ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΟΡΓΑΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ, ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΟΡΓΑΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ, ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Ο ρόλος της σεργλυκίνης στη ρύθμιση του συμπληρώματος και στην έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών σε μυελωματικά πλασματοκύτταρα: βιοχημική, μοριακή και κλινικοεργαστηριακή προσέγγιση ΑΝΤΩΝΙΟΣ Γ. ΣΚΛΗΡΗΣ ΧΗΜΙΚΟΣ ΠΑΤΡΑ 2011

2

3 UNIVERSITY OF PATRAS SCHOOL OF NATURAL SCIENCES DEPARTMENT OF CHEMISTRY DIVISION OF ORGANIC CHEMISTRY, BIOCHEMISTRY AND NATURAL PRODUCTS Ph.D THESIS Role of serglycin in the regulation of complement system and in the expression of matrix metalloproteinases in myeloma plasma cells: biochemical, molecular and clinical lab approach ANTONIOS G. SKLIRIS CHEMIST PATRAS 2011

4

5 Στην Κατερίνα.... «Η ζωή είναι ένα ταξίδι γεμάτο εκπλήξεις, απρόβλεπτες συναντήσεις, περίεργες συμπτώσεις, μερικές φορές δυστυχώς όχι ευχάριστες. Όσο μεγάλος κι αν είναι ο πόνος, όσο δυσβάσταχτος κι αν είναι ο χαμός ενός αγαπημένου προσώπου, το ταξίδι συνεχίζεται, γινόμαστε δυνατότεροι, γινόμαστε καλύτεροι, και οι εκπλήξεις μερικές φορές, ευτυχώς ευχάριστες»

6

7 Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στα πλαίσια του μεταπτυχιακού προγράμματος Διδακτορικού Διπλώματος του Τομέα Οργανικής Χημείας - Βιοχημείας - Φυσικών Προϊόντων, του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Α. Θεοχάρης: Επιβλέπων Καθηγητής, Επίκουρος Καθηγητής Βιοχημείας, Τμήμα Χημείας Πανεπιστήμιο Πατρών Ν. Καραμάνος: Μέλος τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, Καθηγητής Βιοχημείας, Τμήμα Χημείας Πανεπιστήμιο Πατρών Α. Αλετράς: Μέλος τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, Αναπληρωτής Καθηγητής Βιοχημείας, Τμήμα Χημείας Πανεπιστήμιο Πατρών ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Α. Θεοχάρης: Επιβλέπων Καθηγητής, Επίκουρος Καθηγητής Βιοχημείας, Τμήμα Χημείας Πανεπιστήμιο Πατρών Ν. Καραμάνος: Μέλος τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, Καθηγητής Βιοχημείας, Τμήμα Χημείας Πανεπιστήμιο Πατρών Α. Αλετράς: Μέλος τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, Αναπληρωτής Καθηγητής Βιοχημείας, Τμήμα Χημείας Πανεπιστήμιο Πατρών Δ. Βύνιος: Μέλος επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, Καθηγητής Βιοχημείας. Τμήμα Χημείας Πανεπιστήμιο Πατρών Θ. Τσεγενίδης: Μέλος επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, Καθηγητής Οργανικής Χημείας, Τμήμα Χημείας Πανεπιστήμιο Πατρών Μ. Καρακάντζα: Μέλος επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Φ. Λάμαρη: Μέλος επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, Επίκουρη Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών

8

9 Από την παρούσα διδακτορική διατριβή προέκυψαν οι παρακάτω δημοσιεύσεις - ανακοινώσεις: ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΣΕ ΔΙΕΘΝΗ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΑ ΠΕΡΙΟΔΙΚΑ I. Skliris A, Happonen KE, Terpos E, Labropoulou V, Børset M, Heinegård D, Blom AM, Theocharis AD. Serglycin inhibits the classical and lectin pathways of complement via its glycosaminoglycan chains: implications for multiple myeloma. Eur J Immunol Feb;41(2): ΠΡΟΦΟΡΙΚΕΣ ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΣΕ ΔΙΕΘΝΗ ΣΥΝΕΔΡΙΑ A. Skliris, K. Happonen, V. Labropoulou, M. Borset, A.M. Blom, A.D. Theocharis. Serglycin interacts with the C1q subunit of the first complement component and inhibits the classical pathway. FEBS Advanced Lecture Course Matrix Pathobiology, Signaling and Molecular Targets (2 nd FEBS-MPST 2009), July , Patras, Greece. ΑΝΑΡΤΗΜΕΝΕΣ ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΣΕ ΔΙΕΘΝΗ ΣΥΝΕΔΡΙΑ Antonis Skliris, Vasiliki Labropoulou, Magne Borset, Achilleas Theocharis. Alterate expression of metalloproteinase in multiple myeloma cell lines through interaction of cell surface serglycin with type-1 collagen. XXII st FECTS Meeting, 3 7 July 2010, Davos, Switzerland. Α. Skliris, V. Labropoulou, M. Borset, A. Theocharis. Serglycin interacts with type-1 collagen and affects the expression of matrix metalloprotinases from myeloma plasma cells. 35 nd FEBS Congress, Molecules on Life, June 26-July , Göteborg (Gothenburg), Sweden. A. Skliris, K. Happonen, V. Labropoulou, M. Borset, A.M. Blom, A.D. Theocharis. Serglycin interacts with the C1q subunit of the first complement component and inhibits the classical pathway. FEBS Advanced Lecture Course Matrix Pathobiology, Signaling and Molecular Targets (2 nd FEBS-MPST 2009), July , Patras, Greece.

