ΒΙΟΜΙΜΜΗΤΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΣΥΝΘΕΤΩΝ ΥΒΡΙΔΙΚΩΝ ΙΚΡΙΩΜΑΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΟΥΜΕΝΩΝ ΑΠΟ ΝΑΝΟΚΡΥΣΤΑΛΛΟΥΣ ΥΔΡΟΞΥΑΠΑΤΙΤΗ ΚΑΙ ΒΙΟΜΟΡΙΩΝ

Transcript

1 ΒΙΟΜΙΜΜΗΤΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΣΥΝΘΕΤΩΝ ΥΒΡΙΔΙΚΩΝ ΙΚΡΙΩΜΑΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΟΥΜΕΝΩΝ ΑΠΟ ΝΑΝΟΚΡΥΣΤΑΛΛΟΥΣ ΥΔΡΟΞΥΑΠΑΤΙΤΗ ΚΑΙ ΒΙΟΜΟΡΙΩΝ Δ. Μπρασινίκα, Α. Τσετσέκου Σχολή Μηχανικών Μεταλλείων και Μεταλλουργών, Ε.Μ.Π., Ηρώων Πολυτεχνείου 9, Αθήνα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα τελευταία χρόνια οι ερευνητικές προσπάθειες επικεντρώνονται στη βιομιμητική σύνθεση τρισδιάστατων ικριωμάτων για βιολογικές εφαρμογές. Τα ικριώματα αυτά θα πρέπει να αποτελούνται από υλικά με αυξημένη βιοσυμβατότητα και οστεοεπαγωγικότητα, καθώς πρόκειται να αντικαταστήσουν κάποιο κατεστραμμένο τμήμα φυσικού οστού και να έρθουν σε επαφή με τους ιστούς του οργανισμού. Για τον λόγο αυτό, στην παρούσα εργασία, πραγματοποιείται βιομιμητική σύνθεση κρυστάλλων νανοϋδροξυαπατίτη παρουσία των βιομορίων χιτοζάνη και L αργινίνη. Οι κρύσταλλοι του υδροξυαπατίτη που αναπτύσσονται με αυτόν τον τρόπο, χαρακτηρίζονται ως προς τη μορφολογία τους, το μέγεθός τους, την κρυσταλλικότητά τους κ.λπ. με χρήση Περίθλασης Ακτίνων Χ (XRD), Υπέρυθρης Φασματομετρίας με Μετασχηματισμό Fourier (FTIR) και Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Διερχόμενης Δέσμης (TEM). Στη συνέχεια η ανάπτυξη των τρισδιάστατων ικριωμάτων πραγματοποιείται με τη μέθοδο της λυοφιλίωσης. Ωστόσο το μακροπορώδες επηρεάζει αρνητικά τις μηχανικές αντοχές των παραγόμενων ικριωμάτων και ως εκ τούτου προτείνεται η χρήση πηκτικών παραγόντων καθώς και κατάλληλων διασυνδετών (cross-linkers), οι οποίοι προσδίδουν στα ικριώματα μεγαλύτερη σταθερότητα. Με χρήση Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου Σάρωσης (SEM) εξετάζεται το εσωτερικό πορώδες δίκτυο (μακροπορώδες και μικροπορώδες) αυτών, καθώς και η επίδραση της συγκέντρωσης του προστιθέμενου διασυνδέτη στο ποσοστό του μικροπορώδους και μακροπορώδους δικτύου που αναπτύσσεται. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ανάπτυξη τεχνητών υποκατάστατων οστών με όσο το δυνατόν πιο βιοσυμβατές ιδιότητες για ορθοπαιδικές και οδοντιατρικές εφαρμογές έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον πολλών ερευνητών στον χώρο της Ιστικής Μηχανικής. Η κλινική αποκατάσταση προσβλέπει στη μείωση του μεγέθους της βλάβης με την τοποθέτηση ενός μόνιμου ή προσωρινού πορώδους (ικρίωμα) οστικού υποκατάστατου που επιτρέπει την έναυση των φυσικών μηχανισμών επιδιόρθωσης. Το ενδιαφέρον για τα προσωρινά υποκατάστατα έγκειται στο ότι παρέχουν μηχανική υποστήριξη μέχρι ο ιστός να αναπλαστεί και αναμορφωθεί πλήρως φυσικά. Τα υλικά που χρησιμοποιούνται κατά κύριο λόγο για την ανάπτυξη εμφυτευμάτων είναι μέταλλα, ή υβριδικά υλικά αποτελούμενα από κεραμικά (υδροξυαπατίτης HAp ή αλούμινα) και πολυμερή (π.χ. πολυαιθελένιο ή PMMA) [1] καθώς και μοσχεύματα είτε από τον ίδιο τον οργανισμό (autograft), είτε από άλλο ανθρώπινο οργανισμό (allograft) ή από ζώα (xenograft). Τα υλικά αυτά εμφανίζουν πολλά μειονεκτήματα. Τα μέταλλα, όπως τα κράματα τιτανίου ή ο ανοξείδωτος χάλυβας καταστρέφουν σταδιακά το φυσικό οστό με το οποίο έρχονται σε επαφή καθώς η κατανομή των τάσεων στο οστό που περιβάλλει το εμφύτευμα δεν είναι ομοιόμορφη και επιπλέον προκαλούν την ανάπτυξη φλεγμονών λόγω της διαρροής τοξικών μεταλλικών ιόντων στον οργανισμό [2]. Αν και τα μοσχεύματα από τον ίδιο τον οργανισμό 1

