Υπερέκφραση, καθαρισμός και καθήλωση του παράγοντα πήξης ΙΧ σε διάφορους φορείς και μελέτη της δραστικότητάς τους

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ Νανοεπιστήμες & Νανοτεχνολογίες (Ν&Ν) Υπερέκφραση, καθαρισμός και καθήλωση του παράγοντα πήξης ΙΧ σε διάφορους φορείς και μελέτη της δραστικότητάς τους Μαυρίδου Άννα Φυσικός Α.Π.Θ. Διπλωματική εργασία Επιβλέπων καθηγητής: κ. Δ.Α. Κυριακίδης Θεσσαλονίκη

2 στην αγαπημένη μου γιαγιά, που έφυγε πρόσφατα - 2 -

3 Περίληψη Μελέτες έχουν αποδείξει την in vitro αποκατάσταση παθολογικών δοκιμασιών της αιμόστασης σε δείγματα αιμοφιλικών ασθενών, με την προσθήκη σε αυτά φυσιολογικού ανασυνδιασμένου παράγοντα ΙΧ. Στην παρούσα διπλωματική εργασία που πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών Νανοτεχνολογία & Νανοεπιστήμες, αρχικά απομονώθηκε mrna από ολικό αίμα, ακολούθησε αντίδραση ανάστροφης μεταγραφάσης ώστε να παραλάβουμε το cdna του παράγοντα ΙΧ, πολλαπλασιάστηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, κλωνοποιήθηκε σε φορέα pet29c, υπερεκφράστηκε με ουρά ιστιδινών σε κύτταρα E. coli BL21 και καθαρίστηκε με χρωματογραφία αγχιστείας, με στήλη Ni-IDA αγαρόζης. Εν συνεχεία ο καθαρός παράγοντας ΙΧ καθηλώθηκε σε χημικά τροποποιημένους νανοσωλήνες, εγκλωβίστηκε σε σπόγγους πολύυδροξυαλκανοϊκών οξέων και μικροσφαιριδίων αλγινικού οξέως και προσδιορίστηκε η δραστικότητά του μετά την καθήλωση. Τελικός σκοπός της διαδικασίας είναι για πιθανή χρήση του σε εφαρμογές της νανο-βιοϊατρικής, όπως διαδερματικά,σε ασθενείς με αιμοφιλία Β

4 Abstract Several studies have proven the in vitro restoration of pathological situations of haemostasis on samples from haemophilia patiens, by adding recombinant factor IX. In the present study, which is part of the Graduate Program Nanosciences & Nanotechnologies, mrna was isolated from blood and transcripted by reverse transcriptase. The resulted cdna of factor IX was amplified by polymerase chain reaction and was cloned into pet29c vector. The truncated factor IX was overexpressed with a histidine tail, using E. coli BL21 cells and purified by affinity chromatography (with Ni-IDA agarose). The purified recombinant factor IX was then conjugated with chemical modified multiwalled carbon nanotubes, and was encapsulated in poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) sponges and in alginate microspheres. The activity of recombinant factor IX was then estimated, in order to study their potential use in nano-biomedical applications

5 Πρόλογος Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η υπερέκφραση του παράγοντα IX με ουρά ιστιδινών ώστε να είναι εφικτός ο καθαρισμός του με χρωματογραφία αγχιστείας (στήλες Νικελίου), η περαιτέρω καθήλωσή του σε χημικά τροποποιημένους νανοσωλήνες και ο εγκλωβισμός τους σε σπόγγους πολυυδροξυαλκανοϊκών οξέων και μικροσφαιριδια αλγινικού οξέως. Η αποτελεσματικότητα των διαφόρων μεθόδων καθήλωσης προσδιορίζεται με μέτρηση της δραστικότητάς τους και τη δυνατότητα επαναχρησιμοποίησής τους. Ο παράγοτας ΙΧ της πήξης (ή Christmas factor, όπως επίσης ονομάζεται) είναι μία από τις πρωτεΐνες του πλάσματος που συμμετέχουν στον μηχανισμό πήξης του αίματος. Στον πηκτικό μηχανισμό συμμετέχει ένα σύνολο από πρωτεΐνες του πλάσματος και ο ίδιος αποτελεί το σημαντικότερο τμήμα ενός ομοιοστατικού μηχανισμού, που ενεργοποιείται από την απώλεια αίματος στον οργανισμό, της αιμόστασης. Μεταλλάξεις σε αυτόν τον παράγοντα, αλλά και σε άλλες πρωτεΐνες που σχετίζονται με το ομοιοστατικό σύστημα της αιμόστασης, προκαλούν διάφορες παθολογικές καταστάσεις. Όταν η μετάλλαξη έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη ενεργότητα του πηκτικού μηχανισμού, προκαλείται η ασθένεια της θρομβοφιλίας. Στην παθολογική αυτή κατάσταση, ο ασθενής εμφανίζει υποτροπιάζοντα θρομβοεμβολικά επεισόδια, τα αίτια των οποίων μπορούμε να αναζητήσουμε είτε σε επίκτητους (τραυματισμός, εγκυμοσύνη, αυτοάνοσα νοσήματα) είτε σε κληρονομικούς παράγοντες. Όσον αφορά τις κληρονομικές μορφές της θρομβοφιλίας, οι μεταλλάξεις μπορεί να συμβούν στους παράγοντες πήξης ή στους αντιπηκτικούς παράγοντες του πλάσματος. Μέχρι τώρα έχει περιγραφεί μια πληθώρα μεταλλάξεων σε διάφορους παράγοντες της πήξης, οι οποίες προκαλούν θρομβοφιλικά σύνδρομα στα άτομα που τις φέρουν. Άλλου είδους μεταλλάξεις προκαλούν απουσία των παραγόντων πήξης ή μείωση της ενεργότητάς τους με αποτέλεσμα να εμφανίζεται η ασθένεια της αιμοφιλίας - 5 -

6 στην οποία ο πηκτικός μηχανισμός αδυνατεί να εκπληρώσει τον ομοιοστατικό του ρόλο ώστε να σταματήσει την απώλεια του αίματος (αιμορραγία). Η αιμοφιλία τύπου Β σχετίζεται με μετάλλαξη ή έλλειψη του παράγοντα IX ενώ η αιμοφιλία τύπου Α σχετίζεται με την μείωση της ποσότητας ή δραστικότητας του παράγοντα VIII. Οι κλινικές εικόνες των δύο τύπων αιμοφιλίας είναι όμοιες με ηπιότερη αυτή της αιμοφιλίας Β. Μελέτες απέδειξαν την in vitro αποκατάσταση παθολογικών δοκιμασιών της αιμόστασης σε δείγματα θρομβοφιλικών και αιμοφιλικών ασθενών, με την προσθήκη σε αυτά φυσιολογικού ανασυνδυασμένου παράγοντα ΙΧ. Με βάση τις μελέτες αυτές πραγματοποιήθηκε μελέτη της δραστικότητας του παράγοντα ΙΧ μετά την καθήλωσή του σε χημικά τροποποιημένους νανοσωλήνες, τον εγκλωβισμό του σε σπόγγους πολυυδροξυαλκανοϊκών οξέων και σε μικροσφαιρίδια αλγινικού οξέως, με σκοπό την πιθανή χρήση τους σε παθολογικές καταστάσεις της αιμόστασης. Η διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο βιοχημείας, του τμήματος χημείας, του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης υπό την επίβλεψη και την καθοδήγηση του καθηγητή κ. Κυριακίδη Δημητρίου τον οποίο ευχαριστώ θερμά για την εμπιστοσύνη της ανάθεσης ενός τόσο ενδιαφέροντος θέματος και την καθοδήγησή του καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της παρούσας διπλωματικής εργασίας. Επίσης, τον ευχαριστώ θερμά για τη βοήθεια που προσέφερε κάθε φορά που παρουσιάστηκαν δυσκολίες και βέβαια για τη διόρθωση του παρόντος κειμένου. Ακόμα, θα ήθελα να ευχαριστήσω από καρδιάς, τη μεταδιδακτορική ερευνήτρια του εργαστηρίου βιοχημείας Παπή Ρηγίνη για τη συνεχή καθοδήγηση μου καθ όλη την διάρκεια των πειραμάτων τόσο σε θεωρητικό επίπεδο όσο και στο επίπεδο των πειραματικών τεχνικών, αλλά κυρίως για τη φιλία της. Ακόμα ευχαριστώ όλους τους ερευνητές του εργαστηρίου βιοχημείας για τη βοήθειά τους και για την άριστη συνεργασία και το φιλικό περιβάλλον καθ όλη τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Ευχαριστώ τα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, την καθηγήτρια κ Θ. Χολή-Παπαδοπούλου, και τον καθηγητή κ. Μ. Γιάγκου

7 Τα πειράματα για την επιφανειακή τροποποίηση των νανοσωλήνων πραγματοποιήθηκαν στο ερευνητικό εργαστήριο του κ. Ν. Ταγματάρχη στο Ινστιτούτο Θεωρητικής και Φυσικής Χημείας του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών (ΕΙΕ) τον οποίο ευχαριστώ θερμά, καθώς ευχαριστώ και τα μέλη του εργαστηρίου κ. Ν. Καρούση και κ. Δ. Χρονόπουλο που με βοήθησαν σε πειραματικό και θεωρητικό επίπεδο. Τέλος, ευχαριστώ ιδιαίτερα τους γονείς μου και τον αδερφό μου, χωρίς τη στήριξη των οποίων δε θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί το παρόν έργο

8 Περιεχόμενα Κεφάλαιο 1. Θεωρητικό Μέρος 1.1 Το αίμα και ο πηκτικός μηχανισμός Το αίμα Η αιμόσταση και ο πηκτικός μηχανισμός Οι παράγοντες πήξης του αίματος Μοντέλο των κυτταρικών επιφανειών Το γονίδιο του παράγοντα ΙΧ Το mrna του παράγοντα ΙΧ Δομή, παραγωγή και χρόνος ημισείας ζωής Η έλλειψη της βιταμίνης Κ, μια επίκτητη διαταραχή Ενεργοποίηση Διαταραχές του μηχανισμού πήξης Αιμοφιλία A και Αιμοφιλία Β Ασθένεια von Willebrand Θρομβοφιλία Νανοτεχνολογία Σύντομη παρουσίαση νανοδομημένων υλικών Παρασκευή νανοδομημένων υλικών Μηχανικές ιδιότητες νανοδομημένων υλικών Ηλεκτρικές ιδιότητες νανοδομημένων υλικών Μαγνητικές ιδιότητες νανοδομημένων υλικών Οπτικές ιδιότητες νανοδομημένων υλικών Χημικές ιδιότητες νανοδομημένων υλικών Εφαρμογές νανοδομημένων υλικών Νανοσωματίδια Παρουσίαση μορφών άνθρακα Νανοΐνες άνθρακα Φουλερένια Τύποι νανοσωλήνων άνθρακα Τεχνικές σύνθεσης νανοσωλήνων άνθρακα Καταλυτική χημική απόθεση από ατμό (CVD) Καθαρισμός από προσμίξεις Δομή νανοσωλήνων άνθρακα Ηλεκτρονικές ιδιότητες νανοσωλήνων άνθρακα Μηχανικές και άλλες ιδιότητες νανοσωλήνων άνθρακα Νανοβιοτεχνολογία Νανοσωλήνες άνθρακα σε εφαρμογές στην βιοϊατρική Ακτινοβολία στον τομέα της ογκολογίας Αισθητήρες Ακίδες AFM

9 Μεταφορά φαρμάκων Αύξηση διαλυτότητας νανοσωλήνων άνθρακα Μεταφορά πεπτιδίων με νανοσωλήνες άνθρακα Νανοσωλήνες υψηλής βιολειτουργικότητας Προκλήσεις Βιοπολυμερή Συνθετικά πολυμερή Ο ρόλος των βιοπολυμερών υλικών Σύνθεση βιοπολυμερών υλικών από βακτήρια Πολυυδροξυαλκανοϊκά (PHAs) Ένζυμα βιοσύνθεσης των ΡΗΑs Φυσικές και χημικές ιδιότητες των πολυυδροξυαλκανοϊκών οξέων Παραγωγή ΡΗΑs από ανανεώσιμες πηγές ενέργειας Παράγοντες που επηρεάζουν την παραγωγή των ΡΗΑs Εφαρμογές πολυ-υδροξυαλκανοϊκών Τα ΡΗΑs ως φορείς φαρμακευτικών ουσιών (Drug delivery) Εμφυτεύσιμες ενδοπροσθέσεις (stents) επικαλυπτόμενες με φάρμακα προς ελεγχόμενη αποδέσμευση Εφαρμογές στη μηχανική ιστών Εφαρμογές στην ελεγχόμενη απελευθέρωση φυτοφαρμάκων Επιφανειακή τροποποίηση πολυμερών Επιφανειακή τροποποίηση PHA με πλάσμα οξυγόνου Επιφανειακή τροποποίηση PHA με χρήση όζοντος Άλλες εφαρμογές Αλγινικό οξύ Δομή αλγινικού οξέος Εγκλωβισμός ενζύμων σε αλγινικό οξύ Εφαρμογές Καθήλωση ενζύμων και κυττάρων Μέθοδοι και εφαρμογές καθήλωσης Καθήλωση ενζύμων 95 Κεφάλαιο 2. Υλικά & Μέθοδοι 2.1. Υλικά Βακτηριακά στελέχη Θρεπτικά υλικά Υποστρώματα Καλλιέργεια και συλλογή κυττάρων Εισαγωγή τμημάτων DNA σε πλασμίδια-αντίδραση λιγάσης Παρασκευή επιδεκτικών βακτηρίων για μετασχηματισμό Εισαγωγή πλασμιδιακού DNA σε κύτταρα Ε. coli Μέθοδος καλλιέργειας των στελεχών Ε. coli ΤΟΡ10 που φέρουν το πλασμίδιο pgem και ελέγχονται για έκφραση β-γαλακτοσιδάσης

10 2.9. Φυγοκέντρηση Απομόνωση RNA από ολικό αίμα Απομόνωση πλασμιδιακού DNA (μέθοδος αλκαλικής λύσης) Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με χρήση στήλης Nucleobond PC Κοπή με ενδονουκλεάσες περιορισμού Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Aντίδραση ανάστροφης μεταγραφάσης ενσωματωμένης στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Kαθαρισμός των προϊόντων της PCR Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες Χρώση με Coomassie Brilliant Blue R Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών σε μεμβράνη Ανοσοαποτύπωση Συμπύκνωση Προσδιορισμός πρωτεϊνών με χρωματομετρική μέθοδος κατά Bradford τροποποιημένη κατά Bearden Λύση κυττάρων με τη χρήση υπερήχων Εκφραση και καθαρισμός πρωτεΐνης που έχει συνδεδεμένη ουρά 6 ιστιδινών με στήλη αγχιστείας Νi 2+ -NTA αγαρόζης Οξείδωση νανοσωλήνων άνθρακα Προσάρτηση διαμίνης NH2(CH2CH2O)2-CH2CH2NH Μέθοδος Kaiser Σύζευξη rf9 με τους τροποποιημένους νανοσωλήνες Ενεργοποίηση πρωτεΐνης Αμιδολυτική μέθοδος προσδιορισμού δραστικότητας Ετοιμασία σπόγγων PHB με τη μέθοδο έκπλυσης αλάτων Καθήλωση ενζύμων σε μικροκάψουλες αλγινικού νατρίου Πλασμιδιακοί χάρτες..132 Σκοπός Κεφάλαιο 3. Αποτελέσματα 3.1. Υπερέκφραση του παράγοντα IX με ουρά ιστιδινών και καθαρισμός του με χρωματογραφία αγχιστείας Υπερέκφραση του rf9 από κύτταρα BL21 που φέρουν το πλασμίδιο pet22b Πολλαπλασιασμός της ακολουθίας του γονιδίου του rf9 με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Πολλαπλασιασμός του παράγοντα rf9 από ολικό αίμα Κλωνοποίηση στο πλασμίδιο pgem-t-easy Υπερέκφρασης της πρωτεΐνης rf9 από νέα κύτταρα BL Kαλλιέργεια σε μεγάλη κλίμακα και καθαρισμός με στήλη Ni-IDA αγαρόζης

11 3.2. Σύζευξη του ανασυνδιασμένου rf9 με διάφορους φορείς Σύζευξη του ανασυνδιασμένου παράγοντα rf9 με χημικά τροποποιημένους νανοσωλήνες Ετοιμασία σπόγγων PHB με τη μέθοδο έκπλυσης αλάτων και εισαγωγή ενεργοποιημένου rf Ετοιμασία μικροσφαιριδίων αλγινικού αξέος και ενθυλάκωση των rf9 και CNTs_rf Επαναχρησιμοποίηση του ενθυλακωμένου παράγοντα rf Κεφάλαιο 4. Συζήτηση Κεφάλαιο 5. Συμπεράσματα Βιβλιογραφία

12 Κεφάλαιο 1 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.1. Το αίμα και ο πηκτικός μηχανισμός Το αίμα Το αίμα είναι ο μόνος ιστός του σώματος σε ρευστή κατάσταση, ο οποίος ανανεώνεται συνεχώς και κινείται μέσα σε ένα κλειστό σύστημα αγγείων (καρδιά, αρτηρίες, τριχοειδή και φλέβες) χωρίς να εξέρχεται φυσιολογικά από αυτό. Αποτελείται από ένα υγρό, το πλάσμα, μέσα στο οποίο αιωρούνται ελεύθερα τα κύτταρα του αίματος, τα αιμοσφαίρια, τα ερυθροκύτταρα, τα λευκοκύτταρα και τα αιμοπετάλια, που κατάγονται από το μεσέγχυμα. Σύμφωνα με σύγχρονες αντιλήψεις, όλα τα κύτταρα του αίματος προέρχονται από τα αρχέγονα πολυδύναμα κύτταρα που είναι μικρά, μονοπύρηνα και μοιάζουν με ώριμα λεμφοκύτταρα. Τα περισσότερα από αυτά βρίσκονται σε φάση ηρεμίας και χαρακτηρίζονται από έντονη ικανότητα για αυτοανανέωση καθώς και για εξέλιξη και διαφοροποίηση προς ώριμα κύτταρα. Tο αίμα εκτελεί λειτουργίες μεταφοράς, ρυθμίσεως, άμυνας. Με το αίμα μεταφέρονται διάφορες ουσίες όπως: 1. Αναπνευστικά αέρια από τους πνεύμονες προς τους ιστούς και αντίθετα (Ο2 και CO2 αντίστοιχα). 2. Θρεπτικές και δομικές ουσίες από τον πεπτικό σωλήνα στις διάφορες περιοχές του σώματος. 3. Περιττές ουσίες προς τις κατάλληλες περιοχές-θέσεις για να αποδομηθούν και να απεκκριθούν. 4. Διάφορες ανταλλασσόμενες ουσίες όπως K +, Na +, HCO3 - Cl -, H + κ.ά. που συμβάλλουν στην διατήρηση της ομοιόστασης του οργανισμού, δηλαδή στην διατήρηση ενός σταθερού εσωτερικού περιβάλλοντος. 5. Μεταφορά θερμότητας στα πλαίσια της θερμορρυθμίσεως

13 Ρύθμιση: Στην πραγματικότητα πρόκειται για μία ακόμη λειτουργία μεταφοράς, η οποία όμως αποτελεί ειδική περίπτωση. Πρόκειται για τη μεταφορά των ορμονών, ουσιών που συμβάλλουν στη ρύθμιση της λειτουργίας του οργανισμού. Άμυνα: Το αίμα συμβάλλει στην άμυνα του οργανισμού εναντίον των διαφόρων βλαπτικών παραγόντων γιατί διαθέτει ειδικές ουσίες (αντισώματα του πλάσματος) κύτταρα (λευκά αιμοσφαίρια) αλλά και το φαινόμενο της αιμόστασης, το οποίο οφείλεται στα αιμοπετάλια και στους παράγοντες πήξης (1) Η αιμόσταση και ο πηκτικός μηχανισμός Η αιμόσταστη αποτελεί φυσιολογικό μηχανισμό άμυνας του οργανισμού κατά της απώλειας αίματος από μικρές ή μεγάλες βλάβες των αγγείων. Ανεπάρκεια του μηχανισμού επίσχεσης της αιμορραγίας οδηγεί σε διάφορα αιμορραγικά σύνδρομα, ενώ εκτροπή του οδηγεί στην θρόμβωση (τοπικό φαινόμενο) ή στη διάχυτη ενδαγγειακή πήξη (γενικευμένο φαινόμενο). Η αιμόσταση περιλαμβάνει τέσσερις φάσεις: Την αγγειακή Την αιμοπεταλιακή Τη φάση της πήξης Τη φάση της ινωδόλυσης 1 η φάση: αγγειακή Το τραυματισμένο αγγείο αντιδρά αμέσως με σύσπαση, μείωση της διαμέτρου του και περιορισμό της ροής του αίματος. Η σύσπαση οφείλεται στις ελαστικές ίνες και στα λεία μυϊκά κύτταρα του τοιχώματός του και ενισχύεται από διάφορες αγγειοσυσπαστικές ουσίες π.χ σεροτονίνη, που εκκρίνονται από τα αιμοπετάλια ή προσέρχονται με την κυκλοφορία. 2 η φάση: αιμοπεταλιακή Τα αιμοπετάλια έρχονται σε επαφή με το κολλαγόνο της υπενδοθηλιακής στιβάδας του τοιχώματος του τραυματισμένου αγγείου και προσκολώνται. Η προσκόληση απαιτεί την παρουσία του παράγοντα von Willebrand, ο οποίος παράγεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και σχετίζεται με τον παράγοντα VIII του

14 μηχανισμού πήξης. Ταυτόχρονα από τα αιμοπετάλια απελευθερώνεται διφωσφορική αδενοσίνη (ADP) η οποία προάγει την προσκόλληση και συσσώρευσή τους. Στη συνέχεια από τα φωσφολιπίδια των αιμοπεταλίων απελευθερώνεται το αραχιδονικό οξύ που με την δράση της κυκλοοξυγενάσης μετατρέπεται σε προσταγλανδίνη G2(PGG2) και προσταγλανδίνη H2(PGH2). Η PGH2 με τη δράση της συνθετάσης της θρομβοξάνης μετατρέπεται σε θρομβοξάνη Α2, η οποία προκαλεί περαιτέρω απελευθέρωση ADP και συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Η προσκόληση και συσσώρευση των αιμοπεταλίων έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία του αιμοπεταλιακού θρόμβου. Αξίζει να σημειωθεί ότι η ασπιρίνη αναστέλλει τη δράση της κυκλοοξυγενάσης επηρρεάζοντας τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων. 3 η φάση: φάση της πήξης Με τον μηχανισμό της πήξης μετατρέπεται η προθρομβίνη σε θρομβίνη και έτσι δημιουργείται ο ινώδης θρόμβος. Στη διεργασία της πήξης συμμετέχουν διαφορετικής προέλευσης παράγοντες. Στον πηκτικό μηχανισμό διακρίνονται δύο συστήματα, η ενδογενής και εξωγενής οδός. 4 η φάση: φάση της ινωδόλυσης Τη δημιουργία του θρόμβου ακολουθεί η συστολή του με τη δράση της θρομβοσθενίνης και με ενέργεια που προέρχεται από την τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP). Μετά τη συστολή ακολουθεί η διάλυσή του. Αρχίζει με την ενεργοποίηση του πλασμινογόνου από ένα αντίστοιχο ενεργοποιητικό ένζυμο του θρόμβου σε πλασμίνη ή ινωδολυσίνη. Αυτή δρα πάνω στο δίκτυο του ινώδους, στο ινωδογόνο και στους παράγοντες V και VIII με αποτέλεσμα τη διάλυση του θρόμβου (1)

15 Εικόνα 1.1 Μηχανισμός πήξης του αίματος (2). Η ενεργοποίηση του πηκτικού μηχανισμού γίνεται ανάλογα με το αρχικό ερέθισμα με δύο οδούς, την ενδογενή και την εξωγενή. Η εξωγενής οδός είναι εξελικτικά πιο αρχέγονη, ενεργοποιείται όταν το υγρό των ιστών και το υγρό από τραυματισμένα κύτταρα, το οποίο περιέχει έναν ειδικό λιποπρωτεϊνικό και φωσφολιποειδικό παράγοντα (τον ιστικό παράγοντα) έρχονται σε επαφή με τον παράγοντα VII του πλάσματος και τον ενεργοποιούν πρωτεολύοντας και σχηματίζοντας έτσι τον ενεργοποιημένο παράγοντα VIIa. Στην εξέλιξη αυτή συμμετέχουν και το πρωτεολυτικό ένζυμο καλλικρεϊνη που προέρχεται επίσης από του ιστούς και οι ενεργοποιούμενοι παράγοντες Χ και ΧΙΙ. Στη συνέχεια ο ενεργοποιημένος παράγοντας VIIa παρουσία Ca 2+ και του ιστικού παράγοντα ενεργοποιεί τον παράγοντα Χ, o οποίος πλέον μαζί με τον παράγοντα V και τη σύμπραξη Ca 2+ και του PF3 αποτελεί την ενεργό προθρομβινάση των ιστών, τον καταλύτη δηλαδή της μετατροπής της προθρομβίνης σε θρομβίνη που θα πρωτεολύσει με τη σειρά της το ινωδογόνο σε ινική. Το εξωγενές σύστημα επενεργεί γρήγορα, μέσα σε λίγα δευτερόλεπτα, δεδομένου του ότι το υγρό των ιστών αποτελεί αυτό καθ εαυτό μια προθρομβινάση. Η πήξη του αίματος η οποία προκαλείται από την ιστική προθρομβινάση που παράγεται κατά την ενεργοποίηση της εξωγενούς οδού δεν είναι τόσο εκτενής και πλήρης όσο από την προθρομβινάση του πλάσματος που παράγεται κατά την ενεργοποίηση της ενδογενούς οδού

16 Η ενδογενής οδός είναι μια πολύ πιο πολύπλοκη και εξελικτικά νεότερη οδός η οποία ξεκινάει όταν αιμοπετάλια έρχονται σε επαφή με διαβρεχόμενη επιφάνεια και προσκολλώνται σε αυτήν δημιουργώντας έτσι τον αιμοπεταλιακό θρόμβο. Στην εξέλιξη αυτή συμβάλλει ο παράγοντας von Willebrand, που κυκλοφορεί στο πλάσμα σε σύνδεση με τον παράγοντα VIII καθώς επίσης και το ΑDP που απελευθερώνεται από τα ίδια τα αιμοπετάλια. Χάρη στην επαφή αυτή των αιμοπεταλίων ενεργοποιείται ο πρώτος παράγοντας που συμμετέχει στην ενδογενή οδό, ο παράγοντας ΧΙΙ με τη συμμετοχή επίσης της καλλικρεϊνης. Ο ενεργοποιημένος πλέον παράγοντας ΧΙΙa παρουσία ιόντων Ca 2+ συμβάλλει στην καλούμενη γλοιώδη μεταμόρφωση των αιμοπεταλίων που αντιστοιχεί στη μετατροπή των έμμορφων αυτών στοιχείων του αίματος μετά τη συγκόλλησή τους σε άμορφη μάζα χωρίς κυτταρικά όρια. Από την κυτταρική μεμβράνη των μεταμορφωμένων αυτών αιμοπεταλίων ελευθερώνεται ένα φωσφολιποειδές, καλούμενος τρίτος αιμοπεταλιακός παράγοντας PF3. Παράλληλα ο ενεργός παράγοντας ΧΙΙa ενεργοποιεί τον παράγοντα ΙΧ, με τον οποίο και ασχοληθήκαμε στην παρούσα εργασία. Αυτός πλέον παρουσία Ca 2+ και των παραγόντων VIIIa και PF3 ενεργοποιεί τον παράγοντα Χ, ο οποίος στη συνέχεια με τη δράση του παράγοντα V σχηματίζει την ενεργό προθρομβινάση του πλάσματος. Το σύστημα αυτό είναι εξελικτικά ανώτερο από αυτό της εξωγενούς οδού, όμως ενεργοποιείται με αργότερο ρυθμό (2-5 λεπτά) παράγει όμως προθρομβινάση σε μεγάλες ποσότητες και προκαλεί έτσι πήξη του αίματος σε ευρύτερη έκταση(3) Οι παράγοντες πήξης του αίματος Όπως διαπιστώθηκε και πιο πάνω, η πήξη του αίματος είναι αποτέλεσμα μιας σειράς αλυσιδωτών αντιδράσεων που οδηγούν τελικά στη μετατροπή του ινωδογόνου σε αδιάλυτο πλέγμα ινικής. Ο πηκτικός μηχανισμός στηρίζεται στη δράση ενός συνόλου πρωτεϊνών του πλάσματος που διαθέτουν ενζυμική δράση πρωτεάσης της σερίνης. Τα ένζυμα αυτά ονομάζονται παράγοντες της πήξης και καταλύουν μεταξύ τους την πρωτεολυτική τους διάσπαση που έχει ως αποτέλεσμα τη διαδοχική τους ενεργοποίηση. Οι αντιδράσεις πρωτεόλυσης λαμβάνουν χώρα ακολουθώντας συγκεκριμένα μονοπάτια αλλεπάλληλης ενεργοποίησης που έχουν ως κοινό αποτέλεσμα την

17 πρωτεόλυση της προθρομβίνης σε θρομβίνη. Η θρομβίνη είναι ένα πολύ ισχυρό πρωτεολυτικό ένζυμο, το οποίο έχει ως αποτέλεσμα την κατάλυση της τελικής αντίδρασης του πηκτικού μηχανισμού, την μετατροπή του ινωδογόνου σε πολυμερισμένη ινική. Όλοι οι παράγοντες της πήξης σχηματίζονται στο ήπαρ εκτός από τον παράγοντα VIII, το Ca, την θρομβοπλαστίνη και τους αιμοπεταλιακούς παράγοντες. Οι παράγοντες της πήξης είναι ανενεργοί μέχρι να συμβούν τα γεγονότα που αποτελούν έναυσμα για την πήξη του αίματος, οπότε και ενεργοποιούνται αλληλοδιαδόχως. Οι ενεργές μορφές των παραγόντων της πήξης συμβολίζονται με το γράμμα a (= activated) δίπλα στο λατινικό αριθμό. Έτσι η προθρομβίνη ή παράγοντας ΙΙ μετατρέπεται σε θρομβίνη ή παράγοντα ΙIa. Οι ενεργές μορφές πολλών παραγόντων της πήξης είναι ειδικές πρωτεάσες (ενδοπεπτιδάσες) που προκύπτουν μετά από περιορισμένη πρωτεόλυση των ανενεργών μορφών που είναι προένζυμα ή ζυμογόνα. Η μετατροπή των προενζύμων αυτών είναι εξαιρετικά αργή σε απουσία ορισμένων βοηθητικών παραγόντων, παρουσία των οποίων επιταχύνεται κατά φορές. Οι βοηθητικοί αυτοί παράγοντες είναι : 1. Ιόντα Ca Όξινα φωσφολιπίδια, όπως φωσφατιδυλοσερίνη και φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη που προέρχονται από τη μεμβράνη των αιμοπεταλίων αλλά και από τους τραυματισμένους ιστούς 3. Ορισμένοι παράγοντες πήξης, όπως οι παράγοντες III, V, VIII και το κινινογόνο υψηλού μοριακού βάρους (HMWK High Molecular Weight Kininogen), των οποίων οι ενεργές μορφές δεν είναι πρωτεάσες αλλά αυξάνουν σημαντικά την πρωτεολυτική δράση ορισμένων ενεργών παραγόντων- πρωτεασών της πήξης. Οι περισσότερες από τις πρωτεάσες της πήξης είναι σερινοπρωτεάσες, όπως δηλαδή τα παγκρεατικά πρωτεολυτικά ένζυμα τρυψίνη, χυμοτρυψίνη και ελαστάση. Τα προένζυμα του αίματος δείχνουν τόσο μεταξύ τους όσο και με προένζυμα άλλων σερινοπρωτεασών σημαντική ομολογία πρωτοταγούς δομής. Η ομολογία αυτή παρατηρείται στα 250 περίπου αμινοξέα της καρβοξυτελικής περιοχής. Στην περιοχή αυτή της ομολογίας περιέχεται η εξαιρετικά δραστική σερίνη της ενεργής περιοχής των πρωτεασών καθώς και το ηλεκτρικό δίκτυο ασπαραγινικού, ιστιδίνης και σερίνης (4). Στο σύστημα αυτό που είναι γνωστό και ως σύστημα μεταφοράς φορτίου (charge relay system) τα αμινοξέα ασπαραγινικό οξύ, ιστιδίνη και σερίνη

18 συνδέονται μεταξύ τους με δεσμούς υδρογόνου έτσι ώστε η πόλωση του συστήματος αυτού λόγω αρνητικής φόρτισης της καρβοξυλικής ομάδας, κάνει το υδροξύλιο της σερίνης πυρηνόφιλο και ικανό να προσβάλλει τα υποστρώματα (5). Οι δεσμοί που διασπούν οι πρωτεάσες της πήξης είναι του τύπου Arg-X (όπου Χ κυρίως Thr, Ile και Gly). Διαφέρουν όμως από την τρυψίνη στο ότι έχουν εξαιρετικά περιορισμένη ειδίκευση, ώστε in vivo να δρουν αποκλειστικά μόνο στα προένζυμα που αποτελούν τα υποστρώματά τους. Η αμινοτελική περιοχή των προενζύμων της πήξης, η οποία δεν έχει καμία αντιστοιχία με τα παγκρεατικά ένζυμα, συμμετέχει στις διάφορες αλληλεπιδράσεις με τους βοηθητικούς παράγοντες, εμφανίζει μεγάλη ομολογία μεταξύ των διαφόρων παραγόντων και η δομή της θα περιγραφεί στη συνέχεια (4). Ο παράγοντας πήξης IX έχει ως καταλυτική δραστηριότητα το εκλεκτικό σπάσιμο του δεσμού Arg-Ile που υπάρχει στον παράγοντα X για να σχηματιστεί ο ενεργοποιημένος παράγοντας Xa (6). Παράγοντες πήξης του αίματος Αριθμητικός χαρακτηρισμός Παράγοντας I Παράγοντας ΙΙ Παράγοντας III Παράγοντας IV Παράγοντας V Παράγοντας VII Παράγοντας VIII Παράγοντας IX Παράγοντας X Παράγοντας XI Παράγοντας XII Παράγοντας XIII Ονοματολογία ινωδογόνο προθρομβίνη θρομβοπλαστίνη των ιστών ασβέστιο προαξελερίνη προκομβερτίνη αντιαιμοφιλική σφαιρίνη θρομβοπλαστίνη του πλάσματος παράγοντας Stuart-Prower προθρομβοπλαστίνη του πλάσματος παράγων Hageman σταθεροποιητικής του δικτύου ινικής Οι αριθμοί αυτοί αντιστοιχούν στη χρονική σειρά ανακάλυψης αυτών των παραγόντων και όχι με τη σειρά που συμμετέχουν οι παράγοντες αυτοί στη

19 διεργασία της πήξης του αίματος. Ο παράγοντας VI δεν χρησιμοποιείται, πλέον, σήμερα. Εικόνα 1.2. Απεικόνιση του μηχανισμού πήξης του αίματος το οποίο ξεκινά με τον ενεργοποιημένο παράγοντα IX (ΙΧα) στον ενδογενή μηχανισμό και την καταστροφή των κυττάρων στον εξωγενή μηχανισμό Μοντέλο των κυτταρικών επιφανειών H εικόνα της αιμόστασης ως καταρράκτης που αποτελείται από μια σειρά αντιδράσεων η καθεμία από τις οποίες πυροδοτεί την επόμενη υπερίσχυε για δεκαετίες. Το γεγονός ότι οι αντιδράσεις υγρής φάσης είναι ανεπαρκές μοντέλο για την εξήγηση της αιμόστασης και ότι τα αιμοπετάλια και οι άλλες κυτταρικές επιφάνειες παρέχουν τα ανιοντικά φωσφολιπίδια που είναι απαραίτητα για το σχηματισμό συμπλεγμάτων ώστε οι αντιδράσεις να μπορέσουν να συνεχιστούν έχει αναγνωριστεί. Σύμφωνα λοιπόν με τις νέες απόψεις η πήξη είναι ένα φαινόμενο που στηρίζεται κυρίως στην αλληλεπίδραση των παραγόντων με τις επιφάνειες και δεν ρυθμίζεται τόσο από τους παράγοντες της πήξης όσο από κυτταρικά στοιχεία. Σύμφωνα με το νέο μοντέλο θεώρησης του μηχανισμού τη πήξης αυτό διακρίνεται σε τρεις φάσεις. Στην πρώτη φάση έχουμε την έναρξη της πήξης στην επιφάνεια ενός κυττάρου που περιέχει ιστικό παράγοντα, όπου παράγονται οι ενεργοποιημένοι παράγοντες FXa, FIXa και η θρομβίνη. Στη συνέχεια η παραπάνω αντίδραση μεγεθύνεται δίπλα στην αιμοπεταλιακή επιφάνεια καθώς τα αιμοπετάλια

20 ενεργοποιούνται, προσκολλώνται και συσσωρεύουν παράγοντες στις επιφάνειές τους. Στο τρίτο στάδιο είναι η φάση επέκτασης όπου λαμβάνει χώρα η δεύτερη μεγάλη έκρηξη παραγωγής θρομβίνης στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων καθώς αλληλεπιδρούν οι παράγοντες-πρωτεάσες με τους συμπαράγοντές τους και οδηγούν στον πολυμερισμό της ινικής. Τα αιμοπετάλια είναι τα ιδανικά κύτταρα για τη ρύθμιση και το συντονισμό όλων των παραπάνω αντιδράσεων (3) Το γονίδιο του παράγοντα ΙΧ Το γονίδιο του παράγοντα εντοπίζεται στο μακρό σκέλος του φυλετικού χρωμοσώματος Χ και γι αυτό διάφορες ασθένειες που σχετίζονται με μεταλλάξεις του γονιδίου αυτού κληρονομούνται με το φυλοσύνδετο χαρακτήρα. Σύμφωνα με τη βάση δεδομένων EMBL-ebi υπάρχουν 58 ορθόλογα και 13 παράλογα του παράγοντα ΙΧ. Το ολικό μήκος του γονιδίου είναι 34 kb, 12 δηλαδή φορές μεγαλύτερο από το mrna του παράγοντα, λόγω των πολλών ιντρονίων που περιέχει. Εικόνα 1.3. Το χρωμόσωμα Χ όπου η θέση του γονιδίου του παράγοντα ΙΧ επισημαίνεται με κόκκινη γραμμή πάνω στο χρωμόσωμα. Υπάρχουν δύο προτεινόμενες περιοχές για την ακολουθία του προαγωγέα. Η πρώτη βρίσκεται στις θέσεις , 27 νουκλεοτίδια δηλαδή πριν την έναρξη του mrna και είναι η ακολουθία TGTA. Η δεύτερη βρίσκεται στις θέσεις και είναι η ακολουθία ΤΑΑΑ. Η δεύτερη ακολουθία είναι πιο ομόλογη στις συνήθεις ακολουθίες ΤΑΤΑ που αποτελούν τους προαγωγείς των ευκαρυωτικών γονιδίων, αλλά είναι εκτός των συνήθων ορίων τοπικά για τους προαγωγείς. Το γονίδιο του παράγοντα ΙΧ αποτελείται από 8 εξόνια που αντιστοιχούν σε περιοχές της πρωτεΐνης. Το πρώτο εξόνιο, κωδικοποιεί το 5 - άκρο του mrna, το οποίο περιέχει την υδρόφοβη περιοχή του πεπτιδίου σήματος και δε μεταφράζεται. Το εξόνιο 2 κωδικοποιεί την υδρόφιλη αρχική ακολουθία του προενζύμου και όλη

