ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ. Πρόλογος.Σελίδα Εισαγωγή.Σελίδα

Transcript

1

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος.Σελίδα Εισαγωγή.Σελίδα Α. Γενικό μέρος.. Σελίδα 1. Αποφρακτικός ίκτερος. Σελίδα 2. Βακτηριδιακή διαμετακίνηση.. Σελίδα 3. Συστηματική φλεγμονώδης αντίδραση Σελίδα 4. Οξειδωτικό stress..σελίδα 15-F2t-ισοπροστάνιο (15- F2t-IsoP)..Σελίδα 5. Γλουταμίνη Σελίδα 6. Λιπαρά Οξέα Βραχείας Αλύσου...Σελίδα 7. Υποθερμιδικό Αντιοξειδωτικό Ανοσοδιεγερτικό Διάλυμα Εντερικής Διατροφής..Σελίδα Β. Ειδικό μέρος..σελίδα Πειραματική εργασία.σελίδα 1. Σκοπός - Υλικό Μέθοδος Σελίδα Αναισθησία. Σελίδα Εγχείρηση Σελίδα Διαχωρισμός σε ομάδες..σελίδα Μετρήσεις.. Σελίδα Βιοχημικές εξετάσεις......σελίδα Ιστολογικές εξετάσεις Σελίδα Καλλιέργειες....Σ ελίδα Μέτρηση ιντερλευκίνης 6.. Σ ελίδα Μέτρηση ισοπροστάνιου Σ ελίδα Στατιστική ανάλυση Σ ελίδα 2. Συζήτηση Σ ελίδα Συμπεράσματα Σ ελίδα Περίληψη.... Σ ελίδα Summary Σ ελίδα Βιβλιογραφία.. Σ ελίδα

3 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο αποφρακτικός ίκτερος από καλοήθη ή κακοήθη αιτία είναι μια βαριά, απειλητική για τη ζωή νοσηρή κατάσταση. Παρά τις προόδους στα διάφορα μέτρα αντιμετώπισης, οι ανεπιτυχείς διαγνωστικοί και θεραπευτικοί χειρισμοί σε ασθενείς με αποφρακτικό ίκτερο, σχετίζονται με υψηλή λόγω χολαγγειϊτιδας και άλλων σηπτικών επιπλοκών, νοσηρότητα και θνητότητα. Ως βάση της θεραπείας παραμένει η αποσυμφόρηση των χοληφόρων. Παράλληλα πολλές εργασίες σε επίμυες με αποφρακτικό ίκτερο αναδεικνύουν τη σημασία της έλλειψης χολής από το έντερο, ως αιτία βακτηριδιακής διαμετακίνησης. Η υπάρχουσα ενδοτοξίνη αυξάνει τη διαπερατότητα του βλεννογόνου, λόγω της απουσίας των χολικών αλάτων και της εκκρινόμενης στη χολή IgA, που υπό φυσιολογικές συνθήκες αυτά απενεργοποιούν τη βιολογική δράση της. Αποτελέσματα της βακτηριδιακής διαμετακίνησης μπορεί να είναι υπερανάπτυξη μικροβίων, δευτεροπαθείς λοιμώξεις, όπως ενδοκοιλιακά αποστήματα, ή περιτονίτιδα. Η βακτηριδιακή διαμετακίνηση σχετίζεται στη συνέχεια με διάφορες ανοσολογικές διαταραχές. Διεγείρεται έντονη συστηματική φλεγμονώδης αντίδραση με απελευθέρωση διαφόρων διαβιβαστών της φλεγμονής και επακολουθούν ενίοτε σήψη και πολυοργανική ανεπάρκεια. Με αμφίδρομο τρόπο η βακτηριδιακή διαμετακίνηση και η φλεγμονώδης απάντηση χαρακτηρίζονται τέλος από απελευθέρωση ελεύθερων ριζών οξυγόνου, διαταραχή της οξειδωτικής ισορροπίας και διάφορες παθολογικές επιπτώσεις. Τα τελευταία χρόνια σημειώθηκε πρόοδος σε ορισμένα υποστηρικτικά μέτρα, όπως στην ανοσοπροστατευτική τεχνητή διατροφή, στην κατάλληλη αντιβιοτική αγωγή και στη νοσηλευτική φροντίδα στις μονάδες εντατικής θεραπείας. Παρόλα αυτά η θνητότητα εκ της σηπτικής χολαγγειϊτιδας και άλλων επιπλοκών στους ασθενείς με αποφρακτικό ίκτερο παραμένει υψηλή και η σχετική μελέτη είναι επιβεβλημένη.

