Μύκητες Βασίλειο Των Μυκήτων Ευκαρυωτικοί μη φωτοσυνθετικοί οργανισμοί είδη, (3%) έχουν περιγραφεί λοιμώξεις σε ανοσοεπαρκείς

Transcript

1 Μύκητες Βασίλειο Των Μυκήτων Ευκαρυωτικοί μη φωτοσυνθετικοί οργανισμοί είδη, (3%) έχουν περιγραφεί λοιμώξεις σε ανοσοεπαρκείς

2 Το δένδρο της ζωής

3 Ταξινόμηση Μικροοργανισμών Ευκαρυωτικά κύτταρα Μύκητες (πρώτιστα) Πρωτόζωα (πρώτιστα) Μετάζωα ή έλμινθες (ζωϊκό β.) Προκαρυωτικά κύτταρα Βακτήρια ή ευ-βακτήρια Αρχαιοβακτήρια Ιοί (δεν είναι κύτταρα) ( nm) Ιοειδή (5 nm) Prions (<5 nm)

4 Χαρακτηριστικά προκαρυωτικών - ευκαρυωτικών Χαρακτηριστικό Προκαρυωτικό Ευκαρυωτικό DNA με πυρηνική μεμβράνη Όχι Ναι Μίτωση Όχι Ναι Χρωμοσώματα Ένα Πολλά Μιτοχόνδρια Όχι Ναι Μέγεθος ριβοσωμάτων 70S 80S

5 Χαρακτηριστικά μυκήτων Μύκητες Φυτά Ζώα Κυτταρικό τοίχωμα Κυτταροπλασματική μ. Χιτίνη και γλυκάνη Εργοστερόλη Κυτταρίνη Φυτοστερόλη Όχι Ετερότροφοι Ναι Χλωροφύλλη Όχι Ναι Όχι Πυρήνας Απλοειδής (περισσότεροι) 6-20 χρωμοσώματα Διπλοειδής στην C. albicans Διπλοειδής Διπλοειδής Δομή Απλούστερη Όργανα Οργανα, ιστοί Αναπαραγωγή Σπόρια

6 Μύκητες Ταξινόμηση ανάλογα: Μορφολογίας Τρόπου πολλαπλασιασμού Γενετικά χαρακτηριστικά

7 Μύκητες Μακρομύκητες (μανιτάρια) Μικρομύκητες Μυκηλιακοί ή υφομύκητες (moulds) Ζύμες ή βλαστομύκητες (yeasts) Δίμορφοι μύκητες

8 ΚΑΤΩΤΕΡΟΙ ΜΥΚΗΤΕΣ ΑΝΩΤΕΡΟΙ ΜΥΚΗΤΕΣ Υφομύκητες Aseptate Hyphae Υφές χωρίς διαφραγμάτια Διάμετρος 6-10 μm Septate Hyphae Υφές με διαφραγμάτια Διάμετρος 3-4 μm

9 Υφομύκητες ΚΑΤΩΤΕΡΟΙ ΜΥΚΗΤΕΣ ΑΝΩΤΕΡΟΙ ΜΥΚΗΤΕΣ Aseptate Hyphae Υφές χωρίς διαφραγμάτια σε σταθερά διαστήματα Διάμετρος 6-10 μm ΖΥΓΟΜΥΚΗΤΕΣ Septate Hyphae Υφές με διαφραγμάτια Διάμετρος 3-4 μm ΑΣΚΟΜΥΚΗΤΕΣ ΒΑΣΙΔΙΟΜΥΚΗΤΕΣ ΔΕΥΤΕΡΟΜΥΚΗΤΕΣ Κενοκυτικές υφές

10 Υφομύκητες Μυκήλιο Πλέγμα υφών Θαλλός Σύνολο μυκηλίων ΒΛΑΣΤΙΚΟ ή ΘΑΛΛΙΚΟ Στο θρεπτικό υλικό ΕΝΑΕΡΙΟ ή ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΚΟ Πάνω από την επιφάνεια του θρεπτικού υλικού Μέσα αναπαραγωγής μύκητα: σπόρια ή κονίδια Φυγόκεντρη ανάπτυξη Στρογγυλή αποικία in vitro Κυκλική πλάκα in vivo

11 Ζυμομύκητες Μονοκύτταροι μονοπύρηνοι οργανισμοί Βλαστοκονίδια ή βλαστοσπόρια Ψευδοϋφές: αλυσίδες επιμηκυμένων βλαστοκονιδίων Ψευδομυκήλιο: πλέγμα ψευδοϋφών βλαστοκονίδια περίσφιγξη εκβλάστηση θυγατρικού κυττάρου

12 Πολλαπλασιασμός Ασεξουαλικός: μίτωση (βλαστική ανάπτυξη / εκβλάστηση θυγατρικού κυττάρου από το μητρικό κύτταρο) ανάμορφοι Μ Σεξουαλικός: μείωση (σύζευξη δύο διαφορετικών στελεχών ή σύζευξη δύο μυκηλιακών κυττάρων / βλαστοκυττάρων του ίδιου μύκητα) [2 πυρήνες σε ζυγώτη] τελειόμορφοι Μ Περισσότερα ανάμορφα στάδια: συνανάμορφοι Όλα τα στάδια γνωστά: ολόμορφοι

