Kodėl mikroskopija? Optinė mikroskopija: įvadas. Žmogaus akis. Žmogaus akis. Žmogaus akis. Vaizdo formavimasis žmogaus akyje

Transcript

1 Kodėl mikroskopija? Todėl, kad pamatyti reiškia patikėti... Optinė mikroskopija: įvadas Žmogaus akis Žmogaus akis Mato šviesą, kurios bangų ilgis nuo 400 nm (violetinė) iki 750 nm (mėlyna) Stiebelių ir kūgelių jautrumas įvairių spalvų šviesai Žmogaus akis Vaizdo formavimasis žmogaus akyje Akies sandara Kad vaizdas gerai matytųsi, būtina, kad tinklainėje jis būtų suprojektuotas kuo didesniu kampu! Kad išskirtume detales, tarp jų turi būti kontrastas (šviesumo/spalvos skirtumas). 1

2 Vaizdo formavimasis žmogaus akyje Akies raumuo keičia lęšiuko storį ir tokiu būdu sufokusuoja vaizdą tinklainėje. Tačiau viskam yra ribos: minimalus žiūrėjimo atstumas laikomas 5 cm (realiai nuo 10 cm). Vaizdo formavimas lupa: paprasčiausias mikroskopas Lupa (abipusiai iškilus lęšis) koncentruoja spindulius, lyg jie ateitų nuo arčiau esančio objekto. Dėl to akyje susidaro virtualus objekto atvaizdas, kuris yra didesnis, negu pats objektas. Matome ne daiktą, o daikto atvaizdą! Vienas iš pirmųjų mikroskopų Sudėtiniai mikroskopai Antoni van Leeuwenhoek (Delft as, Nyderlandai, ). Pirmasis pamatė ląsteles, bakterijas, vienaląsčius dumblius ir t.t. Broliai Jensen (Nyderlandai) Apie 1595 Priskiramas Galileo (Italija), bet pagamintas tikriausiai jau po jo mirties, apie 1680 Geometrinė optika: lęšis Geometrinė optika: lęšis Fotografija (peizažas) Vienetinis didinimas Fotografija (portretas) Didinimas > 1: mikroskopas Spinduliai, lygiagretūs lęšio ašiai, susirenka židinio taške. Per lęšio centrą einantys spinduliai nelūžta Lygiagretūs spinduliai susirenka į tašką židinio plokštumoje Padidintas atvaizdas gaunamas, kai objektas arčiau negu per du židinio nuotolius nuo lęšio.

3 Geometrinė optika: lęšis Kai objektas patalpinamas židinio plokštumoje, atvaizdas formuojasi begalybėje (spinduliai lygiagretūs). Tokiu režimu dirba mikroskopų okuliarai (akies lęšis sufokusuoja lygiagrečius spindulius) Taip pat veikia ir į begalybę sukoreguoti (infinity corrected) objektyvai (dabar plačiai naudojami). Mikroskopo konstrukcija Jei objektyvas sukoreguotas į begalybę, objektas talpinamas jo židinio plokštumoje, o lygiagrečius spindulius surenka vamzdelio lęšis (tube lens). Jo suformuotą atvaizdą toliau padidina ir fokusuoja okuliaras+akies lęšiukas. Mikroskopo konstrukcija Taigi, reikalingi bent trys lęšiai: Objektyvas Vamzdelio lęšis Okuliaras + iš kažkur bandinį reikia apšviesti... Mikroskopo konstrukcija Kondenseris suformuoja šviesos kūgį, kuris apšviečia bandinį. Šviesa turi būti tolygi, kūgis turi būti toks, kad išnaudotų visą objektyvo kampą. Objektyvas ir okuliaras dviemis stadijomis padidina vaizdą. Jei objektyvas didina 15X, o okuliaras 10X, galutinis didinimas =150X Mikroskopo sudedamosios dalys Objektyvas. Svarbiausia mikroskopo dalis. Jo pagrindinė funkcija yra surinkti pro bandinį praėjusią šviesą ir suformuoti tikslų, realų, apverstą bandinio ATVAIZDĄ mikroskopo vamzdelyje l Objektyvo parametrai: NA Šviesos kiekis, išeinantis iš židinio taško ir patenkantis į objektyvą proporcingas šviečiančio kūgio pagrindo plotui: I πl Kampas μ vadinamas objektyvo apertūriniu kampu. I π sin ( μ) Objektyvo surenkamos šviesos kiekis priklauso nuo apertūrinio kampo sinuso! 3