4 1. ΑΠΟΦΡΑΚΤΙΚΟΣ ΙΚΤΕΡΟΣ Α. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η απόφραξη των χοληφόρων προκαλεί αύξηση της πίεσης στα ενδοηπατικά χολαγγεία, η οποία όταν υπερβεί τα 200 χιλιοστά στήλης ύδατος προκαλεί την αναστολή της έκκρισης των συστατικών της χολής, αρχικά της χοληστερόλης και αργότερα των χολικών αλάτων. Η συμφόρηση και η διάταση των χολαγγείων είναι ανάλογη με το βαθμό και τη διάρκεια της απόφραξης. Αφού λυθεί η απόφραξη η αποκατάσταση της έκκρισης των χολικών αλάτων καθυστερεί πολύ σε σχέση με τη χοληστερόλη. Στη χρόνια χολόσταση η διάταση των χολαγγείων φτάνει μέχρι τα μικρά χολαγγεία, τα οποία συχνά αποφράσσονται από μικροπήγματα χολής. Τα στοιχεία της χολής προοδευτικά απορροφώνται και δημιουργείται τοπικά φλεγμονώδης αντίδραση με περιπυλαία διήθηση από πολυμορφοπύρηνα. Η παράταση της χολόστασης μπορεί να οδηγήσει σε περιχολαγγειακή ίνωση, κίρρωση και πυλαία υπέρταση. Ο βλεννογόνος των χολαγγείων εμφανίζει ατροφία, φλεγμονώδη διήθηση και εξελκώσεις. Εάν επισυμβεί και ανιούσα λοίμωξη προκαλείται χολαγγειΐτιδα, με βαριά κλινική εικόνα και σχηματισμό αποστημάτων (1). Συχνά οξεία νεφρική ανεπάρκεια επιπλέκει τον αποφρακτικό ίκτερο (2). Η χολαγγεΐτιδα είναι συχνότερη στη λιθίαση παρά στα νεοπλάσματα, ενώ χειρισμοί όπως διαδερμική διηπατική παροχέτευση, ενδοσκοπική παλίνδρομη χολαγγειοπαγκρεατογραφία ή τοποθέτηση ενδοπροθέσεων, συνοδεύονται από ποσοστό επιπλοκών. Λόγω της μεγάλης πίεσης στα χολαγγεία παρατηρείται παλινδρόμηση χολής σε λεμφαγγεία και φλεβίδια με κίνδυνο όταν υπάρχει μικροβιοχολία την ανάπτυξη σηπτικής καταπληξίας (3). Ο παθογενετικός μηχανισμός της ηπατικής βλάβης στον αποφρακτικό ίκτερο είναι υπό εντατική έρευνα. Η κατακράτηση χολικών αλάτων προκαλεί μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, που με τη σειρά της οδηγεί τα ηπατοκύτταρα σε ένδεια ATP. Αυτό σε συνδυασμό με την ενεργοποίηση της οφειλόμενης σε ιόντα ασβεστίου πρωτεόλυσης οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο. Διάφορες εργασίες αναδεικνύουν της ενεργοποίηση των κυττάρων του Kuppfer με την έκκριση κυτοκινών ως βλαπτικά για το ηπατοκύτταρα. Τα ενεργοποιημένα ηπατικά μακροφάγα εκκρίνουν ελεύθερες ρίζες οξυγόνου, πρωτεάσες, φωσφολιπάσες και κυτοκίνες. Το μπλοκάρισμα της έκκρισης αυτών των παραγόντων πειραματικά έχει ευεργετικά αποτελέσματα (4). Η έλλειψη χολής από το έντερο σχετίζεται με υπερανάπτυξη βακτηριδίων, διαταραχές της αρχιτεκτονικής του βλεννογόνου και ενδεχόμενη βακτηριδιακή διαμετακίνηση. Το γεγονός αυτό επί

5 αποφρακτικού ικτέρου, συνδυάζεται με ανοσολογικές διαταραχές και άλλοτε άλλου βαθμού συστηματική φλεγμονώδη απάντηση, όπως και με διαταραχές της οξειδωτικής διαδικασίας, με αύξηση του κινδύνου εμφάνισης διαφόρων επιπλοκών (3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11). 2. ΒΑΚΤΗΡΙΔΙΑΚΗ ΔΙΑΜΕΤΑΚΙΝΗΣΗ (TRANSLOCATION) Ο γαστρεντερικός σωλήνας δεν θεωρείται απλά ως ένα όργανο απορρόφησης θρεπτικών ουσιών, αλλά επιπροσθέτως είναι υπεύθυνος για σημαντικές ενδοκρινολογικές, μεταβολικές και κυρίως ανοσολογικές λειτουργίες (12, 13). Ο όρος δυσλειτουργία του γαστρεντερικού τείνει να αντικατασταθεί από τον όρο εντερική ανεπάρκεια (intestinal failure), όπως ακριβώς η καρδιακή, η αναπνευστική ή η νεφρική ανεπάρκεια. Ο σχετιζόμενος με το έντερο λεμφικός ιστός (gut-associated lymphoid tissue - GALT) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο εναντίον των παθογόνων μικροοργανισμών. Αποτελείται από δύο λειτουργικά τμήματα: τον οργανωμένο λεμφικό ιστό, όπως οι πλάκες του Peyer και τα λεμφοκύτταρα που βρίσκονται διάχυτα στο βλεννογόνο (στη βασική μεμβράνη και ενδοεπιθηλιακά). Οι μεσεντέριοι λεμφαδένες αποτελούν τη δεύτερη γραμμή άμυνας και αποτελούν την πιο συχνή εστία ανεύρεσης μικροοργανισμών σε βακτηριδιακή αλλομετάθεση. Ο προστατευτικός ρόλος της ανοσοσφαιρίνης IgA που εκκρίνεται με τη χολή, οφείλεται στην αναστολή της συγκόλλησης των μικροβίων στον εντερικό βλεννογόνο. Τέλος το δικτυοενδοθηλιακό σύστημα του ήπατος με τα κύτταρα του Kupffer αποτελεί την τελευταία γραμμή άμυνας προ της εισόδου των μικροβίων στη συστηματική κυκλοφορία (6, 11, 12, 14). Κατά την βακτηριδιακή διαμετακίνηση (translocation) έχουμε μεταφορά ζωντανών μικροοργανισμών ή παραγώγων τους από τον εντερικό αυλό σε άλλα όργανα, στείρα μικροβίων, όπως οι λεμφαδένες του μεσεντερίου, το ήπαρ, ο σπλήνας, οι νεφροί, το περιτόναιο και η συστηματική κυκλοφορία (3, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21). Σε υγιείς οργανισμούς τα μικρόβια και παράγωγά τους, ενίοτε διαπερνούν σε μικρή ποσότητα το βλεννογονικό φραγμό, αλλά συνήθως εξουδετερώνονται από το ανοσολογικό σύστημα του οργανισμού και έτσι δεν διασπείρονται στη συστηματική κυκλοφορία (12). Ο συνδυασμός της διαμετακίνησης με παθολογικές επιπτώσεις παρατηρείται σε βαρέως πάσχοντες ασθενείς, σε ασιτία και σε άλλες καταστάσεις. Τρεις πιθανοί μηχανισμοί προκαλούν τη βακτηριδιακή διαμετακίνηση. 1. Η διαταραχή του βιολογικού φραγμού της φυσιολογικής εντερικής χλωρίδας, που έχει σαν αποτέλεσμα την υπερανάπτυξη παθογόνων βακτηριδίων (5, 9, 14, 22, 23). 2. Η διαταραχή του μηχανικού φραγμού του εντερικού βλεννογόνου (8, 10, 14, 17, 22, 24).

