4 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Βιοτεχνολογία και Τεχνολογία Τροφίμων Πρακτικά Συνεδρίου

Transcript

1 4 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Βιοτεχνολογία και Τεχνολογία Τροφίμων Πρακτικά Συνεδρίου Οκτωβρίου 2013 ΜΕC Παιανίας foodbiotech4.chemeng.ntua.gr Συνδιοργάνωση: Ένωση Ελλήνων Χημικών Πανελλήνιος Σύλλογος Χημικών Μηχανικών

2 4 ο Πανελλήνιο Συνέδριο «Βιοτεχνολογία και Τεχνολογία Τροφίμων» ΠΡΑΚΤΙΚΑ ΣΥΝΕΔΡΙΟΥ Οκτωβρίου 2013 ΜΕC Παιανίας, Αθήνα

3 Οργανωτική Επιτροπή: Σειραγάκης Γ. (Τμήμα Τροφίμων ΕΕΧ, Πρόεδρος), Βαφειάδης Κ. (Πρόεδρος ΠΣΧΜ), Aναλυτής Β. (Γραμματέας ΔΣ ΠΣΧΜ), Γιανέλλος Π. (Μόνιμη Επιτροπή Τροφίμων & Βιοτεχνολογίας ΠΣΧΜ), Γιάννου Β. (Μόνιμη Επιτροπή Τροφίμων & Βιοτεχνολογίας ΠΣΧΜ), Δερμεσονλούογλου Ε. (Μόνιμη Επιτροπή Τροφίμων & Βιοτεχνολογίας ΠΣΧΜ), Θεοδώρου Δ. (Επιμελητής Μόνιμης Επιτροπής Τροφίμων & Βιοτεχνολογίας ΠΣΧΜ), Καλέση Μ. (Τμήμα Κεντρικής & Δυτικής Θεσσαλίας ΠΣΧΜ), Λαμπή Ε. (ΚΥ Γενικό Χημείο Κράτους), Μακρυπούλιας Φ. (Δ.Ε. - ΕΕΧ), Σάλτα Φ. (Τμήμα Τροφίμων ΕΕΧ), Τσιρώνη Φ. (Μόνιμη Επιτροπή Τροφίμων & Βιοτεχνολογίας ΠΣΧΜ), Φαρμάκης Λ. (Δ.Ε. - ΕΕΧ). Επιστημονική Επιτροπή: Τζιά Κ. (ΕΜΠ, Πρόεδρος ΕΕ), Αντωνοπούλου Σ. (Χαροκόπειο), Γεωργίου Κ. (ΓΠΑ), Καραθάνος Β. (Χαροκόπειο), Καραμάνος Ν. (Π. Πατρών), Κέκος Δ. (ΕΜΠ), Κίζης Δ. (ΓΠΑ), Κολίσης Φ. (ΕΜΠ), Κοντομηνάς Μ. (Π. Ιωαννίνων), Κούκιος Ε. (ΕΜΠ), Κουρέτας Δ. (Π. Θεσσαλίας), Κουτίνας Α. (Π. Πατρών), Κουτίνας Α. (ΓΠΑ), Κροκίδα Μ. (ΕΜΠ), Κυριτσάκης Α. (ΤΕΙ Θεσ/κης), Κωμαῒτης Μ. (ΓΠΑ), Μακρής Δ. (Π. Αιγαίου), Μαρκάκη Π. (ΕΚΠΑ), Μπεζιρτζόγλου Ε. (Π. Θράκης), Μπλέκας Γ. (ΑΠΘ), Νάσκα Α. (ΕΚΠΑ), Νυχάς Ι. (ΓΠΑ), Πετροχείλου Ι. (ΕΕΧ), Προεστός Χ. (EKΠΑ), Στεφανίδου Α. (ΕΕΧ), Στοφόρος Ν. (ΓΠΑ), Ταούκης Π. (ΕΜΠ), Τριχοπούλου Α. (ΕΚΠΑ), Φωτόπουλος Β. (ΤΕ.ΠΑ.Κ.), Ωραιοπούλου Β. (ΕΜΠ). 2

4 Με την ευγενική συμπαράσταση των εταιρειών: Food Allergens Lab Κλαδικές Εμπορικές Εκθέσεις Biotica (R-Biopharm) CORINGREEN S.A. Moulas Scientific Αναλυτικές Συσκευές ΒΑΜΒΑΚΑΣ Hellamco A.E. 3

5 4

6 Παρασκευή 11 Οκτωβρίου 14:30 Εγγραφές 4 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Βιοτεχνολογία και Τεχνολογία Τροφίμων Οκτωβρίου 2013 ΜΕC Παιανίας, Αθήνα ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΥΝΕΔΡΙΟΥ 15:30 Έναρξη-Χαιρετισμοί Συνεδρία A1 Ανάπτυξη και μαθηματική περιγραφή έξυπνων δεικτών για τον έλεγχο της αλυσίδας κατεψυγμένων τροφίμων. Επαλήθευση σε πραγματικές συνθήκες. 16:30 Γιαννόγλου M., Τούλη A., Πλατάκου E., Τσιρώνη Θ., Ταούκης Π. Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ Σελ. 19 Επίδραση εδώδιμων αντιμικροβιακών μεμβρανών σε ζαμπόν και λουκάνικα Φρανκφούρτης στον έλεγχο του Listeria monocytogenes μετά από αναθέρμανση σε 16:45 μικροκύματα Kαπετανάκου Α.Ε., Καρυώτης Δ., Σκανδάμης Π.N. Εργαστήριο Ποιοτικού Ελέγχου και Υγιεινής Τροφίμων και Ποτών, Επιστήμη και Τεχνολογία Τροφίμων, ΓΠΑ Σελ. 23 Μελέτη της επίδρασης διαφορετικών μαρινάδων στη μικροχλωρίδα τεμαχίων κοτόπουλου υπό διαφορετικές συνθήκες χρόνου και θερμοκρασίας εμβάπτισης. 17:00 Λύτου Α.Ε., Μπλάνα Β.Α., Πανάγου Ε.Ζ., Νυχάς Γ.Ι.Ε.* Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων, Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων, ΓΠΑ Σελ. 24 Αξιοποίηση των υγρών αποβλήτων ελαιουργείων για παραγωγή μονοκυτταρικής πρωτεΐνης. Γιαβάσης Ι. 1 *, Δημητράκου Λ. 1, Μπούρος Χ. 1, Ζάρα Π. 1, Ανδριόπουλος Π. 1, 17:15 Μανούρας Α. 1, Πετρωτός Κ. 2 1 ΤΕΙ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ, Τμήμα Τεχνολογίας τροφίμων, Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων 2 ΤΕΙ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ, Τμήμα Μηχανικής Βιοσυστημάτων, Εργαστήριο Μηχανικής τροφίμων Σελ. 28 Επίδραση της υπερυψηλής πίεσης στην επιβίωση του παθογόνου βακτηρίου Salmonella enterica ser. Enteritidis και της φυσικής μικροχλωρίδας σε φιλέτα 17:30 κοτόπουλου. Αργύρη Α.Α., Χωριανόπουλος Ν.Γ., Σουρρή Π.I., Σαμαράς Φ.I., Τάσσου Χ.X. Ελληνικός Γεωργικός Οργανισμός ΔΗΜΗΤΡΑ, Ινστιτούτο Τεχνολογίας Γεωργικών Προϊόντων Σελ :45 Ερωτήσεις 18:00 Διάλειμμα 5

7 18:30 18:45 19:00 19:15 19:30 19:45 Ερωτήσεις Συνεδρία A2 Aντιμικροβιακές και αντιοξειδωτικές ιδιότητες πολυφαινολών απομονωμένων από υγρά απόβλητα ελαιουργείων: Μελέτες in vitro και επιτυχημένες εφαρμογές σε τρόφιμα. Γιαβάσης Ι. 1 *, Λεοντόπουλος Σ. 2, Τσαούση Κ. 1, Αργυρίου Ε.Ε. 1, Κανδυλάκης Μ. 1 Κασαπίδου Ε. 3, Μανούρας Α. 1, Πετρωτός Κ. 2 1 ΤΕΙ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ, Τμήμα Τεχνολογίας τροφίμων, Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων 2 ΤΕΙ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ, Τμήμα Μηχανικής Βιοσυστημάτων, Εργαστήριο Μηχανικής τροφίμων 3 ΤΕΙ ΔΥΤΙΚΗΣ ΜΑΚΕΔΟΝΙΑΣ, Τμήμα Εμπορίας και Ποιοτικού Ελέγχου Αγροτικών Προϊόντων Σελ. 33 Μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης της αιγοπρόβειας πρωτεΐνης τυρογάλακτος in vitro και στην κυτταρική σειρά C2C12. Κερασιώτη Ε., Πρίφτης Α., Αϊβαζίδης Σ., Στάγκος Δ., Κουρέτας Δ. Τμήμα Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Σελ. 35 Μελέτη της δυνατότητας σύμπλεξης ιόντων χαλκού και σιδήρου από αφεψήματα Ελληνικών βοτάνων. Κογιάννου Δ. 1, Κουνδουράκη Χ. 1, Καραβόλτσος Σ. 2, Σακελλάρη Α. 2, Καλογερόπουλος Ν. 1 * 1 Τμήμα Επιστήμης Διαιτολογίας - Διατροφής, Χαροκόπειο Πανεπιστήμιο 2 Εργαστήριο Χημείας Περιβάλλοντος, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ Σελ. 38 Μελέτη της επίδρασης πολυφαινολικού εκχυλίσματος στεμφύλων σε δείκτες οξειδωτικού στρες σε μυικά και ενδοθηλιακά κύτταρα με κυτταρομετρία ροής και με φασματομετρία. Γκουτζουρέλας Ν. 1, Καρτερολιώτη Χ. 1, Γεωργαδάκης Σ. 1, Δεμερτζής Ν. 1, Μαυρίδου Π. 1, Στάγκος Δ. 1, Αληγιάννης Ν. 2, Σκαλτσούνης Λ. 2, Κουρέτας Δ. 1 1 Τμήμα Βιοχημείας-Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας 2 Τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ Μεσογειακή διατροφή και βιοτεχνολογία. Κατσαρός Ν. Επιστημονικός Συνεργάτης ΕΚΕΦΕ ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ Σελ. 42 Σελ. 45 6

8 Σάββατο 12 Οκτωβρίου 10:00 10:15 10:30 10:45 11:00 11:15 Ερωτήσεις 11:30 Διάλειμμα Συνεδρία B1 Proficiency Testing Schemes in food allergen testing. Alexopoulos Ch., Kakoulidis E., Lampi E. General Chemical State Laboratory (G.C.S.L.), 5 th Athens Chemical Service Σελ. 51 Detection of escolar (Lepidocybium flavobrunneum) in commercialized minced fish products by a PCR-RFLP technique. Houhoula D.P., Apostolou V., Lazana N., Siskos Ε., Toulis D., Kyrana V.R., Lougovois V.P. Department of Food Technology, Technological Educational Institution of Athens Σελ. 55 Ανάπτυξη μεθοδολογίας μοριακής βιολογίας για την ανίχνευση αμυγδάλου σε κυπριακά τρόφιμα. Τέλλο Α. 1, Σειραγάκης Γ. 2, Δεληγιάννη Α. 1, Ευσταθίου Κ. 1, Πελεκάνου Η. 1 1 Γενικό Χημείο Κράτους Κύπρου 2 FA Food Αllergens Lab Ltd., Κύπρος Detection of allergens in food animal origin. Rizou K. Food Division, General Chemical State Laboratory Αλλεργιογόνο σέλινο σε φρέσκα και καταψυγμένα τυποποιημένα λαχανικά. Δανιάς Π., Χριστοδούλου Ε., Μπαργωτάκης Π. FA Food Allergens Lab, Κύπρος Σελ. 56 Σελ. 60 Σελ. 64 Συνεδρία B2 12:00 12:15 Μοριακός και αναλυτικός χαρακτηρισμός της βιοσύνθεσης τοκοχρωμανολών σε καρπούς ελιάς (Olea europaea L.). Γεωργιάδου Χ. 1, Γούλας Β. 1, Ντούρου Τ. 2, Μαγγανάρης Γ.Α. 1, Καλαϊτζής Π. 2, Φωτόπουλος Β. 1 1 Τεχνολογικό Πανεπιστήμιο Κύπρου, Τμήμα Γεωπονικών Επιστημών, Βιοτεχνολογίας και Επιστήμης Τροφίμων 2 Μεσογειακό Αγρονομικό Ινστιτούτο Χανίων, Τομέας Γενετικής Βελτίωσης και Βιοτεχνολογίας Οπωροκηπευτικών Σελ. 71 Rapid analysis for fungal growth and OTA production of Aspergillus carbonarius using turbidimetric measurements. Ioannidis A.-G. 1, Magan Ν. 2, Panagou E.Z. 1 * 1 Laboratory of Microbiology and Biotechnology of Foods, Department of Food Science and Technology, AUA 2 Applied Mycology Group, Cranfield Health, Cranfield University, UK Σελ. 72 7

9 12:30 12:45 13:00 ITS-RFLP characterization of Aspergillus isolates in grapes of four traditional grapeproducing areas in Greece. Kizis D.*, Natskoulis P., Nychas G.-J.Ε., Panagou E.Ζ. Laboratory of Microbiology and Biotechnology of Foods, Department of Food Science and Human Nutrition, AUΑ Σελ. 76 Μοριακές Τεχνικές στην Ασφάλεια - Ποιότητα - Γνησιότητα Τροφίμων. Ευαγγέλου Β. 1, Λαμπιδώνης Α. 2, Σειραγάκης Γ. 3 1 Food Allergens Laboratory, Αθήνα, 2 Food Allergens Laboratory, Κρήτη 3 FA Food Allergens Lab Ltd, Κύπρος 13:15 Ερωτήσεις Quality Improvement & QA Tools. Gutschelhofer C.M. 1 *, Niemeijer R. 1, Maune C. 2 1 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstrasse 17, Darmstadt, Germany, 2 Trilogy Analytical Laboratory, 870 Vossbrink Dr., Washington, MO 63090, USA 13:30 Διάλειμμα Ελαφρύ γεύμα Σελ. 78 Σελ. 80 Συνεδρία B3 Μελέτη της επίδρασης της λιποπεριεκτικότητας και της προσθήκης καζεϊνικών αλάτων και συμπυκνωμάτων πρωτεϊνών ορού στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά αναμιγμένης γιαούρτης από βουβαλίσιο γάλα. 14:45 Ακακιάδου Π.*, Χρυσαλίδου Σ., Δημητρέλη Γ., Πετρίδης Δ. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Τεχνολογίας Τροφίμων και Διατροφής, Αλεξάνδρειο Τεχνολογικό Εκπαιδευτικό Ίδρυμα Θεσσαλονίκης (ΑΤΕΙΘ) Σελ. 85 Επιλογή των βέλτιστων συνθηκών επεξεργασίας με υπερυψηλή πίεση για την παραγωγή πορτοκαλοχυμού ποικιλίας NAVEL. 15:00 Αλεξανδράκης Ζ., Γουργουλέτης Α., Κατσαρός Γ., Ταούκης Π. Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ Σελ. 89 Παραγωγή νέων προϊόντων από χυμό ροδιού με εφαρμογή κλασσικών βιοτεχνολογικών διεργασιών. 15:15 Ορδούδη Σ.Α.*, Μαντζουρίδου Φ., Δάφτσιου Ε., Μάλο Χ., Χατζηδημητρίου Ε., Νενάδης Ν., Τσιμίδου Μ. Ζ. Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, ΑΠΘ Σελ. 93 Yeast β-glucan recovery from wine by-products: a functional and valuable ingredient in food production processing. 15:30 Varelas V. 1, Liouni M. 1, Nerantzis E. 2 1 Laboratory of Industrial Chemistry, Dept. of Chemistry, University of Athens 2 Laboratory of Biotechnology & Industrial Fermentation, Dept. of Enology, TEI of Athens Σελ. 97 Μελέτη Επεξεργασίας Χυμού Ιπποφαούς με Υπερυψηλή Πίεση. Αλεξανδράκης Ζ. 15:45 1, Κυριακοπούλου Κ. 2, Κατσαρός Γ. 1, Κροκίδα Μ. 2, Ταούκης Π. 1 1 Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, ΕΜΠ, 2 Εργαστήριο Σχεδιασμού και ανάλυσης Διεργασιών, ΕΜΠ Σελ :00 Ερωτήσεις 8

10 16:15 Διάλειμμα Συνεδρία B4 Ανάπτυξη και επικύρωση επίσημης μεθόδου για τον προσδιορισμό βαρέων μετάλλων και ιχνοστοιχείων σε κονσερβοποιημένη πάστα τομάτας με την τεχνική της Πολυστοιχειακής Φασματομετρίας Ατομικής Απορρόφησης με ηλεκτροθερμαινόμενο 16:45 φούρνο γραφίτη. Ραπτοπούλου Κ. 1, Πασιάς Ι. 2, Θωμαΐδης Ν. 2, Προεστός Χ. 1 * 1 Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ 2 Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ Σελ. 107 Μελέτη της ανάπτυξης στελέχους Salmonella Typhimurium σε εργαστηριακό μέσο και εκχύλισμα ρόκας σε θερμοκρασία 20 C. 17:00 Δουλγεράκη Α.Ι. 1, Ηλιόπουλος Β. 1, Γεωργίου Κ. 2, Πανάγου Ε.Ζ. 1, Νυχάς Γ.-Ι.Ε. 1 1 Εργαστήριο Μικροβιολογίας & Βιοτεχνολογίας Τροφίμων 2 Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων, Τμήμα Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής του Ανθρώπου, ΓΠΑ Σελ. 111 Παραγωγή αφλατοξίνης Β1 από μύκητες που απομονώθηκαν από μαύρη σταφίδα Κρήτης και Κορίνθου. 17:15 Καναπίτσας Α. 1, Κωσταρέλου Π. 1, Ταβουλάρη Μ. 1, Καψανάκη-Γκότση Ε. 2, Μαρκάκη Π. 1 1 Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ 2 Εργαστήριο Συστηματικής και Οικολογίας, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ Σελ. 113 Histamine levels in commercial cured and canned fish products commonly consumed in Greece. 17:30 Houhoula D.P., Batrinou A., Giannakis G., Filios K., Siskos Ε., Toulis D., Kyrana V.R., Lougovois V.P. Department of Food Technology, ΤΕΙ Athens Σελ. 115 Biotechnology and foods: Benefits and concerns 17:45 Labropoulos Α., Anestis S., Pagoni M. TEI Athens Σελ :00 Ερωτήσεις 9

11 Κυριακή 13 Οκτωβρίου 10:00 10:15 10:30 10:45 11:00 11:15 Ερωτήσεις 11:30 Διάλειμμα Συνεδρία Γ1 BIOtechnological COrinthian Raisin EXtract Βιοτεχνολογική έρευνα Απομόνωση και παραγωγή αντιοξειδωτικού συμπληρώματος διατροφής μαύρης Κορινθιακής σταφίδας. Κορδοπάτης Π. 1, Λάμαρη Φ.Ν. 1, Πάϊρας Γ.Ν. 2, Παύλου Α. 3 *, Κατσογιάννης Κ. 3, Clark B.F.C. 3, Πισιμίσης Χ. 4, Βελέντζας Δ. 4 1 Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων 2 Εργαστήριο Φαρμακευτικής Χημείας, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 3 CORINGREEN SA, 4 THANOS VINEGAR SA. Σελ. 123 Μελέτη αντιοξειδωτικής δράσης πολυφαινολικού εκχυλίσματος από απόβλητα ελαιουργείου μετά από ενθυλάκωση σε πρωτείνη τυρογάλακτος, μαλτοδεξτρίνη και ζελατίνη. Φουστέρη Ζ. 1, Στάγκος Δ. 1, Πετρωτός Κ. 2, Ματσούκας Ι. 2, Κεφαλάκης Γ. 2, Μαντάς Χ. 2, Γκουτσίδης Π. 2, Κερασιώτη Ε. 1, Φιλίντας Α. 2, Κουρέτας Δ. 1 1 Τμήμα Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας 2 Τμήμα Μηχανικής Βιοσυστημάτων, ΤΕΙ Θεσσαλίας Σελ. 124 Οι τοκοφερόλες στις ελιές και το ελαιόλαδο στην Ελλάδα. Μαΐστρου Ε.Α.Δ. 1, Σειραγάκης Γ. 2 1 Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών 2 Food Allergens Laboratories Σελ. 127 Μελέτη in vivo της αντιοξειδωτικής δράσης χυμού ροδιού. Ματθαίου Χ. 2, Σαράφογλου Ε. 1, Γκουτζουρέλας Ν. 1, Στάγκος Δ. 1, Χαρουτουνιάν Σ. 2, Κουρέτας Δ. 1 1 Τμήμα Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, 2 ΓΠΑ Σελ. 128 Προσδιορισμός δεικτών οξειδωτικού στρες στο αίμα κοτόπουλων κρεατοπαραγωγής που υπέστησαν αγωγή με πολυφαινολικά πρόσθετα. Γερασόπουλος Κ. 1,2, Οικονομίδης Δ. 1, Στάγκος Δ. 1, Κόκκας Σ. 2, Καντάς Δ. 2, Γούλας Π. 2, Σαβουϊδάκη Κ. 2, Ντομπρουγάς Γ. 2, Πετρωτός Κ. 2, Κουρέτας Δ. 1 1 Τμήμα Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας 2 Τμήμα Μηχανικής Βιοσυστημάτων, ΤΕΙ Θεσσαλίας Συνεδρία Γ2 Σελ :00 Detection of pathogens in foods by ANSR system. Silars N. Neogen Europe, Ayr, Scotland, UK Σελ

12 12:15 12:30 12:45 13:00 Συσχέτιση των ορίων επιβίωσης, ανάπτυξης και έκφρασης γονιδίων καταπόνησης και παθογένειας του Listeria monocytogenes κατά την απόκριση σε όξινη και ωσμωτική καταπόνηση. Μακαρίτη Π.Ι., Πρίντεζη Α., Σκανδάμης Ν.Π. Εργαστήριο Ποιοτικού Ελέγχου και Υγιεινής Τροφίμων, Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Σελ. 138 Μεταβολές στα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των παθογόνων Listeria monocytogenes και Salmonella spp. έπειτα από προσαρμογή τους σε υψηλές συγκεντρώσεις αντιβιοτικών. Μανιός Σ.Γ., Ζώης Ι., Καμιντζής Γ., Σκανδάμης Π.Ν. Εργαστήριο Ποιοτικού Ελέγχου και Υγιεινής Τροφίμων, Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Σελ. 139 Χρήση Ελληνικών φυτών για καταπολέμηση παθογόνων στο κρέας Λαμπιδώνης Α., Πολίτης Μ. Food Allergens Laboratory, Κρήτη Σελ. 140 Βιοτεχνολογική παραγωγή πτητικών οσμηρών ενώσεων από πούλπα πορτοκαλιού με τον ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae σε ζύμωση στερεής κατάστασης. Λάλου Σ., Παρασκευοπούλου Α., Μαντζουρίδου Φ.* Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, ΑΠΘ Σελ :30 Στρογγυλό Τραπέζι Εφαρμογές της Βιοτεχνολογίας στον κλάδο των τροφίμων στην Ελλάδα: Επιτεύγματα & προβληματισμοί 11

13 ΑΝΑΡΤΗΜΕΝΕΣ ΕΡΓΑΣΙΕΣ Εκτίμηση της ποικιλότητας εγχώριων ποικιλιών φακής (Lens culinaris Medik.) με τη χρήση μοριακών δεικτών. Κωμαΐτης Φ., Μπεμπέλη Π. Εργαστήριο Βελτίωσης Φυτών και Γεωργικού Πειραματισμού, Τμήμα Επιστήμης Φυτικής Παραγωγής, ΓΠΑ Σελ. 151 Detection of genetically modified maize lines in packed foodstuffs containing processed corn. Kizis D., Gallou C., Houhoula D., Koussissis S. Department of Food Technology, Faculty of Food Technology and Nutrition, TEI Athens Σελ. 152 Olive fruit respiration study under hypoxia and hyperoxygenation conditions. Kizis D. 1, Houhoula D. 1, Banilas G. 2, Christidis S. 1, Livaditi L. 1, Koussissis S. 1 1 Department of Food Technology, Faculty of Food Technology and Nutririon, TΕΙ Athens 2 Department of Oenology and Beverage Technology, Faculty of Food Technology and Nutririon, ΤΕΙ Athens Σελ. 153 Quantification of parvalbumin in commercially important seafood species, using real time PCR. Houhoula D.P., Dimitriou P., Mengezi G., Kyrana V.R., Lougovois V.P. Department of Food Technology, TΕΙ Athens Σελ. 154 Quantification of aflatoxins in foods, using the direct competitive ELISA technique. Houhoula D.P., Batrinou A., Chaniotis P., Grafas L., Kizis D., Kyrana V.R., Lougovois V.P., Koussissis S. Department of Food Technology, TΕΙ Athens Σελ. 155 Development of a Real Time PCR for the detection of potentially allergenic trace amounts of peanuts and hazelnuts in processes foods. Kiritsi I., Papanastasiou A., Bourdi C., Galafti P., Koussissis S., Houhoula D.P. Department of Food Technology, TΕΙ Athens Σελ. 156 Development of a PCR for the detection of allergenic trace amounts of sesame and hazelnuts in processes foods. Belsis V., Lagou K., Varvaresou M., Platara P., Kollia M., Georgοpoulos L., Koussissis S., Houhoula D.P. Department of Food Technology, TΕΙ Athens Σελ. 157 Η επίδραση της θέρμανσης στα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά και την αντιοξειδωτική ικανότητα του μελιού. Ευθυμίου Μ.-Ν. 1, Γαρδέλη Χ. 1, Χαριζάνης Π. 2, Κωμαΐτης Μ. 1 1 Εργαστήριο Χημείας και Ανάλυσης Τροφίμων, Τμήμα Επιστήμης Τροφίμων & Διατροφής του Ανθρώπου, Γ.Π.Α. 2 Εργαστήριο Μελισσοκομίας και Σηροτροφίας, Τμήμα Επιστήμης Φυτικής Παραγωγής, Γ.Π.Α. Σελ. 158 Επίδραση του είδους του γάλακτος (βουβαλίσιο - αγελαδινό) και της προσθήκης καζεϊνικών αλάτων στις ρεολογικές ιδιότητες και στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά αναμιγμένης γιαούρτης. Δεληγεωργάκης Χ., Βλάχβεη Κ., Δημητρέλη Γ. Αλεξάνδρειο Τεχνολογικό Εκπαιδευτικό Ίδρυμα Θεσσαλονίκης (ΑΤΕΙΘ), Σχολή Τεχνολογίας Γεωπονίας και Τεχνολογίας Τροφίμων και Διατροφής, Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων Σελ

14 LC-MS-MS techniques for food allergens testing. Christofakis M. 1, Xila A. 2 1 Food Allergens Lab, Crete, 2 Novartis Swiss 2,5-Diketopiperazine identification based on gas chromatography-mass spectrometry analysis. Bratakos S.M. 1 *, Sinanoglou V.J. 1, Dourtoglou V. 2, Riganakos K. 3 1 Instrumental Food Analysis Laboratory, Department of Food Technology, TEI Athens 2 Department of Oenology and Beverage Technology, TEI Athens 3 Food Chemistry and Technology Laboratory, Department of Chemistry, University of Ioannina 13 Σελ. 166 Σελ. 170 Μελέτη της φυσιολογίας των βακτηρίων-θηρευτών Bdellovibrio και Bacteriovorax και οι δυνατότητες χρήσης τους ως παράγοντες βιοπροστασίας σε τρόφιμα. Γιαβάσης Ι.*, Δημοπούλου Κ., Νικολάκη Σ., Στεργίου A., Καφετζή Ι., Βουνού Θ., Ιωαννίδου Ν. ΤΕΙ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ, Τμήμα Τεχνολογίας τροφίμων, Εργαστήριο Μικροβιολογίας & Βιοτεχνολογίας Τροφίμων Σελ. 171 Antimicrobial effect of pomegranate juice (Punica granatum L.) on Staphylococcus aureus strains. Batrinou A. 1, Lantzouraki D. 2, Sinanoglou V.J. 1, Fragkouli C. 1, Spiliotis V. 1 1 Department of Food Technology, TEI Athens 2 Laboratory of Food Chemistry, School of Chemistry, National and Kapodistrian University of Athens Σελ. 172 Σύγκριση τεσσάρων μεθόδων προσδιορισμού ολικής και μεσόφιλης χλωρίδας (Ο.Μ.Χ.) σε γάλα μικρών μηρυκαστικών. Καλύβα Ζ.Χ. 1, Ακρίδα-Δεμερτζή Κ. 2, Δεμερτζής Π.Γ. 2 1 Εργαστήριο Μικροβιολογίας - Παρασιτολογίας και Λοιμωδών Νοσημάτων Ζώων, Τμήμα Ζωικής Παραγωγής, ΤΕΙ Ηπείρου 2 Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Σελ. 173 Εκτίμηση της χημικής σύστασης νωπού γάλακτος εγχώριων φυλών μικρών μηρυκαστικών - Συγκριτική μελέτη ατομικών και ομαδικών δειγμάτων. Αυγέρης Ι.Β. 1, Δεμερτζής Π.Γ. 2, Ακρίδα-Δεμερτζή Κ. 2 1 Εργαστήριο Μικροβιολογίας - Παρασιτολογίας και Λοιμωδών Νοσημάτων των Ζώων, Τμήμα Ζωικής Παραγωγής, ΤΕΙ Ηπείρου 2 Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Σελ. 174 Impact of water activity, temperature and sodium metabisulfite concentration on the growth of an Aspergillus carbonarius isolate from Greek grapes. Natskoulis, P. 1, Ioannidis A.-G. 1, Magan N. 2, Panagou E.Z. 1 * 1 Laboratory of Microbiology and Biotechnology of Foods, Department of Food Science and Technology, AUA 2 Applied Mycology Group, Cranfield Health, Cranfield University, UK Σελ. 175 Εφαρμογή προβιοτικής καλλιέργειας εκκίνησης Lactobacillus pentosus σε μεγάλης κλίμακας ζύμωση επιτραπέζιας ελιάς ποικιλίας Χαλκιδικής. Μπλάνα Β.Α., Σταματίου Α.Π., Νυχάς Γ.-Ι., Πανάγου Ε.Ζ. Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων, Τμήμα Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής του Ανθρώπου, ΓΠΑ Σελ. 176 Η μεταβολή των ελεύθερων ανθοκυανών σε οίνους πρώιμης κατανάλωσης σε συσκευασία τροποποιημένης ατμόσφαιρας. Μπιμπίλας Α., Τσιμογιάννης Δ., Ωραιοπούλου Β. Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ Σελ. 180

15 Μελέτη ποιοτικών χαρακτηριστικών κέικ εμπλουτισμένου με ολιγοφρουκτόζη και ινουλίνη. Ψιμούλη Β., Ωραιοπούλου Β. Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ Σελ. 184 Ανίχνευση των τροφογενών παθογόνων Vibrio parahaemolyticus και Bacillus cereus με Μοριακές Τεχνικές. Λαμπιδώνης Α., Πολίτης Μ. Food Allergens Laboratory, Κρήτη Σελ. 188 Σύγκριση ανοσοχημικών και μοριακών τεχνικών για ανίχνευση αλλεργιογόνου μουστάρδας σε τρόφιμα. Λοΐζου Σ. 1 *, Κίζης Δ. 2 *, Σειραγάκης Γ. 2, Νικολάου Σ.A. 1 1 St George s, University of London Medical School at the University of Nicosia, 2 FA Food Allergens, Κύπρος Σελ. 192 Ανάκτηση και ανάλυση καροτενοειδών μετά από ενζυμική κατεργασία αποβλήτων βιομηχανικής τομάτας. Τσέκου Χ., Κατσούφη Σ., Στρατή Ε., Μπατρίνου Α., Κουσίσης Σ. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Τεχνολογίας Τροφίμων και Διατροφής ΤΕΙ Αθήνας Σελ. 193 Πρόβλεψη των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών κέικ εμπλουτισμένου με πίτυρα δημητριακών κατεργασμένα με ξυλανάση μέσω εκτίμησης των φυσικοχημικών και θερμικών του ιδιοτήτων. Λεμπέση Δ., Τζιά Κ. Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ Σελ. 194 Παραγωγή προβιοτικών επιτραπέζιων ελιών: ενσωμάτωση προβιοτικών βακτηρίων σε εδώδιμες μεμβράνες. Κατσαμπές Σ., Σφακιανάκης Π., Πολυχνιάτου Β., Χανιώτη Σ., Χρανιώτη Χ., Γιάννου Β., Τζιά Κ. Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ Σελ. 198 Σχεδιασμός και επικύρωση διεργασιών τροφίμων με επίκεντρο τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Τζιά Κ., Γιάννου Β., Πολυχνιάτου Β., Σφακιανάκης Π., Χρανιώτη Χ., Χανιώτη Σ. Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ Σελ. 202 Επίδραση της μείωσης της κοκκομετρίας με τη χρήση μύλου άλεσης υψηλής πίεσης (JET MILL) στα ποιοτικά χαρακτηριστικά αλεύρου από κριθάρι. Δράκος Α., Κυριακάκης Γ., Πρωτονατάριου Σ., Ευαγγελίου Β., Μαντάλα Ι. Τμήμα Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής του Ανθρώπου, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Σελ. 206 Ανίχνευση αφλατοξίνης με ταχεία ανοσοαναλυτική μέθοδο σε καρυκεύματα της Ελληνικής αγοράς. Μπατρίνου Α. 1, Χούχουλα Δ. 1, Καμπανοπούλου Μ. 1, Μακρυγιάννης Κ. 1, Μαρκάκη Π. 2 1 Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων, ΤΕΙ Αθήνας 2 Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων, ΕΚΠΑ Σελ. 207 Εφαρμογές κυτταρομετρίας ροής στην μελέτη βιωσιμότητας προβιοτικών μικροοργανισμών σε γαλακτοκομικά προϊόντα. Μπατρίνου Α., Κολοκυθά Κ., Παναγή Α., Ερμιζίδου Α., Βράιλας Κ., Σπηλιώτης Β. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων, ΤΕΙ Αθήνας Σελ

16 Προσδιορισμός με χρήση μοριακών μεθόδων της αντιοξειδωτικής δραστικότητας προϊόντων και παραπροϊόντων των σταδίων βιομηχανικής παραγωγής χυμού ροδιού. Μπέσιος Α. 1 *, Στάγκος Δ. 1, Μπόκαρη Α. 1, Ορφανουδάκη Α. 2, Αποστόλου Α. 2, Χαρουτουνιάν Σ. 2, Κουρέτας Δ. 1 1 Τμήμα Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας 2 Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Σελ. 209 Ανίχνευση Γεννετικά Τροποποιημένων Οργανισμών (Γ.Τ.Ο.) σε γαλακτοκομικά προϊόντα. Παραμυθιώτης Σ. 1, Αδράκτα Ν. 1, Σιγάλα Κ. 2, Δροσινός Ε.Χ. 1, Προεστός Χ. 2 1 Εργαστήριο Ποιοτικού Ελέγχου και Υγιεινής Τροφίμων και Ποτών, Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων, ΓΠΑ 2 Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ Σελ. 212 Επίδραση του αερίου όζοντος στην ποιότητα και στο χρόνο ζωής σταφυλιών ποικιλίας sultanina. Πάνου Α.Α., Ρώσσος Ξ.Κ., Ρηγανάκος Κ.Α. Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, Π. Ιωαννίνων Σελ. 213 Μελέτη της συνδυαστικής επίδρασης της προσθήκης πρωτεϊνών γάλακτος, του μεγέθους των λιποσφαιρίων και του χρόνου συντήρησης στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά αναμιγμένης γιαούρτης από βουβαλίσιο γάλα. Χρυσαλίδου Σ.*, Ακακιάδου Π., Δημητρέλη Γ., Πετρίδης Δ. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Τεχνολογίας Τροφίμων και Διατροφής, Αλεξάνδρειο Τεχνολογικό Ίδρυμα Θεσσαλονίκης (ΑΤΕΙΘ) Σελ. 217 Μείωση του λίπους στο παγωτό Ζαφειριάδης Θ. Τομέα Επισιτισμού - Μεταφορών, ΙΕΚ ΞΥΝΗΣ Σελ. 221 Aνάπτυξη Ενζυμοανοσοχημικής μεθόδου ELISA για τον προσδιορισμό του ζιζανιοκτόνου χλωροπυριφός σε τρόφιμα. Τσιάλλα Ζ. 1, Ζήκος Χ. 2, Ευαγγέλου Α. 2, Καραχάλιου Χ. 2, Πέτρου Π. 1, Λιβανίου Ε. 2, Κακαμπάκος Σ. 1 1 Εργαστήριο Ανοσοαναλύσεων - Ανοσοαισθητήρων 2 Εργαστήριο Ανοσοπεπτιδικής Χημείας, Ι.Π.Ρ.Ε.Τ.Ε.Α, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος» Σελ. 225 Ανάπτυξη ενζυμοανοσοχημικής μεθόδου ELISA για τον προσδιορισμό της βοείου κ-καζεΐνης σε κατσικίσιο γάλα. Αγγελοπούλου Μ. 1, Πέτρου Π. 1, Haasnoot W. 2, Peters J. 2, Σιαφάκα-Καπάδαη Α. 3, Κακαμπάκος Σ. 1 1 Εργαστήριο Ανοσοαναλύσεων - Ανοσοαισθητήρων, Ι.Π.Ρ.Ε.Τ.Ε.Α, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος» 2 RIKILT Wageningen UR 3 Εργαστήριο Βιοχημείας, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ Σελ. 229 Ανάπτυξη ενζυμοανοσοχημικής μεθόδου ELISA ανταγωνιστικού τύπου για τον προσδιορισμό ωχρατοξίνης σε δείγματα μπύρας. Πάγκαλη Β. 1, Πέτρου Π. 1, Haasnoot W. 2, Peters J. 2, Οικονόμου Α. 3, Κακαμπάκος Σ. 1 1 Εργαστήριο Ανοσοαναλύσεων-Ανοσοαισθητήρων, Ι.Π.Ρ.Ε.Τ.Ε.Α, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος» 2 RIKILT Wageningen UR 3 Εργαστήριο Βιοχημείας, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ Σελ

17 Κατανομή του είδους και της αντιβιοαντοχής Staphylococcus spp. σε πόσιμα νερά. Θεοδωρίδου Ε. 1, Αλεξόπουλος Α. 1, Σταυροπούλου Ε. 2, Πλέσσας Σ. 1, Μαντζουράνη Ι. 1, Φουρνομίτη Μ. 1,Tζούτη Β. 1, Μπεζιρτζόγλου Ε. 1 1 Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης, Τμήμα Αγροτικής Ανάπτυξης, Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Βιοτεχνολογίας και Υγιεινής, Ορεστιάδα 2 Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης, Ιατρικό Τμήμα, Αλεξανδρούπολη Σελ. 237 Πώς πίνετε τον καφέ σας; Ταμπούρης Κ., Γεωργαντάς Δ., Μπαρμπούνης Ε.Γ. Τμήμα Επιστημονικής Υποστήριξης, Ν. Αστεριάδης Α.Ε., Αθήνα Σελ. 241 Quantitative allergen detection in food as a requirement for harmonised action levels in the EU. Lorenzen E., Waldherr F., Sarrazin I., Mergemeier S., Kuhn M. CONGEN Biotechnologie GmbH, Berlin, Germany Σελ

18 Συνεδρία Α1 17

19 18

20 Ανάπτυξη και μαθηματική περιγραφή έξυπνων δεικτών για τον έλεγχο της αλυσίδας κατεψυγμένων τροφίμων. Επαλήθευση σε πραγματικές συνθήκες. Γιαννόγλου M., Τούλη A., Πλατάκου E., Τσιρώνη Θ., Ταούκης Π. Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών, Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο ΠΕΡΙΛΗΨΗ H ψυκτική αλυσίδα των τροφίμων χαρακτηρίζεται από απώλειες ποιότητας κυρίως λόγω σημαντικών αποκλίσεων από τις θερμοκρασίες προδιαγραφής. Οι Χρονοθερμοκρασιακοί Δείκτες ΤΤΙ (Time Temperature Integrators) επιτρέπουν τον έλεγχο ενδεχόμενης κακομεταχείρισης του προϊόντος όσον αφορά τη θερμοκρασία συντήρησης. Οι ΤΤΙ παρακολουθούν το χρονοθερμοκρασιακό ιστορικό των τροφίμων και μπορούν να χρησιμοποιηθούν επικουρικά της ημερομηνίας ανάλωσης, ως ζωντανή ημερομηνία λήξης. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της κινητικής υποβάθμισης της ποιότητας κατεψυγμένων φιλέτων γλαυκού καθώς και της απόκρισης των ΤΤΙ σε συνθήκες συντήρησης -5 έως -15 C, καθώς και η ανάπτυξη μεθοδολογίας για την επιλογή κατάλληλων ΤΤΙ για το κάθε προϊόν, εφόσον τα κινητικά χαρακτηριστικά της ποιοτικής υποβάθμισής του είναι γνωστά. Ως βέλτιστα για την παρακολούθηση της ποιοτικής υποβάθμισης των κατεψυγμένων φιλέτων γλαυκοκαρχαρία, επιλέχθηκαν το φωτοχημικό ΤΤΙ B1-0.4s και το ενζυμικό ΤΤΙ M-20U. Η αποτελεσματικότητα των ΤΤΙ για την παρακολούθηση της ποιότητας των κατεψυγμένων αλιευμάτων επαληθεύτηκε σε πραγματικές συνθήκες της ψυκτικής αλυσίδας. Development and modelling of TTI smart labels for monitoring the cold chain of frozen foods. Validation in real conditions. Giannoglou M., Touli, A., Platakou, E., Tsironi, F. and Taoukis P. Laboratory of Food Chemistry and Technology, School of Chemical Engineering, NTUA Application of an optimized quality and safety assurance system for the chilled and frozen distribution of products requires continuous monitoring and control of storage conditions, from production to consumption. Time-Temperature Integrators (TTI) are inexpensive, active smart labels that can show an easily measurable, time-temperature dependent change that reflects the temperature history of a food product to which it is attached. As an example case study, a kinetic model for quality deterioration of frozen blueshark slices was used to select appropriate TTI in order to monitor the fish quality during frozen distribution. A UV activatable photochromic TTI and an enzymatic TTI were kinetically studied and the influence of the level of activation or the concentration of the enzyme on the response of the TTI was modeled. The TTI response was tailored to monitor the shelf life of the product during the cold chain storage.the objective of the study was the validation in a laboratory scale of the applicability of selected enzymatic and photochromic TTI, for monitoring the quality of frozen blueshark (Prionace glauca) slices. 19

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ H ψυκτική αλυσίδα των τροφίμων χαρακτηρίζεται από απώλειες ποιότητας κυρίως λόγω σημαντικών αποκλίσεων από τις θερμοκρασίες προδιαγραφής. Η σωστή διαχείριση της απαιτεί την ανάπτυξη ενός διααραστικού συστήματος παρακολούθησης του χρονο-θερμοκρασιακού ιστορικού των τροφίμων σε επίπεδο μοναδιαίας συσκευασίας. Η έξυπνη συσκευασία (intelligent packaging) πέραν της προστασίας του προϊόντος παρέχει πληροφορίες σχετικά με την ποιοτική κατάσταση του. Οι χρονο-θερμοκρασιακοί δείκτες ή ολοκληρωτές (Time Temperature Integrators) ΤΤΙ είναι "έξυπνες" ετικέτες (smart labels) που με μια εύκολα μετρήσιμη, αναντίστρεπτη, οπτική αλλαγή που εξαρτάται από το χρόνο και τη θερμοκρασία, δείχνουν το θερμοκρασιακό ιστορικό και την ποιοτική κατάσταση του τροφίμου που συνοδεύουν. Με βάση τους ΤΤΙ μπορεί να λειτουργήσει ένα ολοκληρωμένο σύστημα παρακολούθησης της ψυκτικής αλυσίδας. Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν επικουρικά της ημερομηνίας ανάλωσης, ως «δυναμική» ημερομηνία λήξης. Η αποτελεσματικότητα και η αξιοπιστία ενός ΤΤΙ ως δείκτη ποιότητας του τροφίμου εξαρτάται από τα κινητικά χαρακτηριστικά της απόκρισης του (Taoukis & Labuza, 2003). Βασική απαίτηση είναι η εξάρτηση του ρυθμού απόκρισης από τη θερμοκρασία να προσεγγίζει ικανοποιητικά την εξάρτηση από τη θερμοκρασία των δράσεων ποιοτικής υποβάθμισης του τροφίμου (Tsironi et al., 2010). Στα πλαίσια του Ευρωπαϊκού προγράμματος IQ-Freshlabel ( πραγματοποιείται η ανάπτυξη φωτοχημικών και ενζυμικών ΤΤΙ για τον έλεγχο της αλυσίδας κατεψυγμένων αλιευμάτων. Στόχος είναι η ανάπτυξη κατάλληλης μεθοδολογίας για την επιλογή του βέλτιστου ΤΤΙ για συγκεκριμένα κατεψυγμένα προϊόντα και η εκτίμηση της εφαρμογής τους μέσω πειραμάτων προσομοίωσης της αλυσίδας κατάψυξης (Giannoglou et al., 2013). ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Κατεψυγμένα φιλέτα γλαυκοκαρχαρία (Prionace glauca) στις εμπορικές τους συσκευασίες αποθηκεύτηκαν σε σταθερή θερμοκρασία -5 και -10 C καθώς και σε μεταβαλλόμενες συνθήκες. Κατάλληλα φωτοχημικά (B1 OnVu TM, Bizerba, Germany) και ενζυμικά ΤΤΙs (M Check Point, VITSAB, Sweden) επιλέχθηκαν για τα φιλέτα βάσει προηγούμενων μελετών του χρόνου ζωής του προϊόντος καθώς και μαθηματικών μοντέλων που περιγράφουν την εξάρτηση της απόκρισης των φωτοχημικών ΤΤΙ τύπου Β1 και των ενζυμικών τύπου Μ από το χρόνο έκθεσης στην υπεριώδη ακτινοβολία (s) και τη συγκέντρωση του ενζύμου (U) αντίστοιχα. Η ποιοτική υποβάθμιση και η εναπομένουσα διάρκεια ζωής προσδιορίζονταν σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα βάσει της απόκρισης των TTIs και οι τιμές συγκρίνονταν με τις πραγματικές τιμές των δεικτών ποιοτικής υποβάθμισης βάσει των τιμών TVB-N, TBARs και μέσω οργανοληπτικής αξιολόγησης. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ανάπτυξη μαθηματικών μοντέλων προσδιορισμού απόκρισης ΤΤΙ Όσον αφορά τα φωτοχημικά ΤΤΙ αναπτύχθηκε ένα συνολικό μαθηματικό μοντέλο το οποίο περιγράφει την εξάρτηση της απόκρισης τους από το χρόνο έκθεσης στην υπεριώδη ακτινοβολία, τη θερμοκρασία και το χρόνο αποθήκευσης (Giannoglou et al., 2013) 20

22 b a Ea 1 1 ΔΕ ΔΕ tc t C exp( (k ref (Tref,t 1s) t C exp( ( ))) t) 1s c R T Tref όπου ΔΕ tc=1s η αρχική απόκριση (t=0) του φωτοχημικού δείκτη τύπου B1 εκτιθέμενου υπό την υπεριώδη ακτινοβολία για 1s, t c ο χρόνος έκθεσης στην υπεριώδη ακτινοβολία, E a η ενέργεια ενεργοποίησης (J/mol), R η παγκόσμια σταθερά αερίων, T ref η θερμοκρασία αναφοράς (-10 C), k ref,tref,1s ο ρυθμός απόκρισης του ΤΤΙ στην T ref για t c =1s, a and b σταθερές και t, T ο χρόνος και η θερμοκρασία αποθήκευσης αντίστοιχα. Παρόμοιο μαθηματικό μοντέλο αναπτύχθηκε και για τα ενζυμικά ΤΤΙ το οποίο περιγράφει την εξάρτηση της απόκρισής τους από τη συγκέντρωση του ενζύμου, το χρόνο και τη θερμοκρασία αποθήκευσης (Giannoglou et al., 2013) X F(X C ) k 1 exp k 1,ref 2,ref * C B1 * C 21 B 1 E a 1 * exp R T E a 1 2 * exp R T όπου T η θερμοκρασία αποθήκευσης (K), E a η ενέργεια ενεργοποίησης (J/mol), R η παγκόσμια σταθερά αερίων, T ref η θερμοκρασία αναφοράς (-10 C), C η συγκέντρωση του ενζύμου (5-20U) και B 1,2 σταθερές. Υπολογισμός διάρκειας ζωής κατεψυγμένων φιλέτων γλαυκοκαρχαρία Για τον υπολογισμό της διάρκειας ζωής του προϊόντος αναπτύχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω εξισώσεις (Giannoglou et al., 2013) t SL k lnc ref,tvb TVB N,l lnc TVB N,o Ea 1 Nexp R T 1 T ref t SL k C ref,tbars TBARS, l C TBARS, o Ea 1 exp R T 1 T ref 1 T t ref 1 T SL ref k t ref s s o E a 1 1, s exp R T Tref όπου t SL η διάρκεια ζωής (d) των κατεψυγμένων φιλέτων γλαυκοκαρχαρία, C TVB-N,l, C TBARS,l και s l τα μέγιστα όρια των TVB-N (12mgN/100g), TBARs (3.5 mgmda/kg) και της συνολικής οργανοληπτικής εντύπωσης (βαθμολόγηση 5) αντίστοιχα, C TVB-N,o, C TBARS,o and s o οι αρχικές τιμές των TVB-N, TBARs και της συνολικής εντύπωσης αντίστοιχα, k ref η σταθερά του ρυθμού ποιοτικής υποβάθμισης στην T ref =-15 C, E a η ενέργεια ενεργοποίησης (J/mol) και R η παγκόσμια σταθερά αερίων. Εφαρμογή και επαλήθευση των επιλεγμένων ΤΤΙ Βάσει των προαναφερόμενων κινητικών μοντέλων, επιλέχθηκαν ως βέλτιστα για την παρακολούθηση της ποιοτικής υποβάθμισης των κατεψυγμένων φιλέτων γλαυκοκαρχαρία, το φωτοχημικό ΤΤΙ τύπου Β1 για χρόνο έκθεσης στην υπεριώδη ακτινοβολία 0,4s (B1-0.4s) και το ενζυμικό ΤΤΙ τύπου Μ με συγκέντρωση ενζύμου 20U (M-20U). Στα παρακάτω διαγράμματα γίνεται σύγκριση της προβλεπόμενης, με βάση το ΤΤΙ, εναπομένουσας ζωής του τροφίμου, με την πραγματική εναπομένουσα διάρκεια ζωής σε οποιοδήποτε σημείο της αλυσίδας διακίνησης, όπως αυτή υπολογίζεται από το πραγματικό χρονοθερμοκρασιακό ιστορικό του τροφίμου και του επαληθευμένου κινητικού μοντέλου μεταβολής της συνολικής οργανοληπτικής εντύπωσης. l

23 Με το σφάλμα στην τιμή της εναπομένουσας διάρκειας ζωής που προσδιορίστηκε βάσει ΤΤΙ να εμφανίζεται αρκετά μικρό, η αποτελεσματικότητα των ΤΤΙ για την παρακολούθηση της ποιότητας των κατεψυγμένων αλιευμάτων επαληθεύεται σε πραγματικές συνθήκες της ψυκτικής αλυσίδας. Η χρήση των ΤΤΙ θα μπορούσε να οδηγήσει σε καλύτερη διαχείριση και βελτιστοποίηση της αλυσίδας κατάψυξης από την παραγωγή του προϊόντος στην κατανάλωση. (a) (b) (c) Διάγραμμα 1. Σύγκριση εναπομένουσας διάρκειας ζωής κατεψυγμένων φιλέτων γλαυκοκαρχαρία (Τref=-15 C) βάσει της οργανοληπτικής αξιολόγησης (SLR experimental) με την προβλεπόμενη βάσει της απόκρισης του φωτοχημικού ΤΤΙ B1-0.4sec (RSL TTI) σε θερμοκρασίες (a) -5 C, (b) -10 C και (c) Var1. (a) (b) (c) Διάγραμμα 2. Σύγκριση εναπομένουσας διάρκειας ζωής κατεψυγμένων φιλέτων γλαυκοκαρχαρία (Τref=-15 C) βάσει της οργανοληπτικής αξιολόγησης (SLR experimental) με την προβλεπόμενη βάσει της απόκρισης του ενζυμικού ΤΤΙ M-20U ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ (RSL TTI) σε θερμοκρασίες (a) -5 C, (b) -10 C και (c) Var1. Η μελέτη υποστηρίχτηκε από το Ευρωπαϊκό πρόγραμμα με τίτλο: IQ-Freshlabel Developing novel intelligent labels for chilled and frozen food products and promoting the influence of smart labels application on waste reduction, food quality and safety in the European supply chains FP7-SME ( ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Giannoglou M., Touli A., Platakou E., Tsironi T., Taoukis P.S, Predictive modeling and selection of Time Temperature Integrators for monitoring the quality and shelf life of frozen seafood. J. Food Science (In preparation). Taoukis P, Labuza TP Time temperature indicators. In: Novel Food Packaging Techniques. R. Ahvenainen (ed.). Woodhead Publ., Cambridge, UK. Tsironi, T., Stamatiou, A., Giannoglou, M., Velliou, E., Taoukis, P.S Predictive modelling and selection of Time Temperature Integrators for monitoring the shelf life of modified atmosphere packed gilthead seabream fillets. LWT-Food Science and Technology, 44(4),

24 Επίδραση εδώδιμων αντιμικροβιακών μεμβρανών σε ζαμπόν και λουκάνικα Φρανκφούρτης στον έλεγχο του Listeria monocytogenes μετά από αναθέρμανση σε μικροκύματα Kαπετανάκου Α.Ε., Καρυώτης Δ., Σκανδάμης Π.N.* Εργαστήριο Ποιοτικού Ελέγχου και Υγιεινής Τροφίμων και Ποτών, Επιστήμη και Τεχνολογία Τροφίμων, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Ιερά οδός 75, 11855, Αθήνα *Τηλ./Φαξ: , Σκοπός της μελέτης ήταν η εκτίμηση της: α) αποτελεσματικότητας εδώδιμων μεμβρανών (ΕΜ) με παραδοσιακά αλκοολούχα αποστάγματα (ΑΑ) στην αναστολή της ανάπτυξης του Listeria monocytogenes σε ζαμπόν και β) επίδρασης των ΕΜ με ΑΑ σε λουκάνικα τύπου Φρανκφούρτης μετά από αναθέρμανση σε μικροκύματα στην μείωση του παθογόνου. Φέτες ζαμπόν (τρία/συσκευασία;10x10cm) και λουκάνικα τύπου Φρανκφούρτης (δύο/συσκευασία;5x2cm) ενοφθαλμίστηκαν αντίστοιχα με logcfu/cm 2, από μίγμα στελεχών L.monocytogenes (1/2a;4b). Μεμβράνες αλγινικoύ-na (1.5% κ.ό.) εμβαπτίστηκαν σε καθαρή αιθανόλη (40% κ.ό.) ή παραδοσιακά αποστάγματα (39-41% αιθανόλη) όπως ρακή, τσίπουρο και ούζο (3 λεπτά). Δείγματα χωρίς ΕΜ ή με ΕΜ αλλά χωρίς ΑΑ ή αιθανόλη αποτέλεσαν τους μάρτυρες. Τα λουκάνικα τοποθετήθηκαν ανάμεσα σε δύο ΕΜ, ενώ μία ΕΜ τοποθετήθηκε ανάμεσα σε δύο φέτες ζαμπόν. Τα δείγματα συντηρήθηκαν υπό κενό στους 4 και 10 ο C (n=4). Τα λουκάνικα τοποθετήθηκαν σε περιέκτες με νερό και αναθερμάνθηκαν σε μικροκύματα (1000W/ 60sec;56±2 C) κατά τις ημέρες 0, 20 και 40 ή 0, 9 και 15 στους 4 C ή 10 C, αντίστοιχα. Στο ζαμπόν, όλες οι ΕΜ-ΑΑ διατήρησαν τα επίπεδα του L.monocytogenes 5.0 logcfu/cm 2 χαμηλότερα από τους μάρτυρες μετά από 80 και 50 ημέρες στους 4 και 10 C, αντίστοιχα. Στα λουκάνικα με ΕΜ-ΑΑ, οι πληθυσμοί του παθογόνου παρέμειναν logcfu/cm 2 χαμηλότερα από τους μάρτυρες μετά από 40 ημέρες στους 4 C, ενώ στους 10 C, η αναστολή της ανάπτυξης περιορίστηκε στους logcfu/cm 2 μετά από 15 ημέρες. Σε αντίθεση με τους 10 C, οι επιζήσαντες πληθυσμοί του L.monocytogenes στα λουκάνικα με ΕΜ-ΑΑ που συντηρήθηκαν στους 4 C και αναθερμάνθηκαν σε μικροκύματα, αυξήθηκε κατά logcfu/cm 2 την 40 η ημέρα συγκριτικά με την 0 η. Η αρχική θερμοανθεκτικότητα των μαρτύρων παρέμεινε αμετάβλητη (2.5 logcfu/cm 2 ;p 0.05) κατά την συντήρηση. Οι κανονισμοί ασφάλειας τροφίμων που σχετίζονται με αντιμικροβιακές μεταχειρίσεις των έτοιμων προς κατανάλωση προϊόντων οφείλουν να διασφαλίσουν τόσο τα χαμηλά επίπεδα παρουσίας του L.monocytogenes όσο και την ελάχιστη δυνατή ανθεκτικότητα κατά την εφαρμογή συνηθισμένων καταναλωτικών πρακτικών (π.χ., μικροκύματα). 23

25 Μελέτη της επίδρασης διαφορετικών μαρινάδων στη μικροχλωρίδα τεμαχίων κοτόπουλου υπό διαφορετικές συνθήκες χρόνου και θερμοκρασίας εμβάπτισης Αναστασία Ε. Λύτου, Βασιλική Α. Μπλάνα, Ευστάθιος Ζ. Πανάγου, Γεώργιος-Ιωάννης Ε. Νυχάς* Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων, Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Ιερά Οδός 75, Αθήνα, * επικοινωνίας: ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το μαρινάρισμα του κρέατος αποτελεί συνήθη πρακτική που στοχεύει τόσο στη βελτίωση της ποιότητας όσο και στην επιμήκυνση της διάρκειας ζωής του. Στην παρούσα μελέτη επιλέχθηκαν 5 διαφορετικές μαρινάδες (χυμός λεμονιού, μηλόξυδο, χυμός ροδιού και συνδυασμοί αυτών) στις οποίες εμβαπτίστηκαν τεμάχια κοτόπουλου για διαφορετικά χρονικά διαστήματα (1, 3, 6, 9 ή 24 ώρες) στους 4, 10 και 20 C. Μετά το πέρας του χρόνου εμβάπτισης προσδιορίστηκαν η ολική μεσόφιλη χλωρίδα, καθώς και οι πληθυσμοί των Pseudomonas spp., Brochothrix thermosphacta, Enterobacteriaceae και οξυγαλακτικών βακτηρίων. Επίσης πραγματοποιήθηκε μέτρηση του ph και ανάλυση με τη μέθοδο της πολυφασματικής απεικόνισης. Η μείωση της ολικής μεσόφιλης χλωρίδας (ΟΜΧ), μετά την εμβάπτιση, κυμάνθηκε από 1,0 έως 3,0 log CFU/g. Με εξαίρεση το μαρινάρισμα διάρκειας μίας ώρας, τόσο η θερμοκρασία όσο και ο χρόνος εμβάπτισης δεν έδειξε να έχουν επίδραση στο τελικό πληθυσμό των υπό εξέταση μεταχειρίσεων. Αξιολογώντας την οσμή, τη γεύση και την τρυφερότητα του θερμικά επεξεργασμένου προϊόντος (στους 180 C για 20 λεπτά), με την υψηλότερη βαθμολογία αξιολογήθηκαν τα δείγματα που εμβαπτίστηκαν στις μαρινάδες για μικρό χρονικό διάστημα (1 και 3 ώρες), ενώ ο χυμός ροδιού και οι συνδυασμοί του οδήγησαν σε ένα οργανοληπτικά πιο ικανοποιητικό αποτέλεσμα. ABSTRACT Marination is a common practice for enhancing quality while prolonging the shelf life of meat. Ten gram samples of chicken breast fillets were immersed in five different marinades (lemon juice, apple cider vinegar, pomegranate juice and combinations of them) for 1, 3, 6, 9 and 24 hours at 4, 10 and 20 C. After marination, levels of total viable counts (TVC), Pseudomonas spp., Brochothrix thermosphacta, Enterobacteriaceae and lactic acid bacteria were determined while ph measurements and multispectral imaging analyses were performed. Marination led to a reduction in TVC by 1 to 3 log cfu/g. Except for one hour marinating, both the temperature and the time did not seem to affect microbial counts. Evaluating odor, flavor and tenderness of oven-cooked samples (at 180 C for 20 minutes), samples marinated for limited time 24

26 intervals (1 and 3 hours) were evaluated with higher scores, while pomegranate juice and combinations of it led to an organoleptically more satisfactory result. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ως μαρινάρισμα χαρακτηρίζεται η εμβάπτιση του κρέατος σε διάλυμα που περιέχει ένα συνδυασμό συστατικών (π.χ. χυμό λεμονιού, ξύδι, κρασί, λάδι, άλμη, καρυκεύματα και βότανα) με στόχο τη βελτίωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών του κρέατος και την επιμήκυνση της διάρκειας ζωής του προϊόντος (Pathania et al. 2010, Kargiotou et al. 2011). Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η εκτίμηση της επίδρασης διαφορετικών μαρινάδων στη μικροχλωρίδα και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά φιλέτων από στήθος κοτόπουλου κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες εμβάπτισης (χρόνο και θερμοκρασία). ΥΛΙΚΑ KAI ΜΕΘΟΔΟΙ Προετοιμασία τεμαχίων κοτόπουλου Χρησιμοποιήθηκαν φιλέτα από στήθος κοτόπουλου τα οποία τεμαχίστηκαν υπό ασηπτικές συνθήκες σε ομοιόμορφα τεμάχια βάρους 10 γραμμαρίων. Προετοιμασία μαρινάδων Παρασκευάστηκαν στο εργαστήριο πέντε μαρινάδες οι οποίες διαφοροποιήθηκαν ως προς το βασικό τους συστατικό (χυμός λεμονιού, μηλόξυδο, χυμός ροδιού καθώς και συνδυασμοί αυτών). Επιπλέον οι μαρινάδες περιείχαν ελαιόλαδο (30 ml ανά 100 ml μαρινάδας), αποξηραμένο θυμάρι (0,1% w/v) και μέλι (2,0% w/v). Εμβάπτιση σε μαρινάδες Η εμβάπτιση των δειγμάτων στις μαρινάδες πραγματοποιήθηκε σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες (4, 10 και 20 C) για πέντε διαφορετικά χρονικά διαστήματα (1, 3, 6, 9 και 24 ώρες). Για την κάθε περίπτωση παρασκευάστηκαν μαρινάδες συνολικού όγκου 100 ml στην κάθε μία από τις οποίες εμβαπτίστηκαν πλήρως επτά (7) δείγματα κοτόπουλου. Μικροβιολογικές αναλύσεις Αμέσως μετά την ολοκλήρωση του χρόνου εμβάπτισης προσδιορίστηκαν η ολική μεσόφιλη χλωρίδα, οι πληθυσμοί των Pseudomonas spp., Br. thermosphacta, Enterobacteriaceae και οξυγαλακτικών βακτηρίων με βάση τη μέθοδο που έχει περιγραφθεί από τους Papadopoulou et al Φυσικοχημικές αναλύσεις Πραγματοποιήθηκε μέτρηση του pη των μαρινάδων καθώς και των δειγμάτων κοτόπουλου μετά την ολοκλήρωση κάθε δειγματοληψίας. Επιπλέον λήφθησαν εικόνες μαριναρισμένων και μη δειγμάτων με τη μέθοδο της πολυφασματικής απεικόνισης (VideometerLab) σε 18 διαφορετικά μήκη κύματος. 25

27 Οργανοληπτική αξιολόγηση Για κάθε συνδυασμό θερμοκρασίας/χρόνου εμβάπτισης πραγματοποιήθηκε οργανοληπτική αξιολόγηση των δειγμάτων μετά από θερμική επεξεργασία (στους 180 C για 20 λεπτά) από 4 δοκιμαστές. Τα δείγματα αξιολογήθηκαν ως προς τη γεύση, την οσμή και την τρυφερότητα σε κλίμακα από 1 έως 5 (πιο επιθυμητά χαρακτηριστικά - 5). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η αρχική μικροχλωρίδα του κοτόπουλου, στην οποία κυριαρχούσαν οι ψευδομονάδες, ήταν της τάξεως των 5,5-6,0 log CFU/g γεγονός που καθιστά το κοτόπουλο ένα ιδιαίτερα ευαλλοίωτο τρόφιμο. Οι μαρινάδες επέφεραν μείωση στην ΟΜΧ από 1,0 έως 3,0 λογαριθμικές μονάδες (Γράφημα 1). Η μείωση αυτή ήταν ελαφρώς εντονότερη στις ψευδομονάδες φτάνοντας τις 4,0 λογαριθμικές μονάδες στην περίπτωση της εμβάπτισης σε μηλόξυδο. (α) (β) (γ) Γράφημα 1. Επίδραση διαφορετικών μαρινάδων (λεμόνι, μηλόξυδο, ρόδι, ρόδι και λεμόνι, ρόδι και μηλόξυδο) και χρόνου εμβάπτισης (1, 3, 6, 9, 24 ώρες) στην ολική μεσόφιλη χλωρίδα τεμαχίων από στήθος κοτόπουλου κατά το μαρινάρισμα στους (α) 4 (β) 10 και (γ) 20 C. Η επίδραση των μαρινάδων ήταν ιδιαίτερα ισχυρή έναντι του Br. thermosphacta αφού οδήγησαν σε μείωση 2,0 (μεταχείριση με ρόδι) έως 5,0 (μεταχείριση με μηλόξυδο) λογαριθμικών μονάδων στους πληθυσμούς του μικροοργανισμού. Αντίθετα, οι μαρινάδες δεν επέφεραν σημαντικές μειώσεις στους πληθυσμούς των γαλακτικών βακτηρίων, γεγονός το οποίο αναμένονταν δεδομένου ότι το όξινο περιβάλλον τους δεν είναι απαγορευτικό για τα οξυγαλακτικά βακτήρια (Bjorkroth, 2005), ενώ φάνηκαν ιδιαίτερα δραστικές έναντι των εντεροβακτηρίων των οποίων οι πληθυσμοί ήταν κάτω του ορίου ανίχνευσης μετά την εμβάπτιση. Τέλος οι διαφορετικές θερμοκρασίες εμβάπτισης δεν παρουσίασαν αξιοσημείωτη επίδραση στους υπό μελέτη μικροβιακούς πληθυσμούς, ενώ όσον αφορά στους χρόνους εμβάπτισης 26

28 παρατηρήθηκε ότι στις περισσότερες περιπτώσεις η εμβάπτιση διάρκειας 3 ωρών είναι αρκετή για να προκληθεί σημαντική μείωση των μικροοργανισμών που δύναται να επιφέρει η κάθε μαρινάδα. Όσον αφορά στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά η μαρινάδα με βάση το ρόδι, καθώς και οι συνδυασμοί αυτής με το χυμό λεμονιού και το μηλόξυδο έλαβαν την υψηλότερη βαθμολογία στην κλίμακα 1 έως 5, τόσο ως προς τη γεύση όσο και ως προς την τρυφερότητα και την οσμή του θερμικά επεξεργασμένου κοτόπουλου. Γενικότερα, σε όλες τις μεταχειρίσεις το καλύτερο οργανοληπτικό αποτέλεσμα έδωσε η εμβάπτιση για μικρό χρονικό διάστημα (1 και 3 ώρες), ενώ οι διαφορετικές θερμοκρασίες εμβάπτισης δε διαφοροποίησαν το οργανοληπτικό αποτέλεσμα. Στα αποτελέσματα που προέκυψαν από το VideometerLab (σύστημα ανάλυσης εικόνας) παρατηρείται ότι στις μεταχειρίσεις που χρησιμοποιείται ως κύριο συστατικό το ρόδι παρουσιάζονται υψηλότερες τιμές ανάκλασης στα διαφορετικά μήκη κύματος κατά το μαρινάρισμα για μικρά χρονικά διαστήματα (1 και 3 ώρες). Το γεγονός αυτό μεταφράζεται σα μικρότερη αλλαγή στο χρώμα του δείγματος εξαιτίας της μαρινάδας (πιο ανοιχτόχρωμο δείγμα). Βιβλιογραφικές αναφορές Pathania, A., McKee, S.R., Bilgili, S.F., Singh, M. (2010). Antimicrobial activity of commercial marinades against multiple strains of Salmonella spp. International Journal of Food Microbiology 139, Kargiotou, C., Katsanidis, E., Rhoades, J., Kontominas, M., Koutsoumanis, K. (2011). Efficacies of soy sauce and wine base marinades for controlling spoilage of raw beef. Food Microbiology 28, Bjorkroth, J. (2005). Microbiological ecology of marinated meat products. Meat Science 70, Papadopoulou, O., Panagou, S., Tassou, S., Nychas, G.J. 2011). Contribution of Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy data on the quantitative determination of minced pork meat spoilage. Food Research International 44, Ευχαριστίες Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια της πράξης Θαλής: «Ανάπτυξη, μαθηματική περιγραφή και άριστος σχεδιασμός καινοτόμων μη θερμικών τεχνολογιών για την επεξεργασία, συσκευασία, διακίνηση και αποθήκευση τροφίμων βελτιωμένης ποιότητας και ασφάλειας», που υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος "Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση" (ΕΠΕΔΒΜ) και συγχρηματοδοτείται από το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο (ΕΚΤ). 27

29 ΑΞΙΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΥΓΡΩΝ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΕΛΑΙΟΥΡΓΕΙΩΝ ΓΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ Γιαβάσης Ιωάννης 1*, Δημητράκου Λυδία 1, Μπούρος Χρήστος 1, Ζάρα Παναγιώτα 1, Ανδριόπουλος Παναγιώτης 1, Μανούρας Αθανάσιος 1, Πετρωτός Κωσταντίνος 2 1 ΤΕΙ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ, Τμήμα Τεχνολογίας τροφίμων, Εργαστήριο Μικροβιολογίας & Βιοτεχνολογίας Τροφίμων, Τέρμα Ν. Τεμπονέρα, 43100, Καρδίτσα. 2 ΤΕΙ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ, Τμήμα Μηχανικής Βιοσυστημάτων, Εργαστήριο Μηχανικής τροφίμων, Περιφερειακός Λάρισας-Τρικάλων, 41110, Λάρισα. *Υπεύθυνος Επικοινωνίας-Επιβλέπων: Δρ. Ιωάννης Γιαβάσης, Εmail: igiavasis@teilar.gr Περίληψη Tα υγρά απόβλητα ελαιουργείων αποτελούν σημαντικό και δύσκολα διαχειρίσιμο αγροβιομηχανικό ρύπο με υψηλό οργανικό φορτίο και η επιβάρυνση που προκαλεί η απόρριψή τους στο περιβάλλον είναι πολύ μεγάλη λόγω της τοξικότητας που έχουν για υδρόβιους και φυτικούς οργανισμούς. Στην παρούσα μελέτη επιχειρήθηκε η αξιοποίηση των υγρών αποβλήτων ελαιουργείων για παραγωγή μονοκυτταρικής πρωτεΐνης από ζύμες και μύκητες, μετά από αποφαινολοποίηση (απομάκρυνση μεγάλου μέρους των πολυφαινολών που λειτουργούν ανασταλτικά για τη ζύμωση) και συμπύκνωση (ώστε να αυξηθεί η συγκέντρωση σακχάρων του υποστρώματος), ώστε να διευκολυνθεί η ανάπτυξη των μικροοργανισμών και η παραγωγή πρωτεΐνης. Οι μικροοργανισμοί που μελετήθηκαν ήταν οι Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, Pleurotus ostreatus. Μελετήθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης (ph, θερμοκρασία, ταχύτητα ανάδευσης και αερισμού, σύσταση υποστρώματος, κλπ) οι οποίες διέφεραν για τον κάθε μικροοργανισμό, καθώς και η συγκέντρωση πρωτεϊνης αλλά και φαινολικών ουσιών στα κύτταρα των μικροοργανισμών. Οι ζύμες πέτυχαν ικανοποιητική παραγωγή σε σχετικά σύντομο χρόνο, με υψηλά ποσοστά ενδοκυτταρικής πρωτεϊνης, ενώ ο μύκητας Pleurotus ostreatus είχε βραδεία ανάπτυξη και μικρότερα ποσοστά πρωτεϊνης. Σε όλες τις ζυμώσεις οι τιμές ΒΟD και COD στο εναπομείναν (απορριπτέο) υγρό ζύμωσης μετά την απομάκρυνση των κυττάρων ήταν αρκετά χαμηλότερα από τις αρχικές τιμές, συνεπώς πέραν της παραγωγής ενός προϊόντος προστιθέμενης αξίας (μονοκυτταρική πρωτεΐνη) από τα ελαιουργικά απόβλητα, επιτεύχθηκε και σημαντική μείωση στο ρυπαντικό τους φορτίο. 28

30 Επίδραση της υπερυψηλής πίεσης στην επιβίωση του παθογόνου βακτηρίου Salmonella enterica ser. Enteritidis και της φυσικής μικροχλωρίδας σε φιλέτα κοτόπουλου Α.Α. Αργύρη, Ν.Γ. Χωριανόπουλος, Π.I. Σουρρή, Φ.I. Σαμαράς και Χ.X. Τάσσου Ελληνικός Γεωργικός Οργανισμός ΔΗΜΗΤΡΑ, Ινστιτούτο Τεχνολογίας Γεωργικών Προϊόντων, Σ. Βενιζέλου 1, Λυκόβρυση Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση της υπερυψηλής πίεσης (ΥΥΠ) στη φυσική χλωρίδα φιλέτων κοτόπουλου και στο παθογόνο Salmonella enterica ser. Enteritidis. Συγκεκριμένα, φιλέτα κοτόπουλου εμβολιάσθηκαν με Salmonella enterica ser. Enteritidis (μικτή καλλιέργεια 4 στελεχών) σε συγκεντρώσεις 10 3, 10 5 και 10 7 cfu/g, συσκευάσθηκαν σε κενό και εφαρμόσθηκε υπερυψηλή πίεση 500 MPa για 10 λεπτά. Στη συνέχεια τα δείγματα συντηρήθηκαν υπό κενό στους 4 και 12 C. Οι μικροβιολογικές αναλύσεις περιλάμβαναν μετρήσεις: ολικής μεσόφιλης χλωρίδας, Salmonella enterica, Pseudomonads, Brochothrix thermosphacta, lactic acid bacteria (LAB), Enterobacteriaceae, ζύμες/μύκητες και εμπλουτισμός του παθογόνου για την παρουσία/απουσία σε περίπτωση μη ανίχνευσής του με τη μεθοδο καταμέτρησης. Επίσης πραγματοποιήθηκαν οργανοληπτικές αναλύσεις σε μη εμβολιασμένα δείγματα για τον καθορισμό του χρόνου ζωής του προϊόντος. Στην περίπτωση των δειγμάτων που είχε εφαρμοσθεί YYΠ, όλες οι ομάδες μικροοργανισμών παρέμειναν κάτω από τα όρια της μεθόδου καταμετρησης, εκτός από το Br. thermosphacta που εμφανίζεται να αποτελεί τον κύριο αλλοιογόνο μικροοργανισμό σε αυτά τα δείγματα. Επιπλέον, σύμφωνα με τον οργανοληπτικό έλεγχο, η εφαρμογή ΥΥΠ φαίνεται να αυξάνει το χρόνο ζωής των φιλέτων κοτόπουλου κατά 6 ημέρες συγκριτικά με το μάρτυρα. Η εφαρμογή της ΥΥΠ στα εμβολιασμένα δείγματα είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του πληθυσμού του παθογόνου στα όρια ανίχνευσης της μεθόδου καταμέτρησης, ακόμη και στα δείγματα με υψηλό αρχικό εμβόλιο, επιτυγχάνοντας μείωση του πληθυσμού έως και 10 7 cfu/g. H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) - Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: ΘΑΛΗΣ Ενίσχυση της Διεπιστημονικής ή και Διιδρυματικής έρευνας και καινοτομίας. 29

31 30

32 Συνεδρία Α2 31

33 32

34 AΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΕΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΠΟΛΥΦΑΙΝΟΛΩΝ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΩΝ ΑΠΟ ΥΓΡΑ ΑΠΟΒΛΗΤΑ ΕΛΑΙΟΥΡΓΕΙΩΝ: ΜΕΛΕΤΕΣ ΙΝ VITRO ΚΑΙ ΕΠΙΤΥΧΗΜΕΝΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΕ ΤΡΟΦΙΜΑ Γιαβάσης Ιωάννης 1 *, Λεοντόπουλος Στέφανος 2, Τσαούση Κωσταντίνα 1, Αργυρίου Ειρήνη-Ελένη 1, Κανδυλάκης Μάριος 1, Κασαπίδου Ελένη 3, Μανούρας Αθανάσιος 1, Πετρωτός Κωσταντίνος 2 1 ΤΕΙ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ, Τμήμα Τεχνολογίας τροφίμων, Εργαστήριο Μικροβιολογίας & Βιοτεχνολογίας Τροφίμων, Τέρμα Ν. Τεμπονέρα, 43100, Καρδίτσα. 2 ΤΕΙ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ, Τμήμα Μηχανικής Βιοσυστημάτων, Εργαστήριο Μηχανικής τροφίμων, Περιφερειακός Λάρισας-Τρικάλων, 41110, Λάρισα. 3 ΤΕΙ ΔΥΤΙΚΗΣ ΜΑΚΕΔΟΝΙΑΣ, Τμήμα Εμπορίας και Ποιοτικού Ελέγχου Αγροτικών Προϊόντων, Τέρμα Κοντοπούλου, 53100, Φλώρινα. *Υπεύθυνος Επικοινωνίας-Επιβλέπων: Δρ. Ιωάννης Γιαβάσης, Εmail: igiavasis@teilar.gr Περίληψη Tα υγρά απόβλητα ελαιουργείων αποτελούν σημαντικό και δύσκολα διαχειρίσιμο αγροβιομηχανικό ρύπο με υψηλή τοξικότητα έναντι υδρόβιων και φυτικών οργανισμών, εν μέρει εξαιτίας της παρουσίας φαινολικών ουσιών σε υψηλές συγκεντρώσεις. Ταυτόχρονα όμως αυτές οι ουσίες είναι πλούσιες σε αντιοξειδωτικές πολυφαινόλες που έχουν και αντιμικροβιακές ιδιότητες. Στην παρούσα έρευνα μελετήθηκε η ιn vitro αντιμικροβιακή δράση διαλυμάτων σκόνης πολυφαινολών από ελαιουργικά απόβλητα, σε ελεύθερη ή ενθυλακωμένη μορφή, που απομονώθηκαν μόνο με φυσικές διεργασίες, έναντι μιας σειράς παθογόνων και αλλοιογόνων βακτηρίων και πολλών αλλοιογόνων και φυτοπαθογόνων μυκήτων. Για κάθε μικροοργανισμό περιγράφονται οι ελάχιστες ανασταλτικές και θανατηφόρες συγκεντρώσεις πολυφαινολών, και οι ζώνες αναστολής σε θρεπτικά υποστρώματα. Επίσης σε σχέση με την αντιοξειδωτική δράση μελετήθηκε η αναστολή (θερμο)οξείδωσης έπειτα από την προσθήκη πολυφαινολών σε έλαια που θερμαίνονται. Σε επίπεδο τροφίμων, μελετήθηκαν οι αντιμικροβιακές ιδιότητες υψηλών και χαμηλών συγκεντρώσεων πολυφαινολών σε νωπά και επεξεργασμένα κρέατα και αλλαντικά, καθώς και δυνατότητα αναστολής της τάγγισης τους λίπους σε αυτά. Τέλος ερευνήθηκαν και τυχόν αντιοξειδωτικές δράσεις των πολυφαινολών σε ότι αφορά τη διατήρηση του κόκκινου χρώματος σε αλλαντικά. Η διεξοδική αυτή μελέτη έδειξε μια σημαντική ευρεία αντιβακτηριακή και αντιμυκητιακή δράση των πολυφαινολών σε υψηλές συγκεντρώσεις, καθώς και μια επιλεκτική αντιβακτηριδιακή δράση ενάντια σε Clostridium spp., Pseudomonas spp., Βrochothrix spp. σε χαμηλές συγκεντρώσεις σε νωπά και επεξεργασμένα κρέατα και αλλαντικά. 33

