GammaCoat TM Androstenedione I RIA Kit For the quantitative determination of androstenedione levels in serum

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1 Word Processed By: Originator Approval: Date: GammaCoat TM Androstenedione I RIA Kit For the quantitative determination of androstenedione levels in serum Instruction Manual Manuel d Instructions Testanleitung Manual de Instrucciones Manuale di Istruzioni Manual de instruções Εγχειρίδιο οδηγιών Catalog No./ REF./KAT.-NR./N de Catálogo/Numero di Catalogo/Nº de Catálogo/ Αριθµός καταλόγου: CA-1725 Stillwater, Minnesota , U.S.A.

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3 GAMMACOAT ANDROSTENEDIONE RADIOIMMUNOASSAY 1. INTENDED USE FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE. The GammaCoat [ 125 I] Androstenedione Radioimmunoassay Kit is to be used for the determination of androstenedione levels in serum. 2. SUMMARY AND EXPLANATION The human adrenal cortex and gonads produce 5 main classes of steroid hormones: glucocorticoids, mineralocorticoids, androgens, estrogens, and progestins. Only a few of the approximately 50 steroids isolated in the adrenal cortex possess physiologic activity. 1 Most important of these are the glucocorticoids - cortisone and cortisol; the mineralo-corticoid- aldosterone; and the androgens-androstenedione (ASD) and dehydroepi-androsterone (DHEA). Among the gonadal hormones, the principal male hormones, synthesized in the Leydig cells of the testes, are the androgens testosterone and to a lesser extent DHEA and ASD. 1 The principal female hormones synthesized in the corpus luteum are progesterone and the estrogens. 1 ASD lies at the convergence of the 2 biosynthetic pathways leading from the progestins to the production of the androgens and estrogens. Disturbances in these pathways or related pathways affect ASD levels. 2 Thus, ASD is a pivotal analyte in the assessment of disease in each of these tissues. In general, the androgens promote anabolism. 1,3 At target tissues they increase the rate of ribonucleic acid (RNA) and protein synthesis and also increase the number of mitochondria; thus the rate of respiration. 1 Its adrenal secretion is relatively constant and under the control of andrenocorticosteroid hormone (ACTH), whereas the testicular and ovarian secretions vary and are under the control of luteinizing hormone (LH). 4 Accurate diagnosis of the diseases mentioned below, therefore, require blood sampling at different times of day and at various stages of the menstrual cycle. 4-6 Peak ASD levels occur at mid-cycle. 5,7,8 Androstenedione levels are high during the first few days of life. 2 They begin to rise again at about age 7-8 years in both boys and girls and remain high through puberty. 1,9 ASD is loosely bound to albumin, and therefore, has a high renal clearance rate. 10 The principal pathway of degradation of testosterone and ASD involves oxidation in the liver, saturation of the A-ring double bond and reduction of its keto group to form the primary 17-ketosteroid extraction products: androsterone and etiocholanolone. 1 Endocrine disorders usually manifest themselves as disturbances of homeostasis. 1 They may result from aberrant production of regulators or altered sensitivity of the target tissue to those regulators. 5,11 Enzyme defects may occur at any stage of biosynthetic path-ways, resulting in partial to complete blockage of that pathway. Increased levels of precursors have the effect of shifting synthesis to other pathways. 1,4,12 A common cause of adrenal androgen excess is congenital adrenal hyperplasia. 2,4 It is the result, in 95% of cases, of a deficiency of the enzyme 21-hydroxylase. 2 This enzyme is found in the zona fasciculata or zona glomerulosa of the adrenal glands. 4 The result of a deficiency of this enzyme is an under production of corticosteroids, an excess of the precursors 17-hydroxyprogesterone and progesterone, and a shift to the androgen path-way with a rise in ASD levels. 1,12 The estimated prevalence of this condition is 1:15000 homozygous and 1:75 heterozygous. If one sibling is affected, there is a 25% risk for the next child. 4 Severe disorders result in a masculinized newborn infant with a salt-losing problem that can be life-threatening. 1,2 Mild defects are difficult to diagnose in males. Female infants may have moderate clitoral enlargement or varying degrees of labial fusion. 2 Excess androgens result in excess hair growth (hirsutism), acne, virilization, increased muscle mass, oligomenorrhea, and short stature due to accelerated growth followed by early closure of the epiphyses. 4 Determination of ASD levels should be part of a diagnostic battery to identify congenital adrenal hyperplasia and to monitor children where treatment may have side effects on growth and sexual development. 2 1

4 Polycystic ovarian disease (PCO) is a common cause of ovarian androgen hypersecretion. In cystic ovaries increased levels of LH can stimulate the interstitial cells to produce the androgens: ASD, DHEA, and testosterone. 4 In polycystic ovarian disease overactivity of the ovarian stroma can result in a threefold to fourfold excess of ASD secretion. Polycystic ovarian disease is a common disorder and is widely recognized as one of the major factors in a large proportion of cases of infertility associated with anovulation. 4,13 It features theca cell hyperplasia, hyperthecosis, and LH dependent ovarian hypersecretion of androgens. 4 In addition, the incidence of carcinoma of the endometrium is higher in women with PCO. The more rare disease, Stein-Leventhal syndrome, is also associated with secondary amenorrhea, bilateral enlargement of the ovaries, infertility, obesity, and hirsutism. 13 The differential diagnosis of PCO and hyper-thecosis is accomplished by measuring the change in ASD levels using the human chorionic gonadotropin (hcg) stimulation test in which levels increase for the former and remain unchanged for the latter. 14 In addition to the disease conditions discussed above, some adrenal and gonadal tumors can produce excess androgens and/or estrogens. 12 The result, in prepubertal boys, can be virilization, sexual precocity, or feminization. The differential diagnosis of the above diseases must exclude exogenous hormones as well as testicular, ovarian, and adrenal tumors. 3. PRINCIPLE OF THE ASSAY The GammaCoat Androstenedione Kit procedure for androstenedione determinations follows the basic principle of radioimmunoassay whereby there is competition between a radioactive and a nonradioactive antigen for a fixed number of antibody binding sites. 15 The amount of [ 125 I]-labeled androstenedione bound to the antibody on the coated tube is inversely proportional to the concentration of androstenedione present in the serum. The separation of free and bound antigen is achieved by decanting or aspirating the antibody coated tubes. 4. REAGENTS PROVIDED IN THE KIT Androstenedione Coated Tubes Androstenedione Calibrator 0 Androstenedione Calibrators Androstenedione Controls Androstenedione Tracer 2 bags / 50 ea 1 vial / 1 ml 5 vials / 0.5 ml 2 vials / 0.5 ml 1 vial / 50 ml Number of tests 100 The reagents are stable through the expiration date printed on their labels when stored at 2-8 C. Three week stability has been proven for the Androstenedione Serum Blank, Calibrators and Controls when stored at 2-8 C. If these components are stored for longer periods they should be stored at -20 C. Do not use the reagents beyond the kit expiration date. Reagents from different batches must not be mixed. 4.1 [ 125 I] Androstenedione Tracer: ready to use reagent Each vial contains approximately 5 µci of tracer ( 4 µg androstenedione per ml) in 50 ml citrate buffer with bovine serum albumin and 0.05% thimerosal as a preservative. 4.2 Rabbit Anti-Androstenedione Coated Tubes: ready to use reagent 12 x 75 mm tubes are coated with rabbit anti-androstenedione serum ( 0.1 µg/tube). The plastic bag should be closed securely when storing unused tubes 4.3 Androstenedione Serum Blank: lyophilized reagent Each vial contains 1 ml of androstenedione free human serum with <0.09% sodium azide as a preservative. Reconstitute with 1 ml purified water. 2