10 A. Skliris, K. Happonen, V. Labropoulou, M. Borset, A. Blom, A. Theocharis. Serglycin inhibits the classical and lectin pathway of complement system by direct interaction with C1q and mannan-binding lectin. 34 th FEBS Congress, Life's Molecular Machines. 4-9 July 2009, Prague, Czech Republic. Skliris Antonis, Labropoulou Vassiliki, Seidel Carina, Borset Magne, Karamanos Nikos, Papageorgakopoulou Nicoleta, Theocharis Achilleas. Production of gelatinases in patients with multiple myeloma. XXI st FECTS Meeting, 9-13 July 2008, Marseille, France. A. Skliris, V. Labropoulou, S. Carina, B. Magne, N. Karamanos, N. Papageorgakopoulou and A. Theocharis. Expression of MMP-2 and MMP-9 in patients with multiple myeloma. 33 rd FEBS Congress & 11 th IUBMB Conference, Biochemistry of Cell Regulation, 28 June 3 July 2008, Athens, Greece. ΠΡΟΦΟΡΙΚΕΣ ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΣΕ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΑ ΣΥΝΕΔΡΙΑ Skliris A., Happonen K., Terpos E., Labropoulou V., Borset M., Heinegard D., Blom A., Theocharis A. Serglycin protects multiple myeloma cells by inhibiting complement system. 60 th Meeting of the Hellenic Society of Biochemistry & Molecural Biology, November 2009, Athens, Greece. Α. Σκλήρης, Κ. Happonen, Β. Λαμπροπούλου, M. Borset, Α. Blom, A. Θεοχάρης. Η εκφραζόμενη από μυελωματικά κύτταρα SG αναστέλλει το σύστημα του συμπληρώματος. 20 o Πανελλήνιο Αιματολογικό Συνέδριο, 4-7 Νοεμβρίου 2009, Χερσόνησος Ηρακλείου Κρήτης, Ελλάδα.

11 Ευχαριστίες Ευχαριστίες Με τη συγγραφή της παρούσας διδακτορικής διατριβής και την επακόλουθη δημόσια υποστήριξή της στις 15 Απριλίου κλείνει ένας κύκλος, περίπου δέκα ετών, σπουδών αλλά και ζωής στο Πανεπιστήμιο Πατρών. Κατά τη διάρκεια όλων αυτών των χρόνων πολλοί άνθρωποι, τόσο εντός όσο και εκτός εργαστηρίου, συνέβαλαν στη διαμόρφωση του επιστημονικού, γνωστικού και προσωπικού μου χαρακτήρα. Σε επιστημονικό και ερευνητικό επίπεδο θα ήθελα να ευχαριστήσω, πάνω από όλους τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Α. Θεοχάρη που με εμπιστεύτηκε όλα αυτά τα χρόνια. Η επιστημονική του γνώση και το πάθος του για την έρευνα ήταν αυτά που ώθησαν και ενίσχυσαν την αγάπη μου για τη βιοχημεία. Τον ευχαριστώ για τη σύλληψη, την οργάνωση και την εμπιστοσύνη του στην ανάθεση της διδακτορικής αυτής διατριβής. Οι συμβουλές και οι συζητήσεις μας κατά τη διάρκεια διεξαγωγής των πειραμάτων ήταν πολύτιμες. Επίσης τον ευχαριστώ για την οικονομική ενίσχυση με την χορήγηση υποτροφίας μέσω του ερευνητικού προγράμματος Καραθεοδωρή. Θεωρώ ότι είχαμε μια άριστη συνεργασία. Αχιλλέα σε ευχαριστώ για όλα. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη τις τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής κ. Ν. Καραμάνο και κ. Α. Αλετρά για όλες τις πολύτιμες και χρήσιμες συμβουλές τους κατά τη διάρκεια της διδακτορικής διατριβής όλα αυτά τα χρόνια. Τους ευχαριστώ γιατί ήταν αυτοί που με μύησαν στον κόσμο της βιοχημείας και μου μετέδωσαν την αγάπη και το πάθος τους για την επιστήμη, ως καθηγητές σε προπτυχιακό και μεταπτυχιακό επίπεδο. Οι συμβουλές τους τόσο στην επίλυση πειραματικών δυσκολιών όσο και στη διόρθωση της διδακτορικής αυτής διατριβής ήταν καθοριστικές. Οι ιδέες και οι προτάσεις τους επίσης σημαντικές. Πέρα όμως από τις επιστημονικές τους γνώσεις, τους ευχαριστώ και για τις ευχάριστες συζητήσεις μας στο εργαστήριο και στα διάφορα επιστημονικά συνέδρια. Ευχαριστώ τον κ. Δ. Βύνιο για το ενδιαφέρον και για τις στοχευμένες παρατηρήσεις που έδειξε όλα αυτά τα χρόνια σχετικά με το θέμα της διατριβής αυτής. Κάθε στιγμή ήταν

