Vispārīgā bioloģija ; Dzīvības ķīmija Biologi-2017 Laboratorijas darbs 2

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Vispārīgā bioloģija ; Dzīvības ķīmija Biologi-2017 Laboratorijas darbs 2"

Ολυμπία Πυλαρινός
6 χρόνια πριν
Προβολές:

1 Vispārīgā bioloģija ; Dzīvības ķīmija Biologi-2017 Laboratorijas darbs 2 Spektrofotometrija. Gaisma, gaismas spektrs, spektrofotometrijas pielietojums bioloģijā, spektrometrijā lietotās iekārtas (FEK, SF). 1. Vielu absorbcijas spektri un to noteikšana. Šajā eksperimentā absorbcijas spektrs tiek uzņemts redzamās gaismas diapazonā λ = nm, izdarot mērījumus starojuma viļņu garums λ tiek mainīts ik pa 20 nm. a) Vienā kivetē iepilda 2 ml šķīdinātāja (H 2 O), otrajā 2 ml analizējamā šķīduma. b) Spektrofotometram uzstāda λ = 400 nm (taustiņi [vairāk] vai [mazāk]), un paraugu kamerā ievieto kiveti ar šķīdinātāju, aizver kameras vāku un ar taustiņu Cal uzstāda OD=0, kiveti ar šķīdinātāju izņem no kameras. c) Paraugu kamerā ievieto kiveti ar paraugu, aizver kameras vāku un nolasīto vērtību pieraksta 1. tabulā. d) Paraugu kamerā ievieto kiveti ar šķīdinātāju, aizver kameras vāku un uzstāda nākamo viļņu garumu λ = = 420 nm (taustiņi [vairāk] vai [mazāk]), ar taustiņu Cal atkal uzstāda OD = 0, kiveti ar šķīdinātāju izņem no kameras. e) Paraugu kamerā ievieto kiveti ar paraugu, aizver kameras vāku un nolasa rezultātu utt., līdz sasniegts viļņu garums λ = 700 nm (ieskaitot). Aprakstiet krāsu, kādā caurejošā gaismā vērojams katrs no mērītajiem paraugiem! Bradfordas reaģents (OD A ): Bradfordas reaģents + BSA (OD B ): f) Pēc iegūtajiem rezultātiem konstruē absorbcijas spektra grafiku. Uz X ass atliek mērījumu punktu λ; uz Y ass, attiecīgajos punktos nolasītās OD vērtības. 2. Proteīnu daudzuma spektrofotometriska noteikšana 2.1. Noteikt doto pārtikas produktu sausnas un ūdens saturu. Lai tālākā darba gaitā noteikto proteīnu daudzumu varētu attiecināt uz produktu sausnes masu, nepieciešams zināt ūdens saturu svaigajos produktos. Tā kā produktu žāvēšana aizņem daudz laika, šis eksperiments jau ir veikts iepriekš - svaigu pētāmo paraugu iesvari tika ievietoti sverglāzītēs ar iepriekš reģistrētu masu, un produkti tika nedēļu žāvēti 50 C temperatūrā, līdz to masa vairs nemainījās. Pēc tam sverglāzītes ar produktu sausni tika nosvērtas un rezultāti apkopoti 2. tabulā. Jūsu uzdevums aprēķināt, cik % ūdens un cik % sausnes satur svaigs produkts. Rezultātus ierakstiet 2. tabulas neaizpildītajos stabiņos Proteīnu kvantitatīva noteikšana - Bradfordas metode. Šajā eksperimentā proteīnu daudzuma noteikšanai tiek izmantota Bradfordas reakcija, kura ir viena no jūtīgākajām starp plašam proteīnu spektram izmantojamajām kvantitēšanas reakcijām. Metodē tiek izmantota kumasija G-250 (Coomassie briliant blue G-250) krāsviela un tās īpatnība skābā vidē saistīties ar proteīniem un izmainīt savu gaismas absorbcijas spektru (reaģenta brūnais krāsojums kļūst zilgans). Metodē izmanto Bradfordas reaģentu: 50 mg kumasijs G ml 98% etanols 50 ml 85% fosforskābe līdz 500 ml destilēts ūdens. Optiskā blīvuma izmaiņas pēc parauga pielikšanas nosaka pie λ = 590 vai 600 nm (oranžā gaisma) Veikt proteīnu kvantitēšanas reakcijas ar proteīnu standartšķīdumiem. Lai noteiktu sakarību starp optiskā blīvuma izmaiņu reakcijas gaitā un proteīnu daudzumu, izmanto standartšķīdumus ar zināmām proteīnu koncentrācijām. Parasti tiek lietoti liellopu sēruma albumīna (BSA) šķīdumi. Šajā eksperimentā izmantosim BSA šķīdumus ar koncentrācijām: 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,5 mg/ml un 0,8 mg/ml. Ar šiem šķīdumiem secīgi veiksim Bradfordas reakciju. Mērījumos iegūtās OD vērtības apkoposim 3. tabulā! Pēc šīm vērtībām varēsim konstruēt reakcijas graduācijas grafiku, kurš parāda proteīna daudzuma saistību ar izmērīto OD. 1

