ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΚΛΙΝΙΚΩΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΑΡΑΓΩΓΙΚΩΝ ΖΩΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΚΛΙΝΙΚΩΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΑΡΑΓΩΓΙΚΩΝ ΖΩΩΝ «ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΑΡΚΕΙΑΣ ΤΩΝ ΑΡΑΙΩΤΙΚΩΝ ΤΟΥ ΕΜΠΟΡΙΟΥ ΓΙΑ ΤΗ ΔΙΑΤΗΡΗΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙΜΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΚΑΠΡΟΥ» ΚΑΡΑΓΕΩΡΓΙΟΥ ΜΑΡΙΝΑ ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013

2 ΚΑΡΑΓΕΩΡΓΙΟΥ Κ. ΜΑΡΙΝΑ ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ 2013 Α.Π.Θ. «ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΑΡΚΕΙΑΣ ΤΩΝ ΑΡΑΙΩΤΙΚΩΝ ΤΟΥ ΕΜΠΟΡΙΟΥ ΓΙΑ ΤΗ ΔΙΑΤΗΡΗΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙΜΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΚΑΠΡΟΥ» ΙSBN: 1

3 «Η έγκριση της παρούσας διπλωματικής μεταπτυχιακής εργασίας από την Κτηνιατρική Σχολή του Α.Π.Θ. δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα». (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2). Τριμελής εξεταστική επιτροπή Ιωάννης Τσακμακίδης, λέκτορας (επιβλέπων) Κωνσταντίνος Μπόσκος, καθηγητής (μέλος) Ελένη Τζήκα, επίκουρος καθηγήτρια (μέλος) 2

4 Στη μητέρα μου 3

5 Πίνακας περιεχομένων ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ Εισαγωγή Τεχνητή Σπερματέγχυση (ΤΣ) Αραιωτικά Κατηγορίες αραιωτικών Κόστος αραιωτικών Στόχος της μελέτης ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Προέλευση βιολογικών υλικών Συλλογή και αραίωση του σπέρματος Εφαρμογή ΤΣ στη χοιροτροφική εκμετάλλευση Εργαστηριακή εξέταση του σπέρματος Εργαστηριακές δοκιμές Εκτίμηση παραμέτρων της κινητικότητας και των επί μέρους κινήσεων των σπερματοζωαρίων Εκτίμηση της μορφολογίας των σπερματοζωαρίων Εκτίμηση της ζωτικότητας των σπερματοζωαρίων Εκτίμηση της ακεραιότητας του DNA των σπερματοζωαρίων ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 43 ΠΕΡΙΛΗΨΗ.. 44 SUMMARY.. 46 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ. 48 4

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή αφορά στη συγκριτική μελέτη, της in vitro και in vivo επάρκειας, τριών αραιωτικών του εμπορίου που χρησιμοποιούνται ως συντηρητικά σπέρματος κάπρου, με διαφορετικό προτεινόμενο χρόνο συντήρησης. Η συνήθης πρακτική στις χοιροτροφικές εκμεταλλεύσεις περιλαμβάνει τη χρήση αραιωτικών μέσης διάρκειας για τη συντήρηση του σπέρματος, με σκοπό την εφαρμογή Τεχνητής Σπερματέγχυσης (ΤΣ). Στο εμπόριο όμως, κυκλοφορούν εκτός από τα μέσης και τα βραχείας, και μακράς διάρκειας αραιωτικά. Κατά τη διάρκεια της μελέτης μας, εκτιμήθηκε η ποιότητα σπέρματος που αραιώθηκε με κάθε ένα από τα παραπάνω αραιωτικά τόσο στο εργαστήριο, όσο και στην εκτροφή μέσω της εφαρμογής συμβατικής ενδοτραχηλικής σπερματέγχυσης. Το πρώτο τμήμα της διατριβής περιλαμβάνει βιβλιογραφική ανασκόπηση, για το ρόλο της τεχνητής σπερματέγχυσης στη σύγχρονη χοιροτροφία, για τους τύπους των αραιωτικών του σπέρματος που κυκλοφορούν στο εμπόριο και για τα γενικά χαρακτηριστικά τους. Στο δεύτερο τμήμα γίνεται περιγραφή των υλικών και μεθόδων που χρησιμοποιήθηκαν στον παρόντα πειραματισμό. Ακολουθεί η ανάλυση των αποτελεσμάτων και η συζήτηση, στην οποία τα αποτελέσματά μας σχολιάζονται και συγκρίνονται με εκείνα άλλων μελετών. Τέλος, παρατίθενται τα συμπεράσματα, η βιβλιογραφία που χρησιμοποιήθηκε και το παράρτημα που περιλαμβάνει το σύνολο των πινάκων με τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης. Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή ολοκληρώθηκε χάρη στην καθοριστική συμβολή ανθρώπων τους οποίους οφείλω να κατονομάσω. Ευχαριστώ θερμά τον κ. Ι. Τσακμακίδη, λέκτορα της Κτηνιατρικής Σχολής Α.Π.Θ., επιβλέποντα καθηγητή μου, ο οποίος με καθοδήγησε και με στήριξε με υπομονή, σε όλη τη διάρκεια του πειραματισμού και της συγγραφής της εργασίας αυτής. 5

7 Ευχαριστώ ιδιαιτέρως, τον κ. Κ. Μπόσκο, καθηγητή της Κτηνιατρικής Σχολής Α.Π.Θ., Διευθυντή της Κλινικής Παραγωγικών Ζώων, τόσο για τη διασφάλιση των κατάλληλων συνθηκών ώστε να ολοκληρωθεί απρόσκοπτα το πειραματικό μέρος, όσο και για τις καίριες και εύστοχες παρεμβάσεις του, που βελτίωσαν το περιεχόμενο της διατριβής. Ευχαριστώ τον κ. Γ. Τσούση, λέκτορα της Κτηνιατρικής Σχολής Α.Π.Θ., για τη βοήθειά που μου προσέφερε στη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, χωρίς την οποία δε θα μπορούσα να ολοκληρώσω τη μελέτη μου. Επίσης, ευχαριστώ όλους τους καθηγητές-μέλη που συντονίζουν το Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα της Σχολής, καθώς και το διδακτικό προσωπικό που συμμετέχει στην υλοποίησή του. Ευχαριστώ τους ιδιοκτήτες της χοιροτροφικής εκμετάλλευσης, κκ. Θωμά και Κυριακή Καρανίκα που μου επέτρεψαν να χρησιμοποιήσω τα ζώα και τις εγκαταστάσεις τους, για την ολοκλήρωση του πειραματισμού μου, καθώς και τον κ. Θεοφάνη Αβραμίδη, τεχνολόγο ζωικής παραγωγής, ο οποίος με βοήθησε με τη συλλογή και αραίωση του σπέρματος. Τέλος, ευχαριστώ την οικογένειά μου, για την υποστήριξη και συμπαράστασή τους, σε όλη τη διάρκεια της φοίτησής μου στο Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Σπουδών. 6

8 1. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 1.1. Εισαγωγή Η συνεισφορά της τεχνητής σπερματέγχυσης στην ανάπτυξη της παγκόσμιας χοιροτροφίας είναι θεμελιώδης, με ιδιαίτερα σημαντικό το ρόλο του αρσενικού στην όλη εξέλιξη. Στις σύγχρονες εκτροφές, η συμβατική εξέταση του σπέρματος των κάπρων πραγματοποιείται με σκοπό να προβλεφθεί η γονιμοποιητική ικανότητά τους, η οποία επηρεάζεται τόσο από το γενετικό δυναμικό και τις συνθήκες της εκτροφής, όσο και από τους χειρισμούς κατά την επεξεργασία του εκσπερματίσματος (Tsakmakidis et al., 2010). Η εκτίμηση των παραμέτρων του σπέρματος για την πρόβλεψη της in vivo γονιμοποιητικής ικανότητάς του συντελεί στο οικονομικό όφελος του παραγωγού (Tardif et al., 1999), καθώς η εκμετάλλευση κάπρων χαμηλής γονιμότητας και εκσπερματισμάτων κακής ποιότητας, μειώνει την αναπαραγωγική ικανότητα, με επιπτώσεις στην κερδοφορία της επιχείρησης (Foxcroft et al., 2008). Η συμβατική ανάλυση του σπέρματος, περιλαμβάνει τον έλεγχο της κινητικότητας, της ζωτικότητας, της πυκνότητας και της μορφολογίας των σπερματοζωαρίων. Η εργαστηριακή εκτίμηση επιπλέον χαρακτηριστικών, εκτός των κλασσικών παραμέτρων του σπέρματος, έχει μεγαλύτερη προγνωστική αξία για την in vivo γονιμότητα των κάπρων (Tsakmakidis et al., 2010). Οι παράμετροι εκτίμησης του σπέρματος του κάπρου επηρεάζονται από πολλούς παράγοντες μεταξύ των οποίων ο τύπος του αραιωτικού, η θερμοκρασία αποθήκευσης και ο χρόνος συντήρησής του (Fraser and Strzezek, 2004) Τεχνητή Σπερματέγχυση (ΤΣ) Η τεχνητή σπερματέγχυση εφαρμόστηκε για πρώτη φορά στη Ρωσία στις αρχές του προηγούμενου αιώνα. Αργότερα, στη δεκαετία του τριάντα, η χρήση της επεκτάθηκε σε άλλες χώρες, όπως οι Ηνωμένες Πολιτείες και η Ιαπωνία και στη συνέχεια, στη δεκαετία του πενήντα, στο Ηνωμένο Βασίλειο. Η τεχνική αυτή έχει το πλεονέκτημα της εκμετάλλευσης του γενετικού δυναμικού των καλύτερων κάπρων για τη γονιμοποίηση μεγάλου αριθμού χοιρομητέρων, καθιστώντας τη γενετική 7