35 Ιδιαίτερα σημαντική ήταν η αντιοξειδωτική δράση είτε σε έλαια, είτε σε χοιρινό λίπος και σε αλλαντικά, όπου η επιβράδυνση της τάγγισης είναι σημαντική, ενώ ακόμα πιο εντυπωσιακή ήταν η επίδραση στο χρώμα των αλλαντικών ακόμα και σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Τα αποτελέσματα αυτά, σε συνδυασμό και με τις γνωστές βιολειτουργικές-φαρμακευτικές ιδιότητες των πολυφαινολών της ελιάς, καθιστούν το συγκεκριμένο προϊόν ένα νέο, αξιόλογο, λειτουργικό, φυσικό πρόσθετο τροφίμων με πολλές ευεργετικές ιδιότητες. 34

36 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΑΙΓΟΠΡΟΒΕΙΑΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΤΥΡΟΓΑΛΑΚΤΟΣ IN VITRO KAI ΣΤΗΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΣΕΙΡΑ C2C12 Ευθαλία Κερασιώτη, Αλέξανδρος Πρίφτης, Στέφανος Αϊβαζίδης, Δημήτριος Στάγκος, Δημήτριος Κουρέτας Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, Λάρισα Εισαγωγή Ο ορός γάλακτος (ή τυρόγαλα) είναι το υγρό απόβλητο της βιομηχανίας γάλακτος αλλά συγχρόνως χαρακτηρίζεται και ως λειτουργικό τρόφιμο (1,2). Είναι το υγρό που απομένει κατά τη διάρκεια παρασκευής του τυριού μετά την αφαίρεση της καζεΐνης του γάλακτος. Εξετάσαμε, 1) in vitro την αντιοξειδωτική δράση της αιγοπρόβειας πρωτεΐνης ορού γάλακτος (ΑΠΠΤ) και τη συγκρίναμε με πρωτεϊνικά σκευάσματα του εμπορίου, δηλαδή με πρωτεΐνη βοδινού (ΠΒ), πρωτεΐνη σόγιας (ΠΣ) και αγελαδινή πρωτεΐνη τυρογάλακτος (ΑΠ) και 2) τις αντιοξειδωτικές της ιδιότητες στην κυτταρική μυϊκή σειρά C2C12. Μεθοδολογία Προσδιορίστηκε in vitro η ικανότητα των πρωτεϊνών να εξουδετερώνουν τις ρίζες DPPH, ABTS +, OH, O 2 - καθώς και η αναγωγική τους δύναμη (ΑΔ). Επίσης, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της γλουταθειόνης (GSH) και των ελευθέρων ριζών (ROS) με κυτταρομετρία ροής, καθώς και τα επίπεδα των δραστικών ουσιών του θειοβαρβιτουρικού οξέος (TBARS) (δείκτης λιπιδικής υπεροξείδωσης) φασματοφωτομετρικά στην κυτταρική μυϊκή σειρά C2C12 υπό την επίδραση του οξειδωτικού παράγοντα t-booh. Αποτελέσματα Όλες οι πρωτεΐνες εμφάνισαν δοσοεξαρτώμενα αντιοξειδωτική δράση. Προσδιορίστηκε η τιμή IC 50 (mg/ml), η συγκέντρωση δηλαδή που εξουδετερώνει τις ρίζες κατά 50%, ενώ για την μέθοδο της ΑΔ προσδιορίστηκε η συγκέντρωση (mg/ml) που δίνει απορρόφηση 0.5 στα 700 nm (RP 0.5AU ) (Πίνακας 1). Πίνακας 1. Τιμές IC 50 (mg/ml) και RP 0.5AU (mg/ml) για την ΠΒ, ΠΣ, ΑΠΠΤ και ΑΠ. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως mean±sem. Πρωτεΐνες DPPH ABTS + OH O 2 - ΑΔ ΑΠΠΤ 3,1±0,06 4,1±0,15 1,8±0,20-1,3±0,05 ΠΒ 1,3±0,12 0,6±0,02 0,85±0,05 2,5±0,2 0,9±0,03 ΠΣ 2,2±0,31 3,1±1,00 1,1±0,34-3,1±1,20 ΑΠ 8,2±0,55 3,9±0,09 1,7±0,10-4,8±0,02 35

37 Όσον αφορά την κυτταρική μυϊκή σειρά C2C12, η ΑΠΠΤ προστάτευσε από τον οξειδωτικό παράγοντα t-booh. Συγκεκριμένα, η ΑΠΠΤ σε συγκεντρώσεις 0.78, 1.56, 3.12 και 6.24 mg/ml αύξησε τα επίπεδα της GSH κατά 25%, 112%, 118% και 138% αντίστοιχα, μείωσε τα επίπεδα των TBARS κατά 21%, 15%, 25% και 24% αντίστοιχα και μείωσε τα επίπεδα των ROS κατά 2.8%, 12.8%, 16.4% και 41.4% αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα στα οποία προστέθηκε μόνο το t- BOOH. Βιβλιογραφία 1) Kerasioti E, Kiskini A, Veskoukis A, Jamurtas A, Tsitsimpikou C, Tsatsakis AM, Koutedakis Y, Stagos D, Kouretas D, Vaios K. Effect of a special carbohydrate-protein cake on oxidative stress markers after exhaustive cycling in humans. Food Chem Toxicol (8): ) Kerasioti E, Stagos D, Jamurtas A, Kiskini A, Koutedakis Y, Goutzourelas N, Pournaras S, Tsatsakis AM, Kouretas D. Anti-inflammatory effects of a special carbohydrate-whey protein cake after exhaustive cycling in humans. Food Chem Toxicol : H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: Ηράκλειτος ΙΙ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου. STUDY OF THE ANTIOXIDANT ACTIVITY OF SHEEP WHEY PROTEIN IN VITRO AND IN C2C12 CELL LINE Efthalia kerasioti, Alexandros Priftis, Stefanos Aivazidis, Dimitrios Stagos, Demetrios Kouretas Department of Biochemistry & Biotechnology, University of Thessaly, Larisa, Introduction Whey is considered as by-product of cheese manufacturing, but it is also described as functional food (1, 2). Whey is the liquid that remains in an aqueous environment after removal of casein. We examined 1) in vitro the scavenging activity of sheep whey protein and compared with that one of beef protein, soy protein and cow whey protein, and 2) its antioxidant properties in C2C12 muscle cell line. Methodology It was determined in vitro the ability of proteins to neutralize DPPH, ABTS +, OH and O 2 - radicals as well as their reducing power. Also, we determined the levels of glutathione (GSH) and free radicals (ROS) by flow cytometry, as well as the levels of thiobarbituric reactive substances 36

38 (TBARS) (marker of lipid peroxidation) spectrophotometrically in muscle cell line C2C12 under the influence of the oxidative agent t-booh. Results All proteins showed a dose-dependent free radical scavenging activity. The IC 50 value was determined, showing the concentration at which the 50% of radicals are scavenged, while for reducing power assay, the RP 0.5AU was determined, the concentration that produces an absorbance of 0.5 at 700 nm (Table 1). Table1. IC 50 (mg/ml) and RP 0.5AU (mg/ml) for sheep whey protein, beef protein, soy protein and cow whey protein. Values are presented as mean±sem. Proteins DPPH ABTS + OH O 2 - RP Sheep protein whey 3,1±0,06 4,1±0,15 1,8±0,20-1,3±0,05 Beef protein 1,3±0,12 0,6±0,02 0,85±0,05 2,5±0,2 0,9±0,03 Soy protein 2,2±0,31 3,1±1,00 1,1±0,34-3,1±1,20 Cow protein whey 8,2±0,55 3,9±0,09 1,7±0,10-4,8±0,02 As regards the muscle cell line C2C12, sheep whey protein protected from the oxidative agent t- BOOH. Specifically, sheep whey protein at concentrations of 0.78, 1.56, 3.12 and 6.24 mg/ml, increased GSH levels by 25%, 112%, 118% και 138% respectively, decreased TBARS levels by 21%, 15%, 25% και 24% respectively and decreased ROS levels by 2.8%, 12.8%, 16.4% και 41.4% respectively, compared to t-booh treatment alone. References 1) Kerasioti E, Kiskini A, Veskoukis A, Jamurtas A, Tsitsimpikou C, Tsatsakis AM, Koutedakis Y, Stagos D, Kouretas D, Vaios K. Effect of a special carbohydrate-protein cake on oxidative stress markers after exhaustive cycling in humans. Food Chem Toxicol (8): ) Kerasioti E, Stagos D, Jamurtas A, Kiskini A, Koutedakis Y, Goutzourelas N, Pournaras S, Tsatsakis AM, Kouretas D. Anti-inflammatory effects of a special carbohydrate-whey protein cake after exhaustive cycling in humans. Food Chem Toxicol : This work was co-financed by the European Union (European Social Fund ESF) and Greek national funds through the Operational Program Education and Lifelong Learning of the National Strategic Reference Framework (NSRF) Research Funding Program: Heracleitus II. Investing in knowledge society through the European Social Fund. 37

39 Μελέτη της δυνατότητας σύμπλεξης ιόντων χαλκού και σιδήρου από αφεψήματα Ελληνικών βοτάνων Δήμητρα A.A. Κογιάννου 1, Χαρά Κουνδουράκη 1, Σωτήριος Καραβόλτσος 2, Αικατερίνη Σακελλάρη 2, Νίκος Καλογερόπουλος 1 * 1 : Τμήμα Επιστήμης Διαιτολογίας - Διατροφής, Χαροκόπειο Πανεπιστήμιο 2 : Εργαστήριο Χημείας Περιβάλλοντος, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ *nickal@hua.gr Copper and iron complexing properties of Greek herbal infusions D.A.A. Kogiannou 1, C. Koundouraki 1, S. Karavoltsos 2, A. Sakellari 2, N. Kalogeropoulos 1 * 1 : Department of Science of Dietetics-Nutrition, Harokopio University, Athens, Greece 2 : Laboratory of Environmental Chemistry, National and Kapodistrian University of Athens, Athens, Greece * nickal@hua.gr Abstract Aromatic plants contain significant amounts of several phytochemicals, known to exhibit metal chelating capacities, therefore being capable to modify metals bioaccessibility and inhibit their prooxidant potential. In this work we sought to investigate the Fe +2 and Cu +2 binding activities of freeze-dried infusions obtained from 13 common Greek aromatic plants. The infusions copper complexing capacity was determined by Diffetential Pulsed Anodic Stripping Voltammetry (DPASV), while ferrous binding capacity was determined photometrically. In order to get information for the components which are responsible for metal binding, samples were also analysed for organic carbon, several phytochemicals, antiodixant potential, surface active substances and catalytically active polysaccharides. The results indicated that all infusions exerted metal binding capacities. Regarding Cu 2+ binding potential, the infusions were classificied as follows: Rosemary < Chamomile < Mountain tea < Sage < St John s wort < Pink savory < Oregano < Lemon balm < Pennyroyal < Cretan marjoram < Cretan dittany < Thyme < Marjoram (complexing capacity μm Cu 2+ per cup), while the classification for Fe 2+ binding was: Rosemary < Sage < Cretan dittany < Pennyroyal < Pink savory < Lemon balm < Oregano < Marjoram < Thyme < Mountain tea < Cretan marjoram < St. John s wort < Chamomile (complexing capacity μm Fe 2+ per cup). These findings indicate that different classes of compounds are responsible for the chelation of each metal. Principal components analysis revealed that copper complexation is partly telated to carbohydrates, catalytically active polysaccharides, flavones, terpenic acids and terpenoid phenols. The complexation of Fe 2+ seems to be in some extend related to the phenolic content, OH-benzoic and OH-cinnamic acids, surface active compounds and the antioxidant attributes (DPPH, FRAP) of the herbal infusions studied. 38

40 Εισαγωγή Η χλωρίδα της Ελλάδας παρουσιάζει μεγάλη ποικιλότητα περιλαμβάνοντας πολλά ενδημικά είδη φαρμακευτικών φυτών και βοτάνων, τα οποία χρησιμοποιούνταν ήδη από την εποχή του Ιπποκράτη τόσο για την ευχάριστη γεύση που έδιναν κατά τις μαγειρικές παρασκευές όσο και για τις θεραπευτικές ιδιότητες που θεωρούνταν ότι διαθέτουν. Καταναλώνονται συνήθως υπό μορφή ροφημάτων και τους αποδίδονται πολλές ευεργετικές δράσεις, όπως αντιοξειδωτική, αντιαθηρογόνος, αντιβακτηριακή, αντιφλεγμονώδης, αντικαρκινική και άλλες, οι οποίες υποστηρίζονται από πρόσφατες επιδημιολογικές μελέτες που αποδεικνύουν ότι η κατανάλωσή τους συσχετίζεται αρνητικά με την εμφάνιση εκφυλιστικών νοσημάτων. Οι δράσεις αυτές αποδίδονται σε πλήθος συστατικών, γνωστών με τον όρο φυτοχημικά, στα οποία περιλαμβάνονται πολυφαινόλες, καροτενοειδή και τερπενοειδή. Οι πολυφαινόλες, που περιέχονται σε μεγάλο ποσοστό στα αρωματικά φυτά δρουν ως αντιοξειδωτικά μέσω 3 μηχανισμών: (α) μέσω της δέσμευσης ελευθέρων ριζών που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες, (β) μέσω αναγωγής οξειδωμένων παραγώγων και (γ) μέσω της δημιουργίας χηλικών συμπλόκων με βαρέα μέταλλα, όπως Cu, Fe, Zn, Co, Cr κ.ά. που μπορούν να δρουν ως προοξειδωτικά και να συμβάλλουν στο σχηματισμό δραστικών μορφών οξυγόνου. Έχει αποδειχθεί ότι όταν τα μέταλλα αυτά συσσωρεύονται σε μεγάλες ποσότητες στον οργανισμό προκαλούν οξειδωτικό στρες σε συγκεκριμένους ιστούς (νεφρούς, ήπαρ) με αποτέλεσμα να δρουν επιβαρυντικά σε περιπτώσεις χρόνιων νοσημάτων όπως είναι η νόσος Alzheimer και η αναιμία. Επομένως τα ροφήματα, όντας πλούσια σε φυτοχημικά, ενδέχεται να δρουν προστατευτικά δεσμεύοντας και μειώνοντας τη βιοδιαθεσιμότητα και την εν δυνάμει οξειδωτική δράση των προαναφερθέντων μετάλλων. Στην παρούσα εργασία αξιολογήθηκε η ικανότητα αφεψημάτων από 13 βότανα της Ελληνικής χλωρίδας να δεσμεύουν ιόντα Fe 2+ και Cu 2+, και έγινε προσπάθεια να διευκρινισθεί ποιά από τα συστατικά των ροφημάτων ευνοούν τον σχηματισμό συμπλόκων. Μεθοδολογία Παρασκευάσθηκαν ροφήματα των αρωματικών φυτών που φαίνονται στον Πίνακα 1., τα οποία στη συνέχεια λυοφιλιώθηκαν. Στα λυοφιλιωμένα ροφήματα προσδιορίσθηκαν, όπως περιγράφεται από τους Kaliora et al. (2014) και Kalogeropoulos et al. (2013), τα: (i) υδροξυβενζοϊκά οξέα, υδροξυκιναμμωμικά οξέα, τερπενοειδείς φαινόλες και τερπενικά οξέα με GC-MS, (ii) ολικές πολυφαινόλες, ολικές φλαβόνες, δυνατότητα δέσμευσης της ελεύθερης ρίζας DPPH και αναγωγική δύναμη (FRAP) με φωτομετρικές μεθόδους, (iii) δυνατότητα σύμπλεξης ιόντων Fe 2+ φωτομετρικά μετά από αντίδραση με φερροζίνη. Επίσης, προσδιορίσθηκαν, όπως περιγράφεται από τους Karavoltsos et al. (2013): (i) η δυνατότητα σύμπλεξης ιόντων Cu 2+ με διαφορική παλμική ανοδική αναδιαλυτική βολταμετρία (DPASV, Differential Pulse Anodic Stripping Voltammetry), (ii) ο οργανικός άνθρακας με καταλυτική οξείδωση, (iii) οι επιφανειακά ενεργές ενώσεις (SAS) με βολταμετρία εναλλασσόμενου ρεύματος εκλεκτικής φάσης (PSACV, Phase Selective Alternating 39

41 Current Voltammetry), (iv) οι καταλυτικά ενεργοί πολυσακχαρίτες (CAC) σε ph=5.1 και ph=8.2 με αναδιαλυτική χρονοποτενσιομετρία σταθερού ρεύματος με προσροφητική μεταφορά (AdT CPS, Adsorptive Transfer Constant Current Chronopotentiometric Stripping) και (v) οι μονο- (MCHOs) και πολυσακχαρίτες (PCHOs) φωτομετρικά. Αποτελέσματα- Συζήτηση Όλα τα αφεψήματα βρέθηκε ότι απελευθερώνουν ουσίες που συμπλέκουν τα ιόντα και των δύο μετάλλων, όπως φαίνεται στον Πίνακα 1. Η κατάταξη των ροφημάτων ως προς τη δυνατότητα σύμπλεξης ιόντων Cu 2+ ήταν: Δενδρολίβανο < Χαμομήλι < Τσάι Βουνού < Φασκόμηλο < Σπαθόχορτο < Θρύμπα < Ρίγανη < Μελισσόχορτο < Φλισκούνι < Αντωναΐδα < Δίκταμο < Θυμάρι < Μαντζουράνα, ενώ αντίστοιχα η κατάταξη για τα ιόντα Fe 2+ ήταν: Δενδρολίβανο < Φασκόμηλο < Δίκταμο < Φλισκούνι < Θρύμπα < Μελισσόχορτο < Ρίγανη < Μαντζουράνα < Θυμάρι < Τσάι Βουνού < Αντωναΐδα < Σπαθόχορτο < Χαμομήλι. Η διαφορετική κατάταξη των ροφημάτων δείχνει ότι διαφορετικές τάξεις οργανικών ουσιών είναι υπεύθυνες για τη δέσμευση των δύο μετάλλων. Η στατιστική ανάλυση κύριων συστατικών (PCA) των παραμέτρων οδήγησε στη δημιουργία 17 κύριων αξόνων. Οι προβολές στους 2 σημαντικότερους άξονες, που είναι υπεύθυνοι για το 61% (37% και 24% αντίστοιχα) της συνολικής διακύμανσης παρουσιάζονται στο Σχήμα 1, από το οποίο προκύπτει ότι η δυνατότητα σύμπλεξης των ιόντων Cu 2+ σχετίζεται εν μέρει με υδατάνθρακες, καταλυτικά ενεργούς πολυσακχαρίτες, φλαβόνες, τερπενικά οξέα και τερπενοειδείς φαινόλες. Αντίστοιχα, η δυνατότητα σύμπλεξης των ιόντων Fe 2+ φαίνεται ότι σχετίζεται με τις ολικές πολυφαινόλες, φαινολικά οξέα, τασιενεργά συστατικά και τις αντιοξειδωτικές ιδιότητες (DPPH, FRAP) των ροφημάτων. Πίνακας 1. Τα αρωματικά φυτά της μελέτης και η συμπλεκτική ικανότητα των ροφημάτων τους για ιόντα Cu 2+ και Fe 2+. (*: 1 cup=200ml) Αρωματικά φυτά Επιστημονική ονομασία Οικογένεια Cu-bind (μmol/cup*) Fe-bind (μmol/cup*) Χαμομήλι Matricaria chamomilla Asteraceae Δίκταμο Origanum dictamnus Lamiaceae Αντωναΐδα Origanum microphyllum Lamiaceae Μελισσόχορτο Melissa officinalis Lamiaceae Μαντζουράνα Origanum majorana Lamiaceae Τσάι του Sideritis syriaca Lamiaceae βουνού Ρίγανη Origanum vulgare Lamiaceae Φλισκούνι Mentha pulegium Lamiaceae Θρύμπα Satureja thymbra Lamiaceae Δενδρολίβανο Rosmarinus officinalis Lamiaceae Φασκόμηλο Salvia officinalis Lamiaceae Σπαθόχορτο Ηypericum perforatum Clusiaceae Θυμάρι Thymus vulgaris ssp hirtus Lamiaceae

42 Σχήμα 1. Ανάλυση κύριων συστατικών (Principal Component Analysis). Cu-bind: ικανότητα σύμπλεξης Cu 2+, Fe-bind: ικανότητα σύμπλεξης Fe 2+, TPC: ολικές πολυφαινόλες, FLAVON: ολικές φλαβόνες, OH-BENZOIC: υδροξυβενζοϊκά οξέα, OH-CINNAM: υδροξυκινναμωμικά οξέα, TERPAC: τερπενικά οξέα, TERPHEN: τερπενοειδείς φαινόλες, DPPH: δυνατότητα δέσμευσης ελευθέρων ριζών, FRAP: αναγωγική δύναμη), ξηρό υπόλειμμα (DRY), ολικός οργανικός άνθρακας (TOC), CAC: καταλυτικά ενεργοί πολυσακχαρίτες, MCHOs: μονοσακχαρίτες, PCHOs: πολυσακχαρίτες, SAS: τασιενεργά συστατικά). Βιβλιογραφία Kaliora AC, Kogiannou DAA, Kefalas P, Papassideri IS, Kalogeropoulos N Phenolic profiles and antioxidant and anticarcinogenic activities of Greek herbal infusions; balancing delight and chemoprevention? Food Chemistry, 142, Kalogeropoulos N, Yanni AE, Koutrotsios G, Aloupi M Bioactive microconstituents and antioxidant properties of wild edible mushrooms from the island of Lesvos, Greece. Food and Chemical Toxicology, 55, Karavoltsos S, Sakellari A, Strmečki S, Plavšić M, Ioannou E, Roussis V, Dassenakis M, Scoullos M Copper complexing properties of exudates and metabolites of macroalgae from the Aegean Sea. Chemosphere, 91,

43 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΦΑΙΝΟΛΙΚΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΣΤΕΜΦΥΛΩΝ ΣΕ ΔΕΙΚΤΕΣ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΥ ΣΤΡΕΣ ΣΕ ΜΥΙΚΑ ΚΑΙ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ ΚΑΙ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ Ν. Γκουτζουρέλας 1, Χ. Καρτερολιώτη 1, Σ. Γεωργαδάκης 1, Ν. Δεμερτζής 1, Π. Μαυρίδου 1, Δ. Στάγκος 1, Ν. Αληγιάννης 2, Λ. Σκαλτσούνης 2, Δ. Κουρέτας 1 1 Τμήμα Βιοχημείας-Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, Λάρισα Τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ, Πανεπιστημιούπολη Ζωγράφου, Αθήνα Εισαγωγή Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι το οξειδωτικό στρες σχετίζεται με δυσμενείς καταστάσεις για τον οργανισμό. Μελέτες έχουν δείξει ότι αντιοξειδωτικά, όπως πολυφαινόλες, που περιέχονται σε φυτικές τροφές μπορούν να μειώσουν το οξειδωτικό στρες (1). Έτσι, μελετήσαμε την επίδραση ενός εκχυλίσματος στεμφύλων, πλούσιο σε πολυφαινόλες (2), σε καλλιέργεια μυϊκών και ενδοθηλιακών κυττάρων. Μέθοδος Μυικά (C2C12) και ενδοθηλιακά (EΑhy926) κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες με την προσθήκη του εκχυλίσματος σε μη κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις. Στη συνέχεια προσδιορίστηκαν δείκτες οξειδωτικού στρες με κυτταρομετρία ροής, οι ελεύθερες ρίζες (ROS) και η γλουταθειόνη (GSH), και φασματοφωτομετρικά ο δείκτης λιπιδικής υπεροξείδωσης TBARS. Επίσης, μελετήθηκε η προστατευτική δράση του εκχυλίσματος στις δύο κυτταρικές σειρές, όταν τα κύτταρα επωάζονταν με τον οξειδωτικό παράγοντα tert-butylhydroperoxide (t-booh). Αποτελέσματα-Συζήτηση Το εξεταζόμενο εκχύλισμα χωρίς την παρουσία οξειδωτικού παράγοντα μείωσε τα TBARS κατά 29, 37 και 54% στα C2C12 κύτταρα σε συγκεντρώσεις 2,5, 5 και 10μg/ml αντίστοιχα σε σχέση με την καλλιέργεια ελέγχου ενώ στα EΑhy926 δεν παρουσιάστηκε κάποια σημαντική διαφορά. Επίσης, βρέθηκε ότι στα C2C12 η GSH αυξήθηκε στις συγκεντρώσεις 2,5, 5 και 10μg/ml κατά 151, 119 και 168% αντίστοιχα, ενώ στα EΑhy926 αυξήθηκε στις συγκεντρώσεις 0,0675 και 0,125μg/ml κατά 15%. Οι ROS στα C2C12 μειώθηκαν στις συγκεντρώσεις 5 και 10μg/ml κατά 39 και 48% ενώ στα EΑhy926 δεν παρατηρήθηκε κάποια διαφορά. Όσον αφορά τον οξειδωτικό παράγοντα t- BOOH, το εκχύλισμα έδρασε προστατευτικά καθώς όταν χορηγήθηκε πριν από αυτόν για 24 ώρες στα C2C12 σε συγκεντρώσεις 2,5, 5 και 10μg/ml αύξησε τη GSH κατά 22, 54 και 17% αντίστοιχα και μείωσε τα TBARS κατά 51, 52 και 36% αντίστοιχα σε σύγκριση με την καλλιέργεια ελέγχου. Επίσης, το εκχύλισμα στα EAhy926 μείωσε τα TBARS κατά 23, 20 και 18% σε συγκεντρώσεις 42

44 0,0675 και 0,125 και 0,25 μg/ml αντίστοιχα σε σύγκριση με την καλλιέργεια ελέγχου. Παρατηρούμε λοιπόν ότι το εκχύλισμα βελτιώνει την οξειδοαναγωγική κατάσταση των κυττάρων αλλά με διαφορετικό τρόπο στις διάφορες συγκεντρώσεις και στις διαφορετικές κυτταρικές σειρές, καθώς και με παρουσία ή όχι οξειδωτικού παράγοντα. Βιβλιογραφία 1) Stagos D, Portesis N, Spanou C, Mossialos D, Aligiannis N, Chaita E, Panagoulis C, Reri E, Skaltsounis L, Tsatsakis AM, Kouretas D. Correlation of total polyphenolic content with antioxidant and antibacterial activity of 24 extracts from Greek domestic Lamiaceae species. Food Chem Toxicol (11): ) Veskoukis AS, Kyparos A, Nikolaidis MG, Stagos D, Aligiannis N, Halabalaki M, Chronis K, Goutzourelas N, Skaltsounis L, Kouretas D. The antioxidant effects of a polyphenol-rich grape pomace extract in vitro do not correspond in vivo using exercise as an oxidant stimulus. Oxid Med Cell Longev. 2012;2012: STUDY OF THE EFFECTS OF POLYPHENOLIC GRAPE EXTRACT ON OXIDATIVE STRESS MARKERS IN MUSCLE AND ENDOTHELIAL CELLS USING FLOW CYTOMETRY AND SPECTROPHOTOMETRY Ν. Goutzourelas 1, C. Karterolioti 1, S. Georgadakis 1, Ν. Demertzis 1, P. Mauridou 1, D. Stagos 1, Ν. Aligiannis 2, L. Skaltsounis 2, D. Kouretas 1 1 Department of Biochemistry & Biotechnology, University of Thessaly, Ploutonos 26 & Aiolou, Larissa Division of Pharmacognosy and Natural Products Chemistry, School of Pharmacy, University of Athens, Panepistimiopolis Zografou, Athens Introduction It is well established the fact that oxidative stress is related to adverse conditions for living organisms. Studies have shown that antioxidants, like plant polyphenols found in plant foods, can reduce oxidative stress (1). Thus, we studied the effects of an extract rich in polyphenols (2) on muscle and endothelial cells. Method Muscle (C2C12) and endothelial (EAhy926) cells were grown for 24 hours with the addition of the extract at non-cytotoxic concentrations. Then, the oxidative stress markers, free radicals (ROS) 43

45 and glutathione (GSH), were determined by flow cytometry, and the lipid proxidation marker TBARS by spectrophotometry. Furthermore, it was examined the protective activity of the extract, in both cell lines, from tert-butylhydroperoxide (t-booh)-induced oxidative stress. Results Conclusions The tested extract, in C2C12 cells without the presence of the oxidative agent, reduced TBARS at concentrations of 2.5, 5 and 10 μg/ml by 29, 37 and 54% respectively compared to the control culture, while in EAhy926 cells there was not any significant difference. Also, it was found that, in C2C12 cells, GSH was increased at the concentrations of 2.5, 5 and 10 μg/ml by 151, 119 and 168% respectively, while in EAhy926 cells GSH was increased at concentrations of and 0.125μg/ml by 15%. ROS in C2C12 cells were reduced at concentrations of 5 and 10 μg/ml by 39 and 48%, while in EAhy926 cells there was not any significant difference. As regards the oxidative agent t-booh, the extract exhibited protection, since when it was administered before t-booh for 24 hours, in C2C12 cells, at concentrations of 2.5, 5 and 10 μg/ml, it increased GSH by 22, 54 and17% respectively and reduced TBARS by 51, 52 and 36% respectively compared to the control culture. Moreover, the extract reduced TBARS by 23, 20 and 18% in EAhy926 cells at concentrations of , and 0.25μg/ml respectively compared to the control culture. Thus, it is observed that the extract improved the antioxidant capacity of cells, but in a different way according to the different concentrations and cell lines as well as to the presence or absence of an oxidative agent. References 1) Stagos D, Portesis N, Spanou C, Mossialos D, Aligiannis N, Chaita E, Panagoulis C, Reri E, Skaltsounis L, Tsatsakis AM, Kouretas D. Correlation of total polyphenolic content with antioxidant and antibacterial activity of 24 extracts from Greek domestic Lamiaceae species. Food Chem Toxicol (11): ) Veskoukis AS, Kyparos A, Nikolaidis MG, Stagos D, Aligiannis N, Halabalaki M, Chronis K, Goutzourelas N, Skaltsounis L, Kouretas D. The antioxidant effects of a polyphenol-rich grape pomace extract in vitro do not correspond in vivo using exercise as an oxidant stimulus. Oxid Med Cell Longev. 2012;2012:

46 ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΟΦΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Νίκος Κατσαρός Επιστημονικός Συνεργάτης ΕΚΕΦΕ ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ Περίληψη Στις 16 Οκτωβρίου του 2010, εγκρίθηκε από την UNESCO, στο Ναϊρόμπι της Κένυα, η Μεσογειακή Διατροφή ως μέρος της άυλης πολιτιστικής κληρονομιάς της ανθρωπότητας. Ως αντιπροσωπευτικές πόλεις η Ιταλία πρότεινε το Σιλέντο, η Ισπανία την Σόρια, η Ελλάδα την Κορώνη και το Μαρόκο το Σεφσάουεν. Από τις τέσσερις χώρες που υπέβαλαν την πρόταση, κάθε μία έπρεπε να προτείνει και ένα αντιπροσωπευτικό πιάτο, έτσι: η Ελλάδα πρότεινε την χωριάτικη σαλάτα, η Ιταλία την καπρέζε, η Ισπανία την παέγια και το Μαρόκο το τατζίν. Σύμφωνα με την έκθεση της UNESCO, το ελαιόλαδο, το κρασί και το αλεύρι αποτελούν τη χρυσή τριλογία που ενώνει τους λαούς της Μεσογείου σε παραδοσιακές εκδηλώσεις παρά τις θρησκευτικές και άλλες διαφορές που τους χωρίζουν. Όλοι γνωρίζουμε ότι η Μεσογειακή Διατροφή στηρίζεται σε φρούτα, λαχανικά, όσπρια, δημητριακά, ελαιόλαδο και περιορισμένη κατανάλωση κόκκινου κρέατος. Σήμερα με την πρόοδο της βιοτεχνολογίας, μία σειρά από νέα προϊόντα έχουν ενταχθεί στη Μεσογειακή Διατροφή όπως: χυμοί από ρόδι, ιπποφαές, αλόη, κράνια κλπ. Επίσης, προϊόντα ζυμώσεων διαφόρων χυμών της Μεσογείου εισέρχονται στο πλαίσιο της Μεσογειακής Διατροφής. Παράλληλα, προϊόντα από χαρούπι, τζιά και άλλα πολύσπορα αρτοσκευάσματα πλαισιώνουν τα παραδοσιακά προϊόντα. Abstract On October 16th of 2010 in Nairobi, Kenya UNESCO approved the Mediterranean Diet as an intangible part of Cultural Heritage of the Humanity. In the Intangible Cultural Heritage of the Humanity are included activities like traditional songs, dances etc. Up to day they have registered more than 186 such activities... The proposal was submitted by four countries: Italy, Spain, Greece and Morroco. According to UNESCO regulations, every country had to propose a city representative of the Mediterranean Diet: Italy suggested Silento, Spain Soria, Greece Koroni and Morroco the city of Shefsaouen. Also every country had to propose a representative dish: Italy suggested spaggeti campreze, Spain paelia, Greece greek salad and Morroco the tatzin. According to UNESCO: olive oil, wine and wheat is the golden trilogy that unifies the people of the Mediterranean countries in similar traditional happenings, apart from their cultural and religious differences. We all know that the Mediterranean Diet is based on fruits and vegetables, olive oil fish, lentils with limited amounts of red meat and dairy products. Today with the progress on biotechnology a series 45

47 of biotechnological products have been introduced into the Mediterranean Diet and another number are on the process to be incorporated. A number of fruits like aloe vera, hippofaes, and other juices undergo processing or products are isolated from them and incorporated into the Mediterranean diet. In the Mediterranean diet we do not use genetically modified products neither meat from animals that consume GMO feed. Εισαγωγή Στις 16 Οκτωβρίου 2010 εγκρίθηκε απο την UNESCO στην Ναϊρόμπι της Κένυα η Μεσογειακή Διατροφή ως μέρος της άυλης πολιτιστικής κληρονομιάς της ανθρωπότητας. Την πρόταση υπέβαλαν η Ισπανία, η Ιταλία, η Ελλάδα και το Μαρόκο. Ως εμβληματικές πολεις προτάθηκαν και εγκρίθηκαν η Σόρια για την Ισπανία, η Κορώνη για την Ελλάδα, το Σιλέντο για την Ιταλία και το Σεφσάουεν για το Μαρόκο. Τα παέλια, η χωριάτικη σαλάτα, τα μακαρόνια καμπρέζε και τα τατζίν ηταν για την Ισπανία, την Ελλάδα, την Ιταλία και το Μαρόκο τα αντίστοιχα αντιπροσωπευτικά μεσογειακά πιάτα. Φρούτα και λαχανικά, όσπρια, δημητριακά, άσπρο κρέας, περιορισμένη κατανάλωση γαλακτοκομικών και κόκκινου κρέατος αποτελούν την πυραμίδα της Μεσογειακής Διατροφής σε συνδυασμό με καθημερινή φυσική άσκηση. Στην Μεσογειακή Διατροφή πρέπει να περιληφθούν οι υπερτροφές και τα λειτουργικά τρόφιμα καθώς και τα προϊόντα βιοτεχνολογίας πού παράγονται από αυτά και να διαμορφωθεί μια νέα πυραμίδα Μεσογειακής Διατροφής για τις υπερτροφές και λειτουργικά τρόφιμα καθώς και τα προϊόντα βιοτεχνολογίας αυτών που προστίθενται στα τρόφιμα. Υπερτροφές Ως υπερτροφές (super foods) χαρακτηρίζονται οι τροφές που περιέχουν υψηλές ποσότητες συστατικών θρεπτικών ή και μη θρεπτικών σε σύγκριση με τα συνηθισμένα τρόφιμα και βελτιώνουν την καλή λειτουργία του οργανισμού με θετικές επιδράσεις όπως την πρόληψη ορισμένων ασθενειών. Ο χαρακτηρισμός ενός τροφίμου ως υπερτροφής είναι ακόμη υποκειμενικός και θα πρέπει να τεθούν όροι με αυστηρά επιστημονικά κριτήρια ώστε ο ορισμός υπερτρόφιμο να είναι σαφής και αντικειμενικός. Οι υπερτροφές βελτιώνουν την υγεία μας, προσφέρουν ευεξία, δρουν προληπτικά έναντι μιας σειράς ασθενειών όπως καρδιαγγειακά νοσήματα, υπέρταση, διαβήτη τύπου ΙΙ, παχυσαρκία, ορισμένων καρκίνων και μεταβολικών νοσημάτων. Πολλές απο τις υπερτροφές καταναλώνονται ωμές και έχουν μικρή θερμιδική αξία αλλά σημαντική διατροφική. Οι υπερτροφές συνήθως περιέχουν σημαντικές ποσότητες αντιοξειδωτικών, βιταμινών, μεταλλικών ιχνοστοιχείων, ορισμένων αμινοξέων κλπ. Βέβαια για να ενταχθούν στην Ελληνική Μεσογειακή Διατροφή θα πρέπει να είναι προϊόντα της ελληνικής γης. Παρακάτω δίνονται ορισμένες ενδεικτικές κατηγορίες υπερτροφών: 46

48 A. Φρούτα: ρόδι, μούρα, μύρτιλο, ιπποφαές, κρανμπέρι, σμέουρα, αβοκάντο, κράνα. B. Ξηροί καρποί: καρύδια, αμύγδαλα, φυστίκια C. Οσπρια: φασόλια, φακές, ρεβίθια,σόγια D. Λαχανικά: μπρόκολο, σπανάκι, πράσινα φυλώδη λαχανικά E. Μπαχαρικά: σαφράν, κανέλλα, F. Προίόντα μέλισσας: μέλι, πρόπολι, βασιλικός πολτός G. Δημητριακά και σπόροι: λιναρόσπορος, ζέα H. Κάποια φύκη: σπιρουλίνα, χλωρέλα Τα προϊόντα της Α κατηγορίας περιέχουν ισχυρές αντιμικροβιακές ουσίες που ενδυναμώνουν την όραση, την μνήμη και μειώνουν τον κίνδυνο καρδιαγγειακών παθήσεων. Τα προϊόντα της κατηγορίας Β περιέχουν αντιοξειδωτικά, μονοακόρεστα λιπαρά οξέα, βιταμίνη Ε. Προστατεύουν από κρίσεις υπερφαγίας, καρδιαγγειακά νοσήματα και μορφές καρκίνου. Τα προϊόντα της κατηγορίας C περιέχουν πρωτείνη, σίδηρο, μεγάλες ποσότητες φυτικών ινών. Προστατεύουν την καρδιά, μειώνουν την χοληστερίνη. Τα προϊόντα της κατηγορίας D περιέχουν μεγάλες ποσότητες φυτικών ινών, είναι πλούσια σε μεταλλικά άλατα, βιταμίνες όπως το φολικό οξύ, β-καροτίνη, οι Α, Κ και C, ασβέστιο, μαγνήσιο. Μειώνουν τον ρυθμό γήρανσης, προστατεύουν την καρδιά, και την αποφυγή οστεοπόρωσης και παχυσαρκίας. Τα προϊόντα της κατηγορίας G περιέχουν φυτικές ίνες, θειαμίνη, ριμποφλαβίνη μαγνήσιο, κάλιο και ψευδάργυρο. Συμβάλουν στην καλή λειτουργία του εντέρου. Λειτουργικά Τρόφιμα Λειτουργικά τρόφιμα (functional foods or neutraceuticals) χαρακτηρίζονται εκείνα τα τρόφιμα τα οποία είναι εμπλουτισμένα και έχουν συγκεκριμένες ευεργετικές επιδράσεις στον οργανισμό. Στα τρόφιμα αυτά έχουν γίνει συνήθως προσθήκες βιταμινών, ιχνοστοιχείων, ω-3 λιπαρά οξέα, στερόλες, προβιοτικά κλπ. Τα λειτουργικά τρόφιμα γενικά; Είτε έχουν υποστεί τροποποίηση ώστε να αυξηθεί η περιεκτικότητα τους σε ένα συστατικό που προσδίδει όφελος στην υγεία του καταναλωτή (αβγά πλούσια σε ω-3 με τροποποίηση της ζωοτροφής των πουλερικών, δημητριακά με προσθήκη βιταμινών). Είτε έχουν εμπλουτιστεί με νέο συστατικό με θετική δράση στην υγεία (εμπλουτισμός γαλακτοκομικών με σίδηρο ή ασβέστιο). Είτε έχουν υποστεί αντικατάσταση ή αφαίρεση ενός βλαβερού συστατικού (π.χ. αφαίρεση κεκορεσμένου λίπους από ένα αλλαντικό και προσθήκη ελαιολάδου). Βασική επιδίωξη της βιομηχανίας είναι τα προϊόντα αυτά να έχουν την ίδια όψη, άρωμα, χρώμα, γεύση, με τα αντίστοιχα συμβατικά. 47

49 Από την ΕΕ υπάρχει από 01/07/2007 ένα αυστηρό νομοθετικό πλαίσιο σχετικά με την επισήμανση των τροφίμων. Μερικά από τα πιο χαρακτηριστικά λειτουργικά τρόφιμα είναι τα παρακάτω: 1. Προϊόντα γάλακτος που έχουν υποστεί ζύμωση, γιαούρτια με προβιοτικές καλλιέργειες που βελτιώνουν την λειτουργία του πεπτικού συστήματος και ιδιαίτερα του παχέος εντέρου. 2. Μαργαρίνες, γιαούρτι, τυρί σε μορφή κρέμας τα οποία είναι εμπλουτισμένα με φυτικές στερόλες που μειώνουν την χοληστερόλη και προλαβαίνουν τις καρδιοπάθειες. 3. Προϊόντα με αντιοξειδωτικούς παράγοντες π.χ. ροφήματα. 4. Χυμοί, μαργαρίνες, αβγά και μπάρες με ω-3 λιπαρά οξέα. 5. Γαλακτοκομικά προϊόντα και ροφήματα χυμών πού παρασκευάζονται με την προσθήκη πεπτιδίων (καζακινίνες) και καλίου αντίστοιχα. 6. Δημητριακά πρωινού εμπλουτισμένα με φυλλικό οξύ και άλλες βιταμίνες και ιχνοστοιχεία. Συμπεράσματα Πρέπει να καθορισθεί σαφής ορισμός του όρου «λειτουργικά τρόφιμα». Πολλές φορές ακόμα και οι «υπερτροφές» χαρακτηρίζονται ως λειτουργικά τρόφιμα. Πρέπει να καθορισθεί μητρώο λειτουργικών τροφίμων. Να εφαρμόζονται με αυστηρότητα οι Κανονισμοί της ΕΕ που αφορούν την επισήμανση των τροφίμων και ιδιαίτερα τους διατροφικούς ισχυρισμούς και τους ισχυρισμούς για την υγεία. Να δημιουργηθεί Πυραμίδα Μεσογειακής Διατροφής για τα λειτουργικά τρόφιμα και τις υπερτροφές. 48

50 Συνεδρία Β1 49

51 50

52 PROFICIENCY TESTING SCHEMES IN FOOD ALLERGEN TESTING Charalampos Alexopoulos, Elias Kakoulides and Evgenia Lampi General Chemical State Laboratory (G.C.S.L.), 5 th Athens Chemical Service 16 An. Tsocha Street, Athens, GREECE Tel.: , schema@gcsl.gr Food allergens represent a significant public health issue worldwide. Approximately 5-7% of young children and up to 4% of adults in western countries are affected by food allergies. Several methods have been developed for the quantification of food allergens based on immunochemical, DNA, and mass spectrometry techniques. Currently, limited data are available on the comparability of the results obtained by different methods (especially in the case of immunochemical techniques) and only few validation data have been reported. This is no doubt due to the lack of certified reference materials in the area of food allergens. Thus, proficiency testing schemes (PTs) constitute a valuable tool for assessing results comparability. SCHEMA-G.C.S.L. (Scheme for CHEmical Measurement Assessment) is a PT provider accredited by E.SY.D. to organize Proficiency Testing schemes (PTs) according to ISO/IEC 17043:2010. PTs are organized on a regular basis according to an annual distribution program (20 PTs per year) in environmental, industrial and agro-food fields. SCHEMA PTs constitute a multifunctional tool to evaluate, monitor, compare and improve the quality of the results of chemical and environmental laboratories that in 2012 had more than 300 participants from 30 countries worldwide. SCHEMA (G.C.S.L. Greece) started the organization of PT schemes in the field of food allergens in An important issue in assessing participants results is that a consensus value cannot be assigned from all the results reported by the participants, since multimodality is observed (due to the determination of food allergens by different ELISA kits). Therefore, as different assigned values have to be set for each ELISA kit, SCHEMA employed the normalization of the reported results as a holistic methodology for the evaluation of laboratory performance. Since results derived by different methods (e.g. ELISA, PCR, lateral flow devices, etc) are not comparable or traceable to a common standard or reference material, the participation in PTs provides a reliable means for evaluating laboratory competence. Εισαγωγή-Αλλεργιογόνα σε τρόφιμα-μέθοδοι προσδιορισμού Η ύπαρξη αλλεργιογόνων σε τρόφιμα αποτελεί σημαντικό πρόβλημα παγκοσμίως, Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας, οι τροφικές αλλεργίες αποτελούν την 4 η μεγαλύτερη πηγή ανησυχίας. Στην ευρωπαϊκή οδηγία 2007/68 καταγράφεται η ενοποιημένη λίστα των αλλεργιογόνων συστατικών (14 αλλεργιογόνα, όπως π.χ. αυγό, σόγια, σουσάμι, ιχθυηρά, γάλα, 51

53 θειώδη, δημητριακά με γλουτένη, κτλ.), η παρουσία των οποίων πρέπει να δηλώνεται στη συσκευασία του τροφίμου. Η επικύρωση μιας αξιόπιστης μεθόδου ποσοτικού προσδιορισμού αλλεργιογόνων στα τρόφιμα αποτελεί απαίτηση για την καλύτερη προστασία των καταναλωτών και τον έλεγχο εφαρμογής της νομοθεσίας για την επισήμανση των τροφίμων. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό τους, διάφορες μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί στοχεύοντας είτε ολόκληρο το αλλεργιογόνο (πρωτεΐνη) είτε κάποιο τμήμα του (πεπτίδιο). Οι μέθοδοι που έχουν αναπτυχθεί για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό αλλεργιογόνων σε τρόφιμα μπορούν να χωριστούν σε: (α) ανοσοχημικές μεθόδους (π.χ.elisa, RAST, βιοαισθητήρες, κτλ), (β) μεθόδους βασισμένες σε ανίχνευση DNA (π.χ. PCR, RT-PCR, PCR-ELISA, κτλ), (γ) μεθόδους στηριζόμενες σε φασματομετρία μάζας και (δ) άλλες μεθόδους (π.χ. μη-ειδικές μέθοδοι, προσδιορισμός ολικής πρωτεΐνης, κτλ). Δεδομένα για τη συγκρισιμότητα των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται με τις παραπάνω μεθόδους είναι σχετικά περιορισμένα (ειδικά στην περίπτωση χρήσης ανοσοχημικών μεθόδων). Μια από τις αιτίες είναι και η απουσία πιστοποιημένου υλικού αναφοράς για αλλεργιογόνα σε τρόφιμα. Επίσης μόλις το 2012 δημοσιεύτηκε οδηγός καλής πρακτικής για τον ποσοτικό προσδιορισμό αλλεργιογόνων σε τρόφιμα με τεχνική ELISA. Επομένως η συμμετοχή σε διεργαστηριακές δοκιμές ελέγχου ικανότητας (PTs, proficiency Testing schemes) αποτελεί σημαντικό εργαλείο τόσο για την αξιολόγηση της επίδοσης των συμμετεχόντων εργαστηρίων όσο και για τη συγκρισιμότητα των αποτελεσμάτων. Διεργαστηριακές Δοκιμές ελέγχου ικανότητας σε αλλεργιογόνα στα τρόφιμα Από το 2009, το Γ.Χ.Κ. διοργανώνει διεργαστηριακές δοκιμές ελέγχου ικανότητας υπό το λογότυπο SCHEMA (Scheme for CHEmical Measurement Assessment) σύμφωνα με το ετήσιο πρόγραμμα διανομής σε τρόφιμα, περιβαλλοντικά και βιομηχανικά δείγματα. Το Γ.Χ.Κ.-SCHEMA έχει διαπιστευτεί από το Ε.ΣΥ.Δ. (Αρ.πιστ.814) κατά ISO/IEC 17043:2010 ως διοργανωτής διεργαστηριακών δοκιμών. Tο Γ.Χ.Κ.-SCHEMA διοργάνωσε το 2012 διεργαστηριακή δοκιμή στον προσδιορισμό σουσαμιού σε φρυγανιά. Aξιολόγηση αποτελεσμάτων διεργαστηριακών δοκιμών-τεχνική ELISA (A) Ποιοτική αξιολόγηση Το πρωτόκολλο που χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση των ποιοτικών αποτελεσμάτων έχει ως εξής: Τα αποτελέσματα σε σειρά δειγμάτων υποβάλλονται ως (Ν) ή (Ο) υποδεικνύοντας την παρουσία ή απουσία αλλεργιογόνων στα τρόφιμα αντίστοιχα. Η επίδοση των συμμετεχόντων εργαστηρίων με βάση τους ποιοτικούς προσδιορισμούς αξιολογείται ως Ικανοποιητική «Ι» ή Μη Ικανοποιητική «Μ.Ι». 52

54 (B) Ποσοτική αξιολόγηση προβλήματα Λαμβάνοντας υπόψη ότι κάθε συμμετέχον εργαστήριο είναι ελεύθερο να επιλέξει τη μέθοδο προσδιορισμού, τα ποσοτικά αποτελέσματα θα εξαρτώνται από αυτήν. Στην περίπτωση που οι συμμετέχοντες χρησιμοποιούν ανοσοχημικές μεθόδους για τον ποσοτικό προσδιορισμό αλλεργιογόνων, στα διανεμημένα δείγματα της διεργαστηριακής δοκιμής, τα αποτελέσματα θα εξαρτώνται από τον κατασκευαστή του εμπορικά διαθέσιμου ELISA κιτ. Δεδομένου ότι οι κατασκευαστές χρησιμοποιούν διαφορετικό τύπο αντισωμάτων για επίστρωση, διαφορετικός τύπος πρωτεϊνών θα αναγνωρίζεται στα αντίστοιχα ELISA κιτ. Καθοριστικό παράγοντα στον προσδιορισμό παίζουν επίσης το προτεινόμενο από τον κατασκευαστή πρωτόκολλo εκχύλισης και ο εσωτερικός βαθμονομητής που παρέχεται μαζί με τα πλακίδια ELISA. Συνεπώς, είναι δυνατό τα υποβληθέντα αποτελέσματα για τον προσδιορισμό αλλεργιογόνων στα τρόφιμα να ανήκουν σε περισσότερους από ένα πληθυσμούς (πολυ-κόρυφες κατανομές σε πυρηνοδιαγράμματα πυκνότητας Kernel). Σε τέτοιες περιπτώσεις, η χρήση συμφωνημένης τιμής (concensus value) για την αξιολόγηση της επίδοσης (μέσω z-score) δε συνιστά μια κατάλληλη διαδικασία (σε περίπτωση πολυκόρυφων κατανομών, διαφορετική αποδιδόμενη τιμή σε κάθε ELISA kit πρέπει να αποδοθεί). Διεργαστηριακή δοκιμή SCHEMA 11 01: σουσάμι σε φρυγανιά Για την αξιολόγηση της επίδοσης των συμμετεχόντων εργαστηρίων, εννέα (9) δείγματα διανεμήθηκαν: (01)-αρνητικό, (02)-θετικό, (03, 04, 06, 07, 09)-θετικά δείγματα, επαναλήψεις ίδιου υλικού που παρασκευάστηκε στις εγκαταστάσεις της Ε Χ.Υ. Αθηνών ύστερα από εμβολιασμό φρυγανιάς με πρωτεΐνη σουσαμιού που είχε απομονωθεί και χαρακτηριστεί. (1) Ποιοτικά αποτελέσματα: Η επίδοση της μεγάλης πλειοψηφίας των συμμετεχόντων εργαστηρίων χαρακτηρίζεται ως ικανοποιητική στην ανίχνευση σουσαμιού σε φρυγανιά (δεν παρατηρήθηκαν ψευδώς θετικά αποτελέσματα). (2) Ποσοτικά αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα που υποβλήθηκαν (για το δείγμα 02) ακολουθούν δικόρυφη κατανομή: κύρια κορυφή 60.9 mg/kg, δευτερεύουσα κορυφή 10.8 mg/kg) (Σχήμααριστερά), επιβεβαιώνοντας ότι οι διαφορές στα αποτελέσματα μπορούν να αποδοθούν στα διαφορετικά ELISA kits που χρησιμοποιήθηκαν. Πρόσφατα έχει ανακοινωθεί ότι η αποστολή δεύτερου επιμολυσμένου δείγματος μπορεί επιτυχώς να χρησιμοποιηθεί για την κανονικοποίηση των αποτελεσμάτων από διαφορετικά ELISA kits. Μολονότι τα δείγματα 03, 04, 06, 07 και 09 (τυφλές επαναλήψεις του ίδιου δείγματος) χρησιμοποιήθηκαν κυρίως για την ποιοτική ανάλυση, έγινε προσπάθεια να επιβεβαιωθεί η προηγούμενη υπόθεση. Υπολογίστηκε η μέση τιμή των πέντε επαναλήψεων για κάθε συμμετέχοντα (δείγματα 03, 04, 06, 07, 09), όπως και ο λόγος της συγκέντρωσης σουσαμιού στο δείγμα 02 δια της μέσης τιμής των πέντε επαναλήψεων. Πράγματι μια κανονική και συμμετρική κατανομή παρατηρείται (μονοκόρυφη κατανομή) (Σχήμα-δεξιά). Τα αποτελέσματα που υποβλήθηκαν για το δείγμα 02 κυμαίνονταν από (10.8 mg/kg έως 72 mg/kg) 53

55 (Σχήμα-αριστερά), ενώ στην περίπτωση των κανονικοποιημένων δειγμάτων από 1.6 έως 4.1 (Σχήμα-δεξιά), σε συμφωνία με τα δεδομένα της βιβλιογραφίας. Εκτός από τη μονοκόρυφη κατανομή και την κανονικότητα, το σύνολο των αποτελεσμάτων των συμμετεχόντων μπορεί να αξιολογηθεί. Kernel Density plot sample 02-SCHEMA Kernel density plot of normalized results-schema Σχήμα. Πυρηνοδιαγράμματα πυκνότητας Kernel των υποβληθέντων αποτελεσμάτων (αριστερά) και των κανονικοποιημένων τιμών (δεξιά). Από τη στιγμή που τα αποτελέσματα προσδιορισμού αλλεργιογόνων σε τρόφιμα από διαφορετικές μεθόδους δεν είναι ιχνηλάσιμα σε κάποιο υλικό αναφοράς, η συμμετοχή σε διεργαστηριακές δοκιμές ελέγχου ικανότητας είναι ένα απαραίτητο εργαλείο για την αξιολόγηση της συγκρισιμότητας των αποτελεσμάτων. 54

56 Detection of escolar (Lepidocybium flavobrunneum) in commercialized minced fish products by a PCR-RFLP technique D.P. Houhoula, V. Apostolou, N. Lazana, Ε. Siskos, D. Toulis, V.R. Kyrana, V.P. Lougovois Department of Food Technology, Technological Educational Institution of Athens, Agiou Spyridonos, 12210, Egaleo, Greece Escolar is the common name for the deep-water finfish Lepidocybium flavobrunneum (Smith, 1843), which stores large amounts ( 20%) of indigestible wax esters in the body. When ingested by humans, wax esters accumulate in the rectum causing keriorrhea, a kind of "oily diarrhoea". Outbreaks of keriorrhea, associated with the consumption of escolar mislabelled and marketed as cod, sea bass, swordfish or white tuna, have been increasingly recognised in the last decade, raising global concerns about seafood authenticity and fraud practices. In the present study, a PCR-RFLP technique that involved digesting an amplified 464bp region of the cytochrome b gene with restriction enzyme was evaluated as to its effectiveness to identify the inclusion of escolar in minced fish products. DNA in macerated flesh samples of escolar and cod that had been mixed in various proportions was extracted using the BIOO SCIENTIFIC commercial kit; amplification of the cytochrome b was performed according to Chiu-Chu Hwang (2012), while restriction enzyme HaeIII was applied to the amplified DNA. The digested PCR products were electrophoresed on 2% agarose gel. The result obtained indicated that escolar could be detected in as low a proportion as 0.5%; cleavage bands visualized in the gel were enough and suitable for discriminating escolar from cod. HaeIII endonuclease cleaved cytochrome b gene products of escolar into three DNA fragments of 189, 149 and 126 bp, quite different from those of cod. PCR-RFLP of the cytochrome b gene offers a rapid and highly sensitive and specific method for detecting the presence of escolar in commercialized minced fish products such as fish sticks, fish balls and fish burgers. Identification of the species through analysis of restriction patterns is quite a practical application. 55

57 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΜΥΓΔΑΛΟΥ ΣΕ ΚΥΠΡΙΑΚΑ ΤΡΟΦΙΜΑ Α. Τέλλο 1, Γ. Σειραγάκης 2, Α. Δεληγιάννη 1, Κ. Ευσταθίου 1, Η. Πελεκάνου 1 1 Γενικό Χημείο Κράτους Κίμωνος 44, 1451, Λευκωσία 2 FA Food Allergens Lab Ltd. Καλοψίδας 38, 7060 Λειβάδια, Κύπρος Περίληψη Στα πλαίσια του ερευνητικού προγράμματος για σύγκριση ανοσοχημικών και μοριακών τεχνικών στον έλεγχο τροφίμων για παρουσία αλλεργιογόνων, εξετάσαμε την περίπτωση του αμύγδαλου που είναι ένα από τα ποιό γνωστά αλλεργιογόνα και αναπτύξαμε μοριακή μεθοδολογία. Οι αναλυτικές μέθοδοι που ακολουθήθηκαν ήταν τo EN :2009 Foodstuffs - Detection of food allergens by immunological methods - Part 1: General considerations και το EN :2009 Foodstuffs Detection of food allergens by molecular biological methods - Part 1: General considerations. Αποφασίσθηκε να χρησιμοποιηθούν για την τεχνική ELISA, τα κιτ της εταιρείας Neogen Veratox for Almond Allergen και της εταιρείας R-Biopharm «Ridascreen Fast Mandel/Almond. Η εκχύλιση του DNA έγινε με δύο διαφορετικά εμπορικά κιτ: Με το κιτ R-Biopharm Surefood Allergen της εταιρείας Congen Biotechnology και με το κιτ foodproof Pure Sample Preparation kit της εταιρείας Biotecon Diagnostics. Όλα τα δείγματα μετρήθηκαν με το σπεκτροφωτόμετρο με σκοπό τον προσδιορισμό της συνολικής συγκέντρωση και της καθαρότητας (purity) του DNA. Ακολούθως αναλύθηκαν με Real-Time PCR για να επιβεβαιωθεί η παρουσία DNA της υπό εξέτασης αλλεργιογόνου ουσίας στα εκχυλισμένα δείγματα. Για την RT-PCR χρησιμοποιήθηκε κιτ της εταιρείας Hai Kang Life Hunter Almond. Η πρώτη αξιολόγηση των μεθόδων έγινε με την χρήση Πρότυπων Υλικών Αναφοράς. Ακολούθως αναλύθηκαν 10 συνολικά δείγματα για την ανίχνευση αμυγδάλου τα οποία ήταν μπισκότα, σοκολάτες, ροφήματα, δημητριακά και κέικ Κυπριακής παραγωγής. Abstract According to the research program, comparison of immunoassay (Elisa) and molecular (RT-PCR) methods for the detection of allergens in food, we examined the case of almond that is one of the most known allergens, developing a molecular technique. The analytical methods that were used are based on, ISO EN :2009 Foodstuffs - Detection of food allergens by immunological methods - Part 1: General considerations and EN :2009 Foodstuffs - Detection of food allergens by molecular biological methods - Part 1: General considerations. For the ELISA method it was decided to use, the "Veratox for Almond Allergen" kit from Neogen corporation and "Ridascreen Fast Mandel / Almond" kit from R-biopharm corporation. DNA 56

58 extraction was performed using two different commercial kits: R-Biopharm "Surefood Allergen" of Congen Biotechnology and "foodproof Pure Sample Preparation kit" of Biotecon Diagnostics. In order to determine the total concentration and purity of DNA, the extracted food samples were evaluated spectrophotometrically. The extracted samples were analysed by Real-Time PCR method, using the kit Hai Kang Life "Hunter Almond", to verify the presence of almond DNA. The first evaluation was performed using reference materials for both methods with known concentration of almond. Afterwards, 10 Cyprus products that include biscuits, chocolates, drinks cereals and cakes were analysed for the detection of almond. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι ολοένα αυξανόμενες τροφικές αλλεργίες σε μερίδα του πληθυσμού, προκαλούν πολλές φορές δυσάρεστα κλινικά συμπτώματα στους πάσχοντες που φτάνουν μέχρι και το θάνατο. Το γεγονός ότι δεν υπάρχει σήμερα θεραπεία κατά των τροφικών αλλεργιών, παρά μόνο η μη κατανάλωση από τα αλλεργικά άτομα των τροφών που τους προκαλούν αλλεργίες, καθιστά αναγκαία την ύπαρξη αναλυτικών τεχνικών με υψηλά αναλυτικά χαρακτηριστικά. Επειδή ακόμη και απειροελάχιστες ποσότητες αυτών των αλλεργιογόνων ουσιών (mg/kg) μπορούν να προκαλέσουν αναφυλακτικό σοκ, είναι συχνές οι περιπτώσεις ανακλήσεων μέσω του συστήματος RASFF της Ευρωπαϊκής Ένωσης τροφίμων, που από διασταυρούμενη επιμόλυνση περιείχαν αλλεργιογόνα χωρίς την απαραίτητη σήμανση. ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ: Αναλύθηκαν Πρότυπα Υλικά Αναφοράς (Certified Reference Materials), γνωστής συγκέντρωσης που παρασκευάστηκαν από την εταιρεία Food Allergens Lab για την μέθοδο ELISA και από την εταιρεία Congen για την μέθοδο Real Time PCR. Ακολούθως αναλύθηκαν συνολικά 10 δείγματα για ανίχνευση αμυγδάλου τα όποια ήταν Κυπριακά προϊόντα, μερικά παραδοσιακά, όπως ή σουμάδα και κάποια άλλα προϊόντα από υπεραγορές όπως μπισκότα, σοκολάτες, ροφήματα, δημητριακά και κέικ. Α. Υλικό αναφοράς Αμυγδάλου με δηλούμενη τιμή 100 mg/kg ±30% (με κιτ της εταιρείας Neogen) Neogen "Veratox for Almond R-Biopharm Ridascreen Fast Allergen" Mandel/Almond" Δείγμα Συγκέντρωση αμυγδάλου mg/kg Συγκέντρωση αμυγδάλου mg/kg 1 RM 1:10 122,8 86,7 2 RM 1: * 3 RM 1: * 181* Σημείωση*: Στις μεγάλες αραιώσεις η αβεβαιότητα της μεθόδου αυξάνεται και τα αποτελέσματα δεν είναι αξιόπιστα. 57

59 B. Υλικό αναφοράς Αμυγδάλου με δηλούμενη τιμή 40 mg/kg της υπό ανίχνευση ουσίας (της εταιρείας Congen SureFood Quantard Allergen ) Αξιολόγηση της καθαρότητας και της συγκέντρωσης του DNA του Υλικού Αναφοράς Κιτ Εκχύλισης BIOTECON CONGEN Δείγμα CONCENTRATION PURITY CONCENTRATION PURITY CRM 306,5 ng/μl 1, ng/μl 1,77 Κιτ Εκχύλισης BIOTECON CONGEN Δείγμα CTs CTs 29,8 35,74 1 CRM 1:10 36,14 35,19 36,67 36,32 2 CRM 1: CRM 1: Για την RT-PCR χρησιμοποιήθηκε κιτ της εταιρείας Hai Kang Life Hunter Almond". Σχόλια: Σε όλες τις πιο πάνω περιπτώσεις η ανίχνευση της υπό εξέταση ουσίας ανιχνεύτηκε μόνο στην αραίωση 1:10, που αντιστοιχεί σε 4mg/kg της αλλεργιογόνου ουσίας. Γ. Δείγματα τροφίμων Κυπριακής προέλευσης Στα έξι από τα δέκα δείγματα ανιχνεύθηκε η υπό εξέταση αλλεργιογόνος ουσία και με τα δύο κιτς της ELISA. Τα αποτελέσματα από την τεχνική ELISA δεν επιβεβαιώθηκαν σε όλες τις περιπτώσεις με την Real-Time PCR. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι μοριακές τεχνικές είναι εξίσου αξιόπιστες με τις ανοσοχημικές τεχνικές (ELISA). Όσον αφορά την ευαισθησία τους, τα εμπορικά RT-PCR κιτς δεν μπορούν ακόμη να φτάσουν την ευαισθησία των ELISA κιτς αφού στα CRMs δεν μπόρεσαν να ανιχνεύσουν αραιώσεις της τάξης των 1/100 και 1/1000. Μεταξύ των διαφόρων εμπορικών κιτς εκχύλισης του DNA, η εκχύλιση με το κιτ της Congen για την μοριακή τεχνική, δουλεύει καλύτερα από αυτό της Biotecon που χρησιμοποιήθηκε. Η εκχύλιση διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη μοριακή τεχνική αφού με ακατάλληλο εκφυλιστικό πρωτόκολλο και κιτ δεν ανιχνεύτηκε αμύγδαλο ακόμη και σε σουμάδα. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Goodwin P R (2004) Food allergen detection methods: a coordinated approach J AOAC Int, 87, Holzhauser T and Roder M (2006) Allergens in tree nuts, sesame seeds, mustard and celery) in Food allergens: Analysis instrumentation and methods Chapter 4,

60 Kizis D and Siragakis G (2010) Detection of allergens in cereals Food allergens: Analysis instrumentation and methods Chapter 6, Mari A and Scala E (2006) Exploring current and novel methods for the detection and diagnosis of food allergy: the clinical approach, in Food Allergy, Chapter Οrtolani, Ispano, Scibilia and Pastorello Introducing chemists to Food Allergy, Allergy pp 5-8 Poms R E, Klein C, L and Anklam E (2004) Methods for allergen analysis in food: a review, Food Addit Contam 21, 1-31 Σειραγάκης Γεώργιος: Χρήση ανοσοχημικών μεθόδων για προσδιορισμό φουντουκελαίου σε ελαιόλαδο. Χημικά Χρονικά 3/2004 σελ «Το Έργο συγχρηματοδοτείται από την Κυπριακή Δημοκρατία (Ιδρυμα Προώθησης Έρευνας) και το Ευρωπαϊκό Ταμείο Περιφερειακής Ανάπτυξης της Ευρωπαϊκής Ενωσης». 59

61 DETECTION OF ALLERGENS IN FOOD OF ANIMAL ORIGIN Rizou Katerina Food Division, General Chemical State Laboratory, 16, A. Tsocha str, Athens SUMMARY The European Union legislation establishes a list of food ingredients which must be indicated on the label of foodstuffs, as they are likely to cause allergies. In this list, the main sources of animalderived food allergens are cow s milk, hen s egg and seafood (fish and shell fish). Sensitive detection methods are needed to ensure compliance with food-labeling legislation. Allergen detection methods can be protein -based methods or DNA- based methods. Protein based techniques, such as ELISA, have been extensively used for the detection of egg and milk allergens in food. The antibody used in these immunoassays play a key role to achieve high sensitivity and specificity. Good recoveries were obtained (up to 96% for egg) and the limit of detection was found to be as low as 0.2 ppm spray-dried whole egg and 0.5 ppm casein for the detection of egg and milk, respectively. DNA based methods such as PCR, being applied to the detection of egg and milk residue in food products, have limitations due to the low DNA content of egg and milk. Fish and crustaceans are amenable to protein-based as well as DNA-based detection methods. ELISA assays have been developed to detect parvalbumin, the major fish allergen. Some of them showed good sensitivity with the LOD being 0.04 ppm parvalbumin, while for processed food LOD was 0.23 ppm parvalbumin. A real time PCR assay with good sensitivity and specificity was also developed to detect fish parvalbumin gene. In crustacean and molluscan shellfish, tropomyosin is the major allergenic protein. Sensitive ELISA assays (LOD: 1ppm) have been developed, using antibodies against tropomyosin. In addition, quantitative real time PCR assays targeting mitochondrial genes were developed. High PCR efficiencies were achieved and LODs were generally between 0.1 and 1 ppm. In conclusion, sensitive methods for the detection of animal-derived food allergens exist that constitute a pillar for the implementation of control strategies, both for industry and for regulatory agencies. 60

62 Η τροφική αλλεργία προκαλείται από μια ειδική ανοσολογική απόκριση έναντι συστατικών των τροφίμων, κυρίως πρωτεϊνών και μπορεί να συνδέεται με παραγωγή ή μη ανοσοσφαιρίνης Ε. Η μόνη εφικτή επιλογή για την προστασία των αλλεργικών ατόμων είναι η αποφυγή των τροφών που περιέχουν αλλεργιογόνα. Στο πλαίσιο αυτό, η επισήμανση έχει αναγνωριστεί ως εργαλείο προστασίας της δημόσιας υγείας, παρέχοντας στους καταναλωτές τη δυνατότητα είτε να αποφεύγουν τα τρόφιμα που μπορεί να προκαλέσουν αλλεργικές αντιδράσεις ή να επιλέξουν ασφαλείς πηγές τροφίμων. Η νομοθεσία της Ευρωπαϊκής Ένωσης για τα αλλεργιογόνα βασίζεται σήμερα στην οδηγία 2000/13/ΕΚ για την επισήμανση και τις μεταγενέστερες τροποποιήσεις της, όπως η οδηγία 2003/89/ΕΚ και την οδηγία 2007/68/ΕΚ, που απαριθμεί τα αλλεργιογόνα τα οποία πρέπει να αναγράφονται στην επισήμανση των τροφίμων. Η ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για την ανίχνευση αλλεργιογόνων σε τρόφιμα είναι σημαντικότατη για την πραγματοποίηση ελέγχων, τόσο για τις αρχές που είναι υπεύθυνες για τον έλεγχο των τροφίμων, όσο και για τη βιομηχανία. Οι πιο κοινές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται σήμερα για την ανίχνευση των αλλεργιογόνων τροφίμων είναι (α) αυτές που στηρίζονται στην ανίχνευση πρωτεϊνών (ELISA, ανοσοαποτύπωση, RAST / EAST, βιοαισθητήρες, μέθοδοι που στηρίζονται στη φασματομετρία μάζας) και (β) αυτές που στηρίζονται στην ανίχνευση του DNA των αλλεργιογόνων συστατικών (PCR και real-time PCR). Τα κυριότερα αλλεργιογόνα ζωικής προέλευσης είναι το γάλα, το αυγό, τα ψάρια, τα καρκινοειδή και τα μαλάκια. Όσον αφορά στο αυγό, το ασπράδι θεωρείται ότι είναι πιο αλλεργιογόνο από ό,τι ο κρόκος του αυγού. Οι κυριότερες αλλεργιογόνες πρωτεΐνες στο ασπράδι του αυγού είναι το ωοβλεννώδες, η ωοαλβουμίνη, η ωοτρανσφερίνη και η λυσοζύμη. Η ανίχνευση αυγού στα τρόφιμα επιτυγχάνεται κυρίως με μεθόδους που ανιχνεύουν τις αλλεργιογόνες πρωτεΐνες. Η εφαρμογή τεχνικών μοριακής βιολογίας, όπως η PCR, δεν ενδείκνυται γιατί το αυγό έχει χαμηλή περιεκτικότητα σε DNA. Από τις μεθόδους που στηρίζονται στην ανίχνευση των πρωτεϊνών η ανοσοενζυμική τεχνική της ELISA είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη. Οι περισσότερες ELISA στηρίζονται στην ανίχνευση του ωοβλεννώδους και της ωοαλβουμίνης. Υπάρχουν πολλές μελέτες σχετικές με την ανίχνευση του αυγού με ELISA σε τρόφιμα όπως προϊόντα κρέατος, ζυμαρικά, παγωτά, προϊόντα αρτοποιίας (1), καθώς και σε οίνους. Πολλές από αυτές έχουν επιτύχει πολύ χαμηλό όριο ανίχνευσης (0,2 ppm), σημαντικές ανακτήσεις έως και 96% και υψηλή ειδικότητα. Επιπλέον θα πρέπει να αναφερθεί ότι έχουν αναπτυχθεί εμπορικά κιτ για την ανίχνευση αυγού σε τρόφιμα που στηρίζονται στην τεχνική της ELISA, με κάποια από αυτά να εξασφαλίζουν την ανίχνευση υπολειμμάτων αυγού ακόμα και σε σύνθετα τρόφιμα που έχουν υποστεί θερμική επεξεργασία. Τέλος θα πρέπει να σημειωθεί ότι τα τελευταία χρόνια υπάρχουν μελέτες που αφορούν στην ανίχνευση αλλεργιογόνων του αυγού με μεθόδους που βασίζονται στην υγρή χρωματογραφία και την φασματομετρία μάζας (LC-MS ) (2). 61

63 Η αλλεργία στο γάλα είναι από τις συχνότερα απαντώμενες τροφικές αλλεργίες. Τα σημαντικότερα αλλεργιογόνα του γάλακτος είναι η καζεΐνη, η α-λακτογλοβουλίνη, η α-λακταλβουμίνη και η αλβουμίνη του ορού βοοειδών. Οι τεχνικές μοριακής βιολογίας έχουν περιορισμένη εφαρμογή στην ανίχνευση του γάλακτος και χρησιμεύουν κυρίως στον προσδιορισμό της προέλευσης του γάλακτος (διάκριση βοείου, πρόβειου και κατσικίσιου). Η πιο διαδεδομένη τεχνική στην ανίχνευση των αλλεργιογόνων του γάλακτος είναι η ανοσοενζυμική τεχνική ELISA. Σημαντικός αριθμός μεθόδων που στηρίζονται στην τεχνική αυτή έχει αναπτυχθεί. Οι μέθοδοι αυτές έχουν εφαρμοστεί επιτυχώς στην ανίχνευση υπολειμμάτων γάλακτος σε τρόφιμα όπως τα σορμπέ, η μαύρη σοκολάτα, οι χυμοί φρούτων, τα κρεατοσκευάσματα και τα είδη αρτοποιίας, αλλά και οι οίνοι, με το όριο ανίχνευσης των μεθόδων να φθάνει στο επίπεδο των 0,5 ppm (3). Επίσης, έχουν αναπτυχθεί και είναι εμπορικά διαθέσιμα διάφορα ELISA κιτ για την ανίχνευση αλλεργιογόνων του γάλακτος, ενώ στη διεθνή βιβλιογραφία περιγράφονται προσπάθειες για την ανίχνευση πρωτεϊνών του γάλακτος με μεθόδους που στηρίζονται στην τεχνική του LC-MS, με όριο ανίχνευσης στο επίπεδο 1ppm. Μεγάλο μέρος των τροφικών αλλεργιών οφείλεται στην κατανάλωση ψαριών, καρκινοειδών και μαλακίων. Το ψάρι είναι μια από τις 4 τροφές που μπορούν να προκαλέσουν σοβαρή τροφική αναφυλαξία. Το κυριότερο αλλεργιογόνο των ψαριών είναι η παρβαλβουμίνη, ενώ και το κολλαγόνο έχει αποδειχθεί ότι μπορεί να δράσει ως αλλεργιογόνο. Διάφορες ELISA μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί για την ανίχνευση αλλεργιογόνων ψαριού τόσο σε τρόφιμα όπως οι σούπες, οι σάλτσες και το ψωμί, όσο και σε οίνους, όπου είναι πιθανόν να απαντώνται σε ίχνη σαν συνέπεια της χρήσης της ζελατίνης ψαριών ως διαυγαστικού μέσου. Πρόσφατα αναπτύχθηκε ELISA μέθοδος που βασίζεται σε μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της παρβαλβουμίνης με όριο ανίχνευσης 0,04 ppm (4), ενώ ανίχνευση της παρβαλβουμίνης ψαριού έχει επιτευχθεί και με real time PCR μέθοδο, η οποία επιδεικνύει ικανοποιητική ευαισθησία και ειδικότητα ώστε να διαχωρίζει την παρβαλβουμίνη των ψαριών από παρβαλβουμίνες άλλων ζωικών οργανισμών (5). Επιπλέον θα πρέπει να αναφερθεί ότι έχουν γίνει προσπάθειες ανίχνευσης της παρβαλβουμίνης με μεθόδους LC-MS. Όσον αφορά στα καρκινοειδή και τα μαλάκια το κυριότερο αλλεργιογόνο είναι η τροπομυοσίνη. Για την ανίχνευση της τροπομυοσίνης στα καρκινοειδή έχουν αναπτυχθεί αρκετές ELISA μέθοδοι με κάποιες από αυτές να επιδεικνύουν υψηλή ειδικότητα (απουσία διασταυρούμενης αντίδρασης με κρέας ιχθύων και θηλαστικών) και χαμηλό όριο ανίχνευσης 1ppm (6). Επιπλέον, έχει αναπτυχθεί ευαίσθητη real- time PCR μέθοδος για την ανίχνευση γονιδίων που βρίσκονται στα μιτοχόνδρια των καρκινοειδών σε πολλά αντίγραφα, με το όριο ανίχνευσης να κυμαίνεται από 0,1 ppm έως 1 ppm (7), ενώ LC-MS/MS μέθοδοι έχουν παίξει σημαντικό ρόλο στην ανίχνευση και ταυτοποίηση νέων αλλεργιογόνων στα καρκινοειδή. 62

64 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Yeung JM, Newsome WH, Abbott MA. 2000, Determination of egg proteins in food products by enzyme immunoassay J AOAC Int., 83(1): Heick J, Fischer M, Pöpping B. 2011, First screening method for the simultaneous detection of seven allergens by liquid chromatography mass spectrometry, J Chromatogr A., 1218, Hefle SL, Lambrecht DM., 2004, Validated sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for casein and its application to retail and milk-allergic complaint foods J Food Prot., 67, Qiu-Feng Cai, Xi-Chang Wang, Guang-Ming Liu, Lin Zhang, Mi-Mi Ruan, Yuan Liu, Min- Jie, 2013, Development of a monoclonal antibody-based competitive enzyme linkedimmunosorbent assay (c-elisa) for quantification of silver carp parvalbumin, Food Control, 29, Sun M, Liang C, Gao H, Lin C, Deng M.,2009, Detection of parvalbumin, a common fish allergen gene in food, by real-time polymerase chain reaction, J AOAC Int., 92, Heidi R. Fullerab, Philip R. Goodwinc & Glenn E. Morris, 2006, An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the major crustacean allergen, tropomyosin, in food, Food and Agricultural Immunology, 17, Eischeid AC, Kim BH, Kasko SM. J,2012, Two Quantitative Real-Time PCR Assays for the Detection of Penaeid Shrimp and Blue Crab, Crustacean Shellfish Allergens, J. Agric Food Chem., 2012 Dec 6 (Εpub ahead of print). 63