5 4.4 Androstenedione Serum Calibrators: lyophilized reagent Each vial contains androstenedione in 0.5 ml of androstenedione free human serum with <0.09% sodium azide as a preservative. Calibrators are provided at the approximate androstenedione concentrations: 0.1, 0.3, 1, 3 and 10 ng/ml, respectively. Refer to vial for exact concentrations. Reconstitute with 0.5 ml purified water. Mix thoroughly by gentle inversion before use. The Androstenedione Assay is calibrated against a pure androstenedione preparation which is obtained through Steraloids, Inc. (Wilton, NH). The kit calibrators demonstrate commutability with patient samples when used with reagents and operating procedure of this in vitro diagnostic test as recommended. 4.5 Androstenedione Serum Controls: lyophilized reagent Level 1 contains low concentrations (0.9 ± 0.3 ng/ml) of androstenedione and Level 2 contains high concentrations (6 ± 2 ng/ml) of androstenedione in 0.5 ml of androstenedione free human serum with <0.09% sodium azide as a preservative. Reconstitute with 0.5 ml purified water. 5. WARNINGS AND PRECAUTIONS FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE. Not for internal or external use in humans or animals. REAGENTS CONTAINING HUMAN SOURCE MATERIAL Treat as potentially infectious. Each serum/plasma donor unit used in the preparation of this product has been tested by a U.S. FDA approved method and found non-reactive for the presence of HBsAg, antibody to HCV, and antibody to HIV 1/2. While these methods are highly accurate, they do not guarantee that all infected units will be detected. This product may also contain other human source material for which there is no approved test. Because no known test method can offer complete assurance that hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), Human Immunodeficiency Virus (HIV), or other infectious agents are absent, all products containing human source material should be handled in accordance with good laboratory practices using appropriate precautions as described in the U.S. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health Manual, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4 th ed., May 1999 or current edition. REAGENTS CONTAINING SODIUM AZIDE CAUTION: Some reagents in this kit contain sodium azide. Sodium azide may react with lead or copper plumbing to form highly explosive metal azides. On disposal, flush with a large volume of water to prevent azide build-up. For further information, refer to Decontamination of Laboratory Sink Drains to Remove Azide Salts, in the Manual Guide-Safety Management No. CDC-22 issued by the Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, European Communities Hazardous Substance Risk Phrases (Council Directive 1999/45/EC) R20/21/22 - Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. R32 - Contact with acids liberates very toxic gas. S28 - After contact with skin, wash immediately with plenty of water. REAGENTS CONTAINING THIMEROSAL Some reagents in this kit contain thimerosal which contains a mercury compound. Disposal of elemental mercury, inorganic mercury, mercury oxides, and mercury compounds should be done in strict compliance with all local, state, and federal regulations. WARNING: This product contains a chemical known to the State of California to cause birth defects or other reproductive harm. 3

6 REAGENTS CONTAINING IODINE-125 This kit contains radioactive material which does not exceed 5 µci (185 kbq) of iodine Appropriate precautions and good laboratory practices should be used in the storage, handling, and disposal of this material. For practitioners or institutions receiving radioisotopes under a general license: This radioactive material may be received, acquired, possessed, and used only by physicians, veterinarians in the practice of veterinary medicine, clinical laboratories or hospitals, and only for in vitro clinical or laboratory tests not involving internal or external administration of the material, or the radiation therefrom, to human beings or animals. Its receipt, acquisition, possession, use, and transfer are subject to the regulations and the general license of the U.S. Nuclear Regulatory Commission or of the state with which the Commission has entered into an agreement for the exercise of regulatory authority. 1. Storage of radioactive material should be limited to a specifically designated area. 2. Access to radioactive materials must be limited to authorized personnel only. 3. Do not pipette radioactive material by mouth. 4. Do not eat or drink within designated radioactive work areas. 5. Areas where spills may occur should be wiped up, then washed with an alkali detergent or radiological decontamination solution. Any glassware used must be rinsed completely with water before washing with other laboratory glassware. For practitioners or institutions receiving radioisotopes under a specific license: The receipt, use, transfer, and disposal of radioactive materials are subject to the regulations and conditions of your specific license. WARNING: This product contains a chemical known to the State of California to cause cancer. ATTENTION: Radioactivity printed in the package insert may be slightly different from the radioactivity printed on the box label and on the tracer vial label. The box label and the tracer vial label indicate the actual amount of radioactivity at the calibration date where the package insert indicates the theoretical radioactivity of the kit. 6. INDICATIONS OF POSSIBLE DETERIORATION OF KIT REAGENTS 6.1 The presence of abnormal particulate matter in any of the reagents. 6.2 A shift in the slope or position of the calibrator curve from what is normally obtained. 6.3 A decrease in maximum binding. 6.4 A high nonspecific binding. 7. COLLECTION AND PREPARATION OF SPECIMEN Serum should be used and the usual precautions for venipuncture should be observed. Do not use grossly hemolyzed or grossly lipemic specimens. Serum samples may be stored at 2-8 C for 24 hours. If the length of time between sample collection and analysis is greater than 24 hours, store aliquots of the sample frozen. Avoid storing samples in self-defrosting freezers as repeated freeze-thaw cycles may denature protein. Prior to assay, bring frozen sera to room temperature slowly and gently mix by hand. Do not thaw sample in a 37 C water bath. 8. EQUIPMENT AND MATERIALS REQUIRED, BUT NOT SUPPLIED The following items, which are not provided with the kit, are required to perform the assay: 8.1 Test tube rack. 8.2 Precision pipet (50 µl). 8.3 Semi-automatic or precision pipet (500 µl). 8.4 Water aspirator (optional). 4

