ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Πολυμορφισμοί και μεταλλάξεις του γονιδίου AQP7 σε προεφηβικά και εφηβικά παιδιά με νοσογόνο παχυσαρκία σε σύγκριση με αντίστοιχα λεπτόσωμα ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Αλίκη Παππά ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ, Ιούλιος 2013 Σελίδα 1

2 ΕΓΚΡΙΣΗ ΜΕ ΥΠΟΓΡΑΦΕΣ Τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Αναστάσιος Μίντζας Πάολα Ρόχας Βασιλική Γκρέκα-Σπηλιώτη Καθηγητής Λέκτορας Καθηγήτρια Ιατρικής Σχολής Ο Επιβλέπων Καθηγητής Αναστάσιος Μίντζας Η έγκριση της διατριβής για την απόκτηση Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης από το Τμήμα Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. Ν. 5343/1392, άρθρο 202. Σελίδα 2

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η εκπόνηση της συγκεκριμένης διπλωματικής εργασίας, διεξήχθη στο Εργαστήριο Μοριακής Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας, της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών με υπεύθυνη την κα Βασιλική Γκρέκα- Σπηλιώτη. Θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες στην καθηγήτρια και μέντορά μου κα Βασιλική Γκρέκα- Σπηλιώτη, η οποία μου έδωσε την ευκαιρία να εκπονήσω τη διπλωματική μου εργασία στο εργαστήριό της σε ένα τόσο ενδιαφέρον και πρωτοποριακό θέμα. Η βοήθειά της ήταν απερίσπαστο κομμάτι της εργαστηριακής μου εμπειρίας και της εμπειρίας μου στον ερευνητικό κόσμο, καθώς μου προσέφερε τα εφόδια για την υπόλοιπη ζωή μου. Επιπρόσθετα, θέλω να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου κο Αναστάσιο Μίντζα, ο οποίος, με δίδαξε καινούριες μεθόδους στο εργαστήριό του και με βοήθησε στην εκπόνηση της παρούσας εργασίας. Θα ήταν μεγάλη μου παράλειψη αν δεν ευχαριστούσα και την κα Πάολα Ρόχας, που με την πολύτιμη καθοδήγηση και βοήθειά της έφερα εις πέρας αυτή τη διπλωματική εργασία, καθώς και για τη μεγάλη της υπομονή για όλες τις φορές που την απασχόλησα με απορίες και διευκρινίσεις. Ένα μεγάλο ευχαριστώ χρωστάω στην οικογένειά μου και στον αρραβωνιατικό μου Δημήτρη που με στήριξαν και με καθησύχαζαν σε περιόδους μεγάλου άγχους και αγωνίας, καθώς και για την κατανόηση που έδειξαν για το χρόνο που δεν τους αφιέρωσα ώστε να διεκπεραιώσω τη διπλωματική μου εργασία. Σελίδα 3

4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 6 ABSTRACT ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΟΡΙΟΘΕΤΗΣΗΣ ΔΜΣ ΚΑΙ ΠΑΙΔΙΑ ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΣΥΝΕΠΕΙΕΣ ΤΗΣ ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑΣ ΛΙΠΩΔΗΣ ΙΣΤΟΣ ΑΝΑΤΟΜΙΑ- ΙΣΤΟΛΟΓΙΑ ΛΙΠΟΓΕΝΕΣΗ ΚΑΙ ΛΙΠΟΛΥΣΗ ΑΚΟΥΑΠΟΡΙΝΕΣ (AQPS) ΝΕΡΟ ΚΑΙ ΑΚΟΥΑΠΟΡΙΝΕΣ ΑΝΑΚΑΛΥΨΗ ΑΚΟΥΑΠΟΡΙΝΩΝ ΆΝΘΡΩΠΟΣ-ΑΚΟΥΑΠΟΡΙΝΕΣ ΔΟΜΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΔΙΑΠΕΡΑΤΟΤΗΤΑ ΝΕΡΟΥ ΕΝΑΝΤΙ ΓΛΥΚΕΡΟΛΗΣ AQP ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΑΡΤΥΡΕΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ DNA PCR (ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ) ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΗΣ PCR ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ PCR ΑΠΟ ΤΟ ΠΗΚΤΩΜΑ ΤΗΣ ΑΓΑΡΟΖΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΤΟΥ DNA ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΓΙΑ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΙ ΜΟΝΟΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΟΣ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ ΣΤΗ ΘΕΣΗ -2291(A2710G) ΜΟΝΟΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΟΣ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ ΣΤΗ ΘΕΣΗ -2219(C2782A) ΜΟΝΟΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΟΣ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ ΣΤΗ ΘΕΣΗ -2091(C2910Α) ΜΟΝΟΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΟΣ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ ΣΤΗ ΘΕΣΗ -1884(C3117T) ΜΟΝΟΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΟΣ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ ΣΤΗ ΘΕΣΗ -1123(C3878T) ΜΟΝΟΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΟΣ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ ΣΤΗ ΘΕΣΗ -953(Α4048G) ΣΥΖΗΤΗΣΗ Σελίδα 4

5 4.1. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Σελίδα 5

6 Περίληψη Εισαγωγή: Η παιδική παχυσαρκία είναι ένας από τους κύριους παράγοντες κινδύνου για ανάπτυξη: Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου ΙΙ, δυσλιπιδαιμίας και καρδιοαγγειακών παθήσεων. O λιπώδης ιστός θεωρείται ως ένα όργανο ενδοκρινές και παρακρινές, το οποίο εκκρίνει ποικίλες κυτταροκίνες και άλλους σημαντικούς μεταβολικούς παράγοντες. Η λιπογένεση και η λιπόλυση διενεργούνται στα λιποκύτταρα με σκοπό να διατηρηθεί η ενεργειακή ισορροπία. Τα λιποκύτταρα αποθηκεύουν τριγλυκερίδια όταν η ενεργειακή πρόσληψη είναι σε υψηλά επίπεδα, ενώ σε αντίθετη περίπτωση, τα λιποκύτταρα απελευθερώνουν στο αίμα ελεύθερα λιπαρά οξέα και γλυκερόλη, διαδικασία που επιτυγχάνεται μέσω της υδρόλυσης των τριγλυκεριδίων. Η ακουαπορίνη-7 [aquaporin-7 (AQP7)] είναι μια ακουαγλυκεροπορίνη, η οποία ρυθμίζει τη μεταφορά της γλυκερόλης μέσα κι έξω από το λιποκύτταρο, όπως επίσης και τη διακίνηση του νερού. Η AQP7 εντοπίζεται περιπυρηνικά. Όταν γίνεται λιπόλυση, η επινεφρίνη αυξάνεται και παράλληλα αυξάνει τα επίπεδα του AMP, διαμέσου της ενεργοποίησης των αδρενεργικών υποδοχέων οι οποίοι διαδοχικά ενεργοποιούν την πρωτεϊνική κινάση Α. Η πρωτεϊνική κινάση Α με τη σειρά της φωσφορυλιώνει την περιλιπίνη, η οποία καθιστά ικανή τη φωσφορυλιωμένη ορμονο-ευαίσθητη λιπάση να υδρολύσει τα τριγλυκερίδια σε λιπαρά οξέα και γλυκερόλη, προκαλώντας τη μετακίνηση της AQP7 στην πλασματική μεμβράνη ώστε να επιτευχθεί η απελευθέρωση της γλυκερόλης. Σκοπός: 1) Η ανίχνευση πολυμορφισμών και μεταλλάξεων στον υποκινητή του γονιδίου της AQP7 σε προεφηβικά και εφηβικά παιδιά με νοσογόνο παχυσαρκία σε σύγκριση με αντίστοιχα λεπτόσωμα παιδιά. 2) Η συσχέτιση των επιπέδων στον ορό του αίματος των παιδιών αυτών της γλυκόζης νηστείας, τριγλυκεριδίων, χοληστερίνης, HDL και LDL και των δεικτών γενικευμένης παχυσαρκίας (ΒΜΙ %) και κεντρικής παχυσαρκίας (περίμετρο μέσης) με τυχόν πολυμορφισμούς ή μεταλλάξεις στον υποκινητή της AQP7. Μέθοδοι και Υλικά: Συλλέχθησαν αίματα από 64 λεπτόσωμα και 38 παχύσαρκα προεφηβικά και εφηβικά παιδιά. Συλλέχθηκαν τα στοιχεία του ιστορικού και της φυσικής εξέτασης (ΒΜΙ %, περίμετρο μέσης, Tanner στάδιο εφηβείας,) και των επιπέδων γλυκόζης, τριγλυκεριδίων, χοληστερίνης, HDL και LDL. Πραγματοποιήθηκε απομόνωση DNA (NucleoSpin Blood Quick Pure- Σελίδα 6

7 Macherey Nagel kit). Έγινε PCR για τον υποκινητή του γονιδίου της AQP7 (4 σετ εκκινητών: PR1a, PR1b, PR2a και PR2b). Έγινε ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR και gel extraction (Sigma Aldrich, Sigma-GenΕlute Gel Extraction kit). Τέλος, τα δείγματα στάλθηκαν για αλληλούχιση στη Λάρισα, στη Σχολή επιστημών Υγείας, στο Τμήμα Ανοσολογίας της Ιατρικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. Αποτελέσματα: Μετά την αλληλούχιση των δειγμάτων, πραγματοποιήθηκε σύγκριση της αλληλουχίας του κάθε δείγματος, με την αλληλουχία του υποκινητή όπως έχει ταυτοποιηθεί από τους Kondo H. et al. (2002) και βρέθηκαν οι εξής μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί [single nucleotide polymorphisms (SNPs)] στον υποκινητή του γονιδίου της AQP7: στη θέση -2291(A2710G) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7, όπου βρέθηκε αλλαγή βάσης από αδενίνη σε γουανίνη, στη θέση -2219(C2782A), όπου βρέθηκε αλλαγή βάσης από κυτοσίνη σε αδενίνη, στη θέση -2091(C2910Α), όπου βρέθηκε αλλαγή βάσης από κυτοσίνη σε αδενίνη, στη θέση -1884(C3117T), όπου βρέθηκε αλλαγή βάσης από κυτοσίνη σε θυμίνη, στη θέση -1123(C3878T), όπου βρέθηκε αλλαγή βάσης από κυτοσίνη σε θυμίνη και στη θέση -953(Α4048G), όπου βρέθηκε αλλαγή βάσης από αδενίνη σε γουανίνη. Πραγματοποιήθηκε συσχέτιση των ατόμων που έχουν τους μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς στις παραπάνω θέσεις με τα κλινικά τους χαρακτηριστικά και βρέθηκε στατιστικώς σημαντικά ότι στα άτομα που έχουν τους πολυμορφισμούς στις θέσεις -2219(C2782A),-2091(C2910Α) και -1884(C3117T) η HDL χοληστερόλη μειώνεται (p<0.05). Επίσης, βρέθηκε ότι υπάρχει στατιστικώς σημαντική αύξηση του ΒΜΙ επί τοις εκατό, στα άτομα που έχουν τον πολυμορφισμό -1123(C3878T), (p=0,035). Τέλος, βρέθηκε ότι υπάρχει στατιστικώς σημαντική αύξηση στην περίμετρο μέσης επί τοις εκατό, στα άτομα που έχουν τον πολυμορφισμό -953(Α4048G), (p=0,033) και ότι τα άτομα αυτά έχουν συσχέτιση με την ύπαρξη οικογενειακού ιστορικού για Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου ΙΙ (p=0,033). Συμπεράσματα: 1) Ο συνδυασμός δύο ή και περισσότερων πολυμορφισμών στις παρακάτω περιοχές του υποκινητή της AQP7: -2219(C2782A), -2091(C2910Α) και -1884(C3117T), έχει βρεθεί σε 7 μάρτυρες. Τέσσερις από τους μάρτυρες αυτούς έχουν οικογενειακό ιστορικό για Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου ΙΙ και 3 έχουν περίμετρο μέσης μεγαλύτερη του 75%. Επίσης, βρέθηκε ότι τα άτομα Σελίδα 7

8 που έχουν τους πολυμορφισμούς αυτούς, έχουν μειωμένη HDL χοληστερόλη. Τα ευρήματα αυτά πιθανώς καταδεικνύουν τη μεταγενέστερη εξέλιξη των παιδιών αυτών σε παχύσαρκους ενήλικες, μιας και εμφανίζουν αρκετά στοιχεία του Μεταβολικού Συνδρόμου. 2) Οι πολυμορφισμοί του υποκινητή του γονιδίου της AQP7-1123(C3878T) και -953(Α4048G), βρέθηκαν κυρίως σε παχύσαρκα παιδιά. Οι πολυμορφισμοί αυτοί βρίσκονται σε περιοχές όπου προσδένεται ο μεταγραφικός παράγοντας C/EBPβ και από μελέτες έχει βρεθεί ότι ο -953(Α4048G) μειώνει την έκφραση της AQP7 και σχετίζεται με την εμφάνιση Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου ΙΙ. Τα παιδιά που είχαν τον πολυμορφισμό -1123(C3878T) είχαν αυξημένο BMI% και τα παιδιά που είχαν τον πολυμορφισμό -953(Α4048G) είχαν συσχέτιση με την ύπαρξη οικογενειακού ιστορικού για Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου ΙΙ και αυξημένη περίμετρο μέσης επί τοις εκατό. Τα ευρύματα αυτά σε συνάρτηση με τα ευρύματα προηγούμενων μελετών στους ενήλικες καταδεικνύουν τη μειωμένη έκφραση της AQP7 στα παιδιά αυτά, τον κίνδυνο για την μελλοντική ανάπτυξη σοβαρής Παχυσαρκίας και Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου ΙΙ. Σελίδα 8

9 Abstract Introduction: Childhood obesity is one of the main risk factors for the development of Diabetes Mellitus II, dyslipidemia and cardiovascular diseases. Adipose tissue is considered as an endocrine and paracrine organ that secretes a variety of cytokines and other important metabolic factors. Ljpogenesis and ljpolysis are held in adipocytes with a view to maintain the energy balance. Adipocytes store triglycerides when the energy uptake is in high levels, while in opposite case, adipocytes release free fatty acids and glycerol in the blood, a process that is achieved via the hydrolysis of triglycerides. Aquaporin -7 (AQP 7) is an aqua-glyceroporin, which regulates the transport of glycerol inside and outside from adipocytes, as also the distribution of water. AQP 7 is located perinuclear. During ljpolysis, the epinephrine is increased and this event increases the levels of AMP, through the activation of adrenergic agonists that successively activate protein kinase A. Protein kinase A phosporylates perilipin, which renders capable the phosporylated hormone-sensitive lipase to hydrolize triglycerides in fatty acids and glycerol, causing the translocation of AQP 7 in the plasma membrane so that is achieved the release of glycerol. of Aim: 1) The detection of polymorphisms and mutations in the promoter of gene AQP 7 in prepubertal and adolescent children with pathogenic obesity compared to respectively lean children. 2) The cross-correlation of levels in the serum of blood of this children of glucose of fast, triglycerides, cholesterol, HDL and LDL and indicators of generalised obesity (BMI %) and central obesity (waist circumference) with any chance of polymorphisms or mutations in the promoter of AQP 7. Methods and Materials: Collected blood from 64 lean and 38 obese prepubertal and adolescent children. Collected the data of history and natural examination (BMI %, waist circumference, Tanner stage of puberty) and levels of glucose, triglycerides, cholesterol, HDL and LDL. DNA extraction by the NucleoSpin Blood Quick Pure - Macherey Nagel kit. PCR for the promoter of gene of AQP7 with 4 set of primers: PR 1 a, PR 1 b, PR 2 a and PR 2 b. Elecrophoresis of PCR products and gel extraction (sigma Aldrich, -genelute Gel Extraction kit). Finally, the samples were sent for sequencing in Larissa, in the Σελίδα 9

10 Faculty of sciences of Health, in the Department of Immunology of Medicine of Thessaly University. Results: Afterwards the sequencing of samples, the sequence of each sample, was compared with the sequence of the promoter as it identified from Kondo H. et al. (2002). The following single nucleotide polymorphisms (SNPs) were found in the promoter of gene of AQP7: in the site -2291(A2710 G) of the promoter of gene of AQP 7, was found change of base from adenine to guanine, in the site (C 2782 A), was found change of base from cytosine to adenin, in the site (C 2910A), was found change of base from cytosine to adenin, in the site (C 3117 T), was found change of base from cytosine to thymine, in the site -1123(C 3878 T), was found change of base from cytosine to thymine and in the site -953(A4048 G), was found change of base from adenine to guanine. After cross-correlation of individuals that has the above SNPs with clinical characteristically, was found statistically significant decreased HDL cholesterol in the individuals that have the polymorphisms in the sites -2219(C 2782 A), (C 2910A) and (C 3117 T ), (p < 0.05). Also, was found statistically significant increase of BMI%, in the individuals that have the polymorphism (C 3878 T), (p = 0,0 35). Finally, was found statistically significant increase in the waist circumference% (WC%), in the individuals that have the polymorphism -953(A4048 G), (p = 0,0 33) and that these individuals have crosscorrelation with the existence of familial history for Diabetes Mellitus II (p = 0,033). Conclusions: 1) The combination of two or even more polymorphisms in the following regions of promoter of AQP 7: (C 2782 A), -2091(C 2910A) and -1884(C 3117 T), has been found in 7 lean children. Four of these children have familial history for Diabetes Mellitus II and 3 have WC% > 75%. Also, was found that the individuals that have these polymorphisms, have decreased HDL cholesterol. These findings show the later development of these children in obese adults, as they present enough elements of Metabolic Syndrome. 2) The polymorphisms of promoter of gene of AQP7-1123(C 3878 T) and -953(A4048 G), were found mainly in obese children. These polymorphisms are found in regions where was bind the transcription factor C / EBP b and studies has been found that the -953(A4048 G) decreases the expression of AQP 7 and is related Σελίδα 10

11 with the appearance of Diabetes Mellitus II. Children that had the polymorphism (C 3878 T) had increased BMI % and children that had the polymorphism - 953(A4048 G) had cross-correlation with the existence of familial history of Diabetes Mellitus II and increased WC%. These findings in combination with findings of previous studies in adults show the decreased expression of AQP7 in these children, the danger for the future development of serious Obesity and Diabetes Mellitus II. Σελίδα 11

12 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σελίδα 12

13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Παχυσαρκία Η παχυσαρκία είναι ένα σημαντικό δημοσιο-υγειονομικό και οικονομικό πρόβλημα που μαστίζει όλη την υφήλιο. Ο αριθμός των ατόμων που πάσχουν από παχυσαρκία αυξάνεται χρόνο με το χρόνο, σε όλες τις περιοχές παγκοσμίως και περιλαμβάνει άτομα όλων των ηλικιών και των δύο φύλων (Rosenbaum et al, 1997). Ως παχυσαρκία ορίζεται η κατάσταση του μη φυσιολογικού ή υπερβάλλοντος λίπους, συγκεντρωμένου στο λιπώδη ιστό σε επίπεδο που επηρεάζει αρνητικά την υγεία. Σχήμα 1. Το ποσοστό των παιδιών ηλικίας μεταξύ 5 και 7 χρόνων ήταν 5 φορές υψηλότερο το , σε σύγκριση με το ποσοστό των παιδιών της ίδιας ηλικίας το Το 1998 ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας χαρακτήρισε την παιδική παχυσαρκία ως μια παγκόσμια επιδημία (WHO, 1998). Σύμφωνα με στοιχεία του AHA (American Heart Association) το 2013, από έρευνες του NHANES (National Health and Nutrition Examination Surveys) ( ) που πραγματοποιήθηκαν σε παιδιά, εφήβους και ενήλικες στις ΗΠΑ, η παιδική παχυσαρκία συνεχίζει να αυξάνεται με ρυθμούς επιδημίας. Το ποσοστό των παιδιών ηλικίας μεταξύ 5 και 7 χρόνων ήταν 5 φορές υψηλότερο το , σε σύγκριση με το ποσοστό των Σελίδα 13