65 ΑΛΛΕΡΓΙΟΓΟΝΟ ΣΕΛΙΝΟ ΣΕ ΦΡΕΣΚΑ & ΚΑΤΑΨΥΓΜΕΝΑ ΤΥΠΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΛΑΧΑΝΙΚΑ Π. Δανιάς, Ε. Χριστοδούλου, Π. Μπαργωτάκης FA Food Allergens Lab, Καλοψίδας 38, 7060 ΛΙΒΑΔΙΑ, ΚΥΠΡΟΣ Abstract: The molecular method used for food analysis by isolating total DNA are more and more applications for both food safety (Pathogenic microorganisms, allergens) and for quality, authenticity (Genetically Modified, hard soft rigging, rigging oil & dairy, meats, halal, horse beef, chicken turkey). This paper presents the ISO standard and for detection Celery with molecular techniques is the essay of the Working Group 12 of Technical Committee 275 of the European Committee for Standardization. This paper presents the specificities of DNA extraction and the different protocols for different commercial kits available in the market for Real Time PCR. The application of the method to detect allergen in celery frozen vegetables with vinegar and halloumi from Cyprus market is presented with reference to confirm the detection limit, selectivity and sensitivity of the method. Περίληψη: Οι μοριακές μέθοδους που χρησιμοποιούνται για αναλύσεις τροφίμων με την απομόνωση ολικού DNA έχουν όλο και περισσότερες εφαρμογές τόσο για την ασφάλεια των τροφίμων (Παθογόνοι μικροοργανισμοί, αλλεργιογόνα) όσο και για την ποιότητα, γνησιότητα (Γενετικά Τροποποιημένα, νοθεία σκληρού μαλακού, νοθεία ελαιολάδου & γαλακτοκομικών, ειδη κρέατος, halal, άλογο σε μοσχάρι, κοτόπουλο σε γαλοπούλα). Η παρούσα εργασία παρουσιάζει το ISO πρότυπο και για ανίχνευση σέλινου με μοριακές τεχνικές που είναι το πόνημα της ομάδας εργασίας 12, της Τεχνικής Επιτροπής 275 της Ευρωπαϊκής Επιτροπής Τυποποίησης. Στην παρούσα εργασία παρουσιάζονται οι ιδιαιτερότητες εκχύλισης του DNA αλλά και τα διαφορετικά πρωτόκολλα για τα διάφορα εμπορικά κιτς που είναι διαθέσιμα στην αγορά για Real Time PCR. Η εφαρμογή της μεθόδου για ανίχνευση αλλεργιογόνου σέλινου σε καταψυγμένα λαχανικά, χαλούμι και ξιδάτα από την Κυπριακή αγορά παρουσιάζεται με αναφορά στην επιβεβαίωση του ορίου ανίχνευσης, της επιλεκτικότητας και της ευαισθησίας της μεθόδου. Εισαγωγή: Τα τελευταία χρόνια όλο και περισσότερα φρούτα και λαχανικά καταλήγουν στον καταναλωτή συσκευασμένα σε αντίθεση με την προηγούμενη δεκαετία που στις περισσότερες των περιπτώσεων διατίθεντο χύμα. Είναι πλέον συνηθισμένο στα ράφια των υπεραγορών να έχουμε φρεσκοκομμένες σαλάτες συσκευασμένες σε σακούλια καθώς και συσκευασμένα και καταψυγμένα λαχανικά που μέχρι πριν λίγα χρόνια ήταν διαθέσιμα μόνο στις φρουταρίες και στα φθαρτοπωλεία. Η διάθεση όμως των συσκευασμένων οπωρολαχανικών διέπεται από την Ευρωπαϊκή Νομοθεσία (Οδηγία 68/2007) για υποχρεωτική επισήμανση τυχόν τροφικών αλλεργιογόνων στα 64

66 συσκευασμένα τρόφιμα και φυσικά και στα συσκευασμένα οπωρολαχανικά. Το πλέον σύνηθες αλλεργιογόνο είναι το σέλινο και οι εταιρείες τυποποίησης φρέσκων η καταψυγμένων λαχανικών ελέγχουν τυχόν παρουσία του σέλινου στις συσκευασμένες συσκευασίες. Ειδικά στην Κύπρο που πρώτη ύλη για την παρασκευή του χαλουμιού είναι ο δυόσμος, ελέγχεται και η παρουσία σέλινου στον παραλαμβανόμενο δυόσμο που μπορεί να βρεθεί με τη σειρά του στο τελικό προϊόν (χαλούμι) αλλά και στα ξιδάτα που είναι παραδοσιακά αναπόσπαστο μέρος της Κυπριακής διατροφής, Η ανίχνευση του σέλινου εκτελείται μόνο με τεχνικές μοριακής βιολογίας (RT-PCR). Παρουσίαση των ISO που σχετίζονται με τη διαδικασία Τα ISO και είναι αυτά που ασχολούνται με την εύρεση της αλληλουχίας που σχετίζεται με τα αλλεργιογόνα και το αλλεργιογόνο σέλινο αντίστοιχα και είναι το πόνημα της ομάδας εργασίας 12, της Τεχνικής Επιτροπής 275 της Ευρωπαϊκής Επιτροπής Τυποποίησης της οποίας είναι και μέλος ο κ. Γεώργιος Σειραγάκης. Το ISO περιέχει ένα πρότυπο σχέδιο που παρέχει ένα γενικό πλαίσιο για την ανίχνευση των αλληλουχιών που αντιστοιχούν στα αλλεργιογόνα είδη που περιέχονται, χρησιμοποιώντας την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Σχετίζεται με τις απαιτήσεις για τη ενίσχυση των συγκεκριμένων αλληλουχιών νουκλεϊκού οξέος (DNA) στόχων και για την επιβεβαίωση της ταυτότητας της ενισχυμένης αλληλουχίας του νουκλεϊκού οξέος [1]. Πιο συγκεκριμένα το (CEN / TS ) αφορα τον ποιοτικό προσδιορισμό (ανίχνευση) της ακολουθίας DNA σέλινου με RT-PCR και καθορίζει μια μέθοδο για την ποιοτική ανίχνευση σέλινου (Apium graveolens) στο γαλάκτωμα λουκάνικου (η μεταφραση στα ελληνικά γίνεται με τον όρο σάλτσες) (για παράδειγμα, Frankfurter, Wiener) και εκδόθηκε από τον ΕΛΟΤ στις 26/10/2012. Η ανίχνευση του σέλινου γίνεται σε real-time PCR και βασίζεται σε μία 101 bp (ζεύγη βάσεων) αλληλουχία του γονιδίου της αφυδρογονάσης της μαννιτόλης (mannitol dehydrogenase) (GenBank Acc. Αρ. AF067082) του σέλινου (Apium graveolens) [2]. Στις προδιαγραφές των αναλύσεων αναφέρεται ότι τα αποτελέσματα από δύο τμήματα δοκιμής πρέπει να είναι συνεπή. Εάν ένα τμήμα δοκιμής είναι θετικό και το άλλο δίνει αρνητικό, τότε η ανάλυση πρέπει να επαναληφθεί, αν είναι δυνατόν, με την αύξηση της ποσότητας του προτύπου νουκλεϊκού οξέος στην αντίδραση, έτσι ώστε να έχουμε ένα ασφαλές αποτελέσματα και για τα δύο τμήματα δοκιμής. Σε περίπτωση διφορούμενα αποτελέσματα συνεχίζουν να υπάρχουν, επαναλαμβάνεται όλη τη διαδικασία από την εκχύλιση του DNA. Επιπλέον, ως ελάχιστο, η καθαρότητα του εκμαγείου νουκλεϊνικού οξέος θα πρέπει να ελέγχονται με τη συμπερίληψη ένός πρότυπου δείγματος αναστολής της RT-PCR. Άλλoi έλεγχοι όπως του μήκους και της ακεραιότητας του εκμαγείου νουκλεϊνικού οξέος μπορεί να είναι χρήσιμη. Τα ISO αυτά περιέχουν πληροφορίες για τις συνθήκες της απομόνωσης του γενετικού υλικού αλλά και της συνθήκες της RT-PCR. Με βάση αυτά τα ISO καθώς και τα προτόκολλα των kits που παρουσιάζουμε παρακάτω κάναμε μια σειρά πειραμάτων σε κυπριακά εμπορικά προϊόντα [1]. 65

67 Διαδικασια απόμόνωσης DNA και το πρωτόκολο της RT-PCR Απομόνωση: Για την απομόνωση του DNA του δείγματος που προορίζεται για ανίχνευση αλλεργιογόνου σέλινου πραγματοποιήθηκαν αξιολογήσεις συγκεκριμένων εμπορικών πακέτων (kits) απομόνωσης DNA από τους εμπορικούς οίκους «HAI KANG Life Corporation» και «BIOO Scientific», τα οποία στηρίζονται στην καλή ομογενοποίηση των δειγμάτων, τη λύση των κυτταρικών τοιχωμάτων με κατάλληλα διαλύματα. Ταυτόχρονα, εφαρμόστηκε απομόνωση του γενετικού υλικού σύμφωνα με το πρότυπο ISO/FDIS και τη μέθοδο εκχύλισης με διάλυμα βρωμιούχου κετυλοτριμεθυλαμμώνιο (CTAB), η οποία πραγματοποιείται με την προσθήκη ενζύμου Rnase που προτείνεται για δείγματα όπου η ταυτόχρονη κατακρήμνιση του RΝΑ δυσκολεύει περαιτέρω την ανάλυση. Όλες οι μέθοδοι απομόνωσης εμφανίζουν διαφορετικά χαρακτηριστικά στη διαδικασία εκχύλισης, τα όρια ανίχνευσης, τις συνθήκες αντίδρασης, κ.λ.π. Φωτομέτρηση: Τα νουκλεϊκά οξέα απορροφούν στα 260nm. Οι πρωτεΐνες και ο αρωματικός δακτύλιος της φαινόλης απορροφούν στα 260nm αλλά και στα 280nm, όπου δεν απορροφούν τα νουκλεϊκά. Για να είναι καθαρό το δείγμα, πρέπει η απορρόφηση στα 260nm να είναι σχεδόν διπλάσια της απορρόφησης στα 280nm. Γίνονται επομένως δύο μετρήσεις και υπολογίζεται ο λόγος OD 260 /OD 280. Ο λόγος αυτός πρέπει να είναι Τέλος, για τον υπολογισμό της τελικής συγκέντρωσης του δείγματος πραγματοποιείται μέτρηση της απορρόφησης στα 320nm, ενώ η συγκέντρωση καθορίζεται από τον τύπο DF x (O.D 260 -O.D 320 ) x 37 όπου DF = Dilution Factor. Την απομόνωση DNA διαδέχονται οι Αλυσιδωτές Αντιδράσεις της Πολυμεράσης (PCR και Real Time PCR) για την ποιοτική και ημι-ποσοτική ανίχνευση του συγκεκριμένου αλλεργιογόνου. Οι αντιδράσεις PCR στηρίζονται στην ανίχνευση συγκεκριμένων περιοχών γονιδίων-στόχων για τον συγκεκριμένο αλλεργιογόνο μέσω ειδικών ζευγών εκκινητών. RT-PCR: Για την εφαρμογή των μεθόδων PCR επιλέχθηκαν συγκεκριμένα εμπορικά πακέτα του εμπορικού οίκου «GENERON ADVANCED TRANSFER TECHNOLOGIES» και του οίκου «HAI KANG Life Corporation» ενώ εφαρμόστηκαν σε συνδυασμό με 2 μεθόδους εκχύλισης DNA, ώστε να αξιολογηθούν ως προς την αποτελεσματικότητα τους με τη μέθοδο της Real Time PCR. Για τους ανιχνευτές της GENERON που χρησιμοποιεί η παρακάτω PCR: Στόχοι Χρωστικές Αναφοράς Σβήνουσες Χρωστικές ALLERGEN TARGET FAM BHQ1-NFQ IPC HEX BHQ1-NFQ Πίνακας 1: Τα είδη των ανιχνευτών που χρησιμοποιεί το κιτ της «GENERON ADVANCED TRANSFER TECHNOLOGIES» Το θερμοκρασιακό πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε για τις αραιώσεις από κάθε συγκεκριμένη εκχύλιση DNA (συγκέντρωση ng) για τη διαδικασία της Real Time PCR, παρουσιάζεται στον Πίνακα και είναι κοινό και για τις δύο εταιρίες: 66

68 Θερμοκρασιακό πρωτόκολλο Real Time PCR Υβριδοποίηση - Επιμήκυνση εκκινητών 50 C για 2 min Αριθμός κύκλων Αρχική Αποδιάταξη 95 C για 10 min αντίδρασης: 1 Αποδιάταξη DNA στόχου 95 C για 15 sec Αριθμός κύκλων Υβριδοποίηση - Επιμήκυνση εκκινητών 60 C για 1 min αντίδρασης: 40 Πίνακας 2: Συνθήκες Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (Real Time PCR) για την ανίχνευση του αλλεργιογόνου σέλινου. [3], [4] Οι ποσότητες που απαιτούνται για μια αντίδραση Real Time PCR δίνονται στον παρακάτω πίνακα: «GENERON ADVANCED TRANSFER TECHNOLOGIES» Ποσότητα Αντιδραστήρια Αντιδραστηρίων (μl) Unknown Sample or Positive Control or DNAse/RNAse Free Water(represents the NTC: No Template Control) 12 «HAI KANG Life Corporation» Αντιδραστήρια Real-time mastermix DNA template Ποσότητα Αντιδραστηρίων (μl) 11,2 X SPECIALfinder WORKING M- MIX [4] Double-distilled water 8,8-X Συνολικός Όγκος 30 Συνολικός Όγκος 20 Πίνακας 3: Αντιδραστήρια και ποσότητα αντιδραστηρίων ανά αντίδραση Real Time PCR για την ανίχνευση του αλεργιογόνου για τους 2 εμπορικούς οίκους. Για την ανίχνευση του αλλεργιογόνου σέλινου μέσω Real Time PCR, εξετάστηκε ο αριθμός των κύκλων κατά την διάρκεια του οποίου, το δείγμα φτάνει την γραµµή «Threshold» [Threshold cycle (Ct)] δηλαδή του σημείου στο οποίο ξεχωρίζει έντονα το φθορίζον σήμα των προϊόντων της Real Τime PCR από το φόντο. Όσο μεγαλύτερη είναι η ποσότητα της αρχικής αλληλουχίας DNA στο κάθε δείγμα τόσο νωρίτερα εμφανίζεται η τιμή Ct για κάθε δείγμα, δηλαδή αναλογικά η Ct θα είναι μικρότερη. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων παρουσιάζονται σε υπολογιστή με τη μορφή γραφημάτων και πινάκων. Βιβλιογραφια [1] CEN/TC 275/WG 12 N 175, pren :2008 [2] DIN CEN/TS :2012 overview of din-spec / [3] Πρωτόκολλο «SPECIALFINDER-ALLERGEN/IPC DETECTION ASSAY», «GENERON ADVANCED TRANSFER TECHNOLOGIES» KAI

69 68

70 Συνεδρία Β2 69

71 70

72 Μοριακός και αναλυτικός χαρακτηρισμός της βιοσύνθεσης τοκοχρωμανολών σε καρπούς ελιάς (Olea europaea L.) Α.Χ. Γεωργιάδου 1, Β. Γούλας 1, Τ. Ντούρου 2, Γ.Α. Μαγγανάρης 1, Π. Καλαϊτζής 2 και Β. Φωτόπουλος 1 1 Τεχνολογικό Πανεπιστήμιο Κύπρου, Τμήμα Γεωπονικών Επιστημών, Βιοτεχνολογίας & Επιστήμης Τροφίμων, 3603 Λεμεσός 2 Μεσογειακό Αγρονομικό Ινστιτούτο Χανίων, Τομέας Γενετικής Βελτίωσης & Βιοτεχνολογίας Οπωροκηπευτικών, Χανιά Οι τοκοχρωμανόλες, μία ομάδα ενώσεων κοινώς γνωστές ως βιταμίνη Ε, συμπεριλαμβάνουν δύο υποομάδες: (α) τις τοκοφερόλες και (β) τις τοκοτριενόλες. Οι τοκοχρωμανόλες έχουν ισχυρή αντιοξειδωτική ικανότητα και βρίσκονται σε υψηλές συγκεντρώσεις στον ελαιόκαρπο και στα υποπροϊόντα του. Η παρούσα εργασία επιχειρεί το χαρακτηρισμό της βιοσύνθεσης τοκοχρωμανολών στη διαδεδομένη ποικιλία Κορωνέικη με μοριακές και αναλυτικές μεθόδους. Καρποί ελιάς συγκομίστηκαν σε δεκαπέντε διαδοχικά αναπτυξιακά στάδια, από τα μέσα Ιουνίου μέχρι τα τέλη Δεκεμβρίου και συγκεκριμένα 6-34 εβδομάδες μετά την άνθιση από τον πειραματικό ελαιώνα του Μεσογειακού Αγρονομικού Ινστιτούτου Χανίων. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε απομόνωση ολικού RNA μέσω πολλαπλών εκχυλίσεων με φαινόλη και/ή χλωροφόρμιο. Ακολούθησε σύνθεση συμπληρωματικού DNA και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qrt-pcr), με την οποία μελετήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση των τοκοχρωμανολών. Τα αποτελέσματα έδειξαν διαφορική έκφραση των εξεταζόμενων γονιδίων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση της βιταμίνης Ε. Συγκεκριμένα, καταγράφηκε μεγαλύτερος βαθμός ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης στα αρχικά και ενδιάμεσα γονίδια του βιοσυνθετικού μονοπατιού (VTE5, Geranylgeranyl reductase, HPPD, VTE2, HGGT και VTE3b) σε σχέση με τα υπόλοιπα γονίδια (VTE1 και VTE4a). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρατηρείται στα γονίδια HGGT και VTE2 που παρουσιάζουν μια γενικότερη καταστολή κατά την διάρκεια όλων των εβδομάδων μετά την άνθιση. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε υγρή χρωματογραφία υψηλής ανάλυσης για τον προσδιορισμό των επιπέδων των επιμέρους τοκοφερολών και τοκοτριενόλων σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια του ελαιοκάρπου, όπου ανιχνεύθηκαν οι υπομορφές α-, γ-, δ- τοκοφερολής και γ-τοκοτριενόλης. 71

73 Rapid analysis for fungal growth and OTA production of Aspergillus carbonarius using turbidimetric measurements Angelos-Gerasimos Ioannidis 1, Naresh Magan 2, Efstathios Z. Panagou* 1 1 Laboratory of Microbiology and Biotechnology of Foods, Department of Food Science and Technology, Agricultural University of Athens, Iera Odos 75, Athens, Greece, *Ε-mail: stathispanagou@aua.gr; 2 Applied Mycology Group, Cranfield Health, Cranfield University, College Road, Cranfield, Bedforshire, UK. Abstract The effect of water activity (0.92 and 0.96), temperature (25 and 30 C) and sodium metabisulphite (NaMBS) on the growth and OTA production of a strain of A. carbonarius isolated from wine grapes was investigated, employing a rapid screening method based on turbidimetric measurements. The technique has been put into application to examine the impact of 24 different concentrations of NaMBS against growth and OTA production in YES medium (ph 3.6) over 7 day periods with automated measurements every 20 min. The values of minimum inhibitory concentration (MIC), non-inhibitory concentration (NIC) and MIC 50 have been calculated using the Lambert-Pearson model. Findings indicated that no fungal growth occurred over 175 and 200 ppm of NaMBS at 25 C and 30 C 0.92 a w respectively. At 0.92 a w there was no significant difference in the calculated MIC, NIC and MIC 50 values for both storage temperatures; their values were 430, 65, and 165 ppm for MIC, NIC and MIC 50, respectively. However, at 0.96 a w some differences were evident between the two temperatures. Specifically, the NIC value at 30 C was higher (100 ppm) compared with 25 C (74 ppm) and the same trend was observed for the MIC (422 ppm/25 C and 444 ppm/30 C). Generally, concentrations up to 444 ppm of NaMBS were required for complete growth inhibition, while lower concentrations (<100 ppm) stimulated growth. OTA was mainly produced at 25 C at 0.92 a w, whereas increased variability was observed depending on the NaMBS concentration. Materials and methods The mathematical model used for data analysis was Lambert & Pearson model (LPM) (2000) which was applied on filamentous fungi by Medina et al (2012). This model calculates the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and the Non-Inhibitory Concentration (NIC) by using the time to detection (TTD) of a specific optical density value (O.D.). The model is described by the following equations: (1) RTD=P 0 exp(-x/p 1 ) P 2), (2) MIC=P 1 exp(1/p 2 ), (3) NIC=P 1 exp((1-e)/p 2 ), (4) MIC P P 1 2 ln2

74 O.D. O.D. O.D. O.D. where RTD is the rate to detection (1/TTD), x is the inhibitor concentration, P 0 is the optimal RTD value, P 1 is the concentration at maximum slope and P 2 the slope parameter (on a log concentration axis). A wild strain of Aspergillus carbonarius was isolated from Greek grapevines. The medium used was yeast extract sucrose (YES) containing 20 g/l yeast extract, 150 g/l sucrose, 0.5 g/l magnesium sulfate and 0.122% w/v agar. Water activity was adjusted with glycerol at 0.92 and 0.96 a w, respectively. ph was adjusted at 3.6 with citric acid- sodium citrate buffer. A standard solution of NaMBS (aq) 10% w/v was prepared and the required amount of stock solution was added under sterile conditions in YES medium to obtain a range of concentrations between ppm. Each medium was inoculated with 10 5 spores/ml, the appropriate amount of NaMBS solution was added and then it was poured in a petri dish. Media (200μl) were decanted into the 100-well microtitrate plates using a multichannel pipette (5 well per each NaMBS concentration). For the turbidimetric assay, a Bioscreen C Microbial Growth Analyzer was used with non-standard, 100-well microtitrate plates. The O.D was recorded every 20 min for a 7-day period using a 600 nm filter. Experiments were conducted at 25 and 30 o C, respectively. Results Discussion Average growth curves with 7-11 different concentrations of NaMBS under 4 different environmental conditions are shown in Fig. 1. The TTD was obtained for an O.D. value of 0.1 for all environmental conditions. Data were analysed with LPM (Eq. 1) and model parameters and 95% confidence intervals were calculated (Table 1). In spite of the differences in the P 0 values observed (showing the effect of different environmental conditions on fungal growth in the absence of the inhibitor) P 1 and P 2 were not statistically different (P>0.05). These results suggest that the effect of NaMBS remains the same under the conditions examined. Using the parameters obtained above the MIC, NIC, MIC 50 were calculated (Eqs. 2-4) Table o C 0.92 a w 0 ppm 25 ppm 50 ppm 75 ppm 100 ppm 150 ppm 175 ppm Time (min) o C 0.96 a w Time (min) 0 ppm 25 ppm 50 ppm 75 ppm 100 ppm 125 ppm 150 ppm 175 ppm 200 ppm 250 ppm 300 ppm ppm 25 ppm 50 ppm 75 ppm 100 ppm 150 ppm 175 ppm 30 o C 0.92 a w Time (min) o C 0.96 a w Time (min) 0 pmm 25 ppm 50 ppm 75 ppm 100 ppm 125 ppm 150 ppm 175 ppm 200 ppm 250 ppm 300 ppm Fig. 1: Average growth curves showing representative concentrations of NaMBS after 7 days in 4 environmental conditions

75 Table 1: Parameters of LPM: P 0, P 1, P 2 with their confidence intervals 0.96 a w 25 o C 30 o C Lower CL Upper CL Lower CL Upper CL P P P a w 25 o C 30 o C Lower CL Upper CL Lower CL Upper CL P P P Table 2: MIC, NIC, and MIC 50 NaMBS concentration values with their 95% confidence limits o C 25 o C Lower CL Upper CL Lower CL Upper CL MIC MIC NIC NIC MIC MIC o C 30 o C Lower CL Upper CL Lower CL Upper CL MIC MIC NIC NIC MIC MIC Comparison of the results indicates that the concentrations were not statistically different (P>0.05). The only difference observed was the NIC value at 30 o C and 0.96 a w, this minor difference is possibly attributed to the fact that these 2 conditions belong to the range of optimal growth conditions for A. carbonarius making the fungus slightly more resistant to the antifungal compound. Despite the difference in the NIC value the efficacy of NaMBS is independent of the environmental conditions. To verify this conclusion relative RTD against NaMBS concentation (Fig. 2) has been plotted demonstrating that the fungus was affected in similar way under all 4 conditions. 74

76 Fig. 2: Graphical representation of relative RTD (RTD/P 0 RTD) against the NaMBS concentration Concerning the ochratoxin A (OTA) results, HPLC analysis was conducted on the 7th day of the experiment detecting relatively low concentrations (<10 ppb) of OTA, specifically at 25 o C and 0.92 a w in a range of NaMBS concentrations between ppm (data not shown). Acknowledgements This work has been supported by the project Design and development of innovative tools for the detection of ochratoxigenic fungi in wine and table grapes FungalPrognosis_242 that is co financed by the European Union (European Social Fund ESF) and Greek national funds through the Operational Program "Education and Lifelong Learning" of the National Strategic Reference Framework (NSRF) Research Funding Program: ARISTEIA-I. References Lambert, R.J.W., Pearson, J. (2000) Susceptibility testing: accurate and reproducible minimum inhibitory concentration (MIC) and non-inhibitory concentration (NIC) values. Journal of Applied Microbiology 88, Medina, A., Lambert, R.J.W., Magan, N. (2012) Rapid throughput analysis of filamentous fungal growth using turbidimetric measurements with the Bioscreen C: a tool for screening antifungal compounds. Fungal Biology 116,

77 ITS-RFLP characterization of Aspergillus isolates in grapes of four traditional grapeproducing areas in Greece Dimosthenis Kizis*, Pantelis Natskoulis, George-John Ε. Nychas, Efstathios Ζ. Panagou Laboratory of Microbiology and Biotechnology of Foods, Department of Food Science and Human Nutrition, Agricultural University of Athens, Iera Odos 75, Athens, Greece, *Ε-mail: Abstract A study on the occurrence of Aspergillus spp. section Nigri species on grapes and their capability to produce OTA was conducted. Table and wine grapes were collected from four traditional grapeproducing areas in Greece (Macedonia, Peloponnese, Attica and Crete) during the harvest period of Thirty three vineyards were sampled and mycological analysis resulted in the identification of common grape microbiota (Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Fusarium and Penicillium spp). One hundred and eighteen black aspergilli isolates were characterised at the species level initially by use of morphological criteria (colour, density and colony appearance) and microscope observation (conidiophore and conidial head characters) in accordance with appropriate keys, followed by molecular characterisation. Molecular characterisation was performed by Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorfism (PCR-RFLP) of the 5.8 ribosomal RNA gene Internal Transcribed Spacer region (5.8 rrna ITS) using the HinfI, HhaI and RsaI restriction endonucleases. Data from molecular characterisation and phenotypical observations were in accordance, and classified the individual isolates into four Aspergillus species corresponding to A. carbonarius, A. niger, A. tubingensis and A. japonicus. From the identified isolates, the two main representative species A. carbonarius and A. tubingensis were equally counted, with higher geographical representation of the former in southern and the latter in northern regions respectively. All isolates were tested for their ochratoxigenic potential by use of High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) coupled with fluorescence detector and Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA), resulting to significant intra- and interspecies differences in OTA production. 76

78 Acknowledgements This work has been supported by the FungalPrognosis project 242 of the ARISTEIA-I call cofunded by EC European Social Fund and the Greek General Secretariat of Research and Technology. 77

79 Μοριακές Τεχνικές στην Ασφάλεια - Ποιότητα - Γνησιότητα Τροφίμων B. Ευαγγέλου 1, Α. Λαμπιδώνης 2, Γ. Σειραγάκης 3 1 Food Allergens Laboratory, Ι. Ζερβού 1, 14121, Ν. Ηράκλειο, Αθήνα 2 Food Allergens Laboratory, Μπιζανίου 5, 74100, Ρέθυμνο, Κρήτη 3 FA Food Allergens Lab Ltd, Καλοψίδας 38, 7060, Λιβάδια, Κύπρος * athens@foodallergenslab.com Οι μοριακές μέθοδοι κατακτούν όλο και περισσότερο έδαφος σε τομείς των τροφίμων, όπως η ασφάλεια (ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών, εντοπισμός αλλεργιογόνων ουσιών), η ποιότητα και η γνησιότητά τους (προσδιορισμός γενετικά τροποποιημένων οργανισμών, νοθεία τελικού προϊόντος με άλλα χαμηλότερης ποιότητας ή κόστους). Οι βασικές μοριακές τεχνικές που πραγματοποιούνται διακρίνονται στα στάδια: 1. Επιλογή αντιπροσωπευτικού δείγματος του προς εξέταση τροφίμου και καλή ομογενοποίησή του. 2. Απομόνωση ολικού γενετικού υλικού (DNA/RNA). 3. Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης Polymerase Chain Reaction (PCR) α) Απλή PCR: ενίσχυση σε θερμοκυκλοποιητή του γονιδιακού τμήματος που είναι επιθυμητή η ανίχνευσή του (παθογόνο, αλλεργιογόνο, DNA ξένου οργανισμού) β) real time PCR (qpcr): ενίσχυση του επιθυμητού γονιδιακού τμήματος και παρακολούθηση της παρουσίας ή απουσίας του σε πραγματικό χρόνο (ποιοτική ή ποσοτική) 4. Ηλεκτροφόρηση πήγματος, συνηθέστερα αγαρόζης ή ακρυλαμιδίου για τον έλεγχο της παρουσίας ή απουσίας του εξεταζόμενου γονιδιακού τμήματος (Το στάδιο αυτό πραγματοποιείται στην περίπτωση της απλής PCR, 3α). Σε κάθε περίπτωση οι εκκινητές (primers) που θα χρησιμοποιηθούν στο στάδιο της PCR πρέπει να είναι κατάλληλοι και εξειδικευμένοι (μιτοχονδριακό, μικροδορυφορικό DNA), για να ανιχνεύσουν το συγκεκριμένο κομμάτι του DNA (πρόσφατη, αναδυόμενη τεχνολογία του Barcoding) και να το πολλαπλασιάσουν πολλές φορές. Οι εκκινητές ανά περίπτωση σχετίζονται με παθογόνους μικροοργανισμούς που βρίσκονται στα τρόφιμα (Camplobacter jejuni, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Vibrio spp., Norovirus κα), αλλεργιογόνα που δεν πρέπει να εντοπίζονται ή να εντοπίζονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις (σέλινο, σόγια, οστρακοειδή κα), γενετικής τροποποίηση (GMO), αλλά και με DNA που εντοπίζεται σε άλλους οργανισμούς (νοθεία) πχ αγελάδος σε φέτα και χαλούμι, αλόγου ή χοιρινού σε μοσχαρίσιο κιμά, κοτόπουλου σε προϊόντα γαλοπούλας, halal κα. 78

80 Τέλος, οι απαιτήσεις της αγοράς έχουν οδηγήσει τη βιομηχανία στην παραγωγή έτοιμων, ολοκληρωμένων πακέτων αντιδραστηρίων και αναλωσίμων (kits για απομόνωση DNA/RNA, εφαρμογή PCR κλπ), η χρήση των οποίων παρουσιάζει πλεονεκτήματα σε χρόνο, ευαισθησία και αποτελεσματικότητα. Λέξεις κλειδιά Mοριακές τεχνικές, ασφάλεια τροφίμων, παθογόνα, αλλεργιογόνα, GMO, DNA, PCR. 79

81 Quality Improvement & QA Tools Christine M. Gutschelhofer 1, Ronald Niemeijer 1, Carrie Maune 2 1 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstrasse 17, Darmstadt, Germany, 2 Trilogy Analytical Laboratory, 870 Vossbrink Dr., Washington, MO 63090, USA, Telephone: Fax: Mail: c.gutschelhofer@r-biopharm.de The performance of an assay like a (competitive) ELISA relies on a number of factors. Many errors can be avoided if the test kit package insert is read through carefully and fully understood before the assay is performed. Different good laboratory practices can help to reduce error in the analytical measurement results. As a matter of course, operator skills have an important impact on the measurements. However there are additional effects which contribute to error. Thus it is absolutely essential to avoid using not suitable or not functioning respectively not calibrated instruments (e.g. pipettes, photometers, etc.). The impact of the environment should not be underestimated. Factors as temperature and light irradiation as well as many other conditions can lead to interferences in the assay performance and/or the measuring instruments. Besides storage temperature of the reagents it is essential to allow the test kit components to reach room temperature according to the instruction given in the package insert. Moreover there are different guidelines to improve the reliability of a test implementation. Assay set-up should be performed in a continuous way. This includes that all standards and samples are prepared appropriately to the test kit manual. Particular attentions must be paid in the pipetting steps. If the test kit has been opened and used before, check reagent solutions for signs of instability or deterioration (e.g. coloration of the chromogen solutions). Avoid cross-contamination of kit reagents using disposable pipette tips. Take particular notice of the washing process and the incubation time. The incubation time of RIDASCREEN FAST Mycotoxin kits with antibody has to be started after the addition of antibody into the last well. Whereas the incubation time with substrate/chromogen has to be started after the addition of substrate/chromogen into the first well. Each RIDASCREEN test kit contains a quality assurance certificate and should be used as a tool for evaluation of the test performance. There are several possible causes for poor standard curves like significant divergent OD values, B/B0 values or the 50% inhibition factor. 80

82 Potential reasons for OD values much higher than given in the certificate or values even out of the range are improper dilutions of test kit reagents when a dilution is required. Further causes are defect photometer, incomplete or inadequate washing of wells, reagent deterioration, false incubation time and temperatures or even a pipetting error. Inadequate handling of the analytical test procedure can also lead to intra- and/or inter-assay problems. To obtain reliable results by using an ELISA requires several factors that may affect the quality of the data performance. Therefore it is highly recommended to utilize some basic tools as part of the overall QA program, laboratories can build additional quality into their systems. Especially in the mycotoxin testing poses some unique challenges for analytical laboratories. Using solid validated analytical methods are only part of the solution to providing the best analytical results possible. Understanding that sampling contributes more to variability of results than any other component of mycotoxin analysis is a critical concept. Mycotoxins are not evenly distributed PLUS they may be present at extremely low levels of contamination. Large samples of whole grains must be collected and subsampled properly, the entire probed sample should be ground finely and then mixed well before taking an analytical sample for testing. Next, knowledge of the type of samples is crucial. Samples submitted for mycotoxin analysis may be as simple as corn or wheat or as complex as nutraceuticals or complex animals feeds. Knowing your sample will give you insight on potential mycotxins. For example wheat products are more commonly contaminated with DON and zearalenone and only in some unusual instances are aflatoxin and fumonisin detected. In addition evaluating the matrix that will be analyzed can help determine the best method for the analysis. Complex matrices typically require analytical methodology such as HPLC, LC/MS or GC and also require multiple steps to remove interferences so that a purified extract with minimal interferences can be utilized for analysis. When unusual matrices are analyzed it is always good practice to analyze a matrix spike to confirm an acceptable toxin recovery through the method. This use of mycotoxin standards to prepare matrix spikes is an excellent tool to measure overall success of the method on an unusual matrix that may not have been specifically validated on any method. Reference materials (RM) can serve as a cornerstone to build daily quality assurance data. Utilizing a RM such as a naturally contaminated grain sample with each sample run provides valuable information about all of the method parameters. When reference materials are used from the extraction step all the way through the method, the reference material provides a complete check on the entire system. It insures extraction was efficient, technician techniques were solid, standards were accurate and instrumentation was running as it should be. Technician training and documentation is a critical part of any laboratory and RM can also be used as both a training tool and as an on-going check on analyst capabilities. Reference materials are available in a wide 81

83 variety of matrices and toxin combinations. These reference materials can also be used when method validations need to be completed. Another application is the use of RM in proficiency testing (like the Double Check program from Trilogy Analytical). Quality assurance in a mycotoxin analysis may be more challenging than for other compounds, however with some basic tools the accuracy of the results reported can be assured. 82

84 Συνεδρία Β3 83

85 84

86 Μελέτη της επίδρασης της λιποπεριεκτικότητας και της προσθήκης καζεϊνικών αλάτων και συμπυκνωμάτων πρωτεϊνών ορού στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά αναμιγμένης γιαούρτης από βουβαλίσιο γάλα Παντελίνα Ακακιάδου*, Στέλλα Χρυσαλίδου, Γεωργία Δημητρέλη, Δημήτριος Πετρίδης Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Τεχνολογίας Τροφίμων και Διατροφής, Αλεξάνδρειο Τεχνολογικό Εκπαιδευτικό Ίδρυμα Θεσσαλονίκης (ΑΤΕΙΘ), Θεσσαλονίκη *Στοιχεία επικοινωνίας - τηλ.: , lakakiad@gmail.com Study of the sensory properties of stirred yogurt made from buffalo milk as affected by fat content and sodium caseinates and whey protein concentrates addition Pantelina Akakiadou*, Stella Chrysalidou, Georgia Dimitreli, Dimitrios Petridis Department of Food Technology, School of Food Technology and Nutrition, Alexander Technological Educational Institute (ATEITHE), 57400, Thessaloniki, Greece *Corresponding author: tel , address:lakakiad@gmail.com ΠΕΡΙΛΗΨΗ Για την αξιολόγηση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών της αναμιγμένης γιαούρτης από βουβαλίσιο γάλα χρησιμοποιήθηκε πειραματικό σχέδιο μίξης τριών παραγόντων με μια μεταβλητή διεργασίας. Οι τρεις παράγοντες ήταν: πρωτεΐνες ορού (WPC) - καζεϊνικά άλατα (SCN) - λίπος σε αναλογίες 0-3,5%, 0-3,5%, 0-7%, ενώ η θερμοκρασία θερμικής επεξεργασίας του γάλακτος είχε δυο επίπεδα, 85 C και 95 C. Παρασκευάστηκαν 18 μίξεις γιαούρτης και αξιολογήθηκαν οργανοληπτικά. Ο εμπλουτισμός του γάλακτος με SCN είχε μεγαλύτερη επίδραση (θετική) σε σχέση με τα WPC στην απόκριση των μεταβλητών του αντικειμενικού οργανοληπτικού ελέγχου. Η αυξημένη λιποπεριεκτικότητα ήταν ο καθοριστικός παράγοντας για την αύξηση της αρεστότητας των μεταβλητών του ηδονικού οργανοληπτικού ελέγχου. Τέλος, η μίξη των τριών συστατικών για την παραγωγή ενός δυνητικά εμπορεύσιμου προϊόντος ήταν, WPC: 0-2,8%, SCN: 0,3-2,3%, Fat: 2,6-6%. ABSTRACT The sensory properties of buffalo milk stirred yogurt were evaluated employing a three components mixture experimental design including one process variable. The three ingredients consisted of Whey Protein Concentrates (WPC)-Sodium Caseinates (SCN)-Fat at corresponding ranges 0-3.5%, 0-3.5% and 0-7.0%, while the processing temperature of the milk had two levels, 85 C and 95 C. Eighteen mixture samples were produced and assessed for sensory intensity and acceptability of odor, white color, acidity, fattiness, viscosity and overall likeliness. SCN addition affected more positively the odor, the acidity and viscosity of the samples when compared with WPC addition. The increase in fat content in the mixtures primarily determined the increased acceptability of the hedonic variables. Optimization techniques converged to the 85

87 production of the most marketable buffalo milk stirred yogurt with the following ingredients combination: WPC:0-2.8%, SCN: % and Fat:2.6-6%. 1. Εισαγωγή Ένα από τα σημαντικότερα ποιοτικά χαρακτηριστικά της γιαούρτης είναι η υφή, η οποία επηρεάζεται κυρίως από τη θερμική επεξεργασία του γάλακτος, την περιεκτικότητα του σε πρωτεΐνες και την οξυγαλακτική καλλιέργεια (Tamime & Robinson, 2007; Sodini et al., 2004). Η χρησιμοποίηση γάλακτος με υψηλή περιεκτικότητα σε λίπος και πρωτεΐνες όπως το βουβαλίσιο, δίνει γιαούρτη με πλούσια κρεμώδη υφή. Η αύξηση της συνεκτικότητας μπορεί να επιτευχθεί και με την προσθήκη πρωτεϊνών γάλακτος (Damin et al., 2009;). Η παρασκευή γιαούρτης από βουβαλίσιο γάλα παρουσιάζει και άλλα πλεονεκτήματα καθώς έχει αυξημένη περιεκτικότητα σε ασβέστιο και μειωμένη σε χοληστερίνη (Ahmad et al., 2008). 2. Υλικά & Μέθοδοι Παρασκευή των δειγμάτων γιαούρτης: Για την παρασκευή των δειγμάτων γιαούρτης χρησιμοποιήθηκε βουβαλίσιο γάλα από την μονάδα επεξεργασίας γάλακτος «Φάρμα Μπέκας», οξυγαλακτική καλλιέργεια Streptococcus thermophilus και Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, με αναλογία στελεχών 1:1, καζεϊνικά άλατα (SCN) και συμπυκνώματα πρωτεϊνών ορού (WPC). Για την μελέτη των τριών συστατικών - παραγόντων επιλέχθηκε η μεθοδολογία των πειραμάτων μίξης με μεταβλητή διεργασίας την θερμοκρασία θερμικής επεξεργασίας του γάλακτος (Πετρίδης, 2000; Montgomery, 2001). Τέθηκαν ανώτερα και κατώτερα όρια συμμετοχής του κάθε παράγοντα, από 0-3,5 για WPC και SCN Θερμοκρασία 85 C WPC 7 Θερμοκρασία 95 C WPC 7 και από 0-7 για το λίπος (Fat). Βάσει αυτής 3,5-3, ,5-1,75-1,75 3,5-0-3,5 0 3,5-3, ,5-1,75-1,75 3,5-0-3,5 0 της μεθοδολογίας προσδιορίστηκαν και παρασκευάστηκαν 9 συνταγές γιαούρτης για 1,75-3,5-1,75 1,75-1,75-3,5 1,75-0-5,25 0-3,5-3,5 0-1,75-5, SCN Fat 1,75-3,5-1,75 1,75-1,75-3,5 1,75-0-5,25 0-3,5-3,5 0-1,75-5, SCN Fat κάθε επίπεδο θερμικής επεξεργασίας, 85 C και 95 C (Σχήμα 2.1). Οργανοληπτικός έλεγχος: Ο οργανοληπτικός Σχήμα 2.1: Το πεδίο ενδιαφέροντος για τα 2 επίπεδα θερμοκρασιών θερμικής επεξεργασίας έλεγχος είχε σκοπό την αξιολόγηση των παρακάτω αντικειμενικών και ηδονικών μεταβλητών: α) ένταση του αρώματος, β) ένταση του λευκού χρώματος γ) ένταση της οξύτητας, δ) ένταση της λιπαρότητας, ε) ένταση του παχύρευστου, στ) ένταση συνολική αρεστότητα. Το οργανοληπτικό σχέδιο που επιλέχθηκε εφαρμόστηκε 2 φορές και είχε τα εξής χαρακτηριστικά: t=9 (αριθμός μεταχειρίσεων), b=18 (αριθμός δοκιμαστών), λ=3 (αριθμός συνεύρεσης κάθε ζεύγους μεταχειρίσεων ανά δοκιμαστή), k=4 (μονάδες δοκιμής ανά δοκιμαστή), n=8 (φορές εμφάνισης κάθε μεταχείρισης συνολικά) (Cochran &Cox, 1957). Στατιστική ανάλυση: Οι μεταβλητές σχολιάστηκαν βάσει των εξισώσεων που τις περιγράφουν (Πίνακας 3.1), ενώ η γραφική απεικόνιση της απόκρισης τους έγινε με γραφήματα ισοϋψών καμπυλών (Contour plot). 86

88 3. Αποτελέσματα Η αντικειμενική αίσθηση της έντασης του αρώματος, της οξύτητα και του παχύρευστου αυξήθηκε κυρίως από την αυξημένη συγκέντρωση SCN στο μίγμα (Tamime & Robinson, 2007; Salaün et al., 2005; Akalin et al., 2012). Η αρεστότητα των δειγμάτων γιαούρτης ως προς την ένταση του λευκού χρώματος επηρεάστηκε θετικά κυρίως από την αυξημένη λιποπεριεκτικότητα του γάλακτος (Walstra et al, 2006). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και στην αρεστότητα ως προς την οξύτητα, την λιπαρότητα και την αίσθηση του παχύρευστου των δειγμάτων. Σε όλες τις περιπτώσεις η θερμοκρασία θερμικής επεξεργασίας των δειγμάτων, δεν εμφάνισε στατιστικά σημαντική επίδραση στην απόκριση των μελετούμενων μεταβλητών. Σχήμα 3.1: Γραφήματα ισοϋψών καμπύλων των μεταβλητών του οργανοληπτικού ελέγχου. Πίνακας 3.1: Εξισώσεις παλινδρόμησης μίξεων των οργανοληπτικών μεταβλητών Αντικειμενικές μεταβλητές Άρωμα: Ŷ= 1,118 (WPC) + 1,622 (SCN) + 1,088 (Fat) - 0,164 (WPC*Fat) (R 2 = 48,75 %, R 2 pred = 33,88 %, έλλειψη προσαρμογής : p= 0,222) Οξύτητα: Ŷ= 0,600(WPC) + 1,322(SCN) + 1,144(Fat) + 0,189(WPC * Fat) + 0,071(WPC * SCN * Fat) (R 2 = 48,73 %, R 2 pred = 29,60 %, έλλειψη προσαρμογής : p= 0,888) Παχύρευστο: Ŷ= 1,071 (WPC) + 1,943 (SCN) + 1,044 (Fat) (R 2 = 78,95 %, R 2 pred = 74,64 %, έλλειψη προσαρμογής : p= 0,069) Ηδονικές μεταβλητές Χρώμα: Ŷ= 1,168 (WPC) + 1,032 (SCN) + 1,507 (Fat) + 0,144(SCN *Fat) (R 2 = 67,1 %, R 2 pred = 57,92 %, έλλειψη προσαρμογής : p= 0,631) Οξύτητα: Ŷ= 0,736(WPC) + 0,462(SCN) + 1,249(Fat) + 0,257(WPC * SCN) + 0,16(WPC *Fat) + 0,279(SCN *Fat) (R 2 = 65,52 %, R 2 pred = 49,59 %, έλλειψη προσαρμογής : p= 0,454) Λιπαρότητα: Ŷ= 0,803(WPC) + 0,635(SCN) + 1,308(Fat) + 0,178(WPC * SCN) + 0,153(WPC *Fat) + 0,20(SCN *Fat) (R 2 = 77,88 %, R 2 pred = 67,49 %, έλλειψη προσαρμογής : p= 0,073) Παχύρευστο: Ŷ= 0,538(WPC) + 0,181(SCN) + 1,15(Fat) + 0,325(WPC * SCN) + 0,224(WPC *Fat) + 0,329(SCN *Fat) (R 2 = 62,12 %, R 2 pred = 44,74 %, έλλειψη προσαρμογής : p= 0,082) Γενική αρεστότητα: Ŷ= 0,14(WPC) 0,069(SCN) + 1,156(Fat) + 0,433(WPC * SCN) + 0,296(WPC*Fat) + 0,366(SCN *Fat) (R 2 = 79,03 % R 2 pred = 69,89 % έλλειψη προσαρμογής : p= 0,113) Εντοπισμός βέλτιστων μίξεων: Τα αποτελέσματα του αντικειμενικού οργανοληπτικού ελέγχου συνδυάστηκαν με αυτά της συνολικής αρεστότητας. Στη λευκή περιοχή του γραφήματος βρίσκονται οι βέλτιστες μίξεις, οι οποίες θέτουν τις προδιαγραφές για την παρασκευή ενός δυνητικά εμπορεύσιμου προϊόντος γιαούρτης. Σχήμα 3.2: Γράφημα επικαλυπτόμενων περιγραμμάτων (Overlaid Contour Plot) της συνολικής αρεστότητας και της αντικειμενικής αίσθησης του αρώματος, της οξύτητας και του παχύρευστου. 87

89 4. Συμπεράσματα Τα συμπεράσματα που προκύπτουν έχουν ως εξής: - Ο εμπλουτισμός του γάλακτος με SCN είχε τη μεγαλύτερη επίδραση (θετική) στην απόκριση των μεταβλητών του αντικειμενικού οργανοληπτικού ελέγχου (αίσθηση του αρώματος, της οξύτητας και του παχύρευστου). - Η αυξημένη λιποπεριεκτικότητα ήταν ο καθοριστικός παράγοντας για την αύξηση της αρεστότητας των μεταβλητών του ηδονικού οργανοληπτικού ελέγχου. - Στις περισσότερες περιπτώσεις o εμπλουτισμός του γάλακτος με WPC είχε ανάλογη επίδραση, χαμηλότερης όμως έντασης, στην απόκριση των μεταβλητών με αυτή των SCN. - Με βάση τη συνδυαστική απεικόνιση των γραφημάτων των ισοϋψών καμπυλών προσδιορίστηκαν τα ανώτερα και κατώτερα όρια προσθήκης των τριών παραγόντων που συμβάλλουν στην ανάπτυξη ενός δυνητικά εμπορεύσιμου προϊόντος: WPC: 0-2,7 %, SCN: 0,3-2,3 %, Fat: 2,7-5,9 %. Σε αυτά τα όρια αντιστοιχούν οι μεταχειρίσεις σύστασης 0 1,75 5,25 και 1,75 1,75 3,5, αντίστοιχα. 5. Βιβλιογραφία Ahmad, S., Gaucher, I., Rousseau, F., Beaucher, E., Piot, M., Gronget, J. F., & Gaucheron, F. (2008). Effects of acidification on physico-chemical characteristics of buffalo milk: A comparison with cows' milk. Food Chemistry, 106, Akalin, A.S., Unal, G., Dinkci, N. & Hayalogut, A.A. (2012). Microstructural, textural and sensory characteristics of probiotic yogurts fortified with sodium calcium caseinate or whey protein concentrate. Journal Dairy Science, 95, Cochran, W.G. & Cox, G.M. (1957). Experimental Designs. John Wiley & Sons, Chichester. Damin, M.R., Alcantara, M.R., Nunes, A.P., Oliveira, M.N. (2009). Effects of milk supplementation with skim milk powder, whey protein concentrate and sodium caseinate on acidification kinetics, rheological properties and structure of nonfat stirred yogurt. LWT-Food Science and Technology 42, Montgomery, C.D (2001). Design and analysis of experiments, 5th Edition, Vol. 11.5: Mixture Experiments, pp John Wiley and Sons inc., New York. Salaün, F., Mietton, B., & Gaucheron, F. (2005). Buffering capacity of dairy products. International Dairy Journal, 15, Sodini, I., Remeuf, F., Haddad, S., & Corrieu, G. (2004). The relative effect of milk base starter culture and process on yogurt texture: A review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44, Tamine, A.Y., & Robinson, R.K. (2007). Tamine and Robinson s yogurt. Science and Τechnology (3rd ed.), DC: CRC Press, Boca Raton, Boston, New York, Washington. Walstra, P., Wouters, J.T.M., & Geurts, T.J. (2006). Dairy Science and Technology (2 nd ed.). Boca Raton: Taylor & Francis, CRC Press. Πετρίδης, Δ. (2000). Εφαρμοσμένη Στατιστική με έμφαση στην Επιστήμη των Τροφίμων, Κεφ. 8.7: Πειράματα Μίξης, σελ.: Όμηρος Εκδοτική, Θεσσαλονίκη. 88

90 ΕΠΙΛΟΓΗ ΤΩΝ ΒΕΛΤΙΣΤΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΜΕ ΥΠΕΡΥΨΗΛΗ ΠΙΕΣΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ NFC ΠΟΡΤΟΚΑΛΟΧΥΜΟΥ ΠΟΙΚΙΛΙΑΣ NAVEL Ζ. Αλεξανδράκης, Α. Γουργουλέτης, Γ. Κατσαρός, Π. Ταούκης Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι βασικότεροι παράγοντες που επηρεάζουν την ποιότητα του χυμού πορτοκαλιού είναι η δράση των πηκτινολυτικών ενζύμων και η ανάπτυξη αλλοιογόνων μικροοργανισμών. Η Υπερυψηλή Πίεση (ΥΠ) είναι μια μη θερμική μέθοδος επεξεργασίας των τροφίμων για την απενεργοποίηση ενζύμων και μικροοργανισμών χωρίς θερμική αλλοίωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών τους. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η κινητική απενεργοποίηση της πηκτινομεθυλεστεράσης (ΠΜΕ) και δυο πιο ανθεκτικών στην πίεση στελεχών γαλακτικών βακτηρίων σε χυμό πορτοκαλιού ποικιλίας Navel με συνδυασμένη εφαρμογή ΥΥΠ και θερμοκρασίας (100 ως 500MPa & 20 ως 40 C). Για κάθε συνθήκη επεξεργασίας (πίεσης και θερμοκρασίας) υπολογίστηκαν οι κινητικές παράμετροι τόσο για το ένζυμο όσο και για τα γαλακτικά βακτήρια. Τόσο για την ΠΜΕ, όσο και για τους δύο μικροοργανισμούς προσδιορίστηκε ένα μαθηματικό μοντέλο για κάθε δείκτη που περιγράφει τη συνδυασμένη επίδραση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίησή τους. Συνδυάζοντας τα δύο μαθηματικά μοντέλα, οι προτεινόμενες συνθήκες για την επεξεργασία του πορτοκαλοχυμού (Navel) με ΥΠ είναι 600 MPa, 40 o C για 3 min. Στις συγκεκριμένες συνθήκες επιτυγχάνεται 90% απενεργοποίηση της ΠΜΕ και μείωση των γαλακτικών βακτηρίων κατά 7D. Τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης εργασίας μπορούν να χρησιμοποιηθούν για το βέλτιστο σχεδιασμό μιας διεργασίας ψυχρής παστερίωσης με ΥΠ για την παραγωγή ενός ποιοτικά ανώτερου Navel πορτοκαλοχυμού NFC. High Pressure processing conditions for the production of NFC Navel orange juice Orange juice is a widely consumed product due to its high nutritional value and desirable sensorial characteristics. Quality degradation of untreated orange juice is due to the presence of spoilage microorganisms and the activity of pectinolytic enzymes. High Hydrostatic Pressure (HHP) processing aims to inactivate spoilage microorganisms, namely yeasts and lactic acid bacteria (LAB), and pectinmethylesterase (PME) that causes the undesirable cloud loss. HHP processing has been proposed as an alternative method for the stabilisation of freshly squeezed orange juice and the extension of its shelf-life. Vitamins, flavouring agents and other compounds associated with sensory, nutritional and health related qualities of the product are not greatly affected by HHP processing. Yeasts have been shown to be considerably more labile to HHP than LAB. Effect of 89

91 HHP on PME has been shown to be source specific. The objective of this work was to study the inactivation of PME and lactic acid bacteria in Greek Navel orange juice during combined HHP and moderate temperature treatments. Process conditions of 600 MPa at 40 C for 3 minutes are proposed as sufficient for Navel orange juice cold pasteurization. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο χυμός πορτοκαλιού είναι ένα ευρείας κατανάλωσης τρόφιμο εξαιτίας της υψηλής θρεπτικής του αξίας και των επιθυμητών οργανοληπτικών χαρακτηριστικών του (Polydera et al., 2004). Η υποβάθμιση του πορτοκαλοχυμού οφείλεται κυρίως στη δράση της ΠΜΕ, η οποία προκαλεί απώλεια της θολότητάς του και μείωση του ιξώδους του, καθώς και την ανάπτυξη μικροοργανισμών, με κυριότερα τα γαλακτικά βακτηρία (Adams et al., 1999; Kimball 1999). Η παραδοσιακή μέθοδος απενεργοποίησης των αλλοιογόνων αυτών παραγόντων του χυμού είναι η θερμική παστερίωση, με αρνητική όμως επίπτωση στα θρεπτικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με την αυξανόμενη απαίτηση των καταναλωτών για προϊόντα που να προσομοιάζουν όσο το δυνατόν τα φρέσκα, οδήγησε στην ανάπτυξη εναλλακτικών μεθόδων επεξεργασίας των τροφίμων που να μην επιδρούν αρνητικά στα θρεπτικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τροφίμου. Μια τέτοια μέθοδος είναι η επεξεργασία με Υπερυψηλή Υδροστατική Πίεση (ΥΥΠ). Με εφαρμογή της συγκεκριμένης τεχνολογίας είναι δυνατή η επιλεκτική απενεργοποίηση παραγόντων αλλοίωσης των τροφίμων (Hendrickx et al., 2001). Στόχος είναι ο υπολογισμός των βέλτιστων συνθηκών επεξεργασίας στις οποίες απενεργοποιούνται οι αλλοιογόνοι παράγοντες, λαμβάνοντας υπόψη τόσο τον ελάχιστο δυνατό χρόνο επεξεργασίας όσο και τις πιο ήπιες συνθήκες επεξεργασίας (Katsaros et al., 2010). Αντικείμενο της έρευνας αυτής ήταν η μελέτη της επίδρασης της επεξεργασίας με ΥΥΠ στην απενεργοποίηση της ΠΜΕ και των γαλακτικών βακτηρίων χυμού πορτοκαλιού ποικιλίας Navel και ο προσδιορισμός των βέλτιστων συνθηκών πίεσης και θερμοκρασίας για την ταυτόχρονη απενεργοποίηση των αλλοιογόνων παραγόντων του χυμού. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Για την εκτέλεση των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε χυμός πορτοκαλιού, ποικιλίας Navel, από γραμμή χυμοποίησης βιομηχανίας (Αργος, Αργολίδας) χωρίς άλλη επεξεργασία. Μικρή ποσότητα αφέθηκε σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για περίπου 3 εβδομάδες, ώστε να αλλοιωθεί και να απομονωθούν οι μικροοργανισμοί που προκαλούν την αλλοίωση του χυμού. Οι δύο πιο ανθεκτικοί σε θερμοκρασία και πίεση μικροοργανισμοί επιλέχθηκαν, μετά από προκαταρκτικό πείραμα επεξεργασίας, για περαιτέρω κινητική μελέτη. Για τα πειράματα της ΥΠ εφαρμόστηκαν πιέσεις εύρους MPa συνδυασμένες με θερμοκρασίες εύρους C για διάφορους χρόνους επεξεργασίας. Τα πειράματα της ΥΥΠ πραγματοποιήθηκαν σε εργαστηριακής κλίμακας μονάδα ΥΥΠ, αποτελούμενη από έξι δοχεία χωρητικότητας το καθένα 45ml, με δυνατότητα ανεξάρτητου χειρισμού (Food Pressure Unit FPU 1.01, Resato International BV, Roden, Holland). Η 90

92 δραστικότητα της ΠΜΕ μετρήθηκε μέσω τιτλοδότησης των καρδοξυλικών ομάδων που δημιουργούνται κατά την υδρόλυση ενός πηκτινικού διαλύματος σε τιμή ph 7.5 και θερμοκρασία 30 C. Τα επιλεγμένα στελέχη μικροοργανισμών εμβολιάζονται σε αρχικό πληθυσμό 10 8 CFU/mL στο δείγμα του χυμού και τα ζωντανά κύτταρα που απομένουν μετά την επεξεργασία με ΥΥΠ μετρούνται με ανάπτυξη σε κατάλληλο μικροβιολογικό υπόστρωμα. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Κινητική Απενεργοποίησης της ΠΜΕ Για κάθε συνθήκη επεξεργασίας υπολογίστηκαν οι σταθερές του ρυθμού απενεργοποίησης της ΠΜΕ (Πίνακας 1). Από τις τιμές του πίνακα και το διάγραμμα της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης συναρτήσει της εφαρμοζόμενης πίεσης (Σχ. 1) είναι φανερό ότι υπήρξε συνεργιστική επίδραση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση του ένζυμου. Πίνακας 1. Σταθερές του ρυθμού απενεργοποίησης (min -1 ) της ΠΜΕ σε κάθε μελετώμενο συνδυασμό συνθηκών επεξεργασίας ΣΥΝΘΗΚΕΣ 20 C 30 C 40 C 200MPa 0,0016 0,0026 0, MPa 0,018 0,119 0, MPa 0,17 0,412 0,754 Σχήμα 1. Απεικόνιση της εξάρτησης της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης από τη θερμοκρασία και την πίεση σύμφωνα με το μαθηματικό μοντέλο Με βάση τα αποτελέσματα προσδιορίστηκε ένα συνολικό μαθηματικό μοντέλο που περιγράφει την εξάρτηση του ρυθμού απενεργοποίησης της ΠΜΕ με εφαρμογή ΥΥΠ και θερμοκρασίας (εξίσωση 1). ref a ref E a 1 1 A T T V P P k kref exp exp B P Pref R T T ref R T Εξίσωση 1 Για συνθήκες αναφοράς P ref =400MPa, T ref =303K προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο της μη γραμμικής παλινδρόμησης (SYSTAT 8.0 Statistics 1998, SPCC Inc., Chicago, III, USA) οι παράμετροι της εξίσωσης και βρέθηκαν ίσες προς k ref =0.392min -1, Ea=53KJ/mol και Va=-18mL/mol K. Κινητική Απενεργοποίησης των Γαλακτικών Βακτηρίων Ακριβώς η ίδια μεθοδολογία ακολουθήθηκε και στην περίπτωση της απενεργοποίησης των μικροοργανισμών. Για κάθε συνθήκη πίεσης και θερμοκρασίας υπολογίστηκαν οι χρόνοι υποδεκαπλασιασμού (D) για καθένα από τα γαλακτικά βακτήρια. Από τις τιμές που προέκυψαν έγινε φανερό ότι η πίεση και η θερμοκρασία επιδρούν συνεργιστικά στην απενεργοποίηση των μικροοργανισμών αυτών και ιδιαίτερα αύξηση της πίεσης επιφέρει σημαντική αύξηση του ρυθμού απενεργοποίησης. Με βάση τα αποτελέσματα προσδιορίστηκε ένα συνολικό μαθηματικό μοντέλο 91

93 που περιγράφει την εξάρτηση της απενεργοποίησης του κάθε μικροοργανισμού με εφαρμογή ΥΥΠ και θερμοκρασίας (εξίσωση 2). D D o 2,303 T T exp ZT ref Σχήμα 2. Αναγκαίες συνθήκες για απενεργοποίηση 90% ΠΜΕ και 7D μικροοργανισμών κατά την επεξεργασία με ΥΠ για 3 και 5 min exp A( P P ref 1 1 ) T T ref B ( T T 92 ref 2,303 ) R T Z p ( P P R T ref ) 1 Εξίσωση 2 Για συνθήκες αναφοράς P ref =200MPa, T ref =303K προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο της μη γραμμικής παλινδρόμησης (SYSTAT 8.0 Statistics 1998, SPCC Inc., Chicago, III, USA) οι παράμετροι της εξίσωσης για το πιο ανθεκτικό στέλεχος (LAB1) και βρέθηκαν ίσες προς Do=4.68min, Ζ Τ =32 C, Ζ P =77MPa, A=0.027MPa -1 και B=-7.3 ml/mol*k. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Για την επεξεργασία του χυμού για χρόνους 3 και 5 min οι συνθήκες που απαιτούνται για την επιθυμητή απενεργοποίηση της ΠΜΕ είναι κατά πολύ πιο έντονες από αυτές που απαιτούνται για την επιθυμητή απενεργοποίηση του πιο ανθεκτικού στελέχους μικροοργανισμών (LAB1) (Σχήμα 2). Έτσι αν κατά το σχεδιασμό της διεργασίας της παστερίωσης θέσουμε ως στόχο την απενεργοποίηση του 90% του ευαίσθητου κλάσματος της ΠΜΕ, τότε ταυτόχρονα εξασφαλίζεται και η απαραίτητη 7D μείωση του πληθυσμού των γαλακτικών βακτηρίων. Με βάση τα παραπάνω προτείνεται η επεξεργασία του πορτοκαλοχυμού Navel σε πίεση 600Mpa και θερμοκρασία 40 ο C για 3min. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Adams M.R., Moss M.O., Food Microbiology, The Royal Society of Chemistry, Cambridge UK (1999) Hendrickx M.E.G., Knorr D., Ultra High Pressure Treatments of Food, Klumer Academic-Plenum Publishers, USA (2001) Katsaros G., Tsevdou M., Panagiotou T., Taoukis P. (2010). Kinetic study of high pressure microbial and enzyme inactivation and selection of pasteurization conditions for Valencia Orange Juice. International Journal of Food Science and Technology, 45 (6), Kimball Dan A., Citrus Processing, An Aspen Publication (1999) Polydera A.C., N.G. Stoforos, P.S.Taoukis, Innov Food Sci and Emerg Techn 6 (2004). ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: Ηράκλειτος ΙΙ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου.

94 Παραγωγή νέων προιόντων από χυμό ροδιού με εφαρμογή κλασσικών βιοτεχνολογικών διεργασιών Σ. Α. Ορδούδη*, Φ. Μαντζουρίδου, Ε. Δάφτσιου, Χ. Μάλο, Ε. Χατζηδημητρίου, Ν. Νενάδης, Μ. Ζ. Τσιμίδου Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Abstract Pomegranate (Punica granatum L.), a universally established nutritional source has gained great popularity in Greece during the last five years. However, domestic sales are still low since consumption is limited to fresh fruit or juice. Development of processing technologies and new products are needed to sustain the pomegranate cultivation. Elaboration of fermented products could be an alternative although it is poorly substantiated in scientific papers. The present study is part of an integrated approach for the development of know-how in the production of pomegranate vinegar from fresh juice. Fruits from a local genotype (Pomology Institute, Imathia, Greece) were used to extract juice with fermentation potential for high ethanol yield. The latter was maximized (75.4 g L -1 ) at optimized temperature, duration and initial ph conditions (25 C, 90 h, ph = 3.3) with the aid of the Response Surface Methodology. The alcoholic product was as rich in total phenols as the starting material (1395 vs 1387 mg L -1, as gallic acid) and retained almost 70% of the DPPH scavenging activity of the raw juice (8.3 vs 11.4 mmol L -1, as Trolox) although its content in total anthocyanins was ten times lower (12.8 vs mg L -1 ). Acetic acid fermentation that took place with submerged culture on a laboratory-scale semi-continuous mode resulted in a finished product of 45.3 g L -1 acetic acid. The pomegranate vinegar, with high total phenol (1254 mg L -1 as gallic acid) and total anthocyanin contents (126 mg/l) had fair amount of antioxidants and attractive red color characteristics, which point out exclusivity, a rather important element in vinegar trade. Εισαγωγή Τα τελευταία χρόνια, η καλλιέργεια ροδιάς έχει εντατικοποιηθεί και στην Ελλάδα ως αποτέλεσμα αντίστοιχης τάσης σε διεθνή κλίμακα που στηρίζεται όχι μόνο στα ευχάριστα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του φρούτου αλλά κυρίως σε επιστημονικά τεκμηριωμένες ευεργετικές ιδιότητές του για την ανθρώπινη υγεία (1). Ωστόσο, η διάθεση του εμπορεύματος στην εγχώρια αγορά είναι περιορισμένη καθώς γίνεται μόνο σε μορφή νωπών φρούτων ή χυμού λόγω έλλειψης επαρκούς τεχνογνωσίας σε θέματα μεταποίησης. Η ανάπτυξη νέων προϊόντων με βάση το ρόδι θεωρείται πλέον αναγκαία για την ενίσχυση της βιωσιμότητας των σχετικών επιχειρήσεων. Μέχρι σήμερα στη διεθνή βιβλιογραφία υπάρχουν ελάχιστες αναφορές σχετικά με την δυνατότητα παραγωγής 93

95 ζυμωμένων προϊόντων με βάση το ρόδι (2-4). Στην παρούσα εργασία περιγράφεται για πρώτη φορά μια προσέγγιση για την ανάπτυξη τεχνογνωσίας στην παραγωγή ξιδιού από φρέσκο, μη παστεριωμένο χυμό ροδιού. Για την παραγωγή ενδιάμεσου αλκοολούχου προϊόντος με δυναμική οξοποίησης επιλέχθηκε βέλτιστος συνδυασμός θερμοκρασίας, διάρκειας της διεργασίας και αρχικής τιμής pη του χυμού έπειτα από εφαρμογή της μεθοδολογίας επιφάνειας απόκρισης. Η βιομηχανική μέθοδος οξοποίησης ημι-διαλείποντος έργου προσαρμόστηκε σε εργαστηριακή κλίμακα. Τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά τόσο του ενδιάμεσου (αλκοολούχο) όσο και του τελικού προϊόντος (ξίδι), το περιεχόμενο αυτών σε βιοδραστικές ενώσεις (πολυφαινόλες, ανθοκυανίνες) αλλά και η ικανότητά τους να δεσμεύουν τη ρίζα DPPH συζητώνται αναφορικά με τα αντίστοιχα χαρακτηριστικά της πρώτης ύλης. Το χρώμα ως κριτήριο αποδοχής του τελικού προϊόντος από τους καταναλωτές αξιολογήθηκε ως προς τυπικά προϊόντα οξοποίησης ερυθρού οίνου που κυκλοφορούν στην ελληνική αγορά. Πειραματικό μέρος Αντιδραστήρια-διαλύτες. Όλα τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας. Συγκομιδή φρούτων και προετοιμασία χυμού. Καρποί από το γενότυπο τοπικής ποικιλίας της Β. Ελλάδας (Ινστιτούτο Φυλλοβόλων Δένδρων, Ημαθία) συγκομίστηκαν στο στάδιο της ωριμότητας, σε δύο συνεχείς καλλιεργητικές περιόδους (2010/2011). Μετά τη μεταφορά τους στο Εργαστήριο αποθηκεύτηκαν στους 4 ο C. Ακολούθησε αποφλοίωση με τα χέρια, καθαρισμός και έκθλιψη των σπόρων, συλλογή του χυμού σε δοχεία ΡΕΤ (0,5 L) και αποθήκευση στους -20 ο C. Πριν την περαιτέρω επεξεργασία και ανάλυση, κάθε δείγμα φυγοκεντρήθηκε (4 ο C, 7000 rpm, 10 min). Αλκοολική ζύμωση. Το εμπορικό στέλεχος Saccharomyces cerevisiae, Fermicru VR5 (DSM Food Specialties BV, Flemingham, Ολλανδία) που χρησιμοποιήθηκε διατέθηκε ευγενικά από την εταιρία Τσάνταλης Α.Ε. (Χαλκιδική, Ελλάδα). Η ενεργοποίηση της ζύμης και η προετοιμασία των εμβολίων έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο των Naziri et al. (5). Η καλλιέργεια της ζύμης έγινε σε φιάλες Erlenmeyer υπό ημι-αναερόβιες συνθήκες και συνεχή ανάδευση. Για τη βελτιστοποίηση της απόδοσης σε αιθανόλη, εξετάστηκε με τη βοήθεια σύνθετου κεντρικού σχεδιασμού και της μεθοδολογίας επιφάνειας απόκρισης η επίδραση τριών μεταβλητών: θερμοκρασία (X 1 ) ( o C), διάρκεια της διεργασίας (X 2 ) (h) και αρχικό pη του χυμού ροδιού (X 3 ) στις συγκεντρώσεις της γλυκόζης (Υ 1, g/l), φρουκτόζης (Υ 2, g/l) και αιθανόλης (Υ 3, g/l) στο τελικό προϊόν. Το μοντέλο πρόβλεψης απαίτησε συνολικά 20 πειραματικές δοκιμές κατά τις οποίες η παρακολούθηση της διεργασίας έγινε υγροχρωματογραφικά (6). Στις βέλτιστες συνθήκες του μοντέλου πρόβλεψης έγινε εκ νέου αλκοολική ζύμωση (εις τριπλούν). Η απόδοση της διεργασίας (%) υπολογίστηκε ως εξής: [Αιθανόλη (g/l) /Ολικά σάκχαρα (g/l)] 100/0.51 (7). 94

96 Οξική Ζύμωση. Χρησιμοποιήθηκε καλλιέργεια βακτηρίων οξικού οξέος κατάλληλων για οξοποίηση του ερυθρού οίνου Ξινόμαυρο που χορηγήθηκε ευγενικά από την εταιρία ΟΙΚΟ-AGRO (Ημαθία, Ελλάδα) και διατηρήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του παραγωγού. Ακολουθήθηκε η μέθοδος του ημι-διαλείποντος έργου με καλλιέργεια σε διασπορά, σε φιάλες Erlenmeyer (50 ml, 30 ο C, 250 rpm). Όλα τα πειράματα έγιναν εις διπλούν. Η απόδοση της διεργασίας (%) υπολογίστηκε ως το πηλίκο της τελικής προς την αρχική "συνολική συγκέντρωση", δηλαδή το άθροισμα των συγκεντρώσεων σε αιθανόλη (ml/l) και οξικό οξύ (g/l) (8). Φυσικοχημικές αναλύσεις. Για τον προσδιορισμό των ολικών διαλυτών στερεών ( o Brix) και της συνολικής οξύτητας εφαρμόστηκαν πρότυπες μέθοδοι (9). Τα ολικά σάκχαρα (g γλυκόζης/l χυμού) προσδιορίσθηκαν χρωματομετρικά (10). Το περιεχόμενο σε ολικές φαινόλες (ως mg γαλλικού οξέος/l) προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Folin-Ciocalteau στα 750 nm (11). Οι ολικές ανθοκυανίνες (mg/l) προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο αποχρωματισμού με SO 2 (12). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσες τιμές τριών μετρήσεων. Η αντιοξειδωτική δράση εξετάστηκε με τη δοκιμή δέσμευσης της ρίζας DPPH (11) εις εξαπλούν και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ισοδύναμα Trolox (mm). Οι μετρήσεις των χρωματικών συντεταγμένων CIEL*, a*, b* και CIEC*, h* στο ξίδι από ρόδι και σε εμπορικά προϊόντα από ερυθρό οίνο έγιναν με βάση το πρωτόκολλο των Garcia- Parrilla et al. (13). Αποτελέσματα-Συζήτηση Ο χυμός που παραλήφθηκε από τους καρπούς του γενότυπου και στα δύο έτη συγκομιδής παρουσίασε ικανοποιητική δυναμική ως υπόστρωμα ζύμωσης με βάση την περιεκτικότητα σε ολικά στερεά (16,8 (2010) και 17,4 o Brix (2011)), το περιεχόμενο σε ολικά σάκχαρα (16,5±1,0 και 17,1±0,2 g γλυκόζης /100 ml χυμού), τις τιμές ph (3,02 και 3,30) καθώς και τη συνολική οξύτητα (3,00±0,05 και 3,75±0,03 g/l, ως κιτρικό οξύ). Για την περαιτέρω επεξεργασία και αναλύσεις, χρησιμοποιήθηκε δείγμα χυμού από τη συγκομιδή του 2011 λόγω μεγαλύτερης διαθέσιμης ποσότητας. To δείγμα αυτό βρέθηκε να είναι πλούσιο σε ολικές φαινόλες (1387±54 mg/l) αλλά και σε ολικές ανθοκυανίνες (130,1±1,4 mg/l) κάτι που αποτυπώθηκε και στα αποτελέσματα της δοκιμής δέσμευσης της DPPH (11,4±0,2 mm Trolox). Από τα πειράματα που έγιναν στη συνέχεια με στόχο τη βελτιστοποίηση της αλκοολικής ζύμωσης του φρέσκου χυμού προέκυψε ότι η διάρκεια της διεργασίας είχε την πιο ισχυρή επίδραση, πολύ σημαντικότερη από εκείνες της θερμοκρασίας και της αρχικής τιμής ph που ήταν παρόμοιου μεγέθους. Η μέγιστη προβλεπόμενη από το μοντέλο συγκέντρωση της αιθανόλης βρέθηκε ίση με 75,1 g/l σε συνθήκες 25 ο C, 90 h και ph 3,3. Η τιμή αυτή επαληθεύτηκε πειραματικά (75,4±0,06 g/l). Η απόδοση της διεργασίας βρέθηκε ίση με 86,5 % της θεωρητικής τιμής και θεωρήθηκε πολύ ικανοποιητική. Πέρα από τα τυπικά φυσικοχημικά χαρακτηριστικά, το προϊόν εξακολουθούσε να είναι πλούσιο σε ολικές φαινόλες (1395±48 mg/l) αλλά 10 φορές φτωχότερο σε ολικές ανθοκυανίνες σε σχέση με το φρέσκο χυμό (12,8±1,3 mg/l), κάτι που πιθανώς να σχετίζεται και με την αποσταθεροποιητική επίδραση της αιθανόλης. Ανάλογη επίδραση δεν παρατηρήθηκε στην ικανότητα δέσμευσης της DPPH καθώς μετά την αλκοολική ζύμωση βρέθηκε μικρότερη κατά 27% (8,3 mm of Trolox). 95

97 Στο επόμενο στάδιο έγινε εμβολιασμός του αλκοολούχου προϊόντος μετά από αραίωση ([αιθανόλη]=47,0 g/l, [οξικό οξύ]=9,0 g/l), με ενεργοποιημένα οξικά βακτήρια που καλλιεργήθηκαν σε διασπορά. Η διεργασία πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο ημι-διαλείποντος έργου κατά την οποία γινόταν περιοδική απομάκρυνση ορισμένης ποσότητας ζυμωμένου υγρού με ταυτόχρονη προσθήκη ίσης ποσότητας του υποστρώματος. Συνολικά έλαβαν χώρα πέντε κύκλοι σε διάστημα 31 ημερών (Σχήμα 1). Η φάση προσαρμογής των βακτηρίων ήταν επτά ημέρες και η απόδοση ανήλθε στο 76,7 % της θεωρητικής τιμής (1,304 g/g) μεταξύ 24 ης και 31 ης μέρας. H ζύμωση διακόπηκε όταν οι τελικές συγκεντρώσεις του οξικού οξέος και της αιθανόλης έγιναν 45,3 και 6,0 g/l, αντίστοιχα, τιμές που ικανοποιούν τις εθνικές αγορανομικές προδιαγραφές του ξιδιού από φρούτα. Η απόδοση της οξικής ζύμωσης θεωρήθηκε ικανοποιητική σε σχέση με εκείνη που αναφέρεται για την παραγωγή ξιδιού από άλλα φρούτα π.χ. μάγκο (14). Το τελικό προϊόν περιείχε σημαντική ποσότητα ολικών φαινολών (1254±37 mg/l). Διαπιστώθηκε επίσης αναγέννηση των χρωστικών καθώς το περιεχόμενο σε ολικές ανθοκυανίνες βρέθηκε παρόμοιο με εκείνο του φρέσκου χυμού (126.0±2.2 mg/l). Το ξίδι φάνηκε να έχει μέτρια δραστικότητα έναντι της DPPH (5.0 mm Trolox) ισοδύναμη περίπου με το 45% εκείνης του φρέσκου χυμού. Οι μετρήσεις των χρωματικών συντεταγμένων κατά το σύστημα CIELab έδειξαν παρόμοια λαμπρότητα (L*=85,6) αλλά πιο κορεσμένο χρώμα (C*=27,6) με κοκκινο-πορτοκαλί απόχρωση (h*~25 o ) στο ξίδι από ρόδι σε σχέση με εμπορικά προϊόντα από ερυθρό οίνο. Σχήμα 1. Κινητική της παραγωγής οξικού οξέος και κατανάλωσης αιθανόλης στη διάρκεια της οξικής ζύμωσης με τη μέθοδο ημι-διαλείποντος έργου για την παραγωγή ξιδιού από χυμό ροδιού. Συνολικά, τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν πολύ ενθαρρυντικά όσον αφορά την παραπέρα κλιμάκωση της διεργασίας για την παραγωγή ξιδιού από φρέσκο, μη παστεριωμένο χυμό ροδιού που θα φέρει υψηλή ποιότητα και ιδιαίτερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Βιβλιογραφία 1. Gil et al. (2000). J Agric Food Chem 48: ; 2. Yae et al (2007). J Korean Soc Food Sci Nutr 36: ; 3. Mena et al. (2012). Food Chem 133: ; 4. Zhuang et al. (2011). J Food Sci 76: ; 5. Naziri et al. (2011) J Agric Food Chem 59: ; 6. Blanco-Gomis et al. (1988) Chromatographia 25: ; 7. Grewal et al. (1988) Biol Waste 26:9-14; 8. Rubio-Fernández et al. (2004) Eur Food Res Technol 219: ; 9. AOAC Official method of analysis (1988) (a) no , (b) no and (c) no J, K. (16th edition), Gaithersburg, USA; 10. Dubois et al. (1956) Anal Chem 28: ; 11. Nenadis et al. (2013) LWΤ-Food Sci Technol, 54: ; 12. Ribéreau-Gayon et al. (2000) (ed) Handbook of Enology Vol. 2, John Wiley & Sons Ltd, Chichester; 13. García-Parrilla et al. (1998) J Agric Food Chem 46: ; 14. Ameyapoh et al., (2010) Pakistan J Biol Sci, 13:

98 Yeast β-glucan recovery from wine by-products: a functional and valuable ingredient in food production processing V. Varelas 1 *, M. Liouni 1, E. Nerantzis 2 1 Laboratory of Industrial Chemistry, Dept. of Chemistry, University of Athens * Τel: , vavarelas@chem.uoa.gr 2 Laboratory of Biotechnology & Industrial Fermentation, Dept. of Enology, TEI of Athens Beta glucans is a well-known widespread group of polysaccharides which are found in microorganisms, mushrooms and plants. Recent years, there is an increasing interest from the global food and pharmaceutical research community for the industrial extraction, purification and production of β-glucans due to their proved significant beneficial role to various human and animal diseases and disorders as they enforce their immunity, lowering cholesterol lever, activating as antitumor and anti-high blood pressure agents, prevent from coronary heart disease etc. Beta glucans can be incorporated in various food, beverage and pharmaceutical products. Yeast β- glucans are located in the cell wall of yeasts such as Saccharomyces cerevisiae. The utilization of the mentioned product through the treatment of waste material of wine and beverage industry which at present is not exploited and possibly harmful for the environment, can give high added value products. The process investigated has dual scope, to offer the winery industry new products as well as to apply a method for the treatment of a waste helping the environment. Keywords: β-glucans, yeast cell wall, Saccharomyces cerevisiae, wine by-products. 1. Εισαγωγή Οι διαδικασίες παραγωγής οίνου και μπύρας οδηγούν στο σχηματισμό ενός σημαντικού όγκου υποπροϊόντων στις δεξαμενές ζύμωσης τα οποία εν συντομία καλούνται λάσπες. Τα υποπροϊόντα αυτά περιέχουν σημαντικές ποσότητες νεκρών κυττάρων ζυμών. Τα κυτταρικά τοιχώματα των ζυμών περιέχουν β-γλυκάνες οι οποίες με τις κατάλληλες βιοτεχνολογικές μεθόδους μπορούν να ανακτηθούν και να παραχθούν προϊόντα προσιθέμενης αξίας όπως είναι οι β-γλυκάνες. Αντί αυτού, η συνηθισμένη πρακτική μέχρι σήμερα όμως είναι η απόρριψη και ταφή τους προκαλώντας αρνητικές περιβαλλοντικές επιπτώσεις [1, 2]. Λόγω του αυξανόμενου ενδιαφέροντος για τη βιομηχανική παραγωγή β-γλυκανών και τη χρήσιμοποίηση τους στη βιομηχανία τροφίμων και φαρμάκων, μιας και μπορούν να ενσωματωθούν σε τρόφιμα, ποτά και φαρμακευτικά σκευάσματα, η ανάπτυξη καινοτόμων μεθοδολογιών για την ανάκτηση των β-γλυκανών από πηγές όπως τα υποπροϊόντα οινοποίας και ζυθοποίας, αποτελεί μια σύγχρονη πρόκληση [3-5]. 97

99 2. Η δομή των β-γλυκανων στις ζύμες Οι γλυκάνες των ζυμών συνιστούν δομικά ποικίλα πολυμερή της D-γλυκόζης. Τα πολυμερή αυτά ανάλογα με τα σχηματιζόμενα ανομερή, διακρίνονται σε α-d-γλυκάνες, β-d-γλυκάνες και α,β-dγλυκάνες [6]. Οι β-d-γλυκάνες είναι ένα ευρέως διαδεδομένο μόριο του κυτταρικού τοιχώματος πολλών οργανισμών: βακτηρίων, μυκήτων, μανιταριών, αλγών και αποτελούν ένα από τα βασικότερα συσταστικά του κυτταρικού τοιχώματος των ζυμών (περίπου 60% του ξηρού βάρους του κυτταρικού τοιχώματος) [7, 8]. Το κυτταρικό τοίχωμα αντιπροσωπεύει περισσότερο από 30% του ξηρού βάρου του κυττάρου [9]. Το κυτταρικό τοίζωμα, ειδικά των ζυμών αρτοποιίας και ζυθοποιίας όπως οι Saccharomyces cerevisiae, αποτελούν μια σημαντική πηγή β-γλυκανών. Στο κυτταρικό τοίχωμα απαντώνται δύο διαφορετικοί τύποι β-d-γλυκανών: η β-1,3-d-γλυκάνη η οποία βρίσκεται σε περίσσεια (85%), είναι η κύρια β-γλυκάνη και αντιπροσωπεύει περισσότερο από 50-55% του κυτταρικού τοιχώματος και η β-1,6-d-γλυκάνη η οποία βρίσκεται σε μικρότερα ποσοστά (15%) και αντιπροσωπεύει το 5-10 % του κυτταρικού τοιχώματος [5-10]. 3. Μέθοδοι απομόνωσης και καθαρισμού β-γλυκανών από ζύμες Οι πρώτες μέθοδοι για την απομόνωσης των β-γλυκανών στηρίζονταν στην υδρόλυση με τη χρήση αλκαλίων και οξέων και αργότερα με την κυτταρική οξείδωση με τη χρήση υποχλωριώδους νατρίου. Οι μέθοδοι αυτοί όμως ήταν «βίαιες» με αποτέλεσμα τον κατακερματισμό της γλυκοζιτικής αλυσίδας, τη διάχυση των β-γλυκανών στο υπερκείμενο κατά τη φάση καθαρισμού, με αποτέλεσμα τη μειωμένη παραγωγή. Τα τελευταία χρόνια η ανάπτυξη βιοτεχνολογικών μέθόδων απομόνωσης των β-γλυκανών με τη χρήση ενζύμων ή/και υπερήχων, προσφέρουν νέες και πολλά υποσχόμενες δυνατότητες. Οι μέχρι σήμερα διαθέσιμες τεχνικές για την απομόνωση είναι: ένζυμα, ομογενοποίηση, αλκάλεα, οξέα και υπέρηχοι και για τον καθαρισμό: φυγοκέντριση, DEAE ionexchange chromatography και ConA chromatography [13-22]. 4. Παραγωγή β-γλυκανών Η ποσότητα της ξηρής βιομάζας που απομένει από τις υγρές οινολάσπες οι οποίες καθιζάνουν κατά τη διαδικασία της λευκής και ερυθρής οινοποίησης, ανέρχεται σε kg ανά 1000 L ζυμώμενου γλεύκους. Από την ανωτέρω ποσότητα το 20-30% περίπου καταλαμβάνει το ξηρό βάρος των κυτταρικών τοιχωμάτων ενώ το 50% περίπου είναι η ποσότητα των β-γλυκανών που μπορούμε να παραλάβουμε από τα κυτταρικά τοιχώματα των ζυμών (δηλ από μία δεξαμενή χωρητικότητος ενός 1000 L μπορούμε να πάρουμε περίπου kg β-γλυκανών (~ %) [1, 12]. Ενδεικτικά αναφέρουμε πως η συνολική παραγωγή 1 οίνου στην Ελλάδα είναι της τάξεως των tn. 1 ΠΟΠ: Ονομασία Προστατευόμενης Προέλευσης. Η συνολική παραγωγή οίνου στην Ελλάδα είναι της τάξεως των tn (πηγή: ICAP, κλαδική μελέτη 2010) 98

100 5. Εφαρμογές στη βιομηχανία τροφίμων και φαρμάκων Οι β-1,3-d-γλυκάνες και οι β-1,6-d-γλυκάνες ανήκουν στους biological response modifiers (BRMs) λόγω της ικανότητάς τους να ενισχύουν και να αναζωογωνούν το ανθρώπινο ανοσοποιητικό σύστημα [7]. Τα τελευταία 50 χρόνια περισσότερες από 2000 μελέτες έχουν δημοσιευτεί καταδεικνύοντας τον ευεργετικό ρόλο των β-γλυκανών στη πρόληψη και θεραπεία ενός τεράστιου αριθμού παθήσεων του ανθρώπου αλλά και των ζώων [8]. Οι β-γλυκάνες μπορούν με την κατάλληλη επεξεργασία να ενσωματωτούν ως συστατικά σε τρόφιμα και φάρμακα μιας και σύμφωνα με τον Us Food and Drug Administration και την European Food Safety Authority αναγνωρίζονται ως ασφαλής για την υγεία των ανθρώπων και των ζώων [5-8]. 6. Συμπεράσματα και προοπτικές Οι β-γλυκάνες των ζυμών είναι ένα μόριο με ένα εξαιρετικά μεγάλο εύρος εφαρμογών στη βιομηχανία τροφίμων και φαρμάκων λόγω της σημαντικής θετικής τους επίδρασης στην υγεία του ανθρώπου και των ζώων. Περαιτέρω έρευνα για ανάπτυξη μεθόδων απομόνωσης οι οποίες καθορίζουν την αύξηση της παραγωγής, τον καθαρισμό, την ποιότητα, το μοριακό βάρός, τις ρεολογικές και φυσικοχημικές ιδιότητες των β-γλυκάνων, απαιτείται. Η ανάκτηση των β-γλυκάνων από υποπροϊόντα οινοποιίας και ζυθοποίας μπορεί να προσφέρει μια καινοτόμο λύση για την παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας και την αύξηση του ετήσιου εισοδήματος των μονάδων οινοποιΐας και ζυθοποιΐας. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Nerantzis, E. T. & Tataridis, P. (2006). Integrated Enology-Utilization of winery by-products into high added value products. e-journal of Science and Technology, 1(3), pp [2] Bertran, E., Sort, X., Soliva, M. & Trillas, I. (2004). Composting winery waste: sludges and grape stalks. Biosource Technology, 95, pp [3] Bisson, L.F., A.L.Waterhouse, S.E. Ebeler, M.A. Walker & J.T. Lapsley. (2002). The present and future of the international wine industry. Nature, 418, pp [4] Shrikhande, A.J. (2000). Wine by-products with health effects. Food Research International, 33, pp [5] Ahmad, A., Anjum, F. M., Zahoor, T., Nawaz, H. & Dilshad, S. M. R. (2012). Beta Glucan: A Valuable Functional Ingredient in Foods. Critical Reviews in Food Science, 52, pp [6] Synytsya, A. & Novák, M. (2013). Structural diversity of fungal glucans. Carbohydrate Polymers, 92, pp [7] Novak, M. & Vetvicka, V. (2008). Beta-glucans, history, and the present: Immunomodulatory aspects and mechanisms of action. Journal of Immunotoxicology, 5,pp [8] Kwiatkowski, S. & Kwiatkofski, S.E. Yeast (Saccharomyces cerevisiae) Glucan Polysaccharides-Occurrence, Separation and Application in Food and Health Industries. The complex world of polysaccharides, D.S. Karunaratne, ed., In Tech, 2012, pp

101 [9] Aguilar-Uscanga, B. and François J.M. (2003). A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode cultivation. Letters in Applied Microbiology, 37, pp [10] Klis, F.M. (1994). Review: Cell Wall Assembly in Yeast. Yeast, 10, pp [11] Michels, C. A. Genetic Techniques for Biological Research, John Wiley & Sons Ltd, 2002, Chapter 3, pp [12] Lesage, G. & Bussey, H. (2006). Cell Wall Assembly in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 70(2), pp [13] Müller, A., Ensley, H., Pretus, H., McNamee, R., Jones, E., McLaughlin, E., Chandley, W., Browder, W., Lowman, D., & Williams, D. (1997). The application of various protic acids in the extraction of (1,3)-β-D-glucan from Saccharomyces cerevisiae. Carbohydrate Research, 299, pp [14] Lee, J.N., Lee, D.Y., Ji, I.H., Kim, G.E. & Kim, H.N. (2001). Purification of Soluble β-glucan with Immune-enchancing Activity from the Cell Wall of Yeast. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 65(4), pp [15] Ohno, N., Miura, T., Miura, N. N., Adachi, Y. & Yadomae, T. (2001). Structure and biological activities of hypochlorite oxidized zymosan. Carbohydrate Polymers, 44, pp [16] Yajun, W., Shanjing, Y. & Tianxing, W. (2003). Combination of induced autolysis and sodium hypochlorite oxidation for the production of Saccharomyces cerevisiae (1, 3)-β-D-glucan. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 19, pp [17] Freimund, S., Sauter, M., Käppeli, O. & Dutler, H. (2003). A new non-degrading isolation process for 1,3-β-D-glucan of high purity from baker s yeast Saccharomyces cerevisiae. Carbohydrate Polymers, 54, pp [18] Kim, K. S. & Yun, S. (2006). Production of soluble β-glucan from the cell wall of Saccharomyces cerevisiae. Enzyme and Microbial Technology, 39, pp [19] Liou, X.L., Wang, Q., Cui, S.W. & Liou, H.Z. (2008). A new isolation method of β-d-glucans from spent yeast Saccharomyces cerevisiae. Food Hydrocolloids, 22, pp [20] Shokri, H., Asadi, F. & Khosravi, A.R. (2008). Isolation of β-glucan from the cell wall of Saccharomyces cerevisiae. Naturals Product Research, 22(5), pp [21] Magnani, M., Calliari, C. M., De Macedo, F. C., Mori, M. P., De Syllos Cólus, I. M. & Castro- Gomez, R. J. (2009). Optimized methodology for extraction of (1,3)(1,6)-β-glucan from Saccharomyces cerevisiae and in vitro evaluation of the cytotoxicity and genotoxicity of the corresponding carboxymethyl derivative. Carbohydrate Polymers, 78, pp [22] Javmen, A., Grigiškis, S. & Gliebute, R. (2012). β-glucan extraction from Saccharomyces cerevisiae yeast using Actinomyces rutgersensis 88 yeast lysing enzymatic complex. Biologija, 58(2), pp

102 Μελέτη Επεξεργασίας Χυμού Ιπποφαούς με Υπερυψηλή Πίεση Αλεξανδράκης Ζ. 1, Κυριακοπούλου Κ. 2, Κατσαρός Γ. 1, Κροκίδα Μ. 2, Ταούκης Π. 1 1 Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ 2 Εργαστήριο Σχεδιασμού και ανάλυσης Διεργασιών, Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο χυμός από ιπποφαές αποτελεί ένα ρόφημα υψηλής θρεπτικής αξίας μιας και είναι εξαιρετική πηγή βιταμινών, κυρίως βιταμίνης C (400mg/100ml) και καροτενίων. Η παρουσία ενζύμων και μικροοργανισμών όμως στο χυμό τον καθιστούν εξαιρετικά ευαλλοίωτο, με αποτέλεσμα να είναι αναγκαία η επεξεργασία του προκειμένου να αυξηθεί ο χρόνος ζωής του ώστε να μπορεί να διατεθεί εμπορικά στους καταναλωτές. Η επεξεργασία με Υπερυψηλή Πίεση (ΥΠ) σε συνδυασμό με ήπιες θερμοκρασίες μπορεί να εφαρμοστεί για την ψυχρή παστερίωση του χυμού. Σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης της ΥΠ ( MPa) και θερμοκρασίας (25-35 C) στην κινητική απενεργοποίησης της πηκτινομεθυλεστεράσης (ΠΜΕ) χυμού ιπποφαούς, της οποίας η δράση επηρεάζει την ποιότητα (διαχωρισμός φάσεων) των τελικών προϊόντων, καθώς και στη μεταβολή της συνολικής αντιοξειδωτικής δράσης του χυμού. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η επεξεργασία με ΥΠ στις συγκεκριμένες συνθήκες δεν επηρεάζει σημαντικά τη συνολική αντιοξειδωτική δράση του χυμού. Πιο έντονες συνθήκες επεξεργασίας (μεγαλύτερη πίεση, θερμοκρασία ή/και χρόνος επεξεργασίας) συμβάλλουν σε μειωμένη αντιοξειδωτική δράση. Για την ΠΜΕ, η απενεργοποίησή της ακολούθησε κινητική α τάξης και υπολογίστηκαν οι σταθερές του ρυθμού απενεργοποίησης σε κάθε συνθήκη επεξεργασίας. Οι σταθερές του ρυθμού απενεργοποίησης της ΠΜΕ εκφράστηκαν συνολικά από μια εξίσωση, ως συνάρτηση της πίεσης και της θερμοκρασίας επεξεργασίας, μέσω της οποίας είναι δυνατός ο υπολογισμός του απαιτούμενου χρόνου επεξεργασίας με ΥΠ. Ως βέλτιστες συνθήκες επεξεργασίας προτείνονται τα 600MPa, 35 C για 5min, στις οποίες επιτυγχάνεται 90% απενεργοποίηση της ΠΜΕ με ταυτόχρονη διατήρηση της αντιοξειδωτικής δράσης κατά περίπου 90% της αρχικής τιμής ανεπεξέργαστου δείγματος. High pressure processing of sea buckthorn juice Sea buckthorn juice, derived from the sea buckthorn berries, provides a nutritious beverage, high in suspended solids extremely rich in vitamin C (400mg/100ml) and carotenes. Due to its perishability (mainly development of off flavors due to enzymatic activity), sea buckthorn juice has to be processed in order to extend its shelf-life. High Hydrostatic Pressure (HHP) can selectively inactivate enzymes such as Pectinmethylesterase (PME), while maintaining the nutritional characteristics and antioxidant activity of the products. The objectives of this work were to study 101

103 and model the effect of HHP processing ( MPa) and temperature (25-35 C) on the inactivation kinetics of PME from sea buckthorn and on its total antioxidant activity. The results indicated that HHP processing did not significantly affect the initial total antioxidant activity of the juice. More intense process conditions (higher temperature and pressure combined with longer treatment) resulted in decreased total antioxidant activity. PME enzyme inactivation followed first order kinetics. Inactivation below measuring limit after adequate processing time at all tested conditions was observed. The PME inactivation rate constants were expressed as functions of the temperature and pressure process conditions. These functions allow the determination of the pressure/temperature conditions that achieve the target enzyme inactivation at a selected processing time. The optimum HHP process conditions may be selected (600MPa, 35 C for 5min) based on the higher antioxidant activity retention and the simultaneous PME inactivation. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα τελευταία χρόνια υπάρχει αυξημένο ενδιαφέρον για κατανάλωση φυτικών τροφίμων πλούσιων σε αντιοξειδωτικά. Ανάμεσα σε αυτά ανήκει και το ιπποφαές το οποίο έχει γίνει ιδιαίτερα δημοφιλές τα τελευταία χρόνια εξαιτίας της υψηλής του διατροφικής αξίας και της εικόνας του ότι προάγει την υγεία του ανθρώπου (Guliyev et al., 2004). Ο πολύ μικρός χρόνος ζωής του όμως εξαιτίας της ευαισθησίας του στην υφή και το άρωμα κατά την αποθήκευση και διακίνηση, δημιουργεί την ανάγκη επεξεργασίας του. Με την επεξεργασία του στοχεύουμε: (1) αύξηση της μικροβιολογικής σταθερότητας με απενεργοποίηση μικροοργανισμών, (2) έλεγχο των ενδογενών ενζύμων (κυρίως πηκτινομεθυλεστεράση, ΠΜΕ) των οποίων η δράση οδηγεί σε ποιοτική υποβάθμιση των τροφίμων (υποβάθμιση υφής) και (3) διατήρηση των βιοδραστικών συστατικών (αντιοξειδωτικά). Η παραδοσιακή μέθοδος απενεργοποίησης των αλλοιογόνων αυτών παραγόντων είναι η θερμική παστερίωση, με αρνητική όμως επίπτωση στα θρεπτικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με την αυξανόμενη απαίτηση των καταναλωτών για προϊόντα που να προσομοιάζουν όσο το δυνατόν τα φρέσκα, οδήγησε στην ανάπτυξη εναλλακτικών μεθόδων επεξεργασίας των τροφίμων που να μην επιδρούν αρνητικά στα θρεπτικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τροφίμου. Μια τέτοια μέθοδος είναι και η επεξεργασία με Υπερυψηλή Πίεση (ΥΠ), η συστηματική μελέτη της οποίας όμως είναι αναγκαία για την επιλογή των βέλτιστων συνθηκών επεξεργασίας (Katsaros et al., 2010). Αντικείμενο της έρευνας αυτής ήταν η μελέτη της επίδρασης της επεξεργασίας με ΥΠ στην απενεργοποίηση της ΠΜΕ χυμού ιπποφαούς και η μελέτη της επίδρασης στην αντιοξειδωτική δραστικότητα του χυμού, με απώτερο σκοπό τον προσδιορισμό των βέλτιστων συνθηκών πίεσης και θερμοκρασίας ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Καρποί ιπποφαούς (Hippophae rhamnoides L. ssp. rhamnoides) συλλέχθηκαν κατά το τελευταίο στάδιο ωριμότητάς τους από καλλιέργειες στη Σιβηρία. Οι καρποί χυμοποιήθηκαν (ph 2.8, 9.5 o Brix) χρησιμοποιώντας κατάλληλο οικιακό εξοπλισμό (αποχυμωτή). Για τα πειράματα της ΥΠ 102

104 εφαρμόστηκαν πιέσεις εύρους MPa συνδυασμένες με θερμοκρασίες εύρους C για διάφορους χρόνους επεξεργασίας. Τα πειράματα της ΥΠ πραγματοποιήθηκαν σε μια εργαστηριακής κλίμακας μονάδα ΥΠ, αποτελούμενη από έξι δοχεία χωρητικότητας το καθένα 45ml, με δυνατότητα ανεξάρτητου χειρισμού (Food Pressure Unit FPU 1.01, Resato International BV, Roden, Holland). Η δραστικότητα της ΠΜΕ μετρήθηκε μέσω τιτλοδότησης των καρδοξυλικών ομάδων που δημιουργούνται κατά την υδρόλυση ενός πηκτινικού διαλύματος σε τιμή ph 7.5 και θερμοκρασία 30 C. Η αντιοξειδωτική δραστικότητα των δειγμάτων εκφράστηκε μέσω του προσδιορισμού της δραστικής συγκέντρωσης χυμού (EC 50 ) που απαιτείται για να μειώσει την απορρόφηση του DPPH κατά 50% (Antolovich et al. 2002). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Κινητική Απενεργοποίησης της ΠΜΕ Για κάθε συνθήκη επεξεργασίας υπολογίστηκαν οι σταθερές του ρυθμού απενεργοποίησης της ΠΜΕ (Πίνακας 1). Από τις τιμές του πίνακα και το διάγραμμα της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης συναρτήσει της εφαρμοζόμενης πίεσης (Σχ. 1) συμπεραίνεται συνεργιστική επίδραση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση του ένζυμου. Πίνακας 1. Σταθερές του ρυθμού απενεργοποίησης (min -1 ) της ΠΜΕ σε κάθε μελετώμενο συνδυασμό συνθηκών επεξεργασίας T ( o C) P (MPa) k (min -1 ) t 1/2 (min) k (min -1 ) t 1/2 (min) k (min -1 ) t 1/2 (min) E a (kj/mol) ± ,a ± ,a ± ,a ± ± ,b ± ,b ± ,b ± ± ,c ± ,c ± ,c ±35 V a (ml/mol) -9.8± ± ±3.3 Με βάση τα αποτελέσματα προσδιορίστηκε ένα συνολικό μαθηματικό μοντέλο που περιγράφει την εξάρτηση του ρυθμού απενεργοποίησης της ΠΜΕ με εφαρμογή ΥΠ και θερμοκρασίας (εξίσωση 1). Σχήμα 1. Απεικόνιση της εξάρτησης της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης από τη θερμοκρασία και την πίεση 103

105 ref a ref E a 1 1 A T T V P P k kref exp exp B P Pref R T T ref R T Εξίσωση 1 Για συνθήκες αναφοράς P ref =600MPa, T ref =308K προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο της μη γραμμικής παλινδρόμησης (SYSTAT 8.0 Statistics 1998, SPCC Inc., Chicago, III, USA) οι παράμετροι της εξίσωσης και βρέθηκαν ίσες προς k ref =0.055min -1, Ea=110KJ/mol και Va=-7mL/mol K, Α=-0,016 ml/molk και Β=0,0012 MPa -1. Μελέτη επίδρασης ΥΠ στην αντιοξειδωτική δραστικότητα Όσον αφορά την επίδραση της ΥΠ στην αντιοξειδωτική δράση του χυμού ιπποφαούς, τα αποτελέσματα έδειξαν να μην επηρεάζεται σημαντικά σε ήπιες συνθήκες επεξεργασίας όπως χαμηλές θερμοκρασίες (< 35 o C) σε συνδυασμό με πιέσεις από Mpa (Σχήμα 2). Εντονότερες συνθήκες επεξεργασίας μειώνουν σηματικά την αντιοξειδωτική δράση του χυμού. Σχήμα 2. Επίδραση της πίεσης στη μεταβολή της αντιοξειδωτική δράσης χυμού ιπποφαούς στους 35ºC ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Με βάση τα αποτελέσματα της μελέτης συνολικά επεξεργασία χυμού ιπποφαούς με ΥΠ στα 600 MPa/35 o C για 5 min συμβάλλει στην παραγωγή προϊόντος απαλλαγμένου κατά 90% από την ΠΜΕ και χωρίς σημαντική υποβάθμιση της αντιοξειδωτικής του δράσης. Οι συνθήκες αυτές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εμπορική παραγωγή χυμού ιπποφαούς επεξεργασμένου με ΥΠ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Antolovich M, Prenzler P, Patsalides E, McDonald S, Robards K Methods for testing antioxidant activity. Royal Soc. Chem. 127, Guliyev V.B., Gul M., Yildirim A Hippophae rhamnoides L.: Chromatographic methods to determine chemical composition, use in traditional medicine and pharmacological effects Journal of Chromatography B, 812 (1 2), pp Katsaros G., Tsevdou M., Panagiotou T., Taoukis P. (2010). Kinetic study of high pressure microbial and enzyme inactivation and selection of pasteurization conditions for Valencia Orange Juice. International Journal of Food Science and Technology, 45 (6), ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: ΘΑΛΗΣ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου. 104

106 Συνεδρία Β4 105

107 106

108 Ανάπτυξη και επικύρωση επίσημης μεθόδου για τον προσδιορισμό βαρέων μετάλλων και ιχνοστοιχείων σε κονσερβοποιημένη πάστα τομάτας με την τεχνική της Πολυστοιχειακής Φασματομετρίας Ατομικής Απορρόφησης με ηλεκτροθερμαινόμενο φούρνο γραφίτη Κ.Γ. Ραπτοπούλου 1, Ι.Ν. Πασιάς 2, Ν.Σ. Θωμαΐδης 2 και Χ. Προεστός 1 * 1 Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστημιούπολη Ζωγράφου, Αθήνα, Ελλάδα. 2 Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστημιούπολη Ζωγράφου, Αθήνα, Ελλάδα * harpro@chem.uoa.gr Abstract Four different methods for the simultaneous determination of Cd-Pb, As-Cu, Cr-Ni and Fe-Mn in canned tomato paste samples by ETAAS were developed and validated. The validation procedure was conducted according to the terms of the European regulation for the official control of contaminants in foods. The validated methods were applied for the determination of these metals and metalloids in 13 different tomato paste samples. Furthermore, a new quality indicator was evaluated in order to provide information about tomato paste quality and the appropriate storage time of an opened canned tomato paste. Finally, a migration test was accomplished based on the calculation of mass balance and the comparison of the elemental content in canned tomato paste samples and in aseptic paper pack. Keywords: Tomato paste samples; quality indicator; metal migration; method validation; uncertainty calculation. 1. Εισαγωγή Η ολοένα και αυξανόμενη παρουσία μετάλλων και μεταλλοειδών στο περιβάλλον, ως φυσικά του συστατικά αλλά και λόγω της ανθρώπινης δραστηριότητας, έχει σαν συνέπεια την μεταφορά τους στα φυτά και ως επέκταση και στη τροφική αλυσίδα. Το γεγονός ότι κάποια από αυτά, όπως το κάδμιο και ο μόλυβδος, έχουν αποδειχθεί ιδιαιτέρως τοξικά για τον άνθρωπο ακόμη και σε μικρές συγκεντρώσεις, έχει αυξήσει το ενδιαφέρον για τη δημόσια υγεία. Σε προηγούμενη μελέτη του Πανεπιστημίου Αθηνών, έγινε προσδιορισμός της περιεκτικότητας κασσιτέρου σε κονσέρβα τομάτας ώστε να μελετηθεί η μετανάστευση από τη συσκευασία [1]. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη κι επικύρωση μιας επίσημης μεθόδου για τον προσδιορισμό και άλλων μετάλλων και μεταλλοειδών, τα οποία μπορεί να μεταναστεύουν από το υλικό συσκευασίας, σε σχέση με την πάροδο του χρόνου συντήρησης του τροφίμου υπό συνθήκες ψύξης. Επιπλέον, μελετήθηκε η συμπεριφορά των ίδιων μετάλλων και σε χάρτινη συσκευασία τοματόπαστας για λόγους σύγκρισης με τη μεταλλική. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν δοκιμές για την επιβεβαίωση της μετανάστευσης των μετάλλων. 107

109 2. Υλικά και μέθοδοι Τα δείγματα ομογενοποιούνται ώστε να προκύψει αντιπροσωπευτικό δείγμα και ζυγίζονται 0,5 g από κάθε δείγμα σε δοχεία Τeflon. Στη συνέχεια προστίθενται 5 ml υπερκάθαρου HNO 3 65% (w/w) και 1 ml υπερκάθαρου H 2 O 2 35% (w/w) και ακολουθεί χώνευση στον φούρνο μικροκυμάτων MARS X-Press (CEM Corporation, NC,USA) για 20 λεπτά. Μετά τη χώνευση ακολουθεί αραίωση των δειγμάτων με υπερκάθαρο νερό, σε τελικό όγκο 20 ml. Ακολουθεί προσδιορισμός των μετάλλων με το πολυστοιχειακό φασματόμετρο ατομικής απορρόφησης με φούρνο γραφίτη Perkin Elmer, SIMAA 6000, μετά από εφαρμογή κατάλληλων θερμοκρασιακών προγραμμάτων και τη χρήση των προβλεπόμενων χημικών τροποποιητών. 3. Αποτελέσματα 3.1 Επικύρωση μεθόδων Η επικύρωση πραγματοποιήθηκε με βάση την Ευρωπαϊκή οδηγία 333/2007, που αφορά την εφαρμογή επίσημων μεθόδων δειγματοληψίας και ανάλυσης διαφόρων συστατικών σε τρόφιμα [2]. Για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκαν καμπύλες αναφοράς προσαρμοσμένες στη μήτρα του δείγματος και λήφθηκαν ικανοποιητικές συσχετίσεις μεταξύ της μετρούμενης παραμέτρου και της συγκέντρωσης του δείγματος (R 2 >0,998) για όλους του προσδιοριζόμενους αναλύτες. Τα όρια ανίχνευσης της μεθόδου (ng g -1 ) υπολογίστηκαν από την καμπύλη προσαρμοσμένη στη μήτρα του δείγματος και βρέθηκαν ίσα με 2,0, 9,2, 33,6, 60,0, 20,4, 31,6, 64,0 και 17,2 για τον προσδιορισμό Cd, Pb, As, Cu, Cr, Ni, Fe και Mn, αντίστοιχα. Οι συγκεκριμένες τιμές είναι σύμφωνες με τις θεωρητικά προβλεπόμενες στην Ευρωπαϊκή οδηγία 333/2007 [2] και αφού ληφθούν υπόψη οι οριακές τιμές όπως προβλέπονται στην Ευρωπαϊκή οδηγία 1881/2006 [3]. Η πιστότητα της μεθόδου ελέγχθηκε με υπολογισμό των τιμών της επί τοις εκατό σχετικής τυπικής απόκλισης (%RSD) τόσο υπό συνθήκες επαναληψιμότητας όσο και αναπαραγωγιμότητας μετά από πολλαπλό εμβολιασμό (n=6) των δειγμάτων τοματόπαστας με γνωστή περιεκτικότητα αναλύτη σε τρία διαφορετικά επίπεδα. Οι τιμές %RSD βρέθηκαν μικρότερες από 23%, 16%, 16%, 3,7%, 16%, 19%, 11% και 9,3% για το Cd, τον Pb, το Cr, το Ni, το Cu, το As, το Fe και το Mn, αντίστοιχα. Ο υπολογισμός της ορθότητας της μεθόδου πραγματοποιήθηκε με μέτρηση δύο πιστοποιημένων υλικών αναφοράς (ERM-BC084a, τοματόπαστα και NIST 1573a, φύλλα τομάτας), καθώς και με πειράματα ανακτήσεων, μετά από εμβολιασμό των δειγμάτων τοματόπαστας με γνωστή συγκέντρωση αναλύτη. Οι επί τοις εκατό ανακτήσεις κυμάνθηκαν από 83 έως 119%. Ο υπολογισμός της αβεβαιότητας της μεθόδου βασίστηκε στον οδηγό της Eurachem [4]. Οι τιμές βρέθηκαν μικρότερες από τις θεωρητικά προβλεπόμενες [2] και για το λόγο αυτό οι μέθοδοι θεωρήθηκαν κατάλληλες για το σκοπό εφαρμογής τους. 3.2 Αποτελέσματα-Συζήτηση Στον πίνακα 1 παρουσιάζονται αναλυτικά τα αποτελέσματα προσδιορισμού των διαφόρων μετάλλων και μεταλλοειδών σε διαφορετικά δείγματα τοματόπαστας από την ελληνική αγορά μετά 108

110 από φύλαξη των δειγμάτων έως και 41 ημέρες από τη στιγμή του ανοίγματος των συσκευασιών στο ψυγείο. Από τα αποτελέσματα γίνεται φανερό πως η περιεκτικότητα του καδμίου είναι υψηλότερη από την οριακή τιμή των 50 ng g -1 [3], τιμή όμως που αφορά την περιεκτικότητα καδμίου στο φρούτο της τομάτας και όχι σε κονσερβοποιημένο προϊόν. Από την άλλη, τα υπόλοιπα μέταλλα εμφάνισαν περιεκτικότητες εντός των επιτρεπόμενων τιμών, όπως αυτές καθορίζονται από τις διάφορες οδηγίες είτε της Ευρωπαϊκής Ένωσης, είτε διαφόρων οργανισμών [3,5,6]. Αρσενικό δεν ανιχνεύτηκε σε κανένα δείγμα. Επίσης, τα αποτελέσματα απέδειξαν ότι οι μεταλλικές συσκευασίες είχαν γενικά υψηλότερες περιεκτικότητες μετάλλων από ότι οι αντίστοιχες χάρτινες και ότι η περιεκτικότητα του σιδήρου είχε μια γραμμική αυξητική τάση με τις ημέρες φύλαξης. Πίνακας 1. Αποτελέσματα προσδιορισμού των διαφόρων αναλυτών σε δείγματα τοματόπαστας και σε διαφορετικές ημέρες φύλαξης. Ημέρες φύλαξης στους 4 o C Αναλύτης (μg g -1 ) Cd 0,061±0,032 0,058±0,029 0,061±0,026 0,066±0,029 0,067±0,031 Pb 0,047±0,043 0,052±0,044 0,047±0,014 0,066±0,016 0,038±0,016 As <0,034 <0,034 <0,034 <0,034 <0,034 Cu 4,12±0,66 4,89±0,88 3,64±0,70 4,26±0,93 4,23±0,97 Cr 0,30±0,16 0,26±0,15 0,33±0,20 0,23±0,13 0,30±0,18 Ni 0,34±0,30 0,42±0,30 0,45±0,28 0,43±0,29 0,49±0,29 Fe 31±14 47±9,0 61±17 117±30 147±40 Mn 10,7±2,4 13,8±3,9 7,7±4,5 10,6±2,1 8,7±2,1 Για το λόγο αυτό, προτάθηκε ένας νέος ποιοτικός δείκτης που συσχετίζει την περιεκτικότητα σιδήρου με την περιεκτικότητα των υπόλοιπων μετάλλων και είναι ικανός να προβλέπει τον ακριβή χρόνο φύλαξης μιας ανοιγμένης συσκευασίας στο ψυγείο. Ο ποιοιτικός αυτός δείκτης (k 1 ή k 2 ) μπορεί να καθοριστεί από τις εξισώσεις 1 και 2, όπου [X], η περιεκτικότητα του X αναλύτη σε μg kg -1 και διαγραμματικά παρουσιάζεται στο σχήμα 1. k 1 [ Fe] (1) [ Cd] [ Pb] [ Ni] [ Cr] [ Cu] [ Fe] [ Mn] k 2 [ Fe] (2) [ Fe] [ Mn] Σχήμα 1. Ποιοτικός δείκτης k σε συνάρτηση με τις ημέρες φύλαξης. 109

111 Για να αποδειχτεί ποια μέταλλα μεταναστεύουν από τη συσκευασία στην τοματόπαστα σχεδιάστηκαν δύο διαφορετικά πειράματα. Στο πρώτο οι μεταλλικές συσκευασίας πληρώθηκαν με οξινισμένο νερό σε ph = 4, ενώ στο δεύτερο το περιεχόμενο μιας χάρτινης συσκευασίας γνωστής περιεκτικότητας μετάλλων μεταφέρθηκε σε μεταλλική συσκευασία και αφέθηκε ανοικτό για 4 ημέρες στο ψυγείο, ενώ ένα δεύτερο ίδιο δείγμα χάρτινης συσκευασίας αφέθηκε ανοικτό για τις ίδιες ημέρες και υπό τις ίδιες συνθήκες φύλαξης. Και οι δύο δοκιμές πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν. Τα αποτελέσματα βασίστηκαν στον υπολογισμό του ισοζυγίου μάζας και της επί τοις εκατό μεταβολής της περιεκτικότητας των μετάλλων στη μεταλλική συσκευασία σε σχέση με την χάρτινη. Τα αποτελέσματα απέδειξαν ότι ο σίδηρος μεταναστεύει σε ποσοστό 29,8%, ενώ και ο μόλυβδος εμφανίζει σημαντική μετανάστευση σε ποσοστό 150%. 4. Συμπεράσματα Σε αυτή την εργασία αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν τέσσερις διαφορετικές μέθοδοι για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό Cd-Pb, As-Cu, Cr-Ni και Fe-Mn με βάση την Ευρωπαϊκή οδηγία για τον επίσημο έλεγχο συστατικών σε τρόφιμα. Τα αποτελέσματα απέδειξαν ότι οι μέθοδοι ικανοποιούν το σκοπό εφαρμογής τους. Οι μέθοδοι εφαρμόστηκαν σε δείγματα τοματόπαστα από την ελληνική αγορά και τα αποτελέσματα απέδειξαν ότι μόνο το κάδμιο υπερβαίνει τα νομοθετικά όρια, που όμως σχετίζονται με την περιεκτικότητα του στο φρούτο τομάτας. Επιπλέον, ο νέος ποιοτικός δείκτης που προτάθηκε είναι ικανός να προβλέψει τον ακριβή χρόνο αλλοίωσης του τροφίμου και να αποτελέσει χρήσιμο εργαλείο για τη βιομηχανία και τον καταναλωτή. Τέλος, αποδείχτηκε ότι ο σίδηρος και ο μόλυβδος έχουν την ικανότητα να μεταναστεύουν στην τοματόπαστα από το εσωτερικό κάλυμμα της μεταλλικής συσκευασίας κάτι που δεν συμβαίνει στις χάρτινες συσκευασίες. Βιβλιογραφία [1] Pasias, I.N., Papageorgiou, V., Thomaidis, N.S. & Proestos C. (2012). Development and Validation of an ETAAS Method for the Determination of Tin in Canned Tomato Paste Samples. Food Analytical Methods, 5, [2] European Commission Regulation (EC) No 333/2007 of 28 March 2007 laying down the methods of sampling and analysis for the official control of the levels of lead, cadmium, mercury, inorganic tin, 3-MCPD and benzo(a)pyrene in foodstuffs, L 88/29-L 88/38. [3] European Commission Regulation (EC) No 1881/2006 of 19 December 2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs, L 364/5-L 364/24. [4] Eurachem Citac Guide CG4, (2000). Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement, English edition, Second edition. [5] FAO/WHO (2004). Summary of evaluations performed by the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA ), (First through sixty-first meetings). ILSI Press International Life Sciences Institute. [6] NRC, Recommended Dietary Allowances, National Academy Press, Washington, DC (1989). 110

112 Μελέτη της ανάπτυξης στελέχους Salmonella Typhimurium σε εργαστηριακό μέσο και εκχύλισμα ρόκας σε θερμοκρασία 20 C Αγάπη Ι. Δουλγεράκη 1, Βασίλειος Ηλιόπουλος 1, Κων/νος Γεωργίου 2, Ευστάθιος Ζ. Πανάγου 1, Γεώργιος-Ιωάννης Ε. Νυχάς 1 1 Εργαστήριο Μικροβιολογίας & Βιοτεχνολογίας Τροφίμων, 2 Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων, Τμήμα Επιστήμης Τροφίμων & Διατροφής του Ανθρώπου, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Ιερά Οδός 75, Αθήνα Το παθογόνο βακτήριο Salmonella θεωρείται ένα από τους σημαντικότερους παθογόνους μικροοργανισμούς που συνδέονται με τροφοδηλητηριάσεις. Η ικανότητά του να σχηματίζει βιουμένια αποτελεί ακόμα ένα δείκτη για την σημαντικότητά του στην βιομηχανία τροφίμων. Επιπρόσθετα, η κατανάλωση ωμών φυτικών ιστών, ενέχει τον κίνδυνο τροφοδηλητηριάσεων από παθογόνα στελέχη που ανιχνεύονται στην επιφάνεια τους λόγω διασταυρούμενης επιμόλυνσης. Ωστόσο, η ικανότητα παθογόνων στελεχών να αναπτύσσονται στην επιφάνεια φυτικών ιστών και να σχηματίζουν βιο-υμένια χρήζει περαιτέρω μελέτης. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν οι κινητικές παράμετροι του παθογόνου στελέχους Salmonella Typhimurium (CDC )σε (i) εργαστηριακό θρεπτικό υπόστρωμα (Luria Bertani broth, LB) και (ii) εκχύλισμα φυτικού ιστού ρόκας εμβολιάστηκαν με το στέλεχος Salmonella Typhimurium. Απαρίθμηση του πληθυσμού και μεταβολομική ανάλυση (HEADSPACE/SPME- GC/MS) των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε κατά την επώαση σε θερμοκρασία 20 C. Ο πληθυσμός του στελέχους βρέθηκε να είναι κατά ένα δεκαδικό λογάριθμο περίπου μικρότερος στο εκχύλισμα ρόκας σε σχέση με το θρεπτικό υπόστρωμα LB, ενώ σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν στην συγκέντρωση των μεταβολικών προϊόντων κατά την ανάπτυξη στα δύο θρεπτικά μέσα. Συγκεκριμένα, στην ομάδα των αλκοολών, παρατηρήθηκαν μεγαλύτερες συγκεντρώσεις στην περίπτωση του εργαστηριακού μέσου σε σύγκριση με το φυτικό εκχύλισμα, ενώ σε άλλες περιπτώσεις, μεταβολίτες που ανιχνεύτηκαν στο πρώτο δεν βρέθηκαν στην ρόκα και αντίστροφα. Επιπρόσθετα, στην περίπτωση του φυτικού εκχυλίσματος, φάνηκε να παράγονται εστέρες του ισοθειοκυανικού οξέος (isothiocyanates), δευτερογενή μεταβολικά προϊόντα, που έχει αναφερθεί ότι χρησιμοποιούνται από διάφορα φυτά ως άμυνα εναντίον παθογόνων μικροοργανισμών. Στο ίδιο θρεπτικό μέσο, ανιχνεύτηκε η ουσία γ-βουτυρολακτόνης (γbutyrolactone) που αναφέρεται ότι ελέγχει τον δευτερογενή μεταβολισμό και την κυτταρική διαφοροποίηση. Από τα αποτελέσματα αυτά, προκύπτει ότι το παθογόνο αυτό στέλεχος μπορεί και αναπτύσσεται σε εκχύλισμα ρόκας, ενώ περαιτέρω μελέτη απαιτείται για την ικανότητά του να αναπτύσσεται υπό 111

113 μορφή βιο-υμενίων σε φυτικούς ιστούς, καθώς και του ελέγχου της παθογένειας του κατά την ανάπτυξη του σε αυτά. Ευχαριστίες Η εργασία χρηματοδοτήθηκε από την πράξη Θαλής: «Βιολογική ολιστικη προσέγγιση της δυναμικής Μορφής Επιβίωσης παθογόνων βακτηριακών σχηματισμών - ΒΙΟΥΜΕΝΙΑ», υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος "Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση" (ΕΠΕΔΒΜ) και συγχρηματοδοτείται από το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο (ΕΚΤ)." 112

114 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΦΛΑΤΟΞΙΝΗΣ Β 1 ΑΠΟ ΜΥΚΗΤΕΣ ΠΟΥ ΑΠΟΜΟΝΩΘΗΚΑΝ ΑΠΟ ΜΑΥΡΗ ΣΤΑΦΙΔΑ ΚΡΗΤΗΣ ΚΑΙ ΚΟΡΙΝΘΟΥ Α. Καναπίτσας 1, Π. Κωσταρέλου 1, Μ. Ταβουλάρη 1, Ε. Καψανάκη-Γκότση 2, Π. Μαρκάκη 1 1 Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστημιούπολη Ζωγράφου, 15784, Αθήνα 2 Εργαστήριο Συστηματικής και Οικολογίας, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστημιούπολη Ζωγράφου, 15784, Αθήνα Περίληψη Οι αφλατοξίνες είναι μεταβολίτες που παράγονται από τους μύκητες A.flavus και A.parasiticus. Η αφλατοξίνη Β 1 (ΑΦΒ 1 ) είναι ισχυρά καρκινογόνος ένωση. Βρίσκεται κυρίως σε δημητριακά, ξηρούς καρπούς, ξηρά φρούτα κ.α. Στην παρούσα εργασία απομονώθηκαν τρία στελέχη Aspergillus (A.) section Nigri (ATHUM 6998, 6999, 7000) από μαύρη σταφίδα Κρήτης και ένα στέλεχος A.section Nigri (ATHUM 6997) από μαύρη σταφίδα Κορίνθου. Μελετήθηκε η παραγωγή ΑΦΒ 1 από τα στελέχη αυτά, στα δείγματα σταφίδας, από πού αρχικά είχαν απομονωθεί και σε εκλεκτικό θρεπτικό υλικό Yeast Extract Sucrose medium (YES) σε σύγκριση με το αφλατοξινογόνο μύκητα A.parasiticus. Η εξέταση για την παραγωγή ΑΦΒ 1 στη σταφίδα και στο YES έγινε την 0 η, 3 η, 7 η, 9 η, 12 η και 15 η ημέρα επώασης. Tα αποτελέσματα έδειξαν την παραγωγή ΑΦΒ 1 από όλα τα στελέχη τόσο σε θρεπτικό υλικό YES όσο και στις σταφίδες όπου αρχικά απομονώθηκαν. Στο YES, όλα τα στελέχη Aspergillus section Nigri παρήγαγαν μέγιστη ποσότητα ΑΦΒ 1 τη 12 η ημέρα (0,064-1,09μg/κωνική), σε σύγκριση με τον μύκητα αναφοράς A.parasiticus που παρουσίασε τη μέγιστη παραγωγή ΑΦΒ 1 την 15 η ημέρα (77,79μg/κωνική). Η παραγωγή ΑΦΒ 1 από τον Α.parasiticus στη σταφίδα Κορίνθου την 12 η ημέρα είναι 48 φορές χαμηλότερη από την παραγωγή σε YES την αντίστοιχη ημέρα, ενώ η παραγωγή ΑΦΒ 1 από τον Α.parasiticus στη σταφίδα Κρήτης είναι φορές χαμηλότερη από το YES την αντίστοιχη ημέρα. Οι υπόλοιποι τέσσερις μύκητες A.section Nigri παρουσιάζουν μέγιστη παραγωγή ΑΦΒ 1 στη σταφίδα από 0,0052 0,087 μg/κωνική. Στα δείγματα σταφίδας Κρήτης η παραγωγή ΑΦΒ 1 είναι 237, 149 και 12 φορές χαμηλότερη για τα στελέχη A. section Nigri 6998, 6999 και 7000 αντίστοιχα τη 12 η ημέρα σε σύγκριση με το YES, ενώ για το στέλεχος 6997 στη σταφίδα Κορίνθου είναι 1,6 φορές μικρότερη. Από τα παραπάνω φαίνεται ότι η παραγωγή της ΑΦΒ 1 επηρεάζεται: 1) από το υπόστρωμα που αναπτύσσεται ο μύκητας και 2) το στέλεχος του μύκητα. Επομένως στην παρούσα εργασία συμπεραίνουμε ότι οι σταφίδες Κρήτης και Κορίνθου δεν είναι ευνοϊκό υπόστρωμα για την παραγωγή ΑΦΒ 1 από τους μύκητες που μελετήθηκαν. 113

115 Abstract Aflatoxins are secondary metabolites produced by A. flavus and A. parasiticus. Aflatoxin B 1 (AFB 1 ) is a powerful carcinogenic compound. It is mainly found in cereals, nuts, dried fruits etc. In the present study, three strains Aspergillus (A.) section Nigri (ATHUM 6998, 6999, 7000) were isolated from black Cretan raisins and one strain A. section Nigri (ATHUM 6997) was isolated from black Corinthian raisins. The production of AFB 1 in those strains was investigated in the raisin samples, from which they had been originally isolated. The production of AFB 1 was investigated into the Yeast Extract Sucrose Medium (Yes) in comparison to the aflatoxinogenic fungus A. parasiticus. AFB 1 production into the raisins and into the Yes medium was examined on the 0, 3 rd, 7 th, 9 th, 12 th, 15 th day of incubation. The results showed the production of AFB 1 by all the strains into the Yes medium, and into the raisins from which they were originally isolated. In the Yes medium all the strains Aspergillus section Nigri produced AFB 1 the 12 th day (0,064 1,09 μg/flask), in comparison to the control strain A. parasiticus which had maximum production of AFB 1 the 15 day (77,79 μg/flask). The AFB 1 production of A. parasiticus in Corinthian raisin the 12 day is 48 times lower than the production in the Yes medium the corresponding day, while the AFB 1 production by A. parasiticus in Cretan raisin is 13,086 times lower than the Yes medium the corresponding day. The four A. section Nigri fungi had maximum production of AFB 1, in Cretan raisin, from 0,0052 0,087 μg/flask. In the samples of Cretan raisin the AFB 1 production is 237, 149 and 12 times lower for the strains A. section Nigri 6998, 6999 and 7000 respectively the 12 th day, in comparison to the Yes medium, while for the strain 6997 in Cretan raisin it is 1.6 times smaller. From the above, it is shown that the AFB 1 production is affected from: 1) the medium in which the fungus grows and 2) the type of the fungus. Consequently, in the present study, we conclude that Cretan and Corinthian raisins are not a favorable substrate for the AFB 1 production from the fungi which were investigated. 114

116 Histamine levels in commercial cured and canned fish products commonly consumed in Greece D.P. Houhoula, A. Batrinou, G. Giannakis, K. Filios, Ε. Siskos, D. Toulis, V.R. Kyrana and V.P. Lougovois Department of Food Technology, Technological Educational Institution of Athens, Agiou Spyridonos, Egaleo, Greece Abstract Histamine levels were assayed in a variety of commercial cured and canned fish products commonly consumed in Greece. Product samples of different brand names were collected from retail markets in the Athens district and analysed using two competitive ELISA test kits: "Neogen Veratox " and "Labor Diagnostika Nord-Histamine Food Elisa". The products tested included drysalted anchovies and sardines, ripened anchovy fillets in vegetable oil, salted-dried mackerel, brined tuna and bonito, hot- and cold-smoked herring and vacuum-packed herring fillets, smoked mackerel, canned light tuna in brine and oil, canned sardines in vegetable oil, and smoked mackerel fillets canned in oil. Cured products were analysed also for parameters relating to microbiological stability and/or degree of spoilage; the data obtained for these parameters were as follows: salt content ( %), moisture content ( %), water phase salt, wps ( %), water activity, aw ( ), ph value ( ), total volatile basic nitrogen level, TVB- N ( mg N/100 g). Low histamine concentrations, not exceeding 2.55 mg/kg, were found in all samples of the canned products examined (tuna, sardines, smoked mackerel), indicating good freshness quality of the raw material used for canning. Low levels of the biogenic amine ( mg/kg) were found also in dry salted sardines, salted-dried mackerel, brined tuna and bonito, with the average content in these products being lower than 1.0 mg/kg. Ripened anchovies and smoked herring exhibited considerably higher levels of histamine, averaging 4.95 and mg/kg, respectively. While "non compliant" samples were not observed with processed anchovies, two out of the sixteen smoked herring samples tested (12.5%) contained histamine concentrations greater than the US FDA hazard action level of 50 mg/kg. Depending on the post-harvest handling of the fish, the processing technique and storage conditions, cured fish may contain unacceptable levels of biogenic amines. 115

117 Biotechnology and Foods: Benefits and Concerns Α. Labropoulos, S. Anestis, and M. Pagoni Technological Educational Institution of Athens, Greece Abstract A new technology rarely receives a broad and enthusiastic welcome. Biotechnology, however, is no exception. Potential advantages in agriculture include: increased crop resistance to pests, disease, and environmental stress; increased crop yields; and decreased production costs. Potential advantages for consumers include: improved organoleptic and nutritional quality; improved shelf-life of fresh fruits and vegetables; and reduced allergen concentrations. In Food Technology (Bio-processing), biotechnology enables optimization of microorganisms and enzymes necessary for processing of fermented foods such as cheeses resulting in food ingredients of higher quality. In Diet, Nutrition, and Health, biotechnology has the potential to provide more food to the world and foods of improved nutritional composition. Potential allergenicity can be assessed and is an important part of a comprehensive safety assessment protocol. Many concerns on naturally occurring toxicants are endogenous to food sources while others are formed in or on foods naturally or as a result of storage or normal processing. For environmental benefits, biotechnology has been used to develop herbicide-tolerant crops that enable the use of comparatively environmentally benign herbicides. Existing scientific evidence leads to the conclusion that there is no increased adverse health or environmental effects attributable to the use of bio-technology in food production Introduction The term biotechnology means different things. In general, food biotechnology is the integration of food science and engineering to provide new products by the application of organisms, cells, parts thereof, molecular analogs, etc. But in a specific way, biotechnology considers new DNA techniques, molecular biology, and to the genetic engineering techniques developed lately. Biotechnology encompasses application in biology, genetics, and biochemistry to advance technical and industrial processes and techniques ranging from drug development, fish farming, forestry, crop development, fermentation, etc. However, biotechnology has been used for centuries in food processing (beer and wine making) but only recently has it gained attention as a process to manipulate DNA of bacteria, plants, and animals. Genetic engineering (GE) began in the early 1970s when California scientists discovered how to make recombinant DNA (rdna) using restriction enzymes to cut and paste DNA. Recombinant DNA techniques allow the transfer of genetic material across species barriers giving 116

118 a bacterium, plant, or animal a trait that it does not possess naturally. The first generation of GE foods has been created toward the production of crops engineered for disease and insect resistance to prevent crop losses making weed management easier. Transgenic crops were first planted commercially in Since then, their use has increased rapidly [4]. By 1999, 70 million acres were planted in the United States alone, and a total of 98.6 million acres were planted globally [1]. Examples of currently approved GE crops in the United States include glyphosateresistant soybeans, insect-resistant corn and potatoes, and virusresistant squash [2]. Biotechnology proponents promise that the second generation of GE foods and crops will provide consumers and farmers with more benefits. Healthier foods, such as cereal grains with increased amounts of soluble and insoluble fiber, milk with improved calcium bioavailability, and vegetables with boosted levels of antioxidants are some of the beneficial objects of biotechnology [3]. Agricultural biotechnology research can contribute to improved yields for poor farmers and make more plentiful, affordable, and nutritious food for consumers, worldwide [4]. Although claims of GE foods and crops have many potential benefits - from a healthier food supply to improved crops yields and decreased pesticide use- more and more controversy is being generated worldwide as to whether or not GE foods and crops are safe for human consumption and the environment [5]. Most of the controversial stems - disagreements over GE foods and crops should be regulated in a proper way including whether or not individual. Food biotechnology is a rapidly expanding field of science which provides powerful tools for the sustainable development of agriculture as well as the food industry with many different applications / investigations into genetic engineering, molecular biology, and cell cultures have been increasing significantly [6]. Traditional food biotechnology Traditional biotechnology refers to the conventional techniques of fermentation processes that have been used for many centuries to produce beer, wine, cheese, bread, and other foods. The fermentation of food is conversion of certain carbohydrates to other products such as alcohol, glycerol, lactic and acetic acid, by yeast or bacterial actions [7,8]. For example, enzymes have been applied to practical uses for years to develop a great variety of plants, animals, and microorganisms for the production of a wide range of food products and ingredients for processed foods [9]. Modern food biotechnology Modern biotechnology embraces all methods of genetic modification by recombinant DNA and cellfusion techniques together with the modern developments of traditional food biotechnological processes. Genetic modification involves the insertion of one or a small number of well characterized genes into the food plant, animal, or microorganism and they are strongly related to fields such as genetic engineering, molecular biology, protein engineering, biochemical 117

119 engineering, and processes involving monoclonal antibodies, which are beginning to have a considerable impact on food processing [10]. Modern biotechnology will play the role not only the production of new foods but also the preservation of raw materials, increased shelf-life of final products, and the planned alteration of their nutritional and functional properties. Some applications of modern biotechnological (genetic) engineering techniques are: increasing the resistance of plants to diseases and pests, herbicides or pesticides; developing plants to withstand more extreme environmental conditions; developing foods with specific improved quality properties, e.g. sensorial and nutritional; adapting microorganisms for more efficient food production; producing natural food ingredients (amino acids, organic acids, vitamins, etc.); and obtaining enzymes, antibodies and microorganisms to monitor food production. Benefits and risks of food biotechnology Farmers have relied on the newest technology to produce and enhance foods that possess specific beneficial traits for the grower, producer, and also the consumer. The current benefits of biotechnology include disease resistance, reduced pesticide use, herbicide tolerance, more rapid growth of crops, producing higher yields and also benefit the environment, including water and soil conservation while enhancing the nutritional characteristics of foods, food taste and quality [11]. During the last five years, the planting of transgenic crops has increased and more genetically enhanced products are expected to be on the market in the years to come. Thus, some of the benefits that can be expected in the near future include: (i) Reduced levels of natural toxins in plants; (ii) Simpler and faster methods to locate pathogens, toxins, and contaminants; and (iii) Extending the self time of products (delayed spoilage). The world population is expected to double by the year 2050 and new technologies needed to approach biotechnology s potential to help avoid starvation in the next century. Another economic and environmental benefit is in the area of fertilizer use which is wasted and can end up in water sources, damaging the environment. Benefits that can be expected further down the road include producing safer foods through reduction of allergenic proteins drought and flood tolerance and salt and metal tolerance; and applications are more acceptable than others. It will be necessary, therefore, to develop programs to educate the public about the benefits and problems of biotechnology in the production and processing of food. Appropriate regulation is a prerequisite from the point of view of the general public and the food industry [12]. Although there is no such thing as zero risk for any food, consumers can be confident that foods produced using biotechnology meet the government s food-safety standards. 118

120 References 1. James C, ed. Global Review of Commercialized Transgenic Crops: No. 12. Ithaca. NY: International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications (ISAAA); Biotechnology Information Center. Commercialized Biological-Based Products in the Food and Agriculture Industries. Beltsville, MD: National Agricultural Library; Rohlfing C. Longevity's latest drugs: milk, carrots, bread, and oj. Food Techno/. 1991; 44: Pinstrup-Anderson P, Cohen M. Modern Biotechnology for Food and Agriculture: Risks and Opportunities for the Poor. Washington DC: International Food Policy Research Institute; October Juma C, Gupta A Safe use of biotechnology. In: Persley GJ. ed. Biotechnology for Developing Country Agriculture: Problems and Opportunities. 20/20Vision Focus 2: Brief 6 out of 10. Washington DC: International Food Policy Research Institute; October Altman A (1998) Agricultural Biotechnology. New York: Marcel Dekker. 7. European Federation of Biotechnology (EFB) Task Group on Public Perceptions of Biotechnology (1997). Biotechnology in Foods and Drinks Inform. London, UK: EFB 8. IFT (2000) Genetically modified organisms. Food Technology 54: Kaufman PB, Cseke LJ, Warber S, Duke JA and Brielmann HL (1999) Natural Products from Plants. Boca Raton, FL: CRC Press. 10. Lappe M and Bailey B (1999) Against the Grain. The Genetic Transformation of Global Agriculture. London: Earthscan Publications. 11. Lee BH (1996) Fundamentals of Food Biotechnology. New York: VCH Publishers. 12. Menrad K, Agrafiotis D, Enzing CM, Lemkow L and Terragni F (1999) Future Impacts of Biotechnology on Agriculture, Food Production and Food Processing. London: Springer. 119

121 120

122 Συνεδρία Γ1 121

123 122

124 BIOtechnological COrinthian Raisin EXtract ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΗ ΕΡΕΥΝΑ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ & ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΥ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ ΔΙΑΤΡΟΦΗΣ ΜΑΥΡΗΣ ΚΟΡΙΝΘΙΑΚΗΣ ΣΤΑΦΙΔΑΣ Παύλος Κορδοπάτης 1, Φωτεινή Ν. Λάμαρη 1, Γιώργος Ν. Πάϊρας 2, Άλεξ Παύλου 3, Κώστας Κατσογιάννης 3, Brian F.C. Clark 3, Χαράλαμπος Πισιμίσης 4, Βελέντζας Δημήτριος 4 1 Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας & Χημείας Φυσικών Προϊόντων, 2 Εργαστήριο Φαρμακευτικής Χημείας, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών. 3 CORINGREEN SA, 4 THANOS VINEGAR SA. * corresponding author: apavlou@coringreen.com Η ηγέτιδα εταιρεία εξαγωγής ξυδιού στην Ελλάδα ΘΑΝΟΣ ΑΕΒΕ, σε συνεργασία με την εταιρεία πράσινης βιοτεχνολογίας CORINGREEN SA, και το Τμήμα Φαρμακογνωσίας της Φαρμακευτικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών, εφαρμόζουν πρωτότυπα μοντέλα μεταφοράς τεχνολογίας και τελικής βιομηχανικής εφαρμογής, για τον φυτοχημικό προσδιορισμό, βιοχημικό χαρακτηρισμό και βιοτεχνολογική παραγωγή του FLAVOCORIN, τού πρώτου αντιοξειδωτικού βιοδραστικού μοριακού συμπλόκου Μαύρης Κορινθιακής Σταφίδας. Η ομάδα έργου έξυπνης εξειδίκευσης με υψηλό δυναμικό καινοτομίας έντεκα επιστημόνων, θα παράξει με την χρήση καινοτόμου βιοτεχνολογικής πλατφόρμας (σύμφωνα με τα διεθνή standards (FDA/GMP)-και θα προωθήσει το τελικό προϊόν σε δύο εκδοχές: α) FLAVOCORIN vinegar στο Ελληνικό ξύδι τύπου balsamico. β) FLAVOCORIN FC σε συμπληρώματα διατροφής και καλλυντικά στην αγορά του φαρμακείου. Το τελικό προϊόν θα κατοχυρωθεί με δύο αιτήσεις Ελληνικής και Ευρωπαϊκής πατέντας και θα αποτελέσει εφαλτήριο ίδρυσης ενός νέου εταιρικού τμήματος βιοδιύλισης μαύρης σταφίδας (με την ονομασία BIOCOREfinery) και εισόδου σε νέες απαιτητικές και ανταγωνιστικές αγορές. Με τον τρόπο αυτό το έργο συμβάλλει στη δυναμική ανάπτυξης της περιοχής και υποστηρίζει την βιωσιμότητα του ενδογενούς δυναμικού, την συγκράτηση του ανθρώπινου κεφαλαίου και την μείωση της εξωτερικής μετανάστευσης. Έτσι η τοπική αγροτική κοινότητα διατηρεί την πληθυσμιακή της βάση που είναι απαραίτητη για την αναπτυξιακή διαδικασία. Όσον αφορά δε τις αμιγώς ελληνικές εξαγωγικές βιομηχανίες τροφίμων και καλλυντικών, η συνεργασία θα είναι σε αυτή την περίπτωση άμεση υποκαθιστώντας την εισαγωγή ακριβών πρώτων υλών, καλύπτοντας με αυτό τον τρόπο το σημαντικό κενό που υπάρχει στην ελληνική αγορά, αυξάνοντας την κερδοφορία τους, μειώνοντας το κόστος παραγωγής τους, προσφέροντάς τους ταυτόχρονα ισχυρά ανταγωνιστικά πλεονεκτήματα και αναβαθμίζοντας την ποιότητα του τελικού προϊόντος του πελάτη-εταιρεία. 123

125 ΜΕΛΕΤΗ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΦΑΙΝΟΛΙΚΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΑΠΟ ΑΠΟΒΛΗΤΑ ΕΛΑΙΟΤΡΙΒΕΙΟΥ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΝΘΥΛΑΚΩΣΗ ΤΟΥ ΣΕ ΠΡΩΤΕΪΝΗ ΤΥΡΟΓΑΛΑΚΤΟΣ, ΜΑΛΤΟΔΕΞΤΡΙΝΗ ΚΑΙ ΖΕΛΑΤΙΝΗ Ζηνοβία Φουστέρη 1, Δημήτριος Στάγκος 1, Κωνσταντίνος Πετρωτός 2, Ιωάννης Ματσούκας 2, Γεώργιος Κεφαλάκης 2, Χρήστος Μαντάς 2, Πασχάλης Γκουτσίδης 2, Ευθαλία Κερασιώτη 1, Αγαθός Φιλίντας 2, Δημήτριος Κουρέτας 1 1 Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, Πλούτωνος 26 & Αιόλου, Λάρισα Τμήμα Μηχανικής Βιοσυστημάτων, Τ.Ε.Ι. Θεσσαλίας, Λάρισα Περίληψη Τα απόβλητα ελαιοτριβείου, αν και δημιουργούν σημαντικά περιβαλλοντολογικά προβλήματα, είναι πλούσια σε φυτικές πολυφαινόλες, οι οποίες είναι βιοδραστικές ενώσεις με ευεργετικές επιδράσεις στην ανθρώπινη υγεία λόγω κυρίως της αντιοξειδωτικής τους δράσης (1). Έτσι, στην παρούσα μελέτη απομονώθηκε πολυφαινολικό εκχύλισμα από απόβλητα ελαιοτριβείου με τη μέθοδο της υπερκρίσιμης εκχύλισης με διοξείδιο του άνθρακα. Στη συνέχεια το εκχύλισμα ενθυλακώθηκε σε πρωτεΐνη τυρογάλακτος, σε μαλτοδεξτρίνη, σε ζελατίνη ή σε συνδυασμούς των προηγούμενων υλικών με σκοπό να αυξηθεί η βιοδιαθεσιμότητα και άρα η βιοδραστικότητα του εκχυλίσματος. Η ενθυλάκωση έγινε με τη μέθοδο της ξήρανσης με ψεκασμό (spray drying). Αρχικά, τα ενθυλακωμένα δείγματα εξετάστηκαν για την αντιοξειδωτική τους δράση με μία in vitro μέθοδο που βασίζεται στην εξουδετέρωση της ελεύθερης ρίζας του ABTS.+. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα ενθυλακωμένα δείγματα είχαν αντιοξειδωτική δράση με τιμές IC 50 που κυμαινότανε από 145 έως 710 μg/ml. Επίσης, προσδιορίστηκε, με τη μέθοδο της πρόκλησης θραυσμάτων σε πλασμιδιακό DNA, η ικανότητα των δειγμάτων να αναστέλλουν βλάβες σε DNA προκαλούμενες από ελεύθερες ρίζες περοξυλίου (ROO ) που παράγονται από θερμική διάσπαση της ένωσης 2,2 -azobis(2- amidinopropane hydrochloride (AAPH). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα δείγματα προστάτευαν από τις προκαλούμενες από ελεύθερες ρίζες βλάβες στο DNA με τιμές IC 50 που κυμαινότανε από 397 έως 2300 μg/ml. Επιπλέον, εξετάστηκε η ικανότητα των δειγμάτων να επιδρούν στους αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα προσδιορίζοντας τα συνολικά επίπεδα των ελευθέρων ριζών (ROS) καθώς και της γλουταθειόνης (GSH) με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα δείγματα μειώνουν τις ROS και αυξάνουν τη GSH και άρα ενισχύουν τους κυτταρικούς αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα δείχνουν πως πολυφαινολικά εκχυλίσματα από απόβλητα ελαιοτριβείου μετά από ενθυλάκωσή τους έχουν ισχυρή αντιοξειδωτική δράση και έτσι θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως συμπληρώματα διατροφής ή σε βιολειτουργικά τρόφιμα. 124

126 Βιβλιογραφία 1) Stagos D, Portesis N, Spanou C, Mossialos D, Aligiannis N, Chaita E, Panagoulis C, Reri E, Skaltsounis L, Tsatsakis AM, Kouretas D. Correlation of total polyphenolic content with antioxidant and antibacterial activity of 24 extracts from Greek domestic Lamiaceae species. Food Chem Toxicol (11): Ευχαριστίες H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) - Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: ΑΡΧΙΜΗΔΗΣ ΙΙΙ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου. STUDY OF ANTIOXIDANT ACTIVITY OF A POLYPHENOLIC EXTRACT FROM OLIVE MILL WASTE WATER AFTER THEIR ENCAPSULATION IN WHEY PROTEIN, MALTODEXTRIN AND GELATIN Zinovia Fousteri 1, Dimitrios Stagos 1, Konstantinos Petrotos 2, Ioannis Matsoukas 2, Georgios Kefalakis 2, Christos Mantas 2, Pashalis Goutsidis 2, Efthalia Kerasioti 1, Agathos Filintas 2, Dimitrios Kouretas 1 1 Department of Biochemistry & Biotechnology, University of Thessaly, Ploutonos 26 & Aiolou, Larissa Department of Biosystems Engineering, Technological Educational Institution of Larissa, Larissa 4110, Greece Abstract Although olive mill waste waters (OMWW) cause serious environmental problems, they are rich in plant polyphenols, bioactive compounds having beneficial effects on human health, especially due to their antioxidant activity (1). Thus, in the present study, a polyphenolic extract was isolated from OMWW using the supercritical carbon dioxide method. Afterwards, the extract was encapsulated in whey protein, maltodextrin and gelatin or in combinations of these materials using the spray drying method in order to increase their bioavailability. Then, the encapsulated extracts were examined for their antioxidant activity using the ABTS + radical scavenging assay. The results showed that the encapsulated samples had antioxidant activity with IC 50 values from 145 to 710 μg/ml. Moreover, the DNA plasmid breakage assay was used to assess the samples activity to inhibit DNA damage induced by peroxy radicals (ROO ) produced from thermal decomposition of 2,2-125

127 azobis(2-amidinopropane hydrochloride (AAPH). The results showed that the samples protected from peroxy radical-induced DNA damage with IC 50 values from 397 to 2300 μg/ml. Furthermore, it was examined the samples ability to affect the antioxidant mechanisms in human endothelial cells by estimating the total reactive oxygen species (ROS) levels and GSH levels by flow cytometry. The results showed that the encapsulated extracts reduced ROS and increased GSH levels, and thus suggesting the enhancement of antioxidant mechanisms. In conclusion, the results showed that polyphenolic extracts from OMWW after encapsulation have strong antioxidant activity, and consequently they may be used as food supplements or for the development of biofunctional foods. References 1) Stagos D, Portesis N, Spanou C, Mossialos D, Aligiannis N, Chaita E, Panagoulis C, Reri E, Skaltsounis L, Tsatsakis AM, Kouretas D. Correlation of total polyphenolic content with antioxidant and antibacterial activity of 24 extracts from Greek domestic Lamiaceae species. Food Chem Toxicol (11): Acknowledgments This research has been co-financed by the European Union (European Social Fund - ESF) and Greek national funds through the Operational Program "Education and Lifelong Learning" of the National Strategic Reference Framework (NSRF) - Research Funding Program: ARCHIMEDES III. Investing in knowledge society through the European Social Fund. 126

128 ΟΙ ΤΟΚΟΦΕΡΟΛΕΣ ΣΤΙΣ ΕΛΙΕΣ ΚΑΙ ΤΟ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ Ελένη Α.Δ. Μαΐστρου 1, Γεώργιος Σειραγάκης 2 1 Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών - Ιερά Οδός 75, , Αθήνα 2 Food Allergens Laboratories - Ι. Ζερβού 1, , Νέο Ηράκλειο Η Food Allergens Laboratories έχει αναπτύξει μια μέθοδο χρησιμοποιώντας HPLC προκειμένου να ανιχνεύσει όλες τις τοκοφερόλες και τοκοτριενόλες σε ελιές και ελαιόλαδο. Αναλύθηκαν 19 τύποι ελληνικού παρθένου ελαιολάδου και 11 δείγματα ελιάς από διάφορες ποικιλίες και περιοχές από όλη την Ελλάδα για τα έτη Παρατηρήθηκαν υψηλές συγκεντρώσεις της άλφατοκοφερόλης στα περισσότερα των επιλεγέντων δειγμάτων, με τιμές της τάξεως των 110 έως 300 mg/kg (> 250 mg/kg σε 75% των δειγμάτων). Συγκρίθηκαν εν σειρά, 2 διαφορετικά συστήματα ανίχνευσης HPLC, με φθορισμό και με υπεριώδη ακτινοβολία για τον ποσοτικό προσδιορισμό των τοκοφερολών και των τοκοτριενολών στις ελιές και στο ελαιόλαδο. Τα καλύτερα αποτελέσματα ελήφθησαν με το σύστημα ανίχνευσης φθορισμού, που εφαρμόστηκε με επιτυχία σε 30 δείγματα. Ως υποστήριξη της εγκυρότητας της μεθόδου οι παράμετροι που αξιολογήθηκαν ήταν η γραμμικότητα, το όριο της ανίχνευσης, η επαναληψιμότητα και η ανάκτηση των αποτελεσμάτων. Όλα τα δείγματα που μελετήθηκαν, παρουσίασαν παρόμοια ποιοτικά χαρακτηριστικά με έξι ταυτοποιημένες ενώσεις: άλφα-t, βήτα-t, γάμμα-t, δέλτα-t, άλφα-t3, και γάμμα-t3. Η άλφατοκοφερόλη (άλφα-τ) ήταν το κύριο ισομερές της βιταμίνης Ε σε όλα τα δείγματα, από 80 έως 250 mg/kg. Οι διαφορετικές ποικιλίες ελιάς φαίνεται να επηρεάζουν τη σύνθεση των τοκοφερολών και τοκοτριενολών και ειδικότερα την περιεκτικότητά τους σε βήτα-τ, γάμμα-τ, δέλτα-t, αλφα-τ3 και γάμμα-τ3. Λέξεις κλειδιά Ελιά, ελαιόλαδο, τοκοφερόλες, HPLC. 127

129 ΜΕΛΕΤΗ IN VIVO ΤΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΧΥΜΟΥ ΡΟΔΙΟΥ Χρυσούλα Ματθαίου 2, Ελένη Σαράφογλου 1, Νικόλαος Γκουτζουρέλας 1, Δημήτριος Στάγκος 1, Σέρκος Χαρουτουνιάν 2, Δημήτριος Κουρέτας 1 1 Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, Πλούτωνος 26 & Αιόλου, Λάρισα Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Ιερά Οδός 75, Αθήνα Εισαγωγή Μεγάλο ενδιαφέρον έχει εκδηλωθεί τα τελευταία χρόνια για την παραγωγή και χρήση τροφών φυτικής προέλευσης με αντιοξειδωτικές ιδιότητες για την πρόληψη ασθενειών που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες (1). Μελέτες έχουν δείξει ότι ο χυμός ροδιού έχει ευεργετικές ιδιότητες στον ανθρώπινο οργανισμό λόγω της περιεκτικότητάς του σε βιταμίνες C, K και B καθώς και σε μια κατηγορία ενώσεων που ονομάζονται πολυφαινόλες. Οι πολυφαινόλες είναι συστατικά με ισχυρή αντιοξειδωτική δράση που βρίσκονται σε φυτικές τροφές και συμβάλουν στη βελτίωση της υγείας του ανθρώπινου οργανισμού (1). Έτσι, εξετάστηκε η αντιοξειδωτική δράση του χυμού ροδιού μετά από χορήγησή του σε ανθρώπους. Μέθοδος Στη μελέτη συμμετείχαν 14 υγιείς εθελοντές, που δεν λάμβαναν φαρμακευτική αγωγή ή συμπληρώματα διατροφής και κατανάλωσαν για 15 ημέρες μισό λίτρο φυσικού χυμού ροδιού ανά ημέρα. Ο χυμός ήταν της εταιρείας VITOM Αφοι Χριστοδούλου. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η μεταβολή δεικτών οξειδωτικού στρες στο αίμα σε τέσσερις χρονικές στιγμές. Έτσι, έγινε αιμοληψία πριν την χορήγηση του χυμού, αμέσως μετά τις 15 ημέρες λήψης χυμού καθώς και μετά από μία και τρεις εβδομάδες από την διακοπή της λήψης του χυμού. Οι δείκτες που μελετήθηκαν ήταν η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα πλάσματος TAC, τα επίπεδα της μαλονικής διαλδεΰδης (MDA, δείκτης λιπιδικής υπεροξείδωσης), η ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH), τα πρωτεινικά καρβονύλια (CARB, δείκτης πρωτεϊνικής οξείδωσης) και η δραστικότητα της καταλάσης (CAT). Αποτελέσματα Συμπεράσματα Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η GSH αυξήθηκε σημαντικά αμέσως μετά το πέρας της λήψης του χυμού κατά 22,6%, η MDA μειώθηκε σημαντικά κατά 24,4% μια βδομάδα μετά τη διακοπή της λήψης του χυμού και τα CARB ήταν σημαντικά μειωμένα κατά 19,6% αμέσως μετά την διακοπή της λήψης του χυμού και κατά 17,7% μια βδομάδα μετά. Η TAC και η δραστικότητα της καταλάσης δεν επηρεάστηκαν σημαντικά. Με βάση την αξιολόγηση των ανωτέρω, φαίνεται ότι ο χυμός του ροδιού μπορεί να έχει θετική επίδραση στην ανθρώπινη υγεία μέσω της αντιοξειδωτικής του δράσης. 128

130 Βιβλιογραφία 1) Apostolou A, Stagos D, Galitsiou E, Spyrou A, Haroutounian S, Portesis N, Trizoglou I, Wallace Hayes A, Kouretas D. Assessment of polyphenolic content, antioxidant activity, protection against ROS-induced DNA damage and anticancer activity of Vitis vinifera stem extracts. Food Chem Toxicol (in press). IN VIVO STUDY OF ANTIOXIDANT ACTIVITY OF POMEGRANATE JUICE Chrysoula Mathaiou 2, Eleni Sarafoglou 1, Νikolaos Goutzourelas 1, Dimitrios Stagos 1, Serkos Haroutounian 2, Dimitrios Kouretas 1 1 Department of Biochemistry & Biotechnology, University of Thessaly, Ploutonos 26 & Aiolou, Larissa Agricultural University of Athens, Iera odos 75, Athens Introduction A great deal of interest has recently been shown on the production and use of plant foods with antioxidant properties in order to prevent diseases related to oxidative stress (1). Studies have shown that pomegranate juice has beneficial effects on human organism as it contains vitamins C, K and B as well as a phytochemical compounds called polyphenols. Polyphenols, components with strong antioxidant activity, can be found in plant foods and contribute to the improvement of human health (1). Thus, pomegranate juice s antioxidant activity has been examined after its administration to humans. Method In this study, 14 healthy volunteers who did not get any medicines or any dietary supplements consumed daily half a liter of pomegranate juice for a period of 15 days. The juice was produced by the company VITOM Christodoulou. Then, changes of oxidative stress markers in blood were estimated at four different time points. Thus, blood was taken before the juice administration, just after the 15 days of juice administration as well as one and three weeks after the interruption of juice administration. The markers that have been studied were the total antioxidant capacity (TAC) in plasma, the levels of Malondialdehyde (MDA, a lipid peroxidation marker), reduced glutathione (GSH), protein carbonyls (CARB, a protein oxidation marker) and catalase activity (CAT). Results Conclusions Results have shown that GSH was increased significantly just after the end juice administration by 22.6%, MDA, after a week of the end of juice consumption, was reduced significantly by 24.4% 129

131 and CARB were reduced significantly by 19.6% just after the interruption of juice administration, and by 17.7% a week after the end of juice consumption. TAC and catalase activity were not affected. Based on the evaluation of the above, pomegranate juice seems to have a positive effect on human health through its antioxidant activity. References 1) Apostolou A, Stagos D, Galitsiou E, Spyrou A, Haroutounian S, Portesis N, Trizoglou I, Wallace Hayes A, Kouretas D. Assessment of polyphenolic content, antioxidant activity, protection against ROS-induced DNA damage and anticancer activity of Vitis vinifera stem extracts. Food Chem Toxicol (in press). 130