13 Ταξινόμηση μυκήτων ιατρικής σημασίας Μυκηλιακοί μύκητες Ζυγομύκητες Κοινοκυττάριες ή κενοκυττικές υφές Ζυγώτης Σπόροι ενδογενείς (sporangiospore) sporangium Αντιπροσωπευτικά γένη: Lichtheimia (Absidia) Mucor Rhizopus Rhizomucor Conidiobolus Basidiobolus

14 Ταξινόμηση μυκήτων ιατρικής σημασίας Μυκηλιακοί μύκητες Ασκομύκητες Αληθείς υφές με εγκάρσια διαφράγματα Ασκοσπόριο Κονίδιο (κονιδιοσπόριο) Αντιπροσωπευτικά γένη: Aspergillus Penicillium Paecilomyces Fusarium Δερματόφυτα Blastomyces dermatitis * Histoplasma capsulatum *

15 Ταξινόμηση μυκήτων ιατρικής σημασίας Βασιδιομύκητες και ατελείς μύκητες Βασιδιομύκητες Ψευδοϋφές (σπάνια) Βασιδιοσπόριο Βλαστοκονίδιο Ανάμορφοι (ατελείς) μύκητες Ψευδοϋφές και αληθείς υφές Αντιπροσωπευτικό είδος: Cryptococcus neoformans Βλαστοκονίδιο, αρθροσπόριο Αντιπροσωπευτικά γένη: Candida Trichosporon Geotrichum

16 Σεξουαλικός πολλαπλασιασμός Γαμετοκύστεις (θήκες με λεπτό τοίχωμα) Anteridium (αρσενικό) Oogonium (θυληκό) Γαμέτες (μειοσπόρια) ΚΑΤΩΤΕΡΟΙ ΜΥΚΗΤΕΣ (ΖΥΓΟΜΥΚΗΤΕΣ) Γαμετοκύστεις = τελικά τμήματα υφών εμιμήκυνση του ενός προς το άλλο (zygophore) σύντειξη τοιχωμάτων Zygosporagium ενός zygospore δημιουργία στο εσωτερικό σποροκύστη

17 Σεξουαλικός πολλαπλασιασμός Ασκοσκάρπιο κλειστοθήκιο περιθήκιο γυμνοθήκιο Δύο γενετικά συμβατές υφές Ασκογόνιο (-) Ανθερίδιο (+) Ασκοσπόριο ΑΣΚΟΜΥΚΗΤΕΣ Σύντηξη των άκρων των υφών βραχεία δικαρυωτική υφή σύντηξη πυρήνων (καρυογαμία) μείωση μία ή διαδοχικές μιτώσεις ασκός = εξειδικευμένη και διευρυμένη υφή με 4-8 (+ & -) ασκοσπόρια μέσα στο ασκοκάρπιο

18 Σεξουαλικός πολλαπλασιασμός Δύο γενετικά συμβατές υφές Βασιδιοσπόριο ΒΑΣΙΔΙΟΜΥΚΗΤΕΣ Σύντηξη των άκρων των υφών διπύρηνη υφή επέκταση και σχηματισμός μικρής προεκβολής (σύνδεσμος επικοινωνίας clamp connection) διπλασιασμός πυρήνων και μεταφορά ενός ζεύγους πυρήνων από το ένα τμήμα της υφής στο άλλο μέσω της προεκβολής καρυογαμία στο άκρο της υφής βασίδιο (στο βασιδιοκάρπιο) 4 βασιδιοσπόρια (2+ και 2-

19 Ταξινόμηση Φύλο Μορφολογία Υφές Σεξουαλική αναπαραγωγή Ασεξουαλική αναπαραγωγή Χυτριδιομύκητες Chytridiomycota Ζυγομύκητες Zygomycota Ασκομύκητες Ascomycota Μονοκύτταροι Ωοσπόρια ζωοσπόρια 1000 είδη Μη παθογόνα Υφομύκητες Υδάτινο Ευρείες περιβάλλον Ζυγοσπόρια Σποραγγειοσπόρια όχι διαφραγμάτια Υφομύκητες Λεπτές με διαφραγμάτια Ασκοσπόρια Κονίδια Βασιδιομύκητες Basidiomycota Υφομύκητες (σπάνια) Ζύμες Λεπτές με διαφραγμάτια Βασιδιοσπόριο Κονίδια (σπάνια) Ανάμορφοι Δευτερομύκητες Υφομύκητες Ζύμες Ψευδο- & αληθείς υφές Άγνωστη Κονίδια

