EΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

Transcript

1 EΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Πώς αλλάζουν οι κυτταρικές πληροφορίες Μεταλλάξεις Φυσικοί Μηχανισμοί Μεταφοράς Γονιδίων Μετασχηματισμός Μεταγωγή Επισώματα και Σύζευξη Εσωτερική Mεταφορά Γονιδίων Γενετική Μηχανική Κυττάρων Τεχνολογία Ανασυνδυασμένου DNA Eργαλεία: (φορείς DNA, ένζυμα) Τεχνικές Κλωνοποίησης Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Γενωμική

2 Μεταλλάξεις Γενότυπος: γενετικό δυναμικό του κυττάρου <Σταθερός> Φαινότυπος: χαρακτηριστικά που εκφράζονται από το κύτταρο («φαίνονται») <Μεταβλητός ανάλογα με το περιβάλλον>

3 Μεταλλάξεις Φαινοτυπική αλλαγή (αντιστρεπτή) O 2 O 2 low O 2 Γενοτυπική αλλαγή (μη αντιστρεπτή) O 2

4 ? Μεταλλάξεις Μετάλλαξη σημείου: αλλαγή μίας βάσης Μεταβολή ενός αμινοξέος πχ στο ενεργό κέντρο μίας πρωτεΐνης ή δημιουργία κωδικονίου STOP (πχ CAA->UAA) Σιωπηλές μεταλλάξεις: UCU UCA -> σερίνη Μετάλλαξη εξάλειψης: εξάλειψη μίας βάσης Μετάλλαξη προσθήκης: προσθήκη μίας βάσης Επαναμεταλλάξεις ή ανακάμψεις: Αποκατάσταση γενότυπου και φαινότυπου Αποκατάσταση μόνο του φαινότυπου Πως δημιουργούνται οι μεταλλάξεις και ποιες οι επιπτώσεις τους;

5 Μεταλλάξεις Προσθήκης UΑA + Εξάλειψης Χ Πόσα είναι τα πλαίσια ανάγνωσης;

6 Πλαίσια Ανάγνωσης (Open Reading Frames)

7 Μεταλλαγμένα κύτταρα Σημασία μεταλλάξεων στη βιομηχανία Μελέτη φυσιολογίας των κυττάρων Βιομηχανικά εργαλεία (μεταβολική ρύθμιση υπερπαραγωγή προϊόντων) Φυσικές μεταλλάξεις: τυπικά 10-6 μεταλλάξεις/γονίδιο Χημικές μεταλλάξεις: μεταλλαξογόνοι παράγοντες, ακτινοβολία UV Επιλέξιμες (επιβίωση μεταλλαγμένου) και μη επιλέξιμες μεταλλάξεις (ανάγκη επιλογής) o άμεση επιλογή (πχ αντιβιοτικά) και o έμμεση επιλογή (πχ αυξοτροφικές μεταλλάξεις) Εξαρτημένες μεταλλάξεις (πχ θανατηφόρες)

8 Έμμεση επιλογή με χρήση διατροφικών μεταλλαγμάτων

9 Γενετικός ανασυνδυασμός Δημιουργία νέων γενοτύπων από δύο διαφορετικά γονιδιώματα

10 Βασικά βήματα γενετικού ανασυνδυασμού Eισαγωγή DNA δότη σε κύτταρο δέκτη

11 Μηχανισμοί Γενετικός ανασυνδυασμός Μετασχηματισμός: Παραλαβή ελεύθερου DNA από ένα κύτταρο Μεταγωγή: Μεταφορά ελεύθερου DNA από βακτηριοφάγο Σύζευξη: Μεταφορά DNA μεταξύ άθικτων κυττάρων με άμεση επαφή Εσωτερική μεταφορά γονιδίων: Μετακίνηση ενός ή περισσότερων γονιδίων (τρανσποζόνια) από ένα σημείο του DNA σε άλλο.

