ΠΑΝΔΠΙΣΗΜΙΟ ΠAΣΡΧΝ ΠΟΛΤΣΔΥΝΙΚΗ ΥΟΛΗ Σκήκα Μεραληθψλ Ζιεθηξνληθψλ Τπνινγηζηψλ & Πιεξνθνξηθήο. Γιπλωματική Δργασία. Μεηαπηπρηαθνύ Πξνγξάκκαηνο ΔΣΤ

Transcript

1 ΠΑΝΔΠΙΣΗΜΙΟ ΠAΣΡΧΝ ΠΟΛΤΣΔΥΝΙΚΗ ΥΟΛΗ Σκήκα Μεραληθψλ Ζιεθηξνληθψλ Τπνινγηζηψλ & Πιεξνθνξηθήο Γιπλωματική Δργασία Μεηαπηπρηαθνύ Πξνγξάκκαηνο ΔΣΤ Μελέηη και ζτεδίαζη ζσζηήμαηος ανάλσζης εικόνας καηαημημένοσ ζπερμαηικού DNA με τρήζη ηετνικών σπολογιζηικής νοημοζύνης Διέλε Αικπάλε Δπηβιέπσλ Καζεγεηήο : Λπθνζαλάζεο ππξίδσλ Σξηκειήο Δπηηξνπή : Λπθνζαλάζεο ππξίδσλ Αγγεινπνύινπ Ρσμάλε Μαπξνπδή εθεξίλα Πάτρα Μάρτιος 2010

2 Δπραξηζηίεο ην ζεκείν απηό ζα ήζεια λα επραξηζηήζσ πνιύ: ηνλ επηβιέπνληα Καζεγεηή θ. ππξίδσλα Λπθνζαλάζε, ηνπ ηκήκαηνο Μεραληθώλ Η/Υ θαη Πιεξνθνξηθήο, γηαηί δέρηεθε λα επηβιέςεη απηή ηε δηπισκαηηθή εξγαζία, κε ζπκβνύιεπζε γηα ηελ επίιπζε ησλ δπζθνιηώλ πνπ πξνέθππηαλ θαηά ηε δηάξθεηα ζπγγξαθήο ηνπ πνλήκαηνο θαη κε πεξηέβαιιε κε εκπηζηνζύλε θαη αγάπε. ηελ ζπλεπηβιέπνπζα εξεπλήηξηα εθεξίλα Μαπξνπδή γηα ηελ απεξηόξηζηε ππνζηήξημε, πλεπκαηηθή θαη ςπρνινγηθή θαη ηηο ιεπηνκεξείο νδεγίεο, απαξαίηεηεο γηα λα θέξσ εηο πέξαο ηελ παξνύζα εξγαζία. ηελ θα. Ρσμάλε Αγγεινπνύινπ, αλαπιεξώηξηα θαζεγήηξηα ηεο Ιαηξηθήο ρνιήο ηνπ Παλεπηζηεκίνπ Αζελώλ, πνπ είρε ηελ αξρηθή ζύιιεςε ηνπ βηνινγηθνύ πξνβιήκαηνο, πξνκεζεύνληάο κε κε όιν ην απαξαίηεην πιηθό (εξγαζίεο, κειέηεο, άξζξα) θαη, ηδηαίηεξα, ηηο αθαηέξγαζηεο εηθόλεο ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ πξνο αλάιπζε θαη επεμεξγαζία. Ήηαλ πάληα πξόζπκε λα ιύζεη θάζε κνπ απνξία, δηεπθνιύλνληαο νπζηαζηηθά ην έξγν κνπ. Ιδηαίηεξεο επραξηζηίεο γηα ην δηεπζπληή ηνπ Δξγαζηεξίνπ Ιζηνινγίαο θαη Δκβξπνινγίαο θαζεγεηή θ. Χξ. Κίηηα, πξύηαλε ηνπ ΔΚΠΑ, πνπ κνπ επέηξεςε λα πινπνηήζσ ην εξγαζηεξηαθό κέξνο ηεο εξγαζίαο ζηηο εγθαηαζηάζεηο ηνπ εξγαζηεξίνπ. ην Νίθν γνύξν, κεηαδηδαθηνξηθό εξεπλεηή ηνπ Ιλζηηηνύηνπ Ιαηξνβηνινγηθώλ Δξεπλώλ ηεο Αθαδεκίαο Αζελώλ, γηα ηε δηαξθή θαζνδήγεζή ηνπ, ηηο ππνδείμεηο ηνπ γηα ηελ επεμεξγαζία εηθόλαο θαη όιν ην ζεσξεηηθό ππόβαζξν, ζην νπνίν ζηεξίρηεθε απηή ε δηπισκαηηθή εξγαζία. ηέινο, ηνλ Κνπηειίδα πύξν, γηα ηελ ακέξηζηε εζηθή ππνζηήξημε ζε όιε ηε δηάξθεηα ζπγγξαθήο ηεο παξνύζαο εξγαζίαο. Αικπάλε Διέλε [2]

3 Πίνακας περιεχομένων Πίλαθαο Δηθφλσλ... 5 Κεθάιαην 1 Πξφινγνο... 7 Κεθάιαην 2. πεξκαηνγέλεζε, ζπκπχθλσζε & θεξκαηηζκφο ηνπ DNA & ηερληθέο αλίρλεπζεο ηνπ θεξκαηηζκνχ Δηζαγσγή Σν ζπεξκαηνδσάξην πεξκαηνγέλεζε πεξκαηνθπηηαξνγέλεζε Μείσζε πεξκηνγέλεζε Μνξθνινγία ζπεξκαηνδσαξίνπ Υαξαθηεξηζηηθά ηνπ αλζξσπίλνπ ζπέξκαηνο πκπχθλσζε ηνπ DNA πκπχθλσζε ζηα ζσκαηηθά θχηηαξα πκπχθλσζε ζηα γελλεηηθά θχηηαξα Απφπησζε Πξνέιεπζε βιάβεο ζην ζπεξκαηηθφ DNA Διαηησκαηηθή ζπκπχθλσζε ρξσκαηίλεο Απφπησζε Ομεηδσηηθφ ζηξεο Δθηίκεζε ηεο βιάβεο ζην DNA ηνπ ππξήλα ηνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ πκπεξάζκαηα Κεθάιαην 3 Σν ινγηζκηθφ & ε δηαδηθαζία ιήςεο ησλ εηθφλσλ Δηζαγσγή Πεξηγξαθή ιήςεο εηθφλσλ Ζ AxioCam MRm & ην Axiovision πκπεξάζκαηα Κεθάιαην 4 Απηφκαηε αλάιπζε εηθφλσλ κηθξνζθνπίνπ Δηζαγσγή Φεθηαθή αλάιπζε εηθφλσλ Ο αιγφξηζκνο αλάιπζεο εηθφλαο Κεξκαηηζκφο εηθφλαο Σαμηλφκεζε ζρεκάησλ θαη ππνινγηζκφο πεξηνρψλ Απνηειέζκαηα πκπεξάζκαηα Κεθάιαην 5 Αιγφξηζκνη κε επηβιεπφκελεο κάζεζεο [3]

4 5.1 Δηζαγσγή Δπηβιεπφκελε θαη κε επηβιεπφκελε κάζεζε Ση είλαη ην clustering Μέζνδνη clustering Παξακεηξηθέο Πξνζεγγίζεηο Μνληέια δεκηνπξγίαο ή πηζαλνηηθά κνληέια Μνληέια Αλαδφκεζεο Με παξακεηξηθέο πξνζεγγίζεηο Οη αιγφξηζκνη ηεξαξρηθήο ζπζηαδνπνίεζεο Απηφ-νξγαλσκέλα δίθηπα Υαξηνγξάθεζε πεξηνρήο εηζφδνπ Υάξηεο δηαηήξεζεο ηνπνινγίαο ζηνλ εγθέθαιν Σν κνληέιν Kohonen Αιγφξηζκνο κάζεζεο Υαξηνγξάθεζε ρψξσλ πςειψλ δηαζηάζεσλ Αλάιπζε ηεο ζχγθιηζεο Κεθάιαην 6 Αιγφξηζκνη εκη-επηβιεπφκελεο κάζεζεο Δηζαγσγή Ο αιγφξηζκνο KSDG-SOM Ζ πξνζαξκνγή ησλ θαλφλσλ κάζεζεο & ε ζπλάξηεζε ζθάικαηνο Αλάπηπμε ηνπ θξηηεξίνπ ιάζνπο Ζ πξνζέγγηζε κάζεζεο KSDG-SOM Κξηηήξηα γηα ηνλ έιεγρν ηεο δπλακηθήο επέθηαζεο ηνπ KSDG-SOM Ο snet-som αιγφξηζκνο Σν snet-som κνληέιν Ζ ζπλάξηεζε θφζηνπο γηα ηελ επηινγή κνληέινπ Ο snet-som αιγφξηζκνο εθπαίδεπζεο Κξηηήξηα γηα ηνλ έιεγρν ηεο δπλακηθήο επέθηαζεο ηνπ snet-som πκπεξάζκαηα Κεθάιαην 7 Δπίινγνο Κεθάιαην 8 Βηβιηνγξαθία [4]

5 Πίλαθαο Δηθόλσλ Δηθόλα 1 - πεξκαηνγέλεζε Δηθόλα 2 - πεξκηνγέλεζε Δηθόλα 3 - Μνξθνινγία ζπεξκαηνδσαξίνπ Δηθόλα 4 - Πξόηππεο ηηκέο πνηόηεηαο ζπέξκαηνο Δηθόλα 5 - πκπύθλσζε ηνπ DNA ησλ ζσκαηηθώλ θπηηάξσλ Δηθόλα 6 - Γηαδηθαζία πξσηακίλσζεο Δηθόλα 7 - Νέθξσζε & Απόπησζε Δηθόλα 8 - TUNEL Δηθόλα 9 - Σν αξρηθό πεξηβάιινλ εξγαζίαο ηνπ AxioVision Δηθόλα 10 - Δπηινγή ηνπ Multidimensional Acquisition Δηθόλα 11 - Δπαλάθηεζε ξπζκίζεσλ πεηξάκαηνο Δηθόλα 12 - Δπαλάθηεζε ξπζκίζεσλ πεηξάκαηνο (2) Δηθόλα 13 - Δπηινγή ρξσζηηθώλ & ξπζκίζεηο θίιηξσλ Δηθόλα 14 - Δηζαγσγή δεύηεξνπ θαλαιηνύ Δηθόλα 15 - Ρύζκηζε ηνπ ρξόλνπ έθζεζεο Δηθόλα 16 - Λήςε εηθόλαο από ην πξώην θαλάιη Δηθόλα 17 - Λήςε εηθόλαο από ην δεύηεξν θαλάιη Δηθόλα 18 - Σειηθή εηθόλα Δηθόλα 19 - Απνζήθεπζε εηθόλαο Δηθόλα 20 - πγθεληξσηηθόο πίλαθαο ιεηηνπξγηώλ ηνπ AxioVision Δηθόλα 21 - Γηαζέζηκεο βαζηθέο ιεηηνπξγίεο ηνπ AxioVision Δηθόλα 22 Δηθόλα κηθξνζθνπίνπ θζνξηζκνύ Δηθόλα 23 - Σα δηαλύζκαηα γλσξηζκάησλ ησλ εηθνλνζηνηρείσλ ζηνλ RGB ρώξν Δηθόλα 24 - Η θαηαλνκή ησλ εηθνλνζηνηρείσλ θόληνπ θαη ησλ εκπξόζζησλ Δηθόλα 25 - Σν παξαγόκελν ηζηόγξακκα κεηά ηελ πξνβνιή ζηνλ q άμνλα Δηθόλα 26 - Σν παξαγόκελν ηζηόγξακκα κεηά ηελ πξνβνιή ζηνλ p άμνλα Δηθόλα 27 - Η αξρηθή θαη ε παξαγόκελε εηθόλα ηξηώλ ηόλσλ κεηά ηελ θαηάηκεζε (segmentation) Δηθόλα 28 - Μεγελζπκέλα ηκήκαηα ηεο εηθόλαο Δηθόλα 29 - πζηαδνπνίεζε ζύλδεζεο κέζσλ Δηθόλα 30 - πζηαδνπνίεζε ζύλδεζεο θεληξνεηδώλ Δηθόλα 31- Η ζπλάξηεζε f : A -> B Δηθόλα 32- Η ραξηνγξάθεζε ηνπ νπηηθνύ πεδίνπ ζην ινβό Δηθόλα 33- Έλα κνλνδηάζηαην πιέγκα ησλ θόκβσλ ππνινγηζκνύ Δηθόλα 34- Η ραξηνγξάθεζε κηαο ηξηγσληθήο πεξηνρήο Δηθόλα 35- Η ραξηνγξάθεζε ελόο ηεηξαγώλνπ κε δηζδηάζηαην πιέγκα. Σν δηάγξακκα πάλσ δεμηά δείρλεη κεξηθέο επηθαιππηόκελεο επαλαιήςεηο ηεο δηαδηθαζίαο κάζεζεο. Σν δηάγξακκα θάησ είλαη ε ηειηθή θαηάζηαζε κεηά από 1000 επαλαιήςεηο Δηθόλα 36- Δπίπεδν δίθηπν κε έλα δεζκό Δηθόλα 37- Ο δηζδηάζηαηνο ράξηεο κηαο ηξηζδηάζηαηεο πεξηνρήο Δηθόλα 38- Σν δηάγξακκα ηεο επηθξάηεζεο ηνπ καηηνύ ζηνλ νπηηθό ινβό. Οη καύξεο ξίγεο αλαπαξηζηνύλ ην έλα κάηη ελώ νη ιεπθέο ην άιιν Δηθόλα 39- Σν βάξνο x ζην δηάζηεκα [a,b] Δηθόλα 40- Η θαηαλνκή ησλ βαξώλ ηνπ δηθηύνπ ζην δηάζηεκα [a,b] Δηθόλα 41- Έλαο δηζδηάζηαηνο ράξηεο Δηθόλα 42- Γύν βάξε ζην δηάζηεκα [-1,1] [5]

6 Δηθόλα 43- Έλα δηζδηάζηαην πιέγκα θαζώο ηζηώλεη Δηθόλα 44- Έλα άηαθην κνλνδηάζηαην δίθηπν [6]

7 Κεθάιαην 1 Πξόινγνο Έλα πνιχ ζνβαξφ ηαηξηθφ πξφβιεκα είλαη ην έλαπζκα απηήο ηεο εξγαζίαο. Ζ αλδξηθή ππνγνληκφηεηα απνηειεί ην αληηθείκελν κειέηεο ηνπ εξγαζηεξίνπ Δκβξπνινγίαο θαη Ηζηνινγίαο ηνπ Παλεπηζηεκίνπ Αζελψλ, απ φπνπ θαη δεηήζεθε ε αξσγή ησλ ππνινγηζηηθψλ ηερληθψλ ψζηε λα εμαρζνχλ πην αληηθεηκεληθά θαη αμηφπηζηα απνηειέζκαηα. Εεηήκαηα πνπ αθνξνχλ ηελ αλζξψπηλε δσή δε κπνξεί λα είλαη απιά κία παξαηήξεζε ζην κηθξνζθφπην θαη ε απάληεζε πνπ δίλεηαη ζε απηά δε κπνξεί λα δίλεηαη ειαθξά ηε θαξδία, κε ην κάηη. Πην ζπγθεθξηκέλα ην πξφβιεκα εληνπίδεηαη ζην βαζκφ θεξκαηηζκνχ ηνπ DNA ζηνλ ππξήλα ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ. Έλαο άλδξαο κε κεγάιε αλαινγία θεξκαηηζκέλσλ ζπεξκαηνδσαξίσλ σο πξνο ηα θπζηνινγηθά ζεσξείηαη ππνγφληκνο θαη ζπλεπψο νη πηζαλφηεηεο γηα ηελ επίηεπμε θχεζεο είλαη κεησκέλεο. Ζ ζρέζε απηή αλάκεζα ζην βαζκφ θεξκαηηζκνχ ηνπ DNA θαη ζηε γνληκφηεηα έρεη απνδεηρζεί απφ ηαηξηθέο έξεπλεο, σζηφζν δελ έρεη αλαπηπρζεί πξνο ην παξφλ ηθαλνπνηεηηθφο ηξφπνο γηα ηελ αμηφπηζηε πνζνηηθνπνίεζε ηνπ βαζκνχ θεξκαηηζκνχ, παξά αθφκα εξεπλάηαη. ε απηφ ην ζεκείν έξρεηαη λα πξνζθέξεη ε παξνχζα εξγαζία. Ζ αξρή γίλεηαη κε ηνλ νξηζκφ ηνπ ηαηξηθνχ πξνβιήκαηνο θαη ηελ πεξηγξαθή φισλ εθείλσλ πνπ ρξεηάδεηαη λα γλσξίδεη έλαο κεραληθφο ειεθηξνληθφο ππνινγηζηψλ, αδαήο βεβαίσο κε ηα ηαηξηθά δεδνκέλα. ηε ζπλέρεηα πεξηγξάθνληαη φιεο νη δηαδηθαζίεο, απφ ηε ιήςε εηθφλσλ θαηάιιεια επεμεξγαζκέλσλ ζπεξκαηνδσαξίσλ ψζηε λα δηαθξίλεηαη ν βαζκφο θεξκαηηζκνχ, ζηελ ςεθηαθή επεμεξγαζία ησλ εηθφλσλ κε ηερληθέο πνπ αλαπηχρζεθαλ αθξηβψο γη απηφ ην ζθνπφ θαη ηέινο, κε ηελ παξνπζίαζε ησλ αιγνξίζκσλ, νη νπνίνη κπνξνχλ λα ζπλεηζθέξνπλ ζηελ αλάιπζε ησλ δεδνκέλσλ πνπ παξέρνληαη ηφζν απφ ηελ ςεθηαθή επεμεξγαζία ησλ εηθφλσλ φζν θαη απφ πιεξνθνξίεο απφ ηε βαζηθή αλάιπζε ζπέξκαηνο. Φζάλνληαο ζην ηέινο ηεο εξγαζίαο, ν αλαγλψζηεο γλσξίδεη φ,ηη ρξεηάδεηαη γηα λα θαηαλνήζεη ην πξφβιεκα, θαζψο θαη ηνπο ηξφπνπο κε ηνπο νπνίνπο πξνηείλεηαη λα αληηκεησπηζηεί ζηα δηάθνξα ζηάδηα απφ ηα νπνία απνηειείηαη. [7]

8 Πίνακας περιεχομένων Κεθάιαην 2. πεξκαηνγέλεζε, ζπκπχθλσζε & θεξκαηηζκφο ηνπ DNA & ηερληθέο αλίρλεπζεο ηνπ θεξκαηηζκνχ Δηζαγσγή Σν ζπεξκαηνδσάξην πεξκαηνγέλεζε πεξκαηνθπηηαξνγέλεζε Μείσζε πεξκηνγέλεζε Μνξθνινγία ζπεξκαηνδσαξίνπ Υαξαθηεξηζηηθά ηνπ αλζξσπίλνπ ζπέξκαηνο πκπχθλσζε ηνπ DNA πκπχθλσζε ζηα ζσκαηηθά θχηηαξα πκπχθλσζε ζηα γελλεηηθά θχηηαξα Απφπησζε Πξνέιεπζε βιάβεο ζην ζπεξκαηηθφ DNA Διαηησκαηηθή ζπκπχθλσζε ρξσκαηίλεο Απφπησζε Ομεηδσηηθφ ζηξεο Δθηίκεζε ηεο βιάβεο ζην DNA ηνπ ππξήλα ηνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ πκπεξάζκαηα [8]

9 Κεθάιαην 2. πεξκαηνγέλεζε, ζπκπύθλσζε & θεξκαηηζκόο ηνπ DNA & ηερληθέο αλίρλεπζεο ηνπ θεξκαηηζκνύ 2.1 Δηζαγσγή ην παξφλ θεθάιαην, επηρεηξείηαη θαη αξράο λα δνζεί κηα πεξηγξαθή ηνπ ηη είλαη έλα ζπεξκαηνδσάξην θαη πνηα είλαη ε δηαθνξά ηνπ απφ ηα ζσκαηηθά θχηηαξα ηνπ αλζξψπνπ. ηε ζπλέρεηα πεξηγξάθεηαη αλαιπηηθά ε ζπεξκαηνγέλεζε, ε δηαδηθαζία θαηά ηελ νπνία ηα δηπινεηδή ζπεξκαηνγφληα (πξσηαξρηθέο κνξθέο ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ) κεηαηξέπνληαη ζε απινεηδή ζπεξκαηνδσάξηα θαη ε πεξηνρή ηνπ αλδξηθνχ αλαπαξαγσγηθνχ ζπζηήκαηνο φπνπ απηή ζπκβαίλεη. ην ηειεπηαίν ζηάδην ηεο ζπεξκαηνγέλεζεο παξάγεηαη έλα ψξηκν ζπεξκαηνδσάξην νπφηε ζηε ζπλέρεηα πεξηγξάθεηαη ε κνξθνινγία ελφο πγηνχο ζπεξκαηνδσαξίνπ θαζψο θαη ηα ηκήκαηα ζηα νπνία απηφ δηαθξίλεηαη. Έπεηηα, αλαθέξνληαη ηα βαζηθά ραξαθηεξηζηηθά ηνπ αλζξψπηλνπ ζπέξκαηνο, θαζψο θαη νη θπζηνινγηθέο ηηκέο πνπ ζα πξέπεη λα έρνπλ. Απφ ηα παξαπάλσ, έρνπλ γίλεη γλσζηά ηα πην γεληθά ζηνηρεία πνπ αθνξνχλ ηα ζπεξκαηνδσάξηα. ηε ζπλέρεηα, γηα λα γίλεη θαηαλνεηφ ην πξφβιεκα ηνπ θεξκαηηζκνχ ηνπ DNA, πεξηγξάθεηαη φιε ε δηαδηθαζία ζπκπχθλσζεο ηνπ DNA ζηα ζσκαηηθά θχηηαξα αξρηθά θαη έπεηηα (ψζηε λα αλαδεηρζεί ε δηαθνξά) ζηα ζπεξκαηνδσάξηα. Αθνινπζεί ε αλαθνξά ζε κηα πνιχ βαζηθή δηαδηθαζία ηνπ αλζξψπηλνπ νξγαληζκνχ, ηελ απφπησζε, δειαδή ηνλ πξνγξακκαηηζκέλν θπηηαξηθφ ζάλαην. Όπσο ζα αλαιπζεί αξγφηεξα, ε απφπησζε, ε ειαηησκαηηθή ζπκπχθλσζε ηεο ρξσκαηίλεο θαη ην νμεηδσηηθφ ζηξεο είλαη αηηίεο βιάβεο ηνπ ζπεξκαηηθνχ DNA. Σέινο, αλαθέξνληαη νη ηερληθέο κε ηηο νπνίεο κπνξεί λα γίλεη ζήκεξα ε αλίρλεπζε θεξκαηηζκέλνπ DNA ζηνλ ππξήλα ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ θαη παξνπζηάδεηαη πεξηζζφηεξν εθείλε ε νπνία ρξεζηκνπνηείηαη απφ ην Δξγαζηήξην Ηζηνινγίαο θαη Δκβξπνινγίαο, ε TUNEL. [9]

10 2.2 Σν ζπεξκαηνδσάξην Σν ζπεξκαηνδσάξην είλαη ν αξζεληθφο γακέηεο. Ο γακέηεο είλαη δηαθνξεηηθφ γηα θάζε θχιν θχηηαξν, ην νπνίν είλαη απινεηδέο. Ο αξζεληθφο γακέηεο (ζπεξκαηνδσάξην) ελψλεηαη κε ην γακέηε ηνπ αληηζέηνπ θχινπ (σνθχηηαξν) γηα ην ζρεκαηηζκφ ηνπ δπγψηε. Χο απινεηδέο ελλνείηαη φηη πεξηέρεη ην κηζφ αξηζκφ ρξσκνζσκάησλ (22+1) ζε ζρέζε κε ηα ζσκαηηθά θχηηαξα (44+2), φπνπ ην +1 ή +2 αλαθέξεηαη ζηνλ αξηζκφ ησλ θπιεηηθψλ ρξσκνζσκάησλ. Σν ζπεξκαηνδσάξην παξάγεηαη κέζσ κηαο ηδηαίηεξεο θπηηαξηθήο δηεξγαζίαο, ε νπνία νλνκάδεηαη ζπεξκαηνγέλεζε θαη αλαιχεηαη αθνινχζσο. 2.3 πεξκαηνγέλεζε Ζ ζπεξκαηνγέλεζε είλαη κηα ζπλερήο δηεξγαζία θαηά ηελ νπνία ηα ζπεξκαηνγφληα (νη πξσηαξρηθέο κνξθέο ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ) κεηαηξέπνληαη ζε ζπεξκαηνδσάξηα. Ζ ζπεξκαηνγέλεζε πξαγκαηνπνηείηαη ζηα ζπεξκαηηθά ζσιελάξηα, ζην εζσηεξηθφ ησλ φξρεσλ. Σν βιαζηηθφ επηζήιην πνπ επελδχεη ηα ζπεξκαηηθά ζσιελάξηα παξάγεη ηνπο απινεηδείο γακέηεο ηνπ άξξελνο (ζπεξκαηνδσάξηα) ζε ηξία δηαδνρηθά ζηάδηα: 1. πεξκαηνθπηηαξνγέλεζε 2. Μείσζε 3. πεξκηνγέλεζε ηελ εηθφλα 1 πεξηγξάθεηαη ζρεκαηηθά ε δηαδηθαζία ζπεξκαηνγέλεζεο θαη ζηε ζπλέρεηα πεξηγξάθνληαη ιεπηνκεξψο ηα ζηάδηα ηεο ζπεξκαηνγέλεζεο. [10]

11 Δηθόλα 1 - πεξκαηνγέλεζε πεξκαηνθπηηαξνγέλεζε Ζ ζπεξκαηνθπηηαξνγέλλεζε αξρίδεη κε ηε δηαίξεζε θαη δηαθνξνπνίεζε ησλ ζπεξκαηνγνλίσλ ηα νπνία δηαθξίλνληαη ζε ηξεηο ηχπνπο: Α βαζπρξσκαηηθά(αβ), Α- αξαηνρξσκαηηθά(αα) θαη Β. Σα Αβ πνιιαπιαζηάδνληαη κε κίησζε θαη παξάγνπλ Αβ, ηα νπνία ζα απνηειέζνπλ πξνγφλνπο ησλ επφκελσλ γεληψλ ζπεξκαηνδσαξίσλ, αιιά θαη Αα, απφ ηα νπνία πξνέξρνληαη ηα Β, ηα νπνία νλνκάδνληαη θαη πξσηνγελή ζπεξκαηνθχηηαξα θαη σξηκάδνπλ πξηλ εηζέιζνπλ ζηελ πξφθαζε ηεο πξψηεο [11]

12 κεησηηθήο δηαίξεζεο. ην ζηάδην ηεο πξνιεπηνηαηλίαο ράλνπλ ηελ επαθή ηνπο κε ηε βαζηθή κεκβξάλε θαη αθνχ νινθιεξψζνπλ ηελ πξψηε κείσζε κεηαηξέπνληαη ζε δεπηεξνγελή ζπεξκαηνθχηηαξα. Ακέζσο κεηά μεθηλά ε δεχηεξε κείσζε απφ ηελ νπνία πξνέξρνληαη νη ζπεξκαηίδεο. Οη ζπεξκαηίδεο, αλ θαη έρνπλ απινεηδή αξηζκφ ρξσκνζσκάησλ, δελ κπνξνχλ λα γνληκνπνηήζνπλ ην σνθχηηαξν. Πξέπεη πξψηα, κε ηε δηαδηθαζία ηεο ζπεξκηνγέλεζεο, λα κεηαηξαπνχλ ζε ζπεξκαηνδσάξηα, ηα νπνία ηνπνζεηνχληαη ζηελ θνξπθή ησλ θπηηάξσλ Sertoli κε ηελ νπξά ηνπο κέζα ζηνλ απιφ ηνπ ζπεξκαηηθνχ ζσιελαξίνπ. Έλα ηδηαίηεξν γλψξηζκα ηεο ζπεξκαηνγέλεζεο, είλαη φηη φια ηα ζπγαηξηθά θχηηαξα κέλνπλ ζπλδεδεκέλα κε ζηαζεξέο θπηηαξνπιαζκαηηθέο γέθπξεο. Οη θπηηαξνπιαζκαηηθέο γέθπξεο δηεπθνιχλνπλ ηελ επηθνηλσλία ησλ αλαπηπζζφκελσλ θπηηάξσλ θαζψο θαη ηε ζχγρξνλε δηαθνξνπνίεζή ηνπο. Όηαλ ηα ζπεξκαηνδσάξηα είλαη έηνηκα λα απειεπζεξσζνχλ ζηνλ απιφ, νη γέθπξεο απνθφπηνληαη καδί κε ην ππνιεηπφκελν ζσκάηην, δειαδή ην πιενλάδνλ θπηηαξφπιαζκά ηνπο Μείσζε Ζ κείσζε είλαη έλαο ηδηαίηεξνο κεραληζκφο θπηηαξηθήο δηαίξεζεο γηα ηελ παξαγσγή απινεηδψλ γακεηψλ θαη παξαηεξείηαη ζηα γελλεηηθά θχηηαξα. Οξίδεηαη σο δχν δηαδνρηθέο θπηηαξηθέο δηαηξέζεηο πνπ αθνινπζνχλ κφλν κία θάζε δηπιαζηαζκνχ ηνπ DNA θαη νδεγνχλ ζην ζρεκαηηζκφ ηεζζάξσλ απινεηδψλ γακεηψλ απφ έλα δηπινεηδηθφ θχηηαξν. Πξηλ αξρίζεη ε κείσζε, νη ππξήλεο ησλ γελλεηηθψλ θπηηάξσλ πεξηέρνπλ 23 δεχγε νκνιφγσλ ρξσκνζσκάησλ, ην έλα παηξηθήο θαη ην άιιν κεηξηθήο πξνέιεπζεο. Κάζε έλα απφ απηά δηπιαζηάδεηαη θαηά ηελ ηειεπηαία θάζε ζχλζεζεο ηνπ DNA, πνπ πξνεγείηαη ηεο κείσζεο θαη πεξηέρεη ηηο δχν αδειθέο ρξσκαηίδεο ελσκέλεο ζην θεληξνκεξίδην (ζπλνιηθά 92 ρξσκαηίδεο). Καηά ηε δηάξθεηα ησλ δχν κεησηηθψλ δηαηξέζεσλ παξαηεξνχληαη νη θάζεηο πξφθαζε, κεηάθαζε, αλάθαζε θαη ηειφθαζε. Οη θάζεηο απηέο ραξαθηεξίδνληαη σο I ή II αλάινγα κε ην αλ αλήθνπλ ζηελ πξψηε ή ζηε δεχηεξε κεησηηθή δηαίξεζε. [12]

