FLUORO TEST

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1 FLUORO ndna TEST Cat. No. 4270E: 80 wells Cat. No. 4270E: 80 puits Art.-Nr. 4270E: 80 Auftragsstellen Cat. No. 4270E: 80 pocillos Cat. n. 4270E: 80 pozzetti Cat. Nº 4270E: 80 poços Aρ. Κατ. 4270E: 80 βυθισμάτων Cat. No. 4280E: 160 wells Cat. No. 4280E: 160 puits Art.-Nr. 4280E: 160 Auftragsstellen Cat. No. 4280E: 160 pocillos Cat. n. 4280E: 160 pozzetti Cat. Nº 4280E: 160 poços Αρ. Κατ. 4280E: 160 βυθισμάτων MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD. KDX Nagoya Sakae Bldg. 10F Sakae, Naka-Ku, Nagoya, Aichi, Japan Tel: Fax : URL

2 - CONTENTS - - CONTENU - - INHALTSVERZEICHNIS - - CONTENIDO - - CONTENUTI - - CONTENDO - - ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ - English 1 Français 6 Deutsch 11 Espaňol 16 Italiano 21 Português 26 Ελληνικά 31 Symbols/Symboles/Symbole/Símbolos/Simboli/ Simbolos/Σύμβολα/ 37

3 English English Intended Use The FLUORO ndna TEST is intended for semi-quantitative detection of anti DNA antibodies in human serum. This product is only for in vitro diagnostic use. Do not use in human beings. Summary and Explanation Antinuclear antibodies can be found in the sera of patients with autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE). Especially, anti-native DNA antibodies (or anti-double stranded DNA antibodies) are highly specific for SLE. Therefore, detection of these antibodies is important in the diagnosis of SLE patients. The mitochondrion (kinetoplast) of the Crithidia luciliae contains a large amount of ds-dna but does not contain ss-dna or histone. Therefore, the FLUORO ndna TEST, which uses Crithidia luciliae as the substrate, is able to isolate and detect anti-ndna antibodies with ease and accuracy. Principle The FLUORO ndna TEST detects anti ndna antibodies by the indirect immuno-fluorescence method. Crithidia luciliae is used as the substrate, and fluorescein isothiocyanate (FITC) is used as fluorescent dye. Materials provided Cat. No. 4270E 80wells 4280E 160 wells Crithidia luciliae Substrate Slide 4 wells x 20 slides 8 wells x 20 slides FITC conjugated goat anti-human immunoglobulins containing 2% BSA and 0.09% sodium azide, and Evans Blue 4.5 ml x 1 vial 8.5 ml x 1 vial PBS Buffer 9.1g (for 1000ml) x 7 bags 9.1g (for 1000ml) x 7 bags Positive Control Serum Human serum (anti ndna positive) containing 2% BSA, 0.09% sodium azide Negative Control Serum Human serum (anti ndna negative) containing 2% BSA, 0.09% sodium azide Mounting Medium Grycerol with Carbonate buffer containing 0.3% Trichloro Acetic Acid 0.5 ml x 1 vial 0.5 ml x 1 vial 0.5 ml x 1 vial 0.5 ml x 1 vial 3.0ml x 1 vial 3.0ml x 1 vial Cover Slip 20 pcs 20 pcs Blotting Paper 40 pcs 40 pcs Materials required but not provided 500ml Beaker, Wash bottle, Magnetic stirrer, Moisture chamber, Staining basket, distilled or deionized 1

4 English water, Fluorescent microscope equipped with blue excitation filter unit Precautions (1) Positive control serum and negative control serum are derived from human serum, in which HBs antigen, HIV (HIV-1 and HIV-2) antibodies and HCV antibodies have not been detected. However, it is strongly recommended that all clinical specimens and materials should be handled as if they are capable of transmitting infectious diseases. (2) FITC-conjugated antibody, negative control serum and positive control serum contain sodium azide (0.09%) as a preservative and must be handled with caution - do not ingest or allow contact with skin or mucous membranes. Sodium azide may react with copper or lead in plumbing system to form explosive metal azides. Therefore, always flush with plenty of water when disposing materials containing sodium azide into a drain. (3) Some kit components contain animal origin materials, which are from non-infectious animals. These components, however, should be treated as potential biohazards in use and for disposal. (4) Mounting medium contains 0.3% trichloroacetic acid which is harmful to aquatic organisms and may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. This material and its container must be disposed of as hazardous waste. Storage and Stability All kit components must be stored at 2-8 C. All reagents are stable for 12 months after manufacturing when stored at 2-8 C. Procedure 1) Preparation of reagent Bring substrate slides to room temperature prior to unsealing, in order to avoid moisture. *Seal unused glass slides together with desiccant tightly in order to keep them dry during storage. Prepare PBS by dissolving 1 bag of PBS powder in 1000ml of distilled water. *Do not dilute the other kit components which are ready-for-use. 2) Preparation of samples Use fresh patient sera. a) Qualitative analysis: Dilute patient sera 1:5 with PBS. b) Quantitative analysis: In the case of patient sera which were positive in the qualitative analysis, make serial dilutions of screening samples. (i.e. 1:10, 1:20, 1:40, 1:80) *Do not repeat freezing and thawing of patient serum samples. This might result in decreased antibody titer or cause non-specific reactions. *Lipemic sera should be avoided, because it causes non-specific reactions. 3) Addition of samples Place one drop (20-30μl) each of diluted sera as well as positive and negative control sera over the antigen wells and place in a moisture chamber. 2

5 English *Perform the analysis using the provided positive control sera and negative control sera as controls. *Ensure that the added sample is not mixed with the sample in the next well. Also, in a quantitative analysis, add samples with lower concentration prior to samples with higher concentration. 4) Primary reaction Incubate the slides in the moisture chamber for 20 minutes at room temperature (20-25 C). *Incubation time should be between min. *Incubation temperature above or below normal room temperature (20-25 C), shorter or longer time periods of incubation may give erroneous results. *Reaction should be performed in the moisture chamber with enough water poured not to dry the substrate slides. 5) Washing (1) Place the PBS and the staining basket into a 500 ml beaker. (2) Remove the slides from the moisture chamber one at a time and carefully rinse off the serum using a washing bottle filled with PBS. *Do not squirt PBS directly on the wells. *Do not take out all substrate slides at once, since this may lead to substrate drying out. (3) Immediately stand the slides in the staining basket, prepared in step 1). (4) After all the slides have been placed in the basket, wash them for 5 minutes using a magnetic stirrer. *The amount of PBS used for washing is 500 ml per 10 glass slides. 6) Addition of FITC conjugated antibody (1) After washing, remove the slides from the basket one at a time, and dry all parts other than the wells, using the enclosed blotting paper. (2) Place the slides back into the moisture chamber, and add one drop of the secondary antibody (FITC-conjugated goat anti-human immunoglobulins) to each well on the slide. *Never dry substrate slide, because this severely obstructs correct detection. *Do not touch the well or remove PBS from well with blotting paper directly. 7) Secondary reaction Incubate the slides in the moisture chamber for 20 minutes at room temperature (20-25 C). *Incubation time should be between min. *Incubation temperature above or below normal room temperature (20-25 C), shorter or longer time periods of incubation may give erroneous results. *Reaction should be performed in the moisture chamber with enough water poured not allowing the substrate slides to dry. 8) Washing Wash the slides as in step 5. 9) Mount coverslip After washing, remove the slides from the staining basket one at a time. Gently remove excess moisture with a piece of blotting paper and apply 2-3 drops of the mounting medium included in the kit. Carefully place coverslip in position. 3