132 Προσδιορισμός δεικτών οξειδωτικού στρες στο αίμα κοτόπουλων κρεατοπαραγωγής που υπέστησαν αγωγή με πολυφαινολικά πρόσθετα Κωνσταντίνος Γερασόπουλος 1,2, Δημήτριος Οικονομίδης 1, Δημήτριος Στάγκος 1, Στυλιανός Κόκκας 2, Δημήτριος Καντάς 2, Παναγιώτης Γούλας 2, Σαβουϊδάκη Καλλιόπη 2, Γεώργιος Ντομπρουγάς 2, Κωνσταντίνος Πετρωτός 2, Δημήτριος Κουρέτας 1 1 Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, Πλούτωνος 26 & Αιόλου, Λάρισα Τμήμα Μηχανικής Βιοσυστημάτων, Τ.Ε.Ι. Θεσσαλίας, Λάρισα Τα τελευταία χρόνια παρουσιάζεται έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον σχετικά με φυτικές τροφές με αντιοξειδωτική δράση (1). Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διατροφή κοτόπουλων κρεατοπαραγωγής, με ζωοτροφές που περιείχαν πολυφαινολικά πρόσθετα, από επεξεργασμένα υγρά αποβλήτων ελαιοτριβείου (ΥΑΕ) και από υπολείμματα απόσταξης τριαντάφυλλου έτσι ώστε να διερευνηθεί αν θα υπήρχε ενίσχυση των αντιοξειδωτικών μηχανισμών τους. Τα κοτόπουλα χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες των δώδεκα ατόμων: η Α ομάδα ελέγχου ελάμβανε καλαμπόκι, η Β ομάδα ελάμβανε καλαμπόκι και εκχύλισμα μερικώς εμπλουτισμένο σε πολυφαινόλες από ΥΑΕ, η Γ ομάδα ελάμβανε καλαμπόκι και εκχύλισμα πλήρως εμπλουτισμένο σε πολυφαινόλες από ΥΑΕ και η Δ ομάδα ελάμβανε πολυφαινολικό εκχύλισμα από απόσταξη τριαντάφυλλου. Πραγματοποιήθηκαν τρεις αιμοληψίες από όλα τα κοτόπουλα ανά δέκα ημέρες, αρχίζοντας από την ηλικία των τριάντα ημερών. Μετά από κάθε αιμοληψία, γινόταν συλλογή του πλάσματος για τον προσδιορισμό των TBARS (δείκτης λιπιδικής υπεροξείδωσης), των πρωτεϊνικών καρβονυλίων (δείκτης πρωτεϊνικής οξείδωσης) και της συνολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας (TAC). Επίσης, στο ερυθροκυτταρικό αιμόλυμα προσδιορίστηκαν η ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH) και η δραστικότητα της καταλάσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλα τα πολυφαινολικά πρόσθετα αυξάνουν την αντιοξειδωτική ικανότητα των κοτόπουλων με πιο ισχυρό το πλήρως εμπλουτισμένο σε πολυφαινόλες εκχύλισμα από ΥΑΕ. Συγκεκριμένα, στην πρώτη αιμοληψία η ομάδα Γ, που ελάμβανε το πλήρως εμπλουτισμένο σε πολυφαινόλες εκχύλισμα από ΥΑΕ, είχε αυξημένες τιμές γλουταθειόνης σε σχέση με την ομάδα ελέγχου περίπου στο τετραπλάσιο (από 1,1 σε 4 μmol/gr αιμοσφαιρίνης). Επίσης, η Γ ομάδα σε σχέση με την ομάδα ελέγχου κατά την τρίτη αιμοληψία παρουσίαζε αυξημένες τιμές της TAC κατά 15% (από 1,067 σε 1,255 mmol DPPH/lt πλάσματος), μειωμένες τιμές στην οξείδωση των πρωτεϊνών κατά 43% (από 0,377 σε 0,216 nmol/mg πρωτεΐνης), μειωμένες τιμές στην οξείδωση των λιπιδίων κατά 54% (από 12,3 σε 5,7 μmol/lt πλάσματος), αλλά και αυξημένη δραστικότητα της καταλάσης κατά 58% (από 13,8 σε 21,8 U/mg αιμοσφαιρίνης). Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα δείχνουν πως η χορήγηση πολυφαινολικών πρόσθετων από ΥΑΕ αλλά και από υπολείμματα απόσταξης τριαντάφυλλου ενισχύουν σημαντικά 131

133 τους αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς άμυνας των κοτόπουλων κρεατοπαραγωγής και μάλιστα από την ηλικία των τριάντα ημερών. Βιβλιογραφία 1) Stagos D, Portesis N, Spanou C, Mossialos D, Aligiannis N, Chaita E, Panagoulis C, Reri E, Skaltsounis L, Tsatsakis AM, Kouretas D. Correlation of total polyphenolic content with antioxidant and antibacterial activity of 24 extracts from Greek domestic Lamiaceae species. Food Chem Toxicol (11): Assessment of Oxidative Stress Markers in Broiler s Blood, Treated with Polyphenolic Extracts Konstantinos Gerasopoulos 1,2, Dimitrios Stagos 1, Stylianos Kokkas 2, Dimitrios Kantas 2, Panagiotis Goulas 2, Savouidaki Kalliopi 2, Georgios Domprougas 2, Konstantinos Petrotos 2, Dimitrios Kouretas 1 1 Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Thessaly, Ploutonos 26 and Aiolou st., P.C , Larisa, Greece. 2 Department of Biosystem Engineering, Technical Education Institute (T.E.I) of Thessaly, P.C Larisa, Greece. In the last years, there is an intense research interest for plant foods exhibiting antioxidant activity (1). The aim of the present study was the raise of broiler chicks with feed containing polyphenolic additives, from processed OMWW (olive mill waste waters) and distilling rose residues, in order to examine if there would be enhancement of their antioxidant capacity. The broilers were divided into four (4) groups of twelve (12) subjects. The group A was the control group receiving the basic diet throughout the experiment. The group B received in the silage corn a moderately polyphenolic extract from OMWW, the C group received in the silage corn a fully polyphenolic extract from OMWW and the D group received polyphenolic extract by distillation of roses. Three (3) blood collections from all broilers were performed, with time interval between each blood collection of ten days, starting at the age of thirty (30) days. After each blood collection, in plasma, it was examined the TBARS (lipid peroxidation marker), the protein carbonyls (protein oxidation marker) and the total antioxidant capacity (TAC). Moreover, in erythrocyte lysate, the reduced glutathione (GSH) and catalase activity were assessed. The results showed that all of the polyphenolic additives increased the antioxidant capacity of the broilers with the most potent being the fully polyphenolic extract from OMWW. Specifically, in the first blood collection, the group C received the enriched polyphenolic extract from OMWW showed 132

134 four-fold higher (from 1.1 to 4 μmol / gr hemoglobin) GSH levels than the control group. Also, the group C compared with the control group, at the third blood collection, showed higher values of TAC by 15% (from 1,067 to 1,255 mmol DPPH / lt plasma), lower values of protein oxidation by 43% (from to 0,216 nmol / mg protein), lower lipid peroxidation by 54% (from 12.3 to 5.7 μmol / lt plasma) and higher catalase activity by 58% (from 13.8 to 21,8 U / mg hemoglobin). In conclusion, the results indicate that the polyphenolic additives from OMWW and residues from distillation of rose enhance significantly the antioxidant defense mechanisms of broiler chickens, even from the age of thirty days. References 1) Stagos D, Portesis N, Spanou C, Mossialos D, Aligiannis N, Chaita E, Panagoulis C, Reri E, Skaltsounis L, Tsatsakis AM, Kouretas D. Correlation of total polyphenolic content with antioxidant and antibacterial activity of 24 extracts from Greek domestic Lamiaceae species. Food Chem Toxicol (11): Acknowledgments This research has been co-financed by the European Union (European Social Fund - ESF) and Greek national funds through the Operational Program "Education and Lifelong Learning" of the National Strategic Reference Framework (NSRF) - Research Funding Program: ARCHIMEDES III. Investing in knowledge society through the European Social Fund. 133

135 134

136 Συνεδρία Γ2 135

137 136

138 Detection of Pathogens in foods by ANSR System Nicola Sillars ΝΕΟGEN Europe, Scotland UK Neogen Corporation develops and markets products dedicated to food and animal safety. The company s Food Safety Division markets dehydrated culture media, and diagnostic test kits to detect foodborne bacteria, natural toxins, genetic modifications, food allergens, drug residues, plant diseases and sanitation concerns. Neogen s Animal Safety Division manufactures and distributes a variety of animal healthcare products, including diagnostics, pharmaceuticals, veterinary instruments, wound care and disinfectants. Neogen Corporation (Nasdaq: NEOG) has received Performance Tested Methods Certification from the AOAC Research Institute for its new ANSR Salmonella assay, which is designed for rapid and definitive detection of Salmonella in food and environmental samples. Neogen recently introduced the ANSR rapid pathogen detection system in May 2012 with the Salmonella and Listeria assay. The issuance of this certificate, Number from the AOAC Research Institute, independently confirms the performance of the assay as equivalent to that of the FDA or USDA reference methods for Salmonella detection. The ANSR system uses an innovative isothermal DNA amplification process to amplify DNA to detectable levels and fluorescent molecular beacon technology for detection of the pathogen target. Combined with ANSR s single enrichment step, Neogen s new pathogen detection method can provide DNA- definitive results for Salmonella in as little as 10 hours from the time the sample is taken. ANSR is the solution for those customers who want fast and accurate results in an extremely easy-to-use format, and this certification is a confirmation of the method and the technology used in the ANSR pathogen detection system, said Gerry Broski, Food Safety marketing director for Neogen. Moving forward, additional assays for the ANSR system are in development for Listeria spp., Listeria monocytogenes and non-o157 STECs. As these tests are developed we will seek relevant global approvals to address the needs of our customers. The AOAC approval covers the use of the ANSR system to detect Salmonella in food matrices such as raw ground beef, raw ground turkey, chicken carcass rinse, hot dogs, oat cereal, and sponge or swab samples from stainless steel, plastic, ceramic tile, sealed concrete, and rubber environmental surfaces. Unlike PCR-based methods, ANSR requires only a single reaction temperature, which completely eliminates the time-consuming heating and cooling cycles of older methods. The ANSR system s small benchtop footprint, 16 well capacity and extremely simple test procedure make it an easy fi t in any laboratory workflow. To learn more about the ANSR system: 137

139 Συσχέτιση των ορίων επιβίωσης, ανάπτυξης και έκφρασης γονιδίων καταπόνησης και παθογένειας του Listeria monocytogenes κατά την απόκριση σε όξινη και ωσμωτική καταπόνηση Μακαρίτη Π.Ι., Πρίντεζη Α., Σκανδάμης Ν.Π. Εργαστήριο Ποιοτικού Ελέγχου και Υγιεινής Τροφίμων, Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Ο Listeria monocytogenes αποτελεί έναν τροφιμογενή παθογόνο μικροοργανισμό, ικανό να επιβιώνει υπό αντίξοες συνθήκες, εμφανίζοντας υψηλή προσαρμοστικότητα. Στόχοι της παρούσης μελέτης ήταν: (α) η μοντελοποίηση της επίδρασης ποικίλων συνδυασμών ph και NaCl σε χαμηλή θερμοκρασία στη μεσεπιφάνεια επιβίωσης/μη επιβίωσης του L. monocytogenes μετά από όξινη καταπόνηση, (β) η χαρτογράφηση της απόκρισης του παθογόνου στις παραπάνω συνθήκες σε μοριακό επίπεδο, μέσω μελέτης γονιδίων σχετιζόμενων με καταπονήσεις. Δύο στελέχη του L. monocytogenes (ορότυποι 1/2α και 4b) εμβολιάστηκαν σε θρεπτικό μέσο με διαφορετικές τιμές ph ( ) και NaCl (0-10% κ.ό.), σε συγκέντρωση 10 7 CFU/ml (n=3). Ακολούθησε συντήρηση στους 7 o C, κατά την οποία μελετήθηκε τόσο η ανάπτυξη του παθογόνου, όσο και η επιβίωσή του έναντι ακόλουθης όξινης καταπόνησης (ph 2.0, ρύθμιση με HCl) για 5 λεπτά. Επιπλέον, προσδιορίστηκε η μεταβολή των επιπέδων μεταγραφής διαφορετικών γονιδίων καταπόνησης και παθογένειας με την τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου. Στις οριακές για την ανάπτυξη συνθήκες (ph 5.5, NaCl 8% κ.ό.) παρατηρήθηκε αυξημένη παραλλακτικότητα στην ανάπτυξη των δύο στελεχών L.monocytogenes 6179 (1/2α) και C5 (4b), τα οποία στο τέλος της συντήρησης, παρουσίασαν πληθυσμιακές μειώσεις 4-6 log και 2-3 log αντίστοιχα. Η μεσεπιφάνεια επιβίωσης/μη επιβίωσης μετά από όξινη καταπόνηση δε διέφερε σημαντικά ανάμεσα στα δύο στελέχη. Κατά τη συντήρηση σε εύρη τιμών ph και NaCl 2-4% κ.ό. τα επίπεδα επιβίωσης του παθογόνου ήταν υψηλότερα κατά την όξινη καταπόνηση, ενώ σε ph και NaCl 8-10% κ.ό. παρατηρήθηκε πλήρης αδρανοποίηση του παθογόνου. Μοριακή προσέγγιση της απόκρισης του παθογόνου κατά τη συντήρηση και την υποβολή σε όξινη καταπόνηση οδήγησε στη δημιουργία μίας μεσεπιφάνειας ενεργοποίησης/ απενεργοποίησης γονιδίων που σχετίζονται τόσο με όξινη και ωσμωτική καταπόνηση, όσο και με την παθογένεια. Η μοριακή χαρτογράφηση της φυσιολογικής απόκρισης του L. monocytogenes σε συνδυασμό με τις φαινοτυπικές παρατηρήσεις θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη ενός στοχαστικού εργαλείου πρόβλεψης της δυνατότητας παθογένειας του μικροοργανισμού. 138

140 Μεταβολές στα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των παθογόνων Listeria monocytogenes και Salmonella spp. έπειτα από προσαρμογή τους σε υψηλές συγκεντρώσεις αντιβιοτικών Σταύρος Γ. Μανιός, Ιωάννης Ζώης, Γεώργιος Καμιντζής, Παναγιώτης Ν. Σκανδάμης Εργαστήριο Ποιοτικού Ελέγχου και Υγιεινής Τροφίμων, Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Η μη ορθολογική χρήση αντιβιοτικών ουσιών στα ζώα δύναται να επιφέρει σταδιακή προσαρμογή παθογόνων μικροοργανισμών σε αυτά, καθιστώντας δυσκολότερη την θανάτωσή τους με τις κλασσικές μεθόδους ελέγχου που χρησιμοποιούνται στην βιομηχανία τροφίμων. Σκοπός της έρευνας ήταν η μελέτη της επίδρασης της προσαρμογής στελεχών Listeria monocytogenes και Salmonella sp. σε υψηλές συγκεντρώσεις αντιβιοτικών στην μετέπειτα επιβίωσή τους σε συνθήκες θερμικής, όξινης και αλκαλικής καταπόνησης. Τριάντα στελέχη διαφορετικής προέλευσης από κάθε παθογόνο ταξινομήθηκαν μεταξύ τους ως προς την εγγενή ανθεκτικότητά τους σε 10 αντιβιοτικά (αμπικιλλίνη, αμοξυκιλλίνη/κλαβουλανικό οξύ, σιπροφλοξασίνη, κεφοταξίμη, χλωραμφαινικόλη, ερυθρομυκίνη, γενταμικίνη, ριφαμπικίνη, στρεπτομυκίνη, τετρακυκλίνη), μέσω της μεθόδου διάχυσης δισκίων σε άγαρ. Εξ αυτών, επιλέχθηκαν τρία αντιβιοτικά για Salmonella sp. (ριφαμπικίνη, στρεπτομυκίνη, αμπικιλλίνη) και δύο για L. monocytogenes (ριφαμπικίνη, στρεπτομυκίνη), στα οποία παρουσιάστηκε η μεγαλύτερη διακύμανση στην ανθεκτικότητα. Ακολούθως επιλέχθηκαν ένα ευαίσθητο, ένα ενδιάμεσης ανθεκτικότητας και ένα ανθεκτικό στελέχος σε αυτά τα αντιβιοτικά και προσαρμόστηκαν σε σταδιακά αυξανόμενες συγκεντρώσεις του ιδίου αντιβιοτικού, έως ότου δεν υπήρξε εμφανής ανάπτυξη (υπερανθεκτικότητα). Ακολούθως, τα στελέχη αυτά εκτέθηκαν σε θερμοκρασία 60 o C σε υδατόλουτρο εντός τριχοειδών σωλήνων, και όξινη (ph 3.5) ή αλκαλική (ph 10.5) καταπόνηση σε TSB. Αν και η διακύμανση στην εγγενή ανθεκτικότητα των στελεχών στα αντιβιοτικά ήταν αξιοσημείωτη, δεν υπήρξε συσχέτιση της ανθεκτικότητας αυτής με την προέλευσή τους. Η σταδιακή προσαρμογή των στελεχών των δύο παθογόνων σε υψηλές συγκεντρώσεις ριφαμπικίνης, ευαισθητοποίησε τα στελέχη ενάντια στις διαφορετικές καταπονήσεις στις οποίες εκτέθηκαν, σε σχέση με τις μητρικές καλλιέργειες. Τα υπερανθεκτικά στελέχη Salmonella sp. στην αμπικιλλίνη ή την στρεπτομυκίνη, εμφάνισαν την ίδια ή μειωμένη ανθεκτικότητα σε όλες τις καταπονήσεις. Αντίθετα, παρατηρήθηκε αυξημένη οξεοανθεκτικότητα των υπερανθεκτικών στελεχών L. monocytogenes στην στρεπτομυκίνη. Η παρατεταμένη έκθεση του παθογόνου L. monocytogenes σε αντιβιοτικές ουσίες μπορεί να προκαλέσει ανάπτυξη μηχανισμών διασταυρούμενης προστασίας ενάντια σε συνθήκες οξύτητας, αυξάνοντας τον κίνδυνο επιβίωσής του σε τρόφιμα χαμηλού ph ή στα οξέα του στομάχου. 139

141 Χρήση Ελληνικών Φυτών Για Καταπολέμηση Παθογόνων Στο Κρέας Α. Λαμπιδώνης 1 και Μ. Πολίτης 2 1 Υπεύθυνος Μοριακών Αναλύσεων και Έρευνας - Food Allergens Laboratory, Ρέθυμνο, Κρήτη 2 Διευθυντής Εργαστηρίου Κρήτης - Food Allergens Laboratory, Ρέθυμνο, Κρήτη Περίληψη Το κρέας αποτελεί το πιο βασικό τρόφιμο στη διατροφή του ανθρώπου κι αυτό γιατί περιέχει μια μεγάλη ποικιλία σημαντικών θρεπτικών συστατικών, απαραίτητων για την ανάπτυξη του ανθρώπινου οργανισμού. Οι μικροοργανισμοί που μπορούν να ανευρεθούν και συνδέονται άμεσα με το κρέας είναι το Escherichia coli, το οποίο ανήκει στα κολοβακτηριοειδή, αποτελεί μόνιμο ξενιστή της εντερικής χώρας των ζώων και μπορεί να επιμολύνει το κρέας κατά την σφαγή καθώς και η Salmonella, ένα ενδοκυτταρικό βακτηρίδιο που αποτελεί το συχνότερο αίτιο τροφογενών λοιμώξεων, προκαλώντας τροφική δηλητηρίαση με γαστρεντερικά συμπτώματα. Παράλληλα, η επιμόλυνση του κρέατος και των προϊόντων του με Staphylococcus aureus (χρυσίζων σταφυλόκοκκος) δύναται να οδηγήσει σε σοβαρά περιστατικά όπως κεφαλαλγία, μυϊκοί σπασμοί, αιφνίδιες μεταβολές της αρτηριακής πίεσης και του σφυγμού, ενώ η Listeria monocytogenes, η οποία ανιχνεύεται κυρίως σε νωπά και κατεψυγμένα κρέατα και πουλερικά προκαλεί σε ανοσοεπαρκή ενήλικα άτομα κυρίως γαστρεντερικά συμπτώματα, ενώ σε ανοσοκατεσταλμένους, ηλικιωμένους και μικρά παιδιά, μηνιγγίτιδα, εγκεφαλίτιδα ενώ ορισμένες φορές επιφέρει και το θάνατο. Στόχος της παρούσας εργασίας αποτελεί η διερεύνηση των ευεργετικών ιδιοτήτων των φύλλων χαρουπιάς, του υδατικού εκχυλίσματος σκόρδου σε κρέατα διαφόρων κατηγοριών αλλά και των αντιμικροβιακών ουσιών που βρίσκονται στο πράσινο τσάι και κυρίως στο τσάι του βουνού. Εισαγωγή Στις μέρες μας το γενικότερο κλίμα ανασφάλειας, τα συνεχή διατροφικά σκάνδαλα και οι καθημερινές εκπτώσεις στα είδη διατροφής δικαίως εντείνουν τις αμφιβολίες του καταναλωτή για την ποιότητα των προϊόντων που κυκλοφορούν στην αγορά. Επιπλέον, η ευαισθητοποίηση του κοινού για το κρέας και τους συναφείς κινδύνους για την υγεία, όπως οι θανατηφόρες βακτηριακές λοιμώξεις, έχει προκαλέσει μεγάλη ανησυχία και αλλαγές στις διατροφικές συνήθειες πολλών ανθρώπων. Η βασική αιτία του μειωμένου χρόνου ζωής των συσκευασμένων προϊόντων είναι η παρουσία μικροοργανισμών, οι οποίοι προκαλούν αλλοιώσεις και μειώνουν το χρόνο ζωής αυτών, παρ όλα τα μέτρα που ενδέχεται να λαμβάνει ο τυποποιητής (συντηρητικά, τροποποιημένες ατμόσφαιρες, ρύθμιση οξύτητας pη κλπ). Οι μικροοργανισμοί που εξετάζονται για να αποφανθούμε αν ένα προϊόν μπορεί να κυκλοφορήσει ασφαλώς ακόμη στην αγορά είναι κυρίως τα παρακάτω: Το Escherichia coli, το οποίο ανήκει στα κολοβακτηριοειδή και αποτελεί μόνιμο ξενιστή της εντερικής χώρας των ζώων και μπορεί να επιμολύνει το κρέας κατά την σφαγή. Το E. coli O157:H7 είναι ένα σπάνιο στέλεχος, το οποίο παράγει μεγάλες ποσότητες μιας δυνητικά τοξίνης που σχηματίζεται εντός και προκαλεί σοβαρή βλάβη στην επιφάνεια του εντέρου. Αποτέλεσμα αυτού είναι μία ασθένεια που ονομάζεται «αιμορραγική κολίτιδα» και η οποία χαρακτηρίζεται από αιματώδη διάρροια. Το μικρόβιο αυτό καταστρέφεται κατά το μαγείρεμα. 140

142 Η Salmonella είναι ενδοκυτταρικό βακτηρίδιο (προέρχεται από βλεφαριδικά αντιγόνα, βακτηρίδια gram «-»), ενώ αποτελεί το συχνότερο αίτιο τροφογενών λοιμώξεων, με αυξανόμενη συνεχώς συχνότητα. Μπορεί να ανευρεθεί στην εντερική χώρα των ζώων (βοοειδή, χοιρινά, κλπ), των πουλερικών, των σκύλων, της γάτας και πολλών άλλων θερμόαιμων οργανισμών, προκαλώντας τροφική δηλητηρίαση με γαστρεντερικά συμπτώματα κατά κύριο λόγο. Υπάρχουν περίπου είδη Salmonella. Το μαγείρεμα καταστρέφει τη Salmonella, όχι όμως και η κατάψυξη. Η Salmonella για να προκαλέσει ασθένεια πρέπει να φαγωθεί. Για το λόγο αυτό πρέπει να αποφεύγεται η τοποθέτηση νωπού κρέατος, πουλερικών και προϊόντων αυτών σε ράφια πάνω από μαγειρεμένα φαγητά ή σαλάτες. Ο Staphylococcus aureus (χρυσίζων σταφυλόκοκκος) μπορεί να ανευρεθεί στα χέρια, στη μύτη ή στο λάρυγγα μας. Η επιμόλυνση του κρέατος και των προϊόντων του οφείλεται κυρίως στους εργαζομένους με το κρέας. Ο μικροοργανισμός αυτός κατά την ανάπτυξή του, παράγει μια τοξίνη, η κατανάλωση της οποίας προκαλεί ασθένεια (διάρροια, εμετός). Σε σοβαρά περιστατικά μπορεί να παρατηρηθούν κεφαλαλγία, μυϊκοί σπασμοί, αιφνίδιες μεταβολές της αρτηριακής πίεσης και του σφυγμού. Η Listeria monocytogenes βρίσκεται στο έδαφος, στο νερό, στα φυτά και σε πάνω από 40 ζωικά είδη. Επίσης, εμφανίζεται σε νωπά και κατεψυγμένα κρέατα και πουλερικά καθώς και σε αποστραγγίσεις πατώματος, στάσιμα νερά, υπολείμματα, επιφάνειες επαφής με τρόφιμα, οικιακά ψυγεία, πετσέτες κουζίνας και σκουπιδοτενεκέδες. Η λιστερίωση, ασθένεια για την οποία είναι υπεύθυνη, προκαλεί σε ανοσοεπαρκή ενήλικα άτομα κυρίως γαστρεντερικά προβλήματα, ενώ σε ανοσοκατεσταλμένους, ηλικιωμένους και μικρά παιδιά, μηνιγγίτιδα, εγκεφαλίτιδα, ενώ μπορεί σε ορισμένες περιπτώσεις να επιφέρει και το θάνατο. Η ίδια καταστρέφεται με το μαγείρεμα. Για τη Listeria monocytogenes έχει καθορισθεί μηδενική ανοχή για βραστά έτοιμα για φάγωμα προϊόντα (π.χ. λουκάνικα Φρανκφούρτης κ.λ.π). Στα παραπάνω πρέπει να προσθέσουμε και το καμπυλοβακτηρίδιο, το οποίο μεταδίδεται στον άνθρωπο μέσω των πουλερικών και μπορεί να προκαλέσει τροφική δηλητηρίαση, ενώ σπανίως οδηγεί και σε παράλυση. Όπως προκύπτει από τη δεύτερη ετήσια κοινοτική έκθεση της Ευρωπαϊκής Αρχής για την Ασφάλεια των Τροφίμων (EFSA) σχετικά με τις μολυσματικές ασθένειες των ζώων που μεταδίδονται στους ανθρώπους (ζωοανθρωπονόσους), το 2005 η καμπυλοβακτηρίωση ήταν η νόσος με την υψηλότερη συχνότητα αναφοράς. Ειδικότερα, τα καταγεγραμμένα περιστατικά καμπυλοβακτηρίωσης σε ανθρώπους αυξήθηκαν κατά 7,8% σε σχέση με το 2004, την ίδια στιγμή που οι αντίστοιχες καταγεγραμμένες αναφορές σαλμονέλωσης στην Ευρωπαϊκή Ένωση μειώθηκαν κατά 9,5%. Επιπλέον, στην τελευταία αναφορά της Ευρωπαϊκής Ένωσης για τα ανασφαλή προϊόντα σημειώθηκε ο υψηλότερος αριθμός ανακλήσεων από παρουσία καμπυλοβακτηριδίου σε πουλερικά στη Γαλλία, Δανία, Γερμανία και Πολωνία. Μέθοδοι ανίχνευσης - τρόποι αντιμετώπισης Η ποιοτική αλλά και ποσοτική, εν δυνάμει, ανίχνευση των ανωτέρω παθογόνων στηρίζεται πλέον σε μοριακές τεχνικές λόγω της αλματώδους ανάπτυξης του τομέα της Μοριακής Βιολογίας. Οι μοριακές τεχνικές κατακτούν όλο και περισσότερο έδαφος στις μεθόδους ελέγχου παθογόνων και για το σκοπό αυτό η Ευρωπαϊκή Επιτροπή Τυποποίησης (CEN) έχει συστήσει ομάδα εργασίας (Tag3) για επικύρωση ISO αναλυτικών μεθόδων με μοριακές τεχνικές. Οι συναντήσεις της ομάδας 141

143 πραγματοποιούνται κάθε εξάμηνο, ενώ Εκπρόσωπος της Ελλάδας σε αυτή την επιτροπή είναι ο Τεχνικός Διευθυντής του Εργαστηρίου Γ. Σειραγάκης Χημικός Μ.Sc. Το εργαστήριο "Food Allergens Laboratory" στο Ρέθυμνο είναι το μοναδικό στην Ελλάδα που ανιχνεύει το καμπυλοβακτηρίδιο σε πουλερικά και κρέατα καθώς και άλλα παθογόνα, με μοριακές τεχνικές (PCR), οι οποίες παρέχουν τη δυνατότητα εξαγωγής του αποτελέσματος την ίδια ημέρα και όχι σε πέντε ημέρες που απαιτεί η κλασική μικροβιολογία. Από τον Σεπτέμβριο του 2012 έχει ξεκινήσει Ερευνητικό Πρόγραμμα, επιδοτούμενο από την Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας για την ανίχνευση παθογόνων σε τρόφιμα με μοριακές τεχνικές. Επιστημονικός υπεύθυνος του προγράμματος είναι ο Δρ. Αντώνης Λαμπιδώνης, Γεωπόνος, MSc, PhD. Αποτελεί το τέταρτο κατά σειρά ερευνητικό πρόγραμμα για μοριακές τεχνικές που διεξάγεται στο εργαστήριο ενώ είναι στο στάδιο της ολοκλήρωσης μεγάλο ερευνητικό πρόγραμμα (ΕΡΑΝΕΤ) για τις αντιοξειδωτικές ιδιότητες που έχει το τσάι του βουνού. Στο πρόγραμμα συνεργάζονται 6 Ευρωπαϊκές χώρες με επιστημονικό υπεύθυνο από πλευράς εργαστηρίου τον Ανδρέα Βαρλάμο Χημικό Μηχανικό Μ.Sc, πρόεδρο του Stakeholders Platform της Ευρωπαϊκής Επιτροπής Ασφάλειας Τροφίμων. Εκτός από το ανωτέρω πρόγραμμα έχει ολοκληρώσει ένα και διεξάγεται ένα ακόμη ερευνητικό πρόγραμμα για το χαρούπι σε συνεργασία με το Γενικό Χημείο Κράτους της Κύπρου, το Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών και το ΑΤΕΙ Θεσσαλονίκης, ενώ αναμένεται η αξιολόγηση ενός νέου προγράμματος για το τσάι του βουνού στα πλαίσια του Προγράμματος Ανάπτυξης Βιομηχανικής Έρευνας και Τεχνολογίας Ο τρόπος προφύλαξης από τα παραπάνω παθογόνα έγκειται στην έμφαση που οφείλει να δίνει ο καταναλωτής στις οδηγίες χειρισμού των προϊόντων, π.χ. «διατήρηση στο ψυγείο» ή «κατανάλωση πριν από» και να τις τηρεί αυστηρά. Το τελευταίο όμως διάστημα έχουν αναφερθεί στη διεθνή βιβλιογραφία σειρά δημοσιεύσεων για καταπολέμηση των ανωτέρω μικροοργανισμών με χρήση ελληνικών φυτών όπως η χαρουπιά, το σκόρδο και το τσάι του βουνού. Επιστημονικό άρθρο που δημοσιεύτηκε το 2012 από Ιταλούς ερευνητές του Πανεπιστημίου του Κάλιαρι αναφέρει ότι η χρήση εκχυλισμάτων φύλλων χαρουπιάς καταπολεμά την ανάπτυξη Listeria αλλά και άλλων τροφογενών παθογόνων σε πολύ σημαντικό βαθμό λόγω της υψηλής συγκέντρωσης του γαλλικού, μαλλικού οξέος, κατεχινών και των ανθοκυανών που περιέχουν. Επίσης, για την καταπολέμηση της Salmonella, έχει δημοσιευθεί πρόσφατα άρθρο από Τυνήσιους και Σαουδάραβες ερευνητές που μελέτησαν την επίδραση υδατικού εκχυλίσματος σκόρδου σε κρέατα διαφόρων κατηγοριών όπως μοσχαρίσιο, χοιρινό, κοτόπουλο και αιγοπρόβειο. Η αντιμικροβιακή ουσία που περιέχει το σκόρδο σε μεγάλες συγκεντρώσεις είναι η allicin, εξαιτίας της οποίας καταπολεμούνται επιτυχώς τα περισσότερα είδη σαλμονέλλας μεταξύ των οποίων και η Salmonella enteritidis για την οποία πρόσφατα η Ευρωπαϊκή Ένωση εξέδωσε τον κανονισμό 517/2011 για παρακολούθησή της στα πουλερικά. Για τον Σταφυλόκοκκο διεξήχθη εργασία Ιαπώνων επιστημόνων που μελέτησαν την επίδραση τανινών (βρίσκονται σε ικανοποιητικές συγκεντρώσεις στο ελληνικό τσάι του βουνού) για την καταπολέμηση του μικροοργανισμού. Οι αντιμικροβιακές ουσίες που βρίσκονται στο πράσινο τσάι και στο τσάι του βουνού είναι το τανικό, γαλλικό και ελαγικό οξύ. Η δράση τους είναι πολύ αποτελεσματική έναντι του σημαντικότερου από τα είδη σταφυλόκοκκων, Staphylococcus aureus. Το εργαστήριο Food Allergens Laboratory θα αναπτύξει σειρά πειραμάτων με μοριακές τεχνικές, εξετάζοντας την αντιμικροβιακή δράση τόσο του φύλλου χαρουπιάς όσο και του σκόρδου και του 142

144 τσαγιού του βουνού σε κρέας και προϊόντα κρέατος, σε επίπεδο DNA, χρησιμοποιώντας υδατικά και μεθανολικά εκχυλίσματα φύλλων των υπό εξέταση φυτών. Abstract Meat is the most basic food in the human diet and that's because it contains a wide variety of important nutrients necessary for the growth and development of the human organism. The Microorganisms that can be found and are directly linked to meat is Escherichia coli, a Gramnegative, facultative anaerobic, rod-shaped bacterium. Most E. coli strains are harmless, but some serotypes can cause serious food poisoning in humans, and are occasionally responsible for product recalls due to food contamination. Salmonella is a Gram-negative, non-spore-forming, predominantly motile enterobacteria. Salmonella is the most common cause of foodborne infections and can be transferred between humans and nonhuman animals. Furthermore, contamination of meat products with the bacterium Staphylococcus aureus can lead to serious incidents such as headache, changes in blood pressure and pulse, while Listeria monocytogenes, which is mainly detected in poultry, in fresh and frozen meats, causes gastrointestinal symptoms in immunocompetent adults and meningitis, encephalitis in immunocompromised, elderly people and young children. The aim of this work is to investigate the beneficial properties of carob leaves, the effect of garlic extract in different meat categories and the antimicrobial properties found in green tea and especially in mountain tea. Βιβλιογραφία George Siragakis Pathogens in Food by PCR, Bio, Greek Biotechnology Association Journal, Vol 26 pp H.Akijama. K.Fujii, O.Yamasaki, T.Oono & K.Iwatsuki Antibacterial action of several tannins against S. aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, Vol H. Belguith, F. Kthiri, A. Chati, A. Abu Sofah, J. Ben Hamida and A. Ladoulsi Inhibitory effect of aqueous garlic extract (Allium sativum) on some isolated Salmonella serovars African Journal of Microbiology Research Vol. 4(5), pp Lance R. Peterson, Axel Dalhoff Towards targeted prescribing: will the cure for antimicrobial resistance be specific, directed therapy through improved diagnostic testing? Journal of Antimicrobial Chemotherapy 53, M.Christofakis, G.Siragakis Rapid Testing for Campylobacter in Poultry, PCR Advantages. Book of Proceedings 1st Mediterranean Summit of World Science Poultry Association pp (ISBN ). Nadhem Aissani, Valentina Coroneo, Sami Fattouch, and Caboni Pierluigi Inhibitory Effect of Carob (Ceratonia siliqua) Leaves J. Agric. Food Chem. 2012, 60, Rijpens NP, Herman LMF Molecular methods for identification and detection of bacterial food pathogens. J AOAC Int. 85: Α. Λαμπιδώνης, Γ. Σειραγάκης Χρήση ελληνικών φυτών για καταπολέμηση παθογόνων στο κρέας. Περιοδικό Meat Point Νοέμβριος Σελ Γ. Σειραγάκης, Λιστέρια: Ένας κίνδυνος που μπορεί να ελεγχθεί. Περιοδικό Meat Point Δεκέμβριος 2007 Σελ Γ. Σειραγάκης, Ο νέος κανονισμός 1881/2006 για επιμολυντές σε κρέας & προϊόντα κρέατος Food Tech Vol. 3, pp ( 143

145 Βιοτεχνολογική παραγωγή πτητικών οσμηρών ενώσεων από πούλπα πορτοκαλιού με τον ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae σε ζύμωση στερεής κατάστασης Σοφία Λάλου, Αδαμαντίνη Παρασκευοπούλου, Φανή Μαντζουρίδου* Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, * fmantz@chem.auth.gr ABSTRACT Most flavour-active compounds are produced via chemical synthesis or extraction from natural sources. Nowadays, many producers and consumers prefer natural food constituents over synthetic ones. Natural aromas produced by microorganisms are recognized as natural (1). However, the rising trend of bioflavour synthesis by microorganisms is hindered by the high manufacturing costs, partially attributed to the cost of the starting material. To overcome this limitation, solid state fermentation (SSF) is used as a cheap technology for the cultivation of yeasts and fungi in low cost substrates for the production of aroma compounds (2). In the present study, orange pulp was employed as a low-cost, rich in fermentable sugars substrate for the production of flavour-active compounds by Saccharomyces cerevisiae via SSF. The parameters such as cell viability and nutrient assimilation in SSF were assessed in order to evaluate the convenience of the yeast cells for growth in orange pulp using SSF. Gas chromatography (GC-MS/GC-FID) analysis was employed to monitor changes in the composition of flavour-active compounds during the fermentation processes. The results showed that the SSF of orange pulp by yeast favors the de novo synthesis of volatile esters in significant concentrations (mg/kg wet pulp) for the case of isoamyl acetate (48.69), ethyl hexanoate (154.17), ethyl octanoate (6.33), ethyl decanoate (9.31), phenylethyl acetate (4.61) and ethyl dodecanoate (25.21). These results, which demonstrate the potential of the volatile ester production by SSF from orange peel, could be of interest to possible, future industrial applications. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι οσμηρές πτητικές ενώσεις, οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στην οργανοληπτική αποδοχή πολλών προϊόντων, απομονώνονται από φυσικές πηγές, κυρίως φυτά, ή συντίθενται χημικά. Η ευαισθητοποίηση των καταναλωτών ως προς τη χρήση των συνθετικών προσθέτων έχει οδηγήσει σε μια συνεχώς αυξανόμενη ζήτηση φυσικών συστατικών τροφίμων. Η τάση αυτή σε συνδυασμό με τα μειονεκτήματα των άλλων μεθόδων παραγωγής αρωματικών υλών έχει στρέψει τόσο τους επιστήμονες όσο και τη βιομηχανία στην αναζήτηση εναλλακτικών πηγών μέσω της «λευκής» βιοτεχνολογίας (1). Η βιοτεχνολογική παραγωγή αρωματικών υλών περιλαμβάνει διεργασίες φιλικές προς το περιβάλλον, οι οποίες παρουσιάζουν, σε σχέση με τις κλασσικές μεθόδους, υψηλή 144

146 εκλεκτικότητα (στερεο-, χημειο-, τοπο-) και απόδοση, και δυνατότητα χρήσης χαμηλού κόστους ακατέργαστων πρώτων υλών και ανανεώσιμων πηγών. Στη βιομηχανία τροφίμων παράγονται σημαντικές ποσότητες αποβλήτων με σοβαρά προβλήματα στην διαχείριση τους. Πολλά από τα απόβλητα αυτά είναι πλούσια σε θρεπτικά συστατικά με αποτέλεσμα να είναι δυνατή η αξιοποίηση τους στη βιοτεχνολογική παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Στην κατεύθυνση αυτή εφαρμόζεται η ζύμωση στερεής κατάστασης (SSF), η οποία έχει κεντρίσει το ενδιαφέρον πολλών ερευνητών για την παραγωγή οσμηρών πτητικών ενώσεων (2). ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η αξιοποίηση της πούλπας πορτοκαλιού για την παρασκευή οσμηρών πτητικών ενώσεων με τον food grade ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae σε SSF. Η πούλπα του πορτοκαλιού είναι ένα παραπροϊόν της επεξεργασίας πορτοκαλοχυμού, πλούσιο σε θρεπτικά συστατικά (απλά σάκχαρα, πολυσακχαρίτες, οργανικό άζωτο) που το καθιστούν κατάλληλο υπόστρωμα για την χρησιμοποίηση του σε βιοτεχνολογικές διεργασίες (3-5). ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Αρχικά εξετάστηκε η σύσταση της πούλπας πορτοκαλιού σε θρεπτικά συστατικά όπως περιγράφεται από τους Mantzouridou και συν. (4). Ο μικροοργανισμός που χρησιμοποιήθηκε ήταν η ζύμη οινοποίησης Saccharomyces cerevisiae var. cerevisiae (Vitilevure MT), ευγενική προσφορά του οινοποιείου Τσάνταλη (Χαλκιδική, Ελλάδα). Η προετοιμασία του υποστρώματος παραγωγής έγινε ως εξής: σε φιάλη 250 ml που περιείχε 45 g υγρής πούλπας πορτοκαλιού, ακατέργαστης ή θερμικά αποστειρωμένης (121 o C, 30 min), προστέθηκε υδατικό διάλυμα των παρακάτω θρεπτικών συστατικών ώστε αυτά να απαντώνται σε τελική συγκέντρωση (g/ kg υγρής ύλης) ίση με 1,0 (KH 2 PO 4 ), 1,0 [(NH 4 ) 2 SO 4 ], 0,4 (εκχύλισμα ζύμης) και 5,0 (MgSO 4 ). Η τελική περιεκτικότητα του υποστρώματος σε υγρασία ήταν ίση με 75% w/w. O εμβολιασμός του στερεού υποστρώματος έγινε με προσθήκη 5% (v/w) εναιωρήματος κυττάρων ζύμης (6,04 x10 7 cfu/ml). Η ανάπτυξη του μικροοργανισμού εκτιμήθηκε με καταμέτρηση του αριθμού των ζώντων κυττάρων (cfu/g υγρής πούλπας) σε τρυβλία με Yeast Peptone Dextrose (YPD) agar. Η κατανάλωση ολικών σακχάρων και αζώτου μετρήθηκε όπως περιγράφεται από τους Lalou και συν. (5). Ο χαρακτηρισμός της σύστασης του παραγόμενου πτητικού κλάσματος και η ποσοτική εκτίμηση οσμηρών πτητικών ενώσεων με εμπορικό ενδιαφέρον πραγματοποιήθηκε με την χρήση GC/MS και GC/FID μετά την παραλαβή τους με την τεχνική της εκχύλισης με διχλωρομεθάνιο και συμπύκνωση τους σε στήλη Vigreaux (5). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Από τα αποτελέσματα φάνηκε ότι η πούλπα πορτοκαλιού είναι ένα πλούσιο σε θρεπτικά συστατικά υπόστρωμα (ολικά διαλυτά σάκχαρα, 29, 90 ± 0,60% w/w και ολικές πρωτεΐνες, 12,5 ± 0,10% w/w) 145

147 που το καθιστά κατάλληλο για την αξιοποίηση του ως έχει σε SSF. Το πτητικό του κλάσμα αποτελείται σχεδόν μόνο από τερπένια με κυριότερο το λεμονένιο (93,44% του συνόλου των κυριότερων πτητικών συστατικών). Η υψηλή περιεκτικότητά του υποστρώματος σε λεμονένιο αναμένεται να επηρεάσει αρνητικά την ανάπτυξη του ζυμομύκητα, λόγω της αντιμικροβιακής του δράσης. Για το λόγο αυτό, σε προκαταρκτικά πειράματα, έγινε εκτίμηση της βιωσιμότητας των κυττάρων σε ακατέργαστη και θερμικά αποστειρωμένη πούλπα πορτοκαλιού (Διάγραμμα 1). Ως υπόστρωμα αναφοράς χρησιμοποιήθηκε συνθετικό θρεπτικό μέσο (4). Η καλύτερη ανάπτυξη των κυττάρων στην θερμικά αποστειρωμένη πούλπα σε σχέση με την ακατέργαστη αποδόθηκε τόσο στη μείωση της περιεκτικότητας της πρώτης σε λεμονένιο (0,630 ± 0,003 έναντι 1,4 ± 0,05 g/100 g ξηρής πούλπας, αντίστοιχα), λόγω μερικής εξάτμισης του λεμονενίου, όσο και στην αδρανοποίηση της γηγενούς χλωρίδας της πρώτης ύλης. Διάγραμμα 1. Κινητική της βιωσιμότητας κυττάρων S. cerevisiae σε θερμικά αποστειρωμένη και ακατέργαστη πούλπα πορτοκαλιού με ζύμωση στερεής κατάστασης, και σε συνθετικό υπόστρωμα YPD. Η ικανότητα του μικροοργανισμού για de novo σύνθεση αρωματικών υλών κρίθηκε ικανοποιητική παρά την παρουσία του λεμονενίου, επιβεβαιώνοντας την αρχική υπόθεση για τη δυναμική της θερμικά κατεργασμένης πούλπας πορτοκαλιού ως ένα υπόστρωμα παραγωγής αρωματικών υλών με SSF. Η αεροχρωματογραφική ανάλυση ανέδειξε τη σύνθεση του οξικού εστέρα της ισοαμυλικής αλκοόλης (48,69 mg/ Kg υγρής πούλπας, 72h), του εξανοϊκού αιθυλεστέρα (154,17 mg/ Kg υγρής πούλπας, 48h), του οκτανοϊκού αιθυλεστέρα (6,33 mg/ Kg υγρής πούλπας, 72h), του δεκανοϊκού αιθυλεστέρα (9,31 mg/ Kg υγρής πούλπας, 72h), του οξικού φαινυλαιθυλεστέρα (4,61 mg/ Kg υγρής πούλπας, 72h) και του δωδεκανοϊκού αιθυλεστέρα (25,21 mg/ Kg υγρής πούλπας, 72h) (Διάγραμμα 2). Η αρχική σύσταση του πτητικού κλάσματος της πούλπας πορτοκαλιού εμφάνισε μικρές διακυμάνσεις κατά την πορεία της ζύμωσης που μπορεί να οφείλονται στην ικανότητα του S.cerevisiae να βιομετατρέπει κάποια τερπένια σε άλλες ενώσεις. Συγκεκριμένα, στο τέλος της 146

148 διεργασίας δεν ανιχνεύθηκε η 1-οκτανόλη, η καρβεόλη και η γερανιόλη ενώ παρατηρήθηκε μικρή μείωση στη συγκέντρωση του λεμονενίου και αύξηση στη συγκέντρωση της α-τερπινεόλης, του α πινενίου και του β-φελλανδρενίου. Διάγραμμα 2. Κινητική της de novo σύνθεσης αρωματικών υλών με ζύμωση στερεής κατάστασης θερμικά αποστειρωμένης πούλπας πορτοκαλιού με κύτταρα S.cerevisiae. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η πούλπα πορτοκαλιού είναι ένα πλούσιο σε θρεπτικά συστατικά απόβλητο γεωργικής βιομηχανίας το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα για βιοτεχνολογικές διεργασίες ακόμα και με ελάχιστη επεξεργασία. Η παραγωγή οσμηρών πτητικών εστέρων με εμπορικό ενδιαφέρον σε σημαντικές ποσότητες είναι δυνατή μέσω της de novo σύνθεσης από τα κύτταρα του S. cerevisiae καλλιεργούμενα στο παραπάνω απόβλητο με SSF. Η αλλαγή κλίμακας (upscaling) της βιοδιεργασίας με τη χρήση κατάλληλου βιοαντιδραστήρα θα μπορούσε να οδηγήσει σε μελλοντική εφαρμογή τηςδιεργασίας σε πιλοτική κλίμακα. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ (1) Schrander, J. Flavors and Fragnaces, R.G. Berger (Ed.), Springer, Heidelberg, Germany, 2007, , (2) Laufenberg, G., Kunz, B., Nystroem, M. Bioresource Technology, 2003, 87: , (3) Plessas, S., Bekatorou, A., Koutinas, A.A., Soupioni, M., Banat, I.M., Marchant, R.. Bioresource Technology, 2007, , (4) Mantzouridou F., Paraskevopoulou, A. Food and Bioprocess Technology, DOI: /s (5) Lalou S, Mantzouridou F, Paraskevopoulou A, Bugarski B, Levic S, Nedovic V. Applied Microbiology and Biotechnology. 2013, DOI: /s

149 148

150 ΑΝΑΡΤΗΜΕΝΕΣ ΕΡΓΑΣΙΕΣ 149

151 150

152 Εκτίμηση της ποικιλότητας εγχώριων ποικιλιών φακής (Lens culinaris Medik.) με τη χρήση μοριακών δεικτών Φώτιος Κωμαΐτης, Πηνελόπη Μπεμπέλη Εργαστήριο Βελτίωσης Φυτών και Γεωργικού Πειραματισμού, Τμήμα Επιστήμης Φυτικής Παραγωγής, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Περίληψη Η μελέτη της γενετικής τους ποικιλότητας είναι προϋπόθεση για προγράμματα διατήρησής και αξιοποίησης εγχώριων ποικιλιών. Μελετήθηκε η ποικιλότητα 11 ξένων και 23 ελληνικών εγχώριων ποικιλιών φακής (Lens culinaris Mediκ.) με μοριακούς δείκτες RAPD (Random Amplified Polymorphic) και ISSR (Inter-Sequence Simple Repeats). Πέντε ISSR και πέντε RAPD δείκτες έδωσαν 43 και 44 ζώνες αντίστοιχα από τις οποίες οι 34 και οι 30 ήταν πολυμορφικές. Η γενετική ομοιότητα για όλα τα ζεύγη των ποικιλιών υπολογίστηκε με βάση τους συντελεστές Jaccard, Dice και Simple Matching. Η ανάλυση των συστάδων πραγματοποιήθηκε με την μέθοδο UPGMA. Με συνδυασμό των μοριακών δεικτών ο συντελεστής ομοιότητας Jaccard κυμάνθηκε από 0,457 έως 0,836. Οι διάφορες ομαδοποιήσεις ήταν σχεδόν ίδιες για τους συντελεστές ομοιότητας των Jaccard και Dice, ενώ διέφεραν για το Simple Matching στα δενδρογράμματα που προέκυψαν από τους RAPD. Από την ανάλυση των τριών κύριων συντεταγμένων παρατηρήθηκαν υψηλά ποσοστά παραλλακτικότητας. Στο διαχωρισμό των δειγμάτων, πιο χρήσιμη φάνηκε η τεχνική των ISSR δεικτών, αλλά καλύτερα αποτελέσματα έδωσε η εφαρμογή και των δύο τεχνικών. Προσοχή θα πρέπει να δοθεί στις ποικιλίες φακής: της Κεφαλλονιάς, της Καστοριάς, της Ροδόπης που διέφεραν από τις άλλες, και αυτές από τα Γιαννιτσά, και την Εγλουβή, Πιθανός χαρακτηρισμός τους ως Π.Ο.Π. ή Π.Γ.Ε. μπορεί να δώσει σημαντικά ενισχυμένο εισόδημα στους αγρότες. Από τα αποτελέσματα διαφάνηκαν συσχετισμοί μεταξύ των χωρών καταγωγής των ποικιλιών. Υπήρχε γενετική ομοιότητα των ποικιλιών που προέρχονταν από την Τουρκία με αυτές της Αιγύπτου, αλλά και μεταξύ αυτών από Αλβανία και Βραζιλία. Αξιοπρόσεκτη ήταν και η σχέση των καταχωρήσεων από την Αργεντινή με την καταχώρηση από την Εγλουβή, αλλά και ο σαφής διαχωρισμός της ποικιλίας αιθιοπικής καταγωγής, από όλα τα εξεταζόμενα δείγματα. Με κάποιες εξαιρέσεις διαπιστώθηκε η τάση των ελληνικών ποικιλιών φακής να ομαδοποιούνται μαζί σε ομάδες διαφορετικές από αυτές των ξένων. 151

153 Detection of genetically modified maize lines in packed foodstuffs containing processed corn Dimosthenis Kizis *, Christina Gallou, Dimitra Houhoula, and Stamatis Koussissis Department of Food Technology, Faculty of Food Technology and Nutririon, Technological Educational Institute of Athens, Ag. Spyridona Str., Athens, Greece * Author for correspondence: dimosthenis_kizis@yahoo.gr Abstract A study on the detection of the genetically modified maize lines Bt176 Maximizer TM maize and MON810 YieldGard TM corn in packed foods was conducted. The aim of the study was to monitor the presence of genetically modified organisms (GMO) in food products that do not declaire information for GMO presence or absence. A total of 57 packed food samples sold commercially in Greece during the years 2009 and 2010 were tested by use of the polymerase chain reaction (PCR). Samples were initially assayed for the presence of corn flour using the maize ivr1 gene as target. Validated primer pairs utilised to test for presence of the cry1 gene (Cry03-Cry04 for detection of cry1 in the Bt176 maize line and MON810F-MON810R for detection of cry1ab in the MON810 maize line), were subsequently used for qualitative detection of the two specific events in all food samples. Results showed that from the 57 assayed samples 46 were found to contain corn as an ingredient. One sample was found positive for Bt176 and none was positive for MON810. Verification for GMO presence was also performed by use of a commercial quantitative PCR (qpcr) kit, targeting the cauliflower mosaic virus 35S (CaMV 35S) promoter and universal genomic plant sequences. Olive fruit respiration study under hypoxia and hyperoxygenation conditions Dimosthenis Kizis 1, Dimitra Houhoula 1, Georgios Banilas 2, Spyros Christidis 1, Leoni Livaditi 1 and Stamatis Koussissis 1,* 1 Department of Food Technology, Faculty of Food Technology and Nutririon, Technological Educational Institute of Athens, Ag. Spyridona Str., Athens, Greece 2 Department of Oenology and Beverage Technology, Faculty of Food Technology and Nutririon, Technological Educational Institute of Athens, Ag. Spyridona Str., Athens, Greece * Author for correspondence: skoussis@teiath.gr 152

154 Abstract The aerobic metabolism and gaseous metabolite production of olive fruits were studied under altered oxygen concentrations spanning from hypoxia to hyperoxygenation. The study was conducted in a closed environment system under strictly controlled conditions. Gaseous metabolite detection and quantification were determined using a GC TCD method of analysis with sufficient resolving power, sensitivity and repeatability. The experimental data were processed following standard enzyme kinetic studies and metabolic control analysis. The results suggest that oxygen uptake from olive fruits is feasible in a wide range of oxygen concentrations much higher than this of the air, following an non Michaelis Menten kinetic pattern. In situations of oxidative stress (rapid change of oxygen concentration), either as hypoxia or hyperoxygenation, ethylene is produced which in turn stabilizes the oxygen uptake rate of olive fruit. Neither oxygen altered concentrations nor ethylene production were found to have an effect on olive fruit stomata closure. It is proposed that ethylene in situations of hyperoxygenation stress acts possibly as an inhibitor of the oxygen catabolism. 153

155 Quantification of parvalbumin in commercially important seafood species, using real time PCR D.P. Houhoula, P. Dimitriou, G. Mengezi, V.R. Kyrana, V.P. Lougovois Department of Food Technology, Technological Educational Institution of Athens, Agiou Spyridonos, Egaleo, Greece Abstract Seafood are among the eight major groups of allergens that are believed to account for more than 90% of all food allergies. Parvalbumin, a low molecular weight (12kDa) calcium-binding, heatstable protein, represents the major allergen in fish. High homology in amino acid sequences and antibody cross-reactivities have been demonstrated for parvalbumins in different fish species. Parvalbumin is extremely abundant in fish muscle, where it plays an important role in relaxation. White muscles generally contain more parvalbumin than dark muscles, which makes the latter much less allergenic. The aim of this study was to quantify the parvalbumin allergen gene in various types of seafood, using real time PCR. Specimens from 25 species of finfish, molluscs and crustacean shellfish commonly consumed in the Mediterranean region were included in the investigation. DNA was extracted using the commercial BIOO SCIENTIFIC kit, after slight modification of the procedure described by the manufacturers. Amplification of the parvalbumin gene by real time PCR was performed according to the study of Mun Sun et al. (2009), with some modification. Sixteen out of the 25 species examined yielded positive amplification. Positive samples, including fish (mackerel, horse mackerel, sheepshead, red mullet, sandsmelt, pandora, saddled sea bream, gilthead sea bream, red sea bream, European sea bass, blue whiting, anchovy, sardine) and cephalopods (cuttlefish, musky octopus) exhibited largely variable thresholds, differing by as much as 12 cycles, even though equal amounts of DNA were used in PCR amplification. Gilthead sea bream (Sparus aurata), sardine (Sardina pilhardus) and red mullet (Mullus sumuletus) gave the lower mean threshold cycle (Ct) value (23.00), while picarel (Spicara smaris) and saddled sea bream (Oblada melanura) gave the highest mean Ct value (35.00), indicating that the copy number of gene-coded parvalbumin varied in different fish species. Studies have shown that allergic reactions to food are highly individual. For some hypersensitive patients, even trace amounts can bring about life-threatening allergic reactions. 154

156 QUANTIFICATION OF AFLATOXINS IN FOODS, USING THE DIRECT COMPETITIVE ELISA TECHNIQUE D.P. Houhoula, A. Batrinou, P. Chaniotis, L. Grafas, D. Kizis, V.R. Kyrana, V.P. Lougovois and S. Koussissis Department of Food Technology, Technological Educational Institution of Athens, Agiou Spyridonos, Egaleo, Greece Mycotoxins include several groups of toxic secondary metabolites produced by a number of diverse fungal species. However, only some mycotoxins have been found to occur significantly in naturally contaminated feeds and foods: aflatoxins, ochratoxin A, fumonisins, patulin, zearalenone, trichothecenes, citrinin and penicillic acid. Besides the considerable impact on animals' and humans' health, the frequent incidence of these mycotoxins in agricultural commodities has also a potentially negative impact on the economies of the affected regions. There are four naturally occurring AFs: aflatoxin B1 (AFB1), B2, G1 and G2, all of which are toxic, mutagenic and carcinogenic compounds. To assure proper consumer protection, the European Commission recently established legal limits in the lower μg/kg range, i.e. 2 μg/kg aflatoxin B1 and 4 μg/kg total aflatoxins for food, and 0.1 μg/kg aflatoxin B1 for infant formulas. The aim of the study was to quantify Aflatoxins in different kinds of foodstuffs, using the competitive ELISA method. A total of 75 samples, including 58 organic products, were collected randomly from local super markets. The direct competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) was employed for the screening of total aflatoxins. The results show a high incidence (26,7%) of aflatoxins in all products analyzed. More specifically, 10 out of the 58 organic samples (17,2%), as well as 10 out of the 17 other samples (58,8%), including breakfast cereals, nuts and snacks, were positive for aflatoxins. ELISA provides a rapid technique, suitable for screening mycotoxins in various foodstuffs, due to its simplicity and specificity. The immunological assays developed are simple, robust, and safe to perform; they are cost effective and can be applied on a wide range of samples. The high incidence of positive samples encountered in this study highlights the fact that the presence of mycotoxins in foods appears to be a significant and persistent problem. 155

157 DEVELOPMENT OF A REAL TIME PCR FOR THE DETECTION OF POTENTIALLY ALLERGENIC TRACE AMOUNTS OF PEANUTS AND HAZELNUTS IN PROCESSED FOODS. I. Kiritsi, A. Papanastasiou, C. Bourdi, P. Galafti, S. Koussissis, and D.P. Houhoula Department of Food Technology, Technological Educational Institution of Athens, Agiou Spyridonos, Egaleo, Greece. Food allergy is the clinical manifestation of an immunological process in which, foods, their constituents or metabolic derivatives act as antigens, thereby stimulating the production of antibodies. In Europe, fourteen food items seem to present the major cause of food allergies, which necessitates the implementation of Food Labelling Regulations. Recent studies aim at detecting small quantities of allergenic substances that may have contaminated foods during preparation. The implementation of immuno-enzymatic methods, like ELISA, and the application of genetic mechanics (PCR and Real Time PCR) in the context of food safety represent a special challenge. The widespread use of peanuts and hazelnuts by the food industry may represent a threat to the health of vulnerable groups. The aim of the present study was to implement sensitive methods for detecting the presence of allergenic substances in low concentrations. The major objective was to apply Real Time RCR in the detection and quantification of hazelnuts and peanuts in a variety of widely consumed goods, e.g. breakfast cereals, chocolate and biscuits, frequently implicated in allergies. In some instances, the presence of hazelnuts and/or peanuts is not declared in the label and the products may carry no warning for potentially allergenic substances, usually referred to as traces. For the purpose of the study, a total of 152 samples were collected from local supermarkets and analysed. The results indicated that 49 of the samples (32%) contained hazelnut, while 25 (16.4%) contained peanuts. Of the 48 samples that carried no hazelnut or peanut label, 5 were found to contain hazelnuts (10.4%), while another 7 contained peanuts (14,6%). In conclusion, Real Time PCR can be very important in the detection and quantification of allergenic substances contained in foods. The availability of multiple methods for detecting peanut and hazelnut traces in foodstuffs is of paramount importance for the protection of sensitive individuals. 156

158 DEVELOPMENT OF A PCR FOR THE DETECTION OF ALLERGENIC TRACE AMOUNTS OF SESSAME AND HAZELNUT IN PROCESSED FOODS V. Belsis, K. Lagou, M. Varvaresou, P. Platara, M. Kollia, L. Georgοpoulos, S. Koussissis, and D.P. Houhoula Department of Food Technology, Technological Educational Institution of Athens, Agiou Spyridonos, Egaleo, Greece. Food allergy is an adverse immune response to a specific kind of food. Nowadays food allergy range is up to 6-8% in children and 1-2% in adults, in the developed countries. Sesame seeds and hazelnut are known as power allergens that cause serious allergic reactions to allergic persons. In recent years in many countries, the emergence of allergy to sesame and hazelnut has increased. Symptoms of an allergic reaction can range from mild to severe. The purpose of this study was to detect Sesame and Hazelnut in commercial foods that might not signal the Sesame and hazelnut existence by laboratory processing of food products. Ninety widely consumed goods from super markets which are responsible for food allergies and which contain no hazelnut and sesame labels or warnings or potential allergenic substances are referred to as traces (various kinds of cereals, chocolate, biscuits) were collected and studied.the results of this research showed that 36 samples which contained no hazelnut or sesame labels 5 (10.4%) and 2 (6%) contained hazelnuts and sesame respectively. In conclusion PCR is very important for the detection of allergens substances in various consumed goods. 157

159 Η επίδραση της θέρμανσης στα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά και την αντιοξειδωτική ικανότητα του μελιού Μαρία-Νεφέλη Ευθυμίου 1, Χρυσαυγή Γαρδέλη 1, Πασχάλης Χαριζάνης 2, Μιχαήλ Κωμαΐτης 1 1 Εργαστήριο Χημείας και Ανάλυσης Τροφίμων, Τμήμα Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής του Ανθρώπου, Γ.Π.Α. 2 Εργαστήριο Μελισσοκομίας και Σηροτροφίας, Τμήμα Επιστήμης Φυτικής Παραγωγής, Γ.Π.Α. Abstract The aim of this study was to investigate the physico-chemical properties: ph, moisture, free acidity, HMF content, and the antioxidant activity of six honey samples of different botanical and geographical origin. The effect of heating to 70 o C for 48 and 96 hours was also tested. Moisture, free acidity and ph values of the unheated samples met the acceptable standards, set by Greek law and Codex Alimentarius. HMF content ranged from 2.45 mg/kg (pine honeydew) to mg/kg (orange honey), with the later value to exceed the acceptable limits. The antioxidant activity was determined by the DPPH method. The values of IC 50% ranged from 18.7 mg/ml (for honeydew) to 75.7 mg/ml (orange honey). A positive effect of heating on the HMF content and antioxidant activity of the samples was also observed. The honey ph seems not to be affected by the thermal treatment. Εισαγωγή. Το μέλι, αποτελεί ένα φυσικό βιολογικό προϊόν που παράγεται από τις μέλισσες ύστερα από τη συλλογή νέκταρος ή μελιτωμάτων. Παρά το γεγονός ότι το ακατέργαστο μέλι παρουσιάζει την καλύτερη ποιότητα, η θέρμανσή του 158 είναι η μόνη πρακτική μέθοδος για να αποτρέψει ή να καθυστερήσει την κρυστάλλωση και την ζύμωση, μέσω της οποίας παράλληλα διευκολύνεται και η συσκευασία. Ως εκ τούτου, κατά τη διάρκεια των μελισσοκομικών χειρισμών και της συσκευασίαs, το μέλι συνήθως υποβάλλεται σε θερμική επεξεργασία. Στην παρούσα μελέτη εξετάστηκαν 6 δείγματα μελιού ως προς τα φυσικοχημικά τους χαρακτηριστικά: ph, υγρασία, ελεύθερη οξύτητα, περιεχόμενο σε υδροξυμεθυλοφουρφουράλη (HMF), και την αντιοξειδωτική ικανότητα. Εξετάστηκε επίσης η επίδραση της θέρμανσης του μελιού στους 70 o C για 48 και 96 ώρες, ως προς τις παραπάνω φυσικοχημικές σταθερές και την αντιοξειδωτική του ικανότητα.. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, όσον αφορά τη θέρμανση παρατηρήθηκε θετική συσχέτιση αυτής με το περιεχόμενο σε HMF και την αντιοξειδωτική ικανότητα των εξετασθέντων δειγμάτων μελιού, ενώ στην περίπτωση του ph η θέρμανση φαίνεται να μην έχει σημαντική επίδραση. Υλικά και Μέθοδοι. Δείγματα μελιού : Εξετάστηκαν 6 δείγματα μελιού με διαφορετική βοτανική και γεωγραφική προέλευση. Πίνακας 1: Δείγματα μελιού Δείγμα Βοτανική προέλευση Γεωγραφική προέλευση 1 Ανθέων Στερεά Ελλάδα 2 Έλατο Στερεά Ελλάδα 3 Έλατο Ελικώνας Βοιωτίας 4 Θυμάρι Βόρεια Εύβοια 5 Πεύκο Κρήτη 6 Πορτοκάλι Πελοπόννησος

160 Τα δείγματα συσκευάστηκαν σε υάλινα δοχεία, ερμητικά κλειστά με επικάλυψη parafilm. Τοποθετήθηκαν σε υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 70 ο C για 48 και 96 ώρες. Μετά το τέλος της θερμικής τους επεξεργασίας αφού παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου αποθηκεύθηκαν σε συνθήκες ψύξης (4 ο C ) έως τη στιγμή της ανάλυσής τους. Ο προσδιορισμός της υγρασίας, του ph, της ελεύθερης οξύτητας και της HMF (μέθοδος White) έγιναν σύμφωνα με τις προτεινόμενες μεθόδους της Διεθνούς Επιτροπής για το Μέλι (International Honey Commission, 2009). Προσδιορισμός της αντιοξειδωτικής ικανότητας του μελιού με τη χρήση της ελεύθερης ρίζας DPPH. Η μέτρηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας στηρίχτηκε στην εργασία των Socha, R. et. al Σύμφωνα με τη μέθοδο παρασκευάζεται μεθανολικό διάλυμα DPPH, συγκέντρωσης 0,1 mm και μεθανολικό διάλυμα μελιού συγκέντρωσης 200 g/l. Το μεθανολικό διάλυμα του μελιού διηθείται και από το διήθημα παρασκευάζονται διαδοχικές αραιώσεις. Για την παρασκευή του τυφλού χρησιμοποιήθηκαν 1,5 ml MeOH και 2,5 ml διαλύματος DPPH. Ακολούθησε ανάδευση σε Vortex και παραμονή σε σκοτεινό μέρος για 15 min. Η απορρόφηση του δείγματος και του τυφλού μετρήθηκε στα 517 nm, σε φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης (JASCO V-530, Tokyo, Japan). Ο μηδενισμός του φασματοφωτομέτρου πραγματοποιήθηκε με MeOH. Η αντιοξειδωτική ικανότητα των δειγμάτων εκφράστηκε ως IC 50% (Inhibition Concentration) που είναι η συγκέντρωση του μελιού εκφρασμένη σε mg/ml που απαιτείται για να δεσμεύσει το 50% της περιεχόμενης στο σύστημα DPPH. Αποτελέσματα & Συζήτηση. H περιεχόμενη υγρασία (Σχήμα 1) των υπό εξέταση μη θερμασμένων δειγμάτων κυμαίνεται μεταξύ 19-12,8 % με τα δείγματα από πορτοκάλι και έλατο από την περιοχή του Ελικώνα να έχουν την μέγιστη και την ελάχιστη τιμή αντίστοιχα. Όλα τα δείγματα βρέθηκαν εντός των ορίων σύμφωνα με την ισχύουσα νομοθεσία, καθώς κανένα δεν ξεπέρασε το μέγιστο επιτρεπτό όριο του 20%. Όσον αφορά το ph, αυτό κυμάνθηκε από 3,91(μέλι πορτοκαλιού) έως 4,91(μέλι πεύκου). Η ελεύθερη οξύτητα κυμαίνεται μεταξύ 31.0 meq/kg και 21,0 meq/kg με τα δείγματα ελάτης Στερεάς Ελλάδας και πεύκο/πορτοκάλι να παρουσιάζουν την μέγιστη και την ελάχιστη τιμή αντίστοιχα. Η ελεύθερη οξύτητα όλων των εξεταζόμενων δειγμάτων βρέθηκε μικρότερη από το ανώτατο όριο των 50 meq/kg σύμφωνα με την Οδηγία 2001/110/ΕΚ. 80,0 70,0 60,0 Μη θερμασμένα δείγματα 71,7 75,7 58,03 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 36,3 33,1 31,0 29,0 29,93 29,0 25,44 27,0 18,0 19,6 21,0 21,0 18,7 19,0 16,8 17,47 14,8 16,0 12,8 4,20 4,54 4,23 4,02 3,23 4,91 2,45 3,91 Aνθέων Έλατο Στ.Ελ. Έλατο Ελικ. Θυμάρι Πεύκο Πορτοκάλι Υγρασία (%) ph Οξύτητα (meq/kg) HMF (mg/kg) IC50%(mg/mL) 159

161 Σχήμα 1: Τιμές φυσικοχημικών χαρακτήρων υγρασία (%), ph, οξύτητα (meq/kg), περιεχόμενο σε HMF (mg/kg) & αντιοξειδωτικής ικανότητας (IC 50% - mg/ml), για τα μη θερμασμένα δείγματα μελιού. Όσον αφορά την περιεκτικότητα των δειγμάτων σε HMF (mg/kg), αυτή κυμάνθηκε μεταξύ 58,03 mg/kg και 2,45 mg/kg με τα δείγματα από πορτοκάλι και πεύκο να παρουσιάζουν την μέγιστη και την ελάχιστη τιμή αντίστοιχα. Μάλιστα το δείγμα από πορτοκάλι ξεπέρασε σημαντικά το ανώτατο όριο ασφάλειας των 40mg/kg για φρέσκα μη επεξεργασμένα μέλια που δεν προέρχονται από τροπικές περιοχές (τον Codex STAN ). Οι τιμές της IC 50% κυμάνθηκαν μεταξύ 18,7 mg/ml και 75,7 mg/ml. Τα δείγματα ελάτης Στερεάς Ελλάδας και μελιού από πορτοκάλι έχουν την ελάχιστη και την μέγιστη τιμή και συνεπώς τη μεγαλύτερη και τη μικρότερη αντιοξειδωτική ικανότητα αντίστοιχα. Πίνακας 1: Τιμές φυσικοχημικών χαρακτήρων υγρασία (%), ph, οξύτητα (meq/kg), περιεχόμενο σε HMF(mg/kg) & αντιοξειδωτικής ικανότητας (IC 50% - mg/ml), κατά τη θέρμανση στους 70 o C για 48 & 96 ώρες. Δείγματα ph Θέρμανση 70 o C/48 ώρες Ελ. Οξ. HMF IC 50% (meq/kg) (mg/kg) (mg/ml) ph Θέρμανση 70 o C/96 ώρες Ελ. Οξ. HMF IC 50% (meq/kg) (mg/kg) (mg/ml) Ανθέων 4,31 29,0 82,46 19,3 4,30 23,0 438,38 11,1 Έλατο Στ. Ελ 4,32 29,0 56,97 10,6 4,54 22,0 338,64 7,3 Έλατο Ελικ. 3,91 30,0 94,03 21,0 4,23 20,0 347,11 13,6 Θυμάρι 4,00 33,0 101,48 39,0 4,02 31,0 315,58 9,0 Πεύκο 4,90 22,0 31,78 19,1 4,91 22,0 60,59 11,9 Πορτοκάλι 3,88 22,0 130,77 55,6 3,95 20,0 383,19 39,8 Στον Πίνακα 2 παρουσιάζονται οι τιμές των υπό εξέταση φυσικοχημικών χαρακτηριστικών και της αντιοξειδωτικής ικανότητας κατά τη θέρμανση των εξεταζόμενων δειγμάτων στους 70 ο C για 48 και 96 ώρες. Όσον αφορά το ph παρατηρούνται μικρές μεταβολές σε ορισμένα δείγματα, οι οποίες μπορούν να θεωρηθούν αμελητέες και πιθανόν να μην οφείλονται στη θέρμανση, αλλά σε συστηματικό σφάλμα. Η ελεύθερη οξύτητα των δειγμάτων μελιού από πεύκο και πορτοκάλι φαίνεται να μην επηρεάζεται ιδιαίτερα κατά τη θέρμανση και παραμένει πρακτικά σταθερή. Κατά την παρατεταμένη θέρμανση των δειγμάτων ελάτης και ανθέων παρατηρήθηκε μείωση της ελεύθερης οξύτητας γεγονός που πιθανόν να οφείλεται στην υδρόλυση της λακτόνης. Όσον αφορά την HMF παρατηρείται, όπως ήταν αναμενόμενο, ότι η θέρμανση επιφέρει αύξηση της περιεκτικότητας των δειγμάτων σε HMF. Η πλειοψηφία των δειγμάτων παρουσίαζαν μεγαλύτερο ρυθμό σχηματισμού HMF κατά το δεύτερο 48άωρο θέρμανσης. Εξαίρεση αποτελεί το πευκόμελο, που παρουσίασε ηπιότερη μεταβολή, με σταθερό ρυθμό σχηματισμού HMF (0,60 mg/kg) και για τα δύο 48ώρα θέρμανσης. Σχετικά με την αντιοξειδωτική ικανότητα παρατηρείται ότι σ όλα τα 160

162 δείγματα μετά από παρατεταμένη θέρμανση παρουσιάζεται αύξηση. Την εντονότερη μεταβολή της αντιοξειδωτικής ικανότητας παρουσίασε το δείγμα μελιού από θυμάρι, ενώ τη μικρότερη το δείγμα ανθέων, η οποία παρατηρήθηκε κυρίως κατά το δεύτερο 48άωρο θέρμανσης. Στα δείγματα από μελιτώματα ο ρυθμός αύξησης της αντιοξειδωτικής ικανότητας ήταν εντονότερος κατά το πρώτο 48ωρο θέρμανσης. μεγαλύτερη μεταβολή παρουσίασαν τα δείγματα από πεύκο και έλατο Ελικώνα. Ο ρυθμός μεταβολής του IC 50% υπολογίστηκε και παρουσιάζεται στον Πίνακα 3. Το αρνητικό πρόσημο υποδηλώνει μείωση του ρυθμού μεταβολής της IC 50% και επομένως αύξηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας των εξεταζόμενων δειγμάτων. Πίνακας 2: Ρυθμός μεταβολής IC 50% στους 70 o C για 48 και 96h. των εξεταζόμενων δειγμάτων μελιού κατά τη θέρμανση Ρυθμός μεταβολής IC 50% (mg/ml) Δείγματα Πρώτο 48άωρο θέρμανσης Δεύτερο 48άωρο θέρμανσης Ανθέων -0,005-0,17 Έλατο Στ.Ελ. -0,17-0,07 Έλατο Ελικ. -0,32-0,16 Θυμάρι -0,68-0,62 Πεύκο -0,29-0,15 Πορτοκάλι -0,42-0,33 Βιβλιογραφία 1. Socha, R, Juszczak, L., Pietrzyk, S. & Fortuna, T. (2009). Antioxidant activity and phenolic composition of herb honeys. Food Chemistry, 113, Harmonised methods of the international honey commission, (2009), responsible for the methods: Stefan Bogdanov, Bee Product Science, 3. Turhan, K. (2009). Effects of Thermal Treatment and Storage on Hydroxymethylfurfural (HMF) Content and Diastase Activity of Honeys Collected from Middle Anatolia in Turkey. Innovations in Chemical Biology, Ed. Sener B. 4. Wang, J. & Li, Q.X. (2011). Chemical Composition, Characterization, and Differentiation of Honey Botanical and Geographical Origins. Advances in Food and Nutrition Research, Elsevier Inc. 5. Wilczyńska, A. (2010). Phenolic Content and Antioxidant Activity of Different Types of Polish Honey-A Short Report. Polish journal of food and nutrition sciences, 60(4),

163 Επίδραση του είδους του γάλακτος (βουβαλίσιο - αγελαδινό) και της προσθήκης καζεϊνικών αλάτων στις ρεολογικές ιδιότητες και στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά αναμιγμένης γιαούρτης Δεληγεωργάκης Χριστόδουλος, Βλάχβεη Καλλιόπη, Δημητρέλη Γεωργία Αλεξάνδρειο Τεχνολογικό Εκπαιδευτικό Ίδρυμα Θεσσαλονίκης (ΑΤΕΙΘ) Σχολή Τεχνολογίας Γεωπονίας και Τεχνολογίας Τροφίμων και Διατροφής, Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων, ΤΘ 141, Θεσσαλονίκη ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά, οι ρεολογικές ιδιότητες και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά αναμιγμένης γιαούρτης που παρασκευάστηκε από μίξη βουβαλίσιου γάλακτος με αγελαδινό. Συνολικά παρασκευάστηκαν 10 δείγματα γιαούρτης με και χωρίς προσθήκη καζεϊνικών αλάτων, στα οποία χρησιμοποιήθηκαν 5 διαφορετικά ποσοστά μίξης βουβαλίσιου και αγελαδινού γάλακτος (100%-0%, 75%-25%, 50%-50%, 25%-75%, 0%-100%). Η χρήση των καζεϊνικών αλάτων και το είδος του γάλακτος, επηρέασαν στατιστικά σημαντικά (p<0,05) την παράμετρο του χρώματος L* (φωτεινότητα) προκαλώντας την αύξησης της. Επίσης, η χρήση καζεϊνικών αλάτων είχε ως αποτέλεσμα την αύξησης της οξύτητας των δειγμάτων. Η αύξηση του ποσοστού προσθήκης βουβαλίσιου γάλακτος αλλά και η προσθήκη καζεϊνικών αλάτων αύξησαν το φαινομενικό ιξώδες των δειγμάτων. Ο δείκτης ρεολογικής συμπεριφοράς μειώθηκε με την αύξηση του ποσοστού του βουβαλίσιου γάλακτος, ενώ αυξήθηκε παρουσία καζεϊνικών αλάτων. Κατά την οργανοληπτική αξιολόγηση (αντικειμενική και ηδονική) των διαφόρων δειγμάτων γιαούρτης διαπιστώθηκε ότι η αύξηση της περιεκτικότητας της γιαούρτης σε βουβαλίσιο γάλα και η χρήση των καζεϊνικών αλάτων, είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της αντικειμενικής και ηδονικής λιπαρότητας καθώς και της έντασης του παχύρευστου. Effect of milk type (buffalo-bovine) and sodium caseinates addition on the rheological and sensory properties of stirred yogurt. ABSTRACT In the present work the physiochemical characteristics, the rheological properties and the sensory profile of stirred yogurt prepared from buffalo and bovine milk, were studied. Ten samples of yogurt with and without the addition of sodium caseinates were prepared using with 5 different mixture combinations of buffalo and bovine milk (100%-0%, 75%-25%, 50%-50%, 25%-75%, 0%-100%). The usage of sodium caseinates and the type of milk was significant (p<0,05) and increased the L parameter of color. Also, the usage of sodium caseinates increased the acidity of the samples. 162