13 Τα ζηάδηα ηεο κείσζεο Ζ πξφθαζε ηεο πξψηεο κεησηηθήο δηαίξεζεο έρεη κεγάιε δηάξθεηα θαη πεξηιακβάλεη πέληε ζηάδηα: ην ζηάδην ηεο ιεπηνηαηλίαο, ην ζηάδην ηεο δπγνηαηλίαο, ην ζηάδην ηεο παρπηαηλίαο, ην ζηάδην ηεο δηπινηαηλίαο θαη ην ζηάδην ηεο δηαθίλεζεο. Σα ζηάδηα απηά νξίδνληαη ζχκθσλα κε ηηο κνξθνινγηθέο κεηαβνιέο πνπ παξαηεξνχληαη ζηα ρξσκνζψκαηα. ην ζηάδην ηεο ιεπηνηαηλίαο ηα ρξσκνζψκαηα αξρίδνπλ λα ζπκππθλψλνληαη θαη λα θαίλνληαη ζα κνλήξε ιεπηά λεκάηηα. Κάζε λεκάηην απνηειείηαη απφ δχν αδειθέο ρξσκαηίδεο. Σν ζηάδην ηεο δπγνηαηλίαο αξρίδεη κε ηε ζχδεπμε ησλ νκνιφγσλ ρξσκνζσκάησλ. Σα άθξα ησλ ρξσκνζσκάησλ γιηζηξνχλ θάησ απφ ηελ ππξεληθή κεκβξάλε θαη ελψλνληαη ζηνλ έλα πφιν ηνπ ππξήλα. Όηαλ νινθιεξσζεί ε ζχλαςε ην θχηηαξν πεξλά ζην ζηάδην ηεο παρπηαηλίαο. Σα δεχγε ησλ νκνιφγσλ ρξσκνζσκάησλ νλνκάδνληαη δηδχλακα ή ηεηξάδεο αθνχ απνηεινχληαη απφ ηέζζεξηο ρξσκαηίδεο (4*23=92). Σν ζηάδην ηεο δηπινηαηλίαο αξρίδεη κε ην δηαρσξηζκφ ησλ δεπγψλ. Σα νκφινγα ρξσκνζψκαηα απνκαθξχλνληαη κέρξη κηα νξηζκέλε απφζηαζε θαη νη αδειθέο ρξσκαηίδεο παξακέλνπλ ελσκέλεο ζπλδεφκελεο ζην θεληξνκεξίδην. Αληίζεηα, νη ρξσκαηίδεο ηνπ δηδχλακνπ ζπλδένληαη κε ηα ρηάζκαηα. Σν ρίαζκα είλαη ε θπηηαξνινγηθή έθθξαζε ηνπ θαηλνκέλνπ ηνπ θπηηαξνινγηθνχ αλαζπλδπαζκνχ ή ελάιιαμεο. ην ζηάδην ηεο δηπινηαηλίαο ηα ρξσκνζψκαηα απνζπκππθλψλνληαη θαη γίλεηαη έληνλε ζπλζεηηθή δξαζηεξηφηεηα αγγειηαθφξσλ RNAs. Σν ζηάδην ηεο δηαθίλεζεο απνηειεί έλα κεηαβαηηθφ ζηάδην κεηαμχ ηεο δηπινηαηλίαο θαη ηεο κεηάθαζεο I. ην ζηάδην απηφ ηα ρξσκνζψκαηα ζπκππθλψλνληαη θαη ε ζπλζεηηθή δξαζηεξηφηεηα ζηακαηά. Ζ πξφθαζε ηεο πξψηεο κεησηηθήο δηαίξεζεο ηειεηψλεη. Καηά ηε κεηάθαζε I ηα δηδχλακα δηαηάζνληαη ζηελ άηξαθην, ζην επίπεδν ηνπ ηζεκεξηλνχ, ε ζπκπχθλσζή ηνπο είλαη κέγηζηε θαη δηαθξίλνληαη ηα ρηάζκαηα. Καηά ηελ αλάθαζε I ηα νκφινγα ρξσκνζψκαηα ρσξίδνληαη κεηά ηε δηάζπαζε ησλ ρηαζκάησλ θαη κεηαθηλνχληαη πξνο ηνπο αληίζεηνπο πφινπο ηνπ θπηηάξνπ. [13]

14 ηελ ηειφθαζε I θάζε ζπγαηξηθφ θχηηαξν έρεη ζηαζεξφ αξηζκφ 23 ρξσκνζσκάησλ. Κάζε ρξσκφζσκα απνηειείηαη απφ δχν ρξσκαηίδεο ελσκέλεο ζην θεληξνκεξίδην (ζχλνιν 46 ρξσκαηίδεο). Ζ δεχηεξε κεησηηθή δηαίξεζε αθνινπζεί ακέζσο ηελ πξψηε. Καηά ηε κεζφθαζε δελ παξαηεξείηαη δηπιαζηαζκφο ηνπ DNA. Σα ρξσκνζψκαηα παξακέλνπλ ζπκππθλσκέλα θαη δηαηάζζνληαη γξήγνξα ζηε δεχηεξε άηξαθην. Καηά ηελ αλάθαζε ηεο δεχηεξεο κεησηηθήο δηαίξεζεο ηα θεληξνκεξίδηα θαη νη ρξσκαηίδεο δηαρσξίδνληαη θαη πξνθχπηνπλ θχηηαξα κε 23 ρξσκνζψκαηα, κνλήο ρξσκαηίδαο. Ζ κείσζε ηνπ ζπεξκαηνθπηηάξνπ είλαη έλα ζπλερέο θαηλφκελν πνπ αξρίδεη θαηά ηελ ήβε θαη ζπλερίδεηαη κέρξη κία αξθεηά πξνρσξεκέλε ειηθία. ην ζπεξκαηηθφ επηζήιην ηνπ αλζξψπνπ γηα λα νινθιεξσζνχλ νη δχν κεησηηθέο δηαηξέζεηο ρξεηάδνληαη 24 εκέξεο. Σεο κεησηηθήο δηαίξεζεο I πξνεγείηαη κηα θάζε πνιιαπιαζηαζκνχ ησλ ζπεξκαηνγνλίσλ. εκεησηένλ, ην πξψην θχκα πνιιαπιαζηαζκνχ παξαηεξείηαη θαηά ηελ εκβξπτθή δσή θαη αθνινπζείηαη απφ έλα απνπησηηθφ θχκα εθθχιηζεο ησλ ζπεξκαηνγνλίσλ. Καηά ηελ ήβε, μαλαξρίδεη ν πνιιαπιαζηαζκφο ησλ ζπεξκαηνγνλίσλ θαη ζπλερίδεηαη, κε δηαδνρηθά επαλαιακβαλφκελα θχκαηα, θαηά κήθνο ησλ ζπεξκαηηθψλ ζσιελαξίσλ. Όηαλ ν πνιιαπιαζηαζκφο ζηακαηά δηαθνξνπνηνχληαη ζε ζπεξκαηνθχηηαξα πξψηεο ηάμεο ηα νπνία πθίζηαληαη ηελ πξψηε κεησηηθή δηαίξεζε θαη κεηαηξέπνληαη ζε ζπεξκαηνθχηηαξα δεχηεξεο ηάμεο. Μεηά ην ηέινο ηεο δεχηεξεο κεησηηθήο δηαίξεζεο ηα γελλεηηθά θχηηαξα ηνπ αξζεληθνχ δηαθνξνπνηνχληαη ζε ζπεξκαηίδεο απφ ηηο νπνίεο ζρεκαηίδνληαη ηα ζπεξκαηνδσάξηα πεξκηνγέλεζε Ζ ζπεξκηνγέλεζε απνηειεί ηε δηεξγαζία κεηαηξνπήο ησλ ψξηκσλ ζπεξκαηίδσλ ζε ζπεξκαηνδσάξηα. Γηαθξίλεηαη ζηα εμήο ζηάδηα (ηα νπνία πεξηγξάθνληαη θαη ζρεκαηηθά ζηελ εηθφλα 2): 1. Σν ηάδην Golgi θαηά ην νπνίν πξναθξνζσκηθά θνθθία ζπλελψλνληαη ζην αθξνζσκηθφ θπζηίδην, ζηνλ πξφζζην πφιν ηνπ ππξήλα θαη ηα θεληξηφιηα [14]

15 κεηαλαζηεχνπλ ζηνλ αληίζεην πφιν, ην έλα θάζεηα πξνο ηελ θπηηαξηθή κεκβξάλε. 2. Σν ηάδην ηεο Καιχπηξαο θαηά ην νπνίν κεηαβάιιεηαη ην ζρήκα ηνπ αθξνζσκηθνχ θπζηηδίνπ, πνπ πεξηβάιιεη ην πξφζζην ήκηζπ ηνπ ππξήλα, ε ππξεληθή κεκβξάλε ράλεη ηνπο πφξνπο ηεο, ε ρξσκαηίλε ζπκππθλψλεηαη θαη αλαπηχζζεηαη ην ζχζηεκα ηνπ αμνλήκαηνο. 3. Σν ηάδην ηνπ Αθξνζψκαηνο θαηά ην νπνίν ην θπηηαξφπιαζκα κεηαηνπίδεηαη ζην νπίζζην ηκήκα ηνπ θπηηάξνπ, ηα θεληξηφιηα ζρεκαηίδνπλ ηνλ απρέλα ηνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ θαη ην αμφλεκα ζρεκαηίδεη κία ζσιελψδε δνκή πνπ απνηειείηαη απφ δχν θεληξηθνχο κηθξνζσιελίζθνπο πεξηβαιιφκελνπο απφ έλα δαθηχιην κε ελλέα πεξηθεξηθέο δπάδεο κηθξνζσιελίζθσλ θαη ελλέα αδξέο ίλεο απφ ηελ πεξηνρή ηνπ απρέλα πνπ εθηείλνληαη πξνο ηελ νπξά, γχξσ απφ ηνπο κηθξνζσιελίζθνπο. 4. Σν ηάδην ηεο Χξίκαλζεο θαηά ην νπνίν γίλεηαη πεξίζθηγμε θαη απνβνιή ηεο πεξίζζεηαο ηνπ θπηηαξνπιάζκαηνο πνπ θαγνθπηηαξψλεηαη απφ ηα θχηηαξα Sertoli θαη αθνινπζεί ε απειεπζέξσζε ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ ζηνλ απιφ. [15]

16 Δηθόλα 2 - πεξκηνγέλεζε 2.4 Μνξθνινγία ζπεξκαηνδσαξίνπ Έλα ζπεξκαηνδσάξην κπνξεί λα δηαθξηζεί ζε 3 κέξε, ηελ θεθαιή, ηνλ απρέλα θαη ηελ νπξά. ηελ εηθφλα 3 απεηθνλίδεηαη ζρεκαηηθά ε κνξθνινγία ελφο πγηνχο ζπεξκαηνδσαξίνπ. [16]

17 Δηθόλα 3 - Μνξθνινγία ζπεξκαηνδσαξίνπ Ζ θεθαιή πεξηέρεη ηνλ ππξήλα, ν νπνίνο απνηειείηαη απφ ην DNA θαη ηηο πξσηεΐλεο, θαη ην αθξφζσκα, ην νπνίν είλαη έλα θπζηίδην πνπ πεξηέρεη πδξνιπηηθά έλδπκα απαξαίηεηα γηα ηε δηείζδπζε ηνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ ζην σνθχηηαξν. Ο απρέλαο είλαη ην θνξπθαίν ηκήκα ηεο νπξάο ηνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ. Πεξηιακβάλεη ην δεχγνο ησλ θεληξηνιίσλ θαη έλα ζπλδεηηθφ ηκήκα πνπ ζρεκαηίδεη ηνπο ελλέα ηλψδεηο δαθηπιίνπο πνπ πεξηβάιινπλ ην αμφλεκα. Ζ νπξά δηαθξίλεηαη ζε ηξία ηκήκαηα, ην κέζν ηκήκα, ην θπξίσο ηκήκα θαη ην ηειηθφ ηκήκα. Σν ψξηκν ζπεξκαηνδσάξην απνηειείηαη απφ ην αμφλεκα πνπ δηαηξέρεη φιε ηελ νπξά θαη είλαη ππεχζπλν γηα ηελ θηλεηηθφηεηα ηνπ. Σν αμφλεκα είλαη έλαο εμεηδηθεπκέλνο θξνζζφο κε ελλέα πεξηθεξηθέο δπάδεο κηθξνζσιελίζθσλ γχξσ απφ [17]

18 έλα θεληξηθφ δεχγνο κηθξνζσιελίζθσλ. Σν κέζν ηκήκα ηνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ πεξηέρεη ην αμφλεκα πεξηβαιιφκελν απφ ελλέα παρηέο επηκήθεηο ίλεο θαη κία εμσηεξηθή δψλε κηηνρνλδξίσλ. Σν θπξίσο ηκήκα απνηειείηαη απφ ην αμφλεκα πεξηβαιιφκελν απφ ηηο ελλέα παρηέο επηκήθεηο ίλεο θαη πνιπάξηζκεο εμσηεξηθέο θπθινηεξείο ίλεο. Σν ηειηθφ ηκήκα απνηειείηαη κφλν απφ ην αμφλεκα. Ζ κνξθνινγία ελφο ζπεξκαηνδσαξίνπ είλαη πνιχ ζεκαληηθή θαη πξνζδηνξίδεη ζε κεγάιν βαζκφ ην θαηά πφζν είλαη απηφ ην ζπεξκαηνδσάξην ηθαλφ θαη θαηάιιειν γηα γνληκνπνίεζε. Αλ γηα παξάδεηγκα ε νπξά ελφο ζπεξκαηνδσαξίνπ δελ έρεη ζρεκαηηζζεί ζσζηά, ηφηε ππάξρεη πηζαλφηεηα απηφ λα κελ κπνξεί λα θηλεζεί εκπξφο θαη θπζηθά λα κελ θαηαθέξεη λα γνληκνπνηήζεη ην σάξην. Ζ κνξθνινγία καδί κε θάπνηα επηπιένλ ραξαθηεξηζηηθά είλαη απφ ηα πξψηα ζηνηρεία πνπ εμεηάδνληαη ζηηο πεξηπηψζεηο ππνγφληκσλ δεπγαξηψλ. Σα ραξαθηεξηζηηθά απηά παξνπζηάδνληαη ζηε ζπλέρεηα. 2.5 Υαξαθηεξηζηηθά ηνπ αλζξσπίλνπ ζπέξκαηνο χκθσλα κε ηνλ Παγθφζκην Οξγαληζκφ Τγείαο, έρνπλ εθδνζεί πξφηππεο ηηκέο γηα ηελ πνηφηεηα ηνπ αλζξσπίλνπ ζπέξκαηνο. χκθσλα κε ηηο έξεπλεο πνπ έρνπλ δηεμαρζεί δηαπηζηψζεθε φηη γηα λα ζεσξείηαη έλαο αζζελήο γφληκνο ζα πξέπεη λα ηζρχνπλ νη πξνυπνζέζεηο πνπ παξνπζηάδνληαη ζηνλ πίλαθα πνπ αθνινπζεί. Υαξαθηεξηζηηθά πέξκαηνο Όγθνο εθζπεξκάηηζεο Φπζηνινγηθέο ηηκέο >2,0 ml ph >7,2 πγθέληξσζε ζπέξκαηνο πλνιηθφο 20 εθαηνκκχξηα ζπεξκαηνδσάξηα αλά ml ή θαη πεξηζζφηεξν αξηζκφο 40 εθαηνκκχξηα ζπεξκαηνδσάξηα [18]

19 ζπεξκαηνδσαξίσλ αλά εθζπεξκάηηζε ή θαη πεξηζζφηεξα Κηλεηηθφηεηα 50% ή πεξηζζφηεξα κε εκπξφζζηα θαηεχζπλζε Μνξθνινγία 14% ή πεξηζζφηεξα έρνπλ θαλνληθή κνξθή ζχκθσλα κε ηα θξηηήξηα ηνπ Krüger. Λεπθνθχηηαξα <1 εθαηνκκχξην αλά ml Δηθόλα 4 - Πξόηππεο ηηκέο πνηόηεηαο ζπέξκαηνο Σα ραξαθηεξηζηηθά πνπ παξνπζηάδνληαη ζηνλ πίλαθα φκσο, δελ είλαη ηα αίηηα ηνπ πξνβιήκαηνο ηεο ππνγνληκφηεηαο. Δίλαη δείθηεο φηη ην γελεηηθφ πιηθφ δελ έρεη εθθξαζηεί νξζά ή φηη ππάξρεη θάπνηα κφιπλζε. Ο εξεπλεηήο μεθηλψληαο κε ην ζπεξκνδηάγξακκα, ειέγρεη ηα βαζηθά ραξαθηεξηζηηθά. Αλ παξαηεξήζεη φηη ππάξρεη θάπνην πξφβιεκα, ηφηε κε πην εμεηδηθεπκέλεο κεζφδνπο πξνζπαζεί λα ην εληνπίζεη. Αλ πξφθεηηαη γηα κφιπλζε, ηφηε εληνπίδεηαη ην κηθξφβην θαη δίλνληαο θαηάιιειε θαξκαθεπηηθή αγσγή, κεηά απφ έλα ζπγθεθξηκέλν δηάζηεκα, ν βαζηθφο έιεγρνο επαλαιακβάλεηαη θαη ζπλήζσο ν αζζελήο είλαη θπζηνινγηθφο. Αλ δελ πξφθεηηαη φκσο γηα κφιπλζε, ηφηε ην πξφβιεκα εζηηάδεηαη αιινχ, φπσο γηα παξάδεηγκα, ζηνλ ππξήλα ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ, ζηε ζπκπχθλσζε ηνπ DNA. Γηα ηελ θαιχηεξε θαηαλφεζε φκσο ηνπ γηαηί ε ζπκπχθλσζε ηνπ DNA κπνξεί λα πξνθαιέζεη πξνβιήκαηα ππνγνληκφηεηαο, ζεσξείηαη ζθφπηκε ε πεξηγξαθή ηεο ηφζν ζηα γελεηηθά θχηηαξα φζν θαη γηα ιφγνπο αληηπαξαβνιήο ζηα ζσκαηηθά. ηελ επφκελε ελφηεηα πεξηγξάθεηαη απηή ε ηφζν ζεκαληηθή δηεξγαζία, ε ζπκπχθλσζε ηνπ DNA. Δίλαη ηφζν ζεκαληηθή γηαηί έρεη ζαλ απνηέιεζκα ηελ πξνζηαζία ηνπ γνληδηψκαηνο κέζα ζηνλ ππξήλα ησλ θπηηάξσλ, έηζη ψζηε λα κπνξεί λα θιεξνδνηεζεί άζηθην θαη ζηηο επφκελεο γεληέο. [19]

20 2.6 πκπύθλσζε ηνπ DNA Σν κφξην ηνπ DNA είλαη έλα καθξχ πνιπκεξέο, ην νπνίν απνηειείηαη απφ δχν καθξηέο πνιπλνπθιενηηδηθέο αιπζίδεο, νη νπνίεο απνηεινχληαη απφ ηέζζεξα είδε λνπθιενηηδίσλ. Αλ απηφ ην πνιπκεξέο μεηπιηρζεί θαη «απισζεί» θηάλεη πεξίπνπ ηα δχν κέηξα κήθνο, γεγνλφο πνπ ζεκαίλεη φηη γηα λα πεξηνξηζηεί ζηνλ ππξήλα ησλ θπηηάξσλ, ζσκαηηθψλ θαη γελλεηηθψλ, ζα πξέπεη λα ζπκππθλσζεί. Ζ δηαδηθαζία ζπκπχθλσζεο γηα ηα δχν είδε θπηηάξσλ πεξηγξάθεηαη ζηε ζπλέρεηα πκπχθλσζε ζηα ζσκαηηθά θχηηαξα Σν ζχκπινθν DNA θαη πξσηετλψλ πνπ ζρεκαηίδεη έλα ρξσκφζσκα ιέγεηαη ρξσκαηίλε. Ζ ρξσκαηίλε πθίζηαηαη ζε δηάθνξεο θαηαζηάζεηο ζηε δηάξθεηα ηνπ θχθινπ δσήο ελφο θπηηάξνπ. ηνπο κεζνθαζηθνχο ππξήλεο βξίζθεηαη ζε κηα πην ραιαξή θαηάζηαζε. ηελ θαηάζηαζε απηή ηα έλδπκα θαη νη άιιεο πξσηεΐλεο πνπ απαηηνχληαη γηα ηελ έθθξαζε ησλ γνληδίσλ θαη ηελ αληηγξαθή ηνπ DNA κπνξνχλ λα πξνζπειάζνπλ ην DNA. Καζψο ηα ρξσκνζψκαηα πξνεηνηκάδνληαη γηα λα εηζέιζνπλ ζηε κίησζε, ε ίλα ηεο ρξσκαηίλεο ζπζπεηξψλεηαη πεξηζζφηεξν θαη πξνζιακβάλεη φιν θαη πην ζπκπαγή δνκή κέρξηο φηνπ ζρεκαηηζηεί ην πνιχ ζπκππθλσκέλν κηησηηθφ ρξσκφζσκα. ηα κηησηηθά ρξσκνζψκαηα ην DNA έρεη ήδε αληηγξαθεί θαη ε κεηαγξαθή έρεη ζηακαηήζεη. Σν πξψην θαη πην βαζηθφ επίπεδν ζπζθεπαζίαο ηεο ρξσκαηίλεο είλαη ην λνπθιενζσκάηην. Σν κεγαιχηεξν κέξνο ηεο ρξσκαηίλεο πθίζηαηαη ππφ κνξθή κηαο ίλαο δηακέηξνπ πεξίπνπ 30nm. Αλ απηή ε ρξσκαηίλε απνζπκππθλσζεί κεξηθψο ηφηε ζα θαίλεηαη ζα κηα ζεηξά απφ «ράληξεο ζε θνκπνιφη». Σν θνκπνιφη είλαη ην DNA θαη θάζε ράληξα είλαη ν ππξήλαο ηνπ λνπθιενζσκαηίνπ πνπ πεξηέρεη DNA πεξηειηγκέλν ζρεδφλ 2 θνξέο γχξσ απφ έλαλ πξσηετληθφ ππξήλα. Ο ππξήλαο ελφο λνπθιενζσκαηίνπ απνηειείηαη απφ έλα ζχκπινθν 8 πξσηετληθψλ κνξίσλ, ησλ ηζηνλψλ, θαη ελφο ηκήκαηνο δίθισλνπ DNA κήθνπο 146 δεπγψλ λνπθιενηηδίσλ. Ο φξνο λνπθιενζσκάηην αλαθέξεηαη ζε έλαλ ππξήλα λνπθιενζσκαηίνπ καδί κε ην γεηηνληθφ ζπλδεηηθφ ηκήκα DNA. Ο ζρεκαηηζκφο ησλ λνπθιενζσκαηίσλ κεηαηξέπεη [20]

21 έλα κφξην DNA ζε κηα ίλα ρξσκαηίλεο κε κήθνο ίζν κε ην 1/3 πεξίπνπ ηνπ αξρηθνχ κήθνπο θαη απνηειεί ην πξψην ζηάδην ζπκπχθλσζεο ηνπ DNA. [21]

22 Δηθόλα 5 - πκπύθλσζε ηνπ DNA ησλ ζσκαηηθώλ θπηηάξσλ [22]

23 Οη ηζηφλεο είλαη κηθξέο πξσηεΐλεο πνπ πεξηέρνπλ κεγάιν πνζνζηφ ζεηηθά θνξηηζκέλσλ ακηλνμέσλ. Σα ζεηηθά θνξηία βνεζνχλ ηηο ηζηφλεο λα ζπλδεζνχλ ηζρπξά κε ηνλ αξλεηηθά θνξηηζκέλν ζθειεηφ ηνπ DNA άζρεηα απφ ηελ αιιεινπρία ησλ λνπθιενηηδίσλ. Πάλσ ζην DNA ηα λνπθιενζσκάηηα απέρνπλ κεηαμχ ηνπο πεξίπνπ 200 δεχγε λνπθιενηηδίσλ (ηα 146 απφ απηά αληηζηνηρνχλ ζε DNA πεξηειηγκέλν γχξσ απφ ηνλ ππξήλα ησλ ηζηνλψλ θαη ηα ππφινηπα ζην ζπλδεηηθφ DNA πνπ παξεκβάιιεηαη αλάκεζα ζε γεηηνληθνχο ππξήλεο λνπθιενζσκαηίσλ). Σα λνπθιενζσκάηηα ζηνηβάδνληαη ην έλα πάλσ ζην άιιν θαη ζρεκαηίδνπλ κηα πην ζπκπαγή δνκή, ηελ ίλα ησλ 30nm. Ζ ίλα ηεο ρξσκαηίλεο ησλ 30nm κπνξεί λα ζπκππθλσζεί αθφκα πεξηζζφηεξν. Οξγαλψλεηαη πεξαηηέξσ ζε βξφρνπο πνπ πξνεμέρνπλ απφ έλα θεληξηθφ άμνλα. Σειηθά, απηή ε αιπζίδα ησλ βξφρσλ εηθάδεηαη φηη ππφθεηηαη ηνπιάρηζηνλ ζε κηα επηπιένλ δηεξγαζία ζπζθεπαζίαο γηα λα ζρεκαηίζεη ην κηησηηθφ ρξσκφζσκα, φπσο απεηθνλίδεηαη ζηελ εηθφλα πκπχθλσζε ζηα γελλεηηθά θχηηαξα Ζ παξαπάλσ δηαδηθαζία αθνξά ηε ζπκπχθλσζε ηνπ DNA ησλ ζσκαηηθψλ θπηηάξσλ. ηα ζπεξκαηνδσάξηα φκσο, ην DNA πξέπεη λα ζπκππθλσζεί πεξαηηέξσ θαη απηφ επηηπγράλεηαη κέζσ ηεο απνκάθξπλζεο ησλ ηζηνλψλ θαη ηεο αληηθαηάζηαζήο ηνπο απφ κηθξέο βαζηθέο πξσηεΐλεο, ηηο πξσηακίλεο. Καηά ηε δηάξθεηα ηεο ζπεξκηνγέλεζεο γίλεηαη έλαο εθηεηακέλνο επαλαζρεδηαζκφο ηεο ζπεξκαηίδαο θαη ε λνπθιενζσκηθή δνκή ηνπ κεζνθαζηθνχ ππξήλα απνδηνξγαλψλεηαη ζηαδηαθά. Οη πεξηζζφηεξεο ζσκαηηθέο ηζηφλεο ηνπ ππξήλα αληηθαζίζηαληαη απφ ζπγθεθξηκέλεο ππξεληθέο πξσηεΐλεο ηνπ ζπέξκαηνο, ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ θαη ησλ κεηαβαηηθψλ πξσηετλψλ, νη νπνίεο κε ηε ζεηξά ηνπο αληηθαζίζηαληαη απφ ηηο πην βαζηθέο πξσηακίλεο. ηνπο αλζξψπνπο έρνπλ αλαγλσξηζηεί 4 κεηαβαηηθέο πξσηεΐλεο. Απηέο νη πξσηεΐλεο ελψλνληαη κε ην DNA θαη πξνθαινχλ αζηάζεηα ζηα λνπθιενζσκαηίδηα ηνπ ππξήλα, επηηξέπνληαο λα αθνινπζήζεη ε δηαδηθαζία ηεο πξσηακίλσζεο θαη ζπλεπψο ε νινθιήξσζε ηεο ζπκπχθλσζεο ηεο ρξσκαηίλεο. [23]

24 Ζ δηαδηθαζία ζπκπχθλσζεο ηεο ρξσκαηίλεο ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ εμειίζζεηαη ζηαδηαθά. Ζ πξψηε βηνρεκηθή αιιαγή είλαη ε αληηθαηάζηαζε ησλ ηζηνλψλ απφ ηζνκνξθέο εηδηθέο γηα ηνλ φξρη. ρεδφλ φιεο απηέο, ζπληίζεληαη πξηλ θαη θαηά ηε δηάξθεηα ηεο παξαγσγήο ησλ κεηαβαηηθψλ πξσηετλψλ θαη πξσηακηλψλ θαη κεξηθά κέιε ηεο νηθνγέλεηαο απηήο έρνπλ θξίζηκν ξφιν ζηε ζπκπχθλσζε ηνπ ππξήλα θαη ζηελ αλαδηνξγάλσζε ηνπ γνληδηψκαηνο. ρεκαηηθά, νη θπξηφηεξεο αιιαγέο ζηε ρξσκαηίλε πνπ ζπκβαίλνπλ θαηά ηε δηάξθεηα ηεο κεηάβαζεο απφ ηηο ηζηφλεο ζηηο πξσηακίλεο μεθηλνχλ κε ηελ ππεξαθεηπιίσζε ζηα Ν-άθξα ηεο νπξάο ησλ ηζηνλψλ θαη ην δηαρσξηζκφ ησλ λνπθιενζσκάησλ, ελψ ε ηνπντζνκεξάζε II μεηπιίγεη ηελ ππεξέιηθα ηνπ DNA. Δίλαη γεληθά παξαδεθηφ φηη ε ζπκπχθλσζε ηεο ρξσκαηίλεο κπνξεί λα θαζηζηά αλαγθαία ηε δξάζε ηεο ελδνγελνχο λνπθιεάζεο (ηνπντζνκεξάζε II) ψζηε λα δεκηνπξγήζεη θαη λα ελψζεη ηηο εγθνπέο πνπ δηεπθνιχλνπλ ηελ πξσηακίλσζε θαηά ηε δηάξθεηα ηεο ζπεξκηνγέλεζεο. Απηέο νη εγθνπέο ζεσξείηαη φηη απαιιάζζνπλ απφ ην ζηξεο ιφγσ ππεξειίθσζεο θαη βνεζνχλ ηελ επαλαδηάηαμε ηεο ρξσκαηίλεο θαηά ηελ εθηφπηζε ησλ ηζηνλψλ απφ ηηο πξσηακίλεο. Γηα ην ιφγν απηφ, ε χπαξμε ησλ ελδνγελψλ εγθνπψλ ζηα ζπεξκαηνδσάξηα κπνξεί λα ζπλνδεχεηαη απφ αλσκαιίεο θαηά ηε δηάξθεηα ηεο ζπεξκηνγέλεζεο θαη εκηηειή δηαδηθαζία σξίκαλζεο. Οη κεηαβαηηθέο πξσηεΐλεο ησλ ζειαζηηθψλ εθθξάδνληαη ζε πςειφ βαζκφ ζηα κεζαία ζηάδηα ηεο ζπεξκηνγέλεζεο ζπκπίπηνληαο κε ηελ αλαδηάηαμε ηεο ρξσκαηίλεο θαη ιακβάλνπλ κέξνο ζηελ επηδηφξζσζε ησλ εγθνπψλ κνλήο-έιηθαο ηνπ DNA. Ζ κεηαβαηηθή πξσηεΐλε TP1 κπνξεί λα δηεγείξεη ηελ επηδηφξζσζε εγθνπψλ κνλήοέιηθαο in vitro, φπσο επίζεο θαη βιαβψλ ζην DNA πνπ έρνπλ πξνθιεζεί απφ UV αθηηλνβνιία. Έρεη πξνηαζεί πσο νη πξσηεΐλεο TP1 ζπκκεηέρνπλ ζηε δηαδηθαζία ηεο επηδηφξζσζεο θαη γη απηφ δηαδξακαηίδνπλ έλαλ ελεξγφ ξφιν ζηε δηαηήξεζε ηεο αθεξαηφηεηαο ηνπ αλδξηθνχ απινεηδνχο γνληδηψκαηνο θαηά ηε δηάξθεηα ηεο ζπεξκηνγέλεζεο. Μεηά ηε καδηθή ζχλδεζε ησλ κεηαβαηηθψλ πξσηετλψλ ζην DNA, ε αληηγξαθή ζηακαηά. Σελ παχζε ηεο αληηγξαθήο αθνινπζεί ε επηδηφξζσζε ησλ εγθνπψλ ηνπ DNA θαη μεθηλά ε ζχλδεζε ησλ θσζθνξπιηνκέλσλ πξσηακηλψλ. Απηέο νη πξσηεΐλεο έρνπλ κηθξή κνξηαθή κάδα θαη είλαη πνιχ βαζηθέο. Ζ θσζθνξπιίσζή ηνπο δηεπθνιχλεη ηελ νξζή ζχλδεζε ζην DNA, ελψ αξγφηεξα ε απνθσζθνξπιίσζε ζρεηίδεηαη κε ηελ αχμεζε ηεο ζπκπχθλσζεο ηεο ρξσκαηίλεο ζηα ζπεξκαηνδσάξηα. [24]