12 Ευχαριστίες πρόθυμος να μου προσφέρει την επιστημονική του άποψη και η πόρτα του γραφείου του ήταν πάντα ανοιχτή. Ένα μεγάλο ευχαριστώ τους κ. Θ. Τσεγενίδη, κα. Μ. Καρακάντζα και κα. Φ. Λάμαρη για τις συμβουλές τους και το αληθινό τους ενδιαφέρον κατά τη διόρθωση της διδακτορικής αυτής διατριβής, ως μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στην Dr. A. Blom για τη φιλοξενία που μου παρείχε στο εργαστήριό της Dept. of Laboratory Medicine, Malmö University Hospital, Lund University. Την ευχαριστώ για την πολύτιμη βοήθειά της και την τύχη να αποκτήσω ένα διαφορετικό τρόπο σκέψης και οπτικής για την έρευνα. Επιπρόσθετα θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους όσους συμμετείχαν ενεργά, έτσι ώστε να μπορέσει να πραγματοποιηθεί η παρούσα μελέτη, καθώς και για τη βοήθειά τους στη συγγραφή της δημοσίευσης η οποία αποτελεί μέρος των αποτελεσμάτων της διδακτορικής διατριβής. Τον Dr. D. Heinegård για την παραχώρηση των διαφόρων PGs και των αντισωμάτων τους καθώς και τους καθηγητές Ε. Τέρπο, M. Borset και Β. Λαμπροπούλου για τη συλλογή και την παραχώρηση των δειγμάτων ασθενών και φυσιολογικών δοτών. Δεν θα μπορούσα να ξεχάσω την κ. Ν. Παπαγεωργακοπούλου, την πρώτη μου δασκάλα στο εργαστήριο. Με τον ιδιαίτερο τρόπο της με εισήγαγε στο μαγικό κόσμο των πρωτεογλυκανών από την πρώτη μου χρονιά ως διπλωματικός αλλά και επιβλέπουσα καθηγήτρια στην αρχή των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω την υποψήφια διδάκτορα Κ. Happonen που αποτέλεσε τον συνδετικό κρίκο με το πανεπιστήμιο της Lund και κατά την παραμονή μου στη Σουηδία με βοήθησε να ενταχθώ στο περιβάλλον του εργαστηρίου. Ευχαριστώ όλα τα μέλη του εργαστηρίου Βιοχημείας για τη συνεργασία μας όλα αυτά τα χρόνια. Πολλοί είναι οι άνθρωποι που πέρασαν από το εργαστήριο και προσέθεσαν με τον δικό τους τρόπο ένα λιθαράκι στη διαμόρφωση του χαρακτήρα μου. Στα πρώτα μου βήματα εκεί, ο Στάθης, η Μαρίνα, η Βιργινία, ο Σπύρος, ο Παναγιώτης, η Εύα ήταν αυτοί που μου έμαθαν τα πρέπει και τα όχι του εργαστηρίου. Μου έμαθαν μικρά πειραματικά «κόλπα» και έκαναν τις ώρες του εργαστηρίου να περνούν ευχάριστα. Η φιλία τους και έξω από το εργαστήριο αναδεικνύει την αξία τους.

13 Ευχαριστίες Ευχαριστώ τους διδάκτορες Σωτήρη Αθανασίου και Πέτρο Δέδε, συνοδοιπόρους όλα αυτά τα χρόνια στο εργαστήριο και όχι μόνο. Μαζί μοιραστήκαμε άγχη, πειραματικές δυσκολίες, ερευνητικές ανησυχίες, προσωπικά προβλήματα και όνειρα για το μέλλον. Τους θεωρώ και τους δύο φίλους και ξέρω ότι όποτε το θελήσω θα είναι εκεί. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τον Σωτήρη που η τύχη μας έφερε και μας φέρνει πιο κοντά, ως συγκάτοικους τον τελευταίο χρόνο, ως συνταξιδιώτες στις ατελείωτες ώρες οδήγησης προς και από τα διάφορα ευρωπαϊκά συνέδρια. Έχουμε να θυμόμαστε πολυάριθμες ιστορίες και εύχομαι να ακολουθήσουν και άλλες. Την υποψήφια διδάκτορα Ελένη Μήλια-Αργείτη που έζησε από κοντά μερικές δύσκολες στιγμές της ζωής μου. Στάθηκε δίπλα μου και ανέχτηκε τις ιδιοτροπίες μου στα πρώτα χρόνια του διδακτορικού μου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τη Σαρίτα, το Σπύρο και τη Γκέλυ που με υποστήριξαν με το δικό τους τρόπο στη συγγραφή της διδακτορικής διατριβής μου. Παρόλο που τους μνημονεύω στο τέλος των ευχαριστιών μου, χωρίς την οικογένειά μου, τους γονείς μου Γιώργο και Doris και τον αδελφό μου Δημήτρη τίποτα δεν θα ήταν δυνατό. Η συμβολή τους ήταν πραγματικά ανυπολόγιστη. Δεν είναι μόνο η οικονομική υποστήριξη, αλλά και η ηθική συμπαράστασή τους όλα αυτά τα χρόνια. Ένα μεγάλο ευχαριστώ δεν αρκεί για να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου προς το πρόσωπό τους. Είναι οι αφανείς ήρωες της προσπάθειας αυτής. Το τέλος των μεταπτυχιακών σπουδών αποτελεί για κάθε διδάκτορα το έναυσμα για την εφαρμογή όλων των γνώσεων που συλλέχτηκαν. Νέοι δρόμοι και νέες προκλήσεις ανοίγονται μπροστά του και νιώθω τυχερός που δεν είμαι μόνος στο ταξίδι αυτό. Είμαι ευτυχής που μοιράζομαι τη ζωή μου με έναν υπέροχο άνθρωπο, που προς το τέλος του διδακτορικού μου, ήρθε να μου δείξει ότι τα καλύτερα έρχονται. Σε ευχαριστώ Ραλλού...

14 Ευχαριστίες

15 Περιεχόμενα

16 Περιεχόμενα 16

17 Περιεχόμενα Συντομογραφίες Επεξηγήσεις 25 Εισαγωγή 31 1 Πολλαπλούν Μυέλωμα Γενικά Επιδημιολογία Διάγνωση και σταδιοποίηση του ΠΜ Παθογένεια του ΠΜ Παθογένεια της οστικής νόσου σε ασθενείς με ΠΜ Ενεργοποίηση οστεοκλαστών στο ΠΜ Ρόλος των οστεοβλαστών Ρόλος των αιμοποιητικών κυττάρων Ρόλος των μυελωματικών κυττάρων Ανενεργοποίηση οστεοβλαστών στο ΠΜ Θεραπευτική προσέγγιση του ΠΜ Χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία Χρήση γλυκοκορτικοειδών Αντιαγγειογενετική θεραπεία Αντιοστεολυτική θεραπεία Μεταμόσχευση αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων Θεραπεία συντήρησης Υποστηρικτική αγωγή Εξωκυττάριος χώρος Ο ρόλος του εξωκυττάριου χώρου Πρωτεογλυκάνες Δομή των γλυκοζαμινογλυκανών