7 8.5 Controlled-temperature waterbath, 37 C ±2 C. 8.6 Gamma Counter. 8.7 Plastic-backed absorbent paper (optional). 8.8 Purified water 9. ASSAY PROCEDURE The assay procedure involves the preparation of a calibrator curve in order to interpolate the unknown androstenedione content of the sample. 9.1 Allow all reagents to reach ambient temperature and mix thoroughly by gentle inversion without foaming before use. 9.2 Label the GammaCoat Rabbit Anti-Androstenedione Coated Tubes in duplicate according to the following scheme. Total Count [T1,T2] tubes and B 0 tubes [1,2] may be required for certain data reduction programs, but may be omitted if the calibrator curve is plotted on semi-logarithmic graph paper. 16 Reseal the bags of unused tubes carefully and return them to the refrigerator immediately. Tube Code No. Contents of Tubes Letter T1,T2 Total Counts (Tracer) 1,2 Androstenedione Serum Cal., B 0 0 ng/ml A 3,4 Androstenedione Serum Cal. 0.1 ng/ml B 5,6 Androstenedione Serum Cal. 0.3 ng/ml C 7,8 Androstenedione Serum Cal. 1 ng/ml D 9,10 Androstenedione Serum Cal. 3 ng/ml E 11,12 Androstenedione Serum Cal. 10 ng/ml F 13,14 Androstenedione Serum Control, Level I 15,16 Androstenedione Serum Control, Level II 17,18 Patient X Serum Sample 19,20 Patient Y Serum Sample 9.3 Add to the bottom of the appropriate duplicate tubes: a. 50 µl of reconstituted Androstenedione Serum Blank, Androstenedione Serum Calibrator or Androstenedione Serum Control. b. 50 µl of each patient serum sample. 9.4 Add 500 µl of [ 125 I] Androstenedione Tracer to each tube. Mix by shaking the test tube rack vigorously by hand. 9.5 Incubate all tubes in a waterbath at 37 C ±2 C for minutes. 9.6 Aspirate or decant all tubes except Total Counts. FAILURE TO REMOVE ADHERING SOLUTION ADEQUATELY MAY RESULT IN POOR REPLICATION AND SPURIOUS VALUES. If the aspirating technique is used, be sure that the plastic tip of the aspirating tube touches the bottom of the coated tube and that all the liquid is removed. If the decanting technique is used, allow the tubes to drain in an inverted position for 3-5 minutes. Tap the tubes on absorbent paper to remove any adhering liquid before placing the tubes upright. 9.7 Count all tubes in gamma counter for 1 minute with the window suitably adjusted for iodine Calculate results. Refer to Results section. 5

8 10. QUALITY CONTROL Two reference controls are supplied for use as quality control material. This material contains androstenedione in concentrations typical of that expected in low and elevated patient ranges. The controls have been assayed using the Gamma-Coat [ 125 I] Androstenedione Radioimmunoassay Kit. Acceptable ranges are printed on the vial labels. In addition, several levels of commercial controls should be used in each series of assays as checks on the performance of the assay and should be treated in the same manner as unknown samples. Quality control charts should be maintained to follow the performance of the commercial controls. Appropriate statistical methods should be used to evaluate trends. Acceptable performance limits should be ascertained for the individual laboratory CALCULATION OF RESULTS Androstenedione levels in serum are interpolated from the calibrator curve obtained using the Androstenedione Serum Calibrators. A calibrator curve based on the appropriate values for the calibrators must be established for every run Record the counts per minute (CPM) bound for each tube Plot the CPM bound for Androstenedione Serum Calibrators (vertical axis) versus androstenedione concentration (ng/ml, horizontal axis) on semilogarithmic graph paper Draw the best fitting curve. Refer to FIGURE 1 and TABLE I for typical calibrator curve data Locate the CPM bound for each tube which corresponds to each sample on the vertical axis and follow a horizontal line intersecting the calibrator curve. At the point of intersection, read androstenedione concentration (ng/ml) from the horizontal axis. 6

9 TABLE I Recording the Data Do not use to calculate unknowns Androstene- Tube CPM Mean B/B 0 dione No. Contents of Tubes Bound (CPM) (%) (ng/ml) T1 Total Counts (Tracer) T2 Total Counts (Tracer) Androstenedione Serum Blank, B 0 0 ng/ml Androstenedione Serum Blank, B 0 0 ng/ml Androstenedione Serum Cal. 0.1 ng/ml Androstenedione Serum Cal. 0.1 ng/ml Androstenedione Serum Cal. 0.3 ng/ml Androstenedione Serum Cal. 0.3 ng/ml Androstenedione Serum Cal. 1 ng/ml Androstenedione Serum Cal. 1 ng/ml Androstenedione Serum Cal. 3 ng/ml Androstenedione Serum Cal. 3 ng/ml Androstenedione Serum Cal. 10 ng/ml Androstenedione Serum Cal. 10 ng/ml Androstenedione Serum Control, Level I Androstenedione Serum Control, Level I Androstenedione Serum Control, Level II Androstenedione Serum Control, Level II Patient X Serum Sample Patient X Serum Sample Patient Y Serum Sample Patient Y Serum Sample

10 Typical Curve CPM (counts per minute) Patient "X" Level I Patient "Y" Level II 5000 FIGURE Androstenedione concentration (ng/ml) 12. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE 12.1 Repeated freezing and thawing of reagents supplied in the kit must be avoided The user should note that erroneous results can be caused by improper handling of patient samples Avoid foaming or vortexing which may denature proteins Hemolyzed and lipemic specimens may give false androstenedione values and thus must be avoided If it is desired to dilute patient serum samples before assaying for androstenedione, use the Androstenedione Serum Blank provided with this kit as a diluent Failure to obtain the appropriate control values may indicate imprecise manipulations, improper handling, or deterioration of reagents Failure to blot tubes adequately following decantation may result in poor replication and spurious values Tubes should be aspirated or decanted as soon as possible. 8