6 English *Be careful not to dry substrate slides. 10) Microscopic examination Examine the slides using fluorescent microscope at a magnification of 400. *Examination should be performed promptly after mounting. If immediate examination is not possible, keep the slides in the cool, dark place, and perform examination within 24 hours. Interpretation of Results Interpretation of negative or positive results (-): As in the negative control serum, no specific fluorescence is seen in the kinetoplast. There are 3 negative patterns: No fluorescence is seen in the Crithidia luciliae at all; the area of the kinetoplast looks like a black hole. Marked fluorescence in the basal body is seen, but no specific fluorescence in the kinetoplast. Specific fluorescence is seen in the nucleus, but no fluorescence in the kinetoplast. (±): Slight specific fluorescence is seen in the kinetoplast. (+): Weak but definite specific fluorescence is seen in the kinetoplast. (++): Marked fluorescence is seen in the kinetoplast. *The staining pattern of nuclei of Crithidia luciliae with the FLUORO ndna TEST does not correspond to the results obtained by common ANA (anti nuclear antibodies) tests. When interpreted as positive at a dilution of 1:5 or greater, the specimen is determined to be positive for anti-ndna antibody. Quality Control Positive control serum and Negative control serum which are included in the kit should be tested in each run to insure that all reagents and procedures have performed properly. Limitations This product is only for diagnosis. Do not use in human beings. Test results should be used in conjunction with information available from clinical evaluation and other diagnostic information. Expected Values and Performance Characteristics 75 patients samples and 40 normal samples were tested by FLUORO ndna Test. n Positive SLE active inactive RA SjS PSS MCTD Others Normal n %

7 English RA: Rheumatoid arthritis, SjS: Sjogren s syndrome, PSS: Progressive systemic sclerosis, MCTD: Mixed connective tissue disease (Miura T. et al. Eisei Kensa 35(8): ,1986, Japanese) <Correlation> 166 samples were measured using the FLUORO ndna TEST as well as RIA kit. RIA DNA Fluoro ndna (28%) 21 (12%) - 2 (1%) 96 (58%) A result of 25 units/ml or higher was interpreted as positive for anti-dsdna antibodies with the RIA method. References 1. Chubick A., Sontheimer R. D., Gilliam J. N., Ziff M. : Ann. Int. Med., 89: 186, Deegan M. J., Walker S. E., Lovell S. E. : Am. J. Clin. Pathol., 69: 599, Sontheimer R. D., Gilliam J. N. : J. Lab. Clin. Med., 91: 550, Aarden L. A., de Groot E. R., Feltkamp T. E. W. : Ann. N. Y. Acad. Sci., 254: 505, Monier J. C., Perraud M., Picard F., Gioud M. :Ann. Immunol., 129C: 463, Jonsson J., Norberg R. : Scand. J. Rheumatology, 5: 221, Ballou S. P., Kushner I. : Arth. Rheum., 22: 321, Sting G., Meingassner J. G., Swelty P. : Clin. Immunol. Immunopathol., 6: 131, Wallage F. G., Clark T. B. : J. Protozool, 6: 58, Bone G. J., Steiner M. : Nature, 178: 308, Slater N. G. P., Gameron J. S. : J. Histo. Cyto., 29: 238, Medof M. E., Lacker J., Bennett R. M. : Clin. Res., 24: 332A, Person D. A., Leatherwood G. M., Sharp J. T. : Clin. Res., 23: 529A,

8 Français Français BUT DU DOSAGE Ce test est un test en Immunofluorescence pour la détection des auto-anticorps anti-adn natif (ndna) dans le sérum. Pour utilisation en diagnostic in vitro uniquement. Ne pas utiliser sur des êtres humains. RESUME ET EXPLICATION Les auto-anticorps antinucléaires (ANA) sont développés chez les patients atteints de maladies auto-immunes systémiques tel que le lupus érythémateux disséminé (LED). Les anticorps anti-adn natif (ou anti-adn double brin) sont particulièrement spécifiques du LED. Voilà pourquoi la détection de ces anticorps joue un rôle important dans le diagnostic du LED. Le kinétophore de Chritidia luciliae contient des quantités importantes d ADN double brin mais ne contient pas d ADN simple brin ou d histones. Le test FLUORO ndna qui utilise comme substrat Chritidia luciliae permet de détecter les anticorps anti-adn natif avec précision et facilité. PRINCIPE DU TEST Le TEST FLUORO ndna permet la détection des auto-anticorps anti-adn natif par immunofluorescence indirecte. Chritidia luciliae est utilisé comme substrat et un anticorps anti-humain couplé au FITC permet de révéler la réaction auto-anticorps-antigène. REACTIFS FOURNIS Cat. No. 4270E 4280E Lames Chritidia luciliae Anticorps de chèvre anti-humain marqué au FITC avec de l albumine bovine (2%), de l azide de sodium (0,09%) et Bleu d Evans Tampon PBS Sérum Contrôle Positif Sérum humain (anti ndna positif) avec de l albumine bovine (2%) et de l azide de sodium (0,09%) Sérum Contrôle Négatif Sérum humain (anti ndna négatif) avec de l albumine bovine (2%) et de l azide de sodium (0,09%) Milieu de Montage Glycérol avec un tampon Carbonate contenant 0,3% 80 puits 160 puits 10 étuis de 2 lames à 4 puits 10 étuis de 2 lames à 8 puits 1 x 4,5 ml 1 x 8,5 ml 7 paquets de 9,1g 7 paquets de 9,1g 1 x 0,5 ml 1 x 0,5 ml 1 x 0,5 ml 1 x 0,5 ml 1 x 3 ml 1 x 3 ml 6