20 Οικολογία - Επιδημιολογία Ενδογενής προέλευση Γαστρεντερικός σωλήνας: C. albicans Δέρμα: άλλα είδη Candida, Geotrichum Εξωγενής προέλευση Έδαφος: H. capsulatum, C. neoformans, A. fumigatus, ζυγομύκητες (Mucor, ) Οικολογικές φωλιές με οργανικά υπολείμματα Κοσμολίτικη κατανομή Candida, Cryptococcus, Aspergillus, δερματόφυτα,... Περιορισμένη γεωγραφική κατανομή χρωμοβλαστομυκητίαση, μυκητώματα σε τροπικά/υποτροπικά κλίματα Ενδημική κατανομή Histoplasma duboisii στην Κ. Αφρική, P. marneffei ΝΑ Ασία

21 Παθογένεια Μηχανισμοί παθογόνου δράσης: Προσκόλληση Είδη μουκορμυκώσεων: βλεννογόνος ρινός Κονίδια Aspergillus: βλεννογόνος αναπνευστικού C. albicans: βλεννογόνος στόματος, κόλπου επιφάνειες από πλαστικό Διείσδηση στους ιστούς Μέσω ΜΦ μετά φαγοκυττάρωση: C. immitis, H. capsulatum Ένζυμα: ελαστάση Α. fumigatus πρωτεάση C. albicans Ιστικός πολλαπλασιασμός Ικανότητα πολλαπλασιασμού στους 37 ο C Τροπισμός προς αγγεία Aspergillus προς μήνιγγες και νευρικό ιστό Cryptococcus

22 Παθογένεια Μηχανισμοί παθογόνου δράσης: Διαφυγή ή τροποποίηση αμυντικών μηχανισμών ξενιστή Έλυτρο προς αποφυγή φαγοκυττάρωσης: Cryptococcus Προσκολλητίνες που μιμούνται υποδοχέα του συμπληρώματος (CR3 CR2): C. albicans Γλοιοτοξίνες ανασταλτικές της φαγοκυτταρικής λειτουργίας των ΜΦ: Α. fumigatus

23 Παθογόνος δράση ασπέργιλλου

24 Παθογόνος δράση ζυγομυκήτων Οι ζυγομύκητες είναι μοναδικοί μεταξύ των υφομυκήτων στην ικανότητα να προκαλούν λοιμώξεις σε μεγαλύτερο φάσμα ασθενών, από ότι άλλοι ευκαιριακοί παθογόνοι υφομύκητες. Εισπνοή των σπόρων τους ή εναπόθεσή τους στις ρινικές θαλάμες. Η δερματική ζυγομύκωση είναι η πρώτη εκδήλωση σε ανοσοεπαρκείς ασθενείς, ως αποτέλεσμα εμβολιασμού μεγάλου φορτίου σπόρων σε βαθύτερους ιστούς του δέρματος, λόγω εκτεταμένου τραυματισμού ή εγκαύματος. Οι σπόροι των ζυγομυκήτων αποτελούν τις τυπικές λοιμογόνες μορφές των παραρρινίων και του δέρματος Kυψελιδικά μακροφάγα: πρώτη γραμμή άμυνας Για πρόκληση Ουδετερόφιλα: λοίμωξης πρέπει δεύτερη οι γραμμή ζυγομύκητες άμυνας να καταναλώσουν Οι αγγειοδιηθητικές από τον νηματοειδές ξενιστή αρκετό μορφές σίδηρο είναι για υπεύθυνες να αναπτυχθούν για, να αποφύγουν τη διείσδυση τους στους φαγοκυτταρικούς ιστούς και τη διασπορά αμυντικούς τους μηχανισμούς σε διάφορα και να διεισδύσουν όργανα. στα αγγεία για να διασπαρούν.

25 Παθογένεια Μηχανισμοί άμυνας: Δέρμα Τραυματισμός: κρυπτοκόκκωση, χρωμομύκωση, σποροτρίχωση Προϋπάρχουσες βλάβες (έγκαυμα): Aspergillus Λύση συνεχείας του λόγω ιατρικών χειρισμών Καθετήρες: καντιντίαση Χειρουργικοί χειρισμοί: ασπεργίλλωση Φαγοκυττάρωση (ΠΜΠ, ΜΦ) Ουδετεροπενικοί: καντιντίαση, ασπεργίλλωση, μουκορμύκωση Συμπλήρωμα C3a, C5a: χημειοταξία ic3b: οψονινοποίηση Τ-λεμφοκύτταρα Το MAC δεν είναι ικανό από μόνο του να καταστρέψει κάποιο μύκητα AIDS:κρυπτοκόκκωση, ιστοπλάσμωση, κοκκιδιοειδομυκητίαση, επιφανειακές καντιντιάσεις Β-κύτταρα: όχι σημαντικός ρόλος ΝΚ-κύτταρα: πειραματική λ. από Cryptococcus