25 Καηά ηε δηάξθεηα ηεο σξίκαλζεο ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ ζηελ επηδηδπκίδα, ε ζηαπξσηή ζχλδεζε ησλ δηζνπιθηδηθψλ δεζκψλ ησλ πξσηακηλψλ ζηαζεξνπνηεί πεξαηηέξσ ην ζχκπιεγκα ησλ λνπθιενπξσηακηλψλ. ηε γνληκνπνίεζε ε πςεινχ βαζκνχ ζπκππθλσκέλε δνκή ησλ λνπθιενπξσηακηλψλ πξέπεη λα απνζπκππθλσζεί θαη λα αλαδηνξγαλσζεί ζηε δνκή ησλ λνπθιενζσκαηηδίσλ. πλεπψο, ε νξγάλσζε ηνπ DNA ηνπ ππξήλα ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ φρη κφλν επηηξέπεη ηελ πνιχ ζπκππθλσκέλε γελεηηθή πιεξνθνξία λα κεηαθεξζεί ζην σάξην, αιιά επίζεο εμαζθαιίδεη φηη ην DNA παξαδίδεηαη ζε κία θπζηθή θαη ρεκηθή κνξθή, ε νπνία επηηξέπεη ζην ππφ αλάπηπμε έκβξπν λα έρεη πξφζβαζε ζηε γελεηηθή πιεξνθνξία. Χζηφζν, είλαη αλαγθαίν λα ηνληζηεί φηη θάπνηεο πεξηνρέο ηνπ DNA ζηνλ ππξήλα ηνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ δηαηεξνχλ κία λνπθιενζσκηθή δνκή. Απηφ είλαη ν ιφγνο θπξίσο ζηνπο αλζξψπνπο φπνπ δηαηεξείηαη κία δηπιή νξγάλσζε θαη κε λνπθιενηζηφλεο θαη κε λνπθιενπξσηακίλεο. Πεξίπνπ ην 15% ηνπ DNA ηνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ ζπζρεηίδεηαη κε ηζηφλεο θαη άιιεο πξσηεΐλεο (λνπθιενζσκηθήο δνκήο), ελψ ην ππφινηπν 85% είλαη ζπκππθλσκέλν κε ην ζχκπιεγκα ησλ λνπθιενπξσηακηλψλ. Οη κεηαβαηηθέο πξσηεΐλεο θαη νη πξσηακίλεο είλαη πξντφληα θάπνησλ κνλαδηθψλ γνληδίσλ ηα νπνία βξίζθνληαη κφλν ζηα αξζεληθά αλαπαξαγσγηθά θχηηαξα. Οη πξσηακίλεο είλαη κηθξέο, βαζηθέο πξσηεΐλεο πνπ παθεηάξνπλ ην DNA θαη ην κηθξαίλνπλ ζε φγθν πεξίπνπ ζην έλα εηθνζηφ απφ απηφλ πνπ έρεη ν ππξήλαο ησλ ζσκαηηθψλ θπηηάξσλ. Σα πεξηζζφηεξα ζειαζηηθά έρνπλ κφλν έλα γνλίδην πξσηακίλεο, αιιά ηα πνληίθηα, νη άλζξσπνη θαη ιίγα άιια ζειαζηηθά έρνπλ δχν. ηα ζειαζηηθά έρνπλ ηαπηνπνηεζεί δχν δηαθνξεηηθνί ηχπνη πξσηακηλψλ, ε P1 θαη ε P2. Απφ ηνλ ππξήλα ηνπ αλζξψπηλνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ έρεη απνκνλσζεί κία νκάδα ηεζζάξσλ πξσηακηλψλ (HP1, HP2, HP3, HP4): ε πξσηακίλε HP1 αληηπξνζσπεχεη ηελ νηθνγέλεηα πξσηακηλψλ P1, ελψ νη πξσηακίλεο HP2,HP3,HP4 αλήθνπλ ζηελ P2 νηθνγέλεηα πξσηακηλψλ. Ζ πξσηακίλε P2 εθηειεί κία πνιχ ζεκαληηθή ιεηηνπξγία ζηελ αλδξηθή γνληκφηεηα. Καη νη δχν πξσηακίλεο βξίζθνληαη ζρεδφλ ζηηο ίδηεο πνζφηεηεο. Απηφ ζεκαίλεη φηη ε κέζε αλαινγία P1/P2 πξσηακηλψλ ζην αλζξψπηλν ζπεξκαηνδσάξην είλαη πεξίπνπ 1,0. Έρεη βξεζεί φηη ηα ζπεξκαηνδσάξηα θάπνησλ κε γφληκσλ αλδξψλ έρνπλ δηαθνξεηηθή αλαινγία πξσηακηλψλ P1/P2 θαη/ή κε αληρλεχζηκε P2 ζε ψξηκν ζπεξκαηνδσάξην, ελψ ε ζπρλφηεηα εκθάληζεο πξσηακηληθψλ αλσκαιηψλ ζε ζπεξκαηνδσάξηα ψξηκσλ αλδξψλ είλαη εμαηξεηηθά ζπάληα (δελ έρνπλ αλαθεξζεί κέρξη ζήκεξα ηέηνηεο πεξηπηψζεηο). ε κεξηθνχο κε- [25]

26 γφληκνπο άλδξεο παξαηεξήζεθαλ απμεκέλεο ή ζρεδφλ κεδεληθέο αλαινγίεο νη νπνίεο ζπρλά ζπλδένληαη κε ζνβαξέο αλσκαιίεο θαηά ηε ζπεξκαηνγέλεζε. Πξφζθαηα έρεη πξνηαζεί φηη ε αλαινγία P1/P2 κπνξεί λα παξέρεη πην αθξηβή θαη επαίζζεηε πξφβιεςε ηεο ιεηηνπξγηθήο ηθαλφηεηαο ηνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ απ φηη νη άιιεο δηαζέζηκεο κέζνδνη κειέηεο ηεο κνξθνινγίαο θαη θπζηνινγίαο ηνπ ζπέξκαηνο. Ζ κε-θπζηνινγηθή έθθξαζε ηεο πξσηακίλεο έρεη ζπζρεηηζηεί κε ρακειφ αξηζκφ ζπεξκαηνδσαξίσλ, κεησκέλε θηλεηηθφηεηα θαη κνξθνινγία ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ, κεδεληθή γνληκφηεηα θαη απμεκέλεο βιάβεο ζηε ρξσκαηίλε ηνπ ζπέξκαηνο, θάπνηεο απφ ηηο νπνίεο δελ ζρεηίδνληαη εθ πξψηεο φςενο κε ηε ιαλζαζκέλε ζπκπχθλσζε ρξσκαηίλεο. ε θάπνηεο πεξηπηψζεηο αλδξηθήο ζηεηξφηεηαο ε P2 είλαη εληειψο απνχζα ή ε θαλνληθή αλαινγία ησλ δχν νηθνγελεηψλ πξσηακηλψλ έρεη αιινησζεί. Δπηπιένλ, νη ζηείξνη αζζελείο είραλ θάπνηεο θνξέο ρακειά επίπεδα πξσηακίλεο P2 καδί κε πςειά επίπεδα απφ πξνδξφκνπο ηεο P2. Δπηπξφζζεηα, ε δηαηάξαμε είηε ηνπ γνληδίνπ P2 είηε ηνπ P1 πνπ έπεηαη ηεο δηαηαξαγκέλεο ζπκπχθλσζεο ηνπ ππξήλα ηνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ, αιιάδεη νδεγψληαο απφ ηηο πξφδξνκεο κνξθέο ζε ψξηκεο θαη ζε ειαηησκαηηθή ιεηηνπξγία ηνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ. πλεπψο θαη νη δχν θπζηνινγηθέο πξσηακίλεο είλαη απαξαίηεηεο γηα ηελ παξαγσγή θπζηνινγηθνχ θαη ιεηηνπξγηθνχ ζπεξκαηνδσαξίνπ. ηελ εηθφλα 6 θαίλεηαη ην πηζαλφ κνληέιν δξάζεο ηεο κεηαβαηηθήο πξσηεΐλεο ηχπνπ 1 ζηελ επηδηφξζσζε βιαβψλ ηνπ DNA. Αξρηθά, δεκηνπξγνχληαη εγθνπέο ζε θάζε έλαλ απφ ηνπο δχν θιψλνπο ηνπ DNA κεηά ηελ απνκάθξπλζε ησλ ηζηνλψλ. α δεχηεξν βήκα, ε κεηαβαηηθή πξσηεΐλε ζπλδέεηαη κε ηα κνλφθισλα ηκήκαηα ηνπ DNA, ηα θέξλεη θνληά θαη ηα πξνζαλαηνιίδεη ην έλα πξνο ην άιιν. Έπεηηα, κηα DNA ιηγάζε ζπλδέεη ηα κνλφθισλα ηκήκαηα θαη ηειηθά αθνινπζεί ε αληηθαηάζηαζε ησλ κεηαβαηηθψλ πξσηετλψλ απφ ηηο πξσηακίλεο. [26]

27 Δηθόλα 6 - Γηαδηθαζία πξσηακίλσζεο Ο ηξφπνο κε ηνλ νπνίν νη πξσηακίλεο αληηθαζηζηνχλ ηηο κεηαβαηηθέο πξσηεΐλεο θαη ζηε ζπλέρεηα ελαπνηίζεληαη ζην DNA δελ έρεη δηεπθξηληζηεί. Απηφ πνπ είλαη γλσζηφ, κε δνκηθέο κειέηεο, είλαη φηη ε εκθάληζε ησλ πξσηακηλψλ θαη ε ζπκπχθλσζε ηεο [27]

28 ρξσκαηίλεο μεθηλά απφ ηελ πεξηθέξεηα ηνπ ππξήλα θάησ απφ ην αθξνζσκηθφ θπζηίδην θαη ζηε ζπλέρεηα πξνρσξά πξνο ην πίζσ κέξνο ηνπ ππξήλα. 2.7 Απόπησζε Ο θπηηαξηθφο ζάλαηνο κπνξεί λα επέιζεη κε δχν ηξφπνπο, ηε λέθξσζε θαη ηελ απφπησζε. Πξφθεηηαη γηα δχν δηαδηθαζίεο εληειψο δηαθνξεηηθέο κεηαμχ ηνπο, κε δηαθνξεηηθέο ζπλζήθεο έλαξμεο θαη δηαθνξεηηθή κνξθή ησλ θπηηάξσλ θαηά ηε δηάξθεηα. Ζ λέθξσζε νθείιεηαη ζε παζνινγηθά αίηηα πνπ πξνθαινχλ βιάβε ηνπ θπηηάξνπ, ραξαθηεξίδεηαη απφ δηφγθσζε θαη δηάζπαζε απηνχ θαη πξνθαιεί θαξπφιπζε θαη ζπγθέληξσζε ηεο ρξσκαηίλεο ζε κάδεο αζαθνχο πεξηγξάκκαηνο. Ζ απφπησζε ή πξνγξακκαηηζκέλνο θπηηαξηθφο ζάλαηνο ή ελεξγφο θπηηαξηθφο ζάλαηνο είλαη βαζηθή βηνινγηθή δηεξγαζία, απαξαίηεηε γηα ηελ απνκάθξπλζε ησλ πιενλαδφλησλ θπηηάξσλ θαηά ηελ εκβξπτθή αλάπηπμε, γηα ηε δηαηήξεζε ηεο νκνηφζηαζεο ζηνλ ψξηκν νξγαληζκφ, ηελ σξίκαλζε ησλ θπηηαξηθψλ πιεζπζκψλ ηνπ αηκνπνηεηηθνχ θαη ηνπ αλνζνπνηεηηθνχ ζπζηήκαηνο θαη ηελ θαηαζηνιή ηεο θαθνήζνπο εμαιιαγήο. Σν βαζηθφ πξφγξακκα ηεο απφπησζεο ππάξρεη ζε φια ηα θχηηαξα αιιά ε ελεξγνπνίεζε ησλ ζπληειεζηψλ πνπ επάγνπλ θαη ξπζκίδνπλ ηελ εθηέιεζε ηνπ εμαξηάηαη απφ εξεζίζκαηα ηνπ εμσθπηηάξηνπ θαη ελδνθπηηάξηνπ πεξηβάιινληνο. Ζ νκνηφζηαζε ζηνλ ψξηκν νξγαληζκφ επηηπγράλεηαη κε δπλακηθή ηζνξξνπία κεηαμχ ησλ δηεξγαζηψλ ηνπ θπηηαξηθνχ πνιιαπιαζηαζκνχ θαη ηνπ θπηηαξηθνχ ζαλάηνπ. Δμσγελή ή/θαη ελδνγελή εξεζίζκαηα ελεξγνπνηνχλ ηνλ απνπησηηθφ κεραληζκφ, κε ζθνπφ ηελ απνκάθξπλζε ησλ θπηηάξσλ πνπ δηαλχνπλ ην ζηάδην ηεο ηειηθήο δηαθνξνπνίεζεο ή πνπ έρνπλ επηδήζεη κεηά απφ θάπνηα γελεηηθή βιάβε. Ζ απφπησζε δηαθξίλεηαη ζηα αθφινπζα ζηάδηα: 1. πξξηθλψλεηαη ην θπηηαξφπιαζκα θαη ζπκππθλψλεηαη ε ρξσκαηίλε ζε κία ή πεξηζζφηεξεο κάδεο 2. Κεξκαηίδνληαη ν ππξήλαο, ηα κηηνρφλδξηα θαη ην θχηηαξν [28]

29 3. ρεκαηίδνληαη απνπησηηθά ζσκάηηα, ηα νπνία πεξηβάιινληαη απφ κεκβξάλε, έρνπλ ιεία επηθάλεηα θαη πεξηέρνπλ αθέξαηα νξγαλίδηα θαη ηκήκαηα ηνπ ππξήλα 4. Υάλεηαη ε ραξαθηεξηζηηθή αζπκκεηξία ζηελ θαηαλνκή ησλ θσζθνιηπηδίσλ πνπ παξαηεξείηαη ζηε θπζηνινγηθή θπηηαξηθή κεκβξάλε θαη ε αξλεηηθά θνξηηζκέλε θσζθαηηδπινζεξίλε εθηίζεηαη ζην εμσηεξηθφ. Ζ κεηαβνιή απηή απνηειεί έλαλ απφ ηνπο θχξηνπο ζηφρνπο αλαγλψξηζεο ησλ απνπησηηθψλ ζσκαηίσλ απφ ηα καθξνθάγα. 5. Σα θαγνθχηηαξα θαγνθπηηαξψλνπλ ηα απνπησηηθά ζσκάηηα θαη παξάγνπλ θπηνθίλεο γηα λα πεξηνξηζηεί ε εθδήισζε θιεγκνλήο ηνπηθά. Οη δχν δηαδηθαζίεο πεξηγξάθνληαη ζρεκαηηθά ζηελ εηθφλα 7, φπνπ θαη θαίλεηαη ε ραξαθηεξηζηηθφηεξε δηαθνξά ηνπο, κε ηελ απφπησζε λα ζρεκαηίδνληαη ζσκάηηα, ελψ κε ηε λέθξσζε φρη. Σν θχξην βηνρεκηθφ ραξαθηεξηζηηθφ ηεο απφπησζεο είλαη ν θεξκαηηζκφο ηνπ DNA απφ ην έλδπκν ελδνλνπθιεάζε ζε πνιιαπιά δηαλνπθιενζσκηθά ηκήκαηα κεγέζνπο δεχγε βάζεσλ. ηνλ θεξκαηηζκφ ηνπ DNA θαη ηελ απνκάθξπλζε ησλ απνπησηηθψλ ζσκαηίσλ ζπκκεηέρνπλ θαη άιια έλδπκα: λνπθιεάζεο, πξσηεάζεο, ηξαλζγινπηακηλάζεο. Γηα λα ελεξγνπνηεζνχλ απηά ηα έλδπκα ρξεηάδνληαη ηφληα αζβεζηίνπ θαη καγλεζίνπ θαζψο θαη κεηαβνιή ηνπ ελδνθπηηάξηνπ ph. [29]

30 Δηθόλα 7 - Νέθξσζε & Απόπησζε 2.8 Πξνέιεπζε βιάβεο ζην ζπεξκαηηθό DNA Ο πιεζπζκφο ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ ζε κηα εθζπεξκάηηζε κπνξεί λα είλαη αξθεηά εηεξνγελήο. Απηφ είλαη πεξηζζφηεξν πξνθαλέο ζε αζζελείο, νη ηηκέο παξακέηξσλ ζπέξκαηνο ησλ νπνίσλ κπνξεί λα είλαη θάησ απφ ην θπζηνινγηθφ φξην. Ζ ζρέζε κεηαμχ θησρψλ παξακέηξσλ ζπέξκαηνο θαη βιάβεο ηνπ DNA ζηα ζπεξκαηνδσάξηα θαηαδεηθλχεη εγγελή πξνβιήκαηα ζηε ζπεξκαηνγέλεζε ζε ζπγθεθξηκέλνπο αζζελείο. Πεξηβαιινληηθά εξεζίζκαηα (stress), κεηαιιάμεηο γνληδίσλ θαη ρξσκνζσκηθέο αλσκαιίεο κπνξνχλ λα δηαηαξάμνπλ ηηο πνιχ επαίζζεηεο βηνρεκηθέο δηαδηθαζίεο, νη νπνίεο ζπκβαίλνπλ θαηά ηε δηάξθεηα ηεο ζπεξκαηνγέλεζεο, γεγνλφο πνπ κπνξεί λα νδεγήζεη ζε κε-θπζηνινγηθή δνκή ηεο ρξσκαηίλεο, θάηη πνπ είλαη αζχκβαην κε ηε [30]

31 γνληκφηεηα. Αλσκαιίεο ζηε ζπεξκαηηθή ρξσκαηίλε ηνπ ππξήλα κπνξνχλ λα πξνθιεζνχλ απφ ή λα ζπκβνχλ θαηά ηε δηάξθεηα ηεο ζπκπχθλσζεο ηνπ DNA ζηε ζπεξκηνγέλεζε. Γηαθνξεηηθά, κπνξεί λα είλαη απνηέιεζκα ειεχζεξσλ ξηδψλ ή ζπλέπεηα ηεο απφπησζεο. Οη αθξηβείο κεραληζκνί κε ηνπο νπνίνπο εκθαλίδεηαη βιάβε ζην DNA ησλ αλζξψπηλσλ ζπεξκαηνδσαξίσλ δελ είλαη επαθξηβψο γλσζηνί, αιιά έρνπλ πξνηαζεί ηξεηο θχξηεο ζεσξίεο, νη νπνίεο είλαη ε ειαηησκαηηθή ζπκπχθλσζε ηεο ρξσκαηίλεο ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ, ε απφπησζε θαη ην νμεηδσηηθφ ζηξεο Διαηησκαηηθή ζπκπχθλσζε ρξσκαηίλεο Απηή ε ζεσξία έρεη ηηο βάζεηο ηεο ζε κειέηεο πνπ γίλνληαη ζε δψα θαη ζπλδέεηαη κε ηνλ κνλαδηθφ ηξφπν κε ηνλ νπνίν ζπκππθλψλεηαη ε ρξσκαηίλε ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ ησλ ζειαζηηθψλ. Έρεη γίλεη αμίσκα φηη ε ζπκπχθλσζε ηεο ρξσκαηίλεο κπνξεί λα απαηηήζεη ηε ιεηηνπξγία ηεο ελδνλνπθιεάζεο γηα λα δεκηνπξγήζεη εγθνπέο ζηνπο θιψλνπο ψζηε λα δηεπθνιπλζεί ε πξσηακίλσζε θαηά ηε δηάξθεηα ηεο ζπεξκαηνγέλεζεο. Απηέο νη εγθνπέο ζεσξείηαη φηη κεηψλνπλ ηελ έληαζε ηεο ππεξειίθσζεο θαη βνεζνχλ ηελ αλαδηάηαμε ηεο ρξσκαηίλεο θαηά ηελ αληηθαηάζηαζε ησλ ηζηνλψλ απφ πξσηακίλεο. πλεπψο, ε παξνπζία ελδνγελψλ εγθνπψλ ζηα ζπεξκαηνδσάξηα, κπνξεί λα θαηαδεηθλχεη δηαηαξαρέο θαηά ηε δηάξθεηα ηεο ζπεξκαηνγέλεζεο θαη κηα εκηηειή δηαδηθαζία σξίκαλζεο Απφπησζε Απηή ε δηαδηθαζία ζπλήζσο ιακβάλεη ρψξα ζε ζπγθεθξηκέλεο θάζεηο ηεο θπζηνινγηθήο εκβξπηθήο αλάπηπμεο γηα λα επηηξέςεη ηνλ νξηζηηθφ ζρεκαηηζκφ ησλ ηζηψλ θαη ζηελ ψξηκε δσή γηα ηελ απνβνιή θπηηάξσλ ηα νπνία πιένλ δελ έρνπλ θακία ιεηηνπξγηθφηεηα, ή έρεη αιιάμεη ε ιεηηνπξγηθφηεηά ηνπο. ηνπο φξρεηο ησλ ζειαζηηθψλ ηα ζπεξκαηνγφληα αλαπηχζζνληαη θισληθά κέζσ πνιιψλ κηηψζεσλ πξνηνχ κπνπλ ζην ζηάδην δηαθνξνπνηήζεο, ην νπνίν ζα ηα κεηαηξέςεη ζε ψξηκα ζπεξκαηνδσάξηα. Απηή ε θισληθή αλάπηπμε είλαη εθηεηακέλε θαη ζπλεπψο απαηηεί έλα κεραληζκφ φπσο ε απφπησζε γηα λα αληηζηνηρεί ν αξηζκφο [31]

32 ησλ ζπεξκαηνγνλίσλ ζηελ ηδαληθή ηξνθηθή ππνζηεξηθηηθή δπλαηφηεηα ησλ θπηηάξσλ Sertoli. πλεπψο ε απφπησζε ειέγρεη ηελ ππεξπαξαγσγή ησλ αλδξηθψλ γακεηψλ θαη πεξηνξίδεη ηα θπζηνινγηθά επίπεδα πνιιαπιαζηαζκνχ θαηά ηε δηάξθεηα ζπλζεθψλ πνπ δελ είλαη θαηάιιειεο γηα ηελ αλάπηπμε ζπεξκαηνδσαξίσλ. Ζ χπαξμε ηεο πξσηεΐλεο Fas ζηελ επηθάλεηα ελφο θπηηάξνπ, κπνξεί λα κεζνιαβεί ηεο απφπησζεο ζην ζπεξκαηνδσάξην. Ζ ζχλδεζε ηεο Fas ιηγάζεο (FasL) ή ηνπ agonistic Fas αληηζψκαηνο κε ηε Fas ζθνηψλεη ηα θχηηαξα κέζσ ηεο απφπησζεο. ε φξρεηο θπζηνινγηθψλ πνληηθψλ θαη αξνπξαίσλ, ηα θχηηαξα Sertoli εθθξάδνπλ ηε Fas θαη ζεκαηνδνηνχλ ην ζάλαην ησλ Fas-ζεηηθψλ ζπεξκαηνγνλίσλ, πεξηνξίδνληαο θαη απηφ ηνλ ηξφπν ηνλ πιεζπζκφ ησλ ζπεξκαηνγνλίσλ ζε αξηζκφ πνπ κπνξνχλ λα ππνζηεξίμνπλ. ηνπο άλδξεο κε θπζηνινγηθέο παξακέηξνπο ζπέξκαηνο ην πνζνζηφ ησλ Fas-ζεηηθψλ ζπεξκαηνδσαξίσλ είλαη κηθξφο. ηνπο άλδξεο κε κε-θπζηνινγηθέο παξακέηξνπο ζπέξκαηνο, σζηφζν, ην πνζνζηφ ησλ Fas-ζεηηθψλ ζπεξκαηνδσαξίσλ κπνξεί λα θηάζεη κέρξη θαη ην 50%. Απηή ε παξαηήξεζε δείρλεη φηη δε ζπκβαίλεη ζσζηή δηαινγή ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ κέζσ ηεο απφπησζεο ζηνπο ζηείξνπο άλδξεο. Γη απηφ ε παξνπζία ζπεξκαηνδσαξίσλ κε απνπησηηθά ραξαθηεξηζηηθά, φπσο ε Fasζεηηθφηεηα θαη ε βιάβε ζην DNA, δείρλεη φηη ζηνπο άλδξεο κε κε-θπζηνινγηθέο παξακέηξνπο ζπέξκαηνο ε απφπησζε μεθίλεζε αιιά δελ νινθιεξψζεθε. Ζ αδπλακία ζηε δηαινγή ησλ Fas-ζεηηθψλ ζπεξκαηνδσαξίσλ κπνξεί λα νθείιεηαη ζε δπζιεηηνπξγία ελφο ή πεξηζζφηεξσλ επηπέδσλ. Δπεηδή ηα θχηηαξα Sertoli κπνξνχλ λα πεξηνξίζνπλ ηνλ πνιιαπιαζηαζκφ ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ κε ηελ παξαγσγή ηεο FasL, είλαη γλσζηφ φηη νιηγνδσνζπεξκηθνί άλδξεο κε κεησκέλε ζπεξκαηνγέλεζε δελ παξάγνπλ αξθεηά ζπεξκαηνδσάξηα ψζηε λα ελεξγνπνηήζνπλ απηή ηε δηαδηθαζία. ε απηνχο ηνπο άλδξεο, ηα Fas-ζεηηθά ζπεξκαηνδσάξηα κπνξεί λα απνθχγνπλ ηελ απφπησζε. Fas -ζεηηθά ζπεξκαηνδσάξηα κπνξεί λα ππάξρνπλ ιφγσ πξνβιήκαηνο ζηελ ελεξγνπνίεζε ηεο FAS-ελδηάκεζεο απφπησζεο. Απηή ε ππφζεζε κπνξεί λα εμεγεί ην γηαηί αζζελείο κε κε-θπζηνινγηθέο παξακέηξνπο ζπέξκαηνο έρνπλ επίζεο θαη πςειφηεξν πνζνζηφ ζπεξκαηνδσαξίσλ κε βιάβε ζην DNA θαη κε-θπζηνινγηθά ζπεξκαηνδσάξηα, ηα νπνία έρνπλ ζεκάδηα απφπησζεο Ομεηδσηηθφ ζηξεο [32]

33 Σα ηειεπηαία ρξφληα, έρεη εθδεισζεί κεγάιν ελδηαθέξνλ γηα ηελ παξαγσγή ελεξγψλ κνξθψλ νμπγφλνπ (reactive oxyges species, ROS) ζηελ αλδξηθή αλαπαξαγσγηθή νδφ. Απηφ γίλεηαη γηαηί νη ROS, ζε πςειά επίπεδα, είλαη ηνμηθέο γηα ηελ πνηφηεηα θαη ηε ιεηηνπξγηθφηεηα ηνπ ζπέξκαηνο. Οη ROS είλαη πνιχ αληηδξαζηηθνί νμεηδσηηθνί παξάγνληεο, κεηαμχ ησλ νπνίσλ πεξηιακβάλνληαη ην ππεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ θαη άιιεο ειεχζεξεο ξίδεο. Οη ηειεπηαίεο νξίδνληαη σο «θάζε άηνκν ή κφξην ην νπνίν πεξηέρεη έλα ή πεξηζζφηεξα ειεχζεξα ειεθηξφληα». Έρεη αλαθεξζεί παξνπζία πςειψλ επηπέδσλ ROS ζην ζπέξκα ππνγφληκσλ αλδξψλ ζε πνζνζηφ 25 κε 40%. Γχν παξάγνληεο πξνζηαηεχνπλ ην DNA ηνπ ζπέξκαηνο απφ ηελ νμείδσζε: ε ραξαθηεξηζηηθή ζπκπχθλσζε ηνπ DNA θαη νη αληηνμεηδσηηθνί παξάγνληεο πνπ βξίζθνληαη ζην ζπεξκαηηθφ πγξφ. Ηζρπξέο απνδείμεηο πξνηείλνπλ φηη πςειά επίπεδα ησλ ROS κεζνιαβνχλ ηεο εκθάληζεο πςειψλ ζπρλνηήησλ εγθνπψλ ζηε κία ή θαη ζηηο δχν έιηθεο ηνπ DNA, γεγνλφο ην νπνίν παξαηεξείηαη ζηα ζπεξκαηνδσάξηα ππνγφληκσλ αλδξψλ. Έρεη αλαθεξζεί επίζεο, κηα ζεκαληηθή ζρέζε κεηαμχ ησλ ROS θαη ηνπ θεξκαηηζκνχ ηνπ DNA. Απφ έξεπλεο έρεη δηαπηζησζεί φηη ζε φινπο ηνπο άλδξεο παξαηεξνχληαη ζπεξκαηνδσάξηα κε θεξκαηηζκέλν DNA. Απηφ ζπκβαίλεη θπζηνινγηθά γηα ηελ θαιχηεξε ζπκπχθλσζε ηεο ρξσκαηίλεο. Μεηά ηε γνληκνπνίεζε, ην σνθχηηαξν δηαζέηεη ηνπο θαηάιιεινπο κεραληζκνχο ψζηε λα επηδηνξζψζεη ηηο εγθνπέο. Χζηφζν, ππάξρεη έλα θαηψθιη ζην πνζνζηφ ηνπ θεξκαηηζκέλνπ DNA πέξα απφ ην νπνίν δε κπνξεί λα ππάξμεη επηηπρήο γνληκνπνίεζε θαη απφ κειέηεο έρεη βξεζεί φηη είλαη πεξίπνπ ην 30%. Δπηπιένλ, ζεκαληηθφ ξφιν ζηε γνληκνπνίεζε παίδεη θαη ε ειηθία ηεο γπλαίθαο. Σν σνθχηηαξν κηαο λεαξήο γπλαίθαο κπνξεί λα επηδηνξζψζεη κε κεγαιχηεξε επηηπρία ηπρφλ βιάβεο ζην ζπεξκαηηθφ DNA, ελψ αλ ε γπλαίθα είλαη κεγαιχηεξε ησλ 30 εηψλ, νη πηζαλφηεηεο κεηψλνληαη. Απηφ ζεκαίλεη φηη ν δπγψηεο πιένλ δε κπνξεί λα επηβηψζεη θαη απνβάιιεηαη. 2.9 Δθηίκεζε ηεο βιάβεο ζην DNA ηνπ ππξήλα ηνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ Λφγσ ηεο δσηηθήο ζεκαζίαο ηεο αθξηβνχο κεηάδνζεο ηεο γελεηηθήο πιεξνθνξίαο ζηελ επφκελε γεληά, έρνπλ αλαπηπρζεί δηάθνξεο ηερληθέο γηα ηελ [33]

34 εθηίκεζε ηεο αθεξαηφηεηαο ηεο ρξσκαηίλεο ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ. Απηέο νη ηερληθέο έρνπλ ήδε ρξεζηκνπνηεζεί ζε κηα πξνζπάζεηα λα θαζηεξψζνπλ κηα ζεκαληηθή ζρέζε κε ηελ αλδξηθή ππνγνληκφηεηα. Οη ηερληθέο γηα ηελ αλίρλεπζε θεξκαηηζκέλνπ ζπεξκαηηθνχ DNA δηαθξίλνληαη ζε άκεζεο θαη έκκεζεο θαη είλαη νη εμήο: Άκεζεο: 1. The deoxynucleotidyl transferase-mediated dutp nick end labeling (TUNEL) assay. Ζ TUNEL, πνζνηηθνπνηεί ηελ ελζσκάησζε ηεο ηξηθσζθνξηθήο δενμπνπξηδίλεο (dutp) ζε εγθνπέο κνλήο ή δηπιήο έιηθαο ηνπ DNA ζε κηα αληίδξαζε πνπ θαηαιχεηαη απφ ηελ ηειηθή δενμπλνπθιενηίδπιν ηξαλζθεξάζε (TdT). Ζ ελζσκαησκέλε dutp ζεκαδεχεηαη έηζη ψζηε νη εγθνπέο λα κπνξνχλ λα πνζνηηθνπνηεζνχλ κε ηε βνήζεηα ηεο θπηηαξνκεηξίαο ξνήο, ηεο θζνξίδνπζαο κηθξνζθνπίαο ή ηεο θσηνληθήο κηθξνζθνπίαο. 2. The single-cell gel electrophoresis assay (Comet assay). Ζ κέζνδνο comet κεηξά ηε βιάβε ζην DNA πνζνηηθνπνηψληαο ηηο εγθνπέο ζηε κνλή θαη ηε δηπιή έιηθα, νη νπνία ζρεηίδνληαη κε ηε βιάβε ζην DNA. ε απηή ηελ ηερληθή ηα ζπεξκαηνδσάξηα ρξσκαηίδνληαη κε κία βαθή, ε νπνία είλαη θζνξίδνπζα θαη ζπλδέεηαη κε ην DNA. Οη εηθφλεο, νη νπνίεο κνηάδνπλ κε θνκήηεο, ππνινγίδνληαη κεηά ηε ρξψζε, γηα λα θαζνξηζηεί ε έθηαζε ηεο βιάβεο ηνπ DNA. Σα ραξαθηεξηζηηθά πνπ ππνινγίδνληαη είλαη ε δηάκεηξνο ηνπ ππξήλα θαη ην κήθνο ηνπ θνκήηε. Μία απφ ηηο αξρέο ηεο κεζφδνπ είλαη φηη ην δηπιήο-έιηθαο DNA παξακέλεη ζηελ θεθαιή ηνπ θνκήηε, ελψ ηα κηθξά θνκκάηηα κνλήο ή θαη δηπιήο έιηθαο θεξκαηηζκέλνπ DNA πξνρσξνχλ ζηελ νπξά. πλεπψο, ζπεξκαηνδσάξηα κε πνιιέο εγθνπέο ζην DNA ζα έρνπλ νπξά κε κεγάιε έληαζε θζνξηζκνχ θαη κεγάιε νπξά θνκήηε. Χζηφζν, δελ έρεη επηηεπρζεί αθφκε ε ηππνπνίεζε θνηλά απνδεθηψλ ηηκψλ αλαθνξάο γηα ηε κέζνδν comet. 3. In situ nick translation assay with or without sperm decondensation. Ζ κέζνδνο απηή πνζνηηθνπνηεί ηελ ελζσκάησζε ηεο ηξηθσζθνξηθήο δενμπνπξηδίλεο (dutp) ζε εγθνπέο κνλήο έιηθαο DNA [34]