14 παιδιών της ίδιας ηλικίας το (Σχήμα 1). Το σύνολο των παιδιών ηλικίας 2-19 χρόνων που ήταν υπέρβαρα ή παχύσαρκα ήταν 23,9 εκατομμύρια, εκ των οποίων το 33% ήταν αγόρια και το 30,4% κορίτσια. Από τα παιδιά αυτά, 12,7 εκατομμύρια ήταν παχύσαρκα, σε ποσοστά 18,6% τα αγόρια και 15% τα κορίτσια (Alan S. Go et al, 2012). Έρευνες που έγιναν το 2011, έδειξαν ότι οι νεαροί ιθαγενείς στην Αμερική, από την Ινδία ή την Αλάσκα, είχαν ποσοστό παχυσαρκίας 17,7%, ενώ αυτό το ποσοστό κυμαινόταν στο 14,7% για τους Ισπανόφωνους, στο 10,6% για τους μαύρους μη-ισπανόφωνους, στο 10,3% για τους λευκούς μη-ισπανόφωνους και στο 9,3% για τους ιθαγενείς από την Ασία. Ύστερα από σύγκριση δύο μελετών που πραγματοποίησε το NHANES, η μια την περίοδο και η άλλη την περίοδο , βρέθηκε ότι υπήρχε μια αύξηση στον επιπολασμό της παχυσαρκίας στους νεαρούς άντρες κατά 5%, γεγονός που δεν παρατηρήθηκε στις γυναίκες της αντίστοιχης ηλικίας (Alan S. Go et al, 2012). Σχήμα 2. Ποσοστά παχυσαρκίας σε Αμερικάνους ηλικίας χρόνων κατά φύλο Σύμφωνα με μελέτες που έγιναν σε Αμερικάνους ηλικίας χρόνων, βρέθηκε ότι 154,7 εκατομμύρια ήταν υπέρβαροι ή παχύσαρκοι(σχήμα 2). Από τα άτομα αυτά, παχύσαρκοι ήταν 36,8 εκατομμύρια άνδρες και 41,6 εκατομμύρια γυναίκες. Στην ηλικιακή αυτή ομάδα των χρόνων τα ποσοστά των Σελίδα 14

15 παχύσαρκων μη-ισπανόφωνων λευκών ήταν 33,8% για τους άνδρες και 32,5% για τις γυναίκες, των μη-ισπανόφωνων μαύρων 37,9% και 53,9% και τέλος των Μεξικάνων 36% και 44,8% αντίστοιχα (Alan S. Go et al, 2012). Τα στοιχεία για τις περισσότερες ευρωπαϊκές χώρες σύμφωνα με τη μελέτη των Lobstein et al. (Lobstein & Frelut, 2003), δείχνουν επίσης μια αύξηση στα ποσοστά των υπέρβαρων και παχύσαρκων παιδιών. Μάλιστα τα υψηλότερα ποσοστά αφορούν τις αναπτυγμένες χώρες με δυτικό τρόπο ζωής. Έτσι χώρες που διανύουν περίοδο οικονομικής κρίσης έχουν χαμηλά ποσοστά υπέρβαρων και παχύσαρκων παιδιών. Για παράδειγμα, στην Πολωνία σε περίοδο οικονομικής κρίσης βρέθηκε ποσοστό υπέρβαρων παιδιών μόνο 8% και στην Τσεχία, από 10% το 1991 με την οικονομική ανάκαμψη το 1999 προσέγγισε το 12,5%. Τα ποσοστά των υπέρβαρων παιδιών στις νότιες χώρες της Ευρώπης και ιδιαίτερα στις Μεσογειακές κυμαίνονταν μεταξύ 20-40%, ενώ στις πιο βόρειες χώρες το αντίστοιχο ποσοστό ήταν 10-20% (Σχήμα 3). Σχήμα 3. Η εξάπλωση της παχυσαρκίας στον κόσμο. Στη Μεγάλη Βρετανία το ποσοστό των υπέρβαρων παιδιών ηλικίας 7-11 ετών αυξήθηκε από 8% σε 20% μέσα στην περίοδο Η αντίστοιχη αύξηση στην Ισπανία για παιδιά ηλικίας 6-7 ετών ήταν από 23% σε 35% για την περίοδο Στη Γαλλία, έρευνες δείχνουν μια αύξηση από 10% σε 16% το χρονικό διάστημα Στην Ελλάδα, στη Θεσσαλονίκη, ο δείκτης μάζας σώματος προσαρμοσμένος για την ηλικία και το φύλο παιδιών ηλικίας 6-12 ετών Σελίδα 15

16 αυξήθηκε περίπου 7% τη χρονική περίοδο (Lobstein & Frelut, 2003) (Σχήμα 3) Κριτήρια Οριοθέτησης Το υπερβάλλον βάρος και η παχυσαρκία είναι αποτέλεσμα υπερβολικής συσσώρευσης λιπώδους ιστού στο σώμα, γεγονός που αντανακλά και τη διαταραχή του ενεργειακού ισοζυγίου. Δεδομένων των δυσκολιών για άμεση μέτρηση του λιπώδους ιστού, η παχυσαρκία μπορεί να οριστεί με υπολογισμό του ΔΜΣ (Δείκτης Μάζας Σώματος, BMI). Ο υπολογισμός του γίνεται με βάση τον παρακάτω τύπο ΔΜΣ= Βάρος/Ύψος² Kg/cm² (Πίνακας 1). Ο ΔΜΣ αποτελεί σε πληθυσμιακό επίπεδο το πιο χρήσιμο, αν και αδρό μέτρο αξιολόγησης της παχυσαρκίας καθώς μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση των επιπέδων και των διαβαθμίσεων της παχυσαρκίας σε ένα πληθυσμό καθώς και για τους κινδύνους που σχετίζονται με αυτή (Caballero, 2007). Παρόλα αυτά, δεν παρέχει πληροφορίες για την ευρεία κατανομή του λίπους στο σώμα και μπορεί να μην αντιστοιχεί στον ίδιο βαθμό πάχους ή το συνοδό κίνδυνο για την υγεία στα διάφορα άτομα και πληθυσμούς γι αυτό και ορισμένες χώρες και περιοχές έχουν υιοθετήσει δικά τους όρια για την αξιολόγηση του κινδύνου νοσηρότητας και θνησιμότητας βάσει ΔΜΣ (π. χ. όριο το 23 σε ορισμένες Ασιατικές περιοχές) (Weng et al, 2006). Πίνακας 1. Κατάταξη ενηλίκων βάσει ΔΜΣ ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΔΜΣ Ελλειποβαρής <18,5 Κανονικού βάρους 18,5 24,99 Υπέρβαρος 25 Παχυσαρκία τάξης Ι 30 34,99 Παχυσαρκία τάξης ΙΙ 35 39,99 Παχυσαρκία τάξης ΙΙΙ 40 Σελίδα 16

17 Οι περιορισμοί του ΔΜΣ ως εργαλείο αξιολόγησης έχουν ήδη αναγνωρισθεί και υπάρχει ένα συνεχές ενδιαφέρον στην ανίχνευση εναλλακτικών ή συμπληρωματικών δεικτών που να συνδέουν το σωματικό λίπος και τον κίνδυνο εμφάνισης ασθενειών ΔΜΣ και παιδιά Τέτοιου είδους ορισμοί δεν είναι αντιπροσωπευτικοί όσον αφορά την αξιολόγηση της παχυσαρκίας στα παιδιά και τους εφήβους, γιατί ανήκουν σε μια ομάδα ατόμων που βρίσκονται υπό συνεχή ανάπτυξη. Ο ΔΜΣ αυξάνει κατά μέσο όρο στα νεαρά άτομα από την ηλικία 6-7 ετών έως και το τέλος της εφηβείας στα 17 έτη και γι αυτό το λόγο θα πρέπει να υπάρχουν σαφείς ορισμοί για το υπερβάλλον βάρος και την παχυσαρκία βάσει ύψους και φύλου. Υπάρχουν πολλές σειρές δεδομένων αναφοράς ΔΜΣ που χρησιμοποιούνται ως μέρος ελέγχου της ανάπτυξης των παιδιών σε πολλές χώρες και τα δεδομένα αυτά βασίζονται σε αντιπροσωπευτικά δείγματα της κάθε χώρας (Daniels et al, 2005). Δύο είναι οι ευρέως αναγνωρισμένες και χρησιμοποιούμενες στις έρευνες μέθοδοι για την εκτίμηση της παχυσαρκίας στα παιδιά. Σχήμα 4. Καμπύλες ανάπτυξης για αγόρια και κορίτσια από 0 έως 20 χρόνων. Σελίδα 17

18 Το IOTF (International Obesity Task Force), προτείνει ειδικές οριακές τιμές για υπέρβαρα και παχύσαρκα παιδιά βάσει δεδομένων από 6 ετερογενείς χώρες (Βραζιλία, Μ. Βρετανία, Ολλανδία, Σιγκαπούρη, Ηνωμένες Πολιτείες και Χονγκ- Κονγκ). Συγκεκριμένα ορίστηκαν καμπύλες με οριακές τιμές το 85 εκατοστημόριο που αντιστοιχεί σε ΔΜΣ>25 για τους ενήλικες (υπέρβαρο άτομο) και το 95 εκατοστημόριο που αντιστοιχεί σε ΔΜΣ>30 για τους ενήλικες (παχύσαρκο άτομο), αντίστοιχα (Cole et al, 2000). Η δεύτερη μέθοδος ορισμού της παχυσαρκίας γίνεται με τη βοήθεια καμπυλών ανάπτυξης που έχει ορίσει το CDC και βασίζεται σε δεδομένα που έχουν συλλεχθεί από τον αμερικανικό πληθυσμό. Αυτοί περιλαμβάνουν ειδικούς για κάθε φύλο πίνακες ανάπτυξης του ΔΜΣ για την ηλικία για παιδιά και εφήβους 2-19 ετών. Ειδικότερα, τα παιδιά των οποίων ο ΔΜΣ βρίσκεται μεταξύ 85 ου και 95 ου εκατοστημορίου ορίζονται ως υπέρβαρα, ενώ τα παιδιά των οποίων ο ΔΜΣ βρίσκεται πάνω από το 95 εκατοστημόριο χαρακτηρίζονται ως παχύσαρκα (Ogden et al, 2000) (Σχήμα 4). Αν και δεν υφίσταται παγκόσμια αναγνώριση των ορισμών του υπερβάλλοντος βάρους και της παχυσαρκίας, τόσο το Center of Disease Control and Prevention όσο και το European Childhood Obesity Group συστήνουν τη χρήση του ΔΜΣ για επιδημιολογικές μελέτες αλλά και στην κλινική πράξη. Ο υπολογισμός των κινδύνων υγείας που διατρέχει το παχύσαρκο ή απλά υπέρβαρο άτομο απαιτεί τη μέτρηση της ποσότητας του λίπους που εντοπίζεται στην κοιλιακή του χώρα. Αυτή η μέτρηση γίνεται κλινικά με υπολογισμό της περιμέτρου μέσης και της αναλογίας της περιμέτρου μέσης(waist circumference), προς την περίμετρο του ισχίου. Αλλαγές στις τιμές αυτών των παραμέτρων επηρεάζουν σημαντικά τη σοβαρότητα των κινδύνων υγείας που διατρέχει το υπέρβαρο ή παχύσαρκο άτομο (Πίνακας 2). Η παρουσία υπερβολικής ποσότητας λίπους στην περιοχή της κοιλιάς δημιουργεί μια δυσαναλογία στη συνολική κατανομή του λίπους στο σώμα και αποτελεί σημαντικό ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη εμφάνισης των προβλημάτων υγείας που συσχετίζονται με την παχυσαρκία. Σελίδα 18

19 Πίνακας 2. Παράμετροι εκτίμησης της παχυσαρκίας ανάλογα με την ηλικία. Ηλικιακέ Παχυσαρκία Τριγλυκερίδι HDL Αρτηριακή Γλυκόζη ς ομάδες περίμετρος μέσης α πίεση (έτη) 6 έως <10 90 εκατοστημόριο < 1.03 mmol/l Γλυκόζη 10 έως<16 90 εκατοστημόριο Συστολική νηστείας 16 94cm για άντρες και 1.7 mmol/l < 1.03 mmol/l για άντρες και BP 130 διαστολική ή 5.6mmol/L 80cm για γυναίκες < 1.29 mmol/l BP 85mm Hg για γυναίκες 1.3. Αιτιολογία της παχυσαρκίας Η συζήτηση σχετικά με τους λόγους της αύξησης της παιδικής παχυσαρκίας συνεχίζεται αμείωτη. Οι προδιαθετικοί παράγοντες για τη νόσο της παχυσαρκίας σε ατομικό επίπεδο φαίνεται να εξαρτώνται από αλληλεπιδράσεις μεταξύ γενετικού υποβάθρου και του περιβάλλοντος του ατόμου (γευματικές συνήθειες, σωματική δραστηριότητα κ. α.) (Neel, 1962) (Σχήμα 5). Σχήμα 5. Παράγοντες που είναι υπεύθυνοι για την παθογένεια της παχυσαρκίας. Οι γενετικοί παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν σημαντικά την ατομική προδιάθεση για παχυσαρκία ωστόσο, τα γονίδια από μόνα τους δεν εξηγούν τη μεγάλη αύξηση του ποσοστού των παχύσαρκων παιδιών που παρατηρείται τα τελευταία χρόνια (Breslow, 1952). Πέρα από τους γενετικούς παράγοντες οι περιβαλλοντικοί παράγοντες συνάδουν στην εκδήλωση και την ανάπτυξη της Σελίδα 19

20 παχυσαρκίας. Διεθνείς έρευνες έδειξαν ότι η δίαιτα, η σωματική δραστηριότητα και η καθιστική ζωή είναι οι παγκόσμιοι παράγοντες κινδύνου για τους υπέρβαρους νεαρούς και εντοπίζονται σε περιβάλλοντα που ευνοούν την εμφάνιση της παχυσαρκίας (Stunkard et al, 1990, Maes et al, 1997) Γενετικοί παράγοντες Η συνεισφορά του γονιδιώματος στο σωματικό βάρος έχει αποδειχθεί μέσω μελετών που διερευνούν τις σχέσεις γονέων απογόνων και τις σχέσεις διδύμων υιοθετημένων παιδιών. Εκτιμάται ότι το γενετικό υπόβαθρο συνεισφέρει κατά % στη νόσο της παχυσαρκίας καθιστώντας το σωματικό βάρος κληρονομούμενο χαρακτηριστικό (Allison et al, 1996). Σύνδρομα Παχυσαρκίας Η παχυσαρκία μπορεί να οφείλεται σε μεταλλάξεις γονιδίων που εκδηλώνουν διαφόρων τύπων συνδρόμων. Οι πιο συχνές περιπτώσεις παχυσαρκίας που οφείλονται σε σύνδρομα είναι οι παρακάτω: Prader Willi, Cohen, Alstrom και Bardet Biedl (Perusse et al, 1999). Πολυγονιδιακή Παχυσαρκία Ο ρόλος των γονιδίων στην ανθρώπινη παχυσαρκία είναι πολύπλοκος και υποστηρίζεται, ως επί το πλείστον, από αλληλεπιδράσεις πολλών γονιδίων (πολυγονιδιακή νόσος) καθένα από τα οποία μπορεί να έχουν σχετικά μικρή επίδραση (π.χ. γονίδια που προδιαθέτουν και δρουν σε συνδυασμό με άλλα, αλλά και με περιβαλλοντικούς παράγοντες) (Neel, 1962). Η γενετική προδιάθεση για παχυσαρκία φαίνεται να οφείλεται σε γονίδια που σχετίζονται με τάση για αύξηση βάρους με την πάροδο του χρόνου ή, εναλλακτικά, στην απουσία των γενετικών επιδράσεων, οι οποίες προστατεύουν έναντι της ανάπτυξης ενός θετικού ισοζυγίου. Σύμφωνα με το GWAS(Genome Wide Association Studies), 7 SNPs συσχετίστηκαν με το βάρος, το ΔΜΣ και την περίμετρο μέσης. Αυτά βρίσκονταν μέσα ή κοντά σε γονίδια όπως το FTO, το MC4R, το KCTD15, το MTCH2, το NEGR1 και το BDNF. Πέντε SNPs συσχετίστηκαν με την πρόσληψη τροφής και ήταν μέσα ή κοντά σε γονίδια όπως το SH2B1, το KCTD15, το MTCH2, το NEGR1 και το Σελίδα 20

21 BDNF (Bauer et al, 2009). Μονογονιδιακή Παχυσαρκία Μελέτες μεγάλων δειγμάτων ανθρώπινου πληθυσμού, οδήγησαν στην ταυτοποίηση πέντε ανθρώπινων γονιδίων παχυσαρκίας: της λεπτίνης, του υποδοχέα της λεπτίνης, της προ- οπιομελανοκορτίνης (POMC), του υποδοχέα της μελανοκορτίνης 4 (MC4R) και της προκονβερτάσης (PC1). Είναι σημαντικό ότι όλες οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από αυτά τα πέντε γονίδια αποτελούν μέρος του ίδιου μηχανισμού ελέγχου της πρόσληψης τροφής (Boutin & Froguel, 2001). Η λεπτίνη, μια 16kDa πρωτεΐνη, είναι μια ορμόνη που εκκρίνεται από το λευκό λιπώδη ιστό και ενέχεται στη ρύθμιση της πρόσληψης τροφής, στην ενεργειακή κατανάλωση και στο ενεργειακό ισοζύγιο όλου του σώματος σε τρωκτικά και σε ανθρώπους. Μετά την έκκρισή της από το λιπώδη ιστό, μεταφέρεται και διαπερνά τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό προσδεμένη στον μικρό μήκους υποδοχέα της, τον ObRa. Όταν φτάσει στην περιοχή του υποθαλάμου, προσδένεται στον μεγάλου μήκους υποδοχέα της, τον ObRb. Ακολουθεί μια σειρά αντιδράσεων μεταγωγής σήματος, με αποτέλεσμα να εμποδίζεται η παραγωγή των διαφόρων ορεξιογόνων νευροπεπτιδίων και να ευοδώνεται η παραγωγή των ανορεξιογόνων. Τα ορεξιογόνα των οποίων η έκκριση υπόκειται στην αρνητική ανατροφοδότηση του μορίου της λεπτίνης είναι το νευροπεπτίδιο Υ, η ορμόνη MCH, οι ορεξίνες Α και Β και τα οποιοειδή (Bjorntorp, 2001). Υπάρχουν διάφορα μονοπάτια μέσα στον υποθάλαμο που συμβάλλουν στο ρόλο που έχει για τη διαδικασία της όρεξης. Το καλύτερα μελετημένο είναι το μονοπάτι της μελανοκορτίνης (Flier, 2004) (Σχήμα 6). Το μονοπάτι αρχίζει με μια περιοχή του υποθαλάμου, τον τοξοειδή πυρήνα, ο οποίος επιδρά στον πλευρικό υποθάλαμο (LH) και στον διάμεσο κοιλιακό υποθάλαμο (VMH), τα εγκεφαλικά κέντρα που αφορούν την πρόσληψη τροφής και την πληρότητα, αντίστοιχα.. Ο τοξοειδής πυρήνας περιέχει δύο ευδιάκριτες ομάδες νευρώνων (Flier, 2004). Η πρώτη ομάδα συνεκφράζει το νευροπεπτίδιο Y (NPY) και το AgRP (agouti-related πεπτίδιο) και έχει διεγερτικές επιδράσεις στο LH και ανασταλτικές στο VMH. Η δεύτερη ομάδα συνεκφράζει προ-οπιομελανοκορτίνη (POMC) και ένα αντίγραφο συσχετιζόμενο με κοκαΐνη και αμφεταμίνη (CART) Σελίδα 21