6 3. Η διαταραχή του ανοσολογικού φραγμού, δηλαδή η εξουδετέρωση του ανοσολογικού συστήματος του οργανισμού, τόσο τοπικά, όσο και συστηματικά (6, 11, 14, 22). Αναλυτικά οι σηπτικές επιπλοκές αποτελούν σοβαρή αιτία νοσηρότητας και θνητότητας σε ασθενείς με αποφρακτικό ίκτερο. Τόσο πειραματικές, όσο και κλινικές μελέτες αναδεικνύουν την αύξηση των εντερικής προέλευσης παθογόνων βακτηριδίων ως πιθανά αίτια ενδοτοξιναιμίας,σήψης και πολυοργανικής ανεπάρκειας στις περιπτώσεις αυτές (1, 4, 14, 18, 21, 24, 25, 26). Τα χολικά άλατα έχουν βακτηριοστατικές ιδιότητες και έτσι επί ικτέρου η έλλειψή τους από τον εντερικό αυλό προκαλεί ποσοτικές και ποιοτικές μεταβολές στη μικροβιακή χλωρίδα, υποβοηθούμενες και από διαταραχές της εντερικής κινητικότητας (12, 22, 27). Πειραματικές μελέτες πιθανολογούν σύνδεση των χολικών αλάτων με τα εντερικά βακτηρίδια και με την ενδοαυλική ενδοτοξίνη, και δημιουργία δυσαπορρόφητων προστατευτικών συμπλεγμάτων (5, 9, 22). Η χολή εξάλλου έχει τροφική επίδραση στον εντερικό βλεννογόνο και η έλλειψή της προκαλεί ατροφία του επιθηλίου. Η διαταραχή στη σχέση κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικού θανάτου στις εντερικές κρύπτες, όπως και η αυξημένη απόπτωση και ελαττωμένη μιτωτική δραστηριότητα συμβάλλουν στη βλεννογονική ατροφία (17, 24, 28). Ο αποφρακτικός ίκτερος καταστρέφει το μηχανικό φραγμό με την τοπική απώλεια των κυτταρικών δεσμών, με αποτέλεσμα τη διαφυγή της ενδοτοξίνης από τον εντερικό βλεννογόνο στην πυλαία κυκλοφορία (27). Ο αποφρακτικός ίκτερος τέλος καταστέλλει τα κύτταρα του Kupffer και τα natural killers, ελαττώνει τα Τ κύτταρα στο εντερικό επιθήλιο και στερεί το έντερο από τη εκκρινόμενη στη χολή IgA και συμβάλλει στην ανοσολογική ανεπάρκεια (6, 11). 3. ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΗ ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ Η συστηματική φλεγμονώδης αντίδραση και η πολυοργανική ανεπάρκεια αποτελούν τις κύριες αιτίες θανάτου στις μονάδες εντατικής θεραπείας (12, 29, 30). Ως σύνδρομο συστηματικής ή γενικευμένης φλεγμονώδους αντίδρασης (SIRS) ορίζεται η αντίδραση του οργανισμού στις διαταραχές της ομοιόστασής του (30, 31). Xαρακτηρίζεται από κλινικές εκδηλώσεις υπερμεταβολισμού, οι οποίες εμφανίζονται μετά από σοβαρό παθολογικό αίτιο, όπως τραύμα, παγκρεατίτιδα, έγκαυμα, ισχαιμία, αιμορραγία, ανοσολογική βλάβη, οξεία νεφρική ανεπάρκεια σε ραβδομυόλυση, σύνδρομο αναπνευστικής δυσχέρειας των ενηλίκων σε πνευμονική θλάση, διαταραχές της πήξης σε μαζικές μεταγγίσεις, χολαγγειϊτιδα και βακτηριδιακή διαμετακίνηση επί ικτέρου. Μικροβιακοί παράγοντες είναι