35 ζε κηα αληίδξαζε, ε νπνία θαηαιχεηαη κέζσ ελφο ελδχκνπ, ηεο DNA πνιπκεξάζεο I. Απηή ε κέζνδνο αλαγλσξίδεη ζπεξκαηνδσάξηα, ηα νπνία έρνπλ εθηηκήζηκα θαη κεηαβιεηά επίπεδα ελδνγελνχο βιάβεο ζην DNA. Ζ θιηληθή αμία ηεο κεζφδνπ είλαη κάιινλ πεξηνξηζκέλε γηαηί δελ έρεη απνδεηρζεί θακία ζπζρέηηζε κε ηελ πηζαλφηεηα γνληκνπνηήζεο θαηά ηε δηάξθεηα in-vivo κειεηψλ θαη ιφγσ ηεο έιιεηςεο επαηζζεζίαο ηεο ζε ζχγθξηζε κε άιιεο κεζφδνπο. Έκκεζεο: 1. Acridine Orange Technique (AOT). Ζ κέζνδνο απηή πξνηάζεθε σο κηα απινπνηεκέλε κέζνδνο κηθξνζθνπίνπ ηεο SCSA γηαηί δελ επηβάιιεη ηε ρξήζε ηνπ αθξηβνχ εμνπιηζκνχ ηεο θπηηαξνκεηξίαο ξνήο θαη ηνπ ηερληθνχ πνπ είλαη εηδηθεπκέλνο ζ απηή. Βαζίδεηαη ζηελ νπηηθή εξκελεία ησλ θζνξηδφλησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ ζε έλα κεγάιν εχξνο ρξσκάησλ ππφ ηε κηθξνζθνπηθή εμέηαζε. Σα ζπγθερπκέλα ρξψκαηα, ν θζνξηζκφο πνπ γξήγνξα εμαζζελεί θαη νη εηεξνγελείο θειίδεο ζπληζηνχλ κείδνλα πξνβιήκαηα εξκελείαο. Σέηνηεο δπζθνιίεο απνθιείνπλ ηε ρξήζε ηεο AOT ζε θιηληθέο δηαγλψζεηο θαη πξνγλψζεηο γνληκφηεηαο βαζηζκέλεο ζε δείγκαηα ζπέξκαηνο, θαζψο ε πξνγλσζηηθή αμία ηνπ ζρεηηθνχ ηεζη αλζξψπηλεο γνληκφηεηαο παξακέλεη ακθηιεγφκελε. 2. Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). Ζ SCSA είλαη κία κέζνδνο θπηηαξνκεηξίαο ξνήο, ε νπνία βαζίδεηαη ζην γεγνλφο φηη ε κε-θπζηνινγηθή ρξσκαηίλε ζπέξκαηνο είλαη επηξξεπήο ζηελ επαγσγή επηηφπηαο κεξηθήο αιινίσζεο ηνπ DNA. Ζ έθηαζε ηεο αιινίσζεο ηνπ DNA πνπ αθνινπζεί ηελ έθζεζε ζε ζεξκφηεηα ή φμηλν πεξηβάιινλ, θαζνξίδεηαη απφ ηελ πνζνηηθνπνίεζε ηεο κεηαρξσκαηηθήο αιιαγήο απφ θζνξίδνλ πξάζηλν (δηπιήο έιηθαο λνπθιετθφ νμχ) ζε θζνξίδνλ θφθθηλν (κνλήο έιηθαο). Ζ πην ζεκαληηθή παξάκεηξνο ηεο SCSA είλαη ν δείθηεο θεξκαηηζκνχ ηνπ DNA (%DFI), ν νπνίνο ηζνχηαη κε ην ιφγν [θφθθηλν / (θφθθηλν + πξάζηλν)] θαη αλαπαξηζηά ηνλ πιεζπζκφ ησλ θπηηάξσλ κε βιάβε ζην DNA. Έλα πνζνζηφ >56% θφθθηλνπ θζνξηζκνχ ζεσξείηαη σο ην θαηψθιη γηα λα ραξαθηεξηζηεί ε θαηάζηαζε ηεο ρξσκαηίλεο σο κε-θπζηνινγηθή. [35]

36 ην Δξγαζηήξην Ηζηνινγίαο θαη Δκβξπνινγίαο ηεο Ηαηξηθήο ζρνιήο Αζελψλ, φπνπ θαη έγηλαλ ηα πεηξάκαηα ζηα ζπεξκαηνδσάξηα, ρξεζηκνπνηήζεθε ε ηερληθή TUNEL, θαζψο παξνπζηάδεη κεγάιε επαηζζεζία, είλαη ζχληνκεο ρξνληθήο δηάξθεηαο, δελ απαηηεί εηδηθά θαη κεγάια κεραλήκαηα φπσο ε SCSA θαη θπξίσο είλαη θζελή θαη εθαξκφδεηαη εχθνια κε θαιά απνηειέζκαηα. Σα βήκαηα πνπ αθνινπζνχληαη ζηελ TUNEL πεξηγξάθνληαη ζηνλ πίλαθα παξαθάησ. 1. Μνληκνπνίεζε ησλ ηζηψλ ζε δηάιπκα θνξκφιεο θαη ζθήλσζε ζε παξαθίλε. Οη ηνκέο ηνπνζεηνχληαη ζε αληηθεηκελνθφξεο πιάθεο. 2. Απνπαξαθίλσζε θαη ελπδάησζε ησλ ηνκψλ. 3. Απνθάιπςε ηνπ DNA. 4. Αδξαλνπνίεζε ηεο ελδνγελνχο ππεξνμεηδάζεο. 5. χλδεζε ηνπ ελδχκνπ ηειηθή δεζνμπλνπθιενηίδπιν ηξαλζθεξάζε ζηα ηειηθά κνλφθισλα 3 -OH άθξα ηνπ DNA θαη πξνζζήθε ζεκαδεκέλεο κε Texas red dutp. 6. Λήμε ηεο αληίδξαζεο κε έθπιπζε ζε ξπζκηζηηθφ δηάιπκα. 7. Υξψζε κε DAPI, ην νπνίν βάθεη ηνπο θπζηνινγηθνχο ππξήλεο κε κπιε. 8. Υξήζε ζεηηθψλ θαη αξλεηηθψλ καξηχξσλ γηα ηελ επηβεβαίσζε ηεο ζσζηήο ιεηηνπξγίαο ηεο κεζφδνπ. Πην ζπγθεθξηκέλα, ζην πέκπην βήκα, πξνζηίζεληαη ε βηνηίλε dutp θαη ην έλδπκν ηειηθή ηξαλζθεξάζε, ην νπνίν είλαη απηφ πνπ ζα κεηαθέξεη θαη ζα ελψζεη ηε βηνηίλε κε ηα ειεχζεξα άθξα ηνπ DNA. ηε ζπλέρεηα, ε βηνηίλε βάθεηαη κε ην ρξψκα Texas Red, ην νπνίν είλαη έλα θφθθηλν, θζνξίδνλ ρξψκα, εχθνια αλαγλσξίζηκν ζην κηθξνζθφπην θζνξηζκνχ. Καη απηφλ ηνλ ηξφπν κπνξνχκε λα αλαγλσξίζνπκε ηηο πεξηνρέο φπνπ είλαη θεξκαηηζκέλν ην DNA. ηε ζπλέρεηα ηεο αληίδξαζεο, νη θπζηνινγηθνί ππξήλεο βάθνληαη κπιε κε ην DAPI ψζηε λα είλαη θαηαλνεηφ ην ζρήκα ηνπ ππξήλα θαη λα κπνξεί λα γίλεη ε ζχγθξηζε ησλ θφθθηλσλ θαη κπιε πεξηνρψλ γηα [36]

37 λα βξεζεί ε έθηαζε ηνπ θεξκαηηζκνχ. ηελ εηθφλα 8 πεξηγξάθεηαη ζρεκαηηθά ε δηαδηθαζία ηεο TUNEL, φπνπ ζηελ εγθνπή πνπ θαίλεηαη επάλσ ζην DNA, κε ηε βνήζεηα ηεο ηειηθήο ηξαλζθεξάζεο πξνζθνιιάηαη ε βηνηίλε. Δηθόλα 8 - TUNEL ην ηέινο ηεο φιεο δηαδηθαζίαο, γηα ηελ επαιήζεπζή ηεο, ρξεζηκνπνηνχληαη ζεηηθνί θαη αξλεηηθνί κάξηπξεο. Πην ζπγθεθξηκέλα, ν ζεηηθφο κάξηπξαο είλαη ην έλδπκν DNase, ην νπνίν δεκηνπξγεί εγθνπέο ζε φιν ην κήθνο ηνπ DNA. Όηαλ ινηπφλ κεηά πξνζηίζεηαη ην θφθθηλν ρξψκα, ηφηε απηφ πξνζθνιιάηαη ζε φιν ην DNA θαη φινο ν ππξήλαο βάθεηαη θφθθηλνο. Αληίζεηα ν αξλεηηθφο κάξηπξαο είλαη είηε ε παξάιεηςε ηεο βηνηίλεο είηε ηεο ηειηθήο ηξαλζθεξάζεο. Καη ζηηο δχν πεξηπηψζεηο, ε βηνηίλε δελ [37]

38 έρεη πξνζθνιιεζεί ζηα ειεχζεξα άθξα ηνπ DNA, νπφηε φινο ν ππξήλαο βάθεηαη κπιε. Αλάινγα κε ην βαζκφ ηνπ θεξκαηηζκνχ ηνπ DNA θάζε ζπεξκαηνδσαξίνπ, κπνξεί απηφ λα απεηθνλίδεηαη κε πεξηζζφηεξν ή ιηγφηεξν θφθθηλν, ή κπνξεί θαη θαζφινπ, αλ απηφ είλαη θπζηνινγηθφ. Σέζζεξηο ραξαθηεξηζηηθέο πεξηπηψζεηο είλαη απηέο πνπ παξνπζηάδνληαη παξαθάησ θαη δείρλνπλ ε Α εηθφλα έλα ζπεξκαηνδσάξην κε 100% ζρεδφλ θεξκαηηζκέλν DNA, ε εηθφλα Β έλα ζπεξκαηνδσάξην κε πεξίπνπ 50% θεξκαηηζκέλν DNA, ε C κε πεξίπνπ 25% ελψ ε D έλα θπζηνινγηθφ. Έρνληαο εηθφλεο κε πνιιά ζπεξκαηνδσάξηα ε θαζεκία, ηα νπνία είλαη φπσο απηά πνπ θαίλνληαη παξαπάλσ, ρξεηάδεηαη έλαο αιγφξηζκνο πνπ κπνξεί λα εληνπίζεη θαη λα δηαρσξίζεη ηα ζπεξκαηνδσάξηα θαη ζηε ζπλέρεηα λα ππνινγίδεη ηελ έθηαζε ηνπ θφθθηλνπ ρξψκαηνο ζε ζρέζε κε ην κπιε γηα θαζέλα απφ απηά. [38]

39 2.10 πκπεξάζκαηα Οινθιεξψζεθε ε αλαθνξά ζε βηνινγηθά δεδνκέλα. Μέρξη ζηηγκήο, έρεη γίλεη ζαθέο πνηα είλαη ε θπζηνινγηθή δνκή ελφο ζπεξκαηνδσαξίνπ, ψζηε λα είλαη αληηιεπηή ε χπαξμή ηνπ ζε κηα εηθφλα, γηαηί κπνξεί λα ππάξμεη θεξκαηηζκέλν DNA ζηνλ ππξήλα ηνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ θαη πψο απηφ αληρλεχεηαη. ηα επφκελα θεθάιαηα αλαθεξφκαζηε ζηνλ ηξφπν ιήςεο ησλ εηθφλσλ πνπ πξνθχπηνπλ απφ ηελ TUNEL, ηελ επεμεξγαζία ηνπο ψζηε λα απνκνλσζνχλ ηα κνλήξε ζπεξκαηνδσάξηα ζηελ εηθφλα θαη ζηε ζπλέρεηα ηξφπνη ζπζηαδνπνίεζεο θαη απηφκαηεο αλάιπζεο απφ αιγφξηζκνπο επηβιεπφκελεο θαη εκη-επηβιεπφκελεο κάζεζεο ψζηε λα δηεξεπλεζνχλ κνληέια πνπ ζα κπνξνχλ λα ππνινγίζνπλ έλα φξην ή κία πεξηνρή ηηκψλ άλσ ηεο νπνίαο έλαο άλδξαο ζα ζεσξείηαη ππνγφληκνο. [39]

40 Πίνακας περιεχομένων Κεθάιαην 3 Σν ινγηζκηθφ & ε δηαδηθαζία ιήςεο ησλ εηθφλσλ Δηζαγσγή Πεξηγξαθή ιήςεο εηθφλσλ Ζ AxioCam MRm & ην Axiovision πκπεξάζκαηα [40]

41 Κεθάιαην 3 Σν ινγηζκηθό & ε δηαδηθαζία ιήςεο ησλ εηθόλσλ 3.1 Δηζαγσγή Αλαπηχρζεθε ζην πξνεγνχκελν θεθάιαην ην ζεσξεηηθφ ππφβαζξν ζηα βηνινγηθά δεδνκέλα, πψο παξαζθεπάδνληαη ηα πιαθίδηα κε ηε κέζνδν ηεο TUNEL θαη ε ηδέα ζηελ νπνία βαζίδεηαη ε νξζφηεηα ησλ εμαγσγψλ ησλ πεηξακάησλ, φηη δειαδή ην πφζν παζνινγηθφ είλαη έλα ζπεξκαηνδσάξην εμαξηάηαη απφ ην βαζκφ θεξκαηηζκνχ ηνπ DNA ζηνλ ππξήλα ηνπο. Ο βαζκφο απηφο κε ηε ζεηξά ηνπ πνζνηηθνπνηείηαη απφ ηελ έθηαζε ηνπ θφθθηλνπ ρξψκαηνο ζε ζρέζε κε ην κπιε γηα θαζέλα απφ απηά. ηε ζπλέρεηα ηνπ παξφληνο θεθαιαίνπ ζα πεξηγξαθεί ε δηαδηθαζία ιήςεσλ ησλ εηθφλσλ κε ην πξφγξακκα πνπ παξέρεηαη απφ ηελ λέα θάκεξα θαζψο θαη φιεο ηηο παξερφκελεο ιεηηνπξγίεο κε θάπνηεο αλαθνξέο ζε θάπνηεο πεξαηηέξσ δπλαηφηεηεο, νη νπνίεο φκσο απαηηνχλ ηελ αγνξά νξηζκέλσλ επεθηάζεσλ ηνπ πξνγξάκκαηνο. Οη ιεηηνπξγίεο απηέο είλαη πνιχ ρξήζηκεο, αιιά φπσο πεξηγξάθεηαη ζηε ζπλέρεηα, κπνξνχλ λα παξαιεθζνχλ θαη έρνπλ εξεπλεζεί λέεο εμεηδηθεπκέλεο ζην ζπγθεθξηκέλν πξφβιεκα ηερληθέο. 3.2 Πεξηγξαθή ιήςεο εηθόλσλ Έρνληαο νινθιεξψζεη ηε δηαδηθαζία ηεο TUNEL, ην επφκελν βήκα είλαη ε ιήςε ησλ εηθφλσλ. Σν κηθξνζθφπην είλαη ζπλδεδεκέλν κε έλαλ ππνινγηζηή κε ιεηηνπξγηθφ Macintosh, ζηνλ νπνίν είλαη εγθαηεζηεκέλν ην πξφγξακκα ξχζκηζεο ησλ θίιηξσλ ηνπ κηθξνζθνπίνπ. Σα θίιηξα απηά έλα θφθθηλν θίιηξν, έλα κπιε θίιηξν θαη έλα δηπιφ δσλνπεξαηφ θίιηξν, orange θαη dapi κπιε. Όηαλ είλαη επηιεγκέλν θάπνην θίιηξν, επηηξέπεηαη ε δηέιεπζε κφλν απηνχ ηνπ ρξψκαηνο. Αλ είλαη επηιεγκέλν κφλν ην θφθθηλν, ηφηε εκθαλίδνληαη κφλν νη πεξηνρέο πνπ έρνπλ βαθηεί κε θφθθηλν. Απηφο είλαη έλαο εχθνινο θαη εκπεηξηθφο ηξφπνο φηαλ ν παξαηεξεηήο ηνπ κηθξνζθνπίνπ έρεη ακθηβνιία γηα ην αλ έλα ζπεξκαηνδσάξην έρεη θφθθηλν ρξψκα λα επηβεβαηψζεη ηελ χπαξμε ηνπ θφθθηλνπ ρξεζηκνπνηψληαο ην θφθθηλν θίιηξν. Γεδνκέλνπ φηη μέξεη ηε [41]

42 ζέζε ηνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ, αλ δεη θφθθηλν, ηφηε ε ππνςία ηνπ επηβεβαηψλεηαη. ηε ζέζε ηνπ δηπινχ θίιηξνπ επηηξέπεηαη ε δηέιεπζε ηφζν ηνπ θφθθηλνπ φζν θαη ηνπ κπιε ρξψκαηνο, νπφηε θαη έρνπκε ηηο εηθφλεο ζαλ θαη απηέο πνπ παξνπζηάζηεθαλ. Σν ινγηζκηθφ ηεο θάκεξαο είλαη εγθαηεζηεκέλν ζε έλα δεχηεξν ππνινγηζηή κε windows θαη ην πξφγξακκα είλαη ην AxioVision. Δθθηλψληαο ην πξφγξακκα εκθαλίδεηαη κία θελή πεξηνρή, φπσο απηή πνπ απεηθνλίδεηαη ζηελ εηθφλα 9. Δπηιέγνπκε ην workarea, θαζψο εθεί βξίζθνληαη ζρεδφλ φιεο νη επηηξεπφκελεο απφ ην αγνξαζκέλν ινγηζκηθφ ιεηηνπξγίεο. Δηθόλα 9 - Σν αξρηθό πεξηβάιινλ εξγαζίαο ηνπ AxioVision Απφ ην αξηζηεξφ κελνχ επηιέγνπκε ην multidimensional acquisition θαη εκθαλίδεηαη έλα κελνχ πνπ αθνξά ηηο αξρηθέο ξπζκίζεηο ηνπ πεηξάκαηνο. Με ην multidimensional acquisition κπνξνχκε λα ιάβνπκε εηθφλεο απνηεινχκελεο απφ δηάθνξα θαλάιηα ή κε δηαθνξεηηθέο ρξνληθέο θαζπζηεξήζεηο. ηε ζπγθεθξηκέλε πεξίπησζε ζέινπκε εηθφλεο [42]

43 απνηεινχκελεο απφ δχν θαλάιηα, ην έλα κε ην dapi κπιε ρξψκα θαη ην άιιν κε ην texas θφθθηλν. Αλάινγα κε ηα δηθαηψκαηα ηνπ ινγηζκηθνχ πνπ είλαη αγνξαζκέλα δίλνληαη θαη θάπνηεο δπλαηφηεηεο ηεο θάκεξαο. Δδψ, έρνπκε δηθαηψκαηα κφλν γηα ην multichannel fluorescence module, επεηδή ρξεηαδφκαζηε κφλν ηνλ αξηζκφ ησλ θαλαιηψλ, ελψ ηα ππφινηπα πνπ θαίλνληαη αρλά ζηε ιίζηα θάησ απφ ηα options ηνπ experiment είλαη θιεηδσκέλα. Δηθόλα 10 - Δπηινγή ηνπ Multidimensional Acquisition ηελ αξηζηεξή ζηήιε ηνπ κελνχ, θάησ απφ ην experiment, ππάξρεη ε δπλαηφηεηα λα ρξεζηκνπνηεζεί έλα απνζεθεπκέλν πείξακα κε ηηο ξπζκίζεηο ηνπ επηιέγνληαο ην reuse. Καηά ηελ πξψηε ρξήζε ηνπ πξνγξάκκαηνο έγηλαλ νη ξπζκίζεηο γηα ηε κέζνδν TUNEL θαη νη ξπζκίζεηο απηέο απνζεθεχζεθαλ, θαζψο είλαη θνηλέο γηα φια ηηο εηθφλεο. Όπσο ζα πεξηγξαθεί ζηε ζπλέρεηα, νη ξπζκίζεηο απηέο αθνξνχλ ηα θαλάιηα πνπ ζα ρξεζηκνπνηεζνχλ θαη ηα ζπγθεθξηκέλα ρξψκαηα γηα θάζε θαλάιη texas red θαη dapi blue. Αληίζεηα, ξπζκίζεηο φπσο ν ρξφλνο έθζεζεο παίξλεη κία ελδεηθηηθή [43]

44 ηηκή, αιιά κπνξεί πνιχ εχθνια λα αιιάμεη, αλάινγα κε ηηο αλάγθεο γηα θάζε πιαθίδην. Δηθόλα 11 - Δπαλάθηεζε ξπζκίζεσλ πεηξάκαηνο ηε ζπλέρεηα εκθαλίδεηαη έλα παξάζπξν φπνπ επηιέγνπκε ην πείξακα κε φλνκα TUNEL. Αλ ζέινπκε, κπνξνχκε λα ζρεδηάζνπκε έλα λέν πείξακα θαη λα απνζεθεχζνπκε ηηο δηθέο ηνπ ξπζκίζεηο κε ηε δηθή ηνπ νλνκαζία. Απηφ ην νπνίν κπνξεί λα αιιάμεη είλαη ν αξηζκφο ησλ θαλαιηψλ κε κέγηζην αξηζκφ ηα 8, θαζψο θαη ηα ρξψκαηα γηα θάζε θαλάιη. [44]

45 Δηθόλα 12 - Δπαλάθηεζε ξπζκίζεσλ πεηξάκαηνο (2) Παξαηεξνχκε φηη ζην επηιεγκέλν πείξακα ππάξρνπλ απνζεθεπκέλεο νη ξπζκίζεηο γηα δχν ρξψκαηα. Σν πξψην ρξψκα είλαη ην dapi blue θαη ην δεχηεξν ην texas red. Καηά ηηο αξρηθέο ξπζκίζεηο ηνπ πεηξάκαηνο, δίπια ζην experiment ππάξρεη κία θαξηέια C. Δθεί, απφ ην πεδίν dye επηιέγνπκε ην ρξψκα πνπ επηζπκνχκε (εκείο επηιέγνπκε ην dapi blue, ελψ ζην παξάδεηγκα ζηελ εηθφλα θαίλεηαη ε ρξήζε ηνπ rhodamine). Δηθόλα 13 - Δπηινγή ρξσζηηθώλ & ξπζκίζεηο θίιηξσλ [45]

46 Γηα λα πξνζζέζνπκε θαη ην texas red επηιέγνπκε ην duplicate, φπνπ εκθαλίδεηαη κία ίδηα θαξηέια κε πξηλ, αιιά εδψ επηιέγνπκε σο dye ην ρξψκα texas red. Γηα θαζέλα απφ ηα ρξψκαηα κπνξνχκε λα θαζνξίζνπκε ην exposure time (φπσο ζα δνχκε αξγφηεξα). Οη hardware ξπζκίζεηο ησλ θίιηξσλ ηνπ κηθξνζθνπίνπ δελ ήηαλ δπλαηφ λα γίλνπλ απφ ην axiovision θαη γη απηφ παξέκεηλε ην ινγηζκηθφ απφ ηα macintosh. χκθσλα κε ηηο πξνδηαγξαθέο ζηα hardware settings ζα έπξεπε λα ξπζκίδεηαη ην θάζε θαλάιη, έηζη ζα άλνηγε ην θιείζηξν θαη ζα ηνπνζεηνχζε ηνλ αλαθιαζηήξα ζηε ζσζηή ζέζε ηνπ θίιηξνπ. Δηθόλα 14 - Δηζαγσγή δεύηεξνπ θαλαιηνύ ην exposure time επηιέγεηαη ν ρξφλνο πνπ είλαη αλνηθηφ θιείζηξν θαη ιακβάλεηαη ε θσηνγξαθία. Δίλαη ξπζκηζκέλν εκπεηξηθά, κε ην κάηη, αλάινγα κε ην πσο θαίλνληαη θαιχηεξα ηα ζπεξκαηνδσάξηα. Απηφ γίλεηαη ιφγσ ηνπ φηη θάπνηα πιαθίδηα κπνξεί λα είλαη έηνηκα αξθεηφ ρξνληθφ δηάζηεκα θαη ην ρξψκα λα έρεη εμαζζελήζεη, νπφηε επηιέγεηαη κεγαιχηεξνο ρξφλνο έθζεζεο. Ζ δηαδηθαζία θαίλεηαη ζηελ παξαθάησ εηθφλα. Δπηιέγνληαο ην θνπκπί measure εκθαλίδεηαη ην παξάζπξν δηαιφγνπ, ζην [46]

47 νπνίν κπνξνχκε λα θάλνπκε ηηο απαξαίηεηεο ξπζκίζεηο. Οη ξπζκίζεηο απνζεθεχνληαη θαη κπνξνχλ λα ρξεζηκνπνηεζνχλ απφ ην θαλάιη (κπνξνχλ λα είλαη δηαθνξεηηθέο γηα θάζε θαλάιη). Δηθόλα 15 - Ρύζκηζε ηνπ ρξόλνπ έθζεζεο Γηα λα ιάβνπκε ηελ επηζπκεηή εηθφλα, ζηελ νπζία ιακβάλνπκε κία απφ θάζε ρξψκα. Πξψηα γηα ην dapi blue ξπζκίδνπκε hardware ην θίιηξν απφ ην πξφγξακκα ζην macintosh θαη κε ην snap ιακβάλνπκε ηελ πξψηε εηθφλα θαη ζηε ζπλέρεηα γηα ην texas red αιιάδνπκε ην θίιηξν ζην macintosh θαη πάιη κε ην snap ιακβάλεηαη ε δεχηεξε. Ζ ηειηθή εηθφλα είλαη ζχλζεζε ησλ δχν απηψλ ιήςεσλ. [47]

48 Δηθόλα 16 - Λήςε εηθόλαο από ην πξώην θαλάιη [48]

49 Δηθόλα 17 - Λήςε εηθόλαο από ην δεύηεξν θαλάιη Ζ ηειηθή εηθφλα πνπ πξνθχπηεη είλαη φπσο ε εηθφλα 18, απνηεινχκελε απφ ηα κπιε ζπεξκαηνδσάξηα θαη θάπνηεο θφθθηλεο πεξηνρέο. [49]

50 Δηθόλα 18 - Σειηθή εηθόλα Δπεηδή ηα πιαθίδηα πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ ήηαλ αξθεηφ θαηξφ ζηε ζπληήξεζε, παξαηεξνχκε φηη ην ζήκα είλαη αξθεηά αζζελέο θαη ηα ζπεξκαηνδσάξηα θαίλνληαη πνιχ αρλά. Σέινο, απνζεθεχνπκε ηελ εηθφλα. [50]

51 Δηθόλα 19 - Απνζήθεπζε εηθόλαο ηηο πξνεγνχκελεο ελφηεηεο αλαθεξζήθακε ζηε δηαδηθαζία παξαγσγήο ηεο εηθφλαο. Χζηφζν ε θάκεξα πνπ ρξεζηκνπνηείηαη θαη ην ινγηζκηθφ ηεο παξέρνπλ θάπνηεο επηπιένλ ιεηηνπξγίεο. Απηέο είλαη βαζηθέο θαζψο ηα εμεηδηθεπκέλα εξγαιεία είλαη ρσξηζκέλα ζε modules απφ ηελ εηαηξεία θαη θαζέλα μεθιεηδψλεη κε εηδηθφ θιεηδί, εθφζνλ βέβαηα αγνξαζηεί. 3.3 Η AxioCam MRm & ην Axiovision [51]

52 Ζ θάκεξα, ε νπνία ρξεζηκνπνηείηαη, είλαη ε AxioCam MRm. Κχξηα ραξαθηεξηζηηθά ηεο είλαη ην δπλακηθφ ηεο εχξνο, ην νπνίν είλαη κεγαιχηεξν απφ 1:2200, θάλνληαο νξαηέο αθφκα θαη ηηο πην ιεπηέο δηαθνξέο ζηε θσηεηλφηεηα θαη επνκέλσο θάλεη πην αμηφπηζηεο ηηο εξκελείεο θαη ν 2/3 κεγέζνπο CCD αηζζεηήξαο, ν νπνίνο δελ είλαη εθνδηαζκέλνο κε κάζθα έγρξσκνπ θίιηξνπ θαη κπνξεί λα ηξαβήμεη θζνξίδνπζεο εηθφλεο πνπ είλαη αθφκα θαη αφξαηεο κε ην αλζξψπηλν κάηη. Δπηπιένλ, ν αηζζεηήξαο ςχρεηαη κε ζχζηεκα Peltier θαη επηηπγράλεη ηε ιήςε εηθφλσλ ρακεινχ ζνξχβνπ αθφκα θαη ζε κεγάινπο ρξφλνπο έθζεζεο. Δπίζεο, παξέρεηαη ε δπλαηφηεηα έθζεζεο απφ 1ms έσο 60s, ε νπνία ζε ζπλδπαζκφ κε ηνλ πνιχ ρακειφ ζφξπβν πνπ παξάγεηαη απφ ηα ειεθηξνληθά κέξε ηεο θάκεξαο επηηξέπνπλ ηε ιήςε εμαηξεηηθά αζζελψλ ζεκάησλ θζνξηζκνχ. Σέινο, ππάξρεη ε δπλαηφηεηα λα πξνζηεζνχλ RGB θίιηξα γηα ηε ιήςε έγρξσκεο εηθφλαο ζε κηθξνζθφπην θζνξηζκνχ. Σν Axiovision είλαη έλα πιήξεο ινγηζκηθφ, ην νπνίν αληαπνθξίλεηαη άςνγα ζηελ επίδνζε ηεο AxioCam, γεγνλφο πνπ ζεκαίλεη φηη επηηπγράλεηαη ε εχθνιε θαη γξήγνξε ιήςε αθφκα θαη ησλ απαηηεηηθψλ πνιπθάλαισλ εηθφλσλ θζνξηζκνχ. Οη ιεηηνπξγίεο πνπ παξέρεη ην Axiovision είλαη ρσξηζκέλεο ζε modules, επνκέλσο ν αγνξαζηήο κπνξεί λα επηιέμεη θάπνην ή θάπνηα απφ απηά κε βάζε ηηο δηθέο ηνπ αλάγθεο. Μία ζχληνκε πεξηγξαθή απηψλ θαίλεηαη ζηηο παξαθάησ εηθφλεο. [52]

53 Δηθόλα 20 - πγθεληξσηηθόο πίλαθαο ιεηηνπξγηώλ ηνπ AxioVision Όπσο κπνξεί λα παξαηεξήζεη θαλείο απφ ηελ εηθφλα 20, ηα modules κπνξνχλ λα ηαμηλνκεζνχλ θαη ζε επξχηεξεο θαηεγνξίεο, δειαδή ζηε ιήςε εηθφλαο, ζηελ επεμεξγαζία εηθφλαο θαη ζηελ αλάιπζε εηθφλαο. Γηα παξάδεηγκα ζηε ιήςε εηθφλαο αλήθεη ην autofocus, ην νπνίν επηηξέπεη ηνλ ππνινγηζκφ ηεο βέιηηζηεο εζηίαζεο κε κεραλνθίλεηα (motorized) κηθξνζθφπηα. Έλα επηπιένλ module είλαη ην MosaiX. Δπηηξέπεη ηε ζάξσζε φιεο ηεο πεξηνρήο ηνπ δείγκαηνο κε απνηέιεζκα ηελ παξαγσγή [53]

