ASTO-CRP-RF. Dr.ΠΑΠΑΓΙΑΝΝΗΣ ΔΗΜΗΤΡΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΕΙ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ

Transcript

1 ASTO-CRP-RF Dr.ΠΑΠΑΓΙΑΝΝΗΣ ΔΗΜΗΤΡΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΕΙ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ

2 Streptococcus pyogenes (πυογόνος στρεπτόκοκκος) Α. Μορφολογία-Ταξινόμηση Gram-θετικός κόκκος (0,6-1,0 μm διάμετρο) Συναντάται σε ζεύγη ή αλυσίδες Ομάδα-β αιμόλυση (πλήρης λύση ερυθρών όπως έχει παρατηρηθεί in vitro) Ομάδα-Α πρασινίζοντες(ταξινόμηση κατά Lancefield) Electron micrograph of Streptococcus pyogenes

3

4 Streptococcus viridans πρασινίζων Βρίσκονται στην φυσιολογική χλωρίδα των αναπνευστικών οδών. Είναι από τα συνηθέστερα αίτια της μικροβιακής ενδοκαρδίτιδος, η οποία παρατηρείται σε άτομα τα οποία πάσχουν από συγγενή ή επίκτητη (ρευματική ενδοκαρδίτιδα). Κινδύνευαν παλιά αυτά τα άτομα σε οδοντιατρικές επεμβάσεις. Σχηματίζει πράσινη άλω γύρω από τις αποικίες και διαφέρει από τον πνευμονόκοκκο με ειδική δοκιμασία που παράγει πράσινη άλω επίσης(ομάδα Α).

5 Streptococcus pyogenes (πυογόνος στρεπτόκοκκος) Δομή καψίδιο που περιέχει υαλουρονικό οξύ Μ πρωτεΐνη >100 διαφορετικοί οροτύποι (serotypes) αναστέλλει την ενεργοποίηση του συμπληρώματος κάποιοι Μ οροτύποι σχετίζονται με τον Ρευματικό πυρετό

6 Αντιγονική σύσταση β-αιμολυτικού στρεπτόκοκκου Περιβάλλεται από έλυτρο που η σύνθεση του είναι Ν- ακετυλογλυκοσαμίνη και γλυκουρονικό οξύ. Η εξωτερική στοιβάδα περιέχει τα αντιγόνα Μ,Τ,Ρ και μια ειδική πρωτεΐνη του παράγοντα θολερότητας του ορού (serum opacity factor, SOF). Η επιφάνεια των στρεπτόκοκκων καλύπτεται από φίμπριες οι οποίες τρυπούν το κυτταρικό τοίχωμα. Είναι χρήσιμα όλα τα αντιγόνα για την τυποποίηση αλλά και την λοιμογόνο δράση του β-αιμολυτικού στρεπτόκοκκου.

7 Streptococcus pyogenes (πυογόνος στρεπτόκοκκος) Βασικές τοξίνες Ερυθρογόνες τοξίνες Α, Β, C (erythrogenic/pyrogenic toxins) Στρεπτολυσίνη-Ο αλληλεπιδρά με μόρια χοληστερόλης (cholesterolbinding/pore-forming toxin) ολιγομερίζεται (25-80 μονομερή) Στρεπτολυσίνη-S * *ενεργοποιείται μόνο μετά από σύνδεση με πρωτεΐνη φορέα

8 Στρεπτολυσίνη- Ο Αιμολύει τα ερυθρά αιμοσφαίρια ανθρώπου, κόνικλου,προβάτου και ίππου. Είναι πρωτεΐνη μοριακού βάρους ευαίσθητη στο οξυγόνο και την θέρμανση στους 37 ο C,δρα αιμολυτικώς αλλά αδρανοποιείται με οξείδωση. Η ανάπτυξη σε αιματούχο άγαρ διευκολύνει την εμφάνιση αιμόλυσης. Έχει αντιγονικές ιδιότητες και προκαλεί τον σχηματισμό αντισώματος της αντι-στρεπτολυσίνης Ο. Προσδιορίζεται ποσοτικά in-vitro στον ορό του αίματος στις 200 μονάδες είναι το φυσιολογικό όριο.