18 Περιεχόμενα Υαλουρονικό οξύ Θειϊκή χονδροϊτίνη και θειϊκή δερματάνη Θειϊκή ηπαράνη και ηπαρίνη Θειϊκή κερατάνη Βιοσύνθεση των πρωτεογλυκανών Βιοσύνθεση των γλυκοζαμινογλυκανών Βιοσύνθεση των CS/DS και HS/heparin Βιοσύνθεση του ΗΑ Βιοσύνθεση της KS Κατάταξη των πρωτεογλυκανών Εξωκυτταρικές PGs PGs της κυτταρικής μεμβράνης Ενδοκυττάριες PGs Σεργλυκίνη Ανακάλυψη και δομή της σεργλυκίνης Σεργλυκίνη και είδος γλυκοζαμινογλυκανικών αλυσίδων Βιολογικές λειτουργίες της Σεργλυκίνης Σεργλυκίνη και αποθηκευτικά κοκκία Σεργλυκίνη και συγκράτηση των πρωτεασών Σεργλυκίνη και απελευθέρωση των συνοδών μορίων Σεργλυκίνη και εκκριτικά κοκκία Σεργλυκίνη και ρύθμιση των συνοδών μορίων Αποικοδόμηση της σεργλυκίνης Αποικοδόμηση του ECM μέσω της δράσης πρωτεολυτικών ενζύμων Μεταλλοπρωτεϊνάσες του ECM

19 Περιεχόμενα Έλεγχος δραστικότητας των MMPs Σύνθεση και έκκριση Ενεργοποίηση των προ-ενζύμων Αναστολή των ενεργών ενζύμων Έλεγχος του εντοπισμού και της απομάκρυνσης των MMPs Ζελατινάσες Ζελατινάσες και ΠΜ Φυσιολογία και σύσταση του οστού Κολλαγόνο τύπου Ι Το Σύστημα του Συμπληρώματος Γενικά Ενεργοποίηση του συμπληρώματος Βιολογικές δράσεις του συμπληρώματος Ρύθμιση του συμπληρώματος Αναστολέας του C Παράγοντας I (FI) Προπερδίνη Ευοδωτικός παράγοντας αποδομήσεως Μεμβρανική πρωτεΐνη-συνυποδοχέας (MCP) Πρωτεκτίνη Παράγοντας C1q Δομή της C1q υπομονάδας Αναστολή της κλασσικής οδού Παράγοντας MBL Δομή της πρωτεΐνης MBL

20 Περιεχόμενα Αναστολή της λεκτινικής οδού Συμπλήρωμα και Β-λευμφοκύτταρα Συμπλήρωμα και PGs Συμπλήρωμα και Πολλαπλούν Μυέλωμα...97 Σκοπός 99 Πειραματικό μέρος Πρωτεΐνες και ορός Ασθενείς Κυτταρικές σειρές και καλλιέργειες Κυτταρικές σειρές Μέτρηση βιωσιμότητας και αριθμού των κυττάρων Συλλογή του μέσου καλλιέργειας για την απομόνωση της SG Καλλιέργεια κυττάρων παρουσία κολλαγόνου τύπου Ι Ενζυμικές και χημικές κατεργασίες Ενζυμική κατεργασία με χονδροϊτινάση ABC Κατεργασία με NaOH / NaBH 4 (αντίδραση β-απόσπασης) Αναλυτικές μέθοδοι Προσδιορισμός θειωμένων γλυκοζαμινογλυκανών Προσδιορισμός πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford Χρωματογραφικές μέθοδοι Χρωματογραφία ανιονανταλλαγής Χρωματογραφία μοριακής διήθησης Ηλεκτροφορητικές μέθοδοι Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία SDS (SDS-PAGE) Χρώση γλυκοζάμινογλυκανών

21 Περιεχόμενα Χρώση πρωτεϊνών Αναγνώριση και ημιποσοτικός προσδιορισμός των ζελατινασών με την τεχνική του ζυμογραφήματος Χαρακτηρισμός της δισακχαριτικής σύστασης των αλυσίδων CS της σεργλυκίνης με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση Ανοσολογικές τεχνικές Ανοσολογική ταυτοποίηση πρωτεϊνικών ζωνών (Western Blotting) Ανοσοενζυμική μέθοδος ELISA Μέτρηση των Ν- και C- τελοπεπτιδίων του κολλαγόνου τύπου Ι Μέτρηση των επιπέδων, στον ορό ασθενών με πολλαπλό μυέλωμα, παραγόντων που εμπλέκονται στη παθοβιοχημεία της νόσου Αιμολυτικές τεχνικές Έλεγχος δραστικότητας της κλασσικής οδού του συμπληρώματος Προετοιμασία ερυθροκυττάρων Προσδιορισμός αραίωσης ορού που προκαλεί 50% λύση των ερυθροκυττάρων Διαδικασία ελέγχου της δράσης της SG Έλεγχος δραστικότητας της εναλλακτικής οδού του συμπληρώματος Προετοιμασία ερυθροκυττάρων Προσδιορισμός αραίωσης ορού που προκαλεί 50% λύση των ερυθροκυττάρων Διαδικασία ελέγχου της δράσης της SG Μέτρηση της εναπόθεσης παραγόντων του συμπληρώματος από τον ορό Έλεγχος ενεργοποίησης του συστήματος του συμπληρώματος Έλεγχος αναστολής του συστήματος του συμπληρώματος Τεχνικές πρόσδεσης στερεάς φάσης Ραδιενεργός σήμανση με 125 I Μέθοδος στερεάς φάσης με χρήση 125 Ι-SG Προσκόλληση των μυελωματικών κυττάρων στο κολλαγόνο τύπου Ι