54 κίαο κεγάιεο εηθφλαο. Έλα επίζεο ρξήζηκν εξγαιείν είλαη ην Z-Stack. Δπηηξέπεη ηε ιήςε ζεηξάο εηθφλσλ απφ δηαθνξεηηθά επίπεδα εζηίαζεο. εκεησκέλν ζηελ παξαπάλσ εηθφλα είλαη ην Multichannel Fluorescence θαζψο απηφ έρνπκε αγνξάζεη θαη επηηξέπεη ηε ιήςε πνιπθάλαισλ εηθφλσλ θζνξηζκνχ. Μπνξεί λα ζπλδπαζηεί κε ηα modules Z-Stack, MosaiX θαη Mark&Find. ηελ επεμεξγαζία εηθφλαο μερσξίδνπκε ην module Imaging Plus, ην νπνίν πξνζθέξεη ηηο θπξηφηεξεο ηερληθέο ηεο ςεθηαθήο επεμεξγαζίαο εηθφλαο. Απηφ ην module πεξηέρεη ιεηηνπξγίεο γηα ηε βειηίσζε ηεο εηθφλαο θαη γηα κεηαζρεκαηηζκνχο ζηελ εηθφλα. Δλδηαθέξνλ επίζεο είλαη θαη ην module 2D Deconvolution, ην νπνίν βειηηψλεη ηελ πνηφηεηα ησλ 2-δηάζηαησλ εηθφλσλ θζνξηζκνχ ηφζν ζηελ νξηδφληηα φζν θαη ζηελ θάζεηε θαηεχζπλζε ζχκθσλα κε κία πξνθαζνξηζκέλε ή απηνπαξαγφκελε Point Spread ζπλάξηεζε. ηελ αλάιπζε εηθφλαο μερσξίδνπκε ηα modules AutoMeasure θαη AutoMeasure Plus. Με ην κελ πξψην κπνξνχλ λα παξαρζνχλ εχθνια θαη γξήγνξα πξνγξάκκαηα κεηξήζεσλ κε ηε βνήζεηα ελφο νδεγνχ πξνγξάκκαηνο (wizard). Καινχληαη ε κία κεηά ηελ άιιε φιεο νη ζπλαξηήζεηο πνπ είλαη απαξαίηεηεο γηα ηε δηαδηθαζία αλάιπζεο ηεο εηθφλαο, θαζνξίδνληαη νη παξάκεηξνη ησλ ζπλαξηήζεσλ θαη ζην ηέινο απνζεθεχνληαη σο έλα πξφγξακκα κεηξήζεσλ. Δθφζνλ έρνπλ θαζνξηζζεί ηα πξνγξάκκαηα κεηξήζεσλ, είλαη δπλαηή ε κέηξεζε νπνηνπδήπνηε αξηζκνχ εηθφλσλ εθηειψληαο απιά κηα ζεηξά αλαιχζεσλ. Σν δεχηεξν module επί ηεο νπζίαο είλαη επέθηαζε ηνπ πξνεγνχκελνπ πεξηιακβάλνληαο έλα κεγάιν εχξνο επηπξφζζεησλ ζπλαξηήζεσλ γηα θεξκαηηζκφ εηθφλαο θαη γηα δπαδηθή επεμεξγαζία εηθφλαο. απηή ηελ πεξίπησζε νη ιεηηνπξγίεο δελ εθηεινχληαη κέζσ ηνπ νδεγνχ (wizard), αιιά είλαη δηαζέζηκεο αλεμάξηεηα σο ιεηηνπξγίεο ζε κελνχ. Μπνξνχλ λα ζπλδπαζηνχλ ειεχζεξα, επηηξέπνληαο ηε δεκηνπξγία δηθψλ καο ξνπηηλψλ. Δθηφο βέβαηα απφ ηηο εμεηδηθεπκέλεο ιεηηνπξγίεο ησλ modules, απφ ην πξφγξακκα axiovision παξέρνληαη θαη βαζηθέο ιεηηνπξγίεο ιήςεο θαη επεμεξγαζίαο εηθφλαο. Μεξηθέο απφ απηέο αλαθέξζεθαλ θαηά ηελ πεξηγξαθή ηεο δηαδηθαζίαο ιήςεο ησλ εηθφλσλ απφ ηελ TUNEL θαη είλαη ηα εξγαιεία ιήςεο, φπσο ην θνπκπί snap, νη ξπζκίζεηο έθζεζεο, ε θσηεηλφηεηα, ε αληίζεζε. Παξαηεξψληαο ην κελνχ φηαλ ηξέρνπκε ην πείξακα, βιέπνπκε θαη ηηο βαζηθέο δπλαηφηεηεο πνπ καο δίλνληαη απφ ην πξφγξακκα. Ζ παξαθάησ εηθφλα δείρλεη κέζα [54]

55 ζηελ έιιεηςε ηηο επηινγέο πνπ έρνπκε δηαζέζηκεο απφ ην πξφγξακκα axiovision. Κάπνηεο απφ ηηο ιεηηνπξγίεο είλαη ηφζν βαζηθέο πνπ αθφκα θαη ην φλνκα είλαη αξθεηφ γηα λα θαλεί ε ιεηηνπξγηθφηεηά ηνπο, φπσο γηα παξάδεηγκα ην Brightness/Contrast φπνπ ξπζκίδεηαη ε θσηεηλφηεηα θαη ε αληίζεζε ησλ ρξσκάησλ. Κάπνηεο άιιεο φκσο είλαη πην ελδηαθέξνπζεο φπσο απηέο ηεο ιείαλζεο ηεο εηθφλαο. Δηθόλα 21 - Γηαζέζηκεο βαζηθέο ιεηηνπξγίεο ηνπ AxioVision Οη εηθφλεο πνιιέο θνξέο πεξηέρνπλ πεξηνρέο κε ζφξπβν ή κε αλνκνηνγελή θσηεηλφηεηα, νη νπνίεο δπζρεξαίλνπλ ηνλ εληνπηζκφ ησλ αληηθεηκέλσλ. Γηα ηελ επίηεπμε ηθαλνπνηεηηθνχ δηαρσξηζκνχ ησλ αληηθεηκέλσλ (segmentation) ρξεζηκνπνηνχληαη θίιηξα ιείαλζεο. Όια ηα θίιηξα ιείαλζεο ιεηηνπξγνχλ ρξεζηκνπνηψληαο πίλαθεο θίιηξσλ, ησλ νπνίσλ ην κέγεζνο θαζνξίδεηαη [55]

56 ρξεζηκνπνηψληαο ηελ παξάκεηξν KernelSize. Απηή ε παξάκεηξνο εμαξηάηαη απφ ηελ αθηίλα ζφισζεο (blur radius) θαη κάιηζηα είλαη KernelSize = (blur radius*2+1) *(blur radius*2+1). Καηά ηε δηάξθεηα ηεο δηαδηθαζίαο θηιηξαξίζκαηνο ην θεληξηθφ pixel ζηνλ πίλαθα ζπλδπάδεηαη κε ηηο γθξη ηηκέο ηνπ πίλαθα θαη ηνπ δίλεηαη κηα λέα ηηκή. Σν πνην θίιηξν ιείαλζεο είλαη ην θαηαιιειφηεξν εμαξηάηαη απφ ηα αληηθείκελα πνπ βξίζθνληαη ζηελ εηθφλα. Γη απηφ ζεσξείηαη θαιχηεξν λα δνθηκαζηνχλ αξρηθά δηάθνξα θίιηξα. ηε ιείαλζε ηεο εηθφλαο καο παξέρνληαη δχν ζπλαξηήζεηο. Απηέο είλαη ε ζπλάξηεζε Sigma θαη ε Gauss binomial. Ζ ζπλάξηεζε Sigma είλαη ηδηαίηεξα θαηάιιειε γηα ηελ απνκάθξπλζε αλνκνηφκνξθσλ θσηεηλνηήησλ πνπ βξίζθνληαη κέζα ζηηο κνξθέο ησλ αληηθεηκέλσλ ρσξίο λα επεξεάδεη ηηο αθκέο ησλ κνξθψλ. Γηα ηελ εμάιεηςε ηνπ ζνξχβνπ ρξεζηκνπνηείηαη ε Gauss. Απηή ειαηηψλεη ην δπλακηθφ εχξνο ηεο εηθφλαο, ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ φκσο θαη ησλ αθκψλ ησλ κνξθψλ. Δπηπιένλ, ζην κελνχ ησλ ξπζκίζεσλ (adjust) ππάξρεη ε ξχζκηζε γηα ηε δηφξζσζε ηεο ζθίαζεο (shading correction). Ο αλφκνηνο θσηηζκφο κπνξεί θάπνηεο θνξέο λα νδεγήζεη ζην θαηλφκελν ζθίαζεο ζηηο εηθφλεο. Απηφ ζεκαίλεη φηη ε θσηεηλφηεηα ηεο εηθφλαο είλαη αλφκνηα, ην νπνίν επεξεάδεη ζε κεγάιν βαζκφ ηνλ εληνπηζκφ ησλ αληηθεηκέλσλ πνπ ζέινπκε λα κεηξήζνπκε. Γηα ηελ αληηκεηψπηζε απηνχ ηνπ θαηλνκέλνπ, ε δηφξζσζε ζθίαζεο εθαξκφδεηαη ρξεζηκνπνηψληαο κία εηθφλα αλαθνξά. Καηά θαλφλα, σο εηθφλα αλαθνξά ρξεζηκνπνηείηαη έλα άδεην πεδίν ρσξίο κνξθέο. πρλά σζηφζν ζπκβαίλεη λα έρεη ιεθζεί κία εηθφλα θαη ην δείγκα λα κελ είλαη πιένλ δηαζέζηκν γηα ηε ιήςε ηνπ άδεηνπ πεδίνπ. απηή ηελ πεξίπησζε κπνξεί λα ρξεζηκνπνηεζεί κία ςεπδνζθηαζκέλε εηθφλα αλαθνξάο. Απηή δεκηνπξγείηαη εθαξκφδνληαο ηζρπξή ιείαλζε (γηα παξάδεηγκα ρξεζηκνπνηψληαο έλα ηζρπξφ ρακεινπεξαηφ θίιηξν) ζηελ αξρηθή εηθφλα. Ζ ιείαλζε, σζηφζν, εθαξκφδεηαη απηφκαηα ζηε ζπλάξηεζε ηεο δηφξζσζεο ζθίαζεο, ε νπνία θαζηζηά πεξηηηή ηε δεκηνπξγία ηεο εηθφλαο αλαθνξάο. Μία επίζεο ζεκαληηθή βαζηθή ιεηηνπξγία ηνπ ινγηζκηθνχ βξίζθεηαη ζηελ θαηεγνξία ησλ γεσκεηξηθψλ, ζηελ εληνιή κεηαηφπηζεο (shift). Καηά ηε δηάξθεηα ηεο ιήςεο πνιπθάλαισλ εηθφλσλ ρξεζηκνπνηψληαο ρεηξνθίλεην κηθξνζθφπην, ε αιιαγή ησλ θίιηξσλ γίλεηαη θαη απηή ρεηξνθίλεηα. Απηφ κπνξεί λα νδεγήζεη ζε κία κηθξή κεηαηφπηζε κεξηθψλ pixels ησλ εηθφλσλ αλάκεζα ζηα θαλάιηα θαηά ηελ νξηδφληηα θαη [56]

57 ηελ θάζεηε θαηεχζπλζε. Σα αλεμάξηεηα θζνξίδνληα θαλάιηα απεηθνλίδνληαη ζε κηα ςεπδν-έγρξσκε εηθφλα. πλεπψο ε κεηαηφπηζε ησλ XY pixels πνπ πξνέθπςε πξέπεη λα δηνξζσζεί ψζηε λα είλαη ζίγνπξν φηη ηα δηαθνξεηηθά θαλάιηα βξίζθνληαη αθξηβψο ην έλα πάλσ απφ ην άιιν ζηελ νξηδφληηα θαη ζηελ θάζεηε θαηεχζπλζε ζηελ ςεπδνέγρξσκε εηθφλα. Ζ ιεηηνπξγία απηή φκσο αθξηβψο επεηδή απεπζχλεηαη γηα κηθξνζθφπηα κε ρεηξνθίλεηε αιιαγή ησλ θίιηξσλ, δελ έρεη εθαξκνγή ζηε δηθή καο πεξίπησζε, θαζψο ηα θίιηξα αιιάδνπλ κέζσ ηνπ ππνινγηζηή κε ηα macintosh. Τπάξρνπλ επίζεο θαη ιεηηνπξγίεο, νη νπνίεο ελψ θαίλνληαη δηαζέζηκεο ζην κελνχ, είηε δελ είλαη ζηελ νπζία, είηε δελ έρνπλ θάπνηα ρξεζηκφηεηα. Γηα παξάδεηγκα, ην white balance είλαη γηα ηε ξχζκηζε ησλ ρξσκάησλ ζε έγρξσκε θάκεξα. Χζηφζν, ε AxioCam MRm είλαη αζπξφκαπξε θάκεξα θαη απεηθνλίδεη ηα θζνξίδνληα θαλάιηα ζε ςεπδν-έγρξσκεο εηθφλεο. πλεπψο, δελ έρεη θάπνηα ρξεζηκφηεηα απηή ε επηινγή, εθηφο θαη αλ ζηελ θάκεξα πξνζηεζεί έγρξσκν θίιηξν. Δπηπιένλ, φζα αθνξνχλ ην Z- Stack (Z-Stack Corrrection θαη Z-Stack alignment) δελ κπνξνχλ λα ρξεζηκνπνηεζνχλ ρσξίο ηελ ελεξγνπνίεζε ηνπ Z-Stack module. Άξα θαη πάιη είλαη δχν ιεηηνπξγίεο, νη νπνίεο δε κπνξνχλ λα γίλνπλ δεδνκέλνπ φηη δελ ππάξρεη ε δπλαηφηεηα ιήςεο εηθφλσλ απφ δηαθνξεηηθά επίπεδα. Σν ίδην ηζρχεη θαη γηα ην ππνκελνχ sharpen, θαζψο ε δπλαηφηεηα γηα contour enhancement δίλεηαη κε ηα modules automeasure θαη automeasure plus. 3.4 πκπεξάζκαηα ην θεθάιαην απηφ πεξηγξάθεθε ην πξφγξακκα πνπ ρξεζηκνπνηείηαη γηα ηε ιήςε ησλ εηθφλσλ, ην νπνίν παξέρεηαη κε ηελ θάκεξα θαζψο θαη ε ίδηα ε θάκεξα κε ηηο ηδηφηεηέο ηεο. Αθελφο κελ πξφθεηηαη γηα έλα πνιχ ιεηηνπξγηθφ πξφγξακκα κε πνιιέο δπλαηφηεηεο αθφκα θαη ζηα βαζηθά ηνπ ζηνηρεία, ην νπνίν ζπλεξγάδεηαη ηδαληθά κε ηελ θάκεξα αθεηέξνπ ε θάκεξα είλαη ε ηδαληθή ζηελ πεξίπησζε γηαηί είλαη εηδηθά ζρεδηαζκέλε γηα ιήςε εηθφλσλ θζνξηζκνχ, ψζηε λα εθκεηαιιεχεηαη αθφκα θαη ην ειάρηζην θσο, λα πξνζζέηεη φζν ην δπλαηφλ ιηγφηεξν ζφξπβν αθφκα θαη ζε κεγάινπο ρξφλνπο έθζεζεο ελψ ηαπηφρξνλα λα απνδίδεη εηθφλεο πςειήο αλάιπζεο θαη επζείαλ επεμεξγάζηκεο ζηνλ ππνινγηζηή. [57]

58 Γηα ηε ζπλέρεηα έρεη πξνηαζεί κειέηε πνπ έδεημε φηη νη εηθφλεο θζνξηζκνχ είλαη θαηάιιειεο γηα επεμεξγαζία θαη κάιηζηα κε εμαηξεηηθά απνηειέζκαηα, ζπκβάιινληαο ζηελ πνζνηηθνπνίεζε ηνπ πξνβιήκαηνο θαη ζπλεπψο ζηελ εμαγσγή πην αμηφπηζησλ απνηειεζκάησλ. Απηή ε κειέηε αλαθνηλψζεθε ζε ζπλέδξην ηεο IEEE θαη παξνπζηάδεηαη αλαιπηηθά ζην επφκελν θεθάιαην. [58]

59 Πίνακας περιεχομένων Κεθάιαην 4 Απηφκαηε αλάιπζε εηθφλσλ κηθξνζθνπίνπ Δηζαγσγή Φεθηαθή αλάιπζε εηθφλσλ Ο αιγφξηζκνο αλάιπζεο εηθφλαο Κεξκαηηζκφο εηθφλαο Σαμηλφκεζε ζρεκάησλ θαη ππνινγηζκφο πεξηνρψλ Απνηειέζκαηα πκπεξάζκαηα [59]

60 Κεθάιαην 4 Απηόκαηε αλάιπζε εηθόλσλ κηθξνζθνπίνπ 4.1 Δηζαγσγή Αθνινπζψληαο ηε δηαδηθαζία ηεο TUNEL θαη ιακβάλνληαο ηηο εηθφλεο απφ κηθξνζθφπην θζνξηζκνχ, φπσο πεξηγξάθεθε ζηα πξνεγνχκελα θεθάιαηα, απηφ πνπ ρξεηάδεηαη λα γίλεη ζηε ζπλέρεηα είλαη ε επεμεξγαζία ησλ εηθφλσλ ψζηε λα κπνξέζνπκε λα μερσξίζνπκε ηα ζπεξκαηνδσάξηα θαη λα ππνινγίζνπκε ην βαζκφ θεξκαηηζκνχ ηνπο. πλεπψο, ε εξεπλεηηθή νκάδα καο, ε νπνία απνηειείηαη θαη απφ ηνπο Κνληαμάθε, αγθξηψηε θαη γνχξν αλέπηπμε κηα ππνινγηζηηθή κέζνδν γηα ηελ απηφκαηε αλάιπζε ησλ εηθφλσλ. Όπσο είλαη ήδε γλσζηφ, ζε θάζε εηθφλα, ηα ζπεξκαηνδσάξηα απεηθνλίδνληαη κε κπιε ρξψκα, ελψ ζην εζσηεξηθφ θάζε ζπεξκαηνδσαξίνπ ε πεξηνρή πνπ είλαη αλάινγε κε ην βαζκφ θαηαθεξκαηηζκνχ ηνπ DNA βάθεηαη κε θφθθηλν ρξψκα θαηά ηε δηαδηθαζία ηεο TUNEL. Ζ πξνηαζείζα κέζνδνο αλάιπζεο ςεθηαθψλ εηθφλσλ ρξεζηκνπνηεί κηα κέζνδν θεξκαηηζκνχ βαζηζκέλε ζηελ Primary Component Analysis (PCA), ε νπνία εθαξκφδεηαη ζηνλ 3- δηάζηαην ρψξν. Με απηφλ ηνλ ηξφπν απνκνλψλνληαη νη κνξθέο ζε θάζε εηθφλα θαη ζηε ζπλέρεηα ρξεζηκνπνηείηαη κηα κέζνδνο ηαμηλφκεζεο γηα λα μερσξίζεη κφλν εθείλεο ηηο κνξθέο πνπ είλαη κνλήξε ζπεξκαηνδσάξηα, λα αγλνήζεη εθείλεο πνπ είλαη επηθαιππηφκελα ζπεξκαηνδσάξηα θαη λα απνξξίςεη θάπνηεο πνπ είλαη «ζθνππίδηα» (debris) θαη αλήθνπλ ζε θνκκάηηα απφ ζπζηαηηθά πνπ δεκηνπξγήζεθαλ θαηά ηε δηάξθεηα ηεο δηαδηθαζίαο. Σέινο, ππνινγίδεηαη ν ιφγνο ηεο θφθθηλεο πεξηνρήο σο πξνο ηε ζπλνιηθή πεξηνρή ηνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ γηα θάζε κνλήξεο ζπεξκαηνδσάξην. 4.2 Φεθηαθή αλάιπζε εηθόλσλ ην πξνεγνχκελν θεθάιαην πεξηγξάθεθε ην axiovision. Δθεί είδακε φηη ην πξφγξακκα παξέρεη πνιιέο ιεηηνπξγίεο ςεθηαθήο επεμεξγαζίαο εηθφλαο ηθαλέο λα βνεζήζνπλ ηνπο εξεπλεηέο ζηα πεηξάκαηά ηνπο. Χζηφζν, έλα ινγηζκηθφ, ην νπνίν θηηάρλεηαη γηα λα θαιχςεη έλα κεγάιν εχξνο εθαξκνγψλ, δελ κπνξεί λα ρξεζηκνπνηεζεί κε αμηνπηζηία ζε νξηζκέλα πεηξάκαηα. Δπηπιένλ, νη ιεηηνπξγίεο πνπ ρξεηαδφκαζηε είλαη ρσξηζκέλεο ζε πνιιά modules ζην axiovision, νπφηε ζα απαηηνχληαλ ε αγνξά φισλ απηψλ γηα λα έρνπκε ηα απνηειέζκαηα πνπ ρξεηαδφκαζηε. [60]

61 Αληηζέησο, ε ζπλεξγαζία εξεπλεηψλ θαη κεραληθψλ ςεθηαθήο αλάιπζεο εηθφλαο κπνξεί λα δψζεη εμαηξεηηθά απνηειέζκαηα. Οη ζπλεξγάηεο καο αλέπηπμαλ θαη παξνπζίαζαλ ζε δηεζλέο ζπκπφζην ηεο IEEE ζηελ επεμεξγαζία ζεκάησλ ην 2007, ηελ εξγαζία ηνπο ζηελ νπνία πεξηγξάθεηαη έλαο αιγφξηζκνο ςεθηαθήο αλάιπζεο εηθφλσλ (Digital Image Analysis Algorithm - DIAA). Ο αιγφξηζκνο απηφο δεκηνπξγήζεθε γηα ηελ εμαγσγή πιεξνθνξίαο πνπ βξίζθεηαη ζε ζπγθεθξηκέλεο κνξθέο εηθφλσλ κηθξνζθνπίνπ θαη νη νπνίεο ζπιιέρζεθαλ κε ην κηθξνζθφπην θζνξηζκνχ. Απηέο νη εηθφλεο ήηαλ κέξνο κειέηεο πνπ αθνξνχζε ηελ έξεπλα γηα ηα απνηειέζκαηα ηνπ γήξαηνο ησλ αλδξψλ ζηνλ θεξκαηηζκφ ηνπ DNA ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ θαη ζηελ ζπκπχθλσζε ηεο ρξσκαηίλεο ζε αζζελείο πάζρνληεο απφ νιηγναζζελνηεξαηνδσνζπεξκία. ε θάζε αληηθεηκελνθφξν πιάθα εθαξκφζηεθε ε κέζνδνο terminal deoxynucleotidyl tranferase-mediated dutp-nick end labeling (TUNEL) κε ηνπο θαηάιιεινπο κάξηπξεο. Σν κηθξνζθφπην ην νπνίν ρξεζηκνπνηήζεθε ήηαλ έλα Zeiss-Axioscope, ελψ νη εηθφλεο ζπιιέρηεθαλ ρξεζηκνπνηψληαο κία cooled CCD (charged coupled device) θάκεξα θαη ηξαβήρηεθαλ κέζσ ηνπ Quips PathVysion (Smart Capture VP) θαη ελφο δηπινχ δσλνπεξαηνχ θίιηξνπ (DAPI/Orange). Ζ θάκεξα δειαδή πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε ήηαλ δηαθνξεηηθή απφ απηή πνπ ππάξρεη ζήκεξα, παιαηφηεξεο ηερλνινγίαο θαη ιηγφηεξσλ δπλαηνηήησλ. Παξφι απηά ηα απνηειέζκαηα ήηαλ πεξηζζφηεξν απφ ελζαξξπληηθά γηα ηε ζεηηθή εμέιημε ηεο έξεπλαο. Οη εηθφλεο πξνο επεμεξγαζία πεξηέρνπλ κνλήξε ζπεξκαηνδσάξηα φπσο επίζεο θαη αιιεινεπηθαιππηφκελα. Μία ελδεηθηηθή εηθφλα είλαη ε εηθφλα 22. Κάπνηα απφ ηα ζπεξκαηνδσάξηα έρνπλ έλα νκνηφκνξθν αλνηθηφ κπιε ρξψκα, ελψ άιια έρνπλ θφθθηλα κέξε ζηα κπιε ζψκαηά ηνπο. Απφ έξεπλεο ησλ ηαηξηθψλ εξγαζηεξίσλ έρεη απνδεηρζεί φηη ην πνζνζηφ ησλ θφθθηλσλ pixels θαζνξίδεη ην βαζκφ θεξκαηηζκνχ ηνπ DNA ζηνλ ππξήλα ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ. Γπζηπρψο δε γίλεηαη λα εθηηκεζεί ε ζπλνιηθή θφθθηλε πεξηνρή θάζε επηθαιππηφκελνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ, ζπλεπψο δε κεηξάηαη νχηε ην πνζνζηφ ηνπ θφθθηλνπ ρξψκαηνο νχηε ν βαζκφο θεξκαηηζκνχ θαη απηά ηα ζπεξκαηνδσάξηα πξέπεη λα απνξξηθζνχλ απφ ηε δηαδηθαζία. Σν θφλην έρεη έλα ζθνχξν κπιε ρξψκα κε θπκαηλφκελε έληαζε ζ φιε ηελ εηθφλα. [61]

62 Δηθόλα 22 Δηθόλα κηθξνζθνπίνπ θζνξηζκνύ Ο αιγφξηζκνο DIAA, ν νπνίνο πξνηάζεθε, απνηειείηαη απφ 3 θχξηα ζηάδηα. ην πξψην ζηάδην δηαρσξίδνληαη ηα αληηθείκελα πνπ απεηθνλίδνληαη ζηελ εηθφλα. ε δεχηεξν ζηάδην ηα αληηθείκελα ηαμηλνκνχληαη ζε ηξεηο δηαθξηηέο θιάζεηο, κία γηα ηα επηθαιππηφκελα ζπεξκαηνδσάξηα, κία δεχηεξε γηα ηα κνλήξε ζπεξκαηνδσάξηα θαη κία ηξίηε γηα ηα «ζθνππίδηα» ηεο εηθφλαο. ην ηξίην ζηάδην ππνινγίδεηαη ην πνζνζηφ ηεο θφθθηλεο πεξηνρήο πνπ πεξηέρεηαη ζε θάζε κνλήξεο ζπεξκαηνδσάξην. 4.3 Ο αιγόξηζκνο αλάιπζεο εηθόλαο Κεξκαηηζκφο εηθφλαο Αξρηθά ν RGB ρψξνο ζεσξείηαη σο ν ρψξνο γλσξηζκάησλ. Κάζε pixel ηεο εηθφλαο αληηζηνηρίδεηαη κέζσ ηνπ (R,G,B) T δηαλχζκαηνο γλσξηζκάησλ ζε έλα ζεκείν ζ απηφ ην ρψξν. Με απηφ ηνλ ηξφπν ζρεκαηίδεηαη ν πιεζπζκφο Υ, Υ={Υ j, j=1,2,,n X }, φπνπ N X είλαη ν αξηζκφο ησλ pixel ηεο εηθφλαο. [62]

63 Δηθόλα 23 - Σα δηαλύζκαηα γλσξηζκάησλ ησλ εηθνλνζηνηρείσλ ζηνλ RGB ρώξν Δίλαη ελδηαθέξνπζα ε παξαηήξεζε φηη ν πιεζπζκφο Υ ηνπνζεηείηαη ζε κία ζρεδφλ επίπεδε πεξηνρή ηνπ RGB ρψξνπ. ηε ζπλέρεηα πινπνηείηαη ε ηερληθή PCA ψζηε λα θαζνξηζηνχλ ηα ηδηνδηαλχζκαηα u θαη v, ηα νπνία αληηζηνηρνχλ ζηηο κεγαιχηεξεο ηδηνηηκέο ηεο επίπεδεο πεξηνρήο θαη έπεηηα ηα ζεκεία πξνβάιινληαη ζην επίπεδν πνπ νξίδνπλ ηα ηδηνδηαλχζκαηα. Ο 2-δηάζηαηνο ρψξνο πνπ δεκηνπξγήζεθε δηαηεξεί ηε δηαθξηηφηεηα ηνπ Υ πιεζπζκνχ ζρεδφλ αλαιινίσηε, θαζψο ε ηξίηε δηάζηαζε έρεη πνιχ κηθξή δηαθχκαλζε. Γηα λα δνζεί κηα ηδέα γηα ην πψο θαηαλέκεηαη ν Υ πιεζπζκφο ζην επίπεδν u-v, ππάξρεη έλα ηζηφγξακκα πνπ απεηθνλίδεη απηή ηελ θαηαλνκή θαη παξνπζηάδεηαη ζηελ εηθφλα 24. Δηθόλα 24 - Η θαηαλνκή ησλ εηθνλνζηνηρείσλ θόληνπ θαη ησλ εκπξόζζησλ [63]

64 ε απηφ ην ηζηφγξακκα δηαθξίλνληαη δχν θχξηεο δηακνξθψζεηο: κηα πεξηνρή κε αηρκέο κεγάιεο έληαζεο θαη θάπνηεο γεηηνληθέο πεξηνρέο κε ηηκέο ρακειφηεξεο έληαζεο. Απηφ ην ζρήκα πεξηέρεη ηελ πιεηνςεθία ησλ εηθνλνζηνηρείσλ θφληνπ, νπφηε ζπκβνιίδεηαη κε ην γξάκκα Β. Σν δεχηεξν ζρήκα, ην νπνίν ζπκβνιίδεηαη κε ην γξάκκα F, είλαη κηα πεξηνρή κηθξφηεξεο έληαζεο, κε επίκεθεο ζρήκα ζε κηα ζηελή πεξηνρή κε πςειέο v ηηκέο. Ο θχξηνο άμνλαο απηήο ηεο πεξηνρήο είλαη ζρεδφλ παξάιιεινο κε ηνλ άμνλα u. Σν F ζρήκα πεξηέρεη κφλν ηα pixel πνπ βξίζθνληαη ζην πξνζθήλην, δειαδή ηα pixels ησλ ζρεκάησλ πνπ αληηζηνηρνχλ ζηα ζπεξκαηνδσάξηα ή ζε θάπνηα κηθξά κε επηζπκεηά ζηνηρεία. Σν ππφινηπν ηεο 2-δηάζηαηεο πεξηνρήο ηνπ ηζηνγξάκκαηνο έρεη ζρεδφλ κεδεληθή έληαζε. Πεξηέρεη ζεκεία πνπ αληηζηνηρνχλ θπξίσο ζηα pixel ηνπ θφληνπ θαη ελδερνκέλσο ζε ιίγα κφλν pixel ηνπ πξνζθελίνπ, ην ρξψκα ησλ νπνίσλ κεηαηνπίζηεθε θαηά ηε δηάξθεηα ηεο παξαγσγήο ηεο εηθφλαο. Σν ζρήκα F κπνξεί λα απνκνλσζεί απφ ηελ ππφινηπε u-v πεξηνρή φπσο πεξηγξάθεηαη ζηε ζπλέρεηα. Αξρηθά, φινο ν πιεζπζκφο κε ηηκή-v κεγαιχηεξε απφ έλα θαηψθιη v th ζεσξείηαη φηη απνηειεί ηνλ πιεζπζκφ P. Ζ ηηκή v th ιακβάλεηαη σο ίζε κε 0.8v max, κηα ηηκή ε νπνία θάλεθε φηη ηθαλνπνηεί φιεο ηηο πεξηπηψζεηο ησλ πεηξάκαηνο. Έπεηηα εθαξκφδεηαη ε PCA ηερληθή ζηνλ πιεζπζκφ P θαη νη άμνλεο ηνπ ζπζηήκαηνο αιιάδνπλ ψζηε λα ζπκπίπηνπλ κε ηνπο αληίζηνηρνπο άμνλεο p θαη q. Καζψο ην ζρήκα F είλαη ε κφλε θπξίαξρε δηακφξθσζε ηνπ πιεζπζκνχ P, ηα δηαλχζκαηα p θαη q έρνπλ ηελ θαηεχζπλζε ησλ πξσηεπφλησλ αμφλσλ ηνπ ειιεηςνεηδνχο F. Σν ηζηφγξακκα ελφο ινβνχ (πνπ παξνπζηάδεηαη ζηελ εηθφλα 25) πξνθχπηεη απφ ηελ πξνβνιή ηνπ πιεζπζκνχ P ζηελ θαηεχζπλζε ηνπ q. Οη αθξαίεο ηηκέο ηνπ ινβνχ, q s θαη q e, κπνξνχλ λα ππνινγηζηνχλ ρξεζηκνπνηψληαο έλαλ αιγφξηζκν βέιηηζηνπ θαησθιίνπ (optimum threshold algorithm - OTA). Ο OTA δηαρσξίδεη έλα δνζέλ ηζηφγξακκα ζε δχν ζχλνια αιιεπάιιεισλ ξάβδσλ κε ηέηνην ηξφπν ψζηε λα κεγηζηνπνηείηαη ε δηαρσξηζηκφηεηα ησλ αληίζηνηρσλ πιεζπζκψλ. Γηα ηηο εθηηκήζεηο ησλ q s θαη q e ην ηζηφγξακκα δηαρσξίδεηαη ζε δχν κέξε απφ ηε κέγηζηε ξάβδν. Σν έλα κέξνο πεξηιακβάλεη φιεο ηηο ξάβδνπο απφ ηελ αξηζηεξφηεξε κέρξη ηε κέγηζηε θαη ην άιιν πεξηιακβάλεη ηηο ξάβδνπο απφ ηε κέγηζηε κέρξη ηε δεμηφηεξε. Ζ εθαξκνγή ηνπ OTA ζε θάζε ηζηφγξακκα πνπ πξνθχπηεη δίλεη ηα θαηψθιηα q s θαη q e. [64]

65 Δηθόλα 25 - Σν παξαγόκελν ηζηόγξακκα κεηά ηελ πξνβνιή ζηνλ q άμνλα Γηα ηνλ πιεζπζκφ P, απνκνλψλνληαη κφλν ηα ζεκεία ζηηο πεξηνρέο φπνπ ηζρχεη φηη q s <q<q e θαη απηέο νη πεξηνρέο θαηαρσξνχληαη ζρεκαηίδνληαο ηνλ πιεζπζκφ C. Ζ πξνβνιή ηνπ C ζηελ θαηεχζπλζε ηνπ p απηή ηε θνξά δίλεη ην ηζηφγξακκα ηεο εηθφλαο 26. Σα θαηψθιηα p s, p i θαη p e ππνινγίδνληαη θαη εδψ κε παξφκνην ηξφπν. Δηθόλα 26 - Σν παξαγόκελν ηζηόγξακκα κεηά ηελ πξνβνιή ζηνλ p άμνλα [65]