12 Μετασχηματισμός Πλασμίδια: «οχήματα μεταφοράς» γονιδίων στα κύτταρα του δέκτη (φορείς κλωνοποίησης) Χαρακτηριστικά: Κυκλικά μόρια DNA Μικρό μέγεθος Δυνατότητα αντιγραφής στο κύτταρο-δέκτη Ανάγκη δημιουργίας «επιδεκτικών» κυττάρων πχ επεξεργασία κυττάρων E. coli με Ca + Συχνότητα 1:10 6, αύξηση με χρήση δεικτών

13 Ιδιότητες φορέων DNA Αντιγράφεται στο βακτήριο Το εισερχόμενο DNA θα είναι σταθερό Συνήθως εξω χρωμοσωμικό Εύκολη η επιλογή του βακτηρίου που περιέχει το φορέα (αντίσταση στα αντιβιοτικά) Φορείς Πλασμίδια (εξω χρωμοσωμικό κυκλικό DNA) Βακτηριοφάγοι Κοσμίδια

14 Τοποθέτηση του ανασυνδυασμένου DNA στο κύτταρο του δέκτη Εισαγωγή πλασμιδίου στα κύτταρα του φορέα Μετασχηματισμός HEAT SHOCK 42 O C, 45 sec

15 Συνθήκες πχ για Pichia pastoris 2000 Volt, 4 ms Ηλεκτροδιάτρηση

16 Μεταγωγή Βακτηριοφάγοι (ιοί): Ενσωμάτωση του DNA των φάγων από το κύτταρο δέκτη. Είδη μεταγωγής: Γενικευμένη μεταγωγή: Κατάτμηση του βακτηριακού DNA. Τυχαία ενσωμάτωση τμήματος DNA στον φάγο. Συνδυασμός του DNA φάγου με το DNA του κυττάρου δέκτη (βακτηρίου). Εξειδικευμένη μεταγωγή: Ενσωμάτωση συγκεκριμένων τμημάτων DNA στον φάγο (π.χ. φάγος λ).

17 Σύζευξη (Oριζόντια μεταφορά γονιδίων) Επίσωμα: Μόριο DNA που είτε είναι ενσωματωμένο στο DNA του κυττάρου δέκτη είτε χωρισμένο από αυτό (πλασμίδιο). Μεταφορά επισώματος από κύτταρο δότη στο κύτταρο δέκτη: άμεση επαφή.

18 Εσωτερική μεταφορά γονιδίων Τρανσποζόνιο: Γονίδιο που έχει τη δυνατότητα να μετακινηθεί από ένα τμήμα DNA σε άλλο (εσωτερικά, στο ίδιο κύτταρο). ΔΕΝ υπάρχει ομολογία με τη νέα θέση. Μπορεί να κωδικεύουν ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά > επιπτώσεις στην υγεία! Δημιουργία μεταλλάξεων.

19 Η τεχνολογία που συνεπάγεται όλες τις διεργασίες που μεταβάλλουν το γενετικό υλικό ενός κυττάρου για να το κάνει ικανό να εκτελέσει τις επιθυμητές λειτουργίες, όπως πχ την παραγωγή καινοτόμων ουσιών.

20 Tεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA Aπομόνωση DNA (PCR, περιοριστικές ενδονουκλεάσες) Συνένωση DNA οργανισμού με DNA ενός φορέα π.χ. ενός πλασμιδίου (DNA λιγάση) > ανασυνδυασμένα πλασμίδια Εισαγωγή πλασμιδίων (ανασυνδυασμένων ή μη) σε ένα ξενιστή (π.χ. βακτήριο, ζύμη) Επιλογή ξενιστών που περιέχουν ανασυνδυασμένα πλασμίδια (π.χ. αντοχή σε αντιβιοτικό) Έκφραση του γονιδίου και παραγωγή της επιθυμητής πρωτεΐνης

21 Στρατηγική

22 Ένζυμα που χρησιμοποιούνται στην τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA Νουκλεάσες: αποικοδομούν το DNA Λιγάσες: ενώνουν τμήματα DNA Πολυμεράσες: αντιγράφουν μόρια DNA Τροποποιητικά ένζυμα: προσθέτουν ή αφαιρούν χημικές ομάδες (πχ φωσφατάσες, κινάσες) Τοποϊσομεράσες

23 Ένζυμα που χρησιμοποιούνται στην τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA

24 Νουκλεάσες Εξω-νουκλεάσες: διασπούν φωσφοδιεστερικούς δεσμούς στα άκρα της αλυσίδας DNA. Ενδο-νουκλεάσες: διασπούν φωσφοδιεστερικούς δεσμούς σε εσωτερικά σημεία της αλυσίδας DNA.