7 δυνατόν να συμμετέχουν στο SIRS, συχνά όμως δεν ανευρίσκεται η μικροβιακή εστία ούτε και νεκροτομικά ακόμη (12, 31, 32, 33, 34, 35). Ο ορισμός της γενικευμένης φλεγμονώδους αντίδρασης διαφέρει αυτού της σήψης, ως προς την παρουσία στη σήψη και ενός λοιμογόνου παράγοντα. Το σύνδρομο χαρακτηρίζεται από διάφορα παθολογικά σημεία (30). Η διάγνωση προϋποθέτει την ύπαρξη δύο τουλάχιστον από τα κάτωθι: 1. Θερμοκρασία μεγαλύτερη από 38 0 C, ή μικρότερη από 36 0 C. 2. Συχνότητα καρδιακών παλμών μεγαλύτερη από 90/1. 3. Ταχύπνοια με αναπνευστική συχνότητα μεγαλύτερη από 20 αναπνοές το λεπτό ή υπεραερισμό με paco2 μικρότερο από 32mmHg. 4. Αριθμός λευκών αιμοσφαιρίων μεγαλύτερος από 12000/mm 3 ή μικρότερος από 4000/mm Εμφάνιση άωρων μορφών ουδετερόφιλων στην κυκλοφορία >10%. Ως σηπτική καταπληξία ή σηπτικό σύνδρομο ορίζεται η οξεία κυκλοφορική ανεπάρκεια που συνοδεύει τη βαρειά σήψη και χαρακτηρίζεται από υπόταση παρά την ικανοποιητική χορήγηση υγρών και υποάρδευση των ιστών και σε πολλές περιπτώσεις δυσλειτουργία πολλών οργάνων (29, 32, 35, 36). Η δυσλειτουργία πολλών οργάνων (multiple organ failure MOF) διακρίνεται σε πρωτοπαθή και δευτεροπαθή (37). Η πρωτοπαθής εμφανίζεται πρώιμα ως αποτέλεσμα άμεσης προσβολής του οργανισμού από βλαπτικούς παράγοντες. Αντίθετα η δευτεροπαθής αναπτύσσεται όψιμα, μετά παρέλευση ημερών ή και εβδομάδων μετά την προσβολή του οργανισμού από βλαπτικό παράγοντα, προσβάλλονται απομακρυσμένα όργανα, που δεν επλήγησαν άμεσα και συνήθως ακολουθεί βαριά σήψη. Η απάντηση του οργανισμού στο τραύμα ή σε άλλες σοβαρές παθολογικές καταστάσεις (stress response) δεν είναι πλήρως διερευνημένη. Πρόκειται για μια πολυοργανική αντίδραση, που θεωρείται αρχικά ωφέλιμη για τον οργανισμό, με σκοπό τη διατήρηση της ομοιόστασης του, όταν όμως η απάντηση του οργανισμού γίνει υπερβολική, είτε λόγω παρατεινόμενης βλάβης, ή λόγω επαναλαμβανόμενης προσβολής, προκαλείται ιστική βλάβη. Οι παραγόμενες μεγάλες ποσότητες μεσολαβητών αλληλεπιδρούν μεταξύ τους (φλεγμονώδης καταρράκτης) και είναι δυνατό να προκληθεί μη ελεγχόμενη συστηματική φλεγμονώδης αντίδραση, με κίνδυνο ανάπτυξης πολυοργανικής δυσλειτουργίας (12, 13). Η ανεπάρκεια ενός οργάνου και ιδιαίτερα του ήπατος επιδεινώνει την ανεπάρκεια των άλλων οργάνων. Εφόσον το γενεσιουργό αίτιο της φλεγμονώδους αντίδρασης

8 αντιμετωπιστεί, η εξέλιξη του φαινομένου μπορεί να σταματήσει. Εάν υπάρξει νέα προσβολή, ακόμα και μικρής έντασης, ενεργοποιείται εκ νέου η φλεγμονώδης αντίδραση, ασθενείς δε με προϋπάρχουσα νόσο, ή περιορισμένες εφεδρείες είναι ιδιαίτερα επιρρεπείς σε κακή έκβαση (31, 35). Περιγράφονται τρεις φάσεις απάντησης στο stress (38, 39). 1 Η φάση της παλίρροιας (ebb phase). Ακολουθεί άμεσα το βλαπτικό παράγοντα (τραύμα, εγχείρηση, λοίμωξη) και συνήθως διαρκεί λίγες ώρες (από μερικά λεπτά ως 24 ώρες μετά την προσβολή). 2 Η φάση της υποχώρησης (flow phase). Χάρη στην πρόοδο των μονάδων εντατικής θεραπείας πολλοί ασθενείς επιβιώνουν και η φάση αυτή μπορεί να κρατήσει ημέρες ή εβδομάδες. 3 Η φάση της αποκατάστασης (convalence phase). Η μετάβαση σε αυτήν τη φάση επιτυγχάνεται μόνο εφόσον οι βλαπτικοί παράγοντες έχουν απομακρυνθεί, επικρατούσες δε είναι οι αναβολικές ορμόνες με επίτευξη θετικού ισοζυγίου αζώτου. Οι τρεις αυτές φάσεις δεν ακολουθούν υποχρεωτικά η μια την άλλη. Εάν οι βλαπτικοί παράγοντες δεν απομακρυνθούν οι ασθενείς που βρίσκονται στη φάση υποχώρησης δεν μπορούν να μπουν στη φάση αποκατάστασης, ή και επιστρέφουν στη φάση της παλίρροιας. Η απάντηση στο stress είναι κλινική και βιοχημική, περιλαμβάνει δε προσαγωγό σκέλος που είναι η φλεγμονώδης αντίδραση και απαγωγό σκέλος που είναι η παραγωγή ορμονών και η αντίδραση από το κεντρικό νευρικό σύστημα (37). Παρατηρούνται κυκλοφορικές μεταβολές, όπως αύξηση καρδιακής παροχής, ταχυκαρδία και αύξηση κατανάλωσης οξυγόνου, νευροενδοκρινικές διαταραχές, όπως παραγωγή κορτιζόλης, κατεχολαμινών, αντιδιουρητικής ορμόνης, γλουκαγόνης και ινσουλίνης και ενεργοποίηση του συμπληρώματος, του μηχανισμού πήξης και της ινωδόλυσης (37, 40). Η διαδικασία κορυφώνεται την 3 η με 5 η ημέρα και εξασθενεί την 7 η ως 10 η, εφόσον λυθεί το γενεσιουργό αίτιο. Η κλινική βελτίωση γίνεται εμφανής με τη πτώση της θερμοκρασίας, των σφύξεων και την αύξηση της διούρησης (37, 39). Κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη του SIRS έχουν οι κυτοκίνες. Πρόκειται για γλυκοπρωτεΐνες που εκκρίνονται από διάφορα κύτταρα και είναι υπεύθυνες για την κυτταρική ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό, την ωρίμανση και την ενεργοποίηση των ανοσιακών κυττάρων. Οι κυτοκίνες παίζουν καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση των τοπικών και συστηματικών ανοσιακών αντιδράσεων (40, 41, 42, 43). Η ανάπτυξη των μεθόδων της μοριακής βιολογίας συνέβαλε στην αναγνώριση πολλών νέων κυτοκινών. Οι δράσεις τους σε κύτταρα - στόχους είναι ποικίλες, διεγερτικές, ανασταλτικές ή και τα δύο με σκοπό