66 Βαζηδφκελνη ζε απηά ηα θαηψθιηα νξίζηεθαλ δχν κέξε ηνπ C πιεζπζκνχ, C 1 θαη C 2. Με απηή ηε δηαδηθαζία ην ζρήκα F απνκνλψλεηαη θαη ρσξίδεηαη ζ απηά ηα δχν κέξε, ηα C 1 θαη C 2. Έλα απφ απηά αληηζηνηρίδεηαη ζηα θφθθηλα pixels, ελψ ην άιιν αληηζηνηρίδεηαη ζηα κπιε. Γηα λα γίλεη δπλαηφλ λα θαζνξηζηεί ε ηαπηφηεηα ηνπ ρξψκαηνο θάζε κέξνπο, ππνινγίδεηαη ην θεληξνεηδέο c c1 =(p c1,q c1 ) T ηνπ C 1. ηε ζπλέρεηα πξνβάιινληαη ηα δηαλχζκαηα ζέζεο ησλ θαζαξψλ ρξσκάησλ X red =(255,0,0) T θαη X blue =(0,0,255) T πάλσ ζην επίπεδν p-q, ζηα ζεκεία c red θαη c blue αληίζηνηρα. Ζ κηθξφηεξε απφζηαζε ηνπ c 1 απφ ην c red θαη c blue θαζνξίδεη ηε ρξσκαηηθή ηαπηφηεηα ηνπ C 1 σο θφθθηλε ή σο κπιε αληίζηνηρα. Όιεο νη άιιεο πξνβνιέο ηνπ Υ ζην p-q (ή ζην u-v) επίπεδν εθηφο απφ απηέο πνπ πεξηέρνληαη ζηα C 1 θαη C 2 ζεσξνχληαη σο πξνβνιέο ησλ pixels θφληνπ. [66]

67 Δηθόλα 27 - Η αξρηθή θαη ε παξαγόκελε εηθόλα ηξηώλ ηόλσλ κεηά ηελ θαηάηκεζε (segmentation) Κάζε pixel ηεο εηθφλαο αλαγλσξίδεηαη σο θφλην, θφθθηλν ηνπ πξνζθελίνπ ή κπιε ηνπ πξνζθελίνπ κε βάζε ην δηάλπζκα ησλ ρξσκαηηθψλ γλσξηζκάησλ ηνπ X j (R,G,B). πγθεθξηκέλα αλ ην c j (p j,q j ) είλαη ε πξνβνιή ηνπ X j (R,G,B) ζην επίπεδν p-q, ηφηε ιακβάλνληαη νη εμήο απνθάζεηο. Αλ p j >p e ή p j <p s ή q j <q e ή q j <q s ηφηε ην pixel αλαγλσξίδεηαη σο θφληνπ. Γηαθνξεηηθά ε ρξσκαηηθή εηηθέηα ηνπ C 1 ή ηνπ C 2 αλαηίζεηαη ζην pixel αλάινγα κε ηελ ηζρχ ηεο ζρέζεο p j <p t. [67]

68 απηφ ην ζεκείν φια ηα pixel ηνπ πξνζθελίνπ είλαη γλσζηά θαη ε ρξσκαηηθή ηνπο ηαπηφηεηα επίζεο γλσζηή. θνπφο ηψξα είλαη λα απνκνλσζνχλ ηα κνλήξε ζπεξκαηνδσάξηα θαη λα ππνινγηζηεί ε επηθάλεηα ησλ θφθθηλσλ pixels ζε απηά ψζηε λα εθθξαζηεί σο πνζνζηφ ηεο ζπλνιηθήο επηθάλεηαο ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ θαη λα ππνινγηζηεί ν βαζκφο θεξκαηηζκνχ ηνπ DNA. Δηθόλα 28 - Μεγελζπκέλα ηκήκαηα ηεο εηθόλαο 27 Δθαξκφδνληαο ηνλ 4-connected component αιγφξηζκν, εληνπίδνληαη φιεο νη θνληηλέο πεξηνρέο ζηελ εηθφλα θαη ππνινγίδεηαη ε κέζε επηθάλεηα. Έπεηηα, απνξξίπηνληαη φιεο νη πεξηνρέο κε επηθάλεηεο πνπ απνθιίλνπλ απφ ηε κέζε θαζψο είλαη είηε ππνιείκκαηα απφ ηε δηαδηθαζία παξαγσγήο ησλ εηθφλσλ φηαλ ε επηθάλεηα είλαη πνιχ κηθξφηεξε απφ ηε κέζε, είηε επηθαιππηφκελα ζπεξκαηνδσάξηα φηαλ ε επηθάλεηα είλαη πνιχ [68]

69 κεγαιχηεξε απφ ηε κέζε. Οη ππφινηπεο θνληηλέο πεξηνρέο είλαη κνλήξε ζπεξκαηνδσάξηα, ζηα νπνία πιένλ ππνινγίδεηαη εχθνια ην πνζνζηφ ησλ θφθθηλσλ pixels απ φπνπ πξνθχπηεη θαη ν βαζκφο ηνπ θεξκαηηζκνχ ηνπ DNA. Ζ δηαδηθαζία απηή πεξηγξάθεηαη αλαιπηηθά ζηε ζπλέρεηα. Βήμαηα διασωπιζμού ηων ζηοισείων ηων εικόνων 1. Τπνιφγηζε ην θεληξνεηδέο M x θαη ηνλ πίλαθα ζπζρεηηζκνχ x ηνπ πιεζπζκνχ X, ππνιφγηζε ηα ηδηνδηαλχζκαηα u,v πνπ αληηζηνηρνχλ ζηηο δχν κεγαιχηεξεο ηδηνηηκέο e u θαη e v, e u < e v. Τπνιφγηζε ην A 1 = [u v] T, x j (u,v) = A 1 (X j M x ), j= 1,2,.,N. 2. Καηαζθεχαζε έλα 2-D ηζηφγξακκα γηα ηε PDF εθηίκεεο ηεο πξνβνιήο ηνπ X ζην επίπεδν u,v. 3. Όξηζε ηνλ P X, P{x j (u,v) P:v> 0.8v max }. Έζησ x Pi, i=1,2,.,n P ηα ζηνηρεία ηνπ P. 4. Τπνιφγηζε ην θεληξνεηδέο M P θαη ηνλ πίλαθα ζπζρεηηζκνχ P ηνπ P πιεζπζκνχ, ππνιφγηζε ηα ηδηνδηαλχζκαηα p,q πνπ αληηζηνηρνχλ ζηηο δχν ηδηνηηκέο e p θαη e q, e p e q. Τπνιφγηζε ην A 2 =[p q] T, x ni (p,q)=a 2 (r Pi -M P ),i=1,2,.,n P. 5. Καηαζθεχαζε έλα ηζηφγξακκα ηεο πξνβνιήο ηνπ P πιεζπζκνχ ζηνλ άμνλα q θαη ππνιφγηζε ηα θαηψθιηα q s θαη q e. Όξηζε ηνλ C P, C={x ni (p,q) C: q s <q<q e }. Έζησ x Ci, i=1,2,...,n C ηα ζηνηρεία ηνπ C. 6. Καηαζθεχαζε ην ηζηφγξακκα ηεο πξνβνιήο ηνπ πιεζπζκνχ C ζηνλ άμνλα p θαη ππνιφγηζε ηα θαηψθιηα p s, p t θαη p e. Όξηζε ηνλ C 1 C C 1 =x Ci (x,q) C: p s <p<p t } θαη C 2 C C 2 ={x Ci (p,q) C: p t <p<p e }. 7. Έζησ c C1 ην θεληξνεηδέο ηνπ C 1 θαη c red =A 2 [A 1 (X red -M R )-M P ] θαη c blue =A 2 [A 1 (X blue -M R )-M P ] ε αληηζηνίρηζε ηνπ θαζαξνχ θφθθηλνπ θαη κπιε ρξψκαηνο ζην επίπεδν p,q. Αλ c C1 - x red < c C1 - x blue φξηζε ηνλ C 1 πιεζπζκφ σο θφθθηλν θαη ην C 2 σο κπιε, αιιηψο φξηζέ ηνπο αληίζηξνθα. 8. Τπνιφγηζε ηελ αληηζηνίρηζε θάζε pixel X(R,G,B) ζην επίπεδν p,q: x(p x,q x )=A 2 [A 1 (X(R,G,B)-M R )-M P ]. Καζφξηζε αλ ην x(p x,q x ) αλήθεη ζηνλ C 1 ή ζηνλ C 2 ή ζε θαλέλα απφ απηνχο θαη φξηζε ην pixel σο θφθθηλν, κπιε ή θφληνπ αλάινγα Σαμηλφκεζε ζρεκάησλ θαη ππνινγηζκφο πεξηνρψλ Μεηά ηελ θαηαζθεπή ηεο εηθφλαο ηξηψλ ηφλσλ (εηθφλα 28b), ε δηαδηθαζία ζπλερίδεη κε ηελ ηαμηλφκεζε θάζε απνκνλσκέλνπ αληηθεηκέλνπ θαη ηελ θαηαρψξεζε εθείλσλ ησλ αληηθεηκέλσλ πνπ αλήθνπλ ζε κνλήξε ζπεξκαηνδσάξηα. Απηά ηα ζπεξκαηνδσάξηα είλαη ε πιεηνςεθία ζηηο εηθφλεο ηνπ πεηξάκαηνο θαη ε πεξηνρή ηνπο παξνπζηάδεη πνιχ κηθξή δηαθχκαλζε ζηελ εηθφλα. Απηφ ην γλψξηζκα ρξεζηκνπνηείηαη γηα λα ηα εληνπίζνπκε αλάκεζα ζηηο άιιεο κνξθέο ηεο ίδηαο εηθφλαο. Γη απηφ ην ζθνπφ, ζε έλα αληίγξαθν ηεο εηθφλαο ηξηψλ ηφλσλ, ν ηφλνο C 2 αληηθαζίζηαηαη απφ [69]

70 ηνλ C 1, θαηαιήγνληαο έηζη ζε κηα εηθφλα δχν ηφλσλ. Απφ ηελ ηειεπηαία εηθφλα, θαηαρσξείηαη θάζε θνληηλή πεξηνρή θαη ππνινγίδεηαη ην πιήζνο ησλ pixels, θάηη ζαλ κέηξεζε ηεο επηθάλεηαο ηεο πεξηνρήο. Ο πίλαθαο πνπ πξνθχπηεη απφ ηηο κεηξήζεηο ηαμηλνκείηαη θαη νη πεξηνρέο κε ηηκέο αλάκεζα ζην 20% θαη 70% ηεο κέγηζηεο ηηκήο είλαη απηέο πνπ ιακβάλνληαη ππφςε. Απηή ε πεξηνρή ρξεζηκνπνηείηαη γηα λα εθηηκεζεί κία κέζε ηηκή, κ cell, θαη ε ηππηθή απφθιηζε, ζ cell. Όιεο νη κνξθέο ζηελ εηθφλα πνπ θαηαιακβάλνπλ πεξηνρή κε ηηκέο πνπ θπκαίλνληαη γχξσ απφ κ cell + 2 ζ cell ζεσξνχληαη σο κνλήξε ζπεξκαηνδσάξηα, ελψ φιεο νη ππφινηπεο κνξθέο εμαηξνχληαη απφ ηελ εηθφλα ηξηψλ ηφλσλ. Σέινο, ππνινγίδεηαη ην πιήζνο ησλ C 1 θαη C 2 pixels γηα θάζε θαηαρσξεκέλν θαη κνλήξεο ζπεξκαηνδσάξην. 4.4 Απνηειέζκαηα Ο αιγφξηζκνο πνπ πεξηγξάθεθε, ειέγρζεθε κε ηελ εθαξκνγή ζε εηθφλεο 20 νιηγναζζελνηεξαηνδσνζπεξκηθψλ αζζελψλ. Σα κνλήξε ζπεξκαηνδσάξηα πνπ εληνπίζηεθαλ απφ ηνλ αιγφξηζκν, καξθαξίζηεθαλ κε έλαλ αχμνληα αξηζκφ ζηελ έγρξσκε εηθφλα, ρσξίο λα απνκαθξπλζνχλ νη ππφινηπεο κνξθέο, θαη θαηαρσξήζεθε ην αληίζηνηρν πνζνζηφ θφθθηλνπ θάζε ζπεξκαηνδσαξίνπ. Οη καξθαξηζκέλεο εηθφλεο εμεηάζζεθαλ απφ εμεηδηθεπκέλν πξνζσπηθφ ηνπ ηαηξηθνχ εξγαζηεξίνπ θαη αξρηθά ζεκεηψζεθαλ εθείλα πνπ είραλ ραξαθηεξηζζεί ιαλζαζκέλα σο ζπεξκαηνδσάξηα θαη ζηε ζπλέρεηα εθείλα ηα κνλήξε ζπεξκαηνδσάξηα ηα νπνία δελ αλαγλσξίζζεθαλ απφ ηελ απηφκαηε δηαδηθαζία. Σειηθά, ρξεζηκνπνηψληαο κηα εκηαπηφλνκε δηαδηθαζία, κεηξήζεθε ην πνζνζηφ ηνπ θφθθηλνπ θάζε καξθαξηζκέλνπ ζπεξκαηνδσαξίνπ. Ζ ζχγθξηζε ησλ απνηειεζκάησλ έδεημε φηη πεξηζζφηεξν απφ ην 95% ησλ κνλήξσλ ζπεξκαηνδσαξίσλ καξθαξίζηεθε ζσζηά θαη ιηγφηεξν απφ 1% ησλ αλεπηζχκεησλ κνξθψλ αλαγλσξίζηεθε ιαλζαζκέλα σο ζπεξκαηνδσάξηα. Οη ηηκέο ησλ πνζνζηψλ κεηαμχ ησλ δχν εθηηκήζεσλ δελ μεπέξαζε ζε θακία πεξίπησζε ην 5%. 4.5 πκπεξάζκαηα Σα απνηειέζκαηα ηεο κειέηεο απνδεηθλχνπλ ηε ζεκαληηθφηεηά ηνπο κε ην γεγνλφο φηη επηηπγράλνπλ λα απνκνλψζνπλ ηα ζπεξκαηνδσάξηα απφ ηελ ππφινηπε εηθφλα ζρεδφλ κε απφιπηε επηηπρία, ελψ ππνινγίδεηαη θαη βαζκφο θεξκαηηζκνχ κε βάζε ην [70]

71 πνζνζηφ ηνπ θφθθηλνπ ρξψκαηνο ζε θαζέλα απφ απηά. Δίλαη πνιχ ελζαξξπληηθά, θαζψο κε βαζηθέο ηερληθέο ηεο επεμεξγαζίαο εηθφλαο επηηπγράλεηαη πνιχ θαιφ απνηέιεζκα. Χζηφζν, δελ είλαη θαη ηα θαιχηεξα δπλαηά. Οη δπλαηφηεηεο ηεο θάκεξαο κε ηελ νπνία είραλ ιεθζεί νη εηθφλεο ζηηο νπνίεο δνθηκάζηεθε ν αιγφξηζκνο ήηαλ πνιχ πεξηνξηζκέλεο θαη νη εηθφλεο ήηαλ ζακπέο. Υξεηάζηεθε ζπλεπψο ε αγνξά ηεο λέαο θάκεξαο, ε νπνία φπσο πεξηγξάθεθε ζην πξνεγνχκελν θεθάιαην, εηδηθεχεηαη ζηε ιήςε εηθφλσλ απφ κηθξνζθφπην θζνξηζκνχ, έρεη πνιχ κεγάιε επαηζζεζία θαη αληρλεχεη αθφκα θαη έλα πνιχ αζζελέο ζήκα. Γπζηπρψο φκσο, αθφκα δελ έρνπλ επεμεξγαζηεί κε ηνλ DIAA νη λεναπνθηεζείζεο εηθφλεο. Ζ θάκεξα εγθαηαζηάζεθε πξφζθαηα θαη ε εχξεζε δεηγκάησλ είλαη κία ρξνλνβφξα δηαδηθαζία. Αλακέλνπκε ινηπφλ ελαγσλίσο ηα λέα απνηειέζκαηα θαη ζεσξνχκε φηη απηά ζα έρεη ελδηαθέξνλ λα ζπγθξηζνχλ κε απηά πνπ ζα έδηλαλ ηα πξφζζεηα ηνπ axiovision, αλ θαη φηαλ απηά αγνξαζηνχλ. Καη απηφ ηνλ ηξφπν ζα γίλνπλ αθφκα πην αμηφπηζηεο νη κεηξήζεηο θαη ζα έρνπλ κεγαιχηεξε βαξχηεηα ηα ζπκπεξάζκαηα ησλ εηδηθψλ γηα θάζε αζζελή. Πξνο απηή ηελ θαηεχζπλζε θηλείηαη θαη ε πξνζπάζεηα πνπ επηρεηξείηαη λα γίλεη ζηε ζπλέρεηα. Γίλεηαη δειαδή πξνζπάζεηα λα ζρεδηαζηεί έλα ζχζηεκα, ην νπνίν ρξεζηκνπνηψληαο ηερληθέο ηεο ηερλεηήο λνεκνζχλεο λα κπνξεί λα εμάγεη νκάδεο αζζελψλ κε θνηλά ραξαθηεξηζηηθά θαη έπεηηα λα ηνπνζεηεί θάζε λέν αζζελή ζε θάπνηα ή θάπνηεο απφ απηέο, αλάινγα ηελ πεξίπησζε. ηα επφκελα θεθάιαηα πξνηείλνληαη θαη παξνπζηάδνληαη νη βαζηθέο αξρέο ηερληθψλ θαη αιγνξίζκσλ, νη νπνίνη ζα κπνξνχζαλ λα εθαξκνζηνχλ θαη λα δψζνπλ θαιά απνηειέζκαηα, αλάινγα κε ηε γλψζε πνπ ππάξρεη θάζε θνξά γηα ηνπο αζζελείο. Υσξίδνληαο ηνπο αιγφξηζκνπο ζε δχν βαζηθέο θαηεγνξίεο, ζηνπο αιγφξηζκνπο επηβιεπφκελεο (5 ν θεθάιαην) θαη ζηνπο αιγφξηζκνπο κε-επηβιεπφκελεο κάζεζεο (6 ν θεθάιαην) θαη ηνπο ηειεπηαίνπο θαη ζε αιγφξηζκνπο εκη-επηβιεπφκελεο κάζεζεο, αλαθέξεηαη ζ απηά ηα θεθάιαηα πψο ζα κπνξνχζε ε θάζε πεξίπησζε λα εθαξκνζηεί θαη ηη απνηειέζκαηα αλακέλεηαη λα δψζεη. [71]

72 Πίνακας περιεχομένων Κεθάιαην 5 Αιγφξηζκνη κε επηβιεπφκελεο κάζεζεο Δηζαγσγή Δπηβιεπφκελε θαη κε επηβιεπφκελε κάζεζε Ση είλαη ην clustering Μέζνδνη clustering Παξακεηξηθέο Πξνζεγγίζεηο Μνληέια δεκηνπξγίαο ή πηζαλνηηθά κνληέια To Gaussian Mixture Model C-Means Fuzzy Clustering Μνληέια Αλαδφκεζεο K-means θαη K-median Με παξακεηξηθέο πξνζεγγίζεηο Οη αιγφξηζκνη ηεξαξρηθήο ζπζηαδνπνίεζεο Απηφ-νξγαλσκέλα δίθηπα Υαξηνγξάθεζε πεξηνρήο εηζφδνπ Υάξηεο δηαηήξεζεο ηνπνινγίαο ζηνλ εγθέθαιν Σν κνληέιν Kohonen Αιγφξηζκνο κάζεζεο Υαξηνγξάθεζε ρψξσλ πςειψλ δηαζηάζεσλ Αλάιπζε ηεο ζχγθιηζεο [72]

73 Κεθάιαην 5 Αιγόξηζκνη κε επηβιεπόκελεο κάζεζεο 5.1 Δηζαγσγή ηα πξνεγνχκελα θεθάιαηα αλαιχζεθε φιε ε δηαδηθαζία πνπ απαηηείηαη ψζηε απφ ηα δείγκαηα ησλ ζπεξκαηνδσαξίσλ ησλ αζζελψλ, λα θαηαιήμνπκε ζην ιφγν θεξκαηηζκνχ ηνπ DNA βάζεη ησλ θφθθηλσλ θαη κπιε πεξηνρψλ ησλ εηθφλσλ. Σν ιφγν απηφλ ηνλ ρξεηαδφκαζηε γηαηί είλαη ην πην βαζηθφ ζηνηρείν ζηελ πξνζπάζεηα λα θαηαηάμνπκε θάπνηνλ σο γφληκν ή φρη. Δθηφο απηνχ φκσο, καο ελδηαθέξεη λα κάζνπκε κέρξη πνην βαζκφ θεξκαηηζκνχ θάπνηνο εμαθνινπζεί λα είλαη γφληκνο, ή αλ ππάξρεη θάπνηα πεξηνρή ηηκψλ ζηελ νπνία ηα απνηειέζκαηα είλαη ακθηιεγφκελα θαη αλ φλησο ηα απνηειέζκαηα πνπ έρνπκε αληαπνθξίλνληαη ζηελ πξαγκαηηθφηεηα. Πξνηείλνπκε ινηπφλ, κία ζεηξά αιγνξίζκσλ, νη νπνίνη ειπίδνπκε φηη κπνξνχλ λα καο βνεζήζνπλ ζηελ πξνζπάζεηά καο λα βξνχκε έλα θαηψθιη, νκαδνπνηψληαο ηνπο αζζελείο θαη ρξεζηκνπνηψληαο φζν πεξηζζφηεξεο πιεξνθνξίεο έρνπκε ζηε δηάζεζή καο. Οη απινχζηεξνη αιγφξηζκνη, σο πξνο ηηο πιεξνθνξίεο πνπ απαηηνχλ, είλαη νη αιγφξηζκνη νκαδνπνίεζεο. Γελ απαηηνχλ λα γλσξίδνπκε ην απνηέιεζκα, ηελ επίηεπμε θχεζεο ή φρη απφ έλαλ αζζελή. Αλήθνπλ δειαδή ζηνπο αιγφξηζκνπο ηεο κε επηβιεπφκελεο κάζεζεο, θαζψο δε ρξεηάδεηαη ε χπαξμε εηδηθνχ ψζηε λα επηβεβαηψζεη φηη έλαο αζζελήο είλαη νξζά ραξαθηεξηζκέλνο σο γφληκνο ή φρη θαη ην αληίζηξνθν. ε απηφ ην θεθάιαην εμεγείηαη αξρηθά ε δηαθνξά αλάκεζα ζηελ επηβιεπφκελε θαη κε επηβιεπφκελε κάζεζε θαη ζηε ζπλέρεηα πεξηγξάθνληαη ν βαζηθφο αιγφξηζκνο νκαδνπνίεζεο (clustering), ν νπνίνο αλήθεη ζηε κε επηβιεπφκελε κάζεζε θαη νη βαζηθέο παξαιιαγέο ηνπ. ηελ ίδηα θαηεγνξία αλήθνπλ θαη νη απηφ-νξγαλψκελνη ράξηεο Kohonen, νη νπνίνη πεξηγξάθνληαη ζηε ζπλέρεηα. ην επφκελν θεθάιαην παξνπζηάδνληαη αιγφξηζκνη εκη-επηβιεπφκελεο κάζεζεο, νη νπνίνη είλαη νη πην ππνζρφκελνη θαη αλακέλεηαη λα δίλνπλ θαιχηεξα απνηειέζκαηα ζε ζρέζε κε φινπο ηνπο άιινπο, θαζψο έρνπλ ηε δπλαηφηεηα λα αμηνπνηνχλ φπνηα δηαζέζηκε πιεξνθνξία ππάξρεη απφ ηνπο εηδηθνχο γηα ηνπο αζζελείο. [73]

74 5.2 Δπηβιεπόκελε θαη κε επηβιεπόκελε κάζεζε Έζησ φηη έρνπκε έλα ζχλνιν απνηεινχκελν απφ ηηο πεξηπηψζεηο πνπ ζέινπκε λα κειεηήζνπκε. Δίλαη ην ζχλνιν ησλ δεδνκέλσλ καο. Έζησ επίζεο φηη έρνπκε θαη έλα ζχλνιν απφ εηηθέηεο, νη νπνίεο ραξαθηεξίδνπλ ηα δεδνκέλα καο. ζηε δηθή καο πεξίπησζε, ηα δεδνκέλα καο είλαη ηα ραξαθηεξηζηηθά ησλ αζζελψλ, ν ιφγνο θεξκαηηζκνχ δειαδή θαη ηα ραξαθηεξηζηηθά ζπέξκαηνο πνπ κπνξνχκε λα έρνπκε απφ ην ζπεξκνδηάγξακκα. ηελ επηβιεπφκελε κάζεζε, παξέρνληαη ζηνλ αιγφξηζκν θαη νη πεξηπηψζεηο (data points) θαη νη εηηθέηεο πνπ εθπξνζσπνχλ ην κνηίβν πξνο εθκάζεζε ζε θάζε πεξίπησζε. Γειαδή ζηε δηθή καο πεξίπησζε ζα πξέπεη εθηφο ησλ δεδνκέλσλ λα παξέρεηαη θαη ε πιεξνθνξία γηα θάζε αζζελή αλ ηειηθά είλαη ή φρη γφληκνο. Ο ζθνπφο είλαη λα δηδαρζεί έπεηηα ην κνηίβν θαηά ηέηνην ηξφπν ψζηε φηαλ κηα θαηλνχξγηα, πξσηνεκθαληδφκελε πεξίπησζε θάλεη ηελ εκθάληζή ηεο γηα λα ηαμηλνκεζεί, ν αιγφξηζκνο λα κπνξεί λα πξνβιέςεη κηα εηηθέηα γηα ηελ πεξίπησζε απηή, δειαδή ζηελ εκθάληζε ελφο λένπ αζζελνχο, ν αιγφξηζκνο λα κπνξεί λα ηνλ ηαμηλνκήζεη σο γφληκν ή φρη. απηή ηε κέζνδν ππάξρεη θαη ε πηζαλφηεηα ηεο ππεξεθπαίδεπζεο (overfitting) κε ηελ απνκλεκφλεπζε φισλ ησλ εηηθεηψλ γηα θάζε πεξίπησζε, αληί γηα ηελ εθκάζεζε γεληθψλ ζρέζεσλ πνπ λα κπνξνχλ λα ζπζρεηίδνπλ ηηκέο θαη εηηθέηεο. Με ζθνπφ ηελ απνθπγή ηεο ππεξεθπαίδεπζεο, απηνί νη αιγφξηζκνη πξνζπαζνχλ λα πεηχρνπλ κηα ηζνξξνπία κεηαμχ ησλ δεδνκέλσλ εθκάζεζεο πνπ παξέρνληαη έηνηκα θαη ηεο γεληθφηεηαο ηνπ αιγνξίζκνπ. Απηφ αλαθέξεηαη θαη σο Bias/Variance δίιεκκα. Απηά πνπ δίλεη σο απνηειέζκαηα απηή ε θιάζε αιγνξίζκσλ αμηνινγνχληαη ζε έλα ζχλνιν παξαδεηγκάησλ αζχλδεησλ κεηαμχ ηνπο απφ ην ζχλνιν εθπαίδεπζεο. Απηφ ην ζχλνιν νλνκάδεηαη ζχλνιν δνθηκήο. Οη κέζνδνη πνηθίινπλ απφ παξαδνζηαθέο ζηαηηζηηθέο πξνζεγγίζεηο, λεπξσληθά δίθηπα θαη ηειεπηαία, κεραλέο δηαλπζκάησλ ππνζηήξημεο (Support vector machines). Απφ ηελ άιιε πιεπξά, ζηε κε επηβιεπφκελε εθκάζεζε παξέρνληαη ζηνλ αιγφξηζκν κφλν ηα παθέηα δεδνκέλσλ (data points) θαη θακία εηηθέηα, κε ζθνπφ λα βξεη κφλνο ηνπ κηα θαηάιιειε παξνπζίαζε ηεο θαηαλνκήο ησλ δεδνκέλσλ. Μηα θχξηα πξνζέγγηζε ζηελ κε επηβιεπφκελε εθκάζεζε είλαη ην data clustering (ζπζηαδνπνίεζε δεδνκέλσλ). Καη νη δχν κέζνδνη, επηβιεπφκελε θαη κε επηβιεπφκελε κάζεζε, έρνπλ ζπγρσλεπηεί ζήκεξα ζε απηφ πνπ θάπνηνη απνθαινχλ εκη-επηβιεπφκελε (semisupervised) κάζεζε. Σν κε επηβιεπφκελν ηκήκα εθαξκφδεηαη πξψην πάλσ ζηα [74]

75 δεδνκέλα κε ζηφρν λα γίλνπλ θάπνηεο ππνζέζεηο ζρεηηθά κε ηελ θαηαλνκή ησλ δεδνκέλσλ θαη έπεηηα απηέο νη ππνζέζεηο εληζρχνληαη ρξεζηκνπνηψληαο κηα επηβιεπφκελε πξνζέγγηζε. 5.3 Ση είλαη ην clustering ηε ινγνηερλία κπνξνχκε λα βξνχκε έλα κεγάιν αξηζκφ νξηζκψλ γηα ηελ ιέμε clustering (ζπζηαδνπνίεζε), απφ πνιχ απινχο κέρξη ππεξβνιηθά ζχλζεηνπο. Ο πην απιφο νξηζκφο φκσο πνπ πεξηέρνπλ φινη έρεη έλα βαζηθφ γλψξηζκα: ηελ νκαδνπνίεζε παξφκνησλ δεδνκέλσλ ζε ζπζηάδεο (clusters). Έλα πην ιεπηνκεξέο παξάδεηγκα ζα ήηαλ «Απηέο νη (εμαρζέληεο) ζπζηάδεο πξέπεη λα αληηθαηνπηξίδνπλ έλαλ κεραληζκφ ν νπνίνο, αλάκεζα ζε έλα πιήζνο ζηηγκηφηππσλ εκθαλίδεη θάπνηα απφ απηά λα έρνπλ κεγαιχηεξε νκνηφηεηα κεηαμχ ηνπο ζε ζρέζε κε φια ηα ππφινηπα». Έλαο απιφο καζεκαηηθφο νξηζκφο ηνπ clustering είλαη ν αθφινπζνο : έζησ X R m x n έλα παθέην δεδνκέλσλ πνπ αληηπξνζσπεχεη έλα ζχλνιν απφ m ζεκεία xi ζην πεδίν R n. θνπφο είλαη λα δηαρσξηζηεί ην Υ ζε Κ νκάδεο C k έηζη ψζηε φια ηα δεδνκέλα κίαο νκάδαο λα «ηαηξηάδνπλ» πην πνιχ κεηαμχ ηνπο απφ φηη κε δεδνκέλα άιιεο νκάδαο. Κάζε κία απφ ηηο νκάδεο Κ νλνκάδεηαη ζπζηάδα (cluster). Σν απνηέιεζκα ηνπ αιγνξίζκνπ είλαη κία αληηζηνίρηζε X C απφ δεδνκέλα X i ζε clusters C k. O αξηζκφο Κ κπνξεί λα είλαη πξνθαζνξηζκέλνο απφ ηνλ ρξήζηε ή άγλσζηνο, δίλνληαο ηελ δπλαηφηεηα ζηνλ αιγφξηζκν λα ηνλ θαζνξίζεη. 5.4 Μέζνδνη clustering Τπάξρνπλ πνιινί ηξφπνη γηα λα εθθξαζηεί θαη λα ηππνπνηεζεί έλα πξφβιεκα clustering. Καηά ζπλέπεηα, ηα απνηειέζκαηα θαη νη εξκελείεο ηνπο εμαξηψληαη θαηά πνιχ απφ ηνλ ηξφπν κε ηνλ νπνίν ηππνπνηήζεθε αξρηθά ην πξφβιεκα. Γηα παξάδεηγκα, νη ζπζηάδεο (clusters) κπνξνχλ λα είλαη ηειείσο μερσξηζηέο κεηαμχ ηνπο, ή λα ππεξθαιχπηνληαη κεξηθψο. Παξφιν πνπ ζηελ νπζία ππάξρνπλ ηφζεο δηαθνξεηηθέο θαηεγνξίεο αιγφξηζκσλ ζπζηαδνπνίεζεο φζεο θαη νη ίδηνη νη αιγφξηζκνη, κπνξνχλ λα ρσξηζηνχλ ζε δχν βαζηθέο θαηεγνξίεο: - clustering κε παξακέηξνπο - clustering ρσξίο παξακέηξνπο [75]