25 Νουκλεάσες

26 Περιοριστικές ενδονουκλεάσες Τα ένζυμα που κόβουν το DNA σε συγκεκριμένες αλληλουχίες Ανακαλύφθηκαν στις αρχές του 1950 Παράγοντας προστασίας των βακτηρίων κατά των βακτηριοφάγων Ελεγχόμενη υδρόλυση νουκλεοτιδίων Κυρίως βακτηριακής προέλευσης Πάνω από 1200 χαρακτηρισμένες

27 Ενδονουκλεάσες περιορισμού Τρεις τύποι με τον τύπο II σημαντικό για τη Γενετική Μηχανική λόγο εξειδίκευσης υποστρώματος Στόχευση κυρίως παλινδρομικών αλληλουχιών Αναγνωρίζουν ακολουθίες 4, 6 ή 8 νουκλεοτιδίων

28 Ενδονουκλεάσες περιορισμού Τυφλά άκρα (blunt ends)

29 Ενδονουκλεάσες περιορισμού Κολλώδη άκρα (sticky ends)

30 Ενδονουκλεάσες περιορισμού Ονομασία βάση του μικροοργανισμού π.χ. EcoRI = Escherichia (E) coli (co) στέλεχος R(R). Το I αναφέρεται στο 1 ο ένζυμο που απομονώθηκε από το μικροοργανισμό Γιατί τα βακτηριακά αυτά ένζυμα δεν αποικοδομούν το δικό τους DNA? Τα βακτήρια παράγουν τις αντίστοιχες μεθυλάσες του DNA οι οποίες αναγνωρίζουν τις ίδιες ακολουθίες νουκλεοτιδίων όπως τα ένζυμα περιορισμού. Οι μεθυλάσες στοχεύουν την ακολουθία DNA κάνοντάς τη ανθεκτική στα ένζυμα περιορισμού

31 Ενδονουκλεάσες περιορισμού και μεθυλάσες του DNA Ξένο DNA GAATTC CTTAAG EcoRI G AATTC CTTAA G DNA Ξενιστή GAATTC CTTAAG CH 3 GAATTC CTTAAG DNA μεθυλάση CH 3 EcoRI CH 3 GAATTC CTTAAG CH 3

32 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή Μέθοδος διαχωρισμού κλασμάτων DNA

33 Λιγάσες Διορθώνουν ασυνέχειες σε αλληλουχίες DNA Ενώνουν δύο μόρια DNA

34 DNA-Πολυμεράσες Συνθέτουν ένα νέο κλώνο DNA ομόλογο μίας υπάρχουσας μήτρας DNA. Εκκινητής (primer): έναρξη πολυμερισμού. Βασική δράση: σύνθεση 5 3 Διορθωτική δράση:3 5 (εξωνουκλεάση Proofreading) Ποια η διαφορά με τις λιγάσες στην ενέργεια;

35 Η DNA πολυμεράση ελέγχει την πιστότητα της αντιγραφής Proofreading «διόρθωση δοκιμίων» Συχνότητα λαθών: 1:10 7 βάσεις

36 Δομή DNA-Πολυμεράσης Ενεργό Κέντρο Πολυμερισμού Ενεργό Κέντρο Εξωνουκλεάσης DNA Polymerases: Structural Diversity and Common Mechanisms (1999) The Journal of Biological Chemistry, 274,

37 Αποκοπή της μονάδας εξωνουκλεάσης 3 >5 με πρωτεάσες

38

39 Λήψη επιθυμητού γονιδίου από τον δότη Κλωνοποίηση τυφλής στόχευσης: τυχαίος τεμαχισμός DNA. Εντοπισμός με χρήση ιχνηθέτηαπαιτείται μερική γνώση της αλληλουχίας του επιθυμητού γονιδίου Oλοκληρωτική χημική σύνθεση γονιδίου: τεχνητό γονίδιο: απαιτείται η γνώση της σειράς των αμινοξέων της επιθυμητής πρωτεΐνης Ενίσχυση γονιδίου από γενωμικό DNA: χρήση τεχνικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) Απομόνωση m-rnα: απομόνωση m-rna από το δότη-σύνθεση μορίου DNA που αντιστοιχεί στο επιθυμητό γονίδιο (αντίστροφη μεταγραφάση)

40 Τι πρέπει να προσέξουμε για τη λήψη του επιθυμητού γονιδίου μέσω mrna; Πότε είναι αναγκαία η χρήση της 2 ης μεθόδου;