22 Περιεχόμενα 14 Απομόνωση ολικού RNA από κυτταρικές καλλιέργειες ΠΜ Υπολογισμός της ποσότητας και της καθαρότητας του RNA Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης με αντίστροφη μεταγραφάση Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της RT-PCR ανάλυσης Κυτταρομετρία ροής Εναπόθεση των παραγόντων C3b και C9 του συμπληρώματος στην κυτταρική επιφάνεια κυττάρων ΠΜ Έκφραση της SG στην κυτταρική επιφάνεια κυττάρων ΠΜ Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων Αποτελέσματα 135 ΜΕΡΟΣ Ι - Απομόνωση και χαρακτηρισμός της SG σε κυτταρικές σειρές πολλαπλού μυελώματος 1.1 Διαχωρισμός των PGs με χρωματογραφία ανιονανταλλαγής Κλασμάτωση των PGs με χρωματογραφία μοριακής διήθησης Ταυτοποίηση της απομονωθείσας SG ΜΕΡΟΣ ΙΙ - Μελέτη του ρόλου της SG στη ρύθμιση του συμπληρώματος 2.1 Μελέτη του ρόλου της SG στη ρύθμιση του κλασσικού μονοπατιού του συμπληρώματος Μελέτη της αναστολής του κλασσικού μονοπατιού από τη SG Μελέτη της ενεργοποίησης του κλασσικού μονοπατιού από τη SG Αλληλεπίδραση SG με τον παράγοντα C1q Δομική μελέτη της αλληλεπίδρασης μεταξύ της SG και του C1q Επίδραση της ιονικής ισχύος και των ιόντων Ca 2+ στην αλληλεπίδραση της SG με το C1q Μελέτη της αλληλεπίδρασης της SG με τον αναστολέα C4BP Μελέτη του ρόλου της SG στη ρύθμιση της λεκτινικής οδού του συμπληρώματος Μελέτη της αναστολής του μονοπατιού λεκτίνης από τη SG Μελέτη της ενεργοπίησης της λεκτινικής οδού από τη SG

23 Περιεχόμενα Αλληλεπίδραση της SG με τον παράγοντα ΜΒL Δομκή μελέτη της αλληλεπίδρασης μεταξύ της SG και της MBL Επίδραση της ιονικής ισχύος και των ιόντων Ca 2+ στην αλληλεπίδραση της SGμε την MBL Μελέτη του ρόλου της SG στη ρύθμιση της εναλλακτικής οδού του συμπληρώματος Μελέτη της αναστολής του εναλλακτικού μονοπατιού από τη SG Μελέτη της ενεργοποίησης του εναλλακτικού μονοπατιού από τη SG 169 ΜΕΡΟΣ ΙΙΙ - Μελέτη του ρόλου της SG στη παθοβιοχημεία του ΠΜ 3.1 Μέτρηση των επιπέδων SG στον ορό ασθενών με ΠΜ Προσδιορισμός της αιμολυτικής δραστικότητας της κλασσικής και της εναλλακτικής οδού του συμπληρώματος σε ασθενείς με ΠΜ Συσχέτιση της δραστηκότητας του συμπληρώματος και της συγκέντρωσης της SG στον ορό Μελέτη της επίδρασης της SGστην ενεργότητα του συμπληρώματος στην κυτταρική επιφάνεια κυττάρων ΠΜ Έκφραση της SG στην κυτταρική επιφάνεια μυελωματικών πλασματοκυττάρων Μελέτη της αλληλεπίδρασης της SG με το κολλαγόνου τύπου Ι Μελέτη της ικανότητας προσκόλλησης των μυελωματικών κυττάρων στο κολλαγόνο τύπου Ι: ο ρόλος της SG Επίδραση του κολλαγόνου τύπου Ι στην έκφραση των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 σε κυτταρικές σειρές ΠΜ ΜΕΡΟΣ IV - Μελέτη των μεταλλοπρωτεϊνασών ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 στο πολλαπλό μυέλωμα 4.1 Ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση των ζελατινασών ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 στον ορό ασθενών με ΠΜ Ταυτοποίηση και ποσοτικός προσδιορισμός των ζελατινασών, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, στον μυελό ασθενών με ΠΜ Συσχέτιση των επιπέδων των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 στον ορό και στον μυελό ασθενών με ΠΜ Συσχέτιση των επιπέδων των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 στον ορό των ασθενών με ΠΜ με δείκτες της οστικής απορρόφησης και παράγοντες που εμπλέκονται στη βιολογία του ΠΜ Συσχέτιση των επιπέδων των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 στον μυελό ασθενών με ΠΜ με δείκτες της οστικής απορρόφησης και παράγοντες που εμπλέκονται στη βιολογία του ΠΜ

24 Περιεχόμενα Συζήτηση - Συμπεράσματα 205 Περίληψη 219 Abstract 223 Βιβλιογραφία 227 Δημοσιεύσεις