9 Français d acide Trichloro-Acétique Lamelles Papier absorbant feuilles 40 feuilles MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI Becher de 500 ml, Flacon pour solution de lavage, Agitateur Magnétique, Chambre d incubation humide, Panier de coloration, Eau désionisée ou distillée, Microscope à fluorescence équipé d un filtre d excitation bleu. Précautions (1) Les sérums contrôles positif et négatif sont préparés à partir de sérums humains, qui ont été testés négatifs pour l antigène HBs, les anticorps anti-hcv et HIV (HIV-1 et HIV-2). Aucune méthode ne pouvant garantir l absence de ces virus ou d autres virus pathogènes, utiliser ces réactifs comme tout prélèvement potentiellement infectieux. (2) Les sérums contrôles positif et négatif ainsi que l anticorps conjugué au FITC contiennent 0,09% d azide de sodium comme conservateur et doivent être manipulés avec précaution ne pas ingérer ou permettre du contact avec la peau ou avec les membranes muqueuses. L azide peut provoquer des réactions explosives dans les conduites en fer ou cuivre. Faire couler l eau en abondance lorsqu on se débarrasse de ces produits (3) Certains composants de la trousse contiennent des matières d origine animale, provenant d animaux non-infectés. Cependant, ces composants doivent être manipulés comme des dangers biologiques potentiels, lors de l utilisation ainsi que lors du traitement des déchets. (4) Le milieu de montage contient 0,3% d acide trichloro-acétique qui est nuisible aux organismes aquatiques et peut engendrer des effets défavorables à long terme pour l environnement aquatique. Ce matériel et son récipient doivent être considérés comme des déchets dangereux. Conservation et Stabilité Tous les composants de cette trousse doivent être conservés à 2-8 C. Tous les réactifs un an après fabrication lorsqu ils sont conservés à 2-8 C. sont stables pour Procédure 1) Préparation des réactifs Amener les lames de substrat à température ambiante avant de desceller l étui pour éviter toute hydratation. * Sceller fortement les lames inutilisées avec du desiccant afin de les garder sèches lors du stockage. Préparer la solution de PBS en dissolvant le contenu d un paquet dans 1 L d eau distillée. * Ne pas diluer d autres composants de la trousse qui sont prêts à utiliser. 2) Préparation des échantillons Utiliser des sérums fraîchement prélevés. a) Analyse qualitative: Diluer chaque échantillon de sérum au 1:5 dans du PBS b) Analyse quantitative: Lorsqu un sérum est positif en méthode qualitative, faire des dilutions en cascade 7

10 Français de l échantillon (1 :10, 1 :20, 1 :40, 1 :80, 1 :160) *Eviter les étapes de congélation-décongélation qui pourraient diminuer le titre en anticorps et également provoquer des réactions non-spécifiques. *Ne pas utiliser d échantillons lipemiques qui provoquent des réactions non spécifiques. 3) Addition des échantillons Placer 1 goutte (20-30 µl) de chaque échantillon dilué ainsi que des contrôles positif et négatif dans les puits d antigène et placer la lame dans une chambre humide. * Effectuer l analyse utilisant les sérums contrôles positif et négatif prévus comme contrôles. * S assurer de ne pas mélanger les échantillons de deux puits consécutifs. Dans une analyse quantitative, ajouter les échantillons avec une concentration plus basse avant les échantillons avec une concentration plus haute. 4) Réaction primaire Incuber les lames en chambre humide 20 minutes à température ambiante (20-25 C). *Le temps d incubation ne doit pas excéder 30 minutes. * Une température d incubation en deçà ou au-delà de le température ambiante (20-25 C), des temps d incubation raccourcis ou augmentés peuvent donner lieu à des résultats erronés. * La réaction doit être effectuée dans la chambre d incubation humide qui doit être suffisamment humidifiée de sorte que les lames de substrat ne s assèchent pas. 5) Lavage (1) Placer le PBS et le panier pour coloration dans un bêcher de 500 ml. (2) Retirer les lames de la chambre d incubation humide, une à la fois, et les laver pour éliminer le sérum avec du PBS contenu dans une pissette. *Ne pas projeter directement le PBS dans les puits. * Ne pas retirer toutes les lames en une seule fois pour ne pas qu elles se dessèchent. (3) Poser immédiatement les lames dans le panier préparé à l étape 1). (4) Une fois que toutes les lames sont déposées dans le panier, laver 5 minutes sous agitation * Utiliser 500 ml de PBS pour 10 lames. 6) Addition du conjugué (1) Après lavage retirer les lames du panier, une à la fois, sécher les bords des lames autour des puits sans sécher les puits, en utilisant le papier absorbant fourni. (2) Replacer les lames dans la chambre d incubation humide et ajouter une goutte de l anticorps secondaire (anti-globulines humaines conjugué au FITC) dans chaque puits. *Ne jamais laisser sécher les lames de substrat car cela va gêner la réaction. *Ne pas toucher les puits ni enlever directement le PBS des puits avec le papier absorbant 7) Réaction secondaire Incuber les lames en chambre humide pendant 20 minutes à température ambiante (20-25 C). *Ce temps d incubation doit être compris entre 20 et 30 minutes. *Une température d incubation en deçà ou au-delà de la température ambiante (20-25 C), des temps d incubation raccourcis ou augmentés peuvent donner lieu à des résultats erronés. * La réaction doit être effectuée dans la chambre d incubation humide qui doit être suffisamment 8

11 Français 8) Lavage humidifiée de sorte que les lames de substrat ne s assèchent pas. Laver comme décrit à l étape 5. 9) Montage des lames Après lavage, retirer les lames du panier de coloration une à la fois. Enlever prudemment l excès d humidité avec un buvard et déposer 2-3 gouttes de milieu de montage Prudemment mettre en position la lamelle couvre-objet. * Ne pas dessécher complètement les lames. 10) Examen microscopique Examiner les lames à l aide d un microscope à fluorescence à un grossissement de X 400. *L examen microscopique doit être fait rapidement après montage. Si on ne peut pas procéder immédiatement à l examen microscopique, conserver les lames au froid et à l obscurité et procéder à l examen microscopique dans les 24 heures. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS Interprétation des résultats positifs ou négatifs (-): Aucune fluorescence spécifique n est détectée dans les noyaux des cellules. Il existe trois types d aspect négatif: On ne distingue aucune fluorescence de Chritidia luciliae: toute la surface du kinétophore apparaît comme un trou noir. Une fluorescence marquée est observée dans le corpuscule basal, mais aucune fluorescence spécifique n est détectée dans le kinétophore. Une fluorescence spécifique est détectée dans le noyau, mais aucune fluorescence spécifique n est détectée dans le kinétophore. (±): Une faible fluorescence positive est observée dans le kinétophore. (+): Une faible fluorescence définie et spécifique est observée dans le kinétoplaste. (++): Une fluorescence marquée est observée dans le kinétoplaste. *Les aspects de fluorescence des noyaux de Chritidia luciliae avec le Fluoro ndna sont différents de ceux observés avec les autres tests ANA anticorps anti-nucléaires, (détection des ANA en méthode qualitative). Les sérums trouvés positifs à une dilution au 1 :5 ou 1 :5 sont déclarés positifs pour la présence d anticorps anti-adn natif. CONTRÔLE DE QUALITÉ Le Sérum contrôle Positif et le Sérum contrôle Négatif qui sont inclus dans la trousse doivent être testés chaque fois pour vérifier si tous les réactifs et procédures ont fonctionnés comme il faut. 9