41 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Ενισχύει DNA δεδομένων αλληλουχιών Διάγνωση Εντοπισμός της παρουσίας κάποιου γονιδίου Εντοπισμός της παρουσίας κάποιας μετάλλαξης Εντοπισμός γονιδιακής έκφρασης Ενισχύει DNA από αρχαία ή σπάνια δείγματα για αναλύσεις Μας δίνει τη δυνατότητα να μεταβάλλουμε την αλληλουχία του DNA Kary B. Mullis βραβείο Nobel Χημείας 1993

42 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Ενίσχυση του DNA χρησιμοποιώντας τα παρακάτω: Θερμοσταθερή DNA πολυμεράση π.χπολυμεράσηtaq απομονωμένη από Thermus aquaticus DNA στόχος Νουκλεοτίδια Εκκινητές Ορίζουν την περιοχή του DNA που ενισχύεται Συσκευή (Thermocycler, μεταβάλει γρήγορα τη θερμοκρασία της αντίδρασης)

43 Αρχές της PCR 1 ος κύκλος 5 3 Περιοχή του DNA για ενίσχυση 94 C Heat Cool to to 72 C 5 55 C 3

44 2 ος κύκλος 55 C 94 C 72 C

45 3 ος κύκλος 94 C 72 C 55 C 2 2

46 Προϊόντα κατά τη διάρκεια της PCR 3ος 4ος 5ος 6ος Η ενίσχυση είναι εκθετική αφού τα σχηματιζόμενα μετάγραφα δρουν ως νέα εκμαγεία. Οι αντιδράσεις PCRs συνήθως τρέχουν για 30 κύκλους όπου παράγονται περίπου 2 28 μόρια ή Το αρχικό ποσό του DNA εκμαγείου μπορεί να είναι ελάχιστα χιλιάδες μόρια (femto moles). Μία από τις πιο ευαίσθητες αντιδράσεις στη Μοριακή Βιολογιά.

47 Αλυσιδωτή αντίδραση DNA πολυμεράσης PCR

48 Αλυσιδωτή αντίδραση DNA πολυμεράσης PCR

49 Θερμόφιλες DNA πολυμεράσες Απομονώνονται από βακτήρια θερμών πηγών Η Taq χρησιμοποιείται για αναλυτικούς κυρίως σκοπούς (μεγάλη συχνότητα λαθών, αδενίνη στα άκρα αλλά φθηνή)

50 Κλωνοποίηση του cdna cdna: συμπληρωματικό ή αντίγραφο DNA Προέρχεται από το mrna Διπλής έλικας DNA με τον ένα κλώνο του ίδιας αλληλουχίας με το mrna Γιατί να κλωνοποιούμε cdna; Απαραίτητο για την έκφραση ευκαρυωτικών πρωτεϊνών σε βακτήρια Τα ιντρόνια ΔΕΝ απομακρύνονται στα βακτήρια Οπότε δεν παράγεται πρωτεΐνη

51 Ευκαρυωτικός οργανισμός Βακτήρια Ιντρόνιο Ιντρόνιο Splicing Μεταγραφή RNA mrna Μετάφραση Μετάφραση Λειτουργική πρωτεΐνη Μη λειτουργική πρωτεΐνη

52 Βακτήρια cdna Μεταγραφή mrna Μετάφραση Μη λειτουργική όταν είναι αναγκαίες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (πχ Ν- γλυκοζυλίωση) Λειτουργική πρωτεΐνη

53 Κλωνοποίηση ενισχυμένων DNA με PCR Ενίσχυση μίας περιοχής DNA αλλά υπάρχει η ανάγκη για τη κλωνοποίηση σε έναν φορέα Τι χρειαζόμαστε στα άκρα; Περιοχές ενζύμων περιορισμού Πως τις δημιουργούμε; Ενσωμάτωση περιοχών περιορισμού στους εκκινητές

54 Εκκινητές PCR για κλωνοποιήσεις Εκκινητής 1 Περιοχή ενδονουκλεάσης περιορισμού Συμπληρωματική περιοχή για τη στόχευση περιοχής του DNA Εκκινητής 2 Περιοχή ενδονουκλεάσης περιορισμού Συμπληρωματική περιοχή για τη στόχευση περιοχής του DNA

55 Εκκινητές PCR για κλωνοποιήσεις Περιοχή για ενίσχυση 30 κύκλοι PCR Το ενισχυμένο DNA περιέχει περιοχές περιορισμού

56 Εκκινητές PCR για ανάλυση Περιοχή για ενίσχυση 30 κύκλοι PCR Το ενισχυμένο DNA δεν περιέχει περιοχές περιορισμού

57 Ανασυνδυασμός DNA δότη και φορέα Τι χρειαζόμαστε Πλασμίδια: «οχήματα μεταφοράς» γονιδίων στα κύτταρα του δέκτη (φορείς κλωνοποίησης) Περιοριστικές ενδονουκλεάσες: τέμνουν το DNA του φορέα σε συγκεκριμένες θέσεις- Κολλώδη άκρα. Λιγάσες: Ενώνουν τα συμπληρωματικά κολλώδη άκρα.