9 Streptococcus pyogenes (πυογόνος στρεπτόκοκκος) ΠΑΘΗΣΕΙΣ Φαρυγγίτιδα Αμυγδαλίτιδα Ωτίτιδα Πυοδερμία Οστρακιά Ρευματικό πυρετό* Μοριακός μιμητισμός (παραγωγή αντι-μ αντισωμάτων που εμφανίζουν διασταυρούμενη αντίδραση με αντιγόνο του μυοκαρδίου) Σπειραματονεφρίτιδα* Εναπόθεση ανοσοσυμπλεγμάτων στα νεφρικά σπειράματα *delayed sequelae (μεταστρεπτοκοκκικές παθήσεις)

10 ΡΕΥΜΑΤΙΚΟΣ ΠΥΡΕΤΟΣ Αποτελεί την σοβαρότερη επιπλοκή της λοιμώξεως από β-αιμολυτικό στρεπτόκοκκο Βλάβες αρθρώσεων Καρδιακού μυός Βαλβίδων καρδιάς Παρατηρείται αύξηση της ταχύτητας καθίζησης, της CRP, και των ειδικών στρεπτοκοκκικών αντισωμάτων (ASO-anti- DNAάση).

11 Προσδιορισμός Ρευματοειδή Παράγοντα (RF) RF: Ab έναντι του Fc κλάσματος της IgG Ανήκει κυρίως στις IgM ανοσοσφαιρίνες και αυξάνει στη ρευματοειδή αρθρίτιδα

12 ASTO Κάνουμε αραιώσεις του ορού με το ρυθμιστικό διάλυμα. Συνήθως γίνονται 10 αραιώσεις από 1:50 έως 1:2400 Τοποθετούμε τις αραιώσεις με τη σειρά στα σωληνάρια Προσθέτουμε διάλυμα στρεπτολυσίνης στα σωληνάρια Ανακινούμε και τα αφήνουμε σε θερμοκρασία δωματίου για 15min. Προσθέτουμε εναιώρημα των ερυθρών τα βάζουμε στον κλίβανο στους 37 ο C για 45 λεπτά, τα βγάζουμε και ελέγχουμε πιθανή αιμόλυση.

13 Αναστολή αιμόλυσης (ASO Titer) Ετοιμάζουμε τις αραιώσεις του εξεταζόμενου ορού και του πρότυπου ορού με το ρυθμιστικό διάλυμα. (δεν συμπεριλαμβάνεται στην εικόνα) Τοποθετούμε τις αραιώσεις με τη σειρά (μικρότερη προς μεγαλύτερη) Προσθέτουμε διάλυμα στρεπτολυσίνης-ο

14 Αναστολή αιμόλυσης (ASO Titer) Ανακινούμε και επωάζουμε σε Τ δωματίου για 15 λεπτά Προσθέτουμε τα ερυθρά. Επωάζουμε στους 37ºC για 45 λεπτά. Ανακίνηση κάθε 15 λεπτά.

15 Αναστολή αιμόλυσης (ASO Titer) Αξιολόγηση ΝΑ ΘΥΜΑΣΤΕ Σχέση Αντισώματος-Αραίωσης ** Το τελευταίο σωληνάριο στο οποίο δεν παρατηρείται αιμόλυση είναι ο τίτλος της αντιστρεπτολυσίνης-ο ** Αξιολόγηση θετικού μάρτυρα Τίτλος ASO αυξάνεται σταδιακά 1 με 2 εβδομάδες μετά την μόλυνση Μέγιστη τιμή 3 με 5 εβδομάδες + >250 μονάδων Διαγνωστική αξία στον Ρευματικό πυρετό

16 ASO LATEX Στην μέθοδο αυτή χρησιμοποιούνται σωματίδια latex τα οποία είναι καλυμμένα με στρεπτολυσίνη-ο. Παρουσία αντι-στρεπτολυσίνης-ο παρατηρείται συγκόλληση. Μπορεί να γίνει ποιοτική ή ημι-ποσοτική αξιολόγηση του εξεταζόμενου ορού.

17 Προσδιορισμός ΑSΤΟ με συγκόλληση latex

18 Αντιδραστήρια: 1. Στρεπτολυσίνη. Φέρεται λυοφιλοποιημένη, δηλαδή αποξηραμένη σε φιαλίδια. Πριν από τη χρήση της ανασυσταίνεται με νερό ή ρυθμιστικό διάλυμα, σύμφωνα με τις οδηγίες του Κατασκευαστή 2. Ρυθμιστικό διάλυμα buffer (ποικίλλει ανάλογα με την κατασκευάστρια εταιρεία) 3. Πρότυπος ορός. Είναι ορός που περιέχει γνωστή ποσότητα αντιστρεπτολυσίνης 4. Ερυθρά αιμοσφαίρια. Συνήθως είναι ερυθρά προβάτου ή κουνελιού. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και ερυθρά ανθρώπου ομάδας Ο. 5. Εξεταστέος ορός. Πρέπει να είναι διαυγής. Αν είναι θολός, λιπαιμικός, ικτερικός ή αιμολυμένος είναι ακατάλληλος για την αντίδραση. Πριν από την εξέταση αδρανοποιείται στους 56 C για 30 λεπτά.