12 Français LIMITATIONS Ce produit a un but purement diagnostique. Ne pas utiliser sur des êtres humains. Les résultats du test doivent être utilisés avec les informations disponibles des évaluations cliniques et avec d autres informations diagnostiques. VALEURS ATTENDUES ET PERFORMANCE 75 échantillons de patients et 40 échantillons normaux ont été testés avec le FLUORO ndna Test. n Positif SLE actif inactif RA SjS PSS MCTD Autres Normal n % RA: arthrite rheumatoïde, SjS: syndrome de Sjogren, PSS: sclérose systémique progressive, MCTD: connectivité mixte (Miura T. et al. Eisei Kensa 35(8): ,1986, Japanese) <Corrélation> 166 échantillons ont été testés utilisant le FLUORO ndna TEST ainsi que la trousse RIA. Fluoro ndna + - RIA DNA + 47 (28%) 21 (12%) - 2 (1%) 96 (58%) Avec la méthode RIA, un résultat de 25 unités/ml ou plus était interprété comme positif pour les anticorps anti-dsdna. REFERENCES 1. Chubick A., Sontheimer R. D., Gilliam J. N., Ziff M. : Ann. Int. Med., 89: 186, Deegan M. J., Walker S. E., Lovell S. E. : Am. J. Clin. Pathol., 69: 599, Sontheimer R. D., Gilliam J. N. : J. Lab. Clin. Med., 91: 550, Aarden L. A., de Groot E. R., Feltkamp T. E. W. : Ann. N. Y. Acad. Sci., 254: 505, Monier J. C., Perraud M., Picard F., Gioud M. :Ann. Immunol., 129C: 463, Jonsson J., Norberg R. : Scand. J. Rheumatology, 5: 221, Ballou S. P., Kushner I. : Arth. Rheum., 22: 321, Sting G., Meingassner J. G., Swelty P. : Clin. Immunol. Immunopathol., 6: 131, Wallage F. G., Clark T. B. : J. Protozool, 6: 58, Bone G. J., Steiner M. : Nature, 178: 308, Slater N. G. P., Gameron J. S. : J. Histo. Cyto., 29: 238, Medof M. E., Lacker J., Bennett R. M. : Clin. Res., 24: 332A, Person D. A., Leatherwood G. M., Sharp J. T. : Clin. Res., 23: 529A,

13 Deutsch Deutsch Verwendungszweck Der FLUORO ndna TEST dient dem semi-quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen DNS in Humanserum. Nur für in-vitro Diagnostik. Nicht zur Anwendung am Menschen. Zusammenfassung und Erklärung Antinukleäre Autoantikörper (ANA) werden bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen, wie systemischer Lupus erythematodes (SLE) gefunden. Autoantikörper gegen native DNS (oder Doppelstrang-DNS) gelten als spezifisch für einen SLE. Der Nachweis dieser Antikörper spielt daher eine wichtige Rolle bei der Diagnostik eines SLE. Das Mitochondrion (der Kinetoplast) von Crithidia luciliae enthält größere Mengen Doppelstrang-DNS (ds-dns, ndns), aber weder Einzelstrang-DNS (ss-dns) noch Histone. Daher können mit dem FLUORO ndna TEST, der Crithidia luciliae als Substrat verwendet, Autoantikörper gegen ndns einfach und sicher nachgewiesen werden. Testprinzip Mit dem FLUORO ndna TEST werden Autoantikörper gegen ndns mittels der indirekten Immunfluoreszenz nachgewiesen. Crithidia luciliae wird als Substrat und Fluorescein- Isothiocyanat (FITC) als Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt. Gelieferte Materialien 80 Tests (Art.-Nr.: 4270E) 160 Tests (Art.-Nr.:4280E) Crithidia luciliae Objektträger 20x4 Objektträger 20x8 Objektträger FITC-markierte Ziegenantikörper gegen Human-Immunglobulin. Enthält 2% BSA, 0,09% Natriumazid und Evans Blau PBS-Puffer Positives Kontrollserum Humanserum (Anti-nDNS-positiv). Enthält 2% BSA, 0,09% Natriumazid Negatives Kontrollserum Humanserum (Anti-nDNS-negativ). Enthält 2% BSA, 0,09% Natriumazid Eindeckmittel Glycerol mit Karbonatpuffer. Enthält 0,3% Trichloro-Essigsäure 1 Fläschchen, 4,5 ml 7 Beutel zu je 9,1 g (je1000 ml) 1 Fläschchen, 0,5 ml 1 Fläschchen, 0,5 ml 1 Fläschchen, 8,5 ml 7 Beutel zu je 9,1 g (je1000 ml) 1 Fläschchen, 0,5 ml 1 Fläschchen, 0,5 ml 1 Fläschchen, 3,0ml 1 Fläschchen, 3,0ml Deckgläschen 20 St. 20 St. Löschpapier 40 St. 40 St. 11

14 Deutsch Erforderliches, aber nicht geliefertes Material 500 ml Becher, Spritzflasche, Magnetrührer, feuchte Kammer, Färbetrog, destilliertes oder entionisiertes Wasser, Fluoreszenzmikroskop mit einem Filter für Blau-Anregung. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Die positiven und negativen Kontrollseren wurden aus Humanseren hergestellt, die negativ auf HBs-Antigen, HIV (HIV 1 und HIV 2)-Antikörper und HCV-Antikörper getestet wurden. Es wird dennoch empfohlen, alle klinischen Proben und Materialien als potentiell infektiös zu handhaben. Das FITC-Konjugat, das negative Kontrollserum und das positive Kontrollserum enthalten 0,09% Natriumazid als Konservierungsmittel. Sie müssen mit Vorsicht gehandhabt werden nicht einnehmen oder mit der Haut oder den Schleimhäuten in Berührung bringen. Natriumazid kann mit Kupfer- und Bleihaltigen Rohren unter Bildung explosiver Metallazide reagieren. Falls Azid-haltige Lösungen in den Ausguss gelangen, sollte daher immer mit viel Leitungswasser gespült werden. Einige Bestandteile des Kits enthalten Materialien aus nicht-infizierten Tieren. Trotzdem sollten diese Bestandteile als potentiell biogefährlich gehandhabt und entsorgt werden. Das Eindeckmittel enthält 0,3% Trichloroessigsäure. Sie ist schädlich für Wasserorganismen und kann die aquatische Umwelt längerfristig schädigen. Das Eindeckmittel und sein Behältnis müssen in einen Behälter für Schadstoffe entsorgt werden. Lagerung und Haltbarkeit Alle Bestandteile des Kits müssen bei 2-8 C gelagert werden. Bei dieser Lagerungstemperatur sind alle Reagenzien 12 Monate ab Herstellungsdatum haltbar. Testdurchführung 1) Herstellung der Reagenzien Vor dem Öffnen die Beutel mit den Objektträgern auf Raumtemperatur bringen, damit kein Kondenswasser gebildet wird. *Nicht benötigte Objektträger zusammen mit dem Trockenmittel wieder in den Beutel geben und diesen zur Lagerung dicht verschließen. Gebrauchsfertige PBS-Lösung herstellen: Inhalt eines Beutels in 1000 ml Aqua dest. auflösen. *Die anderen Bestandteile des Testkits sind gebrauchsfertig. Nicht verdünnen. 2) Herstellung der Proben Es wird empfohlen, frisch gewonnene Patientenseren zu verwenden. a) Qualitative Untersuchung: Patientenseren 1:5 mit PBS verdünnen. b) Quantitative Untersuchung: von Patientenseren, die bei der qualitativen Untersuchung positiv reagierten, eine Reihenverdünnung herstellen (d.h. 1:10, 1:20, 1:40, 1:80) *Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Seren vermeiden, weil dann falsch niedrige Antikörpertiter oder unspezifische Reaktionen möglich sind. *Lipämische Seren sind zu vermeiden; sie können unspezifische Reaktionen verursachen. 12

