Προσδιορισμός MIC, MBC. Γεωργία Βρυώνη

Transcript

1 Προσδιορισμός MIC, MBC Γεωργία Βρυώνη

2 Έλεγχος ευαισθησίας με τη μέθοδο αραιώσεων των αντιβιοτικών Αρχή: Έκθεση μικροβιακού εναιωρήματος σε διαφορετικές συγκεντρώσεις αντιβιοτικού Η μικρότερη συγκέντρωση αντιβιοτικού που δεν επιτρέπει την ανάπτυξη του μικροοργανισμού in vitro Ελάχιστη Ανασταλτική Πυκνότητα του φαρμάκου (ΕΑΠ) Minimun Inhibitory Concentration (MIC)

3 Ελάχιστη Ανασταλτική Πυκνότητα Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Όχι απόλυτη τιμή Η αληθινή τιμή μεταξύ της MIC που αναστέλλει τη μικροβιακή ανάπτυξη και της αμέσως υποδιπλάσιας αραίωσης που επιτρέπει τη μικροβιακή ανάπτυξη Αραιώσεις αντιβιοτικού υποδιπλάσιες (5-7): 1, 2, 4, 8, 16μg/mL Κρίσιμες συγκεντρώσεις αντιβιοτικού (1-3) [ Breakpoint MIC ] : Π.χ. 4, 6, 8, 12, 16 μg/ml

4 MIC 50 Ελάχιστη Ανασταλτική Πυκνότητα Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Η ελάχιστη συγκέντρωση του αντιβιοτικού που αναστέλλει την ανάπτυξη 50% των υπό έλεγχο στελεχών (εντός του ίδιου είδους) MIC 90 Η ελάχιστη συγκέντρωση του αντιβιοτικού που αναστέλλει την ανάπτυξη 90% των υπό έλεγχο στελεχών (εντός του ίδιου είδους)

5 Ελάχιστη Ανασταλτική Πυκνότητα Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Ερμηνεία: 3 κατηγορίες ευαισθησίας μικροοργανισμών Ευαίσθητοι (Susceptible) Μέτρια ευαίσθητοι (Intermediate) Ανθεκτικοί (Resistant)

6 Κριτικές συγκεντρώσεις δύο συγκεντρώσεις c c : χαμηλή C : υψηλή C S I R MIC c c < MIC C MIC > C

7 Έλεγχος ευαισθησίας με τη μέθοδο αραιώσεων των αντιβιοτικών Είδη: Μέθοδος αραιώσεων σε ζωμό (broth dilution method) Μακρο-μέθοδος (macrodilution) Μικρο-μέθοδος (microdilution) Μέθοδος αραιώσεων σε άγαρ (agar dilution method) Μέθοδοι αναφοράς (Standard Reference Methods) Μέθοδοι προτυποποιημένες

8 Αντιβιοτικά Πρότυπες ουσίες περιεκτικότητα σε δραστική ουσία ή ενεργότητα (μg/mg ή IU/mg) ημερομηνία λήξης διατήρηση: </= -20 ο C Παρασκευή μητρικού διαλύματος (stock solution) άνοιγμα αφού πάρουν θ ο C δωματίου (υδρατμοί) καταστροφή β-λακταμικών αντιβιοτικών αύξηση βάρους υγροσκοπικών ουσιών (αμινογλυκοσίδες) προστασία από μεγάλη έκθεση στο φως ριφαμπικίνη, πολυμιξίνη Β σκοτάδι συγκέντρωση (1000 μg/ml ή 10 χ μεγαλύτερης συγκέντρωσης) γνωστό το ακριβές βάρος της ουσίας επιλογή / υπολογισμός διαλύτη (Table 4, M7-MIC)

9 Αντιβιοτικά Πρότυπες ουσίες περιεκτικότητα σε δραστική ουσία ή ενεργότητα (μg/mg ή IU/mg) ημερομηνία λήξης διατήρηση: </= -20 ο C Παρασκευή μητρικού διαλύματος (stock solution) ποσότητα που ζυγίστηκε (mg) X ενεργότητα (μg/mg) Όγκος (ml)= καταστροφή β-λακταμικών επιθυμητή συγκέντρωση αντιβιοτικών (μg/ml) αύξηση βάρους υγροσκοπικών ουσιών (αμινογλυκοσίδες) άνοιγμα αφού πάρουν θ ο C δωματίου (υδρατμοί) όγκος (ml) X συγκέντρωση (μg/ml) Βάρος ριφαμπικίνη, (mg)= πολυμιξίνη Β σκοτάδι ενεργότητα (μg/mg) προστασία από μεγάλη έκθεση στο φως συγκέντρωση (1000 μg/ml ή 10 χ μεγαλύτερης συγκέντρωσης) γνωστό το ακριβές βάρος της ουσίας επιλογή / υπολογισμός διαλύτη (Table 4, M7-MIC)