58

59 Πλασμιδιακό DNA

60 Ένζυμο περιορισμού EcoRI

61 Ένζυμο περιορισμού EcoRI

62

63 Ένθεμα DNA

64 Ένζυμο περιορισμού EcoRI Ένθεμα DNA

65

66

67 Λιγάση

68 Ανασυνδυασμός DNA δότη και φορέα

69 Ανασυνδυασμός DNA δότη και φορέα Κατευθυνόμενη ή μη κλωνοποίηση

70 Ξενιστές: Βακτήρια, ζύμες, κύτταρα θηλαστικών, κύτταρα εντόμων

71 Τοποθέτηση του ανασυνδυασμένου DNA στο κύτταρο του δέκτη Εισαγωγή πλασμιδίου στα κύτταρα του φορέα Μετασχηματισμός Άγνωστος μηχανισμός!!

72

73 Επιλογή μετασχηματισμένων κυττάρων Γονίδιο για προστασία ενάντια σε αντιβιοτικά Ξένο DNA Περιοχή ενδιαφέροντος Ανασυνδυασμένο DNA Κολλώδη άκρα Υπάρχουν άλλες δυνατότητες στο στάδιο της λιγάσης με αρνητικό αποτέλεσμα; Τρυβλίο με αντιβιοτικό Ανάπτυξη μόνο ανασυνδυασμένων κυττάρων Κλωνοποίηση σε φορέα

74 Υπάρχει όμως και η περίπτωση αποικιών χωρίς ενθέματα! Υπάρχει όμως και η περίπτωση αποικιών με λάθος ενθέματα!

75 Εντοπισμός μη ανασυνδυασμένων πλασμιδίων HindIII EcoRI BamHI Τα κύτταρα τα οποία περιέχουν το πλασμίδιο pbluescript εμφανίζουν αντίσταση στην αμπικιλλίνη και παίρνουν μπλε χρώμα σε τρυβλία X Gal puc18 Αφετηρία αντιγραφής LacZ κωδικοποιεί τη γαλακτοζιδάση Amp r προσδίδει αντίσταση στην αμπικιλλίνη

76 Εντοπισμός μη ανασυνδυασμένων πλασμιδίων

77 Ενεργότητα β γαλακτοζιδάσης σε τρυβλία Bromo chloro indoyl galactopyranosidase ή X Gal (Καθαρό) γαλακτοζιδάση Bromo chloro indoyl (Βαθύ μπλε αδιάλυτο)

78 Φορέας Προσθήκη χρωμοσωμικού DNA σε ένα φορέα GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Χρωμόσωμα GAATTC CTTAAG Κοπή με EcoRI και προσθήκη DNA λιγάσης GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Ανασυνδυασμένος φορέας Αντίσταση σε αμπικιλλίνη, Αρνητικό σε -γαλακτοζιδάση (Λευκές αποικίες σε X-Gal) Το LacZ γονίδιο κωδικοποιεί τη γαλακτοζιδάση Γονίδιο αντίστασης αμπικιλλίνης

79 Μη ανασυνδυασμένος φορέας GAATTC CTTAAG Αντίσταση σε αμπικιλλίνη, Θετικό σε -γαλακτοζιδάση (Μπλε αποικίες σε X-Gal) Το LacZ γονίδιο κωδικοποιεί τη γαλακτοζιδάση Γονίδιο αντίστασης αμπικιλλίνης

80 Χωρίς ένθεμα Με ένθεμα Μετασχηματισμός E. coli ευαίσθητο σε αμπικιλλίνη Αντίσταση σε αμπικιλλίνη, Θετικό σε γαλακτοζιδάση (Μπλε αποικίες σε X Gal) Αντίσταση σε αμπικιλλίνη, Αρνητικό σε γαλακτοζιδάση (Λευκές αποικίες σε X Gal)