76 5.5 Παξακεηξηθέο Πξνζεγγίζεηο ε γεληθέο γξακκέο, νη παξακεηξηθέο κέζνδνη έρνπλ ζθνπφ λα ειαρηζηνπνηήζνπλ κία ζπλάξηεζε θφζηνπο ή έλα θξηηήξην βειηηζηνπνίεζεο, ην νπνίν αλαζέηεη έλα θφζηνο ζε θάζε αλάζεζε ελφο ζηηγκηφηππνπ ζε θάπνηα ζπζηάδα. θνπφο απηνχ ηνπ είδνπο αιγνξίζκνπ είλαη λα ιχζεη θάπνην πξφβιεκα βειηηζηνπνίεζεο πξνθεηκέλνπ λα ηθαλνπνηήζεη ην θξηηήξην βειηηζηφηεηαο πνπ επηβάιιεηαη απφ ην κνληέιν, θάηη ην νπνίν ζπλήζσο ζεκαίλεη ειαρηζηνπνίεζε ηεο ζπλάξηεζεο θφζηνπο. Απηνχ ηνπ ηχπνπ ε κέζνδνο ζπλήζσο πεξηιακβάλεη θάπνηεο ππνζέζεηο ζρεηηθά κε ηε δνκή ησλ δεδνκέλσλ. Οη αιγφξηζκνη απηήο ηεο θαηεγνξίαο κπνξνχλ λα ρσξηζηνχλ ζε δχν ππνθαηεγνξίεο: - Μνληέια δεκηνπξγίαο - Μνληέια αλαδφκεζεο Μνληέια δεκηνπξγίαο ή πηζαλνηηθά κνληέια Ζ βαζηθή ηδέα απηνχ ηνπ είδνπο ησλ κνληέισλ είλαη φηη ην δηάλπζκα εηζφδνπ ή ηα ζηηγκηφηππα x 1, x 2,., x m είλαη παξαηεξήζεηο απφ έλα ζχλνιν απφ Κ άγλσζηεο θαηαλνκέο Δ 1, Δ 2,., Δ θ. Αο ππνζέζνπκε φηη ε ππθλφηεηα κίαο παξαηήξεζεο x k ζε ζρέζε κε ηελ θαηαλνκή Δ i δίλεηαη απφ ηνλ ηχπν fi(xk ζ) γηα θάπνην άγλσζην παθέην παξακέηξσλ ζ. Ζ πηζαλφηεηα ην x k λα αλήθεη ζηελ θαηαλνκή Δ i νξίδεηαη σο η i k. Δπεηδή ζπλήζσο θάζε ζεκείν αλήθεη ζε ηνπιάρηζηνλ κία θαηαλνκή, έρνπκε ηνλ πεξηνξηζκφ θνπφο απηήο ηεο κεζφδνπ είλαη λα βξεη ηηο παξακέηξνπο ζ θαη η πνπ λα κεγηζηνπνηνχλ ηελ πηζαλφηεηα [76]

77 Τπάξρνπλ απνδνηηθνί Expectation-Maximization κέζνδνη γηα λα γίλεη ε βειηηζηνπνίεζε. Σν θχξην πξφβιεκα κε απηφ ην κνληέιν είλαη φηη αλ επηηξαπεί ζηηο παξακέηξνπο ζ, πνπ πξέπεη λα εθηηκεζνχλ, λα πνηθίινπλ ειεχζεξα γηα θάζε θαηαλνκή, ηφηε ην λα βξεζεί έλα γεληθφ βέιηηζην κπνξεί λα είλαη πνιχ δαπαλεξφ γηα κεγάια πξνβιήκαηα, ηφζν ζε ρξφλν φζν θαη ζε ρψξν. πλήζσο, απηφ πνπ βξίζθεηαη κεηά είλαη έλα ηνπηθφ ειάρηζην, ην νπνίν εμαξηάηαη θαηά πνιχ απφ ην αξρηθφ ζχλνιν ζπζηάδσλ πνπ απαηηνχλ θάπνηνη αιγφξηζκνη απηνχ ηνπ είδνπο. Έλα θνηλφ κεηνλέθηεκα απηψλ ησλ κνληέισλ (αιιά θαη πνιιψλ άιισλ) είλαη φηη δελ επηιχνπλ ην πξφβιεκα ηνπ «ζνξχβνπ» ζηα δεδνκέλα. Απηφο ν ηχπνο κνληέισλ βαζίδεηαη επίζεο ζηελ ππφζεζε φηη ηα δεδνκέλα πξνέξρνληαη απφ κηα γλσζηή θαηαλνκή (ζπλήζσο Gaussian θαηαλνκή) θάηη ην νπνίν ζε πνιιέο πεξηπηψζεηο δελ ηζρχεη, ή αθφκα ρεηξφηεξα κπνξεί ηα δεδνκέλα λα κελ είλαη θαλ αξηζκεηηθά, νπφηε απηή ε κέζνδνο δελ κπνξεί θαλ λα εθαξκνζηεί. Μάιηζηα, νη πεξηζζφηεξεο βάζεηο δεδνκέλσλ πεξηέρνπλ έλα ζεκαληηθφ πνζφ δεδνκέλσλ θαηεγνξηνπνίεζεο, φπνπ ε έλλνηα ηεο απφζηαζεο δελ είλαη θπζηθή θαη πξέπεη λα νξηζηεί αλάινγα κε ηελ πεξίπησζε. Σα ζπλδπαζηηθά κνληέια δεκηνπξγίαο απφ ηελ άιιε πξνζθέξνπλ πνιιά πιενλεθηήκαηα ράξε ζην γεγνλφο φηη νξίδνπλ κηα πην θαηάιιειε θαηαλνκή πηζαλφηεηαο ζην ρψξν ησλ δεδνκέλσλ. Μπνξνχλ λα ρξεζηκνπνηεζνχλ φρη κφλν γηα εθηίκεζε ππθλφηεηαο ππφ φξνπο, αιιά ιφγσ ηεο πηζαλνηηθήο θχζεο ηνπο παξέρνπλ ηα κέζα γηα αληηκεηψπηζε πξνβιεκάησλ φπσο ησλ ειιηπψλ δεδνκέλσλ To Gaussian Mixture Model ε απηή ηελ πξνζέγγηζε, ηα δεδνκέλα εμεηάδνληαη σο κία αλάκημε πηζαλνηηθψλ Gaussian θαηαλνκψλ, κε θαζεκία απφ απηέο λα αληηπξνζσπεχεη δηαθνξεηηθφ cluster. Ζ ζπλάξηεζε ππθλφηεηαο πηζαλφηεηαο (p.d.f.) κηαο παξαηήξεζεο x ζηελ πεπεξαζκέλε κνξθή αλάκημεο είλαη: [77]

78 φπνπ η είλαη ε παξάκεηξνο αλάκημεο, p i (x; ζ) είλαη ε p.d.f. πνπ αληηζηνηρεί ζηελ θαηαλνκή Δ η θαη ην ζ αληηπξνζσπεχεη ην δηάλπζκα φισλ ησλ αγλψζησλ παξακέηξσλ πνπ ζρεηίδνληαη κε ηηο παξακεηξηθέο θφξκεο πνπ πηνζεηνχληαη γηα απηέο ηηο ππθλφηεηεο Κ ηκεκάησλ (components). Γηα ηελ πεξίπησζε πνιπκεηαβιεηψλ (multivariate) Gaussian ηκεκάησλ, ην ζ απνηειείηαη απφ ηα ζηνηρεία ησλ κέζσλ δηαλπζκάησλ κ η, θαη ηα δηαθξηηά ζηνηρεία ησλ κεηξψσλ ζπλδηαζπνξάο η γηα i=1,..,k. Σν δηάλπζκα ησλ αγλψζησλ (η,ζ) αλήθεη ζε θάπνην ρψξν παξακέηξσλ θαη εθηηκάηαη κε ηελ ρξήζε ηνπ αιγνξίζκνπ ΔΜ. ε απηή ηε ζπγθεθξηκέλε πεξίπησζε Gaussian ηκεκάησλ, ε ππθλφηεηα αλάκημεο (mixture density) πεξηέρεη ηηο αθφινπζεο ξπζκηδφκελεο παξακέηξνπο: η η, κ η, θαη i ( i είλαη ην κεηξψν ζπλδηαζπνξάο πνπ αληηζηνηρεί ζηα ζεκεία ηεο θαηαλνκήο Δ i ) γηα i =1,.,Κ. Ζ αξλεηηθή log-likehood γηα ην ζχλνιν δεδνκέλσλ δίλεηαη απφ : ε νπνία κπνξεί λα ζεσξεζεί σο κία ζπλάξηεζε ζθάικαηνο πνπ ζα ειαρηζηνπνηεζεί. [78]

79 Αλγόπιθμορ βαζικού Gaussian μονηέλος ανάμιξηρ με ηη σπήζη ΕΜ 1. Ξεθίλα κε θάπνηα: (m i 0, i 0, η i 0 ). 2. Έρνληαο (m i t, i t, η i t ) θαζόξηζε ηελ επόκελε επαλάιεςε ρξεζηκνπνηώληαο ηηο αθόινπζεο αλαβαζκίζεηο: όπνπ, 3. Τπνιόγηζε ηελ αιιαγή ζηε ζπλάξηεζε ζθάικαηνο: 4. Αλ Γ tol ζηακάηα, αιιηώο πήγαηλε ζην βήκα 2 [79]

80 C-Means Fuzzy Clustering Αληί λα θαζνξίδεη αλ έλα γεγνλφο ζπλέβε ε φρη, φπσο είλαη θαη ε πεξίπησζε κε ηελ πηζαλφηεηα, ε αζάθεηα κεηξάεη ην βαζκφ ζηνλ νπνίν έλα ζπκβάλ πξνθχπηεη. χκθσλα κε ηνπο ππνζηεξηθηέο ηεο αζάθεηαο, ε αζαθήο πηζαλφηεηα επηηξέπεη ηελ επέθηαζε ηεο παξαδνζηαθήο έλλνηαο ηεο πηζαλφηεηαο. Χο ζπλέπεηα, δηαθνξεηηθέο πηπρέο ηεο αλζξψπηλεο εκπεηξίαο κπνξνχλ λα ραξαθηεξηζηνχλ πην απνηειεζκαηηθά. Σν αλ ε αζάθεηα ή ε πηζαλφηεηα κνληεινπνηεί πην απνδνηηθά ηε θπζηθή δηαδηθαζία πνπ ππάξρεη ζηε θχζε, εμαξηάηαη απνθιεηζηηθά απφ ηε ζπγθεθξηκέλε πεξίπησζε, θαη ζε γεληθέο γξακκέο είλαη άγλσζην. θνπφο ηνπ παξαδνζηαθνχ clustering είλαη λα αλαζέηεη θάζε ζεκείν δεδνκέλνπ (data point) ζε έλα θαη κφλν cluster. Αληίζεηα, ην αζαθέο (fuzzy) clustering αλαζέηεη δηαθνξεηηθέο βαζκίδεο κέινπο ζε θάζε ζεκείν. Έηζη έλα ζεκείν κπνξεί λα είλαη κέινο ζε δηάθνξα clusters. Απηφ δεκηνπξγεί ηελ έλλνηα ησλ αζαθψλ ζπλφξσλ πνπ δηαθέξεη απφ ηελ παξαδνζηαθή έλλνηα ησλ ζαθψο θαζνξηζκέλσλ ζπλφξσλ κεηαμχ ησλ clusters. Ο Bezdek [19] ηζρπξίδεηαη φηη ην κνληέιν ησλ θαιά θαζνξηζκέλσλ ζπλφξσλ δελ απεηθνλίδεη ηελ πεξηγξαθή ησλ πξαγκαηηθψλ δεδνκέλσλ. Ο ηζρπξηζκφο απηφο ηνλ νδήγεζε λα αλαπηχμεη κηα θαηλνχξγηα νηθνγέλεηα αιγνξίζκσλ clustering βαζηζκέλε ζε κία αζαθή επέθηαζε ηνπ θξηηεξίνπ ηνπ ειαρίζηνπ ηεηξαγσληθνχ ζθάικαηνο. Όπσο είλαη ηππηθφ ζηηο παξακεηξηθέο πξνζεγγίζεηο, απηφο ν αιγφξηζκνο επηρεηξεί λα ειαρηζηνπνηήζεη κηα ζπλάξηεζε θφζηνπο, επηηπγράλνληαο έλα ηνπηθφ ειαρηζηνπνηεηή αληί γηα έλα γεληθφ. ηελ πεξίπησζε απηή ε αθφινπζε ζπλάξηεζε θφζηνπο ειαρηζηνπνηείηαη, ζε ζρέζε κε ην U έλα αζαθέο Κ-ηκήκα ηνπ παθέηνπ δεδνκέλσλ, θαη ζε ζρέζε κε ην C έλα ζχλνιν Κ πξσηνηχπσλ (cluster centers): φπνπ q είλαη νπνηνζδήπνηε πξαγκαηηθφο αξηζκφο κεγαιχηεξνο ηνπ 1, X j είλαη ην j- νζηφ n-δηάζηαην ραξαθηεξηζηηθφ δηάλπζκα (feature vector), C i είλαη ην θεληξνεηδέο (centroid) ηνπ i-νζηνχ cluster, d 2 ( X j, C i ) είλαη νπνηνδήπνηε εζσηεξηθφ κεηξηθφ παξάγσγν (inner product metric)(απφζηαζε κεηαμχ x j θαη C i ) M είλαη ν αξηζκφο ησλ [80]

81 data points, K είλαη ν αξηζκφο ησλ clusters. H παξάκεηξνο q είλαη ν εθζέηεο βάξνπο γηα ην u ij θαη ειέγρεη ηελ αζάθεηα ησλ παξαγφκελσλ clusters. Ο αιγφξηζκνο παξαθάησ βαζίδεηαη ζηελ εχξεζε ελφο «θαινχ» αζαθνχο ηκήκαηνο ησλ δεδνκέλσλ, ην νπνίν επηηπγράλεηαη κέζσ κίαο επαλαιεπηηθήο βειηηζηνπνίεζεο ηεο πξνεγνχκελεο ζπλάξηεζεο. Αλγόπιθμορ Fuzzy C-means clustering 1. Δπηιέμηε πξσηαξρηθά centroids C i (πξσηόηππα) 2. Τπνινγίζηε ην βαζκό κέινπο όισλ ησλ δηαλπζκάησλ ραξαθηεξηζηηθώλ ζε όια ηα clusters: 3. Τπνινγίζηε λέα Centroids : θαη αλαβαζκίζηε ηα κέιε, u ij ζε ζύκθσλα κε ην βήκα Αλ max ij u ij -- < tol ζηακαηήζηε, αιιηώο πεγαίλεηε ζην βήκα 3. Δίλαη ζεκαληηθφ λα ζεκεηψζνπκε φηη ν ππνινγηζκφο ηνπ βαζκνχ κέινπο u ij εμαξηάηαη απφ ηνλ νξηζκφ ηεο απφζηαζεο κέηξεζεο d 2 (X j, C k ). [81]

82 5.5.2 Μνληέια Αλαδφκεζεο Όπσο αλαθέξζεθε παξαπάλσ, ηα κνληέια αλαδφκεζεο επηρεηξνχλ ζε γεληθέο γξακκέο λα ειαρηζηνπνηήζνπλ κηα ζπλάξηεζε θφζηνπο. Ζ βαζηθή δηαθνξά αλάκεζα ζηνπο δηάθνξνπο ηχπνπο αλαδνκεηηθψλ αιγνξίζκσλ βξίζθεηαη ζηηο ηερληθέο πνπ ρξεζηκνπνηνχλ γηα λα κνληεινπνηήζνπλ θαη λα ειαρηζηνπνηήζνπλ ηε ζπλάξηεζε θφζηνπο. Μηα απφ ηηο πην βαζηθέο ηερληθέο clustering είλαη ν θιαζζηθφο K-means αιγφξηζκνο, πνπ βξίζθεηαη ζε ρξήζε γηα αξθεηέο δεθαεηίεο. Δίλαη πηζαλφηαηα ν παηέξαο φιεο απηήο ηεο νηθνγέλεηαο αιγνξίζκσλ. Ο K-means ζρεκαηίδεη clusters ζε αξηζκεηηθά πεδία, ρσξίδνληαο ηα ζηηγκηφηππα ζε αζχλδεηα clusters. Έρνπλ πξνηαζεί δηάθνξεο παξαιιαγέο ηνπ K-means φπνπ ε ζπλάξηεζε Δπθιείδεηαο απφζηαζεο αληηθαζίζηαηαη απφ άιιε απφζηαζε. Έρεη απνδεηρζεί φηη ε απφδνζε απηήο ηεο κεζφδνπ εμαξηάηαη θαηά πνιχ απφ ηελ απφζηαζε πνπ ρξεζηκνπνηείηαη [20]. Παξφιν πνπ απηφο ν αιγφξηζκνο είλαη εχθνινο ζηελ πινπνίεζε ηνπ, έρεη ην κεηνλέθηεκα φηη γίλεηαη άπιεζηνο κε ηελ έλλνηα φηη ηείλεη λα θνιιάεη ζην ηνπηθφ ειάρηζην, ην νπνίν ζπλήζσο εμαξηάηαη απφ ην παξερφκελν αξρηθφ θέληξν. Απηφ θάλεη ην ζπγθεθξηκέλν αιγφξηζκν πνιχ επαίζζεην ζηα αξρηθά θέληξα. Χο κία ελαιιαθηηθή ζην πξφβιεκα ηνπ ηνπηθνχ ειαρίζηνπ έρνπλ εθαξκνζηεί ζηα πξνβιήκαηα βειηηζηνπνίεζεο ηνπ clustering δηάθνξεο ζηνραζηηθέο κέζνδνη κε ζηελή ζπγγέλεηα κε ηελ θπζηθή, φπσο παξαιιαγέο ηεο πξνζνκνησκέλεο αλφπηεζεο (simulated annealing). Αληί γηα ηελ αλάζεζε ησλ ζεκείσλ ζην θνληηλφηεξν θέληξν ηνπ ηνπηθνχ ρψξνπ, ηα ζεκεία κπνξνχλ λα ραξηνγξαθεζνχλ ζε έλα ρψξν πςειφηεξσλ δηαζηάζεσλ ζε ζρέζε κε ηνλ ηνπηθφ ρψξν δεδνκέλσλ, κε κε γξακκηθή ραξηνγξάθεζε. Γελ είλαη αλάγθε λα ππνινγηζηεί ε ραξηνγξάθεζε αθξηβψο. Αληίζεηα, κπνξεί λα ππνινγηζηεί κέζσ κηαο ζπγθεθξηκέλεο kernel ζπλάξηεζεο πνπ ζρεηίδεη ηα εζσηεξηθά παξάγσγα απφ ηνλ αξρηθφ ρψξν κε ηα εζσηεξηθά παξάγσγα απφ ηνλ ρψξν πςειφηεξσλ δηαζηάζεσλ. Απηή ε ηδέα νδήγεζε ζηελ νηθνγέλεηα αιγνξίζκσλ πνπ είλαη γλσζηή σο αιγφξηζκνη ηνπνγξαθηθνχ clustering K-means θαη K-median Ο αιγφξηζκνο K-means, πηζαλφηαηα ν πξψηνο ησλ αιγνξίζκσλ clustering πνπ πξνηάζεθε, βαζίδεηαη ζε κία πνιχ απιή ηδέα. Παίξλνληαο έλα ζεη αξρηθψλ clusters, αλαζέηνπκε θάζε ζεκείν ζε θάπνην απφ απηά ηα cluster. Έπεηηα, ην θέληξν απφ θάζε [82]

83 cluster αληηθαζίζηαηαη απφ ην κέζν ζεκείν ηνπ cluster. Απηά ηα δχν απιά βήκαηα επαλαιακβάλνληαη κέρξη λα επηηεπρζεί ζχγθιηζε. Έλα ζεκείν αλαηίζεηαη ζην cluster ην νπνίν είλαη θνληά ζηελ επθιείδεηα απφζηαζε απφ ην ζεκείν. Παξφιν πνπ ν K-means έρεη ην κεγάιν πιενλέθηεκα ηεο εχθνιεο πινπνίεζεο, έρεη επίζεο θαη δχν κεγάια κεηνλεθηήκαηα. Πξψηνλ, κπνξεί λα απνδεηρζεί εμαηξεηηθά αξγφο, αθνχ ζε θάζε βήκα πξέπεη λα ππνινγηζηεί ε απφζηαζε κεηαμχ θάζε ζεκείνπ θαη θάζε cluster, θάηη πνπ είλαη πνιχ δαπαλεξφ ζε κεγάια ζχλνια δεδνκέλσλ. Γεχηεξνλ, απηή ε κέζνδνο είλαη πνιχ επαίζζεηε ζηα αξρηθά δνζέληα clusters, σζηφζν ηα ηειεπηαία ρξφληα απηφ ην πξφβιεκα έρεη αληηκεησπηζηεί κε θάπνην βαζκφ επηηπρίαο. Αλ αληί γηα ηελ επθιείδεηα απφζηαζε ρξεζηκνπνηεζεί ε απφζηαζε ηεο 1-λνξκαο: Πξνθχπηεη κηα παξαιιαγή ηνπ K-means, ε νπνία απνθαιείηαη K-median. ην [3] νη ζπγγξαθείο ηζρπξίδνληαη φηη απηή ε κέζνδνο είλαη ιηγφηεξν επαίζζεηε ζηηο απνκαθξπζκέλεο ηηκέο (outliers) απφ φηη ε παξαδνζηαθή K-means ιφγσ ησλ ραξαθηεξηζηηθψλ ηεο 1-λφξκαο. Καη νη δχν αιγφξηζκνί παξνπζηάδνληαη παξαθάησ. Αλγόπιθμορ Κ-means (Median) Παίξλνληαο C i j,.., C k j αθόινπζα δύν βήκαηα: ζηελ επαλάιεςε j, ππνινγίζηε C 1 j+1,.., C k j+1 κε ηα Α) Cluster assignment : Γηα θάζε H`i, I = 1,..t, πξνζδηνξίζηε l(i) ηέηνην ώζηε ην C j l(i) λα είλαη ην θνληηλόηεξν ζην H`i ζηελ Δπθιείδεηα (one) λόξκα. Β) Cluster center update: Γηα l = 1,., k επηιέμηε C j+1 l σο έλα κέζν (median) γηα όια ηα Η`η πνπ έρνπλ αλαηεζεί ζην C j l. ηακαηήζηε όηαλ C j+1 l = C j l. [83]

84 5.6 Με παξακεηξηθέο πξνζεγγίζεηο Γχν θαιά αληηπξνζσπεπηηθά παξαδείγκαηα ηεο κε παξακεηξηθήο πξνζέγγηζεο είλαη ν ζπζζσξεπηηθφο (agglomerative) θαη o δηαηξεηηθφο (divisive) αιγφξηζκνο, πνπ επίζεο απνθαινχληαη ηεξαξρηθνί αιγφξηζκνη, θαη παξάγνπλ δελδξνδηαγξάκκαηα (dendograms). Καη νη δχν κέζνδνη βαζίδνληαη ζηηο κεηξήζεηο ησλ αλνκνηνηήησλ ζην ηξέρσλ ζχλνιν απφ clusters ζε θάζε επαλάιεςε. Οη ζπζζσξεπηηθνί αιγφξηζκνη ελνπνηνχλ, ζπγρσλεχνπλ θάπνηα απφ ηα cluster, αλάινγα κε ην πφζν παξφκνηα είλαη, ελψ νη δηαηξεηηθνί αιγφξηζκνη ηα δηαρσξίδνπλ. Παξαθάησ παξνπζηάδνληαη νη βαζηθέο ηδέεο ηνπ ζπζζσξεπηηθνχ αιγφξηζκνπ, αιιά φιεο απηέο νη ηδέεο εθαξκφδνληαη θαη ζην δηαηξεηηθφ επίζεο. Έλα δελδξφγξακκα είλαη απιά έλα δέληξν ην νπνίν δείρλεη πνηα cluster ζπγρσλεχηεθαλ ζε θάζε βήκα. Μπνξεί εχθνια λα απνθνπεί ζε επηιεγκέλεο ζπλδέζεηο γηα λα πάξνπκε clusters ή νκάδεο επηζπκεηνχ κεγέζνπο ή αθηίλαο. Απηφο ν αξηζκφο απφ clusters ή νκάδεο κπνξεί επίζεο λα πξνζδηνξηζηεί σο κία ζπλάξηεζε κεξηθψλ ζπγρσλεπκέλσλ θαησθιίσλ (threshold). H ηδέα είλαη φηη κε έλα θαηψθιη ζην κεδέλ, ν αξηζκφο ησλ clusters είλαη ίδηνο κε ηνλ αξηζκφ ησλ ζεκείσλ δεδνκέλσλ, θαη κε θάπνην πςειφηεξν θαηψθιη ηα δεδνκέλα ηκεκαηνπνηνχληαη ζε έλα θαη κφλν cluster. Αθνχ ην δελδξφγξακκα είλαη κφλν έλα δέληξν, ε δνκή ηνπ είλαη επίζεο εχθνιν λα παξαρζεί θαη λα απνζεθεπζεί. Σν θχξην κεηνλέθηεκα απηήο ηεο πξνζέγγηζεο είλαη φηη νιφθιεξν ην δελδξφγξακκα είλαη επαίζζεην ζε πξνεγνχκελεο (θαη πηζαλφλ εζθαικέλεο) ζπγρσλεχζεηο cluster, δειαδή ηα δεδνκέλα δελ κπνξνχλ λα αιιάμνπλ cluster εθφζνλ έρεη γίλεη ε αλάζεζή ηνπο. Έλα ζεκαληηθφ πιενλέθηεκα ησλ κε παξακεηξηθψλ κεζφδσλ clustering είλαη φηη δελ θάλνπλ ππνζέζεηο γηα ηελ θαηαλνκή ησλ δεδνκέλσλ. Δπίζεο, δελ ρξεηάδνληαη κηα αθξηβήο αλαπαξάζηαζε ησλ δεδνκέλσλ ζε Δπθιείδεηα κνξθή. Απαηηνχλ κφλν έλα κεηξείν κε ηηο αλά δεχγε νκνηφηεηεο βαζηζκέλεο ζε κία πξνθαζνξηζκέλε απφζηαζε. Χζηφζν έλα κεηξείν πνπ πεξηέρεη ηηο αλά δεχγε νκνηφηεηεο κπνξεί λα απαηηεί πνιχ ρψξν απνζήθεπζεο, ζπλήζσο ηεο ηάμεο ν(m 2 ), φπνπ m είλαη ν αξηζκφο ησλ ζεκείσλ δεδνκέλσλ πνπ πξέπεη λα ρσξηζηνχλ ζε ζπζηάδεο, απνηξέπνληαο ηελ εθαξκνγή ηνπ αιγνξίζκνπ ζε πνιιά πξνβιήκαηα φπνπ ην παθέην δεδνκέλσλ πξνο ζπζηαδνπνίεζε είλαη κεγάιν. Όηαλ νη ζπζηάδεο επηθαιχπηνληαη ή δηαθέξνπλ ζεκαληηθά ζην ζρήκα, ηελ ππθλφηεηα ή ην κέγεζνο, νη κέζνδνη απηήο ηεο θιάζεο είλαη γλσζηφ φηη έρνπλ θησρή απφδνζε. Γηα λα αληηκεησπηζηνχλ θάπνηα απφ απηά ηα πξνβιήκαηα έρνπλ πξνηαζεί πνιιέο παξαιιαγέο αιγνξίζκσλ απηήο ηεο θιάζεο. [84]

85 5.6.1 Οη αιγφξηζκνη ηεξαξρηθήο ζπζηαδνπνίεζεο Έλαο αληηπξνζσπεπηηθφο αιγφξηζκνο απηνχ ηνπ είδνπο είλαη ε ηεξαξρηθή ζπζηαδνπνίεζε. Απηφο ν αιγφξηζκνο είλαη έλαο ζπζζσξεπηηθφο αιγφξηζκνο κε αξθεηέο παξαιιαγέο αλάινγα κε ηελ κεηξηθή πνπ ρξεζηκνπνηείηαη γηα λα κεηξεζνχλ νη απνζηάζεηο κεηαμχ ησλ ζπζηάδσλ. Ζ Δπθιείδεηα απφζηαζε ρξεζηκνπνηείηαη ζπλήζσο γηα αλεμάξηεηα ζεκεία. Γελ ππάξρνπλ απηά θξηηήξηα γηα ην πνηα απφζηαζε πξέπεη λα ρξεζηκνπνηεζεί θαη θαίλεηαη φηη εμαξηάηαη θπξίσο απφ ην παθέην ησλ δεδνκέλσλ. Αλάκεζα ζηηο πην ρξεζηκνπνηεκέλεο παξαιιαγέο ηεο ηεξαξρηθήο ζπζηαδνπνίεζεο πνπ βαζίδεηαη ζε δηαθνξεηηθέο κεηξήζεηο ηεο απφζηαζεο είλαη θαη νη αθφινπζεο: 1. πζηαδνπνίεζε ζχλδεζεο ησλ κέζσλ ηηκψλ Ζ αλνκνηφηεηα κεηαμχ ησλ ζπζηάδσλ ππνινγίδεηαη κε ηε ρξήζε κέζσλ ηηκψλ. Ζ κέζε απφζηαζε ππνινγίδεηαη απφ ηελ απφζηαζε θάζε ζεκείνπ κηαο ζπζηάδαο κε θάζε έλα ζεκείν κηαο άιιεο ζπζηάδαο. Οη δχν ζπζηάδεο κε ηελ ρακειφηεξε κέζε απφζηαζε ελψλνληαη γηα λα ζρεκαηίζνπλ ηελ λέα ζπζηάδα 2. πζηαδνπνίεζε ζχλδεζεο θεληξνεηδψλ (centroids) Απηή ε παξαιιαγή ρξεζηκνπνηεί ην θεληξνεηδέο ηεο νκάδαο σο ην κέζν. Σν θεληξνεηδέο νξίδεηαη σο ην κέζν κίαο νκάδαο ζεκείσλ. Δηθόλα 29 - πζηαδνπνίεζε ζύλδεζεο κέζσλ 3. πζηαδνπνίεζε νιηθήο ζχλδεζεο (κέζνδνο κέγηζηνπ ή καθξχηεξνπ γείηνλα) [85]

86 Ζ αλνκνηφηεηα κεηαμχ δχν νκάδσλ είλαη ίζε κε ηελ κεγαιχηεξε αλνκνηφηεηα κεηαμχ ελφο κέινπο κηαο ζπζηάδαο i θαη ελφο κέινπο κίαο ζπζηάδαο j. Απηή ε κέζνδνο ηείλεη λα παξάγεη πνιχ ζηελέο ζπζηάδεο παξφκνησλ θαηαζηάζεσλ. 4. πζηαδνπνίεζε κνλήο ζχλδεζεο (κέζνδνο ειάρηζηνπ ή θνληηλφηεξνπ γείηνλα) Ζ αλνκνηφηεηα κεηαμχ ησλ ζπζηάδσλ είλαη ε ειάρηζηε αλνκνηφηεηα κεηαμχ ησλ κειψλ ησλ ζπζηάδσλ. Απηή ε κέζνδνο παξάγεη εθηελείο αιπζίδεο πνπ ζρεκαηίδνπλ ραιαξέο, άηαθηεο ζπζηάδεο. 5. Μέζνδνο Ward: Ο βαζκφο κέινπο ζπζηάδαο αλαηίζεηαη ππνινγίδνληαο ην νιηθφ ζχλνιν ησλ ηεηξαγσληθψλ απνθιίζεσλ απφ ην κέζν (mean) κηαο ζπζηάδαο. Σν θξηηήξην γηα ζπγρψλεπζε είλαη φηη ζα πξέπεη λα παξάγεη ηελ κηθξφηεξε δπλαηή αχμεζε ζην άζξνηζκα ησλ ηεηξαγσληθψλ ζθαικάησλ. ην εηθφλα 30, ν θφθθηλνο θαη ν κπιε ζηαπξφο (+) δείρλνπλ ηα θέληξα ησλ αληίζηνηρσλ ζπζηάδσλ, ελψ ηα ζεκεία θάζε ζπζηάδαο είλαη καξθαξηζκέλα κε κπιε θαη θφθθηλεο ηειείεο αληίζηνηρα. Δηθόλα 30 - πζηαδνπνίεζε ζύλδεζεο θεληξνεηδώλ [86]