4 Objektyvo parametrai Objektyvo parametrai: NA n 1 μ 1 n μ n 1 μ 1 n μ I πl I πl Išėję iš bandinio (uždengto stiklu) spinduliai lūžta, jei pakliūna į orą. Jei erdvė tarp bandinio ir objektyvo užpildyta skysčiu (n =n stiklo ), spinduliai nelūžta (arba lūžta mažiau). Pritaikome lūžio dėsnį ir spindulių ekvivalentiškumą: n sin( μ ) = n sin( μ ) 1 1 Oro n =1, todėl, kas ore buvo sin(μ), užlašinus ant bandinio alyvos, tampa I nsin( μ) NA Abė (Abbe) šį dydį pavadino skaitine apertūra (numerical aperture). Ji parodo, kiek šviesos gali surinkti objektyvas. Objektyvo parametrai: NA Teoriškai sauso objektyvo skaitinė apertūra negali viršyti 1, nes sin(90 )=1. Realiai pagaminami objektyvai iki Su imersijos alyva, gali siekti iki 1.4. Lygiai taip pat apibrėžiama kitų lęšių (okuliaro, kondenserio) skaitinė apertūra. Objektyvo parametrai: Didinimas Objektyvo tiesiniu didinimu (magnification) vadinamas tarpinio atvaizdo ir objekto matmenų santykis. Naudojamų objektyvų didinimas būna nuo 1X iki 100X. Didesnio didinimo objektyvams būdingos ir didesnės skaitinės apertūros (kodėl)? Mikroskopo skiriamoji geba Difrakcija Jei objektyvas didina 15X, o okuliaras 10X, galutinis didinimas =150X. Iš prinicipo didinimas gali būti kiek nori didelis. x a z 0 l = Kodėl optiniu mikroskopu nesimato atomų ir elektronų? c x Taškinis šaltinis (šviečiantis taškas) formuoja vaizdą, panašų į difrakciją nuo mažo plyšio. 4

5 Interferencijos atmaina - difrakcija Interferencijos atmaina - difrakcija Panašiai bus ir jei kliūtis ne plyšys, o skylutė (diafragma), tik tada, aišku, laukas turės posūkio simetriją: aπ sin c λ Ic () aπ c λ aπ sin c λ Ic () aπ c λ Tai vadimamas Erio (Airy) diskas. Jo plotis priklauso nuo apertūros dydžio. Difrakcija pasireiškia visuose erdviškai apribotuose šviesos pluoštuose. Ji praktiškai riboja optinių prietaisų skiriamąją gebą. Difrakcija ir skiriamoji geba Reilėjaus (Rayleigh) kriterijus Realus objektyvas tašką vaizduoja kaip Airie diską, kurio dydis priklauso nuo objektyvo skaitinės apertūros (t.y. nuo kampo, kuriuo objektyvas surenka šviesą). Jei kampas mažas, fazėms išsiskirti per 180 reikia didelio atstumo (gaunamas didelis Airie diskas) ir vice versa. Airie disko dydis priklauso ir nuo bangos ilgio!!! Du taškai laikomi dar atskiriamais, jei vieno taško Airie disko (difrakcinio vaizdo) maksimumas sutampa su kito pirmuoju minimumu: Rayleigh formulė: 0.61λ D = NA Difrakcija ir skiriamoji geba Kadangi peržengus Rayleigh kriterijų, dviejų taškų išskirti nebeįmanoma, nebeapsimoka ir didinti vaizdo atsirada vadinamasis tuščias didinimas (empty magnification). Praktiška taisyklė: naudingas didinimas yra maždaug 1000 x NA (objektyvui su NA=0.85, jis būtų 850. Tačiau tuščias didinimas kartais praverčia, projektuojant vaizdą ant detektoriaus ar fotoplokštelės. Uždavinux Jei objektyvas didina 15X, o okuliaras 10X, galutinis didinimas =150X. Iš prinicipo didinimas gali būti kiek nori didelis. Kaip geriau: ar 5X objektyvas ir 10X okuliaras, ar 10X objektyvas ir 5X okuliaras? Sprendimai skiriamajai gebai pagerinti: didinti NA, mažinti λ. 5