26 Παθογένεια Διάκριση μυκήτων σε 5 ομάδες: Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ασθενούς εισπνοή σπόρων νόσος σε «υγιείς» Ιστοπλάσμωση, βλαστομυκητίαση, κοκκιδιοειδομυκητίαση, παρακοκκιοειδομυκητίαση Πρόκληση λοίμωξης ως αποτέλεσμα τραυματισμού Σποροτρίχωση, χρωμοβλαστομύκωση Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ατόμου λοίμωξη σε άτομο με ανοσολογική ανεπάρκεια Είσοδος από βλεννογόνους: μουκορμύκωση (ζυγομύκωση) Είσοδος με εισπνοή σπόρων: κρυπτοκόκκωση, ασπεργίλλωση Σαπροφυτικοί μύκητες που γίνονται ευκαιριακά λοιμογόνοι λόγω ορισμένων συνθηκών Καντιντίαση Δερματόφυτα: επιφανειακές λοιμώξεις δέρματος, τριχών, νυχιών

27 Histoplasmosis (Histoplasma capsulatum)

28 Coccidioidomycosis (Coccidioides immitis) Arthroconidia Blastomycosis (Blastomyces dermatitis)

29 Paracoccidioidomycosis (Paracoccidioides brasiliensis)

30 Παθογένεια Διάκριση μυκήτων σε 5 ομάδες: Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ασθενούς εισπνοή σπόρων νόσος σε «υγιείς» Ιστοπλάσμωση, βλαστομυκητίαση, κοκκιδιοειδομυκητίαση, παρακοκκιοειδομυκητίαση Πρόκληση λοίμωξης ως αποτέλεσμα τραυματισμού Σποροτρίχωση, χρωμοβλαστομύκωση Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ατόμου λοίμωξη σε άτομο με ανοσολογική ανεπάρκεια Είσοδος από βλεννογόνους: μουκορμύκωση (ζυγομύκωση) Είσοδος με εισπνοή σπόρων: κρυπτοκόκκωση, ασπεργίλλωση Σαπροφυτικοί μύκητες που γίνονται ευκαιριακά λοιμογόνοι λόγω ορισμένων συνθηκών Καντιντίαση Δερματόφυτα: επιφανειακές λοιμώξεις δέρματος, τριχών, νυχιών

31 Χρωμοβλαστομύκωση Από Cladophialophora Μυκήτωμα Άμεσο Καλλιέργεια

32 Παθογένεια Διάκριση μυκήτων σε 5 ομάδες: Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ασθενούς εισπνοή σπόρων νόσος σε «υγιείς» Ιστοπλάσμωση, βλαστομυκητίαση, κοκκιδιοειδομυκητίαση, παρακοκκιοειδομυκητίαση Πρόκληση λοίμωξης ως αποτέλεσμα τραυματισμού Σποροτρίχωση, χρωμοβλαστομύκωση Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ατόμου λοίμωξη σε άτομο με ανοσολογική ανεπάρκεια Είσοδος από βλεννογόνους: μουκορμύκωση (ζυγομύκωση) Είσοδος με εισπνοή σπόρων: κρυπτοκόκκωση, ασπεργίλλωση Σαπροφυτικοί μύκητες που γίνονται ευκαιριακά λοιμογόνοι λόγω ορισμένων συνθηκών Καντιντίαση Δερματόφυτα: επιφανειακές λοιμώξεις δέρματος, τριχών, νυχιών

33 Ζυγομύκωση Ρινοκρανιακή Δερματική

34 Ζυγομύκητες Μυκηλιακοί μύκητες Mycorales Διαδεδομένοι στη φύση Σαπρόφυτα Έδαφος Αποθηκευμένοι σπόροι Φρούτα Επιμόλυνση Κοπράνων Δειγμάτων δέρματος Rhizopus arrhizus (oryzae) R. rhizopodiformis Lichtheimia (Absidia) corymbifera Rhizomucor pusillus

35 Absidiacae Absidia s. str.: αναπτύσσονται σε θερμοκρασίες < 40 C (μεσοφιλικοί) Leptomyces (μεσοφιλικοί) Lichtheimia: καλή ανάπτυξη σε θερμοκρασία σώματος L. corymbifera L. ramosa L. ornata Boekhout Τ et al. 2009, 3:

36 Κρυπτοκόκκωση (Cryptococcus neoformans)

37 Μυκηλιακοί μύκητες Ασκομύκητες-Hyaline Hyphomycetes Aspergillus A. fumigatus, A. flavus, Διαδεδομένος στη φύση Έδαφος, οργανικά υπολλείματα Ρούχα Κλιματιστικά υγραντές αέρα Υγρά διαλύματα Μεγάλη παραγωγή σπόρων σπόροι / gr. Aerosol σε χειρισμούς της αποικίας 12χ10 6 σπόροι/m 3 Μέγεθος και μορφολογία ευνοούν τη διασπορά με αέρα δίοδος από αναπνευστικό, μέχρι πν. κυψελίδες

38 Μυκηλιακοί μύκητες Ασκομύκητες-Hyaline Hyphomycetes Penicillium Διαδεδομένος στη φύση Οργανικά υπολλείματα Σε αποσύνθεση Παλιά Χρησιμοποίηση στη βιομηχανία τυριού Παραγωγή πενικιλλίνης P. chrysogenum Παραγωγή γριζεοφουλβίνης P. marneffei P. griseofulvum