15 Deutsch 3) Auftragen der Proben Jeweils einen Tropfen (20-30µl) der verdünnten Patientenseren sowie der positiven und negativen Kontrollseren auf die beschichteten Testfelder der Objektträger geben und die Objektträger in eine feuchte Kammer legen. *Bei der Untersuchung die positiven und negativen Kontrollen aus dem Testkit mitführen. *Beim Auftragen der Proben eine Berührung mit benachbarten Testfeldern vermeiden. Beim Austitrieren, immer erst die Probe mit der höchsten bzw. höheren Verdünnung auftragen. 4) Erste Inkubation Die Objektträger in einer feuchten Kammer 20 Min. bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren. *Die empfohlenen Inkubationstemperaturen (20-25 C) und Inkubationszeiten (20 Min.) sind einzuhalten, weil sonst falsch positive Ergebnisse möglich sind. *Die Inkubation sollte in einer feuchten Kammer durchgeführt werden. Der Boden der Kammer sollte mit Wasser benetzt sein, um ein Austrocknen der Substrate zu vermeiden. 5) Waschen (1) PBS und einen Färbetrog in einen 500 ml Becher geben. (2) Die Objektträger einzeln aus der feuchten Kammer nehmen und die Seren sorgfältig mit PBS aus einer Spritzflasche abspülen. *Den Pufferstrahl nicht direkt auf die Auftragsstellen richten. *Die Objektträger einzeln abarbeiten. Wenn alle Objektträger auf einmal aus der feuchten Kammer entfernt werden, kann es sein, dass die Substrate austrocknen. (3) Objektträger sofort in den Färbetrog mit PBS (Schritt 1) stellen. (4) Sobald alle Objektträger im Färbetrog stehen, werden sie 5 Min. unter Verwendung eines Magnetrührers gewaschen. *Zum Waschen von jeweils 10 Objektträger werden 500 ml PBS benötigt. 6) FITC-Konjugat hinzufügen (1) Die gewaschenen Objektträger einzeln aus dem Färbetrog nehmen und die Objektträgermaske mit einem Löschpapier aus dem Kit trocknen. Die Substrate auf den Testfeldern dabei nicht berühren. (2) Objektträger wieder in die feuchte Kammer legen und auf jedes Testfeld einen Tropfen des zweiten Antikörpers (FITC-markiertes Ziege-anti-Human-Immunglobulin) geben. *Die Substrate dürfen nicht austrocknen, weil die Beurteilung der Muster verfälscht werden kann. *Das Löschpapier darf die Substrate nicht berühren bzw. darf nicht zum Entfernen von PBS auf den Testfeldern benutzt werden. 7) Zweite Inkubation Die Objektträger in einer feuchten Kammer 20 Min. bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren. *Die empfohlenen Inkubationstemperaturen (20-25 C) und Inkubationszeiten (20 Min.) sind einzuhalten, weil sonst falsch positive Ergebnisse möglich sind. *Die Inkubation sollte in einer feuchten Kammer durchgeführt werden. Der Boden der Kammer sollte mit Wasser benetzt sein, um ein Austrocknen der Substrate zu vermeiden. 8) Waschen Die Objektträger wie in Schritt 5 beschrieben waschen. 13

16 Deutsch 9) Deckgläschen auflegen Die gewaschenen Objektträger einzeln aus dem Färbetrog nehmen. Objektträgermaske behutsam mit einem Löschpapier aus dem Kit trocknen und 2-3 Tropfen Eindeckmittel aus dem Kit auftragen. Ein Deckgläschen auflegen. *Die Substrate auf den Testfeldern der Objektträger dürfen nicht austrocknen. 10) Auswertung am Mikroskop Die Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop bei einer 400fachen Vergrößerung auswerten. *Die Beurteilung sollte sofort nach dem Eindecken erfolgen. Ist das nicht möglich, sollten die Objektträger dunkel und kühl gelagert und binnen 24 Std. beurteilt werden. Auswertung der Ergebnisse Beurteilung negativer und positiver Ergebnisse. (-): Der Kinetoplast zeigt keine spezifische Fluoreszenz (vgl. negatives Kontrollserum). Drei negative Muster sind zu unterscheiden: a) An Crithidia luciliae ist überhaupt keine Fluoreszenz erkennbar; der Kinetoplast erscheint als ein schwarzes Loch. b) Das Basalkörperchen zeigt eine deutliche Fluoreszenz. Der Kinetoplast, aber, ist negativ. c) Der Zellkern zeigt eine deutliche Fluoreszenz. Der Kinetoplast, aber, ist negativ. (±): Der Kinetoplast ist schwach gefärbt. (+): Eine zwar schwache, aber eindeutig spezifische Fluoreszenz des Kinetoplast ist erkennbar. (++): Der Kinetoplast zeigt eine deutliche Fluoreszenz. *Die mit FLUORO ndna Test erhaltenen Fluoreszenzmuster auf Crithidia luciliae sind mit den Ergebnissen herkömmlicher ANA (antinukleärer Antikörper)-Tests nicht vergleichbar. Seren, die ab einer Verdünnung von 1:5 mit FLUORO ndna Test positiv reagierten, sind als positiv für Autoantikörper gegen ndns zu betrachten. Qualitätskontrolle Die im Kit enthaltenen positiven und negativen Kontrollseren sollten bei jedem Testlauf mitgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Reagenzien die richtige Funktion zeigten und der Test richtig durchgeführt wurde. Grenzen des Verfahrens Nur für in-vitro Diagnostik. Nicht zur Anwendung am Menschen. Die Ergebnisse sollten in Verbindung mit den Ergebnissen klinischer Untersuchungen und anderer diagnostischer Verfahren verwendet werden. 14