9 βελτίωση ταχύτερη. Παρόλα αυτά, η τεχνητή σπερματέγχυση δεν χρησιμοποιήθηκε εμπορικά στη χοιροτροφία μέχρι τη δεκαετία του ογδόντα, στη διάρκεια της οποίας εξελίχθηκαν και τυποποιήθηκαν τα πρωτόκολλα εφαρμογής της. Στις ημέρες μας, η εφαρμογή της τεχνητής σπερματέγχυσης του χοίρου με νωπό αραιωμένο σπέρμα χρησιμοποιείται ευρέως στις κτηνοτροφικά ανεπτυγμένες χώρες. Οι πλέον πρόσφατες μελέτες αναφέρουν ότι σε ποσοστό 99% των περιπτώσεων χρησιμοποιείται νωπό σπέρμα που συντηρείται στους C. Η χρήση κατεψυγμένου σπέρματος είναι σπάνια στη χοιροτροφία εξαιτίας του χαμηλού ποσοστού γονιμοποίησης συγκριτικά με το νωπό αραιωμένο σπέρμα (Oliveras, 2008). Στην καθημερινή πράξη ένα εκσπερμάτισμα αραιώνεται και κατανέμεται σε πολλές δόσεις για ανάλογο αριθμό σπερματεγχύσεων (Tardif et al., 1999). Η συνήθης τακτική περιλαμβάνει μία ή συνήθως περισσότερες από μία σπερματεγχύσεις των θηλυκών, στη διάρκεια του οίστρου, ώστε να επιτευχθούν υψηλά ποσοστά γονιμοποίησης. Οι σπερματεγχύσεις ξεκινούν 12 ώρες μετά την ανίχνευση του οίστρου, και επαναλαμβάνονται ανά 12ωρα, 18ωρα ή 24ωρα μεσοδιαστήματα. Η τακτική αυτή φαίνεται πως είναι αποτελεσματική, αφού τουλάχιστον μία σπερματέγχυση εκτελείται ιδανικά εντός του χρόνου των ωοθυλακιορρηξιών (Rozeboom et al., 2000). Η εμπειρία του προσωπικού της εκτροφής στην ανίχνευση του οίστρου, η ικανότητα του σπερματεγχύτη, η ποιότητα του σπέρματος, καθώς και ο αριθμός των σπερματοζωαρίων ανά χρησιμοποιούμενη δόση, παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιτυχία της μεθόδου. Η γονιμοποιητική ικανότητα του σπέρματος προσδιορίζεται με βάση το ποσοστό των επιστροφών σε οίστρο, το ποσοστό των τοκετών και τον αριθμό των γεννηθέντων χοιριδίων (Holt et al., 1997). Προκειμένου να επιτευχθεί το καλύτερο δυνατό οικονομικό αποτέλεσμα, πρέπει να ακολουθείται η ορθή αναλογία αρσενικού προς θηλυκά ζώα, η οποία για τις εκμεταλλεύσεις που εφαρμόζουν ΤΣ είναι 1/ Η εξέλιξη στον τομέα της τεχνητής σπερματέγχυσης, η συνεχής επέκταση της εφαρμογής της και η προσπάθεια μέγιστης εκμετάλλευσης των κάπρων υψηλής γενετικής αξίας, οδηγεί στη δυνατότητα αλλά και στην ανάγκη μείωσης του αριθμού των σπερματοζωαρίων 8

10 ανά δόση. Η ύπαρξη αποτελεσματικών μεθόδων πρόβλεψης της ποιότητας του σπέρματος είναι σημαντική, ώστε να διαγιγνώσκεται έγκαιρα η υπογονιμότητα του αρσενικού και να απομακρύνονται οι υπεύθυνοι κάπροι από την αναπαραγωγική διαδικασία στις εμπορικές εκμεταλλεύσεις. Η ανάγκη λοιπόν, για όσο το δυνατόν αντικειμενικότερη εκτίμηση της γονιμοποιητικής ικανότητας των σπερματοζωαρίων του κάπρου γίνεται πλέον επιτακτική (Foxcroft et al., 2008) Αραιωτικά Είναι γνωστό, ότι τα σπερματοζωάρια του κάπρου συντηρούνται καλύτερα υπό ψύξη σε υγρό μέσο, συγκριτικά με την κατάψυξη (Boonkusol et al., 2010). Τα σπερματοζωάρια του συγκεκριμένου είδους δείχνουν μεγάλη ευαισθησία στη μείωση της θερμοκρασίας, πιθανά λόγω της χαμηλής αναλογίας χοληστερόλης και φωσφολιπιδίων στις μεμβράνες τους. Έτσι, η χρήση κατεψυγμένου σπέρματος, περιορίζεται σε λιγότερο από 1% του συνόλου των σπερματεγχύσεων στη χοιροτροφία, ενώ αντίθετα το νωπό αραιωμένο σπέρμα χρησιμοποιείται κατά κόρον στις χοιροτροφικές εκμεταλλεύσεις. Μια σημαντική πρόκληση για τη χοιροτροφία ήταν, η διατήρηση της γονιμοποιητικής ικανότητας του νωπού σπέρματος για όσο το δυνατό περισσότερες ημέρες, σε αραιωτικά μέσα (Dube et al., 2003). Η έκθεση των αρσενικών γαμετών σε θερμοκρασίες χαμηλότερες από εκείνες του σώματος προκαλεί αναπόφευκτα μείωση του ποσοστού εκείνων που διατηρούν την ακεραιότητα της μεμβράνης τους, τη δομή και τη βιοχημική λειτουργικότητά τους (Boonkusol et al., 2010). Οι μεταβολές αυτές, μετριάζονται ή αναβάλλονται για κάποιο χρονικό διάστημα, με τη χρήση αραιωτικών του σπέρματος (Huo et al., 2002). Με τον όρο αραιωτικά εννοούμε τα υδατικά διαλύματα που χρησιμοποιούνται προκειμένου να αυξηθεί η ικανότητα επιβίωσης των σπερματοζωαρίων για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα αλλά και ο όγκος του εκσπερματίσματος, προκειμένου να εξασφαλισθεί ικανοποιητικός αριθμός δόσεων για σπερματεγχύσεις. Η όλη διαδικασία της αραίωσης πρέπει να εκτελείται έτσι, ώστε 9

11 να διατηρείται η λειτουργικότητα και η γονιμοποιητική ικανότητα των σπερματοζωαρίων. Τα σπερματοζωάρια καλύπτουν τις υψηλές μεταβολικές ανάγκες της επιβίωσης και της κινητικότητάς τους εντός του γεννητικού σωλήνα του θηλυκού, λαμβάνοντας τα απαραίτητα εφόδια από τα συστατικά του σπερματικού πλάσματος. Στο εκσπερμάτισμα, αυτή η υψηλή μεταβολική δραστηριότητα μπορεί να διατηρηθεί μόνο για περιορισμένο χρονικό διάστημα. Η διατήρηση της λειτουργικής ικανότητας των σπερματοζωαρίων για μεγαλύτερο χρόνο, επιτυγχάνεται με τη μείωση της μεταβολικής τους δραστηριότητας με την αραίωση του εκσπερματίσματος με κατάλληλο μέσο και με τη μείωση της θερμοκρασίας συντήρησης. Τα σπερματοζωάρια του κάπρου, υφίστανται σοκ (ψυχρό σοκ), όταν το νωπό αραιωμένο σπέρμα συντηρείται σε θερμοκρασία χαμηλότερη των 12 C (Αlthouse et al., 1998). Η ευαισθησία αυτή αποδίδεται στα λιπίδια της κυτταρικής τους μεμβράνης. Συγκεκριμένα, όταν η θερμοκρασία μειώνεται, διαταράσσεται η πλευρική μετατόπιση των φωσφολιπιδίων της μεμβράνης, με αποτέλεσμα τον αποχωρισμό της λιπιδικής φάσης. Το γεγονός αυτό οδηγεί σε μη αναστρέψιμες μεταβολές των πρωτεϊνών των κυτταρικών μεμβρανών και διαταραχή της φυσιολογικής λειτουργίας των σπερματοζωαρίων με αποτέλεσμα να τίθεται σε κίνδυνο η βιωσιμότητά τους. Στην πράξη, το φαινόμενο του ψυχρού σοκ υποδεικνύει ότι το σπέρμα του κάπρου πρέπει να συντηρείται σε θερμοκρασία C, αφού η περεταίρω μείωση της θερμοκρασίας συντήρησης οδηγεί σε υποβάθμισή του. Η συντήρηση του σπέρματος του κάπρου στους C περιορίζει το χρόνο χρησιμοποίησής του, διότι σε τέτοιες θερμοκρασίες δεν μπορεί να επιτευχθεί σημαντική μείωση του μεταβολισμού των σπερματοζωαρίων, αλλά και αποτελεσματικός περιορισμός της ανάπτυξης μικροοργανισμών όπως θα συνέβαινε σε χαμηλότερες θερμοκρασίες (π.χ. 5 C). Επιπρόσθετα, η αραίωση μειώνει τη συγκέντρωση αρκετών συστατικών του σπερματικού πλάσματος, όπως είναι τα Κ + ή/και οι πρωτεΐνες, επηρεάζοντας τη ζωτικότητα των σπερματοζωαρίων (Gadea, 2003). Ιδιαίτερα σημαντική μείωση της ζωτικότητας παρατηρείται όταν χρησιμοποιείται αραιωτικό μέσο φτωχό σε 10