11 13. EXPECTED VALUES A reference range study was performed by an independent laboratory. The results are offered as an initial guide only. Each laboratory should determine its own laboratory characteristics for interpretation of results based on a representative sample population. Number Serum Androstenedione of Mean Absolute Range Samples (ng/ml) (ng/ml) Male Males (20-40 years) Females Females (19-40 years) Post Menopausal All Specimens SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS 14.1 PRECISION The intra-run precision was determined from the mean of simultaneous assays per sample. Sample Sample A Sample B Sample C Number of Assays Mean (ng/ml) Standard Deviation (ng/ml) CV % The inter-run precision was determined from the mean of the average of duplicates for 5 separate runs. Sample Sample D Sample E Sample F Number of Assays Mean (ng/ml) Standard Deviation (ng/ml) CV %

12 14.2 TRUENESS: THE ASSAY TRUENESS HAS BEEN VERIFIED BY THE RECOVERY TEST. ANDROSTENEDIONE RECOVERY FROM POOLED SERA Two serum samples containing different levels of endogenous androstenedione were spiked with different amounts of a serum sample with an elevated level of androstenedione and assayed. Recovery is calculated as (recovered/expected) x 100. Contrib. From Pool (ng/ml) Contrib. from Spike (ng/ml) Expected Value (ng/ml) Recovered Value (ng/ml) Recovery (%) ANALYTICAL SENSITIVITY The sensitivity of the calibrator curve is defined as the smallest single value which can be distinguished from zero. This value was calculated as the mean of androstenedione concentrations for 30 replicates at two (2) standard deviations from the zero point of the calibrator curve. The calculated sensitivity is 0.03 ng/ml at the 95% confidence level. 10

13 14.4 ANALYTICAL SPECIFICITY The cross-reactivity of the androstenedione antiserum has been measured against various compounds. The percent cross-reactivity is expressed as the ratio of the androstenedione concentration of the reacting compound at 50% binding of the calibrator 0. Compound % Cross-reactivity Androstenedione 100 Androsterone 0.90 Cholesterol <0.01 Corticosterone <0.01 Cortisol 0.02 Cortisone 0.60 Cortexalone 0.39 Dehydroepiandrosterone (DHEA) 0.09 Dehydroepiandrosterone Sulfate (DHEA-S) α-Dihydrotestosterone 0.22 Deoxycorticosterone Deoxycortisol <0.01 Estradiol 0.02 Estriol <0.01 Estrone 0.04 Etiocholanolone α-Hydroxypregnenolone < ß-Hydroxyprogesterone 0.04 Isoandrosterone 0.45 Pregnenolone <0.01 Progesterone 0.09 SEE LAST PAGE FOR REFERENCES 11

14 DOSAGE RADIO-IMMUNOLOGIQUE GAMMACOAT ANDROSTÈNEDIONE 1. INDICATION POUR USAGE DIAGNOSTIQUE IN VITRO. La trousse de dosage radio-immunologique GammaCoat [ 125 I] Androstènedione permet d'effectuer la détermination quantitative du taux d'androstènedione libre dans le sérum. 2. RÉSUMÉ ET COMMENTAIRE Le cortex surrénal humain produit 5 classes principales d'hormones stéroïdes : les glucocorticoïdes, les minéralocorticoïdes, les androgènes, les œstrogènes et les progestines. Seules quelques-unes des 50 (environ) hormones stéroïdes isolées dans le cortex surrénal ont une activité physiologique. 1 Les plus importantes sont les glucocorticoïdes -, la cortisone et le cortisol, l'aldostérone minéralocorticoïde, les androgènes androstènedione (ASD) et la déhydro-épiandrostérone (DHEA). Parmi les hormones gonadiques, les principales hormones mâles, synthétisées dans les cellules de Leydig des testicules, figurent les androgènes testostérone et, en plus faible quantité, la DHEA et l'asd. 1 Les principales hormones femelles synthétisées dans le corps lutéique sont la progestérone et les œstrogènes. 1 L'ASD se trouve au point de convergence entre 2 passages biosynthétiques qui conduisent des progestines à la production des androgènes et des œstrogènes. Des troubles dans ces passages ou des passages qui y sont liés affectent le taux d'asd. 2 L'ASD est donc un analyte pivot pour l'évaluation d'une maladie dans chacun de ces tissus. En général, les androgènes engendrent l'anabolisme. 1,3 Dans les tissus cible, ils augmentent le taux d'acide ribonucléique (RNA) et la synthèse des protéines, ainsi que le nombre de mitochondries, et donc le taux de respiration. 1 Leur sécrétion surrénale est relativement constante et contrôlée par l'hormone adrénocorticotrope (ACTH), tandis que les sécrétions testiculaires et ovariennes varient et sont contrôlées par l'hormone lutéinisante (LH). 4 Un diagnostic précis des pathologies citées ci-dessous nécessite donc un prélèvement sanguin à différents moments de la journée et à différents stades du cycle menstruel. 4-6 Un pic du taux d'asd apparaît à la moitié du cycle. 5,7,8 Le taux d'androstènedione est élevé au cours des premiers jours de vie. 2 Il recommence à augmenter vers 7-8 ans chez les garçons et les filles et reste élevé durant la puberté. 1,9 L'ASD est étroitement liée à l'albumine. Son taux de clairance rénale est donc élevé. 10 Le principal passage de dégradation de la testostérone et de l'asd comprend l'oxydation du foie, la saturation de la double liaison de l'anneau A et la réduction de son groupe cétogène pour former les substances primaires d'extraction des 17- cétosteroïdes : l'androstérone et étiocholanolone. 1 Les troubles de la glande endocrine se manifestent en général par des dysfonctionnements de l'homéostasie. 1 Ils peuvent être provoqués par une production anormale des régulateurs ou par une mauvaise sensibilité des tissus cible de ces régulateurs. 5,11 Des troubles enzymatiques peuvent apparaître à un niveau des passages biosynthétiques, provoquant ainsi un blocage total ou partiel de ce passage. Des taux élevés des précurseurs provoquent un glissement de la synthèse vers d'autres passages. 1,4,12 L'une des causes communes de l'excès d'androgènes surrénaux est l'hyperplasie surrénale congénitale. 2,4 Dans 95% des cas, elle est le résultat d'une déficience de l'hydroxylase de l'enzyme Cette enzyme apparaît dans la zona fasciculata ou zona glomerulosa de la glande surrénale. 4 Le résultat d'une déficience de cette enzyme est une sous-production des corticostéroïdes, un excès des précurseurs 17- hydroxyprogestérone et progestérone et un glissement vers le passage androgène, avec une hausse du taux d'asd. 1,12 La prévalence estimée de cet état est de 1:15000 homozygote et 1:75 hétérozygote. Dans une fratrie, lorsqu un enfant est atteint, le risque pour que l enfant suivant soit atteint est de 25%. 4 Des troubles sévères provoquent la masculinisation du nouveau-né, présentant un problème de carence de sel pouvant 12

