρείται η δεξαµενή των stem κυττάρων. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, τουλάχιστον όσον αφορά το αιµοποιητικό και γαστρεντερικό σύστηµα καθώς και τα τριχοθυλάκια, η φωλεά διατηρεί τα stem κύτταρα σε µία κατάσταση αδράνειας παρέχοντας σήµατα τα οποία αναστέλλουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό και ανάπτυξη, γεγονός που αποδεικνύεται από την ικανότητα των stem κυττάρων να διατηρούν τη σήµανση από βρωµοδεοξυουριδίνη για µεγάλο χρονικό διάστηµα [Li et al., 2006]. 59

60 Εικόνα 2.9. Επιµέρους τµήµατα και λειτουργίες της φωλεάς των stem κυττάρων. Η φωλεά συνιστά µια σύνθετη και δυναµική δοµή που λαµβάνει και µεταδίδει σήµατα διαµέσου κυτταρικών και µη κυτταρικών διαµεσολαβητών. Το σχήµα αυτό απεικονίζει τη σύνθεση µιας φωλεάς που συγκεντρώνει στοιχεία από γνωστές φωλεές stem κυττάρων τόσο σε θηλαστικά, όσο και σε µη θηλαστικά όπως είναι το ίδιο το stem κύτταρο, διαλυτοί παράγοντες, κύτταρα του στρώµατος, η εξωκυττάρια ουσία, νευρικές απολήξεις, αγγειακό δίκτυο καθώς και διάφορα είδη κυτταρικών συνδέσεων. Παρά το γεγονός ότι πολλά στοιχεία των φωλεών παραµένουν σταθερά, δεν είναι απαραίτητο η κάθε φωλεά να συµπεριλαµβάνει απαραιτήτως όλα τα παραπάνω στοιχεία. Αντιθέτως, συχνότερο φαινόµενο αποτελεί η ενσωµάτωση συγκεκριµένων µόνον από αυτά, γεγονός που διευκολύνει και προσαρµόζει την επικοινωνία του stem κυττάρου µε τις συγκεκριµένες λειτουργίες της φωλεάς του που συµβαδίζουν µε τις ιδιαίτερες ανάγκες κάθε ιστού [Jones et al., 2008]. ΑΣΥΜΜΕΤΡΗ ΙΑΙΡΕΣΗ Προκειµένου να εξασφαλίσουν την αυτοανανέωση, τα stem κύτταρα υφίστανται δύο διαφορετικούς τύπους κυτταρικής διαίρεσης. Η συµµετρική διαίρεση δίνει γένεση σε δύο πανοµοιότυπα θυγατρικά κύτταρα τα οποία διατηρούν εξ ολοκλήρου τις αρχικές ιδιότητες του stem κυττάρου από το οποίο προέρχονται. Τα προϊόντα της ασύµµετρης διαίρεσης, από την άλλη πλευρά, είναι ένα κύτταρο το οποίο είναι πανοµοιότυπο µε το αρχικό, καθώς και ένα προγονικό κύτταρο το οποίο όµως διαθέτει περιορισµένο δυναµικό αυτοανανέωσης. Τα προγονικά αυτά κύτταρα είναι δυνατό να υποστούν πολυάριθµους κύκλους κυτταρικής διαίρεσης προτού καταλήξουν στο να διαφοροποιηθούν προς ένα ώριµο κύτταρο [Beckmann et al., 2007]. 60

61 Η ασύµµετρη κυτταρική διαίρεση είναι η πιο ουσιώδης συνθήκη για την ανάπτυξη πολυκύτταρων οργανισµών, καθώς ένας πολυκύτταρος οργανισµός δεν αποτελεί απλά µια µάζα κυττάρων, αλλά ένα απαρτιωµένο σύνολο διακριτών κυτταρικών τύπων, καθένας εκ των οποίων έχει σηµαντικό ρόλο, τον οποίο διαδραµατίζει σε συγκεκριµένη χρονική στιγµή και θέση προκειµένου να συνεισφέρει στη συνολική λειτουργία του οργανισµού. Όπως είδαµε, τα stem κύτταρα εξ ορισµού χαρακτηρίζονται από την ικανότητα να δίνουν γένεση σε νέα stem κύτταρα (αυτοανανέωση) αλλά και σε κύτταρα που υφίστανται περαιτέρω διαφοροποίηση (πολυδυναµία) [Yamashita, 2009]. Με την ασύµµετρη διαίρεση επιτυγχάνουν και τα δύο ταυτόχρονα, δηλαδή τη δηµιουργία ενός θυγατρικού κυττάρου, πανοµοιότυπου µε το αρχικό, καθώς και τη δηµιουργία ενός πιο δεσµευµένου για συγκεκριµένη διαφοροποίηση, προγονικού κυττάρου. Το τελευταίο ονοµάζεται Τransit Αmplyfying Cell ή TAC. Τα Τransit Αmplyfying κύτταρα τελικά καθίστανται ανίκανα για πολλαπλασιασµό και µετατρέπονται σε τελικώς διαφοροποιηµένα (terminally differentiated ή TD) κύτταρα (εικόνα 2.10). Ο πληθυσµός τόσο των stem κυττάρων, όσο και των απογόνων τους µπορεί επίσης να παραµείνει σταθερός και µέσω της συµµετρικής διαίρεσης. Κάτι τέτοιο µπορεί να συµβεί µόνον εάν οποτεδήποτε ένα stem κύτταρο δίνει γένεση σε δύο θυγατρικά Τransit Αmplyfying κύτταρα, ταυτόχρονα ένα άλλο stem κύτταρο διαιρείται επίσης συµµετρικά αλλά δίνει γένεση σε δύο θυγατρικά stem κύτταρα [Caussinus et al., 2005]. Εικόνα Μοντέλο της συνεισφοράς των stem κυττάρων στην οµοιόσταση του δέρµατος. Τα σωµατικά stem κύτταρα του δέρµατος βρίσκονται εντός της φωλεάς τους όπου παραµένουν αδιαφοροποίητα και αδρανή. Η έξοδός τους από τη φωλεά και η διαίρεσή τους δίνει γένεση σε ένα πανοµοιότυπο stem κύτταρο που παραµένει στη φωλεά, αλλά και σε ένα transit amplifying (ΤΑ) 61

62 κύτταρο που εξέρχεται της φωλεάς και εισέρχεται σε πρόγραµµα τελικής διαφοροποίησης ώστε να δώσει ένα τελικώς διαφοροποιηµένο (TD) κύτταρο. Η πολυδυναµία και το δυναµικό αυτοανανέωσης χάνονται σταδιακά µε τη µετακίνηση προς τις καταστάσεις TA και TD [Aznar 2007]. Μηχανισµοί ασύµµετρης κυτταρικής διαίρεσης Από µελέτες που έχουν διεξαχθεί κυρίως στην Drosophila melanogaster, φαίνεται πως η ασύµµετρη κυτταρική διαίρεση διαµεσολαβείται από δύο κύριους µηχανισµούς. Ο πρώτος ελέγχεται από τον ασύµµετρο διαχωρισµό στα δύο θυγατρικά κύτταρα των ενδοκυτταρικών µορίων που καθορίζουν τη µοίρα του κυττάρου ( cell-intrinsic µηχανισµός) [Yamashita, 2009]. Όταν γίνεται χρήση αυτού του µηχανισµού, τα µόρια που ρυθµίζουν την αυτοανανέωση κατανέµονται ασύµµετρα κατά τη διάρκεια της µίτωσης µε αποτέλεσµα να κληρονοµούνται µόνο από το ένα θυγατρικό κύτταρο. Ήδη από την φάση της µεσόφασης, τα κύτταρα τα οποία υφίστανται την διαίρεση µε αυτό τον µηχανισµό χρησιµοποιούν την πολικότητα του περιβάλλοντος ιστού προκειµένου να εγκαταστήσουν και τον δικό τους άξονα πολικότητας. Καθώς εισέρχονται στη µίτωση, ο άξονας αυτός χρησιµοποιείται προκειµένου το κύτταρο να κατευθύνει τα εν λόγω ενδοκυττάρια µόρια και να προσανατολίσει την µιτωτική άτρακτο, ούτως ώστε τα µόρια αυτά να κληρονοµηθούν από το ένα µόνο θυγατρικό κύτταρο [Knoblich et al., 2008]. Ο δεύτερος µηχανισµός ελέγχεται από την ασύµµετρη τοποθέτηση έκαστου εκ των δύο θυγατρικών κυττάρων σε διαφορετικό µικροπεριβάλλον ( cell-extrinsic µηχανισµός) [Yamashita, 2009]. Με αυτό τον µηχανισµό, το stem κύτταρο που βρίσκεται σε στενή επαφή µε την φωλεά διατηρεί το δυναµικό αυτοανανέωσης. Η τοποθέτηση της µιτωτικής ατράκτου του καθέτως της επιφάνειας της φωλεάς διασφαλίζει ότι µόνο το ένα θυγατρικό κύτταρο κατορθώνει να διατηρήσει επαφή µαζί της. Σε αντίθεση µε τον πρώτο µηχανισµό ο οποίος συνηθέστερα λαµβάνει χώρα εντός ενός καλά οργανωµένου συστήµατος ανάπτυξης, ο δεύτερος παρέχει µεγαλύτερη ευελιξία (εικόνα 2.11). Αυτοί οι δύο µηχανισµοί µπορεί να συνδυάζονται ή να λειτουργούν ανεξάρτητα και αναλύονται εκτενέστερα αργότερα, στο κεφάλαιο που εξετάζει την ασύµµετρη διαίρεση στο δέρµα [Knoblich et al., 2008]. 62

63 Εικόνα Μηχανισµοί ασύµµετρης κυτταρικής διαίρεσης. Ενδογενής και εξωγενής ρύθµιση της αυτοανανέωσης των stem κυττάρων. (A) Τα stem κύτταρα διαθέτουν τη ικανότητα να δηµιουργούν έναν άξονα πολικότητας κατά τη διάρκεια της µεσόφασης, τον οποίο και χρησιµοποιούν προκειµένου να τοποθετήσουν µόρια που καθορίζουν την τύχη του κυττάρου ασύµµετρα κατά τη διάρκεια της µίτωσης. Ο προσανατολισµός της µιτωτικής ατράκτου σύµφωνα µε τον ίδιο άξονα πολικότητας εξασφαλίζει την ασύµµετρη κατανοµή των µορίων αυτών σε ένα µόνο από τα δύο θυγατρικά κύτταρα. (B) Η διαίρεση των stem κυττάρων πιθανώς να εξαρτάται από ένα σήµα για αυτοανανέωση που προέρχεται από την φωλεά. Ο προσανατολισµός της µιτωτικής ατράκτου καθέτως της επιφάνειας της φωλεάς διασφαλίζει ότι µόνον ένα από τα δύο θυγατρικά κύτταρα συνεχίζει να δέχεται την επίδραση αυτού του σήµατος και διατηρεί µε αυτό τον τρόπο την ικανότητα αυτοανανέωσης [Knoblich et al., 2008]. Τα stem κύτταρα διαθέτουν επίσης την ιδιότητα να διατηρούν τη χρώση από κάποιες ειδικές χρωστικές όπως είναι η βρωµοδεοξυουριδίνη (BrdU) και για αυτό το λόγο καλούνται και LRCs (Label Retaining Cells). Αυτή η ιδιότητά τους οφείλεται εν µέρει στον βραδύ ρυθµό πολλαπλασιασµού τους και εν µέρει στο γεγονός ότι τα νεοπαραχθέντα stem κύτταρα καθορίζουν µία από τις δύο αλυσίδες DNA σε κάθε χρωµόσωµα ως κλώνο - εκµαγείο ούτως ώστε σε κάθε κύκλο σύνθεσης DNA, ενώ και οι δύο αλυσίδες του DNA αντιγράφονται, µόνον ο κλώνος εκµαγείο και το αντίγραφό του µεταβιβάζονται στο θυγατρικό κύτταρο που παραµένει stem κύτταρο (εικόνα 2.12). Αυτό καλείται υπόθεση της αθάνατης αλυσίδας [Alison et al., 2009]. 63

64 Εικόνα Η υπόθεση της αθάνατης αλυσίδας του DNA [Alison et al., 2009]. ΠΟΛΥ ΥΝΑΜΙΑ Έλεγχος της πολυδυναµίας από µεταγραφικούς παράγοντες και αυτορρυθµιστικό κύκλωµα Όσον αφορά τη διατήρηση της πολυδυναµίας στα εµβρυϊκά stem κύτταρα, ένας αριθµός ερευνών έδειξε πως οι homeοdomain µεταγραφικοί παράγοντες Oct4 (γνωστός και ως POU5F1) και Nanog, καθώς και ο SOX2 (SRY box-containing factor 2) είναι οι βασικοί ρυθµιστές της αρχικής ανάπτυξης και διατήρησης της ταυτότητας των εµβρυικών stem κυττάρων. Τα µόρια αυτά εκφράζονται στην εσωτερική κυτταρική µάζα της βλαστοκύστης καθώς και στα πολυδύναµα εµβρυϊκά stem κύτταρα που προέρχονται από αυτή, και σχηµατίζουν ένα πολύπλοκο δίκτυο θετικής και αρνητικής ανατροφοδότησης [MacArthur et al., 2009]. Ο Oct4 ήταν το πρώτο από τα γονίδια που αναγνωρίστηκε ως ρυθµιστικό της πολυδυναµίας των stem κυττάρων. Οι Nichols et al. απέδειξαν ότι τα έµβρυα στα οποία ο Οct4 έχει κατασταλεί αναπτύσσονται έως το στάδιο της βλαστοκύστης αλλά σε αυτήν την περίπτωση τα κύτταρα της έσω κυτταρικής µάζας δεν είναι πολυδύναµα. Αυτό το κατάφεραν µέσω παρασκευής ενός ανενεργού αλληλίου για τον Oct4 µέσω οµόλογου ανασυνδυασµού σε εµβρυϊκά stem κύτταρα. Τα θηλυκά και 64

65 αρσενικά ζώα που ήταν ετεροζυγώτες για τη συγκεκριµένη µετάλλαξη ήταν ικανά για αναπαραγωγή και η µελέτη των εµβρύων τους (εικόνα 2.13) ανέδειξε την αυξηµένη θνητότητα των οµόζυγων για τη µετάλλαξη απογόνων [Nichols et al., 1998]. Το προφίλ έκφρασης του Oct4 δείχνει ότι πιθανώς επιδρά ρυθµιστικά ως προς την τύχη των κυττάρων πρώιµα κατά την ανάπτυξη [Pei et al., 2009]. Εικόνα Μελέτη των εµβρύων που προέκυψαν από τη διασταύρωση ζώων που έφεραν τη συγκεκριµένη µετάλλαξη για τον Oct4. (A) Η ανοσοϊστοχηµεία βλαστοκύστεων για β γαλακτοσιδάση την 3.5 ηµέρα ανέδειξε τρεις τύπους εµβρύων, τα µη χρωσµένα καθώς και αυτά που ήταν ασθενώς και µετρίως χρωσµένα. Αυτά αναλογούν στα µη φέροντα τη µετάλλαξη έµβρυα, σε αυτά που ήταν ετεροζυγώτες, και σε αυτά που ήταν οµοζυγώτες ως προς την µετάλλαξη, αντίστοιχα (στα σκουρόχρωµα κύτταρα µε το βέλος η έκφραση του Oct4 έχει κατασταλεί πλήρως). (B) Ανοσοϊστοχηµεία βλαστοκύστεων την 3.5 ηµέρα για τον Oct4. Η εικόνα δείχνει τρία έµβρυα των οποίων η έσω κυτταρική µάζα χρώσθηκε και τέσσερα µη χρωσµένα έµβρυα. Τα 25 από τα 32 έµβρυα που εξετάσθηκαν σε αυτό το στάδιο χρώσθηκαν ενώ το αντίστοιχο ποσοστό για έµβρυα που προέρχονταν από ζώα που δεν έφεραν τη µετάλλαξη ήταν 100% [Nichols et al., 1998]. Στα εµβρυϊκά stem κύτταρα η ρύθµιση αυτή φαίνεται να επέρχεται µε έναν δοσοεξαρτώµενο τρόπο. Χρησιµοποιώντας µια πειραµατική µέθοδο που περιελάµβανε την εκλεκτική έκφραση ή καταστολή του Oct4, οι Niwa et al. το 2000 έδειξαν ότι το επίπεδο ενεργότητάς του µπορεί να οδηγήσει σε τρεις διαφορετικές καταστάσεις όσον αφορά τα ES κύτταρα. Κατά πρώτον, η αύξησή του σε µικρό βαθµό (λιγότερο από το διπλάσιο) οδηγεί τα ES κύτταρα προς διαφοροποίηση σε πρώιµο ενδόδερµα και µεσόδερµα. Κατά δεύτερον, η καταστολή του οδηγεί στον σχηµατισµό τροφοεξωδέρµατος. Τέλος, µόνο ένα ιδανικό επίπεδο ενεργότητάς του µπορεί να συντηρήσει την αυτοανανέωση των stem κυττάρων [Niwa et al, 2000]. 65

66 Κάτι τέτοιο σηµαίνει πως ο Oct4 οφείλει να υπόκειται σε αυστηρό έλεγχο της έκφρασής του από ένα δίκτυο ρυθµιστικών παραγόντων προκειµένου να εξασφαλίζεται η πολυδυναµία [Cauffman et al., 2005]. Το γεγονός αυτό αναπόφευκτα δηµιούργησε το ερώτηµα του ποιοί µεταγραφικοί παράγοντες είναι αυτοί που εµπλέκονται στη ρύθµιση της έκφρασής του και οδήγησε στην ανάδειξη της σηµασίας του Nanog. Όπως δηλώνει και το όνοµά του (Tir Nan Og, the Land of the Young), ο παράγοντας αυτός διαθέτει την ικανότητα να συντηρεί την αυτοανανέωση των stem κυττάρων και επί απουσίας του παράγοντα LIF. Αυτό φαίνεται πως το επιτυγχάνει µέσω πρόσδεσης στον υποκινητή του Οct4 και ενεργοποίησης της έκφρασής του [Pei et al., 2009]. Από την άλλη πλευρά, ο Sox2 συχνά συνεργάζεται µε τον Oct4 για τη ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης. Η λειτουργία του οδηγεί στο σχηµατισµό της επιβλάστης και του εξωεµβρυϊκού εξωδέρµατος, κάτι το οποίο τονίζει το γεγονός ότι οι Sox2 και Oct4 συνεργικά καθορίζουν τη µοίρα των πολυδύναµων stem κυττάρων κατά την εµφύτευση. Πρόσφατα πειραµατικά δεδοµένα απέδειξαν ότι ο Sox2 είναι απαραίτητος για τη ρύθµιση πολλαπλών µεταγραφικών παραγόντων οι οποίοι µε τη σειρά τους επηρεάζουν την έκφραση του Οct4, και αυτή του η ιδιότητα τονίζει ακόµα περισσότερο τη συµµετοχή του στη διατήρηση της πολυδυναµίας [Pei et al., 2009]. Τέλος, ένας ακόµα παράγοντας, ο FoxD3, φαίνεται ότι είναι ιδιαίτερα σηµαντικός όσον αφορά την ενεργοποίηση της έκφρασης του Οct4, καθώς είναι ικανός να ενεργοποιεί τον υποκινητή του προσδενόµενος σε συγκεκριµένες αλληλουχίες [Pan et al., 2006]. Εκτός αυτού, ο Oct4 έχει την ικανότητα να αυτοκαταστέλλεται όταν υπερεκφράζεται. Καθώς τόσο ο Nanog, όσο και οι Sox2 και FoxD3 αποτελούν ενεργοποιητές της έκφρασης του Οct4, θα ήταν δύσκολο αυτή να διατηρηθεί στο ιδανικό επίπεδο όπως προαναφέρθηκε. Η ισορροπία διατηρείται λόγω ακριβώς της ιδιότητας του Oct4 να καταστέλλει τον ίδιο του τον υποκινητή όταν τα επίπεδά του ανέλθουν [Pan et al., 2006]. Οι Oct4, Nanog και Sox2 συνδέονται από κοινού σε µια πληθώρα γονιδίων και συχνά σε αλληλεπικαλυπτόµενα σηµεία εντός του γονιδιώµατος [Jaenisch et al., 2008]. Αυτό έγινε φανερό µετά από την ανάλυση του γονιδιώµατος σε ανθρώπινα εµβρυϊκά stem κύτταρα που πραγµατοποιήθηκε από τους Boyer et al., όπου αναγνωρίστηκαν πιθανοί στόχοι και των τριών αυτών παραγόντων [Pei et al., 2009]. 66

67 Το γεγονός αυτό πιθανόν υποδηλώνει ότι οι τρεις αυτοί παράγοντες δεν δρουν ανεξάρτητα, αλλά µε συντονισµένη δράση ώστε να διατηρήσουν το µεταγραφικό προφίλ που απαιτείται για το stemness (εικόνα 2.14). Με τεχνικές ανοσοκαθίζησης έχουν αποµονωθεί µεγάλα πρωτεϊνικά σύµπλοκα που περιέχουν τους Oct4 και Nanog σε εµβρυϊκά stem κύτταρα, στοιχείο που υποστηρίζει την παραπάνω υπόθεση [Jaenisch et al., 2008]. Εικόνα Πολυδυναµία των stem κυττάρων. (A) Οι τρεις κύριες ιδιότητες των stem κυττάρων, η αυτοανανέωση, η διαφοροποίηση και η δυνατότητά που διαθέτουν για επαναπρογραµµατισµό, απεικονίζονται σε αυτό το σχήµα όπου φαίνεται η συσχέτισή τους µε την πολυδυναµία. Τα πολυδύναµα stem κύτταρα απεικονίζονται στην κορυφή του βουνού, έτοιµα να διαφοροποιηθούν αυθόρµητα προς διάφορους κυτταρικούς τύπους (κάτω µέρος). Η κατάσταση πολυδυναµίας εξασφαλίζεται µε διατήρηση της έκφρασης του Οct4 σε βέλτιστο επίπεδο. Η διαφοροποίηση των stem κυττάρων συνεπάγεται τη σταδιακή απώλεια έκφρασης των γονιδίων που ελέγχουν την πολυδυναµία, και την ενεργοποίηση των γονιδίων που ελέγχουν τη διαφοροποίηση. Τα διαφοροποιηµένα σωµατικά κύτταρα δύνανται να επιστρέψουν, µέσω επαναπρογραµµατισµού, στην κατάσταση πολυδυναµίας (δεξιά). (Β) Πολλαπλοί παράγοντες συµµετέχουν στη διατήρηση της έκφρασης του Οct4 στα σωστά επίπεδα στα εµβρυϊκά stem κύτταρα [Pei et al., 2009]. Η αυτορρύθµιση πιστεύεται ότι ενισχύει την σταθερότητα της γονιδιακής έκφρασης, η οποία µε τη σειρά της συµβάλλει στη διατήρηση του stemness. Αυτό επιτελείται σε διάφορα επίπεδα [Jaenisch et al., 2008]. Συγκεκριµένα, οι Oct4 και Sox2 σχηµατίζουν ένα ετεροδιµερές που ρυθµίζει θετικά την έκφραση του Pou5f1 που κωδικοποιεί τον Oct4, καθώς και του Sox2 και του 67

68 Nanog. Το ίδιο συµβαίνει και µετά από αλληλεπίδραση του Nanog µε τον Oct4 η οποία επηρεάζει θετικά την έκφραση και των τριών γονιδίων. Με αυτόν τον τρόπο οι τρεις αυτοί µεταγραφικοί παράγοντες αλληλορρυθµίζουν τόσο τη δική τους έκφραση, όσο και την έκφραση άλλων σηµαντικών γονιδίων και καταστέλλουν την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται µε τη διαφοροποίηση όπως φαίνεται και στην παρακάτω εικόνα [MacArthur et al., 2009]. Εικόνα Η διατήρηση της πολυδυναµίας και της αυτοανανέωσης στα εµβρυϊκά stem κύτταρα ελέγχεται από πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις που αφορούν τη σηµατοδότηση από το εξωκυττάριο περιβάλλον αφ ενός, αλλά και το δυναµικό (dynamics) των κυρίων µεταγραφικών παραγόντων. Οι τρεις µεταγραφικοί αυτοί παράγοντες αλληλο- και αυτορρυθµίζουν την έκφρασή τους µε ένα περίπλοκο µοντέλο που περιλαµβάνει πολλές αγκύλες θετικής ανατροφοδότησης, τόσο µεταξύ πρωτεϊνών, όσο και µεταξύ πρωτεϊνών και του DNA. Οι παράγοντες αυτοί εµπλέκονται επίσης στην καταστολή µιας σειράς γονιδίων που συµµετέχουν στην κυτταρική διαφοροποίηση (δεξιά) ενώ ταυτόχρονα ενεργοποιούν τα γονίδια που σχετίζονται µε την αυτοανανέωση και την πολυδυναµία (αριστερά) [MacArthur et al., 2009]. Τα περισσότερα από τα γονίδια, που απεικονίζονται δεξιά στην ανωτέρω εικόνα, αποτελούν ταυτόχρονα στόχους και για την Polycomb οικογένεια πρωτεϊνών (PcG) όπως φαίνεται στο επόµενο σχήµα. Αυτές οι πρωτεΐνες είναι επιγενετικοί ρυθµιστές οι οποίοι καταστέλλουν την µεταγραφή µέσω αποσιώπησης της χρωµατίνης και σχηµατίζουν σύµπλοκα (PRCs) (εικόνα 2.16). Αυτά τα σύµπλοκα είναι διατηρηµένα 68

69 σε πολλούς οργανισµούς που περιλαµβάνουν την Drosophila melanogaster αλλά και τον άνθρωπο [Schuettengruber et al., 2007]. Πιο συγκεκριµένα, στα γονίδια αυτά ξεκινά µεν η µεταγραφή χωρίς όµως να υπάρχει λειτουργικό αποτέλεσµα καθώς η RNA πολυµεράση δεν είναι ικανή να ολοκληρώσει την µεταγραφή πιθανόν λόγω της κατασταλτικής δράσης των πρωτεϊνών PcG (εικόνα 2.17) [Jaenisch et al., 2008]. Εικόνα Οι πρωτεΐνες της Polycomb οικογένειας (PcG) καταστέλλουν τη µεταγραφή των γονιδίων που σχετίζονται µε διαφοροποίηση. [Bosnali et al., 2009]. Κατά έναν παράδοξο τρόπο, οι Oct4 και Sox2 παρέχουν επίσης τη δίοδο για την εξελικτική εξαφάνιση της πολυδυναµίας ελέγχοντας την έκφραση του FGF4. Το µόριο αυτό δρα ως αυτοεπαγωγικό διεγερτικό σήµα το οποίο ωθεί τα εµβρυϊκά stem κύτταρα προς διαφοροποίηση. Σηµαντικό είναι το γεγονός ότι το FGF4 / Erk σήµα δεν εξειδικεύεται ως προς κάποια συγκεκριµένη κυτταρική σειρά αλλά περισσότερο καθιστά τα ES κύτταρα ευάλωτα στην επίδραση περαιτέρω επαγωγικών σηµάτων. Ως συνέπεια, τα εµβρυϊκά stem κύτταρα ή η επιβλάστη που στερούνται του FGF4 ή της σηµατοδότησης από τη ΜΑΡΚ Erk1 / 2 (mitogen - activated protein kinase Erk1 / 2) παρουσιάζουν µια γενική αδυναµία για δέσµευση προς διαφοροποίηση [Silva et al., 2008]. 69

70 Εικόνα Ρόλος της RNA πολυµεράσης ΙΙ στο ρυθµιστικό κύκλωµα ενός ES κυττάρου. Οι µεταγραφικοί παράγοντες Oct4, Sox2, και Nanog (µπλε) συνδέονται ενεργά µε µεταγραφόµενα γονίδια που σχετίζονται όπως είδαµε µε τη διατήρηση της αδιαφοροποίητης κατάστασης και την αυτοανανέωση. Ταυτόχρονα συνδέονται και µε σιωπηλά γονίδια που η έκφρασή τους σχετίζεται µε πιο διαφοροποιηµένες κυτταρικές καταστάσεις. Στα εν λόγω γονίδια η RNA πολυµεράση II (POL2) ξεκινά µεν τη µεταγραφή αλλά δεν παράγει ολοκληρωµένα µετάγραφα λόγω της κατασταλτικής δράσης των PcG πρωτεϊνών. Οι πρωτεΐνες αυτές εµποδίζουν την RNA πολυµεράση να µετατραπεί σε µια πλήρως τροποποιηµένη µηχανή επιµήκυνσης (που αναπαριστάται στο σχήµα µε τα φωσφορυλιωµένα αστεράκια στην ουρά του ενζύµου). Στο κάτω αριστερά µέρος απεικονίζεται επίσης το κύκλωµα αυτορρυθµιστίας των Oct4, Nanog, και Sox2 [Jaenisch et al., 2008]. Χαρακτηριστικά πρόσδεσης στο DNA των παραγόντων Nanog, Oct4 και Sox2 Ο ακριβής τρόπος µε τον οποίο οι Nanog, Oct4 και Sox2 διαντιδρούν µε το DNA αποτελεί σε µεγάλο βαθµό και τον παράγοντα που καθορίζει τη λειτουργία τους. Ο Nanog διαθέτει ένα µοναδικό homeodomain για πρόσδεση στο DNA. Η αλληλουχία στην οποία προσδένεται ο Nanog αποτελεί σηµείο διαφωνίας µεταξύ των επιστηµόνων, µε πιθανότερες τις TAATGG και CATT. Ο Oct4 ανήκει στην οικογένεια των Octamer µεταγραφικών παραγόντων που ονοµάζονται έτσι λόγω της ικανότητάς τους να αναγνωρίζουν αλληλουχία οκτώ νουκλεοτιδίων, εν προκειµένω την ATGCAAAT. Τέλος, ο Sox2 είναι µέλος της HMG - box οικογένειας πρωτεϊνών. Ο Sox2 αλληλεπιδρά µε το DNA µέσω πρόσδεσής του στην αλληλουχία A/TA/TCAAAG. Ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι ο Oct4 και ο Sox2 δρουν συνεργικά προκειµένου να προσδεθούν στο DNA [Chambers et al., 2009]. 70

71 ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΕΠΑΝΑΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΟΣ Από το 1989 εκατοντάδες κυτταρικές σειρές εµβρυϊκών βλαστοκυττάρων έχουν αναπτυχθεί από χρήση εµβρύων που προέρχονται από εξωσωµατική γονιµοποίηση (IVF). Παρ όλ αυτά, το γεγονός αυτό έχει προκαλέσει µια πληθώρα αντιδράσεων καθώς εγείρει µια πλειάδα από ηθικούς προβληµατισµούς. Έτσι δηµιουργήθηκε η ανάγκη για ανεύρεση εναλλακτικών τεχνικών για τη δηµιουργία πολυδύναµων κυττάρων οι οποίες δε θα περιελάµβαναν τη χρήση ανθρώπινων ωοκυττάρων ή εµβρύων [Rolletschek et al., 2009]. Η επανάσταση επήλθε το 2006, όταν οι Yamanaka και Takahashi κατάφεραν να επιδείξουν για πρώτη φορά in vitro επαναπρογραµµατισµό ινοβλαστών ποντικών προς δηµιουργία επαγόµενων πολυδύναµων stem κυττάρων (induced pluripotent stem cells ips) µέσω ενσωµάτωσης µε τη χρήση ρετροϊών στο γονιδίωµα των ινοβλαστών γονιδίων σχετιζόµενων µε την πολυδυναµία [Takahashi et al., 2006]. Αυτά τα ips κύτταρα αποδείχθηκε πως ήταν λειτουργικά και µοριακά παρόµοια µε τα εµβρυϊκά stem κύτταρα [Rolletschek et al., 2009]. Πιο αναλυτικά, οι ερευνητές αυτοί κατόρθωσαν να επαναπρογραµµατίσουν ινοβλάστες εµβρύων ποντικών (mouse embryonic fibroblasts MEFs) καθώς και ινοβλάστες ενήλικων ζώων σε πολυδύναµα ips κύτταρα µέσω µεταφοράς µε ρετροϊούς στα κύτταρα αυτά των τεσσάρων µεταγραφικών παραγόντων Oct4, Sox2, c - myc, και Klf4. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής. Αφού ανακαλύφθηκε ποιά γονίδια εκφράζονται σε µεγάλο βαθµό στα εµβρυϊκά stem κύτταρα, διαλέχτηκαν 24 από αυτά για να µεταφερθούν. Εν τέλει, η ύπαρξη µόνον τεσσάρων γονιδίων από αυτά που προαναφέρθηκαν αποδείχθηκε πως είναι αρκετή για να επάγει τον επαναπρογραµµατισµό των ινοβλαστών προς κύτταρα που προοµοίαζαν µε εµβρυϊκά stem κύτταρα [Pei et al., 2009]. Η επιλογή των κυττάρων έγινε µε την ενεργοποίηση ενός γονιδίου στόχου του µεταγραφικού παράγοντα Oct4, του Fbx15 (εικόνα 2.18Α). Τα κύτταρα στα οποία είχε ενεργοποιηθεί το γονίδιο αυτό φάνηκε πως ήταν πολυδύναµα λόγω της ικανότητάς τους να σχηµατίζουν τερατώµατα, αν και δεν ήταν ικανά να δώσουν γένεση σε ζωντανά χιµαιρικά ζώα. Αυτή η κατάσταση πολυδυναµίας ήταν σε εξάρτηση από τη συνεχή ιική έκφραση των µεταφερόµενων γονιδίων Oct4 και Sox2, ενώ την ίδια στιγµή τα ενδογενή γονίδια των Oct4 και Nanog είτε δεν εκφράζονταν καθόλου, ή εκφράζονταν σε χαµηλότερο επίπεδο εν σχέσει µε τα εµβρυϊκά stem κύτταρα, και οι αντίστοιχοι υποκινητές φάνηκε πως ήταν σε µεγάλο βαθµό 71

72 µεθυλιωµένοι. Αυτή η παρατήρηση συνάδει µε το συµπέρασµα ότι τα Fbx15-iPS κύτταρα δεν αντιστοιχούν στα ES κύτταρα αλλά πιθανώς αναπαριστούν µια ηµιτελή κατάσταση επαναπρογραµµατισµού [Jaenisch et al., 2008]. Ταυτόχρονα, επετεύχθη το ίδιο αποτέλεσµα και από τους Yu et al. οι οποίοι χρησιµοποίησαν τους παράγοντες Pou5f1, Sox2, Nanog, και την προσδένουσα RNA πρωτεΐνη LIN28 [Ralston et al., 2010]. Όταν η ενεργοποίηση των ενδογενών γονιδίων Oct4 ή Nanog χρησιµοποιήθηκε ως ένα πιο αυστηρό κριτήριο επιλογής για κύτταρα που βρίσκονται σε κατάσταση πολυδυναµίας, τα Oct4-iPS ή Nanog-iPS κύτταρα, σε αντίθεση µε τα Fbx15-iPS κύτταρα βρέθηκε να είναι πλήρως επαναπρογραµµατισµένα σε µια πολυδύναµη κατάσταση που ήταν όµοια µε αυτή των εµβρυϊκών stem κυττάρων, γεγονός που ταυτοποιήθηκε τόσο µε βιολογικά, όσο και µε µοριακά κριτήρια (εικόνα 2.18Β) [Jaenisch et al., 2008, Maherali et al., 2007, Wernig et al., 2007]. Εικόνα Επαναπρογραµµατισµός των σωµατικών κυττάρων προς πολυδύναµα κύτταρα. Η µεταφορά των τεσσάρων µεταγραφικών παραγόντων Oct4, Sox2, c - myc, και Klf4 σε ινοβλάστες σηµατοδοτεί την εκκίνηση της µετατροπής τους είτε προς µερικώς επαναπρογραµµατισµένα κύτταρα τα οποία εκφράζουν το Fbx15, ή προς πλήρως επαναπρογραµµατισµένα ips κύτταρα τα οποία εκφράζουν τον Oct4 ή το Nanog. Η διαδικασία συµπεριλαµβάνει µια αλληλουχία από στοχαστικά επιγενετικά γεγονότα. (B) Σχήµατα επιλογής. Κύτταρα τα οποία φέρουν δείκτες αντοχής σε φάρµακα στα γονίδια Fbx15, Oct4, ή Nanog επάγονται µε τους τέσσερεις παράγοντες. Εν συνεχεία, επιλέγονται 72

73 τα κύτταρα στα οποία ενεργοποιούνται τα συγκεκριµένα γονίδια καθώς εµφανίζουν αντοχή στα αντιβιοτικά σε συνθήκες καλλιέργειας [Jaenisch et al., 2008]. Πιο αναλυτικά, στα κύτταρα αυτά η συνολική γονιδιακή έκφραση και η διάταξη της χρωµατίνης είναι πανοµοιότυπες µε των ES κυττάρων. Επιπλέον, σε αντίθεση µε τα Fbx15 - ips κύτταρα, η κατάσταση πολυδυναµίας στα Oct4 ips και Nanog-iPS κύτταρα εξαρτάται από τη δραστηριότητα των πλήρως επαναπρογραµµατισµένων και υποµεθυλιωµένων υποκινητών των ενδογενών Oct4 και Nanog και όχι από τους µεταφερόµενους από τους ιούς παράγοντες. Επιπρόσθετα, το ανενεργό Χ χρωµόσωµα των σωµατικών κυττάρων επανενεργοποιούνταν στα ips κύτταρα και, επίσης, τα Oct4 ips και Nanog - ips κύτταρα είχαν τη δυνατότητα να δώσουν γένεση σε χιµαιρικά ζώα [Maherali et al., 2007, Wernig et al., 2007]. Οι δείκτες πολυδυναµίας όπως η αλκαλική φωσφατάση (AP), το SSEA1, και οι Oct4 ή Nanog κάνουν την εµφάνισή τους διαδοχικά κατά τη διάρκεια του επαναπρογραµµατισµού (εικόνα 2.19Α) [Wernig et al., 2007, Jaenisch et al., 2008]. Εικόνα 2.19Α. Ο επαναπρογραµµατισµός περιλαµβάνει διαδοχική ενεργοποίηση των δεικτών πολυδυναµίας. Κύτταρα θετικά για την αλκαλική φωσφατάση (ΑΡ) και το αντιγόνο SSEA1 ανιχνεύονται ήδη από την 3η και 9η ηµέρα αντίστοιχα µετά τη µεταφορά των µεταγραφικών παραγόντων, ενώ η ενεργοποίηση των ενδογενών Oct4 και Nanog γίνεται αφού περάσουν δύο εβδοµάδες, γεγονός που συνεπάγεται ότι οι µεταφερόµενοι µεταγραφικοί παράγοντες απαιτείται να εκφράζονται για περίπου δύο εβδοµάδες ώστε να ξεκινήσει η διαδικασία του επαναπρογραµµατισµού [Jaenisch et al., 2008]. Η έκφραση των µεταγραφικών παραγόντων του επαναπρογραµµατισµού στις ινοβλάστες φαίνεται πως σηµατοδοτεί την έναρξη µιας αλληλουχίας από στοχαστικά γεγονότα που τελικά οδηγεί σε ένα µικρό ποσοστό από ips κύτταρα. Αυτή η άποψη 73

74 υποστηρίζεται από κλωνικές αναλύσεις οι οποίες δείχνουν ότι η ενεργοποίηση των δεικτών της πολυδυναµίας µπορεί να συµβεί σε διαφορετικές χρονικές στιγµές µετά τη µόλυνση από τους ιούς φορείς σε κάθε θυγατρικό κύτταρο της ίδιας ινοβλάστης [Meissner et al., 2007]. Κατ αυτό τον τρόπο, η έκτοπη έκφραση των Oct4, Sox2, c-myc, και Klf4 δύναται να πυροδοτήσει µια αλληλουχία από επιγενετικά γεγονότα όπως είναι οι τροποποιήσεις της χρωµατίνης ή οι αλλαγές της µεθυλίωσης του DNA που εν τέλει καταλήγουν στην απόκτηση πολυδύναµου φαινότυπου µόνον από ορισµένα από τα επιµολυσµένα κύτταρα (εικόνα 2.19Β). Αυτά τα πειράµατα επίσης έδειξαν ότι η πιθανότητα επιτυχούς επαναπρογραµµατισµού αυξάνεται µε την πάροδο του χρόνου, µε περισσότερο από το 0.5 % των MEFs να δίνει γένεση σε ips κύτταρα µετά από 3 έως 4 εβδοµάδες [Meissner et al., 2007]. Αυτό που µένει να διευκρινιστεί είναι το κατά πόσον τα µερικώς επαναπρογραµµατισµένα Fbx15- ips κύτταρα αποτελούν σταθερά ενδιάµεσα στη διαδικασία του επαναπρογραµµατισµού ή εάν αντιπροσωπεύουν έναν γενετικά οµοιογενή πληθυσµό από κύτταρα που βρίσκονται σε διαφορετικά στάδια επαναπρογραµµατισµού [Jaenisch et al., 2008]. Εικόνα 2.19Β. Ο επαναπρογραµµατισµός περιλαµβάνει µια αλληλουχία από στοχαστικά επιγενετικά συµβάµατα. Η πρωτεΐνη GFP εκφράζεται από τους ενδογενείς γενετικούς τόπους Oct4 ή Nanog. Όταν σε Oct4-GFP ή Nanog-GFP ινοβλάστες εισήχθησαν οι τέσσερεις µεταγραφικοί παράγοντες, οι αποικίες που αναπτύχθηκαν λίγες ηµέρες αργότερα ήταν αρνητικές γιa την GFP και εµφάνιζαν αλλοιωµένο φαινότυπο. Στη συνέχεια όµως αναπτύχθηκαν αποικίες στις οποίες εκφραζόταν η GFP σε διαφορετικές χρονικές στιγµές. Καθώς όλοι οι υποκλώνοι προέρχονταν από το ίδιο αρχικό κύτταρο, φαίνεται πως η ύπαρξη στοχαστικών επιγενετικών γεγονότων είναι ιδιαιτέρως σηµαντική κατά τη διαδικασία του επαναπρογραµµατισµού [Jaenisch et al., 2008]. 74

75 Τα micrornas Μια οµάδα από micrornas εκφράζεται ειδικά στα εµβρυϊκά stem κύτταρα. Ο ακριβής ρόλος που διαδραµατίζουν τα micrornas στη διατήρηση της πολυδυναµίας παραµένει ασαφής, καθώς τα ES κύτταρα στα οποία δεν εκφράζεται το Dicer ή το DGCR8, ένζυµα δηλαδή που απαιτούνται για την επεξεργασία των micrornas, συνεχίζουν να εκφράζουν όλους τους µοναδικούς δείκτες που χαρακτηρίζουν την αδιαφοροποίητή τους κατάσταση [Wang et al., 2007]. Αντιθέτως, τα κύτταρα αυτά παρουσιάζουν ελαττώµατα στη διαφοροποίηση, γεγονός που υποδεικνύει ότι τα micrornas διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο στη δέσµευση προς διαφοροποίηση σε συγκεκριµένη κυτταρική σειρά [Zhao et al., 2008]. Μια σειρά µελετών έχει αναδείξει το ρόλο που διαδραµατίζουν τα micrornas (mirnas) στον επαναπρογραµµατισµό των ινοβλαστών προς πολυδύναµα stem κύτταρα. Οι Yu et al. το 2007 αναγνώρισαν την πρωτεΐνη LIN28 που έχει την ικανότητα να συνδέεται µε mirnas και συγκεκριµένα µε το mirna let7 (Mirlet7) ως ικανή να επαναπρογραµµατίσει ανθρώπινες ινοβλάστες σε συνδυασµό µε τους παράγοντες POU5F1, SOX2, και NANOG. Μια άλλη µελέτη από τους Judson et al. το 2009 αναγνώρισε µια υποοµάδα από mirnas που ανήκει στην mir οικογένεια, τα οποία βελτιώνουν την ικανότητα επαναπρογραµµατισµού στα ποντίκια όταν συνδυάζονται µε τους POU5F1, SOX2, και KLF4. Ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι και οι δύο οδοί που προαναφέρθηκαν περιλαµβάνουν το MYC (εικόνα 2.20) [Ralston et al., 2010]. Εικόνα ραστηριότητα των µεταγραφικών παραγόντων κατά τον κυτταρικό επαναπρογραµµατισµό και ρόλος των mirnas. Τα mirnas δύνανται να επηρεάσουν τη σταθερότητα του MYC, µολαταύτα µπορούν να δράσουν και σε µεταγενέστερο στάδιο ενισχύοντας κάποιες συµπεριφορές των stem κυττάρων [Ralston et al., 2010]. 75

76 Εκτός όµως από αυτόν που αναφέρθηκε προηγουµένως, υπάρχουν τρεις ακόµα τρόποι επαναπρογραµµατισµού των σωµατικών κυττάρων οι οποίοι αναπτύσσονται επιγραµµατικά παρακάτω. Επαναπρογραµµατισµός µέσω πυρηνικής µεταφοράς (SCNT) Με αυτή τη µέθοδο, ο πυρήνας ενός σωµατικού κυττάρου αποµακρύνεται από το κύτταρο και τοποθετείται εντός ενός ωοκυττάρου από το οποίο έχει αποµακρυνθεί ο πυρήνας, και µετά από την επίδραση διεγερτικών ερεθισµάτων, το κύτταρο που προκύπτει αρχίζει να διαιρείται προχωρώντας στο σχηµατισµό βλαστοκύστης, τα κύτταρα της οποίας όπως είναι αναµενόµενο έχουν πανοµοιότυπο DNA µε τον αρχικό οργανισµό [Yamanaka 2008]. Μια σηµαντική εξέλιξη στον τοµέα αυτό έγινε όταν, το 1996, οι Campbell και Wilmut έκαναν µεταφορά πυρήνα από διαφοροποιηµένα κύτταρα ενός εµβρύου προβάτου εννέα ηµερών και πέτυχαν στο να κλωνοποιήσουν υγιή πρόβατα. Αργότερα ο Wilmut κατόρθωσε να κλωνοποιήσει το διάσηµο πλέον πρόβατο, Dolly, χρησιµοποιώντας πυρήνες που είχαν προέλθει από ωοθυλάκιο. Αργότερα κλωνοποιήσεις εφαρµόστηκαν και σε άλλα ζώα. Η τεχνική αυτή όµως έχει πολέµιους σε πολλές χώρες καθώς εγείρει ηθικά διλήµµατα που αφορούν τόσο τη χρησιµοποίηση ανθρώπινων εµβρύων και ωοκυττάρων, όσο και την πιθανή δηµιουργία ανθρωπίνων κλώνων [Yamanaka 2008]. Επαναπρογραµµατισµός µέσω σύµπτυξης µε ES κύτταρα Μία άλλη τεχνική περιλαµβάνει την σύµπτυξη ενός σωµατικού κυττάρου µε ένα εµβρυϊκό κύτταρο, εµβρυϊκό γεννητικό κύτταρο (EG) ή κύτταρο από εµβρυϊκό καρκίνωµα (EC). Το 1965, πρώτος ο Harris έδειξε ότι η σύµπτυξη HeLa κυττάρων µε ιούς Sendai ήταν ικανή να ενεργοποιήσει ερυθροκύτταρα. Το 1976, οι Miller και Ruddle επέδειξαν ότι τα κύτταρα του θύµου αποκτούσαν την ιδιότητα της πολυδυναµίας µετά από σύµπτυξη µε EC κύτταρα. Μια σειρά πειραµάτων ακολούθησε και διενεργήθηκε ακόµα και επαναπρογραµµατισµός µέσω σύµπτυξης µε ανθρώπινα ES κύτταρα το 2005 [Yamanaka 2008]. 76

77 Ένα σηµαντικό πρόβληµα µε αυτή την τεχνική παραµένει το γεγονός ότι τα κύτταρα που παράγονται περιέχουν χρωµοσώµατα τα οποία προέρχονται όχι µόνον από το σωµατικό κύτταρο αλλά και από το ES κύτταρο. Ως αποτέλεσµα, είναι αρκετά πιθανή η απόρριψη µετά την εµφύτευση [Yamanaka 2008]. Επαναπρογραµµατισµός επαγόµενος από την καλλιέργεια Όπως αναφέρθηκε προηγούµενα, πολυδύναµα κύτταρα έχουν προέλθει από διάφορες πηγές εµβρυϊκής προέλευσης όπως είναι τα βλαστοµερίδια και η έσω κυτταρική µάζα της βλαστοκύστης (ES κύτταρα), η επιβλάστη (EpiSC κύτταρα), εµβρυϊκά γεννητικά κύτταρα (EG κύτταρα), καθώς και µεταγεννητικά σπερµατογόνια ( magscs, ES-like κύτταρα). Έχει φανεί πως πολυδύναµα magscs ή κύτταρα που προσοµοιάζουν µε εµβρυϊκά stem κύτταρα είναι δυνατό να αποµονωθούν έπειτα από παρατεταµένη καλλιέργεια σωµατικών κυττάρων in vitro. Ενώ η πλειονότητα από αυτούς τους πολυδύναµους κυτταρικούς τύπους ήταν ικανοί για in vitro διαφοροποίηση και σχηµατισµό τερατωµάτων, µόνο τα ES, EG, EC, και τα magcss ή τα ES-like κύτταρα αποτελούν πολυδύναµα κύτταρα µε πιο αυστηρά κριτήρια (εικόνα 2.21) [Jaenisch et al., 2008]. Εικόνα Συχνά χρησιµοποιούµενα λειτουργικά κριτήρια του αναπτυξιακού δυναµικού των κυττάρων [Jaenisch et al., 2008]. 77

78 Εικόνα Οι τέσσερεις στρατηγικές επαναπρογραµµατισµού των σωµατικών κυττάρων. (1) Η πυρηνική µεταφορά (somatic cell nuclear transfer - SCNT) περιλαµβάνει τη µεταφορά ενός πυρήνα σωµατικού κυττάρου εντός ενός ωοκυττάρου από το οποίο έχει αφαιρεθεί ο πυρήνας, το οποίο µετά από µεταφορά του σε παρένθετη µητέρα µπορεί να δώσει γένεση σε έναν κλώνο ( αναπαραγωγική κλωνοποίηση ), ειδάλλως, µετά από ανάπτυξη σε καλλιέργεια, µπορεί να δώσει γένεση σε γενετικά ταυτόσηµα εµβρυϊκά stem κύτταρα. (2) Η σύµπτυξη σωµατικών κυττάρων µε εµβρυϊκά stem κύτταρα καταλήγει στη δηµιουργία υβριδίων που παρουσιάζουν όλα τα χαρακτηριστικά των πολυδύναµων εµβρυϊκών εµβρυϊκά stem κυττάρων. (3) Η ανάπτυξη σωµατικών κυττάρων σε καλλιέργεια µπορεί να δώσει γένεση σε αθάνατες κυτταρικές σειρές που µπορεί να είναι είτε pluripotent είτε multipotent. Επί του παρόντος, τα σπερµατογόνια αποτελούν τη µοναδική πηγή πολυδύναµων κυττάρων που µπορούν να προέλθουν από ζώα µετά την γέννησή τους. (4) Η επαγωγή σωµατικών κυττάρων µέσω χρήσης καθορισµένων παραγόντων µπορεί να προκαλέσει τον επαναπρογραµµατισµό τους προς µία πολυδύναµη κατάσταση [Jaenisch et al., 2008]. Χρησιµοποίηση των ips στην Ιατρική Η πιθανή θεραπευτική χρησιµότητα των ips κυττάρων αναδείχθηκε µε µία πρόσφατη µελέτη κατά την οποία, οι Hanna et al. το 2007 θεράπευσαν επιτυχώς ποντίκια µε δρεπανοκυτταρική αναιµία συνδυάζοντας κυτταρική και γονιδιακή θεραπεία. Τα ips κύτταρα προήλθαν από ινοβλάστες από την άκρη της ουράς ενός ποντικού µε δρεπανοκυτταρική αναιµία. Το µεταλλαγµένο αλλήλιο της β αιµοσφαιρίνης επισκευάστηκε στα ips κύτταρα µέσω οµόλογου ανασυνδυασµού. Τα επιδιορθωµένα ips κύτταρα διαφοροποιήθηκαν προς αιµοποιητικά stem κύτταρα και µεταµοσχεύθηκαν ξανά στο ποντίκι µε την αναιµία. Η ανάλυση του περιφερικού 78

79 αίµατος 12 εβδοµάδες µετά τη µεταµόσχευση αποκάλυψε την ύπαρξη φυσιολογικού αίµατος και τη βελτίωση των συµπτωµάτων (εικόνα 2.23) [Hanna et al., 2007]. Εικόνα Αυτόλογα ips κύτταρα από ινοβλάστες hβ S /hβ S ποντικιών µετατρέπονται σε ips cells που δε φέρουν τη µετάλλαξη και µεταµοσχεύονται εκ νέου στο ζώο. Ο in vitro επαναπρογραµµατισµός των ινοβλαστών του δέρµατος µε καθορισµένους µεταγραφικούς παράγοντες συνδυάζεται µε γονιδιακή και κυτταρική θεραπεία προκειµένου να θεραπεύσει τη δρεπανοκυτταρική αναιµία στα ποντίκια [Hanna et al., 2007]. Σε σύγκριση µε τις άλλες προϋπάρχουσες τεχνικές, ο επαναπρογραµµατισµός µέσω χρήσης συγκεκριµένων µεταγραφικών παραγόντων είναι σχετικά εύκολος και αποτελεσµατικός. Σε αντίθεση µε την πυρηνική µεταφορά δεν απαιτείται η ύπαρξη ανθρώπινων ωοκυττάρων ή προεµφυτευτικών εµβρύων. Επιπλέον, τα ips κύτταρα διατηρούν έναν φυσιολογικό καρυότυπο που αντιστοιχεί µε τον καρυότυπο του δότη, αντίθετα δηλαδή απ ότι συµβαίνει κατά την παραγωγή πολυδύναµων κυττάρων µέσω σύµπτυξης µε ES κύτταρα [Zhao et al., 2008]. Σε ορθώς επαναπρογραµµατισµένα ips κύτταρα, τα µεταφερόµενα γονίδια που ανήκουν στον ιικό µεταφορέα αποσιωπούνται πλήρως. Αποτυχία αποσιώπησης είναι 79

80 ενδεικτική ατελούς επαναπρογραµµατισµού και αυξάνει τον κίνδυνο καρκινογένεσης από το ογκογονίδιο cmyc. Προκειµένου να αποφευχθεί αυτός ο κίνδυνος, έχουν αναπτυχθεί νέες µέθοδοι όπως µη ενσωµατούµενοι επισωµατικοί µεταφορείς, και το PiggyBac σύστηµα τρανσπονζονίων [Na et al., 2010]. Μολαταύτα, καθώς και οι τέσσερεις χρησιµοποιούµενοι παράγοντες είναι εν δυνάµει ογκογονίδια, αυτά τα ips κύτταρα δε θεωρούνται αρκετά ασφαλή προς θεραπευτική χρήση και µεγάλος αριθµός εργαστηριακών ερευνών είναι αφιερωµένος στην ανεύρεση µορίων που µπορούν να τους υποκαταστήσουν [Pei et al., 2009]. Ο in vitro επαναπρογραµµατισµός των σωµατικών κυττάρων προς ips κύτταρα προσφέρει µεγάλη ποικιλία νέων δυνατοτήτων για χρησιµοποίησή τους τόσο στη βασική έρευνα όσο και στην Αναγεννητική Ιατρική. Η πλέον πολλά υποσχόµενη εφαρµογή είναι η παραγωγή ειδικών για κάθε ασθενή (patient-specific) ips κυττάρων για αντικατάσταση κυττάρων ή ακόµα ολόκληρων ιστών εντός του ίδιου οργανισµού (εικόνα 2.24). Για παράδειγµα, τα ips κύτταρα που έχουν επαχθεί από ινοβλάστες έχουν το δυναµικό συγκρότησης σε µικρές οµάδες που προσοµοιάζουν µε τα νησίδια του παγκρέατος και φαίνεται πως απελευθερώνουν ινσουλίνη ως απάντηση στην άνοδο της γλυκόζης. Εκτός αυτού, είναι ιδιαίτερη η χρησιµότητα των κυττάρων αυτών για τη µελέτη της παθογένειας διαφόρων νόσων και της επίδρασης των φαρµάκων που συνεπάγεται την χρήση τους και από τις επιστήµες της τοξικολογίας και της φαρµακολογίας [Rolletschek et al., 2009]. Εικόνα Βιοτεχνολογία και stem κύτταρα. Πολυδύναµα stem κύτταρα που λειτουργούν ως εµβρυϊκά stem κύτταρα µπορούν να παραχθούν µέσω της θεραπευτικής κλωνοποίησης και του πυρηνικού επαναπρογραµµατισµού. Αυτά τα κύτταρα αποτελούν bona fide πολυδύναµα stem κύτταρα 80

81 και οι ιστοί στους οποίους δίνουν γένεση είναι γενετικά όµοιοι µε αυτούς του δότη του σωµατικού κυττάρου. Με την τεχνολογία αυτή είναι δυνατή η παραγωγή αυτόλογων stem κυττάρων που είναι όµοιοι µε τα εµβρυϊκά, τα οποία µπορούν να καταστήσουν δυνατή την εφαρµογή κυτταρικών θεραπειών [Nelson et al., 2009]. ΕΠΙΓΕΝΕΤΙΚΗ Ορισµός Ο όρος επιγενετική πρωτοανεφέρθηκε τη δεκαετία του 1940 από τον Conrad Waddington, ο οποίος την όρισε ως τον κλάδο της βιολογίας που µελετά τις αιτιολογικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ των γονιδίων και των παραγώγων τους, οι οποίες προκαλούν την εµφάνιση συγκεκριµένου φαινοτύπου (εικόνα 2.25). Σύµφωνα µε τον αρχικό αυτό ορισµό, η επιγενετική αναφερόταν σε όλα τα µοριακά µονοπάτια που ρυθµίζουν την έκφραση ενός γονότυπου προς έναν συγκεκριµένο φαινότυπο. Το εύρος των διαδικασιών που περιλαµβάνει στις µέρες µας αυτός ο ορισµός έχει περιοριστεί σε µεγάλο βαθµό. Έτσι, ο ορισµός που είναι σήµερα αποδεκτός, αναφέρει την επιγενετική ως τη µελέτη των αλλαγών της λειτουργίας των γονιδίων οι οποίες είναι µιτωτικά ή / και µειωτικά κληρονοµήσιµες και οι οποίες δεν περιλαµβάνουν αλλαγές της αλληλουχίας του DNA, εξ ου και το όνοµα επι γενετική [Dupont et al., 2009]. Εικόνα Η επιγενετική τοπογραφία του Waddington. Πριν από περισσότερα από 50 χρόνια, ο Conrad Waddington διατύπωσε την αντίληψη ότι η εξέλιξη συµβαίνει µε τρόπο παρόµοιο µε µία µπάλα η οποία κυλά σε έναν χώρο που χαρακτηρίζεται από πολλαπλούς λόφους και κοιλάδες: καθώς η εξέλιξη προχωρά, το κύτταρο (µπάλα) µπορεί να ακολουθήσει διαφορετικά µονοπάτια εντός του χώρου αυτού και έτσι να καταλήξει στην απόκτηση διαφορετικών φαινοτύπων και λειτουργιών (κοιλάδες - διαφοροποίηση). Η διαφοροποίηση ελέγχεται καθώς οι λόφοι δρουν ως φραγµοί οι οποίοι χωρίζουν το µέρος αυτό σε διαφορετικές κοιλάδες, 81

82 δηλαδή σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους. Με αυτό τον τρόπο γίνεται κατανοητό ότι η διαφοροποίηση δεν είναι µόνιµη αλλά αντιθέτως, διαφορετικές κυτταρικές καταστάσεις διατηρούνται λόγω της ύπαρξης των επιγενετικών φραγµών οι οποίοι είναι δυνατόν να υπερκεραστούν εάν υπάρξει επαρκές ερέθισµα. Καθώς µπορεί να υπάρχουν πολλά διαφορετικά µονοπάτια ανάµεσα σε δύο κοιλάδες (είτε άµεσα είτε µέσω ενδιάµεσων σταθµών) γίνεται κατανοητό πως ο επαναπρογραµµατισµός ενός κυτταρικού τύπου προς έναν διαφορετικό µπορεί να επιτευχθεί µέσω πολυάριθµων διαφορετικών οδών [MacArthur et al., 2009]. Οι διεργασίες της επιγενετικής είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση ενός οργανισµού, αλλά συµβαίνουν και στους ενήλικες οργανισµούς, είτε λόγω τυχαίας αλλαγής, είτε κάτω από την επίδραση του περιβάλλοντος. Οι επιγενετικοί µηχανισµοί προστατεύουν επίσης το κύτταρο από τα γονιδιώµατα των ιών, τα οποία σε διαφορετική περίπτωση θα οικειοποιούνταν των κυτταρικών µηχανισµών προς δικό τους όφελος [Jaenisch et al., 2003]. Επιγενετικοί µηχανισµοί Οι επιγενετικοί µηχανισµοί περιλαµβάνουν τα ακόλουθα: 1. Μεθυλίωση του DNA (DNA methylation) Πρόκειται για επιλεκτική µεθυλίωση των κυτοσινών της δινουκλεοτιδικής αλληλουχίας CpG (κυτοσίνη φωσφο-γουανίνη). Η έκταση της µεθυλίωσης του DNA αλλάζει µε έναν συντονισµένο τρόπο κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των θηλαστικών, ξεκινώντας µε ένα κύµα αποµεθυλίωσης εντός ωρών από τη γονιµοποίηση και συνεχίζει µε de novo µεθυλίωση µετά την εµφύτευση. Η έκταση αυτής της µεθυλίωσης φαίνεται πως µειώνεται στη συνέχεια σε συγκεκριµένους ιστούς κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης [Jaenisch et al., 2003]. Κατά κανόνα η µεθυλίωση αποτελεί έναν τρόπο άρσης της έκφρασης ενός γονιδίου, δηλαδή τα προϊόντα τα οποία κωδικοποιεί ένα γονίδιο παύουν να παράγονται όταν αυτό µεθυλιωθεί. Αντιθέτως τα γονίδια τα οποία δεν είναι µεθυλιωµένα παραµένουν ενεργά. Η µεθυλιωµένη κυτοσίνη αντιστοιχεί συνήθως σε µια κλειστή µορφή χρωµατίνης και στην αποσιώπηση γονιδίων. Το προφίλ µεθυλίωσης µεταφέρεται κατά τη κυτταρική διαίρεση και αλλάζει κατά τη διάρκεια της ζωής [Blanpain et al., 2009]. 82

83 Η µεθυλίωση του DNA είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των θηλαστικών και συµβαίνει στην πλειονότητα των σωµατικών κυττάρων. Επιτελείται και διατηρείται από τρία ένζυµα, τις DNA µεθυλοτρανσφεράσες Dnmt1, Dnmt3a και Dnmt3b. ύο επιπρόσθετα, οµόλογα ένζυµα, οι Dnmt2 και Dnmt3l, εκφράζονται σε µια ποικιλία κυτταρικών τύπων στους οποίους περιλαµβάνονται και τα ES κύτταρα. Η έλλειψη του Dnmt1 καταλήγει σε εµβρυϊκό θάνατο την 8 η έως 9 η ηµέρα εµβρυϊκής ζωής [Meissner 2010]. 2.Τροποποιήσεις των ιστονών ( histone modifications ) Περιλαµβάνουν την τροποποίηση τόσο των ιδίων των ιστονών όσο και των οµοιοπολικών συνδέσεων που βρίσκονται στα άκρα τους. Οι τροποποιήσεις αυτές έχουν ως αποτέλεσµα την αναδιαµόρφωση της δοµής της χρωµατίνης, γεγονός που µπορεί να οδηγήσει είτε σε έκφραση είτε σε αποσιώπηση κάποιων γονιδίων [Blanpain et al., 2009]. Πολλά από τα ένζυµα που ρυθµίζουν αυτές τις τροποποιήσεις έχουν µελετηθεί εκτεταµένα και περιλαµβάνουν ακετυλοτρανσφεράσες, αποακετυλάσες, µεθυλοτρανσφεράσες και αποµεθυλάσες των ιστονών (εικόνα 2.26) [Meissner, 2010]. Οι πιο καλά µελετηµένες τροποποιήσεις είναι οι τριµεθυλιώσεις των Lys9 και Lys27 καταλοίπων στην ιστόνη H3 (H3K9me3 και H3K27me3), που έχουν κατασταλτικές ιδιότητες, καθώς και η H3K4me3 και H3K9 ακετυλίωση (H3K9ac), που σχετίζονται µε ενεργά γονίδια [Hemberger et al., 2010]. Εικόνα Τροποποιήσεις των ιστονών. Κατάλοιπα αµινοξέων στα µόρια των ιστονών και ιδιαιτέρως αυτά τα οποία βρίσκονται τοποθετηµένα στα αµινοτελικά τους άκρα υπόκεινται σε διάφορες 83

84 µετα µεταφραστικές τροποποιήσεις όπως µεθυλίωση, ακετυλίωση, φωσφορυλίωση, ουβικουϊτίνωση κ.α., κάποιες εκ των οποίων είναι αναστρέψιµες, όπως η ακετυλίωση. Οι τροποποιήσεις των ιστονών έχουν συσχετισθεί µε ενεργή και ανενεργή κατάσταση της χρωµατίνης, καθώς και µε συγκεκριµένες κυτταρικές διεργασίες στις οποίες συµπεριλαµβάνονται η µίτωση, η σπερµατογένεση και η επιδιόρθωση του DNA [Spivakov et al., 2007]. Ανάµεσα στους πιο καλά µελετηµένους διαµεσολαβητές είναι τα πρωτεϊνικά συµπλέγµατα των οµάδων PcG (polycomb) και trxg (trithorax). Οι PcG πρωτεΐνες καταλύουν δύο διαφορετικές τροποποιήσεις των ιστονών: την τριµεθυλίωση της λυσίνης 27 της ιστόνης 3 (H3K27me3) από το σύµπλεγµα PRC2 (polycomb repressive complex 2) και την µονο-ουβικουϊτίνωση της λυσίνης 119 H2A (H2AK119ub1) από το PRC1 [Meissner, 2010]. 3. Παρεµβάσεις από small interfering RNAs (sirnas) Πρόκειται για µικρά τµήµατα RNA, µήκους νουκλεοτιδίων τα οποία προέρχονται από δίκλωνο RNA (dsrna), και ενεργοποιούν µονοπάτια τα οποία ρυθµίζουν αρνητικά τη γονιδιακή έκφραση µέσω µετα µεταγραφικών µηχανισµών [Spivakov et al., 2007]. Η παρεµβολή του RNA ή RNAi όπως αποκαλείται, είναι το φαινόµενο που προκαλεί τη µεταµεταγραφική σίγαση ενός γονιδίου µετά από ενδογενή παραγωγή ή από εισαγωγή στο κύτταρο ενός µικροµοριακού παρεµβατικού RNA µε αλληλουχία συµπληρωµατική µε αυτή του γονιδίου. Η γονιδιακή σίγαση µέσω της οδού του RNAi ενεργοποιείται από την ύπαρξη του dsrna. Το ένζυµο Dicer, που είναι µέλος της οικογένειας των RNAσών ΙΙΙ, κόβει το δίκλωνο RNA προς σχηµατισµό sirnas. Tα sirnas ξετυλίγονται και η µία από τις δύο έλικες ενσωµατώνεται σε ένα σύµπλεγµα µορίων που συνιστούν τη νουκλεάση RISC RNA δηµιουργώντας ένα σύµπλοκο που επάγει τη γονιδιακή σίγαση. Η έλικα αυτή στη συνέχεια υβριδίζεται µε το συµπληρωµατικό RNA-στόχο και ενεργοποιεί τη νουκλεάση που το καταστρέφει [Blanpain et al., 2009]. Επιγενετική και stem κύτταρα Τόσο τα αδιαφοροποίητα όσο και τα δεσµευµένα προς διαφοροποίηση εµβρυϊκά stem κύτταρα χρησιµοποιούνται ευρέως για τη µελέτη των επιγενετικών µηχανισµών 84