39 Μυκηλιακοί μύκητες Ασκομύκητες-Hyaline Hyphomycetes Fusarium Διαδεδομένος στη φύση Σαπρόφυτα ή παράσιτα φυτών Δημητριακά Ρύζι Φρούτα Καλαμοσάκχαρο Βαμβάκι Τοξίνες (Μολυσμένα δημητριακά) Acremonium (100 είδη) Διαδεδομένος στη φύση

40 Παθογένεια Διάκριση μυκήτων σε 5 ομάδες: Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ασθενούς εισπνοή σπόρων νόσος σε «υγιείς» Ιστοπλάσμωση, βλαστομυκητίαση, κοκκιδιοειδομυκητίαση, παρακοκκιοειδομυκητίαση Πρόκληση λοίμωξης ως αποτέλεσμα τραυματισμού Σποροτρίχωση, χρωμοβλαστομύκωση Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ατόμου λοίμωξη σε άτομο με ανοσολογική ανεπάρκεια Είσοδος από βλεννογόνους: μουκορμύκωση (ζυγομύκωση) Είσοδος με εισπνοή σπόρων: κρυπτοκόκκωση, ασπεργίλλωση Σαπροφυτικοί μύκητες που γίνονται ευκαιριακά λοιμογόνοι λόγω ορισμένων συνθηκών Καντιντίαση Δερματόφυτα: επιφανειακές λοιμώξεις δέρματος, τριχών, νυχιών

41 Ζυμομύκητες Candida Ο συχνότερος: 83% Φυσ. χλωρίδα βλεννογόνων C. albicans: γαστρεντερικού C. glabrata: ουρογεννητικού C. tropicalis: γαστρεντερικού, ουροποιητικού έδαφος, νερό, δημητριακά C. parapsilosis: φ.χ. δέρματος

42 Καντιντιάσεις

43 Παθογένεια Διάκριση μυκήτων σε 5 ομάδες: Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ασθενούς εισπνοή σπόρων νόσος σε «υγιείς» Ιστοπλάσμωση, βλαστομυκητίαση, κοκκιδιοειδομυκητίαση, παρακοκκιοειδομυκητίαση Πρόκληση λοίμωξης ως αποτέλεσμα τραυματισμού Σποροτρίχωση, χρωμοβλαστομύκωση Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ατόμου λοίμωξη σε άτομο με ανοσολογική ανεπάρκεια Είσοδος από βλεννογόνους: μουκορμύκωση (ζυγομύκωση) Είσοδος με εισπνοή σπόρων: κρυπτοκόκκωση, ασπεργίλλωση Σαπροφυτικοί μύκητες που γίνονται ευκαιριακά λοιμογόνοι λόγω ορισμένων συνθηκών Καντιντίαση Δερματόφυτα: επιφανειακές λοιμώξεις δέρματος, τριχών, νυχιών

44 Τριχόφυτα

45 Μικρόσπορα Μολυσματικό κηρίο

46 Διάγνωση Υλικό Ξέσματα δέρματος νυχιών Τρίχες Άμεσο με ΚΟΗ Ectothrix Νύχια Δέρμα Endothrix

47 Διάγνωση Καλλιέργεια T. rubrum T. tonsurans T. violaceum Μικροσκόπηση Μικροκονίδια Μακροκονίδια

48 Διάγνωση Καλλιέργεια Μ. canis Epidermophyton floccosum Μικροσκόπηση Μακροκονίδια M. canis Μακροκονίδια E. floccosum

49 Ζυμομύκητες Malassezia M. furfur, M. pachydermatis Χλωρίδα δέρματος (λιπόφιλοι μ.) Trichosporon beigelii Διαδεδομένος στη φύση Φ.Χ. δέρματος, ΓΣ, φάρυγγα Geotrichum G. candidum: κοσμοπολίτικος μ. (έδαφος, νερό) στα φυτά, παράγωγα ζώων (γάλα) [βιομηχανία γάλακτος & τυριού] G. capitatum: λιγότερο συχνός στο περιβάλλον άνθρωπος (ΓΣ, ΑΣ)

50 Pityriasis versicolor Malassezia spp.

51 Εργαστηριακή διάγνωση Άμεση μικροσκοπική εξέταση Καλλιέργεια απομόνωση - ταυτοποίηση Ανοσοδιαγνωστικές μέθοδοι Ανίχνευση κυκλοφορούντων Ags Ανίχνευση ειδικών Abs Μοριακές τεχνικές Ιστολογική εξέταση Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμυκητιακά

52 Ι. Άμεση μικροσκοπική εξέταση Χωρίς χρώση Με χρώση Lactophenol blue (γιά όλα τα είδη δειγμάτων) India ink [ανίχνευση γλυκοκάλυκα Cryptococcus neoformans] Gram stain May-Grunwald Giemsa Μετά διαύγαση με KOH Κύρια πρακτική για νύχια, τρίχες, δέρμα (διάλυση κερατίνης) Μερικά δείγματα πύου ή εκκρίσεων