15 mettre la vie en danger. 1,2 Les effets légers sont difficiles à diagnostiquer chez les sujets masculins. Les filles peuvent présenter un élargissement modéré du clitoris ou différents degrés de fusion labiale. 2 Un excès d'androgènes provoque une croissance excessive des cheveux (hirsutisme), l'acné, la virilisation, l'augmentation de la masse musculaire, l'oligoménorrhée et une petite stature due à la croissance accélérée suivie d'une fermeture précoce de l'épiphyse. 4 La détermination du taux d'asd doit figurer parmi les différents examens diagnostiques visant à déterminer l'hyperplasie surrénale congénitale et pour surveiller les enfants chez qui le traitement peut comporter des effets secondaires sur la croissance et le développement sexuel. 2 La maladie des ovaires polykystiques est une cause commune de l'hypersecrétion d'androgènes ovariens. Le taux élevé de LH dans les ovaires kystiques peut stimuler la production d'androgènes dans les cellules intersticielles : ASD, DHEA et testostérone. 4 Dans la maladie des ovaires polykystiques, la suractivité du stroma ovarien peut provoquer une sécrétion d'asd trois à quatre fois supérieure à la normale. La maladie des ovaires polykystiques est un trouble commun et est largement reconnue comme l'un des principaux facteurs d'infertilité associée à une anovulation dans un grand nombre des cas. 4,13 Elle est présente dans l'hyperplasie des cellules thécales, l'hyperthécose et l'hypersécrétion d'androgènes dépendant de la LH. 4 De plus, l'incidence du carcinome de l'endomètre est plus élevée chez les femmes atteintes par la maladie des ovaires polykystiques. Une affection plus rare, le syndrome de Stein-Leventhal, est également associée à une aménorrhée secondaire, à un élargissement bilatéral des ovaires, à l'infertilité, à l'obésité et à l'hirsutisme. 13 Le diagnostic différentiel de la maladie des ovaires polykystiques et de l'hyperthécose est établi en mesurant le changement du taux d'asd à l'aide du test de stimulation de la gonadotrophine chorionique (hcg), dans laquelle le taux augmente dans le premier cas et reste inchangé dans le dernier. 14 Outre les pathologies citées, certaines tumeurs surrénales et gonadiques peuvent causer un excès d'androgènes et/ou d'œstrogènes. 12 Le résultat chez les garçons en âge prépubère peut être la virilisation, la précocité sexuelle ou la féminisation. Le diagnostic différentiel dans pathologies citées doit exclure les hormones exogènes ainsi que les tumeurs des testicules, des ovaires et de la glande surrénale. 3. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE DE DOSAGE La procédure de la trousse GammaCoat Androstènedione pour la détermination de l'androstènedione suit le principe de base du dosage radio-immunologique, où il y a compétition entre les gènes radioactifs et non radioactifs pour un nombre défini de sites de liaison de l'anticorps. 15 La quantité d'androstènedione marqué [ I 125] lié à l'anticorps dans le tube enduit est inversement proportionnelle à la concentration d'androstènedione présente dans le sérum. La séparation de l'antigène libre et lié est obtenue par décantation ou aspiration de l'anticorps dans les tubes enduits. 4. RÉACTIFS FOURNIS DANS LA TROUSSE Tubes enduits d'androstènedione Etalon 0 androstènedione Etalons androstènedione Contrôles androstènedione Traceur androstènedione 2 poches / 50 chacun 1 flacon / 1 ml 5 flacons / 0,5 ml 2 flacons / 0,5 ml 1 flacon/ 50 ml Nombre de dosages 100 Les réactifs sont stables jusqu'à la date de péremption imprimée sur leur étiquette lorsqu'ils sont conservés à 2-8 C. Les sérum témoin, étalons et contrôles androstènedione ont démontré qu'ils sont stables pendant trois semaines lorsqu'ils sont conservés à 2-8 C. Si ces composants sont conservés plus longtemps, les congeler à -20 C. Ne pas utiliser les réactifs au-delà de la date de péremption de la trousse. Les réactifs de lots différents ne doivent pas être mélangés. 13

