Hλεκτροφόρηση Μοριακοί Δείκτες στα Φυτά

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Hλεκτροφόρηση Μοριακοί Δείκτες στα Φυτά"

Διοκλῆς Βασιλόπουλος
6 χρόνια πριν
Προβολές:

ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ 1 Συσκευή Ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης Τροφοδοτικό

1 Hλεκτροφόρηση Μοριακοί Δείκτες στα Φυτά Ανδρέας Ε. Βολουδάκης, Ph.D ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ ΦΥΤΩΝ & ΓΕΩΡΓΙΚΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ 1 Συσκευή Ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης Τροφοδοτικό µηχάνηµα à Δοχείο ηλεκτροφόρησης à å Κάλυµα Καλώδια â Χτένες à Πλαστικό υποδοχής πηκτής ä 2 1

2 Προετοιµασία πλαστικό υποδοχής πηκτής Σφραγίζονται τα άκρα του πλαστικού υποδοχής της πηκτής και τοποθετούνται οι ειδικές χτένες. Το πλαστικό υποδοχής της πηκτής θα πρέπει να ευρίσκεται σε οριζόντιο επίπεδο. Οι χτένες δεν θα πρέπει να ακουµπούν στην επιφάνεια του πλαστικού υποδοχής. 3 Πηκτή αγαρόζης - Λιώσιµο & Χύσιµο 4 2

3 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Τοποθέτηση της πηκτής στο δοχείο της συσκευής ηλεκτροφόρησης è /µα µ. δ Ρυθ Κάθοδος ä (-) DNAè á πηγάδια Άνοδος ä (+) 5 Φόρτωµα της πηκτής αγαρόζης 6X Διάλυµα φορτώµατος: à Bromophenol Blue (για χρώµα) Γλυκερόλη (για βάρος) 6 3

4 Τρέξιµο της Ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης Κάθοδος (-) ß Πηγάδια δειγµάτων DNA (-) â ß Bromophenol Blue ß Xylene cyanol Άνοδος (+) 7 Χρώση της πηκτής αγαρόζης Τοποθέτηση της πηκτής στο δοχείο χρώσης που περιέχει διάλυµα χρώσης Παραµονή της πηκτής για χρώση για λεπτά Για απαλλαγή από έξτρα χρωστική γίνεται αποχρωµατισµός πηκτής σε νερό Αλλαγή το νερό µερικές φορές για πιο αποτελεσµατικό αποχρωµατισµό 8 4

Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Το Βρωµιούχο Αιθίδιο

Οπτικοποίηση ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης Πηγάδια DNA

- 2,000-1,650-1,000-850 - 650-500 - 400-300 - 200-100

5 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Το Βρωµιούχο Αιθίδιο απαιτεί υπεριώδες (UV) φως για την οπτικοποίηση 9 Οπτικοποίηση ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης Πηγάδια DNA μάρτυρας DNA μάρτυρας προϊόν PCR - 5,000 bp - 2,000-1,650-1, Primer dimers Δείγματα # 1, 4, 6 & 7 είναι θετικά για την παρουσία 10 5

6 Μοριακοί Δείκτες στα Φυτά Ανδρέας Ε. Βολουδάκης, Ph.D ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ ΦΥΤΩΝ & ΓΕΩΡΓΙΚΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ 11 Δείκτης - Μοριακός Δείκτης q Δείκτης Επιλογή φαινοτυπικών χαρακτηριστικών ή γενετικών πληροφοριών ü Μορφολογικός (χρώµα, µέγεθος, κ.ά.) - φαινότυπος ü Βιοχηµικός (πρωτεΐνης-βασιζόµενος) - το προϊόν έκφρασης ü Μοριακός (DNA-βασιζόµενος) - αλληλουχία του DNA q Μοριακός Δείκτης ή DNA-βασιζόµενος δείκτης ü µοναδιαία αλληλουχία DNA ü βασίζεται στην παρουσιαζόµενη παραλλακτικότητα (γενετικός πολυµορφισµός) ü συνδεδεµένος µε το γόνο ενδιαφέροντος 12 6

Μοριακοί Δείκτες q Παραδείγµατα µοριακών δεικτών/τεχνικών ü RFLP - Πολυµορφισµός µήκους θραυσµάτων εκ περιορισµού ü RAPD - Τυχαίως πολλαπλασιαζόµενα πολυµορφικά τµήµατα DNA ü AFLP - Πολλαπλασιασµός