53 Χρώση Gram Ζυμομύκητες (βλαστοκονίδια και ψευδοϋφές): Gram (+) Η μικροσκοπική εξέταση πολύ σημαντική αν ο μύκητας είναι μη βιώσιμος λόγω λήψης αντιμυκητιακής αγωγής Υφομύκητες: Gram(-) Ζυγομύκητες Υαλοϋφομύκητες (Mucor, Rhizopus) (Aspergillus, Fusarium, Scedosporium) υφές ευρείες και ακανόνιστες υφές διαμέτρου 4-6μm χωρίς διαφραγμάτα με παράλληλα και χωρίς περισφίξεις τοιχώματα με βολβοειδείς πλάγιες διογκώσεις ομοιόμορφα κατανεμημένα διαφραγμάτα διχοτόμηση υπό γωνία 90διχοτόμηση 0 υπό γωνία 45 0

54 ΙΙ. Καλλιέργεια Ειδικά υλικά απομόνωσης μυκήτων (Sabouraud) Χλωραμφαινικόλη: μη ανάπτυξη βακτηρίων Ακτιδιόνη: αναστολή ανάπτυξης σαπροφυτικών μυκήτων, επιτρέπει ανάπτυξη παθογόνων (εκτός C. neoformans, Mucor) Παράγοντες ανάπτυξης (βιταμινούχο υλικό για T. ochraceum) Υλικά με αίμα για δίμορφους μύκητες (φάση ζυμομύκητα) Δύσκολη αδύνατη για μερικούς μύκητες Histoplasma - Rhinosporidium Επώαση Μύκητες επιφανειακών μυκητιάσεων 26 0 C Μύκητες εν τω βάθει μυκητιάσεων 37 0 C Διάρκεια Ζυμομύκητες: h Υφομύκητες (Aspergillus, Penicillium, Mucor): 2-4 d Υπόλοιποι παθογόνοι μύκητες, δερματόφυτα: 6-15 d

55 Αναστολή βακτηρίων Αναστολή σαπροφυτικών μυκήτων Θρεπτικά καλλιεργητικά υλικά για την απομόνωση μυκήτων Εκλεκτικό θρεπτικό υλικό Sabouraud dextrose agar (SDA) με αντιβιοτικά Πενικιλλίνη 20U/mL, στρεπτομυκίνη 40U/mL, γενταμυκίνη 5μg/mL, χλωραμφαινικόλη 16μg/mL Κυκλοεξαμίδη ή ακτιδιόνη 0.5μg/mL Μη-εκλεκτικό θρεπτικό υλικό BHI (Brain Heart Infusion): απαιτητικοί μύκητες [δίμορφοι (ιστόπλασμα)] Αλλά και ευκαιριακά παθογόνα 1. C. neoformans 2. Τrichosporon asahii 3. Μερικά είδη Candida 4. Μερικά είδη Aspergillus 5. Πολλούς ζυγομύκητες Koneman, 6 th ed. 2006

56 ΙΙ. Καλλιέργεια Προσοχή στην αξιολόγηση θετικών καλλιεργειών Δείγματα αναπνευστικού Πτύελα βρογχικές εκκρίσεις Επιμόλυνση από χλωρίδα στόματος Επιμόλυνση από περιβάλλον Καντιντουρία Απομόνωση Aspergillus όχι απόδειξη λοίμωξης (ύπαρξη προδιαθεσικών παραγόντων) Επιμόλυνση από χλωρίδα γεννητικού συστήματος Ποσοτική καλλιέργεια > CFU / ml CFU / ml < CFU / ml λοίμωξη επιμόλυνση λοίμωξη πιθανή Λοίμωξη νεφρού: (+) υπερηβική κ/α, (+) κ/α αίματος, (+) ορολογικές εξετάσεις σε ασθενή με προδιαθ. παράγοντες

57 ΙΙ. Καλλιέργεια Προσοχή στην αξιολόγηση θετικών καλλιεργειών Θετική κ/α αίματος Θετική κ/α από 3 διαφορετικές περιοχές Θετική κ/α άσηπτου υλικού (εκτός ουροδόχου κύστης) Συστηματική μυκητίαση

58 Είδος μύκητα Αντιγόνο, αντίσωμα, ένζυμο, μεταβολίτης Κλινικό δείγμα C. neoformans Γλυκουρονοξυλομαννάνη* ΕΝΥ, ορός Aspergillus Γαλακτομαννάνη * Ορός, BAL (ENY, ούρα??) Candida Μαννάνη, αντιμαννάνη* Ορός, ΕΝΥ Candida Ενολάση Ορός Candida Αντι-ενολάση & αντισώματα έναντι άλλων ενδοκυττάριων αντιγόνων Ορός Candida D-αραβινιτόλη Ορός Μύκητες άλλοι εκτός Ζυγομυκήτων και C. neoformans (1,3)-β-D-γλυκάνη * Πλάσμα / ορός * Χρησιμοποιείται στη ρουτίνα

59 ΙV. Μοριακές τεχνικές Ανίχνευση DNA σε κλινικό δείγμα με PCR Aspergillus σε δείγματα αναπνευστικού Όμως 25% υγιών ατόμων αποικισμού Candida από δείγματα αίματος θετικό αποτέλεσμα λόγω Πρόβλημα επιμόλυνση λόγω αποικισμού δέρματος Cryptococcus Ειδικοί ανιχνευτές (probes) για γρήγορη ταυτοποίηση H. capsulatum B. dermatitidis C. immitis Επιδημιολογική μελέτη απομονούμενων στελεχών