12 ηλεκτρολύτες (Johnson et al., 2000). Οι απώλειες αυτές αναπληρώνονται με την προσθήκη στο αραιωτικό συστατικών, όπως ο βόειος ορός αλβουμίνης (BSΑ), ο οποίος έχει αποδειχθεί ότι προάγει την κινητικότητα και τη γονιμότητα του συντηρημένου σπέρματος (Gadea, 2003). Η αναμενόμενη αύξηση των ελεύθερων ριζών οξυγόνου κατά τη διάρκεια της συντήρησης μπορεί να προκαλέσει βλάβες στο DNA των σπερματοζωαρίων με επιπτώσεις στη γονιμότητα. Σχετίζεται επίσης, με διαταραχή φυσιολογικών κυτταρικών λειτουργιών, καθώς και με μείωση της ζωτικότητας και της κινητικότητας (Bansal and Bilaspuri, 2011). Έτσι, τα τελευταία χρόνια, τα μέσα αραίωσης εμπλουτίζονται με αντιοξειδωτικά και αμινοξέα, όπως η βήτα-καροτίνη, η κυστεινη, η ταυρίνη, η υποταυρίνη, η λυκοπένη, η βιταμίνη Ε, το ασκορβικό οξύ, το υπεροξείδιο της δισμουτάσης και η γλουταθιόνη, με σκοπό την πρόληψη των υπεροξειδώσεων κατά την αποθήκευση του σπέρματος (Kaeoket et al., 2010). Τα αραιωτικά, προκειμένου να διασφαλιστεί η παρατεταμένη επιβίωση των σπερματοζωαρίων, θα πρέπει να παρέχουν επαρκείς πηγές ενέργειας, να περιέχουν ρυθμιστικά του pη και της οσμωτικής πίεσης, αλλά και παράγοντες και παρεμποδίζουν τη μικροβιακή ανάπτυξη (Maes et al., 2011). Τα σπερματοζωάρια διατηρούν τον κυτταρικό μεταβολισμό τους και παράγουν την ενέργεια που απαιτείται για την κίνησή τους, μέσω του μηχανισμού της γλυκόλυσης. Οι διεργασίες παραγωγής ενέργειας λαμβάνουν χώρα στα μιτοχόνδρια, που βρίσκονται στο μεσαίο τμήμα της ουράς τους. Στα αραιωτικά ως πηγή ενέργειας χρησιμοποιείται συχνότερα η γλυκόζη, αν και έχουν δοκιμαστεί και άλλα σάκχαρα όπως η γαλακτόζη, η φρουκτόζη, η ριβόζη και η τρεχαλόζη (Gadea, 2003). Το pη του εκσπερματίσματος, είναι περίπου 7,4 ± 0,2, παρόμοιο με αυτό άλλων σωματικών υγρών. Ο γλυκολυτικός μεταβολισμός των σπερματοζωαρίων (η γλυκόζη είναι ο βασικός υδατάνθρακας) οδηγεί σε μείωση του ενδοκυτταρικού pη και κατ επέκταση σε καταστολή του μεταβολισμού και της κινητικότητάς τους. Το γαλακτικό οξύ είναι ο κύριος μεταβολίτης της διαδικασίας αυτής και έχει χρησιμοποιηθεί ως δείκτης της ποιότητας του σπέρματος. Η προσθήκη ρυθμιστικών παραγόντων στα αραιωτικά έχει ως στόχο τον έλεγχο του pη κατά το χρόνο συντήρησης. Ως τέτοιοι 11

13 παράγοντες χρησιμοποιούνται συνήθως το διττανθρακικό και το κιτρικό νάτριο, τα οποία, όμως, έχουν μειωμένη ρυθμιστική ικανότητα (Gadea, 2003). Σε κάποια αραιωτικά χρησιμοποιείται και το χλωριούχο κάλιο (Boonkusol et al., 2010). Περισσότερο σύνθετα ρυθμιστικά διαλύματα που μπορούν να ελέγξουν αποτελεσματικότερα τις διακυμάνσεις του pη είναι τα TES, Tris, Hepes, και MOPS, και μάλιστα τα δύο τελευταία δρουν ανεξαρτήτως θερμοκρασίας. Το pη των αραιωτικών συνήθως κυμαίνεται μεταξύ 6,8 και 7,2, αλλά πρέπει να ληφθεί υπόψη, ότι δεν σταθεροποιείται, παρά μόνο λεπτά μετά από τη διάλυσή τους στο νερό. Έτσι, απαιτείται έλεγχος μετά την ολοκλήρωση της προετοιμασίας του αραιωτικού, και πριν από την προσθήκη του στο σπέρμα, ώστε να αποφευχθούν επιζήμιες επιδράσεις. Το εκσπερμάτισμα του κάπρου έχει οσμωτική πίεση mosm, αλλά η κινητικότητα και η ζωτικότητα των σπερματοζωαρίων παραμένουν ανεπηρέαστες σε εύρος οσμωτικής πίεσης μεταξύ 250 και 300 mosm. Η κινητικότητά τους μειώνεται σημαντικά σε τιμές κάτω από 200 mosm. Με ισότονα ή ελαφρά υπέρτονα (300 mosm) αραιωτικά επιτυγχάνονται τα καλύτερα αποτελέσματα σε συνθήκες εμπορικής χρήσης. Για τη ρύθμιση της οσμωτικής πίεσης, χρησιμοποιούνται κυρίως άλατα ανόργανων ιόντων, όπως χλωριούχο νάτριο και κάλιο (Gadea, 2003). Αναφέρεται ότι η ιοντική ισχύς του αραιωτικού, πιθανώς δεν είναι πρωταρχικής σημασίας για το σπέρμα του κάπρου, όπου η οσμωτικότητα διατηρείται από τα μη ιοντικά συστατικά, όπως η γλυκόζη (Boonkusol et al., 2010). Φυσιολογικά, οι όρχεις και οι επικουρικοί αδένες ενός υγιούς κάπρου είναι απαλλαγμένοι από βακτήρια. Επομένως, η επιμόλυνση του εκσπερματίσματος συνήθως συμβαίνει κατά τη συλλογή του και κατά την επεξεργασία του σπέρματος. Η προσθήκη ενός αντιβιοτικού στο αραιωτικό είναι απαραίτητη, από τη στιγμή που τα συστατικά (γλυκόζη) και η θερμοκρασία στην οποία συντηρείται το αραιωμένο σπέρμα (15-16 C) προάγουν την ανάπτυξη των περισσότερων Gram - βακτηρίων (συμπεριλαμβανομένης της Escherichia coli και ορισμένων ειδών Salmonella και Pseudomonas). Η βακτηριδιακή επιμόλυνση οδηγεί σε μια σειρά μεταβολών που συμπεριλαμβάνουν τη μείωση της κινητικότητας του σπέρματος, τη συγκόλληση των σπερματοζωαρίων και τη δημιουργία συσσωματωμάτων, την αύξηση του 12

14 ποσοστού των βλαβών του ακροσώματός τους και την πτώση του pη (5,7-6,4). Όλοι αυτοί οι παράγοντες μειώνουν το χρόνο συντήρησης του σπέρματος, ενώ παράλληλα, αυξάνεται και ο κίνδυνος μετάδοσης νοσημάτων με τη σπερματέγχυση. Η προσθήκη ενός αντιβιοτικού σε κατάλληλη συγκέντρωση, συμβάλλει στη διασφάλιση της ποιότητας του σπέρματος. Αρχικά, στα αραιωτικά χρησιμοποιήθηκε συνδυασμός πενικιλίνης-στρεπτομυκίνης (1g L -1 ). Αργότερα, χρησιμοποιήθηκαν αμινογλυκοσίδες (γενταμυκίνη, νεομυκίνη και καναμυκίνη), σε συγκεντρώσεις περίπου 200mg L -1. Πρόσφατα, χρησιμοποιήθηκαν και αντιβιοτικά νέων γενεών όπως κεφτιοφούρη, απραμυκίνη κ.ά., παρόλο που δεν υπάρχουν ακόμα επιβεβαιωμένα αποτελέσματα για το κατά πόσο υπερέχουν έναντι των προηγούμενων (Gadea, 2003). Τα κριτήρια χρήσης αντιβιοτικών στα αραιωτικά καθορίζονται από δύο παγκόσμιους οργανισμούς αναφοράς: το Διεθνές Γραφείο Επιζωοτιών (ΟΙΕ), και την Ευρωπαϊκή Ένωση. Στον Παγκόσμιο Κώδικα Υγείας των Ζώων, ο ΟΙΕ ορίζει ότι αραιωτικά που περιέχουν γάλα, αλβουμίνη αυγού ή άλλη πρωτεΐνη ζωικής προέλευσης, θα πρέπει να είναι απαλλαγμένα από βακτήρια ή αποστειρωμένα. Η προσθήκη αντιβιοτικών επιτρέπεται, με την προϋπόθεση ότι διαθέτουν τα αντίστοιχα διεθνή κτηνιατρικά πιστοποιητικά. Η οδηγία 90/429/CEE της Ευρωπαϊκής Ένωσης, η οποία ρυθμίζει τις πολιτικές για την υγεία που εφαρμόζονται κατά την ανταλλαγή μεταξύ κρατών μελών και κατά την εισαγωγή σπέρματος κάπρου, ορίζει τη χρήση ενός συνδυασμού αντιβιοτικών τα οποία πρέπει να είναι αποτελεσματικά, ιδιαίτερα κατά των λεπτοσπιροχαιτών και των μυκοπλασμάτων. Η συγκέντρωσή τους, θα πρέπει να είναι ανάλογης αποτελεσματικότητας με εκείνη των 500 UI ml -1 στρεπτομυκίνης, ή 500 UI ml -1 πενικιλίνης, ή 150mg ml -1 λινγκομυκίνης ή 300mg ml -1 σπεκτινομυκίνης. Ο κανονισμός αυτός, ορίζει επίσης, ότι αμέσως μετά την προσθήκη των αντιβιοτικών, το αραιωμένο σπέρμα πρέπει να παραμείνει κατ ελάχιστο σε θερμοκρασία 15 C για 45 λεπτά προτού χρησιμοποιηθεί (Gadea, 2003) Κατηγορίες αραιωτικών Τα αραιωτικά του σπέρματος του κάπρου, κατατάσσονται σε 3 κατηγορίες: βραχείας (1-2 ημέρες), μέσης (3-4 ημέρες) και μακράς (7-12 ημέρες) διάρκειας συντήρησης από το χρόνο της σπερματοληψίας (Knox, 2011, Boonkusol et al., 2010). 13