16 4.1 [ 125 I] Traceur androstènedione : réactif prêt à l'emploi Chaque flacon contient environ 5 µci de traceur ( 4 µg androstènedione par ml) dans 50 ml de tampon citrate avec de l'albumine bovine et 0,05% de thimérosal comme conservateur. 4.2 Tubes enduits d'anti-androstènedione de lapin : réactif prêt à l'emploi Les tubes de 12 x 75 mm sont enduits de sérum anti-androstènedione de lapin ( 0,1 µg/tube). La poche plastique doit être bien fermée pour conserver les tubes non utilisés. 4.3 Sérum témoin androstènedione : réactif lyophilisé Chaque flacon contient 1 ml de sérum androstènedione humain libre avec <0,09% de nitrure de sodium comme conservateur. Reconstituer avec 1 ml d'eau purifiée. 4.4 Etalons de sérum androstènedione : réactif lyophilisé Chaque flacon contient de l'androstènedione dans 0,5 ml de sérum androstènedione humain libre avec <0,09% de nitrure de sodium comme conservateur. Les étalons sont fournis approximativement dans les concentrations d'androstènedione suivantes : respectivement 0,1 ; 0,3 ; 1 ; 3 et 10 ng/ml. Consulter le flacon pour connaître les concentrations réelles. Reconstituer avec 0,5 ml d'eau purifiée. Bien mélanger par inversion avant l'emploi. Le dosage d'androstènedione est étalonné à l'aide d'une préparation d'androstènedione pure, fournie par Steraloids, Inc. (Wilton, NH). Les étalons de la trousse démontrent leur commutabilité avec les échantillons patient lorsqu'ils sont utilisés avec des réactifs et selon le mode d'emploi de ce dosage diagnostique in vitro, comme recommandé. 4.5 Sérums de contrôle androstènedione : réactif lyophilisé Le premier niveau contient de faibles concentrations (0,9 ± 0,3 ng/ml) d'androstènedione et le second niveau contient des concentrations élevées (6 ± 2 ng/ml) d'androstènedione dans 0,5 ml de sérum androstènedione humain libre avec <0,09% de nitrure de sodium comme conservateur. Reconstituer avec 0,5 ml d'eau purifiée. 5. AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS POUR USAGE DIAGNOSTIQUE IN VITRO. Non prévu pour une utilisation interne ou externe sur l'homme ou l'animal. RÉACTIFS CONTENANT DES PRODUITS D'ORIGINE HUMAINE Traiter comme potentiellement infectieux. Chaque don de sérum/plasma intervenant dans la préparation de ce produit a été testé par une méthode agréée par la FDA et s'est avéré non réactif en présence de HBsAg, d'anticorps anti-vhc et d'anticorps anti-vih1/2. Même si ces méthodes sont extrêmement précises, elles ne garantissent pas la détection de tous les dons infectés. Ce produit peut également contenir d'autres produits d'origine humaine pour lesquelles il n'existe aucun test agréé. Comme aucune méthode de test connue ne peut offrir l'assurance complète de l'absence du virus de l'hépatite B (HBV) ou de l'hépatite C (HCV), du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) ou d'autres agents infectieux, tous les produits d'origine humaine doivent être manipulés conformément aux bonnes pratiques de laboratoire en prenant les précautions appropriées décrites dans le document U.S. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health Manual, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4 ème éd., mai 1999 ou dernière édition. RÉACTIFS CONTENANT DU NITRURE DE SODIUM ATTENTION : Certains réactifs de cette trousse contiennent de l'azide de sodium. L'azide de sodium peut réagir avec la plomberie en plomb ou en cuivre et former des azotures ultra-explosifs. Pour leur mise au rebut, rincer à grande eau pour empêcher l'accumulation d'azide. Pour plus d'informations, consulter Decontamination of Laboratory Sink Drains to Remove Azide Salts, dans le manuel Guide-Safety Management No. CDC-22 publié par les Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA,

17 Déclaration des risques relatifs aux substances dangereuses des communautés européennes (Directive du conseil 1999/45/EC) R20/21/22 - Nocif en cas d'inhalation, d'ingestion et de contact avec la peau. R32 - Un contact avec les acides dégage un gaz très toxique. S28 - Après un contact avec la peau, laver immédiatement à grande eau. RÉACTIFS CONTENANT DU THIMÉROSAL Certains réactifs de cette trousse contiennent du thimérosal contenant un composant de mercure. La mise au rebut du mercure élémentaire, du mercure inorganique, des oxydes de mercure et des composés de mercure doit être effectuée en respectant scrupuleusement les réglementations locales, nationales et fédérales. AVERTISSEMENT : Ce produit contient un produit chimique connu dans l'etat de Californie comme provoquant des malformations à la naissance et des troubles de la reproduction. RÉACTIFS CONTENANT DE L'IODE 125 Cette trousse contient un produit radioactif qui ne dépasse pas 5 µci (185 kbq) d'iode 125. Les précautions appropriées et les bonnes pratiques de laboratoire doivent être utilisées pour la conservation, la manipulation et la mise au rebut de ce produit. Pour les praticiens ou les établissements recevant des radio-isotopes dans le cadre d'une licence générale : Ce produit radioactif peut être reçu, acquis, détenu et utilisé uniquement par des médecins, des vétérinaires pratiquant la médecine vétérinaire, des laboratoires cliniques et des hôpitaux, et uniquement pour des analyses cliniques ou de laboratoire in vitro n'impliquant pas l'administration interne ou externe du produit, ni par rayonnement, à l'homme ou à l'animal. Sa réception, son acquisition, sa détention, son utilisation et son transfert sont sujets aux réglementations et à la licence générale de l'u.s. Nuclear Regulatory Commission de l'état avec lequel la Commission a conclu un accord pour l'exercice de l'autorité réglementaire. 1. Le produit radioactif doit être conservé dans un endroit désigné. 2. L'accès aux produits radioactifs doit être limité au personnel autorisé uniquement. 3. Ne pas pipeter des solutions radioactives avec la bouche. 4. Ne pas manger, ni boire dans les zones de travail radioactives. 5. En cas de déversement de produits radioactifs dans une zone, nettoyer la zone, puis la laver à l'aide d'un produit détergent à base d'alcali ou d'une solution de décontamination radiologique. Tout article de verre utilisé doit être entièrement lavé à l'eau avant de laver les autres articles de verre du laboratoire. Pour les praticiens ou les établissements recevant des radio-isotopes dans le cadre d'une licence spécifique : La réception, l'utilisation, le transfert et la mise au rebut de produits radioactifs sont sujets aux réglementations et conditions de votre licence spécifique. AVERTISSEMENT : Ce produit contient un produit chimique connu dans l'etat de Californie comme étant cancérigène. ATTENTION : La radioactivité imprimée sur la notice d'utilisation peut être légèrement différente de celle qui est imprimée sur l'étiquette de la boîte et sur l'étiquette du flacon du traceur. Les étiquettes de la boîte et du flacon du traceur indiquent la dose réelle de radioactivité à la date de calibrage, alors que la notice d'utilisation indique la radioactivité théorique de la trousse. 6. INDICATION D'UNE DÉTÉRIORATION POSSIBLE DES RÉACTIFS DE LA TROUSSE 6.1 Présence de particules anormales dans l'un des réactifs. 6.2 Écart de pente ou de position de la courbe d'étalonnage par rapport à la normale obtenue. 15