85 [Meissner 2010]. Ένας λόγος γι αυτό, φαίνεται να είναι το γεγονός οτι η χρωµατίνη τείνει να είναι λιγότερο συµπαγής και επιτρέπει περισσότερο τη µεταγραφή στα αδιαφοροποίητα ES κύτταρα εν συγκρίσει µε άλλα, διαφοροποιηµένα κύτταρα [Spivakov et al., 2007]. Λειτουργικές µελέτες έχουν δείξει ότι η ύπαρξη των περισσότερων επιγενετικών τροποποιήσεων, συµπεριλαµβανόµενης και της µεθυλίωσης του DNA, δεν είναι απαραίτητη για την επιβίωση πολυδύναµων κυττάρων σε καλλιέργεια. Παρ όλο όµως που αυτά τα εµβρυϊκά stem κύτταρα φαίνεται πως µπορούν να επιβιώσουν, δεν κατορθώνουν να διατηρήσουν το αναπτυξιακό τους δυναµικό [Meissner 2010]. Το επιγένωµα (η γενική επιγενετική κατάσταση δηλαδή ενός κυττάρου) των εµβρυϊκών stem κυττάρων χαρακτηρίζεται από την αποµεθυλίωση των περιοχών των υποκινητών παραγόντων που διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο όσον αφορά την πολυδυναµία, όπως είναι οι Oct4, Sox2 και Nanog, καθώς και από τροποποιήσεις της χρωµατίνης που αφορούν πάλι αυτούς τους µεταγραφικούς παράγοντες. Κάτι τέτοιο εξασφαλίζει υψηλό επίπεδο έκφρασης των παραγόντων που εξασφαλίζουν την πολυδυναµία. Ταυτόχρονα, το κύτταρο παραµένει σε κατάσταση ετοιµότητας όσον αφορά τη διαφοροποίηση, εάν επιδράσουν πάνω του τα κατάλληλα ερεθίσµατα [Na et al., 2010]. Ενώ έως τότε οι περισσότερες έρευνες της επιγενετικής είχαν διεξαχθεί σε πειραµατόζωα, το 2007, οι Pan et al. διενέργησαν ανάλυση όλου του γονιδιώµατος για ανεύρεση της τριµεθυλίωσης της λυσίνης 4 και της λυσίνης 27 στην ιστόνη 3 (H3K4me και H3K27me3) σε ανθρώπινα ES κύτταρα. Προηγούµενες αναλύσεις υπεδείκνυαν ότι η τροποποίηση H3K4me3 σχετίζεται µε ενεργούς υποκινητές, ενώ η H3K27me3 µε απενεργοποιηµένους. Βρέθηκε ότι οι Oct4, Nanog, και Sox2 αρχικά σχετίζονται µόνο µε την H3K4me3 τροποποίηση, παρ όλ αυτά, καθώς τα κύτταρα διαφοροποιούνται, σχετίζονται επίσης µε την H3K27me3 [Mathews et al., 2009]. Αυτή η παρατήρηση κάνει φανερό ότι, µε βάση τα επιγενετικά σηµάδια H3K4me3 και H3K27me3 είναι δυνατό να γίνει µια κατηγοριοποίηση των γονιδίων ως εξής: ενεργά γονίδια (H3K4me3), γονίδια σε κατάσταση ισορροπίας και ταυτόχρονα ετοιµότητας (bivalent domain) (H3K4me3 και H3K27me3) και γονίδια υπό καταστολή (H3K27me3) (εικόνα 2.27) [Mikkelsen et al., 2008]. Ωστόσο, σχεδόν το ένα τρίτο των γονιδίων στα εµβρυϊκά stem κύτταρα δεν έχει τις επιγενετικές τροποποιήσεις H3K4me3 ή H3K27me3 αλλά είναι κυρίως σε σίγαση. Σε αυτά τα γονίδια φαίνεται πως έχει γίνει άλλου είδους επιγενετική τροποποίηση και πιο 85

86 συγκεκριµένα µεθυλίωση του DNA που λειτουργεί σαν συµπληρωµατικός µηχανισµός ελέγχου [Blanpain et al., 2009]. Εικόνα Αµ µφίρροπες καταστάσεις της χρωµατίνης στα ES κύτταρα. Στα εµβρυϊκά stem κύτταρα, οι υποκινητές µιας µεγάλης ποικιλίας από µη µεταγραφόµενα αναπτυξιακά γονίδια φέρει έναν συνδυασµό από «αντιµαχόµενες» τροποποιήσεις ιστονών οι οποίες φυσιολογικά σχετίζονται είτε µε ενεργή (ακετυλίωση της λυσίνης 9 της ιστόνης 3 - H3K9ac, µεθυλίωση της λυσίνης 4 της ιστόνης 3 - H3K4me) ή µε ανενεργή κατάσταση της χρωµατίνης (H3K27me). Αυτό υποδεικνύει πως τα γονίδια αυτά βρίσκονται σε µία κατάσταση ισορροπίας και ταυτόχρονα ετοιµότητας από την οποία είναι έτοιµα να εξέλθουν κάτω από την επίδραση του κατάλληλου αναπτυξιακού ερεθίσµ µατος. Κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης αυτές οι αµφίρροπες καταστάσεις γενικά παύουν να υφίστανται, κάτι που οδηγεί σε ειδική για έκαστο ιστό ενεργοποίηση γονιδίων και αποσιώπηση των γονιδίων που σχετίζονται µε εναλλακτικά αναπτυξιακά µονοπάτια. Τα ES κύτταρα που έχουν έλλειψη του κατασταλτικού συµπλέγµατος PRC2 (όπως αυτά που φέρουν τη µετάλλαξη Eed / ) δεν φέρουν την τροποποίηση H3K27me και, συνεπώς, πολλά γονίδια ξεφεύγουν από την κατάσταση καταστολής [Spivakov et al., 2007]. Κατά τη διάρκεια του επαναπρογραµµατισµού επίσης, οι τροποποιήσεις που υπάρχουν σε αυτές τις περιοχές, φαίνεται πως υφίστανται αλλαγές σε συνάρτηση µε τη διαδικασία διαφοροποίησης. Για παράδειγµα, η τροποποίηση H3K4me3 χάνεται από υποκινητές γονιδίων που ελέγχουν τις ινοβλάστες στα κύτταρα εµβρύων ποντικών αλλά αυξήθηκε σηµαντικά σε υποκινητές και ενισχυτές των γονιδίων Fgf4, Oct4 και Nanog. Επιπλέον, η µεθυλίωση του DNA εξαφανίσθηκε από τους υποκινητές γονιδίων σχετιζόµενων µε την πολυδυναµία σε πλήρως επαναπρογραµµατισµένα κύτταρα αλλά όχι σε ινοβλάστες εµβρύων ποντικών ή σε µερικώς επαναπρογραµµατισµένα κύτταρα [Mikkelsen et al., 2008]. 86

87 Έως σήµερα, πληθώρα κυτταρικών τύπων, µεταξύ των οποίων εντάσσονται και κάποια καρκινικά κύτταρα έχει βρεθεί ότι είναι δυνατό να υποστούν επαναπρογραµµατισµό, γεγονός που είναι ενδεικτικό της πλαστικότητας του επιγενώµατος. ιαφορετικοί κυτταρικοί τύποι διαθέτουν διαφορετικούς βαθµούς πλαστικότητας, παραδείγµατος χάριν, εν σχέσει µε τις ινοβλάστες του δέρµατος, άλλοι τύποι επιθηλιακών κυττάρων όπως τα κερατινοκύτταρα µπορούν να µετατραπούν σε ips κύτταρα µε µεγαλύτερη αποτελεσµατικότητα. Επιπροσθέτως, µια ιεραρχία επιγενετικών καταστάσεων µπορεί να σχετίζεται και µε το συγκεκριµένο στάδιο διαφοροποίησης στο οποίο ευρίσκεται ένα κύτταρο. Ο κατάλληλος χειρισµός των επιγενετικών τροποποιήσεων δύναται να διευκολύνει τον επαναπρογραµµατισµό σε µεγάλο βαθµό όπως γίνεται επί παραδείγµατι µε την 5 - αζακυτιδίνη που είναι αναστολέας της µεθυλοτρανσφεράσης του DNA, και µε το βαλπροϊκό οξύ που είναι αναστολέας της αποακετυλάσης των ιστονών, η χρήση των οποίων αυξάνει την ικανότητα επαναπρογραµµατισµού κατά πέντε και εκατό φορές αντίστοιχα [Na et al., 2010]. Ένα γενετικό επιγενετικό δίκτυο Στην παρακάτω εικόνα φαίνονται οι επιγενετικοί τροποποιητές οι οποίοι συνδέονται και, πιθανόν, ρυθµίζονται µεταγραφικά από τους παράγοντες πολυδυναµίας Oct4, Nanog, Sox2 και Sall4 (sal -like protein 4). Κάποιοι από αυτούς τους επιγενετικούς τροποποιητές, µε τη σειρά τους, είναι γνωστό πως επιδρούν ρυθµιστικά επί αυτών των παραγόντων πολυδυναµίας. Τα µόρια JMJD1A (Jumonji domain - containing 1A ή αλλιώς KDM3A) και κυρίως το JMJD2C (ή αλλιώς KDM4C) είναι απαραίτητα προκειµένου να αντιστραφεί η τριµεθυλίωση σε κατάλοιπα λυσίνης Lys9 της ιστόνης H3 (H3K9me3) στον γενετικό τόπο του Nanog, η οποία διατηρεί το γονίδιο σε ενεργό κατάσταση. Κατά την φάση της διαφοροποίησης, οι Oct4 και Nanog αποσιωπούνται ταχέως µε τις επιγενετικές τροποποιήσεις H3K9me2 and H3K9me3. Η αποσιώπηση αυτή επιτελείται µε τη δράση των µεθυλοτρανσφερασών EHMT1 (euchromatic histone methyltransferase 1) και EHMT2 και οδηγεί στην de novo µεθυλίωση του DNA από τις DNA µεθυλοτρανσφεράσες DNMT3A και DNMT3B73, πιθανώς σε συνέργεια µε τις DNMT3L και LSH (lymphoid-specific helicase ή HELLS) [Hattori et al., 2007]. Ο Nanog επίσης αποσιωπάται µε την επιγενετική τροποποίηση H3K27me3 που διαµεσολαβείται από το σύµπλεγµα PRC (Polycomb repressive complex) συστατικά του οποίου είναι τα EZH2 (enhancer of zeste homologue 2), EED (embryonic ectoderm development), SUZ12 (suppressor of 87

88 zeste 12 homologue) και PHC1 (polyhomeotic-like 1) και PHC2 (εικόνα 2.28) [Hemberger et al., 2010, Spivakov et al., 2007]. Εικόνα Τα PRC συµπλέγµατα. Το µόριο EZH2, ένα συστατικό του συµπλέγµατος PRC2, το οποίο περιέχει επίσης τα µόρια EED και SUZ12, µεθυλιώνει τη λυσίνη 27 της ιστόνης H3 (H3K27me). Αυτή η τροποποίηση επιστρατεύει το PRC1, ένα σύµπλεγµα που περιέχει πρωτεΐνες όπως η BMI1, που διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο στην αυτοανανέωση των σωµατικών stem κυττάρων, και οι RING1A και RING1B που λειτουργούν ως λιγκάσες ουβικουϊτίνης για το H2AK119. Οι ακριβείς µηχανισµοί της καταστολής που διαµεσολαβούνται από τα συµπλέγµατα δεν είναι αποσαφηνισµένοι, πιστεύεται όµως ότι τα εν λόγω συµπλέγµατα ή οι τροποποιήσεις ιστονών που επάγουν αλληλεπιδρούν µε τα νουκλεοσώµατα και την έναρξη της µεταγραφής. Κατά την διαφοροποίηση, η H3K27me και η πρόσδεση του PRC2 στους υποκινητές των ειδικών για κάθε ιστό γονιδίων µπορεί να παύσουν να υφίστανται (διακεκοµµένη γραµµή) [Spivakov et al., 2007]. Η αφθονία των επιγενετικών τροποποιητών που είναι στόχοι του δικτύου πολυδυναµίας µαρτυρά τη µεγάλη σηµασία τους για τη διατήρηση της πολυδυναµίας. Η από κοινού ενεργοποίηση και ρύθµιση εκ µέρους των επιγενετικών τροποποιητών, πιθανόν να αποτελεί ένα βασικό χαρακτηριστικό της λεπτής ισορροπίας η οποία χαρακτηρίζει την κατάστασης πολυδυναµίας [Hemberger et al., 2010]. Εικόνα Το crosstalk µεταξύ των παραγόντων πολυδυναµίας και των επιγενετικών τροποιητών. Τα 88

89 γονίδια που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες και είναι τονισµένα µε µαύρο χρώµα συνδέονται και µε τους 4 µεταγραφικούς παράγοντες. Ο αστερίσκος αντιστοιχεί σε παράγοντες που αναγνωρίζονται ως στόχοι σε ανθρώπινα εµβρυϊκά stem κύτταρα [Hemberger et al., 2010]. ΣΥΣΤΗΜΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ STEM ΚΥΤΤΑΡΩΝ Αντί να επικεντρώνεται στο ρόλο που διαδραµατίζει ξεχωριστά κάθε γονίδιο, πρωτεΐνη ή σηµατοδοτικό µονοπάτι στην έκβαση των βιολογικών φαινοµένων, ο σκοπός της Συστηµικής Βιολογίας είναι να περιγράφει τους τρόπους µέσω των οποίων τα επιµέρους αυτά κοµµάτια αλληλεπιδρούν προκειµένου να προσδιοριστεί η δυναµική του συστήµατος εν συνόλω (εικόνα 2.30). Καθώς όµως κάτι τέτοιο είναι δύσκολο να επιτευχθεί χρησιµοποιώντας αποκλειστικά και µόνο πειραµατικές µεθόδους, η Συστηµική Βιολογία χρησιµοποιεί συχνά ως µέσα υψηλής απόδοσης τεχνικές µαζί µε θεωρητικές και υπολογιστικές µεθόδους οι οποίες είναι ειδικά σχεδιασµένες για να αναλύουν τέτοιου είδους φαινόµενα που λαµβάνουν χώρα σε σύνθετα βιολογικά συστήµατα [MacArthur et al., 2009, Kirschner 2005]. Εικόνα ίκτυα µοριακών ρυθµιστικών µηχανισµών. Οι κόµβοι αναπαριστούν τα µοριακά συστατικά του δικτύου (παραδείγµατος χάριν γονίδια, πρωτεΐνες) και οι γέφυρες µεταξύ τους αναπαριστούν τις λειτουργικές σχέσεις µεταξύ των κόµβων. Αντίστοιχα, σε ένα µεταγραφικό δίκτυο οι κόµβοι αντιστοιχούν στους µεταγραφικούς παράγοντες και οι γέφυρες στην λειτουργική ρύθµιση της µεταγραφής. Στην εικόνα, σε κάθε περίπτωση υπάρχουν τρεις κόµβοι. Στα αριστερά απεικονίζεται ένα µη κατευθυνόµενο γράφηµα στους αλληλοσυνδεδεµένους κόµβους. Σε αυτή την περίπτωση οι γέφυρες δεν έχουν συγκεκριµένη κατεύθυνση και γι αυτό το λόγο απεικονίζονται χωρίς βέλη. Στο µεσαίο γράφηµα (feedback loop), οι κόµβοι αλληλορρυθµίζονται µε έναν κατευθυνόµενο κυκλικό τρόπο. Στα δεξιά (feedforward loop), ο κόµβος 1 ρυθµίζει τους 2 και 3, και ο κόµβος 2 ρυθµίζει επίσης τον 3. Τέτοιου είδους δίκτυα απαντώνται συχνά στα ρυθµιστικά δίκτυα και δηµιουργούν σύνθετες δυναµικές συµπεριφορές [MacArthur et al., 2009]. 89

90 Η διαφοροποίηση των stem κυττάρων και η διατήρηση της αυτοανανέωσής τους είναι ιδιαίτερα σύνθετες διαδικασίες οι οποίες απαιτούν την ακριβή και ενορχηστρωµένη δυναµική έκφραση εκατοντάδων γονιδίων ως ανταπόκριση σε εξωγενή σήµατα. Πολυάριθµες πρόσφατες µελέτες έχουν χρησιµοποιήσει τόσο πειραµατικές όσο και υπολογιστικές µεθόδους προκειµένου να γίνει περισσότερο κατανοητή αυτή η πολυπλοκότητα. Οι µελέτες αυτές υπονοούν πως ο έλεγχος της τύχης των κυττάρων περιλαµβάνει τόσο προκαθορισµένα όσο και στοχαστικά στοιχεία: σύνθετα ρυθµιστικά δίκτυα καθορίζουν σταθερές µοριακές καταστάσεις προς τις οποίες τα κύτταρα έλκονται σε διάφορες χρονικές στιγµές, ενώ τυχαίες διακυµάνσεις στα επίπεδα της γονιδιακής και πρωτεϊνικής έκφρασης πυροδοτούν µεταβάσεις µεταξύ αυτών των καταστάσεων, γεγονός που εξασφαλίζει σταθερότητα στα πληθυσµιακά επίπεδα των κυττάρων [MacArthur et al., 2009]. Αυτές οι µέθοδοι περιλαµβάνουν τις µικροσυστοιχίες για εκτίµηση της έκφρασης του mrna σε όλο το γονιδίωµα, την ChIP (highthroughput chromatin immunoprecipitation) όπως η ChIP on-chip, η ChIP-seq (ChIP-sequencing) και η ChIP-PET (ChIP paired end-ditag) για εκτίµηση των αλληλεπιδράσεων µεταξύ πρωτεϊνών και DNA, και τη φασµατοµετρία µάζας του πρωτεώµατος για εκτίµηση της πρωτεϊνικής σύνθεσης των µοριακών συµπλεγµάτων και των συνολικών αλλαγών που προκύπτουν λόγω µετα-µεταφραστικών τροποποιήσεων. Η δυσκολία σε αυτή την περίπτωση έγκειται στην κατανόηση του πλήθους πληροφοριών που αποκοµίζουµε. Η παρουσίαση των µοριακών ρυθµιστικών µηχανισµών ως «δίκτυα» είναι χρήσιµη για την απλούστευση αυτής της εργασίας (εικόνα 2.31) [MacArthur et al., 2009]. Εικόνα Ρυθµιστικά δίκτυα των stem κυττάρων. a. Σχηµατική απεικόνιση των αλληλεπιδράσεων µεταξύ του Νanog και των σχετιζόµενων µε τον Νanog πρωτεϊνών. b. Απεικόνιση του 90

91 µεταγραφικού ρυθµιστικού κυκλώµατος των stem κυττάρων. Το δίκτυο αυτό έχει δηµιουργηθεί µέσω συνδυασµού δεδοµένων που έχουν συλλεγεί από διάφορα πρόσφατα πειράµατα που χρησιµοποιούν την υψηλής απόδοσης τεχνική ChIP (υψηλής ανάλυσης ανοσοκαθίζηση χρωµατίνης). Και τα δύο δίκτυα είναι πλούσια σε ρυθµιστικές αγκύλες γεγονός που αναδεικνύει την πολυπλοκότητα του συστήµατος καθώς και την ικανότητά του να επιδεικνύει ένα µεγάλο φάσµα από δυναµικές συµπεριφορές. Οι παράγοντες που είναι παρόντες και στα δύο γραφήµατα απεικονίζονται µε κόκκινο χρώµα. Αξίζει να παρατηρηθεί οτι υπάρχει µεγάλη αλληλεπικάλυψη µεταξύ των δύο αυτών δικτύων (µε τους κοινούς παράγοντες να αποτελούν κεντρικά στοιχεία και στις δύο περιπτώσεις), γεγονός που σηµαίνει ότι οι µεταγραφικοί αυτοί παράγοντες αλληλορρυθµίζουν την έκφρασή τους µε έναν συντονισµένο και συνδυαστικό τρόπο που περιλαµβάνει αλληλεπιδράσεις τόσο µεταξύ πρωτεϊνών, όσο και µεταξύ πρωτεϊνών και DNA [MacArthur et al., 2009]. 91

92 92

93 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. STEM ΚΥΤΤΑΡΑ ΣΤΟ ΕΡΜΑ Το δέρµα σε έναν ενήλικα οργανισµό αποτελείται από µια µεγάλη ποικιλία κυττάρων διαφορετικής εµβρυολογικής προελεύσεως. Κατά συνέπεια, πολλοί διαφορετικοί τύποι stem κυττάρων τίθενται σε λειτουργία προκειµένου να αναπληρώσουν την απώλεια αυτών των κυττάρων στο δέρµα που επέρχεται είτε κατά τη φυσιολογική διεργασία της οµοιόστασης, είτε κατά τη διαδικασία της επούλωσης. Κάποια stem κύτταρα, όπως επί παραδείγµατι αυτά τα οποία χρησιµεύουν στη αντικατάσταση των λεµφοκυττάρων εδράζονται στο µυελό των οστών, ενώ κάποια άλλα (παραδείγµατος χάριν οι µελανοβλάστες και τα επιδερµικά stem κύτταρα) εδράζονται εντός του δέρµατος [Blanpain et al., 2006]. Μια σηµαντική ερώτηση που αποτέλεσε το επίκεντρο του ενδιαφέροντος, είναι το πού βρίσκονται τα πολυδύναµα αυτά stem κύτταρα εντός της επιδερµίδας, καθώς και ποιοί είναι οι δείκτες που µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την ανίχνευσή τους. Μια σειρά µελετών καταδεικνύουν ότι υπάρχουν τρεις κύριες θέσεις τους εντός της επιδερµίδας (εικόνα 3.1): 1. Stem κύτταρα µεταξύ των τριχοθυλακίων της επιδερµίδας (interfollicular epidermal stem cells), 2. Stem κύτταρα από την περιοχή bulge των τριχοθυλακίων(hair follicle bulge stem cells), και 3. Stem κύτταρα των σµηγµατογόνων αδένων (sebocyte stem cells) [Morasso et al., 2006]. Η ενδιάµεση των τριχοθυλακίων επιδερµίδα (interfollicular epidermis-ife), περιέχει προγονικά κύτταρα τα οποία εξασφαλίζουν την ανανέωση του ιστού εν απουσία τραυµατισµού, και η τριχοσµηγµατογόνος µονάδα περιέχει πολυδύναµα stem κύτταρα τα οποία ενεργοποιούνται είτε κατά την έναρξη του κύκλου της τρίχας, είτε κατά το τραύµα για αποκατάσταση της επιδερµίδας, είτε για την αναγέννηση του σµηγµατογόνου αδένα [Blanpain et al., 2006α]. 93

94 Εικόνα 3.1. ιαµερίσµατα στα οποία ανευρίσκονται τα stem κύτταρα (SCs) στο δέρµα. (Α) Η επιδερµίδα περιέχει µεταξύ των άλλων κυττάρων της και έναν πληθυσµό από stem κύτταραα (πράσινο) τα οποία βρίσκονται εντός της βασικής της στιβάδας (basal layer BL) καθώς και Τransit Αmplyfying κύτταρα (κόκκινο). Τα κύτταρα εντός της βασικής στιβάδας, διαφοροποιούνται και κινούνται προς την επιφάνεια της επιδερµίδας σχηµατίζοντας την ακανθωτή (spinous layer Sp), κοκκιώδη (granular layer Gr), και κερατίνη στιβάδα (stratum corneum StC). Πρόσφατες µελέτες τονίζουν ότι λόγω της εγγενούς τους ικανότητας να υφίστανται ασύµµετρες διαιρέσεις, πολλά κύτταρα της βασικής στιβάδας αν όχι όλα πιθανώς διαθέτουν ταυτόχρονα την ικανότητα αυτοανανέωσης και διαφοροποίησης. (Β) Τα stem κύτταρα των τριχοθυλακίων (hair follicle stem cells-hf SCs) εντοπίζονται στην περιοχή που καλείται bulge και βρίσκεται κάτωθεν του σµηγµατογόνου αδένα. Τα HF SCs διαιρούντα µε αργούς ρυθµούς και πολλαπλές µελέτες έχουν πιστοποιήσει ότι από τα κύτταρα αυτά προέρχεται και η αναγέννηση του τριχοθυλακίου. Συγκεκριµένα, τα bulge κύτταρα δίνουν γένεση στα κύτταρα του εξωτερικού ελύτρου της τρίχας (outer root sheath-ors), τα οποία πιστεύεται πως πυροδοτούν τα υψηλού αναπαραγωγικού δυναµικού κύτταρα του matrix τα οποία παράκεινται στην µεσεγχυµατικής προέλευσης δερµατική θηλή (dermal papilla DP). Μετά από ταχύ πολλαπλασιασµό τα κύτταρα του matrix διαφοροποιούνται και σχηµ µατίζουν τον αυλό της τρίχας, το εσωτερικό έλυτρο (inner root sheath - IRS) και το στέλεχος της τρίχας (hair shaft-hs). (Γ) Ο σµηγµατογόνος αδένας περιέχει έναν µικρό αριθµό προγονικών κυττάρων που βρίσκονται κοντά ή στη βάση του αδένα. Τα προγονικά κύτταρα του σµηγµατογόνου αδένα παράγουν απογόνους ικανούς για πολλαπλασιασµό που διαφοροποιούνται προς τα γεµάτα λιπίδια σµηγµατογόνα κύτταρα [Fuchs et al., 2008α]. 94

95 STEM ΚΥΤΤΑΡΑ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΤΡΙΧΟΘΥΛΑΚΙΩΝ ΤΗΣ ΕΠΙ ΕΡΜΙ ΑΣ Μολονότι η ύπαρξη stem κυττάρων εντός της βασικής στιβάδας της επιδερµίδας έχει γίνει γνωστή προ πολλού, υπήρχε για µεγάλο διάστηµα σύγχυση για το κατά πόσον όλα ή κάποια, και ποιά από τα κύτταρα της στιβάδας αυτής αποτελούσαν τον πληθυσµό των stem κυττάρων. Παραδοσιακά, τα επιδερµιδικά stem κύτταρα χαρακτηρίζονταν από τον αργό ρυθµό ανανέωσής τους, καθώς και από την ικανότητά τους να σχηµατίζουν τις επιδερµιδικές αναπαραγωγικές µονάδες, γνωστές ως EPUs (epidermal proliferative units). Η επιδερµιδική αναπαραγωγική µονάδα έχει οριστεί ως µια δοµή που αποτελείται από µία βάση από 10 στερεά συνδεδεµένα βασικά κύτταρα τα οποία παράγουν µια στήλη από σταδιακά µεγαλύτερα και πιο επιπεδωµένα κύτταρα τα οποία καταλήγουν σε ένα µονήρες εξαγωνικό κύτταρο επιφανείας (εικόνα 3.2). Αυτό το γεγονός έχει οδηγήσει στη διατύπωση της υπόθεσης ότι υπάρχει ένα και µόνο stem κύτταρο ανά EPU και ότι τα υπόλοιπα βασικά κύτταρα που καλούνται Transit Amplifying κύτταρα (TA cells), είναι κύτταρα που διαιρούνται ορισµένες φορές και κατόπιν εξέρχονται της βασικής στιβάδας και διαφοροποιούνται [Fuchs 2008]. Εικόνα 3.2. Το EPU µοντέλο οργάνωσης της επιδερµίδας. (a) Οι κανόνες που υπαγορεύουν την τύχη του κυττάρου σύµφωνα µε το EPU µοντέλο. Τα αυτοανανεούµενα stem κύτταρα (κίτρινο) δίνουν γένεση σε έναν πληθυσµό transit - amplifying (TA) κυττάρων (µωβ) τα οποία µετά από τρεις κύκλους συµµετρικής διαιρέσεως (TA1 ως TA3) εισέρχονται σε πρόγραµµα διαφοροποίησης (post-mitotic PM) κύτταρα (µπλε). Αυτά τα PM κύτταρα ακολούθως αποκολλούνται από τη βασική στιβάδα της επιδερµίδας και γίνονται υπερβασικά κύτταρα (suprabasal SB) (πράσινο). Ας παρατηρηθεί ότι σε αυτό 95

96 το µοντέλο η συµπεριφορά των TA κυττάρων προκαθορίζεται από το ιστορικό τους, για παράδειγµα, το TA1 κύτταρο θα διαφοροποιηθεί έπειτα από δύο ακόµα κύκλους κυτταρικής διαίρεσης. (b) Το σχήµα αναπαριστά την οργάνωση στο χώρο των κυττάρων εντός µιας EPU µε τα κύτταρα χρωµατισµένα όπως στο σχήµα a. (c). Η προβλεπόµενη µοίρα των stem κυττάρων σύµφωνα µε το EPU µοντέλο σε ένα πείραµα στο οποίο το stem κύτταρο που αποτελεί τον πυρήνα της EPU σηµαίνεται, και η κυτταρική µοίρα ακολουθεί τους κανόνες που προαναφέρθηκαν. Τα κύτταρα που έχουν σηµανθεί βρίσκονται εντός των κίτρινων γραµµών. Όταν όλα τα TA και τα διαφοροποιηµένα κύτταρα σηµανθούν, το µέγεθος του σηµασµένου κλώνου παραµένει σταθερό [Jones et al., 2008]. Στα µέσα της δεκαετίας του 70, οι, Rheinwald και Green (1975) καθόρισαν τις συνθήκες καλλιέργειας βάσει των οποίων καθίσταται δυνατή η ανάπτυξη ανθρώπινων IFE stem κυττάρων in vitro. Αυτή η σηµαντική ανακάλυψη επέτρεψε τον πολλαπλασιασµό κερατινοκυττάρων που προέρχονταν από εγκαυµατίες και την αυτόλογη µεταµόσχευσή τους στην τραυµατισµένη περιοχή µε τη µορφή λεπτών στιβάδων από καλλιεργηµένα κύτταρα τα οποία ήταν λειτουργικά ως προς την επανεπιθηλιοποίηση της κατεστραµµένης περιοχής. Τα τελευταία 25 χρόνια, αυτή η τεχνική έχει σώσει πολλές ανθρώπινες ζωές. Παρά το γεγονός ότι το επιδιορθωµένο επιθήλιο του ασθενούς δεν κατορθώνει να αναγεννήσει τα τριχοθυλάκια ή τους σµηγµατογόνους αδένες, αποτελεί µια φυσιολογική επιδερµίδα η οποία µπορεί να εφαρµόσει τους µηχανισµούς της επιδιόρθωσης (εικόνα 3.3) [Blanpain et al., 2006α]. Εικόνα 3.3. ερµατικά µοσχεύµατα από καλλιεργηµένα κερατινοκύτταρα. Κερατινοκύτταρα που ελήφθησαν από υγιή περιοχή δέρµατος του εγκαυµατία ασθενή, αρχικά πολλαπλασιάζονται σε καλλιέργεια και µετά τοποθετούνται επί της εγκαυµατικής επιφάνειας για να σχηµατίσουν εκ νέου υγιές, µόνιµο και αυτοανανεώσιµο δέρµα [Alonso et al., 2003]. 96

97 Όταν βρεθούν στις κατάλληλες καλλιεργητικές συνθήκες µε µικρή κυτταρική πυκνότητα, τα ανθρώπινα κερατινοκύτταρα µπορούν να σχηµατίσουν τρεις διαφορετικούς τύπους αποικιών (εικόνα 3.4): (α) υψηλού αναπαραγωγικού δυναµικού αποικίες (holoclones) από µικρά στρογγυλά κύτταρα τα οποία παρουσιάζουν µια αδιαφοροποίητη µορφολογία και τα οποία µπορούν να καλλιεργηθούν επί µακρόν, (β) αποικίες µε δυνατότητα µόνον για 1 έως 15 διαιρέσεις (paraclones) τα κύτταρα των οποίων είναι µεγάλα και επιπεδωµένα, εµφανίζουν δηλαδή µορφολογία τελικά διαφοροποιηµένων κυττάρων, και (γ) σχετικά µικρές ετερογενείς αποικίες (meroclones) περιορισµένου αναπαραγωγικού δυναµικού που εκφυλίζονται έπειτα από κάποιους κύκλους καλλιέργειας. Εικόνα 3.4. Οι τρεις τύποι αποικιών που αναπτύσσονται από τα κερατινοκύτταρα. Από αριστερά προς τα δεξιά: holoclone, meroclone και paraclone [Ιslam et al., 2007]. Αν και ο όρος holoclone αναφέρεται αποκλειστικά στην αναπαραγωγική ικανότητα της αποικίας, οι απόγονοι ενός επιδερµιδικού holoclone in vitro, διαθέτουν την ικανότητα να επανασχηµατίσουν µια λειτουργική και ικανή για αυτοανανέωση επιδερµίδα in vivo. Αυτό το γεγονός υπονοεί πως τουλάχιστον κάποια από τα κύτταρα εντός των holoclones κατέχουν τα θεµελιώδη χαρακτηριστικά των stem κυττάρων. Αντιθέτως, τα κύτταρα των meroclones φαίνεται πως αντιστοιχούν στα transit-amplifying κύτταρα, κύτταρα δηλαδή που επιτελούν περιορισµένο αριθµό διαιρέσεων προτού δεσµευτούν προς τελική διαφοροποίηση [Blanpain et al., 2006α]. 97

98 Στοιχεία που υποστηρίζουν αυτή την υπόθεση προέρχονται από in vitro µελέτες οι οποίες δείχνουν πως ανθρώπινα επιδερµιδικά κύτταρα µε υψηλότερα επίπεδα επιφανειακών β1 ιντεγκρινών δίνουν γένεση σε µεγαλύτερες αποικίες (holoclones) που µπορούν να διατηρηθούν επί µεγάλο χρονικό διάστηµα, ενώ κύτταρα µε χαµηλότερα επίπεδα β1 ιντεγκρινών δίνουν γένεση σε µικρότερες αποικίες (meroclones) που δεν επιβιώνουν µακροπρόθεσµα. Οι αβ1 ιντεγκρίνες είναι τα διαµεµβρανικά συστατικά των focal adhesions (FAs), που απαιτούνται για τη συναρµολόγηση της βασικής µεµβράνης, την προσκόλληση των κυττάρων στο υπόστρωµα καθώς επίσης και για την κυτταρική επιβίωση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό [Fuchs 2008]. Οι ερευνητές εξέτασαν πειραµατικά την ύπαρξη των EPUs χρησιµοποιώντας τη µέθοδο της ανίχνευσης κυτταρικών σειρών (lineage tracing). Ο πρώτος τύπος lineage tracing που χρησιµοποιήθηκε, ήταν µέσω επιµόλυνσης κερατινοκυττάρων ανθρώπων και ποντικών σε καλλιέργεια, από έναν ρετροϊό που εξέφραζε το µόριο LacZ και ακολούθως µεταµόσχευσαν αυτά τα σεσηµασµένα κερατινοκύτταρα σε ανοσοκατεσταλµένα ποντίκια. Εναλλακτικά, ποντικοί µολύνθηκαν απευθείας µε αυτόν τον ιό στο δέρµα τους, και ακολούθως υπέστησαν δερµοαπόξεση. Ανάλυση του χιµαιρικού δέρµατος αποκάλυψε την παρουσία διακριτών στηλών από µπλε κύτταρα που ανευρίσκονταν από τη βασική στιβάδα, έως και τις ανώτερες και πλέον διαφοροποιηµένες στιβάδες (εικόνα 3.5). Αυτά τα ευρήµατα αποδεικνύουν ότι τα EPUs υπάρχουν στη βασική στιβάδα και µπορούν να διατηρηθούν ανεξάρτητα σαν µια αυτόνοµη µονάδα για εκτεταµένες χρονικές περιόδους. Μια τέτοια κατάσταση µπορεί να εξηγηθεί µέσω ενός µηχανισµού µε βάση τον οποίον τα κύτταρα της βασικής στιβάδας διαιρούνται ασύµµετρα πλησίον της βασικής µεµβράνης ούτως ώστε να δώσουν γένεση σε ένα βλαστικό (stem) κύτταρο, καθώς και σε ένα πλέον διαφοροποιηµένο το οποίο µετακινείται προς την επιφάνεια [Blanpain et al., 2006α]. Εικόνα 3.5. Ανίχνευση κυτταρικών σειρών σε επιδερµίδα ποντικού. (A). Παρουσιάζεται κάθε τρίτη τοµή από την επιδερµίδα του ποντικού ώστε να 98

99 καταστεί σαφές ότι η προέλευση των EPUs είναι από την ενδιάµεση των τριχοθυλακίων επιδερµίδα. (B). µεγαλύτερη µεγέθυνση της πέµπτης τοµής της εικόνα Α. παρατηρούµε τις διακριτές µπλε στήλες που εκτείνονται από την βασική έως και τις εξωτερικές στιβάδες της επιδερµίδας [Ghazizadeh et al., 2001]. Εικόνα 3.6. Η ύπαρξη των EPUs καθίσταται εµφανής και µε τη χρήση του ανοσοφθορισµού. Στη συγκεκριµένη µελέτη χρησιµοποιήθηκε σήµανση µε GFP πρωτεΐνη (πράσινο) [Ghazizadeh et al., 2005]. Στο ανθρώπινο δέρµα, φαίνεται πως τα επιδερµιδικά stem κύτταρα διαιρούνται µε σχετικά αργούς ρυθµούς. Τα κύτταρα αυτά αρχικά πιστευόταν πως εντοπίζονταν συχνότερα στις βάσεις των επιδερµιδικών ακρολοφιών, γεγονός που συνεπάγεται ότι βρίσκονται στο πλέον προστατευµένο σηµείο εν σχέσει µε οποιοδήποτε άλλο εντός της επιδερµίδας µεταξύ των τριχοθυλακίων [Lavker et al., 1982]. Νεότερες έρευνες όµως από τους Ghazizadeh et al. αποδεικνύουν πως κάτι τέτοιο δεν ισχύει, αντίθετα, φαίνεται πως δεν υπάρχει προτιµώµενη θέση για τις EPUs (εικόνα 3.7) [Ghazizadeh et al., 2005]. Εικόνα 3.7. Καταγραφή των θέσεων εντοπισµού των EPUs στην ανθρώπινη επιδερµίδα. Εξετάσθηκαν σε σύνολο 2οο EPUs µε τη βοήθεια της µικροσκοπίας φθορισµού. Οι πιθανές θέσεις προέλευσής τους από τη βασική µεµβράνη περιλαµβάνουν: επίπεδα τµήµατα (Α), καθώς και τα πλάγια τµήµατα (Β), βάσεις (C), και κορυφές (D) των επιδερµιδικών ακρολοφιών. Οι σηµασµένες EPUs φάνηκε πως προέρχονται από όλα τα τµήµατα της βασικής στιβάδας της επιδερµίδας [Ghazizadeh et al., 2005]. 99

100 Τόσο τα σηµατοδοτικά µονοπάτια στων οποίων τον έλεγχο υπόκεινται τα επιδερµιδικά stem κύτταρα, όσο και οι παράγοντες οι οποίοι διευθύνουν τη διατήρηση της πολυδυναµίας τους εξετάζονται ξεχωριστά αργότερα, στο κεφάλαιο που πραγµατεύεται τους µηχανισµούς αναγέννησης του δέρµατος. STEM ΚΥΤΤΑΡΑ ΑΠΟ ΤΗΝ ΠΕΡΙΟΧΗ BULGE ΤΩΝ ΤΡΙΧΟΘΥΛΑΚΙΩΝ Τη δεκαετία του 1990, ερευνητές που χρησιµοποίησαν την [3H] θυµιδίνη προκειµένου να εκτιµήσουν την διατήρηση της σήµανσης στην τριχωτή επιδερµίδα επιµύων, ανακάλυψαν ότι η πλειοψηφία των LRCs στο δέρµα βρίσκονται εντός του τριχοθυλακίου, ενώ το ποσοστό τους που ανευρίσκεται εντός της βασικής στιβάδας της ενδιάµεσης των τριχοθυλακίων επιδερµίδας είναι πολύ µικρότερο [Alonso et al., 2003]. Πιο συγκεκριµένα, προκειµένου να εντοπίσουν την ακριβή τοποθεσία όπου βρίσκονται τα LRCs (label retaining cells) στα τριχοθυλάκια, ο Lavker και οι συνεργάτες του χορήγησαν BrdU (5 bromo 2-deoxyuridine) για µία εβδοµάδα σε νεογνά ποντικών και µετά ανέλυσαν τη διατήρηση της σήµανσης στο δέρµα µετά από τέσσερεις εβδοµάδες. Η περιοχή αυτή λοιπόν που βρήκαν, καλείται bulge και βρίσκεται εντός του εξωτερικού ελύτρου της ρίζας (outer root sheath ORS) ακριβώς κάτω από τον σµηγµατογόνο αδένα και πλησίον της καταβολής του ανελκτήρα µυ της τρίχας. Αν και οι καταβολές της ανιχνεύονται στα πρώιµα στάδια της µορφογένεσης του τριχοθυλακίου, η περιοχή bulge αποκτά τη χαρακτηριστική της εµφάνιση όταν αναδύονται οι πρώτες τρίχες µετά τη γέννηση. Κατά την πρώτη τελογενή φάση, µια µονή στιβάδα αδρανών κυττάρων περιβάλλει το στέλεχος της παλαιάς τρίχας ενώ καθώς ξεκινά ο νέος κύκλος της τρίχας η περιοχή bulge αποκτά και δεύτερη στιβάδα κυττάρων [Blanpain et al., 2006α]. Πρόσφατα, οι Tumbar et al. χρησιµοποίησαν pulse - chase πειράµατα σε ποντίκια που εξέφραζαν την εξαρτώµενη από την τετρακυκλίνη H2B-GFP πρωτεΐνη στο δέρµα τους. Επί απουσίας της τετρακυκλίνης, όλοι οι επιθηλιακοί πυρήνες χρωµατίζονταν πράσινοι λόγω της έκφρασης της H2B-GFP, αλλά όταν χορηγούνταν τετρακυκλίνη, το γονίδιο καταστελλόταν και µετά από τέσσερις εβδοµάδες µόνο τα bulge κύτταρα 100

101 παρέµεναν πράσινα. Μετά από τραυµατισµό τα H2B GFP θετικά κύτταρα ανιχνεύονταν εντός της επιδερµίδας, γεγονός που επιβεβαιώνει την ικανότητα των bulge LRCs να επανεπιθηλιοποιούν την επιδερµίδα ως ανταπόκριση στο τραύµα. Τα αποτελέσµατα αυτά επιβεβαιώθηκαν και από άλλες µελέτες µε χρήση της β γαλακτοσιδάσης και όχι µόνον, ενώ µε αντίστοιχο τρόπο φάνηκε πως τα κύτταρα αυτά διαθέτουν επίσης την ικανότητα να αναγεννούν το τριχοθυλάκιο κατά τη διάρκεια του φυσιολογικού κύκλου της τρίχας [Blanpain et al., 2006α, Tumbar et al. 2004]. Εικόνα 3.8. Συµµετοχή των bulge stem κυττάρων στην οµοιόσταση και την επούλωση. Κατά την τελογενή φάση, τα bulge stem κύτταρα σηµαίνονται µε την β γαλακτοσιδάση (LacZ) µέσω επαγωγής της έκφρασης της Cre ρεκοµπινάσης που εκφράζεται υπό την ρύθµιση ενός bulge υποκινητή. Κατά τη διάρκεια του κύκλου της τρίχας η σήµανση επεκτείνεται σε όλα τα κύτταρα του νεοσχηµατισθέντος τριχοθυλακίου, κάτι που αποδεικνύει τη δηµιουργία τους από τη bulge περιοχή κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής οµοιόστασης. Τα bulge SCs µπορούν επίσης να συµβάλλουν στη δηµιουργία της ενδιάµεσης των τριχοθυλακίων επιδερµίδας (IFE) και των σµηγµατογόνων αδένων (SGs), αν και αυτό το φαινόµενο είναι σπάνιο και, στις περισσότερες περιπτώσεις τα IFE κύτταρα δεν προέρχονται από τα bulge cells. Τα bulge SCs, που εµφανίζονται ως πράσινα (LRCs), εξέρχονται της φωλεάς τους και πολλαπλασιάζονται ενεργά προκειµένου να παρέχουν κύτταρα που θα συµµετέχουν στην αναγέννηση του τριχοθυλακίου. β. Μετά τον τραυµατισµό, τα bulge SCs ενεργοποιούνται και µεταναστεύουν προς την επιφάνεια προκειµένου να επιδιορθώσουν την IFE [Blanpain et al., 2009]. 101

102 Το εσωτερικό έλυτρο της ρίζας (inner root sheath-irs) σχηµατίζει το κανάλι µέσα από το οποίο διέρχεται η τρίχα. Όταν η τρίχα βρίσκεται στη φάση «καταστροφής» (καταγενή), ο βολβός της ρικνώνεται και µετακινείται προς την επιφάνεια της επιδερµίδας. Καθώς αυτό συµβαίνει, το IRS αποδοµείται και η τρίχα απελευθερώνεται. Το στέλεχος της τρίχας και το εσωτερικό έλυτρο προέρχονται από το matrix, δηλαδή τα transient-amplifying κύτταρα του τριχοθυλακίου [Fuchs 2008]. Πιο αναλυτικά, κατά τη διάρκεια της καταγενούς φάσης, η δερµατική θηλή πλησιάζει τοπογραφικά την bulge περιοχή. Στη συνέχεια, το τριχοθυλάκιο εισέρχεται σε µια φάση ηρεµίας (τελογενής) κατά την οποία η περιοχή bulge περιβάλλει στενά την παλαιά τρίχα περιµένοντας να ξεκινήσει ένας καινούριος κύκλος της τρίχας. Με την εκκίνηση του νέου κύκλου (αναγενής φάση), τα κύτταρα της αναπτυσσόµενης τρίχας αρχίζουν να πολλαπλασιάζονται και η τρίχα αναπτύσσεται προς το βαθύτερο τµήµα του τριχοθυλακίου (εικόνα 3.9). Με κάθε νέο κύκλο της τρίχας, η φάση ηρεµίας αποκτά και µεγαλύτερη διάρκεια, γεγονός που υπονοεί ότι, όποια και αν είναι τα διεγερτικά ερεθίσµατα που προαπαιτούνται για είσοδο στην αναγενή φάση, το όριο αποκτά όλο και µεγαλύτερη δυσκολία να υπερνικηθεί καθώς ο οργανισµός γηράσκει [Fuchs et al., 2008α]. Εικόνα 3.9. Απεικόνιση ενός τριχοθυλακίου σε αναγενή φάση (A) καθώς και του κύκλου του τριχοθυλακίου (B) σε σχέση µε την περιοχή bulge. (A) Κατά τη διάρκεια της αναγενούς φάσης η δερµατική θηλή (DP) βρίσκεται εγκλεισµένη στο εσωτερικό του βολβού και η περιοχή bulge ακριβώς κάτω από τον σµηγµατογόνο αδένα. (B) Κατά τη διάρκεια του κύκλου της τρίχας, η εγγύτητα της δερµατικής θηλής µε την περιοχή bulge ποικίλλει, µε τη στενότερη επαφή να λαµβάνει χώρα κατά τη 102

103 διάρκεια της τελογενούς φάσης, ενώ το τριχοθυλάκιο προετοιµάζεται για την είσοδο του στην αναγενή φάση [Alonso et al., 2003]. Τα bulge κύτταρα δίνουν γένεση στα κύτταρα του ORS, τα οποία εν συνεχεία πυροδοτούν τα υψηλού αναπαραγωγικού δυναµικού matrix κύτταρα όπως φαίνεται και στην παρακάτω εικόνα. Πιο συγκεκριµένα, τα matrix κύτταρα θεωρούνται πως είναι TA κύτταρα. Αυτή η υπόθεση στηριζόταν σε παλαιότερα πειραµατικά δεδοµένα από τους Montagna και Chase (1956) που παρατήρησαν ότι η ακτινοβόληση µε ακτίνες Χ κατέστρεφε τα matrix κύτταρα αλλά, παρ όλ αυτά, είχαµε επανασχηµατισµό των τριχών από κύτταρα προερχόµενα από το ORS [Montagna et al., 1956]. Μέσα στο τριχοθυλάκιο, τα stem κύτταρα που βρίσκονται κατασκηνωµένα εντός εξειδικευµένου µικροπεριβάλλοντος στη διακριτή περιοχή που καλείται bulge πολλαπλασιάζονται µε πολύ βραδύτερους ρυθµούς εν σχέσει µε τα υπόλοιπα κύτταρα αυτής της περιοχής. Μολαταύτα, κατά τη διάρκεια του κύκλου της τρίχας, τα bulge SCs διεγείρονται, εξέρχονται από την φωλεά τους, πολλαπλασιάζονται και διαφοροποιούνται προς τους διάφορους κυτταρικούς τύπους που συνθέτουν ένα ώριµο τριχοθυλάκιο. Εκτός αυτής της λειτουργίας όµως, η περιοχή bulge αποτελεί τη δεξαµενή από την οποία προέρχονται τα πολυδύναµα stem κύτταρα που επιστρατεύονται κατά τη διεργασία επούλωσης µετά από τραυµατισµό της επιδερµίδας [Blanpain et al., 2006α]. Εικόνα Πολυδυναµία των bulge stem κυττάρων. (A) Τα stem κύτταρα της bulge περιοχής εδρεύουν στην ανώτερη περιοχή του ORS και κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής οµοιόστασης ενεργοποιούνται περιοδικά προς σχηµατισµό νέου τριχοθυλακίου. Κατά την αναγενή φάση µεταναστεύουν στο κατώτερο ORS προς την matrix, που αποτελείται από έναν εξειδικευµένο πληθυσµό από transit - amplifying κύτταρα, τα οποία 103

104 είναι υπεύθυνα για την παραγωγή της νέας τρίχας. Τα bulge stem κύτταρα µπορούν επίσης να µεταναστεύσουν προς το σµηγµατογόνο αδένα και να διαφοροποιηθούν σε αντίστοιχη κυτταρική σειρά όταν τα προγονικά κύτταρα των σµηγµατογόνων αδένων απουσιάζουν ή είναι κατεστραµµένα. Σε περιβάλλον τραυµατισµού, τα bulge stem κύτταρα µπορούν επίσης να µεταναστεύσουν προς τα άνω και εκτός του τριχοθυλακίου και να συµµετάσχουν στην αναγέννηση της επιδερµίδας. (B) Καθώς οι απόγονοι των bulge κυττάρων µεταναστεύουν προς το κάτω µέρος του ORS, εισέρχονται στην matrix. Τα matrix κύτταρα αποκολλώνται τότε από τη βασική µεµβράνη και διαφοροποιούνται προς τις έξι κυτταρικές σειρές, τρεις από τις οποίες συνθέτουν το IRS και τρεις που συνθέτουν το φλοιό, το µυελό και το στέλεχος της τρίχας. Η άµεση επαφή µε τη δερµατική θηλή είναι απαραίτητη για τη διατήρηση του υψηλού αναπαραγωγικού δυναµικού της matrix [Fuchs et al., 2008b]. Για την ακρίβεια, παρά το γεγονός ότι τα stem κύτταρα του τριχοθυλακίου είναι πολυδύναµα, εκτός της περίπτωσης όπου έχουµε τραυµατισµό της επιδερµίδας, αυτά τα κύτταρα λειτουργούν µόνο για την οµοιόσταση των τριχοθυλακίων και δε συνεισφέρουν στην οµοιόσταση της ενδιάµεσης επιδερµίδας [Fuchs 2008]. Η συµµετοχή των bulge stem κυττάρων στη διατήρηση της οµοιόστασης των τριχοθυλακίων έχει τεκµηριωθεί έπειτα από µια σειρά από πειράµατα ανίχνευσης κυτταρικών σειρών. Χρησιµοποιήθηκαν επίµυες στους οποίους είχε πραγµατοποιηθεί σήµανση της ιστόνης Η2Β µε φθορίζουσα ουσία και αποδείχθηκε ότι τα matrix προγονικά κύτταρα προέρχονται από τα bulge κύτταρα που πολλαπλασιάζονται καθώς εξέρχονται από τη φωλεά τους. Επιπλέον, πρόσφατες µελέτες στον lgr5, όµοια µε αυτά της ιστόνης Η2Β, ανίχνευσαν κύτταρα απογόνους των bulge stem κυττάρων πολλούς µήνες αργότερα και µε αυτόν τον τρόπο ταυτοποιήθηκε η ικανότητα αυτών των κυττάρων να συνεισφέρουν και µακροπρόθεσµα στην διατήρηση του τριχοθυλακίου [Blanpain et al., 2009]. Η µεγάλη σπουδαιότητα των bulge stem κυττάρων στην ανάπτυξη και οµοιόσταση του δέρµατος έχει γίνει εµφανής και µέσω πειραµάτων στα οποία έγινε εκλεκτική απαλειφή στο δέρµα του γονιδίου που κωδικοποιεί τον µεταγραφικό παράγοντα SoX9 µετά τη γέννηση. Σε αυτή την περίπτωση, η έκφραση του δείκτη επιφανείας των ώριµων bulge κυττάρων, CD34 χάνεται και τα τριχοθυλάκια αδυνατούν να ανανεωθούν, γεγονός που υποδεικνύει βλάβη των stem κυττάρων. Όταν αυτή η απαλειφή συµβεί προγεννητικά, δεν παρατηρείται καθόλου σχηµατισµός bulge stem κυττάρων, ούτε µορφογένεση τριχοθυλακίου και σµηγµατογόνου αδένα [Blanpain et al., 2009]. 104

105 Ακόµα ένας πληθυσµός δυνητικών stem κυττάρων έχει αναγνωρισθεί πρόσφατα εντός του τριχοθυλακίου, και εδράζεται σε µια περιοχή ανάµεσα στην περιοχή bulge και τον σµηγµατογόνο αδένα που είναι γνωστή ως ανώτερος ισθµός (upper isthmus ui) (εικόνα 3.11). Τα κύτταρα σε αυτή την περιοχή χαρακτηρίζονται από την έκφραση του δείκτη επιφανείας mts24. In vitro, βρέθηκε ότι τα mts24-θετικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από µεγαλύτερο κλωνογόνο δυναµικό εν σχέσει µε τα αρνητικά σε αυτόν το δείκτη και, επιπλέον, η µεταµόσχευση αυτών των κυττάρων αναδηµιούργησε όλες τις κυτταρικές σειρές της επιδερµίδας, δεδοµένο που υποστηρίζει την πολυδυναµία τους. Περισσότερα πειράµατα όµως απαιτούνται προκειµένου να διευκρινιστεί το κατά πόσον τα κύτταρα αυτά είναι ενεργοποιηµένοι απόγονοι των bulge κυττάρων ή είναι ανεξάρτητα stem κύτταρα [Blanpain et al., 2009]. Εικόνα ιαµερίσµατα στα οποία ανευρίσκονται τα stem κύτταρα της επιδερµίδας, συµπεριλαµβανόµενου και του ανώτερου ισθµού [Blanpain et al., 2009]. Πολυδυναµία των bulge stem κυττάρων Σε έρευνές τους, αρχικά οι Oshima et al. (2001) όσο και οι Morris et al. (2004) µετά από σήµανση της bulge περιοχής των τριχοθυλακίων και εµφύτευση των τριχοθυλακίων σε έµβρυα επίµυων µε ανοσοανεπάρκεια, απέδειξαν αφενός τη µετακίνηση των bulge κυττάρων προς τη βάση του τριχοθυλακίου προ της διαφοροποίησης τους και αφετέρου, ότι τα κύτταρα αυτά είναι υπεύθυνα για τη δηµιουργία όχι µόνον σµηγµατογόνων αδένων και ανανεούµενων τριχοθυλακίων, αλλά επίσης και επιδερµίδας. Αυτό το γεγονός επιβεβαιώθηκε και από µελέτες που ακολούθησαν [Blanpain et al., 2004]. Οι µελέτες όµως αυτές δεν διευκρίνιζαν το κατά πόσον η bulge περιοχή αποτελείται από πολλαπλούς τύπους µονοδύναµων προγονικών κυττάρων, ο καθένας εκ των οποίων δύναται να δώσει γένεση σε διαφορετική κυτταρική σειρά, ή εάν έκαστο εξ 105

106 αυτών των κυττάρων κατέχει το δυναµικό πολυδυναµίας. Έτσι αργότερα πρώτοι σε µια σειρά πειραµάτων που ακολούθησαν, η Fuchs και οι συνεργάτες της τοποθέτησαν αποµονωµένα bulge stem κύτταρα σηµασµένα µε K14-GFP σε καλλιέργειες προκειµένου να αποµονώσουν holoclones. Μετά από σύντοµη επώαση, οι απόγονοι ενός και µόνου bulge stem κυττάρου εµφυτεύθηκαν στις πλάτες nude ποντικιών. Οι απόγονοι αυτοί ακολούθως έδωσαν γένεση σε GFP-θετικά τριχοθυλάκια, επιδερµίδα, σµηγµατογόνους αδένες, ακόµα και bulge stem κύτταρα [Blanpain et al., 2004]. Παρόµοια αποτελέσµατα δόθηκαν και από τους Barrandon και τους συνεργάτες του, οι οποίοι κατάφεραν να παράγουν χιλιάδες τριχοθυλάκια από τον απόγονο ενός µόνο bulge stem κυττάρου σε καλλιέργεια. Αυτά τα πειράµατα παρέχουν αποδείξεις που τεκµηριώνουν την άποψη ότι τα κύτταρα της bulge περιοχής πληρούν τα κλασσικά κριτήρια των πραγµατικών πολυδύναµων stem κυττάρων [Blanpain et al., 2009]. Σηµατοδότηση στα bulge stem κύτταρα Όσον αφορά τη ρύθµιση της δραστηριότητας των stem κυττάρων της bulge περιοχής, φαίνεται ότι αυξηµένης σηµασίας είναι η BMP σηµατοδότηση καθώς η ανάλυση του µεταγραφικού προφίλ αποκαλύπτει την αυξηµένη BMP σηµατοδότηση που λαµβάνει χώρα στην bulge περιοχή. Ιn vitro, οι BMPs προκαλούν έξοδο των bulge stem κυττάρων από τον κυτταρικό κύκλο. Επιπλέον, τόσο οι ΒΜΡs, όσο και οι αναστολείς τους, εκφράζονται στα κύτταρα της δερµατικής θηλής τα οποία µε τη σειρά τους µεταδίδουν σήµατα προς την περιοχή bulge µε κυκλικό ρυθµό [Blanpain et al., 2009]. Πρόσφατα ανακαλύφθηκε ότι η BMP σηµατοδότηση επιδρά στη ρύθµιση της µεταγραφής του NFATc1. Λειτουργικές µελέτες δείχνουν ότι η δραστηριότητα του NFATc1 είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της φύσης των bulge stem κυττάρων που χαρακτηρίζεται από αργές διαιρέσεις, καθώς δρα µέσω καταστολής της µεταγραφής του ρυθµιστικού γονιδίου του κυτταρικού κύκλου CDK4 [Blanpain et al., 2009]. Εν συνόλω, τα δεδοµένα αυτά τονίζουν τη σηµασία της BMP σηµατοδότησης στη διατήρηση των κυττάρων της bulge περιοχής σε κατάσταση αδράνειας. Σύµφωνες µε αυτά τα δεδοµένα ήταν µελέτες µε ανοσοφθορισµό, οι οποίες ανίχνευσαν φωσφορυλιωµένο Smad1, που αντικατοπτρίζει την ύπαρξη ενεργούς BMP σηµατοδότησης [Blanpain et al., 2004]. Η σηµατοδότηση από τον TGF-β φαίνεται να είναι επίσης αυξηµένη στα bulge κύτταρα και είναι γνωστό πως µε τη σειρά της και αυτή καταστέλλει τον κυτταρικό κύκλο εµποδίζοντας την είσοδο του κυττάρου στην G1 φάση του κύκλου. Παρ όλ αυτά, η περιστασιακή απαλειφή 106

107 του υποδοχέα του TGF-β δεν φάνηκε να επηρεάζει τον αργό ρυθµό διαιρέσεων που χαρακτηρίζει τα stem κύτταρα της περιοχής bulge [Guasch et al., 2007]. Επιπλέον, σηµαντικό ρόλο στη διατήρηση της bulge περιοχής σε κατάσταση ηρεµίας διαδραµατίζει και η αναστολή της Wnt σηµατοδότησης. Η β κατενίνη είναι το µόριο το οποίο µεταδίδει το Wnt σήµα από την κυτταρική µεµβράνη στον πυρήνα, δρα ως συµπαράγοντας µε τους µεταγραφικούς παράγοντες της LEF1/TCF οικογενείας (lymphoid enhancer binding factor 1/T-cell factor), και ρυθµίζει τη µεταγραφή. Αδρανή bulge stem κύτταρα στα οποία τα επίπεδα β-κατενίνης του πυρήνα είναι είτε χαµηλά, είτε µηδενικά, εκφράζουν επίσης διαλυτούς Wnt αναστολείς όπως οι FRP1 και Wif και δεν επιδεικνύουν δραστηριότητα των µεταγραφικών παραγόντων της LEF1/TCF οικογενείας [Blanpain et al., 2009]. Όταν τα επίπεδα της β - κατενίνης ανέλθουν, τα τριχοθυλάκια εισέρχονται στην αναγενή φάση (εικόνα 3.12) [Fuchs 2008, Blanpain et al., 2006α]. Εικόνα Το σηµατοδοτικό µονοπάτι των Wnt και β-κατενίνης κατά τη διάρκεια της αναγέννησης του τριχοθυλακίου. Επάνω εικόνα: Επί απουσίας ενός Wnt σήµατος, η περίσσεια της κυτταροπλασµατικής β-κατενίνης αποδοµείται. Μετά από σύνδεση µε το Wnt, ο ενεργοποιηµένος υποδοχέας του επιστρατεύει συγκεκριµένα µόρια του συµπλέγµατος που αποδοµεί τη β κατενίνη, µε αποτέλεσµα αυτή να µην αποδοµείται και να µεταβαίνει στον πυρήνα όπου αλληλεπιδρά µε µεταγραφικούς παράγοντες της LEF/TCF οικογένειας. Κατά τη διάρκεια του κύκλου της τρίχας στον ενήλικα, το σηµατοδοτικό µονοπάτι των Wnt/β-κατενίνης είναι απαραίτητο για τη διατήρηση των ιδιοτήτων του stem κυττάρου του τριχοθυλακίου. Μεσαία εικόνα: Όταν η ενεργή µορφή της β-κατενίνης διατηρείται για µεγάλο χρονικό διάστηµα, τα ποντίκια αναπτύσσουν de novo τριχοθυλάκια από την ενδιάµεση των τριχοθυλακίων επιδερµίδα (IFE), το εξωτερικό έλυτρο της 107

108 τρίχας (ORS), και τους σµηγµατογόνους αδένες (SGs). Κάτω εικόνα: Η διαβάθµιση της δραστηριότητας των Wnt και β-κατενίνης καθορίζει την τύχη και συµπεριφορά των stem κυττάρων του τριχοθυλακίου [Blanpain et al., 2006α]. Επιπρόσθετα, η απώλεια του BMPR1a σε τριχοθυλάκια που βρίσκονται στην τελογενή φάση καταλήγει στην πρώιµη είσοδό τους στην αναγενή φάση. Αυτό φαίνεται ότι συµβαίνει µέσω σταθεροποίησης της β-κατενίνης καθώς ενεργοποιείται η σηµατοδότηση από την PI3 κινάση, που ακολούθως έχει ως αποτέλεσµα την φωσφορυλίωση και απενεργοποίηση της GSK3β, της κινάσης δηλαδή που είναι υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση και ουβικουϊτίνωση της β-κατενίνης που οδηγούν στην αποδόµησή της. Οι µελέτες αυτές ξεκαθαρίζουν επιπλέον το πώς η αναστολή της BMP σηµατοδότησης και η ενεργοποίηση της Wnt σηµατοδότησης από κοινού ρυθµίζουν την ενεργοποίηση των stem κυττάρων όπως φαίνεται στην παρακάτω εικόνα [Fuchs 2008]. Εικόνα Παρόµοιοι µηχανισµοί ρυθµίζουν τη µορφογένεση και την οµοιόσταση του τριχοθυλακίου. Μια σειρά από λειτουργικές µελέτες σε ποντίκια έχουν αναδείξει τις διαφορετικές λειτουργίες που επιτελεί η σηµατοδότηση από τους Wnt/β κατενίνη σε σχέση µε τη σηµατοδότηση από την BMP. Κατά τη µορφογένεση του τριχοθυλακίου, η σηµατοδότηση Wnt/β-κατενίνη είναι απαραίτητη προκειµένου να καθοριστεί η τύχη του τριχοθυλακίου στην αδιαφοροποίητη βασική στιβάδα της επιδερµίδας. Κατά τη διάρκεια του κύκλου της τρίχας στον ενήλικα οργανισµό, η αύξηση της Wnt σηµατοδότησης προωθεί την ενεργοποίηση των stem κυττάρων ώστε να αρχίσει η ανάπτυξη µιας καινούριας τρίχας κατά την µετάβαση από τη φάση ηρεµίας στη φάση ανάπτυξης. Μια ακόµα εντονότερη ανταπόκριση στη Wnt σηµατοδότηση παρατηρείται αργότερα, καθώς τα κύτταρα του 108

109 matrix δεσµεύονται οριστικά προς τελική διαφοροποίηση. Τα BMP σήµατα µεταδίδονται από το υποκείµενο µεσέγχυµα προς την επιδερµίδα. Καθώς σχηµατίζονται τα εξαρτήµατα του δέρµατος, η αναπτυσσόµενη δερµατική θηλή εκφράζει τον παράγοντα Noggin που είναι αναστολέας του BMP. Ο Noggin είναι απαραίτητος για τη φυσιολογική ανάπτυξη του τριχοθυλακίου και διεγείρει την έκφραση του LEF1 (lymphoid enhancer binding factor 1) και την Wnt σηµατοδότηση. Κατά τη διάρκεια του κύκλου της τρίχας, η ενεργή BMP σηµατοδότηση προωθεί την είσοδο των bulge stem κυττάρων σε φάση αδράνειας. Κατά την µετάβαση από τη φάση ηρεµίας στη φάση ανάπτυξης της τρίχας, τα επίπεδα τόσο των BMPs όσο και των αναστολέων τους µεταβάλλονται, γεγονός που καταλήγει στην αναστολή της BMP σηµατοδότησης και την ενεργοποίηση των stem κυττάρων. Καθώς το νέο τριχοθυλάκιο ωριµάζει, η ενεργοποίηση του BMP υποδοχέα είναι απαραίτητη για τη διαφοροποίηση των transit amplifying κυττάρων του matrix προκειµένου να σχηµατιστεί το στέλεχος της τρίχας [Blanpain et al., 2009]. Η καταστολή του c-myc φαίνεται πως είναι επίσης κριτικής σηµασίας για τα bulge stem κύτταρα καθώς η υπερέκφρασή του µπορεί να οδηγήσει σε εξεσηµασµένο πολλαπλασιασµό και διαφοροποίηση των κυττάρων αυτών είτε προς επιδερµιδικά είτε προς κύτταρα σµηγµατογόνου αδένα, ενώ η απώλειά του καταστέλλει το αναπαραγωγικό δυναµικό των bulge stem κυττάρων και οδηγεί σε αλωπεκία. Η Rho GTPάση Rac-1 εµπλέκεται επίσης στη διατήρηση της bulge περιοχής όπως φαίνεται από µεταλλάξεις που έχουν ως αποτέλεσµα την απώλεια λειτουργικότητας της Rac-1. Τέλος, τρεις µεταγραφικοί παράγοντες, οι Lhx2, Sox9, και VdR εµπλέκονται επίσης στην οµοιόσταση της περιοχής καθώς η απώλεια του πρώτου καταλήγει σε αναπαραγωγή των bulge stem κυττάρων, ενώ η απώλεια των δύο άλλων οδηγεί στην εµφάνιση αλωπεκίας [Blanpain et al., 2009]. Από τη στιγµή που ενεργοποιηθούν τα bulge stem κύτταρα, µια σειρά από ενδοκυττάρια σήµατα ελέγχει τόσο τη φάση ανάπτυξης όσο και τη φάση διαφοροποίησης του κύκλου της τρίχας. Το Sonic hedgehog (SHH) είναι γνωστό πως αποτελεί ένα σηµαντικό σηµατοδοτικό µονοπάτι που «διασταυρώνεται» µε το Wnt µονοπάτι και είναι απαραίτητο για τη διατήρηση της φάσης ανάπτυξης της τρίχας. Παρ όλ αυτά, η Notch σηµατοδότηση δρα προωθώντας τα αρχικά στάδια διαφοροποίησης στο τριχοθυλάκιο, όπως συµβαίνει και µε την επιδερµίδα [Blanpain et al., 2009]. 109