21 σχεδόν την Gla περιοχή (11 από τα 12 αμινοξέα Glu που τελικά καρβοξυλιώνονται) και που δεσμεύει τα ιόντα Ca 2+. Είναι αξιοπερίεργο το ότι το 12 ο αμινοξύ γλουταμινικού της Gla περιοχής κωδικοποιείται από το 3 ο εξόνιο,το οποίο έχει μήκος μόνο 25 νουκλεοτίδια. Τα εξόνια 4 και 5 σχηματίζουν μια συνδετική περιοχή της πρωτεΐνης που εμφανίζει δύο περιοχές με ομολογία προς τον επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF- epidermal growth factor). H περιοχή αυτή επίσης περιέχει το μοναδικό αμινοξύ β-υδροξυασπαραγινικού, στο αμινοξύ 64. Στο τμήμα αυτό υπάρχουν δύο περιοχές αμινοξέων που εμφανίζουν ομολογία μεταξύ τους και ως προς τον EGF. Οι ομόλογες αυτές περιοχές της πρωτεΐνης κωδικοποιούνται από χωριστά εξόνια, το 4 και 5, γεγονός που υποδηλώνει ότι η παρούσα μορφή της περιοχής αυτής του παράγοντα ΙΧ προήλθε από το διπλασιασμό ενός εξονίου του αρχέγονου γονιδίου. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται και από το γεγονός ότι τα δύο αυτά εξόνια έχουν παρόμοιο μήκος. Η ίδια παρατήρηση ισχύει και για τους άλλους παράγοντες της πήξης που εμφανίζουν αυτήν την περιοχή με την διπλασιασμένη ομόλογη προς τον EGF περιοχή. Η σημασία της ομολογίας αυτής και η δράση της περιοχής αυτής του παράγοντα δεν έχουν ακόμα διευκρινιστεί. Το εξόνιο 6 κωδικοποιεί το πεπτίδιο ενεργοποίησης, το τμήμα δηλαδή του παράγοντα που αποκόπτεται κατά την ενεργοποίησή του. Τα τελευταία δύο εξόνια, το 7 και 8 κωδικοποιούν την καταλυτική περιοχή του παράγοντα που διαθέτει δράση πρωτεάσης της σερίνης. Το ενεργό κέντρο που αποτελείται από την ιστιδίνη His (221) βρίσκεται στο εξόνιο 7, ενώ τα δύο άλλα ενεργά αμινοξέα, το ασπαραγινικό Asp (269) και η σερίνη Ser (365) βρίσκονται στο εξόνιο 8. Είναι ενδιαφέρον ότι η διάταξη αυτή διαφέρει από τη διάταξη άλλων σερινοπρωτεασών με μελετημένη γονιδιακή ακολουθία. Στον ανθρώπινο παράγοντα Β του συμπληρώματος, στην ανθρώπινη προθρομβίνη και σε καλλικρεϊνες επίμυων, όπως και σε χυμοθρυψινογόνα και θρυψινογόνα αυτά τα σημαντικής λειτουργικότητας αμινοξέα κωδικοποιούνται από διαφορετικά εξόνια. Η διαφοροποίηση αυτή στη διάταξη των καταλυτικών τμημάτων της πρωτεΐνης σε εξόνια στους διάφορους παράγοντες της πήξης έρχεται σε αντίθεση με την ισχυρά συντηρημένη γωνιακή διάταξη των περιοχών του πεπτιδίου σήματος και της Gla περιοχής. Οι θέσεις των ορίων των τριών πρώτων εξονίων που κωδικοποιούν τις περιοχές αυτές είναι όμοιες σε όλους τους βιταμινο-κ-εξαρτώμενους παράγοντες της πήξης (7)

22 Το mrna του παράγοντα ΙΧ Το mrna του παράγοντα ΙΧ έχει μήκος 2802 νουκλεοτίδια. Περιέχει στο 5 άκρο μια μικρή αλληλουχία που δε μεταφράζεται, μήκους 29 βάσεων και στο 3 άκρο μια μακριά ουρά 1390 βάσεων που επίσης δε μεταφράζεται και περιέχει την διπλή αλληλουχία τερματισμού UAAUGA και την AAUAAA αλληλουχία, 21 νουκλεοτίδια πριν την πολυαδενυλική ουρά. Το πρώτο κωδικόνιο έναρξης (μεθειονίνης) βρίσκεται στο νουκλεοτίδιο 39, δημιουργώντας έτσι ένα ανοικτό αναγνωστικό πλαίσιο μέχρι τον τερματισμό της μετάφρασης στη θέση 1412 μετά το τελικό κωδικόνιο καρβοξυτελικής θρεονίνης. Η 3 μη μεταφραζόμενη περιοχή σχηματίζει δύο αγκύλες με κέντρο τα νουκλεοτίδια 2203 και αντίστοιχα, δίνοντας αγκύλες μήκους 14 και 19 νουκλεοτιδίων. Η λειτουργική σημασία των αγκυλών αυτών δεν είναι γνωστή Δομή, παραγωγή και χρόνος ημισείας ζωής Ο παράγοντας ΙΧ είναι μια βιταμινο-k-εξαρτώμενη πρωτεΐνη του πλάσματος που συντίθεται όπως και οι περισσότεροι παράγοντες πήξης από το ηπατοκύτταρο αρχικά ως πρόδρομη πρωτεΐνη. Στη συνέχεια υφίσταται εκτεταμένη μεταμεταφραστική τροποποίηση για να μετατραπεί σε ένα πλήρως γ- καρβοξυλιωμένο ώριμο ζυμογόνο που ακολούθως εκκρίνεται στο αίμα. Η πρόδρομη πρωτεΐνη αποτελείται από τα ακόλουθα τμήματα: αρχικά υπάρχει ένα πεπτίδιο σήμα στο αμινοτελικό άκρο που κατευθύνει την πρωτεΐνη στο ενδοπλασματικό δίκτυο του ηπατοκυττάρου. Δίπλα βρίσκεται η αλληλουχία που αναγνωρίζεται από τη γ-γλουταμυλκαρβοξυλάση που είναι υπεύθυνη για τη μεταμεταφραστική τροποποίηση (καρβοξυλίωση) των αμινοξέων γλουταμινικού (Gla) στο αμινοτελικό άκρο του μορίου. Τα δύο αυτά τμήματα του μορίου απομακρύνονται πριν η πρωτεΐνη εκκριθεί στην κυκλοφορία

23 Εικόνα 1.4. Διαμόρφωση του παράγοντα IX στον χώρο. Ο παράγοντας ΙΧ στη μορφή της μονής αλύσου έχει στο αμινοτελικό του άκρο την περιοχή Gla που περιέχει 12 γ-καρβοξυλιωμένα αμινοξέα γλουταμινικού. Αυτό είναι το χαρακτηριστικό γνώρισμα όλων των βιταμινο-κ-εξαρτώμενων παραγόντων. Η Gla περιοχή είναι υπεύθυνη για τη δέσμευση των ιόντων Ca 2+ που είναι απαραίτητο για τη δέσμευση του παράγοντα ΙΧ στις φωσφολιποειδικές μεμβράνες. Η περιοχή Gla ακολουθείται από δύο περιοχές που παρουσιάζουν μεγάλη ομολογία με τον επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF) και από το πεπτίδιο ενεργοποίησης, το οποίο απομακρύνεται όταν ο παράγοντας ΙΧ στη μορφή μονής αλύσου (ζυμογόνο) μετατρέπεται σε ενεργοποιημένο παράγοντα ΙΧ (FIXa), δηλαδή στη μορφή του με δύο αλύσους. Η καταλυτική περιοχή που περιέχει την ενζυματική δράση βρίσκεται αμέσως μετά, προς το καρβοξυλικό άκρο. Εικόνα 1.5. Ο παράγοντας IX αποτελείται από τέσσερα τμήματα (domains) που παρουσιάζουν διαφορετικές λειτουργικότητες το καθένα. Αυτά είναι η Gla περιοχή (περιοχή με γλουταμινικά αμινοξέα), δύο τμήματα με μεγάλη ομολογία με τον επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF) και από το πεπτίδιο ενεργοποίησης και ένα καρβοξυτελικό τμήμα όμοιο της πεπτιδάσης της τρυψίνης στο οποίο οφείλεται η καταλυτική δράση του παράγοντα ΙΧ

24 Πριν την έκκρισή του από το ηπατοκύτταρο παράγοντας ΙΧ υφίσταται εκτενή μεταμεταφραστική τροποποίηση που περιλαμβάνει τη γ-καρβοξυλίωση, β- υδροξυλίωση και απομάκρυνση του πεπτιδίου ενεργοποίησης και του προπεπτιδίου σήματος. Επίσης το μόριο υφίσταται θείωση, φωσφορυλίωση και συνδέονται σε αυτό υδατανθρακικές ομάδες. Τα αμινοξέα γλουταμινικού που γ-καρβοξυλιώνονται στον παράγοντα ΙΧ είναι στις θέσεις 7, 8, 15, 17, 20, 21, 26, 27, 30, 33, 36, 40. Στη θέση 64 βρίσκεται το αμινοξύ ασπαραγινικό που β-υδροξυλιώνεται. Οι υδατανθρακικές ομάδες δεσμεύονται στα αμινοξέα ασπαραγίνης στις θέσεις 157 και 167. Η γ-καρβοξυλίωση είναι μια διαδικασία που εξαρτάται από τη βιταμίνη Κ, κατά την οποία το ένζυμο γ-γλουταμυλκαρβοξυλάση δεσμεύεται σε ειδικές περιοχές στην προπεπτιδική περιοχή της πρόδρομης πρωτεΐνης που συντίθεται στο ήπαρ. Η διαδικασία της γ-καρβοξυλίωσης των αμινοξέων γλουταμινικού σχηματίζει αμινοξέα γ-καρβοξυγλουταμινικού στην ώριμη πρωτεΐνη και απαιτεί ανηγμένη βιταμίνη Κ, οξυγόνο και διοξείδιο του άνθρακα για να επιτελέσει τις λειτουργίες της. Η γ-γλουταμυλκαρβοξυλάση έχει ως συμπαράγοντα τη μορφή της υδροκινόνης της βιταμίνης Κ. Οι βιταμίνες Κ είναι υποκατεστημένα παράγωγα της 2-μεθυλο 1,4-ναφθοκινόνης. Ένας αριθμός ενώσεων με δράση βιταμίνης Κ διαφέρουν ως προς το μήκος της πλάγιας αλύσου R στη θέση 3. Έτσι η βιταμίνη Κ1 είναι η 2-μεθυλο-3-φυτυλο-1,4-ναφθοκινόνη, ενώ η Κ2 είναι η 2-μεθυλο-3- εξαπρενυλο-1,4-ναφθοκινόνη. Εξίσου δραστική με την Κ1 και Κ2 είναι η μεναδιόνη ή 2-μεθυλο-1,4,ναφθοκινόνη, ενώ το αζωτούχο ανάλογο 4-ιμινο-2-μεθυλο-1,4- ναφθοκινόνη είναι τέσσερις φορές δραστικότερο της μεναδιόνης. Εικόνα 1.6. Οι χημικοί τύποι της βιταμίνης Κι και Κ2. Σε ένα φυσιολογικό άτομο που διατρέφεται σωστά η βιταμίνη Κ προέρχεται κατά 50% από τη βιταμίνη Κ της τροφής και κατά 50% από αυτήν που συνθέτουν τα βακτηρίδια της εντερικής χλωρίδας. Ας σημειωθεί ότι η βιταμίνη Κ που

25 προέρχεται από βακτηριδιακή σύνθεση υπερκαλύπτει τις ανάγκες ενός ατόμου και γι αυτό δεν είναι αναγκαία η παρουσία τους στην τροφή. Σε αποφρακτικό ίκτερο η ελάττωση της απορρόφησης της βιταμίνης Κ μπορεί να οδηγήσει σε αβιταμίνωση Κ και αιμορραγική διάθεση. Επίσης η χρήση αντιβιοτικών (κυρίως σουλφοναμιδών) έχει επιπτώσεις στην εντερική χλωρίδα με αποτέλεσμα ελάττωση της σύνθεσης της βιταμίνης Κ. Ο μηχανισμός δράσης της βιταμίνης Κ έγινε φανερός με μελέτη του ανταγωνιστή της δικουμαρόλη. Η δικουμαρόλη απομονώθηκε από το αλλοιωμένο γλυκό τριφύλλι και δεν υπάρχει στο φρέσκο, αλλά σχηματίζεται μετά από τη ζύμωσή του. Ζώα τα οποία τρέφονται με αλλοιωμένο τριφύλλι παρουσιάζουν αιμορραγική νόσο και ανώμαλο χρόνο προθρομβίνης. Η σύνδεση των παραγόντων πήξης με ιόντα Ca 2+ σε τέτοια άτομα είναι ελαττωμένη και αυτό οφείλεται στο ότι τα αμινοξέα γλουταμινικού της Gla περιοχής δε διαθέτουν γ-καρβοξυομάδες για τη δέσμευση των ιόντων. Κατά την αντίδραση γ-καρβοξυλίωσης η βιταμίνη Κ οξειδώνεται προς το 2,3- εποξείδιο της κινόνης. Η αναγέννηση της ενεργής μορφής, δηλαδή της υδροκινόνης γίνεται με αναγωγή του εποξειδίου στη μορφή της υδροκινόνης από την αναγωγάση της βιταμίνης Κ, όπως φαίνεται στην Εικόνα 1.7: Εικόνα 1.7. Ο κύκλος της βιταμίνης Κ και η σύνδεσή του με την αντίδραση γ- καρβοξυκλίωσης των παραγόντων της πήξης. Απεικονίζονται επίσης τα σημεία αναστολής του κύκλου από το αντιπηκτικό φάρμακο βαρφαρίνη (8). Οι Gla περιοχές είναι οι δεσμευτικές περιοχές με μεγάλη συγγένεια για τα ιόντα Ca 2+ που είναι απαραίτητες για τη δέσμευση του ενεργοποιημένου παράγοντα ΙΧa σε λιπιδικές μεμβράνες ώστε να εκδηλώσει πλήρως την πηκτική του δράση. Όλοι οι βιταμινο-κ-εξαρτώμενοι παράγοντες πήξης καθώς και οι αντίστοιχοι

26 αντιπηκτικοί παράγοντες είναι βιολογικά ανενεργοί αν δεν καρβοξυλιωθούν τα αμινοξέα γλουταμινικού που διαθέτουν στο αμινοτελικό τους άκρο. Ο ακριβής αριθμός των αμινοξέων αυτών γλουταμινικού ποικίλλει ανάλογα με τον παράγοντα. Η βαρφαρίνη αναστέλλει την αναγωγή και την ανακύκλωση της οξειδωμένης βιταμίνης Κ (το εποξείδιο της βιταμίνης Κ) που παράγεται κατά την αντίδραση καρβοξυλίωσης. Ως αποτέλεσμα της έμμεσης αναστολής της αντίδρασης καρβοξυλίωσης που οφείλεται σε έλλειψη διαθέσιμης ανηγμένης βιταμίνης Κ, στην κυκλοφορία ασθενών που λαμβάνουν βαρφαρίνη βρίσκονται υποκαρβοξυλιωμένες και αποκαρβοξυλιωμένες μορφές των βιταμινο-κ-εξαρτώμενων παραγόντων. Αυτές οι μη φυσιολογικές μορφές διαθέτουν ελαττωμένη ή καθόλου βιολογική δραστικότητα. Αφού γίνουν αυτές οι τροποποιήσεις η καβοξυτελική περιοχή αναγνωρίζεται από τους εκκριτικούς μηχανισμούς του ήπατος. Μεταλλάξεις που αυξάνουν το φορτίο σε αυτές τις περιοχές οδηγούν σε ελαττωμένη ηπατική έκκριση όλων των βιταμινο-κ-εξαρτώμενων πρωτεϊνών, περιλαμβανομένου του παράγοντα ΙΧ και οδηγούν σε συνδυασμένη έλλειψη των βιταμινο-κ-εξαρτώμενων παραγόντων της πήξης. Ο παράγοντας ΙΧ ανευρίσκεται σε συγκέντρωση 4-5 mg/ml με χρόνο ημίσειας ζωής ώρες. Μια διαφοροποίηση στην ενεργότητα του παράγοντα ΙΧ στο πλάσμα ως και 3 φορές είναι φυσιολογική. Εφόσον ο παράγοντας ΙΧ είναι μικρότερος από την αλβουμίνη, κατανέμεται και στον ενδαγγειακό και στον εξωαγγειακό χώρο. Μετά από ενδοφλέβια χορήγησή του η συγκέντρωσή του στο αίμα ποικίλλει σημαντικά, γεγονός που αποδίδεται στην ανάπτυξη αντισωμάτων έναντι αυτού. Άλλος μηχανισμός που έχει προταθεί για την επίτευξη ελαττωμένων συγκεντρώσεων στον ορό ασθενών μετά από ενδοφλέβια χορήγηση είναι η δέσμευση του παράγοντα στο κολλαγόνο τύπου ΙV. Οι ποσότητα του παράγοντα ΙΧ που βρίσκεται σε κυκλοφορία αντικαθίσταται περίπου κάθε ώρες. Έχει διαπιστωθεί εκτεταμένη ομολογία μεταξύ του παράγοντα ΙΧ και άλλων βιταμινο-κ-εξαρτώμενων πρωτεϊνών (παράγοντας ΙΙ, παράγοντας Χ, παράγοντας VII και αντιπηκτικές πρωτεΐνες C και S, κυρίως στις ακολουθίες προς το αμινοτελικό άκρο (στο προπεπτίδιο και στις Gla περιοχές). Παρά τις πολυάριθμες ομοιότητες κάθε βιταμινο-κ-εξαρτώμενος παράγοντας πήξης επιτελεί διαφορετική λειτουργία στο αιμοστατικό μονοπάτι

27 Η έλλειψη της βιταμίνης Κ, μια επίκτητη διαταραχή Η βιταμίνη Κ βρίσκεται στα πράσινα λαχανικά, είναι λιποδιαλυτή και για την απορρόφησή της χρειάζεται φυσιολογική εντερική χλωρίδα. Είναι απαραίτητη για την σύνθεση από το ήπαρ των παραγόντων II, VII, IX και X. Έλλειψή της παρατηρείται συχνά σε χειρουργημένους ασθενείς εξαιτίας μειωμένης πρόσληψης λόγω κακής διατροφής, σε σύνδρομο δυσαπορρόφησης, σε παρατεταμένη λήψη αντιβιοτικών και αλλοίωση της εντερικής χλωρίδας, σε ασθενείς με αποφρακτικό οίκτερο λόγω έλλειψης χολικών αλάτων ή σε παρατεταμμένη παρεντερική διατροφή χωρίς χορήγηση βιταμίνης Κ. Εργαστηριακά διαπιστώνεται παράταση του χρόνου προθρομβίνης. Η αντιμετώπιση γίνεται με χορήγηση βιταμίνης Κ σε δόση mg με αποτέλεσμα διόρθωση του ελλείματος σε 8-12 ώρες (1) Ενεργοποίηση Η γ-καρβοξυλιωμένη περιοχή του παράγοντα ΙΧ είναι απαραίτητη για τη δέσμευση ασβεστίου και είναι το σημείο όπου οι βιταμινο-κ-εξαρτώμενες περιοχές δεσμεύονται στα φωσφολιπίδια των κυτταρικών επιφανειών και όπου λαμβάνουν χώρα οι αντιδράσεις του πηκτικού μηχανισμού. Η σύνδεση των ιόντων Ca 2+ στην Gla περιοχή οδηγεί σε αλλαγή της διαμόρφωσης που οδηγεί σε έκθεση στην επιφάνεια υδρόφοβων αμινοξέων του μορίου του παράγοντα ΙΧ που πριν ήταν στο εσωτερικό του. Τα υδρόφοβα αυτά αμινοξέα μπορούν να εισέλθουν έτσι στη λιποπρωτεϊνική διπλοστοιβάδα. Ο ιστικός παράγοντας (TF Tissue Factor) είναι μια γλυκοσυλιωμένη μεμβρανική πρωτεΐνη που υπάρχει σε κύτταρα γύρω από τα αγγεία και σε διάφορα όργανα. Αντιθέτως, τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα μακροφάγα των ιστών και τα λεία μυϊκά κύτταρα εκφράζουν τον ιστικό παράγοντα μόνο όταν διεγερθούν από πρωτεάσες της σερίνης, όπως η θρομβίνη, και από φλεγμονώδεις κυτταροκίνες. In vivo υπό φυσιολογικές συνθήκες μόνο ίχνη παράγοντα VII βρίσκονται στην ενεργοποιημένη του μορφή (περίπου 1%). Σε ύπαρξη ιστικού παράγοντα αυτός σχηματίζει σύμπλεγμα με τον παράγοντα VII ή την ενεργοποιημένη του μορφή VIIa. Το σύμπλεγμα αυτό στη συνέχεια ενεργοποιεί τον παράγοντα ΙΧ σε FIXa. Το πεπτίδιο ενεργοποίησης μπορεί να ανιχνευτεί στο πλάσμα

28 Η ενεργοποίηση του παράγοντα ΙΧ γίνεται σε δύο βήματα. Στο πρώτο βήμα ο δεσμός Arg 145 Ala 146 διασπάται, οπότε σχηματίζεται ένα ενδιάμεσο προϊόν δύο αλυσίδων που ονομάζεται παράγοντας ΙΧα και αποτελείται από μια ελαφρά (αμινοξέα 1-145) και μια βαριά (αμινοξέα ) άλυσο. Στο δεύτερο στάδιο η βαριά άλυσος του παράγοντα ΙΧα διασπάται στο δεσμό Arg 180 Val 181, οπότε προκύπτει το πεπτίδιο ενεργοποίησης μήκους 35 αμινοξέων ( ) και το ενεργό ένζυμο με μικρότερη βαριά άλυσο (αμινοξέα ). Μετά την ενεργοποίησή του ο παράγοντας ΙΧ μετατρέπεται σε μόριο δύο αλυσίδων, όπου οι δύο αλυσίδες συνδέονται με ένα δισουλφιδικό δεσμό που συνδέει το μόριο στην Gla περιοχή. Ο ενεργοποιημένος παράγοντας VIII (VIIIa) είναι ο εξειδικευμένος συμπαράγοντας για την πλήρη εκδήλωση της ενεργότητας του ενεργοποιημένου παράγοντα ΙΧ. Τα αιμοπετάλια όχι μόνο παρέχουν την λιπιδική επιφάνεια πάνω στην οποία λαμβάνουν χώρα οι αντιδράσεις στερεάς φάσης αλλά διαθέτουν επίσης θέση δέσμευσης για τον παράγοντα ΙΧ που προωθεί το σχηματισμό του συμπλέγματος με τον ενεργοποιημένο παράγοντα VIII και τα ιόντα Ca 2+. Το σύμπλεγμα των παραγόντων IXa, VIIIa, Ca 2+ και των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων (η φωσφολιπιδική επιφάνεια) φτάνει στη συνέχεια τη μέγιστη δραστικότητά της ενεργοποιώντας τον παράγοντα Χ σε ενεργοποιημένο παράγοντα Χ (Xa). Το σύμπλεγμα που σχηματίζεται και που περιέχει ενεργοποιημένο παράγοντα ΙΧ αποτελεί τον ενεργοποιητή του παράγοντα Χ στην ενδογενή οδό και ονομάζεται σύμπλεγμα ενδογενούς τενάσης ή δεκάσης (intrinsic tenase complex) σε αντίθεση με το σύμπλεγμα ενεργοποιημένου παράγοντα VII με τον ιστικό παράγοντα που αποτελούν τον εξωγενή ενεργοποιητή του παράγοντα Χ (εξωγενής τενάση-extrinsic tenase). Στη συνέχεια ο ενεργοποιημένος παράγοντας Χ με τον ενεργοποιημένο παράγοντα V, ιόντα Ca 2+ και φωσφολιπίδια αποτελούν το σύμπλεγμα που ενεργοποιεί την προθρομβίνη (προθρομβίνη) που οδηγεί στο σχηματισμό θρομβίνης. In vivo το ενεργό σύμπλεγμα FVIIa-TF είναι υπεύθυνο για την ενεργοποίηση του παράγοντα Χ σε Χa οδηγώντας έτσι στην παραγωγή μικρής ποσότητας θρομβίνης. Όταν ο ενεργοποιημένος παράγοντας ΙΧ που παράγεται από το σύμπλεγμα FVIIa-TF είναι συστατικό του συμπλέγματος ενδογενούς τενάσης, ενεργοποιεί επιπλέον ποσότητες παράγοντα Χ σε Χa και οδηγεί σε μια δεύτερη και εκρηκτική παραγωγή θρομβίνης που έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό θρόμβου

29 Στον πηκτικό μηχανισμό υπάρχουν πολλά μονοπάτια ανατροφοδότησης και ο ενεργοποιημένος παράγοντας ΙΧ μπορεί να ενεργοποιήσει και τους παράγοντες VII και VIII εκτός από το Χ, καθώς ασθενείς με σοβαρή έλλειψη παράγοντα ΙΧ εμφανίζουν και χαμηλά επίπεδα ενεργοποιημένου παράγοντα VII. Ο κυριότερος φυσικός αναστολέας του παράγοντα ΙΧ είναι η αντιθρομβίνη ΙΙΙ. Η αντιθρομβίνη ΙΙΙ είναι μια γλυκοπρωτεïνη του πλάσματος που αναστέλλει την θρομβίνη και τους παράγοντες ΙXa, Xa, XIa σχηματίζοντας με αυτούς μη αντιστρεπτά ανενεργά συμπλέγματα. Η ηπαρίνη, ένας αρνητικά φορτισμένος πολυσακχαρίτης συνδέεται με την αντιθρομβίνη ΙΙΙ, οπότε η τάση σύνδεσης της τελευταίας με τον παράγοντα ΙΧ και τους άλλους παράγοντες αυξάνει κατά μερικές εκατοντάδες φορές. Η ηπαρίνη βρίσκεται σε πολλούς ιστούς και κυρίως στα μεταχρωματικά κοκκία των ιστιοκυττάρων. Μικροποσά ηπαρίνης ελευθερώνονται την κυκλοφορία με τον τραυματισμό ενός αγγείου και των γύρω ιστών. Με τον τρόπο αυτό προωθείται η εξουδετέρωση των ενεργοποιημένων παραγόντων με σύνδεσή τους με την αντιθρομβίνη ΙΙΙ, βραχύνεται ο χρόνος δράσης τους και περιορίζεται η πήξη στην περιοχή της αγγειακής βλάβης Διαταραχές του μηχανισμού πήξης Οι πιο συνηθισμένες διαταραχές αφορούν έλλειψη: Του παράγοντα VIII (Αιμοφιλία Α) Του παράγοντα IX (Αιμοφιλία Β) Του παράγοντα von Willebrand Στις διαταραχές των παραγόντων πήξης, μόνον η αναπλήρωση του παράγοντα που λείπει μπορεί να αποκαταστήσει την ανωμαλία στους μηχανισμούς της αιμόστασης (9)

30 Αιμοφιλία A και Αιμοφιλία Β Η αιμοφιλία είναι αιμορραγική διάθεση που απαντά σχεδόν αποκλειστικά στο ανδρικό φύλο και το 85% των περιπτώσεων έχει να κάνει με την έλλειψη του παράγοντα VIII ενώ στο υπόλοιπο 15% των περιπτώσεων η αιμορραγική διάθεση οφείλεται σε έλλειψη του παράγοντα ΙΧ. Οι παράγοντες VIII και IX μεταβιβάζονται γενετικά με το χρωμόσωμα του θηλέος ως υπολειπόμενο χαρακτηριστικό. Γι αυτό και σχεδόν ποτέ δεν θα παρατηρηθεί αιμοφιλία σε γυναίκα, δεδομένου ότι τα κατάλληλα γονίδια σύνθεσης των παραγόντων θα υπάρχουν τουλάχιστον στο ένα από τα δύο Χ χρωμοσώματά της. Αν όμως το ένα Χ είναι ελαττωματικό, η γυναίκα θα είναι φορέας αιμοφιλίας που θα μεταβιβάζει την μεν νόσο στα μισά από τα αρσενικά παιδιά της και την κατάσταση του φορέα στα μισά από τα θηλυκά. Συνήθως στην αιμοφιλία θα παρατηρηθεί αιμορραγία μόνο μετά από τραυματισμό, αλλά ο τραυματισμός που απαιτείται για να προκληθεί βαριά και παρατεταμένη αιμορραγία μπορεί να είναι τόσο ελαφρός που να μην γίνει καν αντιληπτός (10). Έλλειψη του παράγοντα VIII προκαλεί την κλασσική αιμοφιλία Α. Η ασθένεια αυτή παρατηρείται όταν υπάρχει απουσία ή μειωμένη δραστικότητα του παράγοντα VIII η οποία οφείλεται είτε σε ελαττωματική σύνθεση του παράγοντα αυτού είτε σε σύνθεση δομικά μη φυσιολογικού μορίου. Το γονίδιο για τον παράγοντα VIII βρίσκεται στο ανθρώπινο γονιδίωμα, στο φυλετικό χρωμόσωμα Χ (Χq28 ) και αποτελείται από 26 εξόνια που εκτείνονται σε μια περιοχή 186 kb βάσεων. Μέχρι στιγμής, έχουν αναφερθεί έξι διαφορετικές αλλοιώσεις στο γονίδιο του παράγοντα αυτού που από αυτές οι τρεις είναι σημειακές μεταλλάξεις και οι άλλες τρεις ελλείψεις (deletions) και όλες οδηγούν στην σύνθεση μιας ελαττωματικής ή μη λειτουργικής πρωτεΐνης.η Αιμοφιλία Α εμφανίζεται με συχνότητα 1:1000 στα νεογέννητα αρσενικά και η σοβαρότητα και η συχνότητα των αιμορραγιών εξαρτάται από τον βαθμό της εναπομείνασας δραστικότητας του παράγοντα VIII. Τέλος η έλλειψη του παράγοντα IX οδηγεί στην αιμοφιλία Β ή Christmas disease (9). Η θέση του γονιδίου για τον παράγοντα IX στο χρωμόσωμα Χ καθώς και ότι σχετίζεται με αυτόν έχει αναφερθεί σε προηγούμενη υποενότητα του Θεωρητικού Μέρους

31 Ασθένεια von Willebrand (σύνδρομο von Willebrand Jurgens) Απουσία του παράγοντα von Willebrand (vwf, factor VIII-antigen) οδηγεί σε μειωμένη ή παντελή έλλειψη πρόσφυσης-προσκόλλησης των αιμοπεταλίων πάνω στον υποενδοθηλιακό ιστό και σε δευτερογενή έλλειψη του 52 VIII. Ο παράγοντας αυτός κωδικοποιείται από ένα μεγάλο γονίδιο ( 178 kb) που αποτελείται από 52 εξόνια πάνω στο χρωμόσωμα 12 και παίζει σπουδαίο ρόλο στην αιμόσταση αφού : Συνδέεται με τον παράγοντα VIII και τον σταθεροποιεί, προστατεύοντάς τον από πρωτεολυτική διάσπαση στην κυκλοφορία του αίματος. βοηθάει τα αιμοπετάλια να συσσωματώνονται μεταξύ τους αλλά και να προσκολλώνται πάνω στον υποενδοθηλιακό ιστό, εκεί όπου υπάρχει βλάβη του αγγειακού ενδοθηλίου. Η μειωμένη δραστικότητα του παράγοντα αυτού στο πλάσμα είναι αποτέλεσμα είτε χαμηλών συγκεντρώσεών του (τύπος Ι, σε αυτόν ανήκουν το 80% των ασθενών) είτε ανεπαρκούς λειτουργίας του ( τύπος ΙΙ). Η εν λόγω ασθένεια χαρακτηρίζεται από εύκολη δημιουργία μωλώπων και παρατεταμένη αιμορραγία από βλεννώδεις επιφάνειες (9) Θρομβοφιλία Ο όρος θρομβοφιλία είναι σχετικά πρόσφατος και χρησιμοποιείται για να περιγράψει την παθολογική κατάσταση κατά την οποία ένα άτομο έχει αυξημένο κίνδυνο να εμφανίσει θρομβοεμβολικά επεισόδια. Μέχρι τώρα έχει περιγραφεί μια πληθώρα μεταλλάξεων σε διάφορους παράγοντες της πήξης, οι οποίες προκαλούν θρομβοφιλικά σύνδρομα στα άτομα που τις φέρουν. Το παθολογικό πήγμα αίματος που σχηματίζεται μέσα σε ένα αγγείο ονομάζεται θρόμβος. Υπάρχει πιθανότητα αυτός ο σχηματισθείς θρόμβος, λόγω διαρκούς ροής του αίματος, να αποσπασθεί από το σημείο που βρίσκεται προσκολλημένος και να κινηθεί ελεύθερος μέσα στην κυκλοφορία. Τέτοιοι θρόμβοι ονομάζονται έμβολα και εμφανίζουν την τάση να αποφράσσουν ιδιαίτερα τα αγγεία των πνευμόνων, του εγκεφάλου, τα στεφανιαία κ.ά

32 Τα αίτια της δημιουργίας θρομβοεμβολικών επεισοδίων στον άνθρωπο είναι τα παρακάτω : Κάθε ανώμαλη ενδοθηλιακή αγγειακή επιφάνεια συνέπεια αρτηριοσκλήρυνσης, λοίμωξης ή τραυματισμού- τείνει να κινητοποιήσει τη διαδικασία της πήξης Συχνά το αίμα πήζει όταν ρέει πολύ αργά μέσα στα αγγεία γιατί πάντα σχηματίζονται μέσα σε αυτό μικρές ποσότητες θρομβίνης και άλλων πηκτικών ουσιών (10)

33 1.2. Νανοτεχνολογία Νανοτεχνολογία είναι ένας όρος ο οποίος χρησιμοποιείται για να περιγράψει τη δημιουργία και χρήση λειτουργικών δομών μεγέθους μεταξύ 1 και 100 νανομέτρων (nm), της τάξεως δηλαδή του 10-9 μέτρων. Οι διαστάσεις γίνονται ευκολότερα αντιληπτές αναφέροντας πως ένα νανόμετρο ισούται περίπου με το 1/ μιας ανθρώπινης τρίχας ή με το μήκος 10 ατόμων υδρογόνων σε σειρά. Κατά παρόμοιο τρόπο ορίζεται και ο όρος νανοεπιστήμη αναφερόμενος σε επιστήμες οι οποίες μελετούν φαινόμενα στην κλίμακα αυτή. Τα τελευταία χρόνια, η κυρίαρχη τάση είναι η δημιουργία μικρότερων προϊόντων σε κάθε τομέα της ζωής. Τα οφέλη του να έχουμε μικρότερα εργαλεία και ταυτόχρονα με περισσότερες ικανότητες και λειτουργικότητες είναι φανερά σύμφωνα λαμβάνοντας υπ όψιν την οπτική γωνία της μηχανικής που αναφέρει ότι : μικρότερα συστήματα έχουν την τάση να κινούνται ταχύτερα από μεγαλύτερα λόγω μικρότερης μάζας αδράνειας, το μικροσκοπικό μέγεθος των μικρών συστημάτων συντελεί στο να αντιμετωπίζουν λιγότερα προβλήματα θερμικής παραμόρφωσης και ταλάντωσης και καταναλώνουν λιγότερη ενέργεια. Εξ αιτίας αυτών των πλεονεκτημάτων, η ελαχιστοποίηση του μεγέθους των συστημάτων και των εργαλείων έχει γίνει ένας ενεργός τομέας έρευνας. Στη μέχρι τώρα ανάπτυξη της σημαντικό ρόλο έπαιξαν η σημαντική βελτίωση του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου ενώ σταθμοί μπορούν να θεωρηθούν οι ανακαλύψεις δομών άνθρακα σε μορφή σφαίρας γνωστές ως φουλερένια (buckminister fullerenes ή fullerenes ή buckyballs) καθώς και σε μορφή σωλήνα γνωστές ως νανοσωλήνες άνθρακα (carbon nanotubes) με ιδιαίτερες ιδιότητες το καθένα. Ο όρος νανοτεχνολογία χαρακτηρίζεται από μεγάλη ευρύτητα όντας πολύ γενικός για να περιγράψει οτιδήποτε συμβαίνει στις διαστάσεις του νανομέτρου. Κατά συνέπεια, μπορεί να χωρισθεί σε πιο ειδικά θέματα όπως αυτό της νανοηλεκτρονικής, των νανοϋλικών καθώς και άλλων. Οι εφαρμογές της είναι αναρίθμητες ενώ οι επιπτώσεις γίνονται αντιληπτές σε πολλαπλά επίπεδα κατά κύριο λόγο στον οικονομικό τομέα επηρεάζοντας παγκόσμιες βιομηχανίες και οικονομίες, αλλά και στον κοινωνικό βελτιώνοντας το επίπεδο της ζωής μας. Δε θα πρέπει ωστόσο να φανταστεί κάποιος πως η νανοτεχνολογία πρόκειται για επιστημονική επανάσταση. Τα περισσότερα θέματα που αυτή