22 και έχει διεγερτικές επιδράσεις στο VMH και ανασταλτικές στο LH. Σχήμα 6. Τα λεπτινο-ρυθμιζόμενα υποθαλαμικά κυκλώματα είναι σημαντικά για τις ενεργειακές ισορροπίες της λεπτίνης.η λεπτίνη δρα άμεσα στους τοξοειδείς πυρήνες των νευρώνων συνεκφράζοντας το NPY και το AgRP, και το POMC και το CART, μέσω του ObRb τoυ υποδοχέα της λεπτίνης που εκφράζεται σε αυτά τα κύτταρα. Οι προηγούμενοι νευρώνες υποκινούν τα αναβολικά και τα ορεξιγόνα αποτελέσματα που καταστέλλονται από τη λεπτίνη, και οι τελευταίοι νευρώνες υποκινούν τις καταβολικές και ανορεξιγόνες ενέργειες που προωθούν την απώλεια βάρους, και ενεργοποιούνται από τη λεπτίνη. Ένας βασικός στόχος αυτών των νευρώνων είναι οι νευρώνες που εκφράζουν τους υποδοχείς της μελανοκορτίνης 4 (MC4R) που ενεργοποιούνται από το POMC που έχει ως προϊόν το α MSH, και εμποδίζονται από το νευροπεπτίδιο AgRP. Η ενεργοποίηση αυτών των νευρώνων προωθεί τον καταβολισμό με τη μείωση της εισαγωγής τροφίμων και την αύξηση των ενεργειακών δαπανών. Συνεπώς, οι νευρώνες NPY/AgRP υποκινούν την πρόσληψη τροφής και εμποδίζουν την πληρότητα, ενώ οι νευρώνες POMC/CART υποκινούν την πληρότητα και εμποδίζουν την πρόσληψη τροφής. Και οι δύο ομάδες νευρώνων του τοξοειδούς πυρήνα ρυθμίζονται εν μέρει από τη λεπτίνη. Η λεπτίνη εμποδίζει την ομάδα NPY/AgRP ενώ υποκινεί την ομάδα POMC/CART. Κατά συνέπεια ανεπάρκεια του σήματος της λεπτίνης, είτε μέσω της ανεπάρκειας λεπτίνης είτε λόγω αντίστασης στη λεπτίνη, μπορεί να οδηγήσει στην πολυφαγία και να αποτελέσει μερικές γενετικές και επίκτητες μορφές. Έχουν βρεθεί ελάχιστες περιπτώσεις μονογονιδιακής παχυσαρκίας σε ανθρώπους που οφείλονται σε μεταλλάξεις στο γονίδιο της λεπτίνης ή του υποδοχέα της. Για παράδειγμα μια μετάλλαξη που οδηγεί σε απώλεια της Σελίδα 22

23 λειτουργικότητας της λεπτίνης βρέθηκε μόνο σε δύο συγγενικά άτομα. Ο φαινότυπος της σοβαρής αυτής μορφής παχυσαρκίας περιλάμβανε αυξημένη όρεξη, υπερφαγία και υπογοναδισμό (Montague et al, 1997). Παρομοίως, μία μόνο οικογένεια βρέθηκε με μεταλλάξεις στον υποδοχέα της λεπτίνης που είχαν ως απόρροια την απώλεια του σήματος της λεπτίνης και σοβαρή παχυσαρκία (Clement et al, 1998). Αν και οι μεταλλάξεις αυτές είναι σπάνιες, υπογραμμίζουν τον κεντρικό ρόλο που μπορεί να διαδραματίσει η λεπτίνη στην ενεργειακή ομοιόσταση (Froguel & Boutin, 2001). Ο ρόλος κλειδί του συστήματος της μελανοκορτίνης στον έλεγχο του σωματικού βάρους στον άνθρωπο έχει διαπιστευτεί μετά την ανακάλυψη μεταλλάξεων στα γονίδια των POMC και MC4R που προκαλούν παχυσαρκία (Krude et al, 1998, Froguel & Boutin, 2001). Επιπλέον έχουν βρεθεί άτομα με πολυάριθμες μεταλλάξεις στο γονίδιο της MC4R. Μέχρι τώρα το γονίδιο αυτό θεωρείται ότι είναι κυρίαρχο στο χώρο της μονογονιδιακής παχυσαρκίας, καθώς είναι υπεύθυνο για το 1% - 4% της πολύ σοβαρής μορφής παχυσαρκίας (Froguel & Boutin, 2001) Περιβαλλοντικοί παράγοντες Σωματική δραστηριότητα Εικάζεται ότι οι έφηβοι έχουν γίνει λιγότερο δραστήριοι και αυτό πιθανόν να εξηγεί σε κάποιο βαθμό τις αυξανόμενες τάσεις της παχυσαρκίας (Kimm et al, 2002). Το CDC κατέγραψε δραματική μείωση στο ποσοστό των παιδιών που περπατούν ή χρησιμοποιούν ποδήλατο για να πάνε στο σχολείο από 42% το 1969 στο 16% το 2001 (CDC, 2000). Επιπλέον, η παρακολούθηση τηλεόρασης μπορεί να μειώνει το χρόνο που διατίθεται για σωματική δραστηριότητα και συνδέεται με αυξημένη κατανάλωση τροφής γεγονός που οδηγεί σε αύξηση βάρους (Andersen et al, 1998, Giammattei et al, 2003). Επιπροσθέτως, σε μια έρευνα παρέμβασης ύστερα από μείωση των ωρών παρακολούθησης τηλεόρασης και ενασχόλησης με video- games, τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική μείωση στο ΔΜΣ, στην περίμετρο μέσης αλλά και μείωση στα γεύματα που έτρωγαν τα παιδιά μπροστά στην τηλεόραση (Robinson, 1999). Σελίδα 23

24 Ενεργειακή Πρόσληψη Οι ενεργειακά πυκνές τροφές φαίνεται να έχουν ρόλο κλειδί στην καθημερινή ενεργειακή πρόσληψη. Σε πειραματικές μελέτες, εύγεστες τροφές έχουν συνδεθεί με μειωμένο κορεσμό, παθητική υπερκατανάλωση λιπών και ζάχαρης, αύξηση της ενέργειας που προέρχεται από τα λίπη καθώς και αυξημένη ενεργειακή πρόσληψη γενικότερα (Blundell et al, 1997, Drewnowski, 1998). Αντιθέτως, πλούσια σε όγκο τρόφιμα εξαιτίας της αυξημένης περιεκτικότητάς τους σε νερό, έχει δειχθεί ότι προωθούν το αίσθημα του κορεσμού το οποίο οδηγεί σε μειωμένη ενεργειακή πρόσληψη (Rolls et al, 1998). Τα ροφήματα με προσθήκη ζάχαρης έχουν συνδεθεί με αύξηση βάρους τόσο στους ενήλικες όσο και στα παιδιά (Guthrie & Morton, 2000, Berkey et al, 2004). Έρευνα που πραγματοποιήθηκε στη Μασσαχουσέτη σε παιδιά ηλικίας ετών έδειξε ότι για κάθε επιπρόσθετη κατανάλωση μερίδας αναψυκτικού, τόσο ο ΔΜΣ όσο και η συχνότητα της παχυσαρκίας αυξάνονται (Ludwig et al, 2001). Ταυτόχρονα, παρατηρείται ανεξάρτητη συσχέτιση ανάμεσα στη βασική κατανάλωση ζαχαρούχων ροφημάτων και του ΔΜΣ. Όσον αφορά την Ελλάδα, σε έρευνα που διενεργήθηκε, βρέθηκε ότι το 59,8% παιδιών 4 7 ετών κατανάλωναν τέτοιου είδους ροφήματα σε καθημερινή βάση, ενώ η αυξημένη κατανάλωση ζαχαρούχων ροφημάτων συνδέθηκε με μειωμένα επίπεδα πρόσληψης φρούτων, λαχανικών και γαλακτοκομικών. Επίσης, συγκρινόμενα με τα παιδιά που κατανάλωναν ποτά σε μικρές ποσότητες ή καθόλου, τα παιδιά που κατανάλωναν μεγάλες ποσότητες (>250 g/ημέρα) είχαν αυξημένα επίπεδα ΔΜΣ και δύο φορές μεγαλύτερο κίνδυνο να γίνουν παχύσαρκα ή υπέρβαρα (Linardakis et al, 2008). Άτομα τα οποία καταναλώνουν σκουπιδοτροφές (fast-food) έχει φανεί ότι αυξάνουν σημαντικά την συνολική πρόσληψη ενέργειας κατά 500 kcal ημερησίως, συνολικού και κορεσμένου λίπους, υδατανθράκων και πρόσθετης ζάχαρης σε σύγκριση με αυτούς που δεν τα καταναλώνουν (Bowman et al, 2004). Διατροφικές συνήθειες γονέων Οι γονείς διαμορφώνουν τόσο το γενετικό υπόβαθρο όσο και το περιβάλλον στο οποίο θα τραφούν και θα αναπτυχθούν τα παιδιά. Έρευνα έχει δείξει ότι ο επιπολασμός των υπέρβαρων παιδιών με φυσιολογικού βάρους γονείς ήταν 11,8%, Σελίδα 24

25 ενώ το ποσοστό των υπέρβαρων παιδιών ήταν 40,8% όταν και οι δύο γονείς είτε ήταν υπέρβαροι είτε εμφάνιζαν αυξημένη πρόσληψη λίπους/ενέργειας, αποδεικνύοντας ότι οι διατροφικές συνήθειες των γονέων επηρεάζουν το σωματικό βάρος των παιδιών και την τάση τους για εμφάνιση παχυσαρκίας (Mirmiran et al, 2002). Επιπροσθέτως το σημαντικότερο ρόλο μεταξύ δύο γονέων φαίνεται να έχει η μητέρα καθώς η γνώση της σχετικά με τη διατροφή έχει συσχετιστεί θετικά με την πρόσληψη φρούτων και λαχανικών από τα παιδιά και αρνητικά με τη συνολική κατανάλωση ενέργειας και λίπους (Gibson et al, 1998, Golan et al, 2004). Τέλος, η έλλειψη γνώσης σχετικά με τις κατάλληλες ποσότητες σερβιρίσματος, οδηγούν τους γονείς στην υπερσίτιση των παιδιών εφόσον οι μεγάλες μερίδες φαγητού συνδέονται με μεγαλύτερη πρόσληψη ενέργειας (Rolls et al, 2006). Θηλασμός Σε μια ανασκόπηση 11 ερευνών, οι Dewey et al., κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι τα μέχρι στιγμής δεδομένα προτείνουν ότι ο θηλασμός μειώνει τον κίνδυνο υπερβάλλοντος βάρους μέχρι ενός ορίου και οι πιθανοί μηχανισμοί περιλαμβάνουν την εκμάθηση απορρύθμισης της ενεργειακής πρόσληψης και προγραμματισμό μεταβολισμού στα αρχικά στάδια της ζωής (Dewey, 2003). Τα παιδιά που θηλάζουν και εκείνα που τρέφονται από το μπουκάλι έχουν διαφορετική ορμονική απόκριση στην τροφή καθώς η πρόσληψη από το μπουκάλι προκαλεί μεγαλύτερη απόκριση ινσουλίνης που πιθανόν να οδηγεί σε πρώιμη αποθήκευση λίπους (Lucas et al, 1980). Αυτό συμβαίνει διότι τα βρεφικά γάλατα έχουν διπλάσιο ποσοστό λιπαρών για να καλύψουν τις ενεργειακές ανάγκες των βρεφών και επιπλέον τα λιπαρά αυτά δεν είναι τόσο καλής ποιότητας όσο τα λιπαρά που έχει το μητρικό γάλα. Ένας άλλος περιγεννητικός παράγοντας που βρίσκεται στο κέντρο του ερευνητικού ενδιαφέροντος είναι το βάρος κατά τη γέννηση. Θεωρείται ότι το βάρος του νεογνού κατά τη γέννηση συνδέεται με το βάρος και το ποσοστό λίπους αργότερα στη ζωή. Ανάλογα με το βάρος γέννησης τα παιδιά κατηγοριοποιούνται σε τρεις κατηγορίες: μικρόσωμα για την ηλικία γέννησης(small for Gestational Age, SGA), μεγαλόσωμα για την ηλικία γέννησης(large for Gestational Age, LGA) και φυσιολογικά για την ηλικία γέννησης(appropriate for Gestational Age, AGA) (Σχήμα 7). Τα παιδιά που γεννιούνται μεγαλόσωμα για την ηλικία Σελίδα 25

26 γέννησης(lga) φαίνεται να έχουν περισσότερο λίπος και λιγότερη άλιπη μάζα σώματος από ότι τα παιδιά που γεννιούνται φυσιολογικά για την ηλικία γέννησης(aga) και συνεπώς έχουν μεγαλύτερο κίνδυνο για εμφάνιση της παχυσαρκίας (Barker et al, 1993). Σχήμα 7. Ανάλογα με το βάρος γέννησης τα παιδιά κατηγοριοποιούνται σε τρεις κατηγορίες: μικρόσωμα για την ηλικία γέννησης(small for Gestational Age, SGA), μεγαλόσωμα για την ηλικία γέννησης(large for Gestational Age, LGA) και φυσιολογικά για την ηλικία γέννησης(appropriate for Gestational Age, AGA). Μια μελέτη σε πολυεθνικό δείγμα παιδιών γεννημένων στις ΗΠΑ (Hediger et al, 1999) έδειξε ότι τα παιδιά που γεννήθηκαν μικρόσωμα για την ηλικία γέννησης (SGA) παρέμειναν σημαντικά κοντύτερα και ελαφρύτερα καθ όλη την παιδική ηλικία και δεν φάνηκε να αναπτύσσονται από τους 36 έως τους 83 μήνες ζωής. Τα μεγαλόσωμα για την ηλικία γέννησης παιδιά(lga) παραμένουν μακρύτερα και βαρύτερα κατά τους πρώτους 83 μήνες ζωής, αλλά σε αντίθεση με τα SGA, τα LGA παιδιά έχουν προδιάθεση για αυξανόμενη συσσώρευση λίπους κατά την πρώιμη παιδική ηλικία. Κοινωνικο οικονομικό υπόβαθρο Είναι αναμφισβήτητο το γεγονός ότι οι τάσεις της παχυσαρκίας ακολουθούν ένα συγκεκριμένο κοινωνικο οικονομικό υπόβαθρο καθώς η ασθένεια επιβαρύνει Σελίδα 26

27 άτομα με μειωμένο εισόδημα, τις φυλετικές μειονότητες και τους φτωχούς (Bowyer & Kleinstein, 2000, Odgen et al, 2002). Το γεγονός αυτό οφείλεται στο ότι υπάρχει μια αντιστρόφως ανάλογη σχέση ανάμεσα στην ενεργειακή πυκνότητα των τροφίμων και το κόστος καθώς τέτοιου είδους τρόφιμα που αποτελούνται από επιπρόσθετα σάκχαρα και λίπη και επεξεργασμένα δημητριακά αντιπροσωπεύουν την οικονομικότερη επιλογή του καταναλωτή. Αντιθέτως, η φτώχεια και η συνεπαγόμενη ανασφάλεια συνδέονται με μειωμένες σπατάλες στην αγορά τροφίμων και ειδικότερα φρούτων, λαχανικών, ψαριού και άπαχου κρέατος (Bowyer & Kleinstein, 2000, Odgen et al, 2002) Συνέπειες της παχυσαρκίας Τα συμπτώματα που σχετίζονται με την παχυσαρκία τόσο στους ενήλικες όσο και στα παιδιά εφήβους περιλαμβάνουν ψυχοκοινωνικά προβλήματα, αυξημένο κίνδυνο για μεταβολικό σύνδρομο, διαταραγμένο μεταβολισμό γλυκόζης, ηπατικές και γαστρεντερικές διαταραχές, άπνοια ύπνου και μυοσκελετικές επιπλοκές (Σχήμα 8). Η πιο σημαντική, μακροπρόθεσμη συνέπεια της παιδικής παχυσαρκίας είναι η διατήρησή της κατά την ενήλικη ζωή, με όλους τους συνοδούς κινδύνους για την υγεία (Papoutsakis et al, 2007). Σακχαρώδης Διαβήτης Μελέτες έχουν δείξει ότι η κεντρική παχυσαρκία και ειδικότερα η μεγάλη ποσότητα ενδοκοιλιακού ή σπλαχνικού λίπους αποτελούν ανεξάρτητους παράγοντες που συνδέονται με την εμφάνιση διαβήτη (Gahagan & Silverstein, 2003, Yoon et al, 2006). Την τελευταία δεκαετία παρατηρείται μια ανησυχητική αύξηση στην εμφάνιση σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (ΣΔ2) στα παιδιά, μια ασθένεια που μέχρι πρότινος απασχολούσε αποκλειστικά τους ενήλικες. Ο ΣΔ2 σε νεαρή ηλικία αποτελεί την πιο ραγδαίως αυξανόμενη μορφή διαβήτη σε Αμερική, Ευρώπη, Ιαπωνία και Αυστραλία καθώς είναι υπεύθυνη για 1 στις 5 διαγνώσεις διαβήτη σε εφήβους (Gahagan & Silverstein, 2003). Στην Ελλάδα, δεδομένα από την Attica Study προτείνουν ότι η διάγνωση διαβήτη τύπου 2 αυξήθηκε κατά 5,5% τα έτη στους ενήλικες ενώ με την ασθένεια συνδέθηκε τόσο η περίμετρος μέσης όσο και ο ΔΜΣ. Ειδικότερα, τιμές περιμέτρου μέσης πάνω από Σελίδα 27

28 το φυσιολογικό (>102 cm στους άνδρες και >88 cm στις γυναίκες), σχετίστηκε με 1,52 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο για εμφάνιση διαβήτη (Panagiotakos et al, 2008). Σχήμα 8. Σχηματική απεικόνιση των προβλημάτων που δημιουργεί η παχυσαρκία Μεταβολικό Σύνδρομο Το Μεταβολικό Σύνδρομο αποτελεί ένα σύνολο παραγόντων κινδύνου όπως η υπέρταση, υπερτριγλυκεριδαιμία, μειωμένη συγκέντρωση HDL χοληστερόλης, μη φυσιολογικός μεταβολισμός γλυκόζης και υπερινσουλιναιμία που συνδέονται με αντίσταση στην ινσουλίνη. Όσο η παιδική παχυσαρκία αυξάνεται, οι ιατρικές επιπλοκές αρχίζουν να αναγνωρίζονται όλο και πιο συχνά, έρευνες προτείνουν ότι ένα σημαντικό ποσοστό υπέρβαρων παιδιών και εφήβων μπορεί να επιβαρυνθεί με το μεταβολικό σύνδρομο καθώς εμφανίζεται σε πολλούς ένας από τους τρεις παράγοντες: αυξημένα επίπεδα τριγλυκεριδίων, μειωμένες τιμές HDL χοληστερόλης και αυξημένη αρτηριαακή πίεση (Freedman et al, 1999, Falkner et al, 2002). Επίσης, σε σημαντικό αριθμό παιδιών παρατηρούνται αυξημένα επίπεδα ινσουλίνης υποδηλώνοντας αύξηση στην αντίσταση στην ινσουλίνη (Schachter et al, 2003), ενώ αν λάβουμε υπόψη έρευνες αυτοψίας οι οποίες έχουν δείξει ότι το υπερβάλλον βάρος στην εφηβεία συνδέεται με επιτάχυνση της αρτηριακής αθηροσκλήρωσης, τότε γίνεται κατανοητό ότι το ζήτημα περιπλέκεται περισσότερο (McGill et al, 2002). Σύμφωνα με ευρήματα της NHANES III, ο συνολικός επιπολασμός του μεταβολικού συνδρόμου στους εφήβους είναι 4,2%, το 41% εμφάνιζε 1 ή περισσότερους παράγοντες κινδύνου και το 14% 2 ή περισσότερους παράγοντες (Cook et al, 2003). Έρευνα που διεξήχθη στη Φιλανδία, ύστερα από μελέτη σε Σελίδα 28