2 του ασθενούς έχουν επιτυχή αποτελέσματα σε πολλές επεμβάσεις, έχουν το μειονέκτημα της περιορισμένης διαθεσιμότητας, του επιπλέον πόνου από τη δότρια περιοχή και της σημαντικότατης αύξησης της διάρκειας της επέμβασης. Από την άλλη, τα μοσχεύματα από άλλο άνθρωπο ή ζώο, προκαλούν λοιμώξεις και φλεγμονές, είναι επιρρεπή σε ανοσολογική απόρριψη και μεταφέρουν παθογένειες [3]. Βιοενεργά κεραμικά υλικά όπως ο υδροξυαπατίτης Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2, ο οποίος εμφανίζει χημική ομοιότητα με τα συστατικά των σκληρών ιστών του ανθρώπου [4], όπως τα οστά και τα δόντια, καθώς και πολλά φυσικά ή συνθετικά βιοπολυμερή έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για την ανάπτυξη εμφυτευμάτων. Τα υλικά αυτά εμφανίζουν βιοδραστικότητα, αυξημένη οστεοεπαγωγικότητα, αποικοδομούνται εύκολα και δεν εμφανίζουν καθόλου τοξικότητα ή ανοσολογική αντίδραση του οργανισμού όταν έρθουν σε επαφή με τους φυσικούς ιστούς [5]. Ωστόσο η μηχανική συμπεριφορά των εμφυτευμάτων που αποτελούνται από τα υλικά αυτά υστερεί σε σχέση με αυτή που απαντάται στους σκληρούς ιστούς του ανθρώπινου οργανισμού [6] και εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το εσωτερικό πορώδες δίκτυο που παρουσιάζουν [7]. Ο ΗΑp μπορεί να παρασκευασθεί με μία πληθώρα μεθόδων, όπως αντιδράσεις καταβύθισης και στερεάς κατάστασης, υδροθερμικές μεθόδους ανάπτυξης των κρυστάλλων του και κρυστάλλωση με τεχνικές sol gel. Ωστόσο, αυτές οι μέθοδοι παρέχουν συνήθως είτε υλικά με κρυστάλλους στη μικροκλίμακα, που δεν ταυτίζονται με τα μεγέθη σωματιδίων (νανοκλίμακα) που παράγονται στη φύση, είτε με ανώμαλα σχήματα κόκκων σε αντίθεση με τα λεπτά πλακίδια του φυσικού υδροξυαπατίτη, γεγονός που οδηγεί σε τελείως μη ελεγχόμενη συμπεριφορά [8]. Με βάση τα παραπάνω, οι ερευνητικές προσπάθειες στρέφονται προς μία βιομιμητική προσέγγιση της σύνθεσης των κρυστάλλων του υδροξυαπατίτη σε συνδυασμό με διάφορα βιοπολυμερή και αμινοξέα με τελικό στόχο τη ρύθμιση της διεργασίας πυρήνωσης και ανάπτυξης των κρυστάλλων του. Ένα ακόμη ζητούμενο είναι η ανάπτυξη να μπορεί να εστιάσει στην εισαγωγή ορισμένων κυτταρικών αποκρίσεων σε μοριακό επίπεδο, δηλαδή η οστεοενσωμάτωση και η ανάπτυξη του οστού να είναι κατευθυνόμενες [8]. Η σύνθεση των κρυστάλλων του υδροξυαπατίτη παρουσία βιομορίων που περιέχουν συγκεκριμένα κατάλοιπα αμινοξέων όπως η L-αργινίνη ενισχύουν σημαντικά την κυτταρική διασύνδεση, ανάπτυξη και διαφοροποίηση στις επιφάνειες του υδροξυαπατίτη. Η μίμηση της βιολογικής σύνθεσης στο εργαστήριο παρουσία αμινοξέων έχει δείξει ότι μπορεί να επηρεάζει καθοριστικά τη διεργασία πυρήνωσης και ανάπτυξης, ευνοώντας