15 Τα αραιωτικά των δύο πρώτων κατηγοριών χρησιμοποιούνται κυρίως σε δίκτυα διακίνησης σπέρματος μικρών αποστάσεων. Τέτοια είναι τα Ευρωπαϊκά συστήματα στα οποία συνήθως η επεξεργασία, η διακίνηση και η χρησιμοποίηση του σπέρματος γίνονται εντός της ίδιας της εκτροφής. Αραιωτικά της τρίτης κατηγορίας χρησιμοποιούνται σε συγκεκριμένα προγράμματα χωρών, όπως οι ΗΠΑ και η Νορβηγία, όπου η σπερματοληψία λαμβάνει χώρα σε μεγάλη απόσταση από το σημείο της εφαρμογής της τεχνητής σπερματέγχυσης (Gadea, 2003). Τα αραιωτικά μακράς διάρκειας, είναι πιο πλούσια σε ρυθμιστικούς παράγοντες και αντιοξειδωτικά, συγκριτικά με τα μέσης και βραχείας διάρκειας (Kaeoket et al., 2010). Επιπλέον, έχουν μικρότερο ph ( ~ 6,8) έναντι αυτού των αραιωτικών βραχείας διάρκειας ( ~ 7,2) (Gadea, 2003). Στα πλεονέκτημα της χρήσης αραιωτικών μακράς διάρκειας, εκτός από εκείνο της μεταφοράς σε μακρινούς προορισμούς είναι και η δυνατότητα διάθεσης χρόνου για τη διεξαγωγή εξειδικευμένων διαγνωστικών δοκιμών για την πλήρη ανάλυση της ποιότητας του σπέρματος πριν από τη χρήση του, όπως π.χ. η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) για την ανίχνευση της παρουσίας ιών. Τέλος, δίνουν τη δυνατότητα καλύτερης οργάνωσης των χειρισμών στα κέντρα σπερματοληψίας (Gadea, 2003). Εντούτοις, οι Johnson et al., (2000) αναφέρουν ότι η αποθήκευση του σπέρματος για μεγάλο χρονικό διάστημα πριν από τη γονιμοποίηση, οδηγεί σε μείωση της βιωσιμότητας των σπερματοζωαρίων στο γεννητικό σωλήνα του θηλυκού, και ως εκ τούτου, απαιτείται μεγάλη προσοχή στο χρόνο και στην ορθή εφαρμογή της Τεχνητής Σπερματέγχυσης, καθώς και στην επάρκεια και την αξιοπιστία του αραιωτικού μέσου. Η σωστή αραίωση αποτελεί ένα κρίσιμο σημείο για την επιτυχία της Τεχνητής Σπερματέγχυσης. Μικρή αραίωση και συνεπώς πολύ μεγάλος αριθμός σπερματοζωαρίων στην τελική δόση μπορεί να μειώσει τη ζωτικότητα του σπέρματος κατά τη συντήρηση. Αυτό μπορεί να οφείλεται στην παραγωγή μεγαλύτερων ποσοτήτων τοξικών προϊόντων, εξαιτίας του μεγαλύτερου αριθμού των μεταβολικών υποπροϊόντων. Αντίθετα, η υπερβολική αραίωση του εκσπερματίσματος, έχει ως αποτέλεσμα χαμηλά ποσοστά γονιμότητας, λόγω του σημαντικά μικρότερου αριθμού των σπερματοζωαρίων σε κάθε δόση 14

16 σπερματέγχυσης (Knox, 2011). Επομένως, πρέπει πάντα να γίνονται σεβαστοί οι κανόνες αραίωσης του σπέρματος σε ό,τι αφορά στην τελική συγκέντρωση των σπερματοζωαρίων ανά δόση σπερματέγχυσης που για το χοίρο προσδιορίζονται στα 2,5-3 x 10 9 σπερματοζωάρια Κόστος αραιωτικών Σε γενικές γραμμές, το κόστος που σχετίζεται με τα αραιωτικά αλλά και τα υπόλοιπα υλικά και το προσωπικό που απαιτείται για τη διάγνωση του οίστρου, τη σπερματοληψία και τη σπερματέγχυση υπολείπεται σημαντικά του κόστους διατήρησης κάπρων για τη γονιμοποίηση των χοιρομητέρων με φυσική οχεία. Επιπλέον, η αύξηση της δαπάνης επιλογής του μέσου αραίωσης θα ήταν αμελητέα συνυπολογίζοντας το πιθανό όφελος από την αύξηση στα ποσοστά σύλληψηςτοκετών και στο μέγεθος των τοκετοομάδων. Η διάδοση της εφαρμογής της ΤΣ του χοίρου οδήγησε στην ανάπτυξη της σχετικής αγοράς, στην εμφάνιση νέων εταιριών και στην αύξηση των προσφερόμενων προϊόντων. Κατ αυτό τον τρόπο αναπτύχθηκε μια νέα εμπορική δραστηριότητα, που αφορά στα αραιωτικά, με πληθώρα προϊόντων και έντονο ανταγωνισμό. Σε γενικές γραμμές, τα αραιωτικά μακράς διάρκειας, λόγω των ιδιαίτερων απαιτήσεων για την παρασκευή τους και του υψηλότερου κόστους των συστατικών τους (Tris, BSA κλπ.), διατίθενται σε υψηλότερες τιμές από τα βραχείας και μέσης διάρκειας (Gadea, 2003) Στόχος της μελέτης Είναι γνωστό ότι η εκτίμηση των ποιοτικών χαρακτηριστικών κατά τον εργαστηριακό έλεγχο του σπέρματος αποτελεί προγνωστικό δείκτη της in vivo γονιμότητας. Στη διεθνή βιβλιογραφία υπάρχουν μελέτες της επάρκειας διαφόρων αραιωτικών, που βασίζονται κυρίως στην εκτίμηση των βασικών χαρακτηριστικών του σπέρματος, με ποικίλα αποτελέσματα. Απουσιάζει όμως η συγκριτική μελέτη της επάρκειας των αραιωτικών διαφορετικού χρόνου συντήρησης στο εργαστήριο και σε πραγματικές συνθήκες εκτροφής. Επιπλέον, δεν υπάρχουν επαρκή δεδομένα ως προς την αποτελεσματικότητα της σπερματέγχυσης 1-2 ημέρες από τη συλλογή και την 15

17 αραίωση του σπέρματος με αραιωτικά μακράς διάρκειας. Δεδομένου ότι τα αραιωτικά αυτής της κατηγορίας οφείλουν να διατηρούν τα ποιοτικά χαρακτηριστικά του σπέρματος σε αποδεκτά επίπεδα για μεγάλο χρονικό διάστημα (για 5-7 ή ακόμη και για 10 ημέρες), η λογική της χρήσης τους βρίσκεται στην εφαρμογή σπερματέγχυσης σε χρόνους πέρα από εκείνους που επιτυγχάνονται με βραχείας ή μέσης διάρκειας αραιωτικά. Υπάρχουν όμως αναπάντητα ερωτήματα όπως το κατά πόσο πλεονεκτούν έναντι των μικρότερης διάρκειας αραιωτικών ως προς τις ελεγχόμενες εργαστηριακά παραμέτρους του σπέρματος στην αρχή του χρόνου συντήρησης. Εάν η απάντηση είναι θετική, είναι βέβαιο ότι θα πλεονεκτούσαν και ως προς τα αποτελέσματα της σπερματέγχυσης σε συμβατικό χρόνο 1-2 ημερών από την αραίωση; Η μεγαλύτερη επιβράδυνση του μεταβολισμού, συγκριτικά με τα βραχύτερης συντήρησης μέσα πως εκφράζεται εντός του γενετικού σωλήνα του θηλυκού; Στην προσιτή σε εμάς βιβλιογραφία δεν εντοπίστηκαν δεδομένα για την αποτελεσματικότητα σπερματεγχύσεων με χρήση αραιωτικών μακράς διάρκειας, τις πρώτες ημέρες μετά την επεξεργασία του σπέρματος. Στόχος της παρούσας μελέτης, είναι η σύγκριση της επίδρασης τριών αραιωτικών, με διαφορετικούς προτεινόμενους χρόνους συντήρησης, δηλαδή βραχείας, μέσης και μακράς διάρκειας, τόσο στην ποιότητα του σπέρματος όσο και στην in vivo γονιμότητα του χοίρου, μετά από συγκεκριμένο χρόνο συντήρησης του σπέρματος (3 ημέρες). Η μελέτη βασίστηκε στην εκτίμηση της επίδρασης των αραιωτικών στην κινητικότητα, τη ζωτικότητα, τη μορφολογία και την ακεραιότητα του DNA των σπερματοζωαρίων, μετά την αραίωση κλασμάτων κάθε εκσπερματίσματος με καθένα από τα τρία ελεγχόμενα αραιωτικά μέσα. Επιπλέον, δόσεις σπέρματος που προέκυψαν από την όλη διαδικασία, πέρα από τον εργαστηριακό έλεγχο, χρησιμοποιήθηκαν για συμβατική διπλή ενδοτραχηλική σπερματέγχυση σε χοιρομητέρες. Από την καταγραφή και αξιολόγηση των αναπαραγωγικών δεικτών προέκυψαν συμπεράσματα ως προς την in vivo γονιμότητα. 16