10 Αντιβιοτικά Διατήρηση μητρικού διαλύματος (stock solution) όχι απαραίτητη η αποστείρωση αν ναι: διήθηση με ειδικά φίλτρα διαμοίραση σε μικρές ποσότητες σωλην. πολυ-προπυλενίου, -αιθυλενίου, -στυρενίου Θερμοκρασία </= -60 o C για ~ 6 μήνες ποτέ > -20 ο C Ιμιπενέμη, κεφακλόρη, κλαβουλανικό οξύ, ριφαμπικίνη: </= -70 o C για 1 μήνα Αμπικιλλίνη, τριμεθοπρίμη και άλλα σε διαλύματα φωσφορικών: ίζημα (καλή ανάδευση) Αποφυγή απόψυξης / ψύξης

11 Επιλογή αντιβιοτικών Είδος αντιβιοτικού ανάλογα Εστίας μικροβιακού λοίμωξης, είδους αντοχής, αλλεργίας, κλπ Ομάδα Μη απαιτητικά Α: υποχρεωτικά (primary testing) Ομάδα Απαιτητικά Β: Εντεροβακτηριακά Pseudomonas αντοχή aeruginosa στην ομάδας και άλλα Α Haemophilus spp. μη-εντεροβακτηριακά Staphylococcus Neisseria περιοχή gonorrhoeae spp. λοίμωξης: SXT και ουρολοίμωξη, 3 η Enterococcus Streptococcus γενιάς spp. κεφαλοσπορίνες pneumoniae και CSF Acinetobacter Streptococcus spp. πολυμικροβιακή spp. εκτός λοίμωξη,πολλές από S. pneumoniae εστίες Burkolderia cepacia, Stenotrophomonas λοίμωξης, αλλεργία, maltophilia μη απάντηση σε Ομ. Α επιδημιολογικοί λόγοι Ομάδα C: εναλλακτική ή επιπλέον αγωγή Ομάδα U: θεραπεία ουρολοίμωξης Ομάδα Inv. Investigational Table 1, M100-S18, Vol.28 No.1

12 Επιλογή συγκεντρώσεων αντιβιοτικών Κριτικές συγκεντρώσεις (Breakpoints) Tables 2A έως 2L (M100-S18, Vol.28, CLSI) Συνολικός αριθμός απόφαση του εργαστηρίου τέτοιος ώστε ένας τουλάχιστον μικροοργανισμός ποιοτικού ελέγχου να έχει όλες τις διαδοχικές τιμές συγκεντρώσεων ασυνήθεις συγκεντρώσεις σε επιλεγμένες περιπτώσεις, όπως υψηλές για Έλεγχος υψηλού επιπέδου αντοχής σε γενταμυκίνη / στρεπτομυκίνη στους εντεροκόκκους (High-Level Aminoglycoside Resistance, HLAR)

13 Μικροβιακό εναιώρημα Θολερότητα: 0.5 κλίμακας McFarland 1-2 x 10 8 CFU/mL για E. coli ATCC Μέθοδος άμεσο εναιώρημα αποικίας (direct colony suspension m.) εναιώρημα λογαριθμικής φάσης ανάπτυξης (growth method)

14 Μικροβιακό εναιώρημα Θολερότητα: 0.5 κλίμακας McFarland 1-2 x 10 8 CFU/mL για E. coli ATCC Μέθοδος άμεσο εναιώρημα αποικίας (direct colony suspension m.) Η πιο εναιώρημα κατάλληλη λογαριθμικής φάσης ανάπτυξης (growth Η μόνη method) για: Staphylococcus spp., Haemophilus spp., N. gonorrhoeae, N. meningitidis και στρεπτοκόκκους Τρόπος: εναιώρημα σε ζωμό ή φ.ο. τρυβλίο μη εκλεκτικού υλικού (αιματούχο άγαρ) μετά18-24 h επώασης

15 Μικροβιακό εναιώρημα Θολερότητα: 0.5 κλίμακας McFarland 1-2 x 10 8 CFU/mL για E. coli ATCC Μέθοδος άμεσο εναιώρημα αποικίας (direct colony suspension m.) Η πιο εναιώρημα κατάλληλη λογαριθμικής φάσης ανάπτυξης (growth Η μόνη method) για: Staphylococcus spp., Haemophilus spp., N. gonorrhoeae, N. meningitidis και στρεπτοκόκκους Εναλλακτικά, ιδίως αν δεν είναι δυνατή η δημιουργία ομοιόμορφου εναιωρήματος Τρόπος: εναιώρημα σε ζωμό ή φ.ο. Σε μη απαιτητικά μικρόβια (εκτός Staphylococcus) όταν δεν τρυβλίο μη εκλεκτικού υλικού (αιματούχο άγαρ) υπάρχει πρόσφατο καλλιέργημα μετά18-24 h επώασης Τρόπος: 3-5 αποικίες σε 4-5mL ζωμού (tryptic soy broth) επώαση 35 ο C έως θολερότητα =/>0.5 McFarland (2-6h) θολερότητα 0.5 με ζωμό ή φ.ο.

