(Cistus creticus ssp. creticus) ΕΙΡΗΝΗ ΠΑΤΕΡΑΚΗ

Transcript

1

2 II II

3 III ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ - ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΟΜΑΔΑ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΦΥΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΞΙΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΚΡΗΤΙΚΟΥ ΛΑΔΑΝΟΥ (Cistus creticus ssp. creticus) ΕΙΡΗΝΗ ΠΑΤΕΡΑΚΗ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΑΓΓΕΛΟΣ Κ. ΚΑΝΕΛΛΗΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2007 III

4 IV IV

5 V Στους φίλους που είχα την τύχη να γνωρίσω σε αυτή την πόλη V

6 VI VI

7 VII There is no such thing as a unique scientific vision, any more than there is a unique poetic vision. Science is a mosaic of partial and conflicting visions. But there is one common element in these visions. The common element is rebellion against the restrictions imposed by the locally prevailing culture, Western or Eastern as the case may be. Freeman Dyson VII

8 VIII VIII

9 IX Ευχαριστίες Λέγεται ότι «η αρχή είναι το Ημισυ του Παντός», και κατά κάποιο τρόπο αυτό αληθεύει και για μια διδακτορική διατριβή. Ειδικά για μένα «η αρχή» ήταν πολύ σημαντική, αφού όπως αποδείχτηκε χρειάστηκα αρκετά μεγάλο διάστημα για να πάρω μια τέτοια απόφαση. Και για το λόγο αυτό να ευχαριστήσω τον Δρ. Άγγελο Κ. Κανελλή, ο οποίος ήταν ο άνθρωπος που, ελπίζω, πιστεύοντας σε μένα με προέτρεψε σε αυτήν την απόφαση. Ακόμη θα ήθελα να τον ευχαριστήσω για τις υποδείξεις του σε επιστημονικό αλλά και ακαδημαϊκό επίπεδο, τη βοήθεια του για τον επιστημονικό σχεδιασμό των πειραμάτων μου και την κριτική ανάλυση των αποτελεσμάτων μου, για την προσπάθεια του να με κάνει «ολοκληρωμένο επιστήμονα», για την υπομονή που έδειξε κατά τη διάρκεια των επιστημονικών μας «διαφωνιών» και τέλος για τη διόρθωση της παρούσας διατριβής. Η εκπόνηση μιας διδακτορικής διατριβής δε φαίνεται από την αρχή πόσο περίπλοκη και πολυδιάστατη μπορεί να γίνει. Ούτε είναι εύκολο να φανταστείς εκ των προτέρω πόσοι συνάδελφοι ή φίλοι θα χρειαστεί να βοηθήσουν, σε διάφορα επίπεδα, για την ολοκλήρωση της. Ακόμα οι καταστάσεις και οι ψυχολογικές μεταπτώσεις που περνάς εσύ ο ίδιος, στην προσπάθεια να θέσεις ένα τέλος στη διατριβή, αλλα και μια καινούργια αρχή στην ζωή σου, είναι ποικίλες. Κατά τη διάρκεια των χρόνων αυτών ένα χαμόγελο ή μια καλημέρα θα μπορούσαν να αποβούν πολυ σημαντικά. Θα ήθελα λοιπόν να ευχαριστήσω αρχικά όλους αυτούς τους φίλους, «γείτονες», συνεργάτες και συνάδελφους που με την παρουσία τους έκαναν πιο ευχάριστες τις ερευνητικές μας προσπάθειες και τις ατελείωτες ώρες που περνούσαμε στo εργαστήριo προσπαθώντας για «ότι καλύτερο». Πιο συγκεκριμένα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Δρ. Χρήστο Παναγιωτίδη (Αναπλ. Καθ., Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας, Τομέας Φαρμακολογίας, Τμήμα Φαρμακευτικής, Α.Π.Θ.) για τις πολύτιμες συμβουλές και τη συμπαράσταση του καθ όλη τη διάρκεια της διατριβής αυτής. Ακόμη ευχαριστώ τον Δρ. Αλέξανδρο Τριανταφυλλίδη (Λέκτορας, Τομέας Γενετικής, Τμήμα Βιολογίας, Α.Π.Θ.) για τη βοήθεια του όσον αφορούσε την κατασκευή των φυλλογενετικών δέντρων αλλά και για τη φιλική του υποστήριξη όλα αυτά τα χρόνια, και την Δρ. Ελένη IX

10 X Νικολάκη (Επικ. Καθ., Τομέας Βιοχημείας, Τμήμα Χημείας, Α.Π.Θ.) που μου παραχώρησε το φορέα έκφρασης στη ζύμη pyes2. Δεν θα μπορούσα να μην ευχαριστήσω τους συνεργάτες μου από το εργαστήριο Βιοτεχνολογίας Φαρμακευτικών Φυτών (Τομέας Φαρμακογνωσίας, Τμήμα Φαρμακευτικής, ΑΠ.Θ.) την Βασιλική Φαλάρα, την Ευγενία Ιωαννίδη, την Φανή Χατζοπούλου για την άριστη συνεργασία αλλά και για την βοήθεια που μου πρόσφεραν, για τις εποικοδομητικές συζητήσεις μας σε επιστημονικό και μη επιστημονικό επίπεδο και κυρίως για το φιλικό και ευχάριστο περιβάλλον που είχαν δημιουργήσει στο εργαστήριο, σε σημείο που με έκαναν να νιώθω ότι μου λείπουν όταν λόγω δουλειάς απουσίαζα. Ομολογώ ότι χωρίς την παρουσία τους η ζωή μου στο εργαστήριο θα ήταν πιο μονότονη και σίγουρα λιγότερο ενδιαφέρουσα και πικάντικη. Τους είμαι βαθιά ευγνώμων που ήταν εκεί γιατί έδωσαν μια άλλη διάσταση στη θεώρηση μου για τη ζωή και την πραγματικότητα. Ελπίζω η σχέση που αποκτήσαμε αυτό το διάστημα να εξελιχθεί σε σχέση «ζωής» και να συνεχίσει να αναπτύσσεται. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τη Βασιλική για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε και μου εμπιστεύθηκε για περαιτέρω ανάλυση δύο από τους cdna κλώνους (CcHMGR και CcDXS) που απομόνωσε κατά τη διάρκεια της δικής της διδακτορικής διατριβής. Ακόμη θα ήθελα να ευχαριστήσω την Dr. Susan Ferro-Novick (Howard Hughes Medical Institute, Yale University) για την αποστολή του μεταλλάγματος ζύμης S. cerevisiae ANY119, το οποίο ήταν πολύτιμο για την λειτουργική μελέτη των CcGGPPSS1 και CcGGPPSS2 κλώνων. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής για την συμπαράσταση και τις πολύτιμες συμβουλές και καθοδήγηση τους, την επταμελή εξεταστική επιτροπή για τις υποδείξεις τους αλλά και τον Τομέα Φαρμακογνωσίας Φαρμακολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης για την φιλοξενία των ερευνητικών μου δραστηριοτήτων όλο αυτό το διάστημα. X

11 XI Επιβλέπων Καθηγητής: Άγγελος Κ. Κανελλής Αναπλ. Καθηγητής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή: Δρ. Άγγελος Κ. Κανελλής, Αναπλ. Καθηγητής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Δρ. Χρήστος Παναγιωτίδης, Αναπλ. Καθηγητής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Δρ. Χρήστος Σουλελές, Αναπλ. Καθηγητής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή: Δρ. Άγγελος Κ. Κανελλής, Αναπλ. Καθηγητής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Δρ. Χρήστος Παναγιωτίδης, Αναπλ. Καθηγητής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Δρ. Χρήστος Σουλελές, Αναπλ. Καθηγητής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Δρ. Αρτέμιος Μποζαμπαλίδης, Καθηγητής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Δρ. Νικόλαος Πανόπουλος, Καθηγητής, Πανεπιστήμιο Κρήτης Δρ. Βασίλης Ρούσσης Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, Κ.Π.Α. Δρ. Αθανάσιος Τσαφτάρης, Καθηγητής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης XI

12 XII ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ NADPH NADH cdna NMR PCR EDTA UV X-gal SDS APS TEMED SDS-PAGE DTT PVPP ATA CTAB DEPC dntps OD PEG PMSF RT-PCR Tris Ανηγμένο φωσφορικό νικοτιναμιδο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο Ανηγμένο νικοτιναμιδο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο Συμπληρωματικό DNA Πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός (Nuclear Magnetic Resonance) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (polymerase chain reaction) Αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ Υπεριώδης ακτινοβολία (ultra violet) 5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλο-β-D-γαλακτοπυρανοσίδιο Μετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου Υπερθειικό αμμώνιο Τετραμεθυλοαιθυλενοδιαμίνη Πηκτή ηλεκτροφόρησης πολυακρυλαμίδης με SDS (check Efi) Διθειοθρεϊτόλη Πολυ-βινυλοπυρρολιδόνη (Polyvinylpolypyrrolidone) Αουριλικ- τρικαρβοξυλικό οξύ (Aurintricarboxylic acid) Βρωμιούχο εξα τριμέθυλοαμμώνιο (Hexadecyltrimethylammonium bromide) Διαιθυλπυροκαρβονικός εστέρας (Diethyl pyrocarbonate) Τριφωσφορικά δέοξυ-νουκλεοτίδια Οπτική πυκνότητα Πολυαιθυλενική γλυκόλη (Polyethylene glycol) Φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο PCR αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcrption PCR) Τρις υδροξυμεθυλαμινομεθάνιο XII