17 Deutsch Erwartete Werte und Leistungsmerkmale Die Proben von 75 Patienten und 40 normalen Probanden wurden mit dem FLUORO ndna Test untersucht. SLE RA SjS PSS MCTD Andere Normal aktiv inaktiv Anzahl n Positiv % RA: Rheumatoide Arthritis, SjS: Sjögren-Syndrom, PSS: Progressive Systemsklerose, MCTD: Mischkollagenose (Miura T. et al. Eisei Kensa 35(8): , 1986, auf Japanisch) <Vergleich> 166 Proben wurden mit FLUORO ndna TEST und einem RIA-Kit untersucht. RIA DNA + 47 (28%) FLUORO ndna TEST (12%) - 2 (1%) 96 (58%) Mit der RIA-Methode wurde ein Ergebnis von 25 Einheiten/ml oder mehr als positiv für Antikörper gegen ndns gewertet. Literatur 1. Chubick A., Sontheimer R. D., Gilliam J. N., Ziff M. : Ann. Int. Med., 89: 186, Deegan M. J., Walker S. E., Lovell S. E. : Am. J. Clin. Pathol., 69: 599, Sontheimer R. D., Gilliam J. N. : J. Lab. Clin. Med., 91: 550, Aarden L. A., de Groot E. R., Feltkamp T. E. W. : Ann. N. Y. Acad. Sci., 254: 505, Monier J. C., Perraud M., Picard F., Gioud M. :Ann. Immunol., 129C: 463, Jonsson J., Norberg R. : Scand. J. Rheumatology, 5: 221, Ballou S. P., Kushner I. : Arth. Rheum., 22: 321, Sting G., Meingassner J. G., Swelty P. : Clin. Immunol. Immunopathol., 6: 131, Wallage F. G., Clark T. B. : J. Protozool, 6: 58, Bone G. J., Steiner M. : Nature, 178: 308, Slater N. G. P., Gameron J. S. : J. Histo. Cyto., 29: 238, Medof M. E., Lacker J., Bennett R. M. : Clin. Res., 24: 332A, Person D. A., Leatherwood G. M., Sharp J. T. : Clin. Res., 23: 529A,

18 Espaňol Espaňol Uso del kit El kit de FLUORO ndna se usa para detectar anticuerpos anti-dna en suero humano. Resumen y Explicación Los anticuerpos antinucleares se encuentran en el suero de pacientes con enfermedades auto inmunes como el Lupus Eritematoso Sistémico (LES). Especialmente anticuerpos frente a DNA nativo (o anticuerpos frente a DNA de doble banda) son altamente específicos del LES. La detección de este tipo de anticuerpos es por tanto muy importante en el diagnóstico de pacientes con LES. La mitocondria (cinetoplasto) del organismo unicelular Crithidia luciliae contiene una gran cantidad de dsdna, pero no contiene ssdna o histonas. Por tanto el FLUORO ndna TEST, que usa Crithidia luciliae como sustrato es capaz de detectar anticuerpos frente a ndna con sensibilidad y exactitud. Principio del Test El FLUORO ndna TEST detecta anticuerpos frente a ndna por el método de inmunofluorescencia indirecta. Crithidia luciliae se usa como sustrato y el isotíocianato de fluoresceína (FITC) se usa como sustrato fluorescente de tinción. Material suministrado con el Kit Cat. No. Portas luciliae con sustrato de Crithidia Immunoglobulins cabra anti humano conjugadas con FITC conteniendo 2% BSA and 0.09% azida sódica y Azul de Evans. 4270E 80 pocillos 4280E 160 pocillos 20 portas x 4 pocillos 20 portas x 8 pocillos 4.5 ml x 1 vial 8.5 ml x 1 vial Tampón PBS 9.1g (for 1000ml) x 7 sobres 9.1g (for 1000ml) x 7 sobres Suero Control Positivo Suero humano (anti ndna positivo) conteniendo 2% BSA, 0.09% azida Sódica Suero Control Negativo Suero humano (anti ndna negativo) conteniendo 2% BSA, 0.09% azida sódica Medio de montaje Glicerol con tampón Carbonate conteniendo 0.3% ácido tricloroacético 0.5 ml x 1 vial 0.5 ml x 1 vial 0.5 ml x 1 vial 0.5 ml x 1 vial 3.0ml x 1 vial 3.0ml x 1 vial Cubres 20 pcs 20 pcs Papel secante 40 pcs 40 pcs 16

19 Espaňol Material requerido pero no suministrado Vaso de precipitado de 500 ml, frasco lavador, agitador magnético, cámara húmeda, baso de tinción, agua destilada o desionizada, microscopio de fluorescencia equipado con filtro de excitación azul. Precauciones. (1) Los sueros control positivo y los sueros control negativos provienen de sueros humanos, en los cuales no se han encontrado anticuerpos frente a los antígenos de HBs ni frente a HIV (anticuerpos frente a HIV-1 y HIV-2), así como HCV. Sin embargo se ruega que sean manipulados como si fueran muestras potencialmente causantes de infección. (2) Como agente conservante se ha añadido azida sódica al 0,09% al conjugado de FITC, suero control negativo, y suero control positivo. No ingerir y no dejar que entren en contacto con la piel o mucosas.la azida sódica puede entrar en reacción con el cobre o el plomo de las cañerías formando azidas de cobre o plomo que son explosivas. Por este motivo se recomienda dejar correr agua abundante cuando estos productos se eliminen por el fregadero. (3) Algunos componentes del kit son de origen animal y aunque éstos eran declarados sanos, se recomienda que se usen como potencialmente biopeligrosos respecto a su manipulación y eliminación. (4) El medio de montaje contiene ácido tricloro acético, que es dañino para la fauna acuática y pude producir efectos adversos a largo plazo. Este material debe ser eliminado como si de material peligroso se tratara. Almacenaje y Estabilidad Todos los componentes del kit han de ser conservados a 2-8 ºC. Todos los reactivos son estables hasta 12 meses después de su fabricación. Procedimiento 1) Preparación de los reactivos Llevar los reactivos y sustrato a temperatura ambiente antes de su apertura para evitar la condensación de humedad. *Cerrar las portas de vidrio junto con desecante para que permanezcan secos durante su almacenaje. Preparar el PBS disolviendo una bolsa de PBS en 1000 ml de agua destilada. *No diluir otros componentes del kit que están listos para su uso. 2) Preparación de la muestra Usar sueros frescos a) Análisis Cualitativo: Diluir el suero del paciente a 1:5 con PBS. b) Análisis cuantitativo: En el caso de sueros de pacientes que fueran positivos en el análisis cualitativo, hacer diluciones seriadas de las muestras (`. Ej. 1:10, 1:20, 1:40, 1:80). *No repetir ciclos de congelación descongelación de los sueros. Esto puede originar una disminución en el título del suero o aparición de reacciones inespecíficas. *Muestras lipémicas han de evitarse, ya que, pueden dar lugar a reacciones inespecíficas. 3) Adición de las muestras. Colocar una gota (20-30 L) de cada suero diluido, así como de suero control positivo y suero 17