16 Παρασκευή μικροβιακού εναιωρήματος (inoculum) Θολερότητα 0.5 κλίμακας McFarland ( 1-2 Χ 10 8 CFU/ml E.coli ATCC ) ή με φωτόμετρο 0.5McF E.coli ATCC 25922

17 Μέθοδος αραιώσεων σε ζωμό Μακρομέθοδος: σωληνάρια Μικρομέθοδος: πλάκα μικροτιτλοποίησης

18 Μέθοδος αραιώσεων σε ζωμό Υλικό: Mueller-Hinton broth (MHΒ) ph σε θ ο C περιβάλλοντος (25 ο C) Ιόντα: αμινογλυκοσίδες & Pseudomonas, τετρακυκλίνες, δαπτομυσίνη & gram(+) Ca ++ : mg/l (50 για daptomycin) Mg ++ : mg/l HTM για Haemophilus spp. 2% NaCl για οξασιλλίνη, μεθικιλλίνη, ναφκιλλίνη (σταφυλόκοκκοι) 2.5-5% aίμα (LHB): για S. pneumoniae, N. meningitis στρεπτοκόκκους Ενοφθαλμισμός Επώαση: 35±2 ο C για h 20-24h για Acinetobacter spp., B. cepacia, S. maltophilia, Haemophilus spp S. pneumoniae, λοιποί στρεπτόκοκκοι 24h για oxacillin σε Staphylococcus, βανκομυκίνη σε Enterococcus και γενταμυκίνη / στρεπτομυκίνη HLAR σε Enterococcus 5% CO2 για N. meningitis (20-24h)

19 Μέθοδος αραιώσεων σε ζωμό Υλικό: Mueller-Hinton broth (MHΒ) ph σε θ ο C περιβάλλοντος (25 ο C) Ιόντα: αμινογλυκοσίδες & Pseudomonas, τετρακυκλίνες, δαπτομυσίνη & gram(+) Ca ++ : mg/l (50 για daptomycin) Mg ++ : mg/l HTM για Haemophilus spp. 2% NaCl για οξασιλλίνη, μεθικιλλίνη, ναφκιλλίνη (σταφυλόκοκκοι) 2.5-5% aίμα Caution-adjusted (LHB): για S. pneumoniae, ΜΗΒ (CAMHB) N. meningitis στρεπτοκόκκους Ενοφθαλμισμός Επώαση: 35±2 ο C για h Εμπλουτισμένο ΜΗΒ 20-24h για Acinetobacter spp., B. cepacia, S. maltophilia, Haemophilus spp S. pneumoniae, λοιποί στρεπτόκοκκοι 24h για oxacillin σε Staphylococcus, βανκομυκίνη σε Enterococcus και γενταμυκίνη / στρεπτομυκίνη HLAR σε Enterococcus 5% CO2 για N. meningitis (20-24h)

20 Μέθοδος αραιώσεων σε ζωμό Υλικό: Mueller-Hinton broth (MHΒ) ph σε θ ο C περιβάλλοντος (25 ο C) Ιόντα: αμινογλυκοσίδες & Pseudomonas, τετρακυκλίνες, δαπτομυσίνη & gram(+) Ca ++ : mg/l (50 για daptomycin) Διαφορές Mg ++ από : Κ-Β: mg/l HTM για Haemophilus spp. Υλικό: CAMHB (με 50 μg/ml Ca Εμπλουτισμένο ΜΗΒ ++ αν δαπτομυσίνη) Προσθήκη αίματος: αλόγου LHB (όχι προβάτου) σε 2% NaCl για οξασιλλίνη, μεθικιλλίνη, ναφκιλλίνη (σταφυλόκοκκοι) 2.5-5% aίμα Caution-adjusted (LHB): για S. pneumoniae, ΜΗΒ (CAMHB) N. meningitis στρεπτοκόκκους N. meningitis, S. pneumoniae Ενοφθαλμισμός και λοιπούς στρεπτοκόκκους Επώαση: 35±2 ο C για h Χρόνος επώασης έως 20h (όχι 18h) 20-24h για Acinetobacter spp., B. cepacia, S. maltophilia, Haemophilus spp S. pneumoniae, λοιποί στρεπτόκοκκοι 24h για oxacillin σε Staphylococcus, βανκομυκίνη σε Enterococcus και γενταμυκίνη ΌΧΙ 5% / CO2 στρεπτομυκίνη για Haemophilus HLAR σε Enterococcus spp., S. pneumoniae 5% CO2 για N. meningitis (20-24h) Περιβάλλον επώασης:

21 Μέθοδος αραιώσεων σε ζωμό Μέθοδος αναφοράς για CLSI 1 ml 10 8 CFU Mueller Hinton Broth 1 ml µg/ml 35 C για h MIC = µg/ml

22 Μακρομέθοδος Ανάγνωση αποτελεσμάτων Μακρομέθοδος: S. aureus και τετρακυκλίνη Ανάπτυξη φαίνεται στη συγκέντρωση τετρακυκλίνης 0.8 μg/ml αλλά όχι στην 1.6 μg/ml.

23 Μακρομέθοδος Ανάγνωση αποτελεσμάτων Μακρομέθοδος: S. aureus και τετρακυκλίνη Ανάπτυξη φαίνεται στη συγκέντρωση τετρακυκλίνης 0.8 μg/ml αλλά MIC όχι είναι στην μg/ml. μg/ml.

24 Μικρομέθοδος Ανάγνωση αποτελεσμάτων Ceftizoxime (C.III)

25 Μικρομέθοδος Ανάγνωση αποτελεσμάτων Ceftizoxime (C.III)

26 Μικρομέθοδος Ανάγνωση αποτελεσμάτων

27 Ελάχιστη Βακτηριοκτόνος Πυκνότητα Minimal Bactericidal Concentration MBC η ελάχιστη συγκέντρωση του αντιβιοτικού που επιτρέπει την επιβίωση 1/ βακτήρια ή 0.01% του αρχικού εναιωρήματος για πολλές σύγχρονες ουσίες είναι πλησίον της MIC κύρια επιδίωξη για τη θεραπευτική επιτυχία σε βαριές λοιμώξεις: ενδοκαρδίτιδα οστεομυελίτιδα λοιμώξεις σε ανοσοκατεσταλμένους (ουδετεροπενικοί)

28 Ελάχιστη Βακτηριοκτόνος Πυκνότητα Minimal Bactericidal Concentration MBC Μέθοδος Προσδιορισμός MIC (μακρο-/μικρο-μέθοδος) Αραιώσεις αντιβιοτικού από 8χ έως ½ ή ¼ x MIC μg/ml Ανακαλλιέργεια σε στερεό θρεπτικό υλικό από τα σωληνάρια ή πηγαδάκια χωρίς ορατή μικροβιακή ανάπτυξη Προσδιορισμός MBC ως την ελάχιστη πυκνότητα Μέθοδος όχι προτυποποιημένη του αντιβιοτικού που προκαλεί θάνατο στα 99,9% Κατάλληλη για την αξιολόγηση νέων αντιβιοτικών των μικροβιακών κυττάρων και για ερευνητικούς σκοπούς

29 Μέθοδος προσδιορισμού MBC MIC = µg/ml 35 2 C για 24h Gram(-) βακτηρίδια 48h Staphylococcus Enterococcus 72h άλλα βακτήρια 10 µl 0 µg/ml 4 µg/ml 8 µg/ml 16 µg/ml MBC =?

30 Μέθοδος προσδιορισμού MBC Καθορισμός του κρίσιμου αριθμού αποικιών για προσδιορισμό MBC Τελικό εναιώρημα (CFU/mL) Κρίσιμος αριθμός αποικιών Ευαισθησία (%) Ειδικότητα (%) 1 x x x x x x

31 Μέθοδος προσδιορισμού MBC Καθορισμός του κρίσιμου αριθμού αποικιών για προσδιορισμό MBC Τελικό Κρίσιμος Ευαισθησία (%) Ειδικότητα (%) εναιώρημα Σωληνάριο Συγκέντρωση αριθμός Αριθμός 99.9% (CFU/mL) αντιβιοτικού αποικιών αποικιών Θάνατος 1 x 10 5 μg/ml 4 77 CFU x ΝΑΙ x ΝΑΙ x ΝΑΙ x ΌΧΙ x Μη μετρούμενες 99 ΌΧΙ 99 MBC = 32 μg/ml