13 XIII XIII

14 XIV ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 1 1. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ Περιγραφή και σπουδαιότητα του φυτού Cistus creticus ssp. creticus Δευτερογενείς μεταβολίτες και ο ρόλος τους στην ζωή των φυτών Αδενικοί ιστοί στα φυτά Τερπένια και ο ρόλος τους στην ζωή των φυτών Βιοσύνθεση τερπενίων Αναγωγάση του 3-ύδροξυ-3-μέθυλο-γλουταρυλ-συνένζυμου Α (HMGR, EC ) Συνθετάση της 5-φωσφορικής-1-δεοξυ-D-ξυλουλόζης (DXS, EC ) Αναγωγάση της 5-φωσφορικής-1-δεοξυ-D-ξυλουλόζης (DXR, EC ) Συνθετάση του πυροφωσφορικού γερανυλγερανυλίου (GGPPS, EC ) ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Υλικά Φυτικό υλικό - συνθήκες ανάπτυξης και καλλιέργειας Τεχνικές μοριακής βιολογίας Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πηκτή αγαρόζης Απομόνωση και καθαρισμός DNA από πηκτή αγαρόζης Κλωνοποίηση τμημάτων DNA σε πλασμιδιακούς φορείς Error! Bookmark not defined Κλωνοποίηση PCR προϊόντων σε πλασμιδιακούς φορείς Προετοιμασία κυττάρων E.coli για να γίνουν δεκτικά σε μετασχηματισμό με πλασμιδιακό φορέα (competent cells) Μετασχηματισμός δεκτικών κυττάρων E.coli με πλασμιδιακό φορέα Αποθήκευση βακτηριακών κυττάρων για μεγάλα χρονικά διαστήματα Βακτηριακές καλλιέργειες Απομόνωση πλασμιδιακού DNA από κύτταρα E.coli Ποσοτικοποίηση νουκλεϊκών οξέων Ανάλυση ολικού RNA σε αποδιατακτική πηκτή αγαρόζης Μεταφορά DNA/RNA από πηκτή αγαρόζης σε νάιλον μεμβράνη (Southern και northern blot) Υβριδισμός με σημασμένο DNA Εύρεση αλληλουχίας των βάσεων τμήματος DNA Βιοπληροφορική ανάλυση αλληλουχιών 65 XIV

15 XV Εκχύλιση πρωτεϊνών από κύτταρα E.coli Αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία SDS (SDS- PAGE) Μεταφορά πρωτεϊνών σε μεμβράνες και ανοσοανίχνευση με αντίσωμα (Western blotting) Χρώση SDS-PAGE πηκτής με CBB (Coommassie Brilliant Blue) Ανάπτυξη πρωτοκόλλων απομόνωσης νουκλεϊκών οξέων από ιστούς του Cistus creticus ssp creticus Πρωτόκολλο εκχύλισης ολικού RNA Πρωτόκολλο απομόνωσης γενωμικού DNA Κλωνοποίηση γονιδίων που κωδικοποιούν την GGPPS του Cistus creticus ssp creticus Κλωνοποίηση γονιδίων που κωδικοποιούν την DXR του Cistus creticus ssp creticus Παρασκευή πολυκλωνικού αντισώματος ενάντια στην πρωτεΐνη της GGPPS Έκφραση των GGPPS1 και GGPPS2 γονιδίων σε κύτταρα Saccharomyces cerevisiae Σχεδιασμός και κατασκευή των πλασμιδίων έκφρασης CcGGPPS στα κύτταρα S. cerevisiae ΑΝΥ Προετοιμασία κυττάρων S. cerevisiae για να γίνουν δεκτικά σε μετασχηματισμό με πλασμιδιακό φορέα Μετασχηματισμός δεκτικών κυττάρων S. cerevisiae με πλασμιδιακό φορέα Επαγωγή του GAL1 υποκινητή για έκφραση της GGPPS πρωτεΐνης Εκχύλιση πρωτεϊνών από κύτταρα S. cerevisiae Ανάλυση κατά RT-PCR ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ανάπτυξη πρωτοκόλλων απομόνωσης νουκλεϊκών οξέων από ιστούς του Cistus creticus ssp. creticus Αλληλούχηση των EST κλώνων που κωδικοποιούν τα γονίδια DXS και HMGR του Cistus creticus ssp. creticus Κλωνοποίηση του cdna που κωδικοποιεί τη DXR του Cistus creticus ssp. creticus Κλωνοποίηση των cdnas που κωδικοποιούν τη GGPPS του Cistus creticus ssp. creticus Παρασκευή πολυκλωνικού αντισώματος ενάντια στην πρωτεΐνη της GGPPS Λειτουργική ανάλυση των CcGGPPS1 και CcGGPPS2 cdnas Mελέτη έκφρασης των γονιδίων CcHMGR, CcDXS, CcDXR, CcGGPPS1 και CcGGPPS2 σε ιστούς του Cistus creticus ssp. creticus και σε απόκριση διαφόρων περιβαλλοντικών παραγόντων Έκφραση των γονίδιων CcHMGR, CcDXS, CcDXR, CcGGPPS1 και CcGGPPS2 σε διάφορους ιστούς του Cistus creticus ssp. creticus Εποχιακή έκφραση των γονίδιων CcDXS, CcDXR, CcGGPPS1 και CcGGPPS Ημερήσια έκφραση των γονίδιων CcHMGR, CcDXS, CcDXR, CcGGPPS1 και CcGGPPS2 131 XV

16 XVI Έκφραση των γονίδιων CcHMGR, CcDXS, CcDXR, CcGGPPS1 και CcGGPPS2 σε φύλλα και τρίχες που έχουν απομονωθεί από φύλλα διαφορετικού αναπτυξιακού σταδίου Επίδραση των καταπονήσεων με ξηρασία και υψηλές θερμοκρασίες στη γονιδιακή έκφραση των CcHMGR, CcDXS, CcDXR, CcGGPPS1 και CcGGPPS Επίδραση του μηχανικού τραυματισμού στη γονιδιακή έκφραση των CcHMGR, CcDXS, CcDXR, CcGGPPS1 και CcGGPPS Επίδραση των ενεργοποιητών του δευτερογενούς μεταβολισμού στη γονιδιακή έκφραση των CcHMGR, CcDXS, CcDXR, CcGGPPS1 και CcGGPPS ΣΥΖΗΤΗΣΗ Απομόνωση νουκλεϊκών οξέων από ιστούς του Cistus creticus ssp. creticus Χαρακτηρισμός των cdnas της αναγωγάσης του 3-ύδροξυ-3-μέθυλο-γλουταρυλ-συνένζυμου Α (HMGR) και της συνθετάσης της 5-φωσφορικής-1-δεοξυ-D-ξυλουλόζης (DXS) Χαρακτηρισμός του cdna της αναγωγάσης της 5-φωσφορικής-1-δεοξυ-D-ξυλουλόζης από το Cistus creticus ssp. creticus (CcDXR) Χαρακτηρισμός των cdnas της συνθετάσης του πυροφωσφορικού γερανυλγερανυλίου από το Cistus creticus ssp. creticus (CcGGPPS) Έκφραση των γονιδίων CcHMGR, CcDXS, CcDXR, CcGGPPS1 και CcGGPPS Έκφραση των γονίδιων CcHMGR, CcDXS, CcDXR, CcGGPPS1 και CcGGPPS2 σε ιστούς του Cistus creticus ssp. creticus Εποχιακή έκφραση των γονίδιων CcDXS, CcDXR, CcGGPPS1 και CcGGPPS Ημερήσια έκφραση των γονίδιων CcHMGR, CcDXS, CcDXR, CcGGPPS1 και CcGGPPS Επίδραση του αναπτυξιακού σταδίου των φύλλων στην έκφραση των γονίδιων CcHMGR, CcDXS, CcDXR, CcGGPPS1 και CcGGPPS Έκφραση των γονίδιων CcHMGR, CcDXS, CcDXR, CcGGPPS1 και CcGGPPS2 σε απόκριση αβιοτικών καταπονήσεων Έκφραση των γονίδιων CcHMGR, CcDXS, CcDXR, CcGGPPS1 και CcGGPPS2 σε απόκριση μεταχείρισης με ενεργοποιητές ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 179 XVI