με αυτό τον τρόπο το σχηματισμό υδροξυαπατίτη σε φυσιολογική θερμοκρασία και επιδρώντας στο σχήμα, αλλά και στο μέγεθος των παραγόμενων κόκκων [9-11]. Βιολογικά μακρομόρια όπως η χιτοζάνη (Chit) θα μπορούσαν να αποδειχθούν κατάλληλα για τη βιομιμητική σύνθεση των κρυστάλλων του υδροξυαπατίτη. Η χιτοζάνη είναι ένας γραμμικός πολυσακχαρίτης, το αποακετυλιωμένο παράγωγο της χιτίνης, και το δεύτερο σε αφθονία φυσικό πολυμερές [12,13]. Έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στην Ιστική Μηχανική σε κλινικές επιδιορθώσεις, καθώς αποτελεί ένα υλικό με αυξημένη βιοσυμβατότητα, βιοδιασπώμενο, μη τοξικό και βιολειτουργικό, ενώ κατά την εμφύτευση προκαλεί ελάχιστη ανοσοποιητική αντίδραση από τον οργανισμό [14,15]. Η επιφάνεια της χιτοζάνης είναι υδρόφιλη, γεγονός που διευκολύνει την προσκόλληση των κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση τους. Ένα ακόμα πολύ ενδιαφέρον χαρακτηριστικό της, είναι ότι μπορεί να διαμορφωθεί σε πορώδεις δομές και σε συνδυασμό με τον υδροξυαπατίτη να συντελέσουν στην ανάπτυξη σύνθετων ικριωμάτων. Τα σύνθετα αυτά ικριώματα εμφανίζουν ικανοποιητικό ρυθμό βιοαποικοδόμησης, αυξημένη βιοσυμβατότητα και οστεοαγωγιμότητα, και βελτιωμένες τιμές αντοχής σε εφελκυσμό και μέτρου ελαστικότητας. Τέλος στα σύνθετα ικριώματα υδροξυαπατίτη χιτοζάνης βρέθηκε ότι σχηματίζεται πορώδες δίκτυο με μέση τιμή μεγέθους πόρων περίπου 100 μm [16,17]. 2

3 Στην παρούσα εργασία στόχος είναι η ανάπτυξη υβριδικών τρισδιάστατων ικριωμάτων αποτελούμενων από νανοκρυστάλλους υδροξυαπατίτη, οι οποίοι έχουν συντεθεί παρουσία των βιομορίων χιτοζάνη και αργινίνη. Στα ικριώματα αυτά προστίθενται οι απαραίτητοι διασυνδέτες ώστε να επιτευχθεί βελτίωση των μηχανικών τους αντοχών με παράλληλη διατήρηση ικανοποιητικού πορώδους δικτύου. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Τα πρόδρομα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την σύνθεση των νανοκρυστάλλων υδροξυαπατίτη είναι το υδροξείδιο του ασβεστίου, (Ca(OH) 2 ) και το ορθοφωσφορικό οξύ 85%, (H 3 PO 4 ) και παρελήφθησαν από την εταιρεία Sigma Aldrich. Το φυσικό πολυμερές χιτοζάνη, το αμινοξύ L Αργινίνη καθώς και η γενιπίνη αγοράστηκαν και αυτά από την ίδια εταιρεία Sigma Aldrich σε μορφή σκόνης. Το διάλυμα γλουταραλδεϋδης αγοράσθηκε από την εταιρεία Fluka και τέλος οι πολυσακχαρίτες gellan gum και xanthan gum παρελήφθησαν από την εταιρεία AppliChem. Η πειραματική διαδικασία περιλάμβανε καταρχήν την παρασκευή υδατικών διαλυμάτων υδροξειδίου του ασβεστίου Ca(OH) 2 (0,1M) και ορθοφωσφορικού οξέος H 3 PO 4 (0,06M και 0,1M). Οι συγκεντρώσεις τους επιλέχθηκαν έτσι ώστε η αρχική μοριακή αναλογία Ca/P να είναι είτε η στοιχειομετρική αναλογία 10/6 που συναντάται στον απατίτη του φυσικού οστού ή 1/1 δηλαδή η διαδικασία σύνθεσης των κρυστάλλων του υδροξυαπατίτη να πραγματοποιείται με περίσσεια οξέος. Η συγκέντρωση της χιτοζάνης κατά τη σύνθεση υπολογίστηκε σε σχέση με την τελική ποσότητα υδροξυαπατίτη που παράγεται και σύμφωνα με την περιεκτικότητα σε κολλαγόνο που συναντάται στο φυσικό οστό, δηλαδή HAp/Chit = 70/30 (αναλογία