2 2. tabula. Paraugu masas izmaiņas pēc žāvēšanas un noteiktais ūdens/ sausnas saturs paraugos. Nr. paraugs sverglāzes Parauga iesvara masa sausais masa (g) paraugā (%) paraugā (%) glāze + sausnes sausna svaigā ūdens svaigā masa (g) (g) paraugs (g) P xxx 20,00 0,50 20,15 0,15 30,0 70,0 1 Kabacis 21,47 6,00 21,66 2 Biete 18,36 3,00 18,78 3 Burkāns 20,11 2,00 20,32 4 Ābols 19,16 4,00 19,68 5 Zirņi 19,51 0,70 20,17 6 Pupas 19,07 0,80 19,82 7 Sojas pupas 19,87 0,85 20,67 8 Saulespuķu sēklas 19,79 0,90 20,63 9 Olas baltums 18,21 2,00 18,48 10 Aknas (vistu) 18,55 1,50 18,97 11 Reņģe 20,15 3,00 20,68 12 Piens 16,94 2,00 17,17 13 Maizes raugs 24,51 3,00 25,60 14 Beka 21,42 2,50 22, Bradfordas reakcijas izpildes gaita. Kivetē iepilda 2 ml Bradfordas reaģenta (2 reizes pa 1000 μl). Sekojiet, lai uz kivetes sieniņām nepaliek pieķērušies gaisa burbuļi, tie atstaros, lauzīs un izkliedēs gaismu, kā rezultātā mērījumi nebūs pareizi! Ja burbuļi izveidojušies, uzmanīgi tos notrauciet ar pipetes uzgali! Kiveti ievieto fotokolorimetrā (FK) ar uzstādītu 590 nm gaismas filtru (oranža gaisma). Sekojiet, lai gaismas ceļā neievietotu kivetes matētās malas! Nospiežot pogu R, aparātu iestāda uz OD = 0 (T% = 100). Izņem kiveti un pievieno 20μl BSA šķīdumu ar koncentrāciju 0,1 mg/ml. Ar 1000 µl automātiskās pipetes palīdzību (iesūcot un izpūšot) samaisa šķīdumus un ieliek kiveti FK. Sekosim, lai gaismas ceļā neievietotu kivetes matētās malas! Pēc 1 minūtes izdara mērījumu, nospiežot taustiņu T. Rezultātu pieraksta 3. tabulā. Šādā veidā veic reakciju arī ar pārējo koncentrāciju BSA standartšķīdumiem, katru reakciju veic 3 atkārtojumos. Katrai reakcijai jālieto jauna kivete! Katrai kivetei ar reaģentu individuāli jāiestāda OD = 0,00 (nospiežot kontroles (references) taustiņu R ) Noteikt sakarību starp proteīnu daudzumu standartšķīdumos un reakcijas produktu optisko blīvumu, pārliecināties par šīs sakarības linearitāti. Pēc iegūtajiem rezultātiem uz milimetru papīra (2. attēls) konstruē reakcijas graduācijas grafiku (piemērs ar izdomātām gadījuma vērtībām redzams 1. attēlā). Uz X ass atliek proteīnu masu, kura ar 20 μl BSA šķīduma tika ienesta reakcijā (šī vērtība aprēķināma atbilstoši izmantotā BSA šķīduma koncentrācijai un ierakstāma arī 3. tabulas stabiņā proteīni 20 μl šķīduma ). Uz Y ass atliek vidējo nomērīto reaģenta optisko blīvumu pēc reakcijas. Tā kā šis grafiks tiks izmantots, lai pēc iegūtā OD atrastu proteīnu daudzumu analizējamos pārtikas produktos, ir būtiski, lai grafiks izmantotu pēc iespējas visu dotā milimetru papīra lauku, un lai iegūtā taisne atrastos aptuvenu 45 leņķī attiecībā pret X asi. Tādēļ vispirms atrodiet mazāko un lielāko skaitlisko vērtību, kuras jāataino grafikā, un atbilstoši tam racionāli izvietojiet iedaļas uz asīm. Assu krustpunktā obligāti nav jāatrodas 0 vērtībai, asis var sākties ar mazākajām grafikā atainojamajām vērtībām. 2