32 Μέθοδος προσδιορισμού MBC Καθορισμός του κρίσιμου αριθμού αποικιών για προσδιορισμό MBC Υπολογισμός εναιωρήματος (CFU/mL) Τελικό Κρίσιμος Ευαισθησία (%) Ειδικότητα (%) εναιώρημα Σωληνάριο Συγκέντρωση αριθμός Αριθμός 99.9% (CFU/mL) αντιβιοτικού αποικιών αποικιών Θάνατος 1 x 10 5 μg/ml 4 77 CFU x ΝΑΙ x ΝΑΙ x ΝΑΙ x ΌΧΙ x Μη μετρούμενες 99 ΌΧΙ 99 MBC = 32 μg/ml του σωληναρίου χωρίς αντιβιοτικό 1.Αραίωση εναιωρήματος 2.Ενοφθαλμισμός συγκεκριμένης ποσότητας σε τρυβλίο 3.Υπολογισμός (CFU/mL): αριθμός αποικιών x ποσότητα ενοφθαλμισμού x αραίωση

33 (+) μάρτυρας ανάπτυξης Συγκέντρωση αντιβιοτικού σε μg/ml Αν MΒC/MΙC < 4 τότε το αντιβιοτικό είναι βακτηριοκτόνο MIC = 0.125μg/mL Επώαση για 16-20h Τελευταίο σωληνάριο με ορατή ανάπτυξη Ανακαλλιέργεια σε τρυβλία Επιβίωση 0.01% MIC=0.125μg/mL MBC=0.25μg/mL MΒC / MΙC=2 < 4 Αντιβιοτικό = βακτηριοκτόνο CFU / ml

34 Όχι αντιβιοτικό Όχι μικρόβιο μg/ml Δράση βακτηριοκτόνος Όχι αντιβιοτικό Όχι μικρόβιο μg/ml Δράση βακτηριοστατική

35 MIC - MBC MIC MBC Βακτηριοκτόνο Bactericidal (MBC/MIC < 4) MIC MBC Βακτηριοστατικό- Bacteriostatic (MBC/MIC > 4)

36 Gentamicin Η γενταμυκίνη είναι βακτηριοκτόνο αντιβιοτικό γιατί: MIC = 0.8 μg/ml (ανάπτυξη 0.4, όχι 0.8) και MBC = 0.8. Άρα MBC = MIC. Tetracycline Η τετρακυκλίνη είναι βακτηριοστατικό αντιβιοτικό γιατί: MIC = 1.6 μg/ml, και ανάπτυξη σε 3.1, 6.3, και ίχνη σε 12.5 μg/ml, Άρα MBC 4 αραιώσεις υψηλότερη στα 25 μg/ml.

37 Μέθοδος αραιώσεων σε άγαρ Tρυβλία με αντιβιοτικό (το κάθε ένα με διαφορετική συγκέντρωση) Πολλές κηλίδες από διαφορετικά στελέχη που ελέγχονται ταυτόχρονα (30-35 / τρυβλίο 100 mm) Καταγραφή της MIC

38 Μέθοδος αραιώσεων σε άγαρ Υλικό: Mueller-Hinton Agar (MHA) ph σε θ ο C περιβάλλοντος αφού πήξει Όχι ιόντα Mg ή Ca NaCl 2% w/v για οξασιλλίνη, μεθικιλλίνη, ναφκιλλίνη (σταφυλόκοκκοι) 5% αίμα προβάτου για N. meningitis και στρεπτοκόκκους πλην S. pneumoniae, ή αλόγου (LHB) για σουλφοναμίδες σε στρεπτοκόκκους και για λιστέρια Ενοφθαλμισμός Συγκεκριμένη ποσότητα Τοποθέτηση ως κηλίδα 5-8 mm στο ΜΗΑ (10 4 CFU/κηλίδα) Επώαση: 35±2 ο C για h 20-24h για Acinetobacter spp., B. cepacia, S. maltophilia, 24h για oxacillin σε Staphylococcus, βανκομυκίνη σε Enterococcus και γενταμυκίνη / στρεπτομυκίνη HLAR σε Enterococcus 5% CO2 για N. meningitis, N. gonorrhoeae (36±1 o C) και στρεπτοκόκκους (20-24h)