17 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το φυτό Cistus creticus ssp. creticus είναι ενδημικό του Ελληνικού χώρου και αξιοποιείται εμπορικά στην Κρήτη, χάριν των αρωματικών ιδιοτήτων της ρητίνης του ( λάδανο ) η οποία παράγεται και εκκρίνεται κυρίως από τις αδενικές τρίχες που βρίσκονται στην επιφάνεια των φύλλων. Το ενδιαφέρον στο είδος αυτό εντάθηκε μετά την ανακάλυψη ότι συγκεκριμένες ουσίες της ρητίνης οι οποίες ανήκουν στην κατηγορία των λαβδανικών διτερπενίων όπως η (13Ε)-λαβδα-13-εν-8α,15-διόλη, η σκλαρεόλη και πολλά παράγωγα του οξειδίου της μανοόλης, παρουσιάζουν ισχυρή αντιμικροβιακή, κυτταροστατική και κυρίως αντιλευχαιμική δράση in vitro. Με βάση τα παραπάνω κρίθηκε ενδιαφέρουσα η μελέτη της βιοσύνθεσης των ουσιών αυτών στο συγκεκριμένο φυτό, μέσω της κλωνοποίησης και χαρακτηρισμού γονιδίων που συμμετέχουν στο βιοσυνθετικό τους μονοπάτι. Ο απώτερος στόχος ήταν από την μία η διεύρυνση των γνώσεων που έχουμε έως σήμερα πάνω στο μεταβολισμό των τερπενίων στα φυτά και από την άλλη η πιο αποδοτική εκμετάλλευση φυτών του είδους Cistus creticus ssp. creticus για τη δημιουργία νέων φαρμακευτικών και μη προϊόντων. Για το σκοπό αυτό επιλέχθηκαν γονίδια που βρίσκονται σε κομβικά σημεία στο μονοπάτι βιοσύνθεσης των τερπενίων και θεωρείται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του μονοπατιού. Τα γονίδια αυτά ήταν η αναγωγάση του 3-ύδροξυ-3-μέθυλο-γλουταρυλ-CoA (HMGR), η συνθετάση της 5-φωσφορικής-1-δεοξυ-D-ξυλουλόζης (DXS), η αναγωγάση της 5- φωσφορικής-1-δεοξυ-d-ξυλουλόζης (DXR) και η συνθετάση του πυροφωσφορικού γερανυλγερανυλίου (GGPPS). Απομονώθηκαν ένα πλήρες cdna που κωδικοποιούσε την CcDXR και δύο πλήρη cdnas που αντιστοιχούσαν στην GGPPS του λάδανου (CcGGPPS1 και CcGGPPS2). Τα CcHMGR και CcDXS cdnas προέκυψαν από την EST ανάλυση από cdna βιβλιοθήκη κατασκευασμένη από ολικό RNA τριχών από φύλλα του C. creticus. Η λειτουργικότητα των GGPPS cdnas επιβεβαιώθηκε μετά από την έκφραση τους σε κύτταρα ζύμης. 1

18 Στη συνέχεια μελετήθηκε η έκφραση των παραπάνω γονιδίων σε διάφορους ιστούς του φυτού και μετά από διάφορες μεταχειρίσεις. Από τις παραπάνω μελέτες προέκυψε ότι τα γονίδια αυτά παρουσιάζουν μεταξύ τους διαφορετικό πρότυπο έκφρασης και ακόμη ότι τα δύο CcGGPPS γονίδια εκφράζονται διαφορετικά κάτω από όλες σχεδόν τις συνθήκες που έχουν μελετηθεί στην παρούσα εργασία. Η έκφραση των συγκεκριμένων γονιδίων δεν μεταβάλλεται σημαντικά μέσα στην διάρκεια ενός έτους ή μίας ημέρας, ενώ φαίνεται να ελέγχεται αναπτυξιακά τουλάχιστον στα φύλλα. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι τα επίπεδα των mrnas τους ήταν σημαντικά υψηλότερα στις τρίχες που είχαν απομονωθεί από φύλλα του φυτού σε σχέση με τα ολικά φύλλα. Ακόμη παρατηρήθηκε παροδική αύξηση των mrnas μετά από τις αβιοτικές καταπονήσεις που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία όπως ήταν η ξηρασία, υψηλές θερμοκρασίες και μηχανικός τραυματισμός ενώ αύξηση παρατηρήθηκε και μετά από προσθήκη ιασμονικού οξέος. Η παρούσα εργασία είναι η πρώτη προσπάθεια μελέτης της βιοσύνθεσης των τερπενίων σε μοριακό επίπεδο στο συγκεκριμένο φυτό. Με την συνέχιση και επέκταση της έρευνας αυτής είναι πιθανό να καταστεί δυνατή η αύξηση της παραγωγής των διτερπενίων που μπορούν να παραχθούν από τους ιστούς του φυτού αυτού αλλά και η παραγωγή προϊόντων με ακόμη ισχυρότερη φαρμακολογική δράση. 2

19 1. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 1.1 Περιγραφή και σπουδαιότητα του φυτού Cistus creticus ssp. creticus Τα είδη του γένους Cistus (οικ. Cistaceae) είναι πολυετή, θαμνώδη υποτροπικά φυτά που αναπτύσσονται κυρίως σε ξηρές, βραχώδεις και μη καλλιεργούμενες περιοχές της Μεσογείου(Χαβάκη, 1970). Η οικογένεια Cistaceae περιλαμβάνει 8 γένη και περίπου 180 είδη (Guzman and Vargas, 2005). Φυτά της οικογένειας αυτής απαντώνται κυρίως στις παραμεσόγειες περιοχές (Guzman and Vargas, 2005) (Εικ. 1.1) αν και ένα δεύτερο κέντρο εξάπλωσης, με ολιγάριθμους εκπροσώπους, βρίσκεται στη βόρεια και νότια Αμερική. Το γένος Cistus αντιπροσωπεύεται από είκοσι είδη, δεκαέξι από τα οποία συναντιούνται στην μεσόγειο (Warburg, 1968) ενώ εφτά από αυτά φύονται στην Ελλάδα. Στην Κρήτη ενδημούν τέσσερα είδη: Cistus creticus L., C. monspeliensis L., C. parviflorus L. και C. salvifolius L. Το πρώτο απαντάται στη Κρήτη με δύο υποείδη: Cistus creticus ssp. creticus (ή Cistus incanus) και Cistus creticus ssp. eriocephalus (Greuter, 1984). Εικόνα 1.1. Χάρτης κατανομής και αριθμός των ειδών του Cistus. Ο αριθμός μέσα σε κάθε κύκλο δείχνει τον αριθμό των ειδών που ευδοκιμούν σε κάθε περιοχή. Το διάγραμμα δείχνει την αναλογία των ειδών με λευκά και ρόδινα άνθη (λευκό και γκρι μέρος των κύκλων αντίστοιχα) σε κάθε χώρα. Στην Δυτική Μεσόγειο παρατηρείται η πιο έντονη διαφοροποίηση ανάμεσα στα είδη του γένους. Η περιοχή που αντιστοιχεί σε αυτό που ονομάζουμε «Μεσογειακή» δείχνεται με γκρι χρώμα (Guzman and Vargas, 2005). 3

20 Το Cistus creticus ssp. creticus είναι θάμνος με ύψος που μπορεί να φτάσει ως και 100 cm (Εικ. 1.2α). Συναντάται σε υποβαθμισμένες μη καλλιεργούμενες περιοχές όπου κυριαρχούν τα φρύγανα (Μεσογειακή μακία). Τα άνθη του είναι τέλεια, ερμαφρόδιτα, ακτινόμορφα, πενταμερή και έχουν έντονο ρόδινο χρώμα, με διάμετρο 4-6 cm περίπου (Εικ. 1.2β). Εμφανίζονται την άνοιξη (Μάρτιο-Μάιο) και δεν έχουν μεγάλη διάρκεια. Οι στήμονες είναι πολυάριθμοι, υπόγυνοι με ελεύθερα νήματα. Η ωοθήκη είναι επιφυής (υπόγυνο άνθος) αποτελούμενη από πέντε ενωμένα καρπόφυλλα, μονόχωρη με επιτοίχιο πλακούντα. Ο καρπός του είναι πεντάχωρη κάψα και περιέχει μεγάλο αριθμό από σπέρματα. Όλα τα φυτά του γένους Cistus είναι εντομοεπικονιαζόμενα και αυτόστειρα (Talavera et al., 1993; Manetas and Petropoulou, 2000). Α. B. Εικόνα 1.2. Το φυτό Cistus creticus ssp. creticus (A) και το άνθος του (B) (φωτο: Α.Κ. Κανελλής). Τα φύλλα του φυτού είναι ωοειδή μήκους 2-3 cm, απλά, αντίθετα, με κυματοειδής περιφέρεια και παρουσιάζουν εποχιακό διμορφισμό. Τα φυτά που χαρακτηρίζονται έτσι 4