9 τη διατήρηση της ομοιόστασης. Δρουν συντονισμένα ενισχύοντας ή μειώνοντας τη ανοσολογική απάντηση. Η παραγωγή τους εξαρτάται έμμεσα από αντιγόνα, τα οποία ενεργοποιούν τα κύτταρα που παράγουν κυτοκίνες, τα βιολογικά τους όμως αποτελέσματά είναι ανεξάρτητα από τα αντιγόνα (40, 42, 43). Οι ουσίες αυτές ελέγχουν την ανάπτυξη των ενεργοποιημένων πληθυσμών των Τ και Β κυττάρων, ενεργοποιούν κύτταρα στα σημεία της φλεγμονής, απενεργοποιούν την αντίδραση όταν χρειάζεται και συντονίζουν την ιστική αποκατάσταση μετά την απομάκρυνση του παθογόνου παράγοντα. Η συστηματική κυκλοφορία ιδιαίτερα υψηλών επιπέδων κυτοκινών στο σύνδρομο της γενικευμένης φλεγμονώδους αντίδρασης είναι επιζήμια και με διάφορους μηχανισμούς μπορεί να οδηγήσει σε πολυοργανική ανεπάρκεια (44, 45). Οι ιντερλευκίνες εμπεριέχονται στον γενικό όρο κυτοκίνες. Είναι γλυκοπρωτεΐνες που εκκρίνονται από τα λεμφοκύτταρα και δρουν ως μοριακά σήματα για την επικοινωνία των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος και ως συστηματικοί μεσολαβητές της απάντησης στη φλεγμονή. Υπό αυτή την έννοια, η λειτουργία τους είναι ανάλογη με αυτή των ορμονών και των νευροδιαβιβαστών αντίστοιχα (40). Οι ιντερλευκίνες χαρακτηρίζονται από έναν αριθμό που τους δίνεται μόνο αφού αναγνωριστεί η αλληλουχία των αμινοξέων τους και αφού κλωνοποιηθούν. Έως τότε χαρακτηρίζονται από το ειδικό βιολογικό τους αποτέλεσμα (46). Τα κύρια χαρακτηριστικά των ιντερλευκινών παρουσιάζονται στον πίνακα 1: ΠΙΝΑΚΑΣ 1. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΙΝΤΕΡΛΕΥΚΙΝΩΝ Είναι γλυκοπρωτεϊνες που ενεργούν σε χαμηλή συγκέντρωση Δρουν μέσω ειδικών υποδοχέων σε κύτταρα στόχους διαφορετικής προέλευσης Επιδρούν σε πλήθος διαφοροποιημένων κυττάρων από τα αρχικά πρόγονα κύτταρα, μέχρι τα τελικά κύτταρα με πολλαπλά και διαφορετικά αποτελέσματα Συνενεργούν με άλλους παράγοντες ανάπτυξης για να προέλθει συνέργια, ή λιγότερο συχνά, αναστολή Συχνά έχουν στόχο κακοήθη κύτταρα

10 Πιθανά ενεργούν με αυτοκρινή ή παρακρινή τρόπο σε φυσιολογικές καταστάσεις Οι ιντερλευκίνες δρουν συντονισμένα, ενισχύοντας ή μετριάζοντας την ανοσολογική απάντηση. Η ενεργοποίηση των κυττάρων από μικροβιακούς παράγοντες καταλήγει στην παραγωγή ιντερλευκινών στην ίδια περιοχή, με αποτέλεσμα τον περιορισμό της φλεγμονής εκεί όπου χρειάζεται. Γενικά οι ιντερλευκίνες ελέγχουν συντονισμένα την επέκταση των ενεργοποιημένων πληθυσμών Τ και Β κυττάρων, στρατολογούν ενεργοποιημένα κύτταρα στα όρια της φλεγμονής μέσω της συγκόλλησης των κυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα λευκοκύτταρα, δημιουργούν ενεργοποιημένα κύτταρα σε άλλες πιο ισχυρά βακτηριοστατικά περιοχές, απενεργοποιούν την απάντηση, ώστε να ελαττώσουν την ιστική καταστροφή και συντονίζουν την ιστική αποκατάσταση μετά την απομάκρυνση του παθογόνου παράγοντα. Όλες αυτές οι διεργασίες έχουν την τάση να είναι εντοπισμένες. Συστηματικά αποτελέσματα αποδιδόμενα στις ιντερλευκίνες προκαλούν την πρώιμη ρύθμιση της μη ειδικής απάντησης του ανοσολογικού συστήματος, όπως ο πυρετός, η αντίδραση οξείας φάσης και ο ερεθισμός του μυελού των οστών για την παραγωγή των κυττάρων των απαραίτητων για την αντιμετώπιση της φλεγμονής. Η παραγωγή και η δράση των λεμφικών, αιμοποιητικών και ενδοθηλιακών κυττάρων ρυθμίζεται από τις ιντερλευκίνες και τις αλληλεπιδράσεις τους (42, 43, 45). Με εξαίρεση τα μαστοκύτταρα, οι ιντερλευκίνες δεν αποθηκεύονται προσχηματισμένες στα κύτταρα. Η παραγωγή τους απαιτεί νέα πρωτεϊνοσύνθεση και σε πολλές περιπτώσεις νέα σύνθεση mrna. Κάθε ιντερλευκίνη κωδικοποιείται από ένα μοναδικό mrna και οι περισσότερες προέρχονται από ένα μοναδικό γονίδιο. Εντούτοις, υπάρχουν για ορισμένες ιντερλευκίνες εναλλακτικά συνδεδεμένες μορφές, που δημιουργούν διαφορετικές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων των διαλυτών και διαμεμβρανικών μορφών, οι οποίες αποτελούν προϊόν δύο διαφορετικών γονιδίων (47, 48). Η TNF-a και η IL-1 εμποδίζουν τη λιποπρωτεϊνική λιπάση και ενεργοποιούν την ηπατική λιπογένεση, προκαλώντας μ αυτόν τον τρόπο λιπαιμία, η οποία είναι χαρακτηριστική ορισμένων χρόνιων φλεγμονών. Ο ρόλος της TNF-a στην καχεξία που σχετίζεται με την κακοήθεια ή τη φλεγμονή, είναι αποτέλεσμα της δράσης της στη λήψη τροφής και στο καταβολισμό. Όγκοι που παράγουν TNF-a στους επίμυες προκαλούν ανορεξία και απώλεια βάρους, ενώ ανασυνδυασμένη TNF-a προκαλεί ιστικό καταβολισμό, λιπόλυση και λιπαιμία, όταν χορηγείται στους ανθρώπους. Είναι πιθανό η ΙL-1 και ίσως και άλλες κυτοκίνες να συμβάλουν στην απώλεια βάρους στη χρόνια φλεγμονή. Υπάρχει