60 Μοριακές τεχνικές (PCR, real-time PCR) Μέθοδοι μη προτυποποιημένες Δεν συμπεριλαμβάνονται στα διαγνωστικά κριτήρια (Ascioglu S. et al. CID, 2002) (De Pauw B., et al., CID, 2008) Στάδια που πρέπει να προτυποποιηθούν: 1. παρασκευή κλινικού δείγματος 2. επιλογή του κατάλληλου στόχου πολλαπλασιασμού 3. μέθοδοι ανάγνωσης του αποτελέσματος 4. πρόληψη ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων

61 Εμπορικά διαθέσιμες μοριακές τεχνικές

62 1. Μοριακές τεχνικές σε θετικές καλλιέργειες Άμεσος υβριδισμός Σημασμένος probe με φθορισμό FISH ή χρωμογόνο CISH DNA probes peptide nucleic acid PNA probes Στόχος: rrna Συνδυασμός με Gram χρώση Ταυτοποίηση σε 2 ½ h Βακτήρια Ζυμομύκητες C. glabrata cells are slightly visible as reddish yeast cells infiltrated in the smear. C. albicans cells detected by the C. albicans PNA FISH method appear as bright green fluorescent yeast cells on a reddish smear background

63 Πώς εφαρμόζεται η PNA-FISH σε θετικές αιμοκαλλιέργειες Peptide Nucleic Acid Fluorescence In Situ Hybridization

64 2. Μοριακές τεχνικές ανίχνευσης παθογόνου απευθείας στο κλινικό δείγμα Οι μικροοργανισμοί αυτοί προκαλούν > 90% των μικροβιαιμιών Όριο ανίχνευσης: 3-30 CFU/ml

65 Η μεθοδολογία Spacer Technology που χρησιμοποιεί το SeptiFast test επιτρέπει τη διαφορική ανίχνευση σε επίπεδο είδους 16S ITS (Spacer) 23S Generic Primers ( pan bacteria ) Specific Probes Amplification curve Group (e.g. Enterobacteriaceae) Probe Melting Point(s) E. coli Enterobacter cloacae Cycles Tm

66 Mελέτη της καμπύλης αποδιάταξης του DNA (Melting Curve Analysis) Δύο διαφορετικά προϊόντα PCR έχουν τελείως διαφορετική Tm. Με την Real Time PCR μπορούμε να ανιχνεύσουμε την Tm ανεβάζοντας σταδιακά τη θερμοκρασία, ανοίγουν οι αλυσίδες, και φτάνοντας στο υψηλότερο σημείο όπου το 50 % του προϊόντος μας θα είναι αποδιαταγμένο. Αυτό παρουσιάζεται από το λογισμικό του μηχανήματος σαν γράφημα που δείχνει τον αρνητικό λογάριθμο του φθορισμού προς την θερμοκρασία - df/dt και παρουσιάζει για κάθε προϊόν PCR ένα ειδικό peak. Non specific product Sample Two T m = 84.4 C Sample One T m = 91 C Negative Control

67 15 διαφορετικά είδη Α. fumigatus A. flavus A. terreus A. niger Στόχος: 18S rdna Internal control Συνδυασμός λύσης και μηχανικής δύναμης για τη διάσπαση του μυκητιακού κυτ. τοιχ. Target sensitivity: <=50 copies (~ 1 A. fumigatus genome)

68 White PL et al., JCM 2011; 49:2169 Ασθενείς της μελέτης: 10 proven/probable IA (104 οροί) & 21 control χωρίς στοιχεία ΙΑ (66 οροί) A commercially available Aspergillus PCR assay provides a methodology that is standardized and reagents that are quality controlled. This facilitates multicenter evaluation of the clinical utility of PCR diagnosis. The performance of the MAP assay is comparable to that of the IHP assay and to those in previously reported studies evaluating commercial tests (GM enzyme-linked immunosorbent assay).

69 Comparison of MycAssay Aspergillus test with galactomannan detection in bronchoalveolar lavage (BAL) fluid samples of haematological and ICU patients Aspergillus DNA in BAL fluid specimens from IA patients: high sensitivity and specificity rates and its performance was comparable to that of GM. Improve the diagnosis of aspergillosis in haematological and critically ill patients and warrants incorporation to routine work up to establish its role in the management of these at risk patient groups. R. Torelli et al., ECCMID 2011 & JCM 2011

70 Detection of Aspergillus in lung and other tissue samples using the MycAssay Aspergillus real-time PCR kit. Lass-Flörl C et al., Can J Microbiol 2011;57:756 Ασθενείς: 9 μεταμοσχευμένοι και 33 με αιματολογική κακοήθεια Πνεύμονας (n = 30), δέρμα (n = 4), και άλλα. Για όλα τα δείγματα Ευαισθησία και ειδικότητα 82% και 79% (σε σχέση με μικροσκοπική) 90% και 64% (σε σχέση με καλλιέργεια) Θετική και αρνητική προγνωστική αξία: 69% και 88% (καλλιέργεια) 88% και 69% (μικροσκοπική)

