مقدمه سروستاني چكيده. * نويسنده مسوول تلفن: پست الكترونيكي: T در جايگاه 317- پروموتر

Transcript

1 ارتباط پلي مورفيسم 37 G>T در پروموتر ژن Muc6 با افزايش خطر ابتلا به بيماري زخم پپتيك 3 *2 آرمان كمالي سروستاني محمد مهدي مغني باشي منصوريه پريسا محمدي نژاد ليلا كهن و اسكندر كمالي 4 سروستاني ارسنجان 2 دانشگاه آزاد اسلامي واحد ارسنجان گروه زيست شناسي كازرون دانشگاه آزاد اسلامي واحد كازرون دانشكده پزشكي 3 شهركرد دانشگاه آزاد اسلامي واحد شهركرد گروه زيست شناسي 4 شيراز مركز تحقيقات بيماريهاي خود ايمني تاريخ دريافت: 90/5/8 تاريخ پذيرش: 9/0/4 چكيده موسينها (Muc) گليكوپروتي ينهايي با وزن مولكولي بالا هستند كه بخش اصلي لايه ژله اي موكوس را تشكيل داده و در حفاظت از اپي تليوم معده ايروده اي نقش دارند. با توجه به بيان زياد و اختصاصي Muc6 در معده و دوازدهه تغيير بيان Muc6 در بيماري زخم پپتيك و نقش پلي مورفيسم هاي پروموتر در بيان ژنها در اين مطالعه براي نخستين بار ارتباط پلي مورفيسم پروموتر ژن Muc6 با خطر ابتلا به بيماري زخم پپتيك با تكنيك PCR و توالي يابي بررسي شد. نتايج نشان داد كه فراواني آلل T در جايگاه 37 پروموتر df=, ژن Muc6 در افراد بيمار در مقايسه با افراد كنترل به طور معني داري بيشتر است (0/005>P 2,8/94= χ) بطوري كه اگر آلل T به صورت غالب در نظر گرفته شود ژنوتيپهاي TG+TT در مقايسه با GG خطر ابتلا به بيماري زخم پپتيك را بيش از سه برابر افزايش مي دهد (0/0>P.(OR=3/3, 95% CI=/288/6, واژه هاي كليدي: Muc6 بيماري زخم پپتيك پلي مورفيسم پروموتر مقدمه * نويسنده مسوول تلفن: پست الكترونيكي: Mehdimoghani@yahoo.com بيماري زخم پپتيك يكي از بيماريهاي شايع دستگاه گوارش است كه شامل زخم معده و زخم دوازدهه مي باشد (2). شيوع اين بيماري در نقاط مختلف دنيا متغير بوده و به طور كلي 5/2 تا 9 درصد مردان و /9 تا 6 درصد زنان به اين بيماري مبتلا مي شوند (8). آلودگي به عفونت هليكوباكترپيلوري توليد بيش از حد اسيد كلريدريك و آنزيم پپسين از علل اصلي شناخته شده در اتيولوژي اين بيماري مي باشند كه منجر به آسيب مخاط معده و دوازدهه مي گردند (2). در افراد سالم لايه مخاطي (موكوس) سلولهاي اپي تليوم سطحي مخاط را در برابر اسيد پروتي ازها ضربات مكانيكي و ميكروارگانيسم هاي بيماري زا محافظت مي كند. گليكوپروتي ين هايي با وزن مولكولي بالا به نام موسين تركيب اصلي موكوس را تشكيل مي دهند. تاكنون 2 ژن كد كننده موسين (Muc) در انسان شناسايي شده كه الگوي بيان آنها در بافتهاي مختلف متفاوت است (5). موكوس طبيعي معده شامل Muc5AC Muc6 و Muc مي باشد كه Muc6 اختصاصي معده بوده و بيشترين سطح بيان را در معده دارد. همچنين 277

2 Muc6 توسط غدد برونر دوازدهه نيز بيان مي شود (3 و 4). با توجه به نقش ساختاري Muc6 در موكوس معده و دوازدهه و همچنين نقش آنتي بيوتيكي اين موسين كه اخيرا گزارش شده است (5) به نظر مي رسد كه تغيير بيان ژن Muc6 مي تواند در آسيب پذيري مخاط معده و دوازدهه نقش داشته باشد. با توجه به گزارشات متعدد مبني بر نقش پلي مورفيسم هاي تك نوكلي وتيدي در ناحيه پروموتري ژنها و تا ثير آن بر تغيير بيان ژنهاي مربوطه (6 و 6) در اين مطالعه براي نخستين بار ارتباط پلي مورفيسم پروموتر ژن Muc6 با خطر