21 έχουν την ικανότητα να μπορούν να μειώνουν την επιφάνεια αναπνοής τους (φυλλική επιφάνεια) ανάλογα με την εποχή. Αυτό κατορθώνεται με την αποβολή των χειμερινών - μεγάλου μεγέθους φύλλων και την ανάπτυξη άλλων μικρότερων φύλλων κατά τους καλοκαιρινούς μήνες. (Aronne and De Micco, 2001). Ακόμη, η μορφολογία των δύο διαφορετικών ειδών φύλλων είναι διαφορετική. Τα χειμερινά φύλλα είναι επίπεδα ενώ τα καλοκαιρινά έχουν «κατσαρό» έλασμα και είναι καλυμμένα με μεγαλύτερο αριθμό τριχών. Τα χαρακτηριστικά αυτά προσδίδουν στο φυτό μεγαλύτερη αντοχή σε ξηρά κλίματα (Aronne and De Micco, 2001). Τα φυτά του γένους Cistus χαρακτηρίζονται σαν «πυρόφυτα» λόγω της ιδιότητας τους να διεγείρεται η βλάστηση των σπόρων τους μετά από έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες (Roy and Sonie, 1992; Trabaud and Renard, 1999). Αυτό οφείλεται στο ότι τα σπέρματα καλύπτονται από σκληρό κάλυμμα το οποίο διαρρηγνύεται μετά από την έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες, επιτρέποντας έτσι την απορρόφηση νερού και το φύτρωμα των σπόρων. Αν δεν συμβεί αυτό, τότε το κάλυμμα αυτό καταστρέφεται από διαφορετικές αιτίες με πιο αργούς ρυθμούς -συνήθως από μικροοργανισμούς- ή και όχι. Οι σπόροι του φυτού μπορεί να παραμείνουν σε κατάσταση λήθαργου για πολλά χρόνια ώσπου να βρεθούν σε κατάλληλες συνθήκες για να βλαστίσουν. Μετά τη βλάστηση τους, τα νεαρά φυτά ανθίζουν σε ηλικία μεγαλύτερη των δύο χρόνων και η διάρκεια ζωής τους είναι γύρω στα δεκαπέντε χρόνια (Roy and Sonie, 1992; Οικονομάκης, 1996). Τα φύλλα του φυτού καλύπτονται και από τις δύο επιφάνειες από μονήρεις, πολυκύτταρες αδενικές και σύνθετες μη αδενικές- τρίχες (Εικ. 1.3) αποτελούμενες από 6-12 διακλαδώσεις (Gulz et al., 1996). Οι πρώτες έχουν σχήμα σωληνοειδές με σφαιρική κατάληξη, έχουν μήκος μm ενώ η κεφαλή-κατάληξη έχει διάμετρο μm. Από τις κατασκευές αυτές παράγεται και εκκρίνεται η ρητίνη, το κοινό λάδανο (Εικ. 1.4). Το ποσό της ρητίνης το οποίο παράγεται στα φύλλα παρουσιάζει εποχιακή διακύμανση αλλά ποικίλει και από περιοχή σε περιοχή λόγω περιβαλλοντικών ή και γενετικών παραγόντων και κυμαίνεται από % ξηρού βάρους φύλλων (Οικονομάκης, 1996; Robles and Garzino, 2000; Demetzos C., 2002). Η επικάλυψη των φύλλων από ρητίνη και τρίχες προσδίδει στο φυτό μεγαλύτερη ανθεκτικότητα σε ξηρά κλίματα με έντονη ηλιοφάνεια, μια που βοηθάνε στην μείωση της εξατμισοδιαπνοής αλλά και της 5

22 υπεριώδους ακτινοβολίας που λαμβάνουν οι επιφάνειες των φύλλων (Οικονομάκης, 1996). Το Cistus creticus ssp. creticus αξιοποιείται εμπορικά στην Κρήτη, όπου η συλλογή και η εκμετάλλευση της ρητίνης του γίνεται σήμερα κατά παγκόσμια αποκλειστικότητα, κυρίως λόγω των αρωματικών και δευτερευόντως λόγω των φαρμακευτικών ιδιοτήτων της. Το υποείδος αυτό αναφέρεται επίσης ως κύστος, κουνούκλα, κύστους, κίστοι, κίσθοι, λάντανο ή ως «αλάδανος» ή «αγκίσαρος» στην Κρήτη (Οικονομάκης, 1996). Το «λάδανο» που αντιστοιχεί στο «λήδανο» του Ηροδότου, ή το «λάδανο» ή «λήδο» του Διοσκουρίδη, συλλέγεται από φυσικούς πληθυσμούς με τα παραδοσιακά μηχανικά μέσα, κυρίως από φυτά που ευδοκιμούν σε συγκεκριμένες περιοχές του νησιού (Σίσες, Μπαλί, Μυλοποτάμου Ρεθύμνης και Αλόιδες και Φόδελε Ηρακλείου), αποτελεί δε σημαντική πηγή εισοδήματος για τους κατοίκους των περιοχών αυτών. Εδώ αξίζει να σημειωθεί ότι το άλλο υποείδος (Cistus creticus ssp. eriocephalus) δεν παράγει ρητίνη σε αξιόλογη (εκμεταλλεύσιμη) ποσότητα (Anastasaki et al., 1999). Εικόνα 1.3. Αδενικές και μη αδενικές τρίχες των φύλλων του Cistus creticus όπως φαίνονται σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (Πατεράκη, Αργυροπούλου, Μποζαμπαλίδης, Κανελλής, αδημοσίευτα αποτελέσματα). Σήμερα, το συλλεγόμενο προϊόν εξάγεται κυρίως στη Σαουδική Αραβία και στα Ενωμένα Αραβικά Εμιράτα, ενώ αρωματικά αποστάγματα (absolutes) τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως σε πολλά σκευάσματα καλλυντικών παράγονται τελευταία και από πολλές ελληνικές εταιρείες, όπως η ΑPIVITA (Κουτσιανάς, 1996). Πρέπει επίσης να 6

23 αναφερθεί η χρησιμοποίηση του για την Παρασκευή του Αγίου Μύρου (Δεμέτζος, 1990). Οι αρωματικές και φαρμακολογικές ιδιότητες της ρητίνης ήταν γνωστές από αρχαιοτάτων χρόνων και οδήγησαν σε ευρεία χρήση της για θεραπευτικούς σκοπούς. Σχετικές αναφορές έχουν γίνει από τον Ιπποκράτη, τον Ηρόδοτο και τον Διοσκουρίδη (Χαβάκη, 1970). Το λάδανο χρησιμοποιούνταν σε αλοιφές αλλά και ως θυμίαμα. Εικόνα 1.4. Αδενικές τρίχες φύλλων του Cistus creticus εκκρίνοντας ρητίνη, όπως φαίνονται σε στερεοσκόπιο (Πατεράκη, Αργυροπούλου, Μποζαμπαλίδης, Κανελλής, αδημοσίευτα αποτελέσματα). Προϊόντα από τα είδη του Cistus χρησιμοποιούνται στη λαϊκή θεραπευτική ως αντιφλεγμονώδη και παυσίπονα. Αλοιφή που παρασκευάζεται από την ρητίνη χρησιμοποιείται για δερματικές παθήσεις, για πόνους αρθρώσεων και ρευματικές παθήσεις (Δεμέτζος, 1990), για τη θεραπεία ποικίλων νοσημάτων του δέρματος, το εκχύλισμα των φύλλων τους χρησιμοποιείται επίσης σαν αφέψημα, ενώ τα ανθισμένα κλαδιά κατά του άσθματος και ως αντιδιαρροϊκό (Petereit et al., 1991; Danne et al., 1994). Τον 18 ο αιώνα χρησιμοποιήθηκε κατά της πανώλης, ενώ σύμφωνα με την παραδοσιακή ιατρική το λάδανο μπορεί να αναστείλει το «βγαρτό» - δηλαδή αποστήματα καλοήθους μορφής (Δεμέτζος, 1996). Επίσης αναφέρεται η χρησιμοποίησή του σε όγκους μήτρας, ενώ αναμεμειγμένο με λίπος χρησιμοποιούταν σε ρινικούς πολύποδες και καρκινογόνα έλκη (Δεμέτζος, 1996). Έχει χρησιμοποιηθεί ακόμη για 7

24 καταπολέμηση της αϋπνίας, του πονόδοντου και της διάρροιας. Οι βασικές ουσίες από τις οποίες αποτελείται η ρητίνη αυτή είναι τα «λαβδανικά διτερπένια» (Demetzos et al., 1989; Demetzos et al., 1990; Chinou et al., 1994; Demetzos et al., 1994; Demetzos et al., 1994; Demetzos and Loukis, 1995; Anastasaki et al., 1999; Αναστασάκη, 1999) ενώ το χαρακτηριστικό άρωμα της ρητίνης οφείλεται πιθανώς σε ενώσεις που τα κύρια συστατικά τους ανήκουν στην ομάδα των σεσκιτερπενίων (Demetzos et al., 1994; Demetzos and Loukis, 1995; Demetzos et al., 1997). Άλλες ουσίες που έχουν βρεθεί στα επίγεια μέρη του φυτού είναι τανίνες, πολυφαινόλες (Danne et al., 1993,, 1994) φλαβονοειδή σε μορφή άγλυκων (Demetzos et al., 1990; Petereit et al., 1991; Attaguile et al., 2000) αλλά και ως γλυκοσίδες (Demetzos et al., 1989; Danne et al., 1993). Το ανανεωμένο ενδιαφέρον για το φυτό αυτό προέκυψε μετά την ανακάλυψη ότι συγκεκριμένα διτερπένια του φυτού παρουσιάζουν ισχυρή αντιμικροβιακή, αντιμυκητιακή αλλά κυρίως αντιλευχαιμική δράση, συγκρινόμενη με καθιερωμένα φάρμακα των κατηγοριών αυτών, όπως η αμπικιλλίνη και η καμπτοθεκίνη αντίστοιχα (Chinou et al., 1994; Demetzos et al., 1994; Demetzos et al., 1994; Demetzos and Loukis, 1995; Demetzos et al., 1997; Dimas et al., 1998; Singh et al., 1998; Demetzos et al., 1999; Dimas and Demetzos, 1999; Dimas et al., 1999; Dimas et al., 1999; Dimas et al., 2000; Dimas et al., 2001). Πολλές από τις ουσίες που προέρχονται από την ρητίνη αλλά και τα αιθέρια έλαια του φυτού έχουν απομονωθεί και χαρακτηριστεί (Demetzos et al., 1990; Chinou et al., 1994; Demetzos et al., 1994; Demetzos et al., 1994; Demetzos et al., 1994; Demetzos et al., 1994; Demetzos and Loukis, 1995; Demetzos et al., 1997; Demetzos et al., 1999). Το μεγαλύτερο κλάσμα των ουσιών αυτών ανήκει στα λαβδανικά διτερπένια (περίπου 59%) και από αυτά το κύριο συστατικό (περίπου 33%) είναι ισομερή και παράγωγα του οξειδίου της μανοόλης (Demetzos et al., 1994; Demetzos and Loukis, 1995; Demetzos et al., 1997). Πιο ειδικά, τo λαβδανικό διτερπένιο (13Ε)-λαβδα-13-εν-8α,15-διόλη παρουσίασε ισχυρή 8