110 Εικόνα Οι µοριακοί µηχανισµοί που ελέγχουν τον πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση των stem κυττάρων στο τριχοθυλάκιο. Τα bulge SCs παράγουν πολλαπλά προγονικά κύτταρα από τα οποία προέρχονται δύο κύριες δοµές, το εσωτερικό έλυτρο και το στέλεχος της τρίχας. Ο πολλαπλασιασµός των bulge κυττάρων ελέγχεται αρνητικά από την BMP σηµατοδότηση και τους µεταγραφικούς παράγοντες NFATc1 και PTEN, ενώ θετικά επηρεάζεται από την Wnt σηµατοδότηση. Η διαφοροποίηση του IRS ελέγχεται από τη Notch και τη BMP σηµατοδότηση, καθώς και από τους µεταγραφικούς παράγοντες CDP και GATA-3, ενώ η διαφοροποίηση της τρίχας ελέγχεται από τη Wnt σηµατοδότηση και τον µεταγραφικό παράγοντα Lef1. Τα matrix (Mx) κύτταρα ρυθµίζονται από τους Msx1 /2, Ovo1, Foxn1, και Shh [Fuchs et al., 2008α]. STEM ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΩΝ ΣΜΗΓΜΑΤΟΓΟΝΩΝ Α ΕΝΩΝ Ένας τρίτος πληθυσµός stem κυττάρων στην επιδερµίδα φαίνεται ότι εδράζεται εντός του σµηγµατογόνου αδένα ο οποίος βρίσκεται άνωθεν της περιοχής bulge του τριχοθυλακίου. Πειράµατα ανίχνευσης κυτταρικών σειρών, µέσω διαµεσολαβούµενης από ρετροϊό γονιδιακής µεταφοράς, αποκαλύπτουν ότι µια µικρή οµάδα κυττάρων που βρίσκεται στη βάση του σµηγµατογόνου αδένα µπορεί να αποτελεί πληθυσµό stem κυττάρων τα οποία είναι διαφορετικά και ανεξάρτητα εκείνων της bulge περιοχής [Ghazizadeh et al., 2001]. Pulse-chase πειράµατα υποδεικνύουν επίσης την ύπαρξη κυττάρων που διαιρούνται µε αργούς ρυθµούς εντός του αδένα [Fuchs 2008]. Πρόσφατα δείχθηκε πως σε µια µικρή οµάδα κυττάρων στη βάση του σµηγµατογόνου αδένα µπορούσε να ταυτοποιηθεί η Blimp1 που είναι µια πρωτεΐνη κατασταλτική της µεταγραφής. Πειράµατα ανίχνευσης κυτταρικών σειρών αποκάλυψαν ότι αυτά τα Blimp1 - θετικά κύτταρα είναι προγονικά κύτταρα τα οποία µπορούν να αναγεννήσουν ολόκληρο τον σµηγµατογόνο αδένα [Fuchs 2008]. 110

111 Επιπλέον, απαλειφή του Blimp1 καταλήγει σε αυξηµένο πολλαπλασιασµό των σµηγµατογόνων κυττάρων και µεγέθυνση των αδένων. Η πλέον πιθανή εξήγηση αυτής της κατάστασης φαίνεται να πηγάζει από το ρόλο του Blimp1 ως ρυθµιστή της γονιδιακής έκφρασης του c-myc στα Β-λεµφοκύτταρα, στα οποία καταστέλλει τη µεταγραφή του c-myc, ο οποίος ως γνωστόν προάγει την υπερπλασία των σµηγµατογόνων αδένων και τη διαφοροποίηση των σµηγµατογόνων κυττάρων εις βάρος της διαφοροποίησης του τριχοθυλακίου. Ωστόσο, φαίνεται ότι και τα bulge stem κύτταρα παρέχουν κύτταρα απαραίτητα για την οµοιόσταση, όταν η ανανέωση των κυττάρων στον αδένα πραγµατοποιείται σε ασυνήθιστους ρυθµούς. Φαίνεται εποµένως ότι τα αυτόχθονα προγονικά κύτταρα του σµηγµατογόνου αδένα διασφαλίζουν την οµοιόσταση, αλλά όταν αυτά έχουν χαθεί ή υποστεί βλάβη, τα bulge stem κύτταρα είναι επίσης ικανά να δηµιουργήσουν κύτταρα του σµηγµατογόνου αδένα [Fuchs et al., 2008β]. Σηµατοδότηση και stem κύτταρα του σµηγµατογόνου αδένα Το πλέον µελετηµένο σηµατοδοτικό µονοπάτι που συµµετέχει στη ρύθµιση των stem κυττάρων των σµηγµατογόνων αδένων είναι η Ηedgehog σηµατοδότηση. Η έκφραση ενός µεταλλαγµένου υποδοχέα ο οποίος συµµετέχει στην ενεργοποίηση της Ηedgehog σηµατοδότησης οδηγεί σε έκτοπη ανάπτυξη σµηγµατογόνου αδένα. Παροµοίως, χειρισµός των σµηγµατογόνων κυττάρων in vitro µε Indian Ηedgehog (IHH) οδηγεί επίσης σε πολλαπλασιασµό των κυττάρων αυτών. Σε αντίθεση, αναστολή της Ηedgehog σηµατοδότησης µέσω υπερέκφρασης µιας ανενεργούς µορφής του Gli2, που είναι µια πρωτεΐνη η οποία ενεργοποιεί το Ηedgehog, δύναται να καταστείλει την ανάπτυξη των σµηγµατογόνων κυττάρων (εικόνα 3.15) [Fuchs et al., 2008α, Fuchs et al., 2008β]. Εικόνα Το Sonic Hedgehog (Shh) σηµατοδοτικό µονοπάτι. Επί απουσίας του Shh, ο υποδοχέας του, Patched (Ptch) αναστέλλει τη δραστηριότητα του υποδοχέα Smoothened (Smo). Με την πρόσδεση του Shh, ο Ptch δεν 111

112 µπορεί πια να καταστείλει τον Smo, ο οποίος πλέον είναι ελεύθερος να προωθήσει τη µετακίνηση του µορίου Gli εντός του πυρήνα, γεγονός που του επιτρέπει να ενεργοποιήσει τα γονίδια-στόχους του [Blanpain et al., 2006α]. Μια σειρά από πειράµατα επίσης υποδεικνύει ότι η αναστολή της Wnt σηµατοδότησης πιθανώς να είναι απαραίτητη για την εξειδίκευση των κυτταρικών σειρών του σµηγµατογόνου αδένα. Οι πρώτες ενδείξεις εδόθησαν όταν µετά από επαγωγή της έκφρασης του NLEF1, µιας ανενεργούς µορφής του LEF1, η κατάληξη ήταν διαφοροποίηση των κυττάρων του σµηγµατογόνου αδένα εις βάρος της διαφοροποίησης του τριχοθυλακίου. Επιπλέον ανάλογες µεταλλάξεις τόσο στους ανθρώπους όσο και στους επίµυες καταλήγουν σε καρκινογένεση εντός των σµηγµατογόνων αδένων. Ο ρόλος αυτός της Wnt σηµατοδότησης γίνεται εµφανής και µέσω της β-κατενίνης, καθώς υπερέκφραση του Smad7, ο οποίος επάγει την αποδόµηση της β-κατενίνης µέσω ενός µηχανισµού που περιλαµβάνει το µόριο Smurf2, καταλήγει επίσης σε υπερπλασία [Fuchs et al., 2008α, Niemann et al., 2003]. Το µονοπάτι του Wnt φαίνεται ότι συνδέεται µε τη Ηedgehog σηµατοδότηση στα σµηγµατογόνα κύτταρα, καθώς υπερέκφραση του NLef1 µπορεί να οδηγήσει σε αύξηση του IHH στα σµηγµατογόνα κύτταρα. Επιπρόσθετα, σε όγκους των σµηγµατογόνων αδένων έχει παρατηρηθεί αύξηση του Ρatched, του υποδοχέα του Ηedgehog, γεγονός που τονίζει τόσο το ρόλο που διαδραµατίζει η Ηedgehog σηµατοδότηση στην οµοιόσταση του σµηγµατογόνου αδένα, όσο και το γεγονός ότι η ισορροπία ανάµεσα στη Ηedgehog και την Wnt σηµατοδότηση είναι βαρύνουσας σηµασίας για τη σωστή ανάπτυξη του αδένα [Niemann et al., 2003]. Τέλος, φαίνεται πως το πρόγραµµα κυτταρικής διαφοροποίησης του σµηγµατογόνου αδένα, προσοµοιάζει εκείνο των λιποκυττάρων, καθώς όπως τα κύτταρα του λιπώδους ιστού, έτσι και τα σµηγµατογόνα κύτταρα ελέγχουν τη µεταγραφή γονιδίων που αφορούν το µεταβολισµό των λιπιδίων µέσω της µεταγραφής των υποδοχέων PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ) και των retinoid X υποδοχέων. Επώαση µε προσδέτες ττων υποδοχέων PPARγ µπορεί να επάγει τη διαφοροποίηση των σµηγµατογόνων κυττάρων in vitro και να αυξήσει την παραγωγή σµήγµατος στους ανθρώπους. Η Notch σηµατοδότηση συµµετέχει επίσης στην ανάπτυξη του σµηγµατογόνου αδένα [Fuchs et al., 2008α]. 112

113 Εικόνα Οι µοριακοί µηχανισµοί που ελέγχουν τον πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση των stem κυττάρων στο σµηγµατογόνο αδένα. Τα µονοδύναµα SCs των σµηγµατογόνων αδένων ρυθµίζονται αρνητικά από τον µεταγραφικό παράγοντα Blimp1 και από την Wnt σηµατοδότηση, και θετικά από το c-myc και τη σηµατοδότηση Hedgehog. Η διαφοροποίηση των σµηγµατογόνων κυττάρων φαίνεται πως ελέγχεται από την έκφραση του PPARγ [Fuchs et al., 2008α]. ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΑ STEM ΚΥΤΤΑΡΑ Τι είναι τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα; Οι πρώτες ενδείξεις για την παρουσία αυτών των µη αιµοποιητικών stem κυττάρων στο µυελό των οστών ήρθαν από τις παρατηρήσεις του Γερµανού παθολογοανατόµου Cohnheim πριν από 130 χρόνια περίπου, καθώς οι µελέτες του ανέδειξαν την πιθανότητα να είναι ο µυελός των οστών η πηγή των ινοβλαστών που παράγουν ίνες κολλαγόνου κατά τη φυσιολογική διεργασία της επούλωσης. Στις µέρες µας, υπάρχουν πλέον αποδείξεις για το γεγονός ότι ο µυελός των οστών περιέχει κύτταρα τα οποία µπορούν να διαφοροποιηθούν προς άλλα µεσεγχυµατικά κύτταρα (ανάµεσα σε αυτά και οι ινοβλάστες), και η αρχή για αυτό έγινε µε την εργασία του Friedenstein και των συνεργατών του το Η εργασία αυτή περιλάµβανε την τοποθέτηση ολόκληρου του µυελού των οστών σε πλαστικά δισκία καλλιέργειας και την αποµάκρυνση των µη προσκολληµένων (nonadherent) κυττάρων µετά από 4 ώρες, γεγονός που σήµαινε δηλαδή την αποµάκρυνση των αιµοποιητικών κυττάρων. Αυτό που περιέγραψαν, ήταν πως τα προσκολληµένα κύτταρα ήταν ετερογενή ως προς την εµφάνιση, αλλά αυτά που ήταν πιο σταθερά προσκολληµένα σχηµάτιζαν πυρήνες από δύο έως τέσσερα κύτταρα, τα οποία παρέµεναν ανενεργά για 2 έως 4 ηµέρες και κατόπιν ξεκινούσαν να πολλαπλασιάζονται µε ταχείς ρυθµούς [Friedenstein et al., 1976]. 113

114 Μετά από έναν αριθµό διαιρέσεων στην καλλιέργεια, αυτά τα κύτταρα έγιναν πιο οµοιογενώς ινοβλαστικά ως προς την εµφάνιση, γι αυτό το λόγο ονοµάστηκαν και CFU-Fs (fibroblastic colony-forming units). Βρέθηκε επίσης πως τα κύτταρα µπορούσαν να διαφοροποιηθούν προς αποικίες οι οποίες προσοµοίαζαν µε µικρές ποσότητες οστού ή χόνδρου. Οι παρατηρήσεις αυτές του Friedenstein εξετάστηκαν και από άλλες ερευνητικέςοµάδες τη δεκαετία του 80 και το αποτέλεσµα ήταν πως αυτά τα κύτταρα που αποµονώθηκαν από τις καλλιέργειες του Friedenstein ήταν πολυδύναµα και µπορούσαν να διαφοροποιηθούν προς οστεοβλάστες, χονδροκύτταρα, λιποκύτταρα και µυοβλάστες [Chamberlain et al., 2007]. Αναφέρονται είτε ως µεσεγχυµατικά stem κύτταρα (MSCs) λόγω της ιδιότητάς τους να διαφοροποιούνται προς κύτταρα µεσεγχυµατικού τύπου, ή ως κύτταρα του στρώµατος του µυελού, καθώς η προέλευσή τους φαίνεται να είναι από τον µυελό των οστών, αν και υπολογίζεται αδρά ότι αποτελούν µόνο το % των κυττάρων που προέρχονται από τον µυελό των οστών [Sasaki et al., 2008]. Εκτός από το µυελό των οστών, τα MSCs ανευρίσκονται επίσης και σε άλλους ιστούς του σώµατος. Υπάρχει ένας µεγάλος αριθµός αναφορών που περιγράφουν την παρουσία τους στον λιπώδη ιστό, στους σκελετικούς µυς, στο αίµα του οµφαλίου λώρου, στις χοριακές λάχνες του πλακούντα, στο αµνιακό υγρό, στο περιφερικό αίµα, στο εµβρυϊκό ήπαρ, πνεύµονα και µυελό των οστών, και στα νεογιλά δόντια. Το ποσόν των MSCs ελαττώνεται µε την πάροδο των χρόνων (εικόνα 3.17). Ο µέγιστος αριθµός τους ανευρίσκεται κατά τη νεογνική ηλικία και στη συνέχεια µειώνεται προοδευτικά ώστε στα 80 χρόνια ηλικίας να καταλήξει να είναι περίπου ο µισός. Όσον αφορά τα κυκλοφορούντα εµβρυϊκά MSCs, ο µεγαλύτερος αριθµός τους ανιχνεύεται κατά το πρώτο τρίµηνο της κύησης και µειώνεται στο δεύτερο τρίµηνο στο % και κατόπιν στο % των εµπύρηνων κυττάρων στο αίµα του οµφαλίου λώρου [Bobis et al., 2006]. Εικόνα Ο αριθµός των ανθρώπινων MSCs µειώνεται µε την αύξηση της ηλικίας [Caplan 2008]. 114

115 Παρά όµως το γεγονός ότι τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα βρίσκονται εντός του συνδετικού ιστού των περισσοτέρων οργάνων, οι κυτταρικοί αυτοί πληθυσµοί δεν είναι λειτουργικά ισότιµοι όσον αφορά το δυναµικό διαφοροποίησής τους. Εκτός αυτού, οι πληθυσµοί αυτοί περιέχουν ανοµοιογενείς πληθυσµούς MSCs που περιέχουν τόσο αδιαφοροποίητα stem κύτταρα, όσο και δεσµευµένα προς διαφοροποίηση κύτταρα από τα οποία θα προέλθουν τα κύτταρα του συνδετικού ιστού. Τέλος, καθώς τα κύτταρα αυτά παράγουν επίσης συστατικά του στρώµατος του µυελού των οστών, οι πληθυσµοί αυτοί των stem κυττάρων περιέχουν κύτταρα που εκφράζουν µόρια προσκόλλησης και κυττοκίνες που ρυθµίζουν κάποιες παραµέτρους της αιµοποίησης [Phinney et al., 2007]. εδοµένα που υποστηρίζουν την ύπαρξη MSCs στο δέρµα Ένας διαρκώς αυξανόµενος όγκος δεδοµένων τεκµηριώνει την παρουσία των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων εντός του χορίου του δέρµατος. Το γεγονός που σηµατοδότησε την εκκίνηση της έρευνας για την παρουσία των MSCs στο δέρµα ήταν µια δηµοσίευση το 2001 από τους Toma et al. από το Πανεπιστήµιο McGill του Μόντρεαλ, στην οποία αναφερόταν ότι είχαν κατορθώσει να αποµονώσουν πολυδύναµα stem κύτταρα από το χόριο ενήλικου ποντικιού, τα οποία χαρακτήρισαν ως προερχόµενα από το δέρµα προγονικά κύτταρα (skin derived precursors SKPs). Αυτά τα κύτταρα ήταν όχι µόνον ικανά να δώσουν γένεση σε κυτταρικές σειρές του µεσοδέρµατος (λιποκύτταρα και λεία µυϊκά κύτταρα) in vitro, αλλά επίσης να διαφοροποιηθούν προς νευρώνες, γεγονός που οδήγησε στον χαρακτηρισµό τους ως stem κύτταρα. Συγκρίνοντας in vitro τα χαρακτηριστικά της διαφοροποίησης της επιδερµίδας, του χορίου, και του ισχιακού νεύρου, οι Toma et al. καθόρισαν ότι µόνον το χόριο διέθετε αυτού του είδους τα µεσεγχυµατικά κύτταρα. Επιπλέον έδειξαν ότι και το χόριο του τριχωτού της κεφαλής σε ενήλικο άνθρωπο διαθέτει την ίδια ιδιότητα. Η οµάδα συµπέρανε πως το κύτταρο αυτό του χορίου, που είναι ικανό να παράγει κύτταρα που ανήκουν εµβρυολογικώς σε περισσότερες από µία βλαστικές στιβάδες, µπορεί να αποτελέσει τη δίοδο ώστε το δέρµα να λειτουργήσει ως µία εύκολα προσβάσιµη, αυτόλογη πηγή για µελλοντική µεταµόσχευση stem κυττάρων [Toma et al, 2001]. Μετέπειτα µελέτες επιβεβαίωσαν τα αποτελέσµατα αυτά όσον αφορά τους χοίρους, τους επίµυες και, προσφάτως, τους ανθρώπους. Και οι τέσσερεις µελέτες που αφορούσαν ανθρώπους ανέδειξαν το δυναµικό διαφοροποίησης προς πολλαπλές 115

116 κυτταρικές σειρές των κυττάρων αυτών, και συγκεκριµένα προς λιποκύτταρα και οστεοκύτταρα, ενώ στις δύο από αυτές παρατηρήθηκε και η δηµιουργία χονδροκυττάρων [Sellheyer et al., 2009]. Χαρακτηριστικά των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων Λειτουργικά, όπως όλα τα stem κύτταρα έτσι και τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα χαρακτηρίζονται από την ικανότητά τους για αυτοανανέωση και διαφοροποίηση. Το πιο ελκυστικό, ίσως, χαρακτηριστικό τους είναι η σηµαντική τους πλαστικότητα στην οποία βασίζονται και οι ελπίδες που αφορούν τις θεραπευτικές τους χρήσεις, δηλαδή η ικανότητά τους για διαφοροποίηση προς κυτταρικές σειρές που εµβρυολογικώς προέρχονται από διαφορετικές βλαστικές στιβάδες (plasticity ή transdifferentiation), δηλαδή από το εξώδερµα και από το ενδόδερµα (εικόνα 3.18). Τέτοιο παράδειγµα αποτελεί η διαφοροποίηση των προερχόµενων από το µυελό των οστών MSCs (bone marrow derived MSCs ή ΒΜ-MSCs) προς διάφορους κυτταρικούς τύπους που ανευρίσκονται στο δέρµα, όπως είναι τα προερχόµενα από το εξώδερµα κερατινοκύτταρα [Sasaki et al., 2008]. Η θεωρία αυτή της πλαστικότητας των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων έχει δεχθεί πολλές αµφισβητήσεις, καθώς πολλοί είναι οι ερευνητές που θεωρούν ότι τέτοιου είδους διαφοροποίηση είναι εξαιρετικά σπάνια in vivo, ενώ αντιθέτως η ταυτόχρονη παρουσία άλλων βιολογικών φαινοµένων, όπως είναι η σύµπτυξη των κυττάρων, είναι πιθανότατα αυτή που ερµηνεύεται ως εξαιρετική πλαστικότητα των MSCs [Sellheyer et al., 2009]. Άλλες µελέτες υποστηρίζουν ότι πολλαπλοί µηχανισµοί στους οποίους συµπεριλαµβάνονται η πλαστικότητα, η κυτταρική σύµπτυξη και η παραγωγή αυξητικών παραγόντων, µπορεί να συνυπάρχουν. Κάτι τέτοιο µάλιστα φαίνεται πως συµβαίνει στην περίπτωση της επιδιόρθωσης νευρώνων από τα προερχόµενα από το µυελό µεσεγχυµατικά stem κύτταρα. Όσον αφορά τον τοµέα των MSCs που εντοπίζονται στο δέρµα, τα ευρήµατα είναι εξίσου αµφιλεγόµενα [Sellheyer et al., 2009, Hokari et al., 2008]. 116

117 Εικόνα Τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα αποτελούν ένα κλασσικό παράδειγµα πολυδύναµων stem κυττάρων.. Τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα του µυελού των οστών έχουν την ικανότητα να αυτοανανεώνονται (καµπυλωτό βέλος) καθώς και να διαφοροποιούνται (ευθύγραµµα βέλη) προς τις κυτταρικές σειρές του µεσοδέρµατος. Η ικανότητα των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων να διαφοροποιούνται προς κυτταρικές σειρές διαφορετικής εµβρυολογικής προέλευσης in vivo (εξώδερµα και ενδόδερµα) τονίζεται µε τα διακεκοµµένα βέλη καθώς εξακολουθεί να παραµένει αµφιλεγόµενο ζήτηµα [Uccelli et al., 2008]. Πλαστικότητα των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων του δέρµατος Τα MSCs του δέρµατος σε ποντίκια που έχουν ακτινοβοληθεί µε θανατηφόρα ή σχεδόν θανατηφόρα δόση έχει βρεθεί πως είναι ικανά να µεταµοσχευθούν και ακολούθως να πολλαπλασιαστούν και να διαφοροποιηθούν, γεγονός που υπονοεί ότι θα µπορούσαν να χρησιµοποιηθούν για αιµατολογική αποκατάσταση µετά από ακτινοθεραπεία. ύο από τις ερευνητικές οµάδες παρατήρησαν µια σηµαντική αύξηση στον αριθµό των λευκοκυττάρων του περιφερικού αίµατος µετά από µεταµόσχευση µεσεγχυµατικών stem κυττάρων δέρµατος, τα οποία όρισαν ως multipotent κύτταρα του χορίου (dermal multipotent cells DMCs) (εικόνα 3.19) [Shi et al., 2004, Chunmeng et al., 2004]. 117

118 Εικόνα Κινητική των περιφερικών λευκών αιµοσφαιρίων µετά από µεταµόσχευση µεσεγχυµατικών stem κυττάρων δέρµατος. Προκειµένου να µελετηθούν οι επιδράσεις των MSCs στην αιµοποίηση in vivo, ποντικοί ακτινοβολήθηκαν µε σχεδόν θανάσιµη δόση ακτινοβολίας και κατόπιν 2 x 10 6 MSCs εγχύθηκαν σε φλέβα της ουράς κάθε ζώου. Η οµάδα Ν ήταν η οµάδα control, η οµάδα R περιελάµβανε τα ποντίκια που είχαν ακτινοβοληθεί και δεν έλαβαν MSCs, ενώ στην οµάδα Τ ανήκαν τα ζώα στα οποία εγχύθηκαν τα MSCs µετά την ακτινοβόληση. Παρατηρούµε ότι στα ζώα τα οποία έλαβαν ακτινοβολία, ο αριθµός των λευκών αιµοσφαιρίων ελαττώθηκε σηµαντικά µετά από 7 ηµέρες λόγω της βλάβης που προκλήθηκε στο αιµοποιητικό σύστηµα. Με την πάροδο όµως των ηµερών, ο αριθµός των λευκών αιµοσφαιρίων της οµάδας Τ ήταν σηµαντικά υψηλότερος από αυτόν της οµάδας R [Shi et al., 2004]. ύο ακόµα µελέτες περιγράφουν τη διαφοροποίηση των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων του δέρµατος προς ινσουλινοπαραγωγά παγκρεατικά κύτταρα και ηπατοκύτταρα ενώ δύο µελέτες ασχολούνται µε τη διαφοροποίηση των MSCs προς κερατινοκύτταρα. Εάν επιβεβαιωθούν τα αποτελέσµατα αυτά, θα υπάρχει πλέον βάσιµη τεκµηρίωση της ικανότητας διαφοροποίησης των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων προς κυτταρικές σειρές που δεν προέρχονται από το µεσόδερµα. Ωστόσο, πάντα θα πρέπει αν λαµβάνεται υπ όψιν το γεγονός ότι αυτά τα αποτελέσµατα αφορούν in vitro µελέτες και ότι πιθανόν να υπάρχουν κυτταρικές επιµολύνσεις κατά τη διαδικασία αποµόνωσης των κυττάρων [Sellheyer et al., 2009]. Ένα από τα πλέον συναρπαστικά χαρακτηριστικά των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων του δέρµατος είναι η ικανότητά τους να διαφοροποιούνται in vitro σε νευρώνες, κύτταρα του Schwann και αστροκύτταρα, γεγονός που δηµιουργεί ελπίδες για πιθανή χρησιµοποίησή τους σε νευροεκφυλιστικές παθήσεις και σε τραυµατισµούς του νωτιαίου µυελού. Το πρώτο βήµα σε αυτή τη διαδικασία είναι το να αποδειχθεί η λειτουργικότητα των νευρώνων που παρήχθησαν in vitro. Οι Wislet- Gendebien et al., κατάφεραν να αποδείξουν ότι τα προσοµοιάζοντα µε νευρώνες 118

119 κύτταρα που προέρχονταν από MSCs του µυελού επιδεικνύουν ηλεκτροφυσιολογικά χαρακτηριστικά και ένα νευροδιαβιβαστικό προφίλ που είναι συγκρίσιµο µε αυτό των λειτουργικών νευρώνων (εικόνα 3.20) [Wislet-Gendebien et al., 2005]. Όσον αφορά όµως τα προερχόµενα από το δέρµα MSCs, τα αποτελέσµατα δεν ήταν εξίσου ικανοποιητικά. Παρά το γεγονός ότι τα κύτταρα που προσοµοίαζαν µε νευρώνες και προέρχονταν από τα MSCs του δέρµατος εισέρχονταν κανονικά στη διαδικασία διαφοροποίησης προς νευρώνες, το ηλεκτροφυσιολογικό τους προφίλ παρέµενε ανώριµο. Ενδεχοµένως αυτό το αποτέλεσµα να είναι απότοκο της έλλειψης των κατάλληλων παραγόντων ωρίµανσης οι οποίοι είναι απαραίτητοι προκειµένου οι νευρώνες να κατορθώσουν να γίνουν λειτουργικοί, όπως για παράδειγµα είναι η επιπρόσθετη παρουσία άλλων υποστηρικτικών κυττάρων (π.χ. κυττάρων γλοίας) [Sellheyer et al., 2009]. Εικόνα Έκφραση νευρωνικών και αστρογλοιακών δεικτών από τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα. Τα θετικά για νεστίνη MSCs (η νεστίνη είναι ένας δείκτης για την ικανότητα ανταπόκρισης των MSCs σε εξωγενή σήµατα) καλλιεργήθηκαν επί πέντε ηµέρες µαζί µε GFP (green fluorescent protein) θετικούς νευρώνες (CG) (πράσινο). Η σήµανση µε ανοσοϊστοχηµεία καθώς και η FACS ανάλυση (fluorescence - activated cell sorting analysis) έδειξε ότι κάποια από αυτά τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα εξέφραζαν νευρωνικούς δείκτες. Η πρωτεΐνη GFAP (κόκκινο, A C) που αποτελεί δείκτη διαφοροποίησης των νευρικών κυττάρων εκφραζόταν από περίπου το 40% των θετικών για νεστίνη MSCs, και η Tuj1 (κόκκινο, D F) εκφραζόταν από το 20% των κυττάρων αυτών, όπως και ο δείκτης NeuN (κόκκινο, G). Αυτά τα δεδοµένα επιβεβαιώθηκαν από την FACS ανάλυση (GFAP: I, Tuj1: J) σε έναν GFP αρνητικό πληθυσµό (K πρώτη αιχµή). Με διπλή σήµανση έναντι στην GFAP (κόκκινο) και στη NeuN (µπλε) (H) φάνηκε πως τα θετικά για νεστίνη MSCs κατευθύνονταν προς 119

120 διαφοροποίηση σε νευρικά ή αστρογλοιακά κύτταρα. Η πυρήνες χρωµατίστηκαν µε EtD1 (κόκκινο ή µπλε). Τα βέλη δείχνουν τους δείκτες νευρικής έκφρασης των MSCs [Wislet-Gendebien et al., 2005]. Ένα ακόµα σηµαντικό βήµα είναι το να αποδειχθεί ότι τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα που προέρχονται από το χόριο του δέρµατος και έχουν αποµονωθεί in vitro, µπορούν επιτυχώς να εµφυτευθούν εντός νευρικού ιστού. Στα πειράµατά τους, οι Belicchi et al., τοποθέτησαν δερµατικά MSCs εντός του εγκεφάλου ενήλικων ποντικιών όπου αυτά διαφοροποιήθηκαν σε ανώριµους νευρώνες και αστροκύτταρα. Ενδιαφέρουσα ήταν η παρατήρηση ότι τα κύτταρα αυτά εξέφραζαν επίσης ενδοθηλιακούς δείκτες, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα κύτταρα αυτά ενδεχοµένως µπορούν να διαφοροποιηθούν και προς δηµιουργία αιµοφόρων αγγείων, συνεισφέροντας µε αυτό τον τρόπο στην αγγειογένεση του εγκεφάλου του δέκτη. Μία ακόµα ερευνητική οµάδα ανέφερε πως τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα που αποµονώθηκαν από δέρµα είναι επίσης ικανά να µεταναστεύουν στο νωτιαίο µυελό αρουραίων µετά από τραυµατική κάκωσή του όπου και διαφοροποιούνταν σε κύτταρα που εξέφραζαν δείκτες νευρικών κυττάρων και κυττάρων γλοίας [Sellheyer et al., 2009, Belicchi et al., 2004]. Πιθανή διαφοροποίηση προς επιθήλιο Έχει αναφερθεί πως τα MSCs διαθέτουν επίσης την ικανότητα διαφοροποίησης προς διάφορους επιθηλιακούς κυτταρικούς τύπους in vivo. Για παράδειγµα, η εµφύτευση µεσεγχυµατικών stem κυττάρων στον πνεύµονα ενισχυόταν ως αντίδραση στην έκθεση σε µπλεοµυκίνη στους επίµυες, και ένα µικρό ποσοστό από τα MSCs που εντοπίζονταν στις περιοχές πνευµονικής βλάβης προσοµοίαζαν µε επιθηλιακά κύτταρα. Επιπλέον, µια σειρά µελετών που χρησιµοποίησαν το ίδιο µοντέλο πνευµονικής βλάβης στα ποντίκια ανέφεραν πως τα MSCs που είχαν εµφυτευθεί στον πνεύµονα διαφοροποιούνταν προς πνευµονοκύτταρα τύπου I ή συγκέντρωναν χαρακτηριστικά του φαινοτύπου όλων σχεδόν των κυτταρικών τύπων του πνεύµονα ανάµεσα στους οποίους οι ινοβλάστες, τα τύπου Ι και ΙΙ επιθηλιακά κύτταρα και οι µυοϊνοβλάστες [Rojas et al., 2005]. Τα MSCs έχει επίσης αναφερθεί οτι δύνανται να διαφοροποιηθούν προς µελαγχρωµατικά επιθηλιακά κύτταρα του αµφιβληστροειδούς, επιθηλιακά κύτταρα δέρµατος, κύτταρα σµηγµατογόνων αδένων, και σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα στο νεφρό [Phinney et al., 2007]. 120

121 Σε αντίθεση µε τα ανωτέρω, αρκετές οµάδες έχουν αναφέρει ότι τα MSCs δε συνεισφέρουν σηµαντικά στην δοµική αναγέννηση των επιθηλιακών κυττάρων στο νεφρό µετά από ισχαιµία ή στον τραυµατισµένο κερατοειδή. Η έλλειψη οµοφωνίας όσον αφορά αυτές τις παρατηρήσεις µπορεί να οφείλεται σε µια µεγάλη ποικιλία µεταβλητών. Μία µεταβλητή είναι οι διαφορές στις ιδιότητες των MSCs που χρησιµοποιούνται από τα διάφορα εργαστήρια καθώς έχουν διαπιστωθεί διαφορές τόσο ανάµεσα στα MSCs των ανθρώπων και αυτών των τρωκτικών, όσο και σε MSCs που προέρχονται από διαφορετικές γενεές των ποντικών. Επιπροσθέτως, η διαφοροποίηση των MSCs καθοδηγείται σε µεγάλο βαθµό από το µικροπεριβάλλον in vivo, ιδίως σε ταχέως αναπτυσσόµενους ή τραυµατισµένους ιστούς, και σε µεγάλο βαθµό αυτές οι σύνθετες συνθήκες είναι δύσκολο να αναπαραχθούν µε ακρίβεια in vitro. Παρ όλ αυτά, µια σφαιρική µελέτη των ερευνών, µας επιτρέπει να συµπεράνουµε µε ασφάλεια ότι τα MSCs διαθέτουν µια ενδογενή πλαστικότητα που τους επιτρέπει να σχηµατίζουν συνδετικό ιστό [Phinney et al., 2007]. Κριτήρια χαρακτηρισµού των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων Τα προερχόµενα από τον µυελό των οστών µεσεγχυµατικά stem κύτταρα (BM - MSCs), αποτελούν, όπως αναφέρθηκε, έναν πληθυσµό αυτοανανεούµενων stem κυττάρων. Παρά το γεγονός ότι είναι ένας σπάνιος πληθυσµός εντός του µυελού των οστών, καθώς αποτελούν περίπου το % έως το 0.01 % των εµπύρηνων κυττάρων του, δηλαδή ουσιαστικά είναι τουλάχιστον δέκα φορές λιγότερα από τα αιµοποιητικά stem κύτταρα, τα MSCs είναι επεκτάσιµα σε καλλιέργεια και πολυδύναµα [Wu et al., 2010, Chamberlain et al., 2007]. Προκειµένου η αναγνώρισή τους να εµπεριέχει έναν βαθµό ειδικότητας, η επιτροπή Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy πρότεινε κάποια ελάχιστα κριτήρια τα οποία οφείλουν να πληρούνται. Πρώτον, τα MSCs πρέπει να προσκολλώνται σε πλαστικές επιφάνειες όταν βρίσκονται σε συγκεκριµένες καλλιεργητικές συνθήκες. εύτερον, τα MSCs πρέπει να είναι αρνητικά για δείκτες που υποδηλώνουν δέσµευση προς κάποια συγκεκριµένη κυτταρική σειρά και ταυτόχρονα να εκφράζουν τους δείκτες CD105, CD73, και CD90. Τέλος, τα MSCs οφείλουν να έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται τουλάχιστον προς οστεοβλάστες, λιποκύτταρα και χονδροβλάστες in vitro (εικόνα 3.21) [Wu et al., 2010]. 121

122 Εικόνα Μορφολογία των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων και ικανότητα για διαφοροποίηση. (Α) Ανθρώπινα MSCs εµφανίζουν την ατρακτοειδή µορφολογία των ινοβλαστών µετά από καλλιέργεια ex vivo. (Β) ιαφοροποίηση προς λιποκύτταρα. (Γ) διαφοροποίηση προς χόνδρο. ( ) ιαφοροποίηση προς οστούν [Le Blanc et al., 2003]. είκτες επιφανείας των MSCs Τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα εκφράζουν µία πληθώρα δεικτών επιφανείας, κανένας όµως από αυτούς, δυστυχώς, δεν είναι ειδικός για αυτά. Τα MSCs αποτελούν έναν ετερογενή πληθυσµό κυττάρων, τόσο ως προς τη µορφολογία, όσο και ως προς τη φυσιολογία και έκφραση των αντιγόνων επιφανείας τους [Chamberlain et al., 2007]. Παρά την ετερογένεια όµως αυτή που εµφανίζουν, οι πληθυσµοί των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων που προέρχονται από τους περισσότερους ιστούς εκφράζουν από κοινού έναν αριθµό δεικτών επιφανείας στους οποίους περιλαµβάνονται οι CD29, CD44, CD49a-f, CD51, CD73, CD105, CD106 (vascular cell adhesion molecule VCAM-1), CD166, και Stro1 [Phinney et al., 2007]. Ταυτόχρονα, είναι γενικώς αποδεκτό ότι τα ανθρώπινα MSCs των ενηλίκων δεν εκφράζουν τους δείκτες που σχετίζονται µε την αιµοποίηση, όπως είναι οι CD45, CD34, CD14, ή CD11. Επίσης δεν εκφράζουν τα συνδιεγερτικά µόρια CD80, CD86, και CD40 ή τα προσκολλητικά µόρια CD31 (platelet/endothelial cell adhesion molecule [PECAM]-1), CD18 (leukocyte function-associated antigen-1 [LFA-1]), και CD56 (neuronal cell adhesion molecule-1) (εικόνα 3.22) [Chamberlain et al., 2007]. Η απουσία των αντιγόνων CD14, CD34 και CD45 από την επιφάνειά τους, είναι και 122

123 αυτή που χρησιµοποιείται ως βάση για τη διάκρισή τους από τους προγόνους των αιµοποιητικών κυττάρων [Bobis et al., 2006]. Εικόνα Έκφραση δεικτών στα προερχόµενα από τον µυελό των οστών MSCs έπειτα από δύο κύκλους καλλιέργειας. A. CD14, B. CD33, C. CD133, D. CD45, E. CD34, F. HLA-DR, G. CD105, H. HLA-ABC, I. CD29, J. CD44, K. CD166, L. CD73. Χρησιµοποιήθηκε κυτταροµετρία ροής [Bobis et al., 2006]. Ωστόσο, όπως ήταν αναµενόµενο, η έκφραση πολλών δεικτών των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων µπορεί να µεταβάλλεται επίσης, σε συνάρτηση µε τον ιστό από τον οποίο προέρχονται, καθώς επίσης και ανάλογα µε τις µεθόδους αποµόνωσης και καλλιέργειας που έχουν χρησιµοποιηθεί [Chamberlain et al., 2007]. Παραδείγµατος χάριν, κάποιες µελέτες έχουν δείξει οτι τα προερχόµενα από το µυελό των οστών µεσεγχυµατικά stem κύτταρα εκφράζουν τους ειδικούς δείκτες των περικυττάρων CD146 και 3G5, κάτι που συνάδει µε το γεγονός ότι τα εξειδικευµένα περικύτταρα που βρίσκονται στον µυελό των οστών φαίνεται πως αντιπροσωπεύουν τα στενότερα σχετιζόµενα κύτταρα µε τα MSCs in vivo [Phinney et al., 2007]. Ένα ακόµη παράδειγµα αποτελεί ο ανθρώπινος λιπώδης ιστός που είναι πηγή για κάποια πολυδύναµα stem κύτταρα που καλούνται PLA (processed lipoaspirate) κύτταρα, τα οποία, όπως και τα MSCs του µυελού των οστών µπορούν να διαφοροποιηθούν in vitro προς διάφορες µεσεγχυµατικής προέλευσης κυτταρικές σειρές. Μολαταύτα, παρουσιάζουν διαφορές στη έκφραση συγκεκριµένων δεικτών: ο CD49d εκφράζεται στα PLA κύτταρα αλλά όχι στα MSCs του µυελού των οστών, και 123

124 το αντίστροφο συµβαίνει µε τον CD106. Ο CD106 στα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα στον µυελό των οστών σχετίζεται µε τη επικουρική λειτουργία τους όσον αφορά την αιµοποίηση και κατά συνέπεια, η απουσία του από τα PLA κύτταρα έχει σαφώς να κάνει µε τον εντοπισµό τους εντός ενός µη αιµοποιητικού ιστού [Chamberlain et al., 2007]. Τα ανθρώπινα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα των ενηλίκων εκφράζουν ενδιάµεσα επίπεδα του συµπλέγµατος ιστοσυµβατότητας της τάξης Ι (MHC class I) αλλά δεν εκφράζουν τα ανθρώπινα λευκοκυτταρικά αντιγόνα (human leukocyte antigen - HLA) στην κυτταρική τους επιφάνεια. Η έκφραση των HLA class I στα εµβρυϊκά hmscs είναι χαµηλότερη [Phinney et al., 2007, Le Blanc et al., 2005]. Ο Le Blanc µε τους συνεργάτες του ανίχνευσαν HLA class II χρησιµοποιώντας Western blot σε µη διεγερµένα hmscs ενηλίκων που υπέστησαν κυτταρική λύση, γεγονός που υπονοεί την ύπαρξη ενδοκυττάριων αποθηκών του αντιγόνου, και διαπίστωσε επίσης ότι η έκφρασή του στην κυτταρική επιφάνεια µπορεί να προκληθεί µε τη χρήση της ιντερφερόνης γ. Αντιθέτως µε τα hmscs που προέρχονται από ενήλικα οργανισµό, τα εµβρυϊκά ηπατικής προελεύσεως hmscs δε διαθέτουν MHC class II ούτε ενδοκυτταρικά, ούτε στην κυτταρική τους επιφάνεια, γεγονός που υποδεικνύει ότι η έκφραση των MHC αντιγόνων αλλάζει καθώς ο οργανισµός οδεύει από την εµβρυϊκή προς την ενήλικο ζωή [Gotherstrom et al., 2004, Le Blanc et al., 2005]. Σηµατοδοτικά µονοπάτια και µεταγραφικοί παράγοντες Το ερώτηµα του πώς τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα διατηρούν την αδιαφοροποίητή τους κατάσταση δεν έχει διαλευκανθεί πλήρως. Παρ όλ αυτά υπάρχουν σηµαντικές ενδείξεις ότι η πορεία τους προς διαφοροποίηση ή η παραµονή τους σε κατάσταση ηρεµίας ρυθµίζεται από µέλη της Wnt οικογένειας, τα οποία ενισχύουν την παραµονή της αδιαφοροποίητης κατάστασης των MSCs, καθώς και από τους αναστολείς τους όπως: Dickkopf-1 (Dkk1), Frizzled b-1 (Frzb-1) ή sfrp1. Η Wnt σηµατοδότηση είναι γνωστό πως αποτρέπει τη διαφοροποίηση µέσω επαγωγής της έκφρασης των Oct-3/4, Rex-1 και Nanog [Bobis et al., 2006]. Μία ένδειξη ακόµα για αυτό είναι ότι η χρήση του Wnt3a οδηγεί στην αύξηση της αναπαραγωγής των MSCs, ενώ ταυτόχρονα αναστέλλει την διαφοροποίησή τους προς οστούν [Kolf et al., 2007]. 124

125 Ο LIF (Leukemia inhibitory factor) φαίνεται επίσης πως δρα επικουρικά στη διατήρηση του stemness των MSCs. Ο παράγοντας αυτός επίσης ενεργοποιεί και καταστέλλει την οστεοβλαστική και οστεοκλαστική δραστηριότητα. Ο διττός του αυτός ρόλος υποδηλώνει ότι το κυτταρικό περιβάλλον και το στάδιο ανάπτυξης του κυττάρου - στόχου επηρεάζουν και την απόκριση που θα έχει στον LIF. Οι µηχανισµοί µέσω των οποίων δρα ο LIF στην αυτοανανέωση των MSC παραµένουν ασαφείς αλλά φαίνεται πως περιλαµβάνουν παρακρινές crosstalk µε τα γειτονικά κύτταρα [Kolf et al., 2007]. Ο FGF2 επίσης συνεισφέρει στη διατήρηση της αδιαφοροποίητης κατάστασης των MSCs. Τα γονίδια στόχοι του µορίου αυτού όσον αφορά τη διατήρηση της stemness των MSCs δεν έχουν πλήρως διαλευκανθεί. Είναι πιθανή η ύπαρξη µιας αυτοκρινούς ρυθµιστικής αγκύλης που ρυθµίζει την αυτοανανέωση, όπως συµβαίνει και όταν ο παράγοντας αυτός συµµετέχει στην ανάπτυξη των άκρων των σπονδυλωτών ζώων [Kolf et al., 2007]. Εικόνα Αυτοανανέωση και διαφοροποίηση των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων. Εξωκυττάριοι σηµατοδοτικοί παράγοντες, µεταξύ των οποίων αυξητικοί παράγοντες και κυττοκίνες προωθούν ή διατηρούν την αυτοανανέωση των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων in vitro. Γονιδιακοί δείκτες χαρακτηριστικοί της αυτοανανέωσης των MSC είναι οι Oct-4, Sox-2, και Rex-1. LIF: leukemia inhibitory factor, EGF: epidermal growth factor, HGF: hepatocyte growth factor, PDGF: platelet- 125

126 derived growth factor, FGF: fibroblast growth factor, CFU-F: colony forming unit-fibroblast, c: chondroblast; o: osteoblast, a: adipoblast, m: myoblast, cm: cardio- myoblast, t: tenoblast [Kolf et al., 2007]. Φωλεά και κυκλοφορία των MSCs Όπως όλα τα stem κύτταρα, έτσι και τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα εδράζονται εντός της φωλεάς τους, η οποία τα συντηρεί σε µια κατάσταση σχετικής αδράνειας, διατηρώντας παράλληλα το δυναµικό τους για διέγερση και διαφοροποίηση µετά από τραυµατισµό, νόσο, καθώς και κατά τη φυσιολογική διαδικασία της γήρανσης. Όσον αφορά τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα του µυελού των οστών, η έρευνα της κατανοµής τους αποκάλυψε ότι βρίσκονται σε στενή επαφή µε το ενδόστεο, γεγονός που ήταν ενδεικτικό ότι αυτή η θέση µπορεί να είναι και το σηµείο όπου εντοπίζονται οι φωλεές [Gronthos et al., 2003]. ύο πρόσφατες µελέτες πρότειναν µια περιαγγειακή θέση όσον αφορά τη φωλεά των MSCs όπως φαίνεται στην εικόνα 3.24, λόγω της έκφρασης της α - smooth muscle ακτίνης (α-sma) στα MSCs που αποµονώθηκαν από όλους τους ιστούς που εξετάστηκαν και της ανοσοϊστοχηµικής ταυτοποίησης των CD45 /CD31 /Sca 1+/Thy 1+ κυττάρων σε αυτές τις περιαγγειακές θέσεις. Ως υποστηρικτικό αυτής της πρότασης, ήρθε το εύρηµα ότι, µετά από χρησιµοποίηση των δεικτών Stro - 1 και CD146, αποκαλύφθηκε πως τα MSCs περιέβαλαν τα αιµοφόρα αγγεία τόσο στο µυελό των οστών, όσο και στον οδοντικό πολφό. Αυτά τα κύτταρα επίσης εξέφραζαν την α - SMA και κάποια εξέφραζαν επίσης τον 3G5, ο οποίος είναι ένας δείκτης επιφανείας που σχετίζεται µε τα περικύτταρα. Μάλιστα, κάποιοι ερευνητές έχουν υποθέσει ότι τα περικύτταρα είναι στην πραγµατικότητα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα, καθώς δύνανται να διαφοροποιηθούν προς οστεοβλάστες, χονδροκύτταρα και λιποκύτταρα. Κάτι τέτοιο φαντάζει λογικό καθώς η τοποθέτηση των MSCs εντός περιαγγειακών φωλεών σε όλο το σώµα, τους παρέχει εύκολη πρόσβαση σε όλους τους ιστούς και υποστηρίζει τη θεωρία ότι τα κύτταρα αυτά αποτελούν αναγκαίο και αναπόσπαστο κοµµάτι της επούλωσης διαφόρων ιστών [Kolf et al., 2007]. Πρόσφατα προτάθηκε πως στην περίπτωση τοπικού τραυµατισµού το περικύτταρο απελευθερώνεται από τη θέση του πέριξ του αιµοφόρου αγγείου και λειτουργεί τροφικά και ανοσορρυθµιστικά ως ένα µεσεγχυµατικό stem κύτταρο όπως θα δούµε και παρακάτω [Caplan 2008]. 126

127 Εικόνα Φωλεά των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων. Απεικονίζονται τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα (MSCs) εντός της υποθετικής περιαγγειακής φωλεάς τους (BV, blood vessel), και ενώ αλληλεπιδρούν: (1) µε διάφορα άλλα διαφοροποιηµένα κύτταρα (DC1, DC2 κ.λπ.) µέσω µορίων προσκόλλησης όπως είναι οι καντχερίνες, (2) µέσω των υποδοχέων των ιντεγκρινών µε την εξωκυττάρια ουσία (ECM) η οποία προέρχεται από τα κύτταρα της φωλεάς, και (3) µε σηµατοδοτικά µόρια, στα οποία µπορεί να περιλαµβάνονται και αυτοκρινείς, παρακρινείς και ενδοκρινείς παράγοντες. Μία ακόµα µεταβλητή είναι το οξυγόνο, µε την υποξία να συνδέεται µε διέγερση των MSCs στη φωλεά τους εντός του µυελού των οστών [Kolf et al., 2007]. Επιπλέον, όπως προαναφέρθηκε, ο αριθµός των µεσεγχυµατικά stem κύτταρα (CFU-F) µειώνεται σηµαντικά µε την πάροδο των ετών. Αυτή η µείωση συνάδει µε τη µείωση της αγγειακής πυκνότητας που παρατηρείται επίσης µε την αύξηση της ηλικίας και αποτελεί ένα σηµαντικό επιχείρηµα για τη θεωρία ότι τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα εντοπίζονται σε στενή επαφή µε τα αιµοφόρα αγγεία [Caplan 2009]. Τα διαµεµβρανικά µόρια προσκόλλησης, οι καντχερίνες, βοηθούν στη διεκπεραίωση της προσκόλλησης κυττάρου µε κύτταρο, καθώς και στη µετανάστευση, διαφοροποίηση και διατήρηση της πολικότητας των MSCs, και είναι γνωστό πως αλληλεπιδρούν µε το Wnt σηµατοδοτικό µονοπάτι που είναι ιδιαίτερα σηµαντικό για τη βιολογία των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων όπως θα δούµε παρακάτω [Kolf et al., 2007]. 127

128 Μετά τη επίδραση του κατάλληλου ερεθίσµατος, τα κύτταρα αυτά έχουν την ικανότητα να εξέρχονται της φωλεάς τους και να εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίµατος. Στη συνέχεια έλκονται προς συγκεκριµένες θέσεις εντός του σώµατος (homing), όπου υπό την επίδραση εξειδικευµένων συνθηκών από το µικροπεριβάλλον καθίστανται ικανά να εισέλθουν σε συγκεκριµένο πρόγραµµα διαφοροποίησης. Η µελέτη των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων υποδεικνύει πως η έκφραση µιας ποικιλίας υποδοχέων κυτταροκινών είναι αυτή που βοηθάει στον προσανατολισµό τους προς συγκεκριµένους ιστούς, ανάµεσα στους οποίους και ο ίδιος ο µυελός των οστών. Ένας υποδοχέας που κατέχει ζωτικής σηµασίας ρόλο είναι ο CXCR4, ο υποδοχέας δηλαδή για τον SDF-1, ο οποίος µεταξύ άλλων παράγεται από τα κύτταρα του στρώµατος [Bobis et al., 2006]. Πολλά ευρήµατα επιβεβαιώνουν την ικανότητα των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων να βρίσκουν «στέγη» σε πολλούς διαφορετικούς ιστούς, καθώς τόσο στους επίµυες όσο και στον άνθρωπο, κυκλοφορούντα µεσεγχυµατικά προγονικά κύτταρα που ανιχνεύθηκαν στο αίµα, στη συνέχεια µετανάστευσαν και έδωσαν αποικίες σε διάφορους ιστούς. Επιπλέον, αυτά τα κύτταρα βρέθηκαν στο αίµα ασθενών που έπασχαν από καρκίνο του µαστού µετά από κινητοποίηση των αιµοποιητικών stem κυττάρων µε τη χρήση αυξητικών παραγόντων, γεγονός που επίσης τονίζει την ικανότητα των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων να κινητοποιούνται µετά από την επίδραση επαρκούς διεγερτικού ερεθίσµατος [Gao et al., 2001]. Τέλος, είναι γνωστή η ικανότητα των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων να µετακινούνται και τοπικά προς τα σηµεία τραυµατισµού προκειµένου να συµµετάσχουν στην αναγεννητική διαδικασία (εικόνα 3.25). Τέτοιες περιπτώσεις βρέθηκαν να είναι η επιδιόρθωση των χόνδρων, η αναγέννηση των µυών και της καρδίας, η µετακίνηση διαµέσου του προσθίου εγκεφάλου και της παρεγκεφαλίδας, καθώς και η διαφοροποίηση προς οστεοβλάστες στα αναγεννώµενα οστά. Αυτή η ικανότητα των MSCs µπορεί να µειωθεί µετά από παρατεταµένη καλλιέργεια in vitro. Μια µελέτη που διεξήχθη σε ποντίκια, αποκάλυψε ότι MSCs άµεσα προερχόµενα από το µυελό των οστών διέθεταν την ικανότητα να µετακινηθούν και να παραµείνουν στο σπλήνα, ενώ MSCs που παρέµεναν σε καλλιέργεια έχαναν αυτή τους την ικανότητα έπειτα από 24 έως 48 ώρες [Bobis et al., 2006]. Τα ευρισκόµενα σε καλλιέργεια µεσεγχυµατικά stem κύτταρα µετακινούνται προσελκυόµενα από διάφορους αυξητικούς παράγοντες και χηµειοκίνες µε έναν δοσοεξαρτώµενο τρόπο in vitro, και αυτή η µετακίνηση διεγείρεται από την 128

129 προφλεγµονώδη κυτταροκίνη TNF-a. Η µετακίνηση των MSCs περιλαµβάνει την προσκόλληση στο ενδοθήλιο. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα ενεργοποιούνται κάτω από συνθήκες τραυµατισµού και εκφράζουν επιφανειακά µόρια τα οποία επιτρέπουν την αγκυροβόληση των κυκλοφορούντων κυττάρων. ύο από αυτά, τα VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1 ή CD106) και η E σελεκτίνη (ή CD62E), αποτελούν προσδέτες για την ιντεγκρίνη a4 / b1 (CD49d/CD29) και το CD44 αντίστοιχα που αποτελούν µόρια επιφανείας των MSCs [Meirelles et al., 2009]. Εικόνα Προτεινόµενοι µηχανισµοί για τη µετανάστευση και εγκατάσταση των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων στα σηµεία τραυµατισµού. ICAM: intercellular adhesion molecule, JAMs: junctional adhesion molecules, PECAM: platelet-endothelial cell-adhesion molecule, PGE: prostaglandin E2, VCAM: vascular cell-adhesion molecule, VLA: very late antigen [Salem et al., 2010]. Παρακρινής λειτουργία των MSCs Τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα εκτός της µεγάλης ικανότητάς τους για διαφοροποίηση και µετακίνηση εντός διαφόρων ιστών, ασκούν και ένα ευρύ φάσµα 129

130 λειτουργιών µέσω της έκκρισης µιας µεγάλης ποικιλίας παρακρινών διαµεσολαβητών. Αντιαποπτωτικοί παράγοντες Τα MSCs είναι ικανά να εκκρίνουν µια ποικιλία από παράγοντες οι οποίοι είναι ικανοί να καταστείλουν τη διεργασία της απόπτωσης (εικόνα 3.26). Σε αυτούς συµπεριλαµβάνονται οι VEGF (vascular endothelial growth factor), HGF (hepatocyte growth factor) και IGF-1 (insulin-like growth factor 1), που είναι παράγοντες οι οποίοι µεταξύ άλλων ενισχύουν τον πολλαπλασιασµό και την επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα µεταξύ άλλων είναι ικανά να µειώσουν την απόπτωση των ινοβλαστών που έχουν δεχθεί την επίδραση της υπεριώδους ακτινοβολίας, και υπεύθυνη τουλάχιστον εν µέρει- για αυτή τη δράση είναι η έκκριση του µορίου stanniocalcin-1. Επιπρόσθετοι αντιαποπτωτικοί παράγοντες που έχουν εντοπιστεί στα προερχόµενα από το λιπώδη ιστό MSCs είναι οι TGF-b (transforming growth factor beta), bfgf (basic fibroblast growth factor ή FGF2) και GM-CSF (granulocyte macrophage colony-stimulating factor). Η έκφραση των παραπάνω µορίων και κυρίως του VEGF φάνηκε πως αυξάνει ιδιαίτερα κάτω από συνθήκες υποξίας. Η υποξία λαµβάνει χώρα κατά τα πρώτα στάδια της ιστικής βλάβης και η έκκριση αυτών των αντιαποπτωτικών παραγόντων από τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα στη φάση αυτή ελαχιστοποιεί τον κυτταρικό θάνατο στις περιοχές που περιβάλλουν το τραύµα [Rehmanet al., 2004, Meirelles et al., 2009]. Εικόνα Τα MSCs περιορίζουν την απόπτωση. Οι σηµαντικότεροι παράγοντες που είναι υπεύθυνοι για αυτή τη δράση είναι οι VEGF, HGF, IGF-I, stanniocalcin-1, TGF-b και GM-CSF [Meirelles et al., 2009]. 130

131 Ανοσορρύθµιση Η διαπίστωση πως τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα διαθέτουν ανοσορρυθµιστικές ιδιότητες προέρχεται από πειράµατα όπου φάνηκε πως τα κύτταρα αυτά ήταν ικανά να αναστέλλουν άµεσα τον πολλαπλασιασµό των ab T κυττάρων in vitro. Αργότερα, φάνηκε πως είναι ικανά να καταστέλλουν επίσης τα gd T κύτταρα, καθώς και να διαφεύγουν της κυτταροτοξικής δράσης των Τ κυττάρων. Σήµερα είναι γνωστό πως τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα είναι ικανά να επηρεάζουν και άλλα κύτταρα του ανοσολογικού συστήµατος. Πιο συγκεκριµένα, µπορούν να καταστέλλουν ή να ενισχύουν τον πολλαπλασιασµό των Β κυττάρων, να εµποδίζουν την ενεργοποίηση των NK κυττάρων, και να ρυθµίζουν το προφίλ έκκρισης κυτταροκινών των δενδριτικών κυττάρων και των µακροφάγων. Οι παράγοντες µέσω των οποίων τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα επιτυγχάνουν αυτές τις δράσεις τους, απεικονίζονται στην εικόνα 3.27 [Meirelles et al., 2009]. Εικόνα Ανοσορρυθµιστικές δράσεις των MSCs και τα µόρια µέσω των οποίων επιτελούνται. [Meirelles et al., 2009]. Μείωση της παραγωγής ουλής Αν και η ανασταλτική επίδραση των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων στην ουλοποίηση έχει επιδειχθεί επιτυχώς σε διάφορα πειραµατικά µοντέλα µε ζώα, οι µοριακοί µηχανισµοί που διεκπεραιώνουν αυτή τη δράση δεν είναι ακόµα πλήρως αποσαφηνισµένοι. Στις µέχρι σήµερα µελέτες, φαίνεται πως η λειτουργία αυτή των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων έχει σηµαντικό αποτέλεσµα µόνον εάν λάβει χώρα πριν την εγκατάσταση εκτεταµένης ίνωσης. Προσφάτως, µε τη χρήση ενός µοντέλου ισχαιµικής βλάβης στον λιπώδη ιστό επιµύων, δείχθηκε πως οι παράγοντες bfgf and 131

132 HGF συµµετέχουν στην διαδικασία αυτή [Suga et al., 2009]. Σε αυτή τη µελέτη, ινοβλάστες δέρµατος και MSCs προερχόµενα από το µυελό των οστών ανθρώπων και επιµύων φάνηκε πως εκφράζουν HGF ως ανταπόκριση στη διέγερση από τον bfgf, και αυτή η δράση µπορούσε να µπλοκαριστεί από έναν αναστολέα της c-jun αµινοτελικής κινάσης (JNK inhibitor) [Meirelles et al., 2009]. Στη µελέτη επίσης φάνηκε πως στην περίπτωση ιστικής βλάβης τα MSCs που βρίσκονται περιαγγειακά αναπαράγονται και εκκρίνουν τον HGF, ο οποίος µε τη σειρά του διαµεσολαβεί στις αντι - ινωτικές διεργασίες. Ένα ακόµα γεγονός που φαίνεται ότι εµποδίζει την ουλοποίηση στον υπό επιδιόρθωση ιστό είναι η έκκριση του παράγοντα adrenomedullin από τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα (εικόνα 3.28) [Meirelles et al., 2009, Suga et al., 2009]. Εικόνα Αντι ουλοποιητική δράση των MSCs. Οι HGF και bfgf (και πιθανώς και ο παράγοντας adrenomedullin) που παράγονται από τα MSCs συµβάλλουν στην καταστολή της ουλοποίησης που οφείλεται σε ισχαιµία [Meirelles et al., 2009]. Υποστήριξη της ανάπτυξης και της διαφοροποίησης των αυτόχθονων stem και προγονικών κυττάρων Τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα που βρίσκονται σε καλλιέργεια ενισχύουν την αιµοποίηση in vitro, και αυτή τους η ικανότητα συµπεριλαµβάνει την σταθερή έκκριση διαλυτών παραγόντων όπως είναι οι SCF, LIF, IL-6, και M-CSF (macrophage colony - stimulating factor). Επιπρόσθετα, η υποστήριξη της αιµοποίησης µπορεί να ενισχυθεί περαιτέρω από την επαγόµενη από την IL - 1a έκκριση των G-CSF και GM- CSF (εικόνα 3.29). Σε in vivo µελέτες έχει φανεί επίσης πως τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα διατηρούν τη δεξαµενή των αιµοποιητικών stem κυττάρων µέσω της έκκρισης του SDF 1 (stromal - derived factor 1 ή CXCL12), γεγονός το οποίο υπονοεί 132

133 πως η ενίσχυση της αιµοποίησης που παρατηρείται in vitro αναπαριστά µε ακρίβεια κάποια από τα φαινόµενα τα οποία λαµβάνουν χώρα υπό φυσιολογικές συνθήκες in vivo. Στην περίπτωση της ισχαιµικής βλάβης εγκεφάλου επιµύων, τα κύτταρα των αιµοφόρων αγγείων φάνηκε πως εκφράζουν SDF-1 και αγγειοποιητίνη-1, µε επακόλουθο την επιστράτευση προγονικών νευρικών κυττάρων. Η έκφραση του SDF-1 και της αγγειοποιητίνης-1 είναι χαρακτηριστικό των περικυττάρων, γεγονός που υποδηλώνει πως αυτά τα κύτταρα ήταν υπεύθυνα για την επιστράτευση και υποστήριξη της επιβίωσης των νευρικών προγονικών κυττάρων [Meirelles et al., 2009]. Αγγειογένεση Η αγγειογένεση που προκαλείται από τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα µπορεί να θεωρηθεί ως µία ακόµα υποστηρικτική δράση τους απέναντι στα stem και τα προγονικά κύτταρα. Όπως γνωρίζουµε, η επανεγκαθίδρυση της παροχής του αίµατος είναι θεµελιώδους σηµασίας διεργασία κατά την επούλωση των κατεστραµµένων ιστών. Οι αγγειογενετικές δράσεις των MSCs έχουν αποδοθεί σε µια ποικιλία παραγόντων στους οποίους συµπεριλαµβάνονται οι bfgf, VEGF, PlGF (placental growth factor), IL-6 και MCP 1, ενώ ορισµένοι από αυτούς τους παράγοντες ταυτόχρονα αναστέλλουν τον θάνατο των ενδοθηλιακών κυττάρων (εικόνα 3.30). Τέλος, η εκ νέου µετατροπή των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων σε περικύτταρα χρησιµεύει για τη σταθεροποίηση και ενίσχυση των νεοσχηµατιζόµενων αγγείων τόσο in vitro όσο και in vivo [Meirelles et al., 2009, Kinnaird et al., 2004]. Εικόνες 3.29 και Τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα διεγείρουν τον πολλαπλασιασµό των αυτόχθονων προγονικών ή stem κυττάρων των ιστών µέσω έκκρισης των SCF, LIF, M-CSF, SDF-1 και 133

134 αγγειοποιητίνης-1. Επιπρόσθετα, διεγείρουν την τοπική αγγειογένεση µέσω έκκρισης µιας ποικιλίας µορίων στην εξωκυττάρια ουσία στα οποία περιλαµβάνονται τα VEGF, IGF-1, PIGF, MCP-1, bfgf και IL-6 [Meirelles et al., 2009]. Χηµειοταξία Τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα που βρίσκονται σε καλλιέργεια εκκρίνουν ένα ευρύ φάσµα χηµειοτακτικών µορίων στα οποία συµπεριλαµβάνονται τα CCL2 (MCP 1), CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP 3), CCL20 (MIP-3a), CCL26 (eotaxin 3), CX3CL1 (fractalkine), CXCL5 (ENA 78), CXCL11 (i TAC), CXCL1 (GROa), CXCL12 (SDF 1), CXCL8 (IL 8), CXCL2 (GROb) και CXCL10 (IP-10) (εικόνα 3.31). Τα κύτταρα στόχοι για αυτά τα µόρια είναι τα µονοκύτταρα, τα ηωσινόφιλα, τα ουδετερόφιλα, τα βασεόφιλα, τα memory και naive T κύτταρα, τα B κύτταρα, τα NK κύτταρα, τα δενδριτικά κύτταρα, και τα αιµοποιητικά και ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα. Παρά το γεγονός ότι τα µόρια αυτά εκκρίνονται σε σταθερούς ρυθµούς από τα ευρισκόµενα σε καλλιέργεια MSCs, µε κάποιες διαφορές µεταξύ των µελετών που πιθανότατα αποδίδονται στις διαφορετικές καλλιεργητικές συνθήκες, είναι πολύ πιθανόν το µοντέλο της έκφρασης χηµειοκινών εκ µέρους των MSCs να τροποποιείται όταν αυτά αλληλεπιδρούν µε άλλους κυτταρικούς τύπους και ιδιαιτέρως µε κύτταρα του ανοσιακού συστήµατος [Meirelles et al., 2009]. Εικόνα Μια οµάδα από 15 τουλάχιστον χηµειοκίνες που παράγονται από τα MSCs µπορούν να προκαλέσουν τη µετακίνηση λευκοκυττάρων στην τραυµατισµένη περιοχή. Το γεγονός αυτό αναπαριστά ένα ιδιαίτερα σηµαντικό βήµα της επουλωτικής διεργασίας [Meirelles et al., 2009]. 134