κατά βάρος). Στη συνέχεια τα δύο αυτά υδατικά διαλύματα προστέθηκαν στάγδην σε ένα τρίτο διάλυμα, που περιείχε την L Αργινίνη υπό συνεχή ανάδευση και μέσα σε υδατικό λουτρό ώστε να διατηρείται η θερμοκρασία της αντίδρασης σταθερή στους 40 o C. Η συγκέντρωση της L-αργινίνης υπολογίστηκε από την μοριακή αναλογία Ca 2+ :Arg = 1:1. Με την προσθήκη της αργινίνης επιτυγχάνεται και ρύθμιση του ph κατά τη διάρκεια της αντίδρασης σε τιμές Τα αιωρήματα που προέκυψαν από τα πειράματα αυτά αφού υπέστησαν φυγοκέντρηση για 20 λεπτά στις στροφές ξηράνθηκαν υπό κενό στους 40 o C και συλλέχθηκαν σε μορφή σκόνης ώστε να πραγματοποιηθεί έλεγχος της κρυσταλλικής τους δομής με τη Μέθοδο της Περίθλασης Ακτίνων Χ, (XRD), Υπέρυθρης Φασματομετρίας με Μετασχηματισμό Fourier (FTIR) και Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Διερχόμενης Δέσμης (TEM). Η ανάπτυξη των τρισδιάστατων ικριωμάτων πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της λυοφιλίωσης. Κατά τη λυοφιλίωση τα αιωρήματα υδροξυαπατίτη ψύχθηκαν σε θερμοκρασία -50 o C για 3 ώρες, οπότε το περιεχόμενο νερό πάγωσε. Στη συνέχεια, ενόσω διατηρείται η ψύξη, δημιουργήθηκε υψηλό κενό (0,25 mbar) και το νερό απομακρύνθηκε με εξάχνωση. Για τη βελτίωση των μηχανικών αντοχών των παραγόμενων ικριωμάτων και την αύξηση της αντοχής τους σε υδατικό περιβάλλον χρησιμοποιήθηκαν πηκτικοί παράγοντες καθώς και κατάλληλοι διασυνδέτες, οι οποίοι εμφανίζουν και τις απαραίτητες ιδιότητες βιοσυμβατότητας. Οι πηκτικοί παράγοντες, που χρησιμοποιούνται είναι οι βιοπολυσακχαρίτες gellan gum και xanthan gum, που έχουν ως τελικό στόχο τη ρύθμιση των ρεολογικών ιδιοτήτων και την αντοχή στη θερμότητα των παραγόμενων ικριωμάτων. Ως διασυνδέτες μελετήθηκαν η γλουταραλδεΰδη και η γενιπίνη. Πρόκειται για πρωτεϊνικούς διασυνδέτες, οι οποίοι δημιουργούν ισχυρούς δεσμούς με τα αμινικά άκρα της χιτοζάνης και με αυτό τον τρόπο προσδίδουν στο τελικό ικρίωμα πιο σταθερή δομή με μεγαλύτερη ελαστικότητα, σκληρότητα και βελτιωμένες ιδιότητες διαβροχής. Η γλουταραλδεΰδη 3

4 Intensity (a.u.) 9 ο ΠΕΣΧΜ: Η Συμβολή της Χημικής Μηχανικής στην Αειφόρο Ανάπτυξη εμφανίζει το μειονέκτημα ότι είναι ιδιαίτερα τοξική όταν η περιεκτικότητά της στο διάλυμα του υδροξυαπατίτη ξεπερνά σε ποσοστό το 2,5%, αντίθετα η γενιπίνη αποτελεί φυσικό διασυνδέτη, που προέρχεται από το φυτό της γαρδένιας και εμφανίζει πολύ χαμηλότερο ποσοστό τοξικότητας Η κρυσταλλική δομή των παραγόμενων αιωρημάτων μελετήθηκε με Περίθλαση Ακτίνων Χ, XRD με χρήση περιθλασίμετρου Bruker D8 Focus με λυχνία CuKα 1 και φίλτρο νικελίου. Η αλληλεπίδραση μεταξύ των ανόργανων και οργανικών ενώσεων της αντίδρασης εξετάστηκε με Υπέρυθρη Φασματομετρία με Μετασχηματισμό Fourier, FTIR με φασματόμετρο Nicolet 6700 (το οποίο διαθέτει κρύσταλλο Smart Orbit, Thermo Electron Corporation, Madison, WI). Το μέγεθος και το σχήμα των κρυστάλλων του υδροξυαπατίτη που αναπτύχθηκε μελετήθηκαν με Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Διερχόμενης Δέσμης, TEM τύπου Philips FEI CM20, (Eindhoven, Netherlands). Σε αυτή την περίπτωση οι νανοκρύσταλλοι ΗΑp διασκορπίστηκαν σε αλκοόλη με χρήση υπερήχων και εναποτέθηκαν σε φιλμ χαλκού. Τα ικριώματα υδροξυαπατίτη αναπτύχθηκαν με σύστημα λυοφιλίωσης τύπου TELSTAR. Τέλος, το εσωτερικό πορώδες δίκτυο των ικριωμάτων εξετάστηκε με Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης, SEM τύπου Jeol 6380 LV (USA). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ XRD Συγκρίνοντας τα φάσματα ανάλυσης ακτίνων Χ με το χαρακτηριστικό φάσμα του εξαγωνικού κρυσταλλικού υδροξυαπατίτη (JCPDS 9-432), προέκυψε ότι οι κρύσταλλοι που αναπτύχθηκαν εμφανίζουν κρυσταλλική δομή και χαρακτηριστικά όμοια με αυτά του εξαγωνικού υδροξυαπατίτη του φυσικού οστού. Η κρυσταλλική αυτή δομή είναι παρόμοια για όλα τα αιωρήματα που έχουν παρασκευασθεί με διαφορετικές συνθήκες ως προς την περιεκτικότητα σε L-αργινίνη, την τελική μοριακή αναλογία Ca/P καθώς και τις αρχικές συγκεντρώσεις των πρόδρομων αντιδραστηρίων (ορθοφωσφορικό οξύ και υδροξείδιο του ασβεστίου) d.b1-7/3x-r 600 c.b6-7/3x-r (211) (002) (300) (310) (222) (213) b.a1-7/3x-r a.a6-7/3x-r Angle 2θ (degrees) Σχήμα 1: Φάσματα περίθλασης ακτίνων Χ για τα δείγματα ΗΑp που αναπτύχθηκαν με αναλογία μαζών HAp/Chit=70/30, μοριακή αναλογία Ca/P=10/6 και (a) μοριακή αναλογία Ca 2+ :Arg=1:1 και H 3 PO 4 0,06M, (b) Ca 2+ :Arg=1:1 και H 3 PO 4 0,1M, (c) Ca 2+ :Arg=1:2 και H 3 PO 4 0,06M και (d) Ca 2+ :Arg=1:2 και H 3 PO 4 0,1M. 4

5 Intensity (a.u.) 9 ο ΠΕΣΧΜ: Η Συμβολή της Χημικής Μηχανικής στην Αειφόρο Ανάπτυξη Ωστόσο παρατηρήθηκε ότι η περίσσεια αργινίνης αυξάνει τη διασπορά στις διαστάσεις των κρυστάλλων, καθώς τα δείγματα που παρασκευάστηκαν με την μοριακή αναλογία Ca 2+ :Arg=1:2, εμφανίζουν κορυφές με μεγαλύτερο πλάτος. Επιπλέον, αποδεικνύεται ότι οι κρύσταλλοι υδροξυαπατίτη που παρασκευάστηκαν με αραιό H 3 PO 4 εμφανίζουν καλύτερα αποτελέσματα σε σύγκριση με αυτούς που παρήχθησαν με πυκνό, διότι οι χαρακτηριστικές κορυφές αυτών των δειγμάτων παρουσιάζουν μικρότερο πλάτος, το οποίο υποδεικνύει την ύπαρξη κρυστάλλων μικρότερου μεγέθους. Τέλος, παρατηρείται ότι στα φάσματα των δειγμάτων που αναπτύχθηκαν με τη στοιχειομετρική αναλογία Ca/P=10/6 εμφανίζονται πιο έντονες και οξείες κορυφές b. A6-7/3X-R 400 (211) (002) (112) 200 (300) (310) (222) (213) Angle 2θ (degrees) a. A6-7/3X Σχήμα 2: Φάσματα περίθλασης ακτίνων Χ για τα δείγματα ΗΑp που αναπτύχθηκαν με αναλογία μαζών HAp/Chit=70/30, μοριακή αναλογία Ca 2+ :Arg=1:1, H 3 PO 4 0,06M και (a) μοριακή αναλογία Ca/P=1/1 και (b) μοριακή αναλογία Ca/P=10/6. FTIR Στα φάσματα ανάλυσης με FTIR παρατηρείται σε όλες τις περιπτώσεις μία χαρακτηριστική κορυφή στα 3569 cm -1, που αντιστοιχεί στη συμμετρική έκταση καθώς και μία κορυφή στα 629 cm -1 που αναφέρεται στην κάμψη της ομάδας του OH. Η κορυφή στα 1020 cm -1 αναφέρεται στις χαρακτηριστικές συμμετρικές και μη συμμετρικές εκτάσεις του δεσμού P-O και η κορυφή στα 961 cm -1 αντιστοιχεί στην εκτατική δόνηση του ίδιου δεσμού. Επιπλέον παρατηρούνται οι κορυφές στα 599 και 558 cm -1, που αναφέρονται στις κάμψεις του δεσμού O-P-O. Οι χαρακτηριστικές κορυφές του μορίου της χιτοζάνης στα 1380, 1320 και 1650 cm -1 είναι επίσης εμφανείς σε όλα τα φάσματα. Τέλος, η κορυφή που εντοπίζεται στα 1454 cm -1 υποδεικνύει τις εκτατικές δονήσεις των ομάδων του καρβοξυλίου, λόγω των ιχνών CO 2 που υπάρχουν στο διάλυμα. 5