18 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Προέλευση βιολογικών υλικών Τα δείγματα σπέρματος της παρούσας μελέτης συλλέχθηκαν από 7 κάπρους χοιροτροφικής εκμετάλλευσης της Βόρειας Ελλάδας, δυναμικότητας 700 συών. Από κάθε κάπρο συλλέχθηκαν συνολικά 20 εκσπερματίσματα που λαμβάνονταν ανά εβδομάδα, κατά την περίοδο Μαρτίου-Ιουνίου 2012 (συνολική διάρκεια 4 μηνών). Οι κάπροι στεγάζονταν σε ατομικά κελιά εμβαδού 8 m 2, σε χωριστό θάλαμο, υπό ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκρασίας (15-25 C), υγρασίας και αερισμού. Τα κελιά διέθεταν παροχή νερού ad libitum και οι κάπροι διατρέφονταν με ισορροπημένο σιτηρέσιο σύμφωνα με τα διεθνώς αποδεκτά δεδομένα (Nutrients Requirements of Swine, 1998) Συλλογή και αραίωση του σπέρματος Στο δίωρο που προηγείτο της σπερματοληψίας, γινόταν η προετοιμασία των αραιωτικών που επιλέχθηκαν (βραχείας-bio, μέσης-optimia και μακράς-duragen διάρκειας) με βάση τις προδιαγραφές της προμηθεύτριας εταιρίας (Magapor ) ως ακολούθως: - Επιλογή του αραιωτικού και ζύγιση ποσότητας 50 gr - Προσθήκη της βάσης σε 1 λίτρο δισαπεσταγμένο προθερμασμένο νερό (30 C) - Ανάδευση μέχρι την πλήρη διάλυση και ομογενοποίηση των υλικών. Η σπερματοληψία γινόταν από έμπειρο ζωοτέχνη της εκτροφής, με τη μέθοδο του «γαντοφορεμένου χεριού», από τους επιλεγμένους κάπρους που είχαν εκπαιδευτεί να επιβαίνουν σε ομοίωμα συός. Το πρώτο κλάσμα του σπέρματος, υδαρές και φτωχό σε σπερματοκύτταρα, απορριπτόταν. Το δεύτερο κλάσμα, πλούσιο σε σπερματοζωάρια, συλλεγόταν σε ισοθερμικό δοχείο, το στόμιο του οποίου καλυπτόταν από φίλτρο για τη συγκράτηση του τρίτου, ζελατινώδους κλάσματος το οποίο επίσης απορριπτόταν. Μετά το πέρας της σπερματοληψίας το συλλεχθέν 2 ο 17

19 κλάσμα μεταφερόταν, σε γυάλινο προθερμασμένο δοχείο (37 C), στο εργαστήριο της εκτροφής. Στο εργαστήριο, γινόταν αρχική εκτίμηση της ζωτικότητας και της κινητικότητας του σπέρματος με τη βοήθεια οπτικού μικροσκοπίου που έφερε θερμαινόμενη τράπεζα, υπό μεγέθυνση x20 και ακολουθούσε ο υπολογισμός της πυκνότητας του με τη χρήση φωτόμετρου (MiniTub, Germany). Αμέσως μετά το εκσπερμάτισμα χωριζόταν σε 3 ίσα κλάσματα ως προς τον όγκο του και γινόταν η αραίωση του κάθε μέρους με αραιωτικό διαφορετικών προδιαγραφών συντήρησης, σε θερμοκρασία 30 C (ελεγχόταν συνεχώς με τη βοήθεια θερμομέτρου υδραργύρου) μέχρι να επιτευχθεί τελική συγκέντρωση 30Χ10 6 σπερματοζωαρίων/ml. Ακολουθούσε νέα μικροσκοπική εκτίμηση της ζωτικότητας και της κινητικότητας του σπέρματος, για τη διασφάλιση της ορθής διαδικασίας αραίωσης. Το τελικό προϊόν συσκευαζόταν σε φιαλίδια σπερματέγχυσης όγκου 100ml. Μία δόση αραιωμένου σπέρματος με κάθε ένα από τα τρία διαφορετικά αραιωτικά μεταφερόταν στο εργαστήριο της βιοτεχνολογίας αναπαραγωγής της Κλινικής Παραγωγικών Ζώων, εντός μιας (1) ώρας, σε συνθήκες ελεγχόμενης θερμοκρασίας (16-18 C). Οι υπόλοιπες δόσεις (και για τα 3 αραιωτικά του πειραματισμού) χρησιμοποιούνταν για τη γονιμοποίηση των συών της εκτροφής Εφαρμογή ΤΣ στη χοιροτροφική εκμετάλλευση Ο έλεγχος των συών για την εκδήλωση οίστρου γινόταν ανά 24ωρο με χρήση κάπρου ανιχνευτή. Οι σύες που εμφάνιζαν οίστρο, εξαιρουμένων των πρωτοτόκων, ταξινομούνταν ανά εβδομάδα, σε 3 ομοιογενείς, κατά το δυνατόν, ομάδες (30 σύες ανά ομάδα) με βάση την ηλικία (μεταξύ 20 και 36 μηνών) και τον αριθμό των προηγούμενων τοκετών ( 2). Κάθε ζώο, ανάλογα με την ομάδα στην οποία ταξινομήθηκε, υποβαλλόταν σε σπερματέγχυση στο χρόνο πρώτης ανίχνευσης του οίστρου καθώς και μετά από 24 ώρες με σπέρμα του ιδίου κάπρου, αραιωμένου με ένα από τα τρία αραιωτικά που χρησιμοποιήθηκαν. Οι σύες των τριών ομάδων παρακολουθούνταν ως προς α) το ποσοστό των τοκετών και β) τον αριθμό των ζωντανών γεννηθέντων χοιριδίων. 18

20 2.4. Εργαστηριακή εξέταση του σπέρματος Χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω αντιδραστήρια υψηλής καθαρότητας από αξιόπιστες εμπορικές εταιρείες: - Εωσίνη (Eosin, 32617, Riedel-de Haen, Sigma Aldrich, Seelze, Germany) - Νιγροσίνη (Nigrosin, , Aldrich, Milwaukee, USA) - Πορτοκαλόχρουν της ακριδίνης (Acridine orange, A6014, Sigma Aldrich, Seelze, Germany) - SpermBlue (SpermBlue, 08029, Microptic S.L., Automatic Diagnostic Systems, Barcelona, Spain) Χρησιμοποιηθήκαν τα παρακάτω εργαστηριακά όργανα: - Αυτόματος Αναλυτής: Sperm Class Analyzer, Microptic S.L., Automatic Diagnostic Systems, Barcelona, Spain - Μικροσκόπιο: Microscope ZEIZZ, AXIO, Scope A1, Germany Εργαστηριακές δοκιμές Στο εργαστήριο βιοτεχνολογίας αναπαραγωγής της ΚΠΖ τα δείγματα αραιωμένου σπέρματος συντηρούνταν για τρεις (3) ημέρες σε θερμοκρασία C. Την πρώτη και την τρίτη ημέρα λαμβάνονταν κλάσματα σπέρματος αραιωμένου σε βραχείας, μέσης και μακράς διάρκειας αραιωτικό, όγκου 1,5ml, τοποθετούνταν σε φιαλίδια τύπου eppendorf, και θερμαίνονταν για 2 λεπτά σε υδατόλουτρο στους 30 C προκειμένου να πραγματοποιηθεί εκτίμηση της κινητικότητας, της μορφολογίας, της ζωτικότητας και της ακεραιότητας της χρωματίνης του πυρήνα (DNA) των σπερματοζωαρίων Εκτίμηση παραμέτρων της κινητικότητας και των επί μέρους κινήσεων των σπερματοζωαρίων 19