135 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΑΝΑΓΕΝΝΗΣΗΣ ΣΤΟ ΕΡΜΑ Η οµοιόσταση ενός φυσιολογικού ιστού περιλαµβάνει µια πολύ λεπτή ισορροπία ανάµεσα στα κύτταρα που εισέρχονται και στα κύτταρα που εξέρχονται από τον πληθυσµό. Η είσοδος νέων κυττάρων στον πληθυσµό ενός ιστού, όπως είναι το δέρµα, καθορίζεται από το ρυθµό του πολλαπλασιασµού τους, ενώ η έξοδός τους από αυτόν πραγµατοποιείται είτε µε το θάνατό τους, είτε µε τη διαφοροποίηση σε άλλον τύπο κυττάρων [Kumar et al., 1997]. Προκειµένου να διατηρηθεί λοιπόν αυτή η ισορροπία, ο ιστός πρέπει να διαθέτει κύτταρα µε δυνατότητες τόσο αυτοανανέωσης, όσο και διαφοροποίησης. Τα stem κύτταρα και τα προγονικά κύτταρα πραγµατοποιούν αυτές τις βιολογικές διαδικασίες αποτελώντας λειτουργικές µονάδες αναγέννησης τόσο κατά την φυσιολογική αναγέννηση όσο και κατά τη αποκατάσταση του δέρµατος µετά από τραύµα (εικόνα 4.1) [Perryman et al., 2006]. Εικόνα 4.1. Οµοιοστατικοί µηχανισµοί ρύθµισης των κυτταρικών πληθυσµών στο δέρµα. Ο αριθµός των κυττάρων είναι δυνατόν να µεταβληθεί µέσω των διακυµάνσεων συγκεκριµένων µεταβλητών. Αυτές συµπεριλαµβάνουν τους αυξηµένους ή µειωµένους ρυθµούς παραγωγής νέων κυττάρων από τα stem κύτταρα, τον κυτταρικό θάνατο που πραγµατοποιείται µέσω απόπτωσης καθώς και τις αλλαγές στους ρυθµούς πολλαπλασιασµού ή διαφοροποίησης [Kumar et al., 2009]. 135

136 ΑΝΑΓΕΝΝΗΣΗ ΤΟΥ ΕΡΜΑΤΟΣ Τόσο η ανθρώπινη επιδερµίδα, όσο και τα εξαρτήµατά της επιδεικνύουν διαφορετικές ιδιότητες και µορφολογίες κατά τόπους προκειµένου να επιτελέσουν πολύ σηµαντικές λειτουργίες όπως είναι η προστασία έναντι της περιβαλλοντικής βλάβης, η µόλυνση από µικροοργανισµούς, η αφυδάτωση, η θερµορρύθµιση αλλά και η διατήρηση της ανάπτυξης των τριχών. Η ακεραιότητα του δέρµατος και η λειτουργία του ως φραγµού ρυθµίζεται αυστηρά από ένα πολύπλοκο δίκτυο από αλληλεπιδράσεις που λαµβάνουν χώρα τόσο ανάµεσα σε κύτταρα, όσο και ανάµεσα σε κύτταρα και τη θεµέλια ουσία [Mimeault et al., 2010]. Ως αποτέλεσµα των πολλαπλών επιβλαβών ερεθισµάτων που επιδρούν στην επιφάνεια του δέρµατος ενός οργανισµού, η επιδερµίδα είναι υποχρεωµένη να αυτοανανεώνεται καθ όλη τη διάρκεια της ζωής του. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας αυτής, ο αριθµός των κυττάρων της επιδερµίδας παραµένει σταθερός, ούτως ώστε ο αριθµός των νέων κυττάρων που παράγονται από κάθε κυτταρική διαίρεση να αντιστοιχεί µε ακρίβεια στον αριθµό που έχει απωλεσθεί είτε λόγω διαφοροποίησης, είτε λόγω κυτταρικού θανάτου [Blanpain et al., 2009]. Πιο συγκεκριµένα, η κυτταρική αναγέννηση της επιδερµίδας και των τριχοθυλακίων διατηρείται µέσω υποπληθυσµών σωµατικών stem και προγονικών κυττάρων τα οποία βρίσκονται προστατευµένα εντός εξειδικευµένου µικροπεριβάλλοντος, της φωλεάς τους. Οι φωλεές ευρίσκονται τόσο στη βασική στιβάδα της επιδερµίδας, όσο και στους σµηγµατογόνους αδένες και τις bulge περιοχές των τριχοθυλακίων. Αυτοί οι µικροί υποπληθυσµοί κυττάρων, και κυριότερα τα ευρισκόµενα στη βασική στιβάδα της επιδερµίδας, είναι επιφορτισµένοι µε το καθήκον της αναγέννησης µιας ποικιλίας κυτταρικών σειρών σε κατάσταση οµοιόστασης. Σε αυτές περιλαµβάνονται τα ώριµα και εξειδικευµένα κερατινοκύτταρα, τα κύτταρα των σµηγµατογόνων αδένων και τα µελανοκύτταρα [Mimeault et al., 2010]. Ανανέωση της επιδερµίδας κατά τη διάρκεια της ζωής του ενήλικα Η επιδερµίδα ξεκινά στο έµβρυο ως µία µονή στιβάδα από κύτταρα εξωδερµικής προέλευσης τα οποία θα διαφοροποιηθούν προς τα κερατινοκύτταρα της επιδερµίδας. Τα κύτταρα της βασικής στιβάδας της ενδιάµεσης των τριχοθυλακίων επιδερµίδας (IFE) περιλαµβάνουν έναν πληθυσµό προγονικών κυττάρων τα οποία 136

137 µπορούν είτε να διατηρήσουν το αναπαραγωγικό τους δυναµικό παραµένοντας στη βασική στιβάδα, είτε να επιστρατευτούν και να εισέλθουν σε σταδιακή διαφοροποίηση µετακινούµενα προς την επιφάνεια του δέρµατος και δηµιουργώντας κατ αυτό τον τρόπο τις πολλαπλές υπερβασικές στιβάδες [Fuchs et al., 2008α]. ύο διαφορετικοί µηχανισµοί έχουν προταθεί προκειµένου να εξηγηθεί το πώς µία µονήρης στιβάδα από ικανά για αναπαραγωγή βασικά κύτταρα µπορεί να δηµιουργήσει µια πολύστιβη διαφοροποιηµένη επιδερµίδα. Σύµφωνα µε τον πρώτο µηχανισµό, ένας µικρός πληθυσµός από αργά διαιρούµενα stem κύτταρα της βασικής στιβάδας δίνει γένεση σε έναν µεγάλο αριθµό από ταχέως πολλαπλασιαζόµενα transit amplifying (TA) κύτταρα τα οποία, µετά από λίγες διαιρέσεις, υφίστανται µείωση στην έκφραση των επιφανειακών τους ιντεγκρινών, γεγονός που οδηγεί στην αποκόλλησή τους από τη βασική µεµβράνη και στην υπερβασική τους διαφοροποίηση (εικόνα 4.2). Αν και αυτό το µοντέλο έχει γίνει ευρέως αποδεκτό, πρόσφατες µελέτες δείχνουν πως τα βασικά κύτταρα της επιδερµίδας είναι ικανά επίσης να κατανείµουν σηµαντικές ρυθµιστικές πρωτεΐνες σε διακριτές περιοχές. Η διαδικασία αυτή οδηγεί σε διαιρέσεις οι οποίες κατανέµουν ασύµµετρα τις πρωτεΐνες που καθορίζουν τον φαινότυπο του stem κυττάρου έναντι του φαινοτύπου του υπό διαφοροποίηση κυττάρου στα δύο θυγατρικά κύτταρα [Lechler et al., 2005, Clayton et al., 2007]. Επιπλέον, επί απουσίας της β1 ιντεγκρίνης ή της α κατενίνης, οι ασύµµετρες διαιρέσεις δεν πραγµατοποιούνται σωστά, γεγονός που τονίζει τη σηµαντικότητα του ρόλου της βασικής µεµβράνης και των διακυτταρικών συνδέσεων σε αυτή τη διαδικασία [Lechler et al., 2005]. Εικόνα 4.2. Αποίκιση του δέρµατος από τα stem κύτταρα. (A) Τα stem κύτταρα αυτοανανεώνονται και επίσης παράγουν τα transit amplifying κύτταρα, τα οποία διαιρούνται και διαφοροποιούνται. (B) Τα transit amplifying κύτταρα στη βασική στιβάδα παράγουν διαρκώς 137

138 απογόνους οι οποίοι µετακινούνται προς την επιφάνεια της επιδερµίδας και εν τέλει αποφολιδώνονται [Alonso et al., 2003]. Σε έναν ώριµο οργανισµό, η επιδερµίδα υφίσταται οµοιοστατική ρύθµιση καθώς τα κύτταρα της βασικής στιβάδας περιοδικά εισέρχονται σε πρόγραµµα τελικής διαφοροποίησης και µετακινούνται προς την επιφάνεια κατά κατακόρυφες στήλες (εικόνα 4.3). Η µετάβαση από κερατινοκύτταρο της βασικής στιβάδας προς κερατινοκύτταρο της ακανθωτής στιβάδας είναι ένα σηµείο κλειδί στο πρόγραµµα τελικής διαφοροποίησης [Blanpain et al., 2009]. Καθώς τα κερατινοκύτταρα εισέρχονται στην ακανθωτή στιβάδα διακόπτουν την έκφραση των γονιδίων τα οποία κωδικοποιούν την κερατίνη 5 (KRT5 ή αλλιώς K5) και την κερατίνη 14 ( KRT14 ). Αυτές οι πρωτεΐνες των άφθονων ενδιαµέσων ινιδίων αποτελούν δείκτες των στιβαδοποιηµένων πλακωδών επιθηλιακών κυττάρων που διαθέτουν ακόµα αναπαραγωγικό δυναµικό. Ταυτόχρονα, ξεκινούν να εκφράζονται οι κερατίνες KRT1 και KRT10 γεγονός το οποίο οδηγεί στη δηµιουργία ενός ακόµα πιο ισχυρού δικτύου ενδιαµέσων ινιδίων το οποίο συνδέεται µε τα δεσµοσώµατα. Ο προκύπτων κυτταροσκελετός ενισχύει τις διακυτταρικές συνδέσεις και παρέχει προστασία έναντι του µηχανικού stress που ασκείται στην επιφάνεια της επιδερµίδας [Fuchs et al., 1980] Τα δεσµοσώµατα τα οποία συνδέονται µε τις κερατίνες K1 και K10 είναι ιδιαίτερα άφθονα στα υπερβασικά κύτταρα, ενώ τα κύτταρα της βασικής στιβάδας διαθέτουν ένα λιγότερο ισχυρό δίκτυο αποτελούµενο από τα δεσµοσώµατα και τις κερατίνες K5 και K14. Τα βασικά κύτταρα αξιοποιούν το πιο δυναµικό δίκτυο από µικροσωληνίσκους και ινίδια ακτίνης του κυτταροσκελετού τους που συνδέονται µέσω της β- και α κατενίνης µε τις διαµεσολαβούµενες από την E καντχερίνη διακυτταρικές συνδέσεις (adherens junctions), επιπροσθέτως των διαµεσολαβούµενων από την αβ1 ιντεγκρίνη συνδέσεων µεταξύ των κυττάρων και της εξωκυττάριας ουσίας [Blanpain et al., 2006α]. Τα κύτταρα της κοκκιώδους στιβάδας εκφράζουν κάποιες επιπρόσθετες δοµικές πρωτεΐνες οι οποίες εναποτίθενται κάτω από την κυτταροπλασµατική µεµβράνη [Blanpain et al., 2009]. Στα τελικά στάδια της διαφοροποίησης τα κύτταρα της κοκκιώδους στιβάδας πεθαίνουν, ενώ η απελευθέρωση λυσοσωµικών ενζύµων καταλύει ένα είδος πολυµερισµού των κοκκίων κερατοϋαλίνης και των νηµατίων 138

139 κυτταροκερατίνης προς σχηµατισµό της άµορφης µάζας της επιφανειακής κερατίνης. Τα κύτταρα της κοκκιώδους στιβάδας παράγουν ένα υδρόφοβο γλυκοφωσφολιπίδιο, το οποίο δρα ως µεσοκυττάριο «τσιµέντο», παρεµποδίζει το διασκορπισµό των επιφανειακών φολίδων και καθιστά την επιφάνεια του δέρµατος αδιαπέραστη από το νερό [Wheater et al., 2002]. Εδώ παράγονται και οι πρωτεΐνες φιλαγκρίνη και λορικρίνη [Blanpain et al., 2006α]. Με το πέρας της τελικής διαφοροποίησης, τα νεκρά επιθηλιακά κύτταρα βρίσκονται πακεταρισµένα µε λιπίδια στο εξωτερικό τους µέρος ενώ το εσωτερικό τους µέρος καταλαµβάνεται πλήρως από µια άµορφη µάζα κερατίνης. Παρά το γεγονός ότι τα κύτταρα αυτά σταδιακά αποπίπτουν από την επιφάνεια του δέρµατος και αντικαθίστανται από κύτταρα που βρίσκονται υπό διαφοροποίηση στις κατώτερες στιβάδες, προσωρινά δρουν ως ο προστατευτικός φραγµός που εµποδίζει τόσο την είσοδο των µικροβίων στον οργανισµό όσο και την απώλεια των σωµατικών υγρών [Blanpain et al., 2009]. Η ικανότητα των stem κυττάρων της επιδερµίδας για αυτοανανέωση είναι πολύ µεγάλη και, εντός τεσσάρων εβδοµάδων, ένα κύτταρο της βασικής στιβάδας της επιδερµίδας έχει υποστεί τελική διαφοροποίηση και έχει εξέλθει στην επιφάνεια του δέρµατος [Fuchs 2008]. Εικόνα 4.3. Η κυτταρική αρχιτεκτονική της επιδερµίδας. Εδώ απεικονίζονται οι αλλαγές που συµβαίνουν κατά το πρόγραµµα κυτταρικής διαφοροποίησης της επιδερµίδας. Απεικονίζονται η βασική µεµβράνη, η βασική ακανθωτή και κοκκιώδης στιβάδα, καθώς και η εξωτερική κερατίνη στιβάδα. Στα δεξιά, βλέπουµε τα σηµαντικότερα δοµικά συστατικά και τα συστατικά του κυτταροσκελετού που χαρακτηρίζουν κάθε µία από αυτές τις στιβάδες [Fuchs et al., 2008β]. 139

140 Tα stem κύτταρα της βασικής στιβάδας της επιδερµίδας κατασκηνώνουν επάνω στη βασική µεµβράνη η οποία είναι πλούσια σε εξωκυττάρια ουσία και αυξητικούς παράγοντες και διαχωρίζει την επιδερµίδα από το υποκείµενο χόριο [Fuchs 2009]. Ανεξάρτητα από το ρόλο που διαδραµατίζει στον καθορισµό της µοίρας των επιδερµικών κυττάρων µε τη συµµετοχή της στη διαδικασία της ασύµµετρης διαίρεσης, η βασική µεµβράνη είναι εξαιρετικά σηµαντική επίσης ως προς τη διατήρηση του αναπαραγωγικού δυναµικού της επιδερµίδας. Αν και οι φυσικές και µηχανικές της ιδιότητες είναι πιθανόν να επηρεάσουν από µόνες τους την ικανότητα πολλαπλασιασµού των κυττάρων της βασικής στιβάδας, η βασική µεµβράνη διαθέτει επίσης ένα πλούσιο δίκτυο από µόρια και αυξητικούς παράγοντες που παρέχουν ένα σύνθετο ρεπερτόριο από διεγερτικά ερεθίσµατα για τα βασικά κύτταρα. Σε αυτά συµπεριλαµβάνεται η λαµινίνη 5, η οποία προωθεί την αγκυροβόληση και τη σηµατοδότηση για µετανάστευση λόγω της ικανότητάς της να δρα ως προσδέτης για τα πλούσια σε α6β4 ιντεγκρίνη ηµιδεσµοσώµατα και τα πλούσια σε α3β1 ιντεγκρίνη focal adhesions (εστιακές συνάψεις-fas) [Fuchs 2008]. Τα ανθρώπινα επιδερµικά κύτταρα που βρίσκονται σε καλλιέργεια και χαρακτηρίζονται από υψηλότερα επίπεδα έκφρασης της β1 ιντεγκρίνης έχουν µεγαλύτερο δυναµικό πολλαπλασιασµού in vitro εν σχέσει µε τα υπόλοιπα κύτταρα του πληθυσµού [Owens et al., 2003]. Με την ενεργοποίηση της α3β1 ιντεγκρίνης ένας καταρράκτης κινασών που συµπεριλαµβάνει τη FAK (focal adhesion tyrosine kinase) και την Src τυροσινική κινάση απελευθερώνεται και µε αυτό τον τρόπο όχι µόνον ενεργοποιείται το Ras - MAPK σηµατοδοτικό µονοπάτι όπως θα δούµε και αργότερα, αλλά επίσης επάγεται η ανανέωση των focal adhesions και η µετανάστευση των επιδερµιδικών κυττάρων [Guasch et al., 2007]. Εικόνα 4.4. Σηµαντικά συστατικά του κυτταροσκελετού των κερατινοκυττάρων της βασικής στιβάδας της επιδερµίδας και η σχέση τους µε τη βασική µεµβράνη [Fuchs et al., 2008β]. 140

141 Σηµατοδότηση κατά την διαφοροποίηση στην επιδερµίδα Παρά το γεγονός ότι οι µορφογενετικές αλλαγές οι οποίες σχετίζονται µε τη στιβαδοποίηση του δέρµατος έχουν µελετηθεί εκτεταµένα, η κατανόηση των µοριακών µηχανισµών που ενορχηστρώνουν την διαφοροποίηση του δέρµατος παραµένει έως σήµερα σε πρώιµο στάδιο. Οι πολυπληθείς µελέτες που έχουν διεξαχθεί σε ποντίκια έχουν οδηγήσει στην αναγνώριση πολλαπλών σηµατοδοτικών µονοπατιών τα οποία είναι απαραίτητα για την σωστή στιβαδοποίηση της επιδερµίδας και την ορθή λειτουργία της ως προστατευτικού φραγµού [Koster et al., 2007]. Τα σηµατοδοτικά αυτά µονοπάτια συµπεριλαµβάνουν το Notch, το MAPK (mitogen-activated protein kinase), καθώς και τους µεταγραφικούς παράγοντες p63, τον NF-κB (nuclear factor-κb), την AP2 οικογένεια, τους µεταγραφικούς ρυθµιστές C/EBP (CCAAT/enhancer-binding protein) τον IRF6 (interferon regulatory factor 6), τον GRHL3 (grainyhead-like 3) και τον KLF4 (Kruppel - like factor 4). Οι σχετικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ των σηµατοδοτικών αυτών µονοπατιών και των µεταγραφικών παραγόντων έχουν µόλις αρχίσει να διαλευκάνονται [Blanpain et al., 2009]. In vivo pulse-chase πειράµατα µε BrdU (εικόνα 4.5) έδειξαν ότι µόνο το 5% 10% των κυττάρων της βασικής στιβάδας της επιδερµίδας είναι ικανά να διατηρούν τη σήµανση (LRCs). Ωστόσο, έχει αποδειχθεί δύσκολο να προσδιοριστεί το κατά πόσον τα κύτταρα αυτά αποτελούν stem κύτταρα, καθώς η χρήση του παράγοντα αυτού κάνει αδύνατη τη µετέπειτα ανάλυση των φυσιολογικών ιδιοτήτων των LRCs. Αυτά τα πειράµατα, καθώς και άλλα που ακολούθησαν δηµιούργησαν την ανάγκη η ταυτοποίηση των stem κυττάρων να βασίζεται σε δείκτες ειδικούς για αυτά [Ghazizadeh et al., 2001]. Εικόνα 4.5. IFE stem κύτταρα επίµυος. Παρατηρούνται τα BrDu-θετικά LRCs (πράσινο), καθώς και τα TA κύτταρα (κόκκινο σήµανση µε Ki67) [Kaur 2006]. 141

142 Επιπλέον της ετερογένειας στην διατήρηση της σήµανσης των κυττάρων της βασικής στιβάδας, η έκφραση της β1 ιντεγκρίνης παρουσιάζει επίσης διαβάθµιση στην ανθρώπινη επιδερµίδα, καθώς όπως είδαµε, αυξηµένα επίπεδά της αντιστοιχούν σε κύτταρα µε αυξηµένο αναπαραγωγικό δυναµικό, ενώ αποτελεί και αυτή έναν µη ειδικό δείκτη για τα stem κύτταρα [Ghazizadeh et al., 2001]. Μολαταύτα, παρ όλο που βασικά κύτταρα στα οποία έχει γίνει απαλειφή της β1 ιντεγκρίνης αποτυγχάνουν να διατηρήσουν την ικανότητα αναπαραγωγής τους in vivo, αυτό έχει εν µέρει τουλάχιστον αποδοθεί σε συσχετιζόµενα ελαττώµατα στην εναπόθεση και οργάνωση της βασικής µεµβράνης [Blanpain et al., 2006]. Ένα στοιχείο που καθιστά την β1 ιντεγκρίνη ως ένα ιδιαίτερα ενδιαφέρον µόριο, είναι ο ρόλος που διακατέχει στη διαδικασία της ασύµµετρης διαίρεσης. Είναι πιθανόν κατά την ασύµµετρη διαίρεση, τα stem κύτταρα να είναι ικανά να δηµιουργούν ένα θυγατρικό κύτταρο µε υψηλά επίπεδα αβ1 ιντεγκρίνης το οποίο διατηρεί το stemness του, καθώς και ένα µε χαµηλά επίπεδα το οποίο και διαφοροποιείται. Ενδιαφέρον παρουσιάζει και η συσχέτισή της µε τη Notch σηµατοδότηση. Όταν η σηµατοδότηση από τον Notch καταλήγει στο διαχωρισµό της ενδοκυττάριας περιοχής του Notch, ο NICD απελευθερώνεται προκειµένου να σχηµατίσει έναν διµερή µεταγραφικό παράγοντα µαζί µε την RBPj DNA-binding πρωτεΐνη, γεγονός που καταλήγει σε µεταγραφικές αλλαγές απαραίτητες για την αποκόλληση από τη βασική στιβάδα και την διαφοροποίηση προς κύτταρο της ακανθωτής στιβάδας [Blanpain et al., 2006]. Αυτά τα ευρήµατα καθιστούν δύσκολη τη διάκριση µεταξύ της επίδρασης αποκλειστικά της β1 ιντεγκρίνης και της επίδρασης των λοιπών κυτταρικών αλλαγών που διαδραµατίζονται [Fuchs et al., 2008]. Κεντρικό σηµείο στη διαδικασία λήψης αποφάσεων αποτελεί η µετάβαση από τη βασική στην ακανθωτή στιβάδα µε τις µορφολογικές και λειτουργικές αλλαγές που συνεπάγεται για το κερατινοκύτταρο. Αυτή η µετάβαση ελέγχεται από τον p63 και από το Notch σηµατοδοτικό µονοπάτι. Επί απουσίας του p63 σε ποντίκια, η επιδερµίδα αποτυγχάνει να στιβαδοποιηθεί και µόνο λίγα και πτωχά διαφοροποιηµένα κύτταρα παραµένουν προσκολληµένα στην επιφάνεια του εµβρύου. ιαφαίνεται πως ο p63 είναι παράγοντας που προαπαιτείται για την εκκίνηση του προγράµµατος στιβαδοποίησης και για την διατήρηση του δυναµικού αυτοανανέωσης των διαφόρων επιθηλιακών stem κυττάρων [Senoo et al., 2007]. 142

143 Το p63 είναι µέλος της οικογένειας πρωτο ογκογονιδίων του p53 το οποίο τυπικά δρα περιορίζοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό µέσω πρόκλησης παύσης του κυτταρικού κύκλου ή απόπτωσης. Η N ισοµορφή του p63 εκφράζεται στα κύτταρα της βασικής στιβάδας. Η αυξηµένης βαρύτητας σηµασία του στη βιολογία της επιδερµίδας αναδείχτηκε όταν δυο ερευνητικές οµάδες ανακάλυψαν ότι ποντίκια µε έλλειψη του p63 αντιµετωπίζουν σοβαρά προβλήµατα στη δηµιουργία της επιδερµίδας τους [Mills et al.,1999, Yang et al., 1999]. Οι δύο αυτές οµάδες διαφωνούσαν όµως ως προς το κατά πόσον η προκύπτουσα λεπτή επιδερµίδα ήταν αποτέλεσµα ελαττωµατικής ανανέωσης των stem κυττάρων [Yang et al., 1999], ή απουσία διαφοροποίησης σε συγκεκριµένη κυτταρική σειρά [Mills et al., 1999], ενώ πρόσφατες µελέτες δεν έχουν καταφέρει να διαλευκάνουν αυτό το ζήτηµα [Fuchs 2008]. Νεότερα πειράµατα υποδεικνύουν πως η επίδραση του p63 στα κύτταρα της βασικής στιβάδας είναι αποτέλεσµα της ικανότητάς του να αναστέλλει τον p53, γεγονός που συνεπάγεται ενίσχυση της κυτταρικής επιβίωσης και µακροζωίας, ενώ οι επιδράσεις του στη διαφοροποίηση είναι ανεξάρτητες του p53 [Fuchs 2008]. Μόλις τα κύτταρα εξέλθουν της βασικής στιβάδας, ο p63 ελαττώνεται µέσω ενός µηχανισµού ο οποίος δεν είναι απολύτως ξεκαθαρισµένος, αλλά φαίνεται ότι έχει να κάνει µε σηµατοδότηση µέσω διαµεµβρανικών υποδοχέων του Notch που προκαλούν καταστολή του p63 υπερβασικά και αναστολή του πολλαπλασιασµού. Παροµοίως, σε πειράµατα που κατεστάλη ο Delta1, ένας προσδέτης του Notch που ανευρίσκεται στη βασική στιβάδα, παρατηρήθηκε εξεσηµασµένος πολλαπλασιασµός καθώς και καταστολή της διαφοροποίησης [Estrach et al., 2008]. Το σηµατοδοτικό µονοπάτι του Notch διαδραµατίζει λοιπόν σηµαντικότατο ρόλο κατά τη διάρκεια των πρώιµων σταδίων διαφοροποίησης των βασικών κυττάρων προς ακανθωτά. Η µετατροπή προς κύτταρο της ακανθωτής στιβάδας διακόπτεται πλήρως επί απαλοιφής του RBP-J, µιας προσδένουσας DNA πρωτεΐνης, η οποία σχηµατίζει έναν διµερή µεταγραφικό παράγοντα µε το NICD (Notch intracellular domain) προκειµένου να µεταδίδει την Notch σηµατοδότηση στον πυρήνα. Η µετατροπή προς ακανθωτό κύτταρο επίσης τροποποιείται µε απώλεια του Hes1 που αποτελεί ένα από τα κυριότερα γονίδια στόχους του Notch στην ανθρώπινη επιδερµίδα (εικόνα 4.6). Αντιθέτως, υπερβολική σηµατοδότηση από τον Notch καταλήγει στη µετατροπή των βασικών κυττάρων προς ακανθωτά [Blanpain, Lowry et al., 2006]. Πρόσφατες µελέτες από τους Lee et al. (2007) υποδεικνύουν πως ο 143

144 υπερβολικός πολλαπλασιασµός εντός της επιδερµίδας επί καταστολής της Notch σηµατοδότησης πιθανόν να είναι απότοκος µη κυτταρικών αυτόνοµων αλλαγών στο υποκείµενο χόριο [Fuchs 2008]. Η Notch σηµατοδότηση φαίνεται επίσης να δρα εν µέρει µέσω επίδρασης επί της έκφρασης των C/EBP DNA-binding πρωτεϊνών οι οποίες δρουν συνεργικά µε τους µεταγραφικούς παράγοντες της AP2 οικογενείας προκειµένου να ρυθµίσουν τη δέσµευση του κυττάρου προς τελική διαφοροποίηση [Blanpain et al., 2009]. Εικόνα 4.6. Ο ρόλος της σηµατοδότησης Notch στη µετατροπή των κυττάρων της βασικής στιβάδας σε κύτταρα της ακανθωτής στιβάδας της επιδερµίδας. Μετά από σύνδεσή του µε τον κατάλληλο προσδέτη, τον Jagged, ο Notch ενεργοποιείται, απελευθερώνοντας τον NICD. Ο τελευταίος διαδραµατίζει διττό ρόλο όσον αφορά τη µετάβαση του κερατινοκυττάρου από τη βασική στην ακανθωτή στιβάδα. Αφ ενός, ο NICD αλληλεπιδρά µε τον RBP-J προκειµένου να προκαλέσει την έκφραση του Hes1, ενός τυπικού γονιδίου-στόχου. Το γεγονός αυτό οδηγεί στην επαγωγή γονιδίων που η έκφρασή τους χαρακτηρίζει την ακανθωτή στιβάδα καθώς κωδικοποιούν εξειδικευµένες πρωτεΐνες διαφοροποίησης. Αφ ετέρου, ο NICD προκαλεί την καταστολή γονιδίων χαρακτηριστικών της βασικής στιβάδας στα οποία περιλαµβάνονται τα κωδικοποιούντα τις ιντεγκρίνες, και µε αυτό τον τρόπο καθίσταται δυνατή η αποκόλληση των βασικών κυττάρων από τη βασική στιβάδα µέσω ενός µηχανισµού εξαρτώµενου από το Hes1 [Blanpain et al., 2006β]. Η συµµετοχή των micrornas (mirnas) παρέχει µια περαιτέρω βαθµίδα πολυπλοκότητας σε αυτά τα δίκτυα µεταγραφικής ρύθµισης. Τα mirnas φαίνεται πως επιδρούν στην εύρυθµη λειτουργία του κυκλώµατος σηµατοδότησης το οποίο 144

145 ωθεί ένα κύτταρο της βασικής στιβάδας προς τελική διαφοροποίηση. Το mir-203 είναι ένα άφθονο και εξελικτικά διατηρηµένο mirna το οποίο εκφράζεται στις υπερβασικές στιβάδες ταυτόχρονα µε την επιδερµιδική στιβαδοποίηση και διαφοροποίηση. Η πρόωρη έκφραση του mir-203 στα βασικά κύτταρα επάγει την πρώιµη διαφοροποίησή τους και ελαχιστοποιεί το αναπαραγωγικό δυναµικό τους. Αντιθέτως, όταν το µόριο αυτό απουσιάζει ή ανευρίσκεται σε µειωµένες ποσότητες, ο κυτταρικός πολλαπλασιασµός δεν περιορίζεται µόνο στη βασική στιβάδα. Ιδιαίτερα ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι ένας από τους στόχους του mir-203 είναι το mrna του p63, η µετάφραση του οποίου αυξάνεται στα υπερβασικά κύτταρα επί απουσίας του mir 203, και καταστέλλεται στα βασικά κύτταρα όταν το mir-203 εκφράζεται πρόωρα. Οι µελέτες αυτές οδηγούν στο συµπέρασµα πως το µόριο αυτό δρα εν µέρει παρεµποδίζοντας την έκφραση στα υπερβασικά κύτταρα στόχων - κλειδιών της βασικής στιβάδας και ενισχύοντας τη δέσµευση προς διαφοροποίηση [Yi et al., 2008] Η σηµατοδότηση µέσω υποδοχέων µε δραστηριότητα τυροσινικής κινάσης (RTKs), των υποδοχέων IGFR (insulin growth factor receptor), και του υποδοχέα EGFR (epidermal growth factor receptor) ρυθµίζει επίσης την αναπαραγωγική συµπεριφορά στην επιδερµίδα. Τόσο οι προσδέτες του EGFR, όσο και αυτοί του IGFR λειτουργούν ως µιτογόνα για τα κερατινοκύτταρα in vitro. Η υπερέκφραση του EGF µπορεί να οδηγήσει σε πάχυνση της επιδερµίδας, ενώ η απαλειφή του Mig6, ενός µορίου που εξασθενεί τη σηµατοδότηση από τον EGFR, οδηγεί σε υπερβολική αύξηση του ρυθµού αναπαραγωγής των κερατινοκυττάρων και αυξηµένη προδιάθεση για ογκογένεση. Παροµοίως, ο Lrig1, ένας αρνητικός ρυθµιστής της αντίδρασης στον EGFR, φαίνεται πως µπορεί να καταστείλει τον πολλαπλασιασµό των κερατινοκυττάρων in vitro [Jensen et al., 2006]. Το θέµα γίνεται ακόµα πιο σύνθετο, όταν υπεισέρχεται και το σηµατοδοτικό µονοπάτι του TGFβ (εικόνα 4.7), η λειτουργία του οποίου µπορεί να έχει ως αποτέλεσµα τα επιδερµιδικά κερατινοκύτταρα να αποσυρθούν παροδικά από τον κυτταρικό κύκλο µέσω επαγωγής των αναστολέων της εξαρτώµενης από την G1 κυκλίνη κινάσης (cdk) [Massague et al., 2006]. Αντίστροφα, η απώλεια της έκφρασης του TGFβ, η έκφραση ενός ανταγωνιστικού υποδοχέα του TGFβ (TGFβRII), καθώς και η περιστασιακή απαλειφή του TGFβRII γονιδίου στο δέρµα οδηγεί σε επιδερµιδική υπερπλασία. Παρ όλ αυτά, ο TGFβ δύναται επίσης να προωθήσει την απόπτωση των κερατινοκυττάρων, και, ως αποτέλεσµα, σε δέρµα όπου έχει γίνει απαλοιφή του TGFβRII, η υπερπλασία αντισταθµίζεται από την αυξηµένη απόπτωση και δεν παρατηρείται διαταραχή της οµοιόστασης [Fuchs et al., 2008]. Η 145

146 οµοιόσταση που επιτυγχάνεται στην TGFβRII-null επιδερµίδα είναι όµως επισφαλής, καθώς όταν συµβαίνει µια επιπρόσθετη γενετική αλλοίωση, είναι πολύ πιθανή η ανάπτυξη καρκινωµάτων εκ πλακώδους επιθηλίου [Guasch et al., 2007]. Συναφής µε το ρόλο της TGFβ σηµατοδότησης στην πρόκληση κακοήθειας, η απαλοιφή του SMAD4 στην επιδερµίδα καταλήγει σε υπερβολικό πολλαπλασιασµό των επιδερµιδικών κερατινοκυττάρων και την ανάπτυξη καρκινωµάτων εκ πλακώδους επιθηλίου µε την πάροδο του χρόνου. Ο SMAD4 είναι ο συµπαράγοντας στα σηµατοδοτικά µονοπάτια τόσο του TGFβ όσο και της BMP (bone morphogenetic protein) καθώς µετά την ενεργοποίησή του διαµεσολαβεί στην µεταγραφή που εξαρτάται και από τους δύο παράγοντες. Παρ όλ αυτά, µολονότι ο SMAD4 έχει σχέση και µε τα δύο µονοπάτια, η απαλοιφή του υποδοχέα ΙΑ της BMP (BMPRIA) δεν έχει αποκαλύψει ελαττώµατα στην οµοιόσταση της επιδερµίδας, αν και έχει κάποιες επιπτώσεις στα τριχοθυλάκια. Συνεπώς, εκτός εάν η λειτουργική επάρκεια προκύπτει λόγω του επιπρόσθετου BMP receptor 1B και έχει αποκρύψει µια σχέση κλειδί της BMP σηµατοδότησης στην BMPR1Anull επιδερµίδα, οι επιδράσεις του SMAD4 είναι πολύ πιθανό να διαµεσολαβούνται από τη TGFβ σηµατοδότηση σε αυτόν τον ιστό [Fuchs et al., 2008α]. Εικόνα 4.7. Το σηµατοδοτικό µονοπάτι του TGFβ. Ο παράγοντας TGFβ προσδένεται στον τύπου II υποδοχέα του και αυτή η πρόσδεση επάγει την επιστράτευση και του υποδοχέα τύπου I, τον οποίο ο υποδοχέας τύπου II φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί. Ο υποδοχέας τύπου I µε τη σειρά του φωσφορυλιώνει τους δεσµευµένους στον υποδοχέα µεταγραφικούς παράγοντες Smad (Smad2/3), απελευθερώνοντάς τους µε αυτό τον τρόπο στο κυτταρόπλασµα, γεγονός που τους επιτρέπει να µετακινηθούν προς τον πυρήνα. Ο Smad4 δρα σε συνέργεια µε τους ενεργοποιηµένους Smads προκειµένου να τους βοηθήσει να εκτελέσουν τη λειτουργία τους. Στον πυρήνα, οι ενεργοποιηµένες πρωτεΐνες σχηµατίζουν συµπλέγµατα τα οποία ρυθµίζουν τη µεταγραφή µιας ποικιλίας γονιδίων [Massague et al., 2006]. 146

147 εδοµένου του γεγονότος ότι οι RTKs ενισχύουν και ο TGF-β αναστέλλει τον πολλαπλασιασµό στην επιδερµίδα, δεν προκαλεί έκπληξη το γεγονός ότι ο c-myc, ένας από τους µεταγραφικούς παράγοντες στόχους τους, κατέχει σηµαντικό ρόλο στη διατήρηση της οµοιόστασης του δέρµατος. Λειτουργικές µελέτες επιβεβαιώνουν πως η υπερέκφραση του c-myc στην επιδερµίδα καταλήγει σε αύξηση του πολλαπλασιασµού, ότι ο ενδογενής c-myc είναι απαραίτητος για την φυσιολογική οµοιόσταση του δέρµατος, αλλά και ότι η επιδερµίδα όπου η επίδραση του c - Myc δεν είναι δυνατή, καθίσταται ανθεκτική σε Ras-διαµεσολαβούµενη, χηµικά επαγόµενη ογκογένεση [Fuchs et al., 2008α]. Οι τροποποιήσεις των ιστονών έχουν αναδειχθεί το τελευταίο διάστηµα ως επιγενετικοί ρυθµιστές της διαφοροποίησης του δέρµατος. Για παράδειγµα, οι Frye και Watt παρατήρησαν ότι τα πλούσια σε β1 ιντεγκρίνη κύτταρα σχετίζονται µε µειωµένα επίπεδα ακετυλίωσης της ιστόνης H4 (εικόνα 4.8) [Frye et al., 2007]. Αυτό ισχύει και για τα ποντίκια, όσον αφορά τόσο την ενδιάµεση των τριχοθυλακίων επιδερµίδα, όσο και τα τριχοθυλάκια. Η ακετυλίωση των ιστονών γενικά σχετίζεται µε ενεργό γονιδιακή έκφραση και το ίδιο συµβαίνει µε την έκφραση του c Myc. Σε προηγούµενες µελέτες τους οι Watt et al., πρότειναν ότι το γονίδιο c-myc συµµετέχει στη µετατροπή των stem κυττάρων σε transit amplifying κύτταρα και διεπίστωσαν πως η αυξηµένη έκφραση του c Myc στα κύτταρα της βασικής στιβάδας οδηγεί σε ενίσχυση της ακετυλίωσης της ιστόνης H4, καθώς και σε επιπρόσθετες τροποποιήσεις στη λυσίνη 20 της ιστόνης Η4. Αυτά τα δεδοµένα οδήγησαν στην άποψη ότι η ενεργοποιηµένη µορφή του c-myc πιθανόν να επάγει µια κατάσταση της χρωµατίνης η οποία επιτρέπει την διαφοροποίηση των κυττάρων της επιδερµίδας [Fuchs 2009]. Εικόνα 4.8. Η ετερογένεια της βασικής στιβάδας της επιδερµίδας. Η β1 ιντεγκρίνη και η ακετυλιωµένη ιστόνη Η4 (AcH4) εµφανίζουν αντίστροφη έκφραση στην επιδερµίδα. Στα κύτταρα µε µεγάλη έκφραση της β1 ιντεγκρίνης τα επίπεδα της ακετυλιωµένης ιστόνης Η4 είναι χαµηλά [Frye et al., 2007]. 147

148 Στην επιδερµίδα λοιπόν, το ογκογονίδιο Myc είναι απαραίτητο για την έξοδο των stem κυττάρων από την φωλεά τους και τη επακόλουθη αναπαραγωγή και διαφοροποίησή τους. Αυτή η διαδικασία φαίνεται πως ρυθµίζεται από το Myc µέσω επαγωγής τροποποιήσεων στις ιστόνες που τυπικά σχετίζονται µε ενεργή κατάσταση της χρωµατίνης. Σε µια άλλη µελέτη ωστόσο, η αποµάκρυνση ενός άλλου µορίου που καταστέλλει την χρωµατίνη, της τριµεθυλιωµένης λυσίνης 27 της ιστόνης H3 (H3K27me3), συσχετίσθηκε µε την µετάβαση από αναπαραγωγή των βασικών κυττάρων σε διαφοροποίησή τους [Blanpain et al., 2009]. Πιο συγκεκριµένα, οι Sen et al. το 2008 έδειξαν σε καλλιέργειες ανθρώπινων κερατινοκυττάρων ότι υπό συνθήκες ανάπτυξης, το 10 % των υποκινητών των γονιδίων που εξετάστηκαν ήταν θετικοί για τον επιγενετικό δείκτη H3K27me3. Αντιθέτως υπό συνθήκες ευνοϊκές για διαφοροποίηση, οι υποκινητές 10% περίπου των γονιδίων που εµφάνισαν αύξηση στην έκφρασή τους στα κερατινοκύτταρα εµφάνισαν µείωση του H3K27me3 [Sen et al., 2008]. Μια πιθανή λειτουργική ερµηνεία αυτών των αντίθετων αποτελεσµάτων στην τροποποίηση της ιστόνης, κατάφερε να δοθεί µε την εκλεκτική σίγαση µέσω sirna της JMJD3, µιας αποµεθυλάσης που πιστεύεται πως ευθύνεται για την αποµάκρυνση των µεθυλοµάδων από την λυσίνη 27 της ιστόνης Η3. Η ελάττωση στην αποµεθυλάση συσχετίσθηκε µε καταστολή της διαφοροποίησης της επιδερµίδας, ενώ η υπερέκφραση της JMJD3 φάνηκε πως προκαλεί την πρώιµη ενεργοποίηση του προγράµµατος τελικής διαφοροποίησης. Μελλοντικές έρευνες αναµένεται να διαλευκάνουν ακόµα περισσότερο τους επιγενετικούς διακόπτες και τα σχετιζόµενα µε αυτούς γονίδια στόχους που ελέγχουν τη µετάβαση από αναπαραγωγή σε διαφοροποίηση και αντίστροφα στην ανθρώπινη επιδερµίδα (εικόνα 4.9) [Blanpain et al., 2009, Sen et al., 2008]. 148

149 Εικόνα 4.9. Η αποµεθυλάση JMJD3 είναι απαραίτητη για τη διαφοροποίηση της επιδερµίδας. Τα κύτταρα της επιδερµίδας που έλαβαν sirna έναντι της JMJD3 ( JMJD3i ) ή µη λειτουργικό sirna control (CTL) χρησιµοποιήθηκαν για να εκτιµηθεί η αναγέννηση της επιδερµίδας εντός ανθρώπινου χορίου σε οργανοτυπική καλλιέργεια. Οι τοµές του ιστού χρώσθηκαν για την κερατίνη 1 (K1) και την κερατίνη 10 (K10). Το κολλαγόνο τύπου VII (πράσινο) χρησιµοποιήθηκε επίσης για να σηµάνει το όριο µεταξύ επιδερµίδας και χορίου. Παρατηρείται η απώλεια των κερατινών που είναι χαρακτηριστικές της διαφοροποίησης παράλληλα µε την σίγαση της JMJD3 [Sen et al., 2008]. Τα αποτελέσµατα αυτά παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον, κυρίως υπό το πρίσµα των νέων ευρηµάτων ότι το µόριο EZH2 που µεθυλιώνει τη λυσίνη 27 της ιστόνης Η3, και αποτελεί κεντρικό στοιχείο του polycomb κατασταλτικού συµπλέγµατος, λειτουργεί στη βασική στιβάδα της εµβρυϊκής επιδερµίδας ποντικών in vivo καταστέλλοντας µία οµάδα γονιδίων που σχετίζονται µε την τελική διαφοροποίηση στην επιδερµίδα. Αν και οι πλήρεις µοριακοί µηχανισµοί παραµένουν ασαφείς, φαίνεται πως πολλοί από αυτούς τους υποκινητές διαθέτουν θέσεις πρόσδεσης για τους AP1 µεταγραφικούς παράγοντες που είναι γνωστό πως συµµετέχουν στη διαφοροποίηση της επιδερµίδας. Κάποιοι από τους µεταγραφικούς παράγοντες αυτούς εκφράζονται στη βασική στιβάδα, αν και σε χαµηλότερα επίπεδα εν σχέσει µε την έκφρασή τους στις υπερβασικές στιβάδες, και η τροποποίηση H3K27me3 εµπόδιζε την πρόσβαση των AP1 παραγόντων στα γονίδια αυτά [Ezhkova et al., 2009]. Αυτού του είδους η ρύθµιση σχετίζεται µε το ότι πολλά γονίδια που σχετίζονται µε µη επιδερµιδική διαφοροποίηση καταστέλλονται επίσης από το PcG σύµπλεγµα στην αναπτυσσόµενη επιδερµίδα, και χάνουν επίσης την επισήµανση H3K27me3 149

150 όταν απουσιάζει και ο EZH2 [Ezhkova et al., 2009]. Σε αντίθεση µε τα ρυθµιζόµενα από τις PcG πρωτεΐνες επιδερµιδικά γονίδια όµως, τα γονίδια που σχετίζονται µε τα µυϊκά ή νευρικά κύτταρα παραµένουν κατεσταλµένα και δεν προσδένουν τους AP1 παράγοντες στα κύτταρα της βασικής στιβάδας επί απουσίας του Ezh2. Πιθανώς, η έκφραση των µη επιδερµιδικών γονιδίων να εξαρτάται και από άλλους, ειδικούς για τον ιστό παράγοντες που δεν είναι παρόντες στον πληθυσµό των κυττάρων της βασικής στιβάδας [Fuchs 2009]. Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι τόσο η απώλεια του EZH2, όσο και του JMJD3 συνοδεύτηκαν από πρώιµη ωρίµανση της επιδερµίδας και επιτάχυνση της διαφοροποίηση στις υπερβασικές στιβάδες παρά µε πρώιµη διαφοροποίηση των κυττάρων της βασικής στιβάδας. Είναι πιθανόν αυτή η ταχεία διαφοροποίηση να εξαρτάται από την επαγωγή επιπρόσθετων µεταγραφικών παραγόντων, στους οποίους συµπεριλαµβάνονται οι C/EBPs, οι οποίοι επάγονται ανταποκρινόµενοι σε διάφορα ερεθίσµατα, µεταξύ των οποίων και η Notch σηµατοδότηση. Εναλλακτικά είναι πιθανόν οι φαινότυποι που έχουν παρατηρηθεί µέχρι σήµερα να µην έχουν αποκαλύψει πλήρως την επίδραση των PcG συµπλεγµάτων, ενώ µπορεί να συµµετέχουν και άλλες τροποποιήσεις των ιστονών, όπως η αποακετυλίωση των ιστονών [Ezhkova et al., 2009, Sen et al., 2008, Frye et al., 2007]. Εικόνα Η αρχιτεκτονική της µετάβασης από την βασική στην ακανθωτή στιβάδα. Τα διαιρούµενα κύτταρα της βασικής στιβάδας της επιδερµίδας τα οποία αφορούν δυνητικά stem κύτταρα, βρίσκονται προσκολληµένα στη βασική µεµβράνη και διαφοροποιούνται προς κύτταρα της ακανθωτής 150

151 στιβάδας υπό την επίδραση διαφόρων ερεθισµάτων. Σηµείο κλειδί σε αυτή τη µετάβαση αποτελούν οι επιγενετικές τροποποιήσεις της χρωµατίνης καθώς και η σηµατοδότηση από το Notch, που ενεργοποιούνται στα ακανθωτά κύτταρα, ενώ όπως είδαµε είναι κατεσταλµένη στα βασικά κύτταρα µέσω ποικιλίας µηχανισµών στους οποίους συγκαταλέγεται και ο αναστολέας του Notch, Numb, ο οποίος συχνά κατανέµεται ασύµµετρα κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης. Με τη σειρά της, η Notch σηµατοδότηση ελαττώνει την έκφραση της ιντεγκρίνης και του p63 γονιδίου και σε συνεργασία µε την AP2γ, aπενεργοποιεί την έκφραση του C/EBP [Fuchs 2009]. Εικόνα Οι µοριακοί µηχανισµοί που ελέγχουν τον πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση των stem κυττάρων στο δέρµα.. Τα επιδερµιδικά SCs παράγουν τρεις διακριτούς κυτταρικούς τύπους: τα κύτταρα της ακανθωτής, της κοκκιώδους, και της κερατίνης στιβάδας. Η αναπαραγωγή των επιδερµιδικών SCs, ρυθµίζεται θετικά από την β1 ιντεγκρίνη και τον TGFα, και αρνητικά από την TGFβ σηµατοδότηση. Επιπροσθέτως, οι µεταγραφικοί παράγοντες c-myc και p63 ελέγχουν την αναγέννηση της επιδερµίδας. Η Notch σηµατοδότηση και οι µεταγραφικοί παράγοντες PPARα, AP2α/γ, και C/EBPα/β ελέγχουν τη διαφοροποίηση των επιδερµιδικών κυττάρων [Fuchs et al., 2008α]. Κοινά χαρακτηριστικά των stem κυττάρων του δέρµατος Ένα σηµαντικό ερώτηµα που εγείρεται κατά τη µελέτη των stem κυττάρων του δέρµατος είναι το κατά πόσον υπάρχουν κοινά χαρακτηριστικά τόσο ανάµεσα στα stem κύτταρα των τριών διαµερισµάτων του δέρµατος, όσο και ανάµεσα στους µηχανισµούς που τα οδηγούν σε διαφοροποίηση προς συγκεκριµένες κυτταρικές σειρές. Αν και η απάντηση σε αυτό το ερώτηµα διερευνάται ακόµα µε έρευνες σε µοριακό επίπεδο, φαίνεται λογικό πως, δεδοµένων των οµοιοτήτων ανάµεσα στις φωλεές τους και της κοινής αναπτυξιακής τους προέλευσης, συγκεκριµένα χαρακτηριστικά οφείλουν να είναι κοινά και στους τρεις πληθυσµούς stem κυττάρων. Σηµαντικό είναι το γεγονός ότι και οι τρεις πληθυσµοί εκφράζουν τις κερατίνες K5 151

152 και K14, καθώς και το Np63. Αν και το Np63 εµπλέκεται επίσης σε διεργασίες διαφοροποίησης, είναι πιθανόν να αποτελεί τον κοινό παρανοµαστή στον έλεγχο του πολλαπλασιασµού των stem κυττάρων του δέρµατος [Senoo et al., 2007]. Τα κύτταρα εντός και των τριών πληθυσµών εκφράζουν επίσης την E καντχερίνη, η µείωση της οποίας φαίνεται πως είναι σηµαντικό ερέθισµα για την κινητοποίηση των εµβρυϊκών επιδερµιδικών stem κυττάρων για σχηµατισµό τριχοθυλακίου [Fuchs et al., 2008β]. Όλα τα stem κύτταρα του δέρµατος χαρακτηρίζονται επίσης από την εγγύτητά τους µε την υποκείµενη βασική µεµβράνη και εκφράζουν ιντεγκρίνες, στις οποίες συµπεριλαµβάνονται και οι α6β4 και α3β1 και, µάλιστα, όσο υψηλότερο είναι το επίπεδο των ιντεγκρινών, τόσο µεγαλύτερο είναι και το αναπαραγωγικό δυναµικό των κυττάρων. Ένα ενδιαφέρον γεγονός είναι η αύξηση της β6 ιντεγκρίνης και η παρουσία της τενασίνης C η οποία αποτελεί προσδέτη της αvβ6 ιντεγκρίνης, γεγονότα που λαµβάνουν χώρα στα bulge stem κύτταρα καθώς αυτά µεταβαίνουν από την τελογενή προς την αναγενή τους φάση. Παρόµοιες αλλαγές παρατηρούνται στη βασική στιβάδα της επιδερµίδας ως αντίδραση σε τραυµατισµό και κατά την ογκογένεση [Tumbar et al., 2004, Guasch et al. 2007]. Οι οµοιότητες των stem κυττάρων του δέρµατος επεκτείνονται και στα κοινά σηµατοδοτικά µονοπάτια τα οποία τα ρυθµίζουν. Για παράδειγµα, η Blimp1 χαρακτηρίζει τα προγονικά κύτταρα των σµηγµατογόνων αδένων και καταστέλλει την έκφραση του c myc, ενώ το µόριο Miz1 φαίνεται να έχει παρόµοια κατασταλτική δράση στη λειτουργία του c - myc στη βασική στιβάδα της επιδερµίδας. Το αποτέλεσµα της έκφρασης του c - Myc είναι ο πολλαπλασιασµός των κερατινοκυττάρων τόσο στο σµηγµατογόνο αδένα, όσο και στην επιδερµίδα, γεγονός που οδηγεί στο συµπέρασµα ότι το c - Myc πιθανώς ελέγχει τη µετατροπή των stem κυττάρων σε transit amplifying κύτταρα [Frye et al., 2003]. Ένα ακόµα σηµατοδοτικό µονοπάτι που είναι πιθανό να επιδρά στις φωλεές και των τριών πληθυσµών είναι αυτό του Notch, που ελέγχει τον καθορισµό της κυτταρικής µοίρας όχι µόνον στην επιδερµίδα, αλλά επίσης στα τριχοθυλάκια και τους σµηγµατογόνους αδένες (εικόνα 4.12) [Blanpain et al., 2006α]. Οι µέχρι σήµερα µελέτες υποστηρίζουν πως ο ρόλος του Notch είναι να ενεργοποιεί τα κερατινοκύτταρα ώστε αυτά να µεταβούν από µια αδιαφοροποίητη σε µια πιο διαφοροποιηµένη κατάσταση. Ωστόσο, αν και η σηµατοδότηση από το Notch φαίνεται να διαδραµατίζει παρόµοιο ρόλο και στους τρείς πληθυσµούς stem κυττάρων του δέρµατος, η βαρύτητα του δεν είναι ισότιµη καθώς σε µερικές 152

153 περιπτώσεις άλλα σηµατοδοτικά µονοπάτια φαίνεται πως ασκούν πιο ισχυρή επίδραση. Παραδείγµατος χάριν, τα stem κύτταρα της περιοχής bulge εισέρχονται σε νέο κύκλο της τρίχας όταν ξεπεραστεί ένα συγκεκριµένο όριο που αφορά τα επίπεδα της β - κατενίνης [Fuchs et al., 2008β]. Εικόνα Οι ρόλοι της σηµατοδότησης Notch και στις τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές stem κυττάρων του δέρµατος. (Α) Στο δέρµα, οι Notch προσδέτες εντοπίζονται συχνά στη βασική στιβάδα, ενώ οι υποδοχείς τους τυπικά βρίσκονται υπερβασικά. Η σηµατοδότηση Notch καταλήγει στην απελευθέρωση του ενδοκυττάριου τµήµατος του Notch, το οποίο µε τη σειρά του δρα ως µεταγραφικός παράγοντας για την DNA - συνδεόµενη πρωτεΐνη RBPj. Οι στόχοι αυτού του συµπλόκου συµπεριλαµβάνουν τα µόρια Hes1 και Hey1, τα οποία συνδέονται µε το DNA και συχνά λειτουργούν ως καταστολείς της µεταγραφής. Στις κυτταρικές σειρές του δέρµατος, η Notch σηµατοδότηση, όπως επισηµαίνεται είτε από την έκφραση του ενδοκυττάριου τµήµατος του Notch ή των γονιδίων στόχων Hes1 και Hey1, είτε µε λειτουργικές µελέτες, διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο στη µετάβαση των κυττάρων από κατάσταση πολλαπλασιασµού σε διαφοροποίηση. Τα βέλη αναπαριστούν τα µοριακά βήµατα στη πορεία καθεµίας από τις τρεις βασικές κυτταρικές σειρές του δέρµατος. Τα κόκκινα βέλη είναι τα βήµατα στα οποία δρα η Notch σηµατοδότηση. (B) Η µικροσκοπία ανοσοφθορισµού χρησιµοποιήθηκε σε τοµές δέρµατος ποντικιού από την E18.5 ηµέρα της κύησης (επιδερµίδα) και από την 28η ηµέρα µετά τη γέννηση (βολβός τρίχας) προκειµένου να αναδείξει την εντόπιση των Notch3, Hes1, και Hey1. Σε όλα τα δείγµατα οι πυρήνες έχουν σηµανθεί µε µπλε χρώµα. Επιπλέον, χρησιµοποιήθηκαν αντισώµατα για την ιντεγκρίνη β4 (Int) για την απεικόνιση της χοριο - επιδερµιδικής συµβολής και για την κερατίνη 14 (Ker14), ώστε να απεικονιστεί η βασική στιβάδα του εξωτερικού ελύτρου της τρίχας. Οι δύο πάνω εικόνες απεικονίζουν τη σύγχρονη έκφραση του Notch3 και του Hes1, που είναι ιδιαίτερα ισχυρή στο σηµείο µετάβασης από τη βασική στην ακανθωτή στιβάδα της επιδερµίδας. Οι δύο κάτω εικόνες δείχνουν ότι το Hes1 εκφράζεται πιο έντονα στα υπό διαφοροποίηση κύτταρα του εσωτερικού ελύτρου της τρίχας (αριστερά), ενώ το Hey1 εκφράζεται 153

154 έντονα στο εσωτερικό έλυτρο της τρίχας. Παρατηρείται ότι τα υψηλού αναπαραγωγικού δυναµικού κύτταρα του matrix στη βάση του βολβού της τρίχας είναι αρνητικά για Notch σηµατοδότηση [Fuchs 2008]. Ασύµµετρη κυτταρική διαίρεση στο δέρµα Κατά τη διάρκεια της οµοιόστασης η δεξαµενή των stem κυττάρων στο δέρµα παραµένει σταθερή. Ταυτόχρονα, δηµιουργείται η ανάγκη αναπλήρωσης των κυττάρων που αποφολιδώνονται καθηµερινά από την επιφάνεια της επιδερµίδας. Όπως και στους υπόλοιπους ιστούς, η οµοιόσταση αυτή µπορεί να επιτευχθεί είτε µέσω της ασύµµετρης διαίρεσης, είτε µέσω της συµµετρικής διαίρεσης όπως είδαµε και νωρίτερα, µε την προϋπόθεση ότι οποτεδήποτε ένα stem κύτταρο διαιρείται συµµετρικά δίνοντας µε αυτό τον τρόπο γένεση σε δύο πανοµοιότυπα θυγατρικά stem κύτταρα, ένα άλλο ταυτόχρονα θα διαιρείται επίσης συµµετρικά αλλά αυτή τη φορά δίνοντας γένεση σε δύο δεσµευµένα για επιδερµιδική διαφοροποίηση θυγατρικά κύτταρα όπως φαίνεται στην εικόνα που ακολουθεί [Caussinus et al., 2005]. Εικόνα Η οµοιόσταση της επιδερµίδας επιτυγχάνεται τόσο µέσω συµµετρικής, όσο και µέσω ασύµµετρης διαιρέσεως [Blanpain et al., 2009]. Παρ όλο που η ύπαρξη και άλλων µοντέλων είναι πιθανή, ή διατήρηση αυτής της ισορροπίας εξηγείται ευκολότερα µέσω της ασύµµετρης διαίρεσης. ύο τύποι ασύµµετρης διαίρεσης έχουν περιγραφεί στην επιδερµίδα: σύµφωνα µε τον πρώτο ο άξονας της µίτωσης (µιτωτική άτρακτος) είναι παράλληλος µε τη βασική µεµβράνη, ενώ σύµφωνα µε τον δεύτερο είναι κάθετος. Ο δεύτερος τύπος που συµβαίνει κατά 154

155 τη διάρκεια της ανάπτυξης του δέρµατος κατά την εµβρυϊκή ζωή του ποντικού, αποτελεί έναν απλό τρόπο προκειµένου να εξηγηθεί το γεγονός ότι το θυγατρικό κύτταρο που βρίσκεται στην πλευρά της βασικής µεµβράνης παραµένει προσκολληµένο µέσω των ιντεγκρινών σε αυτή και διατηρεί στενή επαφή µε τους παράγοντες που ενισχύουν την επιβίωση και την αυτοανανέωση του κυττάρου, καθώς και µε τους υποδοχείς τους, ενώ το άλλο θυγατρικό κύτταρο που βρίσκεται µακριά από τη φωλεά µπαίνει στη διαδικασία της τελικής διαφοροποίησης (εικόνα 4.14) [Blanpain et al., 2009]. Εικόνα Εικόνα ανοσοφθορισµού από επιθήλιο στοµατικής κοιλότητας. Απεικονίζεται ένα κύτταρο της βασικής στιβάδας σε γλώσσα εµβρύου κατά την E15.5 ηµέρα της κύησης που υφίσταται ασύµµετρη διαίρεση µε άξονα κάθετο στη βασική µεµβράνη η οποία συµβολίζεται µε την διακεκοµµένη λευκή γραµµή. Το δίκτυο των µικροσωληνίσκων έχει σηµανθεί µε την πρωτεΐνη GFP και φαίνεται πράσινο, ενώ το DNA αντιστοιχεί στο κόκκινο χρώµα [Fuchs et al., 2008β]. Αντιθέτως, όταν η διαίρεση συµβαίνει παράλληλα µε τη βασική µεµβράνη, όπως συµβαίνει στην ουρά του ενήλικου ποντικού, και τα δύο θυγατρικά κύτταρα παραµένουν παροδικά εντός της βασικής στιβάδας. Εκεί, το ένα κύτταρο λαµβάνει µια ασύµµετρη ποσότητα ενός σήµατος, γεγονός που οδηγεί στην µείωση της έκφρασης της ιντεγκρίνης, και ακολούθως στην αποκόλληση του κυττάρου από τη βασική στιβάδα [Lechler et al., 2005]. Φαίνεται ότι ένα τέτοιο σηµατοδοτικό µόριο είναι ο numb, ο οποίος είναι αναστολέας του Notch (εικόνα 4.15). Καθώς η σηµατοδότηση από τον Notch έχει ως αποτέλεσµα τη µείωση της έκφρασης της ιντεγκρίνης, έχει προταθεί και ως κύριο συµµετέχον µόριο στις ασύµµετρες κυτταρικές διαιρέσεις πολλών οργανισµών, συµπεριλαµβανοµένης και της Drosophila melanogaster [Blanpain et al., 2009]. Αυτό έγινε πιο σαφές σε µια πρόσφατη µελέτη ανίχνευσης κυτταρικών σειρών σε δέρµα ουράς ενήλικου ποντικού, που παρείχε επίσης στοιχεία ότι οι διαιρέσεις στη 155

156 βασική στιβάδα ήταν τόσο συµµετρικές, όσο και ασύµµετρες, ενώ µόνο το 30% των µιτώσεων σχηµάτιζε γωνία > 20 µε τη βασική µεµβράνη. Σε αυτή την περίπτωση φάνηκε ότι το δεσµευµένο προς διαφοροποίηση θυγατρικό κύτταρο δέχτηκε ισχυρή σηµατοδότηση από τον Notch, ενώ το κύτταρο που στερήθηκε σηµατοδότησης παρέµεινε stem κύτταρο [Fuchs 2008]. Εικόνα Ασύµµετρη διαίρεση µε τον άξονα διαίρεσης παράλληλο προς τη βασική µεµβράνη. Στην οµοιόσταση του δέρµατος ουράς ενήλικων ποντικών, οι ασύµµετρες διαιρέσεις των stem κυττάρων έχουν τον άξονα της διαίρεσης παράλληλο µε τη βασική µεµβράνη. Με αυτό τον τρόπο, µόνο το ένα θυγατρικό κύτταρο µπορεί να κληρονοµήσει ένα µόριο καθοριστικό της τύχης του κυττάρου, όπως το Numb26, και να παραµείνει stem κύτταρο (βήµα 1), ενώ το άλλο δεσµεύεται προς τελική διαφοροποίηση και αποκολλάται από τη βασική µεµβράνη (βήµα 2) [Blanpain et al., 2009]. Η ικανότητα του άξονα της διαίρεσης να αλλάζει προσωρινά κατεύθυνση έχει αποδειχθεί. Προγονικά κύτταρα της βασικής στιβάδας ξεκινούν ως µονή στιβάδα µε άξονα παράλληλο στη βασική µεµβράνη (εικόνα 4.16). Αυτό συµβαίνει διότι κατά την αύξηση του µεγέθους του εµβρύου τα βασικά κύτταρα πρέπει να εξισορροπήσουν τη δηµιουργία των υπερβασικών στιβάδων µε την πλάγια επέκταση του δέρµατος που είναι απαραίτητη λόγω του συνεχώς αυξανόµενου µεγέθους και επιφάνειας του εµβρύου. Αντιθέτως, στη φυσιολογική οµοιόσταση στον ενήλικα, τα προγονικά κύτταρα της βασικής στιβάδας πρέπει να αναπληρώνουν µόνο τα νεκρά κύτταρα της κερατίνης στιβάδας που αποπίπτουν. Αναλογικά, το ποσοστό των κάθετων κυτταρικών διαιρέσεων αυξάνει από 0% την E12.5 ηµέρα έως 70% ανάµεσα στις ηµέρες E14.5 και E17.5, ενώ αργότερα στην ενήλικο ζωή το ποσοστό αυτών των διαιρέσεων µειώνεται σηµαντικά λόγω των ελαττωµένων αναγκών [Lechler et al., 2005]. 156