34 περικλείει προκύπτουν σαν λογική συνέπεια της εξέλιξης της ικανότητας της επιστήμης και της τεχνολογίας να ερευνά και να εργάζεται σε όλο και μικρότερη κλίμακα. Εξάλλου, η κατάλυση, ένα φαινόμενο που ανέκαθεν χαρακτηριζόταν από νανομετρικές διαστάσεις αποτελεί επιστημονικό κλάδο ο οποίος αναπτύσσεται πολλές δεκαετίες. Επιπλέον, ολόκληρα επιστημονικά πεδία όπως η χημεία, ή η βιολογία ανέκαθεν δούλευαν σε τέτοιες διαστάσεις παρόλο που ο όρος νανοεπιστήμη εισήχθη μόλις πρόσφατα. Η νανοτεχνολογία στο επίπεδο των νανοδομημένων υλικών αποτελεί καθοριστικό παράγοντα στην ανάπτυξη της οικονομίας υδρογόνου. Υλικά για την αποθήκευση υδρογόνου, για ηλεκτρόδια κυψελών καυσίμου ή για την κατάλυση η οποία είναι καθοριστική σε όλα τα στάδια από αυτό της παραγωγής μέχρι της χρήσης βελτιώνουν την επίδοση τους ραγδαία όταν αυτά αποκτήσουν νανοκρυσταλλική δομή. Επομένως, η μελέτη των διεργασιών και η κατανόηση τους σε αυτό το επίπεδο μας ενδιαφέρει άμεσα. Αυτό δικαιολογεί τη μεγάλη πειραματική δραστηριότητα στον τομέα αλλά και τις προσπάθειες ανάπτυξης θεωρητικών μοντέλων με τη χρήση προσομοίωσης (11-14,15,16) Σύντομη παρουσίαση νανοδομημένων υλικών Τα νανοϋλικά αποτελούν για τους λόγους που είπαμε ιδιαίτερο πεδίο έρευνας τα τελευταία χρόνια. Νανοϋλικά ονομάζονται τα υλικά των οποίων οι δομικοί λίθοι ανήκουν στην τάξη του νανομέτρου. Σε αυτά τα χαρακτηριστικά οφείλονται και οι ιδιαίτερες ιδιότητες των νανοϋλικών, ιδιότητες κατά πολύ ανώτερες αυτών των συμβατικών υλικών που χρησιμοποιούνται κατά κύριο λόγο αυτή τη στιγμή στη βιομηχανία. Στα πολυκρυσταλλικά νανοδομημένα υλικά ή αλλιώς νανοκρυσταλλικά υλικά (nanocrystalline materials) αναφερόμαστε στο μέγεθος ενός κρυσταλλίτη ή αλλιώς κόκκου (grain), ο οποίος αποτελείται από ένα μικρό αριθμό ατόμων. Συνέπεια αυτού είναι ένα μεγάλο ποσοστό (τα μισά ή περισσότερα) αυτών των ατόμων να βρίσκονται στην επιφάνεια του. Από άποψη φυσικής, αυτό κάνει τα φαινόμενα επιφάνειας (φαινόμενα μεταφοράς μάζας, διαμόρφωση επιφανειακών ενεργειακών σταθμών κ.τ.λ.) να παίζουν πρωταρχικό ρόλο στη μελέτη των νανοδομημένων υλικών

35 Όπως είναι λογικό, οι εφαρμογές των νανοϋλικών είναι ανάλογες σε αριθμό των δυνατοτήτων τους. Οι βελτιωμένες ηλεκτρικές, οπτικές, φυσικές, χημικές, μαγνητικές και μηχανικές ιδιότητες τους είναι και το κίνητρο για την έρευνα που γίνεται πάνω σε αυτά ενώ έχουν αναπτυχθεί πολυάριθμες μέθοδοι παρασκευής τους, αν και όχι όλοι κατάλληλοι για την επιθυμητή από τη βιομηχανία, μαζική παραγωγή τους. Ένας δεύτερος λόγος που δικαιολογεί το ενδιαφέρον για τα νανοϋλικά είναι ότι η φυσική που τα χαρακτηρίζει διαφέρει ριζικά από αυτή που πάνω της στηρίζεται η σύγχρονη βιομηχανία (για παράδειγμα η μικροηλεκτρονική) και απαιτούνται νέες μέθοδοι προσέγγισης, που όμως μόλις πρόσφατα άρχισαν να αναπτύσσονται. Ενδεικτικές χρήσεις των νανοϋλικών είναι, καλύτερα υλικά για υπολογιστές νέας γενιάς, καλύτερα μονωτικά υλικά, καλύτερα κοπτικά εργαλεία, μπαταρίες υψηλής χωρητικότητας, εξαιρετικά ισχυροί μαγνήτες κτλ(11-14,15,16) Παρασκευή νανοδομημένων υλικών Καθώς ο όρος "νανοϋλικά" είναι ιδιαίτερα ευρύς καλύπτοντας μία πολύ μεγάλη κατηγορία υλικών δεν μπορούμε να μιλήσουμε για κάποια γενική μέθοδο παρασκευής τους. Υπάρχουν δύο γενικές κατηγορίες παρασκευής υλικών, η "από πάνω προς τα κάτω" και η "από κάτω προς τα πάνω". Χαρακτηριστικό παράδειγμα των πρώτων είναι η λιθογραφία στις διάφορες μορφές της. Στην πιο απλή της μορφή, ηλεκτρόνια ή φωτόνια κατάλληλων ενεργειών χρησιμοποιούνται για να μορφοποιήσουν μια επιφάνεια με τη βοήθεια μιας μάσκας. Την κατηγορία των "από κάτω προς τα πάνω" αντιπροσωπεύει επάξια ή τεχνικής της αυτο-συναρμολόγησης όπου μοριακά είδη αυτο-οργανώνονται σε περιοδικές δομές σε μια προσπάθεια ελαχιστοποίησης της ελεύθερης ενέργειας του συστήματος

36 Μηχανικές ιδιότητες νανοδομημένων υλικών Αναφερόμενοι σε νανοκρυσταλλικά υλικά, καθώς ο όγκος του κόκκου μειώνεται, αυξάνεται σημαντικά ο αριθμός των ατόμων που βρίσκονται στην επιφάνεια του. Η απόδοση ενός κρυσταλλικού υλικού, κατά κανόνα, όσων αφορά κάποια ιδιότητα του είναι αντιστρόφως ανάλογη του μεγέθους των κόκκων, μέχρι ένα κατώτατο όριο φυσικά όπου μετά από αυτό δεν έχει νόημα πια η έννοια του πολυκρυσταλλικού υλικού αλλά μιλάμε πλέον για άμορφα υλικά. Αυτό γιατί τα περισσότερα ενεργά άτομα και αυτά στα οποία οφείλονται κυρίως οι ιδιότητες τους, είναι τα άτομα που βρίσκονται στην επιφάνεια του κρυσταλλίτη. Τα νανοκρυσταλλικά υλικά παρουσιάζουν πολύ υψηλή σκληρότητα. Για τα νανοκρυσταλλικά μέταλλα κόκκων μεγέθους περίπου 10 nm, για παράδειγμα, μπορεί να παρατηρηθεί από 2 έως και 7 φορές περισσότερη σκληρότητα από μέταλλα με μεγαλύτερους κόκκους μεγέθους (περισσότερο από 1μm). Εξαίρεση αποτελούν τα λεπτά υμένια (thin films) με κόκκους μικρότερους των 6 nm όπου η σκληρότητα μειώνεται καθώς μειώνεται το μέγεθος του κόκκου(11-14,15,16) Ηλεκτρικές ιδιότητες νανοδομημένων υλικών Η πιο χαρακτηριστική χρήση των νανοϋλικών με τέτοιο τρόπο ώστε να εκμεταλλεύονται οι ηλεκτρικές ιδιότητες τους είναι οι νανοσωλήνες άνθρακα, τα οποία έχουν ευρεία χρήση στη νανοηλεκτρονική και στην ηλεκτρονική μικροσκοπία. Οι ηλεκτρικές ικανότητες των νανοσωλήνων άνθρακα εξαρτώνται από τη διάμετρο τους και το προσανατολισμό των ανθράκων ως προς τον κεντρικό άξονα τους. Ανάλογα μπορούν και συμπεριφέρνονται ως μεταλλικά ή ως ημιαγώγιμα υλικά(11-14,15,16)

37 Μαγνητικές ιδιότητες νανοδομημένων υλικών Από τις πιο σημαντικές ιδιότητες των νανοϋλικών είναι οι μαγνητικές. Η παραμένουσα μαγνήτιση των διφασικών σκληρών/μαλακών μαγνητικών προϊόντων νανοκρυσταλλικής δομής έχει βιομηχανικά πάρα πολλές χρήσεις. Μαλακή σιδηρομαγνητική συμπεριφορά εμφανίζουν για παράδειγμα διαλύματα μαγνητικών νανοσωματιδίων. Επιπλέον τα νανοκρυσταλλικά ελαφρά μαγνητικά προϊόντα παρουσιάζουν τις μικρότερες απώλειες ενέργειας από οποιοδήποτε άλλο υλικό. Στα νανοϋλικά επίσης μπορούμε να παρατηρήσουμε και το φαινόμενο της γιγαντιαίας μαγνητοαντίστασης (GMR) κατά το οποίο η ηλεκτρική αντίσταση ενός υλικού μειώνεται όταν το υλικό εκτεθεί σε μαγνητικό πεδίο και αναφέρθηκε πρώτη φορά για πολυστρωματικά λεπτά υμένια(11-14,15,16) Οπτικές ιδιότητες νανοδομημένων υλικών Οι οπτικές ιδιότητες ενός υλικού εξαρτώνται και από τις ηλεκτρονιακές του καταστάσεις. Η δομή των νανοϋλικών είναι τέτοια ώστε αυτές να παρουσιάζουν μεγάλες διαφορές σε σύγκριση με ένα κοινό υλικό. Μιλώντας για νανοκρυσταλλικά υλικά, ανάλογα με το προς χρήση υλικό και το μέγεθος των κόκκων του μπορεί να επιτευχθούν διαφορετικές τιμές ανακλαστικότητας ή οπτικής διαφάνειας για διαφορετικά μήκη κύματος. Συνέπεια αυτού του γεγονότος, οι πάρα πολλές τεχνολογικές εφαρμογές κυρίως σαν επιστρώσεις με τη μορφή λεπτών υμενίων(11-14,15,16) Χημικές ιδιότητες νανοδομημένων υλικών Τέλος πρέπει να αναφερθούμε στη χαρακτηριστική ικανότητα των νανοϋλικών να απορροφούν/αποθηκεύουν μεγάλες ποσότητες υδρογόνου καθώς αντιδρούν φυσικά ή χημικά με αυτό. Αυτό τους δίνει συν τοις άλλοις τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθούν ως πολύ καλοί καταλύτες σε αντιδράσεις που παίρνει μέρος

38 υδρογόνο, κάτι αρκετά σημαντικό, αφού βρίσκει εφαρμογές σε πολλές ενεργειακές εφαρμογές όπως η λειτουργία των κυψελών καυσίμου. Γενικά τα νανοκρυσταλλικά υλικά, λόγω της μεγάλης επιφάνειας των δομικών λίθων τους (αναφερόμενοι είτε σε κρυσταλλίτες είτε στους μονοκρυστάλλους νανοσωματιδίων) μπορούν να δράσουν καταλυτικά και μάλιστα βέλτιστα σε πάρα πολλές περιπτώσεις(11-14,15,16) Εφαρμογές νανοδομημένων υλικών Όπως εύκολα μπορεί να καταλάβει κάποιος, υλικά με ιδιότητες όπως τις παραπάνω είναι επιθυμητά σε μία πληθώρα εφαρμογών. Αναφέρονται μερικές ενδεικτικά: Η ταχύτητα των υπολογιστικών συστημάτων είναι αντιστρόφως ανάλογη με το μέγεθος των μικροεπεξεργαστών τους. Ωστόσο με τη σημερινή τεχνολογία το κατώτατο όριο του μεγέθους αυτού δε θα αργήσει να σταματήσει κάθε περαιτέρω βελτίωση. Τα νανοϋλικά είναι αυτά που με τη χρήση τους μπορούμε να πετύχουμε το ελάχιστο δυνατό όριο. Βελτίωση επίσης της αποδοτικότητας και μείωσης της συχνότητας εμφάνισης λάθους μπορεί να γίνει με τη χρήση καθαρών υλικών όπως τα νανοϋλικά. Δεύτερον, τα νανοκρυσταλλικά υλικά μπορούν να παρασκευαστούν με τέτοιο τρόπο ώστε να καταστούν αρκετά πορώδη για να λειτουργήσουν ως πολύ καλοί μονωτές με τον αέρα να εγκλωβίζεται στα διάκενα του. Τέτοια υλικά δίνει η sol - gel τεχνική. Επιπλέον, νανοκρυσταλλικά υλικά μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε οπτικές συσκευές που απαιτείται μεγάλη ευκρίνεια. H υψηλής ευκρίνειας τηλεοράσεις με χρήση νανοϋλικών αντί για των συμβατικών υλικών που χρησιμοποιούνται σήμερα είναι ένα παράδειγμα αυτού. Δεύτερο παράδειγμα είναι οι ηλεκτροχρωμικές οπτικές συσκευές των οποίων η φωτεινότητα και χρωματική αντίθεση τους εξαρτάται αποκλειστικά από το μέγεθος του κόκκου του υλικού που χρησιμοποιούν. Με τη χρήση νανοϋλικών μπορούν να παρασκευαστούν, επίσης, ανθεκτικότερα και σκληρότερα κοπτικά εργαλεία. Σημαντική χρήση

39 τέτοιων εργαλείων αρκετά μικρών διαστάσεων και στην κατασκευή μικροηλεκτρικών κυκλωμάτων. Ακόμα, νανοϋλικά, προϊόντα της sol - gel τεχνικής αποτελούν άριστα υλικά για την κατασκευή μπαταριών, μεγαλύτερης χωρητικότητας και στην περίπτωση των επαναφορτιζόμενων, μικρότερης συχνότητας επαναφόρτισης. Οι βελτιωμένες μαγνητικές ιδιότητες αυτών των υλικών μπορούν να δώσουν αρκετά υψηλής ενέργειας μαγνήτες ώστε να βρουν χρήση σε γεννήτριες ρεύματος, κινητήρες πλοίων καθώς επίσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την κατασκευή εξαιρετικά ευαίσθητων αναλυτικών οργάνων. Τα νανοϋλικά είναι εξαιρετικά ευαίσθητα στις αλλαγές του περιβάλλοντος τους, λόγω του μικρού μεγέθους του κόκκου τους. Χρήση τους μπορεί να γίνει και στη βελτίωση των υπαρχόντων αισθητήριων οργάνων, δεδομένου του ότι η αρχή λειτουργίας τους στηρίζεται στο ότι κατά την ανίχνευση ο ανιχνευτής αλληλεπιδρά με κάποιο τρόπο με τον περιβάλλον ώστε μια συνεχώς μετρούμενη ιδιότητα του να αλλάξει (για παράδειγμα η ηλεκτρονική αγωγιμότητα του ή η χημική του σύνθεση ή η χωρητικότητα του κτλ.). Στο ίδιο πλαίσιο, νανοαισθητήρες της παραπάνω μορφής μπορούν να αποτελέσουν μέρος ολοκληρωμένων συστημάτων ικανά να συλλέξουν, να επεξεργαστούν και να μεταδώσουν ογκώδη ποσά δεδομένων με ελάχιστο μέγεθος, βάρος και κατανάλωση ενέργειας. Συνεχίζοντας, εκμεταλλευόμενοι τη σκληρότητα των νανοϋλικών μπορούμε να έχουμε ουσιαστική χρήση τους σε αεροδιαστημικές εφαρμογές αφού τα υλικά που χρησιμοποιούνται σήμερα για αυτές τις χρήσεις μπορούν να αντικατασταθούν από άλλα ανθεκτικότερα και ελαφρύτερα. Χρήση τα νανοϋλικά μπορούν να βρουν και στην κατασκευή κεραμικών τα οποία χαρακτηρίζονται από ιδιαίτερη ευθραυστότητα αν και σκληρά δίνοντας κεραμικά εξίσου σκληρά αλλά με πλαστικές ικανότητες. Ακόμα μπορούν να επιτευχθούν υψηλότερες συχνότητες μετάδοσης πληροφορίας με πολλαπλάσια εύρος ζώνης καθώς και πιο αποτελεσματική χρήση του οπτικού φάσματος για αυτό το σκοπό, χάρη στις οπτικές ιδιότητες τους(11-14,15,16)

40 Νανοσωματίδια Τα νανοσωματίδια είναι σωματίδια διαμέτρου μερικών νανομέτρων. Υβριδικά νανοσωματίδια με πυρήνα ανόργανης φάσης τροποποιημένης επιφάνειας με οργανικά μόρια είναι ένα παράδειγμα. Αμφίφυλα μπλοκ συμπολυμερή σε κατάλληλες συνθήκες ph σχηματίζουν μικύλλια και επομένως μπορούν επίσης να χαρακτηριστούν ως νανοσωματίδια. Μεταλλικά ή ημιαγώγιμα κρυσταλλικά νανοσωματίδια μπορούν να βρεθούν στη θέση υψηλά διεσπαρμένης ενεργού φάσης ενός στηριζόμενου καταλύτη. Σε τέτοιους καταλύτες όπως θα δούμε και παρακάτω το μέσο μέγεθος ενός μεταλλικού καταλυτικού σωματιδίου μπορεί να ανήκει στη τάξη του νανομέτρου. Τα νανοσωματίδια αυτά συνήθως είναι μεμονωμένοι κρύσταλλοι παρόμοιοι με αυτούς που ανήκουν στο εσωτερικό ενός πολυκρυσταλλικού υλικού. Το μέγεθος αυτών των κρυστάλλων καθορίζεται κυρίως από την συνεισφορά της επιφανειακής ενέργειας στην ολική. Καθώς η πιο σταθερή δομή είναι αυτή με τη μικρότερη ενέργεια ο κρύσταλλος τείνει να αποκτήσει μορφή που περιγράφεται από: Όσο το δυνατό μικρότερη επιφάνεια Πλευρές χαμηλής επιφανειακής ενέργειας Μελετώντας ένα υλικό μακροσκοπικά και συνεπώς σαν συνεχές μέσο θα λέγαμε ότι τις προϋποθέσεις αυτές πληρεί η σφαιρική μορφή. Ωστόσο, σε νανομετρικές διαστάσεις δε μπορούμε να αγνοήσουμε τη διακριτή τοποθέτηση των ατόμων στο χώρο. Εικόνα 1.8. Κυβο-οκταεδρική μορφή (αριστερά) και μορφή οκταέδρου (δεξιά) (1-4)

41 Η ενέργεια των επιφανειακών επιπέδων είναι υψηλότερη από αυτή του εσωτερικού καθώς χαρακτηρίζονται από θετική ελεύθερη ενέργεια σχηματισμού. Αυτό το καταλαβαίνουμε εύκολα φανταζόμενοι ένα μακροσκοπικό υλικό το οποίο τεμαχίζεται προκειμένου να δημιουργηθεί μία νέα ελεύθερη επιφάνεια. Θα πρέπει τότε να δοθεί ενέργεια στο σύστημα προκειμένου να σπάσουν οι δεσμοί που συγκρατούσαν το στερεό κατά το επίπεδο όπου εμείς το τεμαχίζουμε. Νανοσωματίδια μπορούν να παρασκευαστούν με πολλές τεχνικές όπως η sol - gel, η ball milling ή άλλες χημικές μεθόδους. Καθώς οι παράμετροι κάθε τεχνικής καθορίζουν τη τελική μορφή του νανοσωματιδίου μπορούμε να παρασκευάσουμε νανοσωματίδια βελτιστοποιημένα για κάποια συγκεκριμένη χρήση. Όσων αφορά την ενέργεια υδρογόνου, το ενδιαφέρον για τα νανοσωματίδια έγγυται κυρίως στις καταλυτικές τους ιδιότητες για τη χρήση τους σε κυψέλες καυσίμου αλλά και γενικότερα (11-14,15,16) Παρουσίαση μορφών άνθρακα Το διαμάντι και ο γραφίτης είναι δύο πολύ γνωστές μορφές άνθρακα. Το διαμάντι σχηματίζεται από άτομα άνθρακα κάθε ένα από τα οποία χαρακτηρίζεται από 4 υβριδικά τροχιακά sp 3 και έτσι σχηματίζεται ένα τρισδιάστατο δίκτυο ατόμων. Στο γραφίτη τα άτομα άνθρακα ενώνονται μεταξύ τους μέσω τριών sp 2 υβριδικών τροχιακών σχηματίζοντας έτσι επίπεδα φύλλα από εξαμελείς δακτυλίους. Τα φύλλα αυτά είναι συγκρατημένα μεταξύ τους μέσω δυνάμεων Van der Waals. Εικόνα 1.9. Οι μορφές του άνθρακα

42 Εκτός όμως από τις δύο αυτές μορφές άνθρακα υπάρχουν και άλλες, όπως οι νανοΐνες άνθρακα, τα φουλερένια και οι νανοσωλήνες άνθρακα, τις οποίες θα εξετάσουμε παρακάτω. Όλες αυτές οι ενώσεις χαρακτηρίζονται από νανοκρυσταλλική δομή. Το ενδιαφέρον για αυτές όσων αφορά την οικονομία υδρογόνου έγγυται στο ότι είναι ελαφρά και μπορούν να χρησιμοποιηθούν (όπως και τα υδρίδια μετάλλων) ως μέσα αποθήκευσης υδρογόνου, με περισσότερη ασφάλεια από αυτή των μεθόδων αέριας ή υγρής αποθήκευσης του. (11-14,15,16) Νανοΐνες άνθρακα Οι νανοΐνες άνθρακα (GNFs) αποτελούνται από στρώματα γραφίτη τοποθετημένα με συγκεκριμένο προσανατολισμό ως προς τον άξονα της ίνας. Χαρακτηρίζονται από μεγάλης έκτασης επιφάνεια οι οποίες με τη σειρά τους αποτελούν θέσεις για χημική ή φυσική προσρόφηση αερίου. Η ελεύθερη επιφάνεια κυμαίνεται μεταξύ 300 έως και 700 m 2 ανά γραμμάριο υλικού. Οι νανοΐνες άνθρακα περιγράφονται γενικά από μήκη μερικών μm έως και μερικών mm και διαμέτρους από 0,4 έως 500 nm. Η απόσταση μεταξύ των φύλλων είναι περίπου 3,4 Å. Συνοπτικά, ο μηχανισμός δημιουργίας μιας νανοΐνας άνθρακα περιλαμβάνει τα εξής: Αέριος υδρογονάνθρακας ή κατάλληλο μείγμα ανθρακικών ενώσεων προσροφάται σε μεταλλική καταλυτική επιφάνεια. Οι συνθήκες όπου επικρατούν εκεί ευνοούν τη διάσπαση των δεσμών μεταξύ των ανθράκων στα μόρια. Ο ατομικός άνθρακας διαχέεται στη συνέχεια διαμέσου του μετάλλου. Τέλος, η νανοδομή του άνθρακα σχηματίζεται στην αντίθετη όψη του μετάλλου από αυτή όπου αρχικά εισήλθε ο άνθρακας. Η γεωμετρία του καταλύτη καθορίζει και τον προσανατολισμό των επιπέδων. Το μοντέλο αυτό για τη δημιουργία των νανοϊνών χρησιμοποιείται και για την περιγραφή ενός από τους μηχανισμούς σύνθεσης των νανοσωλήνων, όπως θα δούμε παρακάτω με περισσότερη λεπτομέρεια. Η κρυσταλλική τελειότητα της εναποτιθέμενης ίνας καθορίζεται από τη φύση του καταλύτη, τη φύση του αντιδρώντος αερίου (ή με άλλα λόγια την αναλογία

43 άνθρακα - υδρογόνου του αερίου) και τη θερμοκρασία. Στο τέλος της διαδικασίας τα σωματίδια του μεταλλικού καταλύτη απομακρύνονται με τη χρήση κατάλληλου όξινου διαλύματος(11-14,15,16) Φουλερένια Μια ακόμη αλλοτροπική μορφή άνθρακα είναι τα φουλερένια (fullerenes). Τα φουλερένια είναι ανθρακικές δομές με σφαιρικό σχήμα και ανακαλυφθήκαν το 1985 από τους Harold Kroto et al. (βραβείο Νόμπελ Χημείας 1996). Το πιο γνωστό φουλερένιο είναι αυτό το οποίο αποτελείται από 60 άτομα άνθρακα (C60 ή buckyball) αλλά επίσης κοινά είναι αυτά με 70, 76 και 84 άτομα άνθρακα (C70, C76, C84 fullerenes). Eικόνα Φουλερένιο C60 (1-4,20). Τα φουλερένια είναι γενικά σταθερά μόρια και απαιτούν θερμοκρασίες της τάξεως των 1000 o C και άνω για να διασπαστούν οι δεσμοί μεταξύ των ατόμων άνθράκα που τα αποτελούν. Ανάλυση με ακτίνες Χ ή σκέδαση νετρονίων ενός μοριακού κρυστάλλου μπορεί να φανερώσει τη σφαιρική δομή του μορίου C60 καθώς και τη διάμετρο του. Επιπλέον η φασματοσκοπία NMR δίνει ένα φάσμα μίας μόνο κορυφής, υποδεικνύοντας πως όλα τα άτομα άνθρακα του μορίου είναι ισοδύναμα γεγονός το οποίο επίσης παραπέμπει σε σφαιρική δομή. Τρία ηλεκτρόνια από κάθε άνθρακα συμμετέχοντας σε sp 2 υβριδικά τροχιακά ενώνουν τους άνθρακες μεταξύ τους με σ δεσμούς. Υπάρχουν δύο είδη δεσμών στο μόριο, ένας μεταξύ ανθράκων στην κοινή ακμή μιας πενταγωνικής και μιας

44 εξαγωνικής έδρας καθώς και ένας στην κοινή ακμή δύο εξαγωνικών εδρών. Η σκέδαση με νετρόνια μας δίνει μήκη δεσμών 0,1455 nm και 0,1391 nm αντίστοιχα. Τα άτομα άνθρακα σε ένα φύλλο γραφίτη χαρακτηρίζονται επίσης από ίδιου τύπου υβριδικά τροχιακά sp 2 όπως το φουλερένιο. Αυτά τα υβριδικά τροχιακά δίνουν τρεις ισχυρούς σ δεσμούς πάνω στο ίδιο επίπεδο και έναν ασθενή π σε κάθετη διεύθυνση. Καθώς οι σ δεσμοί είναι κορεσμένοι ο γραφίτης θεωρείται χημικά αδρανής. Στην περίπτωση του φουλερενίου ωστόσο, λόγω της κυρτότητας του μορίου, οι δεσμοί παύουν να βρίσκονται στο ίδιο επίπεδο ενώ επίσης το νέφος των π ηλεκτρονίων παραμορφώνεται κάνοντας το φουλερένιο περισσότερο ενεργό χημικά. Η διάμετρος του βρίσκεται από διάφορες φασματοσκοπικές μεθόδους ίση με 0,710 nm. Προκειμένου να βρούμε την ενεργό διάμετρο του μορίου θα πρέπει να συνυπολογίσουμε το εύρος του ηλεκτρονικού νέφους των π-ηλεκτρονίων το οποίο είναι ίσο με 0,335 nm υπολογίζοντας τελικά τη διάμετρο του μορίου 1,380 nm. Αν και μεγάλα μόρια όσον αφόρα τις διαστάσεις, τα φουλερένια παραμένουν συγκριτικά με τα οργανικά μόρια αρκετά μικρά. Η σφαιρικότητα του φουλερενίου επιτυγχάνεται με την ύπαρξη πενταγωνικών εδρών καθώς είναι αυτά τα οποία εισάγουν κυρτότητα στο μόριο. Η ύπαρξη δύο γειτονικών πενταγώνων σε ένα φουλερένιο, επιβαρύνει τη σταθερότητα του μορίου καθώς έχει σαν αποτέλεσμα αυξημένη κυρτότητα και κατ' επέκταση μεγαλύτερη παραμόρφωση. Είναι επομένως ενεργειακά συμφέρον κάθε πεντάγωνο να βρίσκεται απομονωμένο και αυτό υποδεικνύει ο κανόνας του απομονωμένου πενταγώνου. Σταθεροποίηση μη σταθερών φουλερενίων μπορούμε να επιτύχουμε με άτομα της ΙΑ ομάδας του περιοδικού πίνακα αφού σχηματίζουν δεσμούς με τους άνθρακες του μορίου. Για μεγάλο αριθμό ανθράκων το φουλερένιο τείνει να αποκτήσει μηδενική καμπυλότητα κατά τη διαδρομή που ενώνει 2 οποιουσδήποτε πενταμελείς δακτυλίους. Η ηλεκτρονική μορφή ενός μορίου φουλερενίου χαρακτηρίζεται από HOMO με πέντε εκφυλισμένα ενεργειακά επίπεδα και LUMO με τρία εκφυλισμένα ενεργειακά επίπεδα. Καθώς τα πέντε ενεργειακά επίπεδα της HOMO είναι κατειλημμένα από δέκα ηλεκτρόνια (και πιο συγκεκριμένα π ηλεκτρόνια) το ατομικό φουλερένιο θεωρείται μονωτής. Τα φουλερένια αποτελούν δομές με ιδιαίτερα μορφολογικά χαρακτηριστικά. Το φουλερένιο C60 εμφανίζει 3 είδη αξόνων συμμετρίας, 2ης, 3ης και 5ης τάξεως,

45 συνολικά σε αριθμό 21. Εμφανίζει επίσης 15 διαφορετικά επίπεδα συμμετρίας. Τέλος παραμένει αναλλοίωτο σε αντιστροφή των αξόνων του συστήματος αναφοράς. Συνδυάζοντας όλα τα παραπάνω βρίσκουμε πως είναι πιθανές 120 διαφορετικές διαδικασίες συμμετρίας σημείου. Αυτό καθιστά το μόριο του C60 το περισσότερο συμμετρικό(11-14,15,16,20) Τύποι νανοσωλήνων άνθρακα Είναι εξαγωνικά δίκτυα ατόμων άνθρακα διαμέτρου ~1nm και μήκους ~1-100μm και μπορεί ουσιαστικά να θεωρηθεί ως ένα φύλλο γραφίτη τυλιγμένο σε κύλινδρο. Υπάρχουν δύο τύποι νανοσωλήνων: μονού τοιχώματος (SWCNTs), και πολλαπλών στρωμάτων (MWCNTs), που διαφέρουν ως προς τη διευθέτηση των κυλίνδρων γραφίτη. Οι μονού τοιχώματος έχουν μόνο ένα στρώμα γραφητικού κυλίνδρου, ενώ οι πολλαπλού τοιχώματος έχουν πολλά στρώματα (περίπου 50). Επίσης κατά τη σύνθεση τους, τα στρώματα των νανοσωλήνων μπορούν δημιουργηθούν κατά τυχαίο τρόπο ή να ευθυγραμμιστούν. Εικόνα Δομή SWCNT (αριστερά), Δομή MWCNTs (δεξιά)

46 Τεχνικές σύνθεσης νανοσωλήνων άνθρακα Οι νανοσωλήνες άνθρακα μπορούν να παρασκευαστούν με τις παρακάτω τεχνικές: 1. Εξάχνωση ηλεκτροδίων άνθρακα με τη χρήση ηλεκτρικού τόξου εκκένωσης. 2. Φωτοδιάσπαση γραφίτη με τη χρήση laser. Ένα κομμάτι άνθρακα εξατμίζεται με ακτινοβολία από laser σε υψηλή θερμοκρασία και αδρανή ατμόσφαιρα. Οι παραγόμενοι σωλήνες έχουν μικρή διασπορά ως προς τη διάμετρο. 3. Καταλυτική χημική απόθεση από ατμό (CCVD). Αέριες ενώσεις του άνθρακα (συνήθως υδρογονανθράκων ή μονοξειδίου του άνθρακα) διασπώνται καταλυτικά με τη χρήση μεταλλικών καταλυτών (Fe, Co, Ni) υποστηριγμένων σε υποστρώματα οξειδίων μετάλλων ή αιωρούμενων στην αέρια φάση. Τα προϊόντα μπορεί να είναι πολυφλοιϊκοί νανοσωλήνες ή μονοφλοιϊκοί ανάλογα με τις παραμέτρους της μεθόδου. Γενικά, ενώ οι πολυφλοιϊκοί νανοσωλήνες μπορούν να συντεθούν και χωρίς τη χρήση καταλύτη, οι μονοφλοιϊκοί απαιτούν την παρουσία του. Το μέγεθος μάλιστα των καταλυτικών σωματιδίων καθορίζει και τη διάμετρο του νανοσωλήνα. Θα πρέπει να αναφερθεί ότι υπάρχουν και άλλες μέθοδοι παρασκευής, ωστόσο εδώ αναφέρθηκαν οι πιο σημαντικές (11-14,16) Καταλυτική χημική απόθεση από ατμό (CVD) Στη συνέχεια, από τις μεθόδους σύνθεσης οι οποίες αναφέρθηκαν παραπάνω θα εξεταστεί αναλυτικότερα η καταλυτική χημική απόθεση από ατμό. Η σημαντικότητα της έγγυται στα πλεονεκτήματα χρήσης της έναντι των άλλων, δηλαδή της εξάχνωσης ηλεκτροδίων άνθρακα μέσω εκκένωσης ηλεκτρικού τόξου και της φωτοδιάσπασης με χρήση laser. Τα πλεονεκτήματα αυτά είναι: Οι θερμοκρασίες που τη χαρακτηρίζουν είναι αρκετά χαμηλότερες (τάξεως ο Κ) από αυτές των άλλων (>3000 ο Κ). Χαρακτηρίζεται από καλύτερη ικανότητα ελέγχου της δομής του τελικού προϊόντος. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί επομένως για να δώσει δομές νανοσωλήνων άνθρακα κατάλληλες για διάφορες χρήσεις σε αντίθεση με

47 τις άλλες που δίνουν υψηλά εναγκαλισμένες δομές με αρκετές προσμίξεις. Ωστόσο θα πρέπει να σημειωθεί ότι σημαντική έρευνα γίνεται πάνω στην επίτευξη μεγαλύτερου ελέγχου. Η ουσία που αντιδρά μετατρέπεται σε αέρια μορφή με πυρόλυση και είναι συνήθως το ακετυλένιο, το αιθυλένιο, το μεθάνιο ή το μονοξείδιο του άνθρακα. Οι χαρακτηριστικοί χρόνοι της CVD μπορεί να είναι από λεπτά έως ώρες εν αντιθέσει με τις άλλες μεθόδους που είναι μικροί (μs ms). Κάτω από τις κατάλληλες συνθήκες (για παράδειγμα με χρήση μεταλλικών καταλυτών ενσωματωμένων στους μεσοπόρους διοξειδίου του πυριτίου) δίνει δέσμες νανοσωλήνων άνθρακα, προσανατολισμένους μεταξύ τους. Νανοσωλήνες τέτοιας δομής χρησιμοποιούνται σαν διατάξεις εκπομπής πεδίου σε ηλεκτρονικά κυκλώματα. Μέθοδοι για παραγωγή μεγάλων ωστόσο ποσοτήτων τέτοιας μορφής δεν έχουν επιτευχθεί ακόμα. Στην Εικόνα 1.12 βλέπουμε μια CVD συσκευή. Εικόνα Οριζόντιος φούρνος CVD. Έχουμε δύο μηχανισμούς ανάπτυξης νανοσωλήνων στην περίπτωση που ο καταλύτης είναι στηριζόμενος. Κατά τον πρώτο, το καταλυτικό σωματίδιο απομακρύνεται από το υπόστρωμα καθώς ο νανοσωλήνας σχηματίζεται σταδιακά μεταξύ αυτού και του υποστρώματος Εικόνα 1.13.(a). Κατά το δεύτερο, το καταλυτικό σωματίδιο παραμένει επί του υποστρώματος και ο νανοσωλήνας αναπτύσσεται με άνθρακες να προστίθενται συνεχώς στη βάση του Εικόνα 1.13.(b). Ο πρώτος μηχανισμός λέγεται ανάπτυξη κορυφής και ο δεύτερος ανάπτυξη βάσης

48 Εικόνα (a) ανάπτυξη κορυφής και (b) ανάπτυξη βάσης (11). Ένας από τους πιο αποδεκτούς μηχανισμούς έχει προταθεί από τον Baker et al. Σύμφωνα με τον μηχανισμό αυτό, αέριο υδρογονάνθρακα διασπάται στην επιφάνεια του μεταλλικού καταλύτη. Παράγεται υδρογόνο και άνθρακας, και ο άνθρακας διαχέεται μέσα στο καταλυτικό σωματίδιο μέχρι την πίσω όψη του. Καθώς η διάσπαση είναι εξώθερμη δημιουργείται μια βαθμίδα θερμοκρασίας κατά μήκος του σωματιδίου. Καθώς ο συντελεστής διάχυσης του άνθρακα στο μέταλλο είναι ανάλογος της θερμοκρασίας, θα παρατηρηθεί συσσώρευση του στην πιο ψυχρή πλευρά, στην πίσω δηλαδή όψη του σωματιδίου. Ο άνθρακας θα συνεχίζει να εναποτίθεται στην πίσω μεριά του σωματιδίου και να χτίζει τη δομή όσο η μπροστινή πλευρά του καταλυτικού σωματιδίου είναι ενεργή. Στη περίπτωση που ο άνθρακας καλύψει ολοκληρωτικά αυτή τη πλευρά, ο καταλύτης δηλητηριάζεται και η ανάπτυξη της δομής του άνθρακα σταματά. Η παραπάνω διαδικασία δικαιολογεί το πώς το μέγεθος του καταλυτικού σωματιδίου καθορίζει και τη διάμετρο του νανοσωλήνα ή της ίνας. Για σωματίδια μέσης διαμέτρου μεταξύ 1 και 5 nm ευνοείται η δημιουργία μονοφλοιϊκών νανοσωλήνων ενώ για διαμέτρους σωματιδίων μεταξύ 5 και 25 nm ευνοούνται οι πολυφλοιϊκοί. Ο ανάπτυξη κορυφής μπορεί να εξηγηθεί από αυτό το μοντέλο. Το μοντέλο αυτό δεν είναι τέλειο. Καταρχάς, δεν είναι όλες οι αντιδράσεις διάσπασης εξώθερμες (όπως συμβαίνει με τη διάσπαση του μεθανίου), ωστόσο παρατηρείται δημιουργία καρβονικών δομών. Επιπλέον, η θερμοβαθμίδα την οποία δέχεται το μοντέλο δεν μπορεί να δικαιολογηθεί καθώς τα μέταλλα παρουσιάζουν μεγάλη θερμική αγωγιμότητα και μία μικρή βάθμωση της θερμοκρασίας θα είχε ως αποτέλεσμα πολύ μεγάλη ροή θερμότητας μέσω του σωματιδίου, πράγμα το οποίο δεν ισχύει. Ένα επίσης κοινό μοντέλο, το οποίο προτάθηκε από τον Oberlin συνιστά ότι ο άνθρακας δε διαχέεται διαμέσου του μεταλλικού σωματιδίου αλλά στην επιφάνεια του. Τότε μία κυλινδρική δομή αρχίζει και σχηματίζεται ξεκινώντας από την