25 κυτταροστατική δράση in vitro εναντίον 13 λευχαιμικών ανθρώπινων σειρών (ανάμεσα σε 14 που ελέγχθηκαν), ενώ η (13Ε)-λαβδα-7,13-διενόλη παρουσίασε κυτταροστατική δράση in vitro εναντίον μίας εξ αυτών (Dimas et al., 1998). Πολύ ενδιαφέρον παρουσιάζει το ότι η σκλαρεόλη [(13R)-λαβδα-14-εν-8,13-διόλη] και ένα παράγωγο του οξειδίου της 3-β-υδροξυ-13-επι-μανοόλης, όλα λαβδανικά διτερπένια που έχουν απομονωθεί από το φυτό αυτό, αποδείχτηκε ότι προκαλούν την απόπτωση ανθρώπινων λευχαιμικών κυττάρων αλλά και κυττάρων καρκίνου του μαστού in vitro (Dimas et al., 1999; Dimas et al., 2001; Dimas K, 2006). Οι παραπάνω ουσίες παρεμβαίνουν στη διαδικασία της κυτταρικής διαίρεσης και «παγιδεύουν» τα κύτταρα στη φάση G 0/1 (Dimas et al., 2001; Dimas K, 2006). Στην ίδια έρευνα βρέθηκε ότι οι αντιλευχαιμικές δόσεις της σκλαρεόλης δεν ήταν τοξικές για τα φυσιολογικά μονοπύρηνα λευκοκύτταρα. Αξίζει να σημειωθεί ότι η σκλαρεόλη ενδυναμώνει την δράση άλλων γνωστών αντικαρκινικών φαρμάκων (Dimas K, 2006). Λόγω του εξαιρετικού φαρμακευτικού ενδιαφέροντος που παρουσιάζουν οι λιπόφιλες αυτές ουσίες, τον τελευταίο καιρό γίνονται προσπάθειες να ενσωματωθούν σε λιποσωμάτια, να σταθεροποιηθούν και να μελετηθεί η δράση τους (Kyrikou et al., 2005; Matsingou et al., 2005; Hatziantoniou et al., 2006). Στις παραπάνω μελέτες βλέπουμε ότι και σε αυτήν την μορφή, οι ουσίες που αναφέρθηκαν στην προηγούμενη παράγραφο, παρουσιάζουν κυτταροτοξική και κυτταροστατική δράση in vitro, ενάντια στις περισσότερες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Εκτός από τα λαβδανικά διτερπένια, τα είδη του γένους Cistus χαρακτηρίζονται και από την παρουσία φλαβονοειδών στα αιθέρια έλαια τους. Τα φλαβονοειδή είναι συστατικά, ευρέως διαδεδομένα στο φυτικό βασίλειο, γνωστά κυρίως για τις αντιοξειδωτικές ιδιότητές τους ενώ παρουσιάζουν και αντιφλεγμονώδη (Chan et al., 1998), αντιαλλεργική, αντιϊκή και αντινεοπλασματική δράση (Wei et al., 1999). Επιδημιολογικές μελέτες έδειξαν ότι υπάρχει μια σαφής συσχέτιση ανάμεσα στην υψηλή περιεκτικότητα των τροφών σε φλαβονοειδή (π.χ. ριβοφλαβίνη, ρεσβερατρόλη, κλπ) και τη χαμηλή συχνότητα εμφάνισης καρκίνου και καρδιαγγειακών νοσημάτων (Rimm EB, 1996). Η φαρμακολογική δράση των φλαβονοειδών οφείλεται κατά κύριο λόγο στην ικανότητά τους να «σαρώνουν» τις ενεργές μορφές οξυγόνου (ΕΜΟ) (Attaguile et al., 9

26 2000) που δημιουργούνται συχνά μέσα στο κύτταρο κάτω από ποικίλες συνθήκες καταπόνησης (Wei et al., 1999; Attaguile et al., 2000). Το υδατικό εκχύλισμα από φύλλα του C. creticus ssp. creticus και του C. monspeliensis εμφάνισε «προστατευτική» δράση ενάντια στην κατάτμηση πλασμιδιακού DNA μετά από έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία και H 2 O 2 (Attaguile et al., 2000) και αυτό οφείλεται κυρίως στα φλαβονοειδή, όπως αναφέρουν οι ερευνητές. Η παρουσία φλαβονοειδών στο διαιτολόγιο και η άμεση εφαρμογή τους σε φαρμακευτικά σκευάσματα τα καθιστούν πολύτιμες ουσίες για την προληπτική ιατρική, αλλά και για την παρασκευή δερματολογικών προϊόντων με αντιοξειδωτική δράση. 1.2 Δευτερογενείς μεταβολίτες και ο ρόλος τους στην ζωή των φυτών Τα φυτά παράγουν ένα μεγάλο αριθμό μεταβολιτών. Μόνο ως σήμερα, περίπου χιλιάδες διαφορετικές ουσίες έχουν χαρακτηρισθεί ενώ είναι σίγουρο ότι υπάρχουν πολύ περισσότερες (Pichersky and Gang, 2000). Οι μεταβολίτες αυτοί χωρίζονται σε πρωτογενείς και δευτερογενείς. Στους πρώτους κατατάσσονται αυτοί που είναι κοινοί για όλους τους ζωντανούς οργανισμούς και είναι απαραίτητοι για τη σωστή λειτουργία του κυττάρου, ενώ στους δεύτερους αυτοί που παράγονται μόνο από μια συγκεκριμένη ομάδα ζωντανών οργανισμών (συνήθως από συγκεκριμένα και εξειδικευμένα κύτταρα/ιστούς ή σε συγκεκριμένα ηλικιακά στάδια) και είναι χρήσιμοι όχι για κάθε κύτταρο ξεχωριστά αλλά για ολόκληρο τον οργανισμό και σχετίζονται με την «επικοινωνία» και αλληλεπίδραση του φυτού με το περιβάλλον του. Παλαιότερα πρωτογενείς μεταβολίτες θεωρούνταν αυτοί που είναι «απαραίτητοι» για την ζωή του οργανισμού ενώ οι δευτερογενείς όχι. Γεγονός είναι ότι δεν υπάρχει σαφής διαχωρισμός ανάμεσα στις δύο αυτές κατηγορίες μια και υπάρχουν ουσίες που δεν είναι γνωστή ακόμη η χρήση τους και ο ρόλος τους για την ζωή του φυτού και του κυττάρου (Dewick, 1997; Pichersky and Gang, 2000). Σήμερα, είναι γνωστό ότι η ικανότητα των φυτών να παράγουν τις ουσίες αυτές έχει «επιλεγεί» μέσα στο πέρασμα του χρόνου κατά την εξελικτική διαδικασία, σαν μηχανισμός προσαρμογής στο περιβάλλον και αντίστασης στους φυσικούς εχθρούς, πράγμα που δείχνει την σπουδαιότητα των ουσιών αυτών για 10

27 την επιβίωση των φυτών πάνω στον πλανήτη (Benderoth et al., 2006). Ο ρόλος των δευτερογενών μεταβολιτών για τη ζωή των φυτών θεωρείται ότι είναι συνήθως αμυντικός, προστατεύοντας τα φυτά που φύονται σε αντίξοες συνθήκες όπως υψηλή υπεριώδη ακτινοβολία, ξηρασία, αλλά και από βιοτικούς παράγοντες (Karban and Baldwin, 1997; Sundar and Redd, 2001; Roda et al., 2003). Άλλη σημαντική λειτουργία των μεταβολιτών αυτών είναι η προσέλκυση εντόμων για επικονίαση μέσω του αρώματος που παράγουν τα άνθη και του χρώματος των πετάλων τους με αποτέλεσμα καλύτερο ρυθμό αναπαραγωγής (Pichersky and Gershenzon, 2002; Manfred et al., 2003; Singer et al., 2004). Το άρωμα των ανθέων οφείλεται κυρίως σε πτητικές ουσίες, ανάμεσα στις οποίες κυριαρχούν τα μονο- και σεσκι-τερπένια, τα φαινυλοπροπανοειδή και παράγωγα λιπαρών οξέων. Ακόμη, σε αυτές οφείλεται το άρωμα και η γεύση πολλών φυτικών ιστών. Οι ουσίες, που συνθέτουν τα φυτά για την άμυνα τους ενάντια σε εχθρούς (έντομα, παθογόνους μικροοργανισμούς αλλά ακόμη και άλλα γειτονικά φυτά), και αυτές για την προσέλκυση επικονιαστών, προσδίδουν στα φυτά τη δυνατότητα για καλύτερες συνθήκες διαβίωσης και υψηλότερους αναπαραγωγικούς ρυθμούς από τα γειτονικά άτομα που δεν διαθέτουν αυτή την ικανότητα (Pichersky and Gang, 2000). Ακόμη, κάποιοι δευτερογενείς μεταβολίτες λειτουργούν σαν μόρια μετάδοσης σήματος από φυτό σε φυτό (Dudareva and Pichersky, 2000). Η άμυνα των φυτών χωρίζεται σε δύο κατηγορίες: στην άμεση άμυνα και στη έμμεση (Karban and Baldwin, 1997; Keeling and Bohlmann, 2006). Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν οι «ενέργειες» που κάνει το φυτό για να αποτρέψει την θρέψη των φυτοφάγων οργανισμών σε βάρος του. Αυτό το καταφέρνει με την παραγωγή και έκκριση τοξινών και απωθητικών ουσιών για τους οργανισμούς αυτούς (Karban and Baldwin, 1997). Τα φυτά αμύνονται με αυτό τον τρόπο όχι μόνο ενάντια σε εχθρούς έντομα αλλά και ενάντια σε φυτοφάγα σπονδυλωτά (Foley and Moore, 2005). Η έμμεση άμυνα των φυτών έχει να κάνει με «υποβοήθηση» και «πρόσκληση» των φυσικών εχθρών των φυτοφάγων οργανισμών, παράγουν δηλαδή και εκκρίνουν ουσίες που ελκύουν παράσιτα και αρπακτικά των εχθρών τους (Baldwin and Preston, 1999; Dicke, 1999; Kahl et al., 2000; Van Poecke et al., 2001; Degenhardt et al., 2003). Αυτό έχει δειχθεί για αρκετά είδη φυτών, πολλά από τα οποία έχουν εμπορική αξία. Τουλάχιστον δώδεκα οικογένειες 11