21 Για την εκτίμηση της κινητικότητας, χρησιμοποιήθηκε αυτόματος αναλυτής σπέρματος, υποβοηθούμενος από ηλεκτρονικό υπολογιστή (Computer Assisted Semen Analysis, CASA). Τα βήματα που ακολουθήθηκαν ήταν τα ακόλουθα: - Ήπια ανάδευση του περιεχομένου κάθε φιαλιδίου (eppendorf) για την ομογενοποίηση του αραιωμένου σπέρματος - Λήψη 10 μl δείγματος σπέρματος, τοποθέτησή τους στο κέντρο της επιφάνειας προθερμασμένης πλάκας Makler, στους 37 C, κάλυψη με καλυπτρίδα και ήπια άσκηση πίεσης, έτσι ώστε το δείγμα να καταλάβει όλη την επιφάνεια της πλάκας, χωρίς τη δημιουργία φυσαλίδων - Ρύθμιση των παραμέτρων ελέγχου του συστήματος CASA ως εξής: 10 πεδία και >500 σπερματοζωάρια, 25 εικόνες/δευτερόλεπτο, περιοχή ελέγχου σωματιδίων microns, προοδευτική κίνηση >45% της παραμέτρου STR, κυκλοτερής κίνηση <50% LIN, βάθος πεδίου 10 μm και θερμοκρασία της τράπεζας του μικροσκοπίου 37 C. Επομένως για την εκτίμηση της κινητικότητας κάθε δείγματος γινόταν λήψη εικόνων από 4 πεδία, τουλάχιστον, ώστε να καταγραφούν οι κινήσεις 500 ή περισσότερων σπερματοζωαρίων Οι παράμετροι της κινητικότητας των σπερματοζωαρίων που εκτιμούνταν ανά δείγμα ήταν οι ακόλουθες: - Ποσοστό σπερματοζωαρίων με ταχεία και ισχυρή προοδευτική κίνηση - Ποσοστό σπερματοζωαρίων με αργή, μη προοδευτική κίνηση - Ποσοστό μη κινούμενων σπερματοζωαρίων Οι επιμέρους μορφές κίνησης των σπερματοζωαρίων που εκτιμούνταν ανά δείγμα ήταν οι ακόλουθες: - Η μέση ταχύτητα της ελικοειδούς πορείας των κινούμενων σπερματοζωαρίων, VCL (curvilinear velocity) - Η μέση ταχύτητα της κίνησης των σπερματοζωαρίων σε ευθεία, κατά τη μετάβαση τους από το σημείο εκκίνησης έως το σημείο τερματισμού (σε μm/s), VSL (straight line velocity) 20

22 - Η μέση προωθητική ταχύτητα των σπερματοζωαρίων (σε μm/s), VAP (average path velocity) - Το εύρος της προς τα πλάγια κίνησης των κεφαλών των σπερματοζωαρίων (σε μm), ALH (amplitude of lateral head displacement) - Η συχνότητα διασταύρωσης των κεφαλών των σπερματοζωαρίων με τη μέση νοητή γραμμή κίνησης (σε Hz), BCF (beat cross frequency) - Το ποσοστό των σπερματοζωαρίων που εκδήλωναν υπερκινητικότηταενεργοποίηση (hyperactivation) - Η αναλογία VSL/VAP x 100, STR (straightness) - Η αναλογία VSL/VCL x 100, LIN (linearity) - Η αναλογία VΑΡ/VCL x 100, WOB (wobble) Εικόνα 1: Απεικόνιση της κινητικότητας και των επί μέρους μορφών κίνησης των σπερματοζωαρίων στον αναλυτή CASA. Απεικονίζονται: α) με κόκκινο χρώμα η πορεία των ταχέως κινούμενων σπερματοζωαρίων, β) με πράσινο χρώμα η πορεία των βραδέως κινούμενων σπερματοζωαρίων, γ) με κυανό χρώμα η πορεία των σπερματοζωαρίων χωρίς προοδευτική κίνηση και δ) με κίτρινο χρώμα τα μη κινούμενα σπερματοζωάρια Εκτίμηση της μορφολογίας των σπερματοζωαρίων Η εκτίμηση της μορφολογίας των σπερματοζωαρίων γινόταν μετά από τη χρώση τους με τη μέθοδο SpermBlue. Με την τεχνική αυτή, χρωματίζονται όλα τα επιμέρους τμήματα των σπερματοζωαρίων (ακρόσωμα, κεφαλή, αυχένας, αρχή και τέλος ουράς), σε αποχρώσεις του μπλε διαφορετικής έντασης. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: - Λήψη 10 μl δείγματος σπέρματος, επίστρωση σε αντικειμενοφόρο πλάκα και ξήρανση στον αέρα 21

23 - Τοποθέτηση της αντικειμενοφόρου σε οριζόντια θέση και επικάλυψή της με ποσότητα 0,5-1 ml μονιμοποιητικού διαλύματος, για 10 λεπτά - Τοποθέτηση της αντικειμενοφόρου υπό γωνία 60-80, για την απομάκρυνση της περίσσειας του μονιμοποιητικού διαλύματος - Επανατοποθέτηση της αντικειμενοφόρου σε οριζόντια θέση και επικάλυψή της με 0,45-0,5 ml χρωστικής SpermBlue για 30 λεπτά - Απομάκρυνση της περίσσειας χρωστικής και εμβάπτιση της αντικειμενοφόρου για 3 δευτερόλεπτα σε δοχείο με αποσταγμένο νερό - Τοποθέτηση της αντικειμενοφόρου υπό γωνία 70 και ξήρανση στον αέρα Η εκτίμηση των επιχρισμάτων γινόταν με μικροσκοπική παρατήρηση (μεγέθυνση x 40) και προβολή στην οθόνη του Η/Υ μέσω της κάμερας του αναλυτή (CASA). Καταμετρούνταν 200 σπερματοζωάρια τα οποία κατατάσσονταν σε τρεις κατηγορίες: α) φυσιολογικά, β) με μορφολογικές ανωμαλίες της κεφαλής, του αυχένα και της ουράς και γ) με παρουσία πρωτοπλασματικών σταγονιδίων. Στη συνέχεια υπολογιζόταν η % αναλογία ανά δείγμα. γ β α Εικόνα 2: Μορφολογία σπερματοζωαρίων σε επίχρισμα χρώσης sperm blue: α) φυσιολογικό σπερματοζωάριο, β) σπερματοζωάριο με αναδίπλωση ουράς, γ) σπερματοζωάριο με εξοίδηση της κεφαλής (x 40) Εκτίμηση της ζωτικότητας των σπερματοζωαρίων Η εκτίμηση της ζωτικότητας των σπερματοζωαρίων γινόταν μετά από διπλή χρώση εωσίνης νιγροσίνης σε ένα στάδιο με την ακόλουθη διαδικασία: - Ανάμιξη ίσων όγκων σπέρματος και χρωστικής προθερμασμένων στους 37 C, σε φιαλίδιο eppendorf 22

24 - Επώαση του μίγματος για 3-5 λεπτά, σε υδατόλουτρο 37 C - Λήψη ποσότητας 20 μl και επίστρωσή της σε αντικειμενοφόρο πλάκα με τη βοήθεια καλυπτρίδας, υπό γωνία 45 - Ξήρανση του επιχρίσματος στην επιφάνεια θερμαινόμενης τράπεζας Τα σπερματοζωάρια καθίστανται ευδιάκριτα στο σκοτεινό υπόβαθρο που δημιουργείται από τη νιγροσίνη. Τα ζωντανά δεν χρωματίζονται, με αποτέλεσμα να εμφανίζονται λευκά ενώ τα νεκρά, εξαιτίας της απώλειας της ακεραιότητας της κυτταρικής μεμβράνης τους και της διείσδυσης της χρωστικής χρωματίζονται ροζμωβ. Με τη βοήθεια οπτικού μικροσκοπίου, σε μεγέθυνση x 100 γινόταν εκτίμηση και καταμέτρηση 200 σπερματοζωαρίων και τα αποτελέσματα εκφράζονταν σε αναλογία %. Εικόνα 3: Ζωτικότητα των σπερματοζωαρίων μετά από χρώση εωσίνης-νιγροσίνης. Τα λευκά σπερματοζωάρια είναι ζωντανά, ενώ τα χρωματισμένα ροζ-μωβ είναι νεκρά (x 100) Εκτίμηση της ακεραιότητας του DNA των σπερματοζωαρίων H εκτίμηση της ακεραιότητας της χρωματίνης του πυρήνα των σπερματοζωαρίων (DNA) γινόταν με την εφαρμογή της δοκιμής «Πορτοκαλόχρουν της Ακριδίνης»- Acridine Orange Test (AOT). Το DNA, στην περίπτωση της φυσιολογικής πύκνωσης της χρωματίνης, διατηρεί τη διπλή έλικα και τα σπερματοζωάρια φέρουν φθορίζον πράσινο χρώμα όταν δεσμεύουν ακριδίνη. Αντίθετα όταν η πύκνωση της χρωματίνης δεν είναι φυσιολογική η διπλή έλικα του DNA μεταβάλλεται σε μονή και τα σπερματοζωάρια φέρουν φθορίζον κίτρινο ή πορτοκαλόχρουν ή κόκκινο χρώμα μετά τη δέσμευση της ακριδίνης. Η διαδικασία είχε ως εξής: 23