29 ενήλικες, έδειξε ότι τα μισά από τα παχύσαρκα παιδιά είχαν εξελιχθεί σε παχύσαρκους ενήλικες με έναν ιδιαίτερα αυξημένο κίνδυνο μεταβολικού συνδρόμου στην ενήλικη ζωή, ενώ ο κίνδυνος αυτός ήταν χαμηλότερος για τους παχύσαρκους ενήλικες που είχαν φυσιολογικό βάρος ως παιδιά (Vanhala et al, 1998). Ο πιθανός μηχανισμός που εξηγεί αυτή την κατάσταση είναι το γεγονός ότι η παρουσία της παχυσαρκίας σε όλη την περίοδο από την παιδική ηλικία ως την ενήλικη ζωή αποτελεί το υπόβαθρο για παρατεταμένη αντίσταση στην ινσουλίνη το οποίο μπορεί να εκδηλωθεί σε συνάφεια με την υπέρταση και άλλες μεταβολικές διαταραχές στο άτομο (Bjorntorp, 1990). Στεφανιαία νόσος Συγκριτική μελέτη που πραγματοποιήθηκε στη Δανία και περιλάμβανε παιδιά, διερεύνησε τις μακροπρόθεσμες συνέπειες του αυξημένου βάρους στη στεφανιαία νόσο (CHD). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα υψηλά επίπεδα ΔΜΣ στην παιδική ηλικία αύξαναν τον κίνδυνο για CHD στην ενήλικη ζωή, ενώ αύξηση του ΔΜΣ κατά 1 μονάδα σε κάθε ηλικία από τα 7 έως τα 13 χρόνια για τα αγόρια και από τα 10 έως τα 13 χρόνια για τα κορίτσια αύξαναν σημαντικά τον κίνδυνο για CHD. Επίσης, βρέθηκε ότι ο κίνδυνος για CHD που συνδέεται με το ΔΜΣ στην παιδική ηλικία αυξανόταν αναλογικά με την ηλικία του παιδιού και ενώ στην ηλικία των 7 ο κίνδυνος ήταν μικρός, στην ηλικία των 13 ήταν σημαντικά αυξημένος (Baker et al, 2007). Υπέρταση Η υπέρταση εμφανίζεται πιο συχνά σε παχύσαρκα άτομα κάθε ηλικίας ενώ η παιδική παχυσαρκία ειδικότερα, αποτελεί τον κυρίαρχο παράγοντα εμφάνισης παιδικής υπέρτασης (Speiser et al, 2005, Harding et al, 2008). Όσον αφορά τον ενήλικο πληθυσμό, έρευνα στην Ιταλία έδειξε ότι η υπέρταση ήταν η δεύτερη πιο συχνά εμφανιζόμενη ασθένεια ενώ υπέρβαρα και παχύσαρκα άτομα είχαν αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης της ασθένειας και στα δύο φύλα με παρόμοια σημαντική θετική τάση (Calza et al, 2008). Σελίδα 29

30 Αναπνευστικά Προβλήματα Η παχυσαρκία μπορεί να έχει άμεση επίδραση στη μηχανική συμπεριφορά του αναπνευστικού συστήματος, οδηγώντας σε μείωση του όγκου του πνεύμονα αλλά και της μυϊκής δύναμης του αναπνευστικού (Schachter et al, 2003). Άλλα αναπνευστικά προβλήματα περιλαμβάνουν και την άπνοια ύπνου (Young et al, 2002, Speiser et al, 2005). Μυοσκελετικά Προβλήματα Ένα εύρος ορθοπεδικών προβλημάτων συνδέονται με την παιδική και εφηβική παχυσαρκία. Τα υπέρβαρα παιδιά είναι επιρρεπή στην εμφάνιση δυσμορφιών στα οστά που μπορεί να προδιαθέτουν και για άλλα ορθοπεδικά προβλήματα αργότερα στη ζωή τους, ενώ το υπερβάλλον βάρος μπορεί να προκαλέσει τραυματισμούς στη σπονδυλική στήλη, σκολίωση και οστεοαρθρίτιδα (Speiser et al, 2005). Ψυχολογικές συνέπειες Αν και φαίνεται ότι όσο περισσότερο ζυγίζουν τα παιδιά τόσο πιο πολύ δυσαρεστούνται με την εικόνα του σώματός τους, εντούτοις το ψυχολογικό αυτό στρες αντιμετωπίζεται διαφορετικά ανάμεσα στα δύο φύλα (Steen et al, 1996, Young-Hyman et al, 2006) και σε διαφορετικές εθνικότητες (French et al, 1995). Τα παχύσαρκα παιδιά παρουσιάζουν ψυχολογικά προβλήματα όπως χαμηλή αυτοεκτίμηση, αποξένωση από τους συνομηλίκους τους, κατάθλιψη, άγχος και αίσθημα απόρριψης (Richard et al, 2001) Λιπώδης ιστός Δύο είναι οι τύποι του λιπώδους ιστού: ο λευκός και ο φαιός (Σχήμα 9). Λευκός λιπώδης ιστός : Οι κύριες λειτουργίες του λευκού λιπώδους ιστού, αφορούν αφενός στην ικανότητά του να αποθηκεύει το ενεργειακό απόθεμα με τη μορφή τριγλυκεριδίων, σε μεγάλες μονόχωρες λιποσταγόνες, αφετέρου στην ικανότητα απελευθέρωσης αυτής της ενέργειας με τη μορφή ελεύθερων λιπαρών οξέων. Πράγματι, η ικανότητα του λευκού λιπώδους ιστού για αποθήκευση Σελίδα 30

31 τριγλυκεριδίων είναι θεωρητικά απεριόριστη χρονικά και ποσοτικά. Σε περιόδους που το ενεργειακό ισοζύγιο είναι θετικό, είτε λόγω αυξημένης πρόσληψης τροφής, είτε λόγω ελαττωμένης κατανάλωσης ενέργειας, το επιπλέον ποσό ενέργειας αποθηκεύεται στο λιπώδη ιστό αποτελεσματικά με τη μορφή λιπιδίων, κυρίως υπό την επίδραση της ινσουλίνης. Όταν η υπεροχή της λιπογένεσης έναντι της λιπόλυσης δεν επαρκεί για την αποθήκευση της περίσσειας ενέργειας, ο λιπώδης ιστός διατηρεί την ικανότητα να αυξήσει τον αριθμό τον κυττάρων που τον συγκροτούν με τη διαδικασία της λιπογένεσης. Αντίθετα, σε περιόδους αρνητικού ενεργειακού ισοζυγίου, λόγω υποθρεψίας ή αυξημένων ενεργειακών αναγκών, τα αποθηκευμένα λιπίδια απελευθερώνονται και λειτουργούν ως πρώτη ύλη για την παραγωγή ενέργειας. Υπό την επίδραση κατεχολαμινών και λιπολυτικών ορμονών, τα τριγλυκερίδια κινητοποιούνται και με τη βοήθεια λιπασών του λιπώδους ιστού διασπώνται σε γλυκερόλη και λιπαρά οξέα, που μεταφέρονται με την κυκλοφορία στο ήπαρ, τους μύες και το φαιό λιπώδη ιστό, όπου υφίστανται οξείδωση (Hauner, 2004). Σχήμα 9. Απεικόνιση του φαιού και του λευκού λιπώδους ιστού Φαιός λιπώδης ιστός: Ο φαιός λιπώδης ιστός εντοπίζεται στο μεσοθωράκιο & το άνω τμήμα της ράχης. Αντίθετα από τον λευκό λιπώδη ιστό, ο φαιός αποθηκεύει τριγλυκερίδια σε πολύχωρα λιποκύτταρα, ως καύσιμο άμεσης πρόσβασης για την παραγωγή θερμότητας, μέσω της αποσύνδεσης της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης των ελεύθερων λιπαρών οξέων στα μιτοχόνδρια. Αυτή η θερμογόνος διαδικασία είναι ζωτικής σημασίας για τη θερμορύθμιση των νεογέννητων κατά την έκθεση στο κρύο. Βέβαια, με την πάροδο του χρόνου δεν Σελίδα 31

32 είναι τόσο απαραίτητη για τον ενήλικα, γεγονός που αντικατοπτρίζεται και στην ελαττωμένη μάζα του φαιού λιπώδους ιστού στον ενήλικα σε σχέση με τη βρεφική ηλικία. Η εκλεκτική έκφραση της UCP1 (uncoupling protein 1) στα φαιά λιποκύτταρα τους, προσδίδει την ικανότητα αποσύνδεσης της οξείδωσης των υποστρωμάτων και της μεταφοράς ηλεκτρονίων στην αναπνευστική αλυσίδα από τη σύνθεση του ATP. Έτσι, αντί της σύνθεσης ATP, η οξείδωση υποστρωμάτων όπως λιπαρών οξέων οδηγεί στην απελευθέρωση θερμότητας από τα μιτοχόνδρια των λιποκυττάρων. Η ρύθμιση της θερμογένεσης στο φαιό λιπώδη ιστό γίνεται κυρίως με τη μεσολάβηση του συμπαθητικού νευρικού συστήματος, μέσω β3- αδρενεργικών υποδοχέων. Η διαδικασία διεγείρεται από τη χρόνια έκθεση στο κρύο και τη δίαιτα υψηλής θερμιδικής αξίας και υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά. Η μεσολάβηση ορμονικών και παρακρινών μηχανισμών επηρεάζει την UCP-επαγόμενη θερμογένεση στο φαιό λιπώδη ιστό, αφού τα γλυκοκορτικοειδή αποτελούν ισχυρούς καταστολείς της έκφρασης της UCP1, ενώ η λεπτίνη ευνοεί τη θερμογένεση (Sethi & Vidal-Puig, 2007). Εμείς θα ασχοληθούμε με το λευκό λιπώδη ιστό Ανατομία- Ιστολογία Ο λιπώδης ιστός καταλαμβάνει το χώρο μεταξύ του δικτυωτού χορίου και της μυϊκής περιτονίας. Εμφανίζεται με τη μορφή λοβίων από συναθροίσεις λιποκυττάρων. Ανάμεσα στα λόβια υπάρχουν διαφραγμάτια από λιπώδη ιστό, αιμοφόρα αγγεία, λεμφικά αγγεία και νευρικές ίνες του αυτόνομου νευρικού συστήματος (Σχήμα 10). Ανάμεσα στα λιποκύτταρα βρίσκονται χαλαρός συνδετικός ιστός, μαστοκύτταρα, μικρά αγγεία και νεύρα. Ωστόσο, μόνο τα αγγεία των διαφραγματίων επικοινωνούν με τα αγγεία του δικτυωτού χορίου. Τα λιποκύτταρα είναι μεσεγχυματικής προέλευσης. Παρουσιάζουν ιστογενετική συγγένεια, αλλά όχι ταύτιση, με τους ινοβλάστες. Ακολουθούν δική τους οδό εξέλιξης (ωρίμανσης), διερχόμενη μέσω του σταδίου των προλιποκυττάρων. Στα τελευταία στάδια της ωρίμανσής τους συμβαίνει εκτεταμένη συνένωση και διόγκωση λιποσταγόνων στο κυτταρόπλασμα. Το αποτέλεσμα είναι η συμπίεση και παρεκτόπιση του λοιπού κυτταροπλάσματος αλλά και του πυρήνα, δακτυλιοειδώς προς την περιφέρεια του κυττάρου. Τελικά, Σελίδα 32

33 το 95% του όγκου του ωρίμου λιποκυττάρου αποτελείται από λίπος και τριγλυκερίδια. Σχήμα 10. Απεικόνιση ώριμων και προ λιποκυττάρων. Στα ώριμα λιποκύτταρα παρατηρείται η εκτόπιση του πυρήνα και η συμπίεση του κυτταροπλάσματος. Εντόπιση λιπώδους ιστού Ο λιπώδης ιστός διακρίνεται σε δύο μείζονα διαμερίσματα, το υποοδόριο και το σπλαχνικό. Σχήμα 11. Απεικόνιση της αποθήκευσης λίπους στο ανθρώπινο σώμα. Τα δύο αυτά διαμερίσματα αποτελούν σχεδόν το 90% του ολικού λίπους(~ 80% το υποδόριο και ~10% το σπλαχνικό), ενώ το υπόλοιπο 10% αφορά το οπισθοπεριτοναϊκό, το περινεφρικό κα το λίπος στους οφθαλμικούς κόγχους (Σχήμα 11). Το υποδόριο και το σπλαχνικό λίπος έχουν διαφορετική κατανομη και μεταβολισμό (λιπόλυση/αποθήκευση): το σπλαγχνικό λίπος έχει μεγαλύτερο Σελίδα 33

34 αριθμό λιποκυττάρων κι πυκνότερο τριχοειδικό και νευρικό δίκτυο σε σύγκριση με το υποδόριο λίπος Λιπογένεση και Λιπόλυση Λιπογένεση Η λιπογένεση περιλαμβάνει τη διαδικασία της de novo σύνθεσης των λιπαρών οξέων, την επιμήκυνση/αποκορεσμό των λιπαρών οξέων και την επακόλουθη σύνθεση τριγλυκεριδίων. Στον άνθρωπο, το κύριο όργανο της λιπογένεσης είναι το ήπαρ, ενώ στα τρωκτικά οι πιο σημαντικές λιπογενετικές περιοχές είναι το ήπαρ αλλά και ο λιπώδης ιστός (Hillgartner et al., 1995). Η de novo σύνθεση λιπαρών οξέων λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα και είναι μια διαδοχική διαδικασία στην οποία οι ακετυλο (2-άνθρακες) ομάδες προστίθενται διαδοχικά σε ένα αρχικό μόριο, συνήθως το acetyl-coa, το οποίο προέρχεται από το μεταβολισμό της γλυκόζης. Το πρώτο βήμα για τη σύνθεση των λιπαρών οξέων είναι η μετατροπή του ακετυλο- CoA σε μηλονυλ-coa, μια αντίδραση η οποία καταλύεται από το ένζυμο ακετυλο-coa καρβοξυλάση (ACC) (Hillgartner et al., 1995). Περαιτέρω μετατροπή του μηλονυλ-coa σε κορεσμένα λιπαρά οξέα μακράς αλυσίδας διενεργείται από τη συνθάση των λιπαρών οξέων (FAS), ένα περίπλοκο πολυπεπτίδιο που περιέχει επτά διακριτές περιοχές με διαφορετικές καταλυτικές δραστηριότητες που είναι απαραίτητες για την επιμήκυνση ενός αναπτυσσόμενου λιπαρού οξέος (Smith, 1994). Στα ζώα, το κύριο προϊόν της de novo σύνθεσης των λιπαρών οξέων είναι ένα λιπαρό οξύ με 16-άνθρακες, το παλμιτικό οξύ (Volpe & Vagelos, 1973). Το παλμιτικό οξύ μπορεί να υποβληθεί σε αντιδράσεις αποκορεσμού ή/και επιμήκυνσης έτσι ώστε να σχηματιστούν άλλα λιπαρά οξέα. Αυτά τα νεοσχηματιζόμενα λιπαρά οξέα εστεροποιούνται στην 3-φωσφορική γλυκερόλη για να σχηματίσουν τα τριγλυκερίδια, στο ήπαρ ή στο λιπώδη ιστό. Από τη μετατροπή του παλμιτικού οξέος, σημαντικές ποσότητες στεατικού και ελαϊκού οξέος συγκεντρώνονται στα λιποκύτταρα. Στα μικροσωμάτια, η ελονγκάση των λιπαρών οξέων δρά στο στεατικό οξύ προσθέτοντας ένα μόριο μηλονυλ-coa. Η Σελίδα 34

35 συγκέντρωση του στεατικού οξέος στους ιστούς, ρυθμίζεται από την παρουσία της στεαροϋλικής-coa αποκορεσματάσης (SCD), η οποία μετατρέπει το στεατικό οξύ σε ελαϊκό οξύ. Το ένζυμο αυτό, επίσης γνωστό και ως Δ9-δεσατουράση, είναι υπεύθυνο για την εισαγωγή ενός cis διπλού δεσμού στη θέση Δ9 (Ntambi, 1999). Η Δ9-δεσατουράση έχει μια σημαντική λειτουργία στη ρύθμιση της ρευστότητας των λιπιδίων και της αλληλεπίδρασης κυττάρου-κυττάρου, παίζοντας με την αναλογία των κορεσμένων σε σχέση με τα μονοακόρεστα λιπαρά οξέα (Ntambi, 1999). Δίαιτες πλούσιες σε λινολαϊκό οξύ μειώνουν τη δραστικότητα της Δ9- δεσατουράσης στους Wistar αρουραίους (Jeffcoat & James, 1978). Τα περισσότερα λιπαρά οξέα εστεροποιούνται για να σχηματίσουν τριγλυκερίδια, μια μορφή αποθήκευσης ενέργειας στο λιπώδη ιστό. Μόρια γλυκερόλης λαμβάνονται από τα κύτταρα για να χρησιμοποιηθούν στη σύνθεση γλυκόζης ή στον ανα-σχηματισμό τριγλυκεριδίων. Στο ήπαρ και σε πολλούς άλλους ιστούς, τα περισσότερα λιπαρά οξέα εστεροποιούνται για να σχηματίσουν τα φωσφολιπίδια που είναι σημαντικά συστατικά των ενδοκυτταρικών μεμβρανών αλλά και της πλασματικής μεμβράνης. Το ήπαρ ενεργά συνθέτει τριγλυκερίδια, υπό την παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων λιπαρών οξέων από το αίμα, τα οποία τα εξάγουν στα VLDL (Σχήμα 12). Καθώς αυξάνεται η πρόσληψη ενέργειας, αυξάνεται και η εστεροποίηση των λιπαρών οξέων στο λιπώδη ιστό, ενώ μειώνεται σε περιόδους έλλειψης διατροφικής ενέργειας. Σε ενεργειακά πλούσιες διατροφές, τα υψηλά επίπεδα της εκκρινόμενης ινσουλίνης, έχουν ως αποτέλεσμα την αύξηση της σύνθεσης των λιπιδίων στο ήπαρ και στο λιπώδη ιστό (Bazin & Lavau, 1982). Η επαγόμενη υπερινσουλιναιμία σε αρουραίους, έχει βρεθεί, ότι αυξάνει την πρωτεϊνική και mrna έκφραση του μεταφορέα της γλυκόζης (GLUT-4), καθώς και, τις δραστηριότητες των ενζύμων της συνθάσης των λιπαρών οξέων και της ακετυλο- CoA καρβοξυλάσης στο λιπώδη ιστό (Assimacopoulos-Jeannet et al., 1995). Αντιθέτως, το γλυκαγόνο και οι κατεχολαμίνες αναστέλλουν τη δραστηριότητα του της συνθάσης των λιπαρών οξέων. Καταυτόν τον τρόπο, η σύνθεση του λίπους αναστέλλεται όταν απαιτείται η ενεργοποίηση των αποθηκών ενέργειας (Hillgartner et al., 1995). Πολλές μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι τα διαιτητικά λιπαρά οξέα είναι ικανά να ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση των λιπογενετικών ενζύμων. Τα διαιτητικά Σελίδα 35