19 Εκτέλεση: 1. Κάνουμε αραιώσεις του εξεταστέου ορού με το ρυθμιστικό διάλυμα. Δε γίνονται υποδιπλάσιες αραιώσεις αλλά ενδιάμεσες αραιώσεις. Κάθε εργαστήριο μπορεί να χρησιμοποιεί τη μέθοδο των αραιώσεων που περιγράφει ο κατασκευαστής των αντιδραστηρίων. Τις ίδιες αραιώσεις κάνουμε και στον πρότυπο ορό. Συνήθως γίνονται 10 αραιώσεις (από 1:50 έως 1:2400). 2. Τοποθετούμε τις αραιώσεις με τη σειρά σε σωληνάρια 3. Προσθέτουμε διάλυμα στρεπτολυσίνης στα σωληνάρια 4. Ανακινούμε και τα αφήνουμε σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά 5. Προσθέτουμε εναιώρημα των ερυθρών στα σωληνάρια και βάζουμε το στατό στον κλίβανο των 37 C για 45 λεπτά. Ενδιάμεσα ανακινούμε μια-δυο φορές κάθε 15 λεπτά. Βγάζουμε από τον κλίβανο και εξετάζουμε τα σωληνάρια για παρουσία ή μη αιμόλυσης

20 Ανάγνωση: Εάν στον εξεταζόμενο ορό δεν υπάρχει καθόλου αντιστρεπτολυσίνη θα υπάρχει αιμόλυση σε όλα τα σωληνάρια. Αν όμως υπάρχει αντιστρεπτολυσίνη, αυτή θα αναστείλει την αιμόλυση στα πρώτα σωληνάρια όπου το ποσό του ορού είναι μεγαλύτερο. Όσο περισσότερη αντιστρεπτολυσίνη έχει ο ορός, τόσο η αναστολή της αιμόλυσης θα παρατηρηθεί σε περισσότερα σωληνάρια ίσως και σε όλα. Το τελευταίο σωληνάριο στο οποίο δεν υπάρχει αιμόλυση είναι ο τίτλος της αντιστρεπτολυσίνης. Κάποια σωληνάρια που δείχνουν οριακή αντίδραση πρέπει να φυγοκεντρηθούν για να καθιζήσουν τα μη αιμολυθέντα ερυθρά και να φανεί καλύτερα η παρουσία ή μη αιμόλυσης. Πριν γίνει η ανάγνωση του τίτλου του εξεταζόμενου ορού θα πρέπει να βεβαιωθούμε ότι ο πρότυπος ορός έδωσε τον αναμενόμενο τίτλο. Ο τίτλος της αντιστρεπτολυσίνης είναι η τελευταία αραίωση του ορού χωρίς αιμόλυση και εκφράζεται σε μονάδες Todd.

21 Εργαστηριακή ερμηνεία Η διαφάνεια εξετάζεται για συγκόλληση κάτω από έντονο φως μετά από μερικά λεπτά. Στην ποιοτική μέθοδο, ένα θετικό αποτέλεσμα εμφανίζεται με την ορατή μορφή συγκόλλησης πάνω στην διαφάνεια εξέτασης. Στην ημι-ποσοτική μέθοδο η συγκέντρωση ASO μπορεί να υπολογισθεί πολλαπλασιάζοντας τον παράγοντα αραίωσης (π.χ. 2, 4, 8, 16, 32, 64) με το όριο ανίχνευσης (π.χ. 200), για να δώσει την συγκέντρωση (IU/ml). Αν ο τίτλος συγκόλλησης εμφανιστεί στην αραίωση 1/4, η συγκέντρωση της αντι-στρεπτολυσίνης-ο στον ορό κατά προσέγγιση είναι = 800 IU/ml.

22 Φυσιολογικές τιμές Ηλικία Μονάδες Todd/ml Ενήλικες-ηλικιωμένοι 160 Νεογνά Περίπου ίδιες τιμές με της μητέρας 6 μηνών- 2 ετών ετών ετών

23 Κλινική ερμηνεία Η μέθοδος ASTO συμβάλλει κυρίως στη διάγνωση μεταστρεπτοκοκκικών λοιμώξεων όπως είναι ο ρευματικός πυρετός, η οξεία σπειραματονεφρίτιδα, βακτηριακή ενδοκαρδίτιδα και η οστρακιά. Η ανίχνευση στρεπτοκοκκικών αντισωμάτων αποτελεί δείκτη προηγηθείσας λοίμωξης και όχι οξείας στρεπτοκοκκικής λοίμωξης. Ακόμη, είναι ικανή να διαχωρίζει τον ρευματικό πυρετό από την ρευματοειδή αρθρίτιδα, όταν υπάρχουν πόνοι αρθρώσεων