6 Transmittance % (a.u.) 9 ο ΠΕΣΧΜ: Η Συμβολή της Χημικής Μηχανικής στην Αειφόρο Ανάπτυξη Ca/P=1/1 Ca/P=10/6 Ca 2+ :Arg=1:1 C=0,1M Ca 2+ :Arg=1:2 C=0,06M Ca 2+ :Arg=1:2 C=0,1M -OH - CO OH Chit P-O 961 P-O 1020 O-P-O 599, Wavenumbers (cm -1 ) TEM Σχήμα 3: Φάσματα ανάλυσης υπέρυθρης φασματοσκοπίας για τα δείγματα ΗΑp που αναπτύχθηκαν με αναλογία μαζών HAp/Chit=70/30,μοριακή αναλογία Ca/P=10/6 και Ca 2+ :Arg=1:1 ή 1:2 και H 3 PO 4 0,06M ή 0,1Μ καθώς επίσης και μοριακή αναλογία Ca/P=1/1(πράσινο). Το μέγεθος των σωματιδίων, η μορφολογία τους καθώς και η ομοιογένεια των κρυστάλλων υδροξυαπατίτη που αναπτύχθηκαν εξετάστηκε με Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Διέλευσης Ηλεκτρονίων. Από το Σχήμα 4 αποδεικνύεται ότι τα παραγόμενα δείγματα αποτελούνται από πλακόμορφους κρυστάλλους, των οποίων οι διαστάσεις εξαρτώνται από την τελική περιεκτικότητα σε βιομόρια (χιτοζάνη και L-αργινίνη). Παρατηρήθηκε μικρό εύρος διασποράς στις διαστάσεις των σωματιδίων με μέση τιμή μήκους περίπου 30 nm και μέση τιμή πάχους περίπου 5 nm. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι τα δείγματα που αναπτύχθηκαν με τη στοιχειομετρική αναλογία Ca/P=10/6 εμφανίζουν μεγαλύτερη ομοιογένεια στη δομή τους, ενώ η περίσσεια του φωσφορικού οξέος οδηγεί σε ανομοιογενή υλικά με την συνύπαρξη πλακόμορφων και σφαιρικών σωματιδίων. a. b. 6

7 c. d. Σχήμα 4: Εικόνες Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Διέλευσης Ηλεκτρονίου για δείγματα ΗΑp με αναλογίες μαζών HAP/ Chit = 70/30, μοριακή αναλογία Ca 2+ :Arg = 1:1, Η 3 PO 4 0,06M και (a), (b) μοριακή αναλογία Ca/P= 1/1 και (c),(d) μοριακή αναλογία Ca/P= 10/6. SEM Τα ικριώματα υδροξυαπατίτη, που αναπτύχθηκαν με τη μέθοδο της λυοφιλίωσης, εξετάστηκαν ως προς το εσωτερικό πορώδες δίκτυο τους με χρήση της Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Σάρωσης. Για να θεωρηθούν επιτυχημένα κατά την εφαρμογή τους, τα ικριώματα αυτά θα πρέπει το εσωτερικό τους να αποτελείται τόσο από μακροπόρους όσο και μικροπόρους, ώστε να είναι δυνατή η διέλευση σε όλο το μήκος του ικριώματος των κυττάρων αλλά και των θρεπτικών συστατικών, που είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη και των πολλαπλασιασμό τους. a. b. c. d. Σχήμα 5: Εικόνες Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Σάρωσης ικριωμάτων HΑp με την προσθήκη (a) και (b) 0,1g gellan gum ενώ (c) και (d) 0,1g xanthan gum. Η προσθήκη των πηκτικών παραγόντων gellan gum και xanthan gum στα αιωρήματα υδροξυαπατίτη, οδήγησε στην ανάπτυξη τρισδιάστατων ικριωμάτων με αισθητά βελτιωμένες μηχανικές αντοχές. Ωστόσο, όπως αποδεικνύεται από τις εικόνες του SEM (Σχήμα 5), στο εσωτερικό αυτών των ικριωμάτων εμφανίζεται έντονο μακροπορώδες δίκτυο, με πόρους της τάξης των μm, αλλά ελάχιστοι μικροπόροι με μέγεθος περίπου 10 μm και πιο 7