36 οξέα όπως το λινολαϊκό, το α-λινολενικό και το αραχιδονικό δημιουργούν μια μείωση στη δραστηριότητα της συνθάσης των λιπαρών οξέων και στο ρυθμό σύνθεσης των λιπαρών οξέων στο ήπαρ αρουραίων (Clarke et al., 1976). Τα επίπεδα της έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν την ακετυλο-coa καρβοξυλάση, τη συνθάση των λιπαρών οξέων, το μεταφορέα της γλυκόζης GLUT-4 και τη στεαροϋλική-coa αποκορεσματάση, μειώνονται (60-90%) σε διατροφές που είναι πλούσιες σε n-3 και n-6 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (Sessler & Ntambi, 1998). Επιπλέον, πολλές μελέτες έδειξαν ειδικές επιδράσεις που εξαρτώνται από την αποθήκευση του λίπους. Σε μια από αυτές, η γονιδιακή έκφραση της συνθάσης των λιπαρών οξέων και της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης στον οπισθοπεριτοναϊκό λιπώδη ιστό επηρεάστηκε από τα n-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, γεγονός που δε συνέβη στις υποδόριες και βουβωνικές αποθήκες (Raclot et al., 1997). Σχήμα 12. Η λιπογένεση και η λιπόλυση διενεργούνται στα λιποκύτταρα με σκοπό να διατηρηθεί η ενεργειακή ισορροπία. Λιπόλυση Κατά τη διάρκεια ενός αρνητικού ενεργειακού ισοζυγίου, τα τριγλυκερίδια υδρολύονται σε ελεύθερα λιπαρά οξέα και γλυκερόλη στο λιπώδη ιστό, ένα φαινόμενο γνωστό ως λιπόλυση. Η διαδικασία αυτή εξαρτάται από την ενεργοποίηση της ορμονο-ευαίσθητης λιπάσης. Η ενεργοποίησή της επιτυγχάνεται με φωσφορυλίωση στη σερίνη μέσω της πρωτεϊνικής κινάσης Α (PKA). Η Σελίδα 36

37 διαδικασία αυτή, κατά κύριο λόγο, διεγείρεται από τις κατεχολαμίνες και εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της νηστείας ή όταν οι ενεργειακές απαιτήσεις είναι μεγάλες, όπως κατά τη διάρκεια σωματικής άσκησης και σε συνθήκες άγχους, εξαιτίας της έντονης διέγερσης του συμπαθητικού. Με τον τρόπο αυτό, παράγεται ενδοκυτταρικά το κυκλικό AMP, με επακόλουθη ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α, το οποίο επίσης δρα στις περιλιπίνες (πρωτεΐνες που περιβάλλουν τη λιπιδική σταγόνα) με παρόμοιο τρόπο όπως η ορμονο-ευαίσθητη λιπάση. Οι φωσφορυλιωμένες περιλιπίνες εγκαταλείπουν την επιφάνεια της λιπιδικής σταγόνας, διασπείρονται μέσα στο κυτταρόπλασμα και ανοίγουν χώρους για την ορμονο-ευαίσθητη λιπάση ώστε να φτάσει το υπόστρωμάτους, που είναι τα τριγλυκερίδια. Τα ελεύθερα λιπαρά οξέα δεσμεύονται με την FABP, οδηγούνται στην κυτταρική μεμβράνη και μεταφέρονται στο εξωκυτταρικό περιβάλλον μέσω της FATP. Η γλυκερόλη μεταφέρεται στο εσωτερικό του κυττάρου μέσω ειδικών μεταφορέων, πρωτεΐνες που ανήκουν στην οικογένεια των ακουαγλυκεροπορινών (aquaporin 7 ή AQP7) (Miriam.et al, 2007). Τα ελεύθερα λιπαρά οξέα απελευθερώνονται από τα κύτταρα στην κυκλοφορία του αίματος όταν δεν υπάρχουν ερεθίσματα για την εκ νέου εστεροποίησή τους. Εκεί, προσροφώνται από την αλβουμίνη του ορού και κυκλοφορούν φθάνοντας σε διάφορους ιστούς σαν ένα σύμπλοκο αλβουμίνηςλιπαρών οξέων. Σε φυσιολογικές συνθήκες ο οργανισμός συντονίζει την ισορροπία μεταξύ λιπογένεσης και λιπόλυσης, ρυθμίζοντας την αύξηση ή την απελευθέρωση των ενεργειακών αποθεμάτων από το λιπώδη ιστό. Η ινσουλίνη διεγείρει την πρόσληψη της γλυκόζης καθώς και τη διαδικασία της γλυκόλυσης (μεταβολική οδός για την αποικοδόμηση της γλυκόζης), αυξάνοντας την 3-φωσφορική γλυκερόλη που υπάρχει για τη λιπογένεση (Ducluzeau et al., 2002). Σε αντίθεση, όταν τα επίπεδα της γλυκόζης στο αίμα είναι χαμηλά, το γλυκαγόνο δίνει σήματα στα λιποκύτταρα για να ενεργοποιήσουν την ορμονο-ευαίσθητη λιπάση και να μετατρέψουν τα τριγλυκερίδια σε ελεύθερα λιπαρά οξέα (Σχήμα 12). Η σύνθεση λιπαρών οξέων από τη διατροφή πιθανώς επηρεάζει την ορμονο-ευαίσθητη λιπόλυση στο λιπώδη ιστό, καθώς τα κορεσμένα λιπαρά οξέα ασκούν ανασταλτική επίδραση και επηρεάζουν διάφορα σημεία του λιπολυτικού καταρράκτη (Awad & Chattopadhyay, 1986). Το λινολαϊκό οξύ μειώνει τα επίπεδα της λιπόλυσης στο Σελίδα 37

38 λιπώδη ιστό, μέσω της παραγωγής των προσταγλαδινών (Larking & Nye, 1975), τα οποία είναι μόρια με αντιλιπολυτική δράση (Van Dorp et al., 1964). Οξείδωση λιπαρών οξέων Στα ηπατοκύτταρα, η οξείδωση των λιπαρών οξέων, ή β-οξείδωση, είναι μια σημαντική πηγή ενέργειας για την παραγωγή τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP) στα μιτοχόνδρια. Τα ελεύθερα λιπαρά οξέα ενεργοποιούνται από την ακετυλο- CoA συνθετάση, που βρίσκεται στα μικροσωμάτια και στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη, για να σχηματίσουν λιπαρό ακυλο-coa. Το λιπαρό ακυλο-coa μπορεί είτε να εισέλθει στα μιτοχόνδρια για οξείδωση ή να εστεροποιηθεί μέσα στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Ο βαθμός οξείδωσης των λιπαρών οξέων στο ήπαρ, ρυθμίζεται από την παροχή λιπαρών οξέων σε αυτό μέσω της διαδικασίας της λιπόλυσης και από το διαχωρισμό μεταξύ μιτοχονδριακής οξείδωσης και μικροσωμικής εστεροποίησης (Mannaerts et al., 1979). Λιπαρά οξέα μικρής (έως 12 άνθρακες) και μεσαίας αλυσίδας (μεταξύ 12 και 16 ανθράκων) διαχέονται στα μιτοχόνδρια για να οξειδωθούν ενώ τα λιπαρά οξέα μεγάλης αλυσίδας (περισσότερων των 18 ανθράκων) πρέπει να μεταφερθούν (Schrauwen et al., 2003). Ως εκ τούτου, η είσοδος αυτών των λιπαρών οξέων μεγάλης αλυσίδας μέσα στα μιτοχόνδρια, ρυθμίζεται από την ενεργότητα του ενζύμου καρνιτίνη παλμιτοϋλτρανσφεράση Ι (CPT-I). Το ένζυμο αυτό καταλύει το σχηματισμό της λιπαρής ακυλο-καρνιτίνης από το λιπαρό ακυλο- CoA και την ελεύθερη L-καρνιτίνη. Η λιπαρή ακυλο-καρνιτίνη μεταφέρεται κατά μήκος της μιτοχονδριακής μεμβράνης από μια ειδική πρωτεΐνη μεταφορέα και επαναμετατρέπεται σε ακυλο-coa εντός του μιτοχονδριακού περιβάλλοντος από τη δράση της καρνιτίνης παλμιτοϋλτρανσφεράσης ΙΙ. Η δραστικότητα της καρνιτίνης παλμιτοϋλτρανσφεράσης Ι αναστέλλεται από την αλληλεπίδραση με το μηλονυλ-coa (McGarry & Brown, 1997), το οποίο είναι το προϊόν του πρώτου σταδίου της λιπογένεσης που καταλύεται από την ακετυλο-coa καρβοξυλάση. Σε περιπτώσεις αρνητικού ενεργειακού ισοζυγίου, τα χαμηλά επίπεδα της ινσουλίνης έχουν ως αποτέλεσμα μειωμένες συγκεντρώσεις του μηλονυλ-coa και αυξημένα ποσοσοστά οξείδωσης των λιπαρών οξέων (Hamel et al., 2001). Μέσω της Σελίδα 38

39 μιτοχονδριακής οξείδωσης του λιπαρού ακυλο-coa σχηματίζεται το ακετυλο- CoA, το οποίο εισέρχεται στον κύκλο του Krebs για να παραχθεί ενέργεια. Εναλλακτικά, το ακετυλο-coa συμμετέχει στο σχηματισμό κετονικών σωμάτων. Υπό συνθήκες αυξημένης πρόσληψης μη-εστεροποιημένων λιπαρών οξέων, όπως κατά τη διάρκεια ασιτίας, το ήπαρ συχνά παράγει μεγάλες ποσότητες κετονικών σωμάτων μια διαδικασία γνωστή ως κετογένεση (McGarry & Foster, 1980). Για τα λιπαρά οξέα πολύ μεγάλης αλυσίδας (22 άνθρακες ή περισσότεροι) η β-οξείδωση είναι περισσότερο ενεργή στα περοξεισώματα απ ότι στα μιτοχόνδρια. Στο πρότυπο του αρουραίου, συνθήκες που οδηγούν στην αυξημένη τροφοδοσία του ήπατος με λιπαρά οξέα, όπως διατροφή με υψηλά επίπεδα λιπών, ασιτία και διαβήτης, επάγουν τα ένζυμα της περοξεισωματικής β-οξείδωσης, γεγονός που υποδηλώνει το σημαντικό ρόλο αυτής της οδού, βοηθώντας με την αύξηση της ροής των λιπαρών οξέων (Singh, 1997) Ακουαπορίνες (AQPs) Νερό και ακουαπορίνες Το νερό είναι μια μοναδική ουσία και οι ιδιότητές του το καθιστούν το πιο κεντρικό μόριο στη βιολογία. Οι εξαιρετικές διαλυτές ικανότητες του νερού, προέρχονται από την πολικότητα και τις πολλές δυνατότητες σχηματισμού δεσμούς υδρογόνου, καθιστώντας το ιδανικό βιολογικό διαλύτη. Οι πρώτες μορφές ζωής εμφανίστηκαν σε ένα υδατικό διάλυμα περίπου πριν 4 δισεκατομμύρια χρόνια, με σημαντικό συστατικό όλων των οργανισμών που ζουν σήμερα να είναι το νερό. Περίπου τα 2/3 της μάζας του ανθρώπινου σώματος είναι το νερό. Η ρύθμιση των ουσιών μέσα σε ένα κύτταρο είναι θεμελιώδης και η ροή του νερού διαμέσου των βιολογικών μεμβρανών μεσολαβείται από ενδογενείς μεμβρανικές πρωτεΐνες που λειτουργούν ως κανάλια νερού. Οι πρωτεΐνες αυτές είναι οι ακουαπορίνες (AQPs) και συναντώνται στα βακτήρια, στη ζύμη, στα φυτά, στα ζώα και στον άνθρωπο. Σελίδα 39

40 Ανακάλυψη Ακουαπορινών Η ανακάλυψη της πλασματικής μεμβράνης τη δεκαετία του 1920, έδωσε το έναυσμα για συζητήσεις σχετικά με το πώς το νερό μπορεί να μεταφέρεται διαμέσου της μεμβράνης. Αρχικά, πίστευαν ότι γίνεται με παθητική διάχυση, αλλά σε αρκετές μελέτες διαπιστώθηκε ότι οι κυτταρικές μεμβράνες είχαν μεγαλύτερη διαπερατότητα απ ότι θα μπορούσε θα μπορούσε να εξηγηθεί μόνο με διάχυση (Agre, 2006). Η παρουσία από κανάλια γεμάτων νερό στη μεμβράνη των ερυθρών αιμοσφαιρίων, για πρώτη φορά αναφέρεται το 1957 (Paganelli et al., 1957) και επόμενα στοιχεία για την ύπαρξη τέτοιων διαύλων προέκυψαν όταν η διαπερατότητα του νερού μπόρεσε να ανασταλεί από το HgCl 2 (Macey, 1984). Δεδομένου ότι η ένωση αυτή δε μπορούσε να αναστείλει από μόνη της, τη διάχυση του ύδατος διαμέσου της μεμβράνης, το λογικό συμπέρασμα ήταν ότι μια πρωτεΐνη ευαίσθητη στον υδράργυρο ήταν ικανή να το πράξει. Κατά την ίδια χρονική περίοδο αρκετές ερευνητικές ομάδες προέβλεπαν πρωτεϊνικά κανάλια νερού στα ερυθρά αιμοσφαίρια (Benga et al., 1986, Brown et al., 1975). Το πρώτο κανάλι νερού, ανακαλύφθηκε κατά τη διάρκεια απομόνωσης ενός αντιγόνου της Rhesus ομάδας αίματος από τα ερυθρά αιμοσφαίρια. Η πρωτεΐνη αναμενόταν να είναι γύρω στα 32kDa, κι επειδή δεν είχε βαφτεί σωστά με τη χρωστική coomassie, όταν βάφτηκε με χρώση αργύρου, ανιχνεύτηκε κι άλλη μια μια απροσδόκητη πρωτεΐνη στα 28kDa (Agre et al., 1987). Η πρωτεΐνη αυτή των 28kDa, αρχικά, θεωρήθηκε ότι είναι ένα προϊόν της μεγαλύτερης πρωτεΐνης, αλλά τα κουνέλια που ανοσοποιήθηκαν με αυτή την πρωτεΐνη ανέπτυξαν μια ανοσολογική απόκριση ειδική για το μικρότερο αυτό θραύσμα (Denker et al., 1988). Επιπρόσθετα, τα αντισώματα μπορούσαν, επίσης, να ανιχνεύσουν ένα σήμα υψηλότερου μοριακού βάρους, μια Ν-συνδεδεμένη γλυκοπρωτεΐνη. Περαιτέρω μελέτες (Smith et al., 1991) χαρακτήρισαν τη νέα πρωτεΐνη ως μεμβρανικό κανάλι με αρκετές ομοιότητες με την MIP πρωτεΐνη, την κύρια ενδογενή πρωτεΐνη του φακού του ματιού η οποία μέχρι εκείνη τη στιγμή ήταν ένα υποθετικό μεμβρανικό κανάλι με απροσδιόριστη λειτουργία (Gorin et al., 1984). Η απόδειξη ότι το κανάλι που σχηματίζει η 28kDa πρωτεΐνη (CHIP28) μετέφερε νερό ήρθε το 1992, όταν ο Peter Agre και οι συνεργάτες του ένεσαν ωοκύτταρα του Xenopus laevis με το RNA της CHIP28. Στα ωοκύτταρα αυξήθηκε η ωσμωτική διαπερατότητα του Σελίδα 40

41 ύδατος σε σχέση με ωοκύτταρα μάρτυρες (Preston et al., 1992). Αυτή η επίδραση αναστρέψιμα αναστάλθηκε από τον υδράργυρο και αργότερα η κυστεΐνη 189 βρέθηκε να είναι η περιοχή όπου προσδένεται ο υδράργυρος και προκαλεί την αναστολή (Preston et al., 1993). Καθώς όλο και περισσότερες πρωτεΐνες μεταφοράς νερού ανακαλύπτονταν, εισήχθη η κοινή ονομασία των ακουαπορινών (Agre et al., 1993) και η CHIP28 μετονομάστηκε σε ακουαπορίνη1 (AQP1) (Agre, 1997) Άνθρωπος-ακουαπορίνες Στον άνθρωπο, 13 ομόλογα ακουαπορίνης έχουν ανακαλυφθεί. Χωρίζονται σε δύο υποομάδες: οι ορθόδοξες ακουαπορίνες (AQP0, AQP1, AQP2, AQP4, AQP5, AQP6, AQP8), που κυρίως μεταφέρουν νερό και οι ακουαγλυκεοπορίνες (AQP3, AQP7, AQP9, AQP10), που μεταφέρου νερό και γλυκερόλη. Οι υπόλοιπες δύο ακουαπορίνες (AQP11, AQP12) εξακολουθούν να έχουν απροσδιόριστη εξειδίκευση στη μεταφορά και συνήθως τοποθετούνται σε δική τους ομάδα και αναφέρονται ως σουπερακουαπορίνες Δομικά χαρακτηριστικά Υψηλή ανάλυση των δομών, αποκάλυψε κοινά χαρακτηριστικά των ακουαπορινών. Όπως είχε προβλεφθεί στις πολύ αρχικές μελέτες των ακουαπορινών, βρέθηκε ότι έχουν έξι α-έλικας διαμεμβρανικές περιοχές (TMDs), που συμβολίζονται 1-6 και πέντε συνδετικούς βρόγχους που συμβολίζονται A-E. Τα άκρα βρίσκονται στην ενδοκυτταρική πλευρά (Σχήμα 13). Σελίδα 41

42 Σχήμα 13. Έξι α-έλικας διαμεμβρανικές περιοχές (TMDs), που συμβολίζονται 1-6 και πέντε συνδετικούς βρόγχους που συμβολίζονται A-E. Οι βρόγχοι B και E περιέχουν το μοτίβο ένδειξης των ακουαπορινών: μια εξαιρετικά διατηρημένη αλληλουχία που αποτελείται από ασπαραγίνη-προλίνηαλανίνη (NPA). Αυτά τα δύο μοτίβα συναντιούνται στη μέση της διπλής στιβάδας (Jung et al., 1994b). Επομένως, η πρωτεΐνη αποτελείται από δύο όμοια μισά, που προκύπτουν από τη γονιδιακή επανάληψη των τριών TMD τμημάτων (Pao et al., 1991) (Σχήμα 14). Στη μεμβράνη, οι ακουαπορίνες συναρμολογούνται σε ομοτετραμερή (Smith et al., 1991), όπου κάθε υπομονάδα είναι μια λειτουργική μονάδα και περιέχει ένα μονό κανάλι νερού. Έτσι δημιουργείται ένας κεντρικός πόρος στη μέση των τεσσάρων μονομερών. Οι ακουαπορίνες ενώ παράλληλα διευκολύνουν τη μεταφορά του νερού, μπορούν ακόμη να είναι σε θέση να εμποδίζουν πρωτόνια, μιας και, μια διαρροή πρωτονίων θα καταστρέψει την κινητήρια δύναμη των πρωτονίων που είναι απαραίτητη για το κύτταρο και που χρησιμοποιείται για την παραγωγή ενέργειας. Στο NPA μοτίβο των ακουαπορινών, δύο θετικά φορτισμένες ασπαραγίνες έχουν προταθεί να είναι το κλειδί για τον εμποδισμό των πρωτονίων (de Groot et al., 2001). Το ηλεκτροστατικό πεδίο γύρω από το NPA μοτίβο δημιουργεί έναν αυστηρό προσανατολισμό των μορίων του νερού με αποτέλεσμα τη διακοπή της διαβίβασης των πρωτονίων που δημιουργούνται από τον Grotthuss μηχανισμό. Ωστόσο, έχει επίσης προταθεί ότι τα πρωτόνια άμεσα εμποδίζονται από το θετικό Σελίδα 42