28 φυτών έχει δειχθεί ότι κατέχουν αμυντικούς μηχανισμούς αυτού του τύπου (Dicke, 1999). Η αμυντική στρατηγική (άμεση και έμμεση) των φυτών παρέχει μια ενδιαφέρουσα προοπτική, με την χρήση της βιοτεχνολογίας, για φιλική στο περιβάλλον προστασία εμπορικά αξιόλογων καλλιεργειών (Degenhardt et al., 2003). 1.3 Αδενικοί ιστοί στα φυτά Οι δευτερογενείς μεταβολίτες παράγονται κατά κύριο λόγω από αδενικές κατασκευές των φυτών. Παραδείγματα τέτοιων φυτικών αδένων είναι οι αδενικές τρίχες που βρίσκονται στην επιφάνεια των επίγειων τμημάτων του φυτού, οι οποίες συνθέτουν και συγκεντρώνουν ρητίνη και αιθέρια έλαια (Wagner, 1991; Gershenzon et al., 1992), οι αδενικές κοιλότητες που παράγουν αρωματικά έλαια (στην επιδερμίδα των φρούτων της οικογένειας Citrus αλλά και στην επιδερμίδα φύλλων όπως αυτών του ευκαλύπτου), αδενικοί αγωγοί και κοιλότητες στον κορμό των κωνοφόρων δέντρων που παράγουν κυρίως ελαιορητίνη για την άμυνα του φυτού, και τα οσμοφόρα, ή αρωματικοί αδένες, κατασκευές που βρίσκονται κυρίως στα πέταλα των ανθέων και εκκρίνουν πτητικές αρωματικές ουσίες για την προσέλκυση εντόμων-επικονιαστών (McCaskill and Croteau, 1999). Γενικά οι αδενικοί ιστοί αφιερώνουν μεγάλες ποσότητες ενέργειας και άνθρακα για την σύνθεση συγκεκριμένων ουσιών, που ενίοτε είναι τοξικές ή όχι «απαραίτητες» για την φυσιολογική ανάπτυξη του οργανισμού. Οι φυτικοί αδένες μπορεί να διαχωριστούν σε φωτοσυνθετικούς (αδενικές τρίχες του καπνού, πατάτας, γερανίου και της ντομάτας) και μη φωτοσυνθετικούς (αδενικές τρίχες μέντας και βασιλικού). Η διαφορά μεταξύ των δύο αυτών διαφορετικών ειδών είναι σημαντική (McCaskill and Croteau, 1999) και η βιβλιογραφία που παρατίθεται σε αυτό). Οι πρώτοι είναι ικανοί να προσλάβουν διοξείδιο του άνθρακα που χρησιμοποιείται στη συνέχεια για την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων των δευτερογενών μεταβολιτών ενώ οι δεύτεροι βασίζονται αποκλειστικά στους «υποστηρικτικούς» ιστούς για να προμηθευτούν τις «πρώτες ύλες» για την σύνθεση των μεταβολιτών που παράγουν, που σημαίνει μειωμένη δυνατότητα παραγωγής (Keen and Wagner, 1985; McCaskill et al., 1992). 12

29 Οι αδενικές τρίχες μπορούμε να πούμε ότι αποτελούν την πρώτη γραμμή άμυνας των φυτών, μιας και βρίσκονται στην επιφάνεια τους, το πρώτο σημείο επαφής του φυτού με το περιβάλλον του. Ο ρόλος των αδενικών τριχών πιστεύεται ότι σχετίζεται με τους μηχανισμούς άμυνας κυρίως απέναντι σε φυτοφάγα έντομα και παθογόνους οργανισμούς, αλλά και σε αβιοτικούς παράγοντες (Karban and Baldwin, 1997; Roda et al., 2003). Προσφέρουν στα φυτά «μηχανική» αλλά και «χημική» άμυνα (Wagner, 1991; Gershenzon et al., 1992). Σε πολλά είδη έχει βρεθεί ότι υπάρχει κάποια αρνητική σχέση ανάμεσα στην πυκνότητα των τριχών στην επιφάνεια των φύλλων και την προσβολή από έντομα όπως και την εναπόθεση αυγών εντόμων (Wheeler and Ordung, 2005). Παράγουν μια μεγάλη ποικιλία από δευτερογενείς μεταβολίτες, όπως τερπένια, φλαβονοειδή και αλκαλοειδή (Wagner, 1991; Guo et al., 1994; Roda et al., 2003). Οι κατασκευές αυτές πιστεύεται ότι βρίσκονται απομονωμένες έξω από το κύριο σώμα του φυτού γιατί πρώτον όπως αναφέρθηκε και παραπάνω βρίσκονται στην «πρώτη γραμμή άμυνας» του φυτού και δεύτερον εξ αιτίας της κυτταροτοξικότητας των ουσιών που παράγουν (Lange and Croteau, 1999; Lange et al., 2000). Παρόλο που θεωρήθηκαν αρχικά ότι απλά παρέχουν μια σταθερή-δομική άμυνα στο φυτό, δείχθηκε στη συνέχεια ότι τα επίπεδα των ουσιών που παράγονται από αυτές είναι επαγόμενα από καταστάσεις καταπόνησης, έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία, οξειδωτικό στρες, μηχανικό τραυματισμό, εντομολογικές προσβολές, εφαρμογή ιασμονικού οξέος κ.ά. το οποίο ήταν ένδειξη για την συμμετοχή των μεταβολιτών αυτών στην «χημική άμυνα», πέρα από την μηχανική, που παρέχουν οι αδενικές τρίχες στο φυτό (Roda et al., 2003) Oι κυρίες «τάξεις» των φυτικών δευτερογενών μεταβολιτών είναι τρεις: τερπένια (ταξόλη, λεμονένιο, σκλαρεόλη, καροτενοειδή, καουτσούκ), φαινολικές ενώσεις (φλαβονοειδή, ανθοκυανίνη, ρεσβερατρόλη, λιγνίνη) και αλκαλοειδή (νικοτίνη, υοσκυαμίνη, καφεΐνη, κοκαΐνη) (Dewick, 1997). Και ενώ ο αριθμός των μεταβολιτών αυτών είναι μεγάλος, οι κατηγορίες/είδη των χημικών αντιδράσεων (και αντίστοιχα οι κατηγορίες των ενζύμων) που απαιτούνται για την σύνθεση τους είναι λίγες (π.χ. μεθυλιώσεις, υδροξυλιώσεις, κυκλοποιήσεις) (Pichersky and Gang, 2000). Συνήθως κάθε προϊόν συνθέτεται από ένα συγκεκριμένο ένζυμο, όμως έχουν παρατηρηθεί περιπτώσεις κατά τις οποίες περισσότερα του ενός προϊόντα μπορούν να προέλθουν από ένα μόνο 13