49 περιφέρεια του καταλυτικού σωματιδίου. Αυτός ο μηχανισμός μπορεί να εφαρμοστεί εξίσου στην ανάπτυξη κορυφής όσο και στην ανάπτυξη βάσης. Οι δύο παραπάνω μηχανισμοί εφαρμόζονται και σε καταλυτική φάση με κολλοειδή μορφή. Ο άνθρακας καταρχάς καλύπτει το ένα ημισφαίριο του καταλύτη και ο νανοσωλήνας άνθρακα αναπτύσσεται καθώς άτομα άνθρακα αρχίζουν να προστίθενται στην περιφέρεια του καταλυτικού σωματιδίου. Καθώς γίνεται αυτό το σωματίδιο απομακρύνεται όλο και περισσότερο από την αρχικά σχηματισμένη ημισφαιρική επιφάνεια άνθρακα ενώ η ανάπτυξη του νανοσωλήνα τερματίζεται όταν το σωματίδιο καλυφθεί τελικά εντελώς από άνθρακες. Μοντέλα που ο νανοσωλήνας σχηματίζεται γύρω από φουλερένια τα οποία φέρουν δεσμούς με καταλυτικά άτομα (Ni ή Co) έχουν επίσης προταθεί καθώς υπάρχουν φουλερένια σε εικόνες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας εγκλωβισμένα σε νανοσωλήνες(11-14,15,16) Καθαρισμός από προσμίξεις Τα προϊόντα όσο καθαρά και αν είναι, πάντα απαιτούν επιπλέον επεξεργασία προκειμένου να απομακρυνθούν οι προσμίξεις στο μεγαλύτερο βαθμό που γίνεται. Οι μηχανισμοί ανάπτυξης που είδαμε παραπάνω είναι δυνατόν να τερματιστούν με τέτοιο τρόπο ώστε το καταλυτικό σωματίδιο να μείνει εγκλωβισμένο μέσα στο νανοσωλήνα. Άλλες προσμίξεις εκτός από τα καταλυτικά μεταλλικά σωματίδια μπορεί να είναι φουλερένια, γραφίτης ή άμορφος άνθρακας. Τα μεταλλικά σωματίδια και τα φουλερένια απομακρύνονται σχετικά εύκολα ενώ ο γραφίτης και ο άμορφος άνθρακας απομακρύνονται δύσκολα. Ο καθαρισμός γίνεται με χημικές ή μηχανικές μεθόδους. Οι χημικές μέθοδοι έχουν το πλεονέκτημα του χαμηλού κόστους και της ευκολίας χρήσης. Οι μηχανικές προσφέρονται πιο πολύ για μεγάλης κλίμακας σύνθεσης νανοσωλήνων αλλά είναι απαιτητικές σε χρόνο. Καθαρισμός μπορεί να γίνει και με τον συνδυασμό τους. Για παράδειγμα, με φυγοκέντρηση απομακρύνονται τα μεγαλύτερα σωματίδια γραφίτη ενώ με κατάλληλα διαλύματα, μέσω διάλυσης απομακρύνονται τα φουλερένια και τα μεταλλικά σωματίδια. Τα μεταλλικά σωματίδια συνήθως απομακρύνονται απλά με τη χρήση υψηλών θερμοκρασιών

50 Ωστόσο, δεν υπάρχει κάποια γενική αποτελεσματική και απλή μέθοδος για τον καθαρισμό των προϊόντων αλλά ανάλογα με τις απαιτήσεις επιλέγεται η κατάλληλη(11-14,15,16) Δομή νανοσωλήνων άνθρακα Στους πολυφλοιϊκούς νανοσωλήνες οι εσωτερικοί σωλήνες έχουν διάμετρο της τάξης μερικών nm ενώ οι εξωτερικοί μπορεί να έχουν διαμέτρους πολλές φορές πολλαπλάσιους. Στα άκρα των κυλίνδρων γραφίτη δεν υπάρχουν ελεύθεροι δεσμοί αλλά αυτά καλύπτονται από κατάλληλες ημισφαιρικές δομές παρόμοιες με αυτές των φουλερενίων. Θεωρούμε ένα στρώμα γραφίτη όπως στην Εικόνα το οποίο έχει τυλιχτεί κατά τέτοιο τρόπο ώστε να δημιουργήσει κυλινδρικές δομές. Εικόνα Κατεύθυνση δομής armchair, zigzag και chiral νανοσωλήνων Εδώ επίσης θα πρέπει να αναφερθεί ότι τα στρώματα του γραφίτη στους πολυφλοιϊκούς νανοσωλήνες δεν εμφανίζουν την τέλεια διάταξη ΑΒΑΒ που παρουσιάζει ο κρυσταλλικός γραφίτης μεταξύ των στρωμάτων του. Όπως είδαμε οι νανοσωλήνες χαρακτηρίζονται τόσο από πενταμελείς όσο και εξαμελείς δακτυλίους άνθρακα. Ωστόσο, απόκλιση από τον εξαμελή αποτελούν και οι επταμελείς δακτύλιοι οι οποίοι σε αντίθεση με τους πενταμελείς δίνουν αρνητική καμπυλότητα στο νανοσωλήνα. Αν πενταμελείς δακτύλιοι βρίσκονται απέναντι από επταμελείς τότε ο νανοσωλήνας αποκτά κυρτότητα. Επίσης σωστός συνδυασμός πενταμελών και επταμελών δακτυλίων μπορούν να κάνουν εφικτή την ένωση ενός νανοσωλήνα με κάποιον άλλον, διαφορετικής δομής. Κατά αυτό τον

51 τρόπο μπορούν να δημιουργηθούν ετεροεπαφές όπως μετάλλου - ημιαγωγού ή p - n εξ' ολοκλήρου από νανοσωλήνες. Για ημιαγώγιμους νανοσωλήνες τύπου p ή n θα μιλήσουμε παρακάτω. Τα άκρα στους πολυφλοιϊκούς σωλήνες μπορούν να απομακρυνθούν με οξείδωση από διοξείδιο του άνθρακα ή οξυγόνο σε υψηλές θερμοκρασίες καθώς και με διάλυμα HNO3 υψηλής συγκέντρωσης. Έτσι γίνεται εφικτό το γέμισμα του νανοσωλήνα με άλλο υλικό. Αν για παράδειγμα μαζί με το διάλυμα HNO3 είναι παρόν κάποιο μεταλλικό άλας όπως το Ni(NO3)2 τότε το δεύτερο μετατρέπεται κατά τη διαδικασία σε οξείδιο. Αναγωγή με υδρογόνο τελικά σε θερμοκρασία 400 ο C δίνει μέταλλο μέσα στο σωλήνα. Ομοίως σε μονοφλοιϊκούς χρησιμοποιούνται για τον ίδιο σκοπό ήπια όξινα διαλύματα(11-14,15,16) Ηλεκτρονικές ιδιότητες νανοσωλήνων άνθρακα Οι ηλεκτρονικές ιδιότητες των νανοσωλήνων παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω των πολλών τεχνολογικών εφαρμογών που έχουν. Όπως και στα φουλερένια, η καμπυλότητα των φύλλων γραφίτη επηρεάζει σημαντικά τις ηλεκτρονικές ιδιότητες των νανοσωλήνων. Ο κυριότερος παράγοντας ο οποίος καθορίζει τις ηλεκτρονικές ιδιότητες ενός νανοσωλήνα είναι ότι τα ηλεκτρόνια του είναι χωρικά περιορισμένα. Μπορούν να κινηθούν μόνο στο χώρο του γραφίτη και όχι κατά την κάθετη στον άξονα διεύθυνση στο φύλλο του γραφίτη. Επιπλέον, καθώς το μήκος του είναι πολύ μεγαλύτερο από τη διάμετρο του οι επιτρεπόμενες ηλεκτρονικές καταστάσεις κατά την αξονική διεύθυνση θα είναι πολύ περισσότερες από αυτές κατά την περιφερειακή. Μπορούμε επομένως να θεωρήσουμε πως τα ηλεκτρόνια του νανοσωλήνα χαρακτηρίζονται από κυματανύσματα αξονικής διεύθυνσης. Η πεπερασμένη περιφέρεια και μήκος του νανοσωλήνα εισάγουν οριακές συνθήκες οι οποίες έχουν ως αποτέλεσμα διακριτές ενεργειακές στάθμες και οι νανοσωλήνες παρουσιάζουν τόσο μεταλλική όσο και ημιαγώγιμη συμπεριφορά. Για νανοσωλήνες μικρής διαμέτρου, η σχέση μεταξύ των n και m τα οποία περιγράφουν τη δομή του νανοσωλήνα, είναι ένα μέτρο για το αν ο νανοσωλήνας θα παρουσιάζει μεταλλική ή ημιαγώγιμη συμπεριφορά. Για έναν (n, m) νανοσωλήνα, αν ισχύει n m = 3q, όπου q ακέραιος, τότε ο νανοσωλήνας ανήκει στα μέταλλα. Αν όχι, ο

52 νανοσωλήνας ανήκει στους ημιαγωγούς. Σύμφωνα επομένως με την παραπάνω σχέση, όλοι οι armchair νανοσωλήνες και το ένα τρίτο των zigzag είναι μέταλλα. Το ενεργειακό χάσμα σε έναν ημιαγώγιμο νανοσωλήνα είναι αντιστρόφως ανάλογο της διαμέτρου του. Επίσης, έχει δειχθεί ότι στους πολυφλοιϊκούς νανοσωλήνες το ρεύμα άγεται μόνο από το εξωτερικό στρώμα και όχι από όλο τον όγκο του νανοσωλήνα. Τέλος, είναι δυνατόν να εισάγουμε προσμίξεις στους νανοσωλήνες αντικαθιστώντας άτομα άνθρακα από άλλα άτομα, όπως το βόριο ή το άζωτο προκειμένου να δοθούν στο νανοσωλήνα ημιαγώγιμες ιδιότητες τύπου p ή n αντίστοιχα. Συνδυασμοί των δύο παραπάνω είναι επίσης εφικτοί ( B - C - N ) (11-14,15,16) Μηχανικές και άλλες ιδιότητες νανοσωλήνων άνθρακα Οι νανοσωλήνες είναι εξαιρετικά ανθεκτικοί κατά μήκος του άξονα τους. Η ιδιότητα τους αυτή βρίσκει χρήση στην ενίσχυση άλλων υλικών. Αυτός είναι ένας επιπλέον λόγος που επιζητούμε σύνθεση δεσμών νανοσωλήνων σε μεγάλες ποσότητες. Πιέσεις μέχρι και 30 GPa δε καταστρέφουν τη βασική δομή του σωλήνα. Η πυκνότητα τους εξαρτάται από την ακριβή δομή τους. Ενδεικτικά, η πυκνότητα ενός zigzag (17,0) νανοσωλήνα υπολογίζεται 1,34 gr/cm 3. Όσον αφόρα την ειδική θερμοχωρητικότητα η οποία τους χαρακτηρίζει, για τους μεν πολυφλοιϊκούς βρίσκεται παρόμοια με αυτή του γραφίτη ενώ για τους μονοφλοιϊκούς μεγαλύτερη. Αυτό είναι αναμενόμενο καθώς τα φωτόνια του κρυστάλλου χαρακτηρίζονται από μεγαλύτερη μέση ελεύθερη διαδρομή (περίπου 100 nm) αφού δεν υπάρχουν επιπλέον στρώματα γραφίτη για να επηρεάσουν την κίνηση τους μέσω της μεταξύ τους αλληλεπίδρασης. Η μετακίνηση των νανοσωλήνων στο χώρο πάνω σε κάποιο υπόστρωμα μπορεί να γίνει με τη χρήση της ακίδας ενός AFM μικροσκοπίου. Αυτή η τεχνική έχει χρησιμοποιηθεί και για άλλους σκοπούς, όπως η μέτρηση της φύσης της αλληλεπίδρασης μεταξύ ενός νανοσωλήνα και του υλικού του υποστρώματος. Τέλος, οι ίδιοι οι νανοσωλήνες έχουν πολύ καλή εφαρμογή σαν ακίδες AFM μικροσκοπίων λόγω των αναλογιών μήκους - διαμέτρου εισχωρώντας στις βαθιές

53 ανωμαλίες των επιφανειών. Δεν σπάνε και όντας εξαιρετικά ελαστικοί αποφεύγονται φαινόμενα προσκόλλησης της ακίδας στο δείγμα. Ένα STM μικροσκόπιο μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για το χειρισμό νανοσωλήνων. Στέλνοντας έναν δυνατό παλμό δυναμικού μέσω της ακίδας στο νανοσωλήνα, αυτός μπορεί να τεμαχιστεί τοπικά. Τέλος η μεγάλη τους ηλεκτρική αγωγιμότητα τους κάνει κατάλληλους σαν ακίδες STM μικροσκοπίων (11-14,15,16) Νανοβιοτεχνολογία Στα πλαίσια της έρευνας εύρεσης εναλλακτικών συστημάτων μεταφοράς, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα νανοσυστήματα εξαιτίας των πλεονεκτημάτων που παρουσιάζουν σε σχέση με τα υπάρχοντα συστήματα μεταφοράς. Με αυτά τα συστήματα ασχολείται ο διεπιστημονικός κλάδος της Νανοβιοτεχνολογίας, ο οποίος συνδυάζει δύο πολλά υποσχόμενες τεχνολογίες : τη βιοτεχνολογία και τη νανοτεχνολογία. Η τελευταία παρέχει τα εργαλεία και την τεχνολογία για εργασία σε ατομικά, μοριακά και υπερμοριακά επίπεδα οδηγώντας στη δημιουργία συσκευών και συστημάτων μεταφοράς με νέες ιδιότητες και λειτουργίες. Η νανοτεχνολογία είναι διεπιστημονική και περικλείει γνώσεις από πολλά διαφορετικά γνωστικά πεδία όπως είναι η φυσική, η μηχανολογία και η επιστήμη των υλικών. Περιλαμβάνει το σχεδιασμό, την παραγωγή, το χαρακτηρισμό και την εφαρμογή υλικών (μορίων ή συστημάτων) των οποίων οι διαστάσεις είναι κάτω των 100nm. Έχει αποδειχθεί ότι τα υλικά στην νανομετρική κλίμακα αποκτούν νέες ιδιότητες οι οποίες μπορεί να γίνουν εκμεταλλεύσιμες από διάφορα πεδία συμπεριλαμβανομένων της βιοτεχνολογίας, της εμβιομηχανικής και της νανοϊατρικής. Αυτά τα υλικά καλούνται νανοϋλικά και μπορούν να κατηγοριοποιηθούν ως νανοσωλήνες, νανοκαλώδια, νανοκελύφη (nanoshells), νανοσωματίδια, κβαντικές τελείες, δενδριμερή και βιοπολυμερή (17)

54 Νανοσωλήνες άνθρακα σε εφαρμογές στην βιοϊατρική Κάποιες από τις πολλά υποσχόμενες εφαρμογές αυτής της τεχνολογίας ελαχιστοποίησης του μεγέθους των συσκευών, είναι στην βιομηχανία της βιοϊατρικής. Η βιομηχανία της βιοϊατρικής σήμερα χαρακτηρίζεται από ασύμβατες απαιτήσεις: 1. οι ασθενείς ψάχνουν για καλύτερη φροντίδα, ενώ 2. οι πάροχοι υγειονομικής περίθαλψης και ασφάλισης συνεχώς απαιτούν χαμηλότερου κόστους διαγνώσεις και θεραπείες. Η βιομηχανία της βιοϊατρικής αντιμετωπίζει την πρόκληση της δημιουργίας μηχανών και υλικών που προσφέρουν οφέλη και στα δύο μέτωπα. Η ανακάλυψη των νανοσωλήνων άνθρακα πιθανώς μπορεί να φέρει την επανάσταση στην βιοϊατρική έρευνα, καθώς μπορεί να έχει σημαντική εφαρμογή λόγω των εντυπωσιακών δομικών, μηχανικών και ηλεκτρονικών ιδιοτήτων όπως μικρό μέγεθος και μάζα, υψηλή αντοχή, υψηλή ηλεκτρική και θερμική αγωγιμότητα. Παρόλο βέβαια που οι νανοσωλήνες είναι πολλά υποσχόμενοι, είναι συνδεδεμένοι με πολλούς περιορισμούς, που πολλές φορές απαγορεύουν τη χρήση τους σε συστήματα μεγάλης κλίμακας (17,21-23) Ακτινοβολία στον τομέα της ογκολογίας Η παραδοσιακή μέθοδος δημιουργίας ακτίνων-χ πραγματοποιείται ως εξής: ένα μεταλλικό φύλλο (κάθοδο) λειτουργεί ως πηγή ηλεκτρονίων όταν θερμαίνεται συνεχώς σε πολύ υψηλή θερμοκρασία, τα επιταχυνόμενα ηλεκτρόνια που εκπέμπονται βομβαρδίζουν έναν μεταλλικό στόχο (άνοδος) για τη δημιουργία των ακτίνων-χ. Το πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι δεν απαιτεί πιέσεις υπέρυψηλού κενού. Αυτή η μέθοδος έχει σημαντικούς περιορισμούς: 1. έχει αργό χρόνο απόκρισης, 2. καταναλώνει υψηλή ενέργεια και 3. έχει περιορισμένο χρόνο ζωής. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η εκπομπή ηλεκτρονίων πεδίου είναι καλύτερος μηχανισμός εξαγωγής ηλεκτρονίων συγκριτικά με την θερμοϊονική εκπομπή ηλεκτρονίων. Αυτό συμβαίνει διότι τα ηλεκτρόνια εκπέμπονται σε θερμοκρασία δωματίου και το ρεύμα που λαμβάνουμε είναι ελεγχόμενης τάσης. Επιπροσθέτως, δίνοντας στην κάθοδο τη μορφή που απαιτείται για να αυξηθεί το

55 τοπικό πεδίο, έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της τάσης που είναι απαραίτητη για την εκπομπή ηλεκτρονίων. Ένα ιδανικό υλικό καθόδου πρέπει να έχει υψηλό σημείο τήξης και υψηλή θερμική αγωγιμότητα. Οι νανοσωλήνες άνθρακα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως υλικό καθόδου για τη δημιουργία ελεύθερης ροής ηλεκτρονίων. Τα ηλεκτρόνια στους νανοσωλήνες αποσπώνται εύκολα απ τις θέσεις τους είτε λόγω των οξειδωμένων άκρων, είτε λόγω της καμπυλότητας, όταν εφαρμόζεται τάση μεταξύ της επιφάνειας των νανοσωλήνων και της ανόδου. Ο Yue et al. δημιούργησαν συνεχόμενες ή παλμικές ακτίνες-χ χρησιμοποιώντας εκπομπή ηλεκτρονίων πεδίου βασιζόμενοι σε κάθοδο κατασκευασμένη από νανοσωλήνες. Τα πλεονεκτήματα των συστημάτων ακτίνων-χ που βασίζονται σε νανοσωλήνες άνθρακα περιλαμβάνουν ότι έχουν μικρό χρόνο απόκρισης, εξαιρετικό εστιακό σημείο, χαμηλή κατανάλωση ενέργειας, μεγαλύτερο χρόνο ζωής, χαμηλότερο κόστος και υπάρχει η πιθανότητα ελαχιστοποίησης του μεγέθους της συσκευής. Η μικρογραφία μιας τέτοιας συσκευής ακτίνων Χ μπορεί να εισαχθεί μέσα στο σώμα με ενδοσκόπηση, ώστε να μεταφέρει συγκεκριμένη δόση ακτίνων-χ απευθείας στην περιοχή στόχο ενός κακοήθους όγκου, χωρίς να καταστρέφει τους υγιείς ιστούς που τον περιβάλουν. Άλλες τεχνικές όπως οι χημειοθεραπείες ή η συμβατική ακτινοβολία επιτίθενται εναντίον του καρκίνου αλλά ταυτόχρονα σκοτώνουν και τους υγιείς ιστούς που τον περιβάλουν, κάτι που είναι πολύ βασικό μειονέκτημά (17). Εικόνα (α) Σχηματική απεικόνιση συστήματος ακτίνων-χ με κάθοδο κατασκευασμένη από νανοσωλήνες, (b) Ρεύμα που προέρχεται από εκπομπή ηλεκτρονίων, συγκριτικά με τάση εφαρμοζόμενη σε κάθοδο φτιαγμένη από νανοσωλήνες, εμβαδού 1mm 2 (17)

56 Αισθητήρες Οι αισθητήρες είναι συσκευές που ανιχνεύουν μεταβολή σε κάποια φυσική ποσότητα ή σε κάποιο γεγονός. Υπάρχουν πολλές μελέτες που αναφέρουν τη χρήση των νανοσωλήνων άνθρακα ως αισθητήρες μεταβολής πίεσης, ροής, θερμότητας και ως χημικούς ή και βιολογικούς αισθητήρες. Οι Liu and Dai et al αποδεικνύουν ότι αισθητήρες που μετρούν πιεζοηλεκτρική μεταβολή, μπορούν να κατασκευαστούν με τη βοήθεια των νανοσωλήνων άνθρακα (17). Κατασκεύασαν SWCNTs επάνω σε διακοπτόμενες τετραγωνικές μεμβράνες πολυπυριτίου. Όταν εφαρμοζόταν ομοιόμορφη πίεση πάνω στις μεμβράνες, παρατηρούνταν μια μεταβολή στην αντίσταση των νανοσωλήνων. Σύμφωνα με τους Caldwell et al. οι αισθητήρες μεταβολής πίεσης που είναι κατασκευασμένοι από πυρίτιο έχουν το μειονέκτημα ότι η αντίστασή τους είναι υπερευαίσθητη σε αλλαγές της θερμοκρασίας. Αντιθέτως οι νανοσωλήνες έχουν συντελεστή θερμικής διαστολής περίπου δύο τάξεις μεγέθους μικρότερο από αυτόν του πυριτίου και έχουν υψηλή ευαισθησία, κάτι που τους κάνει υψηλής απόδοσης αισθητήρες. Η κατασκευή τέτοιου είδους αισθητήρων με τη χρήση των νανοσωλήνων άνθρακα, μπορεί να φέρει τεράστιες αλλαγές στην βιομηχανία της βιοϊατρικής καθώς υπάρχουν πολλές διαγνωστικές και θεραπευτικές μέθοδοι που βασίζονται σ αυτήν την τεχνολογία. Οι αισθητήρες πίεσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε οφθαλμολογικές εγχειρήσεις, σε νοσοκομειακά κρεβάτια, σε αναπνευστικές συσκευές, σε συσκευές εισπνοής, σε συσκευές μετάγγισης για νεφρά. Κατά τη διάρκεια οφθαλμολογικής εγχείρησης, υγρό απομακρύνεται από τον οφθαλμό και αν απαιτείται καθαρίζεται και επανατοποθετείται. Οι αισθητήρες πίεσης μετρούν και ελέγχουν το κενό που χρησιμοποιείται για να απομακρύνει το υγρό και παρέχει ενέργεια στα ηλεκτρονικά της αντλίας, μετρώντας την βαρομετρική πίεση. Τα στρώματα από τα κρεβάτια των νοσοκομείων που προορίζονται για ασθενείς με εγκαύματα, αποτελούνται από αισθητήρες πίεσης που ρυθμίζουν μια σειρά από φουσκωμένα μέρη. Για τη μείωση του πόνου και την επιτάχυνση της θεραπείας, τμήματα του στρώματος που βρίσκονται κάτω από τα σημεία με εγκαύματα μπορούν να ξεφουσκώσουν για ελαχιστοποίηση της πίεσης. Αισθητήρες πίεσης μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για διάγνωση άπνοιας σε ασθενείς, με ανίχνευση της παύσης της αναπνοής κατά τη διάρκεια του ύπνου

57 Οι αισθητήρες πίεσης παρακολουθούν την αλλαγή πίεσης σε φουσκωμένα στρώματα. Αν δεν εντοπίζεται κίνηση για συγκεκριμένη χρονική περίοδο, ένα alarm ενεργοποιείται ώστε να ξυπνήσει τον ασθενή. Η τεχνολογία του αισθητήρα πίεσης χρησιμοποιείται και στις παρεμβατικές και στις μη παρεμβατικές συσκευές μέτρησης της πίεσης του αίματος. Πολλοί ασθενείς που χρησιμοποιούν συσκευές εισπνοής, τις ενεργοποιούν σε λανθασμένη χρονική στιγμή, με αποτέλεσμα να μη λαμβάνουν επαρκή δόση του φαρμάκου. Οι αισθητήρες πίεσης στις συσκευές εισπνοής ανιχνεύουν τον κύκλο της αναπνοής και ελευθερώνουν την αντίστοιχη ποσότητα φαρμάκου που χρειάζεται. Κατά τη διάρκεια της μετάγγισης αίματος για τα νεφρά, το αίμα ρέει από την αρτηρία προς τη συσκευή μετάγγισης και αφού καθαριστεί, ρέει ξανά μέσα στις φλέβες. Τα μη επιθυμητά προϊόντα απομακρύνονται από το αίμα μέσω όσμωσης και κινούνται κατά μήκος μιας λεπτής μεμβράνης μέσα σε ένα διάλυμα όπου πραγματοποιείται επανόρθωση όλων των μετάλλων του αίματος. Χρησιμοποιώντας αισθητήρες πίεσης, η ρύθμιση του συστήματος μετάγγισης μπορεί να οριστεί από τη μέτρηση των πιέσεων του αίματος που εξέρχεται και που εισέρχεται. Τα έξυπνα συστήματα αισθητήρων πίεσης παίζουν σημαντικό ρόλο στις φορητές συσκευές αναπνοής που αποτελούνται και από διαγνωστικό και θεραπευτικό εξοπλισμό. Εξυπηρετούν ασθενείς με άσθμα, άπνυα και χρόνια αποφρακτική πνευμονία. Οι αισθητήρες που βασίζονται στους νανοσωλήνες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να ανιχνεύσουν αλληλουχίες DNA στο σώμα. Οι αισθητήρες αυτοί ανιχνεύουν ένα πολύ συγκεκριμένο τμήμα DNA που πιθανώς μπορεί να σχετίζεται με μια ασθένεια. Τέτοιοι αισθητήρες κάνουν δυνατή την ανίχνευση λίγων μόνο DNA μορίων, που περιέχουν συγκεκριμένες αλληλουχίες που πιθανώς διαγιγνώσκουν καρκινικά γονίδια σε ασθενείς. Η χρήση των αισθητήρων που βασίζονται στους νανοσωλήνες έχει το πλεονέκτημα ότι αποφεύγονται προβλήματα που σχετίζονται με τους πολύ μεγαλύτερους εμφυτεύσιμους αισθητήρες που χρησιμοποιούνται τώρα, οι οποίοι πιθανώς θα προκαλέσουν μόλυνση στον ασθενή, καθώς επίσης αποφεύγεται η συνεχής λήψη και η εξέταση δειγμάτων αίματος. Οι συγκεκριμένες συσκευές μπορούν να εφαρμοστούν διαδερματικά, αποφεύγοντας την εισαγωγή τους με ενέσιμο τρόπο. Συνοπτικά, τα πλεονεκτήματα των αισθητήρων που βασίζονται σε νανοσωλήνες είναι, ότι είναι λιγότερο ευαίσθητοι σε μεταβολές στην θερμοκρασία,

58 κάτι που τους κάνει να λειτουργούν καλύτερα σε εφαρμογές αισθητήρων πάνω στη βιοϊατρική. Επίσης, αφού είναι τόσο μικροί σε μέγεθος, καταναλώνουν πολύ λίγη ενέργεια, αποφεύγεται η πιθανότητα μόλυνσης και ελαχιστοποιείται η συνεχής λήψη και εξέταση αίματος. Τέλος μπορούν να ανιχνεύουν συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA που σχετίζονται με ασθένειες, όπως καρκινικά γονίδια και βιομόρια ή ακόμα και αντισώματα που σχετίζονται με αυτοάνοσα νοσήματα (17) Ακίδες AFM Οι ακίδες είναι συσκευές που είναι σχεδιασμένες να ερευνούν και να αποσπούν πληροφορίες από απομακρυσμένες, άγνωστες περιοχές ή κοιλότητες. Υπάρχουν πολλές μελέτες που έχουν αναφέρει τη χρήση των νανοσωλήνων άνθρακα για τη δημιουργία ακίδων. Για παράδειγμα οι Stevens et al. τοποθέτησαν νανοσωλήνες άνθρακα στην άκρη μιας ακίδας AFM. Οι ακίδες αυτές είναι ικανές να μελετήσουν ένα λεπτό νήμα πρωτεΐνης (17). Εικόνα Δύο ακίδες με προσαρμοσμένο νανοσωλήνα στο άκρο τους. (a) SEM απεικόνιση του νανοσωλήνα, (b) TEM απεικόνιση του νανοσωλήνα πάνω στη ακίδα (17). Οι νανοσωλήνες άνθρακα είναι ιδανικά υλικά για ακίδες AFM, καθώς η εικόνα που αποσπάται με το AFM εξαρτάται από το μέγεθος και το σχήμα της ακίδας και από την επιφανειακή δομή του δείγματος. Η βέλτιστη ακίδα πρέπει να έχει κάθετες πλευρές και η άκρη της πρέπει να έχει ακτίνα ατομικών διαστάσεων. Οι ακίδες που είναι φτιαγμένες από πυρίτιο είναι σχήματος πυραμίδας και έχουν ακτίνα περίπου 5nμ. Συγκριτικά με αυτές, οι ακίδες με νανοσωλήνες έχουν πολύ υψηλή ανάλυση καθώς το κυλινδρικό τους σχήμα και η μικρή διάμετρος τους, τους δίνει τη δυνατότητα απεικόνισης στενών και με βάθος κοιλοτήτων (17)

59 Μεταφορά φαρμάκων Όπως όλες οι βιομηχανίες, η αύξηση του κόστους της ιατρικής φροντίδας οδήγησε στην εξέλιξη καινοτόμων τεχνικών μεταφοράς φαρμάκων που είναι αποδοτικές ως προς το κόστος τους. Τα δύο σημαντικά χαρακτηριστικά ενός αποτελεσματικού συστήματος μεταφοράς φαρμάκων είναι η ικανότητα του να εφαρμόζει ελεγχόμενη και στοχευμένη μεταφορά φάρμακου. Γι αυτό το λόγο, τα φάρμακα πρέπει να αποδεσμεύονται σε μια ιδανική αναλογία, καθώς η πολύ γρήγορη απελευθέρωση φάρμακου μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη απορρόφηση, γαστρεντερικές διαταραχές και άλλες παράπλευρες απώλειες. Επίσης θα πρέπει τα φάρμακα να μην αποσυντεθούν κατά τη διάρκεια της μεταφοράς, καθώς πολλά φάρμακα είναι τοξικά στη φύση. Γι αυτόν τον λόγο, τα φάρμακα πρέπει να ενθυλακώνονται μέσα σε κάποιον φορέα κατά τη διάρκεια της μεταφοράς τους μέσα στο σώμα, ενώ ταυτόχρονα θα πρέπει να διατηρούν τις βιολογικές και χημικές τους ιδιότητες. Επίσης ο φορέας της μεταφοράς θα πρέπει να είναι συμβατός με το φάρμακο και να δεσμεύεται εύκολα σε αυτό. Το υλικό θα πρέπει να αποσυντίθεται μετά την ολοκλήρωση του έργου του είτε με διαλυτοποίηση, είτε με αποβολή μέσω φυσιολογικών οδών απέκκρισης από το σώμα (17,18). Οι νανοσωλήνες άνθρακα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φορείς για μεταφορά φαρμάκων, γιατί είναι ιδανικοί στο να εισέρχονται στον πυρήνα των κυττάρων. Ερευνητές έχουν βρει ότι τροποποιημένοι νανοσωλήνες άνθρακα μπορούν να διαπεράσουν την κυτταρική μεμβράνη, ενώ το μέγεθός τους είναι τέτοιο, που τα κύτταρα δεν τους αναγνωρίζουν ως βλαβερούς εισβολείς. Οι Martin και Kohli αναφέρουν ότι οι νανοσωλήνες άνθρακα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως υλικά για μεταφορά φαρμάκων επειδή έχουν μεγαλύτερους εσωτερικούς όγκους, συγκριτικά με τις διαστάσεις από ένα μικρό σωληνάκι που μπορεί γεμίσει με την επιθυμητή βιολογική η χημική ουσία (17,18). Δεύτερον οι νανοσωλήνες έχουν σαφείς εσωτερικές και εξωτερικές επιφάνειες που μπορούν ξεχωριστά να μεταβληθούν, με χημική τροποποίηση. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα, η εξωτερική επιφάνεια του νανοσωλήνα να μπορεί να τροποποιηθεί με βιοσυμβατά υλικά και στο εσωτερικό να τοποθετηθεί η επιθυμητή βιοχημική ουσία

60 Εικόνα Τροποποίηση εξωτερική επιφάνειας νανοσωλήνα Τρίτον, οι νανοσωλήνες έχουν εκτεθειμένα και ανοιχτά τα άκρα τους, κάτι που κάνει το εσωτερικό τους προσβάσιμο, για εισαγωγή ουσιών μέσα στον νανοσωλήνα. Οι προσομοιώσεις της μοριακής δυναμικής δείχνουν ότι οι Van der Waals και οι υδροφοβικές δυνάμεις είναι σημαντικές για την διαδικασία της εισαγωγής. Οι δυνάμεις Van der Waals παίζουν κυρίαρχο ρόλο στις λειτουργίες των νανοσωλήνων. Οι Gao et al. βρήκαν ότι σε συνθήκες υδατικού διαλύματος, το μόριο DNA μπορεί να εισαχθεί μέσα στον νανοσωλήνα μέσω μιας πάρα πολύ γρήγορης διαδικασίας αλληλεπίδρασης της δυναμικής. Βασιζόμενοι σε αυτές τις μελέτες, πρότειναν ότι το μόριο νανοσωλήνων-dna μπορεί να εφαρμοστεί σε DNA-τροποποιημένα μοριακά ηλεκτρονικά, μοριακούς αισθητήρες, σε ηλεκτρονική εύρεση αλληλουχίας DNA και σε συστήματα μεταφοράς γονιδίων. Οι Kong et al. βρήκαν ότι η ενθυλάκωση των βιομορίων αυτών μπορεί να επιταχυνθεί σε υψηλές θερμοκρασίες. Τέλος οι νανοσωλήνες άνθρακα μπορούν να τροποποιηθούν με οργανικό τρόπο, έτσι ώστε να γίνουν διαλυτοί σε υδατικούς και οργανικούς διαλύτες. Οι διαλυτοί νανοσωλήνες άνθρακα μπορούν να συνδεθούν με αμινοξέα, βιοενεργά πεπτίδια και πρωτεΐνες για τη δημιουργία περαιτέρω παραγώγων. Αυτά τα συστήματα μεταφοράς φαρμάκων μπορούν να δημιουργήσουν τη βάση για αντικαρκινικές θεραπείες και εμβόλια στο μέλλον, καθώς ο φορέας μπορεί να εισέλθει μέσα σε κατεστραμμένα κύτταρα και να ελευθερώσει ένζυμα, ή να ενεργοποιήσει μια αλληλουχία αυτοκαταστροφής αυτών των κυττάρων, ή να επιδιορθώσει τα κύτταρα ώστε να λειτουργούν φυσιολογικά. Στο μέλλον, οι εφαρμογές των νανοσωλήνων άνθρακα ως φορείς φαρμάκου για την θεραπεία του καρκίνου του εγκεφάλου, μπορούν να διερευνηθούν

61 μελετώντας αν το φάρμακο διαπερνά τα όρια αίματος-εγκεφάλου ή όχι. Μια ακόμα εφαρμογή που μπορεί να ερευνηθεί είναι η χρήση των νανοσωλήνων άνθρακα για τη μεταφορά φαρμάκου στην περιοχή του οφθαλμού πέρα απ το όριο του αμφιβληστροειδούς χιτώνα-αίματος και στο κεντρικό νευρικό σύστημα πέρα από το όριο αίματος-εγκεφάλου. Αν αυτή η έρευνα αποδειχθεί επιτυχής, τότε οι νανοσωλήνες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη θεραπεία ασθενειών του οφθαλμού καθώς και άλλων ασθενειών όπως το Alzheimer και το Parkinson. Τέλος, μια ακόμα πολύ ενδιαφέρουσα εφαρμογή περιλαμβάνει τη χρήση νανοσωλήνων ως χάπια που περιέχουν ένα μικροσκοπικό σύστημα βίντεο. Το χάπι μετά την κατάποση μπορεί να διαγνώσει ασθένειες σε περιοχές που είναι πολύ δύσκολη η πρόσβαση με τεχνικές όπως η ενδοσκόπηση ή η κολονοσκόπηση (17,18) Αύξηση διαλυτότητας νανοσωλήνων άνθρακα Παρθένοι νανοσωλήνες είναι τελείως μη διαλυτοί σε όλους τους διαλύτες, κάτι που γέννησε κάποιες ανησυχίες ως προς την υγεία, γι αυτόν το λόγο οι βιολογικές τους ιδιότητες ερευνώνται εκτενώς από την άποψη της τοξικότητας. Η ανάπτυξη αποτελεσματικών μεθοδολογιών για την χημική τροποποίηση των νανοσωλήνων έχουν οδηγήσει στην δημιουργία διαλυτών νανοσωλήνων που θα μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε διάφορες εφαρμογές, όπως και η πολλά υποσχόμενη μεταφορά φαρμάκων. Δύο προσεγγίσεις βιολειτουργικότητας χρησιμοποιούνται ευρέως για την τροποποίηση των νανοσωλήνων άνθρακα (18)

62 Εικόνα Οργανική τροποποίηση νανοσωλήνων άνθρακα. Παρθένοι νανοσωλήνες μονού ή πολλαπλών τοιχωμάτων μπορούν να (α)θερμανθούν σε οξέα έτσι ώστε να καθαριστούν και να δημιουργηθούν καρβοξυλικές ομάδες στα τοιχώματα και στα άκρα τους ή (b) αντιδράσουν με παράγωγα αμινοξέων και αλδεϋδες ώστε να προστεθούν διαλυτά τμήματα γύρω από την εξωτερική τους επιφάνεια (18). Οι νανοσωλήνες άνθρακα μπορούν να οξειδωθούν με τη χρήση ισχυρών οξέων, κάτι που οδηγεί στη μείωση του μήκους τους ενώ δημιουργούνται καρβοξυλικές ομάδες, οι οποίες αυξάνουν την διασπορά και τη διαλυτότητά τους σε υδατικά διαλύματα. Εναλλακτικά, αντιδράσεις προσθήκης με τα εξωτερικά τοιχώματα των νανοσωλήνων αλλά και με τα άκρα τους, μπορούν να τους κάνουν διαλυτούς στο νερό. Η δημιουργία διαλυτών νανοσωλήνων κάτω από φυσιολογικές συνθήκες είναι αναγκαία προϋπόθεση για τη βιοσυμβατότητά τους. Επιπροσθέτως, οι τροποποιημένοι νανοσωλήνες μπορούν να συνδεθούν σε μια ευρεία ποικιλία από ενεργά μόρια, η οποία περιλαμβάνει πεπτίδια, πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα και άλλους θεραπευτικούς παράγοντες. Ένας αποτελεσματικός τρόπος τροποποίησης των εξωτερικών τοιχωμάτων των νανοσωλήνων βασίζεται στην 1,3-διπολική κυκλοπροσθήκη αζω-μεθινο-υλιδίων. Οι νανοσωλήνες υφίστανται την αντίδραση προσθήκης κατά τη διάρκεια θέρμανσης τους σε DMF, παρουσία ενός α-αμινοξέος και μιας αλδεϊδης. Ο σκοπός αυτής της αντίδρασης είναι πολύ ευρύς, καθώς παράγονται τροποποιημένοι νανοσωλήνες με μεγάλη διαλυτότητα σε μια μεγάλη γκάμα από διαλύτες. Με προσεκτική επιλογή των αντιδρώντων, είναι δυνατή η μεταβολή της διαλυτότητας σε οργανικούς διαλύτες ή σε υδατικά διαλύματα. Οι νανοσωλήνες που φέρουν ομάδες αμμωνίου (NH4) είναι πολύ διαλυτοί στο νερό και μπορούμε να τους εκμεταλλευθούμε για πιθανή μεταφορά θεραπευτικών μορίων