20 Espaňol control negativo en los pocillos recubiertos de antígeno de los portas y depositarlos posteriormente en una cámara húmeda. *Realizar el análisis usando el control negativo y suero control positivo suministrado en el kit como referencia. *Asegurarse de que las muestras añadidas no se mezclan con las del pocillo contiguo. Así mismo, en un análisis cuantitativo añadir primero las muestras de menor concentración a mayor concentración. 4) Reacción primaria Incubar las portas en la cámara húmeda durante 20 minutos a temperatura ambiente (20-25ºC). *La incubación ha de ser de minutos. *Temperaturas de incubación por encima o por debajo de la ambiente (20-25ºC), o tiempos de incubación más o menos prolongados pueden dar lugar a resultados erróneos. *La incubación ha de realizarse en cámara húmeda con una cantidad de agua suficiente que evite el secado de los portas. 5) Lavado (1) Colocar el PBS y el cestillo de tinción con las muestras en un vaso de 500 ml. (2) Sacar los portas de la cámara húmeda uno cada vez y aclararlos de suero, con mucho cuidado y usando un frasco lavador con PBS. *No proyectar directamente el chorro del frasco lavador contra la porta con alta presión. * No retirar todas las portas de sustrato al tiempo, ya que puede ocasionar el secado de los mismos. (3) Inmediatamente después dejar los portas en el cestillo de tinción preparado en el paso 1). (4) Después de que las portas han sido colocados en el cestillo, lavar durante 5 min. usando un agitador magnético. * La cantidad de PBS usado para el lavado es de 500 ml por 10 portas de vidrio. 6) Adicion del FITC Conjugado al anticuerpo. (1) Después de lavar, sacar todos los portas del cesto al mismo tiempo y secar con el papel de filtro el exceso de humedad, teniendo cuidado de no secar los pocillos. (2) Colocar nuevamente los portas en la cámara de reacción, y añadir una gota del anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra-antihumano conjugado con FITC) a cada uno de los portas. * Nunca dejar que los portas se sequen, ya que esto pude dar lugar a una detección incorrecta por el observador. * Nunca tocar los pocillos o eliminar el PBS del pocillo con el papel secante directamente. 7) Reacción secundaria Incubar los portas en la cámara húmeda durante 20 minutos a temperatura ambiente (20-25ºC) *El tiempo de incubación debe ser de minutos. *Temperaturas de incubación por encima o por debajo de la ambiente (20-25ºC), o tiempos de incubación más o menos prolongados pueden dar lugar a diferentes resultados erróneos. *La incubación ha de realizarse en cámara húmeda con una cantidad de agua suficiente que evite el secado de los portas. 8) Lavado Lavar los portas como en el paso 5. 18

21 Espaňol 9) Montaje de los cubres Después del lavado sacar los portas uno detrás de otro. Con cuidado eliminar el exceso de humedad con el papel secante suministrado y aplicar 2-3 gotas del medio de montaje incluido en el kit. Con sumo cuidado colocar el cubre en su lugar sobre el porta. *Tener cuidado de no secar el sustrato de los portas. 10) Examen microscópico Examinar los portas usando el microscopio de fluorescencia, a un aumento de x 400. *El examen de la muestras debe realizarse inmediatamente después de añadir el medio de montaje. En caso de que no sea posible el examen inmediato de los portas, hay que conservarlo en frío y en lugar oscuro y realizar el examen microscópico dentro de las siguientes 24 horas. Interpretación de Resultados. Interpretación de resultado positivo o negativo. (-): Como en el suero control negativo, no se ve una fluorescencia específica en el cinetoplasto. Existen tres patrones de negatividad: No se ve fluorescencia en los portas de Crithidia luciliae. Todo el área de cinetoplasto aparece como una zona oscura. Se aprecia fluorescencia en el cuerpo basal, pero no hay fluorescencia específica en el cinetoplasto. Se ve fluorescencia específica en el núcleo, pero no se ve en el cinetoplasto. (±) Se aprecia ligera fluorescencia específica en el cinetoplasto. (+) Débil fluorescencia, aunque definida en el cinetoplasto. (++) Se ve marcada fluorescencia en el cinetoplasto. *El patrón de tinción del núcleo de Crithidia luciliae con FLUORO ndna TEST no se corresponde con los resultados obtenidos con el los test de ANA (anti nuclear antibodies ). Cuando aparece una muestra positiva a una dilución de 1:5 o mayor, la muestra se considera positiva para anticuerpos anti ndna. Control de Calidad Los sueros control Positivo y control Negativo que se incluyen en el kit deberían ser incorporados en cada ensayo, para estar seguros de que todos los reactivos han funcionado de forma correcta. Limitaciones Este producto es únicamente para diagnóstico. No usar en seres humanos. Los resultados de los test deberían usarse junto con la información clínica disponible así como con cualquier otra información diagnóstica disponible. Valores esperados y Prestaciones características 19

22 Espaňol 75 muestras de pacientes enfermos y 40 muestras sanas se probaron con FLUORO ndna Test. n Positivo SLE activo inactivo AR SSj ESP EMTC Otros Normal n % 87,5 6, RA: Artritis reumatoide, SSj: Síndrome de Sjogren, ESP: Esclerosis Sistémica Progresiva, MCTD: Enfermedad mixta del tejido conjuntivo (Miura T. et al. Eisei Kensa 35(8): ,1986, Japanese) <Correlación> 166 muestras se midieron usando FLUORO ndna TEST así como un kit de RIA. RIA DNA Fluoro ndna ( 2 8 % ) 2 1 ( 1 2 % ) 2 ( 1 % ) 9 6 ( 5 8 % ) - Un resultado de 25 unidades/ml o mayor se interpretó como positivo para anticuerpos anti-dsdna con el método de RIA. Referencias 1. Chubick A., Sontheimer R. D., Gilliam J. N., Ziff M. : Ann. Int. Med., 89: 186, Deegan M. J., Walker S. E., Lovell S. E. : Am. J. Clin. Pathol., 69: 599, Sontheimer R. D., Gilliam J. N. : J. Lab. Clin. Med., 91: 550, Aarden L. A., de Groot E. R., Feltkamp T. E. W. : Ann. N. Y. Acad. Sci., 254: 505, Monier J. C., Perraud M., Picard F., Gioud M. :Ann. Immunol., 129C: 463, Jonsson J., Norberg R. : Scand. J. Rheumatology, 5: 221, Ballou S. P., Kushner I. : Arth. Rheum., 22: 321, Sting G., Meingassner J. G., Swelty P. : Clin. Immunol. Immunopathol., 6: 131, Wallage F. G., Clark T. B. : J. Protozool, 6: 58, Bone G. J., Steiner M. : Nature, 178: 308, Slater N. G. P., Gameron J. S. : J. Histo. Cyto., 29: 238, Medof M. E., Lacker J., Bennett R. M. : Clin. Res., 24: 332A, Person D. A., Leatherwood G. M., Sharp J. T. : Clin. Res., 23: 529A,