25 Συντομογραφίες Επεξηγήσεις

26 Συντομογραφίες Επεξηγήσεις 26

27 Συντομογραφίες Επεξηγήσεις A Αδενίνη APS Υπερθειικό αμμώνιο ASCT Aυτόλογη μεταμόσχευση βλαστικών κυττάρων BGN Διγλυκάνη (Biglycan) BSA Βόεια αλβουμίνη ορού C Κυτοσίνη C1 Παράγοντας 1 του συμπληρώματος C4BP C4-δεσμευτική πρωτεΐνη C4BP-PS Σύμπλοκο της C4BP με την πρωτεΐνη S CCP Αλληλουχίες των πρωτεϊνών ελέγχου του συμπληρώματος CD44 Υποδοχέας του υαλουρονικού cdna Συμπληρωματικό δεοξυ-ριβονουκλεϊκό οξύ chabc Χονδροϊτινάση ABC ClcA Γλυκουρονικό οξύ CRD Περιοχή αναγνώρισης υδατανθράκων CRs Υποδοχείς συμπληρώματος (Complement Receptors) CS Θειική χονδροϊτίνη (Chondroitin Sulfate) DDK1 Dickkopf-σχετιζόμενη πρωτεΐνη 1 DEAE-Sephacel Διαιθυλο-αμινο-αιθυλο-κυτταρίνη DMB Κυανούν του 1,9-διμεθυλ-μεθυλενίου DNA Δεοξυ-ριβονουκλεϊκό οξύ dntps Τριφωσφορικά δεοξυ-νουκλεοτίδια DS Θειική δερματάνη ECM Εξωκυττάριος χώρος EDTA Αιθυλενο-διαμινο-τετρα-οξικό οξύ EGF Επιδερμικός αυξητικός παράγοντας EMMPRIN Επαγωγέας των ΜΜΡs FCS Ορός εμβρύου μόσχου FGF Αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών FH Παράγοντας Η 27

28 Συντομογραφίες Επεξηγήσεις FI Παράγοντας Ι FM Ινομοντουλίνη G Γουανίνη GAGs Γλυκοζαμινογλυκάνες Gal Γαλακτόζη GalNAc Ν-ακετυλο-γαλακτοζαμίνη GAPDH Αφυδρογονάση της 3 φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης GdnHCl Υδροχλωρική γουανιδίνη GlcNAc Ν-ακετυλο-γλυκοζαμίνη GPI Γλυκοζυλφωσφατιδυλοϊνοσιτόλη HA Υαλουρονικό οξύ HGF Αυξητικός παράγοντας των ηπατοκυττάρων HS Θειική ηπαράνη IGF Αυξητικός παράγοντας ινσουλίνης IL- Ιντερλευκίνη- ISS Διεθνές Σύστημα Σταδιοποίησης Kd Σταθερά κατανομής σε χρωματογραφία πήγματος KS Θειική κερατάνη L-IdoA L-Ιδουρονικό οξύ MAC Σύμπλεγμα προσβολής της μεμβράνης MASPs Πρωτεάσες που δεσμεύονται στην πρωτεΐνη MBL MBL Πρωτεΐνη που συνδέεται με μανόζη (Mannose Binding Lectin) MCP Mεμβρανική πρωτεΐνη-συνυποδοχέας MCP-1 Χημειοτακτική πρωτεΐνη-1 των μονοκύτταρων MGUS Mονοκλωνική γαμμοπάθεια αδιευκρίνιστης κλινικής σημασίας MIP1α Πρωτεΐνη φλεγμονής των μακροφάγων -1α MMΡs Εξωκυττάριες μεταλλοπρωτεϊνάσες mrna Αγγελιοφόρο ριβονουκλεϊκό οξύ MΤ-MMP Μεμβρανικού τύπου MMP NEM Ν-αιθυλο-μηλεϊνιμίδιο NFκβ Πυρηνικός παράγοντας-κb NHS Ανθρώπινος φυσιολογικός ορός 28

29 Συντομογραφίες Επεξηγήσεις OPG PAPS PGs PMSF PTX-3 RANK RANKL RNA RT-PCR SDF-1 SDS SDS-PAGE Sepharose CL-4B SG SLRPs T TBE TEMED TGF-β1 TIMPs TNF-α Tris Triton X-100 TSP Tween-20 u-pa VEGF Vo Vt ΠΜ (MM) οστεοπροτεγκερίνη 3 φωσφοαδενοσινο-5 -φωσφοθειϊκό Πρωτεογλυκάνες Φαινυλο-μεθανο-σουλφονυλο-φθορίδιο Πενταξτρίνη-3 Υποδοχέας ενεργοποίησης του NF-κB Προσδέτης του υποδοχέα ενεργοποίησης του NF-κB Ριβονουκλεϊκό οξύ Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης - αντίστροφης μεταγραφάσης Προερχόμενος από το στρώμα παράγοντας-1 Θειικό δωδεκυλικό νάτριο Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου παρουσία SDS Πολυμερή αγαρόζης Σεργλυκίνη Μικρού μοριακού μεγέθους PGs πλούσιες σε λευκίνη Θυμίνη Διάλυμα Tris-Βορικό-EDTA Τετραμεθυλο-αιθυλενο-διαμίνη Αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού-β1 Ενδογενείς αναστολείς των μεταλλοπρωτεασών Παράγοντας νέκρωσης όγκου-α Τρις-υδοξυ-μεθυλο-αμινο-μεθάνιο Ισοοκτυλ-φαινοξυ-πολυαιθοξυ-αιθανόλη θρομβοσποντίνη Αιθυλενο-σορβιταν-μονολεϊκός αιθέρας Ενεργοποιητής πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης Αυξητικός παράγοντας αγγειακού ενδοθηλίου Νεκρός όγκος στήλης Ολικός όγκος στήλης Πολλαπλούν Μυέλωμα (Multiple Myeloma) 29