81 Τα βακτήρια μετά τη λιγάση αναπτύσσονται σε τρυβλία με αμπικιλλίνη και X Gal Περιέχουν το μη ανασυνδυασμένο πλασμίδιο Περιέχουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο

82 Τα βακτήρια μετά τη λιγάση αναπτύσσονται σε τρυβλία με αμπικιλλίνη και X Gal Περιέχουν το μη ανασυνδυασμένο πλασμίδιο Περιέχουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο

83 Το ccdb γονίδιο εκφράζει μια πρωτεΐνη που αποτελεί παρεμποδιστή της DNA γυράσης στο E. coli σκοτώνοντας έτσι το κύτταρο

84

85 Ετερόλογη έκφρασης μίας πρωτεΐνης Αύξηση και έκφραση πρωτεΐνης Αύξηση κανονικού βακτηρίου Έκφραση ξένης πρωτεΐνης Αύξηση του τροποποιημένου βακτηρίου Χρόνος (ώρες)

86 Στρατηγική ετερόλογης έκφρασης μίας πρωτεΐνης Εάν η έκφραση μιας ξένης πρωτεΐνης λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης του βακτηρίου Η ανάπτυξη θα είναι αργή και φτωχή Παρόλο που το 40 % του βακτηρίου μπορεί να είναι η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη, θα έχουμε χαμηλή απόδοση εξαιτίας της χαμηλής βιομάζας Επιπλέον μικρή απόδοση εξαιτίας της επιλογής μεταλλαγμένων στελεχών που δεν εκφράζουν την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη.

87 Στρατηγική ετερόλογης έκφρασης μίας πρωτεΐνης Αύξηση κανονικού βακτηρίου Αύξηση και έκφραση πρωτεΐνης Έκφραση της ξένης πρωτεΐνης Επαγωγή έκφρασης της ξένης πρωτεΐνης Χρόνος (ώρες)

88 Στρατηγική ετερόλογης έκφρασης μίας πρωτεΐνης Για την παραγωγή σε μεγάλες ποσότητες ξένης πρωτεΐνης: Έλεγχος έκφρασης της ξένης πρωτεΐνης Αύξηση του βακτηρίου μεταξύ μέσης και τέλους της εκθετικής φάσης ανάπτυξης Επαγωγή έκφρασης Ανάγκη για ρυθμιζόμενους φορείς έκφρασης Χρήση επαγόμενου υποκινητή στο φορέα έκφρασης για τον έλεγχο της μεταγραφής

89 Φορέας έκφρασης εφοδιάζει τη κωδικοποιούσα περιοχή του cdna με έναν υποκινητή και ένα RBS Ρυθμιζόμενος υποκινητής RBS (Ribosome Binding Site) RES (restriction enzyme site) Αφετηρία αντιγραφής Ap r γονίδιο Φορέας έκφρασης

90 Επαγώγιμοι υποκινητές σε φορείς έκφρασης Πληθώρα ρυθμιζόμενων υποκινητών Περισσότεροι ελέγχονται από το χειριστή laco (lac operator) π.χ. υποκινητές που επάγονται από τη λακτόζη ή ανάλογα αυτής απενεργοποιώντας τον lac καταστολέα Ανάλογο λακτόζης: isopropylthio D galactopyranoside (IPTG) Δε μεταβολίζεται οπότε είναι ένας ισχυρός επαγωγέας για την έκφραση γονιδίων

91 Χρωμόσωμα E. coli Lac καταστολέας Lac υποκινητής Lac χειριστής Περιοχή έκφρασης T7 RNA πολυμεράσης Γονίδιο Lac καταστολέα Υποκινητής που αναγνωρίζεται από τη T7 RNA πολυμεράση Lac χειριστής Γονίδιο που εκφράζει ξένη πρωτεΐνη Lac καταστολέας Αδυναμία έκφρασης ξένης πρωτεΐνης Η κατάλληλη RNA πολυμεράση (Τ7) της ξένης πρωτεΐνης δε μεταγράφεται! Γονίδιο Lac καταστολέα E. coli RNA πολυμεράση Γονίδιο αντίστασης σε αντιβιοτικά pet Lac καταστολέας Φορέας έκφρασης

92 Αύξηση κανονικού βακτηρίου Αύξηση και έκφραση πρωτεΐνης Έκφραση της ξένης πρωτεΐνης Χρόνος (ώρες) Επαγωγή έκφρασης της ξένης πρωτεΐνης με τη προσθήκη IPTG