25 - Ανάμιξη ποσότητας 150 μl από κάθε δείγμα σπέρματος, με 450 μl υποστρώματος Tyrodes (TS) (σύνθεση ανά 100 ml: 0,80 g NaCl, 0,02 g KCl, 0,1 g NaHCO 3, 0,004 g NaH 2 PO 4 H 2 O, 0,02 g CaCl 2, 0,01 g MgCl 2 6H 2 O, 0,1 g γλυκόζης, pη 7,2) και φυγοκέντρηση στα g για 5 λεπτά, σε θερμοκρασία 25 ο C - Απομάκρυνση του υπερκείμενου κλάσματος, προσθήκη 450 μl TS και νέα φυγοκέντρηση - Ανασύσταση του εναιωρήματος σπέρματος με προσθήκη υποστρώματος TS, ώστε να επιτευχθεί τελική συγκέντρωση 30Χ10 6 σπερματοζωαρίων/ml - Λήψη 25 μl από το τελικό εναιώρημα για την παρασκευή επιχρίσματος σε αντικειμενοφόρο πλάκα - Άμεση τοποθέτηση της αντικειμενοφόρου πλάκας σε θερμαινόμενη τράπεζα (37 ο C) για 20 λεπτά, ώστε να στεγνώσει - Μονιμοποίηση του επιχρίσματος με εμβάπτιση σε διάλυμα Carnoys (COS), το οποίο είχε παρασκευαστεί την ίδια ημέρα (σύνθεση: 3 μέρη μεθανόλης και 1 μέρος κρυσταλλικού οξικού οξέος), για 4 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου - Τοποθέτηση της αντικειμενόφόρου πλάκας στην επιφάνεια θερμαινόμενης τράπεζας για 10 λεπτά προκειμένου να στεγνώσει - Εμβάπτιση της αντικειμενόφόρου πλάκας σε διάλυμα πορτοκαλόχρουν της ακριδίνης (ΑΟ), για 5 λεπτά, σε σκοτεινό χώρο, σε θερμοκρασία δωματίου. Το διάλυμα της ακριδίνης ετοιμαζόταν την ίδια ημέρα και προστατευόταν από το φως. [Διάλυμα πορτοκαλόχρουν της ακριδίνης (ΑΟ): Παρασκευή «μητρικού διαλύματος» με προσθήκη 1 g AO σε ml απεσταγμένου νερού. Στη συνέχεια, ανάμιξη 10 ml «μητρικού διαλύματος» ΑΟ με 40 ml διαλύματος κιτρικού οξέος (1,4196 g/100 ml) και 2,5 ml Na 2 HPO 4 (1,92124 g/100 ml). Ρύθμιση του pη του τελικού διαλύματος στο 2,5 και φύλαξη σε σκοτεινό χώρο μέχρι να χρησιμοποιηθεί εντός της ίδιας ημέρας]. Πλύση του επιχρίσματος με 5 διαδοχικές εμβαπτίσεις σε απεσταγμένο νερό, ξήρανση στον αέρα (σε σκοτεινό χώρο) και κάλυψη της αντικειμενοφόρου πλάκας με καλυπτρίδα (24 x 50 mm). Η τελική εκτίμηση γινόταν σε σκοτεινό χώρο με τη βοήθεια οπτικού μικροσκοπίου φθορισμού. Σε μεγέθυνση x 100 και σε 10 διαφορετικά οπτικά πεδία γινόταν 24

26 εκτίμηση και καταμέτρηση 200 σπερματοζωαρίων και τα αποτελέσματα εκφράζονταν σε αναλογία %. Εικόνα 4: Ακεραιότητα της χρωματίνης του πυρήνα (DNA) των σπερματοζωαρίων μετά από χρώση ΑΟΤ (x 100). Πράσινα φθορίζουν τα σπερματοζωάρια με ακέραια χρωματίνη, πορτοκαλί, κίτρινα ή κόκκινα φθορίζουν τα σπερματοζωάρια με διαταραχή της ακεραιότητας της χρωματίνης. 25

27 3. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του προγράμματος Statistical Analysis Systems version 9.0 (SAS Institute Inc., 1996, Cary, N.C., U.S.A.). Η κανονικότητα των δεδομένων ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας το Shapiro-Wilk Test (PROC UNIVARIATE). Οι παράμετροι «μη κινούμενα σπερματοζωάρια, σπερματοζωάρια με αργή-μη προοδευτική κίνηση, σπερματοζωάρια με ισχυρή προοδευτική κίνηση, ταχέως κινούμενα, μέσης ταχύτητας, βραδέως κινούμενα σπερματοζωάρια, VCL, VSL, VAP, LIN, STR, WOB, ALH, BCF» ακολουθούσαν την κανονική κατανομή. Σε ό,τι αφορά στις παραμέτρους «σπερματοζωάρια που εκδηλώνουν υπερκινητικότητα-ενεργοποίηση, φυσιολογικά, μη φυσιολογικά σπερματοζωάρια, σπερματοζωάρια με μορφολογικές ανωμαλίες, ζωτικότητα, ακεραιότητα της χρωματίνης του DNA» έγινε κανονικοποίηση με μετασχηματισμό τετραγωνικής ρίζας. Οι ελάχιστοι τετραγωνικοί μέσοι αναλύθηκαν με τη χρήση ενός Γενικού Γραμμικού Μικτού Μοντέλου (PROC MIXED). Το μοντέλο περιελάμβανε τον τύπο του αραιωτικού (Ο, Bio, Dur), το χρόνο (1 η και 3 η ημέρα) και τις αλληλεπιδράσεις τους ως σταθερές επιδράσεις. Περιελάμβανε επίσης, τον κάπρο και τον αριθμό του εκσπερματίσματος «ενσωματωμένο» στον κάπρο και το χρόνο, ως τυχαίες επιδράσεις. Οι ελάχιστοι τετραγωνικοί μέσοι λήφθηκαν για κάθε κατηγορία παραγόντων, και συγκρίθηκαν με τη χρήση του Least Significant Different Test (LSD) με την προσαρμογή των Tukey-Kramer για πολλαπλές συγκρίσεις. Η ίδια μέθοδος στατιστικής ανάλυσης χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση του μεγέθους της τοκετοομάδας συμπεριλαμβάνοντας τον τύπο του αραιωτικού, τον κάπρο και την αλληλεπίδρασή τους. Τα ποσοστά εγκυμοσύνης μεταξύ των τύπων των αραιωτικών και των κάπρων συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας τον έλεγχο του x 2 και το Fisher s Exact Test (PROC FREQ). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (SEM). Ως στατιστικά σημαντικές ορίστηκαν οι διαφορές p<0,05 και ως τάση όταν 0,10 p 0,05. 26

28 Ποσοστό μη κινούμενων σπ/ρίων 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Tο ποσοστό των μη κινούμενων σπερματοζωαρίων αυξήθηκε σημαντικά μεταξύ 1 ης και 3 ης ημέρας, στα αραιωτικά Optimia (μέσης διάρκειας) και Bio (βραχείας διάρκειας) (p=0,008 και p=0,005, αντίστοιχα), ενώ παρέμεινε σχετικά σταθερό στο αραιωτικό Duragen (μακράς διάρκειας). Tην 3 η ημέρα μετά την αραίωση, το ποσοστό των μη κινούμενων σπερματοζωαρίων διέφερε μεταξύ των αραιωτικών Bio και Duragen (p=0,02) και έτεινε να διαφέρει μεταξύ των αραιωτικών Optimia και Duragen (p=0,07) (γράφημα 1). Επίσης, υπήρχε τάση (p=0,07) για διαφορετική επίδραση του χρόνου στα τρία αραιωτικά. 70,00 60,00 50,00 β,1 β,1,2 40,00 30,00 α α,2 O bio 20,00 dur 10,00 0,00 1 Ημέρες 3 α,β Διαφορετικοί εκθέτες ανά αραιωτικό και μεταξύ χρονικών σημείων υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05). 1,2 Διαφορετικοί εκθέτες ανά χρονικό σημείο και μεταξύ αραιωτικών υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05). Γράφημα 1: Ποσοστό των μη κινούμενων σπερματοζωαρίων στα τρία αραιωτικά την 1 η και την 3 η ημέρα της μελέτης. Tο ποσοστό των σπερματοζωαρίων με ισχυρή προοδευτική κίνηση μειώθηκε σημαντικά μεταξύ 1 ης και 3 ης ημέρας στο αραιωτικό Bio (p=0,03), ενώ υπήρξε ανάλογη τάση και στο αραιωτικό Optimia (p=0,05). Την 3 η ημέρα παρατηρήθηκε μεγαλύτερο ποσοστό σπερματοζωαρίων με ισχυρή προοδευτική κίνηση στο 27

29 Ποσοστό σπερμ/ρίων με ισχυρή προοδευτική κίνηση αραιωτικό Duragen συγκριτικά τόσο με το αραιωτικό Bio (p=0,006) όσο και με το αραιωτικό Optimia (p=0,02) (γράφημα 2). Και εδώ ο χρόνος έτεινε να επιδρά διαφορετικά στα τρία αραιωτικά (p=0,09). 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 α α,1 1 Ημέρες 3 α,2 β,2 O bio dur α,β Διαφορετικοί εκθέτες ανά αραιωτικό και μεταξύ χρονικών σημείων υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05) 1,2 Διαφορετικοί εκθέτες ανά χρονικό σημείο και μεταξύ αραιωτικών υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05). Γράφημα 2: Ποσοστό των σπερματοζωαρίων με ισχυρή προοδευτική κίνηση στα τρία αραιωτικά την 1 η και την 3 η ημέρα της μελέτης. Το ποσοστό των ταχέως κινούμενων σπερματοζωαρίων μειώθηκε σημαντικά μεταξύ 1 ης και 3 ης ημέρας στο αραιωτικό Optimia (p=0,008). Επίσης, την 3 η ημέρα, το ποσοστό των ταχέως κινούμενων σπερματοζωαρίων, ήταν μεγαλύτερο στο αραιωτικό Duragen συγκριτικά με το Optimia (p=0,03). Για τη συγκεκριμένη παράμετρο, ο χρόνος επέδρασε διαφορετικά στις τρεις ομάδες (p=0,009) (γράφημα 3). 28