43 ηλεκτροστατικό πεδίο, με την απώθησή τους να γίνεται με μικρά θετικά φορτισμένα σωματίδια (de Groot et al., 2005). Σχήμα 14. Οι βρόγχοι B και E περιέχουν το μοτίβο ένδειξης των ακουαπορινών: μια εξαιρετικά διατηρημένη αλληλουχία που αποτελείται από ασπαραγίνη-προλίνηαλανίνη (NPA) Το στενότερο τμήμα του πόρου είναι το φίλτρο εκλεκτικότητας και αποτελείται από μια σφιχτή περιοχή τεσσάρων αμινοξέων από αρωματικό/αργινίνη. Βρίσκεται σε εγγύτητα με την εξωκυτταρική είσοδο με ένα τυπικό πλάτος 2.8Å στις ακουαπορίνες και 3.4Å στις ακουαγλυκεροπορίνες (Walz et al., 2009). Στην AQP1 τα τέσσερα αμινοξέα είναι η Phe58, η His182, η Cys191 και η Arg197, με την ιστιδίνη να είναι συμβολική για τους μεταφορείς του νερού. Τα αμινοξέα διατάσσονται με τέτοιο τρόπο που δημιουργούν ένα μικρό στενό πέρασμα, αρκετά μεγάλο για να περάσει το νερό και υπεύθυνο για την εμπόδιση μορίων μεγάλα σε μέγεθος. Επιπλέον, δομικές αλλαγές σε ορισμένες ακουαπορίνες μπορούν να προκαλέσουν το άνοιγμα ή το κλείσιμο του καναλιού του νερού. Ο μηχανισμός αυτός αναφέρεται ως πύλη και είναι καλά εδραιωμένος στις φυτικές ακουαπορίνες. Ωστόσο, οι πύλες των ακουαπορινών στα θηλαστικά είναι αμφιλεγόμενες και δεν υπάρχουν δομικά χαρακτηριστικά ώστε να επιβεβαιώσουμε την ύπαρξή τους (Tornroth-Horsefield et al., 2010). Αντ αυτού οι ακουαπορίνες στον άνθρωπο ρυθμίζονται με τη διακίνηση από τα ενδοκυτταρικά κυστίδια στην πλασματική μεμβράνη. Έτσι παρέχεται μια πρώτη ταχεία απόκριση στις αλλαγές του βιολογικού περιβάλλοντος. Η διακίνηση πρώτα ανακαλύφθηκε για την AQP2, Σελίδα 43

44 αλλά έχει προταθεί και για άλλες ακουαπορίνες όπως η AQP1, η AQP5 και η AQP8. Στις ακουαγλυκεροπορίνες, τα αντίστοιχα αμινοξέα στην αρωματική περιοχή είναι η γλυκίνη, η τρυπτοφάνη και η φαινυλαλανίνη μαζί με τη συντηρημένη αργινίνη. Η σύνθεση των αμινοξέων δημιουργεί έναν ευρύτερο και πιο υδρόφοβο πόρο (Fu et al, 2000, Murata et al, 2000, de Groot & Grubmuller, 2001, Jensen et al, 2002, Tajkhorshid et al, 2002) Διαπερατότητα νερού έναντι γλυκερόλης Η συνολική τρισδιάστατη δομή, η σύσφιξη στο χώρο και η επιλεκτικότητα του φίλτρου είναι παρόμοιες για τις ακουαπορινες και τις ακουαγλυκεροπορίνες, με κάποιες μικρές αλλαγές στη δομή των ακουαπορινών να επηρεάζουν την προτίμηση των υποστρωμάτων, προκαλώντας το φαινόμενο της πύλης (Walz et al., 2009). Το μέγεθος του πόρου των αυστηρών διαμεσολαβητών του νερού είναι γενικά στενότερο, δημιουργώντας μια στερεοχημική παρεμπόδιση των μεγαλύτερων μορίων από το νερό, ενώ στις ακουαγλυκεροπορίνες η επένδυση του πόρου με αμινοξέα είναι γενικά περισσότερο υδρόφοβη δημιουργώντας ένα λιπαρό ολισθητήρα (Fu et al, 2000, Wang et al, 2005). Σε μια μελέτη της περιοχής σύσφιξης, όπου αυξήθηκε η διάμετρος του πόρου της ακουαπορίνης που μεταφέρει νερό, παρατηρήθηκε διαπερατότητα στην γλυκερόλη και στην ουρία (Beitz et al, 2006) AQP7 Η ακουαπορίνη-7 [aquaporin-7 (AQP7)] είναι μια ακουα-γλυκεροπορίνη, η οποία ρυθμίζει τη μεταφορά της γλυκερόλης μέσα κι έξω από το λιποκύτταρο, όπως επίσης και τη διακίνηση του νερού (Kishida et al, 2000). Το γονίδιό της αποτελείται από 8 εξώνια και βρίσκεται στο χρωμόσωμα 9p Η AQP7 εντοπίζεται περιπυρηνικά. Όταν γίνεται λιπόλυση, η επινεφρίνη αυξάνεται και παράλληλα αυξάνει τα επίπεδα του AMP, διαμέσου της ενεργοποίησης των αδρενεργικών υποδοχέων οι οποίοι διαδοχικά ενεργοποιούν την πρωτεϊνική Σελίδα 44

45 κινάση Α. Η πρωτεϊνική κινάση Α με τη σειρά της φωσφορυλιώνει την περιλιπίνη, η οποία καθιστά ικανή τη φωσφορυλιωμένη ορμονο-ευαίσθητη λιπάση να υδρολύσει τα τριγλυκερίδια σε λιπαρά οξέα και γλυκερόλη, προκαλώντας τη μετακίνηση της AQP7 στην πλασματική μεμβράνη ώστε να επιτευχθεί η απελευθέρωση της γλυκερόλης (Kishida et al, 2000). Σχήμα 15. Ρυθμιστικές περιοχές του γονιδίου της AQP7. Ο υποδοχέας peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ) είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της διαφοροποίησης των λιποκυττάρων και ρυθμίζει σε επίπεδο μεταγραφής διάφορα γονίδια ειδικά για το λιπώδη ιστό. Όταν ενεργοποιείται, o PPARγ διαμορφώνει ένα ετεροδιμερές με τον α υποδοχέα του ρετινοϊκού οξέος Χ και δεσμεύεται στο peroxisome proliferator response element (PPRE) του AQP7 υποκινητή, προκαλώντας υπερενεργοποίηση των mrna επιπέδων της AQP7 στα λιποκύτταρα (Kishida et al, 2001a, Kishida et al, 2001b) (Σχήμα 15). Σε μελέτη, που δημιούργησαν Aqp7 - knockout (KO) ποντίκια, βρέθηκε ότι τέτοια ποντίκια έχουν χαμηλά επίπεδα γλυκερόλης πλάσματος και ότι η απελευθέρωση της γλυκερόλης ήταν σε χαμηλά επίπεδα ως απόκριση στον β3- αδρενεργικό αγωνιστή, δείχνοντας ότι η AQP7 ενεργεί ως ένα μόριο των λιποκυττάρων που ανοίγει την οδό στη γλυκερόλη ώστε να γίνει αποτελεσματική η απελευθέρωσή της από το λιποκύτταρο. Τα KO ποντίκια ανέπτυξαν παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη ακόμη και σε μια νεαρή ηλικία μετά από κατανάλωση πλούσιας σε λίπη διατροφής ή πλούσιας σε σακχαρόζη (Toshiyuki et al, 2005). Σελίδα 45

46 Η κινάση της γλυκερόλης (Gyk) είναι ένα ένζυμο που καταλύει τη φωσφορυλίωση της γλυκερόλης σε γλυκερόλη-3 - P. Βρέθηκε ότι η ενδοκυτταρική συσσώρευση της γλυκερόλης στα Aqp7 KO ποντίκια και knockdown λιποκύτταρα αυξάνει την ενζυματική δραστηριότητα της κινάσης της γλυκερόλης, με αποτέλεσμα την αύξηση της πρόσληψης λιπαρών οξέων και τη συσσώρευση των τριγλυκεριδίων. Τα παραπάνω πειράματα, καταδεικνύουν ότι η απενεργοποίηση της AQP7 οδηγεί στην αύξηση της δραστηριότητας της κινάσης της γλυκερόλης, στην αύξηση της σύνθεσης των τριγλυκεριδίων στα λιποκύτταρα και τελικά οδηγεί στην ανάπτυξη παχυσαρκίας (Toshiyuki et al, 2005). Επιπρόσθετα, μελέτες έχουν δείξει μια ηλικιο-εξαρτώμενη υπερτροφία των λιποκυττάρων σε AQP7- ανεπαρκή (null mice) ποντίκια. Τα άγριου τύπου ποντίκια και τα AQP7- ανεπαρκή βρέθηκε να έχουν παρόμοια αύξηση από 0 16 εβδομάδες. Εντούτοις, μετά το πέρας των 16 εβδομάδων τα AQP7- ανεπαρκή ποντίκια είχαν 3,7 φορές περισσότερη λιπώδη μάζα. Τα λιποκύτταρα των AQP7- ανεπαρκών ποντικών, ηλικίας 16 εβδομάδων ήταν πολύ μεγαλύτερα (διάμετρος 118 μm) σε σχέση με τα λιποκύτταρα του άγριου τύπου ποντικιών (39 μm). Τα λιποκύτταρα από τα AQP7- ανεπαρκή ποντίκια συσσώρευαν, επίσης, υπερβολική γλυκερόλη και τριγλυκερίδια. Για να εξερευνηθεί ο μηχανισμός που είναι αρμόδιος για την προοδευτική υπερτροφία των λιποκυττάρων, μελετήθηκαν η διαπερατότητα της γλυκερόλης και ο μεταβολισμός του λίπους σε λιποκύτταρα που απομονώθηκαν από τα πιο μικρά σε ηλικία ποντίκια. Η διαπερατότητα της γλυκερόλης στην πλασματική μεμβράνη μετρήθηκε με [ 3 H]γλυκερόλη και βρέθηκε ότι ήταν 3 φορές μειωμένη στα λιποκύτταρα των AQP7-ανεπαρκών ποντικών. Συμπερασματικά, η υπερτροφία των λιποκυττάρων στα AQP7- ανεπαρκή ποντίκια έχει ως αποτέλεσμα την ελαττωματική έξοδο της γλυκερόλης και την επακόλουθη συσσώρευση αυτής και των τριγλυκεριδίων. Συνεπώς, αυξάνοντας την έκφραση ή τη λειτουργία της AQP7 στα λιποκύτταρα μπορεί να μειωθεί το μέγεθος του λιποκυττάρου και η λιπώδης μάζα στην παχυσαρκία (Mariko et al, 2005). Μελέτες που έχουν γίνει για τη γονιδιακή έκφραση της AQP7 στον άνθρωπο (ενήλικες) έχουν δείξει διαφορετικά αποτελέσματα σε διάφορες καταστάσεις παχυσαρκίας και σε διαφορετικές περιοχές εναπόθεσης του λιπώδους ιστού. Έχει δειχτεί ότι η γονιδιακή έκφραση της AQP7 είναι μειωμένη στον υποδόριο λιπώδη ιστό γυναικών που έχουν σοβαρή παχυσαρκία (Ceperuelo-Mallafre et al, 2007). Σελίδα 46

47 Αντιθέτως, τα mrna επίπεδα της AQP7 είχαν μια τάση αύξησης στον ενδοκοιλιακό λιπώδη ιστό γυναικών που δεν είχαν σοβαρή παχυσαρκία όταν συγκρίθηκαν με λεπτόσωμα άτομα (Catalan et al, 2008). Σε μελέτη όπου έγινε σύγκριση της έκφρασης της AQP7 στον υποδόριο και στον ενδοκοιλιακό λιπώδη ιστό λεπτόσωμων και υπέρβαρων ατόμων βρέθηκε ότι τα επίπεδα της AQP7 είναι υψηλότερα στον υποδόριο ιστό σε σχέση με τον ενδοκοιλιακό. Ασθενείς με Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου 2 βρέθηκαν να έχουν αυξημένα επίπεδα AQP7 στον ενδοκοιλιακό λιπώδη ιστό σε σχέση με τον υποδόριο (M. Miranda et al, 2010). Επομένως, είτε στην περίπτωση της ακραίας παχυσαρκίας είτε σε αυτή που τα άτομα είχαν Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου 2 παρατηρήθηκε μια αντίστροφη σχέση μεταξύ της έκφρασης της AQP7 στον υποδόριο και ενδοκοιλιακό ιστό σε σύγκριση με τα λεπτόσωμα άτομα αντίστοιχα. Επειδή μόνο ο ενδοκοιλιακός ιστός έχει άμεση πρόσβαση στο ήπαρ μέσω του συστήματος τριχοειδών αγγείων, αυτές οι διαφορές μπορεί να έχουν ενδεχομένως μια φυσιολογική σημασία. Ο υποδόριος ιστός είναι πιο ευαίσθητος στην ινσουλίνη (Meek et al, 1999) και η ινσουλίνη έχει δειχτεί ότι μειώνει την έκφραση της AQP7 (Kishida et al, 2001a ). Έτσι, είναι μη αναμενόμενο να βρεθούν πιο υψηλά AQP7 επίπεδα στον υποδόριο ιστό σε σχέση με τον ενδοκοιλιακό σε μη-ινσουλίνο-ευαίσθητα άτομα. Εντούτοις, εκτός αυτού, ο υποδόριος ιστός είναι πιο ευαίσθητος στην ινσουλίνη και έχει υψηλότερα επίπεδα λιπόλυσης από τον ενδοκοιλιακό. Αντίθετα, ο ενδοκοιλιακός ιστός είναι πιο ευαίσθητος στη λιπόλυση που προκαλείται από τις κατεχολαμίνες σε σύγκριση με τον υποδόριο (Arner, 2005). Στην παχυσαρκία στους ενήλικες, ενώ υπάρχει μια γενική αντίσταση στην ινσουλίνη, η αντίσταση στη λιπόλυση που διενεργείται μέσω των κατεχολαμινών έχει περιγραφεί στον υποδόριο ιστό αλλά όχι στον ενδοκοιλιακό (Arner, 2005). Κατά συνέπεια, υψηλότερα ποσοστά λιπόλυσης στον ενδοκοιλιακό ιστό μπορούν να εξηγήσουν τις υψηλότερες απαιτήσεις σε AQP7 στη σοβαρή παχυσαρκία και στο Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου 2. Συνεπώς, η έκφραση της AQP7 ρυθμίζεται διαφορετικά σε αυτές τις δύο αποθήκες λπώδους ιστού. Τρεις τύποι missense μεταλλάξεων στο γονίδιο της AQP7 παρατηρήθηκαν σε μια μελέτη 160 Γιαπωνέζων ενήλικων ατόμων. Σε άτομα που ήταν ομοζυγωτικά ως προς τις Gly264Val μεταλλάξεις, τα επίπεδα της γλυκερόλης δεν αυξάνονταν κατά τη διάρκεια σωματικής άσκησης, ενώ τα επίπεδα της γλυκερόλης ήταν Σελίδα 47

48 αυξημένα σε υγιή άτομα με την άγριου τύπου AQP7 (Kondo et al, 2002). Εξαιτίας, λοιπόν, της μετάλλαξης που είχαν τα άτομα αυτά, η AQP7 δεν ήταν λειτουργική κι έτσι δεν μπορούσε να γίνει η έξοδος της γλυκερόλης στην κυκλοφορία του αίματος, με αποτέλεσμα να συσσωρεύεται στα λιποκύτταρα και να προκαλεί την αύξηση της πρόσληψης λιπαρών οξέων και τη συσσώρευση τριγλυκεριδίων. Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι η AQP7 είναι ένα σημαντικό μόριο για τη διατήρηση των επιπέδων της γλυκερόλης του πλάσματος στον άνθρωπο. Επιπλέον, ένα άτομο ομόζυγο για την Gly264Val μετάλλαξη είχε Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου 2 και ήταν υπέρβαρο (BMI 28 kg/m). Μελέτες που έγιναν στο γονίδιο της AQP7 ταυτοποίησαν αρκετούς SNPs (Prudente et al, 2007) και έδειξαν ότι ένας συγκεκριμένος τύπος (Α-953G) που βρέθηκε στον υποκινητή του γονιδίου της AQP7 σχετίζεται με το Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου 2 σε δείγμα 977 ανδρών και γυναικών. Βρέθηκε ότι ο (Α-953G) ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση του γονιδίου της AQP7, μειώνοντας την πρόσδεση του C/EBPβ μεταγραφικού παράγοντα στην περιοχή αυτή, το οποίο με τη σειρά του μειώνει τη μεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου της AQP7. Σελίδα 48

49 Σκοπός Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι: 1) Η ανίχνευση πολυμορφισμών και μεταλλάξεων στον υποκινητή του γονιδίου της AQP7 σε προεφηβικά και εφηβικά παιδιά με νοσογόνο παχυσαρκία σε σύγκριση με αντίστοιχα λεπτόσωμα παιδιά. 2) Η συσχέτιση των επιπέδων στον ορό του αίματος των παιδιών αυτών της γλυκόζης νηστείας, τριγλυκεριδίων, χοληστερίνης, HDL και LDL και των δεικτών γενικευμένης παχυσαρκίας (ΒΜΙ %) και κεντρικής παχυσαρκίας (περίμετρο μέσης) με τυχόν πολυμορφισμούς ή μεταλλάξεις στον υποκινητή της AQP7. Σελίδα 49

50 2. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Σελίδα 50

51 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Ασθενείς και μάρτυρες Από το Καραμανδάνειο Νοσοκομείο Παίδων της Πάτρας, έγιναν δειγματοληψίες αίματος από ασθενείς και μάρτυρες, οι οποίοι θα υποβάλλονταν σε χειρουργεία ρουτίνας. Υπήρξε έγκριση από την Ηθική επιτροπή του Καραμανδανείου και επίσης γραπτή συνεννόηση των γονέων των ατόμων της δειγματοληψίας. Οι δειγματοληψίες έγιναν σε 102 άτομα, τα οποία βρίσκονταν σε εφηβικό και προεφηβικό στάδιο. Από αυτά τα 102 άτομα, τα 38 ήταν παχύσαρκα και τα 64 ήταν λεπτόσωμα. Παρακάτω αναφέρονται οι μέθοδοι και τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή των αποτελεσμάτων μας. 2.2.Απομόνωση DNA Η απομόνωση DNA από τα άτομα των δειγματοληψιών μας, έγινε με κιτ (NucleoSpin Blood Quick Pure- Macherey Nagel) ακολουθώντας το πρωτόκολλο της εταιρίας. Η απομόνωση έγινε χρησιμοποιώντας μια αρχική ποσότητα αίματος (200μl) σαν πρώτη ύλη και στηρίζεται στην καταστροφή των λευκών αιμοσφαιρίων και εξαγωγή του DNA από τους πυρήνες τους. H όλη πορεία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: Από το σωλήνα της γενικής αίματος απομονώνονται 200 μl αίματος και αναδεύονται με 25μl πρωτεϊνάσης Κ. Η πρωτεϊνάση Κ έχει την ιδιότητα να πέπτει τις πρωτεΐνες του αίματος και να απομακρύνει τις ακαθαρσίες του νουκλεϊκού οξέος για τη διαδικασία καθαρισμού του DNA. Στη συνέχεια, προστίθεται 200 μl λυτικό διάλυμα BQ1, ένα διάλυμα που έχει την ιδιότητα να διαλύει την κυτταρική και την πυρηνική μεμβράνη απελευθερώνοντας με αυτό τον τρόπο το DNA και πραγματοποιείται γρήγορη ανάδευση (vortex). Έπειτα, τα δείγματα μεταφέρονται σε υδατόλουτρο στους 70 C για 20 όπου ενισχύεται η δράση των διαλυμάτων και παρατηρείται σταδιακή αλλαγή στο χρωματισμό των δειγμάτων. Μετά το πέρας Σελίδα 51