11 συσχέτιση ανάμεσα στα επίπεδα των κυτοκινών και την επιβίωση ασθενών με SIRS (30, 41, 42, 44). Η ιντερευκίνη 6 (IL-6) είναι μια γλυκοπρωτεΐνη με μοριακό βάρος kd. Παράγεται τόσο από λεμφοειδή κύτταρα (κυρίως από μονοπύρηνα φαγοκύτταρα και Τ-κύτταρα), όσο και από μη λεμφοειδή κύτταρα (κυρίως ενδοθηλιακά), ινοβλάστες και μεσαγγειακά κύτταρα και συντίθεται από πολλές σειρές καρκινικών κυττάρων αυτόματα, από τα κύτταρα του μυελώματος και από τα κερατινοκύτταρα. Η κυτοκίνη αυτή ρυθμίζει την ανοσολογική απάντηση οξείας φάσης (ορμόνη συναγερμού) και την αιμοποίηση, παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση τοπικών και συστηματικών μηχανισμών, που αποσκοπούν στην προστασία του ξενιστή, με τελικό σκοπό τον περιορισμό της ιστικής βλάβης, ενισχύει τον πολλαπλασιασμό των Β-κυττάρων, τη διαφοροποίηση των ανοσοσφαιρινών που εκκρίνουν τα πλασμοκύτταρα και μεσολαβεί στον πολλαπλασιασμό των Τ-κυττάρων με ενδυνάμωση της μεγακαρυωτικής ανάπτυξης. Η παραγωγή της IL-6 ξεκινά από διάφορα ερεθίσματα. Τα μονοκύτταρα μακροφάγα διεγείρονται από τους μικροβιακούς λιποπολυσακχαρίτες και οι ινοδοβλάστες και τα ενδοθηλιακά κύτταρα φαίνεται να απαντούν καλύτερα στις ενδογενείς κυτοκίνες IL-1 και TNFa. Η IL-6 μεσολαβεί σε ευρύ φάσμα βιολογικών φαινομένων και το ήπαρ αποτελεί το κυριότερο όργανο στόχο. Μέσω ηπατικών υποδοχέων προκαλεί τη σύνθεση πρωτεϊνών οξείας φάσης στο ήπαρ (CRP, AGP, a2m). Η CRP χρησιμοποιείται ευρέως ως δείκτης φλεγμονής, καθώς και για τη διάκριση ιογενών από τις μικροβιακές φλεγμονές (42). Αυξημένα επίπεδα IL-6 παρατηρούνται στα ανθρώπινα υγρά κατά τη διάρκεια οξέων και χρόνιων λοιμώξεων, σε νεοπλάσματα και αυτοάνοσες νόσους. Ωστόσο και στον ορό φυσιολογικών ατόμων μετά από stress διαπιστώθηκαν αυξημένα επίπεδα IL-6, γεγονός που δείχνει ότι αυτή η κυτοκίνη ασκεί σημαντικές φυσιολογικές και παθολογικές επιδράσεις (40, 42). Η κύρια πηγή παραγωγής IL-6 κατά τη συστηματική φλεγμονώδη αντίδραση είναι τα ενδοθηλιακά κύτταρα, οι ινοβλάστες και τα μονοκύτταρα-μακροφάγα. Η παραγωγή της IL-6 διεγείρεται από τις κυτοκίνες TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IFN-γ, από την λιποπολυσακχαρίδη (LPS) και από μικροοργανισμούς, καταστέλλεται δε από τα γλυκοκορτικοειδή (42). Στη σήψη και στη σηπτική καταπληξία η IL-6 δρα ως βασικός διεγερτικός παράγοντας των ηπατοκυττάρων (HSF - hepatocyte stimulating factor) και είναι υπεύθυνη για την παραγωγή πρωτεϊνών οξείας φάσης. Αυτές οι πρωτεΐνες εμφανίζονται στην κυκλοφορία σε ποικίλες καταστάσεις, ειδικά όμως σε περιπτώσεις ιστικής βλάβης, λοίμωξης, καρκίνου και αυτοάνοσων διαταραχών. Μερικές πρωτεΐνες οξείας φάσης συμπεριλαμβανομένου και του ινωδογόνου, συμμετέχουν στην πήξη του αίματος και στην έναρξη αποκατάστασης των ιστικών βλαβών και ίασης των τραυματικών