63 Οι βιολογικές εφαρμογές των νανοσωλήνων άνθρακα είναι συνεχώς κάτω από έντονη παρακολούθηση και έρευνα (18) Μεταφορά πεπτιδίων με νανοσωλήνες άνθρακα Οι τροποποιημένοι νανοσωλήνες με τη χρήση αμμωνίου, ελέγχονται για την ικανότητά τους να σχηματίζουν υπερμοριακά συγκροτήματα με νουκλεϊκά οξέα, μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων. Πολλά κατιονικά συστήματα ερευνώνται για τη μεταφορά νουκλεϊκών οξέων στα κύτταρα. Ο κοινός τους στόχος είναι να αυξήσουν την μεταφορά γονιδίου και την έκφραση του, διότι το πλασμιδιακό DNA μόνο του εισβάλει μέσα στα κύτταρα και προσεγγίζει τον πυρήνα με σημαντική δυσκολία. Παρομοίως με άλλες οικογένειες μη ιογενών φορέων (όπως λιποσώματα, κατιονικά πολυμερή, μικρομόρια και νανομόρια), η μακρομοριακής φύσεως κατιονική φύση των βιολειτουργικών νανοσωλήνων μπορεί να αξιοποιηθεί ώστε να συμπυκνωθεί το πλασμιδιακό DNA (18) Νανοσωλήνες υψηλής βιολειτουργικότητας Οι νανοσωλήνες άνθρακα μπορούν να τροποποιηθούν με ομοιοπολικούς ή με μη ομοιοπολικούς δεσμούς στα πλευρικά τοιχώματα, με σκοπό να καθηλωθούν πάνω τους νανο-αντικείμενα που έχουν σημαντικές ιδιότητες, για εφαρμογές στη μεταφορά φαρμάκων, στη δημιουργία βιοαισθητήρων ή στην ενέργεια. Ποιο συγκεκριμένα αυτές οι τροποποιήσεις βελτιώνουν τη διαλυτότητα των νανοσωλήνων άνθρακα στο νερό, το οποίο είναι ένας πολύ κρίσιμος παράγοντας για εφαρμογές στη μεταφορά φαρμάκων και γονιδίων. Στη συνέχεια αναφέρεται η διαδικασία μιας εις βάθος πλευρικής τροποποίησης σε νανοσωλήνες άνθρακα πολλαπλού τοιχώματος, που οδηγεί σε μια αξιοσημείωτα υψηλού βαθμού λειτουργικότητα (περίπου μια οργανική ομάδα κάθε έξι άτομα άνθρακα του νανοσωλήνα). Οι υψηλής λειτουργικότητας νανοσωλήνες που προκύπτουν, σχηματίζουν ένα κολλώδες και υδατοδιαλυτό υγρό, που παρουσιάζει ιοντικά χαρακτηριστικά, αγωγιμότητας 1mS/cm στους 100 o C. Οι μοναδικές ιδιότητες αυτού του υλικού το κάνει ιδανικό για εφαρμογές ευρέος φάσματος, από νανοϊατρική έως την ενέργεια

64 Δυο κυρίαρχες προσεγγίσεις έχουν εξελιχθεί ώστε να διευκολύνουν τη διαλυτότητα των νανοσωλήνων άνθρακα, α) η χημική τροποποίηση μέσω ομοιοπολικών δεσμών και b) η φυσική τροποποίηση. Η πρώτη περίπτωση βασίζεται σε οργανική τροποποίηση των νανοσωλήνων, δηλαδή στην τροποποίηση των τοιχωμάτων και των άκρων ώστε να καταστήσουν τη σύνδεση μεταξύ των νανοσωλήνων και των εισαγόμενων ομάδων πιο σταθερή. Μια μεγάλη ποικιλία τροποποιήσεων νανοσωλήνων έχει αναφερθεί, οι περισσότερες από τις οποίες βασίζονται στην αρχική οξείδωση, συνήθως με θειϊκό ή νιτρικό οξύ, των νανοσωλήνων άνθρακα, ώστε να συμβούν κατάλληλες αντιδράσεις, που έχουν ως αποτέλεσμα το σχηματισμό καρβοξυλικών ομάδων πάνω στην επιφάνεια των νανοσωλήνων άνθρακα (19). Εικόνα Υψηλής λειτουργικότητας τροποποιημένοι νανοσωλήνες άνθρακα. α)προτεινόμενη δομή των υψηλής λειτουργικότητας MWCNTs (19). Το ενδιαφέρον για τη χρήση των νανοσωλήνων άνθρακα σε συστήματα μεταφοράς φαρμάκων αυξάνεται προοδευτικά. Επομένως η βελτίωση της διαλυτότητας των νανοσωλήνων άνθρακα κάτω από φυσιολογικές συνθήκες έχει γίνει απαραίτητη προϋπόθεση για τη χρήση τους

65 Εικόνα Υψηλής λειτουργικότητας τροποποιημένοι νανοσωλήνες άνθρακα. Μια φωτογραφία μιας σταγόνας στην οποία περιέχονται υψηλής λειτουργικότητας MWCNTs πάνω σε επιφάνεια πυριτίου. Οι νανοσωλήνες σε υγρή μορφή, έχουν υδάτινη συμπεριφορά όταν εναποτίθενται σε υδρόφιλο υπόστρωμα. Η γωνία επαφής (17.8 ο ) είναι συγκρίσιμη με αυτήν του νερού (18 ο ), αν και επιτυγχάνεται μετά από λίγο χρόνο λόγω του υψηλότερου ιξώδους (19) Προκλήσεις Μέσα σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα, οι νανοσωλήνες άνθρακα εμφανίζονται να είναι πρωτοπόροι που πιθανώς τείνουν να επικρατήσουν στην έρευνα της βιοϊατρικής. Παρόλα αυτά υπάρχουν ακόμα προβλήματα που πρέπει να επιλυθούν, πριν την τελειωτική χρήση τους σε εφαρμογές της βιοϊατρικής. Για παράδειγμα υπάρχει ένα κενό στην λεπτομερή κατανόηση του μηχανισμού ανάπτυξης των νανοσωλήνων άνθρακα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα, η προσπάθεια παραγωγής, σε μεγάλη κλίμακα, δομικά τέλειων νανοσωλήνων άνθρακα να εμπεριέχει μεγάλες δυσκολίες. Δεύτερον, είναι πολύ δύσκολη η συνεχής ανάπτυξη αψεγάδιαστων νανοσωλήνων άνθρακα σε μακροσκοπικά μήκη. Τέλος ο έλεγχος της χειρομορφίας των μονού τοιχώματος νανοσωλήνων άνθρακα, με τις υπάρχουσες τεχνικές ανάπτυξης είναι πάρα πολύ δύσκολη. Επίσης οι παραπάνω περιορισμοί έχουν ως αποτέλεσμα πολύ υψηλού κόστους μεθόδους, για την παραγωγή καθαρών νανοσωλήνων με ομοιομορφία στα χαρακτηριστικά. Εν συντομία, πρέπει να κατακτηθούν γνώσεις για τη βελτιστοποίηση του ελέγχου και των παραμέτρων κατά την ανάπτυξη των νανοσωλήνων. Επιπρόσθετα με τις δυσκολίες σε επίπεδο παραγωγής τους, η τόσο μικρών διαστάσεων γεωμετρία τους, οδηγεί σε δομική αστάθεια, κάτι που είναι πολύ σημαντικό για τις μηχανικές εφαρμογές των νανοσωλήνων άνθρακα, καθώς σε μεγαλύτερα στελέχη τείνουν να μην παραμένουν ευθυγραμμισμένοι κάθετα, αλλά

66 να λυγίζουν και να τυλίγονται μεταξύ τους και τέλος να καταρρέουν. Επίσης, η τοξικότητα τους δεν έχει κατανοηθεί εις βάθος. Ο Dagani συνέταξε μια αναφορά από τη διεθνή συνάντηση του Αμερικάνικου Συλλόγου Χημείας για τις δυσμενείς επιπτώσεις της πιθανής μεταφοράς νανοσωματιδίων με φάρμακο, στο όριο αίματος-εγκεφάλου. Ως αποτέλεσμα των πειραμάτων τους προέκυψε ότι η χρήση νανοσωλήνων άνθρακα εμπεριέχουν κινδύνους για την υγεία. Οι ερευνητές αιτιολόγησαν ότι οι άνθρωποι μπορούν πιθανώς να εκτεθούν σε νανοσωλήνες άνθρακα, με εισπνοή διότι οι ανεπεξέργαστοι νανοσωλήνες είναι πολύ ελαφρύς και γι αυτόν το λόγο μπορούν να γίνουν αερομεταφερόμενοι. Αν οι νανοσωλήνες άνθρακα φτάσουν στους πνεύμονες, μπορούν να συσσωρευτούν και να γεμίσουν τις διόδους του αέρα και να προκαλέσουν ασφυξία. Αυτό επιβάλει μια σε βάθος έρευνα για την τοξικότητα των νανοσωλήνων ώστε να υπάρξει ένα τελικό συμπέρασμα, με σεβασμό στο ανθρώπινο ανοσοποιητικό σύστημα (17)

67 1.3. Βιοπολυμερή Συνθετικά πολυμερή Τα συνθετικά πολυμερή γνωστά και ως πλαστικά πρωτοεμφανίστηκαν το Από τότε έχουν αντικαταστήσει υλικά όπως το γυαλί, το ξύλο, ακόμη και τα μέταλλα σε πολλές βιομηχανικές και περιβαλλοντικές εφαρμογές. Η ευρέως διαδεδομένη χρήση των συνθετικών πολυμερών δεν οφείλεται μόνο στις μηχανικές και θερμικές ιδιότητες τους, αλλά κυρίως στη σταθερότητα και την αντοχή τους. Από την άλλη πλευρά, η χρήση των πλαστικών σε εφαρμογές όπως αναφέρονται «μικρής ζωής», για παράδειγμα η χρήση τους ως συσκευασίες προϊόντων, αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος των πλαστικών απορριμμάτων. Η αυξημένη αντοχή τους και οι επιπτώσεις αυτών στο περιβάλλον έχει ευαισθητοποιήσει πολλές χώρες ως προς τη χρήση τους. Τα απόβλητα των συνθετικών πολυμερών προκαλούν προβλήματα τόσο στην άγρια πανίδα, όσο και στην αισθητική των πόλεων, των δασών και των θαλασσών. Το αυξημένο κόστος διάθεσης των αποβλήτων των συνθετικών πολυμερών, καθώς και οι πιθανοί κίνδυνοι από την αποτέφρωσή τους, όπως είναι η εκπομπή διοξινών από PVC, κάνει τα συνθετικά πολυμερή ως το μεγαλύτερο πρόβλημα διάθεσης αποβλήτων. Κατά συνέπεια, τις τελευταίες δύο δεκαετίες, παρατηρήθηκε ένα αυξημένο δημόσιο και επιστημονικό ενδιαφέρον σχετικά με τη χρήση και την ανάπτυξη βιοπολυμερών υλικών ή αλλιώς βιοαποικοδομήσιμων πολυμερών ως οικολογικά χρήσιμη εναλλακτική λύση στη χρήση των πλαστικών. Τα βιοπολυμερή υλικά πρέπει να διατηρούν τις επιθυμητές φυσικές και χημικές ιδιότητες των συνθετικών πολυμερών, δίνοντας έτσι μία λύση στα υπάρχοντα προβλήματα που προκύπτουν από τα απόβλητα των συνθετικών πολυμερών. -56-

68 Ο ρόλος των βιοπολυμερών υλικών Τα βιοπολυμερή υλικά παράγονται από ανανεώσιμες πηγές, όπως είναι τα βακτήρια και τα φυτά, ούτως ώστε, δε συμβάλλουν στην εξάντληση των ήδη πεπερασμένων πηγών. Ένας μεγάλος αριθμός βιοπολυμερών υλικών, κυρίως βιοαποικοδομήσιμων πολυεστέρων, έχει αναπτυχθεί με μεγάλη επιτυχία τα τελευταία χρόνια για την επίτευξη συγκεκριμένων διεργασιών σε διάφορους τομείς. Πιο συγκεκριμένα έχουν αναπτυχθεί πολυϋδροξυαλκανια ( PHAs ), πολυαμίδια, αλειφατικοί πολυεστέρες, πολυσακχαρίτες, πολυανυδρίτες καθώς και συμπολυμερή ή μείγματα αυτών. Αυτά τα υλικά προσφέρουν λύση και αποτελούν ένα καλό υποκατάστατο των συνθετικών πολυμερών, εφόσον υπάρχουν τα επιθυμητά χαρακτηριστικά και ιδιότητες (24) Σύνθεση βιοπολυμερών υλικών από βακτήρια Τα περισσότερα βακτήρια μπορούν και συνθέτουν ένα ευρύ φάσμα βιοπολυμερών υλικών που χρησιμεύουν σε διάφορες μεταβολικές διαδικασίες. Τα υλικά αυτά, έχοντας τις κατάλληλες ιδιότητες χρησιμοποιούνται τόσο σε βιομηχανικές όσο και σε ιατρικές εφαρμογές. Η ανακάλυψη του πρώτου βακτηριακού πολυμερούς χρονολογείται περίπου στα μέσα του 19ου αιώνα, όταν ο Louis Pasteur ανακάλυψε τη δεξτράνη ως μικροβιακό προϊόν του κρασιού. Ακολούθησε το 1886 η ανακάλυψη ότι η κυτταρίνη είναι βακτηριακό προϊόν. Λίγο μετά την ανακάλυψη αυτών των εξω-πολυσακχαριτών ανακαλύφθηκαν τα πρώτα ενδοκυτταρικά πολυμερή, όπως το πολυαμίδιο κυανοφυκίνη από τα κυανοβακτήρια. Σαράντα χρόνια αργότερα έγινε η ανακάλυψη του πολυεστέρα πολυϋδροξυβουτυρικού στο βακτήριο Bacillus megaterium. Τα περισσότερα βιομηχανικά και ιατρικά βακτηριακά πολυμερή βρέθηκαν στις αρχές της δεκαετίας έως τα μέσα του 20ου αιώνα. Κάποια από αυτά είναι το αλγινικό και η ξανθάνη (24). Οι πρόσφατες ανακαλύψεις στον τομέα της βακτηριακής βιοσύνθεσης πολυμερών, έχουν ανοίξει νέους δρόμους στην κατά παραγγελία παραγωγή

69 βιοπολυμερών κατάλληλων για βιομηχανικές και ιατρικές εφαρμογές. Η καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών έχει προσφέρει μοναδικά εργαλεία για τη δημιουργία βακτηρίων που όχι μόνο αυξάνουν την παραγωγή βιοπολυμερών αλλά είναι σε θέση να παράγουν τροποποιημένα μη-φυσικά πολυμερή με μοναδικές ιδιότητες. Τα νέα βιοπολυμερή χρησιμοποιούνται σε υψηλής αξίας εφαρμογές, παρουσιάζοντας βιώσιμο κόστος. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η παραγωγή των βιοπολυμερών από τα βακτήρια βασίζεται σε μεταβολικές διεργασίες. Πιο αναλυτικά, τα βακτήρια μετατρέπουν τις διάφορες πηγές άνθρακα σε πολυμερή που έχουν ιδιαίτερες φυσικές και χημικές ιδιότητες. Ωστόσο, τα βακτήρια συνθέτουν περιορισμένο αριθμό ενδοκυτταρικών πολυμερών. Από την άλλη πλευρά το εύρος των εξωκυτταρικών πολυμερών είναι τεράστιο. Μερικά από αυτά τα πολυμερή εξυπηρετούν ένα μεγάλο αριθμό προκαρυωτών, ενώ άλλα πολυμερή είναι συγκεκριμένα για ορισμένα είδη βακτηρίων και εξυπηρετούν συγκεκριμένες βιολογικές λειτουργίες. Πολλά βακτήρια είναι σε θέση να συνθέσουν περισσότερα από ένα πολυμερή. Τέσσερις είναι οι κύριες κατηγορίες πολυμερών που παράγονται από βακτήρια, οι πολυσακχαρίτες, οι πολυεστέρες, τα πολυαμίδια και οι ανόργανοι πολυανυδρύτες όπως είναι τα φωσφορικά άλατα. Τα πολυμερή αυτά εξυπηρετούν διάφορες βιολογικές λειτουργίες, για παράδειγμα ως υλικό απόθεμα ή ως τμήμα κάποιας προστατευτικής δομής. Επίσης, μπορούν να προσφέρουν σημαντικό πλεονέκτημα στα βακτήρια κάτω από ορισμένες περιβαλλοντικές συνθήκες. Ως εκ τούτου, για τον έλεγχο της βιοσύνθεσης και τις ιδιότητες των πολυμερών υπάρχουν περίπλοκα ρυθμιστικά μονοπάτια ως απάντηση σε εξωτερικά ερεθίσματα. Διάφορα βακτηριακά πολυμερή έχουν αρχίσει να παράγονται στο εμπόριο, με ετήσιο όγκο παραγωγής παγκοσμίως της τάξης των τόνων και για τους πολυσακχαρίτες dextran και xanthan αντίστοιχα, καθώς και μέχρι τόνους για πολυεστέρες. Παρ ολ αυτά τα βακτηριακά πολυμερή καλούνται να ανταγωνιστούν τα συνθετικά πολυμερή όπου το κόστος παραγωγής αποτελεί κρίσιμη παράμετρο. Ωστόσο, τα βιοπολυμερή που προέρχονται από φυσικούς πόρους, έχουν ανταγωνιστικά πλεονεκτήματα λόγω της βιώσιμης παραγωγής τους από ανανεώσιμες πηγές, τη βιοαποικοδομησιμότητά τους και συχνά, τη βιοσυμβατότητά τους. Ειδικότερα, τα βιοπολυμερή είναι εξ ορισμού βιοαποικοδομήσιμα και έτσι η χρήση τους σε εμπορικά προϊόντα γίνεται όλο και πιο

70 ελκυστική, λόγω της επιθυμίας να αποφευχθεί η χρήση των συνθετικών πολυμερών, τα οποία συσσωρεύονται στο περιβάλλον. Όταν εκτεθούν σε μικροβιακή χλωρίδα που είναι παρούσα σε ένα περιβάλλον όπως το έδαφος ή το νερό ανοργανοποιούνται από διάφορες δεοπολυμεράσες και υδρολάσες σε διοξείδιο του άνθρακα και νερό. Επιπλέον, τα βιοπολυμερή αποτελούνται από φυσικά μη τοξικά συστατικά και θεωρούνται εγγενώς βιοσυμβατά. Αυτή η βιοσυμβατότητα έχει αξιοποιηθεί σε πολλές ιατρικές εφαρμογές. Έτσι λοιπόν, βιοπολυμερή έχουν χρησιμοποιηθεί ως ικριώματα ή μήτρες στη μηχανική ιστών (tissue engineering), για κλείσιμο πληγών και για τη μεταφορά φαρμάκων (24) Πολυυδροξυαλκανοϊκά (PHAs) Τα πολύ-υδροξυ-αλκαν (ΡΗΑ) συντίθενται από τα βακτήρια κάτω από μηισορροπημένες συνθήκες ανάπτυξης. Έχει αναφερθεί ότι, ορισμένα βακτήρια είναι σε θέση να παράγουν και να συσσωρεύουν ΡΗΑ στο 90% w/w κατά την εξάντληση θρεπτικών συστατικών όπως το άζωτο, ο φώσφορος ή το μαγνήσιο. Οι ΡΗΑ αποτελούν μία ιδανική ένωση αποθήκευσης διοξειδίου του άνθρακα και πηγών ενέργειας, λόγω του ότι οι κόκκοι ΡΗΑ είναι αδιάλυτοι στο κυτταρόπλασμα, το οποίο ασκεί αμελητέα αύξηση της οσμωτικής πίεσης. Επίσης, τα βακτήρια που παράγουν ΡΗΑ είναι σε θέση να επιβιώνουν σε συνθήκες πείνας από εκείνα που δεν παράγουν, καθώς οι ΡΗΑ παρέχουν ενεργειακό απόθεμα μειώνοντας έτσι, την πιθανότητα αυτόλυσης του κυττάρου και τη θνησιμότητά του (25)

71 Εικόνα Δομή κόκκου PHA. Τα ΡΗΑs συντίθενται από μεγάλο αριθμό βακτηρίων σαν ενδοκυτταρική αποθηκευτική πηγή άνθρακα και ενέργειας όταν τα βακτήρια βρίσκονται σε κατάσταση τροφικού stress, όταν δηλαδή οι μικροοργανισμοί υφίστανται έλλειψη από κάποιο από τα κύρια θρεπτικά συστατικά του μέσου ανάπτυξης όπως π.χ. οξυγόνο για τους αερόβιους οργανισμούς, άζωτο, ιχνοστοιχεία και ιόντα εν διαλύσει (θειικά, φωσφορικά, αμμωνιακά κλπ) καθώς και διαφοροποίηση της κύριας πηγής του άνθρακα (27). Τα ΡΗΑs συσσωρεύονται με τη μορφή σωματιδίων εγκλεισμού (κόκκων) στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων. Όταν η παροχή των τροφικών μέσων σταματήσει, το παραγόμενο πολυμερές μπορεί να αρχίσει να αποικοδομείται με ενδοκυτταρικές αποπολυμεράσες και να χρησιμοποιηθεί ως πηγή ενέργειας. Εικόνα Κόκοι PHB στο εσωτερικό των κυττάρων

72 Οι ΡΗΑ μπορούν να ταξινομηθούν ανάλογα με το μέγεθος του μονομερούς τους. Επομένως, υπάρχουν δύο μεγάλες ομάδες ΡΗΑ, στην πρώτη ομάδα ανήκουν μικρού μήκους αλυσίδας (SCL) PHA με πέντε ή λιγότερα άτομα άνθρακα σε ένα μονομερές, στη δεύτερη ομάδα ανήκουν μέσου μήκους αλυσίδας (MCL) PHA με έξι έως δεκατέσσερα άτομα άνθρακα σε ένα μονομερές. Έτσι έχουμε το πολύ-3- υδροξυ-βουτυρικό [Ρ(3ΗΒ)], το 3-υδροξυ-βαλερικό (3HV), το 3-υδροξυ-εξανοϊκό (3ΗΗx), το 3-υδροξυ-επτανοϊκό (3ΗΗρ) και ντο 3-υδροξυ-οκτανοϊκό (3ΗΟ) Ένζυμα βιοσύνθεσης των ΡΗΑs Το ένζυμο που είναι υπεύθυνο για τη βιοσύνθεση των ΡΗΑs είναι η PHA πολυμεράση (συνθάση), η οποία καταλύει τη στερεο-εκλεκτική μετατροπή των (R)- 3-υδροξυάκυλο-CoA υποστρωμάτων με την ταυτόχρονη απελευθέρωση CoA, όπως φαίνεται στην Εικόνα 1.23 (28). Εικόνα Καταλυτική αντίδραση ΡΗΑ-συνθάσης. Η βιοσύνθεση των ΡΗΑ με δράση της συνθάσης διακρίνεται σε τρεις φάσεις. Αρχικά, μια κατάλληλη πηγή άνθρακα για τη βιοσύνθεση του πολυμερούς πρέπει να εισέλθει μέσα στο κύτταρο. Αυτό επιτυγχάνεται είτε με ειδικό μηχανισμό μεταφοράς από το κυτταρόπλασμα του βακτηρίου, είτε με διάχυση της πηγής του άνθρακα μέσα στο κύτταρο. Στη δεύτερη φάση, αναβολικές ή καταβολικές αντιδράσεις (ή και οι δύο τύποι αντιδράσεων) μετατρέπουν την πηγή άνθρακα σε θειοεστέρα του υδροξυακυλο-coa. Στη τρίτη φάση η ΡΗΑ-συνθάση, η οποία αποτελεί το βασικό ένζυμο της βιοσύνθεσης του πολυμερούς, χρησιμοποιεί τους

73 θειοεστέρες αυτούς ως υποστρώματα και καταλύει το σχηματισμό εστερικών δεσμών ελευθερώνοντας συνένζυμο-α (28). Η δεύτερη φάση φαίνεται να είναι και η πιο σημαντική, καθώς στη φάση αυτή η πηγή του άνθρακα μετατρέπεται στο κατάλληλο υπόστρωμα για τη δράση της ΡΗΑ-συνθάσης (28). Εικόνα Αρχή βιοσύνθεσης ΡΗΑ στα βακτήρια Φυσικές και χημικές ιδιότητες των πολυυδροξυαλκανοϊκών οξέων Η ακορεστότητα των PHA αυξάνει την ελαστικότητα τους και οι διαφορετικές λειτουργικές ομάδες αλλάζουν τις φυσικές και χημικές ιδιότητες των πολυμερών. Πολυυδροξυαλκανοϊκά με μικρές ελεύθερες ομάδες είναι σκληρά, κρυσταλλικά υλικά ενώ PHA με μακριές πλευρικές ομάδες είναι ελαστομερή. Το PHB έχει υψηλή κρυσταλλικότητα, είναι σκληρό και ψαθυρό υλικό. Η πηγή άνθρακα και το βακτηριακό στέλεχος που χρησιμοποιήθηκε κατά την διεργασία της ζύμωσης, καθορίζουν τις ιδιότητες του πολυμερούς και μπορούν οδηγήσουν στη δημιουργία πολυμερών που είναι σκληρά και ψαθυρά ή ελαστικά (28). Πέρα από μονομερή PHA με ευθείες πλευρικές αλυσίδες, υπάρχουν και PHA με διακλαδούμενες, ακόρεστες και αρωματικές πλευρικές ομάδες. Ειδικό ενδιαφέρον έχουν λειτουργικές πλευρικές ομάδες όπως αλογόνα, καρβοξυ-, υδροξυ-, εποξυ-, φαινοξυ-, κυανοφαινοξυ-, νιτροφαινοξυ-, θειοφαινοξυ- ομάδες και μεθυλεστέρες που επιτρέπουν την περαιτέρω χημική μετατροπή των πολυμερών. Το

74 μήκος, ο κορεσμός και η λειτουργική ομάδα των πλευρικών αλυσίδων επηρεάζουν ιδιότητες όπως το σημείο τήξης (Tm), τη θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης (Tg) και την κρυσταλλικότητα (28). Το συμπολυμερές 3HB και 3HV είναι λιγότερο σκληρό και ψαθυρό από το PHB, αλλά διατηρεί τις περισσότερες μηχανικές ιδιότητές του. Αυτό αυξάνει την αντοχή και μειώνει τη σκληρότητα του υλικού. Η θερμική αποδόμηση του PHB ξεκινά στους 246 ο C, ενώ για το PHBV ξεκινά στους 260 ο C, πράγμα που υποδηλώνει ότι η παρουσία του βαλερικού αυξάνει τη θερμική σταθερότητα του πολυμερούς Παραγωγή ΡΗΑs από ανανεώσιμες πηγές ενέργειας Τα πολυυδροξυαλκανοϊκά, όπως έχει ήδη αναφερθεί είναι πολυμερή με πολύ καλές ιδιότητες, παρόμοιες με αυτές των πολυπροπυλενίων. Επιπλέον εμφανίζουν τις πού σημαντικές ιδιότητες, της βιοαποικοδομισημότητας και της βιοσυμβατότητας, που τα κάνουν ακόμα πιο ελκυστικά, δεδομένου των δεκάδων τόνων πλαστικών αποβλήτων που παράγονται κάθε χρόνο, καθώς και του τεράστιου πεδίου εφαρμογών που θα μπορούσαν να έχουν στην ιατρική. Τα μοναδικά-ίσως- μειονέκτημα που παρουσιάζουν τα ΡΗΑ είναι το ψηλό κόστος παραγωγής τους καθώς και το ψηλό ενεργειακό φορτίο που απαιτεί η διαδικασία παραγωγής τους. Για το λόγο αυτό οι έρευνες στρέφονται στη χρήση ανανεώσιμων πηγών ενέργειας, βιομηχανικά δηλαδή παραπροϊόντα που θα μπορούσαν να μειώσουν σημαντικά το κόστος των ΡΗΑs. Το 1997 η Gargill, μια γιγαντιαία αγροτική επιχείρηση και η Dow Chemical, μια επιφανής εταιρεία χημικών, ένωσαν τις δυνάμεις τους για να υλοποιήσουν την μετατροπή σακχάρων από καλαμπόκι και άλλα φυτά σε πλαστικό, το πολυλακτίδιο (PLA). Μικροοργανισμοί μετατρέπουν τα σάκχαρα του φυτού σε λακτικό οξύ και σε επόμενο στάδιο συνδέουν χημικά τα μόρια μεταξύ τους κατά τέτοιο τρόπο ώστε να παράγεται πλαστικό με ιδιότητες παρόμοιες με αυτές του τερεφθαλικού πολυαιθυλενίου (ΡΕΤ). Πρόσφατα έρευνες έδειξαν ότι με εισαγωγή γονιδίων, που απομονώθηκαν από βακτήρια και έχουν την ικανότητα να παράγουν πλαστικό σε φυτά, τα ένζυμα που θα παραχθούν θα μετατρέψουν το ακέτυλο-coa (προϊόν που σχηματίζεται

75 κατά τη φωτοσύνθεση) σε ένα τύπο πλαστικού. Έτσι ξεκίνησαν οι εργασίες για την παραγωγή ΡΗΑ μέσω του καλαμποκιού και για να μην υπάρχει ανταγωνισμός της παραγωγής πλαστικού και της παραγωγή τροφής οι έρευνες στόχευσαν στα φύλλα και στο κορμό του καλαμποκιού. Η καλλιέργεια καλαμποκιού θα επέτρεπε στους αγρότες να θερίζουν το καρπό και στη συνέχεια να θερίζουν για δεύτερη φορά τους ξηρούς κορμούς και να συλλέγουν το πλαστικό. Επίσης για την κάλυψη των υψηλών ενεργειακών αναγκών παραγωγής πλαστικού, προτάθηκε η χρήση των ξηρών παραπροϊόντων (βλαστός και φύλλα) για την παραγωγή ηλεκτρικής ενέργειας και ατμού. Αν και το κόστος της διεργασίας μειώνεται σημαντικά και το περιβάλλον προστατεύεται από την έκλυση των μεγάλων ποσοτήτων CO2 που παράγεται κατά την παρασκευή συμβατικών πλαστικών από ορυκτέλαια και άλλα παραπροϊόντα της διύλισης του πετρελαίου, το κόστος παραμένει πολύ ψηλό έτσι ώστε η παραγωγή του πολυμερούς σε ευρεία κλίμακα να είναι αποτρεπτική Παράγοντες που επηρεάζουν την παραγωγή των ΡΗΑs Οι κυριότεροι παράγοντες που επηρεάζουν την βιοσύνθεση των ΡΗΑ στα βακτήρια είναι οι ακόλουθοι: Η πηγή του άνθρακα Η έλλειψη κάποιων θρεπτικών συστατικών (θειικά, φωσφορικά, αμμωνιακά κλπ) Η χρονική διάρκεια της ανάπτυξης των βακτηρίων Εφαρμογές πολυ-υδροξυαλκανοϊκών Τα PHAs είναι πολύ καλοί υποψήφιοι για την αντικατάσταση των κοινών πλαστικών λόγω της βιοαποδομησιμότητας που παρουσιάζουν. Επιπρόσθετα είναι θερμοπλαστικά και ελαστομερή (29), παρουσιάζουν υψηλό βαθμό πολυμερισμού, είναι σε μεγάλο ποσοστό κρυσταλλικά, οπτικά ενεργά και ισοτακτικά, πιεζοηλεκτρικά και αδιάλυτα στο νερό. Τα παραπάνω χαρακτηριστικά καθιστούν τα

76 PHAs σημαντικούς ανταγωνιστές των πολυπροπυλενικών πλαστικών. Δυστυχώς η χρήση των ΡΗΑs ως πολυμερή ευρείας κατανάλωσης με στόχο την αντικατάσταση των πετροχημικών πλαστικών δεν είναι ακόμη εφικτή εξαιτίας του υψηλού κόστους παραγωγής τους. Τα ΡΗΑs χρησιμοποιήθηκαν, αρχικά, για την κατασκευή υμενίων περιτυλίγματος (30). Όμοιες εφαρμογές τους παρατηρούνται στην κατασκευή οικιακών πλαστικών (29). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το συμπολυμερές P(3ΗΒ-3ΗV) εξαιτίας της αυξημένης ελαστικότητάς του σε σχέση με το κρυσταλλικό ΡΗΒ. Η υψηλή κρυσταλλικότητα του ΡΗΒ το καθιστά εύθραυστο σε μηχανική καταπόνηση και μεταχείριση (27). To συμπολυμερές P(3ΗΒ-3ΗV), αντίθετα εμφανίζει υψηλότερη αντοχή και ελαστικότητα εξαιτίας της παρουσίας του ΗV. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες των συμπολυμερών αυτών εξαρτώνται από το ποσοστό του μονομερούς HV στο πολυμερές και η θερμοκρασία τήξης μειώνεται με την αύξηση του ποσοστού αυτού. Οι μηχανικές ιδιότητες εξαρτώνται, επίσης, από το μοριακό βάρος, η αύξηση του οποίου αυξάνει την αντοχή σε μηχανική καταπόνηση. Η εισαγωγή άλλων μονομερών οδηγεί σε διαφορετικές ιδιότητες του βιοπολυμερούς ανάλογα με την επιθυμητή του εφαρμογή (27). Τα πολυ(3-υδροξυαλκανοϊκά) PHAs εμφανίζουν δύο κύριες ενδιαφέρουσες ιδιότητες την βιοαποικοδομησιμότητα και την βιοσυμβατότητα. Δεδομένου ότι το υδροξυβουτυρικό είναι κανονικό συστατικό του αίματος, τα πολυ(3- υδροξυαλκανοϊκά) PHAs είναι βιοσυμβατά και ανεκτά από τον ανθρώπινο οργανισμό και αποικοδομούνται σε ανθρώπινους και ζωικούς ιστούς (27). Αυτή η τελευταία ιδιότητα δίνει στα PHAs φαρμακευτική και κλινική σπουδαιότητα, συμπεριλαμβανομένης της χρήσης σε ελεγχόμενη αργή απελευθέρωση φαρμάκων, αντικατάσταση οστών και κατασκευή χειρουργικών ραμμάτων. Tα ΡΗΑs χρησιμοποιήθηκαν πρώτη φορά για βιοτεχνολογικούς σκοπούς το 1982 όταν η ICI Ltd. παρήγαγε το Biopol, ένα μίγμα ΡΗΒ και ΡΗV που βιοσυντίθετο στον R. eutropha για παραγωγή βιοαποικοδομήσιμων δοχείων, υμενίων και ινών (31). Η Proctor and Gamble κατασκεύασε ένα νέο συμπολυμερές από μονομερή μικρής και μεσαίας αλυσίδας με το όνομα NodaxTM το οποίο χρησιμοποιείται για την κατασκευή πλαστικών και ρητινών με κύριο συστατικό το P(3HB-3HX). Ένας μεγάλος αριθμός διαφορετικών PHAs με νέα μονομερή που ποικίλουν σε σύσταση και μοριακό βάρος, με αποτέλεσμα να εμφανίζουν ποικίλες ιδιότητες, έχουν συντεθεί τα τελευταία χρόνια, για βιοτεχνολογικούς σκοπούς

77 Μεγάλος αριθμός πατεντών για διάφορες εφαρμογές, ιδιαίτερα σε ιατρικό επίπεδο, έχουν εγκριθεί (29). Υπάρχουν επίσης κατοχυρωμένες πολλές πατέντες για τη χρήση συγκεκριμένων ΡΗΑs όπως για παράδειγμα στην κλωστοϋφαντουργία (για την κατασκευή συνθετικών ινών), για την κατασκευή πανών, για την κατασκευή υλικών ευρείας κατανάλωσης όπως σακούλες, μπουκάλια, στυλό, στον τομέα της φωτογραφίας για την παραγωγή φιλμ και στον τομέα των καλλυντικών (σαν υλικά για την παρασκευή κολλοειδών διαλυμάτων στα γαλακτώματα). Τα ΡΗΑs θα μπορούσαν να βρουν και ποικίλες εφαρμογές στην βιομηχανία τροφίμων για την παραγωγή υποκατάστατων σε γαλακτοκομικά προϊόντα ή βελτιωτικών γεύσης και αρώματος των τροφίμων. Επίσης είναι χρήσιμα ως στερεοκανονικά συστατικά, για τη χρήση τους ως χηλικών πρόδρομων για τη χημική σύσταση οπτικών συστατικών. Στον τομέα του περιβάλλοντος μελετάται η δημιουργία καψυλλίων από τα πολυμερή αυτά, που να επιτρέπουν την παρατεταμένη απελευθέρωση του περιεχομένου, π.χ. φυτοφαρμάκων. Το γεγονός ότι το προϊόν αποικοδόμησης του ΡΗΒ είναι το R-3- υδροξυβουτυρικό οξύ, μόριο το οποίο δεν είναι τοξικό για τον ανθρώπινο οργανισμό, επιτρέπει τη χρήση του πολυμερούς αυτού, όπως επίσης και κάποιων συμπολυμερών του με 3-υδροξυβαλερικό οξύ, για ιατρικούς σκοπούς, όπως για βιοαποδομήσιμους μεταφορείς φαρμάκων. Χρησιμοποιείται από την εταιρεία Merk για τη σύνθεση του φαρμάκου Truspot, για τη θεραπεία του γλαυκώματος. Σε συνδυασμό με την (R)-1,3-βουτανοδιόλη χρησιμοποιείται για την παρασκευή β- λακταμών. Χρησιμοποιούνται, επίσης για οστεοσυνθετικά υλικά κατά τη διέγερση της ανάπτυξης των οστών, εξαιτίας των πιεζοηλεκτρικών τους ιδιοτήτων,όπως επίσης και σε περιπτώσεις αντικατάστασης αιμοφόρων αγγείων και σε αντιγηραντικά φάρμακα σε συνδυασμό με ρετινοϊκά παράγωγα και υδροκινόνη. PHAs έχουν χρησιμοποιηθεί για την κατασκευή βιοαποικοδομήσιμων ικριωμάτων βαλβίδων καρδιάς. Έντονη, τέλος, είναι η τάση παραγωγής βιοπολυμερών από διαγονιδιακά φυτά, τόσο για βιοτεχνολογική χρήση τους όσο και για τη μελέτη του φυτικού μεταβολισμού (29-35)