52 του χρόνου τα δείγματα αφήνονται να κρυώσουν και προστίθεται 200 μl αιθανόλης για να επιτευχθεί το ξετύλιγμα και η κατακρήμνιση του DNA και πραγματοποιείται γρήγορη ανάδευση (vortex). Εν συνεχεία, τα δείγματα μεταφέρονται σε ειδικές κολώνες που περιέχουν στο εσωτερικό τους μια μεμβράνη πυριτίου και φυγοκεντρούνται για 1 στις rpm. Τοποθετείται ένα καινούργιο συλλεκτικό σωληνάκι σε κάθε κολώνα και προστίθεται 200μl ειδικού αλκοολούχου διάλυματος BQ2 που ξεπλένει τη μεμβράνη πυριτίου. Το DNA έχει την ιδιότητα να δεσμεύεται με τα ιόντα του πυριτίου στη μεμβράνη και το διάλυμα BQ2 ξεπλένει την μεμβράνη από τις προσμίξεις που μπορεί να υπάρχουν στο DNA. Η παραπάνω διαδικασία επαναλαμβάνεται 2 φορές. Τέλος, προστίθεται στο κέντρο της μεμβράνης 25 μl διαλύματος BE αφού έχει προθερμανθεί στους 70 C και έχει τοποθετηθεί η μεμβράνη σε καινούργιο σωληνάκι τύπου eppendorf. Τα δείγματα επωάζονται για 2 σε θερμοκρασία δωματίου και φυγοκεντρούνται για 1 στις 12000rpm. Το διάλυμα ΒΕ περιέχει μια χαμηλή συγκέντρωση αλάτων που έχει την ιδιότητα να απελευθερώνει το δεσμευμένο στη μεμβράνη πυριτίου DNA και έτσι στο σωληνάκι τύπου eppendorf συλλέγεται το καθαρό προϊόν, DNA, που φυλάσσεται στους -20 C για περεταίρω χρήση PCR (Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) Το DNA που απομονώθηκε με την παραπάνω διαδικασία, χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα για τη διεξαγωγή PCR αντίδρασης, για τον πολλαπλασιαμό της αλληλουχίας DNA του υποκινητή του γονιδίου AQP7. Για τον πολλαπλασιασμό της αλληλουχίας DNA του υποκινητή του γονιδίου AQP7, σχεδιάστηκαν τέσσερα ζεύγη εκκινητών (PR1a, PR1b, PR2a, PR2b) με τέτοιο τρόπο, ώστε οι περιοχές πρόσδεσης του κάθε ζεύγους να επικαλύπτουν τις περιοχές πρόσδεσης του προηγούμενου, με τον ανοδικό εκκινητή του πρώτου ζεύγους να προσδένεται κάποιες βάσεις ανοδικά της αρχής του υποκινητή. Έτσι, καταυτόν τον τρόπο, στην αλληλούχιση των προϊόντων αυτής της αντίδρασης δε θα υπάρχουν κενές περιοχές (που δε θα έχουν διαβαστεί). Σελίδα 52

53 παρακάτω: Τα βήματα και τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν στην PCR παρατίθενται Μείγμα (μl) 5x Κapa Hifi PCR buffer 5 (περιέχει 2mM MgCl 2 ) Kapa dntp s (10mM το καθένα) 0,75 25μΜ primer forward 0,3 25μΜ primer reverse 0,3 Kapa Hifi DNA polymerase 0,5 dh 2 O μέχρι τα 25 DNA 0,7-1 Συνθήκες 95 C για 5 (αρχική αποδιάταξη) 98 C για 20 (αποδιάταξη) Tm Primer για 15 (υβριδοποίηση των εκκινητών) 72 C για 15 (επιμήκυνση της αλυσίδας) Πήγαινε στο βήμα 2 για 35 κύκλους 72 C για 5 (συμπλήρωση μονόκλωνων άκρων) 4 C για πάντα (ολοκλήρωση της διαδικασίας) Τα βήματα και τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή των αποτελεσμάτων μας για κάθε ζεύγος εκκινητών αναλύονται παρακάτω: PR1a (μl) Συνθήκες 5x PCR buffer 5 95 C για 5 dntp s 0,75 98 C για 20 25μΜ primer forward 0,3 64 C για 15 25μΜ primer reverse 0,3 72 C για 15 DNA polymerase 0,5 Go to step 2 for 35 cycles dh 2 O 17,15 72 C για 5 DNA 1 4 C για πάντα Σελίδα 53

54 PR1b (μl) Συνθήκες 5x PCR buffer 5 95 C για 5 dntp s 0,75 98 C για 20 25μΜ primer forward 0,3 62 C για 15 25μΜ primer reverse 0,3 72 C για 15 DNA polymerase 0,5 Go to step 2 for 35 cycles dh 2 O 17,45 72 C για 5 DNA 0,7 4 C για πάντα PR2a (μl) Συνθήκες 5x PCR buffer 5 95 C για 5 dntp s 0,75 98 C για 20 25μΜ primer forward 0,3 67 C για 15 25μΜ primer reverse 0,3 72 C για 15 DNA polymerase 0,5 Go to step 2 for 35 cycles dh 2 O 17,15 72 C για 5 DNA 1 4 C για πάντα PR2b (μl) Συνθήκες 5x PCR buffer 5 95 C για 5 dntp s 0,75 98 C για 20 25μΜ primer forward 0,3 67 C για 15 25μΜ primer reverse 0,3 72 C για 15 DNA polymerase 0,5 Go to step 2 for 35 cycles dh 2 O 17,15 72 C για 5 DNA 0,7 4 C για πάντα Σελίδα 54

55 Οι αντιδράσεις πολυμερισμού έλαβαν χώρα σε θερμικό κυκλοποιητή (RTC Peltier Thermal Cycler) (Σχήμα 1). Η θερμοκρασία υβριδοποίησης καθώς και η αλληλουχία των εκάστοτε εκκινητών φαίνονται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 1): Πίνακας 1. Οι αλληλουχίες των εκκινητών καθώς οι θερμοκρασίες υβριδοποίησής τους. Εκκινητές Αλληλουχία Τm PR1a ανοδικός 5 -TCTGCAGTTGAACTTTCTGC-3 64 C PR1a καθοδικός 5 - CAGGTAAGCAGCAGGTGACT-3 64 C PR1b ανοδικός 5 - TCACCTGCTGCTTACCTGTC-3 62 C PR1b καθοδικός 5 - CTTCCTAGTCAGAAGCCCTC-3 62 C PR2a ανοδικός 5 -GAGGCAGAGATTGTGGTGAG-3 67 C PR2a καθοδικός 5 - AGTCCTCAGGGAACCCCCAT-3 67 C PR2b ανοδικός 5 -GGACAGGTGGACTGCTCCTC-3 67 C PR2b καθοδικός 5 - CAGCTATCCCTGTGTCCCCA-3 67 C Σχήμα 1. Απεικόνιση μηχανήματος PCR Σελίδα 55

56 Ανάλυση των προϊόντων της PCR σε πήκτωμα αγαρόζης Μέθοδος Σε κωνική φιάλη προστέθηκαν 1,28gr αγαρόζης (Invitrogen) και 160ml διάλυμα TBE 0,5x καθώς και 2μl βρωμιούχου αιθιδίου (ΕtBr). Το EtBr έχει την ιδιότητα να συνδέεται με τις βάσεις του DNA και να φωσφορίζει όταν εκτεθεί σε υπεριώδη ακτινοβολία σηματοδοτώντας με αυτόν τον τρόπο τα δείγματα σε ένα πήκτωμα αγαρόζης. Το διάλυμα εισήχθη σε κατάλληλη μήτρα ηλεκτροφόρησης, η οποία περιελάμβανε το σχηματισμό κελιών, στα οποία φορτώθηκαν τα δείγματα. Αφού πολυμερίστηκε το πήκτωμα, στη συσκευή ηλεκτροφόρησης προστέθηκε διάλυμα TBE 1x, έτσι ώστε να καλύπτεται πλήρως το πήκτωμα. Στα σωληνάρια τύπου eppendorf που διεξήχθησαν οι αντιδράσεις PCR και περιείχαν 25λ τελικού προϊόντος προστέθηκαν 7,5λ loading buffer. Στη συνέχεια, φορτώθηκε όλο το παραπάνω μείγμα (32,5μl) από το κάθε δείγμα στο πήκτωμα και ηλεκτροφορήθηκαν εφαρμόζοντας σταθερή τάση 80Volt. Στο πρώτο κελί του πηκτώματος, φορτώθηκε μάρτυρας γνωστής συγκέντρωσης βάσεων (ladder), ο οποίος σχημάτιζε ζώνες που ταυτολογούσαν το μέγεθος του προϊόντος της PCR. Το πήκτωμα τοποθετήθηκε με κατεύθυνση από το θετικό προς τον αρνητικό, καθώς αυτή είναι η πορεία κίνησης του DNA λόγω των αρνητικών φωσφορικών ομάδων που φέρει. Σχήμα 2. Απεικόνιση πηκτώματος αγαρόζης σε U.V. και εμφάνιση των προϊόντων της PCR με τη βοήθεια του βρωμιούχου αιθιδίου(κόκκινες γραμμές). Η πορεία της ηλεκτροφόρησης παρακολουθήθηκε από το μέτωπο της χρωστικής που περιεχόταν στο loading buffer. Όταν το μέτωπο πλησίασε το τέλος Σελίδα 56

57 του πηκτώματος, σταμάτησε η ηλεκτροφόρηση και το πήκτωμα παρατηρήθηκε σε U.V.φωτισμό (Σχήμα 2). Υλικά 10x TBE: (1000ml) (500ml) Tris-Base (MB : ) 108g 54g Βορικό οξύ 55g 27,5g 0.5M EDTA 5,845g 2,9225g dh 2 O έως τον τελικό όγκο Loading Buffer: Glycerol 3ml 0.5 x TBE 7,5ml καλή ανάδευση Προσθήκη Bromophenol Blue μέχρι την επίτευξη του σωστού χρώματος. Ladder: Loading dye Stock 1Kb/100bp dh 2 O (1Kb/100bp) 30μl 10μl 60μl Καθαρισμός προϊόντων PCR από το πήκτωμα της αγαρόζης Ο καθαρισμός των προϊόντων της PCR από το πήκτωμα αγαρόζης, γίνεται σύμφωνα με το πρωτόκολλο της προμηθεύτριας εταιρίας (Sigma Aldrich, Sigma- GenΕlute Gel Extraction kit). Η αρχή της μεθόδου είναι η αναδιάλυση του πηκτώματος και το πέρασμά του από φίλτρο με κατάλληλους πόρους που συγκρατούν το DNA. Έπειτα το DNA εκλούεται ξανά μέσα σε νέο αποστειρωμένο eppendorf. Η όλη πορεία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: Αποστειρωμένα σωληνάκια τύπου eppendrof αριθμούνται και ζυγίζονται άδεια. Με χρήση αποστειρωμένου νυστεριού αποκόπτονται οι ζώνες που έχουν προκύψει από τα προϊόντα της PCR και τοποθετούνται ένα-ένα στα αριθμημένα τύπου eppendorf σωληνάκια (Σχήμα 3). Στη συνέχεια, τα σωληνάκια ζυγίζονται ξανά και αφαιρείται από αυτά η τιμή από την προηγούμενη μέτρηση έτσι ώστε, να Σελίδα 57

58 προκύψει η καθαρή μάζα του προϊόντος της PCR. Έπειτα, στα δείγματα προστίθεται διάλυμα που είναι ικανό να διαλύσει το πήκτωμα (gel solubilization) με την εξής αναλογία: προστίθεται τριπλάσια ποσότητα διαλύματος σε σχέση με το καθαρό βάρος του προϊόντος της PCR και τα δείγματα τοποθετούνται σε υδατόλουτρο στους 65 C για 20. Ανά 2-3 λεπτά πραγματοποιείται γρήγορη ανάδευση (vortex). Ενόσω τα δείγματα βρίσκονται στο υδατόλουτρο, προετοιμάζονται οι κολώνες που περιέχουν στο εσωτερικό τους μια μεμβράνη πυριτίου, όπου θα δεσμευτεί το DNA. Για τη δέσμευση του DNA η μεμβράνη εκλούεται με 500 μl διαλύματος column preparation. Γίνεται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις rpm και άδειασμα του υγρού. Μετά την επώαση των δειγμάτων στο υδατόλουτρο, προστίθεται σε αυτά ισοπροπανόλη, ίση ποσότητα με το καθαρό βάρος του προϊόντος της PCR. Εν συνεχεία, φορτώνουμε στην κολώνα όλο το δείγμα ώστε να επιτευχθεί η δέσμευση του DNA στη μεμβράνη. Φυγοκεντρούμε για 1 λεπτό στις rpm. Τέλος, προστίθεται στο κέντρο της μεμβράνης 40λ διαλύματος έκλουσης, αφού έχει τοποθετηθεί η μεμβράνη σε καινούργιο σωληνάκι τύπου eppendorf. Το διάλυμα έκλουσης έχει προθερμανθεί προηγουμένως στους 65 C. Σχήμα 3. Απεικόνιση της διαδικασίας επιλογής των προϊόντων PCR από το πήκτωμα της αγαρόζης ώστε να γίνει μετέπειτα ο καθαρισμός τους. Τα δείγματα επωάζονται για 2 σε θερμοκρασία δωματίου και φυγοκεντρούνται για 1 στις 12000rpm. Το διάλυμα έκλουσης περιέχει μια χαμηλή συγκέντρωση αλάτων που έχει την ιδιότητα να απελευθερώνει το δεσμευμένο στη μεμβράνη πυριτίου DNA και έτσι στο σωληνάκι τύπου eppendorf συλλέγεται το καθαρό προϊόν DNA. Σελίδα 58

59 2.4. Αλληλούχιση του DNA Η αλληλούχιση του DNA αποτελεί μια διαδικασία προσδιορισμού της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ενός δεδομένου τμήματος DNA. Συνήθως, η αλληλούχιση του DNA εκτελείται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο λήξης αλυσίδων (chain termination method) που αναπτύχθηκε από τον Frederick Sanger. Η τεχνική αυτή χρησιμοποιεί μια καθορισμένη ακολουθία λήξης μιας αντίδρασης σύνθεσης του DNA χρησιμοποιώντας ως υποστρώματα τροποποιημένα νουκλεοτίδια. Η αλληλουχία του DNA κωδικοποιεί τις απαραίτητες πληροφορίες για τη διαβίωση και την αναπαραγωγή του οργανισμού. Ο καθορισμός της αλληλουχίας είναι επομένως χρήσιμος στη βασική έρευνα διότι για παράδειγμα στην ιατρική μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό, τον εντοπισμό και την ανάπτυξη ενδεχόμενων θεραπειών για ασθένειες όπως τις γενετικές. Ομοίως, η έρευνα των παθογόνων μικροοργανισμών μπορεί να οδηγήσει στη θεραπεία των μεταδοτικών ασθενειών. Τα καθαρισμένα δείγματα DNA από το πήκτωμα στέλνονται στη Λάρισα στη Σχολή επιστημών Υγείας, όπου το Τμήμα Ανοσολογίας της Ιατρικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας εκτελεί προσδιορισμό της αλληλουχίας τους. Στη συνέχεια, συγκρίνεται η αλληλουχία του κάθε δείγματος με την αλληλουχία του υποκινητή όπως έχει ταυτοποιηθεί από τους Kondo H. et al. (2002) σε ειδική βάση δεδομένων στο διαδίκτυο (NCBI, blast-βάση δεδομένων). Με αυτό τον τρόπο προσδιορίζονται τυχόν αλλαγές ή μεταλλάξεις στα δείγματα που αναλύθηκαν. 2.5.Στατιστική ανάλυση Στα αποτελέσματα από την αλληλούχιση των τμημάτων του εκκινητή του γονιδίου AQP7 έγινε επεξεργασία με το πρόγραμμα aling two sequences από το διαδικτυακό τόπο Οι αλλαγές στην ακολουθία των αμινοξέων παρατηρήθηκε από το πρόγραμμα BioEdit sequence alignment editor, όπου παρατηρήθηκαν στις καμπύλες της αλληλουχίας οι τυχόν υποκαταστάσεις βάσεων. Οι συσχετίσεις των πολυμορφισμών με τα κλινικά Σελίδα 59

60 χαρακτηριστικά των ατόμων πραγματοποιήθηκε με το στατιστικό πρόγραμμα spss 21. Σελίδα 60

61 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σελίδα 61

62 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. Δείγματα για αλληλούχιση Τα PCR δείγματα μετά τον καθαρισμό τους από το πήκτωμα, όπως προαναφέρθηκε, ηλεκτροφορούνται για να διαπιστωθεί η σωστή και επαρκής αππομόνωσή τους. Παρακάτω παρατίθενται ενδεικτικές φωτογραφίες των PCR προϊόντων μετά τον καθαρισμό τους από το πήκτωμα και για τα 4 ζεύγη εκκινητών. Φαίνεται το μέγεθος των προϊόντων που ενισχύει κάθε εκκινητής. Μάρτυρες μεγέθους 1kb PR1a PR1a PR1a PR1a PR1a PR1a PR1a PR1a PR1a PR1b PR1b 752bp 686bp Σχήμα 1. Ενδεικτική φωτογραφία των PCR προϊόντων μετά τον καθαρισμό τους από το πήκτωμα, για τα ζεύγη εκκινητών PR1a και PR1b. Μάρτυρες μεγέθους 1kb 686bp Σχήμα 2. Ενδεικτική φωτογραφία των PCR προϊόντων μετά τον καθαρισμό τους από το πήκτωμα, για τoς ζεύγος εκκινητών PR1b. Σελίδα 62

63 Mάρτυρες μεγέθους 1kb PR2a PR2a PR2a PR2a PR2a PR2a PR2a PR2a PR2a PR2a PR2a 860bp Σχήμα 3. Ενδεικτική φωτογραφία των PCR προϊόντων μετά τον καθαρισμό τους από το πήκτωμα, για το ζεύγος εκκινητών PR2a.. Mάρτυρες μεγέθους 1kb 648bp Σχήμα 4. Ενδεικτική φωτογραφία των PCR προϊόντων μετά τον καθαρισμό τους από το πήκτωμα, για το ζεύγος εκκινητών PR2b Πολυμορφισμοί Μετά την αλληλούχιση των δειγμάτων, πραγματοποιήθηκε σύγκριση της αλληλουχίας του κάθε δείγματος, με την αλληλουχία του υποκινητή όπως έχει ταυτοποιηθεί από τους Kondo H. et al. (2002) και βρέθηκαν οι εξής μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί [single nucleotide polymorphisms (SNPs)] στον υποκινητή του γονιδίου της AQP7: στη θέση -2291(A2710G) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7, όπου βρέθηκε αλλαγή βάσης από αδενίνη σε γουανίνη, Σελίδα 63