39 Μέθοδος αραιώσεων σε άγαρ Υλικό: Mueller-Hinton Agar (MHA) ph σε θ ο C περιβάλλοντος αφού πήξει Όχι ιόντα Mg ή Ca NaCl 2% w/v για οξασιλλίνη, μεθικιλλίνη, ναφκιλλίνη (σταφυλόκοκκοι) 5% αίμα προβάτου για N. meningitis και στρεπτοκόκκους πλην S. pneumoniae, ή αλόγου (LHB) για σουλφοναμίδες σε στρεπτοκόκκους και για λιστέρια Ενοφθαλμισμός Συγκεκριμένη ποσότητα Όχι για δαπτομυσίνη [λιποπεπτίδιο για gram(+)] Τοποθέτηση ως κηλίδα 5-8 mm στο ΜΗΑ (10 4 CFU/κηλίδα) Επώαση: Όχι για 35±2 H. ο C influenzae για h και H. parainfluenzae 20-24h για Acinetobacter spp., B. cepacia, S. maltophilia, Όχι 24h για για oxacillin S. pneumoniae σε Staphylococcus, βανκομυκίνη σε Enterococcus και γενταμυκίνη / στρεπτομυκίνη HLAR σε Enterococcus 5% N. CO2 gonorrhoae: για N. meningitis, GC άγαρ, N. gonorrhoeae 5% CO2, (36±1 36±1 o C) και στρεπτοκόκκους o C (20-24h)

40 Έτοιμα συστήματα προσδιορισμού MIC Σύγκριση αποτελεσμάτων AST panels με μέθοδο αραιώσεων σε ζωμό (μέθοδος αναφοράς) Χειροκίνητα τουλάχιστον 100 κλινικά στελέχη Etest ίδιου γένους ή είδους Πολύ μεγάλα σφάλματα (very major errors) Ημιαυτοματοποιημένα ψευδώς ευαίσθητα: < 1.5% Wider I Μεγάλα σφάλματα (major errors) ATB system ψευδώς ανθεκτικά: < 3% Vitek System Αυτοματοποιημένα Συμφωνία με μέθοδο αναφοράς (± 1 αραίωση): 90% MicroScan Autoscan 4 Phoenix System MicroScan WalkAway

41 Μέθοδος κλιμακωτής (gradient) διάχυσης Ταινίες Εtest (strips): διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις αντιβιοτικού Συγκεκριμένο εναιώρημα σε ΜΗΑ Μετά επώαση, αναστολή ανάπτυξης σε σχήμα έλλειψης MIC: σημείο που η έλλειψη συναντά την ταινία

42 Μέθοδος κλιμακωτής (gradient) διάχυσης Πρώτη παρουσίαση: 1988 στο Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemo- Ταινίες Εtest (strips): διαβαθμισμένες therapy (ICAAC) συγκεντρώσεις αντιβιοτικού Food and Drug Administration (FDA) έγκριση Συγκεκριμένο εναιώρημα σε ΜΗΑ * προσοχή: ανά μικρόβιο ή οικογένεια μικροβίων και αντιβιοτικό Μετά επώαση, αναστολή ανάπτυξης σε σχήμα έλλειψης MIC: σημείο που η έλλειψη συναντά την ταινία

43 Εtest Μέθοδος (σύμφωνα με οδηγίες κατασκευαστού) Υλικό: ΜΗΑ Εναιώρημα - ενοφθαλμισμός: όπως Κ-Β Τοποθέτηση ταινιών Εtest Επώαση (όπως Κ-Β) Ανάγνωση αποτελεσμάτων Οδηγίες κατασκευαστού Προσδιορισμός MIC (CLSI κριτήρια)

44 Μέθοδος Etest Μέτρηση McF κλίβανος Εναιώρημα (σε φ.ο.) Ενοφθαλμισμός 5 min στους 35 C 35 C 35 C CO 2 < 15 min

45 Μέθοδος Etest Μέτρηση McF κλίβανος Εναιώρημα (σε φ.ο.) Ενοφθαλμισμός 5 min στους 35 C 35 C 35 C CO 2 < 15 min

46 Εtest Ανάγνωση αποτελεσμάτων MIC: όπου η έλλειψη συναντά την ταινία Προσοχή στον ερπυσμό, στην αιμόλυση Αν μεταξύ αραιώσεων: MIC η μεγαλύτερη αραίωση Σύμφωνα με οδηγίες κατασκευαστή

47 Εtest Ανάγνωση αποτελεσμάτων MIC: όπου η έλλειψη συναντά την ταινία Προσοχή στον ερπυσμό, στην αιμόλυση Αν μεταξύ αραιώσεων: MIC η μεγαλύτερη αραίωση Σύμφωνα με οδηγίες κατασκευαστή

48 Εtest Ανάγνωση αποτελεσμάτων MIC: όπου η έλλειψη συναντά την ταινία Προσοχή στον ερπυσμό, στην αιμόλυση Αν μεταξύ αραιώσεων: MIC η μεγαλύτερη αραίωση Σύμφωνα με οδηγίες κατασκευαστή

49 Εtest Ανάγνωση αποτελεσμάτων Στα βακτηριοκτόνα αντιβιοτικά: πλήρης αναστολή ανάπτυξης (όχι μικροαποικίες και θόλωση (haze)) Στα βακτηριοστατικά αντιβιοτικά: 80% αναστολή ανάπτυξης Σύμφωνα με οδηγίες κατασκευαστή