12 επιφανειών. Η IL-6 ασκεί και αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις, διαμέσου της ικανότητας που έχει να αναστέλλει την παραγωγή άλλων κυτοκινών, όπως του TNF (40, 42). Το ήπαρ κατέχει κεντρική θέση στη ρύθμιση της ανοσολογικής απάντησης. Η απάντηση στην ενδοτοξιναιμία περιλαμβάνει τη σύνθεση και απέκκριση TNF από τα κύτταρα του Kupffer, ή πρωτεϊνών οξείας φάσης από τα ηπατοκύτταρα και την κάθαρση των κυτοκινών και των εικοσανοϊδών διαβιβαστών. Προϋπάρχουσα ηπατική δυσλειτουργία συνδέεται με αυξημένη συχνότητα συνδρόμου αναπνευστικής δυσχέρειας των ενηλίκων (ARDS) και πολυοργανικής ανεπάρκειας (49). Η εγχείρηση σε ασθενείς με αποφρακτικό ίκτερο και μάλιστα κακοήθους αιτιολογίας σχετίζεται με αυξημένη συχνότητα μετεγχειρητικών επιπλοκών και θνητότητας. Υπάρχουν ενδείξεις ότι ο TNF διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην παθογένεση των επιπλοκών. Τα επίπεδα της IL-6 αυξάνονται σημαντικά τόσο σε κλινική, όσο και σε πειραματική χολόσταση. Ο οφειλόμενος σε απολίνωση του χοληδόχου πόρου αποφρακτικός ίκτερος, προκαλεί ενδοτοξιναιμία στην πυλαία φλέβα και όπως προαναφέρθηκε βακτηριδιακή διαμετακίνηση (28, 50, 51). Ο παθογενετικός μηχανισμός της ενδοτοξιναιμίας είναι αποτέλεσμα βλάβης του ομοιοστατικού μηχανισμού στον άξονα ήπατος εντέρου. Η ύπαρξη ενδοτοξίνης στην πυλαία και συστηματική κυκλοφορία διεγείρει μια συστηματική φλεγμονώδη απάντηση, χαρακτηριζόμενη από την απελευθέρωση μιας πληθώρας κυτοκινών και άλλων διαβιβαστών, συμπεριλαμβανομένων των TNF-a, IL- 1, IL-6, ιντερφερόνη γ, παράγοντα ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων, οξείδιο του αζώτου, προσταγλανδίνες και ελεύθερες ρίζες οξυγόνου (26, 42, 51). 4. ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ STRESS Οι συνυπάρχουσες με βακτηριδιακή διαμετακίνηση και συστηματική φλεγμονώδη αντίδραση περιγραφόμενες κυτταρικές μεταβολές φαίνεται να σχετίζονται με αύξηση των ελεύθερων ριζών οξυγόνου, μεταβολές του οξειδωτικού status, με αυξημένη υπεροξείδωση των λιπών, των πρωτεϊνών και των θειολών. Η διερεύνηση της οξειδωτικής ισορροπίας είναι τομέας εντατικής έρευνας, λαμβάνοντας υπ όψιν ότι οι δραστικές μορφές οξυγόνου έχουν σχέση με τον έλεγχο πολλών κυτταρικών διεργασιών, όπως η διαφοροποίηση, ο πολλαπλασιασμός, η αντίδραση στο stress και ο κυτταρικός θάνατος. Οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου (ΕΡΟ) είναι μόρια ιδιαίτερα ασταθή και δυνητικά τοξικά για κυτταρικές μεμβράνες, πρωτεΐνες και δεσοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) (25, 52, 53). Υπό φυσιολογικές συνθήκες ο οργανισμός μας προστατεύεται με το ενδογενές αντιοξειδωτικό σύστημα, που περιλαμβάνει ενζυμικά

13 συστήματα και βιταμίνες εκκαθάρισης των ελεύθερων ριζών. Όταν η ισορροπία μεταξύ των προστατευτικών αντιοξειδωτικών μηχανισμών και παραγωγής ελεύθερων ριζών οξυγόνου διαταραχτεί η κατάσταση που δημιουργείται οδηγεί σε οξειδωτικό stress (25, 52, 54). Καταστάσεις που προκαλούν οξειδωτικό stress είναι η ισχαιμία επαναιμάτωση, η φλεγμονή, η λοίμωξη, τα θρεπτικά ελλείμματα και τοξικοί παράγοντες, όπως τα χημειοθεραπευτικά (25, 54, 55, 56, 57, 58). Προδιαθετικοί παράγοντες που συμβάλουν στην εκδήλωση οξειδωτικού stress σε βαρέως πάσχοντες είναι: η προχωρημένη ηλικία, το κάπνισμα, η κακή θρέψη και χρόνιες νόσοι όπως η αρτηριοσκλήρυνση, ο σακχαρώδης διαβήτης, η ρευματοειδής αρθρίτιδα, καταστάσεις με αυξημένη παραγωγή ΕΡΟ, μειωμένη αντιοξειδωτική ικανότητα ή και τα δύο (25, 54). Ο αποφρακτικός ίκτερος προκαλεί οξειδωτικό stress (10, 21, 22, 26, 28, 59). Εκτός της διαμετακίνησης και της συστηματικής φλεγμονώδους αντίδρασης που προαναφέρθηκαν άλλος εκλυτικός παράγοντας του φαινομένου είναι ότι τα αυξημένα επίπεδα χολικών οξέων στο αίμα άμεσα προκαλούν ιστική καταστροφή ή έμμεσα ενεργοποιούν ιστικά μακροφάγα, τα οποία απελευθερώνουν ελεύθερες ρίζες οξυγόνου με δομικά και λειτουργικά βλαπτικά αποτελέσματα σε απομακρυσμένα όργανα και ειδικά στα νεφρούς, τους πνεύμονες και την καρδιά, και ενδεχομένως πολυοργανική ανεπάρκεια. Ο αποφρακτικός ίκτερος και η συνεπακόλουθη ενδοτοξιναιμία επίσης προάγουν την έκφραση χημειοτακτικών παραγόντων που αυξάνουν τη διήθηση πολυμορφοπύρηνων κυττάρων στο ήπαρ και ενεργοποιούν την οξειδάση της ξανθίνης. Αυτά με τη σειρά τους παράγουν μεγάλες ποσότητες από ελεύθερες ρίζες οξυγόνου και προκαλείται ιστική καταστροφή. Το παραγόμενο εξάλλου από τα διεγερμένα λευκοκύτταρα οξείδιο του αζώτου (ΝΟ) αντιδρά με το υπεροξείδιο (O2 - ) στο οξειδωτικό περιβάλλον του χολοστατικού ήπατος, με αποτέλεσμα τη δημιουργία του ανιόντος ΟΝΟΟ -, από το οποίο τελικά παράγεται το δραστικότατο οξειδωτικό περοξυνιτρικό οξύ (ΟΝΟΟΗ). Επιπροσθέτως επί αποφρακτικού ικτέρου αυξάνεται η παραγωγή του ανιόντος του υπεροξειδίου (Ο2-), η δε δυσαπορρόφηση των λιποδιαλυτών βιταμινών προκαλεί ένδεια αντιοξειδωτικών παραγόντων (10, 21, 22, 28, 59). Επειδή η πολυοργανική ανεπάρκεια στον αποφρακτικό ίκτερο μοιάζει να είναι έμμεσο αποτέλεσμα της ενδοτοξίνης, απελευθέρωσης κυτοκινών, διαταραχών της μικροκυκλοφορίας και μειωμένης παροχής οξυγόνου,η έγκαιρη χορήγηση αντιοξειδωτικών θρεπτικών ουσιών μπορεί να είναι ευεργετική σε βαρέως πάσχοντες ικτερικούς ασθενείς. Χημεία των ελεύθερων ριζών οξυγόνου Οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου είναι μόρια, άτομα ή ιόντα με ένα ή