3 Ja gatavojot reakciju maisījumus un nolasot rezultātus kļūdas nav pieļautas, visiem četriem punktiem jāatrodas uz vienas taisnes. Ja punkti neiznāk uz vienas taisnes, lūdzu, pārmēriet aizdomīgās vērtības, atkārtojot attiecīgās reakcijas vēlreiz! 3. tabula. Vērtības graduācijas grafika konstruēšanai. BSA koncentrācija proteīni 20 μl šķīduma (μg) OD 1 (o.v.) OD 2 (o.v.) OD 3 (o.v.) OD vid. (o.v.) 0,1 0,3 0,5 0,8 Optiskais blìvums 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Proteìni 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 μg/20 μl parauga 1. attēls. Graduācijas grafika skice un tā izmantošanas princips proteīnu daudzuma noteikšanai. 4. tabula. Iegūtie Bradfordas reakcijas produktu optiskie blīvumi kvantitējot proteīnus pārtikas produktu lizātā. Nr Produkts 1. reakcija OD 4 (o.v.) 2. reakcija OD 5 (o.v.) Vidējā vērtība OD (o.v.) Proteīni 20 μl šķīduma (μg)* * atrasts pēc grafika 2.6. Veikt proteīnu kvantitēšanas reakcijas analizējamo pārtikas produktu lizātiem. Paraugu šķīdumi jau ir pagatavoti iepriekš. Jūsu uzdevums ir noteikt proteīnu koncentrāciju šajos šķīdumos. Proteīnu ekstrakcijai tika izmantots svaiga parauga iesvars (5. tabula, nejaukt ar iesvaru sausnas satura noteikšanai, kurš dots 2. tabulā!), kurš līdz 1 ml tika uzpildīts ar 1 M NaOH. Paraugu lizēšana un proteīnu ekstrakcija tika veikta sasmalcinātus paraugus 10 min. vārot ūdens vannā. Lai reakcijā ievietotajos 20 mikrolitros parauga ekstrakta būtu pareizam mērījumam nepieciešamā proteīnu koncentrācija, daudzi ekstrakti tika atšķaidīti ar 1M NaOH (atšķaidīšanas reižu skaits dots 5. tabulā). Merījumus izdara tāpat kā BSA standartšķīdumiem, ņemot 2 ml Bradfordas reaģenta un 20 μl parauga, ievērojot visus iepriekš dotos norādījumus. Katram paraugam izdara 2 mērījumus (reakcijas). Iegūtās OD vērtības ieraksta 4. tabulā un izrēķina vidējo vērtību. Pēc Jūsu konstruētā graduācijas grafika nolasa iegūtajai OD vidējai vērtībai atbilstošo proteīnu daudzumu, kā 1. attēlā ilustrēts vērtībai OD = 0,2, kur tiek nolasīts proteīnu daudzums 4 μg/ 20 μl. 3

4 Nolasīto vērtību ierakstiet 4. un 5. tabulā! 5. tabulā apkopojiet arī citu grupas biedru rezultātus proteīni 20 μl šķīduma (μg)! 5. tabula. Proteīnu satura aprēķinu starprezultāti un gala rezultāti. Nr. Iesvara masa proteīnu ekstraktam (g) Atšķaidījums reizes (x) Proteīni 20 μl šķīduma (μg)* Konc. mērītajā paraugā Konc. pirms atšķaidīšanas Proteīni svaigā produktā (g/100g) Proteīni % no sausnas masas P. 0, ,0* 0,20 1,00 0,40 1,3 1 0, , , , , , , , , , , , , ,120 3 * atrasts pēc grafika 3. Rezultātu apstrāde un secinājumi (3. ieskaite) a) Pēc konstruētajiem absorbcijas spektru grafikiem izskaidrojiet analizēto šķīdumu krāsas, to krāsu atšķirības (Bradfordas reaģentam pirms un pēc reakcijas)! b) Kādēļ proteīnu kvantitēšanā tika izmantots oranžās krāsas starojums (λ = 590 nm)? 3.2. (4. ieskaite) a) Veiciet nepieciešamos aprēķinus, lai izteiktu doto pārtikas produktu proteīnu saturu gramos uz 100 gramiem svaigā produkta un procentuālo proteīnu saturu produktu sausnas masā! b) Izdariet secinājumus, kuros svaigajos produktos ir lielākais ūdens saturs, kuros lielākais sausnas saturs! c) Izdariet secinājumus, kuros produktos ir lielākais / mazākais proteīnu saturs svaigā produktā! d) Izdariet secinājumus, kuros produktos ir lielākais / mazākais proteīnu daudzums sausnā! e) Salīdziniet produktu grupas: sēņu valsts produkti; augu valsts veģetatīvo daļu produkti; augu valsts sēklu produkti; dzīvnieku valsts produkti! Izdariet secinājumus, kurās produktu grupās ir lielākais ūdens, un kurās - lielākais sausnas saturs; kurās produktu grupās ir lielākais proteīnu saturs svaigā produktā un proteīnu daudzums sausnā! 4

5 2. attēls. Forma grafika "Optiskā blīvuma atkarība no proteīnu masas" konstruēšanai. Lūgums grafiku veidot pēc iespējas izmantojot visu piedāvātās formas laukumu 5

Σχετικά έγγραφα

Rīgas Tehniskā universitāte. Inženiermatemātikas katedra. Uzdevumu risinājumu paraugi. 4. nodarbība

Rīgas Tehniskā universitāte. Inženiermatemātikas katedra. Uzdevumu risinājumu paraugi. 4. nodarbība Rīgas Tehniskā univesitāte Inženiematemātikas kateda Uzdevumu isinājumu paaugi 4 nodabība piemēs pēķināt vektoa a gaumu un viziena kosinusus, ja a = 5 i 6 j + 5k Vektoa a koodinātas i dotas: a 5 ; a =