23 Italiano Italiano Uso previsto FLUORO ndna TEST è previsto per il rilevamento semi-quantitativo di anticorpi anti DNA nel siero umano. Questo prodotto è per solo uso diagnostico. Non usare su esseri umani. Riassunto e spiegazione Gli anticorpi antinucleo si possono trovare in sieri di pazienti affetti da malattie autoimmuni, come il Lupus Eritematosus Sistemico (LES). In particolare sono altamente specifici per SLE gli anticorpi anti-dna nativo (anti-ndna) o anti-doppia elica (anti-dsdna). Perciò la ricerca di questi anticorpi è importante per la diagnosi di SLE. Il mitocondrio (chinetoplasto) della Crithidia luciliae contiene elevate quantità di dsdna, ma non contiene DNA a singola elica (ssdna) o istoni. Il kit FLUORO ndnatest, che utilizza Crithidia luciliae come substrato, isola e rivela con facilità e accuratezza gli anticorpi anti-ndna. Principio FLUORO ndna TEST rileva anticorpi anti ndna per immunofluorescenza indiretta. Come substrati vengono usati Crithidia luciliae ed un coniugato con fluoresceina isotiocianato (FITC) è usato come colorante fluorescente. Materiali forniti 80 pozzetti (Cat. n. 4270E) 160 pozzetti (Cat. n. 4280E) Crithidia luciliae Vetrini Substrato 4 pozz. x 20 vetrini 8 pozz. x 20 vetrini Coniugato FITC capra anti immunoglobuline umane contenente 2% BSA e 0.09% sodioazide, ed Evans Blue Tampone PBS Siero di Controllo Positivo Siero umano (anti ndna positivo) contenente 2% BSA, 0.09% sodioazide Siero di Controllo Negativo Siero umano (anti ndna negativo) contenente 2% BSA, 0.09% sodioazide Mezzo di Montaggio Glicerolo con tampone Carbonato contenente 0.3% Acido TricloroAcetico Vetrini coprioggetto Carta assorbente 4.5 ml x 1 flacone 8.5 ml x 1 flacone 9.1g (per 1000ml) x 7 buste 9.1g (per 1000ml) x 7 buste 0.5 ml x 1 flacone 0.5 ml x 1 flacone 0.5 ml x 1 flacone 0.5 ml x 1 flacone 3.0ml x 1 flacone 20 pezzi 40 pezzi 3.0ml x 2 flaconi Materiali richiesti ma non forniti Beaker da 500 ml, bottiglie per il lavaggio, agitatore magnetico, camera umida, cestello di lavaggio, acqua distillata o deionizzata, microscopio a fluorescenza dotato di unità filtro eccitazione blu. 21

24 Italiano Precauzioni (1) Ogni siero di controllo positivo deriva da siero umano negativo per l antigene HBs, gli anticorpi HIV (HIV-1 ed HIV-2) e gli anticorpi anti HCV. Tuttavia è fortemente raccomandato che tutti i campioni clinici ed i materiali vengano trattati come potenzialmente capaci di trasmettere malattie infettive. (2) Come conservante, 0.09% sodio azide è stata aggiunta all anticorpo coniugato con FITC ed al siero di controllo positivo e negativo, dunque essi devono essere maneggiati con cura (non ingerire o far venire a contatto con mucose o pelle). La sodioazide può reagire con rame o piombo per formare azidi metalliche esplosive. Quindi, diluire con abbondante acqua prima di smaltire. (3) Alcune componenti dei kits contengono materiali di origine animale, derivanti da animali non infetti. Queste componenti dovrebbero essere trattate come pericolose per la salute sia al momento dell uso che a quello dello smaltimento. Conservazione e stabilità dei reagenti Tutti i componenti del kit devono essere conservati a 2-8 ºC. Tutti i reagenti sono stabili per 15 mesi dalla loro preparazione se conservati a 2-8 ºC. Procedura 1) Preparazione dei reagenti Portare i vetrini con il substrato a temperatura ambiente prima di aprire il contenitore, per evitare formazione di umidità. *Sigillare i vetrini che non sono usati assieme a dessiccante per mantenerli lontani dall umidità durante la conservazione. Preparare tampone PBS sciogliendo 1 busta di PBS in polvere in 1000ml di acqua distillata. *Non diluire gli altri componenti del kit che sono segnalati pronti per l uso. 2) Preparazione dei campioni Usare sieri freschi di paziente. a) Analisi qualitativa : Diluire i sieri dei pazienti 1:5 con PBS. b) Analisi quantitativa: Nel caso di sieri di pazienti che sono positivi all analisi qualitativa, fare diluizioni seriali dei campioni da testare (ad esempio 1:10, 1:20, 1:40, 1:80). *Non ripetere congelamento e scongelamento dei campioni di siero dei pazienti. Ciò potrebbe determinare una diminuizione del titolo o causare reazioni non specifiche. *L uso di sieri lipemici dovrebbe essere evitato perché esso può causare reazioni non specifiche. 3) Aggiunta dei campioni Piazzare una goccia (20-30 l) di ognuno dei sieri diluiti così come dei sieri di controllo positivi sui pozzetti e sistemare in camera umida. *Compiere l analisi usando come controlli i controlli positivi che vengono forniti. *Assicurarsi che i campioni dispensati non siano mescolati con il campione del pozzetto adiacente. *Inoltre in una analisi quantitativa, aggiungere campioni con minore concentrazione prima dei campioni a più alta concentrazione. 22

25 Italiano 4) Reazione primaria Incubare i vetrini in camera umida per 20 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). *Il tempo di incubazione deve essere compreso tra i 20 e 30 minuti. *Temperatura di incubazione al di sopra o al di sotto della normale temperatura ambiente (20-25 C), tempi di incubazione più lunghi o più brevi possono dare risultati falsi. *La reazione dovrebbe essere compiuta in camera umida con acqua sufficiente ad evitare che i vetrini si asciughino. 5) Lavaggio (1) Piazzare PBS e cestelli di lavaggio in un beaker da 500 ml. (2) Rimuovere i vetrini dalla camera umida uno alla volta e sciacquarli accuratamente dal siero usando una bottiglia di lavaggio contenente PBS. *Non spruzzare PBS direttamente sui pozzetti. *Non togliere tutti i vetrini in una sola volta, perché questo può comportare che il substrato si asciughi. (3) Piazzare immediatamente i vetrini nei cestelli di lavaggio preparati nello step 1). (4) Dopo che tutti i vetrini sono stati sistemati nel cestello, lavarli per 5 minuti usando un agitatore magnetico. *La quantità di PBS usata per i lavaggi è di 500 ml per 10 vetrini. 6) Aggiunta dell anticorpo coniugato con FITC (1) Dopo i lavaggi, rimuovere i vetrini dal cestello uno alla volta ed asciugarne tutte le parti esterne ai pozzetti usando la carta assorbente fornita. (2) Tornare a piazzare i vetrini nella camera umida ed aggiungere una goccia dell anticorpo secondario (anti immunoglobuline umane da capra coniugate con FITC) ad ogni pozzetto del vetrino. *Non asciugare mai i vetrini perché questo impedirebbe seriamente una corretta rivelazione. *Non toccare i pozzetti nè rimuovere PBS dai pozzetti direttamente con carta assorbente. 7) Reazione secondaria Incubare i vetrini in camera umida per 20 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). *Il tempo di incubazione deve essere compreso tra minuti. Temperatura di incubazione al di sopra o al di sotto della normale temperatura ambiente (20-25 ), tempi di incubazione più lunghi o più brevi possono dare risultati falsi. *La reazione dovrebbe essere compiuta in camera umida con acqua sufficiente ad evitare che i vetrini si asciughino. 8) Lavaggio Lavare i vetrini come descritto nello step 5. 9) Montaggio dei vetrini coprioggetto Dopo i lavaggi, rimuovere i vetrini dal cestello uno alla volta. Eliminare delicatamente l umidità con un pezzo di carta assorbente ed applicare 2-3 gocce di mezzo di montaggio incluso nel kit. Piazzare con cura i vetrini coprioggetto in posizione. Fare attenzione a non lasciar asciugare i vetrini. 23