93 Lac υποκινητής Χρωμόσωμα E. coli Lac χειριστής Περιοχή έκφρασης T7 RNA πολυμεράσης Lac καταστολέας Χ Γονίδιο Lac καταστολέα IPTG Καταστολέας Lac ανενεργός Υποκινητής που αναγνωρίζεται από τη T7 RNA πολυμεράση Lac χειριστής Γονίδιο που εκφράζει ξένη πρωτεΐνη T7 RNA πολυμεράση Προσθήκη IPTG στο υγρό της καλλιέργειας Έκφρασης ξένης πρωτεΐνης E. coli RNA πολυμεράση Γονίδιο Lac καταστολέα Χ Lac καταστολέας Γονίδιο αντίστασης σε αντιβιοτικά pet Φορέας έκφρασης

94 Επαγώγιμοι υποκινητές σε φορείς έκφρασης Ο περισσότερο κοινός φορέας έκφρασης είναι ο pet Ο υποκινητής στο φορέα έκφρασης αναγνωρίζεται από τη T7 RNA πολυμεράση Ο υποκινητής αυτός δεν αναγνωρίζεται από τη RNA πολυμεράση του E. coli Το γονίδιο που κωδικοποιεί την T7 RNA πολυμεράση η οποία ρυθμίζεται από το laco έχει εισαχθεί στο γονιδίωμα του E. coli. Ο υποκινητής του φορέα έκφρασης επίσης ρυθμίζεται από το laco Οπότε το IPTG επάγει την έκφραση της T7 RNA πολυμεράσης Του ξένου γονιδίου ή cdna Δύο επίπεδα ελέγχου

95 Σημειακές μεταλλάξεις με PCR Η τεχνική PCR χρησιμοποιείται για την αλλαγή της αμινοξικής αλληλουχίας με καθορισμένο τρόπο Μεταβολή στη αλληλουχία βάσεων του DNA προξενεί μεταβολή στην αλληλουχία αμινοξέων Κατασκευή εκκινητών που δεσμέυονται στο γονίδιο αλλά μεταφέρουν την επιθυμητή μετάλλαξη ATG TTT AAA TGG GAG CGC MET PHE LYS TRP GLU ARG Μετάλλαξη ATG TTT AAA GGG GAG CGC MET PHE LYS GLY GLU ARG

96 Θεση-κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση

97 Σημειακές μεταλλάξεις με PCR G T TG AC Προσθήκη DpnI αποικοδόμηση του μητρικού κλώνου λόγω αναγνώρισης μεθυλιωμένου DNA C A

98 Κλωνοποίηση PCR Για την απομόνωση ενός άγνωστου γονιδίου βάση της αμινοξικής του ακολουθίας Κατασκευή εκκινητών με βάση την αλληλουχία των αμινοξέων Χρήση PCR και παραλαβή προϊόντος Met Lys Trp Met ATGAA(A/G)TGGATG Lys Met Phe Trp AA(A/G)ATGTT(T/C)TGG

99 Γενετικός κώδικας

100 Γενετικά Τροποποιημένοι Οργανισμοί

101 Φορείς: πλασμίδια,επισώματα, βακτηριοφάγοι (ιοί) Ξενιστές: Βακτήρια, ζύμες, κύτταρα θηλαστικών, κύτταρα εντόμων

102 Περιεχόμενα Προϊόντα γενετικά τροποποιημένων κυττάρων Έκφραση γονιδίων Συστήματα ξενιστή-φορέα Γενετική αστάθεια Μεταβολική μηχανική Πρωτεϊνική μηχανική

103 Συστήματα ξενιστή-φορέα Bακτήρια Zύμες Μύκητες Κύτταρα θηλαστικών Σύστημα κυττάρων εντόμου-ιού Διαγονιδιακά ζώα Διαγονιδιακά φυτά

104 Κύτταρα ωοθήκης Κινέζικου Hamster (CHO)? 1 Βιομηχανία δισεκατ $ 2 Για την αντιμετώπιση σοβαρών ασθενειών (καρκίνος, αυτοάνοσα νοσήματα) 1 Βιομηχανική παραγωγή 3 : max όγκος εργασίας βιοαντιδραστήρα: 20,000L Τύποι μορίων(rdna) Επιθυμητός τρόπος: Fed-batch; μέχρι 20 ημέρες Στόχος: αύξηση της απόδοσης παραγωγής ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών [mabs: <60pg/cell/day max: 100pg/cell/day 3 ] 1. Kyriakopoulos & Kontoravdi (2013). Eur. J. Pharm. Sci., 48(3): Evaluate Pharma (2013). 3. De Jesus & Wurm (2011). Eur. J. Pharm. Biopharm, 78(2): rdna