30 Ποσοστό μέσης ταχύτητας σπερμ/ζωαρίων Ποσοστό ταχέως κινούμενων σπερμ/ρίων 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 α α,1 α,1,2 β,2 O bio dur 5,00 0,00 1 Ημέρες 3 Χρόνος Χ Αραιωτικό p=0,0087 α,β Διαφορετικοί εκθέτες ανά αραιωτικό και μεταξύ χρονικών σημείων υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05) 1,2 Διαφορετικοί εκθέτες ανά χρονικό σημείο και μεταξύ αραιωτικών υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05). Γράφημα 3: Ποσοστό των ταχέως κινούμενων σπερματοζωαρίων στα τρία αραιωτικά την 1 η και την 3 η ημέρα της μελέτης. Το ποσοστό των σπερματοζωαρίων που κινούνταν με μέση ταχύτητα μειώθηκε σημαντικά στο χρονικό διάστημα που μεσολάβησε μεταξύ 1 ης και 3 ης ημέρας στο αραιωτικό Bio (p=0,0001). Την 3 η ημέρα, τα μέσης ταχύτητας σπερματοζωάρια, ήταν σημαντικά περισσότερα στο αραιωτικό Duragen, σε σχέση με το αραιωτικό Bio (p=0,03.) (γράφημα 4), και υπήρχε τάση (p=0,06) για διαφορετική επίδραση του χρόνου στα τρία αραιωτικά. 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 α α,1 α,1,2 β,2 O bio dur 5,00 0,00 1 Ημέρες 3 29

31 VCL α,β Διαφορετικοί εκθέτες ανά αραιωτικό και μεταξύ χρονικών σημείων υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05) 1,2 Διαφορετικοί εκθέτες ανά χρονικό σημείο και μεταξύ αραιωτικών υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05). Γράφημα 4: Ποσοστό των μέσης ταχύτητας σπερματοζωαρίων στα τρία αραιωτικά την 1 η και την 3 η ημέρα της μελέτης. Η μέση ταχύτητα της ελικοειδούς πορείας των κινούμενων σπερματοζωαρίων (VCL) μειώθηκε στο αραιωτικό Optimia την 3 η ημέρα, συγκριτικά με την 1 η ημέρα (p=0,01). Την 3 η ημέρα, η VCL έτεινε να είναι μεγαλύτερη στο αραιωτικό Duragen, σε σχέση με το αραιωτικό Optimia (p=0,006) (γράφημα 5). Στο γράφημα φαίνεται επίσης, πως ο χρόνος επέδρασε με διαφορετικό τρόπο στις τρεις ομάδες του πειραματισμού (p=0,01). 50,00 45,00 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 α 1 3 Ημέρες α α β Χρόνος Χ Αραιωτικό P=0,0138 O bio dur α,β Διαφορετικοί εκθέτες ανά αραιωτικό και μεταξύ χρονικών σημείων υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05). Γράφημα 5: H VCL στα τρία αραιωτικά την 1 η και την 3 η ημέρα της μελέτης. Η μέση ταχύτητα της κίνησης των σπερματοζωαρίων σε ευθεία, κατά τη μετάβαση τους από το σημείο εκκίνησης έως το σημείο τερματισμού (VSL), μειώθηκε σημαντικά στο αραιωτικό Optimia, μεταξύ 1 ης και 3 ης ημέρας (p=0,03), ενώ έτεινε να μειωθεί και στο αραιωτικό Bio (p=0,08). Την 3 η ημέρα η ίδια παράμετρος είχε σημαντικά μεγαλύτερη τιμή στο αραιωτικό Duragen, συγκριτικά με τα αραιωτικά Optimia (p=0,004) και Bio (p=0,002) (γράφημα 6). 30

32 VAP VSL 25,00 20,00 15,00 10,00 α α,1 β,2 α,2 O bio dur 5,00 0,00 1 Ημέρες 3 α,β Διαφορετικοί εκθέτες ανά αραιωτικό και μεταξύ χρονικών σημείων υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05) 1,2 Διαφορετικοί εκθέτες ανά χρονικό σημείο και μεταξύ αραιωτικών υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05). Γράφημα 6: H VSL στα τρία αραιωτικά την 1 η και την 3 η ημέρα της μελέτης. Όπως διαπιστώθηκε η διαφορά της μέσης προωθητικής ταχύτητας των σπερματοζωαρίων (VAP) μεταξύ 1 ης και 3 ης ημέρας μειώθηκε σημαντικά στο αραιωτικό Optimia (p=0,005). Παράλληλα, η VAP, την 3 η ημέρα, ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στο αραιωτικό Duragen σε σχέση με τα αραιωτικά Optimia (p=0,007) και Bio (p=0,02). Τέλος διαπιστώθηκε ότι για τη συγκεκριμένη παράμετρο, ο χρόνος επέδρασε διαφορετικά στις τρεις ομάδες (p=0,03) (γράφημα 7). 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 α α,1 α,2 β,2 O bio dur 5,00 0,00 1 Ημέρες 3 Χρονος Χ Αραιωτικό p=0,

33 WOB α,β Διαφορετικοί εκθέτες ανά αραιωτικό και μεταξύ χρονικών σημείων υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05) 1,2 Διαφορετικοί εκθέτες ανά χρονικό σημείο και μεταξύ αραιωτικών υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05). Γράφημα 7: H VAP στα τρία αραιωτικά την 1 η και την 3 η ημέρα της μελέτης. H αναλογία VΑΡ/VCL x 100 (WOB), διέφερε την 3 η ημέρα μεταξύ των αραιωτικών Bio και Duragen (p=0,03) και έτεινε να μειωθεί σημαντικά την 3 η ημέρα συγκριτικά με την 1 η στο αραιωτικό Bio (p=0,09) (γράφημα 8). 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 1 Ημέρες 3 1 1,2 2 O bio dur 1,2 Διαφορετικοί εκθέτες ανά χρονικό σημείο και μεταξύ αραιωτικών υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05). Γράφημα 8: H WOB στα τρία αραιωτικά την 1 η και την 3 η ημέρα της μελέτης. Το ποσοστό των φυσιολογικών σπερματοζωαρίων μειώθηκε μεταξύ 1 ης και 3 ης ημέρας στα αραιωτικά Bio και Duragen (p<0,0001 και p=0,0004, αντίστοιχα), ενώ και στο Optimia παρατηρήθηκε τάση μείωσης (p=0,07). Επίσης διαπιστώθηκε σημαντική διαφορά στο ποσοστό των φυσιολογικών σπερματοζωαρίων στα αραιωτικά Optimia και Bio την 3 η ημέρα συντήρησης (p=0,003) (γράφημα 9). 32

34 Ποσοστό μη φυσιολογικών σπερματοζωαρίων Ποσοστό φυσιολογικών σπερματοζωαρίων 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 α α,1 β,1,2 β,2 1 Ημέρες 3 O bio dur α,β Διαφορετικοί εκθέτες ανά αραιωτικό και μεταξύ χρονικών σημείων υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05). 1,2 Διαφορετικοί εκθέτες ανά χρονικό σημείο και μεταξύ αραιωτικών υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05). Γράφημα 9: Ποσοστό των φυσιολογικών σπερματοζωαρίων στα τρία αραιωτικά την 1 η και την 3 η ημέρα της μελέτης. Από τις μετρήσεις των ποσοστών των μη φυσιολογικών σπερματοζωαρίων, διαπιστώθηκε αύξηση μεταξύ 1 ης και 3 ης ημέρας στα αραιωτικά Bio, Optimia και Duragen (p<0,0001, p=0,0001 και p<0,0001 αντίστοιχα), και διαφορά μεταξύ των αραιωτικών Optimia και Bio την 3 η ημέρα (p=0,002) (γράφημα 10). 45,00 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 α β,1 β,1,2 β,2 O bio dur 10,00 5,00 0,00 1 Ημέρες 3 α,β Διαφορετικοί εκθέτες ανά αραιωτικό και μεταξύ χρονικών σημείων υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05). 1,2 Διαφορετικοί εκθέτες ανά χρονικό σημείο και μεταξύ αραιωτικών υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05). 33

35 Ζωτικότητα % Γράφημα 10: Ποσοστό των μη φυσιολογικών σπερματοζωαρίων στα τρία αραιωτικά την 1 η και την 3 η ημέρα της μελέτης. Στη ζωτικότητα των σπερματοζωαρίων διαπιστώθηκε σημαντική μείωση μεταξύ 1 ης και 3 ης ημέρας στα αραιωτικά Bio (p<0,0001), Optimia (p<0,0001) και Duragen (p<0,0001). Διαφορές στη ζωτικότητα των σπερματοζωαρίων μεταξύ όλων των αραιωτικών παρατηρήθηκαν τόσο την 1 η ημέρα (Optimia vs. Bio p<0,0001, Optimia vs. Duragen p=0,0012 και Bio vs. Duragen p<0,0001) όσο και την 3 η ημέρα (Optimia vs. Bio p<0,0001, Optimia vs. Duragen p<0,0001 και Bio vs. Duragen p<0,0001) (γράφημα 11). Η επίδραση του χρόνου στα αραιωτικά έτεινε επίσης να διαφέρει (p=0,07). 92,00 90,00 88,00 86,00 84,00 82,00 80,00 α,1 α,2 α,3 β,1 β,2 β,3 O bio dur 78,00 76,00 74,00 1 Ημέρες 3 α,β Διαφορετικοί εκθέτες ανά αραιωτικό και μεταξύ χρονικών σημείων υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05). 1,2,3 Διαφορετικοί εκθέτες ανά χρονικό σημείο και μεταξύ αραιωτικών υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05). Γράφημα 11: Ζωτικότητα στα τρία αραιωτικά την 1 η και την 3 η ημέρα της μελέτης. Τέλος, η ακεραιότητα της χρωματίνης του πυρήνα των σπερματοζωαρίων (DNA), αποτελεί μια ακόμα παράμετρο για την οποία διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ 1 ης και 3 ης ημέρας στα τρία αραιωτικά Bio (p<0,0001), Optimia (p=0,005) και Duragen (p=0,002) (γράφημα 12). 34