30 Συντομογραφίες Επεξηγήσεις 30

31 Εισαγωγή

32 Εισαγωγή 32

33 Εισαγωγή 1 Πολλαπλούν Μυέλωμα 1.1 Γενικά Το πολλαπλούν μυέλωμα (ΠΜ) είναι μια αιματολογική νόσος που χαρακτηρίζεται από τη συσσώρευση κλωνικών πλασματοκυττάρων στο μυελό των οστών. Η συνεχής έρευνα που σχετίζεται με τους παθοβιοχημικούς μηχανισμούς της νόσου έχει οδηγήσει στην ανάδειξη της σπουδαιότητας των αλληλεπιδράσεων μεταξύ μορίων του μικροπεριβάλλοντος του μυελού και των μυελωματικών κυττάρων, συνεισφέροντας τόσο στην κατανόηση της εξέλιξης της νόσου, όσο και στην ερμηνεία της ανθεκτικότητας των νεοπλασματικών κυττάρων στις υπάρχουσες θεραπείες. Αν και το ΠΜ παραμένει μια μη ιάσιμη νόσος, η συνεχής έρευνα έχει οδηγήσει στην παρασκευή νέων πρωτοποριακών φαρμάκων, βελτιώνοντας την ποιότητα ζωής και επιμηκύνοντας τον χρόνο επιβίωσης των ασθενών. Η συνεχής βελτίωση της γνώσης των μορίων και των σηματοδοτικών μονοπατιών που εμπλέκονται στους μηχανισμούς παθογένειας της νόσου δημιουργεί νέους θεραπευτικούς στόχους, αποστέλλοντας ελπιδοφόρα μηνύματα στους ασθενείς. 1.2 Επιδημιολογία Το ΠΜ είναι η δεύτερη πιο συχνή κακοήθεια του αίματος στις ΗΠΑ μετά το non-hodgkin λέμφωμα και αποτελεί περίπου το 1% του συνόλου των νεοπλασιών και το 13% των αιματολογικών κακοηθειών. Η μέση ηλικία κατά τη διάγνωση είναι τα 62 χρόνια για τους άντρες και τα 61 για τις γυναίκες με διακύμανση των ηλικιών από 20 έως 92 έτη, ενώ μόνο ένα ποσοστό της τάξεως του 2% των ασθενών είναι νεότεροι των 40 ετών. Περίπου καινούρια περιστατικά το χρόνο παρουσιάζονται στις ΗΠΑ ενώ η επίπτωση της νόσου ποικίλλει παγκοσμίως από 1 στους ανθρώπους στην Κίνα μέχρι 4 στους ανθρώπους στις περισσότερες ανεπτυγμένες χώρες. Επιπλέον η νόσος εμφανίζεται περισσότερο στους άντρες συγκριτικά με τις γυναίκες και είναι δύο φορές συχνότερη στους μαύρους σε σχέση με τους λευκούς (Cohen et al., 1998; Malpas et al., 1998). Οι λόγοι για αυτή την φυλετική και γενετική ανομοιομορφία παραμένουν άγνωστοι. Επιπλέον, η νόσος φαίνεται να παρουσιάζει κάποια επαγγελματική συσχέτιση. Επαγγέλματα, όπως αυτά που σχετίζονται με την εξόρυξη και επεξεργασία πετρελαίου, ξύλου, μετάλλων, μεταλλικών ελαίων, δέρματος 33

34 Εισαγωγή και αμιάντου σχετίζονται με υψηλότερο κίνδυνο εμφάνισης της νόσου (Kagan et al., 1979; Nandakumar et al., 1986; Heineman et al., 1992; Fritschi and Siemiatycki, 1996). Το τελευταίο ίσως να εξηγεί και την αυξημένη εμφάνιση της ασθένειας στους εκπαιδευτικούς (κιμωλία) (Pasqualetti et al., 1990; Figgs et al., 1994). Επιπλέον, αυξημένη επικινδυνότητα υπάρχει στις ομάδες που εκτίθενται σε ακτνοβολία Χ και στη ραδιενέργεια (Lewis, 1963; Mancuso et al., 1977). Ο μέσος χρόνος επιβίωσης μετά από συμβατική θεραπεία (χημειοθεραπεία) είναι τα 3 με 4 χρόνια, ενώ μετά από αγωγή με υψηλή δόση χημειοθεραπείας ακολουθούμενη από αυτόλογη μεταμόσχευση βλαστοκυττάρων, ο χρόνος επιβίωσης μπορεί να επεκταθεί στα 5 με 7 χρόνια (Munshi, 2008). Νέα φάρμακα, μόνα τους ή σε συνδυασμό με υπάρχουσες θεραπείες, έχουν προταθεί για την περαιτέρω βελτίωση του προσδόκιμου χρόνου επιβίωσης (Kumar et al., 2008; Brenner et al., 2008). 1.3 Διάγνωση και σταδιοποίηση του ΠΜ Η διάγνωση του ΠΜ πραγματοποιείται με ανίχνευση της παρουσίας παραπρωτεΐνης στον ορό ή/και στα ούρα με τεχνικές ηλεκτροφόρησης και ανοσοκαθήλωσης, με ανεύρεση των παθολογικών πλασματοκυττάρων στον μυελό των οστών ο οποίος λαμβάνεται είτε με αναρρόφηση είτε με οστεομυελικές βιοψίες και με έλεγχο των οστικών αλλοιώσεων που πραγματοποιείται με ακτινογραφίες και σε ειδικές περιπτώσεις με αξονική ή μαγνητική τομογραφία. Οι Sirohi και Powles έχουν πραγματοποιήσει εκτεταμένη αναφορά στα συμπτώματα, στις υπάρχουσες διαγνωστικές τεχνικές και στις επιπλοκές που σχετίζονται με το ΠΜ (Sirohi and Powles, 2004). Η διεθνής ομάδα μελέτης του μυελώματος έχει καθιερώσει κριτήρια για τον διαχωρισμό μεταξύ του ασυμπτωματικού ΠΜ, όπου δεν απαιτείται άμεση θεραπεία, και της ενεργού νόσου, όπου η θεραπεία κρίνεται απαραίτητη (Πίνακας 1). Οι κύριοι δείκτες που συνηγορούν στην έναρξη θεραπευτικής αγωγής είναι η υπερασβεστιαιμία, η νεφρική δυσλειτουργία, η αναιμία και οι οστεολυτικές βλάβες (IMWG, 2003). 34