157 Εικόνα Ασύµµετρη διαίρεση των stem κυττάρων στο δέρµα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Κατά τα πρώτα στάδια ανάπτυξης του δέρµατος στη εµβρυϊκή ζωή, οι περισσότερες κυτταρικές διαιρέσεις των stem κυττάρων είναι συµµετρικές και παράλληλες στη βασική µεµβράνη, γεγονός που εξασφαλίζει την αύξηση της επιφάνειας του αναπτυσσόµενου εµβρύου. Το επιθήλιο παραµένει µε τη µορφή µονής στιβάδας [Blanpain et al., 2009]. Η ασύµµετρη διαίρεση στο δέρµα είναι πιθανό να διενεργείται µέσω ενός µηχανισµού που περιλαµβάνει µόρια που καθορίζουν ποια θα είναι η κορυφαία και ποια η βασική επιφάνεια κάθε κυττάρου (πολικότητα του κυττάρου) όπως ο PAR3 (partitioning defective 3), ο PAR6 και η apkc (atypical protein kinase C), τα οποία ρυθµίζουν ποια θα είναι η κατεύθυνση του άξονα της µίτωσης (εικόνα 4.17). Οι πρωτεΐνες αυτές βρίσκονται τοποθετηµένες κατά µήκος της κορυφαίας επιφάνειας των κυττάρων της βασικής στιβάδας στην αναπτυσσόµενη επιδερµίδα. Κατά τη διάρκεια της µίτωσης αυτές οι πρωτεΐνες στρατολογούν άλλα µόρια όπως ο lgn (ή GPSm2), ο InSC (inscuteable) και συστατικά του πόλου της µιτωτικής ατράκτου, όπως το numa1 (nuclear and mitotic apparatus 1), τα οποία στους κατώτερους ευκαρυωτικούς οργανισµούς έχει πιστοποιηθεί πως συµµετέχουν γενετικά στις ασύµµετρες διαιρέσεις [Knoblich et al., 2008]. Η πρωτεϊνική αυτή βαθµίδωση παρέχει ένα πιθανό σηµείο αγκυροβόλησης για τους µικροσωληνίσκους, γεγονός που διευκολύνει την ασύµµετρη διευθέτηση του ενός από τους πόλους της µιτωτικής ατράκτου στο κορυφαίο τµήµα των κυττάρων της βασικής στιβάδας [Blanpain et al., 2009, Knoblich et al., 2008]. Οι ασύµµετρες διαιρέσεις που παρατηρούνται αποτελούν το µέσον για να διατηρηθεί ένα αναπαραγόµενο θυγατρικό κύτταρο πλούσιο σε ενισχυτικές της αύξησης (receptor tyrosine kinases) κινάσες και ιντεγκρίνες, και ένα υπερβασικό θυγατρικό κύτταρο µε χαµηλά επίπεδα RTKs και ιντεγκρινών. Μια σειρά πειραµάτων που ακολούθησαν ανέδειξαν τον ρόλο των αβ1 ιντεγκρινών και της α - κατενίνης στον καθορισµό της πολικότητας του κυττάρου που απαιτείται για τον κατάλληλο προσανατολισµό του πόλου της µιτωτικής ατράκτου και τη διατήρηση της οµοιόστασης [Lechler et al., 2005]. 157

158 Εικόνα Προσανατολισµός του άξονα της ασύµµετρης διαίρεσης από µόρια που καθορίζουν την πολικότητα. Κατά τη στιβαδοποίηση της επιδερµίδας, περίπου το 70% των κυτταρικών διαιρέσεων είναι ασύµµετρες, ούτως ώστε η µιτωτική άτρακτος να είναι κάθετη µε τη βασική µεµβράνη. Με αυτό τον τρόπο επιτρέπεται η ανάπτυξη των υπερβασικών κυττάρων που διαφοροποιούνται τελικώς και εγκαθιδρύουν το φραγµό του δέρµατος (βέλος). Σε αυτό το µοντέλο, τα καθοριστικά της τύχης του κυττάρου µόρια κατανέµονται ασύµµετρα ανάµεσα στα θυγατρικά κύτταρα. Τα βασικά κύτταρα ενσωµατώνουν τις ιντεγκρίνες και τους υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων (GFRs), ενώ οι πρωτεΐνες που δηµιουργούν την πολικότητα συγκεντρώνονται στην κορυφαία επιφάνεια και κατανέµονται ανισότιµα στο υπερβασικό κύτταρο [Blanpain et al., 2009]. Εν συνόλω, το µοντέλο της ασύµµετρης διαίρεσης προτείνει πως ένας πληθυσµός προγονικών κυττάρων εντός της βασικής στιβάδας µπορεί να παράγει δεσµευµένα προς διαφοροποίηση κύτταρα. Το µοντέλο της οριζόντιας ασύµµετρης διαίρεσης υπονοεί πως οι ασύµµετρες διαιρέσεις είναι το µέσον µέσω του οποίου το επιδερµιδικό stem κύτταρο καλύπτει τις αυξηµένες ανάγκες που υπάρχουν σε συγκεκριµένες φάσεις της ζωής του οργανισµού. Το µοντέλο της κάθετης ασύµµετρης διαίρεσης καταδεικνύει το γεγονός ότι η ίδια η βασική µεµβράνη µπορεί να παίζει το ρόλο της φωλεάς για τα stem κύτταρα της επιδερµίδας, διοχετεύοντας µε αυτό τον τρόπο κύτταρα προς την ακανθωτή στιβάδα. Οι οριζόντιες συµµετρικές διαιρέσεις, αποτέλεσµα των οποίων είναι η δηµιουργία δύο stem κυττάρων, παρέχουν πιθανώς εν συνεχεία τον µηχανισµό µέσω του οποίου αντικαθίστανται τα παλαιά ή τα φέροντα βλάβες stem κύτταρα της βασικής στιβάδας (εικόνα 4.18) [Fuchs 2008]. 158

159 Εικόνα ιαφορετικοί µηχανισµοί ασύµµετρης διαίρεσης συνυπάρχουν και καλύπτουν διαφορετικές ανάγκες της οµοιόστασης της επιδερµίδας. Οι συµµετρικές διαιρέσεις γίνονται µε τον άξονα παράλληλο προς τη βασική µεµβράνη, µια διαδικασία που χρησιµεύει στην κάλυψη των απωλειών στον πληθυσµό των stem κυττάρων. Οι πλάγιες συµµετρικές διαιρέσεις καταλήγουν στην παραγωγή δύο stem κυττάρων, γεγονός που τις καθιστά επίσης χρήσιµες κατά τη συνεχόµενη αύξηση της επιφάνειας της επιδερµίδας κατά την ανάπτυξη. Οι ασύµµετρες διαιρέσεις µπορούν να συµβούν είτε παράλληλα είτε κάθετα µε τη βασική µεµβράνη. Στο µοντέλο της ασύµµετρης διαίρεσης που περιλαµβάνει δύο βήµατα, το stem κύτταρο διαιρείται ασύµµετρα κατανέµοντας ανισότιµα παράγοντες που σχετίζονται µε το δυναµικό αναπαραγωγής στο θυγατρικό stem κύτταρο (SC), ενώ ταυτόχρονα οι παράγοντες που επάγουν τη διαφοροποίηση κληρονοµούνται από το άλλο θυγατρικό κύτταρο, το οποίο γίνεται µε αυτό τον τρόπο κύτταρο της ακανθωτής στιβάδας (spinous cell SP). Εάν ο άξονας της µίτωσης ήταν κάθετος προς τη βασική µεµβράνη, η διαίρεση θα κατέληγε στην άµεση τοποθέτηση του SP θυγατρικού κυττάρου µακριά από τη βασική µεµβράνη, ενώ ο παράλληλος µε τη βασική µεµβράνη προσανατολισµός του άξονα απαιτεί την επακόλουθη αποκόλληση του SP θυγατρικού κυττάρου από τη βασική µεµβράνη. Στο µοντέλο ασύµµετρης διαίρεσης που περιλαµβάνει τρία βήµατα, έχουµε την παραγωγή ενός transit - amplifyng (TA) ενδιάµεσου κυττάρου, το οποίο διαιρείται 3 έως 4 φορές προτού να αποκολληθεί από τη βασική µεµβράνη και εισέλθει σε πρόγραµµα τελικής διαφοροποίησης [Fuchs et al., 2008β]. 159

160 160

161 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΠΟΥΛΩΣΗΣ ΣΤΟ ΕΡΜΑ Όπως σε οποιονδήποτε άλλο ιστό, έτσι και στο δέρµα, µετά την επίδραση κάποιου βλαπτικού ερεθίσµατος, ενεργοποιείται µια αλληλουχία γεγονότων που ως σκοπό έχουν τόσο να περιορίσουν τη βλάβη, όσο και να προετοιµάσουν τα επιζώντα κύτταρα για διπλασιασµό. Η αποκατάσταση αρχίζει πολύ νωρίς και αφορά δύο διαφορετικές διεργασίες: (1) αναγέννηση του ιστού που έχει υποστεί βλάβη µε κύτταρα του παρεγχύµατος του ιδίου τύπου, και (2) αντικατάσταση από συνδετικό ιστό - ινοπλασία, µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία µόνιµης ουλής (εικόνα 5.1). Συνήθως στην αποκατάσταση του ιστού συµµετέχουν µε κάποιο συνδυασµό και οι δύο αυτές διεργασίες [Kumar et al., 1997]. Εικόνα 5.1. Οι διαδικασίες της αποκατάστασης µετά από τραυµατισµό. Η επούλωση µετά τον τραυµατισµό µπορεί να συµβεί είτε µέσω της αναγέννησης µε την οποία έχουµε αποκατάσταση της φυσιολογικής δοµής του ιστού, είτε µέσω της δηµιουργίας ουλής [Kumar et al., 2009]. 161

162 Η επούλωση του τραύµατος είναι µια θεµελιώδης για τη διατήρηση της οµοιόστασης, φυσιολογική διεργασία και οι διαταραχές των µηχανισµών της µπορούν να οδηγήσουν σε σοβαρή δυσλειτουργία του οργανισµού και νόσο. Ειδικά όσον αφορά το δέρµα, η επούλωση έχει µελετηθεί εκτεταµένα εδώ και περισσότερα από 100 χρόνια. Το δέρµα αποτελεί έναν σύνθετο ιστό και κατά συνέπεια τα τραύµατα πλήρους πάχους καταλήγουν στην καταστροφή πολλών δοµών, κυτταρικών στιβάδων και κυτταρικών σειρών που περιλαµβάνουν: τις στιβάδες των κερατινοκυττάρων µαζί µε τα σχετιζόµενα εξαρτήµατα όπως τα τριχοθυλάκια και οι ιδρωτοποιοί αδένες, τη βασική µεµβράνη και το χόριο που όπως είδαµε και νωρίτερα είναι ένας περίπλοκο ιστό αποτελούµενος από ινοβλάστες, εξωκυττάρια ουσία (ECM), νευρικές απολήξεις, καθώς και αιµοφόρα και λεµφοφόρα αγγεία. Ένα τραύµα προκαλεί επίσης βλάβη και σε επίπεδο µεµονωµένων κυττάρων [Shaw et al., 2005]. Η επούλωση ενός τραύµατος στο δέρµα είναι µία σύνθετη διαδικασία στην οποία εµπλέκονται συστατικά της θεµέλιας ουσίας, αυτόχθονα κύτταρα (κερατινοκύτταρα, ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα κ.α.), κύτταρα που µεταναστεύουν στο σηµείο της βλάβης όπως είναι τα λευκοκύτταρα, καθώς και ποικίλοι διαλυτοί χηµικοί διαµεσολαβητές. Όλοι αυτοί οι παράγοντες συµµετέχουν και στις τρεις φάσεις της επούλωσης που είναι η δηµιουργία φλεγµονής, ο σχηµατισµός νέου ιστού, καθώς και η αναδιαµόρφωση του ιστού αυτού (εικόνα 5.2) [Gillitzer et al., 2001]. Είναι αυτονόητο πως σηµαντικό ρόλο στη διεκπεραίωση των µηχανισµών που αναλύονται σε αυτό το κεφάλαιο διαδραµατίζουν και τα stem κύτταρα, των οποίων όµως ο ρόλος αναλύεται λεπτοµερώς στο επόµενο κεφάλαιο. Εικόνα 5.2. Φάσεις της επούλωσης του δέρµατος. Φάση φλεγµονής, φάση αναγέννησης και φάση ωρίµανσης και αναδιαµόρφωσης της ουλής [Kumar et al., 2009]. 162

163 ΑΜΕΣΗ ΑΝΤΙ ΡΑΣΗ Αµέσως µετά τον τραυµατισµό του δέρµατος, µια αλυσίδα γεγονότων λαµβάνει χώρα ως απάντηση στα βλαπτικά ερεθίσµατα τα οποία µπορεί να είναι είτε µηχανικά είτε χηµικά (εικόνα 5.3). Τα κύτταρα καθώς και τα αιµοφόρα αγγεία στο χείλος του τραύµατος ρήγνυνται. Τόσο τα κατεστραµµένα, όσο και τα κύτταρα υπό stress αντιδρούν ενεργοποιώντας µια ποικιλία σηµατοδοτικών µονοπατιών εντός των πρώτων λεπτών. Για παράδειγµα, η σηµατοδότηση µέσω των οδών SAPK / JNK και p38 καταλήγει στην φωσφορυλίωση ενός καταρράκτη σηµατοδοτικών µορίων, γεγονός που καταλήγει σε κυτταρικές αλλαγές που αφορούν τροποποιήσεις της γονιδιακής έκφρασης, την κυτταρική επιβίωση και τον κυτταρικό µεταβολισµό. Τα ίδια κύτταρα επίσης εκκρίνουν ενδογενή µόρια, ανάµεσα στα οποία και τα DAMPs (damage - associated molecular pattern molecules) τα οποία πιθανώς λειτουργούν ως ενεργοποιητικά σήµατα και χηµειοτακτικοί παράγοντες για άλλα κύτταρα της περιοχής και έτσι σηµατοδοτείται η έναρξη της φάσης της φλεγµονής [Shaw et al., 2009]. Εικόνα 5.3. Άµεση ανταπόκριση στο τραύµα και προετοιµασία για είσοδο στη φάση φλεγµονής. Το εικονίδιο στο αριστερό µέρος δείχνει την ενεργοποίηση του JNK σηµατοδοτικού µονοπατιού σε δέρµα ποντικού µία ηµέρα µετά το τραύµα [Shaw et al., 2009]. Ο απλούστερος τρόπος επιδιόρθωσης του δέρµατος είναι η επούλωση όπου η τραυµατική επιφάνεια είναι µια καθαρή και χωρίς επιµόλυνση χειρουργική τοµή η οποία συγκλείεται µε χειρουργικά ράµµατα. Αυτού του είδους η επούλωση περιγράφεται ως επούλωση σε πρώτο σκοπό. Η τοµή προκαλεί τον θάνατο ενός 163

164 περιορισµένου αριθµού επιθηλιακών κυττάρων και κυττάρων του συνδετικού ιστού καθώς και εστιακή µόνο διάσπαση της συνέχειας της βασικής µεµβράνης του επιθηλίου. Η επανεπιθηλιοποίηση για το κλείσιµο του τραύµατος συµβαίνει ταυτόχρονα µε τη δηµιουργία µιας σχετικά µικρής ουλής [Gurtner, et al., 2008, Broughton et al., 2008]. Η διαδικασία της επούλωσης γίνεται περισσότερο σύνθετη στην περίπτωση τραυµατισµών οι οποίοι προξενούν µεγάλα ελλείµµατα στην επιφάνεια του δέρµατος, προκαλώντας παράλληλα εκτεταµένη απώλεια κυττάρων και ιστού. Η επούλωση αυτών των πληγών περιλαµβάνει µια εντονότερη φλεγµονώδη αντίδραση, το σχηµατισµό άφθονου κοκκιώδους ιστού και εκτεταµένη εναπόθεση κολλαγόνου, γεγονότα που οδηγούν στη δηµιουργία µεγαλύτερης ουλής η οποία και συστέλλεται. Αυτός ο τρόπος επούλωσης είναι γνωστός ως επούλωση σε δεύτερο σκοπό. Παρά τις διαφορές που παρατηρούνται, οι βασικοί µηχανισµοί παραµένουν όµοιοι στην επούλωση σε πρώτο και στην επούλωση σε δεύτερο σκοπό (εικόνα 5.4) [Kumar et al., 2009]. Εικόνα 5.4. Επούλωση του δέρµατος και σχηµατισµός ουλής. Στάδια επούλωσης τραύµατος σε πρώτο και σε δεύτερο σκοπό. Α. Επούλωση σε πρώτο σκοπό. Το τραύµα έχει προκαλέσει µικρή απώλεια 164

165 ιστού, έχουµε το σχηµατισµό µικρής ποσότητας κοκκιώδους ιστού και τη δηµιουργία λεπτής ουλής που εµφανίζει ελάχιστη συστολή. Β. Επούλωση σε δεύτερο σκοπό. Το τραύµα είναι µεγαλύτερο και παρατηρείται η δηµιουργία µεγάλων ποσοτήτων κοκκιώδους και µετέπειτα ουλώδους ιστού, καθώς και συστολή της ουλής [Kumar et al., 2009]. ΦΑΣΗ ΦΛΕΓΜΟΝΗΣ Αυτή η φάση, η οποία είναι και η πρωιµότερη, µετά την ιστική βλάβη, χαρακτηρίζεται από πόνο, οίδηµα, θερµότητα και ερυθρότητα στο σηµείο της βλάβης και η διάρκεια της είναι µικρή σε απουσία επιµόλυνσης του τραύµατος. Αναλυτικά, µε τη βλάβη του ενδοθηλίου των αγγείων αποκαλύπτεται η εξωκυττάρια ουσία (ΕCΜ) η οποία είναι εξαιρετικά θροµβογόνος. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα η εξαγγείωση αίµατος στο σηµείο του τραυµατισµού να οδηγεί στην προσκόλληση και ενεργοποίηση αιµοπεταλίων. Έτσι, µέσα στα πρώτα λεπτά έχουµε την συνάθροιση αιµοπεταλίων και το σχηµατισµό του πρωτογενούς θρόµβου. Η διεργασία αυτή καλείται πρωτογενής αιµόσταση [Kumar et al., 1997]. Εκτός από τη δράση του στη στεγανοποίηση των αγγείων, ο θρόµβος αποτελεί το σηµείο στο οποίο προσδένονται οι αυξητικοί παράγοντες και επί του οποίου µπορούν να µετακινηθούν τα κύτταρα τα οποία µεταναστεύουν προς το σηµείο της βλάβης [Shaw et al., 2009]. Εκτός από τα αιµοπετάλια, και άλλα κύτταρα του αίµατος, ανάµεσα στα οποία και τα ουδετερόφιλα πολυµορφοπύρηνα βρίσκονται παγιδευµένα εντός του θρόµβου. Αυτά παράγουν και εκκρίνουν µια πληθώρα διαµεσολαβητών οι οποίοι ενισχύουν τη συνάθροιση αιµοπεταλίων, σηµατοδοτούν την εκκίνηση του µονοπατιού της πήξης του αίµατος και, τέλος, δρουν ως χηµειοτακτικοί παράγοντες για τα κύτταρα που εµπλέκονται στη φλεγµονώδη φάση [Eming et al., 2007]. Πιο συγκεκριµένα, τα προσκολληµένα και ενεργοποιηµένα αιµοπετάλια εκτός από αυξητικούς παράγοντες όπως είναι ο PDGF (platelet derived growth factor), CXCL4, bfgf (basic fibroblast growth factor), TGFβ (transforming growth factor - β), VEGF (vascular endothelial growth factor) και RANTES, απελευθερώνουν επίσης και τον CTAP III (chemokine connective tissue activating peptide III) ο οποίος ακολούθως µετατρέπεται µέσω πρωτεόλυσης από ουδετερόφιλα που έχουν παθητικά βρεθεί στην περιοχή µέσω εξαγγείωσης, στον NAP 2 (neutrophil activating peptide-2) ή αλλιώς CXCL7. Αρχικά, χαµηλές συγκεντρώσεις του NAP 2 που δρα ως πρώτος διαµεσολαβητής, δρουν χηµειοτακτικά ως προς τα ουδετερόφιλα 165

166 µέσω του CXCR2 (CXC chemokine receptor 2). Επιπλέον, η έκκριση του GRO a (growth related oncogene a) από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα περικύτταρα των αγγείων που σε αντίθεση µε τον ΝΑΡ 2 παράγεται απ ευθείας στην τελική του µορφή ενισχύει περαιτέρω τη διαδικασία της διαπίδυσης των ουδετεροφίλων [Gillitzer et al., 2001}. H χηµειοταξία των ουδετεροφίλων ενισχύεται περαιτέρω τόσο από τον ΕΝΑ 78 (CXCL5), όσο και από την MCP 1 (monocyte chemoattractant protein - 1). Όλες αυτές οι χηµειοκίνες αλληλεπιδρούν µε τον υποδοχέα CXCR2 που βρίσκεται πάνω στα ουδετερόφιλα και τον ενεργοποιούν. Όπως είναι γνωστό, η ένταση του χηµειοτακτικού ερεθίσµατος µειώνεται έπειτα από κάποιο σηµείο, γεγονός που είναι αποτέλεσµα της απευαισθητοποίησης και της µείωσης των επιπέδων του υποδοχέα. Κάτι τέτοιο θα είχε ως αποτέλεσµα τον τερµατισµό της κίνησης των ουδετεροφίλων µετά τη διαπίδυση και την τυχαία κατανοµή τους εντός του ιστού. Αυτό όµως δεν συµβαίνει καθώς το εµπόδιο αυτό υπερκεράζεται από την ισχυρή και επιλεκτική έκφραση της IL-8 κάτω από την επιφάνεια του τραύµατος, που είναι η περιοχή µε τη µεγαλύτερη συγκέντρωση χηµειοκινών που είναι ειδικές για τα ουδετερόφιλα (εικόνα 5.5). Επειδή η IL-8 διεγείρει επίσης τον υποδοχέα CXCR1 στα ουδετερόφιλα, αυτά καθίστανται ικανά να ανταποκριθούν εκ νέου και να µεταναστεύσουν στο σηµείο του τραυµατισµού. Είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρον ότι η επαγωγή της αναπνευστικής έκρηξης στα ουδετερόφιλα πολυµορφοπύρηνα εξαρτάται από την αλληλεπίδραση της IL- 8 µε τον CXCR1 παρά µε τον CXCR2, γεγονός που αποδεικνύεται σωτήριο ως προς την αποφυγή της πρώιµης ενεργοποίησης των ουδετεροφίλων πριν από την άφιξή τους στο σηµείο του τραυµατισµού [Murdoch et al., 2000]. Εικόνα 5.5. Ισχυρή έκφραση του mrna της IL-8, 24 ώρες µετά από τραυµατισµό σε ανθρώπινο δέρµα. Η IL-8 εκφράζεται από τα ίδια τα κύτταρα της φλεγµονής (ουδετερόφιλα και µακροφάγα) αποκλειστικά στην απογυµνωµένη τραυµατική επιφάνεια [Gillitzer et al., 2001]. 166

167 Ως αποτέλεσµα, εντός των πρώτων ωρών µετά τον τραυµατισµό έχουµε τη µετακίνηση µεγάλου αριθµού ουδετεροφίλων στην περιοχή µέσω του ενδοθηλιακού τοιχώµατος των αιµοφόρων αγγείων το οποίο έχει επίσης ενεργοποιηθεί από µια ποικιλία προφλεγµονωδών κυτταροκινών. Αυτές περιλαµβάνουν την IL 1b, τον TNF a (tumor necrosis factor-1) και την IFN γ (interferon-γ), οι οποίες επάγουν την έκφραση µιας ποικιλίας προσκολλητικών µορίων εκ µέρους του ενδοθηλίου, απαραίτητων για την προσκόλληση και διαπίδυση των λευκοκυττάρων [Kumar et al., 1997]. Τέτοια µόρια είναι οι ενδοθηλιακές P και E σελεκτίνες καθώς και τα ICAM 1, 2 [Eming et al., 2007]. Οι Ρ και Ε σελεκτίνες ελέγχουν την προσκόλληση των λευκοκυττάρων στο ενδοθήλιο των αγγείων και διευκολύνουν τη διαπίδυσή τους διαµέσου του αγγειακού τοιχώµατος (εικόνα 5.6). Η διαδικασία αυτή διευκολύνεται και από την αγγειοδιαστολή και την αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας που οφείλονται στη δράση του µονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ), την ισταµίνης που παράγεται από τα σιτευτικά κύτταρα, του ιστικού ενεργοποιητή του πλασµινογόνου, καθώς και σε άλλους παράγοντες [Shaw et al., 2009]. Τα µόρια αυτά δρουν συνδεόµενα µε ολιγοσακχαριτικούς επιτόπους ορισµένων γλυκοπρωτεϊνών στην επιφάνεια των λευκοκυττάρων. Οι σελεκτίνες του ενδοθηλίου συνήθως βρίσκονται σε χαµηλά επίπεδα ή δεν υπάρχουν καθόλου σε φυσιολογικά κύτταρα, και η έκφρασή τους αυξάνεται µετά από διέγερση από τις ανωτέρω διαµεσολαβητικές ουσίες [Kumar et al., 1997]. Αυτές οι προσκολλητίνες αλληλεπιδρούν µε ιντεγκρίνες που βρίσκονται στην εξωκυττάρια επιφάνεια των ουδετεροφίλων όπως είναι οι CD11a/CD18 (LFA- 1), CD11b/CD18 (MAC 1), CD11c/CD18 (gp150, 95) και CD11d/CD18 [Eming et al., 2007]. Εικόνα 5.6. Απεικόνιση της διαδικασίας της διαπίδυσης. Τα ουδετερόφιλα πολυµορφοπύρηνα ξεκινούν τη διαδικασία της διαπίδυσης προσκολλώµενα και κυλώντας επάνω στο εσωτερικό τοίχωµα του αιµοφόρου αγγείου, γεγονός το οποίο επάγει την έκφραση των σελεκτινών. Η σύνδεση µιας 167

168 ποικιλίας χηµειοκινών µε τους υποδοχείς τους, επάγει επίσης την έκφραση των ιντεγκρινών µέσω των οποίων τα λευκοκύτταρα προσδένονται στέρεα στο ενδοθήλιο [Chamberlain et al., 2007]. Επιπλέον, βακτηριακά υποπροϊόντα όπως λιποπολυσακχαρίτες, που βρίσκονται συγκεντρωµένα στην περιοχή της βλάβης ενισχύουν και επιταχύνουν την όλη διαδικασία. Επιπροσθέτως, κατά τον τραυµατισµό, ενεργοποιούνται τόσο η κλασσική, όσο και η εναλλακτική οδός του συµπληρώµατος, γεγονός που οδηγεί στην παραγωγή του κλάσµατος C5a το οποίο ευοδώνει επιπλέον την επιστράτευση των ουδετεροφίλων και των µονοκυττάρων. Μολαταύτα, το C5a υδρολύεται ταχέως και, συνεπώς, συµβάλλει µόνο στο πρώιµο κύµα διήθησης λευκοκυττάρων. Τέλος, λευκοτριένια από τα ενεργοποιηµένα, άρτι - αφιχθέντα ουδετερόφιλα, επιδεικνύουν και αυτά µε τη σειρά τους ισχυρές χηµειοτακτικές ιδιότητες απέναντι σε όλους τους τύπους λευκοκυττάρων [Rossi et al., 2000]. Εικόνα 5.7. Ενεργοποίηση και µετανάστευση των ουδετερόφιλων πολυµορφοπύρηνων στα τραύµατα του δέρµατος. Μετά από τραυµατισµό, αιµοπετάλια και ουδετερόφιλα πολυµορφοπύρηνα απελευθερώνονται παθητικά από τα κατεστραµµένα αιµοφόρα αγγεία. Τα αιµοπετάλια απελευθερώνουν αυξητικούς παράγοντες αλλά και διαµεσολαβητές όπως ο CTAP-III που µετά τη µετατροπή του στο NAP-2 διεγείρει τη µετανάστευση και εξαγγείωση των ουδετεροφίλων µέσω του CXCR2. Οι διεργασίες αυτές διεγείρονται και από τους GRO-a και ENA-78. Η συνεχής διέγερση από τους παράγοντες αυτούς µέσω του CXCR2 όµως, προκαλεί παροδική µείωση της ανταπόκρισης των ουδετεροφίλων, εµπόδιο το οποίο µπορεί να υπερκεραστεί µέσω της αλληλεπίδρασης της IL-8 µε τον 168

169 υποδοχέα CXCR1. Η έκφραση της IL-8 επάγεται από προφλεγµονώδεις κυτταροκίνες όπως η IL- 1 και ο TNF-a, βακτηριακά υποπροϊόντα (LPS), και από την υποξία. Επιπρόσθετα, τα υψηλά επίπεδα της IL-8 κάτω από την επιφάνεια του τραύµατος µπορούν να διεγείρουν τη µετανάστευση και τον πολλαπλασιασµό των κερατινοκυττάρων που εκφράζουν τον CXCR2, στα χείλη του τραύµατος. Τα βέλη υποδεικνύουν τις βαθµιδώσεις των χηµειοκινών [Gillitzer et al., 2001]. Καθώς στρατολογηµένα ουδετερόφιλα ξεκινούν τη διαδικασία της φαγοκυττάρωσης, ταυτόχρονα απελευθερώνουν µια µεγάλη ποικιλία ισχυρών ενεργών αντιµικροβιακών ουσιών (ενεργές ρίζες οξυγόνου - ROS, κατιονικά πεπτίδια, εικοσανοειδή), καθώς και πρωτεάσες (ελαστάση, καθεψίνη G, πρωτεϊνάση 3, ενεργοποιητή του πλασµινογόνου). Με την τεχνολογία των µικροσυστοιχιών έχει αποκαλυφθεί πρόσφατα ότι η µετανάστευση των ουδετερόφιλων πολυµορφοπύρηνων προς τις βλάβες στο δέρµα επάγει ένα µεγάλο µεταγραφικό πρόγραµµα ενεργοποίησης το οποίο καθορίζει τη λειτουργία των κυττάρων και προάγει την επούλωση της πληγής. Μέσω αυτού γίνεται πιο ξεκάθαρο το γεγονός ότι η λειτουργία των ουδετεροφίλων µπορεί να αποβεί τόσο επωφελής, όσο και καταστροφική για την επούλωση. Πειράµατα που διεξήχθησαν τη δεκαετία του 1970 σε ινδικά χοιρίδια έδειξαν ότι η έλλειψη των ουδετεροφίλων δεν διαταράσσει σηµαντικά την αποκατάσταση µετά από τοµή του δέρµατος υπό στείρες συνθήκες [Eming et al., 2007]. Μία πρόσφατη µελέτη από τους Dovi et al. (2003), χρησιµοποιώντας µια παρόµοια προσέγγιση όσον αφορά την απώλεια των ουδετεροφίλων, επιβεβαίωσε εν µέρει τις προηγηθείσες µελέτες. Παρ όλο που οι άλλες παράµετροι της επούλωσης του δέρµατος δεν επηρεάστηκαν σηµαντικά από την ουδετεροπενία, παρατηρήθηκε σηµαντική επιτάχυνση της φάσης της επανεπιθηλιοποίησης [Dovi et al., 2003]. Επιπλέον, µία πρόσφατη µελέτη δείχνει ότι η σύγκλειση των τραυµάτων σε ποντίκια µε έλλειψη του CD18 εµφάνιζε σηµαντική καθυστέρηση, πιθανότερα λόγω ελλιπούς διαφοροποίησης των µυοϊνοβλαστών και µειωµένης συστολής του τραύµατος. Η υπόθεση είναι ότι σε τραύµατα µε έλλειψη του CD18, που κατά συνέπεια στερούνται ουδετεροφίλων, η έλλειψη των αποπτωτικών ΡΜΝs από την περιοχή του τραύµατος, στερεί τα µακροφάγα από το κυριότερο διεγερτικό τους ερέθισµα προς έκκριση TGF - b1, που αποτελεί διαµεσολαβητή κλειδί στη διαφοροποίηση των µυοϊνοβλαστών. Περαιτέρω, η ελαττωµατική επούλωση πληγών αποτελεί ένα κυρίαρχο στοιχείο των ασθενειών που χαρακτηρίζονται από έλλειµµα στη λειτουργία των πολυµορφοπυρήνων [Eming et al., 2007]. 169

170 Εκτός εάν το ερέθισµα για την επιστράτευση τους επιµένει στην περιοχή του τραυµατισµού, η διήθηση από ουδετερόφιλα παύει µετά από λίγες ηµέρες, και τα ίδια τα ουδετερόφιλα φαγοκυτταρώνονται από µακροφάγα τα οποία ανευρίσκονται στη θέση της βλάβης ενός των δύο πρώτων ηµερών. Εκτός από τα αυτόχθονα µακροφάγα, ο µεγαλύτερος αριθµός τους προέρχεται από την κυκλοφορία του αίµατος [Eming et al., 2007]. Τα µακροφάγα επιδεικνύουν ανοσολογική δραστηριότητα αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου και φαγοκυττάρου και έχουν ιδιαίτερο ρόλο ως πηγή αυξητικών παραγόντων (TGF b, TGF a, basic fibroblast growth factor, PDGF και VEGF), οι οποίοι προάγουν τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων και την σύνθεση της εξωκυττάριας ουσίας από αυτόχθονα κύτταρα του δέρµατος. Με εξαίρεση την άµεση παρουσία των πολυµορφοπυρήνων στη θέση της βλάβης λόγω εξαγγείωσης από τα τραυµατισµένα αγγεία και την άµεση δράση του ΝΑΡ 2, και οι δύο λευκοκυτταρικοί τύποι µεταναστεύουν εξίσου γρήγορα στον τραυµατισµένο ιστό [Gillitzer et al., 2001]. Εικόνα 5.8. Βήµατα - κλειδιά στην επιστράτευση των ουδετερόφιλων στα σηµεία της ιστικής βλάβης. Η στόχευση οποιουδήποτε από αυτά τα βήµατα φέρει ως αποτέλεσµα την άµβλυνση της φλεγµονώδους αντίδρασης. Αρχικά έχουµε την διαπίδυση των ουδετερόφιλων διαµέσου «ενεργοποιηµένων» αιµοφόρων αγγείων που είναι παρακείµενα του σηµείου της βλάβης (A) και κατόπιν τη µετανάστευσή τους (B), που επιτυγχάνεται µέσω της επίδρασης χηµειοτακτικών παραγόντων που εκλύονται στο σηµείο της βλάβης. Τα ουδετερόφιλα απελευθερώνουν µε τη σειρά τους σήµατα (C) τα οποία λαµβάνονται από ινοβλάστες του σηµείου της βλάβης γεγονός που οδηγεί όπως θα δούµε και παρακάτω στη δηµιουργία ουλής (D). Ακολούθως τα κύτταρα αυτά φαγοκυτταρώνονται ή αποπίπτουν και η φλεγµονώδης αντίδραση λύεται [Stramer et al., 2007]. 170

171 Ενώ όµως η εξαγγείωση των πολυµορφοπυρήνων του αίµατος ρυθµίζεται κατά κύριο λόγο από το σύµπλεγµα CD11 / CD18 και τα ICAMs, η µετανάστευση των µονοκυττάρων στο τραύµα ελέγχεται επιπρόσθετα και από την αλληλεπίδραση ανάµεσα στην a4b1 ιντεγκρίνη και το ECAM 1 (endothelial vascular cell adhesion molecule 1). Η διήθηση από µακροφάγα του τραυµατισµένου ιστού ρυθµίζεται σε µεγάλο βαθµό από βαθµιδώσεις διαφορετικών χηµειοτακτικών παραγόντων στους οποίους συµπεριλαµβάνονται αυξητικοί παράγοντες, προφλεγµονώδεις κυτταροκίνες, καθώς και ένας αριθµός από χηµειοκίνες όπως είναι ο RANTES (CCL5), η MIP - 1a (macrophage inflammatory protein - 1a, CCL3), η MIP 1b (CCL4), ο I309 (CCL1), µε σηµαντικότερη την πρωτεΐνη MCP-1 (monocyte chemoattractant protein - 1), η οποία βρέθηκε πως εκφράζεται σχεδόν αποκλειστικά την πρώτη εβδοµάδα από τη στιγµή του τραυµατισµού [Eming et al., 2007]. Η MCP 1 (εικόνα 5.9) παράγεται από αυτόχθονα κύτταρα του ιστού (κερατινοκύτταρα στα χείλη του τραύµατος, ενδοθηλιακά κύτταρα), καθώς και από κύτταρα φλεγµονής (µακροφάγα) και συµµετέχει σε διάφορα στάδια χηµειοταξίας των µονοκυττάρων, των mast κυττάρων και των λεµφοκυττάρων κατά τη διάρκεια της επούλωσης των τραυµάτων του δέρµατος. Τα προσελκυόµενα µακροφάγα και λεµφοκύτταρα παράγουν µια ποικιλία ρυθµιστικών καθώς και αυξητικών παραγόντων. Τα mast κύτταρα απελευθερώνουν IL 4 η οποία διεγείρει τη δραστηριότητα των ινοβλαστών και µειώνει την έκφραση της MCP-1. Μια επιπρόσθετη λειτουργία της MCP-1 είναι να συµβάλλει στην κινητικότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης [Leonard, et al., 1998]. Εικόνα 5.9. Εντόπιση του mrna της MCP-1 στο ανθρώπινο δέρµα 2 ηµέρες µετά τον τραυµατισµό µε in situ υβριδισµό. Εντοπίζεται έκφραση της MCP-1 από τα µονοπύρηνα φλεγµονώδη κύτταρα, καθώς και στις περιοχές των αγγείων σε όλο το βάθος του χορίου [Gillitzer et al., 2001]. 171

172 Καθώς λοιπόν τα µονοκύτταρα εξέρχονται των αιµοφόρων αγγείων, ενεργοποιούνται και διαφοροποιούνται σε ώριµα µακροφάγα. Αυτή η µεταµόρφωσή τους συνεπάγεται σηµαντικές αλλαγές στο φαινότυπο του µακροφάγου οι οποίες προκύπτουν από δραµατικές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση. Υπάρχουν στοιχεία ότι η διεργασία της ενεργοποίησης ρυθµίζεται από διαµεσολαβητές παρόντες στο µικροπεριβάλλον, µε στόχο την προσαρµογή της λειτουργίας του µακροφάγου στις ειδικές µεταβολικές ανάγκες που υπάρχουν στη θέση της βλάβης. Έχει βρεθεί ένας µεγάλος αριθµός υποδοχέων κυτταρικής επιφανείας µέσω των οποίων τα µακροφάγα «αντιλαµβάνονται» και αλληλεπιδρούν µε το µικροπεριβάλλον τους, όπως είναι οι Toll - like υποδοχείς, οι υποδοχείς του συµπληρώµατος και οι υποδοχείς Fc [Eming et al., 2007]. Όσον αφορά τα µαστοκύτταρα, αυτά αποτελούν έναν επιπρόσθετο υπότυπο λευκοκυττάρων που είναι παρόντα στο δέρµα και συµµετέχουν στην ιστική επιδιόρθωση καθώς λειτουργούν ως πηγή µιας ποικιλίας προφλεγµονωδών διαµεσολαβητών και κυττοκινών που συµβάλλουν στη διαδικασία της φλεγµονής και των αγγειακών µεταβολών. Μετά τον τραυµατισµό, τα τοπικά mast κύτταρα αποκοκκιώνονται εντός ωρών και κατά συνέπεια µπορεί να είναι λιγότερο εµφανή. Ο αριθµός των mast κυττάρων επιστρέφει στα φυσιολογικά επίπεδα µέσα στις πρώτες 48 ώρες µετά τον τραυµατισµό, και στη συνέχεια αυξάνει ακόµα περισσότερο καθώς η ιστική επούλωση προχωρά. Και σε αυτήν την περίπτωση το µόριο το οποίο διαδραµατίζει κεντρικό ρόλο είναι η MCP-1 (εικόνα 5.10), η οποία εκτός από τα µονοκύτταρα, σε δεύτερο χρόνο δρα χηµειοτακτικά και ως προς τα µαστοκύτταρα. Μάλιστα, ο πενταπλασιασµός του αριθµού τους στη θέση βλάβης φαίνεται ότι είναι αποτέλεσµα σχεδόν αποκλειστικά της επιστράτευσής τους, παρά του πολλαπλασιασµού τους [Trautmann et al., 2000]. Καθώς τα mast κύτταρα παράγουν υψηλά επίπεδα της IL 4, η οποία εν συνεχεία διεγείρει τον πολλαπλασιασµό των ινοβλαστών, φαίνεται πως η MCP-1 όντως υποβοηθά τη διαδικασία της επούλωσης µέσω στρατολόγησης διαφορετικών κυτταρικών πληθυσµών λευκοκυττάρων [Gillitzer et al., 2001]. 172

173 Εικόνα Μοντέλο της έκφρασης της MCP-1 και της λειτουργίας της στο ανθρώπινο δέρµα κατά τη διεργασία της επούλωσης. Η MCP-1 παράγεται σε µεγάλο βαθµό από τα αυτόχθονα κύτταρα (κερατινοκύτταρα στα χείλη του τραύµατος, ενδοθηλιακά κύτταρα) καθώς και από τα κύτταρα φλεγµονής (µακροφάγα) και συµµ µετέχει σε διάφορα στάδια της χηµειοταξίας των µονοκυττάρων, των µαστοκυττάρων και των λεµφοκυττάρων κατά την επούλωση του δέρµατος. Τα προσελκυόµενα µακροφάγα και λεµφοκύτταρα παράγουν µια ποικιλία ρυθµιστικών και αυξητικών παραγόντων. Τα mast κύτταρα απελευθερώνουν την IL-4, η οποία διεγείρει τις δραστηριότητες των ινοβλαστών και µειώνει την έκφραση της MCP-1. Επιπροσθέτως, η MCP-1 ενδέχεται να συµµετέχει στην κινητικότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων που παρατηρείται κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης. Τα βέλη υποδεικνύουν τις βαθµιδώσεις συγκέντρωσης της MCP-1 [Gillitzer et al., 2001]. Τα αποτελέσµατα των µελετών πάνω σε αυτόν τον τοµέα ήταν αρχικά αντιφατικά. Οι Egozi et al. (2003) ανέφεραν ότι ποντίκια µε έλλειψη mast κυττάρων (WBB6F1/Jkitw/KitW_V) είχαν µειωµένο αριθµό ουδετεροφίλων στην περιοχή της πληγής, ενώ η διήθηση των µακροφάγων και των Τ κυττάρων ήταν φυσιολογική. Σε αυτή τη σειρά µελετών βρέθηκε ότι η έλλειψη αυτή δεν είχε σηµαντική επίδραση στην επιθηλιοποίηση, τη σύνθεση κολλαγόνου ή την αγγειογένεση. Τα αποτελέσµατα αυτά υποδεικνύουν πως τα µαστοκύτταρα συµµετέχουν στη ρύθµ µιση της επιστράτευσης των ουδετεροφίλων [Weller et al., 2006]. Παρ όλ αυτά, σε φυσιολογικές, άνευ επιπλοκών συνθήκες, τα σιτευτικά κύτταρα δεν θεωρείται πιθανό πως επιτελούν λειτουργίες οι οποίες επηρεάζουν το ρυθµό σύγκλεισης του τραύµατος στα ποντίκια. Οι Iba et al. (2004) επιβεβαίωσαν εν µέρει αυτά τα αποτελέσµατα αποδεικνύοντας τη σηµαντική επίδραση της έλλειψης των µαστοκυττάρων (W/Wv ποντίκια) πάνω στην εναπόθεση κολλαγόνου και την 173

174 αναδιαµόρφωση του ιστού στις µετέπειτα φάσεις της επούλωσης, παρ όλ αυτά ο ρυθµός σύγκλεισης του τραύµατος δεν φάνηκε να επηρεάζεται από αυτή την έλλειψη. Προσφάτως, και οι δύο µελέτες έχουν τεθεί υπό αµφισβήτηση λόγω µιας µελέτης που περιγράφει σηµαντική επίδραση της έλλειψης των µαστοκυττάρων πάνω στη διαπερατότητα των αγγείων, την εισροή των πολυµορφοπυρήνων, και, εν τέλει, το ρυθµό επούλωσης του τραύµατος [Weller et al., 2006]. Καταλήγοντας, η επιστράτευση φλεγµονωδών κυττάρων κατά τη φλεγµονώδη φάση της επούλωσης σε τραύµα, είναι µια φυσιολογική και υγιής διαδικασία. Αυτή η ταχεία και οργανωµένη αλληλουχία γεγονότων έχει ως σκοπό την προστασία του οργανισµού από επιπρόσθετες επιβλαβείς επιδράσεις από το περιβάλλον, καθώς και τη διατήρηση της οµοιόστασης του τραυµατισµένου ιστού [Stramer et al., 2007]. Εικόνα Συνοπτική παρουσίαση των κυτταρικών γεγονότων κατά τη φλεγµονώδη φάση της επούλωσης. εξιά κάτω: ανοσοϊστοχηµική χρώση για µακροφάγα δείχνει την έντονη φλεγµονώδη αντίδραση που λαµβάνει χώρα σε δέρµα ποντικού τρεις ηµέρες µετά τον τραυµατισµό [Shaw et al., 2009]. Ωστόσο, η επιτυχής επούλωση απαιτεί επίσης την έγκαιρη παύση της φλεγµονώδους αντίδρασης. Όµως αν και οι γνώσεις µας σχετικά µε τους µηχανισµούς και τα µόρια που συµµετέχουν στην πρόκληση αυτής της φλεγµονώδους αντίδρασης συνεχώς αυξάνονται, οι µηχανισµοί που περιορίζουν και, εν συνεχεία, παύουν αυτή τη δραστηριότητα είναι λιγότερο γνωστοί. Αυτοί οι µηχανισµοί περιλαµβάνουν: µείωση της έκφρασης των χηµειοκινών από αντιφλεγµονώδεις κυτταροκίνες όπως η IL-10 ή 174

175 ο TGF-b1, αύξηση της έκφρασης αντιφλεγµονωδών µορίων όπως ο ανταγωνιστής του υποδοχέα της IL-1 ή ο διαλυτός υποδοχέας του TNF, απόπτωση, καθώς και µείωση της ευαισθησίας και ανταπόκρισης των υποδοχέων των φλεγµονωδών µορίων λόγω υψηλών συγκεντρώσεων προσδετών. Πρόσφατες µελέτες υποδεικνύουν ρόλους και για άλλα µόρια όσον αφορά τη λύση της φλεγµονής, όπως οι µεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs) και ο Nrf-2 [Eming et al., 2007]. Εικόνα ιαµεσολαβητές και µηχανισµοί της φλεγµονής και της λύσης της κατά την επούλωση. Ο ιστικός τραυµατισµός προκαλεί την άµεση εκκίνηση της οξείας φλεγµονώδους αντίδρασης που διαµεσολαβείται από χηµειοτακτικές ουσίες που προέρχονται από πρωτεΐνες του πλάσµατος, αυτόχθονα και επιστρατευµένα αιµοποιητικά κύτταρα, την εξωκυττάρια ουσία και τα ίδια τα βακτήρια. Η διαδικασία της επούλωσης προχωρά µε λύση της φλεγµονής η οποία είναι εξίσου απαραίτητη για επιτυχή επιδιόρθωση. Η λύση της φλεγµονής επιτυγχάνεται µέσω ελάττωσης των προφλεγµονωδών διαµεσολαβητών και την επανάκτηση της φυσιολογικής τριχοειδικής διαπερατότητας που συνεισφέρουν στην παύση έκκρισης χηµειοτακτικών ουσιών, τη σύνθεση αντιφλεγµονωδών µεσολαβητών, την απόπτωση και τη λεµφαγγειακή κάθαρση του τραύµατος. Μια έντονη ή παρατεταµένη φλεγµονώδης αντίδραση καταλήγει σε βλάβη του ιστού και πτωχή επούλωση [Eming et al., 2007]. 175

176 ΦΑΣΗ ΑΝΑΓΕΝΝΗΣΗΣ Τα γεγονότα που λαµβάνουν χώρα κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης συµπεριλαµβάνουν την αγγειογένεση, τη δηµιουργία κοκκιώδους ιστού, την ίνωση και την επιθηλιοποίηση. Αγγειογένεση Τα ενδοθηλιακά κύτταρα συµµετέχουν ενεργά στην αποκατάσταση του τραυµατισµένου ιστού µέσω δύο διαφορετικών αλλά εξίσου σηµαντικών διεργασιών στις οποίες συµµετέχουν: πρώτον, το ενδοθήλιο διαµεσολαβεί και ρυθµίζει την στρατολόγηση των λευκοκυττάρων από το ενδαγγειακό διαµέρισµα προς τον ιστό, και κατά δεύτερον, τα ενδοθηλιακά κύτταρα δηµιουργούν νέα αγγεία κατά τη διάρκεια της επιδιόρθωσης, τα οποία προέρχονται µε εκβλάστηση από τα προϋπάρχοντα τριχοειδή, µια διαδικασία που καλείται αγγειογένεση. Ο ιστός στον οποίο επιτελείται η αγγειογένεση, είναι οιδηµατώδης λόγω των διαρροών που οφείλονται στην ατελή διαµόρφωση των διενδοθηλιακών συνδέσεων, όσο και ερυθηµατώδης, λόγω της πλούσιας παροχής αίµατος, που είναι απαραίτητη για την ικανοποίηση των υψηλών µεταβολικών απαιτήσεων του νεοσυντιθέµενου ιστού [Gillitzer et al., 2001]. Για την ανάπτυξη ενός νέου τριχοειδούς απαιτούνται τέσσερις γενικές βαθµίδες: (1) πρωτεολυτική διάσπαση της βασικής µεµβράνης του αρχικού αγγείου, µε αποτέλεσµα το σχηµατισµό εκβλάστησης τριχοειδούς, (2) µετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων προς το αγγειογενετικό ερέθισµα, (3) πολλαπλασιασµός των ενδοθηλιακών κυττάρων και, (4) ωρίµανση των ενδοθηλιακών κυττάρων, µε οργάνωσή τους σε τριχοειδείς σωλήνες. Είναι δυνατόν να γίνει όµως και µέσω της επιστράτευσης προγονικών ενδοθηλιακών κυττάρων όπως µπορούµε να δούµε στην παρακάτω εικόνα [Kumar et al., 1997]. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα προσελκύονται στο σηµείο της βλάβης από την ινωδονεκτίνη ενώ και διάφοροι άλλοι παράγοντες που εκκρίνονται από άλλα κύτταρα µπορούν να επάγουν την αγγειογένεση, µε κυριότερους τον b FGF (basic fibroblast growth factor) που εκκρίνεται από τα µακροφάγα και τον VEGF (vascular endothelial growth factor) που εκκρίνεται από τα κερατινοκύτταρα [Romo et al., 2006]. 176

177 Εικόνα Μηχανισµοί αγγειογένεσης. (Α) Αγγειογένεση από προϋπάρχοντα αιµοφόρα αγγεία. Σε αυτό το µοντέλο τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων µεταναστεύουν και πολλαπλασιάζονται προς σχηµατισµό τριχοειδικών εκβλαστήσεων. (B) Αγγειογένεση µέσω κινητοποίησης ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων (endothelial precursor cells - EPCs) από το µυελό των οστών και µετανάστευσής τους στο σηµείο του τραυµατισµού. Στο σηµείο της βλάβης, τα EPCs διαφοροποιούνται και σχηµατίζουν ένα ώριµο τριχοειδικό δίκτυο το οποίο συνδέεται µε τα προϋπάρχοντα επιτόπια τριχοειδή αγγεία. Ανεξαρτήτως του µηχανισµού, η ωρίµανση των αγγείων περιλαµβάνει την επιστράτευση περικυττάρων και λείων µυϊκών κυττάρων τα οποία σχηµατίζουν την περιενδοθηλιακή στιβάδα [Kumar et al., 2009]. Σηµαντικό ρόλο διαδραµατίζουν και οι χηµειοκίνες που ανήκουν στην οικογένεια CXC. Οι µελέτες των Strieter et al. το 2000 έδειξαν ότι οι CXC χηµειοκίνες που περιλαµβάνουν την αλληλουχία Glu Leu-Arg (ELR) που είναι παρακείµενη της πρώτης κυστεΐνης στο αµινοτελικό άκρο της πολυπεπτιδικής τους αλυσίδας, είναι πιθανοί προωθητές της αγγειογένεσης. Αυτή η οικογένεια χηµειοκινών που περιλαµβάνουν την αλληλουχία ELR συµπεριλαµβάνει την ΙL 8, τον Gro-a, τον Groβ (CXCL2), τον Gro-γ (CXCL3), τον CTAP III, την b θροµβοσφαιρίνη, και τον NAP-2, οι οποίες επάγουν τον πολλαπλασιασµό των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro και την αγγειογένεση in vivo [Belperio et al., 2000]. 177

178 Η διαδικασία της αγγειογένεσης είναι άρρηκτα συνδεδεµένη µε τον σχηµατισµό του κοκκιώδους ιστού και αποτελεί µια διεργασία που εξαρτάται από τη συνδυασµένη δράση πολλαπλών αγγειογενετικών παραγόντων που προέρχονται από µια ποικιλία κυττάρων. Παράλληλα, τα ίδια τα ενδοθηλιακά κύτταρα παράγουν και απελευθερώνουν πρωτεάσες οι οποίες αποδοµούν τις πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας προκειµένου να επιτραπεί η µετανάστευση και ο πολλαπλασιασµός των ενδοθηλιακών κυττάρων προς σχηµατισµό νέων αγγείων. Πιο συγκεκριµένα, για να µεταναστεύσουν τα ενδοθηλιακά κύτταρα έχουν την ανάγκη κολλαγενασών και του ενεργοποιητή του πλασµινογόνου προκειµένου να αποδοµήσουν τόσο το θρόµβο, όσο και τµήµα της εξωκυττάριας ουσίας. Μεταλλοπρωτεϊνάσες εξαρτώµενες από τον ψευδάργυρο πέπτουν τη βασική µεµβράνη και την εξωκυττάρια ουσία προκειµένου να λάβουν χώρα οι διαδικασίες της αγγειογένεσης. Αντιθέτως, η αγγειογένεση οφείλει να σταµατήσει όταν το έλλειµµα του δέρµατος γεµίσει µε κοκκιώδη ιστό. Όταν τα διεγερτικά ερεθίσµατα παύσουν να επιδρούν επί των ενδοθηλιακών κυττάρων, σταµατά η µετανάστευση και πολλαπλασιασµός τους. Τα διαδοχικά αυτά γεγονότα αντανακλούν τις σχετικές αλλαγές που συµβαίνουν στην ισορροπία µεταξύ αγγειογενετικών και αγγειοστατικών παραγόντων [Gillitzer et al., 2001]. Η συγκέντρωση υγρού στο σηµείο του τραυµατισµού είναι επίσης ένα πρόβληµα που πρέπει να αντιµετωπισθεί, και αυτό γίνεται µέσω της λεµφαγγειογένεσης. Η συσσώρευση αυτή προκύπτει από την τοπική εξαγγείωση από τα κατεστραµµένα αιµοφόρα αγγεία, από την αυξηµένη τριχοειδική διαπερατότητα, καθώς και από την καταστροφή κάποιων λεµφοφόρων τριχοειδών. Η διεργασία της λεµφαγγειογένεσης έχει µελετηθεί σε πολύ µικρότερο βαθµό εν σχέσει µε την αγγειογένεση, αλλά το πιθανότερο είναι πως βρίσκεται υπό τον έλεγχο µιας πληθώρας αυξητικών παραγόντων οι οποίοι είτε συµµετέχουν επίσης στη διαδικασία της αγγειογένεσης, είτε είναι µοναδικοί για αυτή [Shaw et al., 2009]. ηµιουργία κοκκιώδους ιστού Οι ινοβλάστες και τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων πολλαπλασιάζονται τις πρώτες 24 έως 72 ώρες της επούλωσης και σχηµατίζουν έναν χαρακτηριστικό ιστό, τον κοκκιώδη ιστό. Η ονοµασία του προκύπτει από την ρόδινη, µαλακή και κοκκιώδη εµφάνιση που έχει επί των επιφανειών των τραυµάτων. Το κύριο ιστολογικό του χαρακτηριστικό είναι η παρουσία πολλαπλών µικρών νέων αγγείων και ο πολλαπλασιασµός των ινοβλαστών (εικόνα 5.14). Τα καινούρια αυτά αγγεία χαρακτηρίζονται από διαρροές και αυξηµένη διαπερατότητα, γεγονός που επιτρέπει 178

179 τη δίοδο υγρού και πρωτεϊνών του πλάσµατος στον εξωαγγειακό χώρο. Κατά συνέπεια, ο νεοσυντιθέµενος κοκκιώδης ιστός είναι συχνά οιδηµατώδης [Kumar et al., 2009]. Η κατευθυνόµενη αύξηση των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων διεγείρεται όπως είδαµε από παράγωγα των αιµοπεταλίων και των ενεργοποιηµένων µακροφάγων και ινοβλαστών. Εν τέλει ο κοκκιώδης ιστός αποτελείται από έναν πυκνό πληθυσµό από αιµοφόρα αγγεία, µακροφάγα και ινοβλάστες εντός της χαλαρής εξωκυττάριας ουσίας που περιέχει ινωδονεκτίνη, υαλουρονικό οξύ και κολλαγόνο [Lorenz et al., 2008]. Ο κοκκιώδης ιστός σταδιακά γεµίζει το έλλειµµα ιστού που έχει προκύψει κατά τον τραυµατισµό. Το ποσό του κοκκιώδους ιστού που θα παραχθεί εξαρτάται από την ένταση της φλεγµονώδους αντίδρασης και από το µέγεθος του προκύπτοντος ελλείµµατος και, κατά συνέπεια, είναι πολύ µεγαλύτερο στην επούλωση σε δεύτερο σκοπό. Εντός πέντε έως επτά ηµερών ο κοκκιώδης ιστός συµπληρώνει το χάσµα της πληγής και η νεοαγγείωση είναι µέγιστη [Kumar et al., 2009]. Εικόνα Εµφάνιση κοκκιώδους ιστού εν συγκρίσει µε ώριµο, ουλώδη ιστό. (A) Κοκκιώδης ιστός µε πολυάριθµα αιµοφόρα αγγεία, οιδηµατώδη εµφάνιση και χαλαρή ECM που περιέχει διάσπαρτα φλεγµονώδη κύτταρα. Το κολλαγόνο έχει βαφτεί µπλε από την τριχρωµατική χρώση και όπως φαίνεται, ελάχιστο ώριµο κολλαγόνο είναι εµφανές σε αυτή τη φάση. B. Τριχρωµατική χρώση σε ώριµη ουλή, όπου είναι εµφανές το πυκνό ώριµο κολλαγόνο µε πολύ λιγότερα διάσπαρτα αιµοφόρα αγγεία [Kumar et al., 2009]. 179

180 Ινοπλασία Η διεργασία της ινοπλασίας επιτελείται σε δύο φάσεις: (1) µετανάστευση και πολλαπλασιασµός των ινοβλαστών στη θέση της βλάβης, και (2) εναπόθεση της ECM από τους ινοβλάστες [Kumar et al., 1997]. Η µετανάστευση των ινοβλαστών στην περιοχή της βλάβης καθοδηγείται από την ύπαρξη διαφόρων χηµειοτακτικών παραγόντων, µε κυριότερους τους TNF, PDGF, TGF-b, και FGF. Ο επακόλουθος πολλαπλασιασµός τους είναι αποτέλεσµα της επίδρασης πάνω τους µιας ποικιλίας αυξητικών παραγόντων στους οποίους συµπεριλαµβάνονται οι PDGF, EGF, TGF-b, FGF, καθώς και οι κυττοκίνες IL-1 και TNF [Kumar et al., 2009]. Στις πηγές αυτών των αυξητικών παραγόντων περιλαµβάνεται το ενεργοποιηµένο ενδοθήλιο αλλά πιθανώς µεγαλύτερης σηµασίας είναι το γεγονός ότι συµπεριλαµβάνονται επίσης διάφορα κύτταρα φλεγµονής µε κυριότερα τα µακροφάγα. Εφόσον τα κατάλληλα χηµειοτακτικά ερεθίσµατα υπάρχουν, τα λεµφοκύτταρα µπορεί επίσης να είναι παρόντα και ο αριθµός των ιστιοκυττάρων αυξάνεται. Το καθένα από αυτά µπορεί να συµβάλλει άµεσα ή έµµεσα στον πολλαπλασιασµό και την ενεργοποίηση των ινοβλαστών [Kumar et al., 1997]. Εικόνα Αυξητικοί παράγοντες και κυτταροκίνες που επηρεάζουν διάφορες φάσεις της επούλωσης του δέρµατος. HB-EGF, heparinbinding EGF [Kumar et al., 2009]. Οι ινοβλάστες λοιπόν µεταναστεύουν προς το τραύµα χρησιµοποιώντας την ινική που µόλις έχει εναποτεθεί και την ινωδονεκτίνη ως σκελετό επί του οποίου αναρριχώνται. Οι επιτόπιοι ινοβλάστες ενεργοποιούνται και αυξάνουν την πρωτεϊνική τους σύνθεση προετοιµαζόµενοι για κυτταρική διαίρεση. Ο πολλαπλασιασµός των ινοβλαστών, τους καθιστά τον κύριο κυτταρικό πληθυσµό από 180

181 την 3 η έως την 5 η ηµέρα σε καθαρό, µη επιµολυσµένο τραύµα. Μετά την κυτταρική διαίρεση και τον πολλαπλασιασµό, οι ινοβλάστες ξεκινούν τη σύνθεση και έκκριση των συστατικών της εξωκυττάριας ουσίας. To αρχικό στρώµα του τραύµατος είναι προσωρινό και αποτελείται από ινώδες, γλυκοζαµινογλυκάνες (GAG) και υαλουρονικό οξύ. Εξαιτίας της µεγάλης περιεκτικότητάς του σε νερό, το υαλουρονικό οξύ ευνοεί την κυτταρική µετανάστευση. Καθώς οι ινοβλάστες εισέρχονται και αποικίζουν την τραυµατισµένη περιοχή, χρησιµοποιούν υαλουρονιδάση προκειµένου να πέψουν την πλούσια σε υαλουρονικό οξύ εξωκυττάρια ουσία, και επακολούθως εναποτίθενται µεγαλύτερες, σουλφυλιωµένες γλυκοζαµινογλυκάνες [Lorenz et al., 2008]. Η παραγωγή και η αποδόµηση του κολλαγόνου αποτελεί ένα κριτικής σηµασίας γεγονός στην επουλωτική διαδικασία. Η πρωτεϊνική µονάδα που πολυµερίζεται για να σχηµατίσει τα ινίδια του κολλαγόνου είναι ένα επιµηκυσµένο µόριο που ονοµάζεται τροποκολλαγόνο, µε µήκος 280 nm και 1,5 nm πάχος. Το τροποκολλαγόνο (µόριο κολλαγόνου) αποτελείται από τρεις πολυπεπτιδικές αλυσίδες µε διαµόρφωση αριστερόστροφης έλικας. Οι τρεις αυτές αλυσίδες διαπλέκονται µεταξύ τους σε µια δεξιόστροφη έλικα και κρατιούνται συνδεδεµένες µε δεσµούς υδρογόνου και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις [Junqueira et al., 1989]. Στο κολλαγόνο τύπου Ι, ΙΙ και ΙΙΙ (ινώδη κολλαγόνα), τα ινίδια έχουν εγκάρσια γράµµωση µε µία χαρακτηριστική περιοδικότητα περίπου 64 nm (D-period). Κάθε D-period περιέχει 4 και ένα κλάσµα µόρια κολλαγόνου (εικόνα 5.16) [Raspanti et al., 1990]. Τα κυριότερα αµινοξέα που αποτελούν το κολλαγόνο είναι η γλυκίνη (33,5 %), η προλίνη (12 %) και η υδροξυπρολίνη (10 %). Χαρακτηριστικά, κάθε τρίτο αµινοξύ είναι γλυκίνη. Αυτό το επαναλαµβανόµενο µοτίβο είναι απαραίτητο για τη δόµηση της τριπλής έλικας. Το κολλαγόνο είναι πλούσιο σε υδροξυλυσίνη και υδροξυπρολίνη, αµινοξέα που του δίνουν τη δυνατότητα να σχηµατίσει οµοιοπολικούς διασταυρούµενους δεσµούς, µια διαδικασία που καταλύεται µε τη δραστηριότητα του ενζύµου λυσυλοξειδάση [Junqueira et al., 1989]. Εικόνα Ινίδια κολλαγόνου σε επιµήκη τοµή. Είναι εµφανής η εγκάρσια γράµµωση µε περιοδικότητα 64 nm (εικόνα ηλεκτρονικής µικροσκοπίας [Kanitakis 2002]. 181

182 Στο κολλαγόνο τύπου Ι και το κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ αυτά τα ινίδια ενώνονται για να σχηµατίσουν ίνες. Στο κολλαγόνο τύπου Ι οι ίνες στη συνέχεια µπορούν να ενωθούν για να σχηµατίσουν δεσµίδες [Junqueira et al., 1989]. Τα ινίδια κολλαγόνου αρχικά τοποθετούνται στα όρια του τραύµατος, είναι όµως τοποθετηµένα καθέτως της επιφάνειας του δέρµατος και δεν γεφυρώνουν το τραύµα. Στα πρώτα στάδια της ινοπλασίας σχηµατίζεται κατά κύριο λόγο κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ αλλά κατά την πορεία της επούλωσης αυτό αντικαθίσταται σε µεγάλο βαθµό από κολλαγόνο τύπου Ι. Ο κυριότερος παράγοντας που προκαλεί την ινοπλασία είναι ο TGF-b ο οποίος παράγεται από τα περισσότερα κύτταρα του κοκκιώδους ιστού και ο οποίος εκτός από µετανάστευση, πολλαπλασιασµό και έκκριση κολλαγόνου από τους ινοβλάστες, προκαλεί επίσης µειωµένη αποδόµηση της ECM από τις µεταλλοπρωτεϊνάσες [Kumar et al., 2009]. Εικόνα Τύποι κολλαγόνου που ανευρίσκονται στον ανθρώπινο οργανισµό [Kumar et al., 2009]. Επιθηλιοποίηση Εντός των πρώτων ωρών από τον τραυµατισµό, είναι εµφανείς οι µορφολογικές διαφορές στα κερατινοκύτταρα στο χείλος του τραύµατος. Παράλληλα, η επιδερµίδα σε αυτό το σηµείο γίνεται παχύτερη λόγω του πολλαπλασιασµού των επιθηλιακών κυττάρων και τα κύτταρα της βασικής στιβάδας αυξάνουν σε µέγεθος και αρχίζουν να µετακινούνται πάνω στην τραυµατική επιφάνεια ακριβώς κάτω από την εσχάρα του τραύµατος (εικόνα 5.18) [Lorenz et al., 2008]. Κατά την πορεία τους αυτή εναποθέτουν συστατικά της βασικής µεµβράνης. Όταν σταµατήσει η µετακίνησή τους, έχει σχηµατισθεί µια λεπτή συνεχής επιθηλιακή στιβάδα η οποία καλύπτει την επιφάνεια της πληγής. Ταυτόχρονα µε την επανεπιθηλιοποίηση, τα ινίδια 182

183 κολλαγόνου λαµβάνουν οριζόντια θέση και γεφυρώνουν το τραύµα. Η πλήρης επανεπιθηλιοποίηση της επιφάνειας του τραύµατος είναι πολύ πιο χρονοβόρα στην περίπτωση της επούλωσης σε δεύτερο σκοπό, διότι το κενό που πρέπει να γεφυρωθεί είναι πολύ µεγαλύτερο [Kumar et al., 2009]. Κατά τη διάρκεια της µετακίνησής τους, αυτά τα επιθηλιακά κύτταρα δεν διαιρούνται έως ότου αποκατασταθεί η συνέχεια της επιδερµίδας. Περισσότερα επιθηλιακά κύτταρα παρέχονται αποκλειστικά από τις διαιρέσεις που λαµβάνουν χώρα στη βασική στιβάδα κοντά στα χείλη του τραύµατος. Τα θυγατρικά κύτταρα γίνονται πιο επίπεδα και επιµήκη. Κάποιες γλυκοπρωτεΐνες που χρησιµεύουν ως µόρια προσκόλλησης για αυτά τα κύτταρα, όπως η τενασίνη και η ινωδονεκτίνη, αποτελούν τις «σιδηροδροµικές ράγες» που διευκολύνουν τη µετακίνηση των κερατινοκυττάρων πάνω στο έδαφος της πληγής [Lorenz et al., 2008]. Εικόνα Τοµή τραύµατος δέρµατος όπου είναι εµφανής η µετακίνηση των κερατινοκυττάρων (βέλος) ακριβώς κάτω από τον θρόµβο (C) [Martin 1997]. Κατά τη διάρκεια της επανεπιθηλιοποίησης τα µακροφάγα διεγείρουν τους ινοβλάστες προς παραγωγή του FGF-7 (keratinocyte growth factor) και της IL-6, καθώς αυτά τα µόρια ενισχύουν τόσο τη µετανάστευση όσο και τον πολλαπλασιασµό των κερατινοκυττάρων. Άλλοι διαµεσολαβητές της επανεπιθηλιοποίησης είναι οι HGF και HB-EGF. Η σηµατοδότηση µέσω του υποδοχέα χηµειοκινών CXCR3 ενισχύει επίσης τη διαδικασία της επανεπιθηλιοποίησης [Werner et al., 2003]. Μετά την επανεγκαθίδρυση της επιθηλιακής στιβάδας, τα κερατινοκύτταρα και οι ινοβλάστες εκκρίνουν λαµινίνη και κολλαγόνο τύπου IV προκειµένου να σχηµατιστεί η βασική µεµβράνη. Τα κερατινοκύτταρα τότε διαιρούνται καθώς εγκαθίσταται πάλι η φυσιολογική στιβαδοποίηση της επιδερµίδας, δηµιουργούνται πάλι δεσµοί µέσω των δεσµοσωµάτων και ηµιδεσµοσωµάτων, και σχηµατίζεται έτσι πάλι ένας φραγµός απέναντι σε περαιτέρω επιµόλυνση και απώλεια υγρασίας [Lorenz et al., 2008]. Εν 183