50 Εtest Ανάγνωση αποτελεσμάτων Στα βακτηριοκτόνα αντιβιοτικά: πλήρης αναστολή ανάπτυξης (όχι μικροαποικίες και θόλωση (haze)) Στα βακτηριοστατικά αντιβιοτικά: 80% αναστολή ανάπτυξης Linezolid S. aureus ATCC MIC Σύμφωνα με οδηγίες κατασκευαστή

51 24 Hrs ATB STRIPS Αρχή : κάθε αντιβιοτικό (A,B, Γ, Δ ) ελέγχεται στις 2 διαφορετικές κριτικές συγκεντρώσεις (Breakpoints: c, C) 0 A c C Μάρτυρας ανάπτυξης S (Susceptible) B R (Resistant) = όχι μικροβιακή ανάπτυξη = μικροβιακή ανάπτυξη Γ I (Intermediate)

52 ATB 24hrs - Μεθοδολογία Εναιώρημα 10 µl 50 µl 200 µl ATB medium (M-H) 35 C ANA 35 C O 2 35 C CO 2 Θολερότητα McF Ενοφθαλμισμός του strip 135 µl / πηγαδάκι Επώαση Ανάγνωση strips αυτόματα ή manual

53 MICROSCAN AUTOSCAN 4 SYSTEM WALKAWAY SI 40/96 Ημιαυτόματο ή αυτόματο σύστημα για: 1. ταυτοποίηση 2. εύρεση της MIC ή BP των gram ( - ) και gram ( + ) μικροβίων Το σύστημα: εξασφαλίζει πραγματικές MIC ή ΒΡ τιμές ανεξάρτητες από την ταυτοποίηση του μικροβίου έχει δυνατότητα ταυτόχρονης ταυτοποίησης και ΜICή BP σε ένα panel ( COMBO PANEL ) ελαχιστοποιεί την ανάγκη για off line tests δίνει αποτελέσματα ταυτοποίησης και MIC ή ΒΡ σε ώρες για τα gram(-) και gram(+) έχει εύκολο και γρήγορο εμβολιασμός κάθε panel με μία μόνο κίνηση με τη βοήθεια ειδικού εξαρτήματος ( RENOK ) δίνει δυνατότητα διαβάσματος των panels με το μάτι διαθέτει ένα εξαιρετικά ανεπτυγμένο software για τη διαχείριση και την αποθήκευση των πληροφοριών (LABPRO-ALERT)

54

55 MICROSCAN: Prompt Ετοιμασία εναιωρήματος MICROSCAN: Renok Ενοφθαλμισμός πλάκας

56 Διαδικασία MICROSCAN 1 αποικία Prompt ή 0.5 McF 30 ml διαλύ ματος RENOK 35 C

57

58

59 Vitek 2 σύστημα Μέθοδος μικροαραίωσης Κάρτα 64-μικροϋποδοχών Μια υποδοχή ελέγχου Υποδοχές προμετρημένων ποσοτήτων αντιμικροβιακών παραγόντων σε συνδυασμό με υλικό καλλιέργειας Πλήρωση, σφράγισμα της κάρτας και τοποθέτησή της στην μονάδα επώασης/ανάγνωσης του οργάνου Παρακολούθηση ανάπτυξης σε κάθε υποδοχή της κάρτας ανά 15min (φθορισμός, θολερότητα, χρώμα) Προσδιορισμός MIC σε 4-18 ώρες Επαγωγή αποτελεσμάτων για 4-10 επιπλέον αντιβ. Αποτελέσματα για αντιβιοτικά/κάρτα Advanced EXPERT System (AES)

60 60 & XL Εναιώρημα σε: 3mL % NaCl McF

61 Advanced EXPERT System (AES) E.coli Ampicillin Cephalotin Cefotaxime Wild Penicillinase ESBL

62 Advanced EXPERT System (AES) E.coli Ampicillin Cephalotin Cefotaxime 200 μηχανισμοί αντοχής Περισσότεροι Wild από φαινότυποι ~ κατανομές MIC Penicillinase 100,000 βιβλιογραφικές αναφορές ESBL

63 Advanced EXPERT System (AES) Τυπικό στέλεχος Οριακή MIC (εντός) Οριακή MIC (εκτός) MIC Αναμενόμενη MIC στην Ampicillin για E.coli / Άγριο τύπο

64 Advanced EXPERT System (AES) Τυπικό στέλεχος Οριακή MIC (εντός) Οριακή MIC (εκτός) MIC Αναμενόμενη MIC στην Ampicillin για E.coli / Άγριο τύπο