164 The increase in buffalo milk percentage and the addition of sodium caseinates resulted in increased apparent viscosity of the samples. In addition, the flow behavior index was decreased in high percentages of buffalo milk and increased in the presence of caseinates. As it concerns sensory properties of yogurt samples, it was found that the increase in buffalo milk percentage and the use of caseinates, resulted in increased objective and hedonic fatiness and viscosity. 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το βουβαλίσιο γάλα έχει αυξημένη περιεκτικότητα σε λίπος, πρωτεΐνες και ασβέστιο (Khedkar et al., 2003) και μειωμένη σε χοληστερίνη σε σχέση με τα υπόλοιπα είδη γάλακτος (Khedkar et al., 2003; Park et al., 2007). Η γιαούρτη είναι ένα από τα προϊόντα που παράγονται με βάση το βουβαλίσιο γάλα. Ένα από τα σημαντικότερα χαρακτηριστικά της ποιότητας της γιαούρτης που παίζει πρωτεύοντα ρόλο στην προτίμηση των καταναλωτών είναι η υφή, η οποία επηρεάζεται κυρίως από τη θερμική επεξεργασία του γάλακτος, την οξυγαλακτική καλλιέργεια, την περιεκτικότητα του γάλακτος σε πρωτεΐνες και γενικά τη χημική σύσταση του γάλακτος (Sodini et al., 2004). Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης του είδους του γάλακτος (βουβαλίσιο - αγελαδινό) και της προσθήκης καζεϊνικών αλάτων στα φυσικοχημικά, ρεολογικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά αναμιγμένης γιαούρτης. 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Παρασκευή μεταχειρίσεων γιαούρτης Συνολικά παρασκευάστηκαν 10 δείγματα γιαούρτης με και χωρίς προσθήκη καζεϊνικών αλάτων (MIPRODAN 30, Arla Food Ingredients, Viby J., Denmark) σε ποσοστό 1%, στα οποία χρησιμοποιήθηκαν 5 διαφορετικά ποσοστά μίξης βουβαλίσιου και αγελαδινού γάλακτος (100%-0%, 75%-25%, 50%-50%, 25%-75%, 0%-100%). Η προμήθεια του γάλακτος έγινε από την τοπική αγορά. Η θερμική επεξεργασία του γάλακτος πραγματοποιήθηκε στους 85 C για 30 min και ακολούθησε ο εμβολιασμός του, υπό άσηπτες συνθήκες, με την οξυγαλακτική καλλιέργεια (Jointex X3, Dosi 4; CSL Centro Spermentale, de Latte S.P.A, Zelo Buon Persico, Italy). Η επώαση των δειγμάτων έγινε σε επωαστικό κλίβανο (Cooled Incubator Series 8000, Termaks AS, Bergen, Norway) στους 42 C μέχρι τελική τιμή ph 4, Φυσικοχημικές αναλύσεις Το ph των δειγμάτων γιαούρτης μετρήθηκε με τη χρήση εργαστηριακού πεχάμετρου (GP353 ATC ph METER, EDT Instruments). Η οξύτητα προσδιορίστηκε άμεσα με ογκομέτρηση. Η μέτρηση του χρώματος των δειγμάτων γιαούρτης πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια εργαστηριακού χρωματόμετρου τύπου Hunter. Η παράμετρος που προσδιορίστηκε ήταν η τιμή L*, η οποία δείχνει τη λαμπρότητα ή φωτεινότητα των δειγμάτων. 163

165 2.3. Μελέτη της ρεολογικής συμπεριφοράς των δειγμάτων Για τη μελέτη της ρεολογικής συμπεριφοράς των δειγμάτων προσδιορίστηκε το ιξώδες τους χρησιμοποιώντας το ιξωδόμετρο TR-1 (Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων του Α.Τ.Ε.Ι.) Οργανοληπτικός έλεγχος Ο σχεδιασμός του οργανοληπτικού ελέγχου έγινε με βάση το σχέδιο BIB (balanced incomplete block design), δηλαδή ένα ισορροπημένο ατελώς ομαδοποιημένο σχέδιο. Η οργανοληπτική αξιολόγηση (αντικειμενική και ηδονική) των διαφόρων δειγμάτων γιαούρτης έγινε με τη χρήση της δεκαπενταβάθμιας αδιαβάθμητης κλίμακας και τα δείγματα αξιολογήθηκαν ως προς το άρωμα, το λευκό χρώμα, την οξύτητα, την λιπαρότητα και το παχύρευστο Στατιστική ανάλυση Στα πειραματικά δεδομένα εφαρμόστηκε η ανάλυση της διακύμανσης δύο παραγόντων (Two-Way ANOVA). Σε περίπτωση που τα αποτελέσματα της ANOVA εμφάνισαν στατιστική σημαντικότητα του μελετούμενου παράγοντα, εφαρμόστηκε ο έλεγχος των πολλαπλών συγκρίσεων του Tukey ώστε να εντοπισθούν αυτές οι διαφορές. Για την ανάλυση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πρόγραμμα Minitab ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 3.1. Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά Σύμφωνα με την ANOVA η αύξηση του ποσοστού προσθήκης βουβαλίσιου γάλακτος είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της οξύτητας των δειγμάτων γιαούρτης (Σχήμα 1). Αυτό οφείλεται στην αυξημένη περιεκτικότητα του βουβαλίσιου γάλακτος σε πρωτεΐνες. Τόσο οι καζεΐνες όσο και οι πρωτεΐνες ορού παρουσιάζουν έντονη ρυθμιστική ικανότητα (Salaün et al., 2005) με αποτέλεσμα την παραγωγή γιαούρτης με αυξημένη οξύτητα. Αυτός είναι και ο λόγος όπου η προσθήκη καζεϊνικών αλάτων είχε στατιστικά σημαντική επίδραση (p<0,05) στην οξύτητα προκαλώντας την αύξησή της, όπως φαίνεται και στο Σχήμα 1. Σχήμα 1. Επίδραση του ποσοστού προσθήκης βουβαλίσιου και αγελαδινού γάλακτος και της προσθήκης καζεϊνικών αλάτων. H ένταση της φωτεινότητας L* αυξήθηκε με την αύξηση του ποσοστού προσθήκης βουβαλίσιου γάλακτος και με την παρουσία των καζεϊνικών αλάτων. Δεδομένου ότι η ένταση του λευκού χρώματος του γάλακτος και της γιαούρτης οφείλεται στην αντανάκλαση του φωτός επάνω στα λιποσφαίρια και στα μικκύλια της καζεΐνης (Walstra et al, 2006), η αύξηση των σωματιδίων σκεδασμού οδηγεί σε αύξηση της έντασης του λευκού χρώματος. 164

166 3.2. Ρεολογικά χαρακτηριστικά Η αύξηση της περιεκτικότητας της γιαούρτης σε βουβαλίσιο γάλα καθώς επίσης και η προσθήκη καζεϊνικών αλάτων είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του φαινομενικού ιξώδους. Αυτό οφείλεται στην παρουσία των καζεϊνών στο σύστημα του γάλακτος, οι οποίες αυξάνουν τον υδροδυναμικό όγκο των συμπλεγμάτων και επομένως την αντίστασης τους στη ροή. Η αύξηση του βουβαλίσιου γάλακτος προκαλεί μείωση του δείκτη ρεολογικής συμπεριφοράς, ενώ η παρουσία των καζεϊνικών αλάτων προκαλεί την αύξησή του Οργανοληπτικός έλεγχος Από την αξιολόγηση των οργανοληπτικών μεταβλητών (αντικειμενικών και ηδονικών) προέκυψαν στατιστικά σημαντικές διαφορές κατά την αξιολόγηση της έντασης αλλά και της αρεστότητας ως προς τη λιπαρότητα και το παχύρευστο. Η ένταση της λιπαρότητας όπως και η ένταση του παχύρευστου, αυξάνονται με την αύξηση του ποσοστού του βουβαλίσιου γάλακτος και την προσθήκη καζεϊνικών αλάτων. Η αξιολόγηση της αρεστότητας ως προς τη λιπαρότητα έδειξε ότι η παρουσία καζεϊνικών αλάτων την επηρέασε στατιστικά σημαντικά. Η αρεστότητα ως προς το παχύρευστο βρέθηκε ότι εξαρτάται στατιστικά από το είδος γάλακτος, την παρουσία καζεϊνικών αλάτων, όπως και τη μεταξύ τους αλληλεπίδραση. 4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Τόσο το είδος του γάλακτος όσο και η προσθήκη καζεϊνικών αλάτων επηρέασαν τα φυσικοχημικά, ρεολογικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά της αναμιγμένης γιαούρτης. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Ευχαριστούμε τον κ. Κλέωνα Τσακμακίδη για την προμήθεια των καζεϊνικών αλάτων. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Khedkar C.D., Khedkar G.D., Patil M.R. & Kalyankar S.D. (2003). Encyclopedia of Food Sciences & nutrition (2 nd Edition), p.p Academic Press, Maryland. Park Y.W. Juārez M., Ramos M. & Haenlein G.F.W. (2007). Physico-Chemical characteristics of goat and sheep milk. Small Ruminant Research, 68, Salaün F., Mietton B. & Gaucheron F. (2005). Buffering capacity of dairy products. International Dairy Journal, 15, Sodini (2004). The relative effect of milk base, starter and process on yogurt texture: A review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44, Walstra P., Wouters J.T.M. & Geurts T.J. (2006). Dairy Science and Technology, (2 nd Edition), pp , Taylor & Francis, CRC Press, Boca Raton. 165

167 LC-MS-MS techniques for food allergens testing Manos Christofakis 1 Aglaia Xila 2 1 Food Allergens Lab, Bizaniou 5, Rethymno, 74100, Crete. 2 Novartis In, CH 4002, Switzerland Introduction Food allergy, a constantly increasing world-wide phenomenon, is defined as the adverse reaction of humans and other organisms to a food or a food component, usually a protein. Patients who suffer from a food allergy can only avoid the respective allergen, even though something like that is not always possible, since produced food is becoming more complex with ingredients not always known. Increased pressure is placed on food manufacturers worldwide, to implement more stringent control on food processing systems to identify or avoid any hidden allergen present in the product. A series of advanced analytical technologies have been developed over the years in order to detect the presence, even in trace amount, of the protein component of food allergens in food items, whilst delivering fast and accurate results. Immunological and molecular techniques, commonly used in the food industry even though considered highly accurate and fast, seem insufficient when it comes to multi allergen screens and quantification. Introduction to Analytical Techniques and Allergen Testing Since the major aim is to identify allergenic proteins in complex food matrices composed of several hundreds of proteins, identification of the specific protein is possible with the use modern proteomic tools, such as mass spectrometry on line with a reverse phase liquid chromatography (LC-MS/MS). By using some of the new powerful and accurate mass spectrometry techniques described below together with high recovery sample preparation protocols, followed by the use of universal protein databases multiple tracing, identification and even specific peptide sequencing is achieved in a single analytical run. Food Samples Preparation Techniques Even though the section of sample preparation prior MS analysis is large and complex, there are several protocols depending on the sample type, the target analyte and the analytical method that follows. The source of the protein, the matrix in which it is found, the physical and chemical properties, the concentration as well as the cellular locations are the main factors we consider when it comes to choosing a preparation procedure. Starting with the lysis of the cell and the protein extraction, a typical workflow consists of protein or peptide separation, followed usually by the depletion of highly abundant proteins or enrichment of the target proteins and finally identification and quantifications of the target protein. Together with instrumentation and software, a proper sample preparation highly contributes to more reliable and reproducible results. 166

168 Liquid Chromatography Techniques Normal Flow LC In a proteomics experiment the mass spectrometer is usually coupled with a liquid chromatography system (HPLC). The protein samples, or the tryptic fragments, are loaded on a Reverse Phase (RP)-HPLC column and peptides/fragments are separated with a gradient of organic solvent following their hydrophobic scale. This system is usually selected when extremely small amount of sample is available. The peptide after being eluted from the column is directly injected in the electrospray (ESI) ion source through a small capillary insert. This technique involves multiple mass spectrometry steps, with some form of fragmentation of the peptide occurring in between the stages during the MS analysis. The resulting fragment ion masses are exclusive for the amino sequence and we can compare and identify the mother peptide by getting access to hundreds of different protein databases. Mass Spectrometry Mass spectrometry (MS) is an advanced state-of-the art world class technique in the area of identification and characterization of proteins. A mass spectrometer determines the mass of a molecule by measuring the mass-to charge ratio (m/z) of its ion. Ions are generated by inducing either the loss or gain of a charge from a neutral species, and are monitored according to their dynamic properties in electric and magnetic fields under vacuum. The quadrupole mass analyzer uses oscillating electrical fields to selectively stabilize or destabilize ions which pass through a radio frequency (RF) quadrupole field, acting in this way as a mass selective filter. If the molecule is a proteins or a peptide, the instrument can determine the sequence of the peptides though a second stage mass spectrometry analysis (Tandem MS). However mass spectrometry itself wouldn t be that powerful technique if it wasn t for all other important discoveries and outputs in the genomic and software research. Tandem Spectroscopy (MS/MS) The Tandem mass spectrometry experiment involves multiple steps of mass selection, usually separated by some form of fragmentation. The first stage involves a mass analyzer that isolates one peptide out of many entering a mass spectrometer according to the mass-to charge ratio (m/z) of its ion. Then, a second one stabilizes the peptide ions while they collide with an inert gas (nitrogen, argon, etc), causing further fragmentation by collision-induced dissociation (CID). In the final stage, a third mass analyzer registers the fragments produced from the most abundant peptides. The ion of the initial peptide is called precursor ion, whilst the ions produced in the MS/MS spectrum are called product ions. The peptide sequence obtained by the tandem mass spectrometry is used to identify the peptide using a universal protein database 167

169 Nanospray LC Electrospray ionization (ESI) is an ion producing technique used in mass spectrometry commonly referred to as soft ionization technique since there is substantially little fragmentation observed when molecules are ionized. In ESI, a solution of the analyte in a volatile solvent is purged through a capillary insert; the analyte dissolved in volatile liquid is then pushed though the capillary column. The analyte which exists as an ion in the solution is then pushed out of the capillary either because of its charge or with the help of an inert gas, such as argon or nitrogen. An aerosol forms inside a nebulizer and as the neutral solvent is evaporated, the molecules of the analyte are forced to get closer together, repel each other and break up the droplets of the analyte. The solvent free charged ions continue to move to the mass analyzer producing a mass spectrum. Although the fragmentation is very little, a standard observable molecular ion is generated and there is little structural information gained from the simple mass spectrum. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) is another soft ionization technique similar to electrospray ionization used for the analysis of biomolecules (DNA, proteins etc ) and large organic molecules. However, with MALDI we manage to produce much fewer multiply charged ions in gaseous phase proving thus the importance of MALDI-MS, especially when it comes to single-cell analysis where sensitivity as well as selectivity is required. MALDI is based on the desorption of the upper layer of the matrix material using a UV laser beam which when absorbed by the matrix material produces a nebulous. This nebulous contains a variation of species, from neutral and ionized matrix molecules, to matrix clusters and nanodroplets. The analyte molecules in this nebulous are then protonated or deprotonated. Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization (SELDI-TOF-MS) Surface-enhanced laser desorption/ionization (SELDI) is another mass spectrometry ionization method, commonly used for the analysis of protein mixtures usually in clinical as well as food samples. SELDI is typically used with time-of-flight (TOF) MS and it is an alteration of MALDI that uses a target modified to achieve biochemical affinity with the analyte compound. In SELDI, the protein mixture is spotted on a chemically modified surface that binds selectively to some proteins, while all the others are removed by washing. This separation step, allows for an easier analysis of the target proteins that bind to the surface which are, after washing the spotted sample, allowed to crystallize with the sample peptides. With TOF-MS when the laser ionizes the target molecule from crystals of the sample/matrix mixture, the ions are then accelerated through an electric field and down a flight tube. The detector then measures the time they take to reach the detector and if the particles all have the same charge, then their kinetic energies will be identical, and their speed will depend only on their masses. The data produced are represented in a mass chromatogram of Total ion Current (TIC), measured in the ion source during the RP-HPLC separation. 168

170 Evaluation of LC MS/MS Methodologies The ability of LC-MS/MS techniques to detect intact proteins or peptides even in complex mixtures, from both processed and unprocessed food makes them advantageous to ELISA. Moreover the fact the no false positive results are observed, constitutes LC-MS/MS techniques ideal confirmatory tests for both ELISA and PCR. Direct access to MS/MS data can easily provides us with useful information on changes in the protein structure together with a complete profile of all forms of the target protein found in the sample. Compared to indirect PCR techniques, where the target molecule is DNA whose absence doesn t definitely mean absence of the allergen protein analytical techniques easily overcome the instability of immunological or molecular systems used in ELISA and PCR techniques, offering this way, reproducible and repeatable results. With a detection limit lower than 1 ppm, depending on the method, LC-MS/MS sensitivity is comparable to ELISA. However its sensitivity remains lower than PCR techniques, where sometimes less than 10 genomes are enough, for multiplication and semi-quantitation. Even though LC-MS/MS techniques aren t as time consuming as initially though, the main disadvantage remains the high up-front investment as well as the senior technical knowledge & expertise required. The main however advantage of LC-MS/MS remains the simultaneous confirmation and quantification of up to 12 species with one simple sample preparation. To conclude, it seems that the combination of all three methods enables food industries to make better risk management decisions, protecting that way their brands from costly recalls and fines. References Biemann K. (1992). Mass spectrometry of peptides and proteins. Annu. Rev. Biochem. 61, Bodzon-Kulakowska A, Bierczynska-Krzysik A, Dylag T, Drabik A, Suder P, Noga M, (2007) Methods for samples preparation in proteomic research. J Chromatogr B 849:1 31 Careri et al Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008; 22: Abstract As the need for selective and sensitive methods to detect and identify allergens at trace levels in complex food matrices increases, modern proteomic tools such as mass spectrometry on line with a reverse phase liquid chromatography (LC-MS/MS) becomes the prevailing allergen analytical method. In this work, we review all the available techniques (ESI, MALDI, SELDI-TOF-MS, etc) making it easily understood how these LC-MS/MS assays apart from robust, rapid, sensitive and specific, offer a major advantage of simultaneous detection of more than one food allergen in contrast to ELISA where individual allergens are detected by separate kits. With a far lower uncertainty than biological system based methods, LC-MS/MS methods are not only more defensible in court, but also more cost effective for multiple allergen screens. With the initial sample preparation procedure being simplified over the years and with detection limits as low as ppm levels, it is still the combination of all three methods that enables food industries to make better risk management, protecting that way their brands from costly recalls and fines. 169

171 2,5-Diketopiperazine identification based on gas chromatography mass spectrometry analysis Sotirios M. Bratakos 1*, Vassilia J. Sinanoglou 1, Vassilis Dourtoglou 2 and Kyriakos Riganakos 3 1 Instrumental Food Analysis Laboratory. Department of Food Technology, Technological Educational Institution of Athens, Ag. Spyridonos Egaleo, Greece. * sbrat@teiath.gr, vsina@teiath.gr 2 Department of Oenology and Beverage Technology, Technological Educational Institution of Athens, Ag. Spyridonos Egaleo, Greece. 3 Food Chemistry and Technology Laboratory, Department of Chemistry. University of Ioannina, Greece. 2,5-diketopiperazines (DKPs) are formed through nonenzymatic dehydration and condensation of two N-terminal amino acid residues of linear peptides or proteins during storage (fermented foods) and through food sterilization (cooked foods). DKPs are present in various foods (cocoa nibs, roasted coffee,.roasted malt, dried squid, chicken essence) and create a metallic bitter taste. DKPs exhibit various biological activities, including antiviral, antibacterial, antifungal, anthelmintic and anticancer activities [1]. A modified GC MS method was applied for chemical characterization of 2,5-diketopiperazines (cyclic dipeptides) standards. These compounds were identified on the basis of their GC retention times and their mass spectra characteristic fragments (m/z). These cyclic dipeptides were cyclo(ala-gly), cyclo-d-(ala-pro), cyclo-d-(ala-val), cyclo(pro-val), cyclo(ala-his), cyclo(leu-pro), cyclo(phe-pro), cyclo(leu-phe) and cyclo(phe-phe). GC/MS analysis was performed on a Shimatzu gas chromatograph equipped with an automated liquid sampler, split/splitless injector and a Shimatzu quadrupole mass selective detector. Mass spectra were acquired on DB-5ms (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm; Agilent), using helium as the carrier gas. Electron ionization (E.I.) was produced by accelerating electrons from a hot filament through a potential difference, usually of 70 ev. Reference [1] Tsuruoka*, N., Beppu, Y., Koda, H., Doe, N., Watanabe, H., Abe, K. (2012). A DKP Cyclo(L- Phe-L-Phe) Found in Chicken Essence Is a Dual Inhibitor of the Serotonin Transporter and Acetylcholinesterase. PLOS ONE, 7(11), e

172 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ-ΘΗΡΕΥΤΩΝ BDELLOVIBRIO ΚΑΙ BACTERIOVORAΧ ΚΑΙ ΟΙ ΔΥΝΑΤΟΤΗΤΕΣ ΧΡΗΣΗΣ ΤΟΥΣ ΩΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΒΙΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΣΕ ΤΡΟΦΙΜΑ Γιαβάσης Ιωάννης*, Δημοπούλου Καλλιόπη, Νικολάκη Σοφία, Στεργίου Άννα, Καφετζή Ιωσιφίνα, Βουνού Θωμαϊς και Ιωαννίδου Νατάσα ΤΕΙ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ, Τμήμα Τεχνολογίας τροφίμων, Εργαστήριο Μικροβιολογίας & Βιοτεχνολογίας Τροφίμων, Τέρμα Ν. Τεμπονέρα, 43100, Καρδίτσα. * Υπεύθυνος Επικοινωνίας-Επιβλέπων: Δρ. Ιωάννης Γιαβάσης, Εmail: igiavasis@teilar.gr Τα βακτήρια Bdellovibrio bacteriovorus και Bacteriovorax stolpii είναι υποχρεωτικοί (το πρώτο) ή δυνητικοί θηρευτές κυρίως Gram- βακτηρίων και έχουν τη δυνατότητα να εισβάλουν στο κυτταρόπλασμα κυττάρων-θηραμάτων και να τρέφονται από τον ξενιστή, καταστρέφοντάς τον. Αυτό προσδίδει στα σπάνια αυτά βακτήρια ιδιότητες που μοιάζουν σε βακτηριοφάγους, χωρίς ωστόσο να είναι ιοί και χωρίς να έχουν στενό φάσμα δράσης, όπως οι φάγοι. Η συγκεκριμένη εργασία, προϊόν εκτεταμένης έρευνας, αποτελεί μια συγκριτική μελέτη της φυσιολογίας των δύο μικροβίων και της δυνατότητάς τους να αναπτύσσονται σε διαφορετικά υποστρώματα και διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες (ph, θερμοκρασίας, αερισμού, ανάδευσης, αλάτων, κλπ). Η επίδραση των διαφορετικών συνθηκών ph, θερμοκρασίας, αερισμού, και αλατότητας στην βακτηριοκτόνο δράση των δύο βακτηρίων συζητούνται αναλυτικά. Επίσης, στη εργασία αυτή μελετήθηκαν οι δυνατότητες χρήσεις των δύο βακτηρίων σε περιβάλλοντα τροφίμων (επιφάνεια ή εσωτερικό κρεάτων, αλιεύματα, αυγά, νωπό γάλα, λαχανικά) με σκοπό τη βιοπροστασία, δηλαδή την αξιοποίηση αυτών των βακτηρίων ενάντια σε παθογόνα και αλλοιογόνα μικρόβια. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια μείωση στους πληθυσμούς κυρίως της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας, των Ψευδομονάδων και Εντεροβακτηριδίων, που διέφεραν ανάλογα με το είδος του τροφίμου και τις συνθήκες επώασης, και δείχνουν ότι τα συγκεκριμένα βακτήρια μπορούν να είναι χρήσιμα στην ανάπτυξη νέων μεθόδων βιοπροστασίας των τροφίμων. 171

173 Antimicrobial effect of pomegranate juice (Punica granatum L.) on Staphylococcus aureus strains Anthimia Batrinou 1, Dimitra Lantzouraki 2, Vassilia J. Sinanoglou 1, Christiana Fragkouli 1, Vassilis Spiliotis 1 1 Department of Food Technology, Technological Educational Institution of Athens, Agiou Spyridonos, St, 12210, Aegaleo, Greece, batrinou@teiath.gr 2 Laboratory of Food Chemistry, School of Chemistry, National and Kapodistrian University of Athens, Panepistimiopolis, Zografou, GR Athens, Greece There is an increasing demand for natural antimicrobial agents in the Food Industry. Pomegranate has been cultivated in Greece and used as a medicinal food since ancient times but recent research is exploring its health-promoting benefits including antimicrobial, antioxidant, antidiabetic, hypolipidemic, anti-aging, anti-inflammatory, and anticarcinogenic properties. Pomegranate juice is a rich source of polyphenols and tannins (punicalin, punicalagin), and its main antioxidative compounds are anthocyanins and ellagic acid derivatives. Ellagitanins are the most potent antibacterial compounds but synergistic action of several pomegranate constituents also seem to contribute to its beneficial effect. In the present study, the antimicrobial effect of juice extract of two pomegranate varieties ( Wonderful and Persephone ) were tested against two strains of Staphylococcus aureus (ATCC 25932, ATCC 6538) with automated spectrophotometry (turbidometer). Growth patterns of both strains were significantly inhibited by the presence of pomegranate juice in various concentrations. Results indicate that pomegranate may be effective against pathogenic bacteria that can cause food poisoning. Pomegranate seems promising in food preservation but further research is needed to establish its antimicrobial activity on various food pathogens. References 1. Howell A.B. and D Souza D.H. (2013) The pomegranate: effects on bacteria and viruses that influence human health, Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, Vol 2013, article ID , 2. Haghayeghi K., Shetty K. Labbe R. (2013) Inhibition of foodborne pathogens by pomegranate juice, J Med Food, 16(5):

174 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΤΕΣΣΑΡΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟY ΟΛΙΚΗΣ ΜΕΣΟΦΙΛΗΣ ΧΛΩΡΙΔΑΣ (Ο.Μ.Χ.) ΣΕ ΓΑΛΑ ΜΙΚΡΩΝ ΜΗΡΥΚΑΣΤΙΚΩΝ Ζ. Χ. Καλύβα 1, Κ. Ακρίδα-Δεμερτζή 2, Π. Γ. Δεμερτζής 2 1 Εργαστήριο Μικροβιολογίας Παρασιτολογίας και Λοιμωδών Νοσημάτων των Ζώων του Τμήματος Ζωικής Παραγωγής του Τ.Ε.Ι. Ηπείρου. 2 Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Στην παρούσα μελέτη προσδιορίστηκε η Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα (Ο.Μ.Χ.) δειγμάτων νωπού γάλακτος μικρών μηρυκαστικών αυτόχθονων φυλών που συλλέχθηκαν από την περιοχή της Ηπείρου, με τη χρήση τεσσάρων μεθόδων. Ειδικότερα, εφαρμόστηκαν τρείς κλασικές μικροβιολογικές μέθοδοι, δηλαδή η μέθοδος επιφανειακής εξάπλωσης, η μέθοδος της γραμμοειδούς καλλιέργειας με βαθμονομημένο μικροβιολογικό κρίκο και η μέθοδος επιφανειακής σταγόνας Miles-Misra, καθώς και η αυτοματοποιημένη μέθοδος Tempo (biomeriuex), προκειμένου μετά τη σύγκρισή τους να προταθεί μια μέθοδος προσδιορισμού της Ο.Μ.Χ. πρακτική, ευαίσθητη, γρήγορη και οικονομική. Εξετάστηκαν συνολικά 46 δείγματα γάλακτος από πρόβατα φυλής Μπούτσικο και από αίγες της φυλής Capra prisca, από τα οποία τα 36 ήταν ατομικά δείγματα από υγιή ζώα απαλλαγμένα από μαστίτιδα και τα 10 ομαδικά δείγματα γάλακτος από παγολεκάνες και καταμετρήθηκε η Ο.Μ.Χ. με τη χρήση των τεσσάρων μεθόδων που αναφέρθηκαν προηγούμενα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τόσο το πρόβειο όσο και το γίδινο γάλα που προέρχονται από ατομικές δειγματοληψίες υγιών ζώων κατηγοριοποιούνται, σύμφωνα με την νομοθεσία, στην Α κλάση [Καν. (ΕΚ) 853/2004, Καν. (ΕΚ) 1782/2003 αρθ. 3], ενώ τα αντίστοιχα ομαδικά δείγματα κατηγοριοποιούνται σε Α και Β κλάση. Ορισμένα δείγματα ξεπερνούσαν το ανώτατο επιτρεπτό όριο της νομοθεσίας. Επίσης, πρέπει να αναφερθεί ότι το πρόβειο γάλα της φυλής Μπούτσικο είχε χαμηλότερη Ο.Μ.Χ. σε σχέση με αυτό από τις γίδες της φυλής Capra prisca. Η σύγκριση των τεσσάρων μεθόδων καταμέτρησης Ο.Μ.Χ. απέδειξε ότι και οι τέσσερις μέθοδοι είχαν μικρή απόκλιση μεταξύ τους, με τη μέθοδο Tempo (biomeriuex) να διακρίνεται ως η πλέον αξιόπιστη, ευαίσθητη, εύχρηστη και οικονομική για τον προσδιορισμό της Ο.Μ.Χ. στο γάλα. 173

175 ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΧΗΜΙΚΗΣ ΣΥΣΤΑΣΗΣ ΝΩΠΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΕΓΧΩΡΙΩΝ ΦΥΛΩΝ ΜΙΚΡΩΝ ΜΗΡΥΚΑΣΤΙΚΩΝ ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΑΤΟΜΙΚΩΝ ΚΑΙ ΟΜΑΔΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Ι. Β. Αυγέρης 1, Π. Γ. Δεμερτζής 2, Κ. Ακρίδα-Δεμερτζή 2 1 Εργαστήριο Μικροβιολογίας Παρασιτολογίας και Λοιμωδών Νοσημάτων των Ζώων του Τμήματος Ζωικής Παραγωγής του Τ.Ε.Ι. Ηπείρου. 2 Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Στην παρούσα μελέτη έγινε εκτίμηση της χημικής σύστασης του γάλακτος σε δύο ελληνικές φυλές μικρών μηρυκαστικών, προβάτων Μπούτσικο και της αίγας Capra prisca. Συλλέχθηκαν τόσο ατομικά δείγματα (20), όσο και ομαδικά (παγολεκάνη) (3), από 3 εκτροφές προβάτων και 16 ατομικά δείγματα και 2 συλλογικά από 2 εκτροφές αιγών. Τα ατομικά δείγματα ελήφθησαν από ζώα κλινικά υγιή, μετά από κτηνιατρικό έλεγχο, και απαλλαγμένα μαστίτιδας σύμφωνα με τα αποτελέσματα του CMT. Σε όλα τα δείγματα οι μετρήσεις σε λίπος, πρωτεΐνη, ολικά στερεά και ολικά στερεά άνευ λίπους ήταν μεγαλύτερες των βιβλιογραφικών δεδομένων και νομικών απαιτήσεων. Δεν υπήρξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές, μεταξύ των μέσων όρων των ατομικών και συλλογικών δειγμάτων κάθε εκτροφής. Κατεγράφησαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p 0,05) στο λίπος και τα ολικά στερεά μεταξύ των μέσων όρων δειγμάτων γάλακτος ανά εκτροφή προβάτων και στο λίπος, πρωτεΐνη, λακτόζη και ολικά στερεά, μεταξύ των μέσων όρων δειγμάτων γάλακτος ανά εκτροφή αιγών (p 0,05). Η πιο σημαντική διαφορά διαπιστώθηκε, ως προς το λίπος μεταξύ των ατομικών δειγμάτων γάλακτος, τόσο από τις εκτροφές προβάτων, όσο και από τις εκτροφές αιγών (εκτροφή 1: 4,05% - 8,54% υπερδιπλάσιο, εκτροφή 2: 6,29% -17,38% τριπλάσιο, εκτροφή 3: 3,38% - 6,77% διπλάσιο, εκτροφή 4: 2,97% - 6,42% υπερδιπλάσιο, εκτροφή 5: 2,98% - 6,3% διπλάσιο). Δεν διαπιστώθηκαν, στατιστικά σημαντικές διαφορές, μεταξύ των μέσων όρων ατομικών δειγμάτων γάλακτος και ομαδικών (παγολεκάνης). Τα στοιχεία συντείνουν στην άποψη ότι η παραλλακτικότητα είναι έκφραση ατομικού γενετικού χαρακτηριστικού και δείχνουν τις δυνατότητες για βελτίωση των ελληνικών φυλών ως προς τη χημική σύσταση του γάλακτος, καθώς σε όλες τις χώρες καθιερώνονται πλέον ποιοτικά κριτήρια γάλακτος. 174

176 Impact of water activity, temperature and sodium metabisulfite concentration on the growth of an Aspergillus carbonarius isolate from Greek grapes Pantelis Natskoulis 1, Angelos-Gerasimos Ioannidis 1, Naresh Magan 2, Efstathios Z. Panagou 1 * 1 Laboratory of Microbiology and Biotechnology of Foods, Department of Food Science and Technology, Agricultural University of Athens, Iera Odos 75, Athens, Greece, * Ε-mail: stathispanagou@aua.gr; 2 Applied Mycology Group, Cranfield Health, Cranfield University, College Road, Cranfield, Bedforshire, UK. An ecophysiological study was undertaken in vitro for an A. carbonarius Greek isolate of high ochratoxigenic potential on a grape juice based medium, modified with glycerol at a w levels of , and incubated at temperature range of C. Furthermore, the potential of controlling fungal growth by the addition of sodium metabisulfite (NaMBS) to the substrate was studied (0-150 ppm). Maximum growth rates (μ max ) of the fungus under the factors studied were assessed by the implementation of Baranyi primary growth model and analysed with ANOVA to determine their single and interaction effects. Furthermore, surface response contours after quadratic modelling of growth were generated in order to relate growth rates with a w and temperature under the different concentrations of NaMBS. There was evident affect of all factors tested on fungal growth by both graphical and statistical means. When NaMBS was present, low concentration (50 ppm) did not have a clearly inhibitory effect, while at higher concentrations growth was suppressed in combination with the environmental factors. Influence of NaMBS was more present when medium had higher a w, contrary to temperature that did not result to an equally radical decrease of growth under the different NaMBS concentrations. The optimum values for growth of A. carbonarius were found at 0.96 a w and C temperature. The present study will improve present findings on ecophysiology of A. carbonarius incorporating the NaMBS effect as inhibitory agent, contributing to a more effective control of fungal growth on grapes. Acknowledgements This work has been supported by the FungalPrognosis project 242 of the ARISTEIA-I call cofunded by EC European Social Fund and the Greek General Secretariat of Research and Technology. 175

177 Εφαρμογή προβιοτικής καλλιέργειας εκκίνησης Lactobacillus pentosus σε μεγάλης κλίμακας ζύμωση επιτραπέζιας ελιάς ποικιλίας Χαλκιδικής Βασιλική Α. Μπλάνα, Αναστάσιος Π. Σταματίου, Γεώργιος-Ιωάννης Ε. Νυχάς, Ευστάθιος Ζ. Πανάγου* Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων, Τμήμα Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής του Ανθρώπου, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Ιερά Οδός 75, Αθήνα, * επικοινωνίας: stathispanagou@aua.gr Περίληψη Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η δυνατότητα εφαρμογής προβιοτικής καλλιέργειας εκκίνησης του γαλακτικού βακτηρίου Lactobacillus pentosus Β281 σε ελεγχόμενη μεγάλης κλίμακας ζύμωση πράσινης ελιάς Χαλκιδικής ισπανικού τύπου. Κατά τη διάρκεια της ζύμωσης πραγματοποιήθηκαν μικροβιολογικές (απαρίθμηση γαλακτικών βακτηρίων, ζυμών και εντεροβακτηρίων) και φυσικοχημικές αναλύσεις (μέτρηση ph σε άλμη και καρπό, οξύτητα και αλατοπεριεκτικότητα στην άλμη), καθώς επίσης και το ποσοστό επιβίωσης του στελέχους L. pentosus Β281 με τη χρήση της μοριακής τεχνικής ηλεκτροφόρησης εναλλασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου (PFGE) για συνολικό χρονικό διάστημα οκτώ μηνών, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ο πληθυσμός των γαλακτικών βακτηρίων διατηρήθηκε σταθερά σε υψηλό επίπεδο, της τάξεως των 6,5 log CFU/g, ενώ ο πληθυσμός των ζυμών παρέμεινε σε χαμηλότερα επίπεδα, τα οποία δεν ξεπέρασαν τους 4 λογαριθμικούς κύκλους. Μετά τις πρώτες 27 ημέρες της ζύμωσης δεν υπήρξε απαρίθμηση εντεροβακτηρίων, ενώ μετά από 60 μέρες η τιμή του ph στον καρπό της ελιάς διαμορφώθηκε στο 4,3. Μετά από οκτώ μήνες παραμονής του προϊόντος στη δεξαμενή ζύμωσης η τιμή του ph της άλμης σταθεροποιήθηκε στο 4,2, ενώ η οξύτητα ήταν 0,55 γραμ. γαλακτικού οξέος ανά 100 ml άλμης και η αλατοπεριεκτικότητα 8,0 γραμμάρια χλωριούχου νατρίου ανά 100 ml άλμης. Τέλος, η επιβίωση του προβιοτικού στελέχους L. pentosus Β281 παρέμεινε υψηλή σε όλη τη διάρκεια της ζύμωσης και συντήρησης, το ποσοστό της οποίας ξεπέρασε το 95%. Το σύνολο των αποτελεσμάτων δηλώνει επιτυχία στην εφαρμογή της προβιοτικής καλλιέργειας εκκίνησης σε ζύμωση μεγάλης κλίμακας, καθώς το επιλεχθέν προβιοτικό γαλακτικό βακτήριο επικράτησε παρουσιάζοντας υψηλά ποσοστά επιβίωσης, προσαρμόστηκε σε υψηλό επίπεδο αλατιού και η οξύτητα κυμάνθηκε σε ικανοποιητικά επίπεδα. Abstract The performance of Lactobacillus pentosus B281, previously isolated from industrially fermented table olives and screened in vitro for probiotic potential, was investigated as starter culture in Spanish style fermentation of cv. Halkidiki green olives at ambient temperature. The dynamics of lactic acid bacteria, yeasts and Enterobacteriaceae were monitored on the surface of olives for 176

178 eight months. Also, ph (in the brine and olives), titratable acidity and salt concentration in the brine were routinely determined. The survival of inoculated strain on olives was determined using Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). The cell viability of lactic acid bacteria remained almost unchanged (ca. 6.5 log CFU/g) on olives during the eight months of the fermentation and storage. Yeast population did not exceeded 4.0 log cycles, whereas enterobacteria were not enumerated after 27 days of fermentation. The ph values were quite similar in both brine and olives ( ), while titratable acidity reached 0.55 g lactic acid/100 ml brine and salt concentration stabilized at 8.0 g NaCl/100 ml brine after eight months. PFGE analysis revealed that the inoculated strain L. pentosus Β281 showed a high survival rate with a recovery that exceeded 95%. The obtained results indicate the successful application of the selected strain on a large scale fermentation process. The strain was adapted successfully to the salt environment of the brine and the attained acidity in the brine was also satisfactory. Finally, molecular analysis showed high recovery rates of the starter at the final stage of the fermentation. Υλικά και Μέθοδοι Αποπίκρανση ελαιοκάρπου Πράσινες επιτραπέζιες ελιές ποικιλίας Χαλκιδικής τοποθετήθηκαν σε δεξαμενή συνολικής χωρητικότητας 12 τόνων και εμβαπτίστηκαν πλήρως σε διάλυμα 1,7% NaOH για ώρες. Ακολούθησαν δύο εκπλύσεις με νερό στις 4 και 8 ώρες αντίστοιχα. Βακτηριακό στέλεχος και προετοιμασία εμβολίου Το γαλακτικό βακτήριο L. pentosus Β281, το οποίο έχει απομονωθεί από την μικροχλωρίδα των ελιών, αναπτύχθηκε σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα MRS (4,5% NaCl) σε θερμοκρασία 30 C για 24 ώρες (τελικός πληθυσμός 9,0 log CFU/mL). Η καλλιέργεια αυτή χρησιμοποιήθηκε ώστε τελικά να προετοιμαστεί συνολικός όγκος εμβολίου 600 L σε πλαστικά δοχεία που περιείχαν νερό (200 L/δοχείο), αλάτι (4%) και ζάχαρη (0,5%). Τα δοχεία αφού εμβολιάστηκαν και παρέμειναν για 4 ώρες σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (τελικός πληθυσμός 7,8 log CFU/mL). Διαδικασία εμβολιασμού και ζύμωσης Η ζύμωση πραγματοποιήθηκε σε δεξαμενή χωρητικότητας 12 τόνων (7,0-7,5 τόνοι ελιάς και 4,5-5,0 τόνοι άλμης). Η αρχική συγκέντρωση άλατος ήταν 10% (w/v) και η οξίνιση της άλμης έγινε με 0,1% (v/v) γαλακτικό οξύ και 0,014% (v/v) HCl. Μετά από 24 ώρες παραμονής των ελιών στην άλμη προστέθηκαν τα 600 L της καλλιέργειας του L. pentosus Β281 (τελική συγκέντρωση εμβολίου 6,8 log CFU/mL). Η ζύμωση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Μικροβιολογικές και φυσικοχημικές αναλύσεις Ο πληθυσμός των γαλακτικών βακτηρίων, των ζυμών και των εντεροβακτηρίων στον καρπό της ελιάς καθώς επίσης και οι μετρήσεις της τιμής του ph (στην άλμη και στον καρπό), της οξύτητας και αλατοπεριεκτικότητας (στην άλμη) προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τις μεθόδους των Rodríguez- Gómez et al. (2013). 177

179 Απομόνωση και χαρακτηρισμός γαλακτικών βακτηρίων Η απομόνωση των γαλακτικών βακτηρίων και η επιβίωση της προβιοτικής καλλιέργειας L. pentosus B281 προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τις μεθόδους που έχουν περιγραφθεί από τους Doulgeraki et al. (2013). Αποτελέσματα Η εξέλιξη του πληθυσμού των γαλακτικών βακτηρίων, των ζυμών και των εντεροβακτηρίων, των πιο σημαντικών μικροβιακών ομάδων που απαριθμούνται κατά την ζύμωση της επιτραπέζιας ελιάς παρουσιάζεται στο Γράφημα 1. Κατά τη διάρκεια της ζύμωσης και συντήρησης ο πληθυσμός των γαλακτικών βακτηρίων διατηρήθηκε σταθερά σε υψηλό επίπεδο, της τάξεως των 6,5 log CFU/g, ενώ μετά τις πρώτες 27 ημέρες της ζύμωσης δεν υπήρξε απαρίθμηση εντεροβακτηρίων. Οι ζύμες συνυπήρξαν με τα γαλακτικά βακτήρια κατά τη ζύμωση και την συντήρηση, αλλά ο πληθυσμός τους παρέμεινε σε χαμηλότερα επίπεδα. Πιο συγκεκριμένα, ο πληθυσμός των ζυμών αυξήθηκε κατά 4 λογαριθμικούς κύκλους μέσα στις πρώτες 47 μέρες της ζύμωσης, και στη συνέχεια μειώθηκε φτάνοντας τελικά τους 3,0 log CFU/g καρπού. Στο Γράφημα 2 παρουσιάζεται η διακύμανση της τιμής του ph τόσο στην άλμη όσο και στη σάρκα της ελιάς για συνολικό χρονικό διάστημα οκτώ μηνών (ζύμωση και συντήρηση του προϊόντος). Μετά από 60 μέρες η τιμή του ph της σάρκας διαμορφώθηκε στο 4,3, ενώ η τιμή του ph της άλμης σταθεροποιήθηκε στο 4,2. Γράφημα 1. Εξέλιξη του μικροβιακού πληθυσμού των γαλακτικών βακτηρίων ( ), ζυμών ( ) και εντεροβακτηρίων ( ), κατά τη διάρκεια της ζύμωσης (με την εφαρμογή προβιοτικής καλλιέργειας εκκίνησης) και την συντήρηση επιτραπέζιας ελιάς ποικιλίας Χαλκιδικής για συνολικό χρονικό διάστημα οκτώ μηνών. Γράφημα 2. Εξέλιξη της τιμής του ph της άλμης ( ) και του καρπού ( ) κατά τη διάρκεια της ζύμωσης (με την εφαρμογή προβιοτικής καλλιέργειας εκκίνησης) και την συντήρηση επιτραπέζιας ελιάς ποικιλίας Χαλκιδικής για συνολικό χρονικό διάστημα οκτώ μηνών. Η οξύτητα διαμορφώθηκε στα 0,55 γραμ. γαλακτικού οξέος ανά 100 ml άλμης, μετά από οκτώ μήνες παραμονής του προϊόντος στη δεξαμενή ζύμωσης (Γράφημα 3α). Η αρχική συγκέντρωση χλωριούχου νατρίου (10% w/v) μειώθηκε σημαντικά μέσα στις πρώτες 48 ώρες της ζύμωσης, λόγω της διάχυσης μεταξύ άλμης και καρπού. Όμως η σταδιακή προσθήκη άλατος στο πλαίσιο της πρακτικής που ακολουθεί η βιομηχανία οδήγησε σε αύξηση και τελικά σταθεροποίηση της αλατοπεριεκτικότητας σε 8,0 γραμ. χλωριούχου νατρίου ανά 100 ml άλμης (Γράφημα 3β). 178

180 (α) (β ) Γράφημα 3. Εξέλιξη της (α) οξύτητας (γραμμάρια γαλακτικού οξέος ανά 100 ml άλμης) και (β) αλατοπεριεκτικότητας (γραμ. χλωριούχου νατρίου ανά 100 ml άλμης), κατά τη διάρκεια της ζύμωσης και της συντήρησης πράσινης επιτραπέζιας ελιάς ποικιλίας Χαλκιδικής για συνολικό χρονικό διάστημα οκτώ μηνών. Ο αρχικός πληθυσμός του εμβολίου του προβιοτικού στελέχους L. pentosus B281, το οποίο επιλέχθηκε μετά από προκαταρκτικά πειράματα εργαστηριακής κλίμακας, κυμάνθηκε σε 7,0 log CFU/mL άλμης. Το στέλεχος αυτό ανακτήθηκε πλήρως (επιβίωση 100%) στο αρχικό στάδιο της ζύμωσης (5 μέρες). Μετά από συνολικό χρονικό διάστημα οκτώ μηνών, ζύμωσης και συντήρησης του προϊόντος, οι μοριακές αναλύσεις (PFGE) έδειξαν ότι η καλλιέργεια εκκίνησης επιβίωσε σε ποσοστό μεγαλύτερο του 95%. Συμπεράσματα Από το σύνολο των αποτελεσμάτων που λήφθησαν είναι εμφανής η επιτυχία στην εφαρμογή της προβιοτικής καλλιέργειας εκκίνησης σε ζύμωση μεγάλης κλίμακας, καθώς το προβιοτικό γαλακτικό βακτήριο L. pentosus B281 που χρησιμοποιήθηκε επικράτησε και διατηρήθηκε σε υψηλό πληθυσμό, ο οποίος ξεπέρασε τους 6 λογαριθμικούς κύκλους ανά γραμμάριο ελιάς. Πέρα από το υψηλό ποσοστό επιβίωσης, η καλλιέργεια εκκίνησης προσαρμόστηκε με επιτυχία σε υψηλό επίπεδο αλατιού, ενώ και η οξύτητα της άλμης κυμάνθηκε σε ικανοποιητικά επίπεδα. Βιβλιογραφία Doulgeraki, A., Pramateftaki, P., Argyri, A., Nychas, G.-J.E., Tassou, C.C., Panagou, E.Z. (2013) Molecular characterization of lactic acid bacteria isolated from industrially fermented Greek table olives. LWT-Food Science and Technology 50, Rodríguez-Gómez, F., Bautista-Gallego, J., Arroyo-López, F.N., Romero-Gil, V., Jiménez-Díaz, R., Garrido-Fernández, A., García-García, P. (2013) Table olive fermentation with multifunctional Lactobacillus pentosus strains. Food Control 34, Ευχαριστίες Η παρούσα εργασία χρηματοδοτήθηκε από το έργο «PROBIOLIVES - Ζύμωση επιτραπέζιων ελιών με επιλεγμένα στελέχη προβιοτικών γαλακτικών βακτηρίων. Για ένα νέο λειτουργικό τρόφιμο.» που υποστηρίζεται από την Ευρωπαϊκή Κοινότητα μέσω του 7 ου Προγράμματος Πλαισίου: Έρευνα για τις Ενώσεις Μικρομεσαίων Επιχειρήσεων ( 179

181 Η μεταβολή των ελεύθερων ανθοκυανών σε οίνους πρώιμης κατανάλωσης σε συσκευασία τροποποιημένης ατμόσφαιρας Α. Μπιμπίλας, Δ. Τσιμογιάννης, Β. Ωραιοπούλου Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ Περίληψη Η μεταβολή των ελεύθερων ανθοκυανών σε τρεις διαφορετικές ποικιλίες κόκκινου κρασιού, κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης σε συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας ήταν στόχος της παρούσας εργασίας. Η ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση των ανθοκυανών έγινε με χρήση HPLC-DAD και LC-MS/MS. Από την επεξεργασία των αποτελεσμάτων προκύπτει ο χαμηλότερος ρυθμός μείωσης των ανθοκυανών και για τις τρεις ποικιλίες στα δείγματα που συσκευάστηκαν σε ατμόσφαιρα CO 2, σε σχέση με τα αντίστοιχα που συσκευάστηκαν σε N 2 και N 2 -CO 2 (1:1). Σε όλες τις περιπτώσεις οι ελεύθερες ανθοκυάνες είχαν εξαντληθεί σε χρονικό διάστημα μικρότερο των 9 μηνών, ενώ το ολικό φαινολικό φορτίο δεν μεταβλήθηκε σημαντικά κατά την διάρκεια αποθήκευσης των δειγμάτων σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για ένα έτος. Abstract The change of free anthocyanins in 3 different varieties of Greek red wine, during storage under modified atmospheres has been studied. HPLC-DAD and LC-MS/MS have been used for the identification and quantification of anthocyanins. For all varieties, samples stored in CO 2 atmosphere showed the lowest rate of decline of anthocyanins, compared to samples stored in N 2 and N 2 -CO 2 (1:1). In all occasions free anthocyanins have been depleted in less than 9 months, while total phenols remained practically constant throughout storage for 12 months. Εισαγωγή Ο οίνος αποτελεί ένα προϊόν υψηλής αξίας και συστατικό της μεσογειακής διατροφής. Το 57% της παγκόσμιας παραγωγής προέρχεται από τις χώρες της Μεσογείου γεγονός που καθιστά τον οίνο σπουδαίο προϊόν και σε οικονομικό επίπεδο για τις Μεσογειακές χώρες. Τα τελευταία χρόνια μεγάλο μερίδιο της αγοράς οίνου κατέχουν τα προϊόντα τύπου «ασκού» τα οποία αποτελούν κυρίως οίνους οικονομικούς και πρώιμης κατανάλωσης. Οι ερυθροί οίνοι τύπου «ασκού» δεν υποβάλλονται σε παλαίωση εντός δρύινων βαρελιών και κατά συνέπεια δεν φέρουν υψηλό φορτίο ταννινών οι οποίες προστατεύουν τις ανθοκυάνες από οξειδωτικά φαινόμενα. Τα συγκεκριμένα προϊόντα είναι επιδεκτικά σε οξειδώσεις, οι οποίες υποβαθμίζουν το χρώμα και κατά συνέπεια την ποιότητα του προϊόντος. Επιπλέον συγκεκριμένα ένζυμα του οίνου καταλύουν αντιδράσεις των ανθοκυανών προς πυρανοανθοκυανίνες οι οποίες επίσης συνεισφέρουν στην αλλοίωση του χρώματος του οίνου. 180

182 γλυκοζίτης ακετυλιωμένος γλυκοζίτης κουμαρυλιωμένος γλυκοζίτης καφεϋλιωμένος γλυκοζίτης γλυκοζίτης κουμαρυλιωμένος γλυκοζίτης γλυκοζίτης ακετυλιωμένος γλυκοζίτης κουμαρυλιωμένος γλυκοζίτης γλυκοζίτης ακετυλιωμένος γλυκοζίτης κουμαρυλιωμένος γλυκοζίτης Πειραματικό μέρος Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας μελετήθηκαν τρία εμπορικά προϊόντα ερυθρών οίνων από τις ποικιλίες Merlot και Syrah που καλλιεργήθηκαν και οινοποιήθηκαν στην Αττική καθώς και «Μαυροκουντούρα Κύμης» που αποτελεί ένα σπάνιο κλώνο της Μανδηλαριάς. Τα δείγματα των ερυθρών οίνων συσκευάστηκαν σε περιέκτες από πολυστρωματικό υλικό (OPP 20μm/ink/adhesive/PET MET 12μm/adhesive//PE 75μ STC) υπό τροποποιημένες ατμόσφαιρες σε συσκευή MAP. Χρησιμοποιήθηκε Ν 2, Ν 2 -CO 2 (1:1) και CO 2, ενώ στη συνέχεια τα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Το ολικό φαινολικό φορτίο των οίνων μετρήθηκε με τη μέθοδο Folin-Ciocalteu (Waterhouse, 2001), οι ανθοκυάνες ταυτοποιήθηκαν με υγρή χρωματογραφία συζευγμένη με φασματόμετρο μάζας (LC-MS/MS) και ποσοτικοποιήθηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης συζευγμένη με συστοιχία φωτοδιόδων (HPLC-DAD). Για τον υπολογισμό των παραμέτρων του χρώματος χρησιμοποιήθηκαν οι τύποι του Glories (Glories, 1984), η οπτική πυκνότητα των δειγμάτων προσδιορίστηκε με χρήση φασματοφωτόμετρου στα 420, 520 και 620nm, ενώ για τον προσδιορισμό της ολικής αντιοξειδωτικής δράσης χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος DPPH (DPPH assay). Αποτελέσματα Συζήτηση αποτελεσμάτων Και στις τρεις ποικιλίες, η ποιοτική ανάλυση του φαινολικού προφίλ με χρήση LC-MS/MS, έδειξε ότι η κύρια ανθοκυάνη είναι η μαλβιδίνη, η οποία εμφανίζεται στη μορφή του 3-Ο-γλυκοζίτη (Mv-3-glc), του 3-Ο-ακετυλιωμένου γλυκοζίτη (Mv-3-acetglc) και του 3-Ο-κουμαριλιωμένου γλυκοζίτη (Mv-3- coumglc). Το σύνολο των ανθοκυανών που ανιχνεύτηκαν στους αρχικούς οίνους και ποσοτικοποιήθηκαν φαίνεται στον Πίνακα 1. Ανθοκυάνη [ppm Mv-3-glc] Μαλβιδίνη Δελφινιδίνη Πετουνιδίνη Πεονιδίνη Ποικιλία Merlot Syrah Μαυροκουντούρα ίχνη 4.8 ίχνη 8.6 ίχνη Πίνακας 3: Οι ανθοκυάνες που ταυτοποιήθηκαν στους αρχικούς οίνους Στο Διάγραμμα 1 φαίνεται η μεταβολή των τριών κύριων ανθοκυανών του οίνου της Μαυροκουντούρας, σε συσκευασία τροποποιημένης ατμόσφαιρας N 2 -CO 2 (1:1). Σε όλες τις περιπτώσεις η μείωση του κλάσματος των ελεύθερων ανθοκυανών προσαρμόζεται ικανοποιητικά σε κινητική αντίδρασης πρώτης τάξης, ανεξαρτήτως ποικιλίας και συσκευασίας. Στον Πίνακα 2 παρουσιάζονται οι συντελεστές του ρυθμού μείωσης (k) των ολικών ελεύθερων ανθοκυανών για όλες τις περιπτώσεις. 181

183 Διάγραμμα 1-Α: Ποσοτικοποίηση ανθοκυανών σε ppm Μαλβιδίνης-3-γλυκοζίτη / 1-Β: Η μείωση των ανθοκυανών ακολουθεί κινητική 1 ης τάξης Mv-3-glc Mv-3-acglc Mv-3-coumglc k [mon -1 ] R 2 k [mon -1 ] R 2 k [mon -1 ] R 2 Merlot N 2-0,288 0,882-0,306 0,925-0,307 0,911 CO 2-0,170 0,705 0,193 0,735-0,190 0,569 N 2 -CO 2 (1:1) -0,204 0,759-0,227 0,793-0,243 0,859 Syrah N 2-0,079 0,946-0,103 0,903-0,111 0,81 CO 2-0,054 0,820-0,080 0,839-0,114 0,883 N 2 -CO 2 (1:1) -0,228 0,997-0,243 0,999-0,230 0,991 Μαυροκουντούρα N 2-0,259 0,984-0,247 0,990-0,252 0,977 CO 2-0,164 0,911-0,158 0,882-0,171 0,865 N 2 -CO 2 (1:1) -0,299 0,986-0,286 0,992-0,271 0,997 Πίνακας 4: Οι σταθερές της ταχύτητας μείωσης των ελεύθερων ανθοκυανών Από την σύγκριση των σταθερών k προκύπτει, ότι στις ποικιλίες Syrah και Μαυροκουντούρα η αποθήκευση των οίνων σε ατμόσφαιρα N 2 :CO 2 (1:1) δίνει τoν υψηλότερο ρυθμό μείωσης των ανθοκυανών σε σχέση με τις δύο άλλες συνθήκες αποθήκευσης, ενώ και για τις τρεις ποικιλίες η ατμόσφαιρα CO 2 έδωσε τους χαμηλότερους ρυθμούς αντίδρασης. Παρά το γεγονός ότι σε χρονικό διάστημα μικρότερο των 9 μηνών, οι ελεύθερες ανθοκυάνες σε όλες τις περιπτώσεις είχαν εξαντληθεί, η συγκέντρωση των ολικών φαινολών δεν έδειξε σημαντικές μεταβολές. Επομένως η μείωση των ανθοκυανών αποδίδεται σε αντιδράσεις πολυμερισμού τους με τα άλλα φαινολικά συστατικά του οίνου (π.χ. προκυανιδίνες, φλαβονόλες) και όχι σε αντιδράσεις οξείδωσης. Από την στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων δεν προέκυψε συσχέτιση της ατμόσφαιρας αποθήκευσης με τη μεταβολή του χρώματος (Διάγραμμα 2). Αντίθετα υπάρχει θετική συσχέτιση 182

184 ανάμεσα στην ποικιλία, το χρόνο και το ολικό χρώμα (CI index) και αρνητική μεταξύ αυτών και της παραμέτρου da% (brilliance). Η μεταβολή αυτή του χρώματος σύμφωνα με τους Ribéreau-Gayon et al. παρατηρείται λόγω των αντιδράσεων που συμβαίνουν κατά την παλαίωση του κρασιού και στις οποίες παίζουν πρωτεύοντα ρόλο οι ανθοκυάνες. Η μέτρηση της ολικής αντιοξειδωτικής δράσης των προϊόντων με τη μέθοδο DPPH, έπειτα από 9 μήνες αποθήκευσης, δεν έδειξε όπως και το χρώμα, να συσχετίζεται με την ατμόσφαιρα αποθήκευσης. Πάντως με την πάροδο επιπλέον χρόνου αποθήκευσης, αναμένεται να βγουν χρήσιμα συμπεράσματα σχετικά με την διατηρησιμότητα των προϊόντων. Διάγραμμα 2: Στατιστική επεξεργασία αποτελεσμάτων 1,0 Projection of the variables on the factor-plane ( 1 x 2) ΜΑΡ 0,5 Factor 2 : 20,31% 0,0 da% Ποι κι λί α Cl Χρόνος -0,5-1,0-1,0-0,5 0,0 0,5 1,0 Factor 1 : 54,26% Βιβλιογραφία Andersen QM, Markham KR. Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and Applications, CRC Taylor and Francis Group, Boca Raton, New York. pp , (2006) Glories Y., The color of red wines. Part 2: Measurement, origin and interpretation. Connaissance de la Vigne et du Vin 18: (1984) Nixdorf S.L., Hermosin-Gutierez I. (2010) Brazilian red wines made from the hybrid grape cultivar Isabel: Phenolic composition and antioxidant capacity. Analytica Chimica Acta 659: Ribéreau-Gayon P., Glories Y., Maujean A., Dubourdieu D. Phenolic Compounds. pp In: Handbook of Enology vol. 2 Wiley, Hoboken, New Jersey, USA (2006) Waterhouse AL., Determination of total phenolics. pp In: Handbook of food analytical chemistry. Wrolstad RE (ed). Wiley, USA (2001). 183

185 ΜΕΛΕΤΗ ΠΟΙΟΤΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΚΕΙΚ ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΜΕΝΟΥ ΜΕ ΟΛΙΓΟΦΡΟΥΚΤΟΖΗ ΚΑΙ ΙΝΟΥΛΙΝΗ Βασιλική Ψιμούλη, Βασιλική Ωραιοπούλου Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ ABSTRACT In the present study the effect of the replacement of sugar by an equal amount of oligofructose and the effect of the replacement of fat at levels 35% to 100% by inulin or oligofructose on batter and cake characteristics was investigated. Sugar or fat replacement by oligofructose induced significant increase of starch gelatinization temperature compared to control batter. However no significant differentiations of the characteristics of the cakes with oligofructose as sugar replacer from the control were observed. Fat replacement by 35% also did not induce significant differentiation from control, but above 65% decrease of air incorporation in the batter was observed. Furthermore at higher levels of fat replacement, increase of crumb hardness and decrease of volume development was observed. At 65% fat replacement however, the cakes presented acceptable quality characteristics. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση της πλήρους υποκατάσταση της ζάχαρης με ίση ποσότητα ολιγοφρουκτόζης και της υποκατάσταση λιπαρού σε επίπεδα από 35% έως 100% με ινουλίνη ή ολιγοφρουκτόζη στα χαρακτηριστικά της ζύμης και του κέικ. Η ολιγοφρουκτόζη ως υποκατάστατο ζάχαρης ή λιπαρού επέφερε αύξηση της θερμοκρασίας ζελατινοποίησης του αμύλου σε σύγκριση με το τυφλό. Ωστόσο δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφοροποίηση ως προς τα ποιοτικά χαρακτηριστικά του κέικ με την υποκατάσταση της ζάχαρης. Η υποκατάσταση του λιπαρού κατά 35% επίσης δεν επέφερε σημαντική διαφοροποίηση ως προς το τυφλό, ωστόσο σε επίπεδα άνω του 65% παρατηρήθηκε μείωση της ενσωμάτωσης αέρα στη ζύμη. Επιπλέον σε υψηλά επίπεδα υποκατάστασης λιπαρού, παρατηρήθηκε αύξηση της σκληρότητας της ψίχας και μείωση της ανάπτυξης του όγκου του κέικ. Ωστόσο τα δείγματα με 65% υποκατάσταση λιπαρού παρουσίασαν ικανοποιητικά ποιοτικά χαρακτηριστικά. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Στις μέρες μας η υποκατάσταση συστατικών υψηλού θερμιδικού φορτίου, όπως είναι η ζάχαρη και το λιπαρό, αποκτά ιδιαίτερη σημασία, καθώς οι καταναλωτές δείχνουν ολοένα και μεγαλύτερη προτίμηση για τρόφιμα χαμηλών θερμίδων στα πλαίσια της αντιμετώπισης επιβαρυντικών για την 184

186 υγεία παθήσεων, όπως είναι η παχυσαρκία. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση της χρήσης της ολιγοφρουκτόζης ως υποκατάστατο ζάχαρης και λιπαρού και της ινουλίνης ως υποκατάστατο λιπαρού στα ποιοτικά χαρακτηριστικά ενός ιδιαίτερα αρεστού προϊόντος αρτοποιίας (κέικ). Η ζάχαρη και το λιπαρό έχουν σημαντικό λειτουργικό ρόλο στην ποιότητα του κέικ, καθώς από τα γευστικά χαρακτηριστικά που προσδίδουν επηρεάζουν σημαντικά την ανάπτυξη της δομής και της ποιότητας του προϊόντος. Πιο συγκεκριμένα η ζάχαρη μεταθέτει τη ζελατινοποίηση του αμύλου και επομένως τη σταθεροποίηση της ζύμης κατά τον κλιβανισμό σε υψηλότερη θερμοκρασία, και κατά αυτό τον τρόπο ενισχύει την ανάπτυξη των φυσαλίδων αέρα και κατ επέκταση τη δομή του τελικού προϊόντος. 1 Το λιπαρό συμβάλλει στην ενσωμάτωση αέρα στη ζύμη και κατ επέκταση στην ανάπτυξη του όγκου του προϊόντος. Επιπλέον συμβάλλει στη τρυφερότητα της υφής του κέικ μέσω της συγκράτησης υγρού και της αποδυνάμωσης του πλέγματος γλουτένης. 2 Η ινουλίνη και η ολιγοφρουκρόζη είναι πολυσακχαρίτης και ολιγοσακχαρίτης, αντίστοιχα, με μήκος αλυσίδας που κυμαίνεται από 2-60 μονάδες και από 2-10 μονάδες αντίστοιχα. Το κύριο μονομερές είναι η φρουκτόζη. Οι β(2-1) γλυκοζιτικοί δεσμοί που συνδέουν τα μόρια της φρουκτόζης, προσδίδουν στην ινουλίνη και την ολιγοφρουκτόζη χαμηλή θερμιδική αξία καθώς τις καθιστούν μη αφομοιώσιμες στο άνω γαστρεντερικό σύστημα. 3 Επιπλέον η ινουλίνη και η ολιγοφρουκτόζη έχουν πρεβιοτική δράση, βελτιώνουν την απορρόφηση ασβεστίου, μειώνουν τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων και της LDL-χοληστερόλης, συμβάλλουν στην καλή λειτουργία του εντέρου και μειώνουν τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του παχέος εντέρου. 4 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η σύσταση του πρότυπου (τυφλού) κέικ % βάσει βάρους αλεύρου είναι: αλεύρι σίτου (Μύλοι Π. Δάκου, Οινόφυτα), διτανθρακική σόδα 11.1 g kg -1, πυροφωσφορικό νάτριο 13.5 g kg -1, φωσφορικό μονοασβέστιο 2.0 g kg -1, ζάχαρη 900 g kg -1, αυγά 670 g kg -1, μαργαρίνη 535 g kg -1 (Μινέρβα Α.Ε., Σχηματάρι), γάλα 666 g kg -1 και αλάτι 19 g kg -1. H ινουλίνη GR και η ολιγοφρουκτόζη P95 (Orafti Active Food Ingredients, Tienen, Belgium) διαλύονταν σε νερό σε συγκεντρώσεις 20% και 70% αντίστοιχα και αποθηκεύτηκαν στους 4ºC προκειμένου να παραληφθούν πήγματα. Η ζάχαρη υποκαταστάθηκε από ίση ποσότητα του παρασκευάσματος ολιγοφρουκτόζης, ενώ το λιπαρό υποκαταστάθηκε σε ποσοστά 35%, 65% και 100% από ίση ποσότητα παρασκευασμάτων ολιγοφρουκτόζης ή ινουλίνης. Για την παρασκευή του κέικ αναμιγνύονταν το λιπαρό (ή και το υποκατάστατο) με τη ζάχαρη (ή το υποκατάστατο). Στη συνέχεια προστίθετο το αυγό και τέλος το γάλα και το αλεύρι, στο οποίο είχαν προηγουμένως προστεθεί οι διογκωτικοί παράγοντες και το αλάτι. Τα κέικ ψήθηκαν στους 180 ºC για 50 min. Ακολούθησε ψύξη σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, συσκευασία και αποθήκευση τους σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Το ειδικό βάρος της ζύμης προσδιορίστηκε ως ο λόγος του βάρους της ζύμης προς το βάρος απιονισμένου νερού ίσου όγκου, ενώ οι θερμοκρασίες έναρξης, κορύφωσης και λήξης της 185

187 T ( o C) ζελατινοποίησης του αμύλου προσδιορίσθηκαν μέσω της διαφορικής θερμιδομετρικής ανάλυσης με χρήση του Perkin-Elmer DSC6 (Perkin-Elmer, Wellesley, MA, USA). Τα κέικ υποβλήθηκαν σε μετρήσεις 20 h μετά την παρασκευή τους. Προσδιορίσθηκε ο ειδικός όγκος του κέικ ως ο λόγος του όγκου προς το βάρος του, η σκληρότητα της ψίχας με τον αναλυτή υφής (Ta-XTi2 Stable Microsystems, Surrey, UK). και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η υποκατάσταση της ζάχαρης ή του λιπαρού από την ολιγοφρουκτόζη οδήγησε σε αύξηση των θερμοκρασιών έναρξης (Tonset), κορύφωσης (Tpeak) και λήξης (Tend) της ζελατινοποίησης του αμύλου σε σύγκριση με το τυφλό αλλά και σε σχέση με την ινουλίνη (Σχήμα 1), που μπορεί να αποδοθεί στη δράση των ολιγοσακχαριτών προς τη μείωση της ενεργότητας του νερού και τον περιορισμό της ενυδάτωσης του αμύλου. Ωστόσο η υποκατάσταση της ζάχαρης από ολιγοφρουκτόζη δεν επέφερε σημαντική διαφοροποίηση ως προς τον ειδικό όγκο και τη σκληρότητα του κέικ σε σύγκριση με το τυφλό (Σχήμα 2) Τon Tpeak Tend τυφλό ολιγοφρουκτόζη τυφλό ολιγοφρουκτόζη υπ ζάχαρης ολιγοφρουκτόζη υπ λιπαρού ινουλίνη ειδικό βάρος ζύμης (g cm-3) ειδικός όγκος κέικ (cm3 g-1) σκληρότητα (Ν) Σχήμα 1. Επίδραση υποκατάστατων στη ζελατινοποίηση αμύλου Σχήμα 2. Επίδραση της υποκατάστασης ζάχαρης σε χαρακτηριστικά ζύμης και κέικ Η υποκατάσταση του λιπαρού σε ποσοστό 35% δεν επέφερε σημαντική διαφοροποίηση ως προς το ειδικό βάρος της ζύμης (Σχήμα 3) και τα χαρακτηριστικά του κέικ (Σχήματα 4 και 5) σε σύγκριση με το τυφλό. Η υποκατάσταση του λιπαρού σε υψηλότερο ποσοστό οδήγησε σε μείωση της ενσωμάτωσης αέρα της ζύμης με αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση του ειδικού όγκου του τελικού προϊόντος. Η μεγαλύτερη διόγκωση των δειγμάτων με ολιγοφρουκτόζη σε σύγκριση με την ινουλίνη μπορεί να αποδοθεί και στη σημαντική επίδραση της πρώτης στη μετάθεση της ζελατινοποίησης του αμύλου σε υψηλότερη θερμοκρασία. Επιπλέον η μείωση της ενσωμάτωσης αέρα στη ζύμη σε συνδυασμό με την απώλεια της συμβολής του λιπαρού στην τρυφερότητα της υφής, είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της σκληρότητας της ψίχας. Κατά την οργανοληπτική εξέταση τα δείγματα με υποκατάστατα έλαβαν χαμηλότερη βαθμολογία σε σύγκριση με το τυφλό. Ωστόσο τα κέικ με 65% υποκατάσταση λιπαρού αξιολογήθηκαν ως αποδεκτά. 186

188 σκληρότητα (Ν) ειδικός βάρος ζύμης (g cm -3 ) ειδικό όγκος κέικ (cm 3 g -1 ) 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0% υπ λιπαρού 35% υπ λιπαρού 65% υπ λιπαρού 100% υπ λιπαρού a b ab c b c c c 2,7 2,6 2,5 0% υπ λιπαρού 35% υπ λιπαρού 65% υπ λιπαρού 100% υπ λιπαρού a abc ab ab abc bc cd d 0,6 2,4 0,4 0,2 2,3 0,0 ολιγοφρουκτόζη ινουλίνη 2,2 ολιγοφρουκτόζη ινουλίνη Σχήμα 3. Επίδραση υποκατάστατων λιπαρού στο ειδικό βάρος ζύμης Σχήμα 4. Επίδραση υποκατάστατων λιπαρού στον ειδικό όγκο κέικ % υπ λιπαρού 35% υπ λιπαρού 65%υπ λιπαρού 100%υπ λιπαρού a ab b c c c c c ολιγοφρουκτόζη ινουλίνη Σχήμα 5. Επίδραση υποκατάστατων λιπαρού στη σκληρότητα του κέικ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η ολιγοφρουκτόζη ως υποκατάστατο ζάχαρης παρείχε κέικ με παρόμοια χαρακτηριστικά με το τυφλό. Ωστόσο η υποκατάσταση του λιπαρού οδήγησε σε υποβάθμιση των ποιοτικών χαρακτηριστικών του κέικ, η οποία ήταν πιο σημαντική σε υψηλά επίπεδα υποκατάστασης. Ωστόσο τα δείγματα με υποκατάσταση λιπαρού 65% είτε με ινουλίνη είτε με ολιγοφρουκτόζη παρουσίασαν ικανοποιητικά ποιοτικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Oι συγγραφείς ευχαριστούν τις εταιρείες: Μύλοι Π. Δάκου, Μινέρβα και Orafti, για τη δωρεάν παραχώρηση πρώτων υλών. Η παρούσα εργασία υποστηρίχθηκε με υποτροφία από τον Ειδικό Λογαριασμό Κονδυλίων Έρευνας του Ε.Μ.Π. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Kim CS and Walker CE (1992). Effects of sugars and emulsifiers in starch gelatinization evaluated by differential scanning calorimetry. Cereal Chemistry, 69, Bennion EB and BAmford GST (1997). The technology of cake making. 6 th ed. London: Blackie Academic & Professional. 3. Niness KR. (1999). Inulin and oligofructose: What are they? Journal of Nutrition 129 Supp: S Flamm G, Glismann W, Kritchevsky D, Porsky L and Roberfoid M. (2001). Inulin and oligofructose as dietary fiber: A review of the evidence. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 41,

189 Ανίχνευση των τροφογενών παθογόνων Vibrio parahaemolyticus και Bacillus cereus με Μοριακές Τεχνικές Α. Λαμπιδώνης 1 και Μ. Πολίτης 2 1 Υπεύθυνος Μοριακών Αναλύσεων και Έρευνας - Food Allergens Laboratory, Ρέθυμνο, Κρήτη 2 Διευθυντής Εργαστηρίου Κρήτης - Food Allergens Laboratory, Ρέθυμνο, Κρήτη ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα τελευταία έτη η εξέλιξη της επιστήμης της Μοριακής Βιολογίας επιτρέπει την ανίχνευση παθογόνων οργανισμών σε βασικές πρώτες ύλες στην ελληνική βιομηχανία τροφίμων. Παράδειγμα παθογόνου οργανισμού αποτελεί το Vibrio spp. (π.χ Vibrio parahaemolyticus) τα στελέχη του οποίου παρουσιάζουν αιμολυτικές ιδιότητες, ενώ ξεχωριστό παθογόνο αποτελεί και το βακτήριο Bacillus cereus, το οποίο σχηματίζει θερμοανθεκτικά σπόρια κατά τη θερμική επεξεργασία μολυσμένων τροφίμων. Στην ανάλυση τροφίμων οι τεχνικές Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης (PCR) επιτρέπουν την ταχύτερη διάγνωση, συγκριτικά με τις συμβατικές μεθόδους καλλιέργειας. Το πλεονέκτημα των μεθόδων αυτών είναι τα άμεσα και έγκυρα αποτελέσματα που απαιτεί ο έλεγχος των τροφίμων. Στόχος της συγκεκριμένης εργασίας είναι η εφαρμογή κατάλληλων πρωτοκόλλων και τεχνικών PCR για την ανίχνευση των προαναφερόμενων παθογόνων μικροοργανισμών τόσο σε οργανισμούς που προέρχονται από το θαλάσσιο περιβάλλον, όσο και σε διάφορα δείγματα της ελληνικής βιομηχανίας τροφίμων. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι πρόσφατες εξελίξεις στον τομέα της διαγνωστικής Μοριακής Βιολογίας επιτρέπουν νέες προσεγγίσεις στην ανίχνευση των παθογόνων οργανισμών στα τρόφιμα. Στην ανάλυση τροφίμων οι τεχνικές Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης (PCR) επιτρέπουν την ταχύτερη διάγνωση συγκριτικά με τις συμβατικές μεθόδους καλλιέργειας. Το πλεονέκτημα αυτών των μεθόδων είναι η υψηλή ευαισθησία καθώς και τα άμεσα αποτελέσματα που απαιτεί ο έλεγχος των τροφίμων. Η εφαρμογή της PCR αποτελεί μια πρωτοπόρο τεχνική στην ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών και συγκεκριμένα του Vibrio parahaemolyticus και Bacillus cereus στα τρόφιμα. Πιο συγκεκριμένα, τo Vibrio spp. αποτελεί μικροοργανισμό που ανήκει στο γένος των Gramαρνητικών βακτηρίων. Αρκετά από τα είδη Vibrio είναι παθογόνα, περισσότερα από τα οποία προκαλούν ασθένειες που συνδέονται με γαστρεντερίτιδες. Είναι δυνατόν να βρίσκονται σε πολυάριθμους θαλάσσιους οργανισμούς, όπως καβούρια ή γαρίδες, ενώ είναι ευρέως διαδεδομένο ότι προκαλούν θανατηφόρες μολύνσεις σε ανθρώπους κατά τη διάρκεια της έκθεσης. Στα παθογόνα στελέχη ανήκουν τα είδη Vibrio cholerae (παράγοντας της χολέρας), Vibrio parahaemolyticus και Vibrio vulnificus. Το είδος Vibrio parahaemolyticus συνδέεται με το φαινόμενο «Kanagawa», σύμφωνα με το οποίο, τα στελέχη που προέρχονται από ανθρώπινους ξενιστές (κλινικά προερχόμενα) είναι αιμολυτικά σε τρυβλία που περιέχουν άγαρ με αίμα. Όσον αφορά το παθογόνο Bacillus cereus, αποτελεί ένα ραβδόμορφο, σπορογόνο, θετικό κατά Gram βακτήριο ευρύτατα διαδεδομένο στο περιβάλλον. Το κύριο χαρακτηριστικό του είναι ο σχηματισμός θερμοάντοχων σπορίων κατά τη θερμική επεξεργασία μολυσμένων με B. cereus τροφίμων. Το βακτήριο παράγει τουλάχιστον πέντε διαφορετικές εντεροτοξίνες (HBL, Nhe, CytΚ, BceT και FM) και μια εμετική τοξίνη. Οι εντεροτοξίνες HBL, Nhe και CytΚ είναι οι αιτιολογικοί 188

190 παράγοντες στην πρόκληση της διαρροϊκής νόσου. Έχει διαπιστωθεί σε in vitro μελέτες ότι η εμετική τοξίνη του B. cereus παραμένει σταθερή ακόμη και μετά από θέρμανση στους 121 ο C για 2 h, ενώ είναι ιδιαίτερα ανθεκτική σε χαμηλές τιμές ph (μέχρι 2) και στην πρωτεόλυση. Συνεπώς, μπορεί να παραμείνει δραστική στο όξινο περιβάλλον του στομάχου και στην επίδραση της πρωτεολυτικής δράσης των ενζύμων του εντερικού σωλήνα (Agata et al. 1995, Granum και Lund 1997, Kramer και Gilbert 1989). Στόχος της συγκεκριμένης εργασίας είναι η εφαρμογή κατάλληλων πρωτοκόλλων για την ανίχνευση των παθογόνων μικροοργανισμών Vibrio parahaemolyticus και Bacillus cereus, σε οργανισμούς που προέρχονται από το θαλάσσιο περιβάλλον, αλλά και σε βασικές πρώτες ύλες της ελληνικής βιομηχανίας τροφίμων (δείγματα ζυμαρικών, γαλακτοκομικών και αμυλούχων προϊόντων κ.α), αντίστοιχα. ΜΕΘΟΔΟΙ Οι μέθοδοι ανίχνευσης που αναπτύχθηκαν εστιάζονται στη χρήση Μοριακών τεχνικών, οι οποίες βασίζονται στον τομέα της Μοριακής Βιολογίας. Στην περίοδο διεξαγωγής της συγκεκριμένης πειραματικής εργασίας, η οποία αποτελεί μέρος ερευνητικού προγράμματος, επιστημονικός υπεύθυνος του οποίου είναι ο Δρ. Αντώνης Λαμπιδώνης, πραγματοποιήθηκαν αξιολογήσεις συγκεκριμένων εμπορικών πακέτων (kits) απομόνωσης DNA από τους εμπορικούς οίκους «HAI KANG Life Corporation» και «BIOO Scientific». Ταυτόχρονα, εφαρμόστηκε απομόνωση του γενετικού υλικού σύμφωνα με το πρότυπο ISO/FDIS Μετά την απομόνωση του γονιδιωματικού DNA από εισερχόμενα δείγματα και αντιδείγματα του εργαστηρίου Food Allergens Laboratory, διαπιστώθηκε η ποιότητα του απομονωμένου δείγματος DNA με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% παρουσία βρωμιούχου αιθιδίου. Την απομόνωση DNA διαδέχθηκαν οι αντιδράσεις PCR και Real Time PCR για την ποιοτική και ημιποσοτική ανίχνευση των συγκεκριμένων παθογόνων, αντίστοιχα. Οι αντιδράσεις PCR, γενικότερα, στηρίζονται στην ανίχνευση συγκεκριμένων περιοχών γονιδίων-στόχων των υπό εξέταση παθογόνων παραγόντων μέσω ειδικών ζευγών εκκινητών. Ειδικότερα, ανιχνεύθηκαν τμήματα της κωδικοποιούσας περιοχής των «θερμοευαίσθητων» γονιδίων της αιμολυσίνης [Thermostable direct hemolysin gene-related Hemolysin gene (trh) και Thermostable direct hemolysin gene (tdh)], γονίδια τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί σε μελέτες για την ανίχνευση των παθογόνων V. parahaemolyticus και B. cereus, αντίστοιχα, με τη χρήση κατάλληλων εκκινητών. Τα προϊόντα των ανωτέρω γονιδίων έχουν παρατηρηθεί σε όλα τα στελέχη του V. Parahaemolyticus, το μέγεθος των οποίων ανέρχεται στις 450 bp (Ward and Bej, 2006), αλλά και σε όλα τα στελέχη του B. cereus, το μέγεθος των οποίων ανέρχεται στις 185 bp (Wang et al., 1997), αντίστοιχα. Θερμοκρασιακό πρωτόκολλο PCR Αρχική αποδιάταξη 95 C για 10 min Αποδιάταξη DNA στόχου 95 C για 1 min Υβριδοποίηση εκκινητών C για 1 min Επιμήκυνση εκκινητών 72 C για 1 min Τελική επέκταση 72 C για 10 min Αριθμός κύκλων αντίδρασης: 35 Πίνακας 1: Συνθήκες Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης (PCR) για την ποιοτική ανίχνευση των παθογόνων Vibrio parahaemolyticus και Bacillus cereus. 189