184 τέλει η επιδερµίδα ανακτά το φυσιολογικό της πάχος, αρχιτεκτονική και επιφανειακή κερατινοποίηση [Kumar et al., 2009]. Εικόνα Πολλαπλασιασµός και µετανάστευση των κερατινοκυττάρων κατά την επούλωση. Ακολούθως του τραυµατισµού, τα κερατινοκύτταρα ενεργοποιούνται (ροζ χρώµα) από διάφορες προφλεγµονώδεις κυτταροκίνες και αυξητικούς παράγοντες. Ως ανταπόκριση, εκκρίνουν και τα ίδια µια ποικιλία µορίων ενώ ταυτόχρονα τα κύτταρα της βασικής στιβάδας αρχίζουν να πολλαπλασιάζονται και να µεταναστεύουν. Τα κόκκινα τρίγωνα αντιπροσωπεύουν το σηµείο της µη αναστρέψιµης δέσµευσης των κερατινοκυττάρων προς διαφοροποίηση µετά το οποίο αδυνατούν να συµµετάσχουν στη διαδικασία της επούλωσης [Morasso et al., 2005]. Η αναγεννώµενη επιδερµίδα επίσης χρησιµοποιεί τα stem κύτταρα που βρίσκονται είτε εντός της επιδερµίδας, είτε εντός της bulge περιοχής των τριχοθυλακίων (εικόνα 5.20) [Fuchs 2008]. Ως αντίδραση στον τραυµατισµό, τα bulge stem κύτταρα δεσµεύονται προς απόκτηση ενός επιδερµικού φαινοτύπου και στη συνέχεια µεταναστεύουν προκειµένου να συµµετάσχουν στη διαδικασία της επούλωσης [Ito et al., 2005]. Εικόνα Επανεπιθηλιοποίηση µε τη βοήθεια των τριχοθυλακίων. Στα όρια του θρόµβου που έχει διηθηθεί από κύτταρα φλεγµονής και ινοβλάστες, ξεκινά η δηµιουργία µιας νέας στιβάδας 184

185 επιδερµίδας από τα χείλη του τραύµατος και από τα εναποµείναντα τµήµατα των τριχοθυλακίων [Martin 1997]. ΣΥΣΤΟΛΗ ΤΗΣ ΟΥΛΗΣ Οι ανοικτές πληγές χαρακτηρίζονται από συστολή, ένα φαινόµενο που δεν παρατηρείται στις κλειστές χειρουργικές τοµές. Λέγοντας συστολή, εννοούµε µια διεργασία που ξεκινά σχεδόν ταυτόχρονα µε τη σύνθεση κολλαγόνου και κατά την οποία το περιβάλλον ένα τραύµα δέρµα έλκεται κυκλοτερώς προς το κέντρο της πληγής. Η συστολή διευκολύνει τη σύγκλειση του τραύµατος, καθώς καταλήγει σε µείωση του µεγέθους του χάσµατος χωρίς το σχηµατισµό νέου ιστού. Ως συνέπεια, η επιδιόρθωση είναι πολύ πιο ταχεία παρ ότι αν λάµβανε χώρα µόνο η επιθηλιοποίηση. Επιπλέον, η έκταση της περιοχής της στερούµενης αισθητικότητα ουλής είναι πολύ µικρότερη [Lorenz et al., 2008]. Η συστολή σε γενικές γραµµές λαµβάνει χώρα σε µεγάλες τραυµατικές επιφάνειες. Κατά συνέπεια είναι ένα σηµαντικό χαρακτηριστικό των πληγών που επουλώνονται σε δεύτερο σκοπό. Τα αρχικά βήµατα της συστολής συµπεριλαµβάνουν το σχηµατισµό στο χείλος της πληγής ενός δικτύου από µυοϊνοβλάστες που εκφράζουν a-smooth muscle ακτίνη και βιµεντίνη. Τα κύτταρα αυτά έχουν χαρακτηριστικά της δοµής των λείων µυϊκών κυττάρων και έχουν τη δυνατότητα να παράγουν µεγάλες ποσότητες από πολλά συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας όπως κολλαγόνο τύπου Ι, τενασίνη-c, SPARC και ινωδονεκτίνη [Darby et al., 2007]. Μυοϊνοβλάστες Είναι γενικώς αποδεκτό ότι οι µυοϊνοβλάστες αποτελούν κύτταρα µε ρόλο κλειδί τόσο στη φυσιολογική αναδόµηση του συνδετικού ιστού µετά από τραυµατισµό, όσο και στη δηµιουργία των παθολογικών παραµορφώσεων που χαρακτηρίζουν την ίνωση. Το κύτταρο αυτό αρχικά αναγνωρίστηκε µε τη βοήθεια της ηλεκτρονικής µικροσκοπίας (εικόνα 5.21)σε κοκκιώδη ιστό τραυµάτων που είχαν εισέλθει στη διαδικασία επούλωσης ως τροποποιηµένη ινοβλάστη η οποία επεδείκνυε και ιδιότητες λείου µυϊκού κυττάρου (SMC), όπως δεσµίδες µικροϊνιδίων [Gabbiani 2004]. 185

186 Ο όρος µυοϊνοβλάστες πρωτοεισήχθη από τους Majno et al. το 1971 για κύτταρα τα οποία βρέθηκαν σε πειραµατικό µοντέλο επούλωσης τραύµατος. Αυτά τα κύτταρα είχαν το εµφανές αδρό ενδοπλασµατικό δίκτυο (rer) των ινοβλαστών και τα συσταλτικά µικροϊνίδια ενός λείου µυϊκού κυττάρου (αν και σε αυτή την περίπτωση ήταν λίγα, και τοποθετηµένα κάτω από την κυτταρική µεµβράνη) όπως φαίνεται στην παρακάτω εικόνα. Κατά τη δεκαετία του 1980, οπότε και η µέθοδος της ανοσοϊστοχηµείας γνώρισε µεγάλη εξέλιξη, οι µυοϊνοβλάστες βρέθηκε να εκφράζουν την πρωτεΐνη α-sma (a smooth muscle actin), ενώ εξέφραζαν επίσης ορισµένες φορές δεσµίνη. Έτσι, ένας ορισµός βασισµένος στην ανοσοϊστοχηµεία θεωρήθηκε πιο ολοκληρωµένος, και κατά συνέπεια ο όρος ατρακτοειδές κύτταρο που εκφράζει α-sma εξακολουθεί να είναι ένας από τους πλέον δηµοφιλείς [Eyden 2008]. Εικόνα A: Μυοϊνοβλάστες από στρώµα καρκινώµατος εκ πλακώδους επιθηλίου. Είναι εµφανές το άφθονο αδρό ενδοπλασµατικό δίκτυο (rer), τα περιφερικά µυοϊνίδια (m) και ένα εξωκυττάριο ινίδιο ινωδονεκτίνης στο fibronexus (FNX). Ας σηµειωθεί ότι το ινίδιο ινωδονεκτίνης είναι πυκνής υφής και ευθύγραµµο, και προβάλλει από την κυτταρική επιφάνεια προς την εξωκυττάρια ουσία. Το βέλος µε τον αστερίσκο υποδεικνύει µια εστιακή περιοχή ινωδονεκτίνης παρακείµενη στην κυτταρική επιφάνεια [Eyden 2008]. Η παρουσία των µυοϊνοβλαστών έχει περιγραφεί επιτυχώς πρακτικά σε όλες τις ινωτικές καταστάσεις που χαρακτηρίζονται από συστολή και αναδιαµόρφωση του ιστού. Οι εργασίες πολλαπλών ερευνητικών οµάδων έχουν συµβάλλει στον καθορισµό µορφολογικών κριτηρίων για αυτό το κύτταρο, στο να αποδοθεί η ικανότητα συστολής που διαθέτει στα συσταλτικά ινίδια που το χαρακτηρίζουν, καθώς και στο να δειχθεί ότι στα συσταλτικά αυτά ινίδια εκφράζονται πρωτεΐνες χαρακτηριστικές των λείων µυϊκών κυττάρων, ειδικά των αγγειακών λείων µυϊκών κυττάρων, µια εκ των οποίων είναι και η α-sm ακτίνη. Οι µυοϊνοβλάστες, αναλόγως της πειραµατικής ή κλινικής κατάστασης µπορεί να εκφράζουν και άλλες 186

187 συσταλτικές πρωτεΐνες των λείων µυϊκών κυττάρων όπως είναι οι βαριές αλυσίδες της µυοσίνης των λείων µυϊκών κυττάρων ή η δεσµίνη (εικόνα 5.22), παρ όλ αυτά όµως, η παρουσία της α-sma αποτελεί τον πιο αξιόπιστο δείκτη του µυοϊνοβλαστικού φαινοτύπου [Gabbiani 2004]. Εικόνα Χαρακτηριστικά των αντιδραστικών µυοϊνοβλαστών που έχουν αποµονωθεί από το στρώµα καρκινώµατος εκ πλακώδους επιθηλίου [Eyden 2008]. Προέλευση Υπάρχει µια πλειάδα θεωριών σχετικά µε την προέλευση των µυοϊνοβλαστών. Σύµφωνα µε την κλασσική θεωρία για την επούλωση των τραυµάτων του δέρµατος, υπάρχει επιστράτευση των ινοβλαστών από το χόριο του άθικτου δέρµατος που βρίσκεται παρακείµενο στη θέση τραυµατισµού και φλεγµονής [Desmouliere et al., 2005]. Περικύτταρα και λεία µυϊκά κύτταρα προερχόµενα από το επιτόπιο αγγειακό δίκτυο έχουν επίσης προταθεί ως «πηγές» µυοϊνοβλαστών τόσο σε δερµατικές παθήσεις όπως το σκληρόδερµα, όσο και στην ηπατική και τη νεφρική ίνωση [Desmouliere et al., 2003]. Μία ακόµα θεωρία υποστηρίζει πως ενδεχοµένως προέρχονται από τα ινοκύτταρα, έναν υποπληθυσµό λευκοκυττάρων προερχόµενων από τον µυελό των οστών, τα οποία διαθέτουν κάποια χαρακτηριστικά όµοια µε των 187

188 ινοβλαστών (εικόνα 5.23) [Hinz 2007]. Τα ινοκύτταρα όπως θα δούµε και παρακάτω, εκφράζουν τόσο αντιγόνα των αιµοποιητικών stem κυττάρων, όσο και δείκτες της µονοκυτταρικής σειράς καθώς και παράγωγα των ινοβλαστών. Σε in vitro διέγερσή τους µε προ-ινωτικές κυτταροκίνες και µε αυξητικούς παράγοντες παράγουν συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας και διαφοροποιούνται περαιτέρω σε ικανούς για συστολή µυοϊνοβλάστες. Εκτός αυτού ινοκύτταρα που παράγουν κολλαγόνο ή αποκτούν δείκτες µυοϊνοβλαστών έχουν αποµονωθεί σε εστίες που βρίσκονται σε διαδικασία φυσιολογικής ή όχι επούλωσης, όπως είναι οι υπερτροφικές ουλές και τα χηλοειδή [Bellini et al., 2007]. Αυτή η θεωρία πρόσφατα αναθεωρήθηκε µέσω της µεταµόσχευσης µυελού των οστών από αρσενικό σε θηλυκό ποντίκι που είχε προηγουµένως ακτινοβοληθεί, αναγνωρίζοντας κατόπιν το Υ χρωµόσωµα µέσω in situ υβριδισµού (Direkze et al., 2003] και, µετέπειτα, µεταµοσχεύοντας µυελό των οστών από διαγονιδιακά ποντίκια που εξέφραζαν πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη, σε ακτινοβοληµένα ποντίκια που δεν έφεραν αυτή τη µετάλλαξη [Hinz 2007]. Αυτές οι µελέτες αποκάλυψαν ότι ένα εντυπωσιακά υψηλό ποσοστό ύψους % των µυοϊνοβλαστών στην περιοχή του τραυµατισµού πιθανώς προέρχονταν από τα ινοκύτταρα [Direkze et al., 2003]. Ανάλογα ποσοστά έχουν προκύψει όσον αφορά µυοϊνοβλάστες που ενέχονται στην ίνωση του ήπατος, των νεφρών, και του πνεύµονος, καθώς και κατά τη διάρκεια της αντίδρασης στρώµατος σε επιθηλιακούς καρκίνους [Direkze et al., 2003, Ishii et al., 2003]. Παραµένει να διαπιστωθεί κατά πόσον µυοϊνοβλάστες διαφορετικής προέλευσης επιδεικνύουν διαφορετικά χαρακτηριστικά και λειτουργίες κατά την επούλωση του δέρµατος όπως έχει προταθεί για την ηπατική ίνωση ή εάν ο οργανισµός επιστρατεύει προγονικά των µυοϊνοβλαστών κύτταρα από διάφορες πηγές προκειµένου να ικανοποιήσει την ανάγκη παρουσίας συσταλτικών κυττάρων τα οποία όλα έχουν ακολουθήσει παρόµοιο πρόγραµµα διαφοροποίησης [Hinz 2007]. 188

189 Εικόνα Ένα κύτταρο, πολλαπλές προελεύσεις. Οι διαφοροποιηµένοι µυοϊνοβλάστες χαρακτηρίζονται από την αυξηµένη παραγωγή των πρωτεϊνών της ECM και από την ανάπτυξη των α- SMA-θετικών συσταλτικών ινιδίων που συνδέονται µε την ECM στις περιοχές των υπερώριµων FAs και στα σηµεία σύνδεσης µεταξύ των κυττάρων. Τα κυριότερα προγονικά κύτταρα για τους µυοϊνοβλάστες κατά τη διάρκεια ενός τραυµατισµού φαίνεται πως είναι οι αυτόχθονοι ινοβλάστες, που παροδικά διαφοροποιούνται προς πρωτο-µυοϊνοβλάστες, κύτταρα στα οποία δεν παρατηρείται ακόµα η έκφραση της α-sma. Στο ήπαρ, οι µυοϊνοβλάστες επιπρόσθετα προέρχονται από τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα (HSCs) που εισέρχονται σε πρόγραµµα ενεργοποίησης καθώς και από επιθηλιακά κύτταρα που υφίστανται επιθηλιακή προς µεσεγχυµατική µετατροπή (EMT). Στον πνεύµονα η ενδοθηλιακή προς µεσεγχυµατική µετατροπή µπορεί να παρέχει έναν ακόµα µηχανισµό δηµιουργίας µυοϊνοβλαστών. Κατά το σχηµατισµό των αθηρωµατικών πλακών φαίνεται πως η κύρια πηγή µυοϊνοβλαστών είναι αποδιαφοροποιηµένα λεία µυϊκά κύτταρα (δηλαδή λεία µυϊκά κύτταρα που χάνουν κάποιους από τους δείκτες που χαρακτηρίζουν τα τελικά στάδια διαφοροποίησης) [Hinz et al., 2007]. 189

190 Πρωτο - µυοϊνοβλάστες Η διαφοροποίηση των ινοβλαστών προς µυοϊνοβλάστες µπορεί να γίνει αντιληπτή ως µία διαδικασία αποτελούµενη από δύο βήµατα. Αρχικά, προκειµένου να αποικήσουν εκ νέου τον τραυµατισµένο ιστό, οι ινοβλάστες αποκτούν µεταναστευτικό φαινότυπο µέσω de novo ανάπτυξης συσταλτικών ινιδίων. Αυτά τα ινίδια αποτελούνται αρχικά από κυτταροπλασµατική ακτίνη και είναι ικανά να παράγουν σχετικά µικρές δυνάµεις έλξης [Hinz et al., 2001a]. Έχει προταθεί ο όρος «πρωτο µυοϊνοβλάστες» προκειµένου να καταστεί δυνατό να διακριθούν αυτοί οι ενεργοποιηµένοι ινοβλάστες από τους σχετικά αδρανείς ινοβλάστες που στερούνται δυνατοτήτων συστολής και που αποικίζουν τους άθικτους ιστούς. [Tomasek et al., 2002]. Επί του παρόντος, είναι αποδεκτό το γεγονός ότι η µετατροπή των ινοβλαστών προς µυοϊνοβλάστες µέσω των πρωτο-µυοϊνοβλαστών είναι ενδιάµεσο στάδιο κατά το οποίο τα κύτταρα αυτά των οποίων τα ινίδια περιέχουν µόνο β- και γ- κυτταροπλασµατικές ακτίνες συνήθως εξελίσσονται χωρίς όµως κάτι τέτοιο να είναι απαραίτητο- προς διαφοροποιηµένους µυοϊνοβλάστες που εκφράζουν την α-smα [Gabbiani 2004]. Αυτή η πρώτη αλλαγή του φαινοτύπου συµβαίνει ως απάντηση σε αλλαγές της σύνθεσης, της οργάνωσης και των µηχανικών ιδιοτήτων της εξωκυττάριας ουσίας (ECM), καθώς και σε κυτταροκίνες που απελευθερώνονται τοπικά τόσο από φλεγµονώδη όσο και από αυτόχθονα κύτταρα [Hinz 2007]. Τα συσταλτικά ινίδια συνδέονται µε ινώδεις πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας σε περιοχές σύνδεσης των κυττάρων µε την εξωκυττάρια ουσία που περιέχουν ιντεγκρίνη και σε περιοχές διακυτταρικής σύνδεσης µέσω de novo δηµιουργίας εστιακών συνάψεων που περιέχουν N-καντχερίνη. Αυτά τα χαρακτηριστικά οµοιάζουν µε τα χαρακτηριστικά ινοβλαστών σε καλλιέργειες που έχουν όπου τεχνικά έχει δηµιουργηθεί µηχανική τάση. Τα συσταλτικά ινίδια δεν σχηµατίζονται σε υδαρή υλικά καλλιέργειας ή σε γέλη όπου η µηχανική τάση είναι µηδενική όπως φαίνεται στην παρακάτω εικόνα [Hinz et al., 2007]. 190

191 Εικόνα Η τάση που επικρατεί στην ECM ελέγχει την ανάπτυξη του φαινοτύπου των µυοϊνοβλαστών σε τρισδιάστατη γέλη κολλαγόνου. ιαφοροποιηµένοι µυοϊνοβλάστες καλλιεργήθηκαν σε γέλη κολλαγόνου µε µικρή (A, B) και µεγάλη τάση και πυκνότητα (C, D). Τα κύτταρα χρώσθηκαν ανοσοϊστοχηµικά µετά από 36 ώρες για α-sma (A, C: κόκκινο, B, D: µπλε), β-κυτταροπλασµατική ακτίνη (A, C: πράσινο, B, D: κόκκινο), βινκουλίνη (βρίσκεται στις συνάψεις προσκόλλησης) (B, D: πράσινο), και πυρήνες (A, C: µπλε). Αυτό που παρατηρείται είναι πως τα κύτταρα στις «µαλακές» γέλες αποκτούν µια δενδριτική µορφολογία µε περιφερειακή διάταξη της ακτίνης και µικρά ακιδωτά σηµεία προσκόλλησης, ενώ η α-sma δεν είναι οργανωµένη σε ινίδια (A, µικρό εικονίδιο). Στις γέλες µε µεγάλη πυκνότητα κολλαγόνου, οι µυοϊνοβλάστες αναπτύσσουν α-sma-θετικά ινίδια (C, µικρό εικονίδιο) που καταλήγουν σε υπερώριµες εστιακές συνάψεις (FAs - focal adhesions) [Hinz et al., 2007]. Κατά το δεύτερο βήµα, η αυξηµένη τάση που υπάρχει στην εξωκυττάρια ουσία και η οποία προκαλείται από τη δική τους δράση, γίνεται αισθητή από τους πρωτο µυοϊνοβλάστες, που µε αυτό τον τρόπο διεγείρονται και διαφοροποιούνται στην τελική µορφή τους, τους µυοϊνοβλάστες. Η διαφοροποίηση των πρωτο- µυοϊνοβλαστών σε µυοϊνοβλάστες σηµατοδοτείται από την de novo έκφραση της a- SMA η οποία αποτελεί τον πλέον ευρέως χρησιµοποιούµενο δείκτη των µυοϊνοβλαστών. Η έκφραση της a-sma ελέγχεται µε ακρίβεια από την ενορχηστρωµένη δράση αυξητικών παραγόντων όπως ο TGFb1, εξειδικευµένων πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας όπως είναι η ινωδονεκτίνη (fibronectin FN), και από τις µηχανικές ιδιότητες του µικροπεριβάλλοντος (εικόνα 5.25) [Tomasek et al.,2002]. Η ενσωµάτωση της a-sma στα συσταλτικά ινίδια ενισχύει σηµαντικά το συσταλτικό δυναµικό του κυττάρου και σηµατοδοτεί την έναρξη της φάσεως συστολής της ουλής [Hinz et al., 2001b]. Η έκφραση της a-sma προσφέρει στους µυοϊνοβλάστες τουλάχιστον δύο φορές µεγαλύτερη ικανότητα συστολής εν σχέσει µε ινοβλάστες σε καλλιέργειες που δεν εκφράζουν την a-sma. Ο µηχανισµός µε τον οποίον η a-sma 191

192 δηµιουργεί µεγαλύτερες δυνάµεις συστολής αναλογικά µε άλλες ισοµορφές ακτίνης παραµένει σχετικά ασαφής. Φαίνεται µολαταύτα πως η αλληλουχία AcEEED του αµινοτελικού άκρου της a-sma διαδραµατίζει ρόλο κλειδί σε αυτόν το µηχανισµό [Hinz et a al., 2007]. Ένα ακόµα σηµαντικό σηµείο είναι ότι η ισοµετρική τάση που παράγεται από τους µυοϊνοβλάστες ρυθµίζεται µε διαφορετικό τρόπο απ ότι η αναστρέψιµη συστολή που παράγεται από τα λεία µυϊκά κύτταρα. Ενώ η συστολή των λείων µυϊκών κυττάρων είναι Ca ++ εξαρτώµενη και είναι αναστρέψιµη, η παραγωγή τάσης από τους µυοϊνοβλάστες είναι µη αναστρέψιµη και ρυθµίζεται από µια διαµεσολαβούµενη από την Rho/Rho κινάση (ROCK) αναστολή της φωσφατάσης της µυοσίνης [Gabbiani 2004]. Εικόνα Μοντέλο της διαφοροποίησης των ινοβλαστών σε µυοϊνοβλάστες σε δύο στάδια. In vivo, οι ινοβλάστες µπορεί να περιέχουν ακτίνη στο κυτταρόπλασµά τους, όµως δεν διαθέτουν συσταλτικά ινίδια ούτε σχηµατίζουν συµπλέγµατα προσκόλλησης µε την εξωκυττάρια ουσία. Κάτω από την επίδραση µηχανικού stress, οι ινοβλάστες διαφοροποιούνται προς πρωτο µυοϊνοβλάστες, οι οποίοι διαθέτουν συσταλτικά ινίδια που περιέχουν κυτταροπλασµατική ακτίνη και τα οποία καταλήγουν στα fibronexus συµπλέγµατα προσκόλλησης. Οι πρωτο µυοϊνοβλάστες επίσης εκφράζουν και οργανώνουν ινωδονεκτίνη (συµπεριλαµβανοµένης και της ED-A ινωδονεκτίνης) στην κυτταρική τους επιφάνεια. Λειτουργικά, τα κύτταρα αυτά δύνανται να παράγουν δυνάµεις συστολής. Ο παράγοντας TGF-β1 επάγει την αύξηση της έκφρασης της ED-A ινωδονεκτίνης. Τόσο ο TGF-β1, όσο και η ED-A ινωδονεκτίνη επί παρουσίας µηχανικού stress, επάγουν τη µετατροπή των πρωτο µυοϊνοβλαστών σε πλήρως διαφοροποιηµένους µυοϊνοβλάστες που χαρακτηρίζονται από τη de novo έκφραση της α-smooth muscle ακτίνης στα συσταλτικά τους ινίδια που εδώ έχουν αναπτυχθεί πιο 192

193 εκτεταµένα, καθώς και από µεγάλα fibronexus συµπλέγµατα προσκόλλησης (in vivo) ή υπερώριµες εστιακές συνάψεις (in vitro) όπως θα δούµε και παρακάτω. Λειτουργικά, οι διαφοροποιηµένοι µυοϊνοβλάστες παράγουν µεγαλύτερες δυνάµεις συστολής εν σχέσει µε τους πρωτο µυοϊνοβλάστες, γεγονός που αντανακλάται από το υψηλότερο επίπεδο οργάνωσης της εξωκυττάριας ινωδονεκτίνης σε ινίδια [Tomasek et al., 2002]. Ένα ακόµα χαρακτηριστικό των µυοϊνοβλαστών είναι ότι, όπως και τα λεία µυϊκά κύτταρα, συνδέονται άµεσα µεταξύ τους µέσω των χασµατικών συνάψεων (gap junctions). Η ύπαρξη λειτουργικών gap junctions έχει αναγνωριστεί µορφολογικά µεταξύ µυοϊνοβλαστών σε τραύµατα του δέρµατος, καθώς και σε µυοϊνοβλάστες που προέρχονται από ινοβλάστες κερατοειδούς. Το γεγονός αυτό επισηµαίνει την πιθανότητα δηµιουργίας πολυκύτταρων συσταλτικών µονάδων εκ µέρους των µυοϊνοβλαστών κατά τη διάρκεια της συστολής της ουλής [Tomasek et al.,2002]. Η ύπαρξη διαύλων στις χασµατικές συνάψεις υπονοεί τη δυνατότητα επικοινωνίας µεταξύ των γειτονικών µυοϊνοβλαστών [Tomasek et al.,2002, Desmouliere et al., 2003]. Είναι γενικά αποδεκτό πως, προκειµένου να αντιληφθούν τα σήµατα από την ECM που χαρακτηρίζουν το µηχανικό stress, οι ινοβλάστες χρησιµοποιούν συνάψεις που περιέχουν ιντεγκρίνη, χρησιµοποιούν δηλαδή τα ίδια διαµεµβρανικά οργανίδια που αγκυροβολούν τα συσταλτικά ινίδια στο υπόστρωµα [Chen et al., 2004]. Η ανάλυση της δοµής των µυοϊνοβλαστών σε ινώδη καθώς και κοκκιώδη ιστό τραύµατος έχει αποκαλύψει εκτεταµένες συνδέσεις µεταξύ των κυττάρων και της εξωκυττάριας ουσίας, που ονοµάζονται fibronexus και απουσιάζουν από τους ινοβλάστες στο φυσιολογικό συνδετικό ιστό [Eyden 2005]. Αναλογικά, οι µυοϊνοβλάστες σε καλλιέργεια αναπτύσσουν εξειδικευµένες συνάψεις (focal adhesions-fas) που καλούνται υπερώριµα FAs και συµβάλλουν στη σηµαντικά πιο επιµήκη µορφή τους (8 30 µm) εν σχέσει µε τα κλασσικά FAs (2 6 µm) των αρνητικών για a-sma ινοβλαστών (εικόνα 5.26) [Dugina et al., 2001]. Επιπροσθέτως, τα υπερώριµα FAs επιδεικνύουν µια ειδική µοριακή σύνθεση µέσω έκφρασης υψηλών επιπέδων βινκουλίνης, παξιλλίνης, τενσίνης και ιντεγκρινών avb3 and a5b1 [Dugina et al., 2001, Hinz et al., 2003b]. 193

194 Εικόνα Το µέγεθος των FAs ελέγχει την οργάνωση της a - SMA σε συσταλτικά ινίδια. (a) 1 Χ 1.25 µm, (b) 4 Χ 1.25 µm, και (c) 10 Χ 1.25 µm. Τα συσταλτικά ινίδια σχηµατίζονται και στις τρεις περιπτώσεις, ωστόσο η a-sma ενσωµατώνεται στα προϋπάρχοντα ινίδια β κυτταροπλασµατικής ακτίνης και παίρνει οργανωµένη µορφή µόνον εφόσον οι συνάψεις ξεπεράσουν το µέγεθος των κλασσικών FAs ( 6 µm) ή επιδείξουν χαρακτηριστικά των υπερώριµων FAs (>8 µm). Ακτίνη (πράσινο), a-sma (µπλε) [Hinz 2007]. Όλα αυτά τα δεδοµένα υπονοούν ότι ο σχηµατισµός των υπερώριµων FAs αναπαριστά ένα κριτικό σηµείο ελέγχου στην αντίληψη του εξωκυττάριου stress και της διακυτταρικής τάσης που ρυθµίζει τη διαφοροποίηση των µυοϊνοβλαστών. Στη φυσιολογική ιστική επούλωση αυτό το σηµείο ελέγχου εξασφαλίζει ότι η αυξηµένη συστολή των µυοϊνοβλαστών θα συµβεί µόνο όταν ο ιστός έχει πλήρως εισέλθει σε φάση αναδιαµόρφωσης από τους πρωτο-µυοϊνοβλάστες. Είναι δύσκολο παρ όλ αυτά να διευκρινιστεί κατά πόσον το αρχικό γεγονός είναι η προκαλούµενη από την a- SMA τάση ή η δηµιουργία των υπερώριµων FAs [Hinz 2007]. Μηχανισµός διαφοροποίησης Τουλάχιστον τρία διαφορετικά τοπικά γεγονότα πρέπει να συµβούν για τη δηµιουργία θετικών για a-sma διαφοροποιηµένων µυοϊνοβλαστών: (1) συγκέντρωση βιολογικά ενεργού TGFb1, (2) η παρουσία εξειδικευµένων πρωτεϊνών της ECM όπως η ED-A ινωδονεκτίνη, και (3) υψηλό εξωκυττάριο stress, που προκύπτει από τις µηχανικές ιδιότητες της εξωκυττάριας ουσίας καθώς και από την διαδικασία της αναδιαµόρφωσης από τα κύτταρα. Η αντίληψη του µηχανικού stress, 194

195 όπως είδαµε, διαµεσολαβείται από εξειδικευµένες συνάψεις που δηµιουργούνται µεταξύ του κυττάρου και της εξωκυττάριας ουσίας που καλούνται fibronexus in vivo και υπερώριµες focal adhesions (FAs) in vitro. Ανάλογα, µικρές διακυτταρικές συνάψεις που περιέχουν N-καντχερίνη εξελίσσονται προς µεγαλύτερες συνάψεις που περιέχουν OB-καντχερίνη (καντχερίνη-11), κατά τη δηµιουργία των διαφοροποιηµένων µυοϊνοβλαστών τόσο in vitro όσο και in vivo [Hinz et a al., 2007]. Το µονοπάτι µέσω του οποίου ο TGFb1 προάγει και ρυθµίζει την έκφραση της a- SMA στους ινοβλάστες περιλαµβάνει τη Smad σηµατοδότηση (εικόνα 5.27). Η πρόσδεση του TGFb1 στον TGFb υποδοχέα τύπου ΙΙ οδηγεί στη φωσφορυλίωση και επιστράτευση του TGFb υποδοχέα τύπου Ι ο οποίος µε τη σειρά του προσδένεται στο σύµπλοκο. Μέσω της δραστικότητας κινάσης σερίνης/θρεονίνης του ενεργοποιηµένου πλέον συµπλόκου, φωσφορυλιώνονται οι πρωτεΐνες Smad2 και Smad3, η κάθε µία τους συνδέεται µε την Smad4 και µετακινούνται προς τον πυρήνα όπου ευοδώνουν την γονιδιακή µεταγραφή µέσω συνεργασίας τους µε άλλους µεταγραφικούς παράγοντες [Hinz 2007]. Εναλλακτικά, ο TGFb1 είναι ικανός να ρυθµίσει τη γονιδιακή έκφραση των ινοβλαστών ανεξάρτητα από τη Smad σηµατοδότηση. Η έκφραση της a-sma έχει τεκµηριωθεί κατά τη διάρκεια ενεργοποίησης Smad3-null ηπατικών αστεροειδών κυττάρων σε καλλιέργεια και λειτουργεί µέσω της πρόσδεσης των πρωτεϊνών Sp1/2, που είναι µέλη της οικογένειας των kruppel - like παραγόντων σε ειδικές αλληλουχίες του πυρήνα του µυοϊνοβλάστη [Hinz 2007, Schnabl et al., 2001]. Ένα πολύ σηµαντικό ερώτηµα παραµένει τελικά το πώς οι µυοϊνοβλάστες αντιλαµβάνονται τη σταδιακά αυξανόµενη τάση στην εξωκυττάρια ουσία που συνοδεύει την αναδιαµόρφωση της ουλής. Τρεις µηχανισµοί διακρίνονται ως πιθανότεροι: (1) ύπαρξη µηχανοευαίσθητων ιοντικών διαύλων στην κυτταροπλασµατική µεµβράνη, (2) διαµεσολαβούµενη από την ιντεγκρίνη αντίληψη του stress και, (3) γεωµετρικές αλλαγές των πρωτεϊνών της ECM οι οποίες αποκαλύπτουν κρυφές περιοχές που συµµετέχουν στη σηµατοδότηση [Hinz 2007]. 195

196 Εικόνα Ρύθµιση της µεταγραφής της a-sma στους µυοϊνοβλάστες. Το κύριο µονοπάτι µέσω του οποίου ο TGFb επάγει την έκφραση της a-sma στους µυοϊνοβλάστες διαµεσολαβείται από την ενεργοποίηση της Smad3 από το σύµπλεγµα του υποδοχέα του TGFb1, γεγονός που οδηγεί στη σύνδεσή της µε τη Smad4 και τη µετακίνηση του συµπλόκου εντός του πυρήνα. Η πρόσδεση της Smad3 σε ειδικές αλληλουχίες στην περιοχή του υποκινητή σε συνεργασία µε µια ποικιλία µεταγραφικών παραγόντων (TF), ρυθµίζει την µεταγραφή της a-sma. Κάποιοι ανταγωνιστές του TGFb1 όπως η IFN γ, δρουν µέσω ενεργοποίησης του YB-1 που αναστέλλει την ευοδωµένη από τη Smad3 γονιδιακή µεταγραφή και αυξάνει την έκφραση της ανασταλτικής Smad7 πρωτεΐνης. Η επαγόµενη από τον TGFb1, αλλά ανεξάρτητη από τη Smad σηµατοδότηση µεταγραφή της a-sma ενισχύεται από την πρόσδεση των kruppel-like παραγόντων Sp1/3 [Hinz 2007]. είκτες των µυοϊνοβλαστών και διάκρισή τους από άλλα κύτταρα Υπάρχει µια ποικιλία δεικτών που χρησιµεύουν για την αναγνώριση και ταυτοποίηση των µυοϊνοβλαστών. Ένα µέρος αυτών αφορά πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού, και ο ευρύτερα διαδεδοµένος µεταξύ αυτών είναι η a-sma (εικόνα 5.28). Η πρωτεΐνη αυτή ωστόσο, αδυνατεί να µας βοηθήσει να διακρίνουµε µεταξύ µυοϊνοβλαστών και λείων µυϊκών κυττάρων σε περιπτώσεις όπου συνυπάρχουν πληθυσµοί και των δύο αυτών κυττάρων. Για παράδειγµα, στην αναδιαµόρφωση τραυµατισµένων αρτηριών θεωρείται πως το κύτταρο το οποίο διαδραµατίζει το 196

197 σηµαντικότερο ρόλο είναι το λείο µυϊκό κύτταρο, αλλά έχει προταθεί και συµµετοχή των τοιχωµατικών ινοβλαστών. Τα συσταλτικά λεία µυϊκά κύτταρα εκφράζουν ειδικά τις βαρείες αλυσίδες της µυοσίνης των λείων µυϊκών κυττάρων, τη β-caldesmon, και τη δεσµίνη, παρ όλ αυτά, χάνουν αυτούς τους δείκτες όταν αποκτούν τον φαινότυπο κυττάρου που συνθέτει. Μέχρι πρόσφατα η smoothelin θεωρούνταν ως ένας δείκτης των τελικών σταδίων διαφοροποίησης για τα λεία µυϊκά κύτταρα που δεν εκφράζεται στους µυοϊνοβλάστες. Παρ όλ αυτά, µελέτη της γονιδιακής έκφρασης σε συνδυασµό µε την πρωτεϊνική βιοχηµεία αποκάλυψε επαγωγή της smoothelin καθώς και άλλων όψιµων δεικτών των λείων µυϊκών κυττάρων σε ινοβλάστες πνευµόνων που είχε χορηγηθεί TGFb1 [Chambers et al., 2003]. Πιο πρόσφατα ακόµα, η 4Ig ισοµορφή της πρωτεΐνης των συσταλτικών ινιδίων, παλλαντίνης, προτάθηκε ως νέος δείκτης της διαφοροποίησης των µυοϊνοβλαστών, αλλά η ανάλυση κατά Western µε τη χρήση αντισωµάτων για την παλλαντίνη αποκάλυψε έκφραση αυτής της ισοµορφής και στα λεία µυϊκά κύτταρα [Hinz 2007]. Εικόνα Κοκκιώδης ιστός που έχει χρωσθεί για α-sma και δεσµίνη. Η α-sma (κόκκινο) και η δεσµίνη (πράσινο) εκφράζονται ταυτόχρονα από τα λεία µυϊκά κύτταρα των αγγείων. Οι ινοβλάστες στον κοκκιωµατώδη ιστό του τραύµατος εκφράζουν de novo την α-sma 9 ηµέρες µετά τον τραυµατισµό και τα επίπεδα της έκφρασης µειώνονται µετά την 12η ηµέρα. Η αυξηµένη µηχανική τάση του ιστού καταλήγει σε πρωιµότερη έκφραση της α-sma και σε αυξηµένη έκφρασή της µέχρι την 12η ηµέρα [Hinz 2001α]. Κατά συνέπεια, προς το παρόν καµία πρωτεΐνη του κυτταροσκελετού δεν επιτρέπει να διαχωρίσουµε αξιόπιστα τους µυοϊνοβλάστες από τα λεία µυϊκά κύτταρα, όµως, πρόσφατες εξελίξεις στην πρωτεωµική και στην γονιδιακή ανάλυση µπορεί να µας οδηγήσουν στην αναγνώριση ενός τέτοιου απόλυτα ειδικού δείκτη των µυοϊνοβλαστών, µε την προϋπόθεση ασφαλώς ότι υπάρχει [Hinz 2007, Chambers et al., 2003]. 197

198 Όσον αφορά πρωτεΐνες που εκφράζονται στην κυτταροπλασµατική µεµβράνη των µυοϊνοβλαστών, ιδιαίτερα σηµαντική είναι η έκφραση ειδικών καντχερινών, διαµεµβρανικών πρωτεϊνών που συµµετέχουν στις διακυτταρικές συνάψεις οι οποίες ενδοκυττάρια συνδέονται µε τα ινίδια ακτίνης [Hinz et al., 2003]. Σε αντίθεση µε τους αρνητικούς για έκφραση καντχερίνης ινοβλάστες του φυσιολογικού δέρµατος, οι πρωτο µυοϊνοβλάστες που βρίσκονται σε πρώιµο κοκκιώδη ιστό, όσο και αυτοί που αναπτύσσονται σε καλλιέργεια εκφράζουν Ν καντχερίνη (cadherin-2, A-cell adhesion molecule A-CAM). Σε συνδυασµό µε την εµφάνιση της a-smα έπειτα από επίδραση του TGFb1 σε καλλιέργεια ή σε διαφοροποιηµένους µυοϊνοβλάστες από κοκκιώδη ιστό τραύµατος, η Ν καντχερίνη αντικαθίσταται σταδιακά από την ΟΒ καντχερίνη (καντχερίνη 11). Η ΟΒ και όχι η Ν καντχερίνη φαίνεται να διαδραµατίζει έναν σηµαντικό λειτουργικό ρόλο στο συντονισµό της συστολής των µυοϊνοβλαστών κατά πληθυσµούς [Hinz et al., 2004]. Μία παρόµοια αλλαγή έκφρασης από Ν- σε ΟΒ καντχερίνη έχει περιγραφεί σε ινοβλάστες του στρώµατος στον καρκίνο του προστάτου. Η ΟΒ καντχερίνη απουσιάζει από τα λεία µυϊκά κύτταρα, παρ όλ αυτά εκφράζεται σε µια ποικιλία κυτταρικών πληθυσµών µεσεγχυµατικής προέλευσης, και ως εκ τούτου, δε µπορεί να θεωρηθεί επίσης ως εξειδικευµένος δείκτης των µυοϊνοβλαστών [Hinz 2007]. Τέλος, σηµαντικό ρόλο στη διάκριση µεταξύ ινοβλαστών και µυοϊνοβλαστών, πέραν των µορφολογικών τους διαφορών, διαδραµατίζει η µεµβρανική πρωτεΐνη Thy-1, η οποία εκφράζεται από τους ινοβλάστες αλλά απουσιάζει από τους διαφοροποιηµένους µυοϊνοβλάστες. Πολύ ενδιαφέρον είναι ότι κύτταρα που δεν εκφράζουν την Thy-1 αποτυγχάνουν να ανταποκριθούν σε ινοποιά ερεθίσµατα, γεγονός που υποδεικνύει ότι η έκφραση της πρωτεΐνης αυτής χαρακτηρίζει έναν συγκεκριµένο υποπληθυσµό ινοβλαστών οι οποίοι ενδεχοµένως δεν δύνανται να διαφοροποιηθούν προς µυοϊνοβλάστες [Hinz 2007]. Ένα ακόµα ενδιαφέρον χαρακτηριστικό των µυοϊνοβλαστών είναι η ικανότητά τους τόσο να παράγουν όσο και να επεξεργάζονται την εξωκυττάρια ουσία. Οι µυοϊνοβλάστες παράγουν πολλά από τα συστατικά της ECM τα οποία µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως µοριακοί δείκτες. Από τα πλέον σηµαντικά µόρια που παράγουν οι µυοϊνοβλάστες είναι τα µόρια κολλαγόνου τύπου I, III, IV, και V, τα οποία ωστόσο παράγονται επίσης από µια µεγάλη ποικιλία κυττάρων. Πιο πρόσφατα, δόθηκε αυξηµένη βαρύτητα στην παραγωγή του κολλαγόνου τύπου VI καθώς φαίνεται ότι αυξάνει παράλληλα µε τη διαφοροποίηση των µυοϊνοβλαστών, τόσο στην νεφρική ίνωση στον άνθρωπο, όσο και στην µυοκαρδιακή διάµεση ίνωση και το στρώµα του 198

199 ηπατοκυτταρικού καρκινώµατος [Hinz 2007, Schurch et al., 2004]. Ιδιαίτερα ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι σε ινοβλάστες από καρδία που καλλιεργήθηκαν σε µέσα που περιείχαν κολλαγόνο τύπου VI υπήρξε επαγωγή της διαφοροποίησης προς µυοϊνοβλάστη αλλά το φαινόµενο αυτό δεν παρατηρήθηκε σε καλλιεργητικά µέσα που αντίστοιχα περιείχαν κολλαγόνο τύπου I και III (εικόνα 5.29) [Naugle et al., 2006]. Εικόνα Το κολλαγόνο τύπου VI επάγει τη διαφοροποίηση των µυοϊνοβλαστών στην καρδιά. Ινοβλάστες από την καρδιά τοποθετήθηκαν σε καλλιεργητικά µέσα που περιείχαν κολλαγόνο τύπου Ι, ΙΙΙ και VI για 24 ώρες, µετά τις οποίες ανιχνεύθηκε µε ανοσοφθορισµό η έκφραση της α SMA (πράσινο) ενώ οι πυρήνες χρώσθηκαν µπλε. Παρατηρούµε την επίδραση του κολλαγόνου τύπου VI στη διαφοροποίηση των ινοβλαστών σε µυοϊνοβλάστες µε µικρή επίδραση στο αναπαραγωγικό δυναµικό των ινοβλαστών. Αντιθέτως, τα κολλαγόνα που ανήκουν στους τύπους Ι και ΙΙΙ διέγειραν σηµαντικά την αναπαραγωγή των ινοβλαστών χωρίς να έχουν, όµως, επίδραση στη διαφοροποίησή προς µυοϊνοβλάστες [Naugle et al., 2006]. Επί του παρόντος, ο πλέον αξιόπιστος δείκτης για την συντιθέµενη από τους µυοϊνοβλάστες ECM είναι η ED-A ινωδονεκτίνη, η οποία επίσης εκφράζεται σε χαµηλά επίπεδα από τα ινοβλαστικά κύτταρα σε καλλιέργεια, καθώς και από τα λεία µυϊκά κύτταρα των αγγείων in vivo και in vitro [Dugina et al., 2001, Hinz et al., 2001β]. Ένα άλλο συστατικό της παραγόµενης εκ των µυοϊνοβλαστών εξωκυττάριας ουσίας, η γλυκοπρωτεΐνη τενασίνη-c έχει συσχετισθεί µε τα φαινόµενα που λαµβάνουν χώρα κατά την ιστική επούλωση. Η τενασίνη-c φαίνεται πως διαθέτει την ικανότητα να προσελκύει τους ινοβλάστες και να επάγει τη διαφοροποίησή τους προς µυοϊνοβλάστες στους υπό επούλωση ιστούς αλλά και στο διηθητικό µέτωπο στον καρκίνο. Παρ όλ αυτά, και σε αυτή την περίπτωση, η έκφρασή της και από τα λεία 199

200 µυϊκά κύτταρα δηµιουργεί περιορισµούς για τη χρήση της ως δείκτη των µυοϊνοβλαστών [Chiquet-Ehrismann et al., 2003]. Τερµατισµός της δράσης των µυοϊνοβλαστών Στη φυσιολογική φάση ωρίµανσης σε τραυµατισµούς του δέρµατος, η συσταλτική ικανότητα των µυοϊνοβλαστών παύει µόλις ο ιστός επιδιορθωθεί, η έκφραση της a- SMA τότε ελαττώνεται και οι µυοϊνοβλάστες υφίστανται απόπτωση [Desmouliere et al., 1995]. Στην παθολογική επούλωση όµως, η δραστηριότητα των µυοϊνοβλαστών επιµένει και µπορεί να οδηγήσει σε παραµόρφωση του ιστού (εικόνα 5.30). Αυτό το φαινόµενο είναι συχνότερο στην περίπτωση δηµιουργίας υπερτροφικών ουλών µετά από εγκαύµατα, στη φάση ίνωσης στο σκληρόδερµα και στην παλαµιαία ίνωση της νόσου του Dupuytren. Οι προκαλούµενες από τους µυοϊνοβλάστες συσπάσεις είναι επίσης χαρακτηριστικές για περιπτώσεις δηµιουργίας εστιών ίνωσης που επηρεάζουν τη λειτουργία ζωτικών οργάνων όπως είναι το ήπαρ [Desmouliere et al., 2003], η καρδία, ο πνεύµονας και οι νεφροί. Η ένταση της συστολής εξαρτάται τόσο από το µέγεθος του τραύµατος, όσο και από την κινητικότητα του δέρµατος. Στους ανθρώπους η συστολή είναι µεγαλύτερη στον κορµό και το περίνεο όπου έως και το 80 % της σύγκλεισης του τραύµατος µπορεί να αποδοθεί στο µηχανισµό αυτό, µικρότερη στα άκρα και ενδιάµεση στην κεφαλή και τον τράχηλο. Αυτές οι διαφορές φαίνεται πως µπορούν να αποδοθούν στην διαφορετική χαλαρότητα που έχει το δέρµα από περιοχή σε περιοχή. Οι συσπάσεις αναπτύσσονται συχνότερα στα άκρα, στα βλέφαρα, τον τράχηλο και τα δάκτυλα [Lorenz et al., 2008]. 200

201 Εικόνα ράση και παύση της λειτουργίας των µυοϊνοβλαστών κατά την επούλωση τραύµατος στο δέρµα. (a) Στους φυσιολογικούς ιστούς οι ινοβλάστες δέχονται την επίδραση χαµηλής µηχανικής τάσης από το εξωκυττάριο περιβάλλον και κατά συνέπεια δεν υπάρχει ερέθισµα για τη δηµιουργία συσταλτικού κυτταροσκελετού. Σε περίπτωση τραυµατισµού πλήρους πάχους, η έκκριση µιας ποικιλίας παραγόντων διεγείρουν τους ινοβλάστες από το παρακείµενο άθικτο δέρµα να εισέλθουν στο χώρο του τραύµατος, γεγονός που οδηγεί στο σχηµατισµό του κοκκιωµατώδους ιστού. Σε αυτό το σηµείο, οι ινοβλάστες έχουν ήδη διεγερθεί ώστε να παράγουν ED-A ινωδονεκτίνη (ED-A FN). (b) Οι ινοβλάστες που µεταναστεύουν ασκούν δυνάµεις έλξης στο κολλαγόνο του εξωκυττάριου χώρου, γεγονός το οποίο καταλήγει στη γραµµική αναδιοργάνωσή του. Η ανάπτυξη µηχανικού stress διεγείρει τους ινοβλάστες προς ανάπτυξη συσταλτικών ινιδίων και παραγωγή κολλαγόνου, καθώς και στην απόκτηση του φαινοτύπου των πρωτο µυοϊνοβλαστών. Οι δυνάµεις τάσης διεγείρουν τους πρωτο µυοϊνοβλάστες να εκκρίνουν TGFβ1 και αυξηµένα επίπεδα ED-A ινωδονεκτίνης. (c) Οι πρωτο µυοϊνοβλάστες µετατρέπονται σε λειτουργικούς µυοϊνοβλάστες µέσω σύνθεσης της α-sma και µε τον τρόπο αυτό παράγουν µεγαλύτερες δυνάµεις συστολής. Ταυτόχρονα, διαφοροποιηµένοι µυοϊνοβλάστες παράγουν κολλαγόνο και άλλα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας και εκκρίνουν πρωτεάσες. Αυτή η σύνθετη διεργασία έχει ως αποτέλεσµα τη διευκόλυνση της επούλωσης. (d) Ταυτόχρονα µε την παύση της φυσιολογικής επούλωσης, οι µυοϊνοβλάστες εξαφανίζονται µέσω απόπτωσης και έχουµε τον σχηµατισµό µιας ουλής. (e) Σε πολλές παθολογικές καταστάσεις όπως είναι ο σχηµατισµός υπερτροφικών ουλών, η δραστηριότητα των µυοϊνοβλαστών επιµένει, γεγονός που οδηγεί στην εµφάνιση παθολογικών συσπάσεων [Tomasek et al., 2002]. 201

202 Επιπροσθέτως, η συµµετοχή των µυοϊνοβλαστών στη διαδικασία που καλείται αντίδραση στρώµατος στον καρκίνο υποβοηθά την ανάπτυξη της κακοήθους εστίας µέσω δηµιουργίας ενός µικροπεριβάλλοντος διεγερτικού για τα κύτταρα των επιθηλιακών όγκων [Hinz 2007, Desmouliere et al., 2004]. Το να απαντηθεί το ερώτηµα κατά πόσον η διαφοροποίηση των µυοϊνοβλαστών είναι ή όχι αναστρέψιµη θα βοηθήσει στην ανάπτυξη στρατηγικών προκειµένου να ανασταλεί εξειδικευµένα και απόλυτα η δηµιουργία των µυοϊνοβλαστών. Μια σειρά µελετών περιγράφουν την µείωση της a-sma σε διαφοροποιηµένους µυοϊνοβλάστες σε καλλιέργεια ως απάντηση στη χρησιµοποίηση µιας ποικιλίας παραγόντων, όπως ανταγωνιστές του TGFb1, αυξητικοί παράγοντες, κυτταρική πυκνότητα (cell density), καθώς και σε καλλιεργητικά µέσα µε µικρή πυκνότητα χωρίς εµφανή σηµεία αυξηµένου κυτταρικού θανάτου. In vivo, παρ όλ αυτά, δεν έχει περιγραφεί αναστροφή των µυοϊνοβλαστών, παρά µόνο µαζική απόπτωσή τους µετά την επούλωση του τραύµατος και την επανεπιθηλιοποίηση [Desmouliere et al., 1995]. Εικόνα Πορεία ζωής των µυοϊνοβλαστών. Οι ινοβλάστες εντός του άθικτου ιστού προστατεύονται από την επίδραση του stress λόγω της ύπαρξης µιας φυσιολογικής και λειτουργικής εξωκυττάριας ουσίας, και µε αυτό τον τρόπο δεν αποκτούν συσταλτικές ιδιότητες και συνάψεις µε την εξωκυττάρια ουσία. Μετά τον τραυµατισµό, τα φλεγµονώδη σήµατα ενεργοποιούν τους ινοβλάστες ώστε να µετακινηθούν εντός του τραυµατισµένου ιστού. Η αναδιαµόρφωση της ουλής οδηγεί στη σταδιακή αύξηση της πυκνότητας τη εξωκυττάριας ουσίας, γεγονός που καταλήγει στη δηµιουργία δυνάµεων έλξης που επιδρούν πάνω στα κύτταρα. Ως αποτέλεσµα έχουµε τη δηµιουργία µικρών FAs και συσταλτικών 202

203 ινιδίων που περιέχουν µόνο κυτταροπλασµατικές ακτίνες. Έχουµε δηλαδή τη δηµιουργία των πρωτο- µυοϊνοβλαστών. Ο TGFb1 διεγείρει τους πρωτο-µυοϊνοβλάστες για έκφραση της a-sma, που αρχικά δεν ενσωµατώνεται στα συσταλτικά ινίδια αλλά οργανώνεται σε ραβδόµορφες κυτταροπλασµατικές δοµές. Η συνεχιζόµενη συναρµολόγηση των ινών της ECM δηµιουργεί µεγαλύτερες επιφάνειες που ενδείκνυνται για σχηµατισµό συνδέσεων, γεγονός το οποίο µε τη σειρά του επιτρέπει την ανάπτυξη ισχυρότερων συσταλτικών ινιδίων και τη δηµιουργία µεγαλύτερων δυνάµεων συστολής. Όταν τα σηµεία προσκόλλησης µεγαλώσουν έως το µέγεθος των υπερώριµων FAs, η ενδοκυττάρια τάση αγγίζει ένα κριτικό επίπεδο που επιτρέπει τη ενσωµάτωση της a-sma στα προϋπάρχοντα συσταλτικά ινίδια. Η δύναµη συστολής που παράγεται από αυτά τα ενισχυµένα ινίδια είναι µεγαλύτερη και οδηγεί σε περαιτέρω ωρίµανση των FAs και συστολή της ECM. Οι µυοϊνοβλάστες εξέρχονται από αυτό τον κύκλο µε την επανεγκαθίδρυση της φυσιολογικής δοµής της ECM µέσω της απόπτωσης που υφίστανται [Hinz 2007]. Εναλλακτικώς των σηµάτων που δίνονται από αυξητικούς παράγοντες, δύο ακόµα µηχανισµοί συµµετέχουν στην εξαφάνιση των µυοϊνοβλαστών στο τέλος της φυσιολογικής διαδικασίας επούλωσης: (α) η κυτταρική αποδέσµευση από το stress και (β) η αυξηµένη σύνθεση ειδικών διακυτταρικών συνδέσεων ενώ πιθανότατα τα ενδοκυττάρια µονοπάτια που συνδέουν τη µείωση του stress µε την απόπτωση περιλαµβάνουν πολλά κοινά σηµεία µε αυτά που χρησιµοποιούνται και κατά τη µετατροπή των ινοβλαστών σε µυοϊνοβλάστες [Hinz 2007] Εικόνα Φάση αναγέννησης στην επούλωση. Παρατηρείται ο πολλαπλασιασµός και η µετανάστευση των κερατινοκυττάρων καθώς και η συστολή του τραύµατος. Στο εικονίδιο επάνω αριστερά παρατηρούµε το δέρµα ποντικού 5 ηµέρες µετά τον τραυµατισµό. Παρατηρείται το πεπαχυσµένο, υπό πολλαπλασιασµό και µετανάστευση επιθήλιο (κυτταροκερατίνη 14 κόκκινος 203

204 ανοσοφθορισµός) καθώς και η νεοαγγείωση (CD 31- ενδοθηλιακός δείκτης, πράσινος ανοσοφθορισµός ) [Shaw et al., 2009]. ΩΡΙΜΑΝΣΗ ΚΑΙ ΑΝΑ ΙΑΜΟΡΦΩΣΗ ΤΗΣ ΟΥΛΗΣ Η αντικατάσταση του κοκκιώδους ιστού µε ουλώδη ιστό συµπεριλαµβάνει αλλαγές στη σύνθεση της εξωκυττάριας ουσίας. Η λυσυλοξειδάση είναι το κύριο ένζυµο που δηµιουργεί διασταυρούµενες συνδέσεις µεταξύ των αρχικά µη οργανωµένων ινών κολλαγόνου, δράση που οδηγεί σε σηµαντική αύξηση της ανθεκτικότητας (tensile strength) του τραύµατος. Η ισορροπία µεταξύ της σύνθεσης της ECM και της αποδόµησής της καταλήγει στην αναδιαµόρφωση του σκελετού του συνδετικού ιστού και αποτελεί ένα σηµαντικό χαρακτηριστικό της ιστικής επούλωσης. Κάποιοι από τους αυξητικούς παράγοντες οι οποίοι διεγείρουν τη σύνθεση κολλαγόνου καθώς και άλλων µορίων του συνδετικού ιστού δρουν επίσης ρυθµιστικά ως προς τη σύνθεση και την παραγωγή των µεταλλοπρωτεϊνασών, των ενζύµων δηλαδή που αποδοµούν αυτά τα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας [Robbins et al., 2009, Kobayashi et al., 1994]. Η λειτουργία των µεταλλοπρωτεϊνασών εξαρτάται από τα ιόντα ψευδαργύρου. Στις µεταλλοπρωτεϊνάσες περιλαµβάνονται οι κολλαγονάσες του διάµεσου ιστού (MMP - 1, -2, και -3) οι οποίες διασπούν το ινιδιακό κολλαγόνο των τύπων Ι, ΙΙ και ΙΙΙ, οι γελατινάσες (MMP-2 και 9, ή κολλαγονάσες τύπου IV) οι οποίες διασπούν το άµορφο κολλαγόνο και την ινωδονεκτίνη, οι στρωµαλυσίνες (MMP-3, 10, και 11) οι οποίες καταβολίζουν διάφορα συστατικά της ECM περιλαµβανοµένων των πρωτεογλυκανών, λαµινίνης, ινωδονεκτίνης και άµορφου κολλαγόνου, καθώς και η οικογένεια των ADAMs. Αυτά τα ένζυµα παράγονται από διάφορους τύπους κυττάρων (ινοβλάστες, µακροφάγα, ουδετερόφιλα, επιθηλιακά κύτταρα), η δε σύνθεση και έκκρισή τους ρυθµίζονται από αυξητικούς παράγοντες (PDGF, FGF), κυτταροκίνες (IL-1, TNF) και ερεθίσµατα για φαγοκύττωση, ενώ αναστέλλεται από τον TGF-β και τα στεροειδή [Kumar et al., 2009, Moses et al., 1996]. 204

205 Εικόνα Οι πολλαπλοί ρόλοι των µακροφάγων κατά την επούλωση του δέρµατος. Τα µακροφάγα συµµετέχουν στην αποµάκρυνση των απορριµµάτων από την τραυµατισµένη περιοχή, επιδεικνύουν αντιµικροβιακή δραστηριότητα, διεγείρουν τη χηµειοταξία και την ενεργοποίηση των φλεγµονωδών κυττάρων και των ινοβλαστών, ενισχύουν την αγγειογένεση και, τέλος, διεγείρουν τόσο την εναπόθεση, όσο και την αναδιαµόρφωση της εξωκυττάριας ουσίας. ROS: reactive oxygen species [Kumar et al., 2009]. Καθώς οι µεταλλοπρωτεϊνάσες έχουν τη δυνατότητα να προκαλέσουν καταστροφή στους ιστούς, η δραστηριότητά τους ελέγχεται αυστηρά. Έτσι, ανενεργές πρόδροµες ουσίες (ζυµογόνα), που πρώτα πρέπει να ενεργοποιηθούν. Αυτό επιτυγχάνεται από ορισµένες χηµικές ουσίες (π.χ. HOCL ) ή πρωτεάσες (π.χ. πλασµίνη) που είναι πιθανόν να βρίσκονται µόνο στη θέση της βλάβης. Επιπλέον ενεργοποιηµένες κολλαγονάσες µπορούν τάχιστα να υφίστανται αναστολή από ειδικούς ιστικούς αναστολείς της µεταλλοπρωτεϊνάσης (ΤΙΜΡ) που παράγονται από τα περισσότερα κύτταρα του µεσεγχύµατος [Witte et al., 1998, Talhouk et al., 1992]. Εν τέλει, το αποτέλεσµα είναι η δηµιουργία ουλής. Η ουλή χαρακτηρίζεται µορφολογικά από την έλλειψη οργάνωσης του ιστού εν συγκρίσει µε την αρχιτεκτονική του φυσιολογικού ιστού καθώς και από την µη οργανωµένη εναπόθεση κολλαγόνου. Οι νεοσυντιθέµενες ίνες κολλαγόνου που εκκρίνονται από τους ινοβλάστες είναι παρούσες στο δέρµα από την 3 η κιόλας ηµέρα µετά τον τραυµατισµό, και εντός της ουλής έχουν τη µορφή πυκνά πακεταρισµένων ινών, κάτι 205

206 που απέχει πολύ από τη δικτυωτή σύνθετη διάταξη που έχουν στο µη τραυµατισµένο δέρµα [Lorenz et al., 2008]. Τα ινώδη κολλαγόνα (κυρίως το κολλαγόνο τύπου Ι) αποτελούν ένα µεγάλο µέρος του επιδιορθωµένου ιστού στα σηµεία τραυµατισµών και είναι καθοριστικής σηµασίας για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας στην τάση. Η συνολική εναπόθεση κολλαγόνου όµως είναι η συνισταµένη όχι µόνον της αυξηµένης σύνθεσης κολλαγόνου αλλά και της µειωµένης αποδόµησής του. Πόσο όµως είναι το χρονικό διάστηµα που απαιτείται να παρέλθει προκειµένου το σηµείο του τραυµατισµού να αποκτήσει µέγιστη ανθεκτικότητα; Μετά την αφαίρεση των ραµµάτων σε µια χειρουργική τοµή, η ανθεκτικότητα στο τέλος της πρώτης εβδοµάδας περιορίζεται στο 10% εκείνης του άθικτου δέρµατος. Μολαταύτα, η αύξηση της ανθεκτικότητας αυξάνεται ραγδαία κατά τις επόµενες τέσσερις εβδοµάδες, εν συνεχεία επιβραδύνεται κατά το χρονικό διάστηµα που αντιστοιχεί, κατά προσέγγιση, στον τρίτο µήνα µετά την τοµή, και τελικά φθάνει στο 70% έως 80% της φυσιολογικής ανθεκτικότητας. Αυτή η ελαττωµένη ανθεκτικότητα στην επουλωθείσα περιοχή µπορεί να παραµένει καθ όλη τη διάρκεια της ζωής. Η µερική ανάκτηση της ανθεκτικότητας είναι απότοκή αρχικά της περίσσειας της κολλαγονικής σύνθεσης έναντι της αποδόµησής του κατά τους πρώτους 2 µήνες της επούλωσης και, εν συνεχεία, των δοµικών αλλαγών των ινών κολλαγόνου (cross-linking, αυξηµένο µέγεθος ινών) όταν η αυξηµένη σύνθεση κολλαγόνου έχει παύσει [Kumar et al., 2009]. ΛΥΣΗ ΤΗΣ ΙΕΡΓΑΣΙΑΣ ΤΗΣ ΕΠΟΥΛΩΣΗΣ Η λύση της διεργασίας της επούλωσης είναι απαραίτητη για την αποκατάσταση της πλήρους λειτουργικότητας και της φυσιολογικής εµφάνισης του τραυµατισµένου ιστού. Η µετανάστευση και ο πολλαπλασιασµός των κερατινοκυττάρων στο χείλος της πληγής σταµατούν µέσω αναστολής εξ επαφής που λαµβάνει χώρα καθώς κύτταρα από τα δύο απέναντι όρια του τραύµατος συναντώνται πάνω στην τραυµατική επιφάνεια. Η απλή αποκατάσταση της συνέχειας, παρ όλ αυτά, µιας επιδερµικής επιφάνειας δε συνεπάγεται και επιστροφή του ιστού στην προτραυµατική του κατάσταση, καθώς τα επιδερµιδικά εξαρτήµατα όπως τα τριχοθυλάκια και οι σµηγµατογόνοι αδένες πρέπει επίσης να αναγεννηθούν. Η αναγέννηση των εξαρτηµάτων δεν είναι αυτόµατη εντός µιας ουλής, έχει αναφερθεί 206

207 όµως πως η φλεγµονή µπορεί να προωθήσει την επαναδηµιουργία εξαρτηµάτων µέσω επανενεργοποίησης του επιδερµιδικού αναπτυξιακού προγράµµατος στο οποίο σηµαίνοντα ρόλο διαδραµατίζει η Wnt σηµατοδότηση [Osaka et al., 2007, Ito et al., 2007]. Κατά τη διάρκεια της λύσης της επούλωσης πολλές αλλαγές λαµβάνουν επίσης χώρα και το χόριο. Τα αιµοφόρα αγγεία εντός του ουλώδους ιστού ωριµάζουν προκειµένου να σχηµατίσουν ένα λειτουργικό δίκτυο [Adams et al., 2007]. Η πυκνή εξωκυττάριος ουσία τα συστατικά της οποίας είχαν τοποθετηθεί µε τυχαίο τρόπο, αναδιαµορφώνεται. Επιπλέον, οι περισσότεροι µυοϊνοβλάστες εισέρχονται σε πρόγραµµα απόπτωσης κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης [Ulrich et al., 2007]. Η φλεγµονώδης αντίδραση στον τραυµατισµό επίσης λύεται παράλληλα µε την ολοκλήρωση της επούλωσης. Τα ουδετερόφιλα εκκαθαρίζονται από την περιοχή της πληγής, τουλάχιστον εν µέρει, µέσω απόπτωσης και ακολούθως φαγοκυτταρώνονται από τα µακροφάγα. Τα µακροφάγα πιστεύεται πως απενεργοποιούνται µέσω αντιφλεγµονωδών κυτταροκινών, γλυκοκορτικοστεροειδών, διακυτταρικής επαφής, ή µέσω φαγοκυττάρωσης. Άλλη στρατηγική για καταστολή της φλεγµονώδους αντίδρασης είναι η ενσωµάτωση των προφλεγµονωδών κυτταροκινών σε µη λειτουργικούς υποδοχείς των ίδιων των κυττάρων της φλεγµονής καθώς και η παραγωγή ενδογενών αντιφλεγµονωδών µορίων όπως η ρεσολβίνη E και η αννεξίνη I [Shaw et al., 2009, Schwab et al., 2007]. Η ατελής ρύθµιση της λύσης της διεργασίας της επούλωσης µπορεί να καταλήξει σε υπερβολικό κυτταρικό πολλαπλασιασµό, παραµονή της φλεγµονώδους αντίδρασης και συνεπακόλουθα στην εµφάνιση ίνωσης και τη δηµιουργία υπερτροφικών ουλών [Wynn 2008]. Θεωρείται πιθανόν ότι οι επιγενετικοί µηχανισµοί (όπως οι τροποποιήσεις των ιστονών και η ρύθµιση από τα micrornas ) συµµετέχουν επίσης στην φάση αυτή [Shaw et al., 2009]. 207