6 Mikroskopo sudedamosios dalys: kondenseris Kondenserio paskirtis apšviesti bandinį. Abės kondenseryje lempos šviesa sufokusuojama į diafragmą (ant bandinio išfokusuota). Diafragma valdo apertūrinį šviesos kampą. Kondenseris, apšvietimo sistema Kondenserio židinio plokštumoje kolektoriniu lęšiu suformuojamas lempos atvaizdas. Kadangi jis sufokusuotas židinyje, iš kondenserio išeina lygiagretūs spinduliai visais kampais (kūgis). Spinduliai bandinyje nesufokusuoti!!!. Apertūrinė diafragma nustato suformuoto šviesos kūgio apertūrinį kampą, o lauko diafragma diametrą bandinyje Kondenseris, apšvietimo sistema Konjuguotosios plokštumos, apšviečiant bandinį. Tokią apšvietimo schemą sugalvojo Köhler is (XX a pradžia). Mikroskopo sudedamosios dalys: kondenseris a. Apšviečiančioji šviesa. b. Bandinio vaizdą formuojanti šviesa. Svarbu, kad iš kondenserio išeinančios šviesos kampas atitiktų objektyvo skaitinę apertūrą, kitaip objektyvo galimybės bus nevisiškai išnaudotos. Mikroskopo sudedamosios dalys: kondenseris Vėl objektyvas: Sistemos skaitinė apertūra atitinka mažiausią komponentų skaitinę apertūrą (riboja vienas komponentas). Geriausias ir pigiausias variantas yra, kai kondenserio ir objektyvo NA vienodos. Kodėl ten tiek daug lęšių? 6

7 Aberacijos Aberacijos: Chromatinė Lęšiai yra netobuli. Jiems būdingos aberacijos (nukrypimai nuo geometrinės optikos). Chromatinės Sferinės Astigmatizmas Koma Lauko kreivumas Kadangi stiklo lūžio rodiklis priklauso nuo bangos ilgio, mėlynos, žalios ir raudonos spalvos židinys bus skirtingose vietose: Problema sprendžiama, kombinuojant lęšius su skirtingomis lūžio rodiklio priklausomybėmis nuo bangos ilgio. Aberacijos: Sferinė Aberacijos: Astigmatizmas Kadangi lęšis nėra be galo plonas, spinduliai einantys pro jo kraštus fokusuojasi kitur, negu einantys pro vidurį: Taškas atrodo kaip linija arba elipsė. Aberacija atsiranda, kad skirtingų koordinačių židiniai yra skirtingose vietose: Problema sprendžiama, kombinuojant teigiamus (glaudžiamuosius) ir neigiamus (skleidžiančiuosius) lęšius. Atsiranda dėl nekokybiškų ar blogai įmontuotų lęšių. Koreguojama nusiperkant brangesnį ir geresnį objektyvą Reikia sukoreguoti ir spalvines sferinių aberacijų priklausomybes! Aberacijos: Koma Taškas vaizduojamas kaip kometa (todėl koma). Prigimtis tokia pat, kaip ir sferinės aberacijos, tik atsiranda nelygiagrečiuose ašiai spinduliuose Rodo, kad kažkuris lęšis blogai orientuotas. Aberacijos: Lauko kreivumas Angliškai Field curvature. Atsiranda todėl, kad naudojami sferiniai lęšiai. Tokiais lęšiais suprojektuotas vaizdas yra ant sferos paviršiaus. Dėl to, projektuojant ant plokščio paviršiaus (pvz, CCD) vaizdas bus sufokusuotas arba centre, arba kraštuose. Koreguojama papildomais lęšiais (ir pinigais). 7

8 Objektyvai: rūšys Fainas objektyvas Achromatas Fluoritas Chromatinė aberacija mėlynai ir raudonai spalvai ir sferinė žaliai Chromatinė ir sferinė aberacija mėlynai ir raudonai spalvai Apochromatas Plano- (achromatas, fluoritas, apochromatas) Chromatinė aberacija violetinei, mėlynai, žaliai ir raudonai; sferinė violetinei, mėlynai ir raudonai. Tie patys, tik dar sukoreguotas lauko kreivumas. Jei objektyve viskas sukoreguota, jis tampa labai jautrus atstumui iki bandinio. Derinama skaitinė apertūra, kompensacija Fainas objektyvas Mikroskopų pavyzdžiai Klinikinis Olympus firmos mikroskopas Jei objektyve viskas sukoreguota, jis tampa labai jautrus atstumui iki bandinio. Jį (uždengimo stikliuko storį) galima sukompensuoti sukiojant žiedą ant objektyvo. Mikroskopų pavyzdžiai Literatūra Mokslinis Olympus firmos mikroskopas (gali dirbti pralaidumo ir atspindžio režime) (žiūrėta ) 8