ابتلا به بيماري زخم پپتيك بررسي شده است. مواد و روشها روش جمع آوري نمونه ها: جامعه آماري اين مطالعه تحليليمشاهده اي (از نوع موردشاهدي) شامل 50 بيمار مبتلا به زخم پپتيك و 50 فرد سالم به عنوان گروه كنترل مي باشد. بيماري افراد مورد مطالعه توسط پزشك متخصص ) رب اساس نتايج آندوسكوپي) تا ييد گرديد. گروه كنترل را افرادي تشكيل مي دهند كه عدم ابتلا به بيماري زخم پپتيك آنها توسط پزشك متخصص (بر اساس نتايج آندوسكوپي) تا ييد شده است تست آلودگي به عفونت هليكوباكترپيلوري آنها منفي و از نظر جنس سن( ±5 ) و منطقه جغرافيايي با بيماران همسان سازي شده اند. اطلاعات فردي سابقه پزشكي و آلودگي به عفونت هليكوباكتر پيلوري بر اساس پرونده پزشكي و تكميل پرسش نامه جمع آوري گرديد. آزمايشات تشخيصي در مركز MRI درمانگاه مطهري شيراز بيمارستان مركزي و بيمارستان نمازي شيراز انجام شد. استخراج : DNA از هر دو گروه مورد مطالعه پس از اخذ رضايت نامه نمونه خون گرفته شده و استخراج DNA با روش نمك اشباع انجام گرديد (0). با استفاده از دستگاه تعيين شد. بر اساس توالي ژن Muc6 در سايت NCBI و با استفاده از نرم افزار Oligo يك جفت پرايمر با تواليهاي (Forward) و (Reverse) اي پليمرازي 5 GGCTGCAGAGACACGGTAG3 5 CATGGTGCACAGTGGAGAG3 طراحي گرديد و با تكنيك واكنش زنجيره يك ناحيه 732 bp كه دربرگيرنده ناحيه پروموتري است تكثير گرديد. برنامه PCR به صورت دقيقه در دماي 94 درجه سانتي گراد دقيقه در دماي 62 درجه سانتي گراد و دقيقه در دماي 72 درجه سانتي گراد (30 سيكل) بهينه شد. براي تا ييد صحت انجام واكنش محصول PCR بر روي ژل آگارز دو درصد الكتروفورز گرديد و با اتيديوم برومايد رنگ آميزي و با دستگاه Gel documentation عكس برداري شد. در صورت شارپ بودن باند مورد نظر و عدم وجود دايمر پرايمر 50 ميكروليتر از محصول PCR جهت توالي يابي با پرايمر Reverse به خارج از كشور ارسال گرديد. در نهايت تواليهاي به دست آمده با نرم افزار Chromas مشخص شده و با نرم افزار Seqman مقايسه گرديدند. روش هاي آماري: به منظور بررسي ارتباط پلي مورفيسم پروموتر ژن Muc6 و استعداد ابتلا به زخم پپتيك از روشهاي آماري كاي دو( χ) 2 رگرسيون لجستيك و محاسبه OR با فاصله اطمينان 95 درصد توسط نرم افزار SPSS6 استفاده گرديد. نتايج مشخصات جمعيت مورد مطالعه: مشخصات افراد مورد مطالعه در جدول نشان داده شده است. در جمعيت گروه بيمار تعداد زنان 20 نفر (40 درصد) و تعداد مردان 30 نفر (60 درصد) بود كه بيانگر شيوع بالاتر بيماري در مردان نسبت به زنان است. همچنين مقايسه دامنه سني زنان و مردان مبتلا به زخم پپتيك نشان مي دهد كه سن بروز اين بيماري در مردان كمتر از زنان مي باشد (جدول ). اسپكتروفتومتر مدل Biophotometere (آلمان) غلظت DNA استخراج شده بين /52 ميكروگرم بر ميكروليتر 278

3 جدول مشخصات جمعيت مورد مطالعه و بررسي فاكتورهاي خطر در ابتلا به بيماري زخم پپتيك مشخصات گروه كنترل گروه بيمار CI) P OR 95%) تعداد نمونه ها 4 زخم معده 36 زخم دوازدهه جنسيت مرد زن 46/9 ± 6/8 43/6 ± /4 47/2 ±4/8 ميانگين سني (سال) ميانگين سن بروز زخم معده 32/5 ± 7/6 ميانگين سن بروز زخم دوازدهه 0/7 /3 (0/33 5/4) عادت به كشيدن سيگار خير آري مصرف داروهاي NSAID < 0/00 73 (8/9 594) خير آري جدول 2 ارتباط بين پلي مورفيسم پروموتر ژن Muc6 با خطر ابتلا به بيماري زخم پپتيك P CI) OR 95%) گروه بيمار گروه كنترل ژنوتيپ ژنوتيپ GG 0 /05 2/6 (0/986/9) 5 8 TG 4 0 TT 0 /0 3/3 (/288/6) 9 8 TT+TG % 77 % 92 G % 23 % 8 T آلل 279