208 Εικόνα Λύση της επούλωσης. Η µικρή φωτογραφία στο κάτω µέρος απεικονίζει την αλλοιωµένη σύνθεση, πυκνότητα και οργάνωση του κολλαγόνου εντός της αναπτυσσόµενης ουλής σε δέρµα ποντικιού 14 ηµέρες µετά τον τραυµατισµό [Shaw et al., 2009]. 208

209 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6. ΕΠΟΥΛΩΣΗ ΣΤΟ ΕΡΜΑ ΚΑΙ STEM ΚΥΤΤΑΡΑ Όπως αναφέρθηκε και νωρίτερα, η επιδερµίδα και τα εξαρτήµατα επιτελούν µια σειρά από πολύ σηµαντικές λειτουργίες όπως είναι η προστασία από την αφυδάτωση, η διατήρηση και ρύθµιση της θερµοκρασίας του σώµατος, καθώς και η προστασία από τις επιβλαβείς περιβαλλοντικές επιδράσεις όπως είναι η ακτινοβολία και οι λοιµώξεις. Η συνοχή του δέρµατος και η λειτουργία του ως φραγµού ρυθµίζεται αυστηρά από ένα σύνθετο δίκτυο αλληλεπιδράσεων τόσο µεταξύ των κυττάρων, όσο και µεταξύ των κυττάρων και της εξωκυττάριας ουσίας ενώ οι κύριοι ενορχηστρωτές αυτής της πολύ καλά ρυθµισµένης οµοιόστασης είναι τα stem κύτταρα. Το ίδιο συµβαίνει και στην περίπτωση τραυµατισµού του δέρµατος όπου τα κύτταρα αυτά συνεχίζουν να κατέχουν τον πρωταγωνιστικό ρόλο, µαζί µε έναν δεύτερο πληθυσµό, τα προερχόµενα από τον µυελό των οστών, µεσεγχυµατικά stem κύτταρα [Mimeault et al., 2010]. Εικόνα 6.1. Ο σηµαντικός ρόλος των stem κυττάρων στην οµοιόσταση και την επιδιόρθωση του δέρµατος. Όπως φαίνεται στην εικόνα, παρατηρείται µεγάλη ετερογένεια ως προς τη συνεισφορά των stem κυττάρων στην οµοιόσταση και την επιδιόρθωση διαφόρων ιστών. Το δέρµα ανήκει στην κατηγορία των ιστών που εµφανίζουν ιδιαίτερα υψηλά επίπεδα διαιρέσεων και παράλληλα διαθέτουν ιδιαίτερα υψηλό αναπαραγωγικό δυναµικό που οφείλεται στα αυτόχθονα stem κύτταρα που εδράζονται εντός αυτού [Rando 2008]. 209

210 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Όπως προαναφέρθηκε, κατά τη διάρκεια της διαδικασίας της ιστικής επούλωσης τα κερατινοκύτταρα υφίστανται σηµαντικές αλλαγές όσον αφορά τις συνδέσεις τους και τα µόρια προσκόλλησης. Τα ηµιδεσµοσώµατα λύονται προκειµένου να επιτραπεί η µετανάστευση των κερατινοκυττάρων. Τα µεταναστεύοντα κερατινοκύτταρα στη συνέχεια, παράγουν µια διαφορετική οµάδα µεµβρανικών µορίων, όπως είναι η βιτρονεκτίνη, οι υποδοχείς της ινωδονεκτίνης και η ιντεγκρίνη α5β1, τα οποία βοηθούν τα κερατινοκύτταρα σε αυτήν τους τη µετακίνηση. Πολλοί παράγοντες όπως ο EGF, ο KGF (keratinocyte growth factor) και ο TGFβ, θεωρούνται πιθανοί ρυθµιστές αυτών των διεργασιών. Ο φαινότυπος του ενεργοποιηµένου κυττάρου είναι µελετηµένος σε ευρεία κλίµακα, ποια όµως είναι τα κερατινοκύτταρα που είναι επιδεκτικά ενεργοποίησης; [Morasso et al., 2005]. Η υπόθεση που αρχικά διατυπώθηκε βασιζόταν σε πληθώρα µελετών και υποστήριζε πως, λόγω της µιτωτικής τους δραστηριότητας, τα κερατινοκύτταρα της βασικής στιβάδας και όχι τα διαφοροποιηµένα κερατινοκύτταρα ήταν αυτά που αναλάµβαναν δραστηριότητα κατά τη διεργασία της επούλωσης. Παρ όλ αυτά, η πορεία έδειξε ότι τα stem κύτταρα της περιοχής bulge του τριχοθυλακίου και όχι αυτά της βασικής στιβάδας είναι τα υπεύθυνα για ένα µεγάλο τµήµα της επούλωσης [Morasso et al., 2005]. Στην καθηµερινή ιατρική πράξη, οι παρεκκλίσεις από το φυσιολογικό των επουλωτικών διεργασιών στο δέρµα αποτελούν συχνό πρόβληµα και συχνά απαιτούν την ύπαρξη µακρόχρονης παροχής ιατρικής φροντίδας. Η ανάπτυξη ουλών επηρεάζει τους ασθενείς έχει πολλές φορές όχι µόνον αισθητικές αλλά και λειτουργικές και ψυχοκοινωνικές επιδράσεις στους ασθενείς. Το έγκαυµα αποτελεί έναν ακόµα παράγοντα τραυµατισµού του δέρµατος, η επίδραση του οποίου στους πληθυσµούς των αυτόχθονων stem κυττάρων είναι δυνατόν να καταλήξει στην αδυναµία επιδιόρθωσης του δέρµατος, γεγονός που δηµιουργεί την ανάγκη ανεύρεσης και εφαρµογής περισσότερων τρόπων θεραπευτικής παρέµβασης εκτός από την αυτόλογη µεταµόσχευση δέρµατος που αποτελεί µέχρι σήµερα την πιο κοινή πρακτική [Lau et al., 2009]. Οι χρόνιες πληγές στο δέρµα επηρεάζουν επίσης την ποιότητα ζωής του ασθενούς, δηµιουργούν την ανάγκη για σηµαντικές ιατρικές δαπάνες, και αποτελούν έναν σηµαντικό παράγοντα νοσηρότητας και θνητότητας. Τέτοιου είδους πληγές 210

211 συµβαδίζουν συχνά µε µεγάλη ηλικία του ασθενούς, γεγονός που συνδυάζεται µε µια µικρότερη δεξαµενή λειτουργικών stem κυττάρων. Η µείωση αυτή της λειτουργικότητας µπορεί να οφείλεται σε µια ποικιλία παραγόντων όπως φαίνεται και στην παρακάτω εικόνα. Τόσο οι χρόνιες πληγές όσο και οι υπερτροφικές ουλές και τα χηλοειδή είναι δυνατόν να εµφανίζονται κατ εξακολούθηση, γεγονός που υποδεικνύει την ύπαρξη διαφορών στην ενδογενή ικανότητα για επούλωση των stem κυττάρων µεταξύ ασθενών που εµφανίζουν πτωχή επούλωση, και αυτών στους οποίους οι µηχανισµοί επούλωσης διεκπεραιώνονται µε πιο επιθετικό τρόπο [Lau et al., 2009, Zouboulis et al., 2008]. Εικόνα 6.2. Μείωση της λειτουργικότητας των stem κυττάρων παράλληλα µε την αύξηση της ηλικίας. Η ελάττωση της λειτουργικότητας των stem κυττάρων µε την πάροδο των ετών µπορεί να σχετίζεται µε αλλαγές που συµβαίνουν σε πολλά επίπεδα. Ως ανταπόκριση στο τραύµα, τοπικά παραγόµενα σήµατα δρουν διεγερτικά επί των stem κυττάρων, µε αποτέλεσµα αυτά να αρχίσουν να πολλαπλασιάζονται προκειµένου να παράγουν απογόνους που θα χρησιµοποιηθούν για την ιστική επούλωση. Οι σχετιζόµενες µε την αύξηση της ηλικίας αλλαγές που συµβαίνουν στα ίδια τα stem κύτταρα, την φωλεά τους ή το ιστικό περιβάλλον, είναι δυνατόν να καταλήξουν στη µειωµένη λειτουργικότητα των κυττάρων αυτών σε έναν οργανισµό µεγάλης ηλικίας, γεγονός που γίνεται φανερό µέσω της ελάττωσης της παραγωγής επαρκούς αριθµού απογόνων που θα συµµετάσχουν στις φυσιολογικές αυτές διεργασίες [Rando 2008]. 211

212 Η πληρέστερη κατανόηση, κατά συνέπεια, των µηχανισµών ρύθµισής και της συνεισφοράς των stem κυττάρων στην επούλωση του δέρµατος είναι απαραίτητη για την καλύτερη αντιµετώπιση των τραυµάτων του δέρµατος, καθώς και για την ανάπτυξη νέων και αποτελεσµατικότερων θεραπευτικών στρατηγικών [Lau et al., 2009]. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ BULGE ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΗΝ ΕΠΟΥΛΩΣΗ Η συνεισφορά του τριχοθυλακίου στην επούλωση της επιδερµίδας µετά από λύση της συνέχειάς της έχει µελετηθεί επί σειρά ετών από ερευνητές που χρησιµοποίησαν κατά κύριο λόγο επίµυες και κουνέλια. Τα ερωτήµατα που προέκυπταν ήταν δύο: κατά πόσον τα κερατινοκύτταρα που προέρχονταν από το τριχοθυλάκιο ήταν όντως αυτά που επανοίκιζαν τα σηµεία τραυµατισµού, και κατά δεύτερον, ποιος ήταν ο ακριβής ρόλος της bulge περιοχής, κάτι που µέχρι πρόσφατα παρέµενε ασαφές [Ito et al., 2005]. Η αρχή των µελετών που ασχολήθηκαν µε αυτό το θέµα έγινε πολύ νωρίς το 1976, µε τη µελέτη του Argyris, κατά την οποία τεκµηριώθηκε ότι τα κύτταρα του τριχοθυλακίου διαθέτουν την ικανότητα µετανάστευσης προκειµένου να αναδηµιουργήσουν την επιδερµίδα έπειτα από πλήρη καταστροφή της µε µηχανική απόξεση ή έγκαυµα. Στη συνέχεια, για να καταστεί σαφές εάν το ίδιο συµβαίνει και µε µικρότερης έκτασης τραυµατισµούς και προκειµένου να βεβαιωθούν ότι τα bulge LRCs έχουν όντως αυτή την ικανότητα, οι Taylor et al. το 2000 χρησιµοποίησαν τεχνικές διπλής σήµανσης σε πειράµατα που αφορούσαν τη διεργασία της επούλωσης (εικόνα 6.3). Όπως βρέθηκε, κατόπιν τραυµατισµού, τα BrdUσηµασµένα κύτταρα που προέρχονταν από τη bulge περιοχή, αναπαράγονταν εντός της επιδερµίδας και πλησίον του infundibulum, που είναι το τµήµα του τριχοθυλακίου ανάµεσα στον σµηγµατογόνο αδένα και την επιφάνεια του δέρµατος [Argyris 1976, Cotsarelis et al., 2006, Taylor et al., 2000]. 212

213 Εικόνα 6.3. Η µετανάστευση κερατινοκυττάρων προερχόµενων από την ανώτερη περιοχή του τριχοθυλακίου στην επιδιόρθωση τραυµάτων της επιδερµίδας ποντικών. Εικοσιµία ώρες µετά τη δηµιουργία τραυµάτων µε αιχµηρό αντικείµενο στο δέρµα της πλάτης ενήλικων ποντικών, η χρωστική ουσία BrdU ενέθηκε ενδοπεριτοναϊκά, γεγονός που ακολουθήθηκε δέκα ώρες αργότερα από την ενδοπεριτοναϊκή έγχυση της ουσίας 3H-TdR προκειµένου να σηµανθούν εκλεκτικά τα κύτταρα του ανώτερου τµήµατος του τριχοθυλακίου. Τα ποντίκια αυτά εν συνεχεία θανατώθηκαν µετά από µία, δέκα, και είκοσι ώρες (a), και οι τοµές παραφίνης χρησιµοποιήθηκαν για BrdU ανοσοϊστοχηµεία και αυτορραδιογραφία. (b) Ποσοτικοποίηση των διπλά σηµασµένων κυττάρων του ανώτερου τµήµατος (bulge περιοχή) του τριχοθυλακίου έναντι της επιδερµίδας. Πολυάριθµα διπλά σηµασµένα κύτταρα ανευρέθηκαν εντός της επιδερµίδας (a, βέλη) τα οποία προήλθαν από το ανώτερο αυτό τµήµα του τριχοθυλακίου (τρίγωνα στο εικονίδιο a) [Taylor et al., 2000]. Πιο πρόσφατα, η Elaine Fuchs και οι συνεργάτες της [Tumbar et al., 2004], χρησιµοποίησαν pulse-chase πειράµατα νουκλεοτιδίων σε ποντίκια τα οποία εξέφραζαν την ρυθµιζόµενη από την τετρακυκλίνη H2B-GFP πρωτεΐνη στην επιδερµίδα τους. Επί απουσίας της τετρακυκλίνης, όλοι οι πυρήνες των επιθηλιακών κυττάρων χρωµατίζονταν πράσινοι λόγω της έκφρασης της H2B-GFP, αλλά όταν υπήρχε τετρακυκλίνη στο περιβάλλον, το γονίδιο καταστελλόταν, και µετά από τέσσερις εβδοµάδες µόνο τα bulge κύτταρα εξακολουθούσαν να σηµαίνονται µε αυτή την πρωτεΐνη (εικόνα 6.4). Μετά από τραυµατισµό, τα H2B-GFP-θετικά κύτταρα ανιχνεύονταν στην επιδερµίδα και το infundibulum, γεγονός που επιβεβαιώνει την ικανότητα των bulge LRCs να επανεπιθηλιοποιούν την επιδερµίδα ως ανταπόκριση σε τραυµατισµό. Με την ενεργοποίηση του κύκλου της τρίχας, η καινούργια αναδυόµενη τρίχα επιδείκνυε H2B-GFP θετικά κύτταρα µε πολύ ασθενέστερο φθορισµό εν σχέσει µε αυτά της bulge περιοχής, κάτι που υποδεικνύει οτι τα κύτταρα 213

214 αυτά στην πραγµατικότητα προέρχονται από τα bulge LRCs [Blanpain et al., 2006α, Tumbar et al., 2004]. Εικόνα 6.4. Τα bulge stem κύτταρα. Τα bulge (Bu) stem κύτταρα είναι περισσότερο αδρανή και εισέρχονται σε λιγότερες διαιρέσεις εν σχέσει µε τα άλλα κερατινοκύτταρα του δέρµατος που διαθέτουν επίσης αναπαραγωγικό δυναµικό. Οι Tumbar et al. το 2004 ανέπτυξαν µια νέα τεχνική προκειµένου να διεξάγουν pulse-chase πειράµατα µε φθορίζουσες ουσίες σε ποντίκια που ήταν κατασκευασµένα να εκφράζουν την H2B - GFP µε έναν µηχανισµό εξαρτόµενο από την τετρακυκλίνη. Έτσι, σήµαναν όλα τα επιθηλιακά κύτταρα του δέρµατος µε την H2B-GFP και παρατήρησαν τη διατήρηση της σήµανσης τέσσερις εβδοµάδες αργότερα. Τα αποτελέσµατα ήταν εντυπωσιακά καθώς σηµαντική διατήρηση της σήµανσης παρατηρήθηκε µόνο στην περιοχή bulge (a). Label-retaining κύτταρα (LRCs) ήταν δυνατό να εντοπισθούν εντός της βασικής στιβάδας της επιδερµίδας σε κύτταρα που εκφράζουν α6β4- ιντεγκρίνες καθώς και σε µια υπερβασική τοποθεσία εντός της περιοχής bulge (b). Τα bulge SCs εκφράζουν υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης επιφανείας CD34, η οποία µαζί µε την α6 ιντεγκρίνη έχει χρησιµοποιηθεί προκειµένου να αποµονωθούν τα βασικά και υπερβασικά bulge κύτταρα χρησιµοποιώντας κυτταροµετρία ροής. Cb: club hair, HF: hair follicle, SG: sebaceous gland [Blanpain et al 2006α]. Μια σειρά µελετών που ακολούθησε, επιβεβαίωσε αυτά τα αποτελέσµατα, όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα. 214

215 Εικόνα 6.5. Αποτελέσµατα από διάφορες µελέτες που υποδεικνύουν ότι κύτταρα προερχόµενα από το τριχοθυλάκιο µετακινούνται προς την επιδερµίδα µετά από τραυµατισµό της. Τα κύτταρα αυτά που προέρχονται από την περιοχή bulge παραµένουν εντός της επιδερµίδας επί µακρόν [Ito et al., 2008]. Ως απόκριση λοιπόν σε έναν τραυµατισµό, τα stem κύτταρα του τριχοθυλακίου, ακολουθούν µε ταχείς ρυθµούς προγράµµατα διαφοροποίησης τα οποία δε λαµβάνουν χώρα σε φυσιολογικές συνθήκες οµοιόστασης. Τα κύτταρα αυτά στη συνέχεια µεταναστεύουν προς την επιφάνεια της επιδερµίδας και ξεκινούν τις διαδικασίες επιδιόρθωσης [Blanpain et al., 2006]. Αυτή η µετακίνηση προς τα επάνω είναι αντίθετη από την µετακίνηση των bulge κυττάρων προς τις περισσότερο εν τω βάθει στιβάδες του δέρµατος που συµβαίνει λόγω των αλληλεπιδράσεων του µεσεγχύµατος µε το επιθήλιο κατά την έναρξη του κύκλου της τρίχας (εικόνα 6.6) [Cha et al., 2007]. Η ροή αυτή των bulge κυττάρων προς την επιδερµίδα φαίνεται πως είναι αυστηρά ρυθµιζόµενη καθώς σταµατά άµεσα µε την επούλωση του τραύµατος [Blanpain et al., 2009]. Εικόνα 6.6. Η µετακίνηση των stem κυττάρων της bulge περιοχής. Η περιοχή bulge περιέχει, όπως είδαµε, βραδέως διαιρούµεναα κύτταρα που διατηρούν τη σήµανση, τα οποία συµπεριλαµβάνουν 215

216 multipotent stem κύτταρα (πράσινο) που διαθέτουν την ικανότητα να δηµιουργήσουν το νέο τριχοθυλάκιο κατά τη διάρκεια της οµοιόστασης καθώς και να επιδιορθώσουν την επιδερµίδα επί τραυµατισµού της. Τα κύτταρα της περιοχής bulge, όπως είδαµε και νωρίτερα, βρίσκονται εντός της εξειδικευµένης φωλεάς τους και περιτριγυρίζονται από µια ποικιλία άλλων κυτταρικών τύπων, γεγονότα τα οποία σε συνδυασµό παρέχουν τα κατάλληλα σήµατα προκειµένου αυτά τα stem κύτταρα να παραµείνουν σε µια αδιαφοροποίητη, αδρανή κατάσταση. Προκειµένου να ενεργοποιηθούν τα κύτταρα αυτά πρέπει να αλλάξουν οι συνθήκες εντός της φωλεάς [Fuchs 2007]. Έρευνες ανίχνευσης κυτταρικών σειρών υποδεικνύουν ότι η διαµεσολαβούµενη από τα bulge κύτταρα επιδιόρθωση του δέρµατος είναι µόνον παροδική στο δέρµα των ενηλίκων. Ωστόσο, ιδιαίτερα ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι υπάρχουν stem κύτταρα εντός των τριχοθυλακίων των νεογνών που διαθέτουν την ικανότητα παρατεταµένης συµµετοχής στην επούλωση όπως θα δούµε και παρακάτω [Levy et al., 2007]. Αρχικά θεωρήθηκε ότι πιθανώς αυτά τα stem κύτταρα αυτά εδράζονται στο ανώτερο µέρος του εξωτερικού ελύτρου της τρίχας και όχι στην περιοχή bulge [Nowak et al., 2008]. Πιο πρόσφατες µελέτες δείχνουν ότι το δέρµα των νεογνών στο οποίο υπάρχει έλλειψη του Sox9 δεν µπορεί να πραγµατοποιήσει ικανοποιητική επούλωση των πληγών του, γεγονός που εγείρει τη σηµαντική πιθανότητα ότι το δυναµικό των bulge stem κυττάρων για επούλωση πιθανώς να ελαττώνεται µε την αύξηση της ηλικίας όπως φαίνεται στο πείραµα των Nowak et al. που περιγράφεται στην εικόνα 6.7 [Nowak et al., 2008]. Ο Sox9 είναι ένας µεταγραφικός παράγοντας, η σηµαντικότητα του οποίου όσον αφορά την ανάπτυξη και οµοιόσταση του δέρµατος έχει φανεί µε µελέτες εκλεκτικής απαλοιφής από την επιδερµίδα του γονιδίου που τον κωδικοποιεί. Όταν ο Sox9 απαλείφεται µεταγεννητικά, η έκφραση του δείκτη κυτταρικής επιφανείας CD34 των bulge κυττάρων χάνεται, και τα τριχοθυλάκια αποτυγχάνουν να πραγµατοποιήσουν τον κύκλο τους, γεγονός που είναι ενδεικτικό βλάβης των stem κυττάρων. Από την άλλη, όταν ο Sox9 απενεργοποιείται στο έµβρυο, υπάρχει αδυναµία σχηµατισµού των βραδέως διαιρούµενων bulge κυττάρων κατά την ανάπτυξη, διακόπτεται η µορφογένεση των τριχοθυλακίων και, παράλληλα, υπάρχει πλήρης αδυναµία δηµιουργίας των σµηγµατογόνων αδένων. Τα ευρήµατα αυτά παρέχουν σηµαντικές αποδείξεις για το γεγονός ότι η bulge περιοχή αποτελεί, όπως είδαµε και νωρίτερα, την έδρα stem κυττάρων που είναι απαραίτητα όχι µόνον για τον κύκλο της τρίχας 216

217 αλλά και για τη µορφογένεση των τριχοθυλακίων [Blanpain et al., 2009, Nowak et al., 2008]. Εικόνα 6.7. Ο ρόλος του Sox9 κατά την διαµεσολαβούµενη από τα πρώιµα bulge stem κύτταρα επούλωση και επιδιόρθωση της ενδιάµεσης των τριχοθυλακίων επιδερµίδας. Τα πλήρους πάχους (full thickness) (επιδερµίδα και χόριο/τριχοθυλάκια) και µερικού πάχους (split thickness) (χόριο/τριχοθυλάκια) µοσχεύµατα από WT (wildtype) και Sox9 cko ποντίκια µεταµοσχεύθηκαν σε θηλυκά nude ποντίκια και αναλύθηκε η αδρή εµφάνισή τους 6 εβδοµάδες µετά την τοποθέτηση (A) καθώς και (B) η συνεισφορά των µεταµοσχευµένων κυττάρων στο επιδιορθωµένο επιθήλιο µε την τεχνική Y FISH (Y-chromosome in situ hybridization). Οι ποσοτικοποιήσεις αυτών των δεδοµένων παρουσιάζονται στα σχήµατα (C) και (D) αντίστοιχα. Τα εικονίδια (B ) αποτελούν µεγεθύνσεις της εικόνας (B) και τονίζουν την ύπαρξη Y θετικών κυττάρων (βέλη) εντός του χορίου όλων των µοσχευµάτων. Η διακεκοµµένη λευκή γραµµή απεικονίζει την χοριο επιδερµιδική συµβολή. Τα πλήρους και µερικού πάχους µοσχεύµατα από τα WT ποντίκια οδήγησαν στη δηµιουργία σχετικά πυκνών και οµοιόµορφων έντριχων επιφανειών δέρµατος, και η ποσοτικοποίηση των επιφανειών δεν 217

218 έδειξε σηµαντικές διαφορές. Παροµοίως, αν και τα µοσχεύµατα από το Sox9 cko δέρµα δεν διέθεταν τρίχες και η επιφάνεια της επιδερµίδας τους ήταν ελαφρώς ρυτιδωµένη, η µέση επιφάνεια των µοσχευµάτων προσέγγιζε αυτή των WT. Η Y-FISH αποκάλυψε ότι η IFE σε όλα τα µοσχεύµατα προερχόταν σχεδόν αποκλειστικά από τους δότες. Όλα τα µοσχεύµατα αυξήθηκαν σε µέγεθος µε την πάροδο του χρόνου, γεγονός που υποδεικνύει την ενδογενή ικανότητά τους για ανάπτυξη και επιδιόρθωση των πληγών. Ενώ όµως τα µερικού πάχους µοσχεύµατα από το cko δέρµα είχαν αρχικά το ίδιο µέγεθος µε τα υπόλοιπα µοσχεύµατα, πάντα εµφάνιζαν σηµαντική συρρίκνωση σε βάθος χρόνου 6 εβδοµάδων και παρουσίαζαν ελαττωµένους αριθµούς (~15%) από Υ θετικά IFE κύτταρα (A και C). Η παρουσία των Υ θετικών κυττάρων του χορίου που βρίσκονται κάτω από την Υ αρνητική επιδερµίδα επιβεβαιώνει την ικανότητα της αρχικής µεταµοσχευτικής διαδικασίας. Τα πειράµατα αυτά αποκάλυψαν ότι τα Sox9 cko τριχοθυλάκια των νεογνών είχαν διαταραχθεί σε µεγάλο βαθµό ως προς την ικανότητα επιδιόρθωσης της τραυµατισµένης IFE. epidermis (Epi), dermis (Der) [Nowak et al., 2008]. Ανεξαρτήτως του γεγονότος ότι η ικανότητα των stem κυττάρων του δέρµατος να αντιδρούν κατά τον τραυµατισµό, αποδεικνύει την ικανότητα ενεργοποίησής τους, τα χαρακτηριστικά του stemness τους φαίνεται πως σχετίζονται µε τις εγγενείς τους ιδιότητες. Όταν τοποθετούνται σε καλλιέργειες, τα bulge κύτταρα από ενήλικα τρωκτικά επιδεικνύουν σηµαντικά υψηλότερο αναπαραγωγικό δυναµικό εν σχέσει µε τα κερατινοκύτταρα που προέρχονται από διαφορετικές τοποθεσίες. Ιδιαίτερα σηµαντικό είναι το γεγονός ότι τα bulge stem κύτταρα από ενήλικες οργανισµούς τα οποία αναπτύσσονται σε καλλιέργειες και κατόπιν µεταµοσχεύονται στη ράχη ανοσοκατεσταλµένων ποντικιών µπορούν να δηµιουργήσουν όχι µόνον σµηγµατογόνους αδένες και τριχοθυλάκια, αλλά επίσης και επιδερµίδα [Blanpain et al., 2004]. Το κατά πόσον η πολυδυναµία των bulge stem κυττάρων ελαττώνεται µε την αύξηση της ηλικίας και εν συνεχεία επανακτάται όταν τα bulge κύτταρα τίθενται σε κατάλληλες καλλιεργητικές συνθήκες και µεταµοσχεύονται σε µια τραυµατισµένη περιοχή, παραµένει ασαφές [Blanpain et al., 2009]. Μηχανισµοί επούλωσης από τα bulge stem κύτταρα Οι ερευνητές εδώ και πολλά χρόνια έχουν παρατηρήσει την τάση που διαθέτουν οι περιοχές που φέρουν τρίχες να επουλώνονται ταχύτερα εν σχέσει µε τις περιοχές που στερούνται τριχών. Οι παρατηρήσεις αυτές υπονοούν ότι η βέλτιστη επούλωση των πληγών, που συµπεριλαµβάνει όπως είδαµε αντίδραση τόσο εκ µέρους της επιδερµίδας, όσο και εκ µέρους του χορίου, εξαρτάται από την ύπαρξη άθικτων 218

219 τριχοθυλακίων. Η ακριβής σχέση αλληλεπίδρασης µεταξύ του τριχοθυλακίου και της επιδερµίδας αρχίζει µόλις να ξεδιπλώνεται, και ακόµα περισσότερες µελέτες είναι απαραίτητες, προκειµένου να διαλευκανθεί ο ρόλος του περιβάλλοντος το τριχοθυλάκιο χορίου κατά την επούλωση [Ito et al., 2008]. Όπως αναφέρθηκε λοιπόν, οι απόγονοι των bulge κυττάρων µεταναστεύουν στην επιδερµίδα µετά από διάφορους τύπους τραυµατισµών [Cotsarelis et al., 2006]. Χρησιµοποιώντας έναν επαγόµενο K-15 υποκινητή προκειµένου να συνδεθεί η Cre recombinase µε τα bulge κύτταρα, οι Ito et al., το 2005 δηµιούργησαν ενήλικα K15CrePR;R26R διαγονιδιακά ποντίκια στα οποία είχε σηµανθεί η bulge περιοχή, και προκάλεσαν τραυµατισµό µε εκτοµή δέρµατος [Ito et al., 2008]. Αυτό ως αναµενόταν προκάλεσε τη µετακίνηση των bulge κυττάρων προς την επιδιορθούµενη επιδερµίδα αλλά, εκτός αυτού, αποκάλυψε πως περισσότερο από το 25% της νεοσυντιθέµενης επιδερµίδας προερχόταν από απογόνους αυτών των κυττάρων. Το ίδιο συνέβαινε µετά από γραµµοειδή διατοµή [Cotsarelis et al., 2006]. Το εντυπωσιακό µολαταύτα είναι πως παρά την παρουσία των κυττάρων που προέρχονται από τη bulge περιοχή στη βασική στιβάδα της επανεπιθηλιωµένης επιδερµίδας, η πλειονότητα αυτών των κυττάρων, όπως είδαµε και νωρίτερα, δεν παρέµεινε στην επιδιορθωµένη περιοχή, αλλά αντί αυτού τα συγκεκριµένα κύτταρα συµπεριφέρθηκαν µάλλον ως transient amplifying κύτταρα και εξαφανίστηκαν µετά από µερικές εβδοµάδες [Ito et al., 2008]. Αυτό υπονοεί πως τα bulge κύτταρα και τα ενδοεπιδερµικά stem κύτταρα έχουν ουσιώδεις διαφορές µεταξύ τους καθώς τα τελευταία είναι περισσότερο ικανά στην δηµιουργία EPUs που θα διατηρηθούν για µεγάλο χρονικό διάστηµα (εικόνα 6.8) [Cotsarelis 2006]. Εικόνα 6.8. Αναπαράσταση της σχέσης µεταξύ των επιδερµιδικών και των bulge stem κυττάρων κατά τη 219

220 φυσιολογική οµοιόσταση και µετά από τραυµατισµό. (a) Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, η επιδερµιδική αναγέννηση βασίζεται στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό που λαµβάνει χώρα εντός των EPUs. Τα bulge stem κύτταρα δε συνεισφέρουν στη φυσιολογική ανανέωση της επιδερµίδας. (b) Μετά από τραυµατισµό πλήρους πάχους, τα bulge κύτταρα παρέχουν κύτταρα στην επιδερµίδα για άµεση σύγκλειση της πληγής (επάνω µπλε βελάκι). Τα bulge κύτταρα απαιτούνται επίσης για την κυκλική λειτουργία του τριχοθυλακίου (κάτω µπλε βελάκι) (c). Με την πάροδο του χρόνου τα προερχόµενα από την bulge περιοχή κύτταρα σταδιακά εξαφανίζονται, ενώ κύτταρα µη προερχόµενα από την περιοχή bulge σταδιακά κάνουν την εµφάνισή τους και αποκτούν την κυριαρχία στο επανεπιθηλιωµένο τραύµα [Cotsarelis 2006]. Πώς συνεισφέρουν τα bulge stem κύτταρα στην επανεπιθηλιοποίηση; Είναι όµως η συνεισφορά του τριχοθυλακίου απαραίτητη για την επούλωση του δέρµατος; Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της έρευνας των Langton et al. το 2008, η συµµετοχή του τριχοθυλακίου είναι ουσιώδης για την ταχεία έναρξη της επανεπιθηλιοποίησης, όχι όµως και για την τελική επούλωση του τραύµατος [Langton et al., 2008]. Αυτό έγινε µέσω χρησιµοποίησης µιας γενετικής µετάλλαξης στον Edaradd που είναι µέλος της σηµατοδοτικής οδού του υποδοχέα της εξωδερµοδυσπλασίνης, µε την οποία εµποδίζεται η ανάπτυξη όλων των εξαρτηµάτων στην ουρά των ποντικών. Οι τραυµατισµοί µε γραµµοειδή διατοµή που προκαλούνταν στο δέρµα της ουράς επουλώνονταν πολύ διαφορετικά στα ποντίκια που στερούνταν τριχοθυλακίων. Πιο συγκεκριµένα, οι πληγές στα ποντίκια αυτά δεν θεραπεύονταν τόσο γρήγορα αρχικά, παρ όλ αυτά, µετά από µία λανθάνουσα περίοδο, οι πληγές αυτές επανεπιθηλιοποιήθηκαν στον ίδιο χρόνο µε αυτές του πληθυσµού control (εικόνα 6.9) [Langton et al., 2008]. 220

221 Εικόνα 6.9. Η επανεπιθηλιοποίηση σε δέρµα που στερείται τριχοθυλακίων εµφανίζει καθυστέρηση κατά την οξεία φάση, αν και ακολουθείται από πλήρη επιδιόρθωση. (a h) Τοµές αιµατοξυλίνης ηωσίνης από τραύµατα πλήρους πάχους που προκλήθηκαν σε Edaradd cr/+ (ετερόζυγα για τη µετάλλαξη) (a d) και Edaradd cr/cr (οµόζυγα για τη µετάλλαξη) (e h) δέρµα ουράς. (a, e) ηµέρα 3, (b, f) ηµέρα 4, (c, g) ηµέρα 6, (d, h) ηµέρα 8 µετά τον τραυµατισµό. Τα βέλη υποδεικνύουν τα τραυµατικά χείλη της επιδερµίδας. (i) Ποσοτικοποίηση του πλάτους των τραυµάτων στα Edaradd cr/cr και Edaradd cr/+ ποντίκια από την τρίτη έως και την όγδοη ηµέρα µετά τον τραυµατισµό. [Langton et al., 2008]. Είναι πιθανόν η µετάλλαξη αυτή να επηρέασε την επούλωση του τραύµατος µέσω µιας ποικιλίας διαφορετικών µηχανισµών. Οι ερευνητές επιβεβαίωσαν το γεγονός ότι τα κύρια χαρακτηριστικά των επιθηλιακών stem κυττάρων, συµπεριλαµβανοµένου του αριθµού των κλωνογόνων κυττάρων καθώς και των κυττάρων που διατηρούν τη σήµανση στην ενδιάµεση των τριχοθυλακίων επιδερµίδα στα ποντίκια που έφεραν τη µετάλλαξη δεν διέφεραν σηµαντικά από αυτά των ποντικών που ανήκαν στον πληθυσµό control. Αυτή η µελέτη µας επέτρεψε να υποθέσουµε ότι οι διαφορές οι οποίες παρατηρούνται στους χρόνους της επούλωσης µπορούν να αποδοθούν στην απουσία τριχοθυλακίων, ωστόσο, παραµένει η πιθανότητα ύπαρξης µη ταυτοποιηµένων µέχρι σήµερα κυτταρικών ή µοριακών διαφορών στο δέρµα των µεταλλαγµένων ποντικιών που θα µπορούσαν είτε να επιβραδύνουν τα πρώιµα βήµατα της επούλωσης, είτε να επιταχύνουν τα τελευταία της στάδια [Ito et al., 2008]. 221

222 Ένα ακόµα σηµείο στο οποίο πρέπει να δοθεί προσοχή, είναι ότι τα τριχοθυλάκια είναι σχετικά αραιά διεσπαρµένα στο δέρµα της ουράς ενός ποντικιού σε σύγκριση µε το δέρµα της πλάτης του. Παρ όλ αυτά, η καθυστέρηση της επιθηλιοποίησης τέσσερις ηµέρες µετά το τραύµα υποδεικνύει ότι το τριχοθυλάκιο όντως συνεισφέρει στη σύγκλειση του τραύµατος. Σε περιοχές µε µεγαλύτερη πυκνότητα τριχοθυλακίων, όπως το δέρµα της πλάτης των ποντικών είναι πιθανόν ότι τα τριχοθυλάκια συνεισφέρουν σε ακόµα µεγαλύτερο βαθµό. Η επέκταση αυτών των συµπερασµάτων στον άνθρωπο είναι δύσκολη, αλλά τα ευρήµατα αυτά υποστηρίζουν την παρατήρηση ότι το τριχωτό της κεφαλής επουλώνεται καλύτερα από άλλες άτριχες περιοχές αν και άλλοι παράγοντες όπως ο υψηλότερος βαθµός αγγείωσης του τριχωτού της κεφαλής θα µπορούσαν επίσης να συνεισφέρουν στην ταχεία επούλωση [Langton et al., 2008, Ito et al., 2008]. Ένα ακόµα ενδιαφέρον εύρηµα είναι ότι ο ρυθµός της επούλωσης του δέρµατος φαίνεται πως σχετίζεται επίσης µε τον κύκλο της τρίχας στα ποντίκια, καθώς έχει αποδειχθεί πως είναι µέγιστος κατά την αναγενή φάση των τριχοθυλακίων [Lau et al., 2009]. Καθώς όµως, όπως είδαµε, το τριχοθυλάκιο διαθέτει διάφορους πληθυσµούς stem κυττάρων, εύλογα γεννήθηκε άµεσα το ερώτηµα του αν όλοι αυτοί οι υποπληθυσµοί συµµετέχουν ισότιµα στην επούλωση, και αν όχι, ποιος είναι αυτός που αναλαµβάνει πρωταγωνιστικό ρόλο. Προηγούµενες εργασίες που χρησιµοποιούσαν ανάλυση ανίχνευσης κυτταρικών σειρών, σε συνδυασµό µε την εργασία του Ito το 2005 παρείχαν πληθώρα πληροφοριών για την συνεισφορά των επιµέρους υποπληθυσµών των τριχοθυλακίων στην επιδιόρθωση της επιδερµίδας. Σε αυτές ήρθε να προστεθεί και η µελέτη των Levy et al. το 2007 που χρησιµοποίησαν έναν Sonic Hedgehog υποκινητή σε ένα παρόµοιο Cre - Lox reporter σύστηµα προκειµένου να σηµάνουν τη µεγάλη πλειονότητα των stem κυττάρων των τριχοθυλακίων. Με αυτό τον τρόπο, διαπίστωσαν την παρουσία απογόνων των stem κυττάρων των τριχοθυλακίων εντός της επιδερµίδας µετά την επανεπιθηλιοποίηση [Levy et al., 2007]. Η µελέτη αυτή προσέθεσε ακόµα περισσότερα στοιχεία στο σύνθετο αυτό ζήτηµα. Ενώ η µακροχρόνια ανίχνευση κυτταρικών σειρών έως τώρα είχε υποδείξει πως η διαµεσολαβούµενη από τα bulge κύτταρα επούλωση του δέρµατος στους ενήλικες οργανισµούς είναι ένα παροδικό φαινόµενο, η µελέτη αυτή ανέδειξε το ενδιαφέρον δεδοµένο πως ανευρέθησαν bulge stem κύτταρα εντός του τριχοθυλακίου νεογνών τα οποία κατέχουν µακρά διάρκεια δράσης όσον αφορά την ιστική επιδιόρθωση (εικόνα 6.10), γεγονός που εγείρει έντονα την υποψία οτι η ικανότητα των bulge stem 222

223 κυττάρων για ιστική επούλωση είναι πιθανόν να µειώνεται µε την πάροδο της ηλικίας. Εν τέλει, είτε µιλάµε για ενήλικες οργανισµούς, είτε όχι, φαίνεται πως τα stem κύτταρα του τριχοθυλακίου διαθέτουν την ικανότητα να επιδιορθώνουν τις βλάβες του δέρµατος και να αποκαθιστούν τις φυσιολογικές συνθήκες οµοιόστασης [Blanpain et al., 2009]. Ο συνδυασµός αυτών των µελετών µας οδηγεί επίσης στο συµπέρασµα πως τα µη - bulge κύτταρα του τριχοθυλακίου που ευρίσκονται είτε στον ανώτερο ισθµό, είτε στο infundibulum, συµπεριφέρονται διαφορετικά από τα bulge κύτταρα και κατέχουν την ικανότητα να δηµιουργούν µόνιµες αποικίες στο δέρµα µετά τον τραυµατισµό [Ito et al., 2008]. Εικόνα Επιδερµιδικοί απόγονοι που προέρχονται από το τριχοθυλάκιο είναι δυνατόν να ανιχνευθούν για µεγάλο χρονικό διάστηµα µετά από τραυµατισµό. (A C) Τοµές δέρµατος 9 εβδοµάδες µετά τον τραυµατισµό. (A) Τοµή της επουλωθείσας πληγής µε χρώση για β γαλακτοσιδάση (µπλε) και το K1 αντίσωµα (καφέ). (B) Μεγαλύτερη µεγέθυνση ενός τµήµατος όπου απεικονίζεται µια οµάδα κυττάρων της βασικής στιβάδας που προέρχεται από το τριχοθυλάκιο. Η χοριο επιδερµιδική συµβολή απεικονίζεται µε τη διακεκοµµένη γραµµή. (C) Μια διαφορετική περιοχή του ίδιου τραύµατος που έχει χρωσθεί µε το K14 αντίσωµα προκειµένου να τονισθεί η βασική στιβάδα. (D) Την 16η εβδοµάδα, η τραυµατική περιοχή έχει συρρικνωθεί και παραµένει καλυµµένη µε Lac-Z θετικά κύτταρα. (E) Εγκάρσια τοµή επουλωµένης πληγής 16 εβδοµάδες µετά τον τραυµατισµό, όπου διακρίνεται η έκταση της σηµασµένης για K14 περιοχής εντός της επιδερµίδας [Levy et al., 2007]. 223

224 Παρ όλ αυτά η περίπτωση του ποντικού µε τη µετάλλαξη Edaradd έρχεται να µας δείξει πως και τα ενδοεπιδερµιδικά stem κύτταρα µπορούν να συνεισφέρουν στην επούλωση τραυµάτων κατά περίσταση, καθώς όπως είδαµε, η ουρά του πειραµατόζωου αυτού στερείται τριχοθυλακίων και παρά ταύτα κατορθώνει έστω και µε αργούς ρυθµούς να επιδιορθώσει τα τραύµατά του [Langton et al., 2008]. Σε περίπτωση σοβαρού τραυµατισµού, τα stem κύτταρα της ενδιάµεσης των τριχοθυλακίων επιδερµίδας µπορούν ακόµα και να αναγεννήσουν τα τριχοθυλάκια, γεγονός που οδηγεί στην άποψη πως τα ενδοεπιδερµικά και τα stem κύτταρα του τριχοθυλακίου έχουν πολλές κοινές ιδιότητες που χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης [Fuchs 2009]. ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΑ STEM ΚΥΤΤΑΡΑ ΚΑΙ ΕΠΟΥΛΩΣΗ Όπως αναφέρθηκε και νωρίτερα, τα κύτταρα τα οποία προέρχονται από τον µυελό των οστών (BM) αποτελούν ένα διόλου αµελητέο ποσοστό των κυττάρων του δέρµατος. Είναι γνωστό προ πολλού πως τα προερχόµενα από τον µυελό των οστών κύτταρα του δέρµατος συµµετέχουν στις φλεγµονώδεις διαδικασίες και κατ επέκταση στη άµυνα του δέρµατος και την επούλωση στα σηµεία τραυµατισµού του. Επιπροσθέτως αυτού του δεδοµένου όµως, µια σειρά πρόσφατων µελετών έρχεται να αποδείξει πως ο µυελός των οστών δε συµµετέχει µόνον στην παραγωγή αυτών των φλεγµονωδών κυττάρων, αλλά στην παραγωγή ακόµα και κερατινοκυττάρων και κυττάρων που προσοµοιάζουν µε ινοβλάστες στο δέρµα. Παροµοίως µε τη µετακίνηση των λευκοκυττάρων προς τους τραυµατισµένους ιστούς, τα προερχόµενα από τον µυελό των οστών προγονικά κύτταρα µετακινούνται προς το σηµείο της βλάβης και συµµετέχουν στην επιδιόρθωση και αναγέννηση του δέρµατος. Πέραν τούτου, τα αναπτυγµένα σε καλλιέργεια µεσεγχυµατικά stem κύτταρα που προέρχονται από το µυελό των οστών (BM-MSCs) έχει αποδειχθεί πως προωθούν την επούλωση των διαβητικών ελκών, γεγονός που υποδεικνύει το σηµαντικό δυναµικό για χρησιµοποίησή τους και σε βλάβες του δέρµατος που χαρακτηρίζονται από χρονιότητα όπως είναι οι χρόνιες µη επουλωθείσες πληγές και τα εγκαύµατα [Wu et al., 2010]. 224

225 Πιθανοί τρόποι δράσης Αµέσως µετά τον τραυµατισµό του δέρµατος και το σχηµατισµό του πρωτογενούς θρόµβου, όπως είδαµε και νωρίτερα, πληθώρα κυττάρων φλεγµονής τα οποία προέρχονται από το µυελό των οστών (όπως κοκκιοκύτταρα και µονοκύτταρα), µετακινούνται στην περιοχή του τραυµατισµού προκειµένου να ξεκινήσει η διαδικασία της επούλωσης. Η πλειονότητα των φλεγµονωδών αυτών κυττάρων είτε υφίσταται απόπτωση µετά το πέρας της δράσης τους είτε µετακινείται πάλι προς την κυκλοφορία του αίµατος όταν το προερχόµενο από το σηµείο του τραυµατισµού χηµειοτακτικό ερέθισµα πάψει να επιδρά πάνω τους. Ένας υποπληθυσµός των προερχόµενων από τον µυελό των οστών κυττάρων ενσωµατώνεται εντός της επουλωθείσας πληγής και τα κύτταρά του δρουν ως αντιγονοπαρουσιαστικά δενδριτικά κύτταρα, τα οποία συχνά αναφέρονται ως SΑLΤ (skin - associated lymphoid tissue) κύτταρα και ινοκύτταρα. Η προέλευση των κυττάρων αυτών από τον µυελό των οστών τεκµηριώνεται από την έκφραση του δείκτη επιφανείας CD45 [Cha et al., 2007]. Στο φυσιολογικό δέρµα, αυτά τα προερχόµενα από τον µυελό των οστών κύτταρα επιτυγχάνουν σταθερή παρουσία εντός του δέρµατος και είναι υπεύθυνα για την παραγωγή του κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ. Το κολλαγόνο τύπου Ι είναι αυτό που κυριαρχεί στο φυσιολογικό, µη τραυµατισµένο δέρµα και η αναλογία της ποσότητάς του έναντι αυτής του κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ ισοδυναµεί όπως είδαµε µε 4 προς 1. Κατά τη διάρκεια της επούλωσης ο λόγος αυτός ελαττώνεται στο 2 προς 1 εξαιτίας µιας πρώιµης αύξησης της εναπόθεσης του κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ. Οι Fathke et al απέδειξαν ότι τα κύτταρα που προέρχονται από τον µυελό των οστών διαθέτουν την ικανότητα να προκαλούν τη συστολή του αποτελούµενου από κολλαγόνο στρώµατος και να εκφράζουν τα κολλαγόνα τύπου I και III, ενώ τα αυτόχθονα κύτταρα συνέχιζαν την παραγωγή αποκλειστικά κολλαγόνου τύπου Ι [Fathke et al., 2004]. Η συµµετοχή του µυελού των οστών Πιο συγκεκριµένα, η ερευνητική αυτή οµάδα χρησιµοποίησε ένα χιµαιρικό µοντέλο ποντικού, στο οποίο από ένα διαγονιδιακό που έφερε ενισχυµένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (EGFP) στο µυελό των οστών, ο µυελός αφαιρέθηκε και µεταµοσχεύθηκε σε φυσιολογικό C57BL ποντίκι. Βρέθηκε λοιπόν πως EGFP - θετικά κύτταρα που προέρχονταν από το µυελό των οστών ήταν δυνατόν να ανευρεθούν στο 225

226 φυσιολογικό δέρµα και, µάλιστα, συµµετείχαν ενεργά και στις διαδικασίες της επούλωσης [Wu et al., 2010]. Βρέθηκε, δηλαδή, πως το δέρµα αποτελεί όργανο στόχο, τόσο για τα αιµοποιητικά, όσο και για τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα του µυελού και πως η συµµετοχή του µυελού των οστών κατά την επούλωση ήταν πολύ µεγαλύτερη από την αρχικά υπολογιζόµενη, καθώς 15 % 20 % των ατρακτόµορφων ινοβλαστών του χορίου στο µη τραυµατισµένο φυσιολογικό δέρµα βρέθηκε πως ήταν θετικά για την EGFP, είχαν δηλαδή προέλευση από το µυελό των οστών, και περισσότερο από τα δύο τρίτα των κυττάρων αυτών ήταν επίσης αρνητικά για το CD45, γεγονός που υποδεικνύει ότι επρόκειτο για µη αιµοποιητικά κύτταρα [Wu et al., 2010, Fathke et al., 2004]. Εν συνόλω, τα αποτελέσµατα των πειραµάτων τους ήταν ενδεικτικά του γεγονότος ότι η επούλωση των τραυµάτων συµπεριλαµβάνει τη συµµετοχή αυτοχθόνων κυττάρων του δέρµατος για την αποκατάσταση της επιδερµίδας, αλλά επίσης τη συµµετοχή κυττάρων προερχόµενων από το µυελό των οστών καθώς και των παρακείµενων µεσεγχυµατικών κυττάρων για την αποκατάσταση του πληθυσµού των ινοβλαστών του δέρµατος (εικόνα 6.11) [Fathke et al., 2004]. Εικόνα (A) Συγκεντρωτικό γράφηµα από δεδοµένα κυτταροµετρίας ροής σε ποντίκι control, που περιλαµβάνει φυσιολογικό δέρµα (ηµέρα 0) καθώς και κατά τη διάρκεια της επούλωσης. Ο κάθετος άξονας αναπαριστά το ποσοστό των κυττάρων που σηµαίνεται µε τα αντίστοιχα αντισώµατα. (B) συγκεντρωτικό γράφηµα από δεδοµένα κυτταροµετρίας ροής σε χιµαιρικό ποντίκι που εκφράζει την EGFP. Τα ποσοστά κάθε κυτταρικού πληθυσµού στον πληθυσµό control και τον πειραµατικό πληθυσµό είναι παρόµοια, µολαταύτα, τα προερχόµενα από το µυελό των οστών κύτταρα παραµένουν στην επουλωθείσα πληγή όπου αποτελούν περισσότερο από το 15% όλων των κυττάρων (ηµέρα 28). Στη 226

227 φθορίζουσα µικροσκοπία, τα EGFP+ κύτταρα ήταν ορατά στο υπό επούλωση χόριο την 14η (C) και 21η (D) ηµέρα µετά τον τραυµατισµό. (E) Τα EGFP+ κύτταρα παρέµειναν στο χόριο κατά τη φάση επαναδιαµόρφωσης, όπως φαίνεται εδώ, κατά την 42η ηµέρα από τον τραυµατισµό. Ας σηµειωθεί η οµοιότητα των EGFP+ κυττάρων µε τους ινοβλάστες. (F) Μικρό αγγείο βαθιά µέσα στο τραύµα δείχνει EGFP+ κύτταρα που µπορεί να είναι είτε ενδοθηλιακά κύτταρα, είτε περικύτταρα. EGFP, enhanced green fluorescent protein [Fathke et al., 2004]. Σε συµφωνία µε τα προαναφερθέντα ευρήµατα, σε µια άλλη µελέτη όπου χρησιµοποιήθηκε ένα παρόµοιο µοντέλο ποντικιού, τα προερχόµενα από το µυελό των οστών κύτταρα που εξέφραζαν την GFP πρωτεΐνη αποτελούσαν το 8.7 % του συνολικού αριθµού των κυττάρων που προσοµοίαζαν µε ινοβλάστες στο φυσιολογικό δέρµα, ενώ το ποσοστό αυτών των GFP θετικών κυττάρων αυξανόταν αξιοσηµείωτα στις ινωτικές αλλοιώσεις που προκαλούνταν από εµφύτευση καρκινικών κυττάρων (59.7 % ± 16.3 %) ή µετά από τραυµατισµό (32.2 % ± 4.8 %). Η ανάλυση µε ανοσοφθορισµό έδειξε ότι αυτά τα GFP θετικά ατρακτόµορφα κύτταρα που προέρχονταν από το µυελό των οστών εξέφραζαν κολλαγόνο τύπου I, και µόνο περίπου το 50 % αυτών ήταν επίσης θετικό και για το αντιγόνο CD45 (εικόνες 6.12 και 6.13) [Ishii et al., 2005]. Εικόνα Μικροσκοπική εµφάνιση του δέρµατος µετά τη µεταµόσχευση του µυελού των οστών. Το εικονίδιο Β αποτελεί µεγέθυνση της περιγεγραµµένης περιοχής του εικονιδίου Α, ενώ το εικονίδιο C αποτελεί serial section του εικονιδίου B. Τα βέλη υποδεικνύουν τις GFP+ ινοβλάστες [Ishii et al., 2005]. Συνδυάζοντας τα αποτελέσµατα, αυτές οι µελέτες δείχνουν πως τα µισά κατά προσέγγιση από τα προερχόµενα από τον µυελό των οστών κύτταρα του δέρµατος που έχουν µορφολογία ινοβλάστης, ανήκουν σε µη αιµοποιητικές κυτταρικές σειρές. Το εύρηµα αυτό έχει βελτιώσει σηµαντικά την κατανόησή µας όσον αφορά τη συνεισφορά του µυελού των οστών στη φυσιολογία του δέρµατος, καθώς και τις 227

228 παθολογικές του διεργασίες, και έχει βοηθήσει στη διάνοιξη νέων οδών µελέτης των µηχανισµών της οµοιόστασης του δέρµατος καθώς και των διεργασιών της επούλωσής του [Wu et al., 2010]. Εικόνα Κοινός εντοπισµός της GFP πρωτεΐνης και του κολλαγόνου τύπου Ι σε τραύµα του δέρµατος (αριστερά) και σε µη τραυµατισµένο δέρµα (δεξιά). Στα επάνω αριστερά εικονίδια διακρίνεται ο φθορισµός της GFP. Στα επάνω δεξιά εικονίδια απεικονίζονται κύτταρα που έχουν χρωσθεί ανοσοϊστοχηµικά µε αντίσωµα έναντι του κολλαγόνου τύπου Ι στην ίδια περιοχή. Τα κάτω αριστερά εικονίδια δείχνουν κύτταρα που έχουν χρωσθεί µε DRAQ5 για την διάκριση των εµπύρηνων κυττάρων, ενώ τα κάτω δεξιά εικονίδια αποτελούν τη σύνθεση των υπολοίπων τριών εικονιδίων [Ishii et al., 2005]. Τα MSCs συµµετέχουν στη δοµική αποκατάσταση της αρχιτεκτονικής του δέρµατος Στους ανθρώπους µετά τη γέννηση, η ιστική βλάβη που αφορά τόσο το δέρµα όσο και άλλους ιστούς θεραπεύεται, όπως προαναφέρθηκε, όχι µε την αναγέννηση του ιστού, αλλά µε τη δηµιουργία ουλώδους ιστού. Τα κατεστραµµένα επιδερµιδικά εξαρτήµατα στην περιοχή της βλάβης δεν αναδηµιουργούνται. Παρ όλ αυτά σε προηγούµενη µελέτη των Wu et al., η ενδοφλέβια έγχυση Flk1-θετικών BM-MSCs που προέρχονταν από Balb/C επίµυες (µε λευκό τρίχωµα) για αιµατολογική αποκατάσταση σε θηλυκά C57BL ποντίκια (µε µαύρο τρίχωµα) που είχαν δεχθεί θανατηφόρα δόση ακτινοβολίας, οι δέκτες σταδιακά ανέπτυξαν λευκό τρίχωµα. Η ανοσοϊστοχηµική ανάλυση των περιοχών του δέρµατος στις οποίες είχε αναπτυχθεί 228

229 το λευκό τρίχωµα έδειξε πως τα τριχοθυλάκια των λευκών τριχών περιείχαν κύτταρα τα οποία προέρχονταν από τα MSCs του δότη, γεγονός που υποδεικνύει ότι τα BM- MSCs συµµετέχουν σηµαντικά ακόµα και στην αναγέννηση λειτουργικών τριχοθυλακίων. Παρά το γεγονός ότι η ακτινοβόληση του δέρµατος είχε ως αποτέλεσµα τον κυτταρικό θάνατο, ο δοµικός «σκελετός» του δέρµατος παρέµενε και χρησίµευε ως εκµαγείο πάνω στο οποίο συντελείται η αναγέννηση του δέρµατος [Wu et al., 2010]. Τι συµβαίνει όµως στις περιπτώσεις όπου εκτός από καταστροφή των κυττάρων έχουµε και καταστροφή του εκµαγείου αυτού όπως συµβαίνει σε κάποια τραύµατα; Αυτή η περίπτωση έχει εξετασθεί στις παρακάτω µελέτες. Όταν ένα µίγµα από κύτταρα του µυελού των οστών ενήλικων ζώων και εµβρυϊκά κύτταρα δέρµατος εφαρµόσθηκε σε πρόσφατο τραύµα εντός ειδικού θαλάµου που είχε προκληθεί σε nude ποντίκια, παρατηρήθηκε η εκβλάστηση τριχών στην τραυµατισµένη περιοχή, και ένας σηµαντικός αριθµός από κύτταρα που προέρχονταν από το µυελό των οστών του δότη ήταν δυνατόν να ανιχνευθεί εντός της επιδερµίδας, των τριχοθυλακίων και των σµηγµατογόνων αδένων, ενώ παρατηρήθηκε και η δηµιουργία δενδριτικών και ενδοθηλιακών κυττάρων εντός τριών εβδοµάδων µετά τη µεταµόσχευση (εικόνα 6.14). Όµως, όταν τα προερχόµενα από το µυελό των οστών κύτταρα µεταµοσχεύθηκαν µόνα τους στην επιφάνεια της πληγής εντός του θαλάµου, δεν παρατηρήθηκε επιδιόρθωση του δέρµατος [Kataoka et al., 2003]. Εικόνα Αποκατάσταση δέρµατος µε τη χρήση θαλάµου σιλικόνης. Κύτταρα από την επιδερµίδα και το χόριο εµβρυϊκού δέρµατος µαζί µε κύτταρα του µυελού των οστών από ενήλικα ζώα 229

230 (Α) µεταµοσχεύθηκαν σε προκλητά τραύµατα σε nude ποντίκια εντός θαλάµων σιλικόνης (Β) (αριστερά). Το αποτέλεσµα ήταν η αποκατάσταση του δέρµατος και η δηµιουργία τριχών όπως φαίνεται δεξιά (Α). Σε ιστολογική τοµή του νεοσχηµατισθέντος δέρµατος (Β) είναι εµφανής η δηµιουργία τριχοθυλακίων και σµηγµατογόνων αδένων [Kataoka et al., 2003]. Παρ όλ αυτά, όταν οι Wu et al. µεταµόσχευσαν BM-MSCs σε γέλη πάνω σε τραύµατα µε εκτοµή δέρµατος εκτός του θαλάµου, αδενοειδείς δοµές µε µορφή εξαρτηµάτων που αποτελούνταν σε µεγάλο βαθµό από κύτταρα που προέρχονταν από τα BM-MSCs εµφανίστηκαν στην υπό επούλωση πληγή. Αυτά τα αποτελέσµατα υποδεικνύουν πως τα BM-MSCs απαιτούν τη συνύπαρξη κυττάρων του δέρµατος και πιθανόν και κάποιων µορίων που απελευθερώνονται από αυτά προκειµένου να διαφοροποιηθούν και να συντελέσουν στην αναδηµιουργία του δέρµατος [Wu et al., 2010]. Αυτά τα συµπεράσµατα υποστηρίζονται περαιτέρω και από ex vivo µελέτες. Η καλλιέργεια κερατινοκυττάρων που έχουν υποστεί βλάβη από ακτινοβολία µαζί µε BM - MSCs οδήγησε στη σηµαντική αύξηση της έκφρασης των επιθηλιακών δεικτών κυτταροκερατίνης στα BM - MSCs, εν σχέσει µε άλλες καλλιέργειες των BM-MSCs µαζί µε µη τραυµατισµένα κερατινοκύτταρα [Wu et al., 2007]. Επιπλέον, το crosstalk µεταξύ των BM - MSCs και του κερατινοκυττάρου φαίνεται να είναι απαραίτητο για την δοµική οργάνωση της επιδερµίδας. Στην µελέτη των Aoki et al., όπου τα κερατινοκύτταρα τοποθετήθηκαν στην επιφάνεια γέλης κολλαγόνου που περιείχε BM-MSCs, προλιποκύτταρα του υποδόριου ιστού ή ινοβλάστες του χορίου, ενώ και οι τρεις κυτταρικοί τύποι προωθούσαν την επιβίωση των κερατινοκυττάρων, µόνον τα BM-MSCs οδηγούσαν στη δηµιουργία µιας δοµής που προσοµοίαζε µε θηλές στην επιδερµίδα, η οποία επεκτεινόταν βαθύτερα (προσοµοίαζε µε τη δοµή του χορίου) και σχηµάτιζε αδενοειδείς δοµές (εικόνα 6.15) [Aoki et al., 2004]. 230

231 Εικόνα Μεσεγχυµατικά κύτταρα προερχόµενα από τον µυελό των οστών (BM - MSCs) στην αναγέννηση του δέρµατος. Κερατινοκύτταρα τα οποία επιστρώθηκαν πάνω σε γέλη κολλαγόνου που περιείχε προερχόµενα από το µυελό των οστών µεσεγχυµατικά stem κύτταρα σχηµάτισαν δοµή που προσοµοίαζε µε θηλές, ενώ τα κερατινοκύτταρα τα οποία επιστρώθηκαν πάνω σε γέλη κολλαγόνου η στην οποία εµπεριέχονταν ινοβλάστες ή προλιποκύτταρα δεν επέδειξαν τέτοιου είδους δραστηριότητα αν και παρατηρήθηκε στιβαδοποίηση της επιδερµίδας. Σε αντίθεση, τα κερατινοκύτταρα που στερούνταν πλήρως της µεσεγχυµατικής υποστήριξης, δεν κατάφεραν καν να στιβαδοποιηθούν και σχηµάτισαν µόνο µια λεπτή στιβάδα επιδερµίδας [Aoki et al., 2004]. Ο σχηµατισµός παρόµοιων αδενοειδών σχηµατισµών παρατηρήθηκε επίσης στις in vivo µελέτες επούλωσης των Wu et al. το 2007 όπου κάποιες από τις δοµές σχηµατίσθηκαν από κύτταρα που προέρχονταν από τα µεταµοσχευθέντα BM - MSCs, που προσοµοίαζαν µε αναπτυσσόµενους ιδρωτοποιούς ή σµηγµατογόνους αδένες (εικόνα 6.16), ωστόσο, οι δοµές αυτές εξαφανίζονταν παράλληλα µε την πλήρη ολοκλήρωση της επούλωσης [Wu et al., 2007]. Εκτός αυτού, σε µελέτη των Borue et al., βρέθηκε πως επιθηλιακά κύτταρα που προέρχονταν από ενδογενή κύτταρα του µυελού των οστών έκαναν την εµφάνισή τους παροδικά κατά τη διάρκεια της επούλωσης στο δέρµα [Borue et al., 2004]. Αυτά τα δεδοµένα υποστηρίζουν πως ο µυελός των οστών µπορεί να µην παρέχει µακροπρόθεσµα αυτοανανεούµενα stem κύτταρα ως πηγή κερατινοκυττάρων για το δέρµα. Είναι ιδιαίτερα σηµαντικό όµως το γεγονός ότι αυτές οι παροδικές δοµές που σχηµατίζονται από κερατινοκύτταρα τα οποία διαντιδρούν µε τα προερχόµενα από 231

232 το µυελό των οστών µεσεγχυµατικά stem κύτταρα φαίνεται να λειτουργούν ως ένα µεταβατικό στάδιο για τη δηµιουργία ενδογενών µόνιµων δοµών του δέρµατος και κατά συνέπεια ο ρόλος τους στην αναγέννηση του δέρµατος είναι ιδιαίτερα σηµαίνων [Aoki et al., 2004]. Εικόνα ιαφοροποίηση των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων προς σχηµατισµό εξαρτηµάτων του δέρµατος. BM-MSCs (πράσινο) από ποντίκια που εξέφραζαν την πρωτεΐνη GFP εγχύθηκαν περιφερικά του τραύµατος και εφαρµόστηκαν επί της τραυµατικής επιφάνειας µε τη χρήση της ουσίας Matrigel σε Balb/C ποντίκια. Την έβδοµη ηµέρα, κάποια από τα GFP+ µεσεγχυµατικά stem κύτταρα εξέφρασαν δείκτες κυτταροκερατίνης των κερατινοκυττάρων (κόκκινο) και σχηµάτισαν δοµές που προσοµοίαζαν µε πρώιµους ιδρωτοποιούς ή σµηγµατογόνους αδένες στο χόριο (αριστερά), και οι δοµές αυτές έγιναν πιο ώριµες 14 ηµέρες µετά τον τραυµατισµό [Wu et al., 2007]. Τύχη των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων στα τραύµατα Η µακροπρόθεσµη κατάληξη των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων στα τραύµατα δεν είναι πλήρως διευκρινισµένη. Προσφάτως, οι Falanga et al., οι οποίοι χρησιµοποιώντας MSCs που καλλιεργήθηκαν από αυτόλογο µυελό των οστών τα εφάρµοσαν τόσο σε οξείες πληγές όσο και σε χρόνιες που δεν κατόρθωναν να επουλωθούν µε τη χρήση ενός εξειδικευµένου συστήµατος ψεκασµού, ανέφεραν ότι όλα τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα που εναποτέθηκαν στα τραυµατισµένα σηµεία δέρµατος επίµυων εξήλθαν των τραυµάτων πριν την ολοκλήρωση της διαδικασίας της επούλωσης [Cha et al., 2004, Falanga et al., 2007]. 232