30 ένζυμο, αλλά και αντίστροφα, όπου δηλαδή ένα προϊόν μπορεί να συντεθεί από πάνω από ένα ένζυμα (τουλάχιστον in vitro), χρησιμοποιώντας το ίδιο ή και διαφορετικά υποστρώματα (Maury et al., 1999; Phillips et al., 1999; Tholl, 2006). Υπολογίζεται ότι το 15 25% των φυτικών γονιδίων συμμετέχει στον δευτερογενή μεταβολισμό (Somerville and Somerville, 1999). Οι μεταβολίτες αυτοί έχουν πολλές και διαφορετικές ιδιότητες εκτός του ρόλου τους στην φυσιολογία των φυτών. Σήμερα χρησιμοποιούνται ευρέως σαν φαρμακευτικές ουσίες, καλλυντικά, προσθετικά, αντιοξειδωτικά και αρωματικά τροφίμων αλλά και σε πολλές άλλες βιομηχανικές χρήσεις (Lange and Croteau, 1999; McCaskill and Croteau, 1999; Sandmann, 2001; Bouvier et al., 2003). 1.4 Τερπένια και ο ρόλος τους στην ζωή των φυτών Τα τερπένια αντιπροσωπεύουν μια τάξη λιπόφιλων ουσιών με μεγάλες και έντονες διαφορές στην χημεία αλλά και στην λειτουργία τους. Περιλαμβάνουν στις τάξεις τους μεταβολίτες που παίζουν σημαντικό ρόλο τόσο στον πρωτογενή όσο και στο δευτερογενή μεταβολισμό των φυτών (Langenheim, 1994; Bohlmann et al., 1998; Lange and Croteau, 1999; Lange et al., 2000). Είναι μία από τις μεγαλύτερες ομάδες μεταβολιτών, με περισσότερες από ουσίες γνωστές ως σήμερα (Trapp and Croteau, 2001; Bouvier et al., 2005). Τερπένια απαντώνται σε ευκαρυωτικούς (φυτά, μύκητες, ζώα), και προκαρυωτικούς (ευβακτήρια, αρχαιοβακτήρια, άλγη) οργανισμούς (Lange et al., 1998), αλλά η πλειοψηφία τους προέρχεται από το φυτικό βασίλειο (McCaskill and Croteau, 1998). Στην ομάδα των τερπενίων υπάγονται ουσίες που χρησιμοποιούνται για βασικές κυτταρικές λειτουργίες όπως οι κινόνες που βρίσκονται στα κανάλια ιοντικής μεταφοράς, οι στερόλες που είναι συστατικά των κυτταρικών μεμβρανών στα ευβακτήρια και στα ευκαρυωτικά κύτταρα, οι φυτικές ορμόνες όπως είναι οι γιββερελίνες, κυτοκινίνες και το αψισικό οξύ, φωτοσυνθετικές χρωστικές όπως τα καροτενοειδή και η φυτόλη (αλκοόλη που αποτελεί την πλευρική αλυσίδα της χλωροφύλλης), ουσίες που παίζουν ρόλο στη 14

31 ρύθμιση της υποκυτταρικής μεταφοράς ουσιών (πρενυλίωση πρωτεϊνών) αλλά και ουσίες που λειτουργούν ως μόρια μεταφοράς σήματος (Langenheim, 1994; McGarvey and Croteau, 1995; Lange and Croteau, 1999). Εκτός από τις παραπάνω δράσεις των τερπενίων, που σχετίζονται περισσότερο με τον πρωτογενή μεταβολισμό, υπάρχουν και αυτές που όπως αναφέρθηκε και πριν σχετίζονται με το δευτερογενή μεταβολισμό. Τα τερπένια είναι ουσίες που συμμετέχουν στο αμυντικό σύστημα των φυτών, όχι μόνο απέναντι σε βιοτικούς (φυτοφάγα θηλαστικά και έντομα, φυτοπαθογόνους μύκητες και βακτήρια) αλλά και αβιοτικούς παράγοντες (McGarvey and Croteau, 1995; Munne-Bosch and Alegre, 2003). Στα κωνοφόρα, που το φαινόμενο αυτό έχει μελετηθεί εκτεταμένα, η ελαιορητίνη που εκκρίνεται μετά από εντομολογική προσβολή του κορμού, είναι ένα σύμπλεγμα από τερπενοειδή (μονοσεσκι- και διτερπένια) που περιέχει τοξίνες και ουσίες με αντιμικροβιακές ιδιότητες που δρουν συνεργιστικά για να αποθαρρύνουν την εντομολογική επίθεση. Μετά την επαφή της ρητίνης αυτής με τον ατμοσφαιρικό αέρα, οι πτητικές ουσίες εξατμίζονται, αυτές που μένουν κρυσταλλοποιούνται και καλύπτουν την πληγή που προκαλείται από τα ξυλοφάγα έντομα, εμποδίζοντας δευτερογενείς προσβολές από άλλα παθογόνα (Phillips and Croteau, 1999). Παρόμοια φαινόμενα, επαγωγής πτητικών ουσιών για την αποθάρρυνση εντομολογικών εχθρών του φυτού έχουν παρατηρηθεί στη λεύκα (Arimura et al., 2004), σε φυτά αγγουριού (Mercke et al., 2004) αλλά και σε διάφορα άλλα είδη. Με παρόμοιο τρόπο, τα φυτά αμύνονται και για τα υπόγεια μέρη τους. Έχει δειχθεί ότι σε ρίζες καλαμποκιού που έχουν προσβληθεί από παθογόνα αλλά και σε ρίζες φτέρης που έχει υποστεί μεταχείριση με ιασμονικό οξύ ουσία που η προσθήκη της λειτουργεί ως προσομοίωση μυκητολογικής προσβολής- επάγεται η παραγωγή διάφορων τερπενίων (Huber et al., 2005; Rasmann et al., 2005). Σημαντικές είναι οι μελέτες που έχουν γίνει τα τελευταία χρόνια σε σχέση με την στρατηγική της έμμεσης άμυνας των φυτών, η οποία σχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με τα τερπένια. Η παραγωγή συγκεκριμένων πτητικών τερπενίων επάγεται μετά από προσβολή φυτικών ιστών από φυτοφάγους οργανισμούς, με σκοπό να ελκύσουν εχθρούς ή παράσιτα των οργανισμών αυτών, για να περιοριστεί η περεταίρω βλάβη των φυτικών ιστών (Baldwin and Preston, 1999; Kahl et al., 2000; Degenhardt et al., 2003; De Vos et 15

32 al., 2006). Πρόσφατα δείχθηκε η αντιοξειδωτική ικανότητα κάποιων πτητικών τερπενίων (Loreto and Velikova, 2001; Loreto et al., 2004) αλλά και διτερπενίων (καρνοσικού οξέος, καρνοσόλης), ισάξια με αυτή γνωστών αντιοξειδωτικών παραγόντων όπως το ασκορβικό οξύ και η α-τοκοφερόλη, παρεμποδίζοντας την οξειδωτική βλάβη των φωτοσυνθετικών μεμβρανών (Munne-Bosch et al., 1999; Munne-Bosch and Alegre, 2000,, 2003) Πτητικά τερπένια συχνά εκπέμπονται από ανθικούς ιστούς, σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές για την προσέλκυση εντόμων επικονιαστών. Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα είναι τα άνθη φυτών του γένους Antirrihinum, τα οποία εκπέμπουν, για τον λόγο αυτό, κατά την διάρκεια της ανάπτυξης τους συγκεκριμένα μονοτερπένια από τα πέταλα (Dudareva et al., 2003). Άνθη του φυτού Arabidopsis, που ως γνωστό είναι αυτοεπικονιαζόμενο είδος, παράγουν μονοτερπένια και σεσκιτερπένια αποκλειστικά από τους ανθήρες και το στίγμα της ωοθήκης, πιθανά για την προστασία αυτών των ευαίσθητων ιστών από παθογόνους μικροοργανισμούς (Tholl et al., 2005). Πολλοί καρποί από εμπορικά σημαντικές καλλιέργειες παράγουν μια πληθώρα τερπενίων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και ωρίμανσης τους (όπως καροτένια). Οι μεταβολίτες αυτοί ευθύνονται για το χρώμα, το άρωμα αλλά και την γεύση των ιστών αυτών (Aharoni et al., 2004; Lucker et al., 2004) Ακόμη, κάποια τερπένια ευθύνονται και για φαινόμενα αλληλοπάθειας ανάμεσα σε φυτικά είδη (όπως παρεμπόδιση βλάστησης σπόρων γειτονικών ειδών), (Langenheim, 1994). Πολλά τερπένια παρουσιάζουν έντονο εμπορικό και βιομηχανικό ενδιαφέρον ως αρωματικές και γευστικές ουσίες που είτε χρησιμοποιούνται μεμονωμένες ή ως αιθέρια έλαια, αρωματικές ουσίες και προσθετικά τροφίμων (McCaskill and Croteau, 1998). Κάποια από αυτά χρησιμοποιούνται ως αγροχημικά (πυρερθρίνες) και ως εντομοκτόνα (McGarvey and Croteau, 1995). Ακόμη στην ομάδα αυτή ανήκουν ενώσεις με σημαντικές φαρμακολογικές δράσεις (Hanson, 1991; Cantrell et al., 2001; Gurib-Fakim, 2006). Αξίζει να αναφερθεί ότι ένα από τα πιο γνωστά και δραστικά αντικαρκινικά φάρμακα, η ταξόλη (Taxol, generic name paclitaxel) είναι διτερπένιο και προέρχεται από φυτά του γένους Taxus (Suffness, 16