8 συγκεκριμένα στην περίπτωση του xanthan gum δεν εντοπίζονται καθόλου μικροπόροι. Ένα επιπλέον μειονέκτημα της προσθήκης αυτών των βιοπολυμερών είναι ότι τα παραγόμενα ικριώματα χάνουν το σχήμα τους και τελικά διαλύονται όταν βρεθούν σε υδατικό περιβάλλον. Η χρήση των διασυνδετών γλουταραλδεΰδη και γενιπίνη οδηγεί και αυτή, στην ανάπτυξη ικριωμάτων με ικανοποιητικές μηχανικές αντοχές. Σε αυτή την περίπτωση, τα ικριώματα εξετάστηκαν με το Μικροσκόπιο SEM σε εγκάρσια αλλά και κάθετη τομή, ώστε να εξαχθούν συμπεράσματα και σχετικά με τη συνεκτικότητα του εσωτερικού πορώδες δικτύου. Εγκάρσια τομή 0,8% GA 1,6% GA 2,5% GA Κάθετη τομή 0,8% GA 1,6% GA 2,5% GA Σχήμα 6: Εικόνες Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Σάρωσης (σε μεγέθυνση x500) ικριωμάτων HΑp με την προσθήκη διαλύματος γλουταραλδεΰδης (GA) σε ποσοστό 0,8, 1,6 και 2,5% επί της χιτοζάνης. Εγκάρσια τομή 0,8% GA 1,6% GA 2,5% GA Κάθετη τομή 0,8% GA 1,6% GA 2,5% GA Σχήμα 7: Εικόνες Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Σάρωσης (σε μεγέθυνση x1000) ικριωμάτων HΑp με την προσθήκη διαλύματος γλουταραλδεΰδης (GA) σε ποσοστό 0,8, 1,6 και 2,5% επί της χιτοζάνης. 8

9 Από τα Σχήματα 6 και 7, παρατηρείται ότι τα ικριώματα υδροξυαπατίτη, που έχουν διασυνδεθεί με διάλυμα γλουταραλδεΰδης εμφανίζουν εξαιρετικό εσωτερικό πορώδες δίκτυο αποτελούμενο από μακροπόρους με μέγεθος μm αλλά και μικροπόρους τάξης μεγέθους 10 μm. Καθώς αυξάνεται η περιεκτικότητα σε γλουταραλδεΰδη, η εσωτερική δομή των παραγόμενων ικριωμάτων εμφανίζει μεγαλύτερη ομοιογένεια και κατ επέκταση και καλύτερη μηχανική συμπεριφορά. Επιπλέον, το γεγονός, ότι τόσο οι εικόνες από τις εγκάρσιες τομές όσο και από τις κάθετες παρουσιάζουν παρόμοια μορφή, υποδεικνύει ότι οι πόροι είναι διασυνδεδεμένοι στο εσωτερικό του ικριώματος. Τέλος, τα ικριώματα, που έχουν διασυνδεθεί με γλουταραλδεΰδη, συμπεριφέρονται εξίσου ικανοποιητικά και σε υδατικό περιβάλλον. Εγκάρσια τομή Κάθετη τομή Εικ. 9: Εικόνες Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Σάρωσης ικριωμάτων HΑp με την προσθήκη 0,004g γενιπίνης. Εναλλακτικά, στην περίπτωση διασύνδεσης των ικριωμάτων με γενιπίνη, εντοπίζεται και πάλι ικανοποιητικό εσωτερικό πορώδες δίκτυο με μακροπόρους και μικροπόρους στις επιθυμητές διαστάσεις, αλλά ωστόσο τα ικριώματα αυτά επιδεικνύουν ελαφρώς κατώτερες μηχανικές αντοχές συγκρινόμενα με αυτά που έχουν διασυνδεθεί με γλουταραλδεΰδη. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Διαπιστώθηκε ότι η συγκεκριμένη μέθοδος που εφαρμόστηκε είναι ιδιαιτέρως επιτυχής αφού το σχήμα και οι διαστάσεις των κρυστάλλων υδροξυαπατίτη που αναπτύχθηκαν παρουσία χιτοζάνης και αργινίνης είναι παρόμοια με τους κρυστάλλους που απαντώνται στον υδροξυαπατίτη του φυσικού οστού. Αποτελούνται από πλακόμορφους κρυστάλλους με μέση τιμή μήκους 30 nm και μέση τιμή πάχους 5 nm. Τα ικριώματα ΗΑp που προέκυψαν έπειτα από διασύνδεση με γλουταραλδεΰδη και γενιπίνη εμφανίζουν εξαιρετικό εσωτερικό πορώδες δίκτυο αποτελούμενο τόσο από μακροπόρους όσο και μικροπόρους διασυνδεδεμένους μεταξύ τους και εμφανώς βελτιωμένες μηχανικές ιδιότητες. Αντίθετα τα ικριώματα στα οποία προστέθηκαν πηκτικοί παράγοντες εμφανίζουν μόνο μακροπορώδες και χάνουν αμέσως το σχήμα τους σε υδατικό περιβάλλον. 9