7 Μοριακοί Δείκτες q Παραδείγµατα µοριακών δεικτών/τεχνικών ü RFLP - Πολυµορφισµός µήκους θραυσµάτων εκ περιορισµού ü RAPD - Τυχαίως πολλαπλασιαζόµενα πολυµορφικά τµήµατα DNA ü AFLP - Πολλαπλασιασµός πολυµορφικών τµηµάτων DNA εκ περιορισµού ü SSR - Μικροδορυφόροι (Simple Sequence Repeat) ü SNP - Πολυµορφισµός ενός νουκλεοτιδίου ü κ.ά. PCR-βασιζόµενοι δείκτες Aλληλουχίας -βασιζόµενος δείκτης 13 Μικροδορυφόροι ή SSR Ø SSR: Αλληλοδιαδόχως επαναλαµβανόµενες νουκλεοτιδικές αλληλουχίες Φυτό Α Εκκινητής F Αλληλουχία µικροδορυφόρου Εκκινητής R Φυτό Β Σκάλα DNA 14 7

8 SSR δείκτες Δείκτης umc1001 στο Καλαµπόκι Δείγµατα από φυτά F2 διασταυρώσεως P1xP2 3% πηκτή αγαρόζης 15 SSRs από τις βάσεις δεδοµένων q DNA - γενωµατικές αλληλουχίες ü Γρήγορα αυξανόµενες πληροφορίες ü Μειώνει το κόστος και το χρόνο απόκτηση ενός SSR δείκτη q EST - εκφραζόµενες γενωµατικές αλληλουχίες ü Γρήγορα αυξανόµενες πληροφορίες ü Μειώνει το κόστος και το χρόνο απόκτηση ενός SSR δείκτη ü Λειτουργικοί µοριακοί δείκτες 16 8

Βελτίωση Φυτών Το «πρόβληµα» Για την ενσωµάτωση της γενετικής πληροφορίας η οποία κωδικεύει ένα επιθυµητό χαρακτηριστικό σε µια καλλιεργούµενη ποικιλία χρειάζονται πολλές επαναδιασταυρώσεις

9 Βελτίωση Φυτών Το «πρόβληµα» Για την ενσωµάτωση της γενετικής πληροφορίας η οποία κωδικεύει ένα επιθυµητό χαρακτηριστικό σε µια καλλιεργούµενη ποικιλία χρειάζονται πολλές επαναδιασταυρώσεις (backcrossing). Συνήθως περισσότερες από 6 επαναδιασταυρώσεις Η «λύση» Επιλογή µε βάση τους Μοριακούς δείκτες Επιβοηθούµενη από δείκτες επιλογή (Marker Assisted Selection, MAS) 17 Mοριακοί δείκτες & MAS Ένας µοριακός δείκτης για να χρησιµοποιηθεί στην επιβοηθούµενη από δείκτες επιλογή (Marker assisted selection, MAS) θα πρέπει να έχει τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: ü να είναι πολυµορφικός ü να δίνει µετρήσιµες διάφορες έκφρασης µεταξύ των φαινοτυπικών τύπων σε νεαρό αναπτυξιακό στάδιο του φυτικού είδους ü να µην επηρεάζει το χαρακτηριστικό υπό µελέτη ü να µην αλληλεπιδρά µε άλλους δείκτες (χρήση πολλών δεικτών σε πληθυσµό υπό διάσχιση) ü να είναι εύκολα αναγνωρίσιµος σε όλους τους δυνατούς φαινότυπους (όµο- και ετεροζυγώτες) για τους διαφορετικούς αλληλόµορφους ü να είναι σε µεγάλο αριθµό ü να είναι εύκολος στη χρήση του (ειδικά σε υψηλής παραγωγικότητας γενοτύπηση όπου επιζητείται η αυτοµατοποίηση) και οικονοµικός 18 9

barbadense) Στα δεξιά φαίνονται οι µοριακοί δείκτες Στα αριστερά

10 Γενετικός Χάρτης Γενετικός χάρτης για το χρωµατόσωµα A1 χρησιµοποιώντας έναν πληθυσµό BC1 (G. hirsutum X G. barbadense) Στα δεξιά φαίνονται οι µοριακοί δείκτες Στα αριστερά η γενετική απόσταση σε centimorgan (cm) 10

Σχετικά έγγραφα

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΦΥΤΩΝ

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΦΥΤΩΝ Μοριακοί Δείκτες Επιμέλεια διαφανειών Τραντάς Μάνος 1 Μοριακοί Δείκτες είναι αλληλουχίες DNA (ή πρωτεϊνών) που μπορούν να συσχετιστούν με συγκεκριμένα χαρακτηριστικά ώστε να ανιχνευτούν