65 Αποτελέσματα ευαισθησίας και φαινότυπος αξιολογούνται και επιβεβαιώνονται E.coli Ampicillin Cephalotin Cefotaxime Wild Penicillinase ESBL Αποτέλεσμα ευαισθησίας Observed result MIC

66 Ταυτοποίηση Phoenix σύστημα Μικρομέθοδος Panels ταυτοποίησης και αντιβιογράμματος Αντιβιόγραμμα 84 πηγαδάκια + 1 μάρτυρας ανάπτυξης τουλάχιστον 3 αραιώσεις / αντιβιοτικό Προσδιορισμός MIC όχι υπολογιζόμενη MIC Διπλός τρόπος ανάγνωσης Θολερότητα σαν δείκτης ανάπτυξης Χρώμα ως αντίδραση μικροβιακού μεταβολισμού Μέτρηση ανάπτυξης κινητικής μορφής / 20 min

67

68 BDXpert TM -System MIC ID Ερμηνεία (CLSI Standard) SIR Κανόνες expert ID Τελική ερμηνεία και διόρθωση αποτελεσμάτων

69 Αραιώσεις αντιβιοτικών Gram (-) panels VITEK 2 vs Phoenix

70 Αραιώσεις αντιβιοτικών Gram (+) panels VITEK 2 vs Phoenix

71 Επιλογή αντιβιοτικών Προτεινόμενα από την επιτροπή CLSI Ανάλογα με το είδος του μικροβίου Ανάλογα με τη θέση της λοίμωξης

72 Επιλογή αντιβιοτικών Εστίας λοίμωξης, αντοχής, αλλεργίας, κλπ Ομάδα Α: υποχρεωτικά (primary testing) Ομάδα Β: αντοχή στην ομάδας Α περιοχή λοίμωξης: SXT και ουρολοίμωξη, 3 η γενιάς κεφαλοσπορίνες και CSF πολυμικροβιακή λοίμωξη,πολλές εστίες λοίμωξης, αλλεργία, μη απάντηση σε Ομ. Α επιδημιολογικοί λόγοι Ομάδα C: εναλλακτική ή επιπλέον αγωγή Ομάδα U: θεραπεία ουρολοίμωξης Ομάδα Inv. Investigational

73 Αντιβιοτικά στον έλεγχο ευαισθησίας Gram αρνητικών (Α) Έλεγχος και αναφορά Αμπικιλλίνη Κεφαζολίνη Κεφουροξίμη Γενταμικίνη (Ο) Επιπλέον για τα ούρα Ναλιδιξικό οξύ Νορφλοξασίνη ή οφλοξασίνη Νιτροφουράνια Κο-τριμοξαζόλη (Β) Έλεγχος και επιλεκτική αναφορά Πιπερακιλλίνη (Εμπορικά δεν υπάρχει) Τικαρκιλλίνη (Εμπορικά δεν υπάρχει) Αμοξυκιλλίνη+κλαβ. ή αμπικιλλίνη+σουλμπ. Πιπερακιλλίνη+ταζομπακτάμη Τικαρκιλλίνη+κλαβουλανικό Κεφοξιτίνη Κεφοταξίμη ή κεφτριαξόνη Κεφταζιδίμη Κεφεπίμη Αζτρεονάμη Ιμιπενέμη ή μεροπενέμη Ερταπενέμη Σιπροφλοξασίνη ή λεβοφλοξασίνη Κο-τριμοξαζόλη Αμικασίνη Νετιλμικίνη Τομπραμυκίνη Τετρακυκλίνη Χλωραμφαινικόλη

74 Αντιβιοτικά στον έλεγχο ευαισθησίας σταφυλοκόκκων (Α) Έλεγχος και αναφορά Κεφοξιτίνη (30μg) ή Oxacillin (1 μg) Πενικιλλίνη (10 u) Ερυθρομυκίνη (15μg) Κλινδαμυκίνη (2μg) Φουσιδικό οξύ (10μg) Σουλφαμεθοξαζόλη- Τριμεθοπρίμη (1,25/23,75μg) (Ο) Επιπλέον για τα ούρα Νορφλοξασίνη (10μg) Νιτροφουραντοΐνη (300μg) (Β) Έλεγχος και επιλεκτική αναφορά Γενταμικίνη (10μg) Καναμυκίνη (30μg) Νετιλμικίνη (30μg) [Τομπραμυκίνη] (10μg) Βανκομυκίνη (30μg) Τεϊκοπλανίνη (30μg) Σιπροφλοξασίνη (5μg) Ριφαμπικίνη (5μg) Τετρακυκλίνη (30μg) Λινεζολίδη (30μg) Κινοπριστίνη/Δαλφοπριστίνη (15μg)