87 Αλγόπιθμορ ζςζηαδοποίηζηρ μονήρ ζύνδεζηρ Έζησ όηη D(i,j) είλαη ε απόζηαζε κεηαμύ ησλ ζπζηάδσλ i θαη j θαη Ν(i) ν θνληηλόηεξνο γείηνλαο ηεο ζπζηάδαο i. 1. Ξεθηλάκε κε αξηζκό ζπζηάδσλ ίζν κε ηνλ αξηζκό ησλ ζεκείσλ 2. Γηα θάζε δεπγάξη ζπζηάδσλ (i,j) ππνινγίδνπκε ηελ απόζηαζε D(i,j) 3. Γηα θάζε ζπζηάδα i ππνινγίδνπκε ην Ν(i) 4. Δπαλαιακβάλνπκε κέρξη λα θηάζνπκε ζηνλ επηζπκεηό αξηζκό ζπζηάδσλ (α) Οξίδνπκε i,j ηέηνηα ώζηε ην D(i,j) λα ειαρηζηνπνηεζεί (β) πγρσλεύνπκε ηηο ζπζηάδεο i θαη j (γ) Αλαλεώλνπκε θάζε D(i,j) θαη Ν(i) όπνπ είλαη απαξαίηεην 5. Σειεηώλνπκε ηελ επαλάιεςε 5.7 Απηό-νξγαλσκέλα δίθηπα Σα απηφ-νξγαλσκέλα δίθηπα είλαη έλα είδνο ηερλεηψλ λεπξσληθψλ δηθηχσλ, ηα νπνία εθπαηδεχνληαη ρξεζηκνπνηψληαο κε-επηβιεπφκελε κάζεζε ψζηε λα παξάμνπλ κία ιίγσλ δηαζηάζεσλ απεηθφληζε ηνπ ρψξνπ εηζφδνπ ησλ δεηγκάησλ εθπαίδεπζεο. Απηή ε απεηθφληζε νλνκάδεηαη ράξηεο. Ζ βαζηθή δηαθνξά αλάκεζα ζηα απηφ-νξγαλσκέλα δίθηπα θαη ηα ζπκβαηηθά είλαη φηη ε ζσζηή έμνδνο δελ κπνξεί λα πξνζδηνξηζηεί εθ ησλ πξνηέξσλ, θαη έηζη δελ είλαη δπλαηή ε αξηζκεηηθή κέηξεζε ηνπ εχξνπο ηνπ ζθάικαηνο ραξηνγξάθεζεο. Δπίζεο, ρξεζηκνπνηνχλ κία ζπλάξηεζε γεηηλίαζεο ψζηε λα δηαηεξνχλ ηηο ηνπνινγηθέο ηδηφηεηεο ηνπ ρψξνπ εηζφδνπ. Χζηφζν, ε δηαδηθαζία κάζεζεο νδεγεί ζην πξνζδηνξηζκφ θαιά νξηζκέλσλ παξακέηξσλ ηνπ δηθηχνπ, φπσο θαη ζηα λεπξσληθά, γηα κηα δεδνκέλε εθαξκνγή. [87]

88 5.7.1 Υαξηνγξάθεζε πεξηνρήο εηζφδνπ Όηαλ ρξεζηκνπνηείηαη έλα απηφ-νξγαλσκέλν δίθηπν παξνπζηάδεηαη έλα δηάλπζκα εηζφδνπ ζε θάζε βήκα. Απηά ηα δηαλχζκαηα απνηεινχλ ην «πεξηβάιινλ» ηνπ δηθηχνπ. Δηθόλα 31- Η ζπλάξηεζε f : A -> B Κάζε λέα είζνδνο πξνθαιεί κηα πξνζαξκνγή ησλ παξακέηξσλ. Αλ απηέο νη ηξνπνπνηήζεηο ειεγρζνχλ ζσζηά, ην δίθηπν κπνξεί λα δεκηνπξγήζεη έλα είδνο εζσηεξηθήο αλαπαξάζηαζεο ηνπ πεξηβάιινληνο. Γεδνκέλνπ φηη ζε απηά ηα δίθηπα νη θάζεηο ηεο κάζεζεο θαη ηεο «παξαγσγήο» ( production ) κπνξνχλ λα επηθαιχπηνληαη, ε αλαπαξάζηαζε κπνξεί λα αλαλεψλεηαη ζπλερψο. Σν πην γλσζηφ θαη δεκνθηιέο κνληέιν απηφ-νξγαλσκέλσλ δηθηχσλ είλαη ν ράξηεο δηαηήξεζεο ηνπνινγίαο, πνπ πξνηάζεθε απφ ηνλ Teuvo Kohonen. Σα απνθαινχκελα δίθηπα Kohonen είλαη έλαο ζπλδπαζκφο θάπνησλ απφ ηηο ηδέεο πνπ αλαπηχρζεθαλ απφ ηνπο Rosenblatt, von der Malsburg θαη άιινπο εξεπλεηέο. Αλ έλαο ρψξνο εηζφδνπ πξφθεηηαη λα επεμεξγαζηεί απφ έλα λεπξσληθφ δίθηπν, ην πξψην ζεκαληηθφ ζέκα είλαη ε δνκή ηνπ ρψξνπ απηνχ. Έλα λεπξσληθφ δίθηπν κε πξαγκαηηθέο εηζφδνπο ππνινγίδεη κία ζπλάξηεζε f πξνζδηνξηζκέλε απφ έλαλ ρψξν εηζφδνπ Α ζε έλαλ ρψξν εμφδνπ Β. Ζ πεξηνρή πνπ ε f νξίδεηαη κπνξεί λα θαιπθζεί απφ έλα δίθηπν Kohonen θαηά ηέηνην ηξφπν ψζηε φηαλ, γηα παξάδεηγκα, επηιέγεηαη έλα δηάλπζκα εηζφδνπ απφ ηελ πεξηνρή α 1, φπσο είλαη ζηελ εηθφλα 31, κφλν κία πεξηνρή ηνπ δηθηχνπ ελεξγνπνηείηαη. Απηή ε ηκεκαηνπνίεζε θαηά ηελ νπνία ν ρψξνο εηζφδνπ θαηεγνξηνπνηείηαη ζε ππνπεξηνρέο απνθαιείηαη επίζεο δηάγξακκα ή ράξηεο ηνπ ρψξνπ εηζφδνπ. Σα δίθηπα Kohonen καζαίλνπλ λα δεκηνπξγνχλ ράξηεο ηνπ ρψξνπ εηζφδνπ κε έλα απην-νξγαλψκελν ηξφπν. [88]

89 5.7.2 Υάξηεο δηαηήξεζεο ηνπνινγίαο ζηνλ εγθέθαιν Σν κνληέιν ηνπ Kohonen έρεη έλα βηνινγηθφ θαη καζεκαηηθφ ππφβαζξν. Δίλαη επξέσο γλσζηφ ζηε λεπξνβηνινγία φηη πνιιέο δνκέο ηνπ εγθεθάινπ έρνπλ κία γξακκηθή ή επίπεδε ηνπνινγία πνπ εθηείλνληαη ζε κία ή δχν δηαζηάζεηο. Ζ αηζζεηήξηα εκπεηξία απφ ηελ άιιε είλαη πνιπδηάζηαηε. Έλα απιφ γεγνλφο, φπσο ε αληίιεςε ελφο ρξψκαηνο, πξνυπνζέηεη ηελ αιιειεπίδξαζε κεηαμχ ηξηψλ δηαθνξεηηθψλ εηδψλ απφ αηζζεηήξεο θσηφο. Σα κάηηα ζπιιακβάλνπλ επίζεο πξφζζεηεο πιεξνθνξίεο γηα ηε δνκή, ηε ζέζε θαη ηε ζχλζεζε ησλ αληηθεηκέλσλ. Σν εξψηεκα είλαη: πψο νη επίπεδεο δνκέο ζηνλ εγθέθαιν θαηαθέξλνπλ λα επεμεξγάδνληαη ηέηνηα πνιπδηάζηαηα ζήκαηα; Απηή ε ζεκαληηθή εξψηεζε κπνξεί λα πεξηγξαθεί κε δχν παξαδείγκαηα. Ο νπηηθφο θινηφο είλαη κία θαιά κειεηεκέλε πεξηνρή ζην πίζσ κέξνο ηνπ αλζξψπηλνπ εγθεθάινπ. Πνιινί λεπξψλεο ηεο ζπλεξγάδνληαη γηα λα απνθσδηθνπνηήζνπλ θαη λα επεμεξγαζηνχλ ηηο νπηηθέο εληππψζεηο. Δίλαη ελδηαθέξνλ λα γλσξίδνπκε φηη ε νπηηθή πιεξνθνξία ραξηνγξαθείηαη σο κία δηζδηάζηαηε πξνβνιή ζηνλ θινηφ, παξά ηελ πνιππινθφηεηα ηεο νδνχ απφ ηνλ θαθφ σο ηελ δνκή ηνπ θινηνχ. Ζ παξαθάησ εηθφλα δείρλεη έλα ράξηε ηνπ νπηηθνχ θινηνχ πνιχ φκνην κε απηφλ πνπ είρε ήδε αλαθαιπθζεί απφ ηνλ Gordon Holmes ζηηο αξρέο ηνπ αηψλα. Σν δηάγξακκα ζηα δεμηά αλαπαξηζηά νιφθιεξν ην νπηηθφ πεδίν θαη ηηο δηάθνξεο πεξηνρέο ηνπ. Ο εζσηεξηθφο θχθινο αλαπαξηζηά ην θέληξν ηνπ νπηηθνχ πεδίνπ, ηα πεξηερφκελα ηνπ νπνίνπ ζπιιακβάλνληαη απφ ην βνζξίν ηεο ψρξαο θειίδαο (fovea). Σν δηάγξακκα ζηα αξηζηεξά ρξεζηκνπνηεί ηξείο δηαθνξεηηθέο ζθηάζεηο γηα λα δείμεη ηελ ζρέζε αλάκεζα ζηηο πεξηνρέο ηνπ νπηηθνχ θινηνχ θαη ηηο πεξηνρέο ηνπ νπηηθνχ πεδίνπ. Γχν ζεκαληηθά θαηλφκελα κπνξνχλ λα παξαηεξεζνχλ. Πξψηνλ, ην γεγνλφο φηη γεηηνληθέο πεξηνρέο ηνπ νπηηθνχ πεδίνπ επεμεξγάδνληαη απφ γεηηνληθέο πεξηνρέο ηνπ νπηηθνχ θινηνχ, θαη δεχηεξνλ, φηη ε επηθάλεηα ηνπ νπηηθνχ θινηνχ πνπ δεζκεχεηαη γηα ηελ επεμεξγαζία ηεο πιεξνθνξίαο ηνπ βνζξίνπ είλαη δπζαλάινγα κεγάιε. Απηφ ζεκαίλεη φηη ηα ζήκαηα απφ ην θέληξν ηνπ νπηηθνχ πεδίνπ επεμεξγάδνληαη κε κεγαιχηεξε ιεπηνκέξεηα θαη αλάιπζε ζε ζρέζε κε ηα ζήκαηα ηεο πεξηθέξεηαο ηνπ νπηηθνχ πεδίνπ. Ζ νπηηθή νμχηεηα απμάλεηαη απφ ηα άθξα πξνο ην θέληξν ηνπ νπηηθνχ πεδίνπ. [89]

90 Δηθόλα 32- Η ραξηνγξάθεζε ηνπ νπηηθνύ πεδίνπ ζην ινβό Ο νπηηθφο θινηφο είλαη ινηπφλ έλα είδνο ράξηε ηνπ νπηηθνχ πεδίνπ. Αθνχ απηφο ν ράξηεο είλαη κία πξνβνιή ηνπ νπηηθνχ πεξηβάιινληνο ζηνπο ζθαηξηθά δηαηεηαγκέλνπο αηζζεηήξεο θσηφο ηνπ καηηνχ, κία ηέιεηα αληαπφθξηζε αλάκεζα ζην κάηη θαη ηνλ θινηφ ζα απαηηνχζε κία ζθαηξηθή δηακφξθσζε ηνπ θινηνχ. Χζηφζν, ην θέληξν ηνπ νπηηθνχ πεδίνπ ραξηνγξαθείηαη ζε κία πνιχ κεγαιχηεξε πεξηνρή ηνπ θινηνχ. Μία εθηεηακέλε κνξθή ινηπφλ ηνπ θινηνχ ζα παξνπζηαδφηαλ σο παξακνξθσκέλε ζθαίξα. Απηή ε ππφζεζε έρεη απνδεηρζεί απφ θπζηνινγηθά πεηξάκαηα. Φπζηθά δελ έρεη γίλεη δπλαηφ κέρξη ζήκεξα λα δηεξεπλεζνχλ φιεο νη ιεπηνκέξεηεο πνπ αθνξνχλ ηνλ ηξφπν κε ηνλ νπνίν ν θινηφο επεμεξγάδεηαη ηα ζήκαηα πνπ δέρεηαη απφ ηα αηζζεηήξηα φξγαλα. Χζηφζν, θαίλεηαη αζθαιέο λα ππνζέζνπκε φηη ε πξψηε παξνπζίαζε πνπ δεκηνπξγείηαη γηα ηνλ θφζκν απφ ηνλ εγθέθαιν είλαη ηνπνινγηθή, θαηά ηελ νπνία νη εμσηεξηθέο ρσξνηαμηθέο ζρέζεηο ραξηνγξαθνχληαη κε παξφκνηεο ρσξνηαμηθέο ζρέζεηο θαη ζηνλ εγθέθαιν. Κάπνηνο κπνξεί λα λνκίζεη φηη ε ραξηνγξάθεζε ηνπ αηζζεηνχ θφζκνπ ζηνλ εγθέθαιν είλαη γελεηηθά πξνθαζνξηζκέλε. Έρεη απνδεηρζεί φκσο κε πεηξάκαηα ζε γάηεο πνπ ήηαλ ηπθιέο απφ ην έλα κάηη φηη ε [90]

91 πεξηνρή ηνπ θινηνχ πνπ ζε θπζηνινγηθέο γάηεο επεμεξγάδεηαη ηηο πιεξνθνξίεο απηνχ ηνπ καηηνχ, ζηηο ηπθιέο γάηεο ε πεξηνρή απηή αλαπξνζαξκφδεηαη θαη επεμεξγάδεηαη ηηο πιεξνθνξίεο ηνπ άιινπ καηηνχ. Απηφ ζπκβαίλεη κφλν φηαλ ε γάηα ράλεη ηελ φξαζή ηεο ελψ ν εγθέθαινο βξίζθεηαη αθφκα ζε αλάπηπμε θαη δηαζέηεη αξθεηή πιαζηηθφηεηα. Απηφ ζεκαίλεη φηη ε ηνπνινγηθή αληαπφθξηζε αλάκεζα ζην κάηη θαη ηνλ θινηφ δελ είλαη πιήξσο πξνζδηνξηζκέλε γελεηηθά αιιά απαηηείηαη θαη ε εκπεηξία ησλ αηζζήζεσλ γηα λα αλαπηπρζεί ην ζσζηφ λεπξηθφ θχθισκα. Σν κνληέιν ηνπ Kohonen γηα ηα απηφ-νξγαλσκέλα δίθηπα πεγαίλεη θαηεπζείαλ ζηελ θαξδηά απηνχ ηνπ ζέκαηνο. Σν κνληέιν ηνπ δνπιεχεη κε ζηνηρεία φρη πνιχ δηαθνξεηηθά απφ απηά πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη απφ άιινπο εξεπλεηέο. Σν πην ζρεηηθφ απφ απηά είλαη ν νξηζκφο ηεο γεηηνληάο ελφο ππνινγηζηηθνχ θφκβνπ. Σα δίθηπα ηνπ Kohonen είλαη δηαηάμεηο ππνινγηζηηθψλ θφκβσλ νξγαλσκέλεο ζε κνλνδηάζηαηα, δηζδηάζηαηα, ή πνιπδηάζηαηα επίπεδα. Οη κνλάδεο έρνπλ θάζεηεο ζπλδέζεηο κε δηάθνξεο γεηηνληθέο κνλάδεο. 5.8 Σν κνληέιν Kohonen Θα αλαιχζνπκε παξαθάησ θάπνηα παξαδείγκαηα ησλ νξγαλσκέλσλ δηαηάμεσλ, γλσζηψλ σο δίθηπα Kohonen. Σν πιέγκα ησλ ππνινγηζηηθψλ ζηνηρείσλ καο επηηξέπεη λα αλαγλσξίζνπκε ηνπο άκεζνπο γείηνλεο ελφο θφκβνπ. Απηφ είλαη πνιχ ζεκαληηθφ, αθνχ θαηά ηελ κάζεζε ηα βάξε ησλ ππνινγηζηηθψλ κνλάδσλ θαη ησλ γεηηφλσλ ηνπο αλαλεψλνληαη. θνπφο απηήο ηεο καζεζηαθήο πξνζέγγηζεο είλαη λα κάζνπλ νη γεηηνληθέο κνλάδεο λα αληηδξνχλ ζε ζήκαηα ζρεηηθά κεηαμχ ηνπο Αιγφξηζκνο κάζεζεο Θεσξνχκε ην πξφβιεκα ραξηνγξάθεζεο ελφο n-δηάζηαηνπ ρψξνπ κε ηε ρξήζε κίαο κνλνδηάζηαηεο αιπζίδαο θφκβσλ Kohonen. Οη θφκβνη είλαη φινη ηαμηλνκεκέλνη θαη αξηζκεκέλνη απφ 1 σο m. Κάζε θφκβνο γίλεηαη ε n-δηάζηαηε είζνδνο x θαη ππνινγίδεη ηελ αλάινγε ελεξγνπνίεζε. Σα n-δηάζηαηα δηαλχζκαηα βάξνπο w 1, w 2,, w m ρξεζηκνπνηνχληαη γηα ηνλ ππνινγηζκφ. θνπφο ηεο δηαδηθαζίαο ραξηνγξάθεζεο είλαη λα κάζεη θάζε θφκβν λα εμεηδηθεχεηαη ζε δηαθνξεηηθέο πεξηνρέο ηνπ ρψξνπ εηζφδνπ. Όηαλ κία είζνδνο απφ κία ηέηνηα πεξηνρή εηζάγεηαη ζην δίθηπν, ν [91]

92 αλάινγνο θφκβνο πξέπεη λα ππνινγίζεη ηε κέγηζηε ελεξγνπνίεζε. Ο αιγφξηζκνο Kohonen ρξεζηκνπνηείηαη σο εγγχεζε φηη απηφ ην απνηέιεζκα ζα επηηεπρζεί. Δηθόλα 33- Έλα κνλνδηάζηαην πιέγκα ησλ θόκβσλ ππνινγηζκνύ Έλαο θφκβνο Kohonen ππνινγίδεη ηελ επθιείδεηα απφζηαζε κεηαμχ κηαο εηζφδνπ x θαη ηνπ δηαλχζκαηνο βάξνπο ηεο, w. Απηφο ν λένο νξηζκφο ηεο ελεξγνπνίεζεο είλαη πην θαηάιιεινο γηα νξηζκέλεο εθαξκνγέο θαη επίζεο πην εχθνινο λα απεηθνληζηεί. ην κνλνδηάζηαην δίθηπν Kohonen, ε γεηηνληά αθηίλαο 1 ελφο θφκβνπ ζηελ k-νζηή ζέζε απνηειείηαη απφ ηνπο θφκβνπο ζηηο ζέζεηο k-1 θαη k+1. Οη κνλάδεο ζηα άθξα ηεο δηάηαμεο έρνπλ αζπκκεηξηθνχο γείηνλεο. Ζ γεηηνληά αθηίλαο r ηνπ θφκβνπ k απνηειείηαη απφ φιεο ηνπο θφκβνπο πνπ βξίζθνληαη κέρξη θαη r ζέζεηο δεμηά θαη αξηζηεξά ζηελ αιπζίδα. Ζ κάζεζε Kohonen ρξεζηκνπνηεί κηα ζπλάξηεζε γεηηλίαζεο θ, ηεο νπνίαο ε ηηκή θ(i,k) αληηπξνζσπεχεη ηελ ηζρχ ηεο ζχδεπμεο κεηαμχ ηνπ θφκβνπ i θαη ηνπ θφκβνπ k θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο δηαδηθαζίαο εθπαίδεπζεο. Μία απιή επηινγή είλαη λα νξίζνπκε θ(i,k) = 1 γηα φιεο ηνπο θφκβνπο i κίαο γεηηνληάο αθηίλαο r ελφο θφκβνπ k, θαη θ(i,k) = 0 γηα φιεο ηνπο ππφινηπνπο θφκβνπο. Ο αιγφξηζκνο γηα ηα δίθηπα Kohonen είλαη ν εμήο: [92]

93 Αλγόριθμος μάθησης Kohonen Αρχή: Σα n-δηάζηαηα δηαλύζκαηα βάξνπο w 1, w 2,, w m ησλ m ππνινγηζηηθώλ κνλάδσλ επηιέγνληαη ηπραία. Δπηιέγνληαη κία αξρηθή αθηίλα r, κία ζηαζεξά κάζεζεο ε, θαη κία ζπλάξηεζε γεηηλίαζεο θ. Βήμα 1: Δπηιέγνπκε έλα δηάλπζκα εηζόδνπ μ επηιέγνληαο ηελ θαηάιιειε θαηαλνκή πηζαλνηήησλ από ην δηάζηεκα εηζόδνπ. Βήμα 2: Δπηιέγεηαη ν θόκβνο k κε ηελ κέγηζηε δηέγεξζε (δειαδή ηνλ θόκβν ηνπ νπνίνπ ε απόζηαζε κεηαμύ w i θαη μ είλαη ε ειάρηζηε, I = 1,,m). Βήμα 3: Σα δηαλύζκαηα βάξνπο αλαλεώλνληαη κε ηελ ρξήζε ηεο ζπλάξηεζεο γεηηλίαζεο θαη ηνπ θαλόλα αλαλέσζεο w i w i + εθ(i,k)(μ-w i ), γηα i = 1,.,m Βήμα 4: ηακαηάκε όηαλ θηάζνπκε ζην κέγηζην αξηζκό επαλαιήςεσλ, αιιηώο ηξνπνπνηνύκε ηα ε θαη θ όπσο είλαη πξνγξακκαηηζκέλν θαη ζπλερίδνπκε κε ην βήκα 1 Οη ηξνπνπνηήζεηο ησλ δηαλπζκάησλ βάξνπο (βήκα 3) ηα σζνχλ πξνο ηελ θαηεχζπλζε ηεο εηζφδνπ μ. Δπαλαιακβάλνληαο απηή ηελ απιή δηαδηθαζία πνιιέο θνξέο, πεξηκέλνπκε λα θαηαιήμνπκε ζε κία νκνηφκνξθε θαηαλνκή ησλ δηαλπζκάησλ βάξνπο ζην δηάζηεκα εηζφδνπ (αλ νη είζνδνη έρνπλ επίζεο επηιερζεί εληαία). Ζ αθηίλα ηεο γεηηνληάο κεηψλεηαη ζχκθσλα κε έλα πξνεγνχκελν ζρέδην, ην νπνίν απνθαινχκε πιάλν. Σν απνηέιεζκα θάζε θνξά πνπ έλαο θφκβνο αλαλεψλεηαη είλαη λα αλαλεψλνληαη καδί ηνπ θαη νη γεηηνληθνί θφκβνη. Αλ ην δηάλπζκα βάξνπο ελφο θφκβνπ ειθχεηαη ζε κία πεξηνρή ηνπ δηαζηήκαηνο εηζφδνπ, ειθχνληαη επίζεο θαη νη γεηηνληθνί θφκβνη αιιά ζε κηθξφηεξν βαζκφ. Καηά ηελ δηάξθεηα ηεο κάζεζεο ηφζν ην κέγεζνο ηεο γεηηνληάο φζν θαη ε ηηκή ηνπ θ κεηψλνληαη ζηαδηαθά, έηζη ψζηε ε επηξξνή θάζε θφκβνπ ζηνπο γεηηνληθνχο ηνπ λα κεηψλεηαη. Ζ ζηαζεξά κάζεζεο ειέγρεη ην εχξνο ηεο αλαλέσζεο ζηα βάξε θαη κεηψλεηαη θαη απηή ζηαδηαθά. Σν γεληθφ απνηέιεζκα ηνπ επηιεγκέλνπ πιάλνπ είλαη ε παξαγσγή κεγάισλ ζπλδέζεσλ ζηελ αξρή ηεο εθπαίδεπζεο θαη κηθξφηεξσλ ζην ηέινο. Ζ εηθφλα 34 δείρλεη ηα απνηειέζκαηα ελφο πεηξάκαηνο κε κνλνδηάζηαην δίθηπν Kohonen. Κάζε θφκβνο αληηπξνζσπεχεηαη απφ κία ηειεία. Ζ πεξηνρή εηζφδνπ είλαη έλα ηξίγσλν. ην ηέινο ηεο δηαδηθαζίαο κάζεζεο ηα δηαλχζκαηα βάξνπο θζάλνπλ ζε κία θαηαλνκή πνπ κεηαηξέπεη θάζε θφκβν ζε έλαλ αληηπξφζσπν ελφο κηθξνχ ηκήκαηνο ηεο πεξηνρήο εηζφδνπ. Ζ θφκβνο ζηελ θάησ δεμηά γσλία γηα παξάδεηγκα, [93]

94 είλαη απηφο πνπ αληαπνθξίλεηαη κε ην κεγαιχηεξν εξεζηζκφ γηα δηαλχζκαηα εηζφδνπ ζηελ ζθηαζκέλε πεξηνρή. Αλ πηνζεηήζνπκε κηα ζηξαηεγηθή ελεξγνπνίεζεο ηνπ ηχπνπ winner takes all, ηφηε απηή ν θφκβνο ζα είλαη ε κνλαδηθφο πνπ ζα ελεξγνπνηεζεί. Δηθόλα 34- Η ραξηνγξάθεζε κηαο ηξηγσληθήο πεξηνρήο Σν ίδην πείξακα κπνξεί λα πξαγκαηνπνηεζεί γηα πεξηνρέο εηζφδνπ κε δηαθνξεηηθφ ζρήκα. Ζ αιπζίδα ησλ κνλάδσλ Kohonen ζα πάξεη ηελ κνξθή κίαο απνθαινχκελεο θακπχιεο Peano. Σα δίθηπα Kohonen κπνξνχλ επίζεο λα δηεπζεηεζνχλ θαη ζε πνιπδηάζηαηα πιέγκαηα. Μία ελδηαθέξνπζα επηινγή είλαη έλα επίπεδν δίθηπν, φπσο θαίλεηαη ζην παξαθάησ ζρήκα. Ζ γεηηνληά αθηίλαο r ηνπ θφκβνπ k απνηειείηαη ζε απηή ηελ πεξίπησζε απφ φινπο ηνπο άιινπο θφκβνπο πνπ βξίζθνληαη ζε απφζηαζε r πάλσ, θάησ δεμηά θαη αξηζηεξά ζην πιέγκα. Με ηελ ζπλζήθε απηή, ε γεηηνληά ελφο θφκβνπ είλαη έλα ηεηξάγσλν ηκήκα ηνπ δηθηχνπ. Βέβαηα κπνξνχκε λα νξίζνπκε πην εμεηδηθεπκέλεο γεηηνληέο, αιιά απηή ε απιή πξνζέγγηζε είλαη θαη ε πην ρξήζηκε γηα ηελ πιεηνςεθία ησλ εθαξκνγψλ. ηελ εηθφλα 35 βιέπνπκε ηελ νκαινπνίεζε ελφο δηζδηάζηαηνπ δηθηχνπ Kohonen ζε κία ηεηξάγσλε πεξηνρή εηζφδνπ. Σα ηέζζεξα δηαγξάκκαηα δείρλνπλ ηελ θαηάζηαζε ηνπ δηθηχνπ κεηά απφ 100, 1000, 5000 θαη επαλαιήςεηο αληίζηνηρα. ην δεχηεξν δηάγξακκα παξνπζηάδνληαη πνιιέο επαλαιήςεηο επηθαιππηφκελεο γηα λα απνδψζνπλ κία αίζζεζε ηεο δηαδηθαζίαο επαλάιεςεο. Μηαο θαη ζην πείξακα απηφ ε δηάζηαζε ηε πεξηνρήο εηζφδνπ είλαη ίδηα κε ηελ δηάζηαζε ηνπ δηθηχνπ, ε δηαδηθαζία κάζεζεο θζάλεη ζε έλα πνιχ ηθαλνπνηεηηθφ απνηέιεζκα. [94]

95 Δηθόλα 35- Η ραξηνγξάθεζε ελόο ηεηξαγώλνπ κε δηζδηάζηαην πιέγκα. Σν δηάγξακκα πάλσ δεμηά δείρλεη κεξηθέο επηθαιππηόκελεο επαλαιήςεηο ηεο δηαδηθαζίαο κάζεζεο. Σν δηάγξακκα θάησ είλαη ε ηειηθή θαηάζηαζε κεηά από 1000 επαλαιήςεηο. Ζ θαηάιεμε ζε κία ζηαζεξή θαηάζηαζε δελ είλαη ηφζν εχθνιε ζηελ πεξίπησζε ησλ πνιπδηάζηαησλ δηθηχσλ. Τπάξρνπλ πνιινί παξάγνληεο πνπ παίδνπλ ξφιν ζηε δηαδηθαζία ζχγθιηζεο, φπσο ην κέγεζνο ηεο επηιεγκέλεο γεηηνληάο, ην ζρήκα ηεο ζπλάξηεζεο γεηηνληάο θαη ν πξνγξακκαηηζκφο πνπ έρεη γίλεη γηα λα ηξνπνπνηεί απηά ηα δχν. Ζ εηθφλα 36 δείρλεη έλα παξάδεηγκα ελφο δηθηχνπ ην νπνίν έρεη θζάζεη ζε κία θαηάζηαζε πνιχ δχζθνιε ζην λα επηιπζεί. Καηά ηελ δηάξθεηα ηεο εθπαίδεπζεο εκθαλίζηεθε έλαο θφκπνο. Αλ ε πιαζηηθφηεηα ηνπ δηθηχνπ έρεη πέζεη ζε ρακειφ επίπεδν, απηφο ν θφκπνο δελ ζα ιπζεί κε πεξαηηέξσ εθπαίδεπζε, φπσο δείρλνπλ νη επηθαιπκκέλεο επαλαιήςεηο [95]

96 Δηθόλα 36- Δπίπεδν δίθηπν κε έλα δεζκό Έρνπλ δνζεί πνιιέο απνδείμεηο ζχγθιηζεο γηα κνλνδηάζηαηα δίθηπα Kohonen ζε κνλνδηάζηαηεο πεξηνρέο εηζφδνπ, δελ ππάξρεη σζηφζν θάπνηα απφδεημε γηα ζχγθιηζε ζε πνιπδηάζηαηα δίθηπα Υαξηνγξάθεζε ρψξσλ πςειψλ δηαζηάζεσλ πλήζσο φηαλ ρξεζηκνπνηείηαη έλα εκπεηξηθφ παθέην δεδνκέλσλ δελ γλσξίδνπκε ηελ πξαγκαηηθή ηνπ δηάζηαζε. Αθφκα θαη αλ ηα δηαλχζκαηα εηζφδνπ είλαη δηάζηαζεο n, κπνξεί ηα δεδνκέλα λα δεκηνπξγνχλ δηαθιαδψζεηο ζε κία ρακειφηεξε δηάζηαζε. ε γεληθέο γξακκέο δελ είλαη εκθαλέο πνηα δηάζηαζε δηθηχνπ πξέπεη λα ρξεζηκνπνηεζεί γηα έλα ζπγθεθξηκέλν παθέην δεδνκέλσλ. Απηφ ην γεληθφ πξφβιεκα νδήγεζε ηνλ Kohonen λα ζθεθηεί ηη γίλεηαη φηαλ έλα ρακειψλ δηαζηάζεσλ δίθηπν ρξεζηκνπνηείηαη γηα ηελ ραξηνγξάθεζε κηαο πςειφηεξσλ δηαζηάζεσλ πεξηνρήο. ηελ πεξίπησζε απηή, ην δίθηπν πξέπεη λα δηπισζεί πξνθεηκέλνπ λα γεκίζεη ην δηαζέζηκν ρψξν. Ζ παξαθάησ εηθφλα δείρλεη ην απνηέιεζκα ελφο πεηξάκαηνο, ζην νπνίν έλα δηζδηάζηαην δίθηπν ρξεζηκνπνηήζεθε γηα λα ραξηνγξαθήζεη έλα ηξηζδηάζηαην θνπηί. Όπσο κπνξνχκε λα δνχκε, ην δίθηπν εθηείλεηαη ζηελ x θαη y δηάζηαζε, αιιά δηπιψλεη ζηε z δηάζηαζε. Οη κνλάδεο ηνπ δηθηχνπ πξνζπαζνχλ φζν ην δπλαηφλ θαιχηεξα λα γεκίζνπλ ηνλ δηαζέζηκν ρψξν, αιιά ε ηεηξάγσλε γεηηνληά ζέηεη θάπνηνπο πεξηνξηζκνχο ζηε δηαδηθαζία απηή. [96]