10 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Ratner B.D., Hoffman A.S., Schoen F.J., Lemons J.E., Biomaterials science: an introduction to materials in medicine, 3 rd edition, Academic press, (2004). [2] Yamomoto A., Honna R., Sumita M., Hanawa T., Cytotoxicity evaluation of ceramics particles of different sizes and shapes, J. Biomed. Mater. Res., 68(A): (2004). [3] Hsu F.Y., Chueh S.C., Wang Y.J., Microspheres of hydroxyapatite / reconstituted collagen as supports for osteoblast cell growth, J. Biomaterials, 20: (1999). [4] Koutsopoulos S., Synthesis and characterization of hydroxyapatite crystals: A review study on the analytical methods, J. Biomed. Mater. Res., 62(4): (2002). [5] Zhang R., Ma P.X., Poly(a-hydroxyl acids) / hydroxyapatite porous composite for bonetissue engineering. Preparation and morphology, J. Biomed. Mater. Res., 44: (1999). [6] Blokhuis T.J., Chris Arts J.J., Bioactive and osteoinductive bone graft substitutes: Definitions, facts and myths, J. Injury, 42: (2011). [7] LeGeros R.Z., Biphasic calcium phosphate bioceramics: preparation, properties and applications, J. Mater, Science: Mater. In Med., 14: (2004). [8] Palmer L.C., Newcomb C. J., Kaltz S. R., Spoerke E.D., Stupp S. I., Chem. Rev. 108, (2008). [9] Gonzalez McQuire R., Chane-Ching J.Y., Vignaud E., Lebugle A., Mann S., Synthesis and characterization of amino acid functionalized hydroxyapatite nanorods, J. Mater. Chem., 14: (2004). [10] Jack K.S., Vizcarra T.G., Trau M., Characterization and surface properties of amino acid modified, carbonate containing hydroxyapatite particles, J. Langmuir, 23: (2007). [11] Rosseeva E.V., Golovanova O.A., Frank Kamenetskaya O.V., The influence of amino acids on the formation of nanocrystalline hydroxyapatite, J. Glass Phys. Chem., 33: (2007). [12] Thein-Han W.W., Saikhun J., Pholpramoo C., Misra R.D.K., Kitiyanant Y., Chitosangelatin scaffolds for tissue engineering: Physico-chemical properties and biological response of buffalo embryonic stem cells and transfectant of GFP-buffalo embryonic stem cells, Acta Biomaterialia, 5: (2009). [13] Mali S., Misra R.D.K., Somani M.C., Karjalainen L.P., Biomimetic nanostructured coatings on nano-grained / ultrafine-grained substrate: Microstructure, surface adhesion strength, and biosolubility, Materials Science & Engineering C, 29: (2009). [14] Zhang Y., Zhang M., Three-dimensional macroporous calcium phosphate bioceramics with nested chitosan sponges for load-bearing bone implants, Wiley Periodicals, 61:1-8 (2002). [15] Thein-Han W.W., Misra R.D.K., Biomimetic chitosan-nanohydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering, Acta Biomaterialia, 5: (2009). [16] Zhao F., Grayson W.L., Ma T., Bunnell B., Lu W.W., Effects of hydroxyapatite in 3-D chitosan-gelatin polymer network on human mesenchymal stem cell construct development, Biomaterials, 27: (2006). [17] Khor E., Lim L.Y., Implantable applications of chitin and chitosan, Biomaterials, 24: (2003). 10