191 Το θερμοκρασιακό πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε για την ποιοτική ανίχνευση των παθογόνων V. parahaemolyticus (θερμοκρασία υβριδοποίησης εκκινητών 59 C) και B. cereus (θερμοκρασία υβριδοποίησης εκκινητών 55 C), χρησιμοποιώντας ~150 ng/μl συγκέντρωσης απομονωμένου DNA, παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Το θερμοκρασιακό πρωτόκολλο της Real Time PCR που χρησιμοποιήθηκε για τον ημι-ποσοτικό προσδιορισμό των δυο παθογόνων ήταν κοινό. Η συγκέντρωση του απομονωμένου DNA που χρησιμοποιήθηκε στις αντιδράσεις ανήλθε στα ~100 ng/μl (Πίνακας 2). Θερμοκρασιακό πρωτόκολλο Real Time PCR Υβριδοποίηση - Επιμήκυνση εκκινητών 50 C για 2 min Αριθμός κύκλων Αρχική Αποδιάταξη 95 C για 10 min αντίδρασης: 1 Αποδιάταξη DNA στόχου 95 C για 15 sec Αριθμός κύκλων Υβριδοποίηση - Επιμήκυνση εκκινητών 60 C για 1 min αντίδρασης: 40 Πίνακας 2: Συνθήκες Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (Real Time PCR) για την ημι-ποσοτική ανίχνευση των παθογόνων Vibrio parahaemolyticus και Bacillus cereus. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΧΟΛΙΑΣΜΟΣ Μετά τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό των προϊόντων σε πήκτωμα αγαρόζης 2%, παρουσία βρωμιούχου αιθιδίου και κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος (ΤΒΕ), παρατηρήθηκε η ενίσχυση της ζώνης του αναμενόμενου μήκους των 450 bp για την ποιοτική ανίχνευση του παθογόνου Vibrio parahaemolyticus. Για την ανίχνευση του παθογόνου Bacillus cereus παρατηρήθηκε η ενίσχυση του προϊόντος αναμενόμενου μήκους 185 bp καθώς και του θετικού control του εμπορικού πακέτου (350 bp) (ενδεικτικό δείγμα αλεύρου 1, σε αντίθεση με το δείγμα αλεύρου 2 Εικόνα 1). Εικόνα 1: Αποτελέσματα εφαρμογής PCR για την ανίχνευση του παθογόνου Bacillus cereus μετά από τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό των προϊόντων σε πήκτωμα αγαρόζης 2%, παρουσία βρωμιούχου αιθιδίου. Στo πήκτωμα απεικονίζονται τα μεγέθη του μοριακού δείκτη (DNA Ladder), το προϊόν της PCR μήκους 185 bp που αντιστοιχεί στo απομονωμένο γενετικό υλικό ενδεικτικού θετικού δείγματος αλεύρου 1 (σε αντίθεση με το δείγμα αλεύρου 2) καθώς και τα προϊόντα της PCR μήκους 350 bp που αντιστοιχούν στα Positive και Inhibition Control του υπό μελέτη παθογόνου. Η χρήση του Inhibition Control ενδείκνυται για τη διαπίστωση ύπαρξης διαφόρων αναστολέων στο απομονωμένο γενετικό υλικό, οι οποίοι εμποδίζουν τη δράση της πολυμεράσης και την αντίδραση της PCR. Για την ημι-ποσοτική ανίχνευση των εξεταζόμενων παθογόνων μέσω Real Time PCR, εξετάστηκε ο αριθμός των κύκλων κατά την διάρκεια του οποίου, το δείγμα φτάνει το όριο «Threshold» [Threshold cycle (Ct)], του σημείου δηλαδή στο οποίο ξεχωρίζει έντονα το φθορίζον σήμα των προϊόντων της Real Τime PCR από το φόντο. Όσο μεγαλύτερη είναι η ποσότητα της αρχικής αλληλουχίας DNA στο κάθε δείγμα τόσο νωρίτερα εμφανίζεται η τιμή Ct για κάθε δείγμα, δηλαδή αναλογικά η Ct είναι μικρότερη. Στην Εικόνα 2 καθώς και στον Πίνακα 3, φαίνεται παραστατικά η περίπτωση ενδεικτικού θετικού στην ανίχνευση του παθογόνου Vibrio parahaemolyticus δείγματος γαρίδας, όπως εμφανίζεται στο Test Report της Real Time PCR. 190

192 Real Time PCR Fluorescence Test Report Well Type Test Item CT Label/Name B5 Sample Vibrio 17, B6 Positive Vibrio 16,43 Control B7 Negative Vibrio No CT Control B8 Control Vibrio No CT Control Εικόνα 2, Πίνακας 3: Αποτελέσματα Real Time PCR δείγματος γαρίδας για την ανίχνευση του παθογόνου Vibrio parahaemolyticus. Η ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας δίνει μια σειρά από συγκεκριμένα πρωτόκολλα ανίχνευσης κατά τα οποία ο τύπος και οι συνθήκες ανάλυσης που χρησιμοποιούνται είναι ανάλογα προσαρμοσμένες για την ανίχνευση των παθογόνων Vibrio parahaemolyticus και Bacillus cereus, στο αντίστοιχο δείγμα τροφίμου που εξετάζεται. ABSTRACT In the recent years the development of Molecular Biology allows the detection of pathogens to key raw materials in the Greek food industry. Vibrio spp. (e.g. Vibrio parahaemolyticus) is the pathogen that belongs to the Gram-negative bacteria exhibiting hemolytic properties. In addition, a separate pathogen, Gram-positive bacterium, Bacillus cereus, forms heat-resistant spores during thermal processing contaminated food. Food analysis and new techniques of Polymerase Chain Reaction (PCR) allow faster diagnosis compared to conventional culture methods. The advantage of these methods is the direct and valid result that requires the control of food. The aim of this work is the implementation of appropriate protocols and PCR techniques for the detection of the aforementioned pathogens in organisms derived from sea and in various samples of Greek food industry. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Agata, N., Ohta, M., Mori, and Isobe M A novel dodecapepsipeptide, a cereulide, is an emetic toxin of B.cereus. FEMS Microbiology Letters, 129: Granum, P.E. and Lund, T Bacillus cereus enterotoxins. FEMS Microbiology Letters, 157: Kramer, J.M. and Gilbert, R.J Bacillus cereus and other Bacillus species. In Doyle, M.P. (ed.), Foodborne Bacterial Pathogens, New York: Marcel Dekker, pp Ward LN, and Bej AK Detection of Vibrio parahaemolyticus in Shellfish by Use of Multiplexed Real-Time PCR with TaqMan Fluorescent Probes. Applied and Environmental Microbiology 72(3): Wang, R.F., Cao, W.W. and Cerniglia C.E A universal protocol for PCR detection of 13 species of pathogens in foods. Journal Of Applies Microbiology, 83:

193 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΑΝΟΣΟΧΗΜΙΚΩΝ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΓΙΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΛΛΕΡΓΙΟΓΟΝΟΥ ΜΟΥΣΤΑΡΔΑΣ ΣΕ ΤΡΟΦΙΜΑ Σ. Λοϊζου 1, Δ. Κίζης 2, Γ. Σειραγάκης 2 και Σ.A. Νικολάου 1 1 St George s, University of London Medical School at the University of Nicosia, Ερευνητικό Ίδρυμα, Πανεπιστήμιο Λευκωσίας, Λεωφόρος Μακεδονιτίσσης 46, 1700, Λευκωσία, Κύπρος 2 FA Food Allergens Lab Ltd, Καλοψίδας 38, 7060 Λειβάδια, Κύπρος Αντικείμενο της παρούσας έρευνας είναι η σύγκριση ανοσοχημικών τεχνικών με αυτών μοριακής βιολογίας που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση αλλεργιογόνων σε τρόφιμα. Σκοπός μας είναι η βέλτιστη επιλογή για ανίχνευση και προσδιορισμό αλλεργιογόνου μουστάρδας σε διάφορες κατηγορίες πρώτων υλών και τροφίμων (άλευρα, αρτοσκευάσματα, προϊόντα κρέατος). Η μουστάρδα είναι ένα από τα 14 αλλεργιογόνα τρόφιμα που συγκαταλέγονται στον κανονισμό 1169/2011. Η τεχνική Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) και η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης [Polymerase Chain Reaction (PCR)], είναι οι πιο διαδεδομένες τεχνικές ανίχνευσης αλλεργιογόνων και γι' αυτό το λόγο υπάρχει ένας σχετικά μεγάλος αριθμός αντίστοιχων εμπορικών πακέτων (kit). Στο έργο γίνεται αξιολόγηση επιλεγμένων kit που χρησιμοποιούν τις μεθόδους ELISA (Immunolab και Veratox-Neogen) και PCR (Watcher HaiKang Life και Biooscientific), με απώτερο σκοπό τη σύγκριση των μεθόδων/kit σε πολλαπλό επίπεδο (ποσοστό ανάκτησης ανά μέθοδο εκχύλισης-δύο διαφορετικά kit DNA extraction, αναλυτική επάρκεια, ευαισθησία, ακρίβεια, επαναληψιμότητα). Παρουσιάζονται τα δεδομένα σύγκρισης των δυο επιλεγμένων kit ELISA όπου καταδεικνύεται καλύτερο όριο ανίχνευσης για το kit της Immunolab όπως και μεγαλύτερο εύρος ποσοτικοποίησης (2-60ppm έναντι ppm). Η αποτελεσματικότητα εκχύλισης του DNA των δύο εμπορικών kit (Biooscientific, HaikangLife) της μεθόδου PCR ήταν παρεμφερής ενώ και η PCR κατάφερε να ανιχνεύσει ισοδύναμα με το καλύτερο από τα δύο επιλεγμένα ELISA kit, ίχνη μουστάρδας (της τάξης του 1mg/Kg) σε τρόφιμα. 192

194 ΑΝΑΚΤΗΣΗ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΡΟΤΕΝΟΕΙΔΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗΣ ΤΟΜΑΤΑΣ Τσέκου Χρήστος, Κατσούφη Σταματίνα, Στρατή Ειρήνη, Μπατρίνου Ανθιμία και Κουσίσης Σταμάτης Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Τεχνολογίας Τροφίμων και Διατροφής ΤΕΙ Αθήνας. Οι βιομηχανίες επεξεργασίας και παραγωγής προϊόντων τομάτας παράγουν μεγάλες ποσότητες απόβλητων που αποτελούνται κατά ένα μεγάλο μέρος από φλοιούς και σπόρους τομάτας. Τα υπολείμματα αυτά είναι σημαντική πηγή καροτενοειδών και κυρίως λυκοπενίου. Στην παρούσα εργασία, απόβλητα βιομηχανικής τομάτας, σε ξηρή και σε υγρή μορφή, υποβλήθηκαν σε ενζυμική κατεργασία πριν την εκχύλιση με επιλεγμένους οργανικούς διαλύτες, προκειμένου να βελτιστοποιηθεί η ανάκτηση των καροτενοειδών. Τα ανακτημένα καροτενοειδή προσδιορίστηκαν ποσοτικά με φασματοφωτομετρική μέθοδο και με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης HPLC. Τα ένζυμα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα Pectinex Ultra AFP και Cellulyve AN 3500, με πηκτινολυτική και κυτταρινολυτική δράση και συγκεντρώσεις 70 U/g και 122,5 U/g, αντίστοιχα, σε χρόνο επώασης 180 min. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και τα δύο ένζυμα έδρασαν αποτελεσματικά στην ανάκτηση των ολικών καροτενοειδών και λυκοπενίου. Πιο συγκεκριμένα, το ένζυμο της πηκτινάσης (Pectinex Ultra AFP) έδρασε αποτελεσματικότερα σε σχέση με το ένζυμο της κυτταρινάσης (Cellulyve AN 3500) στον γαλακτικό αιθυλεστέρα για την ανάκτηση των ολικών καροτενοειδών και του λυκοπενίου. Στο απόβλητο τομάτας μετά από ξήρανση παρατηρήθηκε σχεδόν 9πλάσια αύξηση στην ανάκτηση του λυκοπενίου και με τα δυο ένζυμα στην εκχύλιση με γαλακτικό αιθυλεστέρα και διπλάσια έως τριπλάσια αύξηση στην εκχύλιση με εξάνιο. Αποδοτικότερος οργανικός διαλύτης για την εκχύλιση βρέθηκε να είναι ο γαλακτικός αιθυλεστέρας που αποτελεί μια καλή επιλογή, επειδή παραλαμβάνει σε ικανοποιητικό βαθμό τα καροτενοειδή και είναι βιοαποικοδομήσιμος. Στην ενζυμική κατεργασία υγρών βιομηχανικών αποβλήτων τομάτας δεν παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στην ανάκτηση των καροτενοειδών, πιθανώς λόγω της παρουσίας εγγενών, μη αδρανοποιημένων ενζύμων που παρεμποδίζουν τη δράση των προστιθέμενων. Απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση ως προς τις βέλτιστες συνθήκες δράσης (συγκέντρωση, χρόνος επώασης) των προστιθέμενων ενζύμων σε υγρά βιομηχανικά απόβλητα. 193

195 Predicting sensory characteristics of cakes enriched with xylanase treated cereal brans by physicochemical and thermal properties assessment Dimitra Lebesi & Constantina Tzia Laboratory of Food Chemistry and Technology, School of Chemical Engineering, National Technical University of Athens, Athens, Greece ABSTRACT Oat and rice bran were added to cake samples at 30% flour base. Also, brans treated with different levels (70, 700 ppm) of commercial enzyme xylanase (Pentopan mono BG) were used. The addition of enzyme treated brans led to increased batter viscosity and to cakes with improved characteristics (reduced crumb firmness and increased specific volume and porosity). According to the results, underutilized sources of bran after enzymic treatment can be properly incorporated in baked goods, improving their nutritional value and quality characteristics. Sensory characteristics of cakes can be adequately predicted by their physicochemical characteristics assessment. INTRODUCTION Cereal bran is a low cost and common source of dietary fibre that is considered a functional food component, providing well-known benefits on human health. By using cereal bran one can upgrade agricultural products and by-products for use as food ingredients without any additional cost. However, the addition of bran especially in such amounts that health benefits can be expected, may prove detrimental for the quality characteristics of the products. The treatment of raw cereal brans with xylanase alters the properties of brans, influencing the physicochemical, thermal and sensorial properties of the final product as well. The objective of the present work was to examine the relationships between sensory attributes and objective measurements of physicochemical and thermal properties of cakes enriched with cereal brans. In addition, the effect of the endoxylanase (EX) treatment of brans on the quality characteristics of the cakes was evaluated. MATERIALS AND METHODS Oat (OB) and rice (RB) brans were treated with different levels (0, 70 and 700 ppm) of commercial enzyme (EX) xylanase (Pentopan mono BG) containing 2500 xylanase units/g (30 min, T=40 C, ph 5-6). EX treated bran was added to the cakes at 30% flour base. The following cake formulations were studied: reference oat bran (OB0), 70 ppm EX treated oat bran (OB1), 700 ppm EX treated oat bran (OB2), reference rice bran (RB0), 70 ppm EX treated rice bran (RB1), 700 ppm EX treated rice bran (RB2). Cake batter was prepared in a Kenwood mixer (Model KM 400, Kenwood, UK) using the sugar batter method. The cake recipe was as follows: Component Sugar Shortening Milk Egg Vanillin Leavening agents Wheat Flour/Bran blend basis (%)

196 Measurements The rheological behaviour of cake batters was determined using a rotational viscometer (RC1 Rheometer, Rheotec Messtechnic GmbH, Raderburg, Germany) and by fitting the data to the Power law model. The thermal properties of the batters were determined with differential scanning calorimetry (DSC 6, Perkin Elmer Inc., Wellesley, USA). Cake volume (cm 3 ) was determined by rapeseed displacement method. Crumb firmness (N) was measured with a Stable Micro System Texture Analyser (TA-XTi2 Stable Microsystems, Surrey, UK) using AACC (74-09) method. The porosity was estimated by using a gas multipycnometer (MVP-1, Quantachrome, USA). Moisture of the cakes was determined according to AACC (44-15A) method. The sensorial properties of cakes were evaluated by a 32 member trained (ISO 5492:2008, ISO 5496:2006) panel that had experience in accessing bakery products. Hedonic sensory tests were conducted by fifty panellists using a nine-point hedonic scale ranging from like extremely (9) to dislike extremely (1). RESULTS AND DISCUSSION The relationship between the sensory and the instrumentally evaluated characteristics of cakes containing EX treated and untreated brans was approached by using multiple regression analysis (Table 1). Cake appearance (based mainly on the sensorially evaluated proofing) can be efficiently predicted when T p and k cp of the batter as well as moisture and volume of the cakes are known. Overall acceptability is more dependent on cake volume, firmness and batter T p and k cp, while the decomposition perceived as mouthfeel, a very important textural parameter of cakes with brans, could be predicted when batter T p and k cp along with the crumb moisture are known. This is useful for the food industries as they can foresee the consumers attitude towards their product before it reaches the market, by measuring some physicochemical and thermal properties of the products, and meet their expectations. Table 1. Prediction of cake sensory characteristics from their instrumentally evaluated characteristics Sensory Parameter (Y) Regression models R 2 Appearance 0.436*T p *k cp *V-0.242*M Texture (Decomposition) 0.749*M+1.132*k cp *T p *M*k cp *T p Overall Acceptability 0.539*V-0.419*F+0.264*k cp *T p F: Firmness (N), T p : Peak gelatinization temperature ( C), M: Crumb moisture (% w.b.), V: Sp. Volume (cm 3 /g), k cp : Batter consistency index (Pa*s n ) Rheological and thermal properties of cake batter EX treatment significantly (P<0.05) increased the consistency values (k cp ) in the cake batters favoring the retention of air at the end of baking [1], while it lowered the shear-thinning index (n) in the respective batters indicating a less complex structure (Table 2). Considering the individual CB sources, OB cake batters showed the highest k cp values, while RB cake batters showed the highest n values (Table 2) [2]. 195

197 Temperature ( ⁰C) Table 2. Gelatinization enthalpy (ΔH g ) and rheological data (n: flow behavior index; k cp : consistency index) of cake batters Sample Codes k cp (Pa*s n ) N ΔH g (J/g) OB (±0.038) (±0.011) (±0.668) OB (±0.388) (±0.006) (±0.282) OB (±1.122) (±0.030) (±0.714) RB (±0.239) (±0.050) (±0.411) RB (±0.508) (±0.006) (±0.796) RB (±0.228) (±0.016) (±0.496) CB type affected the T o, T p, T c (onset, peak and conclusion temperature respectively) and ΔH g of the batters. OB containing cakes exhibited significantly higher T o, T p and T c (Figure 1) and lower ΔH g than RB cakes (Table 2). As a general trend it was observed that EX treatment increased significantly (P<0.05) the T o and T p values and lowered significantly (P<0.05) the ΔH g values of the respective batters. The reduction of ΔH g suggests the formation of a more stable structure T0 Tp Tc OB0 OB1 OB2 RB0 RB1 RB2 Figure 1. Starch gelatinization temperatures of cake batters Cake Quality characteristics The effect of EX treatment and CB type on specific volume, firmness and porosity of the respective cakes was significant (P<0.05) (Table 3). OB enriched cakes showed higher specific volumes than cakes with RB. In particular, OB1 cakes exhibited the highest specific volume, while RB0 cakes had the lowest. Cake volume loss may ensue as a result of the rapidly rising bubbles in low viscosity cake batters, as in the case of OB0 and RB0. Similar results were obtained for cake crumb porosity, with the higher volume cakes having the higher porosity. All cakes containing EX treated CB exhibited significantly (P<0.05) softer texture than OB0 and RB0 containing cakes. In the case of OB0 and RB0 lower cake volumes with coarser crumb and higher crumb firmness were obtained. OB1 containing cakes had the lowest crumb firmness while RB0 cakes had the highest. Finally the CB type affected significantly (P<0.05) the crumb firmness with RB containing cakes exhibiting higher values. None of the qualitative attributes of cakes varied when increasing the level of EX treatment. Table 3. Quality attributes of cakes in respect to crumb firmness, specific volume and porosity. Sample Codes Firmness (N) Sp. Volume (cm 3 /g) Porosity OB (±1.239) (±0.014) (±0.008) OB (±0.232) (±0.023) (±0.009) OB (±0.540) (±0.044) (±0.020) RB (±0.455) (±0.106) (±0.015) RB (±0.512) (±0.009) (±0.008) RB (±1.059) (±0.004) (±0.003) 196

198 Sensory evaluation Regarding the descriptive evaluation parameters, aftertaste and off flavor varied significantly (P<0.05) with the CB type used, textural attributes with the EX treatment of CB, while volume and porosity varied with both of them (Table 3). RB cakes had more intense off flavor and aftertaste than OB cakes, due to the husky taste of RB. EX treatment of both OB and RB increased the scores for the volume and the porosity of the respective cakes, while the sensory brittleness and decomposition perceived as mouthfeel was significantly (P<0.05) lowered. Attending overall acceptability, it can be stated that addition of EX treated CB led to cakes with a greater appreciation by panelists (Figure 2). This is mainly attributed to the textural parameters and the appearance of the respective cakes, as the flavor and taste of the cakes did not alter significantly when EX treated CB were used. The type of CB also affected significantly (P<0.05) the overall acceptability of the cakes, with OB cakes having higher scores than RB cakes. The level of the EX treatment did not alter significantly (P<0.05) the sensory attributes of the cakes. Overall acceptability Aftertaste Off flavour Volume Porosity Decomposition perceived as mouthfeel OB0 OB1 OB2 RB0 RB1 RB2 Brittleness Figure 2. Influence of the CB type and the endoxylanase treatment of CB on descriptive and hedonic sensory scores of the respective cakes CONCLUSIONS The cake sensory attributes can be efficiently predicted by objective measurement of the thermal and physicochemical parameters of cakes or batters. EX treatment of CBs led to cakes with improved volume, porosity, texture and sensory characteristics, and increased batter viscosity and gelatinization temperature. The level of the EX treatment of CBs did not result in differences to batter and cake properties. Comparing the sources of CB used, OB addition resulted to cakes with superior characteristics. Underutilized sources of bran after enzymatic modification can be properly incorporated in baked goods, improving their nutritional value and quality characteristics. REFERENCES [1] Gómez M., Ronda F., Caballero P., Blanco C., Rosell C.M Functionality of different hydrocolloids on the quality and shelf-life of yellow layer cakes. Food Hydrocolloids, 21: [2] Lebesi D., Tzia C Development of dietary fiber enriched cakes by incorporation of endoxylanase treated cereal brans. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 13:

199 Παραγωγή προβιοτικών επιτραπέζιων ελιών: ενσωμάτωση προβιοτικών βακτηρίων σε εδώδιμες μεμβράνες Σ. Κατσαμπές, Π. Σφακιανάκης, Β. Πολυχνιάτου, Σ. Χανιώτη, Χ. Χρανιώτη, Β. Γιάννου, Κ. Τζιά Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών, EMΠ Περίληψη Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η ενσωμάτωση προβιοτικών βακτηρίων Bifidobacterium animalis σε εδώδιμες μεμβράνες υδροξυ-προπυλο-μεθυλο-κυτταρίνης (HPMC) και χιτοζάνης για τη συντήρηση πράσινων επιτραπέζιων ελιών σε συνδυασμό με συσκευασία υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα (ΜΑΡ) και διερευνήθηκαν οι μεταβολές στις φυσικοχημικές, μικροβιολογικές και οργανοληπτικές ιδιότητές των ελιών κατά την αποθήκευσή τους σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Εισαγωγή Η έρευνα τις επιτραπέζιες ελιές έχει επικεντρωθεί τα τελευταία χρόνια σε τεχνικές συντήρησης με σκοπό τη διατήρηση της φυσικής ποιότητας και την παράταση της διάρκειας ζωής τους, χωρίς την υποβάθμιση των οργανοληπτικών τους χαρακτηριστικών. Οι εδώδιμες μεμβράνες έχουν διερευνηθεί στη συντήρηση των επιτραπέζιων ελιών με ελπιδοφόρα αποτελέσματα στην παράταση του χρόνου διατήρησής τους σε συνδυασμό με συσκευασία τροποποιημένης ατμόσφαιρας (ΜΑΡ) [1-3]. Αντίστοιχα, η κατανάλωση των προβιοτικών βακτηρίων μέσω των τροφίμων έχει αποδειχθεί ότι επιφέρει ευεργετικές ιδιότητες για την υγεία του ανθρώπου, όπως ικανότητα ρύθμισης της μικροχλωρίδας του εντέρου, παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών, ενίσχυση της προστατευτικής δράσης έναντι παθογόνων κ.α. Οι επιτραπέζιες ελιές αποτελούν ένα καλό όχημα για τη μεταφορά προβιοτικών οργανισμών τόσο λόγω της μορφολογίας/δομής τους όσο και λόγω των περιεχόμενων θρεπτικών συστατικών τους. Ως εκ τούτου, η ενσωμάτωση των προβιοτικών βακτηρίων σε εδώδιμες μεμβράνες προσφέρει μία εναλλακτική μέθοδο παραγωγής προβιοτικών επιτραπέζιων ελιών, που οδηγεί σε ένα λειτουργικό προϊόν με βάση την ελιά. Πειραματικό μέρος Πρώτες ύλες: Στα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν πράσινες ελιές (προσφορά ΓΑΙΑ ΤΡΟΦΙΜΑ ΑΒΕΕ): (α) βιολογικές, φυσικής εκπίκρανσης, εκπυρηνωμένες, διατηρημένες σε άλμη και (β) μη εκπικρισμένες (μη εκπυρηνωμένες) σε νερό υπό ψύξη. Ως επικαλυπτικές μεμβράνες χρησιμοποιήθηκαν υδατικά διαλύματα: χιτοζάνης 1% w/v (με 1% v/v οξικό οξύ) και HPMC 1% w/v. Η άλμη για τις μη εκπικρισμένες ελιές ήταν 8% w/v σε NaCl. Τα προβιοτικά βακτήρια ήταν στέλεχος Bifidobacterium animalis σε λυοφιλιωμένη μορφή (προσφορά ΦΑΓΕ ΑΕ) και προστέθηκε στα επικαλυπτικά διαλύματα σε συγκέντρωση 0,5% w/v. Παράλληλα εξετάζονται και μη επικαλυμμένες ελιές τόσο πράσινες βιολογικές φυσικής εκπίκρανσης όσο και πράσινες μη εκπικρισμένες, ενώ εμβολιασμός με προβιοτικά βακτήρια γίνεται και σε δείγματα μη εκπικρισμένων ελιών σε άλμη. Πειραματική διαδικασία: Οι ελιές φυσικής εκπίκρανσης (α) υφίστανται εκπλύσεις για μείωση της αλατότητας. Οι ελιές (α και β) αρχικά στεγνώνονται, εμβαπτίζονται για 2 min στα διαλύματα των επικαλυπτικών μεμβρανών (με ή χωρίς προβιοτικά), στραγγίζονται, στεγνώνουν, συσκευάζονται υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα (80% ατμοσφαιρικός αέρας - 20% CO 2 ) και αποθηκεύονται για 100 (α) ή 50 ημέρες (β) σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (25 ο C). 198

200 ph ph Αλατότητα % κ.β. Αλατότητα %κ.β. Αναλύσεις - Μετρήσεις: Στις ελιές μετρήθηκαν οι εξής ιδιότητες: η: αλατότητα % κ.β., το ph, η ολική μικροβιακή χλωρίδα, οι μύκητες, τα βιώσιμα γαλακτικά βακτήρια και η συνολική οργανοληπτική εκτίμηση (κλίμακα 1-10, 10=άριστα). Αποτελέσματα και Συζήτηση Κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης των εκπυρηνωμένων βιολογικών φυσικής εκπίκρανσης και των μη εκπικρισμένων με πυρήνα επικαλυμμένων προβιοτικών πράσινων ελιών συσκευασμένων με τροποποιημένη ατμόσφαιρα (ΜΑΡ) μελετήθηκαν οι μεταβολές στις φυσικοχημικές, μικροβιολογικές και οργανοληπτικές ιδιότητές τους και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στα Διαγράμματα Η αλατότητα των πράσινων ελιών φυσικής εκπίκρανσης όπως και των μη εκπικρισμένων επικαλυμμένων ή μη διατηρείται περίπου σταθερή κατά την αποθήκευση (Διαγράμματα 1, 2) Τυφλό CH CH - προβ. HPMC HPMC - προβ Άλμη Άλμη - προβ. CH CH - προβ. HPMC HPMC - προβ. t (ημέρες) t (ημέρες) Διάγραμμα 1: Μεταβολή της αλατότητας πράσινων ελιών φυσικής εκπίκρανσης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης Διάγραμμα 2: Μεταβολή της αλατότητας πράσινων μη-εκπικρισμένων ελιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης Τυφλό CH CH - προβ. HPMC HPMC - προβ Άλμη Άλμη - προβ. CH CH - προβ. HPMC HPMC - προβ. t (ημέρες) t (ημέρες) Διάγραμμα 3: Μεταβολή του ph πράσινων ελιών φυσικής εκπίκρανσης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης Διάγραμμα 4: Μεταβολή του ph πράσινων μη εκπικρισμένων ελιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης Το ph των πράσινων ελιών φυσικής εκπίκρανσης μειώνεται αρχικά κατά την αποθήκευση ενώ μετά παρουσιάζει τάση αύξησης. Το ph των ελιών με τα προβιοτικά παρουσιάζει ίδια πορεία με μεγαλύτερες γενικώς μεταβολές (Διάγραμμα 3). Το ph των πράσινων μη-εκπικρισμένων ελιών αρχικά αυξάνεται και στη συνέχεια μειώνεται απότομα κατά την αποθήκευση (Διάγραμμα 4). Από τα αποτελέσματα της ολικής μικροβιολογικής χλωρίδας (Διαγράμματα 5, 6), του πληθυσμού των μυκήτων (Διαγράμματα 7, 8) και των γαλακτικών βακτηρίων (Διαγράμματα 9, 10) προκύπτει ότι τόσο οι βιολογικές φυσικά εκπικρισμένες ελιές όσο και οι μη εκπικρισμένες ελιές διατηρούνται σε καλή μικροβιολογική κατάσταση για τα χρονικά διαστήματα αποθήκευσης που δοκιμάστηκαν (100 και 50 ημερών αντίστοιχα). Με βάση τα γαλακτικά βακτήρια φαίνεται ότι οι επικαλυμμένες ελιές προβιοτικές ελιές διατηρούν ικανοποιητικά τα χαρακτηριστικά των προβιοτικών προϊόντων. 199

201 Συνολική αρέσκεια Συνολική αρέσκεια logcfu/g logcfu/g logcfu/g logcfu/g logcfu/g logcfu/g t (ημέρες) Τυφλό CH CH - προβ. HPMC HPMC - προβ. Διάγραμμα 5: Μεταβολή της ολικής μικροβιακής χλωρίδας πράσινων ελιών φυσικής εκπίκρανσης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης t (ημέρες) Άλμη Άλμη - προβ. CH CH - προβ. HPMC HPMC - προβ. Διάγραμμα 6: Μεταβολή της ολικής μικροβιακής χλωρίδας πράσινων μη-εκπικρισμένων ελιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης t (ημέρες) Τυφλό CH CH - προβ. HPMC HPMC - προβ. Διάγραμμα 7: Μεταβολή των πληθυσμών μυκήτων πράσινων ελιών φυσικής εκπίκρανσης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης t (ημλερες) Άλμη Άλμη - προβ. CH CH - προβ. HPMC HPMC - προβ. Διάγραμμα 8: Μεταβολή των πληθυσμών μυκήτων πράσινων μη εκπικρισμένων ελιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης t (ημέρες) Τυφλό CH CH - προβ. HPMC HPMC - προβ. Διάγραμμα 9: Μεταβολή των πληθυσμών γαλακτικών βακτηρίων πράσινων ελιών φυσικής εκπίκρανσης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης t (ημέρες) Άλμη Άλμη - προβ. CH CH - προβ. HPMC HPMC - προβ. Διάγραμμα 10: Μεταβολή των πληθυσμών γαλακτικών βακτηρίων πράσινων μη εκπικρισμένων ελιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης t (ημέρες) Τυφλό CH CH - προβ. HPMC HPMC - προβ. Διάγραμμα 11: Μεταβολή της συνολικής οργανοληπτικής αρέσκειας πράσινων ελιών φυσικής εκπίκρανσης συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης t (ημέρες) Άλμη Άλμη - προβ. CH CH - προβ. HPMC HPMC - προβ. Διάγραμμα 12: Μεταβολή της συνολικής οργανοληπτικής αρέσκειας πράσινων μη εκπικρισμένων ελιών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης

202 Η συνολική αρέσκεια των πράσινων ελιών φυσικής εκπίκρανσης μειώνεται σταδιακά κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης (Διάγραμμα 11). Οι επικαλυμμένες ελιές χωρίς προβιοτικά είχαν γενικώς μεγαλύτερη προτίμηση από τους δοκιμαστές. Η συνολική αρέσκεια των πράσινων μη εκπικρισμένων ελιών αυξάνεται τις πρώτες ημέρες αποθήκευσης καθώς ολοκληρώνεται η εκπίκρανση των ελιών και έκτοτε σταθεροποιείται (Διάγραμμα 12). Σε αντίθεση με τις πράσινες ελιές φυσικής εκπίκρανσης, φαίνεται ότι οι ελιές με προβιοτικά παρουσιάζουν περίπου ίδια επίπεδα συνολικής αρέσκειας με εκείνες χωρίς προβιοτικά. Οι επικαλυπτικές μεμβράνες χιτοζάνης και HPMC συμβάλλουν στην καλύτερη διατήρηση των ποιοτικών χαρακτηριστικών των βιολογικών φυσικά εκπικρασμένων καθώς και των μη εκπικρισμένων προβιοτικών και μη πράσινων ελιών. Βιβλιογραφία 1. Fernandez G.A., Fernandez Diez M.J., Adams M.R., (1997). Table olives: Production and Processing, Chapman and Hall. 2. Li D., Zhao Y., (2007). Innovations in the development and application of edible coatings for fresh and minimally processed fruits and vegetables. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 6: Moutsatsou P., Tzia C., Kerasiotis T., Skondras D., (2011). Prolongation of table olive shelf-life by combining edible coating application and modified atmosphere packaging (MAP), 11 th International Congress on Engineering and Food-ICEF11, May 22-26, 2011, Athens, Greece, Congress Proceedings, Vol. II: Ευχαριστίες H παρούσα έρευνα πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο υλοποίησης του έργου με τίτλο «Μελέτη συντήρησης ελιών και λαχανικών με εδώδιμες μεμβράνες και συσκευασία υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα - Σχεδιασμός προϊόντων με βάση την ελιά με φυσικές μεθόδους συντήρησης», της δράσης «ΣΥΝΕΡΓΑΣΙΑ» της ΓΓΕΤ, η οποία συγχρηματοδοτείται από το Ευρωπαϊκό Ταμείο Περιφερειακής Ανάπτυξης (ΕΤΠΑ) και από Εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού προγράμματος «ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΕΠΙΧΕΙΡΗΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑ» (ΕΠΑΝ ΙΙ) και των Περιφερειακών Επιχειρησιακών Προγραμμάτων (ΠΕΠ) των 5 Περιφερειών μεταβατικής στήριξης του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ)

203 Design and validation of sensory focused processes of foods C. Tzia, V. Giannou, V. Polychniatou, P. Sfakianakis, C. Chranioti, S. Chanioti Laboratory of Food Chemistry and Technology, School of Chemical Engineering, National Technical University of Athens, Athens, Greece ( ABSTRACT In the present work the factors affecting the sensorial properties of foods related to the food constituents, processing conditions, packaging and storage conditions are presented and the critical factors of the sensory focused processes that should be designed and validated are noticed. INTRODUCTION Sensory characteristics are the main quality characteristics of foods that designate the consumer choice and acceptability. The sensorial attributes are influenced during processing of foods depending on the applied method and conditions. Sensory quality of processed foods may also be altered during storage depending on the packaging and storage conditions. The possibility for control and maintenance of the sensory attributes of foods is of interest for food processors. Moreover, the identification of the processes directly and critically affecting the sensory quality of a food product is of great interest as well [1]. However, some food processes intend to develop one or certain sensory characteristics of food (i.e. flavor compounds extraction, removal of undesirable constituents, yogurt coagulation, etc.). The occurrence of a sensory attribute in respect to a certain process can be affected by various factors (i.e. type/amount of a material, proper processing conditions etc.) while the effectiveness of such a process has important impact on the total quality of the final product [2]. Such sensory focused processes should be designed and validated. In the present study representative sensory focused processes of foods are presented in relation to the sensory characteristic they induce (e.g. flavor, taste, odor, texture, appearance, color). Thereafter the methodology for their design and validation is developed. RESULTS & DISCUSSION Process design, from the sensorial characteristics point of view, includes the determination of the relative process parameters (formulation and conditions) focusing on the critical factors. A proper methodology is proposed for design verification and process validation. Critical factor for the formulation is the concentration of the ingredients and their addition in the correct/optimum quantity. Several food processes are specialized in the development of a sensorial property (e.g. the critical factors for the development of shape/size can be the extrusion conditions, coloring reactions (Maillard, caramelization) or bleaching can affect color, fermentation or deodorizing 202

204 induce odor characteristics, etc.). Optimum processing and storage/maintenance parameters can ensure the retention of desirable properties of foods and lead to the development of intended attributes in the final product. Thermal processing, freezing, proofing, baking/grilling and aeration are examined and the critical factors which may induce sensorial characteristics, such as time and intensity are recorded. Packaging and storage can also be very important. Parameters such as the material, type and integrity of packaging may affect the formation of off-flavors or generate oxidation. Finally, storage conditions (temperature, humidity, aeration, duration,) may affect color, odor, taste or flavor of food products through degradation, browning, decolorization, gelling or whey off reaction. In Table 1 the critical factors related to the receipt or food products formulation are specialized and typical examples are presented. Each ingredient concentration in the product receipt is welldefined during its design and is varied depending on its functional role in the food system. For example, yeast s and wheat flour s concentration in dough preparation are determinant for the sensorial quality (bread volume, expansion/inflation, crumb texture, etc.) of bread. Thus, the correct amount of ingredients should be estimated, weighed and added. These operations are more significant for minor constituents used in food preparations satisfying a certain role i.e. in order to increase viscosity, enhance color or flavor etc. Thus, accurate weighing and adding of the minor constituents is required. Table 1. Effect of constituents on the sensory properties of foods Constituent Critical factors Examples Receipt/Formulation - Definition of the ingredients concentration in the receipt/formulation - Ingredient - Addition of the correct amount of the ingredient Yeast and flour in bread - Minor constituents - Constituent quality (concentration in active substances) - Accuracy of weighing - Addition of the correct amount of the certain constituent 203 Coloring materials, texture improvers, flavorings, thickening agents, etc. In Table 2 typical examples of food processes specialized in the development of sensorial properties and the respective critical factors are shown. Also, typical food processing operations closely related to sensorial quality of foods and the relative critical control limits of these processes are presented. For food processes specialized in the development of the sensorial properties, the critical factors for the development of them (i.e. shape/size, color, odor, flavor etc.) should be taken in account during food process design and control. The critical factors are substantially linked to the particular process conditions required for the sensorial characteristics to attribute. Furthermore, the critical limits of conditions should be determined and controlled during the operation of food processes. For food processing or in particular certain steps crucially affecting the sensorial properties of foods (i.e. heating, chilling, freezing, dehydration etc.), the optimum conditions and the respective critical limits should be determined. Any deviation of critical limits of conditions in such processing

205 steps can lead to undesirable sensorial properties in the final product. For that reason the design and control of such processing steps for the various products is required. Table 2. Effect of process on the sensory properties of foods Process Examples Critical factors Specialized process for a certain sensory property development Processing: deviation of the including processes control limits Shape/size Color Foaming Odor Taste Consistency Texture Flavor Thermal process (heating, cooking, baking etc.) Refrigeration Freezing Proofing Baking Dehydration Aeration Fermentations Extraction Ripening Emulsion formation Grinding/milling - Extruder/extension conditions (Temp., screw speed, feeding etc.) - Extruder s matrix - Coloring reactions i.e. Maillard, caramalization etc. - Decolorization i.e. bleaching of oils - CO 2 production by fermentation i.e. in beer - CO 2 incorporation in beverages - Fermentation i.e. lactic acid production - Deodorization i.e. oil refining - Acidification i.e. yogurt production - Starch hydrolysis for sweetener syrup production - Gel formation i.e. soups - Whey off i.e. yogurt - Acid coagulation of milk i.e. yogurt production - Enzymic tendering i.e. in meat - Crispness, crunchiness i.e. extruded snacks, potato chips - Ripening i.e. cheese, wine production - Production of aromatic compounds i.e. fermentation - Deodorization of undesirable compounds Deviation of temperature-time of heating - inadequate color or browning - off-flavor, burnt-flavor - unexpected gel formation Deviation of temperature - color, appearance alteration (meat) Deviation of freezing rate, frozen temperature - texture shrinking due to large size/irregular ice crystals (fruits, vegetables) - texture and shape/appearance alteration due to frosting/ refrosting (ice cream) Deviation of temperature-time of proofing - appearance, volume (bread) Deviation of temperature-time of baking - color, taste (bakery products) Deviation of temperature - inadequate re-constitution Deviation of agitation - softness (ice cream) Deviation of temperature and other fermentation conditions - quality and intensity of flavor Deviation of selective volatility of compounds - flavor or off flavor (aromatic plants) Deviation of time and other ripening conditions - quality of flavor, balanced flavor profile, individual flavor compounds (wine, beer, etc.) Deviation of homogenization conditions - appearance (homogenous or decomposed) Deviation of grinding and sieving conditions - appearance (particle size distribution) The packaging of foods (material, type, integrity) should be carefully designed and the proper storage conditions should be suggested by food processors as they are critical for the best maintenance/keeping of the sensorial quality of food products during their shelf-life (Table 3). 204

206 Table 3. Effect of storage on the sensory properties of foods Storage Critical factors Examples Packaging Storage conditions - Package integrity - Maintenance of gas atmosphere into the package (vacuum, air, modified atmosphere) - Migration (odor, taste) - Temperature of storage environment - Humidity of storage environment - Aeration of storage area - Co-storage with other odorous materials Deterioration of sensorial properties: fat oxidation, molding, off-flavor, metal/plastic odor/taste, cracking/breaking of particle texture Bulk storage foods or Packaged products: Deterioration of sensorial properties: fat oxidation, off-flavor, decolorization/ browning, moist texture, molding, migration of tastes and odors Concluding, the sensorial quality of a food product should be designed and all the individual sensorial attributes of foods should be specified. The research and development of a product should study the consumers liking and expectation in relation to the certain product and the technological requirements in respect the raw materials, ingredients and the processing conditions of the product. A procedure for the design and validation of the sensorial quality of food is proposed. The desirable and undesirable sensorial characteristics of the product as accepted by consumers are recorded. Based on the consumers informative data and the food processing technology, the critical sensorial attributes are isolated and the relevant processing steps that crucially affect them are characterized. The critical processing conditions are selected and experiments are designed to investigate their significant effect on the sensorial properties of foods as well as their critical limits. The products are evaluated by both consumers and trained panellists and the sensory focused processes are validated verifying the critical processing conditions capable to produce the designed sensorial properties and the acceptable variations. The sensory analyses should be conducted according to standardized methods and tests by trained panellists and their results should be statistically processed properly in order the significant critical processing conditions to be discriminated, as well as the effect of their variation on the relevant sensorial properties of food to be evaluated. For food processing or certain steps crucially affecting the sensorial properties of foods (i.e. heating, chilling, freezing, dehydration, etc.), the optimal conditions and the respective critical limits should be determined; any deviation of critical limits of conditions can lead to undesirable sensorial properties in the final product. Thus the design and control of such processing steps for the various products is required. REFERENCES [1] Lawless H.T. & Heymann H Sensory Evaluation of Food: Principles and Practices, 2nd Edition. Springer Science & Business Media, USA. [2] Perez Elortondo F.J., Ojeda M., Albisu M., Salmeron J., Etayo I. & Molina, M Food quality certification: An approach for the development of accredited sensory evaluation methods. Food Quality and Preference, 18,

207 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΜΕΙΩΣΗΣ ΤΗΣ ΚΟΚΚΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΜΥΛΟΥ ΑΛΕΣΗΣ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ (JET MILL) ΣΤΑ ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΛΕΥΡΟΥ ΑΠΟ ΚΡΙΘΑΡΙ Α. ΔΡΑΚΟΣ, Γ. ΚΥΡΙΑΚΑΚΗΣ, Σ. ΠΡΩΤΟΝΟΤΑΡΙΟΥ, Β. ΕΥΑΓΓΕΛΙΟΥ* ΚΑΙ Ι. ΜΑΝΤΑΛΑ Τμήμα Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής του Ανθρώπου, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Ιερά Οδός 75, 11855, Αθήνα * evageliou@aua.gr Η παρούσα μελέτη εστιάστηκε στην επίδραση της μείωσης της κοκκομετρίας αλεύρου από κριθάρι στα ποιοτικά χαρακτηριστικά του. Τα λεπτόκοκκα αλέσματα προέκυψαν μετά από άλεση αλεύρου κριθαριού συμβατικής άλεσης με κοκκομετρία μικρότερη από 315 μm με μύλο άλεσης με πεπιεσμένο αέρα (Jet mill) σε δύο διαφορετικές ταχύτητες τροφοδοσίας (70 και 90%). Αρχικά μελετήθηκαν η υγρασία, η τέφρα, το ph και η περιεχόμενη πρωτεΐνη. Οι μετρήσεις έδειξαν ότι η περιεχόμενη υγρασία ελαττώθηκε με τη μείωση της κοκκομετρίας ενώ η τέφρα αυξήθηκε. Το ph ήταν ελαφρώς μεγαλύτερο στη περίπτωση των αλεύρων με μικρότερη κοκκομετρία. Όσον αφορά στο δείγμα από άλεση με τροφοδοσία 70% βρέθηκε να περιέχει στατιστικώς την ίδια ποσότητα πρωτεΐνης με το άλευρο από το οποίο προήλθε, σε αντίθεση με το δείγμα τροφοδοσίας 90% που παρουσίασε αυξημένη ποσότητα πρωτεΐνης. Ακολούθως μελετήθηκε η δυνατότητα συγκράτησης διαφόρων διαλυτών που χρησιμοποιείται για την εξακρίβωση της ποιότητας ενός αλεύρου και τη δυνατότητα χρήσης του σε ψωμιά, μπισκότα κ.ά. Τα άλευρα μειωμένης κοκκομετρίας παρουσίασαν αυξημένη συγκράτηση νερού, σακχαρόζης, γαλακτικού οξέος, ανθρακικού νατρίου και όξινου ανθρακικού νατρίου σε σχέση με το μητρικό άλευρο. Αντίθετα η συγκράτηση ελαίου ήταν μειωμένη. Μια ακόμα παράμετρος που μελετήθηκε ήταν το χρώμα. Σύμφωνα με τις πραγματοποιηθείσες μετρήσεις τα λεπτόκοκκα αλέσματα του κριθαριού ήταν πιο φωτεινά. Ταυτόχρονα, διέφεραν ως προς τη συνολική μεταβολή χρώματος και παρουσίασαν μικρότερες τιμές του b σε σχέση με το μητρικό άλευρο. Τέλος, τα άλευρα μειωμένης κοκκομετρίας παρουσίασαν αυξημένες τιμές πορώδους αλλά μειωμένες τιμές πραγματικής και φαινομενικής πυκνότητας σε σχέση με το αρχικό άλεσμα. 206

208 Ανίχνευση αφλατοξίνης με ταχεία ανοσοαναλυτική μέθοδο σε καρυκεύματα της Ελληνικής αγοράς Μπατρίνου Α. 1, Χούχουλα Δ. 1, Καμπανοπούλου Μ. 1, Μακρυγιάννης Κ. 1, Μαρκάκη Π. 2 1 Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων, ΤΕΙ Αθήνας, Αγ. Σπυρίδωνος 1, Αιγάλεω, Αθήνα 2 Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Αθήνα Περίληψη Οι αφλατοξίνες είναι μυκοτοξίνες που παράγονται κυρίως από δύο είδη του μύκητα Aspergillus (Aspergillus flavus και Aspergillus parasiticus) που βρίσκονται συχνά σε περιοχές με θερμό και υγρό κλίμα. Οι αφλατοξίνες (αφλατοξίνη B1, B2, G1 και G2) έχουν χαρακτηριστεί ως τοξικές ενώσεις με καρκινογόνο δράση και η παρουσία τους στα τρόφιμα θα πρέπει να είναι όσο το δυνατόν χαμηλότερη. Οι αφλατοξίνες ανιχνεύονται σε ένα ευρύ φάσμα τροφίμων, όπως φιστίκια και ξηρούς καρπούς, δημητριακά, ρύζι, αποξηραμένα φρούτα, μπαχαρικά, κόκκους κακάο, κα, ως αποτέλεσμα προσβολής από μύκητες πριν ή μετά την συγκομιδή. Η ΕΕ έχει θέσει ως μέγιστο επιτρεπτό επίπεδο για το άθροισμα των αφλατοξινών σε καρυκεύματα τα 10 μg/kg. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανίχνευση της παρουσίας αφλατοξίνης σε δείγματα καρυκευμάτων από την Ελληνική αγορά με την μέθοδο της άμεσης ανταγωνιστικής ELISA. Μελετήθηκαν 30 δείγματα από 18 συσκευασμένα και 12 μη συσκευασμένα καρυκεύματα (κανέλα, πάπρικα, κύμινο, πιπέρι, κάρυ, μοσχοκάρυδο, γαρύφαλο, τζίτζερ, κρεμμύδι, σκόρδο, μπούκοβο, ρίγανη, θυμάρι, δενδρολίβανο, δάφνη). Από το σύνολο των δειγμάτων, τα 26 (86%) βρέθηκαν θετικά σε αφλατοξίνη, ενώ τα 6 από αυτά βρέθηκαν με τιμές>10ppb (20%). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η παρουσία αφλατοξινών στα καρυκεύματα είναι πολύ συχνή και ένα υψηλό ποσοστό υπερβαίνει τα νομοθετικά όρια που έχουν τεθεί από την ΕΕ. Είναι απαραίτητο να αναπτυχθούν στρατηγικές ορθής αγροτικής πρακτικής και ελέγχων για την διασφάλιση της ποιότητας των τροφίμων. Βιβλιογραφία 1. M. W. Trucksess & P. M. Scott (2008) Mycotoxins in botanicals and dried fruits: A review, Food Additives and Contaminants, 25(2):

209 Εφαρμογές κυτταρομετρίας ροής στην μελέτη βιωσιμότητας προβιοτικών μικροοργανισμών σε γαλακτοκομικά προϊόντα. Μπατρίνου Α., Κολοκυθά Κ., Παναγή Α., Ερμιζίδου Α., Βράιλας Κ, Σπηλιώτης Β. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων, ΤΕΙ Αθήνας, Αγ. Σπυρίδωνος 1, Αιγάλεω, Περίληψη Η κυτταρομετρία ροής (FC) είναι μια ταχεία μέθοδος για ανίχνευση των μικροοργανισμών μέσα στα δείγματα σε πραγματικό χρόνο και είναι κρίσιμη για να αξιολογηθεί η παρουσία μικροοργανισμών, η βιωσιμότητά τους, καθώς και για τον έλεγχο και τη βελτίωση βιοεπεξεργασιών. Σκοπός της εργασίας ήταν να μελετηθεί με κυτταρομετρία ροής (Bactiflow, Chemunex): α) η βιωσιμότητα προβιοτικών μικροοργανισμών (βακτηρίων και ζυμών) σε γαλακτοκομικά προϊόντα της Ελληνικής αγοράς και β) η ανθεκτικότητα των προβιοτικών μικροοργανισμών σε όξινο περιβάλλον που προσομοιάζει τις γαστρεντερικές συνθήκες. Αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής, 12 γαλακτοκομικά προϊόντα από 8 διαφορετικές εταιρίες (5 διαφορετικά είδη γιαουρτιού, 5 είδη επιδόρπια γιαουρτιού, 1 είδος κεφίρ και 1 τυρί φέτα). Σε όλα τα προϊόντα καταμετρήθηκαν βιώσιμοι μικροοργανισμοί σε πληθυσμούς που κυμαίνονταν από 10 5 ως και 10 8 cfu/ml. Διαπιστώθηκε ότι όλα τα προϊόντα γιαουρτιού που περιέχουν το στέλεχος Bifidobacterium Actiregularis διατηρούν αρκετά υψηλούς πληθυσμούς (>10 6 cfu/ml) μικροοργανισμών καθ όλη τη διάρκεια της ζωής τους. Από τις δοκιμές επιβίωσης σε όξινο περιβάλλον επιβεβαιώθηκε ότι τα προϊόντα που περιέχουν την προβιοτική καλλιέργεια Bifidobacterium Actiregularis παρουσίασαν την μεγαλύτερη ανθεκτικότητα σε χαμηλές τιμές ph σε σχέση με άλλες καλλιέργειες. Συγκριτικά με την κλασσική μέθοδο αρίθμησης τρυβλίων, η εφαρμογή της κυτταρομετρίας ροής στην καταμέτρηση μικροοργανισμών σε γαλακτοκομικά προϊόντα παρουσιάζει αξιόπιστα αποτελέσματα, με το πλεονέκτημα της ταχύτητας των εφαρμογών και της δυνατότητας παρακολούθησης του μικροβιακού φορτίου σε πραγματικό χρόνο. Βιβλιογραφία 1. Laerte Dagher Cassoli, Paulo Fernando Machado, Ana Carolina De Oliveira Rodrigues, and Arlei Coldebella. (2007) Correlation study between standard plate count and flow cytometry for determination of raw milk total bacterial count. International Journal of Dairy Technology, 60(1): Mario Diaz, Monica Herrero, Luis A. Garcia, Covadonga Quiros, (2009) Application of flow cytometry to industrial microbial bioprocesses. Biochemical Engineering Journal, 48 (2010)

210 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΤΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΠΑΡΑΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΩΝ ΣΤΑΔΙΩΝ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΧΥΜΟΥ ΡΟΔΙΟΥ Αναστάσιος Μπέσιος 1 *, Δημήτριος Στάγκος 1, Ανδρομάχη Μπόκαρη 1, Αργυρώ Ορφανουδάκη 2, Άννα Αποστόλου 2, Σέρκος Χαρουτουνιάν 2, Δημήτριος Κουρέτας 1 1 Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, Πλούτωνος 26 & Αιόλου, Λάρισα, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Ιερά Οδός 75, Αθήνα, Περίληψη Σημαντικό ενδιαφέρον παρατηρείται τα τελευταία χρόνια για την παραγωγή και χρήση τροφών φυτικής προέλευσης με αντιοξειδωτικές ιδιότητες και ο πιθανός ρόλος τους στην πρόληψη ασθενειών που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες (1). Στην παρούσα εργασία έγινε αποτίμηση της αντιοξειδωτικής δραστικότητας προϊόντων και παραπροϊόντων των σταδίων βιομηχανικής παραγωγής χυμού ροδιού από την εταιρεία VITOM Αφοι Χριστοδούλου. Τα δείγματα που μελετήθηκαν παρασκευάστηκαν είτε με απευθείας λυοφιλίωση είτε με εκλεκτική εκχύλιση των πολυφαινολών τους. Αρχικά έγινε ποσοτικός προσδιορισμός του ολικού πολυφαινολικού περιεχομένου (TPC) των δειγμάτων καθώς και του συνόλου των φλαβονοειδών τους. Στο χυμό, στους φλοιούς και τα σπέρματα οι τιμές του TPC ήταν 405, 1786, 595 mg/g ξηρού βάρους αντίστοιχα ενώ το σύνολο των φλαβονοειδών ήταν (9,7), (21,6), και (16,1) mg/g ξηρού βάρους αντίστοιχα. Στη συνέχεια αποτιμήθηκε η αντιοξειδωτική ικανότητα των δειγμάτων με δύο in vitro μεθόδους, οι οποίες βασίζονται στην εξουδετέρωση των χημικών ριζών DPPH. και ABTS.+. Οι μετρήσεις έδειξαν ισχυρή ικανότητα εξουδετέρωσης και των δύο ριζών για όλα τα δείγματα. Ισχυρή αντιοξειδωτική δραστικότητα έδειξαν τα εκχυλίσματα του χυμού (IC 50 : DPPH 14μg/ml και ABTS 4,2μg/ml) αλλά και τα αντίστοιχα, μετά τη λυοφυλίωση δείγματα (IC 50 : DPPH 95μg/ml και ABTS 53μg/ml). Σημαντική δράση παρουσίασαν τα εκχυλίσματα των παραπροϊόντων της παραγωγικής διαδικασίας, και συγκεκριμένα των φλοιών (IC 50 : DPPH 4μg/ml και ABTS 5μg/ml) και των σπερμάτων (IC 50 : DPPH 13,5μg/ml και ABTS 5,5μg/ml). Επίσης, όλα τα δείγματα ανέστειλαν προκαλούμενες από ρίζες περοξυλίου (ROO ) βλάβες σε DNA, αλλά πολύ σημαντική δράση είχαν ο χυμός, τόσο το εκχύλισμα (IC 50 : 13μg/ml) όσο και το λυοφυλισμένο δείγμα (IC 50 : 112μg/ml), καθώς και τα εκχυλίσματα των φλοιών (IC 50 : 5μg/ml) και των σπερμάτων (IC 50 : 19,5μg/ml). Συμπερασματικά, προτείνεται η ανάκτηση των φυτικών πολυφαινολών που περιέχονται σε σημαντικές ποσότητες στα παραπροϊόντα της παραγωγικής διαδικασίας, οι οποίες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την ενίσχυση της αντιοξειδωτικής δράσης του χυμού ροδιού ή ως συμπληρώματα διατροφής. 209

211 Βιβλιογραφία 1) Apostolou A, Stagos D, Galitsiou E, Spyrou A, Haroutounian S, Portesis N, Trizoglou I, Wallace Hayes A, Kouretas D. Assessment of polyphenolic content, antioxidant activity, protection against ROS-induced DNA damage and anticancer activity of Vitis vinifera stem extracts. Food Chem Toxicol (in press). ASSESSMENT OF ANTIOXIDANT ACTIVITY OF POLYPHENOLIC EXTRACTS FROM PRODUCTS AND BY-PRODUCTS OF POMEGRANATE JUICE PRODUCTION PROCESS USING MOLECULAR METHODS Anastasios Mpesios 1, Dimitrios Stagos 1, Andromachi Mpokari 1, Argyro Orfanoudaki 2, Anna Apostolou 2, Serkos Haroutounian 2, Dimitrios Kouretas 1 1 Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Thessaly, Ploutonos 26 & Aiolou, Larissa 2 Agricultural University of Athens, Athens, Iera Odos 75, Athens Abstract In recent years, there is a great interest for the production and use of plant foods with antioxidant properties and for their possible role in the prevention of diseases related to oxidative stress (1). In the present study, it was assessed the antioxidant activity of products and by-products of pomegranate juice production process from the company VITOM Christodoulou. The tested samples were prepared either by direct lyophylisation or by selective extraction of their polyphenols. At first, the total polyphenolic content (TPC) and the total amount of flavonoids were quantified. In the juice, peeling and seeds, the TPC values were 405, 1786, 595 mg/g of dried extract respectively, while the total amount of flavonoids were (9.7), (21.6), και (16.1) mg/g dried extract respectively. Afterwards, it was evaluated the antioxidant activity using two in vitro methods, which are based on the scavenging of DPPH. and ABTS.+ radicals. The results showed high scavenging activity of both free radicals by all tested samples. The polyphenolic extract from juice had strong antioxidant activity (IC 50 : DPPH 14μg/ml and ABTS 4,2μg/ml) as well as the respective sample derived from lyophylisation (IC 50 : DPPH 95μg/ml and ABTS 53μg/ml). Moreover, important antioxidant activity was shown by the extracts from the by-products of production process, and especially those from peelings (IC 50 : DPPH 4μg/ml και ABTS 5μg/ml) and seeds (IC 50 : DPPH 13,5μg/ml και ABTS 5,5μg/ml). Furthermore, all samples inhibited DNA damage induced by peroxy radicals (ROO ), but the most potent were the both samples from juice, the 210

212 polyphenolic extract (IC 50 : 13μg/ml) and the lyophylised (IC 50 : 112μg/ml), as well as the extract from peelings (IC 50 : 5μg/ml) and seeds (IC 50 : 19,5μg/ml). In conclusion, it is suggested the isolation of plant polyphenols that are contained in large amounts in the by-products of the pomegranate juice production process and may be used for the enhancement of the antioxidant activity of pomegranate juice or as food supplements. References 1) Apostolou A, Stagos D, Galitsiou E, Spyrou A, Haroutounian S, Portesis N, Trizoglou I, Wallace Hayes A, Kouretas D. Assessment of polyphenolic content, antioxidant activity, protection against ROS-induced DNA damage and anticancer activity of Vitis vinifera stem extracts. Food Chem Toxicol (in press). 211

213 Ανίχνευση Γεννετικά Τροποποιημένων Οργανισμών (Γ.Τ.Ο.) σε γαλακτοκομικά προϊόντα Παραμυθιώτης Σ. 1, Αδράκτα Ν. 1, Σιγάλα Κ. 2, Δροσινός Ε.Χ. 1, Προεστός Χ. 2 1 Εργαστήριο Ποιοτικού Ελέγχου και Υγιεινής Τροφίμων και Ποτών, Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών. 2 Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η ανίχνευση αλληλουχιών-δεικτών γενετικής τροποποίησης σε γαλακτοκομικά προϊόντα που διατίθενται στην ελληνική αγορά. Συνολικά εξετάστηκαν 133 δείγματα, εκ των οποίων 31 δείγματα γιαούρτης και 27 δείγματα γάλακτος διαφόρου λιποπεριεκτικότητας καθώς και 75 δείγματα διαφόρων ειδών τυριών. Η μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε περιελάμβανε τον εντοπισμό του 35S προαγωγέα του ιού του μωσαϊκού του κουνουπιδιού (Brassica oleracea L.) (P35S), της ληκτικής αλληλουχίας του γονιδίου της συνθετάσης της νοπαλίνης του Agrobacterium tumefaciens (T-nos), της περιοχής συνένωσης μεταξύ του πεπτιδίου διαμερισματοποίησης στους χλωροπλάστες (ctp2) του γονιδίου epsps του Arabidopsis thaliana και του γονιδίου epsps από το A. Tumefaciens στέλεχος CP4, του γονιδίου bar από το Streptomyces hygroscopicus και του γονιδίου pat από το S. viridochromogenes μέσω εξειδικευμένης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Η ανίχνευση ενός ή περισσοτέρων αλληλουχιών-δεικτών θα ήταν ενδεικτική επιμόλυνσης του προϊόντος με γενετικό υλικό από ζωοτροφές, για την παρασκευή των οποίων είχαν χρησιμοποιηθεί και γενετικά τροποποιημένες πρώτες ύλες. Μετά την εξέταση των δειγμάτων δεν διαπιστώθηκε η παρουσία κάποιας από τις αλληλουχίες-δείκτες γενετικής τροποποίησης. 212

214 Επίδραση του αερίου όζοντος στην ποιότητα και στο χρόνο ζωής σταφυλιών ποικιλίας sultanina Ανδρέας Α. Πάνου, Ξενοφώντας Κ. Ρώσσος και Κυριάκος Α. Ρηγανάκος Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Ιωάννινα, Τηλ.: , Fax: ΠΕΡΙΛΗΨΗ Σταφύλια ποικιλίας sultanina μετά την συγκομιδή και την κατεργασία τους (πλύσιμο) εκτέθηκαν για 1 ώρα σε αέριο όζον 0,5, 1,0 και 2,0 ppm και αποθηκεύτηκαν υπό ψύξη στους 4 ο C με σχετική υγρασία 90% για 56 ημέρες. Αντίστοιχα, αποθηκεύτηκαν στις ίδιες συνθήκες και τα δείγματα αναφοράς. Στα σταφύλια προσδιορίστηκαν φυσικοχημικά [η αντοχή στη διάτρηση, η απώλεια βάρους, οι παράμετροι του χρώματος (L*, a* και b*), η ολική οξύτητα, τα σάκχαρα και το ph], μικροβιολογικά (ολική μεσόφιλη χλωρίδα και ζύμες-μύκητες) και οργανοληπτικά (εμφάνιση, οσμή και γεύση) χαρακτηριστικά κατά την διάρκεια της συντήρησής τους. Όσον αφορά τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ορισμένα εξ αυτών παρουσιάζουν στατιστικά σημαντικές μεταβολές κατά την διάρκεια της συντήρησης σε όλα τα δείγματα (αναφοράς και οζονισμένα), ενώ άλλα όχι. Επίσης σε όλα τα δείγματα (αναφοράς και οζονισμένα) υπάρχει αύξηση του πληθυσμού της ολικής μεσόφιλης χλωρίδας και των ζυμών και μυκήτων καθ όλη την διάρκεια συντήρησης των σταφυλιών, χωρίς να φτάνει το ανώτατο επιτρεπτό όριο. Τέλος, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των σταφυλιών των δειγμάτων αναφοράς και των οζονισμένων στα 2,0 ppm διατηρήθηκαν σε αποδεκτά επίπεδα μέχρι την 35 η ημέρα της αποθήκευσης, των σταφυλιών που επεξεργάστηκαν με 1,0 ppm μέχρι την 42 η ημέρα, ενώ των σταφυλιών που επεξεργάστηκαν με 0,5 ppm όζον μέχρι την 49 η ημέρα. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το όζον (Ο 3 ) είναι ένα ισχυρό οξειδωτικό μόριο με πολύ καλές αντιμικροβιακές ιδιότητες. Χρησιμοποιείται στη βιομηχανία των τροφίμων για να αυξηθεί ο χρόνος ζωής και η ασφάλειά τους. Η υψηλή δραστικότητα, η διαπερατότητα και η ταχύτατη αποικοδόμησή του σε μη τοξικά μοριακά παράγωγα οξυγόνου, καθιστούν το όζον ένα βιώσιμο απολυμαντικό για τη διασφάλιση της μικροβιολογικής ασφάλειας των τροφίμων. Το όζον χρησιμοποιείται για την αύξηση του χρόνου συντήρησης των τροφίμων, την απολύμανση της επιφάνειας των τροφίμων, την αποστείρωση των συσκευών, την απολύμανση του πόσιμου ύδατος, την επεξεργασία των αποβλήτων και την καταστροφή των κατάλοιπων φυτοφαρμάκων. 213

215 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ Σταφύλια ποικιλίας sultanina παραλήφθηκαν από την τοπική λαχαναγορά Ιωαννίνων (Οκτώβριος 2012). Μεταφέρθηκαν αμέσως στο εργαστήριο και πλύθηκαν. Τα σταφύλια εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις αέριου όζοντος (0,5, 1 και 2 ppm) για μία ώρα. Για την παραγωγή του αερίου όζοντος χρησιμοποιήθηκε ο οζονιστήρας C-Lasky (Air Tree, Taiwan). Μετά το πέρας του οζονισμού τα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε εμπορικά τελάρα και συντηρήθηκαν υπό ψύξη στους 4±1 0 C για όλη τη χρονική περίοδο του πειράματος (56 ημέρες). Κάθε 7 ημέρες λαμβανόταν δείγμα από την κάθε παρτίδα για τον προσδιορισμό του ph (με την χρήση πεχαμέτρου ph meter 3305, JENNAY, UK), της ολικής οξύτητας (με τιτλοδότηση με πρότυπο διάλυμα ΝαΟΗ 0,1 Ν παρουσία δείκτη φαινολοφθαλεΐνη 1%), της υφής (με τη χρήση του δυναμόμετρου INSTRON 4411, UK), του χρώματος (με την χρήση χρωματόμετρου Spectrophotometer CM-2500d, Konica Minolta, Japan), των σακχάρων (με τη χρήση ενός ψηφιακού διαθλασιμέτρου JENA, Germany), της απώλειας βάρους (σταθμικά), καθώς και για την καταμέτρηση της ολικής μεσόφιλης χλωρίδας, των ζυμών και μυκήτων και τον οργανοληπτικό έλεγχο. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Το ποσοστό απώλειας βάρους αυξάνεται γραμμικά με την πάροδο του χρόνου λόγω απώλειας υγρασίας εξαιτίας της διαπνοής του φυτικού ιστού. Ο ρυθμός απώλειας της υγρασίας είναι ανάλογος της διαφοράς στην τάση υδρατμών που επικρατεί μεταξύ του εσωκυτταρικής δομής και του περιβάλλοντος χώρου. Υψηλότερο ποσοστό απώλειας βάρους παρουσίασαν τα οζονισμένα δείγματα συγκριτικά με τα δείγματα αναφοράς με την ακόλουθη σειρά 0.5 ppm<1,0 ppm<2,0 ppm. Η αυξημένη απώλεια βάρους οφείλεται στην οξείδωση των ακόρεστων λιπαρών οξέων της κυτταρικής μεμβράνης κατά την οποία παράγονται υπεροξείδιο του υδρογόνου, υπεροξειδικές ρίζες και τελικώς αλδεΰδες που μεταβάλλουν το ηλεκτροχημικό δυναμικό της μεμβράνης και τελικά την διαπερατότητά της (Recknagel and Turocy, 1977, Pryor, et. al., 1995, Rao et. al., 2000). Στα δείγματα αναφοράς παρατηρήθηκε μια ελάττωση στην αντοχή στη διάτρηση που οφείλεται στο μαλάκωμα εξαιτίας της ενζυμικής υδρόλυσης των πηκτινικών υλών που δομούν το κυτταρικό τοίχωμα των φυτικών ιστών. Τα επεξεργασμένα με αέριο όζον δείγματα σε όλες τις συγκεντρώσεις παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερη αντοχή στη διάτρηση σε σχέση με τα δείγματα αναφοράς από την 28η ημέρα μέχρι το τέλος της αποθήκευσης. Αυτό πιθανώς οφείλεται στη διάσπαση του αιθυλενίου από το όζον (οζονόλυση) και συνεπώς στην αναστολή της ενζυμικής διάσπασης των πηκτινικών υλών (Μc Murry, 2000) και στην μεγαλύτερη απώλεια νερού που παρουσιάζουν. Το νερό δρα ως πλαστικοποιητής των μακρομορίων (ελαττώνει το σημείο υαλώδους μετάπτωσης, T g ) με αποτέλεσμα η απώλεια νερού να αυξάνει το T g και να ελαττώνει την ευκαμψία των μακρομορίων. Κατά την διάρκεια της αποθήκευσης τα σταφύλια που επεξεργάστηκαν με αέριο όζον στα 0,5 ppm παρουσίασαν μεγαλύτερες τιμές της παραμέτρου L* σε σχέση με τα δείγματα αναφοράς στο μεγαλύτερο διάστημα της αποθήκευσης. Αυτό πιθανώς να οφείλεται στην αύξηση της 214

216 συγκέντρωσης αντιοξειδωτικών ουσιών, π.χ. καφεϊκό οξύ, ρεσβερατρόλη κ.τ.λ. που πραγματοποιείται σε χαμηλές συγκεντρώσεις όζοντος οι οποίες δρουν ως παρεμποδιστές της ενζυμικής αμαύρωσης των φυτικών ιστών (Sarig, et. al., 1996, Allende, et. al., 2007). Αντιθέτως οι παρτίδες των σταφυλιών που επεξεργάστηκαν με αέριο όζον σε συγκέντρωση 1,0 και 2,0 ppm παρουσίασαν μία μη στατιστικά σημαντική αύξηση της παραμέτρου L* σε σχέση με το δείγμα αναφοράς πιθανώς λόγω της υψηλής οξειδωτικής δράσης του όζοντος (Zeynep et al., 2002). Οι παράμετροι a* και b* αυξάνονται κατά την διάρκεια της αποθήκευσης λόγω αποπρασινισμού που υφίσταται το σταφύλι κατά την ωρίμανσή του. Τα σταφύλια που επεξεργάστηκαν με όζον σε όλες τις συγκεντρώσεις εμφάνισαν μια ελάττωση του ρυθμού αύξησης των παραμέτρων a* και b* σε σχέση με το δείγμα αναφοράς καθ όλη την διάρκεια της αποθήκευσης. Αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί στην επιβράδυνση της ωρίμανσης που προκαλεί το όζον λόγω διάσπασης του αιθυλενίου μέσω της οζονόλυσης. Στα δείγματα που επεξεργάστηκαν με αέριο όζον σε συγκεντρώσεις 0,5 και 2,0 ppm παρατηρήθηκε μια μείωση στην ολική οξύτητα σε σχέση με τα δείγματα αναφοράς μέχρι την 49 η και 28 η ημέρα της αποθήκευσης αντίστοιχα. Αντιθέτως, στα δείγματα που επεξεργάστηκαν με αέριο όζον σε συγκέντρωση 1,0 ppm δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές σε σχέση με τα δείγματα αναφοράς. Η επεξεργασία με αέριο όζον δεν επηρέασε στατιστικά σημαντικά την τιμή του ph καθ όλη την διάρκεια της αποθήκευσης, ενώ δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές μεταξύ των οζονισμένων δειγμάτων και των δειγμάτων αναφοράς. Η περιεκτικότητα των ολικών διαλυτών στερεών στα δείγματα αναφοράς ελαττώνεται κατά την διάρκεια της αποθήκευσης εξαιτίας της μετατροπής της γλυκόζης σε διοξείδιο του άνθρακα και νερό (αερόβια αναπνοή). Στα οζονισμένα δείγματα παρατηρήθηκε μια αύξηση της συγκέντρωσης των ολικών διαλυτών στερεών από την 28 η ημέρα της αποθήκευσης μέχρι το τέλος αυτής. Αυτό οφείλεται στην ελάττωση του ρυθμού αναπνοής που προκαλεί το όζον (Aguayo, et al., 2006) και στην μεγαλύτερη απώλεια υγρασίας. Ο πληθυσμός της ολικής μεσόφιλης χλωρίδας και των ζυμών-μυκήτων παρέμεινε σε επίπεδα μικρότερα από το ανώτατο επιτρεπτό όριο καθ όλη την διάρκεια της αποθήκευσης εξαιτίας του χαμηλού ph των σταφυλιών που δρα ως εμπόδιο στην ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά (εμφάνιση, άρωμα, γεύση) των δειγμάτων αναφοράς και των δειγμάτων που επεξεργάστηκαν στα 2,0 ppm διατηρήθηκαν οριακά αποδεκτά μέχρι την 35 η ημέρα της αποθήκευσης, ενώ των δειγμάτων που επεξεργάστηκαν στα 0,5 και 1,0 ppm διατηρήθηκαν οριακά αποδεκτά μέχρι την 49 η και 42 η ημέρα της αποθήκευσης αντίστοιχα. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Το αέριο όζον συνέβαλε στην καλύτερη διατήρηση των σταφυλιών σε σχέση με τα δείγματα αναφοράς κατά την διάρκεια της συντήρησής τους. Καλύτερα αποτελέσματα έδειξε ο οζονισμός σε συγκέντρωση 0,5 ppm, ο οποίος επιμηκύνει σημαντικά το χρόνο ζωής των σταφυλιών. 215

217 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Aguayo, E., Escalona, V. H. & Artes, F., (2006). Effect of cyclic exposure to ozone gas on physicochemical, sensorial and microbial quality of whole and sliced tomatoes. Postharvest Biol. Techn., 39, Allende A., Marin A., Buendia B., Tomas-Barbean F., & Gil M.I. (2007). Impact of combined postharvest treatments (UV-C light, gaseous O 2, super atmospheric O 2 and high CO 2 ) on health promoting compounds and shelf-life of strawberries. Postharvest Biol. Technol, 46, Guzel-Seydim, Ζ.Β., Greene, Α. Κ. & Seydim A.C. (2002). Use of ozone in the food industry. LWT-F. Sci. Technol., 4, Mc Murry, J. (2000). Οργανική Χημεία, Τόμος Ι, σ. 298, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης. 5. Pryor, W.A., Squadrito, G.L. & Friedman, M. (1995). The cascade mechanism to explain ozone toxicity: the role of lipid ozonation products. Free Radic Biol Med, 19, Rao MV., Kozh JR. & Davis KR. (2000). Ozone: a tool for probing cell death in plants. Plant Mol. Biology, 44, Recknagel, R.O. & Turocy, Y. (1977). Fatal susceptibility of a free-swimming paramecium to peroxidizing rat liver microsomes. Exp Mol Pathol, 27, Sarig P., Zahavi T., Zutkhi Y., Yannai S., Lisker N., & Ben-Arie R. (1996). Ozone for control of postharvest decay of table grapes caused by Rhizopus stolonifer. Physiol. Mol. Plant Pathol, 48, ABSTRACT Sultanina variety grapes after harvest and processing (washing) were exposed for 1 hour to gaseous ozone at concentrations 0.5, 1.0 and 2.0 ppm and stored under refrigeration at 4 C with 90% relative humidity for 56 days. Also, the reference samples (control) were stored in the same conditions. Physicochemical [penetration resistance, weight loss, colour parameters (L*, a* and b*), titratable acidity, total soluble solids and ph], microbiological (total mesophilic bacteria, yeasts and moulds) and sensory (appearance, odour and taste) characteristics were estimated during shelf life of the grapes. Regarding the physicochemical characteristics some of them showed statistically significant changes during the preservation in all samples (control and ozonated), while others did not show statistically significant changes. Also, was observed an increase in all samples (control and ozonated) in total viable counts, yeasts and moulds during the shelf life of the grapes, without reaching the maximum permissible limit. Finally, the results showed that the sensory characteristics of the control grapes and the ozonated grapes at 2.0 ppm maintained at acceptable levels until the 35 th day of storage, the grapes treated at 1.0 ppm ozone until the 42 nd day, while the grapes treated at 0.5 ppm ozone until the 49 th day. 216