71 C. g. C. p. C. l. C. k. C. n. C. li. C. m. C. t. C. u. DNA arrays Σύνολο μικρών στοιχείων ή κηλίδων τακτοποιημένων σε σειρές και στήλες σε στερεή επιφάνεια (γυαλί ή διοξείδιο της σιλικόνης). Υβριδισμός μορίων-στόχων του υπό εξέταση δείγματος με μόρια σημασμένα Ανάγνωση αποτελέσματος Ανάλυση της εικόνας μέσω Η/Υ Macroarray C. glabrata C. parapsilopsis C. lipolytica C. krusei C. norvegensis C. lusitaniae C. multigemmis C. tropicalis C. utilis Microarray DNA ανιχνευτές ειδικοί του είδους γονίδια αντοχής στα αντιμυκητιακά γονίδια λοιμογόνων παραγόντων Garaizar J et al, FEMS Yeast Res, 2006;6:987

72 Development and optimisation of a Novel Multiplex Assay for Identifying Candida Species The MycArray Yeast ID has been optimised to identify 18 clinically relevant yeast species from agar plates and positive blood culture bottles The array process can be completed in 4 hrs X.Cui et al. TIMM 2009

73 Μοριακές τεχνικές και αντοχές Antifungal drug resistance: do molecular methods provide a way forward? David S. Perlin Curr Opin Infect Dis 2009; 22:

74 Direct detection of triazole resistance in A. fumigatus from airway secretions (Park S et al., 2011 ECCMID) High-frequency triazole resistance found In nonculturable Aspergillus fumigatus from lungs of patients with chronic fungal disease (Denning DW et al., 2011 CID;52:1123

75 Μοριακή διάγνωση σε επιφανειακές μυκητιάσεις New molecular tools in the diagnosis of superficial fungal infections RJ Hay et al., Clinics in Dermatology 2010;28: Brillowska-Dabrowska A et al., JCM 2007

76 Γιατί?? Πότε?? ΙV. Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμυκητιακά Εμφάνιση αντοχών π.χ. Αζόλες C. albicans από HIV(+) και ΜΜΟ ασθενείς C. neoformans από ασθενείς με AIDS C. glabrata (3o αίτιο μυκηταιμίας) [αντοχή σε κετοκοναζόλη, φλουκοναζόλη] Α. fumigatus σε ασθενείς υπό θεραπεία με ιντρακοναζόλη Αμφοτερικίνη Β σε ασθενείς με καρκίνο C. lusitaniae και στελέχη C. albicans C. tropicalis: αντοχή στη 5- Απομόνωση από φλουροκυτοσίνη αίμα στείρα υγρά παρακεντήσεων και ιστούς ασθενείς με επαναλαμβανόμενες μυκ. λοιμ.

77 ΑΜΒ Κ F I V C Aspergillus C. neoformans Candida C. albicans C. glabrata C. guilliermondii C. krusei C. lusitaniae C. parapsilosis C. tropicalis Φάσμα δράσης διαφόρων συστηματικά χορηγούμενων αντιμυκητιακών Fusarium Mucor, Rhizopus άλλοι ζυγομύκητες Προσαρμογή από Manual of Clinical Microbiology, 9 th ed.

78 Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμυκητιακά Ζυμομύκητες: μικρο- και μακρο μέθοδοι αραιώσεων σε ζωμό οδηγίες CLSI M27-A2 για Candida spp., C. neoformans οδηγίες EUCAST (CMI 2008; 14: ) για ζυμομύκητες που ζυμώνουν τη γλυκόζη (Candida spp.) [όχι Cryptococcus, δίμορφους] Εναλλακτικά: Χρωματομετρική μέθοδος: εμπορικές (FUNGITEST, Sensititre YeastOne), μη εμπορικές (tetrazolium salt μέθοδος) Σπεκτρο-φωτομετρική μέθοδος Μέθοδος κυτταρομετρίας ροής μέθοδος διάχυσης δίσκων: fluconazole / voriconazole οδηγίες CLSI Μ44-Α για Candida spp. E-test

79 Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμυκητιακά Υφομύκητες μικρο- και μακρο μέθοδοι αραιώσεων σε ζωμό οδηγίες CLSI M38-A (προτεινόμενες - proposed) Εναλλακτικά: Χρωματομετρική μέθοδος Μέθοδος διάχυσης δίσκων Πιστοποιημένη για caspofungin και voriconazole Έλεγχος επαναληψιμότητας Ε-test Συμφωνία με μέθοδο σε ζωμό >90% για τριαζόλες (F, I, V), αλλά >80% για αμφοτερικίνη Β

80 Ο κλινικός Ο Βιοπαθολόγος Ο Παθολογοανατόμος Ο λοιμωξιολόγος Φαρμακοβιομήχανος

81 ?!