4 شكل الف: A الكتروفورز محصول PCR بر روي ژل آگاروز دو درصد. در اين شكل Lane M ماركر 00 جفت بازي Lane0 محصول PCR پروموتر ژن Muc6 و Lane N كنترل منفي را نشان مي دهد. ب مقايسه تواليهاي مختلف با نرم افزار.Seqman 2 و 3 نشان دهنده توالي افرداي است كه در نوكلي وتيد 37 به ترتيب ژنوتيپ CC AA و CA را نشان مي دهند. با توجه به اين كه توالي يابي با پرايمر Reverse صورت گرفته است در موقعيت 37 نوكلي وتيد هاي G و T به ترتيب بصورت C و A مشاهده مي شود. نتايج حاصل از آناليز داده ها نشان مي دهد كه سن بروز زخم دوازدهه از زخم معده كمتر بوده و اين اختلاف از لحاظ آماري معني دار است 0/04) = P.(t = 2/, بررسي اثر مصرف داروهاي NSAID به عنوان يك ريسك فاكتور در استعداد ابتلا به زخم پپتيك نشان داد كه مصرف داروهاي NSAID در بين گروه بيمار در مقايسه با افراد گروه كنترل بيشتر بوده و اين اختلاف از لحاظ آماري 280

5 ب جلد 27 شماره معني دار مي باشد 0/00) < P 95% CI= 8/9 594,.(OR = 73, مقايسه عادت به كشيدن سيگار در دو گروه كنترل و بيمار نيز نشان داد كه تعداد افراد سيگاري در بين بيماران نسبت به گروه كنترل اختلاف آماري معني دار را نشان نمي دهد.(OR = /3, 95% CI= 0/33 5/4, P = 0/7) تعيين پلي مورفيسم در پروموتر ژن : Muc6 به منظور تكثير ناحيه اي از پروموتر ژن Muc6 از تكنيك PCR استفاده شد. شكل الف تصوير باند مورد نظر را روي ژل آگارز دو درصد نشان مي دهد. همان طور كه در اين شكل مشخص است قطعه مورد نظر با طول 732 bp به صورت تك باند و شارپ ديده مي شود. شناسايي پلي مورفيسم در پروموتر ژن : Muc6 به منظور شناسايي پلي مورفيسم هاي پروموتر ژن Muc6 جمعيت مورد مطالعه ناحيه تكثير شده توالي يابي در شد. جهت تعيين پلي مورفيسم در اين ناحيه تمامي تواليهاي به دست آمده توسط نرم افزار شدند. seqman نتايج نشان داد كه در موقعيت با يكديگر مقايسه SNP يك 37 وجود دارد كه شامل جايگزيني G به T است و مطابق با پلي مورفيسم تك نوكلي وتيدي ( (rs: گزارش شده در سايت NCBI مي باشد (شكل.( بررسي ارتباط ژنوتيپها و آللها با خطر ابتلا به زخم پپتيك: بررسيها نشان مي دهد كه توزيع ژنوتيپ در جمعيت سالم از تعادل هاردي واينبرگ تبعيت مي كند( P>0/05 χ). 2 =,/92 df=, توزيع ژنوتيپي و فراواني آللي پروموتر ژن Muc6 در جايگاه نوكلي وتيد و 37 ارتباط آن با استعداد ابتلا به زخم پپتيك در جدول 2 آورده شده است. مقايسه فراواني آلل T در افراد بيمار با گروه كنترل نشان مي دهد كه فراواني آلل T در جمعيت افراد بيمار بيشتر از گروه كنترل مي باشد كه از لحاظ آماري معني دار است آناليز آماري داده ها بيانگر آن است كه ژنوتيپهاي TT+TG خطر ابتلا به زخم پپتيك را بيش از 3 برابر افزايش مي دهد 0/0) < P.(OR = 3/3, 95% CI= /28 8/6, همچنين با افزايش تعداد آلل پر خطر (T) از 0 به و 2 خطر ابتلا به بيماري افزايش مي يابد 0/0) = P χ 2 for linear = 6/4,.