78 Τα ΡΗΑs ως φορείς φαρμακευτικών ουσιών (Drug delivery) Πολλά επιστημονικά εργαστήρια ασχολούνται με ερευνητικά προγράμματα για την ανάπτυξη νέων μεθόδων μεταφοράς φαρμάκων (Drug Delivery) για την θεραπεία ανθρωπίνων ασθενειών. Οι διάφορες μέθοδοι χρησιμοποιούν την επιστήμη των υλικών και ιδιαίτερα την ανάπτυξη βιο-αποικοδομήσιμων πολυμερών τα οποία θα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την χορηγία των φαρμάκων και την εστίαση της δράσης τους στα κύτταρα ή στους ιστούς που χρειάζονται θεραπεία. Με την εστιασμένη μεταφορά φαρμάκων το φάρμακο μεταφέρεται στην περιοχή της ασθένειας και όχι σε ολόκληρο το σώμα, ώστε η δράση/απόδοση του φαρμάκου μεγαλώνει και οι παρενέργειες ελαχιστοποιούνται ή και εξαφανίζονται. Η ερευνητική πρόκληση είναι να βρεθεί ο συνδυασμός φαρμάκου-υλικού ο οποίος θα είναι αποτελεσματικός και ασφαλής για κάθε ασθένεια. Για την επιτυχή συνεργασία μεταξύ των φαρμάκων και των νέων συσκευών είναι απαραίτητη όχι μόνο η γνώση της δομής των υλικών αλλά και η φυσιολογική διεργασία που συσχετίζεται με την μεταφορά, τον μεταβολισμό και την δράση της φαρμακευτικής ουσίας. Τα περισσότερα ερευνητικά εργαστήρια δίνουν ιδιαίτερη έμφαση πρώτον στον σχεδιασμό μοριακών φαρμάκων και συστημάτων μεταφοράς τους και δεύτερο στον βιολογικό μεταβολισμό των φαρμάκων και την κατανομή τους στους ιστούς. Η πρόσφατη τεχνολογία χρησιμοποιεί μικροσκοπικούς μεταφορείς φαρμάκων κατασκευασμένους κυρίως από πολυμερές. Τέτοιου είδους υλικά μπορούν να κατασκευαστούν σε σχήμα σφαίρας με διαμέτρους μέχρι και m. Με τον τρόπο αυτό κατορθώνεται η μεταφορά φαρμάκων ακόμα και στα μικρότερα τριχοειδή αγγεία του σώματος. Τα νανοσφαιρίδια αυτά σχεδιάζονται έτσι ώστε να ταξιδεύουν σε συγκεκριμένα μέρη του σώματος, να ελευθερώνουν το φορτίο τους σε φάρμακο και στη συνέχεια να βιοαποικοδομούνται. Τα παραπροϊόντα τις αποικοδόμησης τους δεν είναι τοξικά και θα αποβάλλονται από το σώμα. Η ανάπτυξη στην επιστήμη των πολυμερών είχε μεγάλη επίδραση στην τεχνολογία του Drug Delivery. Είναι δυνατόν πλέον να κατασκευάζονται βιοσυμβατά και βιοαποικοδομήσιμα πολυμερή τα οποία θα ελευθερώνουν τη φαρμακευτική ουσία ακόμα και με ελεγχόμενο τρόπο. Για ένα συγκεκριμένο πολυμερές, όσο χαμηλότερο το μοριακό βάρος τόσο γρηγορότερα αυτό θα

79 διασπαστεί μέσα στο σώμα και έτσι τόσο γρηγορότερο το μεταφερόμενο φάρμακο απελευθερώνεται. Η κατασκευή τέτοιων νανοσφαιδίων είναι μια περίπλοκη διαδικασία και περιλαμβάνει τη χρήση των μορίων που αυτο-συγκεντρώνονται κατά τη διάρκεια μιας χημικής διαδικασίας και τη χρήση των αυτο-συγκεντρωμένων (self-assemble) σφαιρών ως μοριακή "φόρμα" (mould) στην οποία το αντιδραστικό μονομερές διασκορπίζεται και πολυμερίζεται για να διαμορφώσει τις στερεές σφαίρες. Τα PHA χρησιμοποιούνται ως κατασκευαστικά υλικά για φορείς μεταφοράς φαρμάκων (drug delivery vehicles), για πάνω από μια δεκαετία. Οι μελέτες για συστήματα μεταφοράς φαρμάκων έχουν γίνει με χρήση PHB και PHBV τα οποία είχαν κατεργαστεί έτσι ώστε να πάρουν τη μορφή μικροσφαιριδίων, μικροκάψουλων και ράβδων (28). Εικόνα Εικόνες διαφόρων συστημάτων μεταφοράς φαρμάκων από PHBV. Σε μία από τις αρχικές μελέτες, μικροκάψουλες από PHB και PHBV παρασκευάστηκαν με την μέθοδο εξάτμισης διαλύτη (solvent evaporation technique), στις οποίες προστέθηκε 2,7-διχλοροφθοροσκεΐνη ή ένα σύμπλοκο πολυφοσφορικών-ca +2 εντός των μεμβρανών τους. Η συμπεριφορά απελευθέρωσης του φαρμάκου και η απόδοση της ενθυλάκωσης επηρεάζονταν από τον τύπο του πολυμερούς (28). Η συγκεκριμένη περιοχή μέσα στο σώμα στην οποία τα νανοσωματίδια θα ταξιδέψουν ελέγχεται από τη χημεία επιφάνειας (surface chemistry) των σωματιδίων. Τα μόρια μπορούν να δεθούν στην επιφάνεια των σωματιδίων, που θα προκαλέσουν την εκλεκτική λήψη, από τα διάφορα όργανα μέσα στο σώμα

80 Εμφυτεύσιμες ενδοπροσθέσεις (stents) επικαλυπτόμενες με φάρμακα προς ελεγχόμενη αποδέσμευση Stent, ονομάζεται το βιοσυμβατό εμφύτευμα σε σχήμα διάτρητου σωλήνα, που χρησιμοποιείται για τη διάνοιξη φραγμένων αιμοφόρων αγγείων και την αποκατάσταση της ομαλής ροής του αίματος. Εικόνα Μεταλλικό stent(αριστερα), Διαδικασία τοποθέτησης stent σε φραγμένο αιμοφόρο αγγείο(δεξιά) Τα stent αρχικά έχουν πολύ μικρή διάμετρο και εισέρχονται στο αιμοφόρο αγγείο και με τη βοήθεια καθετήρα (balloon catheter) κινείται στο τμήμα όπου υπάρχει η παρεμπόδιση. Όταν το μπαλόνι του καθετήρα διογκωθεί, το stent διαστέλλεται και εφαρμόζει στο αγγείο διαμορφώνοντας ένα ικρίωμα. με αποτέλεσμα να το κρατά ανοικτό. Τα υλικά κατασκευής των stents είναι κυρίως μέταλλα (Τιτάνιο, Λευκόχρυσος, Ανοξείδωτος Χάλυβας). Τα τελευταία χρόνια τα μεταλλικά υλικά κατασκευής των stents, τείνουν να αντικατασταθούν από πολυμερικά βιοσυμβατά υλικά. Τα πολυμερικά stents θα μπορούσαν να επικαλυφθούν από φαρμακευτικές ουσίες οι οποίες θα απελευθερώνονται με πολύ βραδύ ρυθμό, με τη βοήθεια της ροής του αίματος, και οποίες θα βοηθούν τη διάνοιξη και τη διατήρηση της καλής κατάστασης των αρτηριών. Στο ινστιτούτο ECRI-(Emergency Care Research Institute) (Plymouth Meeting, Pa., Sept. 10 /PR Newswire), μελετήθηκαν οι επιδράσεις επικαλυμμένων Stents με Sirolimus (Sirolimus-eluting -SES) και Paclitaxe (Paclitaxel-eluting-PES) στην αντιμετώπιση της στεφανιαίας νόσου με εκπληκτικά αποτελέσματα. Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι τα drug eluted stents με βάση πολυμερή μειώνουν το ποσοστό επαναστένωσης (restenosis) των αγγείων μέχρι και 64 φορές σε σύγκριση με τα μεταλλικά stents. Συγκεκριμένα οι μελέτες έδειξαν ότι οι πιθανότητες για επαναστένωση των αγγείων με χρήση SES ήταν

81 εώς 64 φορές λιγότερες σε σύγκριση με τα μεταλλικά Stents ενώ οι πιθανότητες από τη χρήση PES ήταν περίπου 8 φορές λιγότερες Εφαρμογές στη μηχανική ιστών Η μηχανική ιστών είναι ένας ενδιαφέρον κλάδος των βιοϋλικών και έχει οριστεί από τους δύο πρωτοπόρους του κλάδου ως ένα διεπιστημονικό πεδίο το οποίο εφαρμόζει τις αρχές της μηχανικής και των βιολογικών επιστημών (life sciences), για την ανάπτυξη υποκατάστατων που θα αντικαθιστούν, διατηρούν ή βελτιώνουν την λειτουργία των ιστών. Για την αντικατάσταση, υποστήριξη ή αποκατάσταση κατεστραμμένων ιστών χρησιμοποιούνται συγκεκριμένοι συνδυασμοί κυττάρων, ικριωμάτων και χημικών ή βιολογικών σημάτων. Η πηγή των κυττάρων μπορεί να είναι ο ίδιος ο ασθενής ή ένας δότης και τα κύτταρα μπορεί να είναι βλαστικά μη διαφοροποιημένα κύτταρα με τη δυνατότητα να διαφοροποιηθούν σε διάφορους τύπους κυττάρων ή να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα του ιστού στόχου. Για την μηχανική ιστών ο φορέας των κυττάρων, γνωστός και ως ικρίωμα, θα πρέπει να είναι ταυτόχρονα βιοσυμβατός και βιοαποδομήσιμος. Η επιφάνεια του φορέα θα πρέπει να έχει κατάλληλες φυσικές και χημικές ιδιότητες ώστε να μπορέσουν τα κύτταρα να δεσμευτούν, να αναπτυχθούν και να οργανωθούν με τον επιθυμητό τρόπο. Τα ικριώματα θα πρέπει επίσης να έχουν υψηλό πορώδες ώστε να παρέχουν τον απαιτούμενο χώρο στα κύτταρα για προσκόλληση και για ανάπτυξη καθώς και για να επιτρέπουν τη μεταφορά θρεπτικών συστατικών και αποβλήτων (28). Τα πολυμερή έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως στο σχεδιασμό ικριωμάτων για μηχανική ιστών καθώς έχουν τα χαρακτηριστικά που προαναφέρθηκαν. Ένα από τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα πολυμερή είναι το βακτηριακής προέλευσης PHA. Αν και το PHB και το PHBV έχουν αναφερθεί ότι προκαλούν παρατεταμένη και χρόνια φλεγμονική αντίδραση (induce prolonged acute and chronic inflammatory responses) σε in vivo μελέτες, άλλες μελέτες έδειξαν ότι οι αντιδράσεις αυτές τελικά υποχωρούν. Η ένταση των κυτοτοξικών και φλεγμονικών

82 αντιδράσεων σε in vitro και in vivo εφαρμογές του poly(3hb-co-3hv), διαφέρουν ανάλογα με την αναλογία του υδροξυβαλερικού στο PHA. Ξέχωρα από την χημική σύσταση του πολυμερούς, μεγάλο ρόλο παίζει και η καθαρότητα του. Έχει αναφερθεί ότι καθαρό P(3HB) και P(3HB-co-3HV) που περιέχει μέχρι 28 mol% HV μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την in vitro καλλιέργεια ινοβλαστών (fibroblasts), ενδοθηλιακών κυττάρων και hepatocytes. Ακόμα το προϊόν αποδόμησης του PHB, το R-3-υδροξυβουτιρικό οξύ, αποτελεί ένα έμφυτο συστατικό του αίματος σε συγκεντρώσεις μεταξύ 0.3 και 1.3 mm. Επιπλέον το PHB είναι ένα υλικό αποδεκτό ως βιοσυμβατό (28). Στις εφαρμογές της μηχανικής ιστών, οι επιφάνειες θα πρέπει να προωθούν την προσκόλληση των κυττάρων και εν συνεχεία την ανάπτυξη του ιστού. Για τη βελτίωση της κυτταρικής προσκόλλησης, οι ιδιότητες της επιφάνειας μπορούν να τροποποιηθούν με αλλαγή των λειτουργικών ομάδων, του φορτίου, της υδροφιλικότητας και της διαβροχής χωρίς ωστόσο να μεταβάλλονται οι μηχανικές και θερμικές ιδιότητες του πολυμερούς. Για τη βελτίωση της προσκόλλησης και της ανάπτυξης των κυττάρων καθώς και την ελάττωση των in vivo φλεγμονικών αντιδράσεων, η επιφάνεια των PHA έχει τροποποιηθεί με κατεργασία πλάσματος (οξυγόνου, αζώτου), επεξεργασία ph και με επικάλυψη πρωτεϊνών. Η γεωμετρία του ικριώματος παίζει καθοριστικό ρόλο στην απόδοσή του. Τα ικριώματα πρέπει να είναι πορώδη και να ελαττώνουν τις αποστάσεις διάχυσης αερίων και θρεπτικών συστατικών κάτω από τα μm. Τα PHA μπορούν να κατασκευαστούν σαν σπόγγοι, υμένια, ίνες, σωλήνες κ.α. με χρήση συμβατικών μεθόδων επεξεργασίας πολυμερών όπως solvent casting, fiber spinning, foaming και melt processing. Ανάλογα με την εφαρμογή προτιμάται και η ανάλογη τεχνική. Πολλές φορές τα PHA αναμιγνύονται με άλλα πολυμερή ώστε να τροποποιηθούν οι ιδιότητες του ικριώματος (28)

83 Εικόνα Εικόνες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διαφόρων μορφών PHBV. Σπόγγος(αριστερά),μικροδιαμορφομένο υμένιο (micropatterned film) (κέντρο), electrospun ίνες (δεξιά) (28) Εφαρμογές στην ελεγχόμενη απελευθέρωση φυτοφαρμάκων Μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις, όσων αφορά την οικολογία και την βιομηχανική βιωσιμότητα, είναι η ανάπτυξη νέων εννοιών και εργαλείων για περιβαλλοντικές εφαρμογές που θα μπορούν να καλύψουν τις κοινωνικές ανησυχίες για την απελευθέρωση στο περιβάλλον γενετικά τροποποιημένων οργανισμών. Μία από τις νέες αυτές μεθόδους χρησιμοποιεί κόκκους PHA για την απελευθέρωση στο περιβάλλον ενεργών πρωτεϊνών (34). Οι κόκκοι του PHA περιέχουν στην επιφάνειά τους πολυεστέρες καλυμμένους με φωσφολιπίδια και πρωτεΐνες που σχετίζονται με τους κόκκους (granule-associated proteins, GAP). Οι φασίνες (phasins) είναι το κύριο συστατικό των GAP και χρησιμοποιούνται για την σταθεροποίηση των κόκκων PHA, καθώς δημιουργούν μία υδρόφιλη διεπιφάνεια (interphase) ανάμεσα στο κυτταρόπλασμα και τον υδρόφοβο πυρήνα του πολυμερούς. Χρησιμοποιώντας τη φυσιολογική λειτουργία αυτών των πρωτεϊνών, αναπτύχθηκε μια νέα τεχνική ανασυνδυασμού [fusion tag system (named BioF tag)], που επιτρέπει την κατασκευή διάφορων χειμερικών και πλήρως λειτουργικών πρωτεϊνών, οι οποίες καθηλώνονται in vivo σε κόκκους PHA. Οι πρωτεΐνες αυτές συγκαταβυθίζονται με τους κόκκους σε μία απλή διεργασία φυγοκέντρισης. Η BioF tag κατασκευάζεται με τη χρήση Ν-τελικών περιοχών της συνθάσης PhaF, που περιέχεται σε κόκκους PHA του μικροοργανισμού Pseudomonas putida Gpo1, και

84 συμπεριφέρεται σαν λειτουργική περιοχή (functional domain) ικανή να δεσμεύεται σε κόκκους PHA (34). Με τη μέθοδο αυτή μπορεί να γίνει η ελεγχόμενη απελευθέρωση ενεργών πολυπεπτιδίων, όπως της τοξίνης Cry του Bacillus thuringiensis (ΒΤ), στο περιβάλλον. Η συγκεκριμένη τοξίνη αποτελεί ένα από τα πιο διαδεδομένα παρασιτοκτόνα, καθώς η ΒΤ σπόριο-κρυσταλλικές (spore crystal) πρωτεΐνες χρησιμοποιούνται ως εναλλακτικές των συνθετικών χημικών παρασιτοκτόνων που χρησιμοποιούνται στην εμπορική αγροτική καλλιέργεια, στο δασικό έλεγχο και τον έλεγχο των κουνουπιών. Ο Bacillus thuringiensis αποτελεί την κύρια πηγή γονιδίων Cry, που χρησιμοποιούνται για τη διαγονιδιακή έκφραση πρωτεϊνών σε φυτά με σκοπό την αντοχή τους σε παράσιτα (34) Επιφανειακή τροποποίηση πολυμερών Ο σκοπός της επιφανειακής τροποποίησης των πολυμερικών επιφανειών είναι η τροποποίηση του επιφανειακού στρώματος του πολυμερούς εισάγοντας λειτουργικές ομάδες στην επιφάνεια, αυξάνοντας έτσι τη διαβροχή του υλικού, τη στεγανότητα του, την ικανότητα εκτύπωσης του, την αντίστασή του στο στίλβωμα ή την ικανότητα πρόσφυσης του πολυμερούς σε άλλα υλικά. Η επιφανειακή τροποποίηση χρησιμοποιείται και σε περιπτώσεις που είναι επιθυμητή η μετάδοση αντιμικροβιακών ιδιοτήτων στην πολυμερική επιφάνεια (35). Επιφανειακή τροποποίηση πολυμερών μπορεί να γίνει και με τη χρήση βιομορίων, όπως ινοδεκτίνης, κολλαγόνου, ινσουλίνης κ.α., με σκοπό την ενίσχυση της προσκόλλησης και του πολλαπλασιασμού κυττάρων πάνω στην επιφάνεια. Η καθήλωση τέτοιων βιομορίων, όπως πρωτεϊνών που ενεργοποιούν μηχανισμούς καθήλωσης κυττάρων, έχει γίνει σε πολυουρεθάνες, οι οποίες είχαν τροποποιηθεί αρχικά με αμμωνία και στη συνέχεια με μία αντίδραση σύζευξης με ινσουλίνη με σκοπό την ενίσχυση της ανάπτυξης ενδοθηλιακών κυττάρων. Η συμπεριφορά των κυττάρων επηρεάζεται από την ποσότητα της καθηλωμένης πρωτεΐνης καθώς και από τη χρήση του βραχίονα (spacer arm), που συνδέει την πρωτεΐνη με το πολυμερές. Η επιφανειακή τροποποίηση των πολυυδροξυαλκανοϊκών οξέων και συγκεκριμένα των PHB και PHBV επιτυγχάνεται με τη χρήση πλάσματος, με τη

85 χρήση ακτινοβολίας ακτινών γ, με ενοφθαλμισμό με ακρυλικό οξύ, με ενοφθαλμισμό με οξειδωτικά αντιδραστήρια καθώς και με ανάμιξή τους με πολυκαπρολακτόνη, χιτίνη, κυτοζάνη (chitosan) κ.α. (37) Επιφανειακή τροποποίηση PHA με πλάσμα οξυγόνου Η τεχνική πλάσματος τύπου εκκένωσης λάμψης (plasma glow discharge technique) ή πλάσματος οξυγόνου, είναι μια μέθοδος αύξησης της επιφανειακής συγκέντρωσης μίας περιοχής καθήλωσης. Η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί στην επιφανειακή τροποποίηση πολυμερών με σκοπό την τοποθέτηση λειτουργικών ομάδων σε αυτές. Συγκεκριμένα, υμένια PHA επεξεργάστηκαν χημικά με πλάσμα τύπου εκκένωσης λάμψης με σκοπό τη δημιουργία περοξυ- ομάδων στην επιφάνεια τους. Στη συνέχεια οι περοξυ- ομάδες χρησιμοποιήθηκαν ως εκκινητές για τον πολυμερισμό ενοφθαλμισμού του ακρυλικού οξέος. Μετά τον ενοφθαλμισμό του ακρυλικού οξέος, πραγματοποιήθηκε η σύζευξή του με πολυαιθυλενοξείδιο. Το πολυαιθυλενοξείδιο περιέχει μία πρωτοταγή αμίνη και στις δύο άκρες της αλυσίδας του και ενώνεται με την καρβοξυλική ομάδα του ακρυλικού οξέος. Τέλος, γίνεται η αντίδραση με ινσουλίνη και παράγεται πολυυδροξυαλκανοϊκό οξύ με καθηλωμένη ινσουλίνη (PHA-P-In) (37) Επιφανειακή τροποποίηση PHA με χρήση όζοντος Αν και ο ενοφθαλμισμός με χρήση όζοντος έχει εφαρμοστεί σε πολυμερή όπως η πολυουρεθάνη, η σιλικόνη, το πολυ( μεθυλ-μεθακρυλικό) (PMMA), το πολυαιθυλένιο, το PET και το Teflon, η συγκεκριμένη τεχνική έχει χρησιμοποιηθεί ελάχιστα σε πολυμερή όπως το PHB και το PHBV. Συγκεκριμένα, έγινε κατεργασία με όζον σε μεμβράνες PHB και PHBV, με σκοπό τον ενοφθαλμισμό ακρυλικού οξέος, ο οποίος ακολουθήθηκε από

86 εστεροποίηση χιτοζάνης (Chitosan, CS) και χιτοολιγοσακχαριτών (chitooligosaccharides, COS) (38) Άλλες εφαρμογές Η βιοαποικοδομησιμότητα των πολυμερών τα καθιστά πολύ καλούς υποψήφιους για την αντικατάσταση των συμβατικών πλαστικών σε πολλές βιομηχανικές εφαρμογές. Στον τομέα του περιβάλλοντος μελετάται η χρήση των ΡΗΑs στη δημιουργία καψυλλίων που θα επιτρέπουν την παρατεταμένη απελευθέρωση του περιεχομένου (μυκητοκτόνα, λιπάσματα κλπ). Μελέτες γίνονται επίσης για την χρήση τους στον τομέα των τροφίμων (σαν συστατικά που παράγουν γεύση και άρωμα ή σαν υλικά συσκευασίας) στον τομέα των καλλυντικών (σαν υλικά για την παρασκευή κολλοειδών διαλυμάτων στα γαλακτώματα), στον τομέα των υφασμάτων (συνθετικές ίνες) ή ακόμα στον τομέα της φωτογραφίας για την παραγωγή φιλμ. Επίσης στον τομέα της συσκευασίας για την παραγωγή ευρείας κατανάλωσης πλαστικών όπως σακούλες, μπουκάλια, στυλό, κλπ. Τέλος, στον τομέα της βιοτεχνολογίας έχει προταθεί μεγάλη παραγωγή βιοπολυμερών και με λογικό κόστος σε διαγονιδιακά φυτά., φυτά που φέρουν βιοσυνθετικά γονίδια, ή γενετικά ανασυνδυασμένα φυτά

87 1.4.Αλγινικό οξύ Το αλγινικό οξύ είναι ένας πολυσακχαρίτης, υψηλής μοριακής μάζας που παράγεται από ένα είδος θαλάσιου φύκους (51). Το αλγινικό οξύ επίσης παράγεται εξωκυττάρια από τα βακτήρια Pseudomonas aeruginosa και Azetobacter Vinilandi. (52). O Edward Stanford ανακάλυψε το αλγινικό οξύ το 1883 και η εμπορική του πώληση ξεκίνησε το 1927 και η ζήτηση του έχει φτάσει τους τόνους το χρόνο σε όλον τον κόσμο. Από αυτούς το 30% χρησιμοποιείται από τη βιομηχανία τροφίμων και το υπόλοιπο 70% χρησιμοποιείται για βιομηχανικές, φαρμακευτικές και οδοντιατρικές εφαρμογές (53). Η λειτουργία του αλγινικού οξέος στα φύκια είναι κυρίως δομική, με το gel να βρίσκεται μέσα στη μεμβράνη του κυττάρου και μεταξύ των κυττάρων παρέχοντας την κατάλληλη ισχύ και ελαστικότητα που απαιτείται ώστε να αντέχουν στη δύναμη του νερού, μέσα στο οποίο αναπτύσσονται τα φύκια (54) Δομή αλγινικού οξέος Το αλγινικό οξύ είναι ένας γραμμικός ετεροπολυσακχαρίτης, που αποτελείται από τα μονομερή β-d-1,4 μαννουρονικό οξύ (G) και α-l-γουλουρονικό οξύ (Μ) σε διάφορες αναλογίες, τάξη και μοριακό βάρος. Η δομή του αλγινικού οξέος συνίσταται από ομοπολυμερικές περιοχές και από ετεροπολυμερικές περιοχές. Εικόνα Δομή του αλγινικού οξέος. Το αλγινικό οξύ κυκλοφορεί στο εμπόριο κυρίως ως άλας με νάτριο. Όταν έρχεται σε επαφή με δισθενή κατιόντα (Ca ++, Ba ++, Str ++ ) αντικαθίστανται τα κατιόντα Na με τα δισθενή κατιόντα οδηγώντας έτσι στον ιονοτροπικό σχηματισμό πηκτής. Συγκεκριμένα ο σχηματισμός της πηκτής οφείλεται στη σύνδεση των

88 καρβοξυλικών ομάδων των γουλουρινικών μονομερών με τα δισθενή κατιόντα και το πλέγμα που προκύπτει είναι τύπου egg box. Εικόνα1.29. Πολυμερισμός αλγινικού οξέος παρουσία Ca ++ και σχηματισμός πηκτής τύπου egg box. Ο πιο διαδεδομένος τρόπος πολυμερισμού του αλγινικού οξέος είναι με κατιόντα ασβεστίου. Η καθήλωση των κυττάρων ή ενζύμων σε σφαιρίδια Ca ++ βρίσκει πολλές εφαρμογές: 1. στην καθήλωση κυττάρων ή ενζύμων για βιοαντιδραστήρες 2. στην καθήλωση φυτικών πρωτοπλαστών για μικροαναπαραγωγή 3. στην καθήλωση υβριδικών κυττάρων για παραγωγή μονόκλωνων αντισωμάτων 4. στην μεταφορά θρεπτικών συστατικών και φαρμάκων Εγκλωβισμός ενζύμων σε αλγινικό οξύ Η πιο διαδεδομένη τεχνική καθήλωσης μικροοργανισμών ή ενζύμων είναι ο εγκλωβισμός σε πηκτή. Το κατεξοχήν υλικό επιλογής είναι το αλγινικό οξύ. Το κύριο πλεονέκτημα της μεθόδου είναι το γεγονός ότι είναι πολύ ήπια για τα κύτταρα και

89 τα ένζυμα σε αντίθεση με άλλες τεχνικές που είτε είναι τοξικές είτε οι συνθήκες καθήλωσης είναι ακραίες. Το αλγινικό οξύ είναι φυσικό βιοπολυμερές με αποτέλεσμα να είναι βιοσυμβατό και βιοαποικοδομήσιμο. Επίσης είναι μια τεχνική απλή (ενός σταδίου), χαμηλού κόστους και ευέλικτη. Μελέτες έχουν δείξει ότι με την καθήλωση ενός μικροοργανισμού ή ενζύμου σε σφαιρίδια αλγινικού οξέος παρατηρείται: 1. μεγάλη αύξηση στην ενζυμική δράση 2. ευκολότερος χειρισμός της βιομάζας 3. αύξηση διάρκειας ζωής των καθηλωμένων μικροοργανισμών Επιπλέον το πορώδες του πολυμερικού πλέγματος επιτρέπει αφενός την καθήλωση των κυττάρων αφετέρου την δίοδο των θρεπτικών συστατικών και των πρωτεϊνών. Το κύριο μειονέκτημα της καθήλωσης σε σφαιρίδια Ca ++ -αλγινικού οξέος είναι η χημική αστάθεια του πλέγματος έναντι χηλικών ενώσεων (π.χ. κιτρικά και φωσφορικά ιόντα) και αντιπηκτικών κατιόντων (Na +, Mg + ). Ωστόσο η σταθερότητα του πλέγματος αυξάνεται με τη χρήση ως κατιόντων πολυμερισμού τα κατιόντα Ba ++ και Sr ++, τα οποία έχουν μεγαλύτερη αγχιστεία για το αλγινικό οξύ σε σχέση με το ασβέστιο και επιπλέον το πλέγμα που προκύπτει έχει πολύ καλύτερη μηχανική σταθερότητα Εφαρμογές Τα τελευταία χρόνια η ιατρική και φαρμακευτική βιομηχανία έδειξε πολύ μεγάλο εμδιαφέρον για τα βιοπολυμερή γενικότερα και ειδικότερα και το αλγινικό οξύ. Ο λόγος αυτού του αυξημένου ενδιαφέροντος είναι η χρηστικότητά τους σε συγκεκριμένες εφαρμογές, καθώς ενισχύει τη θεραπεία για την οισοφαγική παλινδρόμηση και δημιουργεί ίνες ασβεστίου για δερματολογική χρήση και επούλωση πληγών. Επιπροσθέτως, το αλγινικό οξύ διασπάται φυσικά και αποτελεί ένα ελκυστικό υλικό για τη δημιουργία δισκίων καθώς μπορεί να απελευθερώσει ελεγχόμενα ουσίες που έχουν εγκλωβιστεί στο εσωτερικό του. Πλεονεκτεί έναντι των συνθετικών πολυμερών καθώς δημιουργεί υδροτζελ κάτω από συνθήκες ήπιου ph και θερμοκρασίας και γενικότερα αναφέρεται ως μη τοξικό, βιοσυμβατό και

90 βιοαποικοδομήσιμο, αρκετά φθηνό και σε αφθονία στη φύση. Επίσης το αλγινικό οξύ ανταποκρίνεται στη σημαντική προϋπόθεση της δυνατότητας αποστείρωσης και αποθήκευσης. Όλα αυτά τα πλεονεκτήματα κάνουν το αλγινικό οξύ πολύ χρήσιμο για εφαρμογές στον τομέα της βιοϊατρικης, ειδικά για την μεταφορά και απελευθέρωση φαρμάκων και άλλων βιολογικά ενεργών συστατικών και για την ενθυλάκωση κυττάρων. Επίσης το αλγινικό ασβέστιο είναι ένας φυσικός αιμοστάτης, γι αυτό επιθέματα που περιέχουν αλγινικό ασβέστιο χρησιμοποιούνται στην επούλωση πληγών που αιμοραγούν. Το αλγινικό οξύ χρησιμοποιήθηκε επιτυχώς ως δίκτυο που εγκλωβίζει και μεταφέρει βιολογικούς φορείς όπως φάρμακα ή πρωτεΐνες. Πιο συγκεκριμένα οι πρωτεΐνες μπορούν να εγκλωβιστούν και να ελευθερωθούν από δίκτυα αλγινικού οξέος χωρίς να χάσουν την βιολογική τους δράση, χάρη στην ήπια διαδικασία παρασκευής της πηκτής του. Σε φαρμακευτικές εφαρμογές, το gel αλγινικού οξέος μπορεί να κατασκευαστεί πριν τη χρήση, ή μπορεί να σχηματιστεί αυθόρμητα in situ σε φυσιολογικά υγρά περιβάλλοντα χαμηλού ph και ιόντων ασβεστίου που υπάρχουν στο σημείο της εφαρμογής. Η τεχνική της μικρο-ενθυλάκωσης αναπτύχθηκε για την εκ του στόματος μεταφορά πρωτεϊνών, αφού αποδιατάσσονται πολύ γρήγορα στο εχθρικό περιβάλλον του στομάχου. Η πρωτεΐνη ενθυλακώνεται στον πυρήνα του υλικού, το οποίο με τη σειρά του επικαλύπτεται με μια βιοσυμβατή ημιδιαπερατή μεμβράνη, η οποία ελέγχει το ρυθμό απελευθέρωσης της πρωτεΐνης ενώ την προστατεύει από την αποδιάταξη. Μίκρο και νάνο-κάψουλες μπορούν να δημιουργηθούν από αλγινικό οξύ. Μικρο-κάψουλες συνήθως μικρότερες από 200 μm παρασκευάζονται σταλάζοντας το υδατικό διάλυμα αλγινικού οξέος μέσα σε διάλυμα (Ph<4) χλωριούχου ασβεστίου (CaCl2) (54)

91 1.5 Καθήλωση ενζύμων και κυττάρων Ως καθήλωση ενζύμου ορίζεται το σύνολο εκείνο των διεργασιών που ακολουθείται για τον εγκλωβισμό ενός ενζύμου σε ένα συγκεκριμένο υλικό. Τα υδρόφιλα πολυμερή (π.χ. ακρυλαμίδιο, κυτταρίνη) αποτελούν πολύ συνηθισμένα υλικά για την καθήλωση των ενζύμων. Η βιομηχανική καθήλωση των ενζύμων ξεκίνησε από τη δεκαετία του 1970 και από τότε έχει συντελεστεί αλματώδης πρόοδος στον τομέα αυτόν, γιατί έγινε αντιληπτό ότι πολλές in vitro ιδιότητες των ενζύμων διατηρούνται και στη καθηλωμένη μορφή, ότι μπορούν να βελτιωθούν οι φυσικοχημικές αντιδράσεις στις οποίες συμμετέχει το καθηλωμένο ένζυμο, ότι μπορούν να βελτιωθούν ορισμένες ιδιότητες του ενζύμου στην καθηλωμένη μορφή και τέλος, επειδή τα καθηλωμένα ένζυμα χρησιμοποιούνται σε έναν ολοένα αυξανόμενο αριθμό βιοτεχνολογικών εφαρμογών (5) Μέθοδοι και εφαρμογές καθήλωσης Με τον όρο καθήλωση, ορίζεται η φυσική έγκλειση/περιορισμός ή εντόπιση άθικτων κυττάρων σε μια συγκεκριμένη κενή περιοχή. Τα κύτταρα μετά την καθήλωση διατηρούν την επιθυμητή καταλυτική δραστηριότητα. Ουσιαστικά η καθήλωση μικροοργανισμών μιμείται τη φύση καθώς υπάρχουν πολλά παραδείγματα μικροοργανισμών που μεγαλώνουν σε επιφάνειες ή μέσα σε φυσικές δομές. Ο κύριος λόγος που προτιμάται η χρήση καθηλωμένων κυττάρων έναντι ενζύμων είναι, η αποφυγή των σταδίων εκχύλησης και καθαρισμού των ενζύμων και των συνεπειών που έχουν τα στάδια αυτά στη δραστικότητα, στη σταθερότητα αλλά και στο κόστος των ενζύμων. Πολλές βιοτεχνολογικές διεργασίες έχουν βελτιωθεί με τη χρήση καθηλωμένων μικροοργανισμών σε σχέση με τους ελεύθερους. Χρησιμοποιούνται σε βιομηχανική κλίμακα για βιοσυνθέσεις και βιομετατροπές παράγοντας μία μεγάλη γκάμα προιόντων που κυμαίνεται από πρωτογενείς μεταβολίτες μέχρι βιομόρια υψηλής αξίας. Σε γενικές γραμμές οι καθηλωμένοι μικροοργανισμοί εφαρμόζονται στα ακόλουθα πεδία:

92 Στην κατεργασία οικιακών και βιομηχανικών αποβλήτων Στη ζυθοποιεία και την οινοποιεία με την παραγωγή ξυδιού, αρωμάτων κ.α. Στη γαλακτοβιομηχανία με συνεχές ενοφθάλμισμα του γάλακτος, με υδρόλυση της λακτόζης κ.α. Ως βιοαισθητήρες για περιβαλλοντική παρακολούθηση, ηλεκτροχημική και οπτική, για ανάλυση της ποιότητας τροφίμων και για τον έλεγχο διεργασιών ζύμωσης Οι περιβαλλοντικές εφαρμογές διευρύνονται σε διάφορους τομείς, όπως στην επεξεργασία του νερού (απομάκρυνση άνθρακα, αζώτου, βαρέων μετάλλων κ.α.), στη βιολίπανση, στη βιοθεραπεία και φυσικά στον τομέα των εναλλακτικών καυσίμων με την παραγωγή υδρογόνου, μεθανίου, αιθανόλης και βιοκαυσίμων. Μελέτες έχουν δείξει ότι η συμπεριφορά των καθηλωμένων μικροοργανισμών και των κυττάρων, είναι διαφορετική από αυτήν των ελεύθερων. Συγκεκριμένα κατά την καθήλωση λαμβάνουν χώρα μορφολογικές και φυσιολογικές αλλαγές των μικροοργανισμών και των κυττάρων, αλλαγές που δεν έχουν ερμηνευτεί πλήρως από τους επιστήμονες. Μερικά από τα οφέλη της χρήσης καθηλωμένων μικροοργανισμών είναι η αύξηση της διάρκειας των μεταβολικών λειτουργιών, η επιμήκυνση των κύκλων ζωής (life cycle), αύξηση της αντίστασης σε τοξικά συστατικά, η μείωση της ανάπτυξης των μικροοργανισμών καθώς και του σχηματισμού βιομάζας, η αύξηση της παραγωγής μεταβολικών προιόντων, ο σχηματισμός ιδιαίτερων προϊόντων, η δυνατότητα αναγέννησης της βιοκαταλυτικής δραστηριότητας των καθηλωμένων κυττάρων, ο ευκολότερος χειρισμός των διαδικασιών ζύμωσης (5)