18 6.3 Diminution de la liaison maximale. 6.4 Haute liaison non spécifique. 7. PRÉLÈVEMENT ET PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS Pour l'utilisation du sérum et la ponction veineuse, adopter les précautions d'usage. Ne pas utiliser d'échantillons largement hémolysés ou lipémiques. Les échantillons de sérum doivent être conservés à 2-8 C pendant 24 heures. Si la durée entre le prélèvement et l'analyse dépasse 24 heures, fractionner et congeler l'échantillon pour le conserver. Eviter de conserver les échantillons dans un freezer à auto-dégivrage, car les cycles répétés de congélation et décongélation peuvent dénaturer les protéines. Avant le dosage, porter lentement les sérums congelés à température ambiante et mélanger délicatement à la main. Ne pas décongeler l'échantillon dans un bain d'eau à 37 C. 8. MATÉRIEL ET PRODUITS REQUIS MAIS NON FOURNIS Les éléments suivants ne sont pas fournis dans la trousse et sont nécessaires au dosage : 8.1 Portoir. 8.2 Pipette de précision (50 µl). 8.3 Pipette de précision ou pipette semi-automatique (500 µl). 8.4 Aspirateur d'eau (optionnel). 8.5 Bain d'eau à température contrôlée : 37 C ±2 C. 8.6 Compteur gamma. 8.7 Papier absorbant recouvert d'une pellicule plastique (optionnel). 8.8 Eau purifiée 9. PROCÉDURE DE DOSAGE La procédure de dosage prévoit la préparation d'une courbe d'étalonnage permettant d'interpoler le contenu d'androstènedione à déterminer dans l'échantillon. 9.1 Laisser tous les réactifs atteindre la température ambiante et bien mélanger par inversion avant l'usage, en évitant la formation de mousse. 9.2 Etiqueter les tubes enduits d'anti-androstènedione de lapin GammaCoat en double, suivant le schéma. Les tubes Efficacité totale [T1,T2] et B 0 [1,2] peuvent être nécessaires pour un programme de réduction des données, mais peuvent être omis si la courbe d'étalonnage est dessinée sur du papier quadrillé semi-logarithmique. 16 Bien refermer l'emballage des tubes inutilisés et immédiatement les replacer dans un réfrigérateur. N Lettre de tube Contenu des tubes code 1,T2 Efficacité totale (Traceur) 1,2 Sérum étalon androstènedione, B 0 0 ng/ml A 3,4 Sérum étalon androstènedione 0,1 ng/ml B 5,6 Sérum étalon androstènedione 0,3 ng/ml C 7,8 Sérum étalon androstènedione 1 ng/ml D 9,10 Sérum étalon androstènedione 3 ng/ml E 11,12 Sérum étalon androstènedione 10 ng/ml F 13,14 Sérum de contrôle androstènedione, niveau I 15,16 Sérum de contrôle androstènedione, niveau II 17,18 Echantillon de sérum du patient X 19,20 Echantillon de sérum du patient Y 16

19 9.3 Ajouter au fond des tubes en double appropriés : a. 50 µl de sérum témoin androstènedione, de sérum étalon androstènedione ou de sérum de contrôle androstènedione reconstitués. b. 50 µl de chaque échantillon de sérum du patient. 9.4 Ajouter 500 µl de traceur androstènedione [ I 125] à chaque tube. Mélanger et agitant vigoureusement le portoir à la main. 9.5 Incuber tous les tubes dans un bain d'eau à 37 C ±2 C pendant 30 - à 40 minutes. 9.6 Aspirer ou décanter toutes les éprouvettes, à l'exception de l'activité totale. UNE ÉLIMINATION INCOMPLÈTE DE LA SOLUTION ADHÉRANT AUX PAROIS RISQUE D ENGENDRER UNE MAUVAISE REPRODUCTIBILITÉ OU DES VALEURS ERRONÉES. Si l on utilise la technique par aspiration, s assurer que l embout en plastique de l aspirateur est en contact avec le fond du tube enduit et que tout le liquide est bien éliminé. Si l on utilise la technique par décantation, laisser les tubes à l envers pendant 3 à 5 minutes afin qu ils se vident bien. Taper les tubes sur du papier absorbant pour éliminer le liquide qui y adhère avant de replacer les tubes à l'endroit. 9.7 Compter tous les tubes dans le compteur gamma pendant 1 minute, la fenêtre correctement réglée pour l'iode Calculer les résultats. Se reporter à la section Résultats. 10. CONTRÔLE QUALITÉ Deux contrôles de référence sont fournis comme matériel de contrôle de qualité. Ce matériel contient de l'androstènedione dans des concentrations typiques attendues pour les marges basses et élevées des patients. Les contrôles ont été testés à l'aide de la trousse de dosage radio-immunologique Androstènedione Gamma-Coat [ I 125]. Les marges acceptables sont indiquées sur les étiquettes des flacons. De plus, différents niveaux de contrôles commerciaux doivent être utilisés dans chaque série de dosages pour vérifier les performances du dosage ; ils doivent être traités comme les échantillons à déterminer. Les graphiques de contrôle de qualité doivent être maintenus pour suivre les performances des contrôles commerciaux. Des méthodes statistiques appropriées doivent être utilisées pour évaluer les tendances. Chaque laboratoire doit établir ses propres limites de performances acceptables CALCUL DES RÉSULTATS Le taux sérique d'androstènedione est interpolé sur la courbe d'étalonnage obtenue à l'aide des sérums étalon androstènedione. Une courbe d étalonnage basée sur les valeurs adéquates des étalons doit être établie pour chaque dosage Enregistrer le nombre de coups par minute (CPM) liés de chaque tube Tracer les CPM liés pour les sérums étalon androstènedione (axe vertical) et la concentration d'androstènedione (ng/ml, axe horizontal) sur du papier quadrillé semi-logarithmique Tracer la courbe la plus précise possible. Des données typiques et une courbe d'étalonnage sont présentées à la FIGURE 1 et au TABLEAU I Indiquer les CPM liés pour chaque tube correspondant à chaque échantillon sur l axe vertical et suivre une ligne horizontale jusqu au point d intersection avec la courbe d étalonnage. Au point d'intersection, lire la concentration d'androstènedione (ng/ml) sur l'axe horizontal. 17