105 Συστήματα ξενιστή-φορέα Βακτήρια Escherichia coli Πλεονεκτήματα Μεγάλο εύρος γνώσεων Υψηλοί ρυθμοί ανάπτυξης Μειονεκτήματα «Έξοδος» ενδοκυτταρικών πρωτεΐνες Κυτταρικά έγκλειστα Δεν γλυκοζυλιώνει Αποικοδόμηση της πρωτεΐνης Ανάπτυξη σε φθηνά και απλά θρεπτικά υλικά

106 Έκκριση και απέκκριση

107 Συστήματα ξενιστή-φορέα Βακτήρια Escherichia coli Περιορισμοί: Το επιθυμητό γονίδιο δεν πρέπει να περιέχει ιντρόνια. Το επιθυμητό γονίδιο μπορεί να περιέχει αλληλουχίες που κωδικοποιούν σήματα τερματισμού της μεταγραφής για το E.coli. Codon bias: Η αποτελεσματικότητα του t-rna να αναγνωρίζει τα διαφορετικά κωδικόνια διαφέρει σε κάθε οργανισμό.

108 Επαγωγή με χρήση συνθετικών μορίων που δε μεταβολίζονται π.χ. IPTG (Isopropyl β-d-1- thiogalactopyran

109 Συστήματα ξενιστή-φορέα Ζύμες Saccharomyces cerevisae Πλεονεκτήματα FDA GRAS- Εφαρμογή στα τρόφιμα Έκκριση πρωτεϊνών Γλυκοζυλίωση πρωτεϊνών Μειονεκτήματα Χαμηλά επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης Υπεργλυκοζυλίωση Pichia pastoris Πλεονεκτήματα Aνάπτυξη σε μεθανόλη Έκκριση πρωτεϊνών Υψηλή κυτταρική πυκνότητα-μεγαλύτερη κατ όγκο παραγωγή Μειονεκτήματα Υψηλή θερμότητα μεταβολισμού Υψηλές απαιτήσεις σε οξυγόνο Δύσκολος έλεγχος της διεργασίας Αποικοδόμηση της πρωτεΐνης

110 Συστήματα ξενιστή-φορέα Κύτταρα θηλαστικών Πλεονεκτήματα Σωστές μετα-μεταφραστικές διαδικασίες Έκκριση πρωτεϊνών Μειονεκτήματα Ακριβά θρεπτικά υλικά Χαμηλά επίπεδα έκφρασης Θνησιγενείς κυτταρικές σειρές Παθογόνοι φορείς? Σειρές κυττάρων CHO: κύτταρα ωοθήκης κινεζικού χάμστερ Φορείς: Ιοί ανώτερων θηλαστικών

111 Συστήματα ξενιστή-φορέα Συστήματα Εντόμου-Ιού Πλεονεκτήματα Υψηλά επίπεδα έκφρασης Ασφάλεια Ταχύτητα Μειονεκτήματα Πολυπλοκότητα Μετάλλαξη του ιού Ξενιστές: Spodoptera frugipedra, Trichoplusia ni Ιός: Autographa califomica, πυρηνικός πολυεδρικός ιός

112 Συστήματα ξενιστή-φορέα Διαγονιδιακά ζώα Πλεονεκτήματα Εξειδικευμένες μετα-μεταφραστικές διαδικασίες Υψηλές συγκεντρώσεις πρωτεϊνών Μειονεκτήματα Προβλήματα υγείας των ζώων Μετάδοση ιών Δαπανηρά συστήματα Πρόβατα, αίγες, χοίροι

113 Συστήματα ξενιστή-φορέα Διαγονιδιακά φυτά Πλεονεκτήματα Χαμηλό κόστος Ασφάλεια Μειονεκτήματα Χαμηλά επίπεδα έκφρασης Ατελής γλυκοζυλίωση Χρονοβόρες καλλιέργειες Καλαμπόκι Αντικείμενο έρευνας: Καλλιέργειες φυτικών κυττάρων