93 Η καθήλωση των μικροοργανισμών και των κυττάρων γίνεται με τέσσερις μεθόδους. Η μέθοδος που θα επιλεγεί τελικά, εξαρτάται από το είδος του μικροοργανισμού και τη χρήση του. Η καθήλωση λοιπόν ενός μικροοργανισμού ή ενός κυττάρου μπορεί να γίνει με τους εξής τρόπους: Α. Προσρόφηση. Η καθήλωση με προσρόφηση σε μια επιφάνεια αποτελεί μια από τις πιο απλές μεθόδους και από τις πρώτες που χρησιμοποιήθηκαν. Τα κύτταρα προσροφούνται στην επιφάνεια ενός φορέα και συγκρατούνται με ασθενείς δυνάμεις Van der Waals. Έχουν αναφερθεί περιπτώσεις όπου η σύνδεση με την επιφάνεια γίνεται με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, δεσμούς υδρογόνου και ιονικές αλληλεπιδράσεις (προσρόφηση αζωτοβακτηρίων σε κυτταρίνη). Μερικά από τα υλικά που χρησιμοποιούνται για την καθήλωση των μικροοργανισμών και των κυττάρων είναι τα εξής: Φυσικά υλικά (κυτταρίνη, πριονίδια) Ρητίνες Γυαλί, τετηγμένο πορώδες γυαλί Κοκκώδης άργιλος, λάβα και παρεμφερή προιόντα Ενεργοποιημένος άνθρακας Πορώδης πορσελάνη Η καθήλωση με προσρόφηση είναι μια απλή και ήπια μέθοδος ωστόσο σημαντικό μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί η ασθενής σύνδεση των κυττάρων με την επιφάνεια. Αυτό έχει ως συνέπεια να εκροφούνται εύκολα λόγω θερμοκρασιακών διακυμάνσεων ή λόγω αύξησης της συγκέντρωσης του υποστρώματος ή ακόμα και της ιοντικής ισχύος (5). Β. Σχηματισμός συσσωματώματος. Η καθήλωση με σύμμειξη είναι ουσιαστικά μία τεχνική αυτοκαθήλωσης των μικροοργανισμών. Έχει χρησιμοποιηθεί πολλές φορές για βιοτεχνολογικούς σκοπούς π.χ. στην παραγωγή αιθανόλης από τον

94 μικροοργανισμό Saccharomyces cerevisiae. Η ανάπτυξη των καθηλωμένων μικροοργανισμών είναι διαφορετική από αυτή των ελεύθερων και αυτό οφείλεται στο ιδιαίτερο φυσικοχημικό περιβάλλον των καθηλωμένων οντοτήτων. Γ. Ομοιοπολική σύνδεση. Στη μέθοδο αυτήν, ο μικροοργανισμός καθηλώνεται μέσω του σχηματισμού σταυροδεσμού με κάποιο χημικό αντιδραστήριο όπως είναι η γλουταραλδεϋδη. Στην περίπτωση της γλουταραλδεϋδης, οι επιφάνειες των μικροοργανισμών (ιδιαίτερα οι πρωτείνες) συνδέονται μεταξύ τους μέσω των αλδεϋδικών ομάδων της γλουταραλδεϋδης (5). Σημαντικό μειονέκτημα της μεθόδου αποτελούν τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για τη σύνδεση των κυττάρων. Συγκεκριμένα έχει παρατηρηθεί ότι παρεμποδίζεται η ανάπτυξη των μικροοργανισμών και γενικά υφίσταται έντονες τοξικές επιδράσεις. Δ. Εγκλωβισμός. Η μέθοδος του εγκλωβισμού σε πηκτή αποτελεί μία από τις πιο διαδεδομένες τεχνικές καθήλωσης. Ο μικροοργανισμός μπορεί να καθηλωθεί σε Συνθετικά πολυμερή (πολυακρυλαμίδιο, πολυουρεθάνες) Ρητίνες Φυσικά πολυμερή (αλγινικό οξύ, κ-καρραγενάνη, πηκτίνη, ζελατίνη κ.α.) Στην περίπτωση των συνθετικών πολυμερών, η καθήλωση πρέπει να ακολουθεί τον προ-πολυμερισμό ώστε να αποφεύγεται η έκθεση των μικροοργανισμών σε ακραίες συνθήκες (υψηλη θερμοκρασία, τοξικά αντιδραστήρια). Γενικά, η καθήλωση σε συνθετικά πολυμερή και εποξείδια έχει ως αποτάλεσμα τον θάνατο μεγάλου ποσοστού των μικροοργανισμών. Το πρόβλημα των ακραίων συνθηκών καθήλωσης λύνει ο εγκλωβισμός σε φυσικά πολυμερή. Ο πολυμερισμός γίνεται με ήπιες συνθήκες ενώ οι πηκτές που σχηματίζονται δεν είναι τοξικές. Χαρακτηριστικά παραδείγματα εγκλωβισμένων μικροοργανισμών είναι τα εξής: μεθανογόνα βακτήρια σε άγαρ, νιτροβακτήριο σε αλγινικό οξύ κ.α. (5,56)

95 Η μεταφορά οξυγόνου, του υποστρώματος και των θρεπτικών συστατικών στις κοιλότητες των πηκτών που είναι καθηλωμένοι οι μικροοργανισμοί, γίνεται μέσω διάχυσης. Επιπλέον οι εγκλωβισμένοι μικροοργανισμοί προστατεύονται υδροδυναμικά και μπορούν να σχηματίσουν μικροκαλλιέργειες ή αποικίες και συνεπώς έχουμε αύξηση της παραγωγικότητας. Μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί η ευαισθησία των ιονοτροπικών πηκτών (αλγινικό οξύ) σε ιόντα αντίθετου φορτίου από αυτά του πλέγματος. Γενικά ο εγκλωβισμός σε πηκτές είναι η πιο διαδεδομένη τεχνική καθήλωσης μικροοργανισμών λόγω της απλότητας και του ήπιου της μεθόδου. Ε. Μηχανικός περιορισμός. Στην τεχνική αυτή, τα κύτταρα καθηλώνονται μέσω μηχανικού περιορισμού. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με Περιορισμό των κυττάρων σε μικροπορώδη μεμβράνη Ενθυλάκωση σε μικροκάψουλα Καθήλωση στη διεπιφάνεια μη αναμειγνυόμενων υγρών Ο μηχανικός περιορισμός των κυττάρων προτιμάται όταν απαιτείται προϊόν ελεύθερο κυττάρων. Οι βιοαντιδραστήρες μεμβράνης χρησιμοποιούνται στην ανακύκλωση κυττάρων και σε συνεχείς διαδικασίες Καθήλωση ενζύμων Τα ένζυμα είναι κατά κύριο λόγο πρωτεϊνες που καταλύουν τις διάφορες βιοχημικές αντιδράσεις (βιοκαταλύτες) οι οποίες γίνονται μέσα στα κύτταρα κάτω από πολύ ήπιες συνθήκες θερμοκρασίας, πιέσεως και ph. Οι μεταβολικές διαδικασίες των φυτικών και ζωικών κυττάρων είναι πολύπλοκες σειρές αντιδράσεων και κάθε στάδιο ελέγχεται από ένα ειδικό ένζυμο. Η σπουδαιότητα των ενζύμων ως καταλύτες και στις χημικές διεργασίες σε βιομηχανική ή και εργαστηριακή κλίμακα είναι εξίσου σημαντική. Ενώ οι συμβατικές χημικές διεργασίες οι οποίες αναπτύχθηκαν στις προηγούμενες δεκαετίες επιτρέπουν την παραγωγή, τον διαχωρισμό και τον αναλυτικό προσδιορισμό μιας τεράστιας ποικιλίας προϊόντων υψηλής τεχνολογίας, αναζητούνται εναλλακτικές μεθοδολογίες

96 οι οποίες πέρα από αποδοτικές θα πρέπει να είναι φιλικές προς το περιβάλλον και να επιτρέπουν την εξοικονόμηση πρώτων υλών και ενέργειας (55). Τα ένζυμα εμφανίζουν μια σειρά χαρακτηριστικών τα οποία καθιστούν τη χρήση τους πλεονεκτικότερη έναντι των συμβατικών χημικών καταλυτών. Συγκεκριμένα: Εμφανίζουν εξαιρετική καταλυτική απόδοση, πολλές φορές πολλαπλάσια των χημικών καταλυτών Εμφανίζουν υψηλό βαθμό εξειδίκευσης όχι μόνο ως προς το είδος της αντίδρασης αλλά και προς το υπόστρωμα (εξειδίκευση υποστρώματος). Η εξειδίκευδη τους είναι τόσο υψηλή ώστε μπορούν να διακρίνουν ακόμα και μεταξύ όμοιων περιοχών των μορίων (εξειδίκευση περιοχής) καθώς επιίσης και μεταξύ οπτικών ισομερών (στερεοεξειδίκευση). Με τον τρόπο αυτόν εξασφαλίζουν τον αποκλεισμό παράπλευρων αντιδράσεων, καταλύουν την παραγωγή ενός αποκλειστικού επιθυμητού προϊόντος, παρέχουν υψηλές αποδόσεις στις αντιδράσεις περιορίζοντας το κόστος των υλικών. Λειτουργούν σε ήπιες συνθήκες θερμοκρασίας, πίεσης και ph με ρυθμούς αντίδρασης οι οποίοι στην περίπτωση χρήσης χημικών καταλυτών θα απαιτούσαν ακραίες συνθήκες. Με τον τρόπο αυτόν περιορίζεται σε μεγάλο βαθμό η κατανάλλωση ενέργειας και το λειτουργικό κόστος παραγωγής. Τα ένζυμα δεδομένου ότι είναι κατά κύριο λόγο πρωτεϊνες ή πεπτίδια, είναι βιοαποικοδομήσιμα και μπορούν εύκολα να απομακρυνθούν από τα απόβλητα. Αυτός ο μοναδικός συνδιασμός χαρακτηριστικών των ενζύμων ως καταλύτες γίνεται εκμεταλεύσιμος από το 1960 και ένας μεγάλος αριθμός προϊόντων έχουν παραχθεί από αντίστοιχες βιοχημικές διεργασίες κατά τις οποίες χρησιμοποιούνται καταλύτες-ένζυμα στα πλαίσια της βιοτεχνολογίας. Μεταξύ των βιοτεχνολογικών προϊόντων ανήκουν πολλά τρόφιμα, φαρμακευτικά σκευάσματα, αγροχημικά καθώς και οργανικά χημικά συνθετικά

97 Πέρα όμως από τα αναμφισβήτητα πλεονεκτήματα των ενζύμων υπάρχει και ένας αριθμος πρακτικών προβλημάτων που προκύπτουν κατά τη χρήση των ενζύμων. Μεταξύ αυτών είναι: Το υψηλό κόστος απομόνωσης και καθαρισμού των ενζύμων Φαινόμενα αστάθειας της δομής τους δεδoμένου ότι απομακρύνονται από το φυσικό τους περιβάλλον Η ευαισθησια τους στις συνθήκες των διεργασιών οι οποίες είναι διαφορετικές από αυτές της βέλτιστης λειτουργίας τους Η ευαισθησία τους ακόμα και σε ιχνοποσότητες ουσιών που μπορούν να αναστείλουν την λειτουργία τους. Τα δύο τελευταία προβλήματα καθιστούν τα ενζυμα σε ενεργούς καταλύτες μικρής διάρκειας. Επιπλέον σε αντίθεση με τους ετερογενείς χημικούς καταλυτες, τα περισσότερα ένζυμα λειτουργούν διαλυμένα στο νερό σε συστήματα ομοιογενούς κατάλυσης μολύνοντας το προϊόν και καθιστώντας δύσκολη την ανάκτηση τους από το μίγμα της αντίδρασης σε δραστική μορφή. Διάφορες μέθοδοι έχουν προταθεί προκειμένου να επιλυθούν πολλά από τα παραπάνω προβλήματα μεταξύ των οποίων είναι και η καθήλωση ενζύμων σε αδιάλυτους φορείς (5). Η καθήλωση των ενζύμων πετυχαίνεται με δέσμευση του ενζύμου πάνω ή μέσα σε κάποιο στερεό υλικό υπόστρωμα προκειμένου να λαμβάνονται ετερογενή καθηλωμένα ενζυμικά συστήματα. Με τον τρόπο αυτό μιμούμαστε τον φυσικό τρόπο σταθεροποίησης της δομής των ενζύμων στα ζωντανά κύτταρα όπου τα ένζυμα στις περισσότερες περιπτώσεις είναι προσκολλημένα σε κυτταρικές μεμβράνες. Σε σύγκριση με τα ελεύθερα ένζυμα, τα καθηλωμένα ενζυμικά συστήματα: 1. Είναι πιο ανθεκτικά σε αλλαγές περιβάλλοντος 2. Επιτρέπουν την εύκολη ανάκτηση τόσο του ενζύμου όσο και του προϊόντος 3. Επιτρέπουν την πολλαπλή χρήση του ενζύμου 4. Εξασφαλίζουν τη συνεχή λειτουργία των ενζυμικών αντιδράσεων

98 5. Διευκολύνουν τον γρήγορο τερματισμό των ενζυμικών αντιδράσεων 6. Μπορούν να λειτουργήσουν σε μια μεγάλη ποικιλία βιοαντιδράσεων Τα ένζυμα μπορούν να καθηλωθούν με πολλές μεθόδους οι οποίες μπορούν να ταξινομηθούν στις παρακάτω κατηγορίες (5). Φυσικές μέθοδοι: όπου υπάρχει ασθενής αλληλεπίδραση μεταξύ του ενζύμου και του μέσου καθήλωσης. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα εξής είδη καθήλωσης: i. Περίκλειση του ενζύμου σε έναν αντιδραστήρα μεμβράνης ii. Προσρόφηση του ενζύμου πάνω σε αδιάλυτο υπόστρωμα iii. Εγκλεισμός ή εγκλωβισμός σε πηκτή iv. Μικροεγκλωβισμός του ενζύμου σε στερεή μεμβράνη v. Μικροεγκλωβισμός του ενζύμου σε υγρή μεμβράνη vi. Σχηματισμός ενζυμικών φίλμ Χημικές μέθοδοι: όπου λαμβάνει χώρα ομοιοπολική σύνδεση μεταξύ ενζύμου και υλικού μέσου καθήλωσης. Στην κατηγορία αυτήν ανήκουν τα εξής είδη καθήλωσης: Ομοιοπολική σύνδεση του ενζύμου με ένα αδιάλυτο υπόστρωμα Διαμοριακή σύνδεση του ενζύμου με χρήση ενός πολυλειτουργικού, χαμηλού μοριακού βάρους αντιδραστηρίου Διαμοριακή σύνδεση του ενζύμου με άλλες ουδέτερες ουσίες π.χ. πρωτεΐνες Γενικά έχουν εφαρμοστεί πολλές άλλες μέθοδοι οι οποίες αποτελούν συνδιασμούς των παραπάνω ειδών. Ωστόσο δεν υπάρχει κάποια συγκεκριμένη μέθοδος ούτε και κάποιο συγκεκριμένο υλικό καθήλωσης που μπορεί να χρησιμοποιηθεί ανεξαιρέτως για την καθήλωση όλων των ενζύμων και αυτό εξαιτίας της μεγάλης ποικιλομορφίας και διαφορετικότητας της δομής και των χημικών χαρακτηριστικών των ενζύμων καθώς και εξαιτίας των διαφορετικών ιδιοτήτων των

99 υποστρωμάτων και των προϊόντων των ενζυμικών αντιδράσεων. Αντιθέτως όλες οι μέθοδοι εμφανίζουν μειονεκτήματα και πλεονεκτήματα. Η φυσική προσρόφηση είναι απλή, χαμηλού κόστους και αποτελεσματική αλλά σύχνά αντιστρεπτή. Αντιθέτως η ομοιοπολική και διαμοριακη σύνδεση είναι μη αντιστρεπτές και αποτελεσματικές ενώ ταυτόχρονα προσδίδουν στο ένζυμο ανθεκτικότητα. Ωστόσο έχουν υψηλό κόστος και πολλές φορές μειώνουν την απόδοση του ενζύμου. Κατά τον εγκλωβισμό συχνά εμφανίζονται προβλήματα διάχυσης. Συνεπώς η βέλτιστη μέθοδος καθήλωσης ενός ενζύμου είναι αποτέλεσμα δοκιμών κατά τις οποίες μελετάται η δραστικότητα, η ανθεκτικότητα και η λειτουργική σταθερότητα του καθηλωμένου ενζύμου για διάφορα υλικά και με διάφορες μεθόδους. Η καθήλωση επιφέρει μια σειρά από μεταβολές στο ένζυμο προκαλώντας τη μείωση της απόδοσης του (5,55). Σε σύγκριση με τα περισσότερα ένζυμα, τα καθηλωμένα ένζυμα εμφανίζουν: Χαμηλότερη δραστικότητα Μεγαλύτερες σταθερές Michaelis-Menten Αυτές οι μεταβολές στα χαρακτηριστικά των καθηλωμένων ενζύμων οφείλονται σε μεταβολές στη δομή τους κατά τη διαδικασία καθήλωσης καθώς και στη δημιουργία ενός μικροπεριβάλλοντος στο οποίο λειτουργούν τα καθηλωμένα ένζυμα και το οποίο είναι διαφορετικό από αυτό της κύριας μάζας του διαλύματος. Το τελευταιο εξαρτάται ισχυρά από την αντίδραση που λαμβάνει χώρα και τη φύση του υποστρώματος. Επιπλέον, τα συστήματα καθηλωμένων ενζύμων ως συστήματα δύο φάσεων υποφέρουν από ανεπιθύμητους περιορισμούς σε φαινόμενα μεταφοράς μάζας, τα οποία προκαλούν ανεπιθύμητους περιορισμούς στη ολική απόδοση του συστήματος Προκειμένου να χρησιμοποιηθεί μια βιοχημική διεργασία για την παραγωγή ενός συγκεκριμένου προϊόντος με ελεύθερο ή καθηλωμένο ένζυμο έναντι μιας συμβατικής χημικής διεργασίας με έναν κατάλληλο χημικό καταλύτη, θα πρέπει να ληφθούν υπόψη όλα τα παραπάνω καθώς και το κατά πόσο η διεργασία αυτή είναι οικονομικά βιώσιμη. Μέχρι σήμερα πολλές βιοχημικές διεργασίες με καθηλωμένα

100 ένζυμα έχουν αποδειχθεί οικονομικά βιώσιμες και μια μεγάλη ποικιλία προϊόντων παράγεται με τον τρόπο αυτόν. Άλλες εφαρμογές πέρα από τη χρήση των καθηλωμένων ενζύμων σε βιομηχανική κλίμακα είναι η χρήση τους για οργανικές συνθέσεις σε εργαστηριακή κλίμακα καθώς και σε αναλυτικές και ιατρικές εφαρμογές (55)

101 Κεφάλαιο2 Υλικά & Μέθοδοι 2.1. Υλικά Όλα τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας των οίκων Merck (Darmstadt, Germany), Sigma-Aldrich Chemie GmbH, (Steinheim, Germany), Riedel de Haan (Seelzer, Germany), J.T. Baker (Deventer, Holland), Gibco BRL (Karlsruhe, Germany) και BDH (Poole, UK). Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού, η T4 DNA λιγάση, οι DNA πολυμεράσες ήταν του οίκου TAKARA BIO INC. Για την έκφραση της πρωτεΐνης μας χρησιμοποιήθηκε το truncated γονίδιο του παράγοντα ΙΧ (rf9), το οποίο μας παραχωρήθηκε κλωνοποιημένο σε πλασμίδιο pet22b από τον Prof. H. Brandstetter. Το γονίδιο αυτό κωδικοποιεί την έκφραση ενός truncated παράγοντα ΙΧ, από τον οποίο λείπουν τα πρώτα 132 αμινοξέα του αμινοτελικού άκρου. Το τμήμα του παράγοντα που λείπει είναι αυτό που υφίσταται τις μεταφραστικές τροποποιήσεις κατά την έκφραση του παράγοντα στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Το truncated γονίδιο μας έδωσε τη δυνατότητα να εκφράσουμε τον παράγοντα σε προκαρυωτικά κύτταρα, τα οποία δεν διαθέτουν τα απαιτούμενα ένζυμα για τις μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις του αμινοτελικού άκρου. Η truncated πρωτεΐνη που προκύπτει από την έκφραση του γονιδίου αυτού αποτελείται από τα 329 αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου, το οποίο περιέχει και την καταλυτική του περιοχή

102 Οι μάρτυρες μοριακού βάρους DNA και πρωτεϊνών ήταν των οίκων GenScript (USA Inc.) και Lonza (UK). Τα ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν ως εκκινητές στην PCR ήταν της MWG (Germany). (α) (β) Εικόνα 2.1. (α)bluestar Prestained Protein Marker, (β)dna KB Ladder markers 2.2. Βακτηριακά στελέχη Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω βακτηριακά στελέχη: E. coli TOP10 μετασχηματισμένο με το πλασμίδιο pet22b. Η πρωτεΐνη σύντηξης υπερεκφράζεται έπειτα από επαγωγή με ισοπροπυλοθειογαλακτοσίδιο (IPTG). E. coli BL21 μετασχηματισμένο με το πλασμίδιο. Η επιλογή των μετασχηματισμένων κυττάρων έγινε με βάση την ανθεκτικότητά τους σε αντιβιοτικά επιλογής. Στον παρακάτω Πίνακα 2.1 δίνονται τα αντιβιοτικά που χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε περίπτωση:

103 Πίνακας 2.1 Στέλεχος/πλασμίδιο Ανθεκτικότητα Συγκέντρωση (μg/ml) Top10F Str 20 BL21[DE3] JM109 pet29c Km 50 pet22b Amp 100 pgem-t-easy Amp Θρεπτικά υλικά υποστρώματα Για την ανάπτυξη των μετασχηματισμένων με τα προαναφερθέντα πλασμίδια κυττάρων, καθώς και την ανάπτυξη των αντίστοιχων άγριων στελεχών, χρησιμοποιείται το θρεπτικό υπόστρωμα Luria-Bertani (LB) (39), του οποίου η σύσταση είναι η εξής: 1% w/v Τρυπτόνη 0,5% w/v Εκχύλισμα ζύμης 0,5% w/v NaCl Στην περίπτωση των μετασχηματισμένων στελεχών, στο θρεπτικό υλικό προστίθεται αντιβιοτικό αμπικιλλίνη ή καναμυκίνη, σε συγκέντρωση 100 μg/ml και 50 μg/ml αντίστοιχα

104 Η διατήρηση των στελεχών γίνεται μακροπρόθεσμα με υγρά αποθέματα που περιέχουν 10% v/v γλυκερόλη στους 75 ο C, ενώ για σύντομα χρονικά διαστήματα σε τρυβλία με LB-άγαρ, το οποίο προκύπτει με προσθήκη 2% w/v άγαρ στο παραπάνω υπόστρωμα, στους 4 ο C. Η αποστείρωση των υλικών γίνεται σε κλίβανο υγρής αποστείρωσης (αυτόκαυστο) σε συνθήκες 120 ο C και πίεση 1,1 bar για διάστημα 20 λεπτών. Τα διαλύματα των αντιβιοτικών αποστειρώνονται με διήθηση (φίλτρα Corning Costar, διάμετρος πόρων 0,2 μm) Καλλιέργεια και συλλογή κυττάρων Τα στελέχη E. coli που έχουν μετασχηματιστεί με το πλασμίδιο το οποίο περιέχει το γονίδιο της πρωτεΐνης, καθώς και τα άγριου τύπου E. coli αναπτύχθηκαν παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού επιλογής, όταν απαιτείται, στους 37 ο C σε LB. Ακολουθεί ενοφθάλμισμα 3-5% v/v από την υγρή καλλιέργεια σε νέο θρεπτικό υλικό και συνεχίζεται η ανάπτυξη του μικροοργανισμού μέχρι τη στατική φάση ανάπτυξης. Όταν η οπτική απορρόφηση της καλλιέργειας είναι 0,6-0,7 προστίθεται IPTG, συνήθως 1 mm και συνεχίζεται η επαγωγή για 3 ώρες. Η συλλογή των κυττάρων γίνεται με φυγοκέντρηση του θρεπτικού υλικού στις 3000xg για 15 min. Το υπερκείμενο απορρίπτεται και το ίζημα φυλάσσεται στους -20 o C. Τα στελέχη E. coli BL21 που έχουν μετασχηματιστεί με το πλασμίδιο καθώς και τα άγριου τύπου E. coli BL21 αιωρούνται σε πενταπλάσιο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος PBS που περιέχει 1 mm ΡMSF και 1% v/v Triton X-100. Ακολουθεί λύση των κυττάρων. Τα λυμένα κύτταρα φυγοκεντρούνται στις 4.000xg (κεφαλή SS-34) για 20 min στους 4 o C, ώστε να απομακρυνθούν τα άσπαστα κύτταρα στο ίζημα. Το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης των 4.000xg (ολικό κυτταρικό εκχύλισμα), φυγοκεντρείται ξανά στις 9.000xg, (κεφαλή SS-34) 15 min στους 4 o C. Στο ίζημα κατακρημνίζονται τα σωματίδια εγκλεισμού (inclusion bodies), ενώ στο υπερκείμενο ακολουθεί υπερφυγοκέντρηση στις xg (κεφαλή Α-1.256) για 1 h στους 4 o C. Στο ίζημα κατακρημνίζονται οι μεμβράνες, ενώ το υπερκείμενο αποτελεί το κυτταρόπλασμα (39)

105 2.5. Εισαγωγή τμημάτων DNA σε πλασμίδια-αντίδραση λιγάσης Η κοπή του DNA με ενδονουκλεάσες περιορισμού έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός μορίου με συμπληρωματικά ή τυφλά άκρα, ανάλογα με την ενδονουκλεάση που χρησιμοποιείται. Η κοπή του πλασμιδίου με την ίδια ενδονουκλεάση περιορισμού δίνει τη δυνατότητα να συνενωθούν τα δυο τμήματα DNA μέσω των συμπληρωματικών τους άκρων, με τη βοήθεια της T4 DNA λιγάσης. Στην περίπτωση που το ένθεμα DNA έχει τυφλά άκρα, ή πρόκειται για προϊόν της PCR, το πλασμίδιο φορέας κόβεται με μια ενδονουκλεάση που δίνει τυφλά άκρα, συνήθως την EcoRV. Ακολουθεί πάλι η συνένωσή τους από την T4 DNA λιγάση. Το μίγμα της αντίδρασης έχει συνολικό όγκο 20 μl και αποτελείται από το ένθεμα, το πλασμίδιο-φορέα, 2 μl κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος το οποίο περιέχει ATP και τέλος 1 μl λιγάσης. Αρχικά το μίγμα επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 1-2 ώρες και εν συνεχεία επωάζεται στους 15 ο C για 16 περίπου ώρες. Όλη η ποσότητα χρησιμοποιείται για το μετασχηματισμό επιδεκτικών κυττάρων. Πριν την αντίδραση λιγάσης ελέγχεται η ποσότητα και των δύο τμημάτων DΝΑ που θα ενωθούν σε πηκτή αγαρόζης. Για κάθε αντίδραση χρησιμοποιείται η γραμμομοριακή αναλογία: εισαγόμενο τμήμα/πλασμιδιακός φορέας = 3/1 (39) Παρασκευή επιδεκτικών βακτηρίων για μετασχηματισμό Η μέθοδος δημιουργίας επιδεκτικών κυττάρων βασίζεται στην παρατήρηση των Mandel και Higa ότι τα κύτταρα είναι ικανά να προσλάβουν DNA όταν κατεργαστούν με ψυχρό διάλυμα CaCl2. H μεθοδολογία που ακολουθήθηκε είναι η εξής (39). Μια αποικία κυττάρων E. coli μεταφέρεται σε 10 ml θρεπτικού υποστρώματος LB και αναπτύσσεται ώρες, στους 37 ο C, από την καλλιέργεια αυτή γίνεται ενοφθάλμισμα 100 μl σε 10 ml LB (1% v/v) και ακολουθεί επώαση στους 37 ο C

106 μέχρι την αρχή της λογαριθμικής φάσης (Α600=0,3). Η καλλιέργεια τοποθετείται στον πάγο για 10min και φυγοκεντρείται στις 9000xg για 10 min. Το ίζημα των κυττάρων αιωρείται σε 5 ml (στο ½ του αρχικού όγκου της καλλιέργειας) διαλύματος CaCl2 100 mm και παραμένει στον πάγο για 20min. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 9000xg για 10 min και το ίζημα προσεκτικά αιωρείται σε 1 ml CaCl2 50 mm (1/10 του αρχικού όγκου). Τα κύτταρα είναι πλέον «ικανά» να δεχθούν το πλασμιδιακό DNA και είτε παραμένουν στον πάγο για να χρησιμοποιηθούν αμέσως ή αφού ψυχθούν με ξηρό πάγο φυλάσσονται στους 70 o C Εισαγωγή πλασμιδιακού DNA σε κύτταρα Ε. coli Ο μετασχηματισμός των κυττάρων γίνεται με την προσθήκη ορισμένων νανογραμμαρίων πλασμιδιακού DNA σε 200 μl επιδεκτικών κυττάρων, που έχουν παρασκευαστεί, όπως περιγράφθηκε προηγουμένως. Ο όγκος του DNA δεν πρέπει να είναι μεγαλύτερος από το 10% του όγκου των κυττάρων. Για το μετασχηματισμό των κυττάρων αναμειγνύονται 200 μl επιδεκτικών κυττάρων με 2 μg/ml πλασμιδιακού DNA και επωάζονται στον πάγο για 45 min. Ακολουθεί θερμικό σοκ στους 42 ο C, για 2 min και παραμονή στον πάγο για 1 min. Στο μείγμα προστίθενται 800 μl LB χωρίς αντιβιοτικό, τα κύτταρα επωάζονται στους 37 ο C για 30 min, ώστε να εκφράσουν την αντίστασή τους στο αντιβιοτικό επιλογής και εν συνεχεία συλλέγονται με φυγοκέντρηση και επιστρώνονται σε τρυβλίο με LB άγαρ, στο οποίο έχει προστεθεί η κατάλληλη συγκέντρωση αντιβιοτικού και τα κύτταρα επωάζονται για μια νύχτα. Ως μάρτυρες χρησιμοποιούνται επιδεκτικά κύτταρα στα οποία δεν έχει προστεθεί πλασμιδιακό DNA (39)

107 2.8. Μέθοδος καλλιέργειας των στελεχών Ε. coli ΤΟΡ10 που φέρουν το πλασμίδιο pgem και ελέγχονται για έκφραση β-γαλακτοσιδάσης Πολλοί από τους πλασμιδιακούς φορείς φέρουν ένα μικρό τμήμα DNA του E. coli που περιέχει τις ρυθμιστικές αλληλουχίες και την αλληλουχία που κωδικοποιεί τα πρώτα 146 αμινοξέα του γονιδίου της β-γαλακτοσιδάσης (lacz). Εντός της περιοχής που κωδικοποιεί τη β-γαλακτοσιδάση βρίσκεται η θέση κλωνοποίησης, η οποία δεν καταστρέφει το αναγνωστικό πλαίσιο, αλλά έχει ως αποτέλεσμα την εισαγωγή ενός αριθμού αμινοξέων στο αμινο-τελικό τμήμα της β-γαλακτοσιδάσης. Πλασμιδιακοί φορείς αυτού του τύπου χρησιμοποιούνται σε κύτταρα ξενιστές που εκφράζουν το καρβοξυ-τελικό τμήμα της β-γαλακτοσιδάσης. Παρόλο που ούτε το τμήμα που κωδικοποιείται από τον ξενιστή ούτε αυτό που κωδικοποιείται από το πλασμίδιο είναι από μόνα τους ενεργά, μπορούν να ενωθούν μεταξύ τους προς το σχηματισμό δραστικής πρωτεΐνης. Αυτός ο τύπος συμπληρωματικότητας, καλείται α-συμπληρωματικότητα (40). Τα βακτήρια Lac + που προέρχονται από την α-συμπληρωματικότητα αναγνωρίζονται εύκολα, διότι σχηματίζουν μπλε αποικίες παρουσία του χρωμογόνου υποστρώματος 5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλο-β- D-γαλακτοσιδίου (X-gal) (41). Η εισαγωγή τμήματος ξένου DNA στην περιοχή κλωνοποίησης του πλασμιδίου οδηγεί στην παραγωγή αμινο-τελικού τμήματος που δεν είναι ικανό για α- συμπληρωματικότητα. Τα βακτήρια που φέρουν αυτά τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια σχηματίζουν άσπρες αποικίες. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας pgem, ο οποίος κωδικοποιεί το αμινο-τελικό τμήμα της β-γαλακτοσιδάσης χωρίς όμως να περιέχει το εναρκτήριο κωδικόνιο και τις ρυθμιστικές αλληλουχίες του προαγωγέα. Όταν εισαχθεί στη θέση κλωνοποίησης του πλασμιδίου, που βρίσκεται στην αρχή του γονιδίου lacz, τμήμα ξένου DNA που περιέχει τις ρυθμιστικές αλληλουχίες ενός προαγωγέα και το εναρκτήριο κωδικόνιο, η β-γαλακτοσιδάση εκφράζεται μέσω α-συμπληρωματικότητας και τα κύτταρα που φέρουν τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια σχηματίζουν γαλάζιες αποικίες παρουσία του υποστρώματος X-gal. Το

108 υπόστρωμα X-gal παρασκευάζεται σε τελική συγκέντρωση 20 mg/ml σε διμεθυλφορμαμίδιο (DMF) και από το διάλυμα αυτό, το οποίο δε χρειάζεται να διηθηθεί, προστίθενται 100 μl/τριβλίο. Ως αντιβιοτικό επιλογής χρησιμοποιείται η αμπικιλλίνη σε τελική συγκέντρωση 100 μg/ml Φυγοκέντρηση Η φυγοκέντρηση, ως τεχνική, συνέβαλλε σημαντικά στη γνώση που υπάρχει σήμερα για τα υποκυτταρικά στοιχεία. Στη συνηθισμένη τους μορφή, οι συσκευές φυγοκέντρησης, αποτελούνται από ένα μεταλλικό ρότορα με οπές όπου εισάγονται οι σωλήνες με τα κυτταρικά παρασκευάσματα, και από ένα κινητήρα περιστροφής. Υπάρχουν δύο βασικοί τύποι συσκευών φυγοκέντρησης. Ένας από αυτούς είναι οι αναλυτικές φυγόκεντροι που χρησιμοποιούνται για μικρά δείγματα (της τάξης των ml) και ονομάζονται και υπερφυγόκεντροι επειδή μπορούν να φτάσουν σε μεγάλο αριθμό στροφών ανά λεπτό (πάνω από στροφές / λεπτό). Ο δεύτερος τύπος είναι οι παρασκευαστικές φυγόκεντροι που λειτουργούν με μεγαλύτερα δείγματα ( ml) και οι οποίες φτάνουν έναν περιορισμένο αριθμό στροφών ανά λεπτό. Σε κάθε υλικό μέσο που περιστρέφεται, ασκείται μια φυγόκεντρος δύναμη F, που ισούται με το γινόμενο του τετραγώνου της γωνιακής ταχύτητας ω, επί την ακτίνα περιστροφής r (F = ω 2 r). Συνήθως γίνεται αναφορά στη σχετική φυγόκεντρο δύναμη Φ που είναι αριθμός πολλαπλάσιος της επιτάχυνσης της βαρύτητας g και ισούται με Φ = ω2r / 980. Για να εκφραστεί το προηγούμενο μέγεθος σε μονάδες στροφών ανά λεπτό (rpm, revolution per minute), η γωνιακή ταχύτητα ω θα πρέπει να εκφραστεί ως ω = π (rpm) / 30. Κατά την περιστροφή μέσα στο ρότορα, ο σωλήνας αποκτά μια κλίση με αποτέλεσμα να μεταβάλλεται (αυξάνεται) η ακτίνα περιστροφής από την κορυφή προς τον πυθμένα του σωλήνα. Το γεγονός αυτό έχει σαν αποτέλεσμα η φυγόκεντρος δύναμη που ασκείται στον πυθμένα του σωλήνα να είναι μεγαλύτερη από τη φυγόκεντρο δύναμη που ασκείται στην κορυφή του σωλήνα. Για το λόγο

109 αυτό, η σχετική φυγόκεντρος δύναμη πρέπει να αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο των τιμών της κορυφής και του πυθμένα του ιδίου σωλήνα Απομόνωση RNA από ολικό αίμα Η απομόνωση του RNA από το ολικό αίμα έγινε με χρήση του Mini Kit της εταιρίας Qiagen. Με βάση το πρωτόκολλο της εταιρίας η διαδικασία που ακολουθήθηκε είναι η εξής. 250μl αίματος αναμίχθηκαν με πενταπλάσιο όγκο (1250 μl) διαλύματος ΕL και επωάστηκαν για min στον πάγο για τη λύση των ερυθροκυττάρων. Το μείγμα φυγοκεντρήθηκε στις 400 g για 10 λεπτά και στους 4 ο C. Το υπερκείμενο διάλυμα αφαιρέθηκε και στο ίζημα προστέθηκαν 500μl του διαλύματος EL με τα οποία έγινε ανάμειξη. Η διαδικασία επαναλήφθηκε, το υπερκείμενο διάλυμα αφαιρέθηκε, ενώ στο ίζημα προστέθηκαν 350 ml του διαλύματος RLT, για τη διάσπαση των κυττάρων. Το μίγμα ανακινήθηκε και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε στήλη φυγοκέντρησης QIAshredder όπου και φυγοκεντρήθηκε στη μέγιστη ταχύτητα. Η στήλη απομακρύνθηκε και στο μίγμα προστέθηκαν 350 μl αιθανόλης 70%, ενώ στη συνέχεια μεταφέρθηκε με τη βοήθεια πιπέτας σε νέα στήλη όπου και φυγοκεντρήθηκε στις 8000 g για 15 sec περίπου. Το υποκείμενο διάλυμα απομακρύνθηκε ενώ η στήλη μεταφέρθηκε σε νέο σωληνάκι. Για τη πρώτη πλύση προστέθηκαν 700 μl ρυθμιστικού διαλύματος RW1 στη στήλη και ακολούθησε νέα φυγοκέντρηση στις 8000 g για 15 sec. Το υποκείμενο διάλυμα απομακρύνθηκε και ακολούθησε προσθήκη 500 μl ρυθμιστικού διαλύματος RPE. Μετά τη φυγοκέντρηση στις 8000 g η διαδικασία επαναλήφθηκε με τη διαφορά ότι η φυγοκέντρηση έγινε για 3 λεπτά στις g. Για τη πλήρη απομάκρυνση του διαλύματος RPE έγινε νέα μεταφορά σε σωληνάκι και μονόλεπτη φυγοκέντρηση στη μέγιστη ταχύτητα. Τέλος για την έκλουση του RNA από τη στήλη προστέθηκαν μl νερού, απουσία RNA-σών, και ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 8000 g για 1min. Το υποκείμενο διάλυμα περιείχε το απομονωμένο RNA