233 Σε µελέτη επίσης των Chen et al. χρησιµοποιήθηκαν GFP+ BM-MSCs ή GFP+ ινοβλάστες του χορίου που προέρχονταν από C57BL/6-GFP ποντίκια τα οποία µεταµοσχεύθηκαν επάνω σε τραύµατα σε Balb/C ή C57BL/6 ποντίκια (εικόνα 6.17). Φάνηκε λοιπόν πως, πλην του γεγονότος ότι τα τραύµατα στα οποία χορηγήθηκαν BM MSCs επουλώνονταν πολύ ταχύτερα εν σχέσει µε αυτά τα οποία χορηγήθηκαν ινοβλάστες, οι αριθµοί των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων και στους δύο τύπους µεταµόσχευσης µειώνονταν µε παρόµοιο ρυθµό παράλληλα µε τη διαδικασία της επούλωσης, ενώ οι αριθµοί των ινοβλαστών παρουσίαζαν επίσης ελάττωση. Σύµφωνα µε τα δεδοµένα της µελέτης, η ελάττωση αυτή στον αριθµό των µεταµοσχευθέντων MSCs είναι πιθανό να προκαλείται από τις αλλαγές που παρατηρούνται στο µικροπεριβάλλον κατά την επούλωση και όχι σε ανοσιακές αντιδράσεις έναντι των κυττάρων αυτών. Αυτό αποδίδεται στο γεγονός πως κατά τη διεργασία της επούλωσης, ένα φάσµα κυτταροκινών και µορίων της εξωκυττάριας ουσίας που δρουν ευοδωτικά ως προς την επιβίωση των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων στο νέο οργανισµό, εξαφανίζονται [Chen et al., 2009]. Εικόνα Η ενσωµάτωση των µεταµοσχευθέντων BM MSCs και ινοβλαστών στο τραυµατισµένο δέρµα. Επάνω: τα κύτταρα που ήταν προς µεταµόσχευση έφεραν σήµανση µε την πρωτεΐνη GFP. Η µεταµόσχευση έγινε τόσο µεταξύ ποντικών του ιδίου είδους, όσο και µεταξύ ποντικών που ανήκαν σε διαφορετικά είδη. Κάτω: λαµβάνοντας τα αρχικά µεταµοσχευθέντα κύτταρα ως το 100%, απεικονίζονται τα ποσοστά των ενσωµατωµένων BM - MSCs και ινοβλαστών σε διαφορετικούς χρόνους µετά τη µεταµόσχευση. *P,0.001 [Chen et al., 2009]. 233

234 Αντιθέτως, οι Yamaguichi et al., διεπίστωσαν ότι τα τοπικά εφαρµοσµένα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα διαφοροποιούνταν προς µυοϊνοβλάστες σε τραύµατα δέρµατος περιτονίας αρουραίων. Η διαφοροποίηση των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων προς ινοβλάστες είναι δύσκολο να αποδειχθεί καθώς οι δύο αυτοί κυτταρικοί τύποι µοιράζονται κοινούς δείκτες επιφανείας. Μολαταύτα, η µελέτη των Lee et al. το 2010, απέδειξε ότι υπότυποι κλωνοποιηµένων MSCs έχουν την ικανότητα να αποκτούν χαρακτηριστικά ινοβλαστών όταν βρεθούν υπό την επίδραση συγκεκριµένων αυξητικών παραγόντων του συνδετικού ιστού. Τα κύτταρα αυτά δεν εκφράζουν την a-sma εκτός και αν διεγερθούν περαιτέρω µε τον παράγοντα TGFb-1 (εικόνα 6.18)[Sorrell et al., 2010, Lee et al., 2010]. Εικόνα ιαφοροποίηση των προερχόµενων από µεσεγχυµατικά κύτταρα ινοβλαστικών κυττάρων προς µυοϊνοβλάστες µετά από την χορήγηση του TGF-β1. (A D) MSCs (A) ή ινοβλάστες προερχόµενες από MSCs µετά την εφαρµογή του CTGF (connective tissue growth factor ή CCN2) (C) εξέφραζαν µικρές ποσότητες α-sma. Μετά τη χορήγηση του TGF-β1, τα MSCs εξακολουθούσαν κα εκφράζουν χαµηλά επίπεδα της α-sma (B), αλλά οι ινοβλάστες ξεκίνησαν να εκφράζουν θετικά για α-sma µικροϊνίδια (D). (E H) Η κυτταροµετρία ροής επιβεβαίωσε την απουσία έκφρασης της α - SMA εκ µέρους των MSCs (E) και των προερχόµενων εξ αυτών ινοβλαστών (G). Σε αντίθεση, το 31.9 % των προερχόµενων από MSCs ινοβλαστών (H), αλλά µόνον το 1.8 % των MSCs (F), 234

235 απέκτησε έναν α SMA+ φαινότυπο µετά από διέγερση µε TGF-β1. (I L) Η µελέτη της συστολής γέλης κολλαγόνου έδειξε ότι τα MSCs στα οποία χορηγήθηκε τακτικά ο CTGF (4 εβδοµάδες) και ο TGF-β1 (1 εβδοµάδα) προκάλεσαν την πιο ισχυρή συστολή (I), εν σχέσει µε την µέτριας έντασης συστολή µετά από διέγερση των MSCs µόνο µε CTGF (J) ή TGF - β1 (K). Τα MSCs στα οποία δεν χορηγήθηκε ούτε CTGF ούτε TGF-β1 προκάλεσαν την ασθενέστερη συστολή (L). (M) Ποσοτικοποίηση των αποτελεσµάτων από την µελέτη της συστολής της γέλης κολλαγόνου [Lee et al., 2010]. Μηχανισµοί λειτουργίας των MSCs στην επούλωση του δέρµατος Οι κύριοι µηχανισµοί µέσω των οποίων τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα κατορθώνουν να επιδράσουν στην επούλωση των πληγών του δέρµατος είναι: (α) µέσω παρακρινούς επικοινωνίας µε τα αυτόχθονα στο σηµείο του τραύµατος κύτταρα, καθώς και µε τα διηθούµενα κύτταρα φλεγµονής και τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, (β) µέσω διαφοροποίησης τους προς αυτόχθονα κύτταρα του δέρµατος, ή (γ) και µε τους δύο µηχανισµούς που προαναφέρθηκαν. Εάν η παρακρινής τους δραστηριότητα είναι και η κυριότερη κατά τη διάρκεια της επούλωσης, τότε η παρουσία τους στα σηµεία τραυµατισµού θα αναµενόταν να είναι και παροδική. Μολαταύτα, εάν ισχύει το αντίθετο, δηλαδή εάν η διαφοροποίηση των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων προς δοµικά κύτταρα του ιστού (παραδείγµατος χάριν ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων, περικύτταρα κ.λπ.) υπερτερεί, η παρουσία τους εντός του δέρµατος θα αναµενόταν να είναι µακροχρόνια [Sorrell et al., 2010]. Τα δεδοµένα πάνω σε αυτό το ζήτηµα έως σήµερα παραµένουν αµφιλεγόµενα. Επί παραδείγµατι, η οµάδα των Falanga και των συνεργατών του που όπως είδαµε νωρίτερα στα πειράµατά της ενσωµάτωσε αυτόλογα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα σε ένα διάλυµα ινικής το οποίο εν συνεχεία χρησιµοποιήθηκε στην επιφάνεια τραυµάτων σε ποντικούς, ανακάλυψε πως η πλειονότητα των MSCs που εναποτέθηκαν σε τραύµατα στα πειράµατά τους, είχε εξαφανισθεί από το σηµείο του τραυµατισµού έως την 25 η ηµέρα από τον τραυµατισµό [Falanga et al., 2007]. Σε αντίθεση, σε πρόσφατη µελέτη των Wang et al. όπου χρησιµοποιήθηκε ένα πειραµατικό µοντέλο εµφράγµατος του µυοκαρδίου, η έγχυση µεσεγχυµατικών stem στην περικαρδιακή περιοχή αποκάλυψε την παραµονή της επιτόπιας παρουσίας τους για χρονικό διάστηµα που έφτανε το ένα έτος. Αυτές οι αποκλίσεις των πειραµατικών αποτελεσµάτων ενδέχεται να οφείλονται σε µεγάλο βαθµό στη µέθοδο της σήµανσης 235

236 των κυττάρων ή στο µεγάλο βαθµό ετερογένειας που χαρακτηρίζει αυτά τα κύτταρα [Sorrell et al., 2010, Wang et al., 2010]. Παρακρινείς παράγοντες των MSCs στην αναγέννηση και επιδιόρθωση του δέρµατος Καθώς τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα αποτελούν κύτταρα του στρώµατος του µυελού των οστών και είναι γνωστό πως προωθούν την επιβίωση, ανάπτυξη και διαφοροποίηση των αιµοποιητικών stem κυττάρων µέσω παροχής εκ µέρους τους παρακρινών παραγόντων και µορίων της εξωκυττάριας ουσίας, θεωρήθηκε πιθανό επίσης ότι τα MSCs τα οποία εδρεύουν εντός του δέρµατος να επιδεικνύουν ανάλογες λειτουργίες όσον αφορά τη διατήρηση της δοµικής και λειτουργικής ακεραιότητας του δέρµατος. Μια ποικιλία µελετών έχουν αποδείξει ότι τα προερχόµενα από τον µυελό των οστών µεσεγχυµατικά stem κύτταρα εκκρίνουν µια ποικιλία κυτταροκινών. Σε µια µελέτη ΑΒΒΡΑ (antibody - based protein array analysis) 79 ανθρώπινων κυτταροκινών στις οποίες συµπεριλαµβάνονταν αυξητικοί παράγοντες και χηµειοκίνες, βρέθηκε πως το µέσον στο οποίο είχαν εφαρµοστεί τα BM MSCs, αντιδρούσε στη µεγάλη πλειονότητα εξ αυτών [Wu et al., 2010]. Η βέλτιστη επούλωση ενός τραύµατος προϋποθέτει µια άρτια ενορχηστρωµένη διεκπεραίωση πολλαπλών µοριακών συµβαµάτων που διαµεσολαβούνται από κυτταροκίνες. Καθώς οι ινοβλάστες είναι ένας από τους κυριότερους κυτταρικούς πληθυσµούς του δέρµατος και διαθέτουν την ικανότητα έκκρισης ποικιλίας µορίων τα οποία συµµετέχουν στην οµοιόσταση και την επιδιόρθωση του δέρµατος, είναι ιδιαίτερης σηµασίας να κατανοηθεί ποιοί ακριβώς είναι οι διακριτοί ρόλοι των παρακρινών παραγόντων που εκκρίνονται από τα BM - MSCs εν σχέσει µε αυτούς που παράγονται από τους ινοβλάστες. Σε µία συγκριτική ανάλυση στην οποία εξετάσθηκαν εν συνόλω 81 κυτταροκίνες, βρέθηκε πως οι 31 εξ αυτών εκφράζονταν και στα BM - MSCs (εικόνα 6.19), και µάλιστα, τα BM - MSCs είχαν την ικανότητα έκκρισης σηµαντικά µεγαλύτερων ποσοτήτων από διάφορους αυξητικούς παράγοντες που είναι γνωστό πως ενισχύουν την επούλωση [Martin 1997, Singer et al., 1999]. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει δε η έκφραση του IGF-1 (insulin - like growth factor-1) καθώς αποτελεί έναν παράγοντα ο οποίος είναι γνωστό ότι διαδραµατίζει σηµαίνοντα ρόλο στην επούλωση και αναγέννηση διαφόρων ιστών, και η έκφρασή του από τα BM - MSCs είναι ιδιαίτερα υψηλή, κάτι που υπονοεί πως συµµετέχει ενεργά και στην επούλωση του δέρµατος. Εν συνόλω, το προφίλ 236

237 έκφρασης κυτταροκινών εκ µέρους των BM - MSCs υποδεικνύει ότι τα κύτταρα αυτά εκκρίνουν υψηλότερα επίπεδα κυτταροκινών οι οποίες είναι γνωστό πως δρουν ευοδωτικά για την επούλωση ενώ ταυτόχρονα οι ινοβλάστες του δέρµατος παράγουν µεγαλύτερα ποσά κυτταροκινών που ενισχύουν τη φλεγµονώδη διαδικασία, όπως είναι η IL-6. Θεωρείται ιδιαίτερα πιθανόν, οι υψηλότεροι αριθµοί κυκλοφορούντων και ιστικών µεσεγχυµατικών stem κυττάρων που ανευρίσκονται στα νεογνά να αποτελούν το λόγο που στα νεογνά παρατηρείται πολύ υψηλότερος βαθµός αναγέννησης µετά τον τραυµατισµό εν σχέσει µε τους ενήλικες οργανισµούς [Wu et al., 2010]. Εικόνα ιαφορική έκφραση παρακρινών παραγόντων από τα προερχόµενα από το µυελό των οστών µεσεγχυµατικά stem κύτταρα εν συγκρίσει µε τους ινοβλάστες του δέρµατος. Καλλιεργητικά µέσα από ανθρώπινους ινοβλάστες και BM-MSCs αντίστοιχα, τέθηκαν σε συνθήκες υποξίας για 24 ώρες και κατόπιν αναλύθηκαν µε ABBPA και ELISA. Η ένταση κάθε κουκίδας εν συνεχεία µετρήθηκε και καταγράφηκε: _ : δεν ανιχνεύθηκε, ± : ασθενής ανίχνευση, + έως ++++: ένταση ανιχνευθέντος σήµατος. ABBPA: antibody-based protein array, ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay [Wu et al., 2010]. Όπως γνωρίζουµε, κατά τη διάρκεια της διεργασίας της φλεγµονής, παρατηρείται στρατολόγηση µιας ποικιλίας κυττάρων φλεγµονής, τα οποία συµµετέχουν ενεργά στην επούλωση των πληγών, κυριότερα εκ των οποίων όπως έχουµε δει και σε προηγούµενα κεφάλαια είναι τα ουδετερόφιλα πολυµορφοπύρηνα, τα µονοκύτταρα (µακροφάγα) και τα λεµφοκύτταρα. Επιπλέον της καταπολέµησης των βακτηρίων και της εκκαθάρισης των κυτταρικών συγκριµάτων από το σηµείο του τραυµατισµού, τα κύτταρα αυτά επηρεάζουν σηµαντικά τη διαδικασία της επούλωσης και µέσω της 237

238 παρακρινούς έκκρισης κυτταροκινών. Μολαταύτα, πρόσφατες knockout και knockdown µελέτες στα ποντίκια υπονοούν πως συγκεκριµένες κυτταρικές σειρές λευκοκυττάρων πιθανόν να µην είναι απαραίτητες για την επούλωση των τραυµάτων του δέρµατος, ιδιαιτέρως εκείνων που δεν είναι επιµολυσµένα. Επί παραδείγµατι, η απώλεια των σιτευτικών κυττάρων από την πληγή βρέθηκε να επιταχύνει τη διαδικασία της επούλωσης και να οδηγεί σε µειωµένη ουλοποίηση, ενώ η απώλεια των ουδετεροφίλων δεν φάνηκε να επηρεάζει την επουλωτική διεργασία [Martin et al., 2005]. Τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα από την άλλη πλευρά, δύνανται να απελευθερώνουν έναν µεγάλο αριθµό κυτταροκινών οι οποίες είναι γνωστό πως επιδρούν επί των φλεγµονωδών κυτταρικών σειρών (όπως MIP-1, MIP-2, G-CSF κ.α.). Κατά συνέπεια, είναι σηµαντικό να εξετασθεί εάν η τοπική εφαρµογή των κυττάρων αυτών επηρεάζει τη φλεγµονώδη διαδικασία κατά την ιστική επούλωση. Ανάλυση των κυττάρων σε πειραµατικά µοντέλα τραυµατισµών έδειξε πως η χρήση διαλύµατος εντός του οποίου είχαν καλλιεργηθεί BM-MSCs οδήγησε στη σηµαντική αύξηση του αριθµού των µακροφάγων αλλά δεν επηρέασε τον αριθµό των κοκκιοκυττάρων που βρέθηκαν, αντιθέτως ο αριθµός των T κυττάρων επέδειξε µια πτωτική τάση [Wu et al., 2007]. Αυτά τα αποτελέσµατα είναι σύµφωνα µε αποτελέσµατα in vitro µελετών, στις οποίες το διάλυµα αυτό βρέθηκε να είναι ισχυρά χηµειοτακτικό ως προς τα µονοκύτταρα, και για την ακρίβεια, 6 φορές περισσότερο εν σχέσει µε αντίστοιχο διάλυµα εντός του οποίου είχαν καλλιεργηθεί ινοβλάστες του χορίου. Τα µόρια MIP και MCP αποτελούν ισχυρά χηµειοτακτικά µόρια για τα µονοκύτταρα/µακροφάγα και διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο για την επιστράτευσή τους κατά τη διεργασία της επούλωσης. Τα BM-MSCs απελευθερώνουν αρκετές φορές µεγαλύτερα ποσά MIP-1 και MCP-5 εν σχέσει µε τις ινοβλάστες του δέρµατος [Chen et al., 2008]. Τα ιστικά µακροφάγα είναι γνωστό πως διαδραµατίζουν έναν ζωτικής σηµασίας ρόλο στην επούλωση. Τα δεδοµένα αυτά λοιπόν καθιστούν σαφές το γεγονός ότι τα BM- MSCs επιλεκτικά επιστρατεύουν µονοκύτταρα στο τραύµα µέσω απελευθέρωσης κυτταροκινών, γεγονός που υπογραµµίζει τη µεγάλη σηµασία τους στην επούλωση των χρόνιων πληγών [Wu et al., 2010]. 238

239 Εικόνα Επίπεδα του mrna κυτταροκινών και µορίων της εξωκυττάριας ουσίας στα BM - MSCs και τις ινοβλάστες. SDF1: stromal cell-derived factor-1, MIP: macrophage inflammatory protein, SCF: stem cell factor, EPO: erythropoietin, TPO: thrombopoietin, G-CSF: granulocyte colony stimulating factor, MCP1: monocyte chemotactic protein 1, MIG: monokine induced by gama interferon. [Chen et al., 2008]. Η νεοαγγείωση όπως είδαµε αποτελεί ένα βασικό κοµµάτι της επούλωσης. Η τοπική εφαρµογή των BM MSCs έχει φανεί πως προωθεί την αγγειογένεση, µέσω έκκρισης εκ µέρους τους µιας ποικιλίας παρακρινών παραγόντων (εικόνα 6.21). Τα ΒM-MSCs απελευθερώνουν υψηλά επίπεδα προαγγειογενετικών κυτταροκινών όπως είναι οι VEGF-a, IGF-1, platelet-derived growth factor-b, και η αγγειοποιητίνη (Ang-1) [Wu et al., 2007]. Κατά δεύτερον, το διάλυµα εντός του οποίου είχαν καλλιεργηθεί τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα φάνηκε πως ενισχύει την αγγειογένεση in vitro και τραύµατα στα οποία εφαρµόσθηκε το διάλυµα αυτό, παρουσίαζαν αυξηµένους αριθµούς από κύτταρα θετικά για CD34, C-kit, ή Flk-1, δείκτες δηλαδή των κυττάρων της ενδοθηλιακής σειράς, υποδηλώνοντας αυξηµένη στρατολόγηση ενδοθηλιακών κυττάρων καθώς και προγονικών ενδοθηλιακών κυττάρων στο τραύµα [Wu et al., 2007, Chen et al., 2008]. 239

240 Εικόνα Η παρακρινής επίδραση των BM-MSCs στην επούλωση των πληγών. Τα BM- MSCs (πράσινο) που βρίσκονται εντός µιας δερµατικής πληγής απελευθερώνουν µια πλειάδα αυξητικών παραγόντων όπως IGF-1, EGF, και KGF προκειµένου να ενισχύσουν τον πολλαπλασιασµό των κερατινοκυττάρων. Επίσης απελευθερώνουν κυτταροκίνες οι οποίες προάγουν την αγγειογένεση όπως είναι οι VEGF-a και Ang-1 και επιπλέον παράγουν χηµειοκίνες όπως η MIP-1 προκειµένου να επιστρατευθούν µονοκύτταρα στο σηµείο του τραυµατισµού. Περαιτέρω, η απελευθέρωση κάποιων κυτταροκινών από αυτά τα κύτταρα, όπως οι SDF-1 και G-CSF, προσελκύει και EPCs στο σηµείο της βλάβης Ang-1: angiopoietin-1, EGF: epidermal growth factor, EPC: endothelial progenitor cell, FB: fibroblast, G-CSF: granulocyte colony-stimulating factor, IGF: insulin-like growth factor, KGF: keratinocyte growth factor, MIP-1: macrophage inflammatory protein-1, MSC: mesenchymal stem cell; SDF1, Stromal cell-derived factor-1; VEGF, vascular endothelial growth factor [Wu et al., 2010]. ιαφοροποίηση των MSCs προς πολλαπλούς κυτταρικούς τύπους του δέρµατος Πρόσφατες µελέτες έχουν δείξει ότι κύτταρα που προέρχονται από το µυελό των οστών δε συνεισφέρουν µόνο ως προς την εµφάνιση ινοβλαστικών κυττάρων εντός του χορίου, αλλά συµµετέχουν επίσης στη δηµιουργία και άλλων κυτταρικών τύπων που συνθέτουν το δέρµα. Αν και θεωρητικά, τα προερχόµενα από τον µυελό των οστών κύτταρα µπορούν να συµπτυχθούν µε τα κερατινοκύτταρα, και το γεγονός αυτό µάλιστα έχει φανεί πως συµβαίνει σε διάφορες ex vivo µελέτες, φαίνεται πως το φαινόµενο αυτό δε λαµβάνει χώρα in vivo και η κυτταρική διαφοροποίηση των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων είναι ο λόγος εµφάνισης κερατινοκυττάρων που προέρχονται από τον µυελό των οστών [Wu et al., 2010]. 240

241 Ένας προβληµατισµός που προέκυψε ήταν κατά πόσον τα κερατινοκύτταρα που προέκυψαν µπορούσαν να αποδοθούν αποκλειστικά και µόνο στα BM MSCs καθώς είναι γνωστό ότι ο µυελός των οστών περιέχει διάφορους κυτταρικούς τύπους. Προκειµένου να διαλευκανθεί αυτό το ζήτηµα, οι Wu et al. εµφύτευσαν BM MSCs που εξέφραζαν την GFP πρωτεΐνη αλλά όχι και τον CD34 καθώς και CD34 θετικά αιµοποιητικά stem κύτταρα σε τραύµατα δέρµατος και εξέτασαν τα αποτελέσµατα. Τα δεδοµένα απέδειξαν ότι τα BM-MSCs και όχι τα HSCs υιοθέτησαν τον φαινότυπο του κερατινοκυττάρου µέσω κυτταρικής διαφοροποίησης [Wu et al., 2007]. Ένας ακόµα, λοιπόν, τρόπος µε τον οποίο τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα συµµετέχουν στους µηχανισµούς της επούλωσης του δέρµατος, είναι µέσω διαφοροποίησής τους προς πολλαπλούς κυτταρικούς τύπους που συνθέτουν το φυσιολογικό δέρµα. Όπως είδαµε και νωρίτερα, η δηµιουργία µηχανικού stress στο δέρµα κατά την επούλωση, καταλήγει στην απελευθέρωση µιας ποικιλίας κυτταροκινών που έχει ως αποτέλεσµα την επιστράτευση των κυκλοφορούντων στο αίµα µεσεγχυµατικών stem κυττάρων του αίµατος αλλά και στην ενεργοποίηση των αυτόχθονων MSCs [Sasaki et al., 2008]. Σε µια µελέτη των Sasaki et al. το 2008, µεσεγχυµατικά stem κύτταρα προερχόµενα από διαγονιδιακά ποντίκια που εξέφραζαν την GFP πρωτεΐνη ενέθησαν ενδοφλέβια σε τραυµατισµένα ποντίκια και εξετάσθηκε το κατά πόσον τα κύτταρα αυτά µεταναστεύουν και ενσωµατώνονται στην τραυµατισµένη περιοχή προκειµένου να ενισχύσουν την επούλωσή της. Όταν το τραύµα είχε επουλωθεί, αποµονώθηκε η συγκεκριµένη περιοχή του δέρµατος και ελέγχθηκε µε τη βοήθεια του ανοσοφθορισµού όπου φάνηκε ότι τα GFP θετικά κύτταρα είχαν σηµανθεί και µε τους pan cytokeratin (δείκτης των κερατινοκυττάρων), CD31 (δείκτης των ενδοθηλιακών κυττάρων), και a-sma (δείκτης των µυοϊνοβλαστών και των περικυττάρων) (εικόνα 6.22). Οι µετρήσεις έδειξαν ότι το 0.14 % όλων των κυττάρων που ήταν θετικά για το δείκτη pan cytokeratin ήταν και GFP θετικά, ενώ το ποσοστό για τα ενδοθηλιακά κύτταρα ήταν υψηλότερο καθώς το 13.2 % των ενδοθηλιακών κυττάρων ήταν GFP-θετικό. Επίσης φάνηκε πως το 33.0 % των περικυττάρων (αναγνωρίσθηκαν από την έκφραση της a SMA, το γεγονός ότι ήταν αρνητικά για τον CD31 και ήταν τοποθετηµένα πέριξ των αγγείων) είχαν διαφοροποιηθεί από τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα που είχαν ενεθεί στα ζώα [Sasaki et al., 2008] 241

242 Εικόνα Τα MSCs διαφοροποιούνται προς πολλαπλούς κυτταρικούς τύπους του δέρµατος στο σηµείο του τραυµατισµού. GFPθετικά κύτταρα (πράσινο) σηµάνθηκαν ταυτόχρονα και µε τους δείκτες pancytokeratin (a c, κόκκινο), CD31 (d f, κόκκινο), και a SMA (g i, κόκκινο). Οι πυρήνες στα εικονίδια c και f και ο CD31 στο εικονίδιο l απεικονίζονται µπλε. Τα δεδοµένα αυτά υποδηλώνουν ότι τα MSCs διαφοροποιήθηκαν σε κερατινοκύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα και περικύτταρα αντίστοιχα [Sasaki et al., 2008] Εικόνα ραστηριότητες των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων κατά την επούλωση [Wu et al., 2010]. 242

243 Ο ρόλος των ινοκυττάρων στη φυσιολογική και την παθολογική επούλωση Τα ινοκύτταρα αποτελούν έναν πληθυσµό µεσεγχυµατικών προγονικών κυττάρων προερχόµενων από το µυελό των οστών που επιδεικνύουν µορφολογικά και µοριακά χαρακτηριστικά των αιµοποιητικών stem κυττάρων, των µονοκυττάρων και των ινοβλαστών (εξ ου και η ονοµασία τους, που αποτελεί σύµπτυξη των λέξεων ινοβλάστη και λευκοκύτταρο). Αποτελούν το 0.1 % 0.5 % των περιφερικών κυττάρων του αίµατος, χαρακτηρίζονται από την έκφραση κολλαγόνου τύπου Ι, ινωδονεκτίνης, CD11b, CD34, και CD45, και φαίνεται πως αποτελούν το ενδιάµεσο στάδιο διαφοροποίησης προς ώριµα µεσεγχυµατικά κύτταρα ενός προερχόµενου από τον µυελό των οστών προγονικού κυττάρου της σειράς των µονοκυττάρων, κάτω από τις κατάλληλες συνθήκες [Bellini et al., 2007, Wu et al., 2010]. Τα κύτταρα αυτά παράγουν µεγάλες ποσότητες από συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας µετά από in vitro διέγερση από προ ινωτικές κυτταροκίνες, καθώς και ένζυµα που τροποποιούν την εξωκυττάρια ουσία, και µπορούν να διαφοροποιηθούν περαιτέρω σε µυοϊνοβλάστες τόσο in vitro όσο και in vivo όταν οι συνθήκες του µικροπεριβάλλοντος είναι ευοδωτικές [Bucala 2007]. Υπάρχουν συνεχώς αυξανόµενες σε αριθµό ενδείξεις ότι αυτά τα κύτταρα συνεισφέρουν στο νέο πληθυσµό ινοβλαστών και µυοϊνοβλαστών που παρουσιάζονται στον ιστό που βρίσκεται υπό φυσιολογική ή παθολογική επουλωτική διαδικασία, καθώς και σε ισχαιµικές ή φλεγµονώδεις ινωτικές διεργασίες, ακόµα στην αντίδραση στρώµατος που παρατηρείται σε κακοήθειες, ενώ ένας µεγάλος αριθµός µελετών έχει προτείνει την ύπαρξη αιτιολογικής σχέσης ανάµεσα στην συσσώρευση των ινοκυττάρων και τη συνεχιζόµενη ινοπλασία που παρατηρείται στις υπερτροφικές ουλές και τα χηλοειδή του δέρµατος, καθώς και στο δέρµα των ασθενών που προσβάλλονται από νεφρογενή συστηµατική σκλήρυνση [Bellini et al., 2007, Bucala 2007]. Τα ινοκύτταρα λόγω της πρώιµης εµφάνισής τους και της αντιγονοπαρουσιαστικής ικανότητάς τους συµµετέχουν στη φάση φλεγµονής και επίσης διαδραµατίζουν ιδιαίτερα σηµαντικό ρόλο και µετέπειτα κατά την επούλωση καθώς, όπως είδαµε, µπορούν να παράγουν µόρια της εξωκυττάριας ουσίας όπως είναι το κολλαγόνο τύπου Ι, το κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ και η ινωδονεκτίνη, αν και όχι σε τόσο υψηλές ποσότητες όπως οι ινοβλάστες. Τα ινοκύτταρα παράγουν επίσης αγγειογενετικούς παράγοντες (εικόνα 6.24) όπως ο VEGF, ο PDGF-A, ο M-CSF, ο HGF, ο GM-CSF, ο b-fgf, ο CTGF, η IL-1β και η IL-8. Τα ινοκύτταρα, κατά συνέπεια έχουν µια πιθανή 243

244 επίδραση στον σχηµατισµό νέων αγγείων, γεγονός που υποστηρίζεται περαιτέρω από την έκφραση εκ µέρους τους της µεταλλοπρωτεϊνάσης 9 (MMP-9), η οποία υποβοηθά την εισβολή των ενδοθηλιακών κυττάρων εντός της εξωκυττάριας ουσίας και µε αυτό τον τρόπο διευκολύνει περαιτέρω την αγγειογενετική διαδικασία [Bucala 2007]. Εικόνα Αγγειογενετικοί παράγοντες που εκκρίνονται από τα ινοκύτταρα. afgf: acidic FGF, bfgf: basic FGF, CTGF: connective tissue growth factor, EGF: epidermal growth factor, GM CSF: granulocyte macrophage colony stimulating factor, HGF: hepatocyte growth factor, IGF 1: insulin growth factor 1, M CSF: macrophage colony stimulating factor, MMP 9: matrix metalloproteinase 9, PD ECGF: platelet-derived endothelial cell growth factor, PDGF: plateletderived growth factor, PIGF: placental growth factor, VEGF: vascular endothelial cell growth factor [Hartlapp et al., 2001]. Τα ινοκύτταρα µεταναστεύουν στις περιοχές τραυµατισµού του δέρµατος in vivo (εικόνα 6.25). Ο αριθµός των ινοκυττάρων έχει βρεθεί πως αυξάνει σηµαντικά στους εγκαυµατίες (έως και 10% των µονοπύρηνων κυττάρων του περιφερικού αίµατος) εν σχέσει µε τον αριθµό στα φυσιολογικά άτοµα (< 0.5 %) [Abe et al., 2001, Yang et al., 2005]. Επιπλέον, αυξηµένοι αριθµοί ινοκυττάρων βρέθηκαν σε υπερτροφικές ουλές, και ανιχνεύονταν κυρίως στις εν τω βάθει στιβάδες της θηλώδους στιβάδας του χορίου, όπου παρήγαγαν περισσότερο κολλαγόνο αλλά λιγότερη κολλαγενάση εν σχέσει µε τις ινοβλάστες στις ανώτερες στιβάδες του χορίου [Yang et al., 2005]. 244

245 Θεωρείται πιθανό τα ινοκύτταρα να ρυθµίζουν τη λειτουργία των ινοβλαστών στα βαθύτερα τµήµατα του χορίου µε έναν παρακρινή τρόπο µέσω παραγωγής κυτταροκινών. Έχει αποδειχθεί πως τα ινοκύτταρα διαθέτουν την ικανότητα παραγωγής των προ-ινωτικών κυτταροκινών TGFβ1 και CTGF [Wu et al., 2010]. Εικόνα Τα ινοκύτταρα µεταναστεύουν στις περιοχές τραυµατισµού του δέρµατος in vivo. Ινοκύτταρα ποντικιού που είχαν σηµανθεί µε τη φθορίζουσα χρωστική PKH 26 ενέθησαν σε φλέβα της ουράς BALB/c ποντικιών, και ακριβώς µετά έγινε τραυµατισµός στο δέρµα. Έπειτα από 4 ηµέρες τα ποντίκια θανατώθηκαν και εξετάσθηκαν οι τραυµατικές περιοχές. Η µετανάστευση των σηµασµένων ινοκυττάρων εκτιµήθηκε µέσω µικροσκοπικής εξέτασης (A) και µέσω της ποσοτικής ανάλυσης του αριθµού των φθοριζόντων ινοκυττάρων που βρέθηκαν στις βιοψίες του τραυµατισµένου δέρµατος έναντι του µη τραυµατισµένου δέρµατος (µε και χωρίς ενδοφλέβια ένεση των φθοριζόντων ινοκυττάρων (B) [Abe et al., 2001]. Η µετατροπή των ινοκυττάρων σε µεσεγχυµατικά κύτταρα όπως µυοϊνοβλάστες συνεπάγεται µια σειρά από αλλαγές στο φαινότυπό τους. Σε ένα ζωικό µοντέλο που χρησιµοποιήθηκε από τους Bellini et al. για τη µελέτη της επούλωσης, πολυάριθµα CD45+ CD13+ κολλαγόνο τύπου I+ ινοκύτταρα µε προέλευση από το µυελό των οστών αποµονώθηκαν από ιστό τραύµατος την 4 η και την 7 η ηµέρα µετά τον τραυµατισµό, όταν οι µονοκυτταρικοί πληθυσµοί είναι ιδιαίτερα άφθονοι στον κοκκιώδη ιστό του τραύµατος. Ενώ µόνον ένας µικρός αριθµός ινοκυττάρων ανιχνευόταν θετικός για την έκφραση της a-sma την 4 η ηµέρα, περίπου το 59 % αυτών των κυττάρων βρέθηκε να εκφράζει αυτόν το δείκτη των µυοϊνοβλαστών την 7 η ηµέρα µετά τον τραυµατισµό. Η διαφοροποίηση των ινοκυττάρων προς κύτταρα που προσοµοίαζαν σε µυοϊνοβλάστες συνέβη ταυτόχρονα µε την αυξηµένη παραγωγή TGF-b1 στον τραυµατισµένο ιστό και συσχετίσθηκε µε µία προοδευτική 245

246 µείωση της έκφρασης των CD34 και CD45 αντιγόνων, καθώς µόνο το 21% των θετικών για την a-sma ινοκυττάρων ανιχνεύθηκε θετικό για το CD34 αντιγόνο την 7 η ηµέρα [Bellini et al., 2007]. Εικόνα Σήµατα που µπορεί να προωθούν (πράσινα διακεκοµµένα βέλη) τη µετατροπή των ινοκυττάρων σε ινοβλάστες και µυοϊνοβλάστες (µαύρα βέλη) κατά την επούλωση. Τα ινοκύτταρα απελευθερώνουν µια ποικιλία αυξητικών παραγόντων µεταξύ των οποίων ο CTGF (connective tissue growth factor) και ο TGF-b1 που µπορούν να επάγουν τον πολλαπλασιασµό των αυτόχθονων ινοβλαστών και να υποκινήσουν τη διαφοροποίησή τους σε µυοϊνοβλάστες σε συνεργασία µε την ET-1 και τον TGF-b1 που παράγονται από άλλους κυτταρικούς τύπους (συµπαγή πράσινα βέλη). Η διαφοροποίηση των ινοκυττάρων σε µυοϊνοβλάστες συνδέεται µε την απώλεια δεικτών επιφανείας που επί του παρόντος χρησιµοποιούνται προκειµένου να διακριθούν τα ινοκύτταρα και τα κύτταρα που προέρχονται από τα ινοκύτταρα από τις µυοϊνοβλάστες που προέρχονται από διαφοροποίηση των αυτόχθονων ινοβλαστών [Bellini et al., 2007]. Ρύθµιση από τα MSCs των ανοσολογικών αντιδράσεων και των αντιδράσεων απόρριψης Οι δράσεις των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων στο σηµείο του τραυµατισµού συµπεριλαµβάνουν επίσης και ανοσορρυθµιστικές δραστηριότητες οι οποίες ενισχύουν τις υπόλοιπες επουλωτικές διαδικασίες µέσω πολυάριθµων και σύνθετων βηµάτων. Το πρώτο βήµα για τη διεκπεραίωση των ανοσορρυθµιστικών αυτών 246

247 διεργασιών εκ µέρους των MSCs προϋποθέτει την ενεργοποίηση αυτών των κυττάρων µε την ιντερφερόνη-γ (interferon-gamma) [Ghannam et al., 2010]. Η ενεργοποίηση αυτή καταλήγει στην αυξηµένη απελευθέρωση διαλυτών παραγόντων όπως είναι οι indoleamine 2,3-dioxygenase, η ιντερλευκίνη-10, και η προσταγλανδίνη E2. Κάτω από τις κατάλληλες αναλογίες, αυτοί οι απελευθερούµενοι από τα διεγερµένα MSCs παράγοντες καταστέλλουν τον πολλαπλασιασµό τόσο των CD4+, όσο και των CD8+ T κυττάρων [Le Blanc et al., 2003]. Οι παράγοντες αυτοί επιπλέον είναι ικανοί να προωθήσουν τη δηµιουργία ανοσορρυθµιστικών T κυττάρων και αλληλεπιδρούν λειτουργικά µε τα natural killer κύτταρα και ανώριµα δενδριτικά κύτταρα [Ghannam et al., 2010]. Οι δραστηριότητες αυτές έχουν θεραπευτικό δυναµικό και ήδη έχουν αρχίσει να αξιοποιούνται σε προκλινικές και κλινικές µελέτες. Εικόνα Σχηµατική αναπαράσταση των αλληλεπιδράσεων µεταξύ των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων και των κυττάρων του συστήµατος ανοσίας. Μετά την ενεργοποίησή τους, τα MSCs εκκρίνουν µια ποικιλία από διαλυτούς διαµεσολαβητές όπως µονοξείδιο του αζώτου (NO),προσταγλανδίνη Ε2 (PGE2), indoleamine 2,3- dioxygenase (IDO), IL-6, και human leukocyte antigen (HLA)-G. Η παραγωγή αυτών των διαµεσολαβητών ρυθµίζει τόσο την αναπαραγωγή όσο και τη λειτουργία µιας ποικιλίας ανοσιακών κυττάρων καθώς και την επαγωγή των Τ ρυθµιστικών κυττάρων (TREG cells ) είτε άµεσα, είτε µε έµµεσο τρόπο µέσω της παραγωγής ανώριµων δενδριτικών κυττάρων (DC). NK, natural killer [Ghannam et al., 2010]. Η ανοσοκατασταλτική ικανότητα που διαθέτουν τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα έχει εκτιµηθεί και από µελέτες που έχουν πραγµατοποιηθεί in vivo. Οι Bartholomew et al. το 2002 έδειξαν πως η ενδοφλέβια χορήγηση µεσεγχυµατικών stem κυττάρων 247

248 που προέρχονταν από το µυελό των οστών µπαµπουίνων παρέτεινε την επιβίωση των αλλογενών µοσχευµάτων. Η έκταση της καταστολής που προέκυπτε, και ήταν δυνατόν να αποκτηθεί µε µία µόνο δόση ενδοφλέβιας χορήγησης των MSCs ήταν παρόµοια µε την αντίστοιχη κάποιων ανοσοκατασταλτικών φαρµάκων που χρησιµοποιούνται σήµερα κατά τη συνήθη ιατρική πρακτική. Η χορήγηση µιας δεύτερης δόσης µεσεγχυµατικών stem κυττάρων δεν επιµήκυνε την επιβίωση του µοσχεύµατος, τα ουδετερόφιλα πολυµορφοπύρηνα τελικά διήθησαν το µόσχευµα το οποίο εν συνεχεία απορρίφθηκε [Bartholomew et al., 2002]. Η θεραπευτική εισαγωγή των MSCs στις τραυµατισµένες περιοχές κατά συνέπεια, δηµιουργεί προβληµατισµούς για το εάν τα κύτταρα αυτά θα µπορούσαν και σε αυτή την περίπτωση να ασκήσουν τέτοιου είδους ανοσορρυθµιστικές επιδράσεις. Για παράδειγµα τα κύτταρα αυτά µπορεί να αυξήσουν την ανοχή για την ενσωµάτωση σκευασµάτων ισοδύναµων µε δέρµα κατασκευασµένων από αλλογενή κύτταρα. Μπορεί επίσης να διαδραµατίσουν ρόλο ως προς την µείωση του σχηµατισµού ουλών, καθώς τόσο τα δενδριτικά κύτταρα όσο και ένας εξειδικευµένος πληθυσµός ινοκυττάρων φαίνεται να συµµετέχουν στο σχηµατισµό υπερτροφικών ουλών. Η παρουσία των MSCs είναι πιθανό να αµβλύνει τις επιδράσεις αυτών των κυττάρων και κατά συνέπεια να ελαττώσει την ουλοποίηση [Sorrell et al., 2010]. Θεραπευτικές χρήσεις των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων Οι περισσότερες θεραπευτικές εφαρµογές των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων σε τραυµατισµένες περιοχές του σώµατος εξυπακούουν ότι εξωγενείς (παραδείγµατος χάριν ανεπτυγµένοι σε καλλιέργειες) πληθυσµοί θα εφαρµοστούν επί του ασθενούς χρησιµοποιώντας είτε συστηµατική είτε τοπική προσέγγιση. Η πρώτη, µιµείται τη διαδικασία µέσω της οποίας τα ενδογενή µεσεγχυµατικά stem κύτταρα καταφθάνουν και κατασκηνώνουν στα σηµεία στόχους µέσω της συστηµατικής κυκλοφορίας. Κατά τη διαδροµή αυτή που ακολουθούν µέσω του αγγειακού συστήµατος, υπάρχει ο κίνδυνος τα MSCs να «παρασυρθούν» εκτός κυκλοφορίας σε σηµεία του σώµατος που διαφέρουν από τα σηµεία στόχους (όπως είναι οι πνεύµονες, ο σπλήνας και το ήπαρ), και να παραµείνουν εκεί προσωρινά ή ακόµα και µόνιµα. Κάτι τέτοιο µπορεί είτε να καθυστερήσει σηµαντικά την µετάβασή τους στο σηµείο στόχο, είτε να µειώσει σηµαντικά τον αριθµό των κυττάρων που τελικά θα καταφθάσει εκεί. Όταν τελικά τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα προσεγγίσουν την περιοχή της βλάβης, πρέπει να εξέλθουν από τα αγγεία και να εισέλθουν στον συνδετικό ιστό όπου και θα ασκήσουν τις λειτουργίες τους [Karp et al., 2009]. 248

249 Μια εναλλακτική µέθοδος για τη διανοµή των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων στα σηµεία τα οποία έχουν υποστεί τραυµατισµό είναι µέσω άµεσης ή τοπικής εφαρµογής τους. Αυτή η προσέγγιση διαφέρει ουσιωδώς από την συστηµατική είτε ως προς το ότι τα MSCs µεταναστεύουν στο έδαφος της πληγής µέσω µη αγγειακών οδών, είτε ως προς το ότι προκαλούν την επούλωση µέσω πληθώρας βιοδραστικών ουσιών που απελευθερώνουν από τις γάζες ή άλλα µέσα τα οποία χρησιµοποιούνται στην επιφάνεια της πληγής και στα οποία βρίσκονται εµποτισµένα. Ένας περιορισµός αυτής της µεθόδου αποτελεί η εύκολη ή όχι προσβασιµότητα στο σηµείο του τραυµατισµού, κάτι το οποίο δεν ισχύει για το δέρµα, όπου λόγω της εύκολης προσβασιµότητας αυτή η µέθοδος αποτελεί την κυρίως χρησιµοποιούµενη, µε την οποία µεγάλες επιφάνειες µε χρόνιους ή όχι τραυµατισµούς επιδέχονται τοπικής θεραπείας µε µεσεγχυµατικά stem κύτταρα [Falanga et al., 2007]. Τρόπος εφαρµογής των εξωγενών µεσεγχυµατικών stem κυττάρων Προκειµένου η άµεση τοπική εφαρµογή των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων να είναι αποτελεσµατική, προϋποτίθεται πως ένας υψηλής συγκέντρωσης πληθυσµός αυτών των κυττάρων είτε θα τοποθετηθεί απευθείας πάνω στον τραυµατισµένο ιστό, είτε θα ενεθεί περιφερικά του χείλους του τραύµατος. Η χρονική στιγµή επίσης της εφαρµογής διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο καθώς τα τοποθετούµενα MSCs θα πρέπει να αλληλεπιδράσουν µε τα αυτόχθονα στο σηµείο του τραυµατισµού κύτταρα κατά τη διάρκεια συγκεκριµένων φάσεων της διαδικασίας επούλωσης [Sorrell et al., 2010]. Λόγω της θέσης του στην εξωτερική επιφάνεια του σώµατος, το δέρµα έχει αποτελέσει το αντικείµενο πληθώρας προκλινικών αλλά και κλινικών µελετών. Ενώ διαθέτει την ικανότητα να επουλώνει τις µικρής έκτασης βλάβες του αποτελεσµατικά και χωρίς την εφαρµογή θεραπευτικών µέσων, κάτι τέτοιο δεν ισχύει σε περιπτώσεις τραυµάτων πλήρους πάχους όπου πολλές φορές η παρέµβαση είναι κριτικής σηµασίας για έγκαιρη επούλωση χωρίς εξεσηµασµένη ουλοποίηση [Singer et al., 1999, Sorrell et al., 2010]. Είναι γνωστή η χρήση αυτόλογων µοσχευµάτων για θεραπευτικούς σκοπούς, όµως σηµαντικό µειονέκτηµα αποτελεί η περιορισµένη διαθεσιµότητα δέρµατος προς µεταµόσχευση. Έχει επίσης χρησιµοποιηθεί η µεταµόσχευση αυτόλογων και ετερόλογων υποκατάστατων δέρµατος. Η ενσωµάτωση των MSCs σε αυτά τα υποκατάστατα δέρµατος φαίνεται πως θα αποτελέσει την καινοτόµο προσέγγιση του προβλήµατος όσον αφορά τη επιτάχυνση 249

250 της επούλωσης αυτών των τραυµάτων. Οι χρόνιες πληγές που αδυνατούν να επουλωθούν παρουσιάζουν σηµαντικό έλλειµµα ως προς την αγγειοβρίθεια. Η χρήση αυτού του είδους των θεραπειών για αυτή ακριβώς την κατηγορία πληγών είναι συνεχώς αυξανόµενη και έχει επιδείξει θεραπευτικά αποτελέσµατα που είναι ιδιαίτερα ελπιδοφόρα [Falanga et al., 2007]. Η κυτταρική θεραπεία µε µεσεγχυµατικά stem κύτταρα έχει πολλαπλούς σκοπούς: να επιταχύνει τη διαδικασία της επιδιόρθωσης, να αµβλύνει τα εξεσηµασµένα φλεγµονώδη συµβάµατα και, τέλος, να µειώσει ή και να εξαφανίσει το σχηµατισµό ουλών. Η ταυτόχρονη επίτευξη όλων αυτών των στόχων, όπως είναι κατανοητό, προϋποθέτει την ύπαρξη ενός πολυλειτουργικού κυτταρικού πληθυσµού, γεγονός που αναδεικνύει τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα ως τους τέλειους υποψηφίους [Sorrell et al., 2010]. Πιθανές θεραπευτικές εφαρµογές των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων του δέρµατος και χρήση τους στην Αναγεννητική Ιατρική Από την ηµέρα της αναγνώρισης των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων του δέρµατος Από τους Toma et al. το 2001, το πεδίο µελέτης των κυττάρων αυτών διαρκώς διευρύνεται και πρέπει να αναµένονται και οι κλινικές εφαρµογές στο µέλλον αν και είναι απαραίτητη η διεξαγωγή πολλών ακόµη µελετών. Κρίνοντας, ωστόσο, από τα διάφορα θεραπευτικά οφέλη της πλέον εξελιγµένης µελέτης των προερχόµενων από τον µυελό των οστών MSCs, δεν θα έπρεπε να θεωρηθεί απίθανη η ανάδειξη των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων που εντοπίζονται στο δέρµα ως ανταγωνιστών των προηγουµένων εξαιτίας σε µεγάλο βαθµό της εύκολης πρόσβασης σε αυτά [Sellheyer et al., 2009]. Τέτοιου είδους προσδοκίες δεν είναι αβάσιµες, δεδοµένης ιδιαίτερα της στενής οµοιότητας που παρουσιάζουν τα stem κύτταρα των τριχοθυλακίων µε τα προερχόµενα από τον µυελό των οστών µεσεγχυµατικά stem κύτταρα, καθώς και οι δύο αυτοί πληθυσµοί εκφράζουν τους ίδιους δείκτες επιφανείας (συµπεριλαµβανόµενων των δεικτών νευρικών προγονικών κυττάρων), έχουν παρόµοια µορφολογία, και διαθέτουν την ικανότητα διαφοροποίησης προς ποικίλες κυτταρικές σειρές µεσεγχυµατικής προέλευσης (εικόνα 6.28) [Fritz et al., 2008]. 250

251 Εικόνα Πιθανές θεραπευτικές εφαρµογές των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων που εντοπίζονται στο δέρµα [Sellheyer et al., 2009]. Η µεταµόσχευση των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων του µυελού των οστών χρησιµοποιείται ήδη σε κλινικές δοκιµές για διάφορες παθήσεις, µε ποικίλα, ωστόσο, κλινικά αποτελέσµατα. Οι δύο χαρακτηριστικές ιδιότητες των κυττάρων αυτών που τα κάνουν ιδιαίτερα ελκυστικά για την θεραπευτική, είναι, πρώτον, οι ανοσοκατασταλτικές τους ιδιότητες, και δεύτερον, η ικανότητά τους για διαφοροποίηση προς ένα ιδιαίτερα ευρύ φάσµα κυτταρικών τύπων µεσοδερµατικής και όχι µόνον - προελεύσεως [Trounson 2009]. Οι ιδιότητες αυτές µένουν να αποδειχθούν και για τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα του δέρµατος, καθώς υπάρχει η πιθανότητα οι ιδιότητες αυτές να αποτελούν ειδικό χαρακτηριστικό των MSCs που προέρχονται από τον µυελό των οστών εξαιτίας της εξειδικευµένης φωλεάς τους. Ωστόσο, δεδοµένων των υπολοίπων πανοµοιότυπων ιδιοτήτων των MSCs που προέρχονται από τις δύο προαναφερθείσες πηγές, θεωρείται πιθανόν ότι και τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα του δέρµατος διαθέτουν επίσης την ικανότητα να δρουν ανοσοκατασταλτικά [Sellheyer et al., 2009]. Επιπλέον, δεδοµένου του δυναµικού νευρικής διαφοροποίησης των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων του δέρµατος, ειδικά όσον αφορά αυτά που εντοπίζονται πέριξ των τριχοθυλακίων στο τριχωτό της κεφαλής, εξετάζεται εάν τα κύτταρα αυτά είναι δυνατόν να χρησιµοποιηθούν εναλλακτικώς των νευρικών stem 251

252 κυττάρων. Εκτός αυτού, η συµµετοχή τους στις καρκινικές διεργασίες, ανοίγει νέες οδούς για θεραπευτικές εφαρµογές, στις οποίες γενετικά τροποποιηµένα MSCs χρησιµοποιούνται για την διανοµή αντικαρκινικών παραγόντων σε διάφορους τύπους κακοηθειών [Fritz et al., 2008]. Η χορήγηση ανθρώπινων µεσεγχυµατικών stem κυττάρων που προέρχονται από τον µυελό των οστών έχει φανεί επίσης πως επιταχύνει την επούλωση προκλητών τραυµάτων σε χοίρους και κουνέλια [Stoff et al., 2009, Nakagawa et al., 2005]. Τα ανθρώπινα κύτταρα δεν έγειραν ανοσολογική αντίδραση στα κουνέλια και, κατά συνέπεια, φαίνεται πως επιδεικνύεται ανοσοανοχή απέναντί τους, τουλάχιστον στην περίπτωση του δέρµατος. Στην έρευνα αυτή αναδείχθηκε επίσης ότι τα τραύµατα στα οποία είχαν εφαρµοσθεί τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα εµφάνιζαν µεγαλύτερη ανθεκτικότητα στην τάση, µικρότερη δηµιουργία κοκκιώδους ιστού, και καλύτερη επούλωση στο σύνολο, σύµφωνα µε την κλίµακα του Singer (εικόνα 6.29) [Stoff et al., 2009]. Εικόνα Ιστοµορφολογική εκτίµηση των προκλητών τραυµάτων και εκτίµηση σύµφωνα µε την κλίµακα του Singer έπειτα από 80 ηµέρες. Αριστερά: Οι τοµές έγιναν στις ράχες των κουνελιών (Α), και ένα διάλυµα από hmscs ενέθηκε περιφερικά των τραυµάτων (Β). Την 80η ηµέρα η µακροσκοπική εµφάνιση των ουλών στα οποία είχαν εφαρµοσθεί τα hmscs (C)ήταν σαφώς καλύτερη από την εικόνα των τραυµάτων του πληθυσµού control (D). εξιά: Τοµές στα κουνέλια στις οποίες είχαν εφαρµοσθεί ανθρώπινα MSCs και τοµές control εκτιµήθηκαν ως προς την παρουσία υπερκεράτωσης, επιδερµιδικής υπερπλασίας, την παρουσία και την έκταση της αποδιοργάνωσης του κολλαγόνου, την ινοπλασία, τη δηµιουργία νέων αγγείων, την απουσία εξαρτηµάτων στα οποία 252

253 συµπεριλαµβάνονται τα τριχοθυλάκια, οι αποκρινείς αδένες και οι λείοι µύες 80 ηµέρες µετά την εφαρµογή της θεραπείας. Τα σκορ εκτείνονταν από το 0 (βαρύτερη ουλοποίηση) έως το 10 (απουσία ουλοποίησης) [Stoff et al., 2009]. Όπως προαναφέρθηκε, τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα διαθέτουν την ικανότητα να αποικίζουν τις περιοχές τραυµατισµού, να διαφοροποιούνται προς διάφορους κυτταρικούς τύπους και να επιδεικνύουν ανοσοκατασταλτικές ιδιότητες, γεγονός που τα καθιστά ιδανικούς υποψηφίους για χρήση στις µεταµοσχεύσεις [Caplan 2006, Hwang et al., 2009]. Ένας µεγάλος αριθµός µελετών µε ζώα έχει ασχοληθεί µε την in vivo αναγεννητική ικανότητα των MSCs για διάφορα µοντέλα ιστικής επούλωσης. Τα αποτελέσµατα των ερευνών έδειξαν ότι η µεταµόσχευση των κυττάρων αυτών έχει δράσει ευοδωτικά στην επουλωτική διεργασία και την αναγέννηση του ιστού ακόµα και σε περιπτώσεις µε χαµηλή ή παροδική ενσωµάτωσή τους στον υπό επούλωση ιστό. Οι µελέτες αυτές υποδηλώνουν έναν εναλλακτικό τρόπο δράσης των MSCs στην ιστική επούλωση εκτός από την διαφοροποίηση [Caplan 2006, Caplan 2010]. Αποτελέσµατα πρόσφατων µελετών επίσης υποδεικνύουν οτι τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα εκκρίνουν διαλυτούς παράγοντες οι οποίοι µπορούν να τροποποιήσουν το µικροπεριβάλλον και, κατά συνέπεια, να συµµετάσχουν στην ανανέωση ή επιδιόρθωση των τραυµατισµένων ιστών και κυττάρων τους οποίους, σε ένα πρόσφατό τους άρθρο οι Caplan et al. ονόµασαν τροφικούς παράγοντες [Caplan 2006]. Κατά συνέπεια, η επαγόµενη από τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα in vivo επιδιόρθωση των δυσλειτουργικών ιστών µπορεί να είναι ένα αποτέλεσµα είτε της διαφοροποίησης, είτε της έκκρισης αυτών των τροφικών παραγόντων (χωρίς την συµµετοχή της διεργασίας της διαφοροποίησης) η οποία προκαλεί τροποποίηση των συνθηκών του µικροπεριβάλλοντος ούτως ώστε να αναγεννηθεί ο δυσλειτουργικός ιστός (εικόνα 6.30), ενώ θα µπορούσε να αποδίδεται επίσης, τουλάχιστον εν µέρει, και στη σύνθετη και µε µεγάλη ετερογένεια φύση των MSCs [Hwang et al., 2009]. 253

254 Εικόνα Συνεισφορά των µεσεγχυµατικών stem κυττάρων στην ιστική αναγέννηση και επούλωση. Τα MSCs µπορούν να συµµετάσχουν στις διεργασίες αυτές είτε µέσω της διαφοροποίησής τους σε εξειδικευµένα κύτταρα, είτε µέσω της έκκρισης τροφικών παραγόντων. Τόσο η διαφοροποίηση, όσο και η έκκριση των τροφικών παραγόντων ρυθµίζονται από µία ποικιλία µεταβλητών του µικροπεριβάλλοντος [Hwang et al., 2009]. εδοµένης της αυξηµένης προσοχής και των εκτεταµένων µελετών που λαµβάνουν χώρα στον τοµέα της δερµατολογίας όσον αφορά τη µελέτη των µηχανισµών επούλωσης και αναγέννησης του δέρµατος, θεωρείται αναµενόµενο πως ιδίως τα µεσεγχυµατικά stem κύτταρα που εδρεύουν στο δέρµα αλλά και οι υπόλοιποι πληθυσµοί stem κυττάρων του δέρµατος θα αποτελέσουν αντικείµενο εντατικής έρευνας στο εγγύς µέλλον [Sellheyer et al., 2009]. 254

255 ΕΠΙΛΟΓΟΣ Η Αναγεννητική Ιατρική έχει ως στόχο της την αποκατάσταση της φυσιολογικής δοµής και λειτουργίας των ιστών έπειτα από την επίδραση κάποιου επιβλαβούς ερεθίσµατος ή µετά από τραυµατισµό τους, ενώ τα stem κύτταρα και τα φυσικά ή εµβιοµηχανικά τους παράγωγα παρέχουν τα λειτουργικά συστατικά του αναγεννητικού θεραπευτικού προγράµµατος. Αυτόλογα ή ετερόλογα, αυτόχθονα ή έκτοπα, τα stem κύτταρα διατηρούν ένα αυτόνοµο δυναµικό αυτοανανέωσης και ανταποκρίνονται στα καθοδηγητικά σήµατα προκειµένου να διαφοροποιηθούν στους υπό επιδιόρθωση ιστούς [Klimanskaya et al., 2008]. Μέσω της επούλωσης ενός τραυµατισµού, τα stem κύτταρα έχουν τη δυνατότητα να θεραπεύσουν την υποκείµενη βλάβη του ιστού µέσω της de novo δηµιουργίας της κατάλληλης δοµής και λειτουργίας του. Η αποκατάσταση αυτή των τραυµατισµένων ιστών προσφέρει ένα θεραπευτικό πλεονέκτηµα σε καταστάσεις που ποικίλουν από συγγενείς ανωµαλίες έως επίκτητες και σχετιζόµενες µε την ηλικία παθολογικές καταστάσεις. Το αποτέλεσµα εξαρτάται από την εγγενή τάση που έχει ο πληθυσµός των stem κυττάρων να διασφαλίζουν τη µέγιστη, εξειδικευµένη για τον κάθε ιστό επιδιόρθωση καθώς από τη δηµιουργία ενός ευοδωτικού περιβάλλοντος εντός της φωλεάς, στον τραυµατισµένο ιστό, που καθιστά ικανή την εκτέλεση των µηχανισµών της επιδιόρθωσης [Nelson et al., 2008]. Η εξέλιξη της φαρµακοθεραπείας προς συγκεκριµένα θεραπευτικά πρότυπα εκµεταλλεύεται τη συνεχώς αυξανόµενη κατανόηση των µηχανισµών των διαφόρων νοσηµάτων καθώς και των φυσιολογικών επιδιορθωτικών µηχανισµών προκειµένου να ανακαλύψει, να εκτιµήσει και, εν τέλει, να εφαρµόσει την θεραπευτική των stem κυττάρων που στοχεύει στην αιτία της νόσου. Οι συµπληρωµατικές επιστήµες της µοριακής ιατρικής, της βιοτεχνολογίας, και της βιολογίας των δικτύων έχουν µε τη σειρά τους υποβοηθήσει σηµαντικά την ανάπτυξη των εφαρµογών των stem κυττάρων. Προσαρµοσµένη το γενετικό και µοριακό προφίλ έκαστου ασθενούς, η Αναγεννητική Ιατρική ενσωµατώνει τη βιολογία των stem κυττάρων µε εξατοµικευµένες προληπτικές, διαγνωστικές και θεραπευτικές λύσεις που αφορούν την ανθρώπινη νόσο, παρέχοντας µε αυτό τον τρόπο τον ακρογωνιαίο λίθο της µοντέρνας εξατοµικευµένης ιατρικής πρακτικής (εικόνα 1) [Daley et al., 2008]. 255

256 Εικόνα 1. Η Αναγεννητική Ιατρική αποτελεί τον συνδετικό κρίκο µεταξύ της βιολογίας των stem κυττάρων και της εξατοµικευµένης ιατρικής πρακτικής [Nelson et al., 2008]. Πέραν όµως της αποκατάστασης της δοµής και της λειτουργίας, η Αναγεννητική Ιατρική ανοίγει νέες οδούς τόσο για την πρόληψη όσο και για την καθυστέρηση της εξέλιξης της νόσου µέσω της προφυλακτικής επιδιόρθωσης. Τα stem κύτταρα διαθέτουν την ικανότητα να επιλέγουν, καθοδηγούν και να «κατασκευάζουν» τα κυτταρικά χαρακτηριστικά που απαιτούνται για την αποτελεσµατική θεραπεία ή την παρεµπόδιση της εκδήλωσης της νόσου [Nelson et al., 2008]. Μέσω της πρόβλεψης των αναγκών των ευπαθών στη νόσηση ιστών, στόχος της Αναγεννητικής Ιατρικής γίνεται η επιδιόρθωση των επαπειλούµενων ιστών µε ανθεκτικά στο stress κύτταρα προκειµένου να αποφευχθεί η µη αναστρέψιµη βλάβη τους. Η προληπτική αναγεννητική θεραπευτική αγωγή προϋποθέτει την ικανότητα πρόβλεψης της ευπάθειας έναντι συγκεκριµένων νοσηµάτων, βασιζόµενη στο µοριακό προφίλ των πρωιµότερων σταδίων της νόσου προκειµένου να προγραµµατίσει κατάλληλες και έγκαιρες, βασιζόµενες στα stem κύτταρα παρεµβάσεις [Waldman et al., 2008]. Το πεδίο της βασιζόµενης στα stem κύτταρα Αναγεννητικής Ιατρικής καθορίζεται από την τριάδα της επιδιόρθωσης που συντίθεται από την αντικατάσταση, αναγέννηση και ανανέωση (replacement, regeneration, rejuvenation - το R3 πρότυπο της θεραπευτικής επιδιόρθωσης) (εικόνα 2). Όπως είναι αναµενόµενο, οι τρεις αυτές παράµετροι αλληλοεπικαλύπτονται στην πράξη, µε αποτέλεσµα η επιδιόρθωση από την σκοπιά της Αναγεννητικής Ιατρικής να καλύπτει ένα ευρύ φάσµα εφαρµογών που ποικίλλει από την µεταµόσχευση οργάνων (αντικατάσταση) έως τη δηµιουργία νέων οργάνων από τα παλαιότερα µετά από την ενσωµάτωση προγονικών κυττάρων στο σηµείο της βλάβης, την de novo λειτουργία του νέου οργάνου (αναγέννηση) και την δηµιουργία αυτοανανεούµενων οργάνων µέσω της 256

257 λειτουργίας των αυτόχθονων ενδογενών stem κυττάρων (ανανέωση) [Nelson et al., 2008]. Εικόνα 2. Το αντικείµενο της Αναγεννητικής Ιατρικής. Η επιδιόρθωση αποτελεί τον κύριο στόχο της Αναγεννητικής Ιατρικής που συµπεριλαµβάνει την αντικατάσταση, αναγέννηση και ανανέωση του οργάνου ή ιστού. Εν συνόλω, οι τρεις θεραπευτικές αυτές στρατηγικές καλούνται το R3 πρότυπο της Αναγεννητικής Ιατρικής [Nelson et al., 2008]. Συµπερασµατικά, η Αναγεννητική Ιατρική, βασισµένη επάνω στις συνεχώς αυξανόµενες σε αριθµό ανακαλύψεις που αφορούν τη βιολογία των stem κυττάρων, έχει ήδη αρχίσει να καθορίζει το πεδίο της µελλοντικής κλινικής πρακτικής [Nelson et al., 2006]. Η Αναγεννητική Ιατρική και η βιολογία των stem κυττάρων καταλύουν όλα τα µέχρι σήµερα γνωστά όρια της Ιατρικής και παρέχουν ένα συνολικό πρότυπο θεραπευτικών στόχων βασιζόµενο στις επιστηµονικές ανακαλύψεις και την κλινική εφαρµογή τους. Βασισµένη στα θεµέλια της µεταµοσχευτικής ιατρικής, η επιστήµη της Αναγεννητικής Ιατρικής θα εξακολουθήσει να αναπτύσσεται και να εφαρµόζει τεχνολογίες προκειµένου να θεραπεύει ασθένειες σε πρωιµότερα στάδια και µε ασφαλέστερα αποτελέσµατα, κάτι που δεν είναι δυνατόν µε τις υπάρχουσες θεραπείες. Οι στρατηγικές της αντικατάστασης, αναγέννησης και ανανέωσης συνθέτουν το R3 πρότυπο της θεραπευτικής επιδιόρθωσης. Η εξέλιξη αυτού του πεδίου έρευνας θα λάβει χώρα µέσω της υποστήριξης εκ µέρους των ασθενών και του ευρέος κοινού, της εξέλιξης της φαρµακολογίας και της βιοτεχνολογίας, της συνεργασίας των κυβερνητικών οργανισµών µε τις διεθνείς επαγγελµατικές βιοϊατρικές οργανώσεις και, τέλος, µέσω της έρευνας των πανεπιστηµιακών ιδρυµάτων που καθορίζει σε σηµαντικό βαθµό τον ρυθµό µε το οποίο οι εξελίξεις αυτές θα έχουν άµεση επίδραση και στην καθηµερινή ιατρική πρακτική [Nelson et al., 2008]. 257

258 2006, Εικόνα 3. Ο Έλληνας Τιτάνας Προµηθέας και η Αναγεννητική Ιατρική. Ως τιµωρία επειδή παρέδωσε τη φωτιά στον Ηρακλή, ο ίας διέταξε να δεθεί ο Προµηθέας µε αλυσίδες σε έναν βράχο και έστελνε κάθε µέρα έναν αετό ο οποίος έτρωγε το ήπαρ του. Παρ όλ αυτά, το ήπαρ του Προµηθέα είχε την ικανότητα να αναγεννάται κάθε µέρα, γεγονός που τον καθιστούσε ικανό να επιβιώνει. Ο Προµηθέας αποτελεί ένα ταιριαστό σύµβολο για την Αναγεννητική Ιατρική. Οι επιστήµονες ευελπιστούν να καταστήσουν το µύθο της αναγέννησης αληθινό µέσω της ανάπτυξης νέων θεραπειών που αποκαθιστούν τα κατεστραµµένα, φέροντα βλάβες ή γηράσκοντα κύτταρα και ιστούς του ανθρωπίνου σώµατος [regenerative medicine The woods decay, the woods decay and fall, The vapours weep their burthen to the ground, Man comes and tills the field and lies beneath, And after many a summer dies the swan. Me only cruel immortality Consumes. from Tithonus, by Alfred Tennyson 258