(trend بحث بيماري زخم پپتيك يك بيماري شايع است به طوري كه 0 درصد افراد جمعيت در طول عمر خود به اين بيماري مبتلا مي شوند. اگر چه با ريشه كني نسبي عفونت هليكوباكتر پيلوري شيوع اين بيماري و عواقب آن كاهش يافته است اما تاكنون مساي لي چون كنترل قطعي عفونت هليكوباكتر پيلوري جلوگيري از به وجود آمدن و گسترش اين زخمها در مصرف كنندگان آسپيرين و داروهاي ضد التهابي غير استروي يدي (NSAID) حل نشده باقي مانده است (3). لذا شناخت عوامل ژنتيكي محيطي مو ثر در ابتلا به اين بيماري از اهميت به سزايي برخوردار است. نتايج حاصل از بررسي داده ها در جمعيت اين مطالعه نشان مي دهد كه تمامي بيماران مبتلا به زخم پپتيك داراي سابقه عفونت به هليكوباكتر پيلوري هستند كه تا ييد كننده نقش هليكوباكتر پيلوري در ابتلا به زخم پپتيك مي باشد (7). همچنين در مطالعه اي كه توسط مباركي و همكاران انجام گرفت گزارش گرديده است كه بعضي از فاكتورهاي ويرولانس هليكوباكتر پيلوري با التهاب معده دوازدهه ارتباط دارد (). همچنين نتايج حاصل از اين مطالعه نشان مي دهد كه خطر ابتلا به زخم پپتيك در بين مصرف كنندگان تركيبات 95% CI= 8/9 594, P < 0/00) بيشتر است NSAID,73 =.(OR پروستاگلاندين ها از جمله پروستاگلاندين هاي E و I كه از مهمترين واسطه هاي ايجاد التهاب مي باشند در سراسر لوله گوارش به خصوص در موكوس 2.(χ = 8/94, df=, P < 0/005) 28

6 دوازدهه و معده توليد مي شوند و در حفاظت از تماميت لايه مخاطي كنترل جريان خون مخاط و حفاظت عليه عوامل مخرب نقش دارند. تركيبات NSAID با مهار آنزيم سيكلواكسيژناز مانع تبديل اسيد آراشيدونيك به پروستاگلاندين ها مي گردد. بدين ترتيب مهار توليد پروستاگلاندين توسط تركيبات NSAID موجب صدمه به مخاط و افزايش خطر ابتلا به زخم پپتيك مي شود (). نتايج به دست آمده از اين مطالعه ارتباط عادت به كشيدن سيگار و خطر ابتلا به زخم پپتيك را تا ييد نمي كند (0/7 =.(OR = /3, 95% CI= 0/33 5/4, P با توجه به اينكه گزارش شده است كه مصرف سيگار خطر سوراخ شدگي زخمهاي پپتيك را ده برابر افزايش مي دهد (4) بنظر مي رسد كه مصرف سيگار بيشتر با طولاني شدن مدت بيماري و عدم بهبود و التيام سريع زخمها همراه باشد كه احتمالا اين امر ناشي از كاهش توليد پروستاگلاندين ها افزايش توليد اسيد و كاهش توليد بيكربنات در اثر مصرف سيگار است (4). مهم ترين نقش لايه مخاطي محافظت از سلولهاي اپي تليوم سطحي لوله گوارش در برابر اسيد پروتي ازها ضربات مكانيكي و ميكروارگانيسم هاي بيماري زا محافظت مي باشد كه توسط سلولهاي گابلت اختصاصي اپي تليوم استوانه اي معده اي روده اي ساخته مي شود. مهم ترين تركيب موكوس كه مسي ول خصوصيات ويسكوزيته اي ارتجاعي و ژل مانند آن است موسينها مي باشند (2). توليد موسين و ترشح آن از سلولهاي اپي تليال مكانيسم مشتركي است كه پستانداران استفاده مي كنند تا مخاط را در مقابل آسيبها محافظت كنند. بيان ژنهاي موسين اختصاصي بافتي است و سنتز آنها تحت كنترل مسيرهاي پايدار و تنظيم شده مي باشد. مسير پايدار مسي ول سنتز مداوم سطح پايه اي از موسينهاست در حالي كه مسير تنظيم شده در پاسخ به محركهاي محيطي يا فيزيولوژيك موجب افزايش بيان موسين ها مي شود (2). با توجه به اينكه در ناحيه پروموتري ژنهاي موسين تواليهاي تنظيمي متعددي وجود دارد و مسيرهاي تنظيمي و پايدار اثر خود را از طريق اين تواليها اعمال مي كنند بنابراين