35 Εισαγωγή Πίνακας 1: Κλινικά κριτήρια διάγνωσης του ΠΜ 1. Πλασματοκυττάρωση στο μυελό των οστών >30% 2. Παρουσία πλασματοκυτταρικής διήθησης στο μυελό των οστών Μείζονα κριτήρια 3. Παραπρωτεϊναιμία χωρίς αμυλοείδωση: Στον ορό: IgG>3.5g/dL, IgA>2g/dL Στα ούρα: κ ή λ ή Βence-Jones Ig/24h 1. Πλασματοκυττάρωση στο μυελό των οστών 10-30% 2. Παραπρωτεϊναιμία στον ορό ή/και τα ούρα σε χαμηλότερες Ελάσσονα κριτήρια συγκεντρώσεις 3. Λυτικού τύπου οστικές αλλοιώσεις 4. Μειωμένες συγκεντρώσεις (<50%) φυσιολογικών ανοσοσφαιρινών Για τη διάγνωση του ΠΜ απαραίτητη είναι η παρουσία ενός τουλάχιστον μείζονος και ενός ελάσσονος κριτηρίου ή τριών μόνο ελασόνων εφ όσον σε αυτά περιλαμβάνονται τα κριτήρια 1 και 2. Πίνακας 2: Διεθνές Σύστημα Σταδιοποίησης (ISS) Συγκέντρωση συστατικών στον ορό Στάδιο Ι (Stage I) β2-μικροσφαιρίνη 3.5 mg/l και αλβουμίνη 3.5 g/dl Στάδιο ΙΙ (Stage II) β2-μικροσφαιρίνη <3.5 mg/l και αλβουμίνη <3.5 g/dl, ή β2-μικροσφαιρίνη mg/l Στάδιο ΙΙΙ (Stage III) β2-μικροσφαιρίνη >5.5 mg/l Μέχρι το 2005, η σταδιοποίηση του ΠΜ πραγματοποιούνταν με βάση το σύστημα των Durie-Salmon (Durie and Salmon, 1975). Ωστόσο μεταξύ του 1981 και του 2002, δεδομένα από ασθενείς με ΠΜ από την Ευρώπη, τις ΗΠΑ, τον Καναδά και την Ασία χρησιμοποιήθηκαν για την εδραίωση του Διεθνούς Συστήματος Σταδιοποίησης (International Staging System, ISS) 35

36 Εισαγωγή (Greipp et al., 2005). Το σύστημα αυτό προσφέρει βελτιωμένη πρόγνωση με τη χρήση εύκολων και άμεσα διαθέσιμων διαδικασιών για την μέτρηση της συγκέντρωσης της αλβουμίνης και της β2-μικροσφαιρίνης στον ορό (Πίνακας 2). Έχει αξιολογηθεί σε διάφορες κλινικές μελέτες, ενώ η προγνωστική του αξία βελτιώνεται σε συνδυασμό με άλλους βιολογικούς δείκτες. 1.4 Παθογένεια του ΠΜ Όπως αναφέρθηκε παραπάνω το ΠΜ χαρακτηρίζεται από τον υπερβολικό πολλαπλασιασμό β-λεμφοκυττάρων στον μυελό των οστών, την παρουσία μονοκλωνικής πρωτεΐνης, τις οστεολυτικές διαταραχές, νεφρική ανεπάρκεια και ανοσοανεπάρκεια. Ένα μοντέλο ανάπτυξης προτείνει ότι η μονοκλωνική γαμμοπάθεια αδιευκρίνιστης κλινικής σημασίας (MGUS), μέσω πολλαπλών βημάτων μπορεί να εξελιχθεί αρχικά σε υφέρπον ΠΜ (smoldering myeloma) και τελικά σε ενδομυελικό και εξωμυελικό ΠΜ (Kuelh and Bergsagel, 2002; Kyle et al., 2002). Γονιδιακές μελέτες έχουν δείξει την ύπαρξη διαφορών ανάμεσα στην MGUS και στο ΠΜ, αναδεικνύοντας τη σημασία που διαδραματίζει το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών στην ανάπτυξη, στη διατήρηση και στην εξέλιξη της νόσου (Zhan et al., 2002; Keats et al., 2006). Η απευθείας αλληλεπίδραση των μυελωματικών κυττάρων με τα κύτταρα του στρώματος του μυελού, καθώς και η σύνδεση των πρωτεϊνών του εξωκυττάριου χώρου (ECM) με τα μυελωματικά κύτταρα, διαμεσολαβείται μέσω μεμβρανικών υποδοχέων που ανήκουν στις οικογένειες των ιντεγκρινών, των συνδεκανών, των σελεκτινών και των μελών της οικογένειας των μορίων κυτταρικής προσκόλλησης. Και οι δύο αυτοί τύποι αλληλεπιδράσεων συμβάλλουν στον πολλαπλασιασμό, στην επιβίωση, στη μετανάστευση των πλασμοκυττάρων, εμπλέκονται στους μηχανισμούς ανθεκτικότητας έναντι των χημειοθεραπευτικών σκευασμάτων, καθώς και στη ρύθμιση διαφόρων λειτουργιών των κυττάρων του στρώματος, (πχ. ενισχύοντας την έκφραση διαφόρων κυτταροκινών). Η προσκόλληση των μυελωματικών κυττάρων σε πρωτεΐνες του εξωκυττάριου περιβάλλοντος, όπως στα κολλαγόνα, τη λαμινίνη, τη ινοσυνδετίνη και τη βιτρονεκτίνη, καθορίζει την κυτταρική επιβίωση των νεοπλασματικών κυττάρων, την ανθεκτικότητα έναντι φαρμάκων (Hazlehurst et al., 2000) και την παραγωγή και έκκριση μεταλλοπρωτεϊνασών 36