64 στη θέση -2219(C2782A), όπου βρέθηκε αλλαγή βάσης από κυτοσίνη σε αδενίνη, στη θέση -2091(C2910Α), όπου βρέθηκε αλλαγή βάσης από κυτοσίνη σε αδενίνη στη θέση -1884(C3117T), όπου βρέθηκε αλλαγή βάσης από κυτοσίνη σε θυμίνη στη θέση -1123(C3878T), όπου βρέθηκε αλλαγή βάσης από κυτοσίνη σε θυμίνη και στη θέση -953(Α4048G), όπου βρέθηκε αλλαγή βάσης από αδενίνη σε γουανίνη. Σελίδα 64

65 Σχήμα 5. Η αλληλουχία του υποκινητή του γονιδίου της AQP7, όπως έχει ταυτοποιηθεί από τους Kondo H. et al. (2002) και οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί που βρέθηκαν στα δείγματα που ελέγχθηκαν Μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός στη θέση -2291(A2710G) Πραγματοποιήθηκε σύγκριση της αλληλουχίας του κάθε δείγματος, με την αλληλουχία του υποκινητή όπως έχει ταυτοποιηθεί από τους Kondo H. et al. (2002) και βρέθηκε αλλαγή βάσης στη θέση -2291(A2710G) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7 και με τον ανοδικό αλλά και με τον καθοδικό εκκινητή. Σχήμα 6. Ενδεικτική απεικόνιση της σύγκρισης της αλληλουχίας του κάθε δείγματος, με την αλληλουχία του υποκινητή όπως έχει ταυτοποιηθεί από τους Kondo H. et al. (2002) και βρέθηκε αλλαγή βάσης στη θέση -2291(A2710G) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7 με τον ανοδικό εκκινητή. Σελίδα 65

66 Σχήμα 7. Ενδεικτική απεικόνιση της σύγκρισης της αλληλουχίας του κάθε δείγματος, με την αλληλουχία του υποκινητή όπως έχει ταυτοποιηθεί από τους Kondo H. et al. (2002) και βρέθηκε αλλαγή βάσης στη θέση -2291(A2710G) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7 με τον καθοδικό εκκινητή. Η αλλαγή βάσης, στη συνέχεια, ταυτοποιήθηκε στο χρωματογράφημα και βρέθηκε ότι στην αλληλούχιση με τον ανοδικό εκκινητή, η αδενίνη υποκαθίσταται από τη γουανίνη και αντίστοιχα στην αλληλούχιση με τον καθοδικό εκκινητή η θυμίνη υποκαθίσταται από την κυτοσίνη. Σχήμα 8. Ενδεικτική απεικόνιση της αλλαγής βάσης που ταυτοποιήθηκε στο χρωματογράφημα και βρέθηκε ότι στην αλληλούχιση με τον ανοδικό εκκινητή η αδενίνη υποκαθίσταται από τη γουανίνη. Σελίδα 66

67 Σχήμα 9. Ενδεικτική απεικόνιση της αλλαγής βάσης που ταυτοποιήθηκε στο χρωματογράφημα και βρέθηκε ότι στην αλληλούχιση με τον καθοδικό εκκινητή η θυμίνη υποκαθίσταται από την κυτοσίνη. Ο μονονουκλεοτιδικός πουμορφισμός στη θέση -2291(A2710G), βρέθηκε σε 13 μάρτυρες εκ των οποίων: 7 μάρτυρες είχαν περίμετρο μέσης μεγαλύτερη του 75%, δύο εκ των οποίων είχαν οικογενειακό ιστορικό για Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου ΙΙ 2 μάρτυρες είχαν αυξημένη γλυκόζη νηστείας και περίμετρο μέσης μεγαλύτερη του 75%, ένας εκ των οποίων είχε οικογενειακό ιστορικό για Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου ΙΙ Συνολικά 5 μάρτυρες είχαν οικογενειακό ιστορικό για Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου ΙΙ Ο μονονουκλεοτιδικός πουμορφισμός στη θέση -2291(A2710G), βρέθηκε και σε 5 παχύσαρκα παιδιά εκ των οποίων: 3 παχύσαρκα παιδιά είχαν περίμετρο μέσης μεγαλύτερη του 75%, ένα εκ των οποίων είχε οικογενειακό ιστορικό για Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου ΙΙ, αυξημένη χοληστερόλη και αυξημένη γλυκόζη νηστείας. Σελίδα 67

68 Μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός στη θέση -2219(C2782A) Πραγματοποιήθηκε σύγκριση της αλληλουχίας του κάθε δείγματος, με την αλληλουχία του υποκινητή όπως έχει ταυτοποιηθεί από τους Kondo H. et al. (2002) και βρέθηκε αλλαγή βάσης στη θέση -2219(C2782A) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7 και με τον ανοδικό αλλά και με τον καθοδικό εκκινητή. Σχήμα 10. Ενδεικτική απεικόνιση της σύγκρισης της αλληλουχίας του κάθε δείγματος, με την αλληλουχία του υποκινητή όπως έχει ταυτοποιηθεί από τους Kondo H. et al. (2002) και βρέθηκε αλλαγή βάσης στη θέση -2219(C2782A) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7 με τον ανοδικό εκκινητή. Η αλλαγή βάσης, στη συνέχεια, ταυτοποιήθηκε στο χρωματογράφημα και βρέθηκε ότι στην αλληλούχιση με τον ανοδικό εκκινητή, η κυτοσίνη υποκαθίσταται από την αδενίνη και αντίστοιχα στην αλληλούχιση με τον καθοδικό εκκινητή η γουανίνη υποκαθίσταται από τη θυμίνη. Σελίδα 68

69 Σχήμα 11. Ενδεικτική απεικόνιση της αλλαγής βάσης που ταυτοποιήθηκε στο χρωματογράφημα και βρέθηκε ότι στην αλληλούχιση με τον ανοδικό εκκινητή η κυτοσίνη υποκαθίσταται από την αδενίνη. Ο μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός στη θέση -2219(C2782A), βρέθηκε σε 7 μάρτυρες εκ των οποίων: 3 μάρτυρες είχαν περίμετρο μέσης μεγαλύτερη του 75%, δύο εκ των οποίων είχαν οικογενειακό ιστορικό για Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου ΙΙ Συνολικά, 4 μάρτυρες είχαν οικογενειακό ιστορικό για Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου ΙΙ, ένας εκ των οποίων είχε αυξημένη γλυκόζη νηστείας. Πραγματοποιήθηκε συσχέτιση των ατόμων που έχουν το μονονουκλεοτιδικό πολυμορφισμό στη θέση -2219(C2782A) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7, με τα κλινικά τους χαρακτηριστικά και βρέθηκε στατιστικώς σημαντικά ότι στα άτομα που έχουν τον πολυμορφισμό -2219(C2782A), η HDL χοληστερόλη μειώνεται (p=0,037). Σελίδα 69

70 Correlations Pol2782 HDL Spearman's rho Pol2782 HDL Σχήμα 12. Βρέθηκε στατιστικώς σημαντικά ότι στα άτομα που έχουν τον πολυμορφισμό -2219(C2782A), η HDL χοληστερόλη μειώνεται (p=0,037). Correlation 1,000,229 * Coefficient Sig. (2-tailed).,037 N Correlation,229 * 1,000 Coefficient Sig. (2-tailed),037. N *. Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed) Μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός στη θέση -2091(C2910Α) Πραγματοποιήθηκε σύγκριση της αλληλουχίας του κάθε δείγματος, με την αλληλουχία του υποκινητή όπως έχει ταυτοποιηθεί από τους Kondo H. et al. (2002) και βρέθηκε αλλαγή βάσης στη θέση -2091(C2910Α) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7 και με τον ανοδικό αλλά και με τον καθοδικό εκκινητή. Σχήμα 13. Ενδεικτική απεικόνιση της σύγκρισης της αλληλουχίας του κάθε δείγματος, με την αλληλουχία του υποκινητή όπως έχει ταυτοποιηθεί από τους Kondo H. et al. (2002) και βρέθηκε αλλαγή βάσης στη θέση Σελίδα 70

71 -2091(C2910Α) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7 με τον ανοδικό εκκινητή. Η αλλαγή βάσης, στη συνέχεια, ταυτοποιήθηκε στο χρωματογράφημα και βρέθηκε ότι στην αλληλούχιση με τον ανοδικό εκκινητή, η κυτοσίνη υποκαθίσταται από την αδενίνη και αντίστοιχα στην αλληλούχιση με τον καθοδικό εκκινητή η γουανίνη υποκαθίσταται από τη θυμίνη. Σχήμα 14. Ενδεικτική απεικόνιση της αλλαγής βάσης που ταυτοποιήθηκε στο χρωματογράφημα και βρέθηκε ότι στην αλληλούχιση με τον ανοδικό εκκινητή η κυτοσίνη υποκαθίσταται από την αδενίνη. Ο μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός στη θέση -2091(C2910Α), βρέθηκε σε 6 μάρτυρες εκ των οποίων: 3 μάρτυρες είχαν περίμετρο μέσης μεγαλύτερη του 75% 4 μάρτυρες είχαν οικογενειακό ιστορικό για Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου ΙΙ, ένας εκ των οποίων είχε αυξημένη γλυκόζη νηστείας και περίμετρο μέσης μεγαλύτερη του 75%. Πραγματοποιήθηκε συσχέτιση των ατόμων που έχουν το μονονουκλεοτιδικό πολυμορφισμό στη θέση -2091(C2910Α) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7, με τα κλινικά τους χαρακτηριστικά και βρέθηκε ότι υπάρχει στατιστικώς σημαντική μείωση της HDL χοληστερόλης, στα άτομα που έχουν τον πολυμορφισμό -2091(C2910Α), (p=0,005). Σελίδα 71

72 Correlations Pol2910 HDL Correlation Coefficient 1,000,308 ** Pol2910 Sig. (2-tailed).,005 N Spearman's rho Correlation Coefficient,308 ** 1,000 HDL Sig. (2-tailed),005. N **. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed). Σχήμα 15. Βρέθηκε με το Spearman test ότι υπάρχει στατιστικώς σημαντική μείωση της HDL χοληστερόλης, στα άτομα που έχουν τον πολυμορφισμό -2091(C2910Α), (p=0,005). Correlations Pol2910 HDL Pol2910 HDL Pearson Correlation 1,265 * Sig. (2-tailed),015 N Pearson Correlation,265 * 1 Sig. (2-tailed),015 N *. Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed). Σχήμα 16. Βρέθηκε με το Pearson test ότι υπάρχει στατιστικώς σημαντική μείωση της HDL χοληστερόλης, στα άτομα που έχουν τον πολυμορφισμό -2091(C2910Α), (p=0,015) Μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός στη θέση -1884(C3117T) Πραγματοποιήθηκε σύγκριση της αλληλουχίας του κάθε δείγματος, με την αλληλουχία του υποκινητή όπως έχει ταυτοποιηθεί από τους Kondo H. et al. (2002) και βρέθηκε αλλαγή βάσης στη θέση -1884(C3117T) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7 και με τον ανοδικό αλλά και με τον καθοδικό εκκινητή. Σελίδα 72

73 Σχήμα 17. Ενδεικτική απεικόνιση της σύγκρισης της αλληλουχίας του κάθε δείγματος, με την αλληλουχία του υποκινητή όπως έχει ταυτοποιηθεί από τους Kondo H. et al. (2002) και βρέθηκε αλλαγή βάσης στη θέση -1884(C3117T) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7 με τον ανοδικό εκκινητή. Η αλλαγή βάσης, στη συνέχεια, ταυτοποιήθηκε στο χρωματογράφημα και βρέθηκε ότι στην αλληλούχιση με τον ανοδικό εκκινητή, η κυτοσίνη υποκαθίσταται από τη θυμίνη και αντίστοιχα στην αλληλούχιση με τον καθοδικό εκκινητή η γουανίνη υποκαθίσταται από την αδενίνη. Σχήμα 18. Ενδεικτική απεικόνιση της αλλαγής βάσης που ταυτοποιήθηκε στο χρωματογράφημα και βρέθηκε ότι στην αλληλούχιση με τον ανοδικό εκκινητή η κυτοσίνη υποκαθίσταται από τη θυμίνη. Σελίδα 73

74 Ο μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός στη θέση -1884(C3117T), βρέθηκε σε 6 μάρτυρες εκ των οποίων: 3 μάρτυρες είχαν περίμετρο μέσης μεγαλύτερη του 75% 3 μάρτυρες είχαν οικογενειακό ιστορικό για Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου ΙΙ, ένας εκ των οποίων είχε αυξημένη γλυκόζη νηστείας. Πραγματοποιήθηκε συσχέτιση των ατόμων που έχουν το μονονουκλεοτιδικό πολυμορφισμό στη θέση -1884(C3117T) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7, με τα κλινικά τους χαρακτηριστικά και βρέθηκε ότι υπάρχει στατιστικώς σημαντική μείωση της HDL χοληστερόλης, στα άτομα που έχουν τον πολυμορφισμό -1884(C3117T), (p=0,037). Pol3117 HDL Correlations Pol3117 HDL Pearson Correlation 1,230 * Sig. (2-tailed),037 N Pearson Correlation,230 * 1 Sig. (2-tailed),037 N *. Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed). Σχήμα 19. Βρέθηκε κατά Pearson, ότι υπάρχει στατιστικώς σημαντική μείωση της HDL χοληστερόλης, στα άτομα που έχουν τον πολυμορφισμό -1884(C3117T), (p=0,037). Correlations Pol3117 HDL Spearman's rho Pol3117 HDL Correlation 1,000,274 * Coefficient Sig. (2-tailed).,012 N Correlation,274 * 1,000 Coefficient Sig. (2-tailed),012. N *. Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed). Σχήμα 20. Βρέθηκε κατά Spearman, ότι υπάρχει στατιστικώς σημαντική μείωση της HDL χοληστερόλης, στα άτομα που έχουν τον πολυμορφισμό -1884(C3117T), (p=0,012). Σελίδα 74

75 Μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός στη θέση -1123(C3878T) Πραγματοποιήθηκε σύγκριση της αλληλουχίας του κάθε δείγματος, με την αλληλουχία του υποκινητή όπως έχει ταυτοποιηθεί από τους Kondo H. et al. (2002) και βρέθηκε αλλαγή βάσης στη θέση -1123(C3878T) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7 και με τον ανοδικό αλλά και με τον καθοδικό εκκινητή. Σχήμα 21. Ενδεικτική απεικόνιση της σύγκρισης της αλληλουχίας του κάθε δείγματος, με την αλληλουχία του υποκινητή όπως έχει ταυτοποιηθεί από τους Kondo H. et al. (2002) και βρέθηκε αλλαγή βάσης στη θέση -1123(C3878T) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7 με τον ανοδικό εκκινητή. Η αλλαγή βάσης, στη συνέχεια, ταυτοποιήθηκε στο χρωματογράφημα και βρέθηκε ότι στην αλληλούχιση με τον ανοδικό εκκινητή, η κυτοσίνη υποκαθίσταται από τη θυμίνη και αντίστοιχα στην αλληλούχιση με τον καθοδικό εκκινητή η γουανίνη υποκαθίσταται από την αδενίνη. Σελίδα 75

76 Σχήμα 22. Ενδεικτική απεικόνιση της αλλαγής βάσης που ταυτοποιήθηκε στο χρωματογράφημα και βρέθηκε ότι στην αλληλούχιση με τον ανοδικό εκκινητή η κυτοσίνη υποκαθίσταται από τη θυμίνη. Ο μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός στη θέση -1123(C3878T), βρέθηκε σε 2 μάρτυρες εκ των οποίων: Ένας μάρτυρας είχε περίμετρο μέσης μεγαλύτερη του 75% Ο μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός στη θέση -1123(C3878T), βρέθηκε και σε 6 παχύσαρκα παιδιά εκ των οποίων: 4 παχύσαρκα παιδιά είχαν περίμετρο μέσης μεγαλύτερη του 75%, δύο εκ των οποίων είχαν οικογενειακό ιστορικό για Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου ΙΙ Ένα παχύσαρκο παιδί είχε αυξημένη χοληστερόλη και αυξημένη γλυκόζη νηστείας. Πραγματοποιήθηκε συσχέτιση των ατόμων που έχουν το μονονουκλεοτιδικό πολυμορφισμό στη θέση -1123(C3878T) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7, με τα κλινικά τους χαρακτηριστικά και βρέθηκε ότι υπάρχει στατιστικώς σημαντική αύξηση του ΒΜΙ επί τοις εκατό, στα άτομα που έχουν τον πολυμορφισμό -1123(C3878T), (p=0,035). Σελίδα 76

77 Correlations Pol3878 BMI Pol3878 BMI Pearson Correlation 1 -,231 * Sig. (2-tailed),035 N Pearson Correlation -,231 * 1 Sig. (2-tailed),035 N *. Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed). Σχήμα 23. Βρέθηκε κατά Pearson ότι υπάρχει στατιστικώς σημαντική μείωση της HDL χοληστερόλης, στα άτομα που έχουν τον πολυμορφισμό -1123(C3878T), (p=0,035). Correlations Pol3878 BMI Spearman's rho Pol3878 BMI Correlation 1,000 -,305 ** Coefficient Sig. (2-tailed).,005 N Correlation -,305 ** 1,000 Coefficient Sig. (2-tailed),005. N **. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed). Σχήμα 24. Βρέθηκε κατά Spearman ότι υπάρχει στατιστικώς σημαντική μείωση της HDL χοληστερόλης, στα άτομα που έχουν τον πολυμορφισμό -1123(C3878T), (p=0,005) Μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός στη θέση -953(Α4048G) Πραγματοποιήθηκε σύγκριση της αλληλουχίας του κάθε δείγματος, με την αλληλουχία του υποκινητή όπως έχει ταυτοποιηθεί από τους Kondo H. et al. (2002) και βρέθηκε αλλαγή βάσης στη θέση -953(Α4048G) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7 και με τον ανοδικό αλλά και με τον καθοδικό εκκινητή Σελίδα 77

78 Σχήμα 25. Ενδεικτική απεικόνιση της σύγκρισης της αλληλουχίας του κάθε δείγματος, με την αλληλουχία του υποκινητή όπως έχει ταυτοποιηθεί από τους Kondo H. et al. (2002) και βρέθηκε αλλαγή βάσης στη θέση -953(Α4048G) του υποκινητή του γονιδίου της AQP7 με τον ανοδικό εκκινητή. Η αλλαγή βάσης, στη συνέχεια, ταυτοποιήθηκε στο χρωματογράφημα και βρέθηκε ότι στην αλληλούχιση με τον ανοδικό εκκινητή, η αδενίνη υποκαθίσταται από τη γουανίνη και αντίστοιχα στην αλληλούχιση με τον καθοδικό εκκινητή η θυμίνη υποκαθίσταται από την κυτοσίνη. Σχήμα 26. Ενδεικτική απεικόνιση της αλλαγής βάσης που ταυτοποιήθηκε στο χρωματογράφημα και βρέθηκε ότι στην αλληλούχιση με τον ανοδικό εκκινητή η κυτοσίνη υποκαθίσταται από τη θυμίνη. Σελίδα 78