218 Μελέτη της συνδυαστικής επίδρασης της προσθήκης πρωτεϊνών γάλακτος, του μεγέθους των λιποσφαιρίων και του χρόνου συντήρησης στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά αναμιγμένης γιαούρτης από βουβαλίσιο γάλα. Στέλλα Χρυσαλίδου*, Παντελίνα Ακακιάδου, Γεωργία Δημητρέλη, Δημήτριος Πετρίδης Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Τεχνολογίας Τροφίμων & Διατροφής, Αλεξάνδρειο Τεχνολογικό Ίδρυμα Θεσσαλονίκης (ΑΤΕΙΘ), 57400, Θεσσαλονίκη * Στοιχεία επικοινωνίας: Τηλέφωνο , Διεύθυνση . schrysal@gmail.com Study of the effect of Sodium Caseinates or Whey Protein Concentrates addition, fat globule size and storage time on the sensory properties of buffalo milk stirred yogurt. Stella Crysalidou*, Pantelina Akakiadou, Georgia Dimitreli, Dimitrios Petridis Department of Food Technology, School of Food Technology and Nutrition, Alexander Technological Educational Institute (ATEITHE), 57400, Thessaloniki, Greece * Corresponding author: Tel , address: schrysal@gmail.com Περίληψη Αξιολογήθηκαν οι οργανοληπτικές ιδιότητες αναμιγμένης γιαούρτης που παρασκευάστηκε από βουβαλίσιο γάλα εμπλουτισμένο ή όχι με συμπυκνώματα πρωτεϊνών ορού (WPC) ή καζεϊνικά άλατα (SCΝ) και ομογενοποιημένο σε δύο διαφορετικούς χρόνους με σκοπό την επίτευξη διαφορετικού μεγέθους λιποσφαιρίων. Τα δείγματα γιαούρτης διατηρήθηκαν από 1 έως 7 ημέρες. Με βάση τον συνδυασμό των επιπέδων των 3 μελετώμενων παραγόντων, προέκυψαν 12 συνδυασμένα επίπεδα που αντιστοιχούν σε 12 διαφορετικές συνθέσεις αναμιγμένης γιαούρτης. Ο εμπλουτισμός του γάλακτος με SCN προκάλεσε αύξηση της οργανοληπτικής οξύτητας και του παχύρευστου της γιαούρτης. Γάλα με μικρό μέγεθος λιποσφαιρίων οδήγησε στην παρασκευή γιαούρτης με έντονα λευκό χρώμα, αλλά με πολύ μεγάλη συνεκτικότητα, με αποτέλεσμα να μη γίνονται αποδεκτά από τους οργανολήπτες. Η αύξηση του χρόνου συντήρησης των δειγμάτων οδήγησε στην αύξηση της οξύτητας και κατ επέκταση της αρεστότητας των δειγμάτων. Abstract The sensory properties of buffalo milk stirred yogurt enriched or not with two milk protein-based ingredients additives (Sodium Caseinates-SCN and Whey Protein Concentrates-WPC), prepared with homogenized milk at two different fat globule sizes (0.8 and 2.8μm) and stored for 1 or 7 days, were evaluated. Twelve interactive levels were produced in which SCN addition increased the sensory intensity of acidity, fattiness, viscosity and the overall acceptability. Small fat globule size increased the whiteness and the consistency of the yogurt samples. Though, the increase in consistency resulted in very low acceptability of these samples. Increasing storage time resulted in increased sensory and physicochemical acidity. 217

219 1. Εισαγωγή Το βουβαλίσιο γάλα είναι ένα από τα πιο πλούσια είδη γάλακτος από άποψη σύνθεσης, με την υψηλή λιποπεριεκτικότητα να είναι υπεύθυνη για την υψηλή ενεργητική και θρεπτική του αξία. Από τεχνολογικής άποψης, το βουβαλίσιο γάλα μπορεί να προσφέρει μία ποικιλία γαλακτοκομικών προϊόντων με τη γιαούρτη να κατατάσσεται παγκοσμίως στα πιο δημοφιλή (Sodini et al., 2004; Tamime & Robinson, 2007). Η διαδικασία παρασκευής για κάθε τύπο γιαούρτης είναι περίπου η ίδια και στηρίζεται στη ζύμωση του γάλακτος από τους Streptococcus thermophilus και Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, παράγοντας γαλακτικό οξύ και επομένως αυξάνοντας την οξύτητα του γάλακτος (Walstra, 1998; Damin et al., 2009). Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό για την αξιολόγηση της ποιότητας της γιαούρτης είναι η υφή της που επηρεάζεται κυρίως από τα στάδια προετοιμασίας του γάλακτος, την οξυγαλακτική καλλιέργεια και την περιεκτικότητα του γάλακτος σε πρωτεΐνες (Sodini et al., 2004). Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, ο εμπλουτισμός του γάλακτος με συμπυκνώματα πρωτεϊνών ορού (WPC) και καζεϊνικά άλατα (SCN), βελτιώνει την υφή των παραγόμενων προϊόντων. Αντίστοιχα αποτελέσματα προκύπτουν με την ομογενοποίηση του γάλακτος, με την οποία ενισχύεται η σταθερότητα και η συνεκτικότητα της πηκτής της γιαούρτης (Damin et al., 2009). 2. Υλικά και Μέθοδοι Οι πρώτες ύλες που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή των δειγμάτων γιαούρτης ήταν α) βουβαλίσιο γάλα από φάρμα στην περιοχή της Κερκίνης, β) οξυγαλακτική καλλιέργεια σύστασης Streptococcus thermophilus και Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 1:1, γ) καζεϊνικά άλατα, δ) συμπυκνώματα πρωτεϊνών ορού και ε) αγελαδινό γάλα του εμπορίου. Το νωπό γάλα παστεριώθηκε με τη βραδεία μέθοδο, για 30min στους 63 C. Η ομογενοποίηση του γάλακτος πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της συσκευής υπερήχων UP 100H (Ultrasonic Processor hielscher, Germany) και σε δύο διαφορετικούς χρόνους, με σκοπό την επίτευξη διαφορετικού μεγέθους λιποσφαιρίων (μικρό 0,8μm και μεγάλο 2,8μm). Ο σχεδιασμός του οργανοληπτικού ελέγχου έγινε με βάση το σχέδιο BIB (balanced incomplete block design). Το οργανοληπτικό σχέδιο είχε τα εξής χαρακτηριστικά: t=13, b=13, λ=1, k=4, n=4. Για την προσαρμογή του στατιστικού σχεδίου στο πλάνο που προτείνεται από τους Cochran & Cox (1957), επιλέχθηκε η προσθήκη μίας επιπλέον μεταχείρισης γιαούρτης (παρασκευασμένη με μίγμα βουβαλίσιου & αγελαδινού γάλακτος σε αναλογία 1:1). Με βάση το συγκεκριμένο σχέδιο, διεξήχθησαν δύο πειραματικές εκτελέσεις για την αξιολόγηση των αντικειμενικών οργανοληπτικών μεταβλητών και δύο για την αξιολόγηση της συνολικής αρεστότητας των δειγμάτων. Η αξιολόγηση των μεταβλητών πραγματοποιήθηκε από 52 (2x13x2) έμπειρους και άπειρους δοκιμαστές. Για την μέτρηση της έντασης των μεταβλητών χρησιμοποιήθηκε αδιαβάθμητη μονοπολική κλίμακα 15 cm. Οι διορθωμένοι μέσοι όροι του οργανοληπτικού ελέγχου υπολογίστηκαν για τα 13 δείγματα κάθε πειραματικής εκτέλεσης. Στη συνέχεια το 13 ο δείγμα αποκλείστηκε από περαιτέρω μελέτη. Σε κάθε μια από τις εξεταζόμενες μεταβλητές των 12 δειγμάτων εφαρμόστηκε η Ανάλυση της Διακύμανσης τριών παραγόντων three way ANOVA. Όπου διαπιστώθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,05) η ανάλυση συνοδεύτηκε από τον έλεγχο του Tukey για την πολλαπλή σύγκριση των 218

220 μέσων όρων. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων αποτυπώθηκαν σε γραφήματα επίδρασης των κυρίων παραγόντων (main effects plots) (Πετρίδης, 2000). Για την ανάλυση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πρόγραμμα Minitab Αποτελέσματα Από την ανάλυση της διακύμανσης προέκυψαν οι στατιστικά σημαντικές διαφορές των μέσων όρων των επιπέδων των τριών παραγόντων του πειράματος ή/και των αλληλεπιδράσεων αυτών, για κάθε μελετούμενη οργανοληπτική μεταβλητή. Η προσθήκη πρωτεϊνών γάλακτος άσκησε στατιστικά σημαντική επίδραση στην ένταση του λευκού χρώματος και στην αίσθηση του παχύρευστου, όπως προέκυψε από την σημαντικότητα της πιθανότητας p. Η πολλαπλή σύγκριση των μέσων όρων κατέδειξε ότι η προσθήκη SCN συντέλεσε στην αύξηση τις τιμής των δύο μεταβλητών (Χρώμα - SCN: 10,8 = control: 10,2 >: 8,4 / Παχύρευστο - SCN: 12,1 > WPC: 8,3 = control: 8,6), ενώ η προσθήκη WPC είχε ως αποτέλεσμα την εμφάνιση χαμηλότερης μέσης τιμής λευκού χρώματος, σε σύγκριση με το μάρτυρα (Walstra et al., 2006; Akalin et al., 2012). Το μέγεθος των λιποσφαιρίων της γιαούρτης προκάλεσε στατιστικά σημαντική μεταβολή στην αίσθηση της λιπαρότητας και του παχύρευστου. Όπως φαίνεται από τη σύγκριση των μέσων όρων (Λιπαρότητα - g:9,9>g:8,7 / Παχύρευστο - g: 11,0 > G: 8,3), τα δείγματα γιαούρτης με μικρό μέγεθος λιποσφαιρίων έδωσαν την αίσθηση περισσότερο λιπαρού και παχύρευστου προϊόντος (Tamime & Robinson, 1989; Walstra et al., 2006). Ο αυξημένος χρόνος συντήρησης των δειγμάτων γιαούρτης άσκησε στατιστικά σημαντική (θετική) επίδραση στην αντίληψη της αντικειμενικής αίσθησης της οξύτητας, ενώ στην αίσθηση του παχύρευστου εμφάνισε αντίθετο αποτέλεσμα (αρνητική επίδραση). Από τη σύγκριση των μέσων όρων προέκυψαν τα εξής: Οξύτητα - 1 st d : 6,0 < 7 th d: 10,3 / Παχύρευστο - 1 st d: 10,4 > 7 th d: 8,9. (Walstra et al., 2006) (Σχήμα 1). Σχήμα 1: Επίδραση των τριών παραγόντων του πειράματος στις μελετούμενες μεταβλητές. 219

221 4. Συμπεράσματα Τα συμπεράσματα που προκύπτουν έχουν ως εξής: Ο εμπλουτισμός του γάλακτος με SCN προκάλεσε αύξηση του λευκού χρώματος και του παχύρευστου της γιαούρτης, ενώ η προσθήκη WPC μείωσε την ένταση του λευκού χρώματος και επέδρασε στην οξύτητα της γιαούρτης, σε μικρότερο όμως βαθμό συγκριτικά με τις SCN. Ο σχηματισμός λιποσφαιρίων μικρού μεγέθους εξαιτίας της ομογενοποίησης του γάλακτος για περισσότερο χρόνο, οδήγησε στην αύξηση τόσο της αίσθησης της λιπαρότητας και του παχύρευστου, όσο και του χρώματος, αυξάνοντας την φωτεινότητα της γιαούρτης. Η αύξηση του χρόνου συντήρησης των δειγμάτων είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της οργανοληπτικής οξύτητας και την μείωση της αίσθησης του παχύρευστου. Τα δείγματα γιαούρτης που χαρακτηρίστηκαν ως πλέον αρεστά από τους οργανολήπτες, ήταν: δείγματα που αποθηκεύτηκαν για 7 ημέρες δείγματα μικρότερου χρόνου ομογενοποίησης (μεγάλα λιποσφαίρια). Βιβλιογραφία Akalin A.S., Unal G., Dinkci N. & Hayalogut A.A. (2012). Microstructural, textural and sensory characteristics of probiotic yogurts fortified with sodium calcium caseinate or whey protein concentrate. Journal Dairy Science, 95, Damin, M.R., Alcantara, M.R., Nunes, A.P., Oliveira, M.N. (2009). Effects of milk supplementation with skim milk powder, whey protein concentrate and sodium caseinate on acidification kinetics, rheological properties and structure of nonfat stirred yogurt. LWT-Food Science and Technology 42, Cochran, W.G. & Cox, G.M. (1957). Experimental Designs. John Wiley & Sons, Chichester. Sodini, I., Remeuf, F., Haddad, S., & Corrieu, G. (2004). The relative effect of milk base starter culture and process on yogurt texture: A review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44, Tamime, A.Y. & Robinson, R.K. (1989). Yoghurt Science and Technology. Pergamon Press, U.K. Tamine, A. Y., & Robinson, R. K. (2007). Tamine and Robinson s yogurt. Science and technology (3 rd ed.). DC: CRC Press, Boca Raton, Boston, New York, Washington. Walstra, P. (1998). Relationship between structure and texture of cultured milk products. Texture of Fermented Milk Products and Dairy Desserts, IDF Special Issue 9802, pp. 9-15, International Dairy Federation, Brussels. Walstra, P., Wouters, J. T. M., & Geurts, T. J. (2006). Dairy Science and Technology (2 nd ed.). Boca Raton: Taylor & Francis, CRC Press Πετρίδης Δ. (2000). Εφαρμοσμένη Στατιστική με έμφαση στην Επιστήμη των Τροφίμων. Όμηρος Εκδοτική, Θεσσαλονίκη. 220

222 Μείωση του λίπους στο παγωτό Ζαφειριάδης Θωμάς Τομέας Επισιτισμού Μεταφορών ΙΕΚ ΞΥΝΗΣ ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το παγωτό είναι ένα γαλακτοκομικό προϊόν υψηλού κόστους, του οποίου η παραγωγή και η κατανάλωση αυξάνουν σταθερά από χρόνο σε χρόνο. Παρόλα αυτά, τα τελευταία χρόνια μία νέα τάση μεταξύ των καταναλωτών για θρεπτικά και υγιεινά γαλακτοκομικά προϊόντα έχει δημιουργήσει την ανάγκη για μείωση του λίπους ή υποκατάστασή του στα παγωτά. Έχουν αναπτυχθεί πολλές μέθοδοι και τεχνικές, που χρησιμοποιούν υλικά, τα οποία έχουν ως βασικό συστατικό τους υδατάνθρακες, τις πρωτεΐνες και τα λιπίδια. Μεταξύ αυτών των τεχνικών περιλαμβάνονται η αντικατάσταση των λιπών με πρωτεΐνες του τυρογάλακτος ή παραγώγων αυτού, με υδατάνθρακες, και η χρησιμοποίηση υποκατάστατων λιπαρών ουσιών. Λέξεις κλειδιά: Παγωμένα επιδόρπια, στερεό υπόλειμμα άνευ λίπους, πρωτεΐνη τυρογάλακτος, μαλτοδεξτρίνη, Olestra, Salatrim. 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το παγωτό είναι υψηλής αξίας γαλακτοκομικό προϊόν με σημαντικό κόστος παραγωγής, αναφορικά με τα χρησιμοποιούμενα συστατικά, την απαιτούμενη για την παραγωγή του ενέργεια, τη διακίνηση και την λιανική πώληση (Herald et al, 2008). Η βιομηχανία παραγωγής παγωτού χρησιμοποιεί το 10% της συνολικής παραγωγής γάλατος και το 16% της παραγωγής βιομηχανικού γάλατος στις ΗΠΑ και τον Καναδά. Στον Καναδά, η παραγωγή κατεψυγμένων επιδορπίων με βάση το γάλα ανήλθε το 2003 σε 380 εκ. λίτρα, από τα οποία το 79% ήταν παγωτό και παγωτό διαίτης, το 9% παγωμένο γάλα, και το 4% παγωμένη γιαούρτη (Goff and Griffiths, 2006). Η κατανάλωση παγωτού με μικρή περιεκτικότητα σε λίπος ή χωρίς λίπος αυξήθηκε τα τελευταία χρόνια λόγω των πιθανών ευεργετικών αποτελεσμάτων στην υγεία και των διατροφικών πλεονεκτημάτων (Haque and Ji, 2003). 2. ΤΡΟΠΟΙ ΜΕΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΛΙΠΟΥΣ ΣΤΟ ΠΑΓΩΤΟ Το παγωτό (Σχήματα 1 3) αποτελεί ένα περίπλοκο φυσικοχημικό σύστημα, αποτελούμενο από λιποσφαίρια, φυσαλίδες και παγοκρυστάλλους σε ένα συμπυκνωμένο, λόγω κατάψυξης, εναιώρημα πρωτεϊνών, αλάτων και πολυσακχαριτών. Το λίπος είναι συστατικό με πολλαπλή λειτουργικότητα σε αυτό το σύστημα, καθώς προάγει τη γεύση, το χρώμα, τη δομαισθησία και την αίσθηση κατά τη μάσηση (Karaca et al, 2009). Η μείωση του λίπους μπορεί να οδηγήσει, από απόψεως οργανοληπτικών χαρακτηριστικών, σε διάφορα προβλήματα στο άπαχο ή χαμηλής 221

223 λιποπεριεκτικότητας παγωτό, όπως η απώλεια γεύσης, το ασθενές σώμα και η χαμηλή δομαισθησία. Ο σχηματισμός και η παραγωγή παγωτού χωρίς λίπος με καλή δομαισθησία αποτελεί μεγάλη πρόκληση για τους σημερινούς παρασκευαστές παγωτού. Για την αντιμετώπιση της πρόκλησης αυτής, η βιομηχανία παγωτού έχει προχωρήσει στην έρευνα και ανάπτυξη νέων προϊόντων παγωτού (Haque and Ji, 2003). Ένας από τους κυριότερους στόχους των ερευνητών και των παρασκευαστών είναι η παραγωγή παγωτών με μειωμένη περιεκτικότητα σε λίπος και υψηλή δομαισθησία, τα οποία ικανοποιούν την απαίτηση των καταναλωτών που στρέφονται σε προϊόντα υγιεινής διατροφής (Karaca et al, 2009). Οι υποκαταστάτες λίπους χρησιμοποιούνται κατά κόρον στην παρασκευή τροφίμων με χαμηλά λιπαρά. Οι υποκαταστάτες με βάση τους υδατάνθρακες ή τις πρωτεΐνες μπορούν να μιμηθούν επαρκώς το λίπος του γάλατος, αναφορικά με τη δομαισθησία και την ανάπτυξη γεύσης στα παγωτά (Karaca et al, 2009). Μία από τις πλέον σημαντικές ομάδες στερεών, που μιμούνται το λίπος στο παγωτό, είναι η πρωτεΐνες του τυρογάλατος (Karaca et al, 2009). Η υπερδιήθηση αποτελεί μία πολλά υποσχόμενη μέθοδο ανάκτησης των στερεών αυτών από το τυρόγαλα, και η εξάτμιση υπό κενό είναι μία από τις πλέον πρακτικές μεθόδους ανάκτησης στερεών, χωρίς να επηρεάζονται οι θρεπτικές και λειτουργικές ιδιότητες των πρωτεϊνών του τυρογάλατος. Μία άλλη κατηγορία πρωτεϊνών, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην παραγωγή παγωτού με χαμηλά ή καθόλου λιπαρά, είναι οι πρωτεΐνες με αντιψυκτικές ιδιότητες (ISP). Οι πρωτεΐνες αυτές είναι φυσικές πρωτεΐνες και πεπτίδια που υπάρχουν σε διάφορους ζωντανούς οργανισμούς, όπως οι ιχθύες, τα φυτά και τα έντομα (Kapoli G., 2009). Από την άλλη μεριά, ένας από τους σημαντικότερους υποκαταστάτες υδατανθρακικής φύσης προέρχεται από τις μαλτοδεξτρίνες του κηρώδους αραβοσίτου και έχει χρησιμοποιηθεί με εξαιρετική επιτυχία για την απομίμηση των οργανοληπτικών και λειτουργικών ιδιοτήτων του λίπους του γάλατος σε παγωμένα επιδόρπια γάλατος. Στην περίπτωση αυτή, οι τιμές σκλήρυνσης και ο 222

224 ρυθμός τήξης βρέθηκαν να βρίσκονται σε χαμηλότερο επίπεδο στα παγωτά με μαλτοδεξτρίνες κηρώδους αραβοσίτου σε σχέση με εκείνα που περιέχουν συμπυκνώματα πρωτεϊνών τυρογάλατος, ενώ το ιξώδες (όλα τα παγωτά παρουσιάζουν συμπεριφορά παρόμοια με ψευδοπλαστικά υλικά) βρέθηκε υψηλότερο (Karaca et al, 2009). Παραπέρα, η ινουλίνη ένας προβιοτικός, άπεπτος υδατάνθρακας που αποτελείται από φρουκτο-ολιγοσακχαρίτες παρουσιάζει, εκτός από μερικές από τις ιδιότητες των φυτικών ινών, και σημαντικές λειτουργικές ιδιότητες, όπως την ικανότητα να δρα ως υποκαταστάτης λίπους ή ζάχαρης, χωρίς να επηρεάζει αρνητικά τη γεύση του τελικού προϊόντος. Η ιδιότητα που έχει η ινουλίνη να υποκαθιστά το λίπος, βασίζεται στην ικανότητά της να σταθεροποιεί τη δομή της υδατικής φάσης, η οποία είναι υπεύθυνη για τη βελτιωμένη κρεμώδη υφή του παγωτού. Αναφορικά με το ρυθμό τήξης και το ιξώδες, τα αποτελέσματα είναι παρόμοια με εκείνα που παρατηρούνται στην περίπτωση χρησιμοποίησης μαλτοδεξτρινών (Karaca et al, 2009). Πιο πρόσφατα, ερευνητές του Υπουργείου Γεωργίας των ΗΠΑ (USDA) ανακάλυψαν και ανέπτυξαν το Oatrim, ένα προϊόν προερχόμενο από βρώμη. Το Oatrim μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μείωση του ενεργειακού περιεχόμενου τροφίμων, όπως τα παγωμένα επιδόρπια, μεταξύ των οποίων και τα παγωτά, έως και 50%. Σε αντίθεση με άλλα υποκατάστατα λίπους, το Oatrim διατηρεί τις ιδιότητες των φυτικών ινών. Το λίπος του γάλατος μπορεί να υποκατασταθεί, επίσης, από ύλες με βάση το λίπος, όπως το και το Olestra. Αυτές οι ύλες μπορούν να διακριθούν σε 2 μεγάλες ομάδες. Η πρώτη ομάδα περιλαμβάνει τροποποιημένα λίπη, ενώ η δεύτερη συνθετικά λίπη. 3. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η βιομηχανία κατεψυγμένων γαλακτοκομικών προϊόντων είναι ένα δυναμικό τμήμα της ευρύτερης βιομηχανίας γαλακτοκομικών προϊόντων με τη δική της τεχνολογία και τις δικές της μεθόδους μάρκετινγκ. Επομένως, η ανάπτυξη μεθόδων και τεχνικών για την παραγωγή παγωτών με χαμηλά ή καθόλου λιπαρά θα δημιουργήσει μία νέα αγορά για καταναλωτές στραμμένους στην υγιεινή διατροφή, διευρύνοντας ακόμα περισσότερο το ποσοστό των καταναλωτών παγωτού σε παγκόσμιο επίπεδο. Σχήμα 2: Διάγραμμα ροής διαδικασίας παραγωγής ενός τυπικού επιδόρπιου (Lampert, Modern Dairy Products 2009) 223 Σχήμα 3: Διάγραμμα ροής αυτόματης συνεχούς παγωμένου επεξεργασίας μίγματος παγωτού (Lampert, Modern Dairy Products 2009)

225 4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Goff, D.H., and Griffiths, W.M. (2006), Major advances in fresh milk and milk products: Fluid milk products and frozen desserts. Journal of Dairy Science 89, Gösta, B. (1995), Whey Processing. Dairy Processing Handbook. Tetra Pak Processing Systems AB, Sweden, pp Gösta, B. (1995), Ice Cream. Dairy Processing Handbook. Tetra Pak Processing Systems AB, Sweden, pp Haque, U.Z., and Ji, T. (2003), Cheddar whey processing and source II: Effect on non-fat ice cream and yoghurt. International Journal of Food Science and Technology 38, Herald, J.T., Aramouni, M.F., and Abu-Ghoush, H.M. (2008), Comparison study of egg yolks and egg alternatives in French vanilla ice cream. Journal of Texture Sciences 39, Karaca, B.O., Güven, M., Yasar, K., Kaya, S., and Kahyaoglou, T. (2009), The functional, rheological and sensory characteristics of ice creams with various fat replacers. International Journal of Dairy Technology 62, Kapoli, G. (2009), Can proteins contribute to the ice cream production? Από το website Fat reduction in ice cream Zafiriadis Thomas Department of Food Supply and Transportation, IEK XINIS SUMMARY Ice cream is a high cost dairy product, the production and consumption of which grow steadily year by year. Nevertheless, the last few years a new tendency among consumers concerning to nutritious and hygienic dairy products has created the need for fat reduction or fat substitution in ice creams. Many methods and techniques have been developed that enable materials that use carbohydrates, proteins and lipids, as a key ingredient. Among these the most significant are fat substitution with whey proteins and their products, with carbohydrates, and the use of lipid substitutes made from crude fiber or artificial lipids. Key words: frozen dairy desserts, non-fat milk solids, whey protein, maltodextrin, Olestra, Salatrim 224

226 DEVELOPMENT OF AN ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY FOR THE DETERMINATION OF PESTICIDE CHLORPYRIFOS IN FOOD Ζ. Τsialla 1, C. Ζikos 2, Α. Εvangelou 2, C.-E. Κarachaliou 2, P. Petrou 1, Ε. Livaniou 2, S. Kakabakos 1 1 Immunoassays-Immunosensors Laboratory, 2 Immunopeptide Chemistry Laboratory, INRaSTES, NCSR "Demokritos" Aghia Paraskevi Chlorpyrifos (O,O-Diethyl O-3,5,6-trichloropyridin-2-yl phosphorothioate) is a widely used pesticide, highly toxic for both terrestrial and aquatic organisms (SANCO/3059/99). Due to its toxicity, many methods, including immunochemical ones, have been reported in the literature for its detection in food and water samples. Nonetheless, the development of antibodies against compounds with small molecular weight which do not possess suitable chemical groups for conjugation with proteins, such as chlorpyrifos, is not a straightforward procedure -mainly due to the highly demanding step of the immunogen preparation; thus, the widespread application of immunochemical methods for such compounds may be rather limited. The aim of this work was the development of specific anti-chlorpyrifos antibodies, their evaluation and use in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for the detection of chlorpyrifos in food samples. For this purpose, two novel haptens were synthesized, one based on commercially available triclopyr (hapten A) and one based on the in-house prepared chlorpyrifos-derivative Ο,Οdiethyl O-[3,5-dichloro-6-[2-carboxyethylthio]-2-pyridyl] phosphothioate (hapten B); the above haptens were subsequently conjugated to proteins and used as immunogens for antibody development in rabbits. Moreover, conjugates of the above haptens with various proteins (other than those used as immunogenic carriers) and peptide dendrimers were also prepared and used for coating the ELISA wells. For the ELISA, 50 μl of suitably diluted antiserum and 50 μl of chlorpyrifos standard solutions in phosphate buffer were added to microtiter wells coated with hapten-conjugates and incubated for 1 hour at room temperature. After washing, a solution of goat anti-rabbit IgG antibody labeled with horseradish peroxidase was added to the wells and incubated for 45 min. Finally, the chromogenic substrate ABTS/ H 2 O 2 was added to the wells and the optical absorbance at 405 nm was measured after 30 min. The highest signals and the most sensitive displacement curves were obtained when a conjugate of hapten B with a peptide dendrimer was used as the solid phase reagent, at a concentration of 5 μg/ml, in combination with the antiserum corresponding to hapten B diluted 1:7,500. The method has a detection limit of 3 μg/ml, ΙC μg/ml and a dynamic range of μg/ml. In addition, the method was accurate (recovery %) and reproducible with intra- and inter-assay CVs lower than 3 and 7%, respectively. Currently, the method is evaluated for application to the analysis of fresh fruit extracts. Acknowledgements: The work was funded by the E.U. (FOODSNIFFER FP7-ICT and FOODSCAN FP7-SME ). 225

227 AΝΑΠΤΥΞΗ ΕΝΖΥΜΟΑΝΟΣΟΧΗΜΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ELISA ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΟΥ ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΟΝΟΥ ΧΛΩΡΟΠΥΡΙΦΟΣ ΣΕ ΤΡΟΦΙΜΑ Ζ. Τσιάλλα 1, Χ. Ζήκος 2, Α. Ευαγγέλου 2, Χ.-Ε. Καραχάλιου 2, Π. Πέτρου 1, Ε. Λιβανίου 2, Σ. Κακαμπάκος 1 1 Εργαστήριο Ανοσοαναλύσεων-Ανοσοαισθητήρων, 2 Εργαστήριο Ανοσοπεπτιδικής Χημείας, Ι.Π.Ρ.Ε.Τ.Ε.Α., ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος», Αγία Παρασκευή ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το χλωροπυριφός (O,O-Diethyl O-3,5,6-trichloropyridin-2-yl phosphorothioate) είναι ένα ζιζανιοκτόνο, τοξικό για όλους τους ζωντανούς οργανισμούς. Λόγω της τοξικότητάς του έχουν αναπτυχθεί ανοσοχημικές και άλλες μέθοδοι για τον προσδιορισμό του σε τρόφιμα και σε πόσιμα νερά. Ωστόσο, η διαδικασία ανάπτυξης αντισωμάτων για την εν λόγω ένωση δυσχεραίνεται από το μικρό μοριακό της βάρος και την έλλειψη κατάλληλων χημικών ομάδων για σύνδεση με πρωτεΐνες, περιορίζοντας την ευρεία εφαρμογή ανοσοχημικών μεθόδων για τον προσδιορισμό της. Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν: ι) η ανάπτυξη ειδικών απτενίων, συζευγμάτων των απτενίων με ανοσογονικές πρωτεΐνες και στη συνέχεια αντισωμάτων κατά του χλωροπυριφός, ιι) η παρασκευή συζευγμάτων των παραπάνω απτενίων με διαφορετικές πρωτεΐνες και πεπτιδικά δενδριμερή, ώστε να χρησιμοποιηθούν για την επικάλυψη πλακιδίων ELISA, και, ιιι) η αξιολόγηση και χρήση τόσο των αντιορών που αναπτύχθηκαν σε κουνέλια, όσο και των συζευγμάτων των απτενίων για την ανάπτυξη ανοσοχημικής μεθόδου ELISA για τον προσδιορισμό του χλωροπυριφός σε τρόφιμα. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε ήταν ανταγωνιστικού τύπου με όριο ανίχνευσης 3 μg/ml, ΙC μg/ml, δυναμική περιοχή μg/ml, υψηλή ακρίβεια (ανάκτηση %) και υψηλή ενδο- και δι-αναλυτική επαναληψιμότητα (CVs <3 και 7%, αντίστοιχα). ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το χλωροπυριφός (O,O-Diethyl O-3,5,6-trichloropyridin-2-yl phosphorothioate) είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο ζιζανιοκτόνο το οποίο είναι τοξικό για όλους τους ζωντανούς οργανισμούς (SANCO/3059/99, rev 1.5) [1], γεγονός που οδήγησε την Ευρωπαϊκή Αρχή Ασφάλειας Τροφίμων να ορίσει ανώτατα επιτρεπτά όρια υπολειμμάτων του σε τρόφιμα και στο πόσιμο νερό [2]. Προκειμένου να γίνει προσδιορισμός του χλωροπυριφός στα τρόφιμα, αλλά και σε άλλες μήτρες, όπως χώμα, νερό κ.ά., έχει αναπτυχθεί πληθώρα χρωματογραφικών μεθόδων, κυρίως αέριας και υγρής φάσης σε συνδυασμό ή όχι με φασματομετρία μάζας [3,4], οι οποίες χαρακτηρίζονται από πολύ χαμηλά όρια ανίχνευσης, αλλά και από υψηλό κόστος ανάλυσης καθώς και από χρονοβόρα προετοιμασία του δείγματος πριν την ανάλυση. Η ανάγκη για πιο γρήγορες, απλές, ευαίσθητες και οικονομικές μεθόδους οδήγησε στην ανάπτυξη ανοσοχημικών μεθόδων, οι οποίες μπορούν να 226

228 θεωρηθούν μια πολύ καλή εναλλακτική λύση έναντι των παραδοσιακών χρωματογραφικών μεθόδων. Ωστόσο, η ανάπτυξη αντισωμάτων για μικρού μοριακού βάρους ενώσεις που δεν διαθέτουν κατάλληλες χημικές ομάδες για σύνδεση με πρωτεΐνες, όπως το χλωροπυριφός, δυσχεραίνει σημαντικά την διαδικασία παρασκευής ανοσογόνων και την παραγωγή αντισωμάτων έναντι αυτών. Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη ειδικών πολυκλωνικών αντισωμάτων κατά του χλωροπυριφός σε κουνέλια και η χρήση τους για την ανάπτυξη ενζυμοανοσοχημικής μεθόδου ELISA για τον προσδιορισμό του σε τρόφιμα. Η εργασία περιελάμβανε σύνθεση δύο ειδικών απτενικών παραγώγων, συγκεκριμένα ενός παραγώγου του triclopyr (απτένιο A) και ενός παραγώγου του Ο,Ο-diethyl O-[3,5-dichloro-6-[2-carboxyethylthio]-2- pyridyl] phosphothioate (απτένιο B), σύζευξή τους με ανοσογονικές πρωτεΐνες και χρήση των συζευγμάτων ως ανοσογόνων για παραγωγή αντιορών σε κουνέλια. Επιπλέον, παρασκευάσθηκαν συζεύγματα των απτενίων Α και Β με διαφορετικές πρωτεΐνες και με πεπτιδικά δενδριμερή, κατάλληλα για ακινητοποίηση σε φρεάτια ELISA. ΜΕΘΟΔΟΣ Σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης προστίθενται 100 μl διαλύματος του συζεύγματος του απτενίου Β με πεπτιδικό δενδριμερές (5 μg/ml) σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 10mΜ, ph 7,4, NaCl 0,9% (PBS) και επωάζονται ολονυκτίως σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Στη συνέχεια ακολουθεί έκπλυση των φρεατίων με PBS που περίεχει 0,05% Tween 20 (PBST) και προσθήκη 300μL ανά φρεάτιο διαλύματος αποκλεισμού (PBST) που περιέχει 2% οροαλβουμίνης βοός (BSA). Μετά από 1 ώρα τα φρεάτια εκπλένονται με PBST και σε αυτά προστίθενται 50 μl αντιορού σε αραίωση 1:7.500 σε PBST που περιέχει 0,2% BSA και 50 μl προτύπων διαλυμάτων χλωροπυριφός στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει και 10% αιθανόλη. Μετά από επώαση 1 ώρας σε RT τα φρεάτια εκπλένονται με PBST. Ακολουθεί προσθήκη αντισώματος κατά των γ-σφαιρινών κουνελιού συζευγμένου με υπεροξειδάση της ραπανίδος επί 45 λεπτά, έκπλυση με PBST, προσθήκη χρωμογόνου υποστρώματος (ABTS/H 2 O 2 ) επί 30 λεπτά και μέτρηση της οπτικής απορρόφησης των φρεατίων στα 405 nm (Σχήμα 1). Σχήμα 1. Σχηματική απεικόνιση του συστήματος προσδιορισμού χλωροπυριφός, όταν για ακινητοποίηση χρησιμοποιείται σύζευγμα του απτενίου Β με πεπτιδικό δενδριμερές. 227

229 B/B0% ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η αξιολόγηση των αντιορών που αναπτύχθηκαν, πραγματοποιήθηκε μέσω προσδιορισμού του τίτλου τους χρησιμοποιώντας τόσο ομόλογα όσο και ετερόλογα συζεύγματα για ακινητοποίηση στα φρεάτια. Βρέθηκε ότι όταν στα φρεάτια μικροτιτλοδότησης ακινητοποιήθηκαν συζεύγματα του ομόλογου απτενίου με πεπτιδικά δενδριμερή οι τίτλοι των αντιορών ήταν υψηλότεροι σε σύγκριση με εκείνους που επιτεύχθηκαν με συζεύγματα του απτενίου με πρωτεΐνη. Επιπλέον, με την χρήση των συζευγμάτων των απτενίων Α και Β με πεπτιδικά δενδριμερή ως αντιδραστηρίων στερεάς φάσης, ελήφθησαν σημαντικά πιο ευαίσθητες καμπύλες βαθμονόμησης. Στο Σχήμα 2 παρουσιάζεται η βέλτιστη καμπύλη βαθμονόμησης η οποία προέκυψε όταν στα φρεάτια μικροτιτλοδότησης ακινητοποιήθηκε σύζευγμα του απτενίου Β με πεπτιδικό δενδριμερές, σε συγκέντρωση 5 μg/ml, σε συνδυασμό με αντιορό κατά του αντίστοιχου απτενίου (απτένιο Β) σε αραίωση 1: B IC Chlorpyrifos (ìg/ ml) Σχήμα 2. Καμπύλη βαθμονόμησης χλωροπυριφός. Χρησιμοποιήθηκαν: ι) ακινητοποιημένο σύζευγμα του απτενίου Β με πεπτιδικό δενδριμερές, 5 μg/ ml, και, ιι) αντιορός εναντίον του απτενίου Β, σε αραίωση 1: Η μέθοδος είχε όριο ανίχνευσης 3 μg/ml, ΙC μg/ml, δυναμική περιοχή μg/ml και ήταν ακριβής (ανάκτηση %). Η ενδο- και δι-αναλυτική επαναληψιμότητα της μεθόδου ήταν υψηλή (CVs<3 και 7%, αντίστοιχα). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε ταχεία, ακριβής και με σχετικά ικανοποιητική ευαισθησία μέθοδος ανοσοχημικού προσδιορισμού ELISA για τον προσδιορισμό του χλωροπυριφός. Η μέθοδος θα αξιολογηθεί περαιτέρω όσον αφορά την εφαρμογή της για τον προσδιορισμό του χλωροπυριφός σε εκχυλίσματα φρέσκων φρούτων. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η εργασία χρηματοδοτήθηκε από την Ε.Ε. μέσω των προγραμμάτων FOODSNIFFER (FP7-ICT ) και FOODSCAN (FP7-SME ). ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1) 2) 3) Anli Ε., Vural Ν., Vural Η., Gucer Υ., J. Inst. Brew. 2007,113(2), pp ) Rodrigues A.M., Ferreira V., Cardoso V.V., Ferreira E., Benoliel M.J., Journal of Chromatography A, 2007, 1150 (1-2), pp

230 DEVELOPMENT OF ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY FOR THE DETERMINATION OF THE BOVINE k-casein IN GOAT MILK Μ. Angelopoulou 1, P. Petrou 1, W. Haasnoot 2, J. Peters 2, A. Siafaka-Kapadai 3, S.E. Kakabakos 1 1 Laboratory of Immunoassays/Ιmmunosensors, INRaSTES, NCSR "Demokritos", Aghia Paraskevi RIKILT Wageningen UR, Akkermaalsbos 2, 6708 WB Wageningen, the Netherlands 3 Biochemistry Lab, Department of Chemistry, University of Athens, Panepistimiopolis, Athens In recent years, the consumption of goat milk is increasing worldwide not only because of its higher nutritional value compared to bovine milk, but also because of the fact that it causes fewer allergic reactions. The detection of possible adulteration of goat with bovine milk at low concentrations, in order to ensure its suitability for consumption by people allergic to bovine milk, requires methods of higher sensitivity and specificity than those currently employed for adulteration control where a detection limit of 1% bovine milk to goat s milk is acceptable. The aim of this study was to develop a sensitive ELISA method for the determination of bovine k- casein in goat s milk. This is accomplished by immobilizing bovine k-casein on microtiter wells. Then, for the assay, calibrators prepared in goat milk by addition of known concentrations of k casein, are diluted 100-times with phosphate buffer and pre-incubated for 30 minutes with an equal volume of a solution of two mouse monoclonal antibodies against k-casein. Thereafter, 100 μl of this mixture are transferred to the wells and incubated for 1 hour. After washing, 100 ml of the horseradish peroxidase (HRP) labeled anti-mouse IgG antibody are added per well and incubated for 40 minutes. Then, following washing, 100 ml of HRP substrate solution (ABTS/H 2 O 2 ) are added per well and the optical absorbance is measured at 405 nm after 30 min. The method developed had a detection limit of 135 pg/ml, IC ng/ml and dynamic range that extended from 0.5 to 25 ng/ml. In addition, it can detect the presence of bovine milk to goat s milk at percentages as low as %. The proposed method was characterized by high accuracy (recovery: %, dilution linearity R 2 : 0,987), and high inter- and intra-assay repeatability with coefficients of variation lower than 2 and 5%, respectively. In conclusion, a rapid, sensitive, accurate and highly reproducible method for the determination of bovine k-casein in goat s milk was developed. The method can be applied to detect the presence of cow's milk proteins in different foodstuffs in order to be labeled as allergen-free. Acknowledgements: This work was funded by the EU (project FOODSNIFFER FP7-ICT ) 229

231 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΝΖΥΜΟΑΝΟΣΟΧΗΜΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ELISA ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΗΣ ΒΟΕΙΟΥ κ-καζεινησ ΣΕ ΚΑΤΣΙΚΙΣΙΟ ΓΑΛΑ Μ. Αγγελοπούλου 1, Π. Πέτρου 1, W. Haasnoot 2, J. Peters 2, Α. Σιαφάκα-Καπάδαη 3, Σ. Κακαμπάκος 1 1 Εργαστήριο Ανοσοαναλύσεων-Ανοσοαισθητήρων, Ι.Π.Ρ.Ε.Τ.Ε.Α, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος», Αγία Παρασκευή RIKILT Wageningen UR, Akkermaalsbos 2, 6708 WB Wageningen, the Netherlands 3 Εργαστήριο Βιοχημείας, Τμήμα Χημείας, Ε.Κ.Π.Α., Πανεπιστημιόπολη, Αθήνα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η κατανάλωση κατσικίσιου γάλακτος αυξάνεται παγκοσμίως τα τελευταία χρόνια λόγω της υψηλότερης διατροφικής του αξίας σε σχέση με το βόειο γάλα αλλά και του γεγονότος ότι προκαλεί λιγότερες αλλεργικές αντιδράσεις. Ωστόσο, ο έλεγχος πιθανής ύπαρξης προσμίξεων βοείου γάλακτος στο κατσικίσιο σε χαμηλές συγκεντρώσεις ώστε να εξασφαλιστεί η καταλληλότητά του για κατανάλωση από άτομα αλλεργικά σε αυτό το γάλα προϋποθέτει την ύπαρξη μεθόδων υψηλότερης ευαισθησίας και ειδικότητας σε σχέση με τις χρησιμοποιούμενες για τον έλεγχο νοθείας οι οποίες έχουν σχετικά υψηλά όρια ανίχνευσης. Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε ενζυμοανοσοχημική μέθοδος ανταγωνιστικού τύπου για τον ποσοτικό προσδιορισμό βοείου κ-καζεΐνης σε κατσικίσιο γάλα. Για την ανάλυση, χρησιμοποιήθηκαν δυο μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού κατά της κ-καζεΐνης σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης επιστρωμένα με αυτήν την πρωτείνη. Η αναπτυχθείσα μέθοδος είχε όριο ευαισθησίας 135 pg/ml, IC 50 2,86 ng/ml και δυναμικό εύρος 0,5-25 ng/ml και παρείχε τη δυνατότητα ανίχνευσης προσμίξεως βοείου γάλακτος σε κατσικίσιο σε ποσοστό >0,009%. Επιπλέον η μέθοδος χαρακτηριζόταν από υψηλή ακρίβεια (ανάκτηση: %, γραμμικότητα αραίωσης R 2 : 0,987) και επαναληψιμότητα (ενδο- και δια-αναλυτικός συντελεστής διακύμανσης <2 και 5%, αντίστοιχα). Ως εκ τούτου η αναπτυχθείσα μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί για τον έλεγχο της παρουσίας πρωτεϊνών του αγελαδινού γάλακτος σε τρόφιμα ώστε να χαρακτηριστούν ως ελεύθερα αλλεργιογόνων. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η κατανάλωση κατσικίσιου γάλακτος αυξάνεται παγκοσμίως τα τελευταία χρόνια όχι μόνο λόγω της υψηλότερης διατροφικής του αξίας σε σχέση με το βόειο γάλα αλλά και του γεγονότος ότι προκαλεί λιγότερες αλλεργικές αντιδράσεις [1]. Η Ευρωπαϊκή νομοθεσία απαιτεί από τις βιομηχανίες τροφίμων να αναφέρουν το είδος προέλευσης του γάλακτος που χρησιμοποιείται για την παρασκευή τροφίμων ώστε να εξασφαλιστεί η καταλληλότητά του για κατανάλωση. Οι πιο αλλεργιογόνες πρωτεΐνες του βοείου γάλακτος είναι οι καζεΐνες [2], για τις οποίες έχουν αναπτυχθεί διαφορές μέθοδοι προσδιορισμού. Οι επικρατέστερες μέθοδοι είναι εκείνες που βασίζονται σε ανίχνευση DNA (PCR) και οι ανοσοχημικές. Ωστόσο οι τεχνικές PCR απαιτούν υψηλού κόστους εξοπλισμό και είναι ακατάλληλες 230

232 για έλεγχο ρουτίνας [3]. Αντιθέτως, οι ενζυμοανοσοχημικες τεχνικές είναι εύκολες στη χρήση, ταχείες και επιδέχονται αυτοματοποίηση [4]. Ωστόσο, οι περισσότερες από τις υπάρχουσες ανοσοχημικές μεθόδους δεν έχουν τα όρια ανίχνευσης που απαιτούνται έτσι ώστε να εξασφαλιστεί η καταλληλότητα του γάλακτος για κατανάλωση από άτομα αλλεργικά σε αυτό [5]. Για το λόγο αυτό, σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη ενζυμοανοσοχημικής μεθόδου ELISA για τον προσδιορισμό βοείου κ-καζεΐνης σε κατσικίσιο γάλα με υψηλότερη ευαισθησία και ειδικότητα σε σχέση με τις χρησιμοποιούμενες για τον έλεγχο νοθείας. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Υλικά Η βόειος κ-καζεΐνη και το σημασμένο με υπεροξειδάση της ραπανίδος αντίσωμα αιγός κατά των γ- σφαιρινών ποντικού ήταν από τη Sigma-Aldrich (Germany). Τα φρεάτια μικροτιτλοδότησης ήταν από την Greiner Diagnostic GmbH (Germany). Τα μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού κατά της κ-καζεΐνης με κωδικούς 33-4G10 και 33-6A10 αναπτύχθηκαν στο RIKILT (Wageningen). Πρωτόκολλο ενζυμοανσοσοχημικής μεθόδου Σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης προστίθενται 100 μl διαλύματος κ-καζεΐνης 10 μg/ml σε ρυθμιστικό διάλυμα (Ρ.Δ.) ανθρακικών 50 mm, ph 9,25, και ακολουθεί ολονύκτια επώαση στους 4 ο C. Ακολουθεί έκπλυση των φρεατίων δύο φορές με 300 μl Ρ.Δ. φωσφορικών 10 mm, ph 7,4, που περιέχει 9 mg/ml NaCl και 0,05% (ο/ο) Tween 20 (PBST), και κάλυψη των ελεύθερων θέσεων της επιφάνειας μέσω επώασης με 300 μl διαλύματος NAHCO 3 0,1 M, ph 8,5, που περιέχει 1% (β/ο) βόειο οραλβουμίνη (BSA), επί 1 ώρα. Στην συνέχεια τα φρεάτια εκπλενονται με PBST όπως προηγουμένως. Για την ανάλυση, πρότυπα διαλύματα που παρασκευάζονται σε κατσικίσιο γάλα με προσθήκη γνωστών ποσοτήτων κ-καζεΐνης ή αγελαδινού γάλακτος αραιώνονται 100 φορές με Ρ.Δ. φωσφορικών 10 mm, ph 7,4, που περιέχει 10 mg/ml BSA, 9 mg/ml NaCl, 0,5 mg/ml NaN 3 και 0,05% (ο/ο) Tween 20, και προεπωάζονται με ίσο όγκο διαλύματος των δύο μονοκλωνικών αντισωμάτων ποντικού κατά της κ-καζεΐνης (300 ng/ml το καθένα) επί 30 λεπτά. Στη συνέχεια, 100 μl του μίγματος μεταφέρονται στα φρεάτια και επωάζονται επί 1 ώρα υπό ανάδευση. Ακολουθεί έκπλυση των φρεατίων με 4Χ300 μl PBST και επώαση με 100 μl διαλύματος αντισώματος κατά των γ-σφαιρινών ποντικού σημασμένου με HRP (2,5 μg/ml) σε Τris-HCl 0,15 M, ph 8,25, που περιέχει 5 mg/ml BSA, επί 40 λεπτά. Ύστερα από τέσσερις εκπλύσεις με PBST, στα φρεάτια προστίθενται 100 μl διαλύματος χρωμογόνου υποστρώματος της HRP (ABTS/H 2 O 2 ) και μετά από επώαση 30 λεπτών μετράται η απορρόφηση των φρεατίων στα 405 nm με την συσκευή Multiscan RC (Labsystems OY, Finland). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στο σχήμα 1.1. παρουσιάζονται αντιπροσωπευτικές καμπύλες βαθμονόμησης που ελήφθησαν με την αναπτυχθείσα μέθοδο χρησιμοποιώντας πρότυπα διαλύματα που είχαν παρασκευαστεί σε κατσικίσιο γάλα με προσθήκη γνωστών ποσοτήτων πλήρους βοείου γάλακτος (Α) ή βοείου κ-καζεΐνης (Β). 231

233 (B x /B 0 )% (B x /B 0 )% A 100 B ,0 0,5 1,0 1,5 2,0 cow's milk in goat milk (%) k-casein (ug/ml) Σχήμα 1.1. Αντιπροσωπευτικές καμπύλες βοείου γάλακτος (Α) και κ-καζεΐνης (Β) σε κατσικίσιο γάλα. Κάθε σημείο είναι ο μέσος όρος 4 μετρήσεων ± S.D. Η αναπτυχθείσα μέθοδος είχε όριο ευαισθησίας 135 pg/ml, IC 50 : 2,86 ng/ml και δυναμικό εύρος 0,5-25 ng/ml ως προς κ-καζεΐνη. Επιπλέον, παρείχε τη δυνατότητα ανίχνευσης προσμίξεως βοείου γάλακτος σε κατσικίσιο με όριο ευαισθησίας 0,01%, IC 50 : 8,9% και δυναμικό εύρος 0,01-2% σε 100 φορές αραιωμένο γάλα. Η ακρίβεια και η επαληψιμότητα της μεθόδου ήταν υψηλές με τιμές ανάκτησης που κυμαίνονταν από 92 έως 105%, γραμμικότητα αραίωσης R 2 : 0,987, και συντελεστές ενδο- και διαναλυτικής διακύμανσης μικρότερους από 2 και 5%, αντίστοιχα, για όλο το εύρος της περιοχής εργασίας. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Συμπερασματικά, αναπτύχθηκε ταχεία, ευαίσθητη, ακριβής και υψηλής επαναληψιμότητας μέθοδος προσδιορισμού κ-καζεΐνης σε κατσικίσιο γάλα η οποία μπορεί να εφαρμοστεί για τον έλεγχο της παρουσίας πρωτεϊνών του αγελαδινού γάλακτος και σε άλλα τρόφιμα ώστε να χαρακτηριστούν ως ελεύθερα αλλεργιογόνων. Ευχαριστίες: Η εργασία χρηματοδοτήθηκε από την Ε.Ε. (FOODSNIFFER FP7-ICT ). ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] H. Song, H. Xue, Y.Han, Food Control 22 (2011), [2] P.R. del Rıo, S. Sanchez-Garcıa, C. Escudero, C. et al., Pediatr. Allergy Immunol. 23 (2012), [3] I. P. Hurley, R. C. Coleman et a.l, Int. Dairy J., 16 (2006), [4] I. Giovannacci, C. Guizard et al., Int. J. Food Sci. Techn., 39 (2004), [5] M. Vitkova, P. Rauch and L. Fukal, Czech. J. Food Sci., 20 (2002),

234 DEVELOPMENT OF A DIRECT COMPETITIVE ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY FOR THE DETERMINATION OF OCHRATOXIN A IN BEER SAMPLES B. Pagkali 1, P. Petrou 1, W. Haasnoot 2, J. Peters 2, Α. Economou 3, S. Kakabakos 1 1 Immunoassays/Immunosensors Lab, INRaSTES, NCSR «Demokritos», Aghia Paraskevi 15310, Greece 2 RIKILT Wageningen UR, Akkermaalsbos 2, 6708 WB Wageningen, the Netherlands 3 Analytical Chemistry Lab, Dept. Chemistry, University of Athens, Panepistimiopolis Zografou 15771, Greece Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin produced by several fungi of the Aspergillus and Penicillium species and is highly toxic to humans [1, 2]. OTA is detected as a contaminant in a variety of foods, with cereals and cereal processing products to be listed amongst the most usually contaminated. Therefore, European Union has set limits on the maximum allowed concentrations of OTA in foodstuffs (0.5-5 mg/kg) [3], and as a result there is an increasing demand to develope sensitive methods for determining OTA in those samples. In the present study, two competitive enzyme-linked immunosorbent assay methods (ELISA) are developed and compared with regard to determination of OTA in beer samples. Both methods are based on the use of an OTA conjugate with ovalbumin (OVA) as a solid phase reagent. In the first method, mixtures of standard solutions and mouse monoclonal antibody against OTA (Mab anti- OTA) are added to the wells, while the detection is performed using anti-mouse IgG antibody (secondary antibody) labeled with horseradish peroxidase (HRP). In the second method, mixtures of standard solutions, monoclonal antibody and conjugate of OTA with biotinylated bovine gammaglobulins are added to the wells whereas for the detection a mixture of second antibody and streptavidin, both labeled with HRP is used. In all cases, standard solutions of OTA prepared in beer are diluted 8-fold with buffer solution containing 10% (v/v) methanol and used in the assay. The highest signals and the most sensitive calibration curves were obtained following the second method and using the OTA-OVA conjugate at a concentration of 1 μg/ml for coating of the wells (100 μl), 30 ng/ml of MAb anti-ota (50 μl) and 1 μg/ml of biotinylated OTA-bovine gamma globulin conjugate (10 μl). The detection limit of the proposed method was 0.22 ng/ml, the IC ng/ml, and the dynamic range ng/ml. The method was accurate (recovery 87 to 111%) and exhibited high intra- and inter-assay repeatability with variation coefficients lower than 3 and 5%, respectively. In conclusion, the developed method is accurate and has detection sensitivity and dynamic range suitable for the quantitative determination of OTA in beer samples and cereals. Acknowledgements: This work was financed by the EU (project FOODSNIFFER FP7-ICT ) 233

235 AΝΑΠΤΥΞΗ ΕΝΖΥΜOΑΝΟΣΟΧΗΜΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ELISA ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΙΚΟΥ ΤΥΠΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΩΧΡΑΤΟΞΙΝΗΣ Α ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΜΠΥΡΑΣ Β. Πάγκαλη 1, Π. Πέτρου 1, W. Haasnoot 2, J. Peters 2, Α. Οικονόμου 3, Σ. Κακαμπάκος 1 1 Εργαστήριο Ανοσοαναλύσεων-Ανοσοαισθητήρων, Ι.Π.Ρ.Ε.Τ.Ε.Α, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος», Αγία Παρασκευή RIKILT Wageningen UR, Akkermaalsbos 2, 6708 WB Wageningen, the Netherlands 3 Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ, Πανεπιστημιόπολη, Αθήνα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η ωχρατοξίνη Α (ΟΤΑ) είναι τοξική ουσία που παράγεται από μύκητες του γένους Penicillium και Aspergillus και ανιχνεύεται συχνά σε δημητριακά και προϊόντα κατεργασίας αυτών. Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκαν και συγκρίθηκαν δύο μέθοδοι ενζυμοανοσοχημικής ανάλυσης ανταγωνιστικού τύπου για τον προσδιορισμό της ΟΤΑ σε δείγματα μπύρας. Στην πρώτη μέθοδο, στα επικαλλυμένα με σύζευγμα ΟΤΑ-OVA φρεάτια προστίθενται μίγματα προτύπων διαλυμάτων και μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού κατά της ΟΤΑ, ενώ η ανίχνευση πραγματοποιείται με χρήση αντισώματος κατά των γ-σφαιρινών ποντικού επισημασμένου με υπεροξειδάση της ραπανίδος. Στη δεύτερη, προστίθενται μίγματα προτύπων διαλυμάτων, μονοκλωνικού αντισώματος και βιοτινυλιωμένου συζεύγματος ΟΤΑ με γ-σφαιρίνες βοός, ενώ για την ανίχνευση χρησιμοποιείται μίγμα δευτέρου αντισώματος και στρεπταβιδίνης, επισημασμένα με HRP. Τα υψηλότερα σήματα και οι πλέον ευαίσθητες καμπύλες βαθμονόμησης ελήφθησαν με την δεύτερη μέθοδο, η οποία βρέθηκε ότι είναι ακριβής και έχει ευαισθησία ανίχνευσης και δυναμικό εύρος κατάλληλα για τον ποσοτικό προσδιορισμό ΟΤΑ σε δείγματα μπύρας και δημητριακών. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ωχρατοξίνη Α (ΟΤΑ) παράγεται από τους μύκητες του γένους Penicillium και Aspergillus και απαντάται κυρίως σε δημητριακά, κόκκους καφέ και ξηρούς καρπούς καθώς επίσης και στα προϊόντα κατεργασίας αυτών όπως η μπύρα και ο καφές. Η ΟΤΑ είναι εξαιρετικά τοξική και έχει αποδεδειγμένα τερατογόνο, μεταλλαξιογόνο, ηπατοτοξική, νεφροτοξική και ανοσοκατασταλτική δράση [1,2]. Για τον λόγο αυτόν, η Ε.Ε. έχει θέσει αυστηρά όρια όσον αφορά τις ανώτερες επιτρεπτές συγκεντρώσεις της ΟΤΑ στα τρόφιμα (0,5 μg/kg για παιδικές τροφές, 5 μg/kg για μη μεταποιημένα δημητριακά) [3]. Η ανίχνευση της ΟΤΑ σε τόσο χαμηλά επίπεδα απαιτεί ευαίσθητες αναλυτικές μεθόδους. Οι συνήθως χρησιμοποιούμενες μέθοδοι περιλαμβάνουν χρωματογραφικές και ενζυμοανοσοχημικές [4]. Οι χρωματογραφικές μέθοδοι απαιτούν ειδική οργανολογία και είναι αρκετά χρονοβόρες όσον αφορά την προετοιμασία του δείγματος αφού συνήθως απαιτείται απομόνωση του αναλύτη από το δείγμα με στήλη χρωματογραφίας συγγενείας. Αντιθέτως, οι ενζυμοανοσοχημικές αναλύσεις είναι δυνατόν να παράσχουν αξιόπιστα αποτελέσματα με απλή ή 234

236 καθόλου κατεργασία του δείγματος. Για τον λόγο αυτόν, στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκαν δύο μέθοδοι ενζυμοανοσοχημικής ανάλυσης ανταγωνιστικού τύπου για τον προσδιορισμό της ΟΤΑ σε δείγματα μπύρας και αξιολογήθηκαν ως προς την ευαισθησία ανίχνευσης, την ακρίβεια και την επαναληψιμότητα τους για τον ποσοτικό προσδιορισμό ΟΤΑ σε δείγματα μπύρας. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Υλικά και Αντιδραστήρια Το μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού κατά της ΟΤΑ (Mab anti-ota) ήταν από την Soft Flow Ltd. Το σύζευγμα ΟΤΑ-ωαλβουμίνη (ΟΤΑ-ΟVA) και η ΟΤΑ ελήφθησαν από την aokin AG. Το σημασμένο με υπεροξειδάση της ραπανίδος αντίσωμα κατά των γ-σφαιρινών ποντικού (anti-mouse IgG- HRP), οι γ-σφαιρίνες βοός (b-igg) και η στρεπταβιδίνη-hrp (str-hrp) ήταν από την Sigma- Aldrich. Τα φρεάτια μικροτιτλοδότησης ήταν από την Nunc. Παρασκευή και βιοτινυλίωση συζεύματος OTA με b-igg Σε διάλυμα ΟΤΑ 1 mg/ml σε μίγμα 50:50 MES/DMSO προστέθηκαν 1,2 mg Ν- υδροξυηλεκτριμιδίου και 2,1 mg EDC και το μίγμα επωάστηκε επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Στη συνέχεια, 300 μl από το μίγμα αναμίχθηκαν με 500 μl διαλύματος b-igg συγκέντρωσης 2 mg/ml σε NaHCO 3 0,1 M, ph 8,5, και επωάστηκαν επί 18 ώρες στους 4 o C. Ακολούθησε διαπίδυση ως προς διάλυμα NaHCO 3 0,1 M, ph 8,5. Η βιοτινυλίωση του συζεύγματος της ΟΤΑ με b-igg πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με μέθοδο της βιβλιογραφίας [5]. Παρασκευή προτύπων διαλυμάτων ΟΤΑ σε μπύρα Πρότυπα διαλύματα ΟΤΑ γνωστής συγκέντρωσης παρασκευάσθηκαν σε μπύρα, μετά από απαέρωση με υπερήχους. Τα πρότυπα και τα δείγματααραιώνονται πριν την ανάλυση 8 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα (Ρ.Δ.) Τris-HCl 50 mm, ph 7,8, το οποίο περιείχε 5 mg/ml BSA, 9 mg/ml NaCl, 0.05% (o/o) Tween 20, και 10% (ο/ο) μεθανόλη. Πρωτόκολλο ανάλυσης Τα φρεάτια επωάστηκαν με 100 μl διαλύματος ΟΤΑ-OVA, συγκέντρωσης 1 μg/ml σε Ρ.Δ. ανθρακικών 50 mm, ph 9,2 για 18 ώρες σε RT. Στη συνέχεια τα φρεάτια εκπλύθηκαν 2Χ με 300 μl Ρ.Δ. Τris-HCl 10 mm, ph 8,25, 0,9% NaCl και 0,05% Tween 20 (διάλυμα έκπλυσης), και σε αυτά προστέθηκαν 300 μl διαλύματος BSA 1% σε NaHCO 3 0,1 M, ph 8,5 επί 2 ώρες σε RT και εκπλύθηκαν. Πριν την ανάλυση, 50 μl διαλύματος Mab anti-ota συγκέντρωσης 60 ng/ml σε Ρ.Δ. Τris-HCl 50 mm, ph 7,8, το οποίο περιείχε 0,5% BSA, 0,9% NaCl και 0,05% Tween 20 (Ρ.Δ. ανάλυσης) επωάστηκαν με 50 μl προτύπων διαλυμάτων ΟΤΑ επί 2 ώρες σε RT. Κατόπιν, για την πρώτη μέθοδο, προστέθηκαν ανά φρεάτιο 100 μl μίγματος και επωάστηκαν επί 2 ώρες. Τα φρεάτια εκπλύθηκαν 4Χ με 300 μl διαλύματος έκπλυσης και ακολούθησε επώαση με 100 μl διαλύματος anti-mousue IgG-HRP 2,5 μg/ml σε Tris-HCl 0,15 M, ph 8,25, 0,5% BSA, επί 40 λεπτά σε RT. Σύμφωνα με τη δεύτερη μέθοδο, στα φρεάτια προστέθηκαν 100 μl προεπωασμένου μίγματος αντισώματος-προτύπων διαλυμάτων και 10 μl διαλύματος βιοτινυλιωμένου συζεύγματος 235

237 % Abs OTA με b-igg 1 μg/ml σε Ρ.Δ. ανάλυσης και επωάστηκαν επί 2 ώρες, υπό ανάδευση και εκπλύθηκαν. Ακολούθησε επώαση με 100 μl διαλύματος που περιείχε 2,5 μg/ml anti-mouse IgG- HRP και 500 ng/ml str-hrp σε Tris-HCl 50 mm, ph 7.8, 1% BSA, επί 40 λεπτά σε RT. Και στις δύο μεθόδους, τα φρεάτια εκπλύθηκαν 4Χ με Ρ.Δ. έκπλυσης. Ακολούθησε προσθήκη 100 μl/φρεάτιο διαλύματος χρωμογόνου υποστρώματος (ABTS/H 2 O 2 ) και μέτρηση της οπτικής απορρόφησης στα 405 nm μετά από 30 λεπτά με τη συσκευή Multiscan RC (Labsystems OY). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Οι πλέον ευαίσθητες καμπύλες βαθμονόμησης ελήφθησαν χρησιμοποιώντας διάλυμα ΟΤΑ-OVA 1 μg/ml για την επικάλυψη των φρεατίων και στις δύο μεθόδους. Το ΜΑb anti-ota στην πρώτη μέθοδο ήταν 100 ng/ml, ενώ για στη δεύτερη μέθοδο χρησιμοποιήθηκαν 60 ng/ml ΜΑb anti-ota και 1 μg/ml βιοτινυλιωμένης OTA/b-IgG. Το όριο ανίχνευσης της πρώτης μεθόδου ήταν 0,58 ng/ml και το IC 50 8,9 ng/ml, ενώ της δεύτερης 0,22 ng/ml και IC 50 5,3 ng/ml, αντίστοιχα. Λόγω της μεγαλύτερης ευαισθησίας ανίχνευσης που επιτεύχθηκε με την δεύτερη μέθοδο, πραγματοποιήθηκε περαιτέρω αξιολόγηση. Βρέθηκε ότι η μέθοδος ήταν ακριβής (ανάκτηση %) και είχε υψηλή επαναληψιμότητα με ενδο- και δι-αναλυτικό συντελεστή διακύμανσης <3 και 5%, αντίστοιχα Σχήμα 1. Αντιπροσωπευτικές καμπύλες ΟΤΑ σε μπύρα που ελήφθησαν με την πρώτη (μαύρα τετράγωνα) και την δεύτερη (κόκκινοι κύκλοι) αναπτυχθείσα μέθοδο ενζυμο-ανοσοχημικού προσδιορισμού OTA concentration (ng/ml) ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η αναπτυχθείσα μέθοδος ενζυμοανοσοχημικού προσδιορισμού της ΟΤΑ σε δείγματα μπύρας έχει επαρκή ευαισθησία ανίχνευσης και χαρακτηρίζεται από ακρίβεια και επαναληψιμότητα. Ως εκ τούτου μπορεί να βρει εφαρμογή για τον προσδιορισμό της ΟΤΑ σε διάφορα είδη τροφίμων. Ευχαριστίες: Η εργασία χρηματοδοτήθηκε από την Ε.Ε. (FOODSNIFFER FP7-ICT ). ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Fink-Gremmels J., Veterinary Quarterly, 21 (1999) [2] Richard J.L., & Payne G.A., Raleigh: CAST Task Force Report (1999). [3] Commission Regulation (EC) No. 123/2005 Official Journal of the European Communities L25/3 ( PDF). [4] Songsermsakul P., Razzazi-Fazelib E.J. Liquid Chrom. Rel. Technolog., 31 (2008) [5] Niotis A.E., Mastichiadis C., Petrou P.S., Christofidis I., Kakabakos S.E., Siafaka-Kapadai A., Misiakos K., Anal. Bioanal. Chem., 396 (2010),

238 Κατανομή του είδους και της αντιβιοαντοχής Staphylococcus spp. σε πόσιμα νερά Θεοδωρίδου Ειρήνη 1, Αλεξόπουλος Αθανάσιος 1, Σταυροπούλου Ελισάβετ 2, Πλέσσας Σταύρος 1, Μαντζουράνη Ιωάννα 1, Φουρνομίτη Μαρία 1,Tζούτη Βασιλική 1 & Μπεζιρτζόγλου Ευγενία 1 * 1 Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης, Τμήμα Αγροτικής Ανάπτυξης, Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Βιοτεχνολογίας και Υγιεινής.,68200-Ορεστιάδα. 2 Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης, Ιατρικό Τμήμα, Αλεξανδρούπολη * empezirt@agro.duth.gr Abstract Staphylococci are microorganisms with a worldwide distribution and health significance given that very often associated with foodborne disease and nosocomial infections. Additionally, they are also characterized by an elevated resistance to common synthesized antibiotics. But besides their abundance in nature, its presence in drinking water supplies has not studied adequately mainly due to their special growth requirements and because they have not included in guidelines set by various national and international authorities. However, various factors as the water source surface or ground - the insufficient treatment, flooding and salinization phenomena, affects the final quality and allow the contamination of drinking water supplies exposing the public to a health danger. In this study, we have focused our efforts on the occurrence of Staphylococcus spp., in 317 drinking water samples collected from 126 sites cities and small communities located in NE Greece. Water samples were examined for the presence of Staphylococci by using classical microbiological methods, their subsequent identification with biochemical and enzymatic techniques and automated analyzers. Additionally, a large percentage of isolated strains were tested for their susceptibility against 9 common antibiotics belonging to an equal number of groups. Our results showed that Staphylococcus spp., were prevalent in 164 drinking water samples (51.7%) in densities ranging from 1 to 190 cfu/ 100 ml. Common species were S. aureus, S. warneri, S. sciuri, S. gallinarum, S. xylosus and S. haemoliticus. Oxacillin resistant Staphylococcus aureus and therefore probably methicillin resistant S. aureus were observed in 33 samples (10.4%). Vancomycin resistant strains were detected in 12% of the positive samples, ampicillin resistant in 90% and piperacillin/tazobactam resistant in 53%. No resistant strains to amikacin, levofloxacin, linezolid and minocycline were found. The occurrence of antibiotic resistant Staphylococcus spp., in drinking water samples, arise some questions regarding the quality of water sources used to supply the population as well as to the methods employed and the efficiency of treatment. Key words: Staphylococcus spp., drinking water, water quality, susceptibility 237

239 1. Εισαγωγή Οι σταφυλόκοκκοι είναι ένα γένος θετικών κατά Gram βακτηρίων τα οποία στο μικροσκόπιο εμφανίζονται ως κόκκοι, σε σχηματισμό σταφυλιού (από το σχηματισμό αυτό προήλθε και η ονομασία του). Το γένος περιλαμβάνει τουλάχιστον 40 είδη, τα περισσότερα από τα οποία είναι αβλαβή και αποικούν φυσιολογικά στο δέρμα και στους βλεννογόνους αδένες του ανθρώπου αλλά και άλλων οργανισμών [1]. Οι σταφυλόκοκκοι έχουν επίσης αναφερθεί ως μέρος της φυσιολογικής μικροβιακής χλωρίδας του αέρα, του εδάφους και του φυσικού επιφανειακού νερού. Εκτός από τους σταφυλόκοκκους το νερό περιέχει ποικιλία μικροοργανισμών επιβλαβών και μη. Οι περισσότερες έρευνες που έχουν γίνει πάνω στην ποιότητα του νερού εξετάζουν την παρουσία Escherichia coli, κολοβακτηριδίων και εντερόκοκκων καθώς αποτελούν κριτήρια ποιότητας νερού [2]. Επίσης οι περισσότερες έρευνες έχουν γίνει σε νερό ποταμών [3,4], θαλασσινό νερό [5], παράκτια ρεύματα [6], υπόγειο νερό [7], νερό από πισίνες [8,9]. Τα τελευταία χρόνια πραγματοποιήθηκαν κάποιες έρευνες και σε πόσιμο νερό [10,11,12]. Σκοπός της παρούσας έρευνας είναι ο έλεγχος της παρουσίας Staphylococcus spp. αλλά και η πιθανή αντοχή τους σε αντιβιοτικά (αντιβιοαντοχή) σε δείγματα πόσιμου νερού. 2. Υλικά και Μέθοδοι Σε διάστημα δύο χρόνων συλλέχθηκαν 317 δείγματα πόσιμου νερού από χωριά και πόλεις του Νομού Έβρου. Τα δείγματα αναλύθηκαν αμέσως μετά τη συλλογή μέσα σε διάστημα 3 ωρών. Εξετάστηκαν για ελεύθερο χλώριο, ph, αγωγιμότητα, νιτρικά ιόντα (NΟ 3 ) και την αμμωνία (NΗ + 4 ). Ο μικροβιακός έλεγχος έγινε με την μέθοδο των διηθητικών μεμβρανών, αρχικά σε καλλιεργητικό υλικό Mannitol Salt Agar. Τα τριβλία επωάστηκαν στους 37 ο C για 24h. Καταμετρήθηκαν οι χαρακτηριστικές για σταφυλόκοκκο αποικίες και έγινε η ταυτοποίησή τους με ενζυμικά τεστ και με το σύστημα VITEK 2 Compact 30. Τέλος, έγινε έλεγχος της αντιβιοαντοχής με τη μέθοδο διάχυσης δίσκων (Kirby-Bauer). Η κατηγοριοποίηση σε ευαίσθητα, ενδιάμεσα και ανθεκτικά έγινε με βάση τα πρότυπα του NLSI [13] αλλά λήφθηκαν υπ όψη και τα πρότυπα της Ευρωπαϊκής EUCAST [14]. 3. Αποτελέσματα - Συζήτηση Συνολικά ελέγθηκαν 317 δείγματα νερών. Από αυτά ελεύθερο χλώριο βρέθηκε στα 233 δείγματα (74.7%) με μέση τιμή τα 0.16 mg/l (0.01 έως 3.85 mg/l). Η μέση τιμή της αγωγιμότητας ήταν μs, του ph 7.56, της αμμωνίας τα 0.09 mg/l (NH 3 -N) και των νιτρικών στα 2.15 mg/l (ΝΟ 3 - Ν). Από τα 317 δείγματα, θετικά ως προς την παρουσία Staphylococus spp., βρέθηκαν τα 205 ή το 64.7% του συνόλου σε πληθυσμούς από cfu/100ml. Τα πλέον συχνότερα στελέχη ήταν τα S. aureus, S. warneri, S. sciuri, S. gallinarum, S. xylosus και S. haemoliticus Από τα στελέχη που απομονώθηκαν σε μονοκαλλιέργειες και ελέγθηκαν όσον αφορά την ανθεκτικότητά τους σε αντιβιοτικά παρατηρήσαμε ότι: Σχεδόν, το σύνολο των στελεχών ήταν ανθεκτικό στην αμπικιλλίνη και στην σεφταζιδίμη αφού οι ζώνες ανάσχεσης που μετρήθηκαν ήταν μικρότερες από 2.8 mm και 238

240 1.4 mm αντίστοιχα [13]. Ανθεκτικότητα επίσης εμφάνισε το 53% των στελεχών στον συνδυασμό πιπερακιλλίνης/ταζομπακτάμης. Σημαντικό είναι ότι ένα ποσοστό Staphylococcus spp. (12%), εμφάνισε αντοχή στην βανκομυκίνη ενώ ένα ποσοστό 37% εμφανίστηκε σαν ενδιάμεσο. Η παρουσία τέτοιων στελεχών χαρακτηρίζεται ιδιαίτερα ανησυχητική τόσο από τους κλινικούς όσο και από τους περιβαλλοντικούς μικροβιολόγους [15]. Ικανό ποσοστό ενδιάμεσης ανθεκτικότητας (22.2%) καταγράφηκε και στην περίπτωση της μινοκυκλίνης. Όσον αφορά την ευαισθησία των στελεχών, αυτή κυμάνθηκε από το 44.4% στον συνδυασμό πιπερακιλλίνης/ταζομπακτάμης, σχεδόν 60% στην βανκομυκίνη και έφθασε το 92.6% για την αμικασίνη, λεβοφλοξασίνη και λινεζολίδη. 4. Συμπεράσματα Συμπερασματικά, αν και η παρουσία του γένους Staphylococcus μεμονωμένα δεν αποτελεί κριτήριο για την ποιότητα του πόσιμου νερού, απομονώθηκαν είδη σταφυλόκοκκων των οποίων η αντοχή σε αντιβιοτικά, θέτει ερωτηματικά αφενός για την προέλευση του νερού ύδρευσης και αφετέρου για την αποτελεσματική επεξεργασία και απολύμανσή του πριν δοθεί προς κατανάλωση. Περαιτέρω έρευνα θα αναδείξει το μέγεθος του πιθανού προβλήματος. 5. Βιβλιογραφία 1. Ευγενία Μπεζιρτζόγλου, Μικροβιολογία Τροφίμων, Επιστημονικές Εκδόσεις Παρισιανού Α.Ε., Αθήνα. 2. AWWA, Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Water Works Association, Water Environment Federation, Baltimore. 3. Vavias S., Alexopoulos A., Plessas S., Stefanis C., Voidarou C., Stavropoulou E., Bezirtzoglou E., Microbial ecology of the watery ecosystems of Evros river in North Eastern Greece and its influence upon cultivated soil ecosystem. Anaerobe, 17, Gemmell M. E., Schmidt S., Is the microbiological quality of the Msunduzi River (KwaZulu- Natal, South Africa) suitable for domestic, recreational, and agricultural purposes?. Environ. Sci. Pollut. Res., 20, Curiel- Ayala F., Quiñones- Ramírez E.I., Pless R.C., González-Jasso E., Comparative studies on Enterococcus, Clostridium perfringens and Staphylococcus aureus as quality indicators in tropical seawater at a Pacific Mexican beach resort. Marine Pollytion Bulletin, 64, Viau E.J., Goodwin K.D., Yamahara K.M., Layton B.A., Sassoubre L.M., Burns S.L., Tong H., Wong S.H.C., Lu Y., Boehm A.B., Bacterial pathogens in Hawaiian coastal streams- Associations with fecal indicators, land cover, and water quality. Water Research, 45,

241 7. Özler H.M., Aydın A., Hydrochemical and microbiological quality of groundwater in West Thrace Region of Turkey. Environ. Geol., 54, Rasti S., Assadi M.A., Iranshahi L., Saffari M., Gilasi H.R., Pourbabaee M., Assessment of Microbial Contamination and Physicochemical Conditions of Public Swimming Pools in Kashan, Iran. Jundishapur J. Microbiol., 5 (3), Papadopoulou C., Economou V., Sakkas H., Gousia P., Giannakopoulos X., Dontorou C., Filioussis G., Gessouli H., Karanis P., Leveidiotou S., Microbiological quality of indoor and outdoor swimming pools in Greece: Investigation of the antibiotic resistance of the bacterial isolates. Int. J. Hyg. Environ.-Health, 211, Faria C., Vaz- Moreira I., Serapicos E., Nunes O.C., Manaia C.M., Antibiotic resistance in coagulase negative staphylococci isolated from wastewater and drinking water. Science of the Total Environment, 407, Yagoub S. O., Ahmed R. Y., Microbiological Evaluation of the Quality of Tap Water Distributed at Khartoum State. Research Journal of Microbiology, 4 (10), Sacchetti R., De Luca G., Dormi A., Guberti E., Zanetti F., Microbial quality of drinking water from microfiltered water dispensers. International Journal of Hygiene and Environmental Health, dx.doi.org/ /j.ijheh CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing 16th Informational Supplement: Approved Standard M100-S16. Wayne, PA, USA (accessed July 15, 2013). 15. Bal, A. M., Garau, J., Gould, I. M., Liao, C. H., Mazzei, T., Nimmo, G. R., & Tenover, F. C. (2013). Vancomycin in the treatment of meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infection: End of an era?. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 1,

242 Πώς Πίνετε Τον Καφέ Σας; Κωνσταντίνος Ταμπούρης, Δημήτριος Γεωργαντάς, Εμμανουήλ Γ. Μπαρμπούνης Τμήμα Επιστημονικής Υποστήριξης, Ν. Αστεριάδης Α.Ε., Αθήνα Η καφεΐνη μπορεί να έχει θετική ή αρνητική επίδραση στον οργανισμό ανάλογα με την προσλαμβανόμενη ημερήσια ποσότητα. Θεωρείται ότι κατανάλωση ποσότητας 300 mg καφεΐνης ημερησίως δεν προκαλεί προβλήματα υγείας. Όμως πόση καφεΐνη προσλαμβάνουμε καθημερινά με τον καφέ μας; Για να δοθεί απάντηση στο παραπάνω ερώτημα, πραγματοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισμός καφεΐνης σε δείγματα καφέ με την τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC). Για τον προσδιορισμό χρησιμοποιήθηκε σύστημα HPLC τύπου Prominence του οίκου Shimadzu με ανιχνευτή UV και έγινε καταγραφή της απορρόφησης στα 272 nm, όπου το φάσμα UV της καφεΐνης παρουσιάζει μέγιστο. Η καμπύλη βαθμονόμησης είχε εξαιρετική γραμμικότητα, με συντελεστή R 2 = 0,9995. Υπολογίστηκαν επίσης οι τιμές LOD = 6,7 mg/l και LOQ = 20,2 mg/l (με βάση την τυπική απόκλιση των υπολοίπων της ευθείας παλινδρόμησης, S y/x ). Για τα δείγματα καφέ βρέθηκαν οι ακόλουθες περιεκτικότητες σε καφεΐνη: Καφές Περιεκτικότητα σε Καφεΐνη (g/kg) Ελληνικός 13,1 Ελληνικός 2 23,4 Γαλλικός 12,6 Εσπρέσο 15,4 Νες 41,0 Χρωματογράφημα δείγματος καφέ Από τις μετρήσεις προκύπτει ότι η περιεκτικότητα του νες καφέ σε καφεΐνη είναι πολύ μεγαλύτερη από αυτές του ελληνικού, του γαλλικού και του εσπρέσο. Για τον υπολογισμό της ποσότητας καφεΐνης που περιέχεται σε ένα φλιτζάνι ή ποτήρι καφέ θα πρέπει επίσης να λάβουμε υπόψιν την ποσότητα του καφέ που χρησιμοποιείται για την παρασκευή του ροφήματος, η οποία κατά κανόνα είναι μεγαλύτερη στις περιπτώσεις του εσπρέσο και του νες καφέ σε σχέση με τον ελληνικό και τον γαλλικό. Βιβλιογραφία IFIC Review: Caffeine & Health: Clarifying The Controversies, International Food Information Council Foundation (2008). 241