تغييرات نوكلي وتيدي در اين نواحي مي تواند بر بيان ژنهاي موسين تا ثيرگذار باشد (9). قبل از جايگاه آغاز رونويسي در ژن Muc6 تواليهاي تنظيمي وجود دارند كه شروع رونويسي و ميزان بيان ژن را كنترل مي كنند. در اين مطالعه نشان داده شد كه پلي مورفيسم 37 G/T پروموتر ژن Muc6 با خطر ابتلا به زخم پپتيك ارتباط معني داري دارد به طوري كه حضور آلل T خطر ابتلا به اين بيماري را افزايش مي دهد. با توجه به مجاورت اين SNP با عناصر تنظيمي متصل شونده به پروتي ينهاي SP و NFκβ ممكن است حضور آلل T در اين جايگاه بر عملكرد اين عناصر تا ثير گذاشته منجر به تغيير بيان ژن Muc6 گردد و به نوبه خود خطر ابتلا به زخم پپتيك را افزايش دهد. در صورتي كه اين مطالعه در جمعيتهاي ديگر و در سطح وسيع تري انجام شود و نتايج مشابهي حاصل گردد اين SNP مي تواند به عنوان يك ماركر مولكولي در غربالگري افراد مستعد به زخم پپتيك بررسي شود و در پيشگيري از ابتلا به اين بيماري كمك كننده باشد. علاوه بر اين بررسي پلي مورفيسم پروموتر ژنهاي ديگري از خانواده موسينها كه جايگاه بيان آنها در معده و دوازدهه است مي تواند به شناخت بيشتر نقش اين پروتي ينها در اتيولوژي بيماري زخم پپتيك كمك كند. منابع مباركي م. روغنيان ر. آزرم ط. زركش اصفهاني س.ح. دقاق زاده ح. (390) تشخيص همزمان ژن caga و آللهاي ژن vaca باكتري هليكوباكتر پيلوري در بيماران مبتلا به التهابات دستگاه گوارش با روش.Multiplex PCR مجله زيست شناسي 24:6 ص

7 2 Bell, A., Sellers, L., Allen, A., Cunliffe, W., Morris, E. and RossMurphy, S. (985) Properties of gastric and duodenal mucus: effect of proteolysis, disulfide reduction, bile, acid, ethanol, and hypertonicity on mucus gel structure. Gastroenterology, 88, De Bolos, C., Real, F.X. and LopezFerrer, A. (200) Regulation of mucin and glycoconjugate expression: from normal epithelium to gastric tumors. Front Biosci, 6, D Ho, S.B., Roberton, A.M., Shekels, L.L., Lyftogt, C.T., Niehans, G.A. and Toribara, N.W. (995) Expression cloning of gastric mucin complementary DNA and localization of mucin gene expression*. Gastroenterology, 09, Hollingsworth, M.A. and Swanson, B.J. (2004) Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nature Reviews Cancer, 4, Kim, B.C., Kim, W.Y., Park, D., Chung, W.H., Shin, K. and Bhak, J. (2008) SNP@ Promoter: a database of human SNPs (single nucleotide polymorphisms) within the putative promoter regions. BMC bioinformatics, 9, S2. 7 Leoci, C., Ierardi, E., Chiloiro, M., Piccioli, E., Matteo, G.D., Misciagna, G. and Giorgio, I. (995) Incidence and risk factors of duodenal ulcer: a retrospective cohort study. Journal of clinical gastroenterology, 20, Lu, C.L., Chang, S.S. and Wang, S.S. (2004) Silent peptic ulcer disease: frequency, factors leading to. Gastrointestinal endoscopy, 60, Mall, A.S. (2008) Analysis of mucins: role in laboratory diagnosis. Journal of clinical pathology, 6, Miller, S., Dykes, D. and Polesky, H. (988) A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic acids research, 6, 25. Mizushima, T. (2007) Various stress proteins protect gastric mucosal cells against nonsteroidal antiinflammatory drugs. Inflammopharmacology, 5, Moniaux, N., Escande, F., Porchet, N., Aubert, J.P. and Batra, S.K. (200) Structural organization and classification of the human mucin genes. Front Biosci, 6, Papatheodoridis, G.V., Sougioultzis, S. and Archimandritis, A.J. (2006) Effects of Helicobacter pylori and nonsteroidal antiinflammatory drugs on peptic ulcer disease: a systematic review. Clinical Gastroenterology and Hepatology, 4, Parasher, G. and Eastwood, G.L. (2000) Smoking and peptic ulcer in the Helicobacter pylori era. European journal of gastroenterology & hepatology, 2, Reis, C.A., David, L., Carvalho, F., Mandel, U., Bolós, C., Mirgorodskaya, E., Clausen, H. and SobrinhoSimões, M. (2000) Immunohistochemical study of the expression of MUC6 mucin and coexpression of other secreted mucins (MUC5AC and MUC2) in human gastric carcinomas. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 48, Wang, D. and Sadée, W. (2006) Searching for polymorphisms that affect gene expression and mrna processing: example ABCB (MDR). The AAPS Journal, 8,

8 Association of 37 G/T polymorphism of Muc6 gene promoter with increased risk of peptic ulcer disease Kamali Sarvestani A., Moghanibashi Mansourieh M.M. 2, Mohammadi Nejad P. 3, Kohan L. and Kamali Sarvestani E. 4 Biology Dept., Arsanjan Branch, Islamic Azad University, Arsanjan, I.R. of Iran 2 School of Medicine, Kazeroon Branch, Islamic Azad University, Kazeroon, I.R. of Iran 3 Biology Dept., Shahr e Kord Branch, Islamic Azad University, Shahr e Kord, I.R. of Iran 4 Autoimmune Diseases Research Center, Shiraz, I.R. of Iran Abstract Mucins are high molecular weight glycoproteins that form a major component of mucus gel layer and protect the underlying epithelium in the gastrointestinal tract versus acid, pathogen and etc. Regarding to high and specific expression of Muc6 gene in gastric and duodenum, deregulated expression of it in peptic ulcer disease and role of promoter polymorphisms in gene expression, in this study, was investigated association of Muc6 gene promoter polymorphisms with risk of peptic ulcer disease by using PCR and sequencing, for the first time. Results indicated that frequency of T allele in 37 position of muc6 gene promoter increased significantly in patients in compared to controls (χ 2 = 8.94, df=, P < 0/005). In the dominant effect of the T allele (comparison between TT+TG vs. GG), TT+TG genotypes significantly increased 3fold the risk of peptic ulcer (OR=3.3, 95% CI=.288.6, P=0.0). T allele in this position may be decrease expression of Muc6 gene. Key words: Muc6 Peptic ulcer disease Promoter polymorphism 284