33 1995; Hezari et al., 1997; Walker and Croteau, 2000), ενώ η αρτεμισίνη είναι σεσκιτερπένιο και χρησιμοποιείται ενάντια στη μαλάρια (McGarvey and Croteau, 1995; Souret et al., 2003). Τα τελευταία χρόνια έντονο ενδιαφέρον υπάρχει για την φωτοπροστατευτική και αντιοξειδωτική δράση τους από την βιομηχανία καλλυντικών. 1.5 Βιοσύνθεση τερπενίων Ο όρος «τερπένια» προήλθε από την γερμανική λέξη terpentin ή "turpentine, υλικό που προέρχεται από απόσταξη της ρητίνη των κωνοφόρων (μαζί με την «ροζίνη») και ειδικότερα των φυτών του γένους Pinus. Από αυτό το υλικό απομονώθηκαν τα πρώτα τερπένια και χαρακτηρίστηκε η δομή τους. Ιστορικά, η μελέτη της ρητίνης των κωνοφόρων είναι συνδεμένη με την ανάπτυξη της κλασσικής οργανικής χημείας (και κυρίως της «βιογενετικής» θεωρίας) και με την επεξεργασία και εκμετάλλευση της ελαιορητίνης των κωνοφόρων από την «ναυτική» βιομηχανία. (naval stores, χρησιμοποιούσαν την ρητίνη μαζί με πίσσα για στεγανοποίηση των ξύλινων ιστιοπλοϊκών σκαφών). Σήμερα, παρόλο που η κατασκευή ξύλινων ιστιοφόρων είναι πολύ περιορισμένη, η «τουρπεντίνη» (turpentine) και η «ροζίνη» (rosin) παράγονται ακόμη από την ελαιορητίνη και χρησιμοποιούνται από την βιομηχανία για διαφορετικούς σκοπούς (σαν υλικά για κόλλες, στεγανωτικά, διαλυτικά χρωμάτων και βερνικιών, για παραγωγή υλικών καθαριότητας και σαπουνιών, ως αρωματικές ουσίες, συστατικά μελανιών εκτύπωσης) (Croteau, 1998). Εικόνα 1.5. Χημική δομή και μετατροπή του πυροφωσφορικού ισοπεντενυλίου (IPP) σε πυροφωσφορικό διμεθυλοαλλύλιο (DMAPP) όπως καταλύεται από το ένζυμο ισομεράση του IPP (Durbecq et al., 2001). 17

34 Σήμερα γνωρίζουμε ότι για την σύνθεση όλων των τερπενίων (ή ισοπρενοειδών όπως λέγονται διαφορετικά) χρησιμοποιούνται οι «δομικές μονάδες» διφωσφορικό (ή πυροφωσφορικό) ισοπεντενύλιο (IPP) και το ισομερές του διφωσφορικό (ή πυροφωσφορικό) διμεθυλοαλλύλιο (DMAPP) (Εικ. 1.5). Συμπύκνωση μορίων IPP και DMAPP (C 5 ) οδηγεί στην δημιουργία των εναρκτήριων ενώσεων για τη σύνθεση μονο- (διφωσφορικό γερανύλιο, GPP, C 10 ), σεσκι- (διφωσφορικό φαρνεσύλιο, FPP, C 15 ) και δι- (διφωσφορικό γερανυλγερανύλιο, GGPP, C 20 ) τερπενίων (Εικ. 1.7) (West, 1981; McGarvey and Croteau, 1995; Bouvier et al., 2005; Rodriguez-Concepcion, 2006). Για πολλά χρόνια πιστεύονταν ότι το IPP προέρχονταν αποκλειστικά από το ακετυλοσυνένζυμο Α (CoA), μέσω του μεβαλονικού οξέως (μεβαλονικό ή MVA μονοπάτι) και στη συνέχεια ισομερίζονταν σε DMAPP, σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς (McGarvey and Croteau, 1995). Το βιοσυνθετικό αυτό μονοπάτι ανακαλύφθηκε γύρω στο 1950 (Goldstein and Brown, 1990), ενώ μόνο μια δεκαετία πριν από σήμερα, εμφανίστηκαν ενδείξεις για την ύπαρξη και κάποιου άλλου διαφορετικού μονοπατιού στα βακτήρια και τα φυτά (Lichtenthaler et al., 1997; Lichtenthaler and Hartmut, 1999; Rodriguez-Concepcion and Boronat, 2002; Rodriguez-Concepcion, 2006). Σήμερα η ύπαρξη του μονοπατιού αυτού έχει αποδειχθεί (ξεκινά από το πυροσταφυλικό οξύ και την 3-φωσφορική γλυκεριναλδεΰδη) και είναι ευρέως γνωστό σαν «μη μεβαλονικό» ή σαν «MEP» μονοπάτι (από την 4-φωσφορική-2-C-μέθυλο-D-ερυθριτόλη ή 2-C-methyl- D-erythritol 4-phosphate MEP-, το πρώτο συστατικό που προορίζεται αποκλειστικά για την παραγωγή IPP και DMAPP, μέσω αυτού του μονοπατιού, ανάλογο δηλαδή του μεβαλονικού οξέως) (Bouvier et al., 2005; Rodriguez-Concepcion, 2006) (Εικ. 1.6). Τα ζώα, οι μύκητες και τα αρχαιοβακτήρια διαθέτουν μόνο το MVA μονοπάτι ενώ τα περισσότερα βακτήρια και πρωτόζωα είναι εφοδιασμένα με το MEP. Στα φυτά, σε αντίθεση με τους άλλους οργανισμούς, είναι ενεργά και τα δύο παραπάνω μονοπάτια, παρόλο που εντοπίζονται και λειτουργούν σε διαφορετικά «υποκυτταρικά διαμερίσματα» (Εικ. 1.6) (Lange and Croteau, 1999; Lange et al., 2000; Eisenreich et al., 2001; Trapp and Croteau, 2001; Rodriguez-Concepcion and Boronat, 2002; Eisenreich et al., 2004; Rodriguez-Concepcion, 2006). Μέσα στα πλαίσια της εξελικτικής διαδικασίας τα φυτά, από την μία διατήρησαν το MVA μονοπάτι, αλλά απέκτησαν και το MEP μέσα από 18

35 φαινόμενα ενδοσυμβίωσης των προγόνων τους με βακτηριακής προέλευσης οργανισμούς (Pichersky and Gang, 2000). Τα γονίδια που κωδικοποιούν τα ένζυμα και των δύο μονοπατιών είναι πυρηνικά. Το MVA μονοπάτι λειτουργεί στο κυτταρόπλασμα (λέγεται και κυτταροπλασματικό) και είναι υπεύθυνο για την παραγωγή στερολών, μπρασσινοστεροειδών, κινονών, σεσκιτερπενίων αλλά και πρενυλ-ομάδων που χρησιμοποιούνται για την πρενυλίωση πρωτεϊνών. Το MEP μονοπάτι λειτουργεί στα πλαστίδια των φυτικών κυττάρων (λέγεται και πλαστιδιακό) και παρέχει IPP για την σύνθεση μονο- και δι-τερπενίων και όλες τις ουσίες που προέρχονται από αυτά όπως τα καροτενοειδή, φυτόλη, γιββερελίνες, αψισικό οξύ (Εικ. 1.11) (Bohlmann et al., 1997; Pichersky and Gang, 2000; Rohdich et al., 2001; Trapp and Croteau, 2001; Rodriguez-Concepcion and Boronat, 2002). Όλα τα γονίδια που κωδικοποιούν τα ένζυμα που συμμετέχουν στα δύο μονοπάτια έχουν κλωνοποιηθεί και χαρακτηρισθεί λειτουργικά από αρκετά φυτά (McGarvey and Croteau, 1995; Lange et al., 2000; Rodriguez-Concepcion and Boronat, 2002; Eisenreich et al., 2004; Bouvier et al., 2005). Το MEP μονοπάτι παράγει IPP και DMAPP ενώ το MVA παράγει μόνο IPP (Bouvier et al., 2005). To μονοπάτι της βιοσύνθεσης των τερπενίων μπορεί να διαιρεθεί σε τρία στάδια (Lange and Croteau, 1999; Trapp and Croteau, 2001): Στάδιο 1: Περιλαμβάνει την σύνθεση IPP και DMAPP μέσω των δύο διαφορετικών μονοπατιών (Εικ. 1.6). MVA (κυτταροπλασματικό) μονοπάτι Το αρχικό βήμα του μονοπατιού είναι η ένωση τριών μορίων ακετυλ-συνενζύμου Α για την δημιουργία της ανθρακικής αλυσίδας του 3-ύδροξυ-3-μέθυλο-γλουταρυλσυνένζυμου Α (HMG-CoA). Η παραπάνω διαδικασία ολοκληρώνεται σε δύο στάδια αντιδράσεις, με την δράση δύο διαφορετικών ενζύμων, τη θειολάση του ακετοακετυλ- 19

36 Εικόνα 1.6. Τα δύο μονοπάτια, MVA (μεβαλονικό ή κυτταροπλασματικό) και MEP (μη μεβαλονικό ή πλαστιδιακό), βιοσύνθεσης των δομικών μονάδων των τερπενίων, IPP και DMAPP στα φυτά. MVA μονοπάτι, Συντομεύσεις υποστρωμάτων: DMAPP, πυροφωσφορικό διμεθυλοαλλύλιο; HMG-CoA, 3-ύδροξυ-3-μέθυλο-γλουταρυλ-CoΑ; IPP, πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο; Συντομεύσεις ενζύμων: AACT, θειολάση του ακετοακετυλ-coα; HMGS, συνθετάση του HMG-CoA; HMGR, αναγωγάση του HMG-CoA; MK, κινάση του μεβαλονικού οξέος; PMK, κινάση του φωσφορομεβαλονικού; DPMDC, αποκαρβοξυλάση του πυροφωσφορικου μεβαλονικού οξέος; IPPI, ισομεράση του IPP. 20