110 2.11. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA (μέθοδος αλκαλικής λύσης) Η απομόνωση και ο καθαρισμός του πλασμιδιακού DNA από βακτηριακά κύτταρα E. coli σε μικρή κλίμακα περιλαμβάνει τρία στάδια: την ανάπτυξη της μετασχηματισμένης βακτηριακής καλλιέργειας, τη συλλογή και λύση των κυττάρων και το καθαρισμό του πλασμιδιακού DNA. Η ανάπτυξη της βακτηριακής καλλιέργειας γίνεται με επώαση των βακτηρίων στους 37 C για 16 h σε υγρό θρεπτικό μέσο L.B., παρουσία του αντιβιοτικού (100 μg/ml). Η συλλογή των βακτηριακών κυττάρων καλλιέργειας πλήρους ανάπτυξης 1,5ml γίνεται με φυγοκέντρηση στα xg για 10 min και ακολουθεί η αλκαλική λύση τους σύμφωνα με τα εξής: Το ίζημα των κυττάρων αιωρείται σε 100 μl διαλύματος GTE (50 mm γλυκόζη, 25 mm Tris-HCl, 10 mm EDTA, ph 8.0) και στο αιώρημα προστίθεται ο διπλάσιος όγκος (200 μl) διαλύματος 0.2 Ν NaOH, 1% SDS. Το μίγμα ομογενοποιείται με απλή ανακίνηση του σωλήνα και αφήνεται στον πάγο για 5 min. Με φυγοκέντρηση, στις xg για 10 min απομακρύνονται τα αδιάλυτα μεμβρανικά υπολείμματα και οι πρωτεΐνες, ενώ στο υπερκείμενο προστίθεται ίσος όγκος εξισορροπημένης φαινόλης με Tris-HCL ph 8,0. Οι δύο φάσεις διαχωρίζονται με φυγοκέντρηση στις 1000xg για 1 min και στην υδατική φάση προστίθεται ίσος όγκος μίγματος χλωροφορμίουισοαμυλικής αλκοόλης, αναλογίας 24:1. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις xg για 1min και στην υδατική φάση προστίθεται 1/10 του όγκου CH3COONH4 7,5 mm και διπλάσιος όγκος παγωμένης αιθανόλης για την κατακρήμνιση του DNA. Το μίγμα παραμένει 20 min στους -20 ο C και φυγοκεντρείται στις xg για 10 min. Το ίζημα που αποτελείται από DNA, RNA και άλατα διαλύεται σε δις-απιονισμένο νερό ή σε ρυθμιστικό διάλυμα TE (10 mm Triw-HCL ph 7,5 και 1 mm EDTA). Η σύσταση των διαλυμάτων που χρησιμοποιούνται είναι η ακόλουθη: Διάλυμα Ι : 50 mm γλυκόζη, 25 mm Tris-HCL και 10 mm EDTA, ph 8,0 Διάλυμα ΙΙ : 0,2 Μ NaOH από αρχικό διάλυμα 10 Μ και 1% w/v SDS

111 Διάλυμα ΙΙΙ : 60 ml CH3COOK 5M, 11,5ml παγόμορφο CH3COOH και 28,5 ml H2O. Το διάλυμα Ι αποστειρώνεται με φιλτράρισμα και διατηρείται στους 4 ο C όπως και τα διαλύματα ΙΙΙ και CH3COONH4 (39) Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με χρήση στήλης Nucleobond PC100 Για την απομόνωση πλασμιδίου σε μεγάλη κλίμακα χρησιμοποιήθηκε η στήλη Nucleobond Midi και για απομόνωση πλασμιδίου σε μικρή κλίμακα, η στήλη Nucleobond Mini της εταιρείας MACHEREY-NAGEL. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: Μια αποικία κυττάρων μεταφέρεται σε LB, που έχει προστεθεί το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής και επωάζεται για 8 ώρες στους 37 ο C με έντονη ανάδευση. Ακολουθεί αραίωση της αρχικής καλλιέργειας 1:500 ως 1:1000 ανάλογα με τον αριθμό αντιγράφων του παλσμιδίου και μετά από ώρες ανάπτυξης υπό τις ίδιες συνθήκες συλλέγοντσι τα κύτταρα με φυγοκέντρηση στις 6000xg για 15 min στους 4 ο C. Το ίζημα των κυττάρων αιωρείται σε διάλυμα S1, το οποίο περιέχει RNAse, με σκοπό την λύση των κυττάρων. Στη συνέχεια προστίθεται διάλυμα S2 και αναμειγνύεται απαλά για 2-3 min σε θερμοκρασία 25 ο C έτσι ώστε να διασπαστεί η κυτταρική μεμβράνη. Προστίθεται το διάλυμμα S3 και αναμειγνύεται απαλά 7-8 φορές και επωάζεται στον πάγο για 5 min με σκοπό την κατακρήμνιση όλων των τμημάτων του κυττάρου εκτός από το DNA. Με φυγοκέντρηση στις xg για 30 min απομακρύνονται όλα τα αδιάλυτα κυτταρικά υπολείμματα, οι πρωτεΐνες και το γενωμικό DNA, ενώ το πλασμίδιο παραλαμβάνεται στην υπερκείμενη στοιβάδα. Η στήλη Nucleobond AX 20 (Mini), AX 100 (Midi) εξισορροπείται με διάλυμα Ν2 και εν συνεχεία διαβιβάζεται το υπερκείμενο το οποίο αφήνεται να διέλθει από τη στήλη με τη βοήθεια της βαρύτητας. Η στήλη ξεπλένεται 2 φορές με το διάλυμα Ν3 και ακολουθεί έκλουση με διάλυμα Ν5. Το πλασμίδιο κατακρημνίζεται με την

112 προσθήκη ισοπροπανόλης σε θερμοκρασία δωματίου και φυγοκεντρείται αμέσως στις xg για 30 min. Το ίζημα ξεπλένεται με 70% v/v αιθανόλη, αναδεύεται απαλά και φυγοκεντρείται ξανά στις xg για 10 min. Η αιθανόλη απομακρύνεται προσεκτικά από το ίζημα με μια πιπέτα και το δείγμα αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου ώστε να εξατμιστεί όλη η ποσότητα αιθανόλης. (39)Το ίζημα διαλυτοποιείται σε δις-απιονισμένο νερό. Η σύσταση των διαλυμάτων είναι η εξής: S1 : 50 mm Tris-HCl, 10 mm EDTA, ph 8,0 και 100 μg/ml RNAse S2 : 200mM NaOH, 1 % w/v SDS S3 : 3 M CH3COOK ph 5,5 N2 : 750 mm NaCl, 50mM MOPS, 15% v/v αιθανόλη, 0.15% w/v Triton X-100 ph7,0 N3 : 1 M NaCl, 50 mm MOPS, 15% v/v αιθανόλη, ph 7,0 N5 : 1,25 M NaCl, 50 mm Tris-HCl, 15% v/v αιθανόλη, ph 8,5 Οι ποσότητες που χρησιμοποιούνται φαίνονται στον Πίνακα 2.2 Πίνακας 2.2. Mini Midi S1 0,8ml 8ml S2 0,8ml 8ml S3 0,8ml 8ml N2 1ml 2,5ml N3 2x2ml 12ml N5 1ml 5ml isopropanol 0,75ml 3,5ml 70% ethanol 500μl 2ml

113 2.13. Κοπή με ενδονουκλεάσες περιορισμού Για την κοπή του DNA με ενδονουκλεάσες περιορισμού προστίθεται στο πλασμίδιο κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα όπου το ένζυμο παρουσιάζει τη βέλτιστη δράση του. Η αντίδραση πραγματοποιείται, εκτός ελαχίστων εξαιρέσεων, στους 37 ο C. Η ποσότητα του ενζύμου που προστίθεται δεν πρέπει να υπερβαίνει το 10% του συνολικού όγκου της αντίδρασης, διαφορετικά το ένζυμο είναι δυνατό να κόψει μη εξειδικευμένα λόγω της μεγάλης συγκέντρωσής του, ή της μεγάλης ποσότητας γλυκερόλης που περιέχει το μίγμα αντίδρασης (39) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Η μέθοδος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολύμεράσης ή αλλιώς PCR (Polymerase Chain Reaction) δίνει τη δυνατότητα να πολλαπλασιαστεί η επιθυμητή ακολουθία DNA και να κλωνοποιηθεί σε έναν φορέα, αρκεί να είναι γνωστή η ακολουθία εκατέρωθεν του γονιδίου στόχου (42). Ως εκμαγείο της DNA πολυμεράσης, για τη σύνθεση του συμπληρωματικού κλώνου, χρησιμοποιείται μονόκλωνο DNA. Τα μονόκλωνα μόρια προκύπτουν κατά τη θέρμανση του δίκλωνου μορίου στους 94 o C. Απαραίτητη όμως προϋπόθεση για να ξεκινήσει η DNA πολυμεράση την αντιγραφή είναι η ύπαρξη μιας μικρής δίκλωνης περιοχής στο μόριο του DNA. Για το λόγο αυτόν χρησιμοποιούνται συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια μικρού μεγέθους, τα οποία είναι συμπληρωματικά μιας περιοχής εκατέρωθεν της επιθυμητής ακολουθίας. Τα ολιγονουκλεοτίδια αυτά χαρακτηρίζονται ως εκκινητές. Για την κλωνοποίηση της επιθυμητής ακολουθίας σε ένα πλασμίδιο, οι εκκινητές σχεδιάζονται έτσι ώστε να περιέχουν τη θέση κοπής μιας ενδονουκλεάσης περιορισμού. Οι δύο κλώνοι του δίκλωνου DNA διαχωρίζονται με θέρμανση του αντιδρώντος μίγματος στους 95 ο C. Ακολουθεί ψύξη του μίγματος σε μια συγκεκριμένη θερμοκρασία, ώστε να επιτευχθεί υβριδισμός των εκκινητών στην κατάλληλη

114 συμπληρωματική περιοχή των δύο κλώνων. Η θερμοκρασία αυτή, όπως και ο χρόνος παραμονής του μίγματος σε αυτήν εξαρτάται από το μέγεθος της ακολουθίας, το μέγεθος και την περιεκτικότητα των εκκινητών σε GC. Το στάδιο αυτό καθορίζει την εξειδίκευση της αντίδρασης. Ακολουθεί θέρμανση του μίγματος στους 70 ο C όταν χρησιμοποιείται η Taq πολυμεράση (από τον T. aquaticus). Στο στάδιο αυτό γίνεται η σύνθεση του DNA μόνο της περιοχής που έχει επιλεχθεί. Οι DNA πολυμεράσες που χρησιμοποιούνται προέρχονται από θερμοάντοχους μικροοργανισμούς, για να μη μετουσιώνονται στις υψηλές θερμοκρασίες που εφαρμόζονται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Ο κύκλος αυτός επαναλαμβάνεται φορές και παράγονται 2 n μόρια DNA, όπου n είναι ο αριθμός των κύκλων που γίνονται. Στο τέλος των κύκλων το μείγμα της αντίδρασης παραμένει στους 72 ο C για 10 λεπτά για να συνεχιστεί ο πολυμερισμός. Η αντίδραση PCR έγινε σε αυτόματη προγραμματιζόμενη συσκευή Mini Cycler της εταιρείας M.J.Research Inc.,Massachusetts, USA Aντίδραση ανάστροφης μεταγραφάσης ενσωματωμένης στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Η αντίδραση της αντίστροφης μεταγραφάσης πραγματοποιείται σε συνδυασμό με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης με τη βοήθεια του Transcriptor One-Step RT-PCR Kit της εταιρείας Roche. Το συγκεκριμένο kit είναι σχεδιασμένο έτσι ώστε να προσφέρει γρήγορη, υψηλής ευαισθησίας αντίστροφη μεταγραφή καθώς επίσης και υψηλής απόδοσης αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Τα μετάγραφα τμήματα μπορούν να φτάσουν και τις 6,5 kb. To kit περιλαμβάνει: Την αντίστροφη μεταγραφάση που εξασφαλίζει ισχυρή και υψηλής ευαισθησίας μεταγραφή με υψηλή απόδοση

115 Τον αναστολέα της RNAάσης, που αποτρέπει την υδρόλυση του RNA σε υψηλές θερμοκρασίες και συμβάλει στην προστασία του κατά την ανάστροφη μεταγραφή Την taq DNA πολυμεράση που προσφέρει υψηλή απόδοση στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης και αποτρέπει τη δημιουργία μεταλλάξεων Το ρυθμιστικό διάλυμα περιέχει υψηλής ποιότητας dntps που παραμένουν λειτουργικές σε υψηλές θερμοκρασίες. Επίσης τα συστατικά του ρυθμιστικού διαλύματος αποτρέπουν την μη εξειδικευμένη πρόσδεση των εκκινητών σε χαμηλές θερμοκρασίες καθώς επίσης συνδέονται με το μαγνήσιο ώστε να αποφευχθεί η ανεξέλεγκτη σύνθεση DNA. Το ρυθμιστικό διάλυμα αυτό είναι αποτελεσματικό τόσο κατά τη διάρκεια της αντίδρασης της αντίστροφης μεταγραφής όσο και κατά τη διάρκεια της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης Kαθαρισμός των προϊόντων της PCR Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε το NucleoTraP CR kit της εταιρείας Macherey-Nagel. Η μέθοδος στηρίζεται στη δέσμευση του DNA πάνω σε σωματίδια σίλικας (οξειδίου του πυριτίου) παρουσία χαοτροπικών αλάτων. Προσμίξεις όπως άλατα και μακρομόρια απομακρύνονται με πλύση με αιθανολικό ρυθμιστικό διάλυμα και στη συνέχεια το καθαρό DNA εκλούεται υπό συνθήκες χαμηλής ιοντικής ισχύος σε ελαφρώς αλκαλικό Η2Ο (ph 8,0). Οι εκκινητές δεν δεσμεύονται στα σωματίδια λόγω του μικρότερου μεγέθους τους σε σχέση με το προϊόν της PCR. Το προϊόν της PCR αναμιγνύεται με τετραπλάσιο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος και στη συνέχεια προστίθενται 6-10 μl από το εναιώρημα των σωματιδίων σίλικα. Το μίγμα παραμένει για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου και ανακινείται κάθε 2-3 min ώστε να δεσμευτεί το DNA πάνω στα σωματίδια. Ακολουθεί φυγοκέντρηση και στο ίζημα που έχει πλέον δεσμευμένο το DNA προστίθεται ίσος με τον αρχικό όγκο από το δεύτερο ρυθμιστικό διάλυμα του kit

116 που περιέχει αιθανόλη και το διάλυμα φυγοκεντρείται πάλι. Με τον τρόπο αυτό εκπλένονται από το διάλυμα τα άλατα και τα dntps που χρησιμοποιήθηκαν στην αντίδραση. Ο κύκλος της πλύσης με το ρυθμιστικό της αιθανόλης επαναλαμβάνεται και το ίζημα στη συνέχεια ξηραίνεται στους 37 C. Η έκλουση του DNA από τα σωματίδια σίλικα πραγματοποιείται με διαλυτοποίηση σε απιονισμένο Η2Ο, επώαση σε θερμοκρασία δωματίου και τακτές αναδεύσεις για min. Καθώς τα συγκεκριμένα προϊόντα είχαν μεγάλο μοριακό βάρος η επώαση έγινε σε θερμοκρασία 55 C, η οποία σύμφωνα με τον κατασκευαστή βελτιώνει την απόδοση κατά τον καθαρισμό τμημάτων DNA μεγέθους > 5-10 kb. Τέλος το διάλυμα επαναφυγοκεντρείται και το υπερκείμενο που περιέχει το καθαρό DNA είναι έτοιμο να χρησιμοποιηθεί σε αντίδραση εύρεσης της νουκλεοτιδικής ακολουθίας Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης Το DNA αναλύεται με οριζόντια ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης (39). Παρασκευάζεται διάλυμα αγαρόζης συγκεντρώσεως από 0,6% ως 2,0% w/v σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ, με θέρμανση και όταν η θερμοκρασία του διαλύματος ελαττωθεί αρκετά προστίθεται 0,5 μg/ml βρωμιούχο αιθίδιο. Με την ελάττωση της θερμοκρασίας σχηματίζεται το πλέγμα της πηκτής, η πυκνότητα του οποίου εξαρτάται από τη συγκέντρωση της αγαρόζης. Με την εφαρμογή διαφοράς δυναμικού το μόριο του DNA κινείται προς την κάθοδο, εξαιτίας του αρνητικού του φορτίου. Η ηλεκτροφορητική του κινητικότητα καθορίζεται από το μέγεθός του και από τη διαμόρφωσή του. Το υπερελικωμένο πλασμίδιο κινείται ταχύτερα, ακολουθεί το γραμμικό (ύστερα από κοπή με κάποιο ένζυμο περιορισμού) και τέλος το κυκλικό. Για την ανάλυση μορίων DNA μικρής μοριακής μάζας χρησιμοποιείται πηκτή αγαρόζης μεγάλης συγκέντρωσης ή πραγματοποιείται κατακόρυφη ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Το ρυθμιστικό διάλυμα των ηλεκτροδίων που

117 χρησιμοποιείται είναι το ΤΒΕ (89 mm Tris-boric, 2 mm EDTA, ph 8,0). Τα δείγματα περιέχουν 5% v/v γλυκερόλη και 0,04% w/v κυανό της βρωμοφαινόλης. Το DNA σχηματίζει σύμπλοκο με το βρωμιούχο αιθίδιο που είναι ορατό κατά την έκθεσή του σε υπεριώδη ακτινοβολία (254 nm) επειδή το ίδιο εκπέμπει την ακτινοβολία που απορρόφησε στην ορατή περιοχή (590 nm). Η ένταση της ακτινοβολίας αυτής είναι ανάλογη της ποσότητας του DNA Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Κατά την ηλεκτροφόρηση με αποδιατακτικές συνθήκες SDS (μετά νατρίου άλας του θεεικού δωδεκυλίου) οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται με βάση τη μοριακή τους μάζα (43). Στο συγκεκριμένο είδος ηλεκτροφόρησης ως αποδιατακτικό μέσο χρησιμοποιείται το ανιονικό απορρυπαντικό δωδεκαθειικό νάτριο (SDS). Το SDS δεσμεύεται με υδρόφοβους δεσμούς στη ραχοκοκαλιά της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και την αποδιατάσσει σε αναλογία 1,4 gr ανά gr πρωτεΐνης, η οποία δεν εξαρτάται από τη φύση της πρωτεΐνης. Έτσι, δημιουργούνται επιμήκη μόρια, αρνητικά φορτισμένα, με σαφή και καθορισμένη δομή. Το ποσό του SDS που δεσμεύεται είναι αρκετά σταθερό. Επειδή το φορτίο ανά μονάδα μάζας είναι περίπου σταθερό και οι υδροδυναμικές ιδιότητες είναι συνάρτηση μόνο του μοριακού μεγέθους, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων, κάτω από αυτές τις συνθήκες, εξαρτάται αποκλειστικά από το μοριακό μέγεθος. Το σύστημα που χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό των διαφόρων πρωτεϊνικών παρασκευασμάτων, αποτελείται από την πηκτή διαχωρισμού (separating gel) και την πηκτή επιστοίβαξης (stacking gel), οι ποσότητες των οποίων φαίνονται στους Πίνακες 2.3. και 2.4. :

118 Πινακας 2.3. Separating gel (10%) Acrylamide : Bis-acrylamide (29:1) 6.6 ml Tris-HCl M (ph=8.9) SDS (10%) APS (10%) 4 ml 200 μl 240 μl TEMED ddh2o 30 μl 9 ml Σύνολο 20ml Πινακας 2.4. Stacking gel Acrylamide : Bis-acrylamide (29:1) Tris-HCl M (ph=6.8) 0.6 ml 1 ml SDS (10%) APS (10%) 50 μl 40 μl TEMED 12 μl ddh2o Σύνολο 3.3 ml 5ml

119 Το διάλυμα ηλεκτροδίων (running buffer) περιέχει Tris, γλυκίνη και SDS. Τα δείγματα πριν εισέλθουν στην πηκτή επιστοίβαξης αναμιγνύονται με διάλυμα φόρτωσης (loading buffer) το οποίο περιέχει β-μερκαπτοαιθανόλη 1% v/v που προκαλεί αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών και το διαχωρισμό των υπομονάδων των πρωτεϊνών, αν υπάρχουν. Στην 1η διαδρομή φορτώνουμε τους μάρτυρες (2μl) και στις άλλες τα δείγματα. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται αρχικά με σταθερή τάση 50 Volt, ενώ όταν εισέλθουν τα δείγματα στο separating gel η τάση αυξάνεται στα 100 Volt Χρώση με Coomassie Brilliant Blue R-250 Η μέθοδος βασίζεται στο σχηματισμό συμπλόκου, κυανού χρώματος, των πρωτεϊνών και της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB) όπως και στη μέθοδο Bradford (44). Η στερέωση και η χρώση των πρωτεϊνών γίνεται ταυτόχρονα με εμβάπτιση της πηκτής σε διάλυμα 0.1 w/v CBB R-250, 10% v/v οξικού οξέος και 50% v/v μεθανόλης. Ο αποχρωματισμός της πηκτής γίνεται με ανακίνηση σε διάλυμα 10% v/v οξικού οξέος και 45% v/v μεθανόλης, με συχνές αλλαγές μέχρι να παραμείνουν χρωματισμένες μόνο οι πρωτεϊνικές ζώνες. Με τη μέθοδο αυτή είναι δυνατή η ανίχνευση μέχρι και 0.1 μg πρωτεΐνης Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών σε μεμβράνη Εφόσον διαχωριστούν οι πρωτεΐνες σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία SDS, είναι δυνατή η μεταφορά τους σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου (45). Η διαδικασία αυτή είναι γνωστή ως western blotting και βασίζεται στο γεγονός ότι οι πρωτεΐνες είναι με τη μορφή ενός αρνητικά φορτισμένου συμπλόκου με το SDS. Η εφαρμογή διαφοράς δυναμικού στη πηκτή έχει ως αποτέλεσμα τη μετακίνηση των πρωτεϊνών προς την άνοδο, την έξοδο τους

120 από την πηκτή και τέλος τη καθήλωσή τους στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Μετά την ηλεκτροφόρηση η πηκτή εμβαπτίζεται σε ρυθμιστικό διάλυμα 12,5 mm Tris-βορικό και 0,02 SDS με ph 8,5. Στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα εμβαπτίζεται και η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και τα φύλλα Whatmann 3 mm, που τοποθετούνται πάνω και κάτω από την πηκτή και τη μεμβράνη. Προς την άνοδο της συσκευής ηλεκτρομεταφοράς τοποθετείται η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, ενώ προς την κάθοδο η πηκτή. Η ηλεκτρομεταφορά στη παρούσα εργασία έγινε στη συσκευή Semidry Electroblotting Unit V10-SDB της Scie-Plas, υπό σταθερή ένταση ρεύματος 64 ma για χρονικό διάστημα 30 λεπτών Ανοσοαποτύπωση Με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης επιτυγχάνεται η ανίχνευση μιας πρωτεΐνης, η οποία έχει προηγουμένως δεσμευθεί σε μεμβράνη. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιείται ειδικό πρωτεύον αντίσωμα το οποίο έχει αναπτυχθεί έναντι ουράς ιστιδινών η οποία είναι συνδεδεμένη με την επιθυμητή πρωτείνη. Αντιγόνο και αντίσωμα σχηματίζουν ένα πρώτο σύμπλοκο στη μεμβράνη. Ακολουθεί επώαση της μεμβράνης με δευτερεύον αντίσωμα, το οποίο βρίσκεται δεσμευμένο ομοιοπολικά με ένα ένζυμο δείκτη. Το δευτερεύον αντίσωμα αναγνωρίζει το πρωτεύον και σχηματίζει σύμπλοκο με αυτό στη μεμβράνη, ενώ το ένζυμο-δείκτης που φέρει καταλύει μια χρωμογόνο αντίδραση, το προϊόν της οποίας είναι δυσδιάλυτο και χρωματίζει τη μεμβράνη στην περιοχή του αντιγόνου (πρωτεΐνης) (45). Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για την ανοσοαποτύπωση είναι η εξής: Αρχικά η μεμβράνη εμβαπτίζεται σε 5% w/v διάλυμα σκόνης γάλακτος (άπαχο γάλα εμπορίου) σε PBS (8 g/l NaCI, 0,2 g/l KCI, 1,15 g/l Na2HPO4 και 0,2 g/l KH2PO4), για να κορεσθεί με τις πρωτεΐνες του, κυρίως την καζεΐνη, ώστε να αποφευχθεί η μη εξειδικευμένη δέσμευση του αντισώματος στη μεμβράνη. Η μεμβράνη επωάζεται με το διάλυμα γάλακτος σε PBS για 2 ώρες σε θερμοκρασία

121 δωματίου, ενώ ακολουθούν δύο 10λεπτες πλύσεις της με διάλυμα 100 ml PBS στο οποίο έχουν προστεθεί 500 μl tween-20. Στη συνέχεια προστίθενται στη μεμβράνη 10 ml διαλύματος γάλακτος-pbs 5% w/v, και 2 μl του πρώτου αντισώματος και αφήνεται για επώαση 12 περίπου ώρες. Ακολουθούν δύο δεκάλεπτες πλύσεις με το διάλυμα PBS-Tween, για την απομάκρυνση αντισωμάτων που δε δεσμεύτηκαν και προστίθεται το διάλυμα του γάλακτος με 5 μl του δεύτερου αντισώματος. Η μεμβράνη αφήνεται 2 ώρες για επώαση, ενώ η εμφάνιση της πρωτεΐνης πραγματοποιείται με νέα επώαση (σε 9ml νερό και 1 ml αλκαλική φωσφατάση) σε ρυθμιστικό διάλυμα 100 mm Tris-HCI ph 9,5, 100 mm NaCI και 5 mm MgCI2 στο οποίο έχει προστεθεί 1 ml του υποστρώματος της αλκαλικής φωσφατάσης, 30 μl 5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλ φωσφορικό (BCIP) υποστρώματος του ενζύμου -δείκτη και 60 μl της χρωστικής κυανού του νιτροτετραζολίου (NBT) για τη βαφή και την τελική αποκάλυψη της πρωτεΐνης Συμπύκνωση Για τη συμπύκνωση ενός παρασκευάσματος μπορεί να χρησιμοποιηθεί η κλασματική καθίζηση με θειικό αμμώνιο, η υπερδιήθηση, η λυοφίλυση και η φυγοκέντρηση σε κενό (46). Στην παρούσα εργασία η λυοφίλιση πραγματοποιείται με πάγωμα του δείγματος και εξάχνωση του διαλύτη σε συσκευή ALPHA I-S της M.CHRIST. Και τέλος η φυγοκέντρηση υπό κενό, σε συσκευή speed-vac Savant SC 100, όπου ο διαλύτης εξατμίζεται. Η φυγοκέντρηση μπορεί να γίνει και με θέρμανση των δειγμάτων

122 2.23. Προσδιορισμός πρωτεινών με χρωματομετρική μέθοδος κατά Bradford τροποποιημένη κατά Bearden Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνών και βασίζεται στην ιδιότητα της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G- 250 να συμπλέκεται με τις πρωτεΐνες σε όξινο περιβάλλον. Ο σχηματισμός του συμπλόκου έχει ως αποτέλεσμα τη μετατόπιση του μέγιστου της απορρόφησης της χρωστικής από τα 465 nm στα 595 nm. Το αντιδραστήριο Bradford παρασκευάζεται με διάλυση της χρωστικής σε πυκνό φωσφορικό οξύ (85% v/v), σε συγκέντρωση 1 mg/ml. Το αντιδραστήριο αναδεύεται 12 ως 16 ώρες και στη συνέχεια αραιώνεται με Η2Ο σε πενταπλάσιο όγκο και διηθείται. Χρησιμοποιείται σε αναλογία 1:1 με το δείγμα και μετράται η απορρόφηση στα 595 nm. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης γίνεται βάσει πρότυπης καμπύλης αναφοράς με γνωστές ποσότητες αλβουμίνης ορού βοδιού (BSA) Λύση κυττάρων με τη χρήση υπερήχων Η χρήση υπερήχων ανήκει στις μηχανικές μεθόδους λύσης των κυττάρων. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις περιπτώσεις όπου χρειάστηκε να διασπαστούν τα βακτηριακά κύτταρα κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων σε αυτή τη διπλωματική εργασία. Η συσκευή των υπερήχων περιλαμβάνει δύο κύριες μονάδες: τη συσκευή που παράγει το υπερηχητικό σήμα και τον μεταδότη που μεταφέρει τα υπερηχητικά κύματα στο κυτταρικό διάλυμα. Ένα μειονέκτημα που συνδέεται με αυτή τη μέθοδο είναι η αύξηση της θερμοκρασίας του διαλύματος που μπορεί να αλλοιώσει ή και να καταστρέψει ουσίες (π.χ. ευαίσθητα ένζυμα) που θα θέλαμε να μελετήσουμε. Το

123 πρόβλημα αυτό αντιμετωπίζεται με τη χρήση παγόλουτρου μέσα στο οποίο τοποθετείται το ποτήρι με το κυτταρικό διάλυμα σε όλη τη διάρκεια που εφαρμόζονται οι υπέρηχοι. Ένας εναλλακτικός τρόπος αντιμετώπισης αυτού του προβλήματος, είναι η εφαρμογή των υπερήχων κατά διαστήματα ώστε εν τω μεταξύ να χαμηλώνει και πάλι η θερμοκρασία του μεταδότη και του κυτταρικού διαλύματος. Ο δείκτης amplitude ρυθμίζεται στην τιμή 60 και ο δείκτης cycle ρυθμίζεται στην τιμή 0.7. Κατά τη διάρκεια χρήσης της συσκευής, ο χειριστής πρέπει να κάνει χρήση ακουστικών για λόγους προστασίας. Το ποτήρι εκτός από τα κύτταρα, περιλαμβάνει και 2.5 ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (μίγμα μονόξινου και δισόξινου φωσφορικού καλίου) ph=7.9 και συγκέντρωσης 50 mm. Η χρονική διάρκεια εφαρμογής των υπερήχων είναι λεπτά Εκφραση και καθαρισμός πρωτεΐνης που έχει συνδεδεμένη ουρά 6 ιστιδινών με στήλη αγχιστείας Νi 2+ -IDA αγαρόζης H στήλη Νi 2+ -IDA ανήκει σε μια ειδική κατηγορία στηλών χρωματογραφίας αγχιστείας που ονομάζεται IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography). Η ακολουθία των 6 ιστιδινών έχει τη δυνατότητα να δεσμεύεται στη στήλη δημιουργώντας, μέσω των ιμιδαζολίων, δεσμούς συναρμογής με το δισθενές κατιόν του νικελίου. To νιτριλο-τριοξικό οξύ (ΝΤΑ) είναι τετραδοτικό ligand, έτσι ώστε να συνδέεται με το ιόν του νικελίου με τέσσερις από τις 6 μονάδες συναρμογής που έχει η οκταεδρική του δομή, αφήνοντας δύο ελεύθερες μονάδες, για να συνδεθεί με δυο μόρια ιστιδίνης από την ουρά των 6 μορίων ιστιδίνης της πρωτεΐνης Εικόνα2.2. Το NTA έχει διαπιστωμένα πολύ αναπτυγμένες ικανότητες δέσμευσης του ιόντος του νικελίου, καλύτερες από άλλες χημικές ενώσεις. Επιπρόσθετα, οι στήλες νικελίου με το NTA δεσμεύουν φορές περισσότερο από ότι ανάλογες στήλες με ιμινο-διοξικό οξύ (NTA) (η πρώτη ένωση που χρησιμοποιήθηκε για τέτοιου είδους χρωματογραφίες)

124 Εικόνα 2.2. Σύνδεση δύο μορίων της ουράς πολυ-ιστιδινών μιας πρωτεΐνης σύντηξης σε στήλη Ni 2+ - IDA-αγαρόζης. Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται εναλλακτικά για την έκφραση πρωτεϊνών σε βακτηριακά κύτταρα και τον εύκολο καθαρισμό τους. Σύμφωνα με την τεχνική αυτή το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη, την έκφραση της οποίας επιθυμούμε, κλωνοποιείται σε κατάλληλο πλασμιδιακό φορέα ο οποίος φέρει εκτός των χαρακτηριστικών εκείνων που εξυπηρετούν την παραγωγή της πρωτεΐνης σε μεγάλες ποσότητες και μια αλληλουχία η οποία κωδικοποιεί έξι συνεχόμενες ιστιδίνες. Έτσι η πρωτεΐνη θα εκφραστεί με μια «ουρά» έξι ιστιδινών στο ένα της άκρο. Η μικρή αυτή αλληλουχία εξυπηρετεί τον εύκολο καθαρισμό της πρωτεΐνης με μια στήλη Ni +2 -αγαρόζης. Παράλληλα στο ρυθμιστικό διάλυμα συνυπάρχει και μια μικρή συγκέντρωση ιμιδαζολίου, ώστε να αποφεύγονται μη εξειδικευμένες άλληλεπιδράσεις με τα συστατικά του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος. Η έκλουση της πρωτεΐνης σύντηξης επιτυγχάνεται με την προσθήκη αυξημένης συγκέντρωσης ιμιδαζολίου το οποίο συναγωνίζεται με τις έξι ιστιδίνες για τις θέσεις δέσμευσης στο Ni

125 Κύτταρα BL21 μετασχηματισμένα με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα απλώνονται σε τριβλία με θρεπτικό υλικό LB/άγαρ που περιέχει 100 μg/ml αμπικιλλίνη και επωάζονται για 16 ώρες στους 37 C. Με επιλογή μιας αποικίας από το τρυβλίο, εμβολιάζονται 50 ml υγρού θρεπτικού υλικού LB (100 μg/ml αμπικιλλίνη) και το αιώρημα επωάζεται υπό ανάδευση για 16 ώρες στους 37 C. Με 10 ml από την παραπάνω καλλιέργεια εμβολιάζονται 500 ml LB (100 μg/ml αμπικιλλίνη) και επωάζονται υπό ανακίνηση στους 37 C έως ότου παρουσιάσει απορρόφηση Α590= Στην καλλιέργεια προστίθενται 5 mm IPTG και η θερμοκρασία επώασης μειώνεται στους 28 C. Μετά την πάροδο 2 ωρών επώασης της καλλιέργειας υπό ανακίνηση, γίνεται φυγοκέντρηση των κυττάρων για 20 λεπτά σε 4500xg στους 4 ο C και μετά την απόχυση του υπερκειμένου, κύτταρα αιωρούνται σε ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης LEW buffer (50 mm Tris-HCl ph 8,0, 300 mm NaCl, 5 mm ιμιδαζόλιο και 1% v/v Triton X-100) και ακολουθεί λύση των κυττάρων έπειτα από κατεργασία με λυσοζύμη 1 mg/ml και ρήξη των μεμβρανών, η οποία γίνεται με τη χρήση υπερήχων για 10 χρονικά διαστήματα των 15 δευτερολέπτων, μεσολαβώντας κάθε φορά, μία παύση 15 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο, ώστε να μην υπερθερμανθεί το δείγμα. Στη συνέχεια το αιώρημα φυγοκεντρείται για 30 min σε xg στους 4 ο C και παραλαμβάνεται το υπερκείμενο. Η δέσμευση της πρωτείνης θα πραγματοποιηθεί με στήλη Ni +2 -αγαρόζης Protino Ni-NTA της εταιτείας MACHEREY-NAGEL. Οι στήλες εξισορροπούνται με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που έγινε η αιώρηση των κυττάρων. Ακολουθεί εισαγωγή του υπερκειμένου μέσα στην εξισορροπημένη στήλη με σκοπό την αποστράγγιση του με τη βοήθεια της βαρύτητας. Ακολουθούν δύο πλύσεις της στήλης με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που έγινε η αιώρηση των κυττάρων. Η έκλουση της πρωτεΐνης σύντηξης γίνεται με την εισαγωγή στη στήλη διαλύματος Elution buffer 50 mm Na2HPO4 ph 8.0, 300 mm NaCl και 300 mm ιμιδαζολίου, τέσσερις συνεχόμενες φορές. Από τα υπερκείμενα, προτού τα φυλάξουμε στους 20 C, παραλαμβάνονται δείγματα των 10 μl, ώστε μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου

126 και βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250, να αποφανθούμε για την απόδοση της έκφρασης της πρωτεΐνης Οξείδωση νανοσωλήνων άνθρακα Οι νανοσωλήνες πολλαπλού τοιχώματος, εξωτερικής διαμέτρου 20-30nm, κατασκευασμένοι με τη μέθοδο της χημικής απόθεσης με ατμό (CVD), αγοράσθηκαν από την εταιρεία Nanoamor (95% καθαρότητα, εξωτερική διάμετρος x πάχος τοιχώματος x μήκος : nm x 1-2 nm x 0,5-2 μm). Στη συνέχεια οι MWCNTs θερμαίνονται με την προσθήκη των οξέων, θειικό οξύ (H2SO4) και νιτρικό οξύ (HNO3) ώστε να καθαριστούν και να δημιουργηθούν καρβοξυλικές ομάδες στα άκρα τους (19). Εικόνα Προσθήκη καρβοξυλικών ομάδων στα τοιχώματα των νανοσωλήνων άνθρακα Πιο αναλυτικά οι MWCNTs (50mg) τοποθετήθηκαν σε μείγμα 2,5ml συμπυκνωμένων H2SO4/HNO3 αναλογίας 3:1 v/v. Το εναιώρημα που προέκυψε αραιώνεται στη συνέχεια με παγωμένο νερό 5ml. Τα περιττά ανόργανα οξέα καθώς και το νερό απομακρύνονται με διήθηση (Millipore 0,5μm) (19). Το μαύρο στερεό που προέκυψε από τη διήθηση υφίσταται εκτενή πλύση με NaOH 0,1 M και ακολούθως με 0,1 Μ HCl ώστε να απομακρυνθούν απομεινάρια

127 της οξείδωσης και στη συνέχεια πλύση με απιονισμένο νερό, έως ότου οι εκλούσεις να είναι ουδέτερες (19) Προσάρτηση διαμίνης NH2(CH2CH2O)2-CH2CH2NH2 Τα MWCNTs-COOH που προέκυψαν από τις παραπάνω αντιδράσεις, αφέθηκαν να στεγνώσουν, σε θερμοκρασία δωματίου, υπό συνθήκες κενού. Το εναιώρημα των MWCNTs-COOH (40mg) τοποθετήθηκε σε oxalyl chloride (2ml) και αναδεύτηκε στους 62 ο C για 24 ώρες. Το περιττό oxalyl chloride απομακρύνθηκε με θέρμανση στους 60 o C υπό κενό και στη συνέχεια μέσα στο μείγμα όπου είχαν δημιουργηθεί MWCNTs-COΟΗ προστέθηκε 20ml -NH2(CH2CH2O)2-CH2CH2NH2 και το μείγμα θερμάνθηκε για 48h με ταυτόχρονη ανακίνηση (19). Εικόνα 2.4. Προσάρτηση διαμίνης στους νανοσωλήνες Μετά την επαναφορά του σε θερμοκρασία δωματίου, το διάλυμα διηθείται (Millipore 0,5μm) και η περισσότερη από την περιττή αμίνη απομακρύνεται με θέρμανση υπό κενό 66,67 Pa. Για την εξάλειψη όλης της περιττής αμίνης, το εναπομείναν σκούρο-καστανό υγρό διαλύεται σε μεθανόλη και χύνεται αργά σε αιθανόλη κάτω από ισχυρή ανάδευση. Αυτό προκάλεσε τη δημιουργία δύο φάσεων, α) ενός κολλώδους υγρού που αποτελείται από υψηλής λειτουργικότητας MWCNTs και b) μιας οργανικής φάσης