24 Πιθανά σφάλματα Ο αυξημένος τίτλος αντισωμάτων μπορεί να ανευρεθεί σε υγιείς φορείς σε: Αυξημένα επίπεδα β-λιποπρωτεΐνης που αναστέλλουν την στρεπτολυσίνη Ο και δίνουν ψευδώς υψηλό τίτλο ASO. Στις στρεπτοκοκκικές λοιμώξεις του δέρματος, η παραγωγή μη φυσιολογικού τίτλου ASO είναι σπάνια ακόμα και μετά την νόσο. H φαρμακευτική αγωγή με αντιβιοτικά ή αδρενοκορτικοστεροειδή μειώνει τα επίπεδα των αντισωμάτων έναντι της στρεπτολυσίνης Ο

25 C-αντιδρώσα πρωτεΐνη πρωτεΐνη του πλάσματος που συντίθεται από τα ηπατοκύτταρα εμπλέκεται στην αντίδραση της φλεγμονής αυξάνεται ταχύτατα (μέσα σε λίγες ώρες) μέχρι και 1000Χ προσδένεται σε συγκεκριμένες μοριακές διαμορφώσεις (πχ φωσφορυλοχολίνη) ενεργοποιεί το κλασσικό μονοπάτι του συμπληρώματος, την φαγοκυττάρωση και προσδένεται σε ανοσοσφαιρινικούς υποδοχείς FcR (FcγRI και FcγRII) Black, Kushner and Samols, 2004

26 C-αντιδρώσα πρωτεΐνη Μέθοδοι ανίχνευσης Latex (ποιοτικός και ημιποσοτικός προσδιορισμός) Νεφελομετρία (ποσοτικός προσδιορισμός) Latex (ποιοτικός προσδιορισμός) Βάζουμε σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα: Α) μια σταγόνα του εξεταζόμενου ορού (χωρίς αραίωση) Β) μια σταγόνα θετικού μάρτυρα Γ) μια σταγόνα αρνητικού μάρτυρα Προσθέτουμε από μια σταγόνα του αιωρήματος Latex Ανακατεύουμε. Αξιολογούμε (μέσα στα επόμενα 3 λεπτά).

27 Προσδιορισμός CRP με τη συγκόλληση latex

28 C-αντιδρώσα πρωτεΐνη Αξιολόγηση Φυσιολογική τιμή ~ 0,5 μg/dl Μέτρια αύξηση 1-10 μg/dl Σαφής αύξηση >10 μg/dl Αξιοποίηση (Εφαρμογές) Δείκτης οξείας φλεγμονής Εξέταση των επιπέδων της CRP δίνει πληροφορίες για την πορεία: α) της ίασης, β) νεοπλασιών, γ) μεταμοσχεύσεων Προγνωστική αξία για έμφραγμα του μυοκαρδίου και εγκεφαλικό

29 Ημί-ποσοτική μέθοδος Χρησιμοποιώντας το ρυθμιστικό διάλυμα παρασκευάζονται αύξουσες διαδοχικές αραιώσεις από τον ορό του ασθενούς στον δοκιμαστικό σωλήνα (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64). Μεταφέρεται μια σταγόνα ορού (50μl) από κάθε αραίωση στον κύκλο της εξέτασης επάνω στην διαφάνεια. Μετά την ανακίνηση του αντιδραστηρίου latex, προστίθεται μια σταγόνα εναιωρήματος με την χρήση του σταγονόμετρου, στους κύκλους εξέταση κάθε αραίωσης. Ανάμειξη των σταγόνων (ορού-αντιδραστηρίου) χρησιμοποιώντας τον αναδευτήρα μιας χρήσης, έτσι ώστε να καλυφθεί ολόκληρη η επιφάνεια του κύκλου της εξέτασης Πραγματοποιείται περιστροφή της διαφάνειας εξέτασης απαλά και ομοιόμορφα για 2 λεπτά. Η διαφάνεια εξετάζεται για την δημιουργία συγκόλλησης