20 TABLEAU I Enregistrement des données A ne pas utiliser pour calculer les valeurs à déterminer Androstène- Tube CPM Moyenne B/B 0 dione No. Contenu des tubes lié (CPM) (%) (ng/ml) T1 Efficacité totale (Traceur) T2 Efficacité totale (Traceur) Androstènedione Sérum témoin, B0 0 ng/ml Androstènedione Sérum témoin, B0 0 ng/ml Androstènedione Sérum étalon 0,1 ng/ml Androstènedione Sérum étalon 0,1 ng/ml ,8 5 Androstènedione Sérum étalon 0,3 ng/ml Androstènedione Sérum étalon 0,3 ng/ml ,5 7 Androstènedione Sérum étalon 1 ng/ml Androstènedione Sérum étalon 1 ng/ml ,8 9 Androstènedione Sérum étalon 3 ng/ml Androstènedione Sérum étalon 3 ng/ml ,9 11 Androstènedione Sérum étalon 10 ng/ml Androstènedione Sérum étalon 10 ng/ml ,8 13 Androstènedione Sérum de contrôle, niveau I Androstènedione Sérum de contrôle, niveau I ,1 0,98 15 Androstènedione Sérum de contrôle, niveau II Androstènedione Sérum de contrôle, niveau II ,8 6,07 17 Echantillon de sérum du patient X Echantillon de sérum du patient X ,6 0,40 19 Echantillon de sérum du patient Y Echantillon de sérum du patient Y ,6 1,62 18

21 Courbe typique CPM (counts per minute) Patient "X" Level I Patient "Y" Level II 5000 FIGURE Androstenedione concentration (ng/ml) 12. LIMITES DU DOSAGE 12.1 Ne pas congeler et décongeler de manière répétée les réactifs fournis dans la trousse L utilisateur doit garder en mémoire qu une manipulation des échantillons de patients peut engendrer des résultats erronés Eviter la formation de mousse et ne pas agiter sur un vortex, car cela dénaturerait les protéines Les échantillons hémolysés et lipémiques peuvent engendrer des valeurs erronées d'androstènedione. Ils doivent donc être évités Si l'on veut diluer les échantillons de sérum des patients avant le dosage de l'androstènedione, utiliser le sérum témoin androstènedione fourni comme diluant dans la trousse S'il est impossible d'obtenir des valeurs correctes de contrôle, la manipulation a peut-être été imprécise ou impropre, ou les réactifs ont pu être endommagés Si les tubes ne sont pas correctement enduits après la décantation, le répliqué sera faible et les valeurs erronées Les tubes doivent être aspirés ou décantés le plus rapidement possible. 19

22 13. VALEURS ESCOMPTÉES Une étude de marge de référence a été conduite par un laboratoire indépendant. Les résultats sont uniquement fournis en guise de guide initial. Chaque laboratoire doit établir ses propres caractéristiques d'interprétation des résultats selon un échantillon de population représentatif. Nombre Moyenne Sérum androstènedione d' échantillons (ng/ml) Marge absolue (ng/ml) Homme 28 1,58 0,61-3,71 Hommes (20-40 ans) 14 1,72 0,61-3,71 Femmes 51 1,61 0,46-3,39 Femmes (19-40 ans) 35 1,65 0,47-3,39 Post ménopause 12 1,41 0,46-2,67 Tous les échantillons 79 1,60 0,46-3, CRITÉRES DE QUALITÉ 14.1 PRÉCISION La précision intra-dosage a été déterminée par le dosage simultané de dosages par échantillon. Échantillon Echantillon A Echantillon B Echantillon C Nombre de dosages Moyenne (ng/ml) 0,85 3,14 6,86 Déviation standard (ng/ml) 0,05 0,24 0,46 CV % La précision inter-dosage a été déterminée par la moyenne des doubles de 5 dosages différents. Échantillon Echantillon D Echantillon E Echantillon F Nombre de dosages Moyenne (ng/ml) 0,68 2,17 7,03 Déviations standard (ng/ml) 0,07 0,16 0,93 6,4 7,6 6,7 CV % 11,1 7,7 13,2 20

23 14.2 EXACTITUDE : L'EXACTITUDE DU DOSAGE A ÉTÉ VÉRIFIÉE PAR UN TEST DE RÉCUPÉRATION. RÉCUPÉRATION D'ANDROSTÈNEDIONE DE L'ENSEMBLE DE SÉRUM Deux échantillons de sérum contenant différentes quantités d'androstènedione endogène ont été ajoutés à différentes quantités d'échantillons de sérum avec une quantité élevée d'androstènedione et dosés. La récupération est calculée de la façon suivante : (récupéré/attendu) x 100. Contrib. de l'ensemble (ng/ml) Contrib. de l'ajout (ng/ml) Valeur attendue (ng/ml) Valeur récupérée (ng/ml) Récupération (%) 0,42 0,5 1,5 5,0 0,92 1,92 5,42 1,01 2,15 5, ,01 0,5 1,5 5,0 1,51 2,51 6,01 1,77 2,68 6, SENSIBILITÉ ANALYTIQUE La sensibilité de la courbe d étalonnage est définie comme la plus petite valeur unique pouvant être distinguée de zéro. Cette valeur a été calculée comme la moyenne de la concentration d'androstènedione pour trente répliqués à deux (2) déviations standard au point zéro de la courbe d'étalonnage. La sensibilité calculée est de 0,03 ng/ml à un taux de confiance de 95%. 21

24 14.4 SPÉCIFICITÉ ANALYTIQUE La réactivité croisée de l'antisérum androstènedione a été mesurée pour les différents composants. Le pourcentage de réactivité croisée est exprimé comme la proportion de concentration d'androstènedione du composant de réaction à 50% de liaison de l'étalon 0. Composant % Réactivité croisée Androstènedione 100 Androstérone 0,90 Cholestérol <0,01 Corticostérone <0,01 Cortisol 0,02 Cortisone 0,60 Cortexalone 0,39 Déhydro-épiandrostérone (DHEA) 0,09 Sulfate de déhydro-épiandrostérone (DHEA-S) 0,12 5α-Dihydrotestostérone 0,22 Désoxycorticostérone 0,03 11-Désoxycortisol <0,01 œstradiol 0,02 œstriol <0,01 œstrone 0,04 Etiocholanolone 0,08 17α-Hydroxypregnénolone <0,01 17ß-Hydroxyprogestérone 0,04 Isoandrostérone 0,45 Pregnénolone <0,01 Progestérone 0,09 VOIR LA DERNIÈRE PAGE POUR LES RÉFÉRENCES 22