30 Κλινική ερμηνεία Η CRP, αν και δηλώνει την παρουσία φλεγμονής δεν είναι ικανή να προσδιορίζει το αίτιο της. Ανιχνεύεται στον ορό του αίματος ώρες μετά την έναρξη της ιστικής βλάβης, και χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση θεραπείας του ρευματικού πυρετού, της επούλωσης τραυμάτων, των εγκαυμάτων και της μεταμόσχευσης οργάνων. Ωστόσο δεν είναι ειδική για την παρακολούθηση πορείας μια φλεγμονώδους νόσου όταν συνυπάρχει με ιστική νέκρωση (π.χ. έμφραγμα μυοκαρδίου). Επίσης, χρησιμοποιείται για την ανίχνευση μετεγχειρητικών λοιμώξεων, όπου τα επίπεδα της CRP αυξάνονται 4-6 ώρες μετά το χειρουργείο και αρχίζουν να μειώνονται μετά την τρίτη μετεγχειρητική μέρα. Εάν δεν μειωθούν τα επίπεδα της CRP, τότε αυτή αποτελεί δείκτη επιπλοκών, όπως μολύνσεις ή πνευμονική εμβολή.

31 Ρευματοειδής Παράγοντας Αντίσωμα ενάντια στο Fc τμήμα της IgG Συνήθως IgM Ανιχνεύεται: Ρευματοειδή αρθρίτιδα (στο 80% των ασθενών) Άλλα αυτοάνοσα ( π.χ Sjögren, SLE) Οξείες και χρόνιες λοιμώξεις (πχ φυματίωση, σύφιλη, λέπρα) Μέθοδοι ανίχνευσης Latex Νεφελομετρία

32 Ρευματοειδής Παράγοντας (RF) Ο ρευματοειδής παράγοντας (RF) είναι αντίσωμα έναντι του Fc κλάσματος της IgG. Ανήκει κυρίως στις IgM ανοσοσφαιρίνες μπορεί όμως να είναι και IgG ή IgA, ακόμα και IgE ή IgD. Χαρακτηριστικά, ο ρευματοειδής παράγοντας αυξάνει στη ρευματοειδή αρθρίτιδα. Οι μέθοδοι προσδιορισμού του RF που έχουν χρησιμοποιηθεί από παλιά είναι οι συγκολλητινοαντιδράσεις, κυρίως η αντίδραση latex. Χρησιμοποιούνται σωματίδια latex καλυμμένα με IgG ανοσοσφαιρίνη και αναζητείται στον ορό του αίματος αντίσωμα έναντι της IgG (δηλαδή ρευματοειδής παράγοντας). Σήμερα, μέθοδος εκλογής με μεγάλη ευαισθησία και ειδικότητα που δίνει επιπλέον και ποσοτικά αποτελέσματα είναι η νεφελομετρία που έχει αντικαταστήσει τις άλλες μεθόδους, κυρίως στα νοσοκομειακά εργαστήρια. Περιγράφεται όμως και η μέθοδος latex για λόγους διδακτικούς και διότι βρίσκει ακόμη εφαρμογές στα μικρά εργαστήρια. Η συγκολλητινοαντίδραση και η νεφελομετρία ανιχνεύουν IgM ρευματοειδή παράγοντα. Oι άλλοι ρευματοειδείς παράγοντες ανιχνεύονται με ELISA ή ραδιοανοσολογικές μεθόδους και ζητούνται σε ειδικές μόνο περιπτώσεις.

33 Εκτέλεση 1. Πάνω σε γυάλινη πλάκα συγκολλητινοαντιδράσεων τοποθετούμε μια σταγόνα του εξεταστέου ορού που τον έχουμε αραιώσει 1:20 με το ρυθμιστικό διάλυμα που περιλαμβάνεται στη συσκευασία. Επίσης τοποθετούμε ξεχωριστά μια σταγόνα από το θετικό και μια από τον αρνητικό μάρτυρα. 2. Βάζουμε κοντά σε κάθε μια από τις τρεις σταγόνες από μια σταγόνα αντιγόνο latex. 3. Με ξεχωριστή οδοντογλυφίδα ή γυάλινο ραβδάκι ανακατεύουμε τον κάθε ορό με το αντιγόνο. 4. Ανακινούμε την πλάκα κυκλικά πίσω - μπρος επί 1 έως 5 λεπτά, παρατηρώντας για εμφάνιση συγκόλλησης. Πρώτα εξετάζουμε τους μάρτυρες. Ο θετικός πρέπει να παρουσιάσει γρήγορη και σαφή συγκόλληση, ενώ ο αρνητικός θα πρέπει να παραμείνει ομοιογενής. Εσφαλμένα αποτελέσματα μπορεί να βγουν αν ο εξεταζόμενος ορός είναι λιπαιμικός, αν αργήσει να διαβαστεί το αποτέλεσμα, αν το latex μπήκε στην κατάψυξη

34 ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΣΟΧΗ ΣΑΣ