14 περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια (25, 52, 53, 54). Μια σταθερή χημική ένωση έχει στην εξωτερική στοιβάδα τα ηλεκτρόνιά της συζευγμένα, περιέχει δηλαδή ζεύγη ηλεκτρονίων. Αν ένα ηλεκτρόνιο δεν είναι συζευγμένο, είναι δηλαδή μονήρες, τότε το μόριο στο οποίο ανήκει είναι περισσότερο ενεργό και ασταθές και τείνει να συμπληρώσει το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο. Το μόριο που περιέχει ασύζευκτα ηλεκτρόνια ονομάζεται ελεύθερη ρίζα (Free Radical FR) και συμβολίζεται με μια τελεία στο πάνω δεξιό μέρος της ένωσης (R ) (52). Η ηλεκτρονική αυτή δομή καθιστά τις ελεύθερες ρίζες εξαιρετικά δραστικές, διότι προκειμένου να επιτύχουν την αποκατάσταση σταθερής ηλεκτρονικής δομής ζεύγους ηλεκτρονίων αντιδρούν με οποιοδήποτε γειτονικό μόριο, από το οποίο αποσπούν ένα ηλεκτρόνιο. Το μόριο που προσβάλλεται υφίσταται οξειδωτική μετατροπή (25, 52, 53, 54). Οι περισσότερες από τις ελεύθερες ρίζες περιέχουν μοριακό οξυγόνο και γι αυτό ονομάζονται ελεύθερες ρίζες οξυγόνου (ΕΡΟ) (oxygen free radicals OFR). Υπάρχουν ενώσεις του Ο2, που ενώ χημικά δεν είναι ελεύθερες ρίζες, μπορούν να οδηγήσουν στο σχηματισμό ελεύθερων ριζών. Οι ενώσεις αυτές μαζί με τις ΕΡΟ ονομάζονται δραστικές μορφές οξυγόνου (reactive oxygen species ROS) (25, 52, 54). Η πρόσληψη ηλεκτρονίου στην εξωτερική στοιβάδα ενός ατόμου ή μορίου ονομάζεται αναγωγή, ενώ η αποβολή του από αυτήν ονομάζεται οξείδωση. Το χαρακτηριστικό των ριζών κατά την αντίδρασή τους με ουδέτερα μόρια είναι ότι έχουν την τάση να προκαλούν αλυσιδωτές αντιδράσεις (chain reactions), όπου μια ρίζα προκαλεί διαδοχικά τη γένεση μιας άλλης ρίζας (25, 52, 54). Το 95-98% του μοριακού οξυγόνου (Ο2) που φτάνει στα κύτταρα, υφίσταται σταδιακή ελεγχόμενη τετρασθενή αναγωγή σε Η2Ο με την προσθήκη 4 ηλεκτρονίων (Ο2+4e - +4H H2O), που παράγονται στον κύκλο του Krebs και μεταφέρονται σ αυτό μέσω των μιτοχονδριακών ενζύμων της αναπνευστικής αλυσίδας με ταυτόχρονη παραγωγή ενέργειας από την οξειδωτική φωσφορυλίωση (25, 53, 54): ADP+Pi ATP+H2O (ADP αδενοσινοδιφωσφορικό οξύ, ATP αδενοσινοτριφωσφορικό οξύ και Pi ανόργανο φωσφορικό.) Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας, δηλαδή της σταδιακής τετρασθενούς αναγωγής του Ο2, σχηματίζονται δραστικά ενδιάμεσα χημικά προϊόντα, που ονομάζονται δεσμευμένες ρίζες Ο2 και παραμένουν σταθερά συνδεδεμένες στα ενεργά κέντρα των οξειδοαναγωγικών ενζύμων της αναπνευστικής αλυσίδας, με αποτέλεσμα να μην αποτελούν κίνδυνο για το κύτταρο. Αντίθετα το 2-5% του οξυγόνου που φτάνει στα κύτταρα υφίσταται σταδιακή μονοσθενή αναγωγή με την πρόσληψη ενός ηλεκτρονίου κάθε φορά. Κατά την προσθήκη ενός ηλεκτρονίου στο μόριο του Ο2 (1 ο στάδιο) σχηματίζεται η ρίζα Ο.- (ανιόν του σουπεροξειδίου), το οποίο είναι μέτρια τοξικό, αποτελεί όμως τη μητρική

15 μορφή άλλων τοξικότερων μεταβολιτών. Στο 2 ο στάδιο (προσθήκη 2 ηλεκτρονίων) σχηματίζεται το Η2Ο2 (υπεροξείδιο του υδρογόνου), το οποίο δεν είναι ρίζα, αλλά προκαλεί οξειδώσεις. Το Ο - αντιδρά με το Η2Ο2, παρουσία ιόντων τρισθενούς σιδήρου (καταλύτης), σχηματίζοντας (3 ο στάδιο) την τοξικότερη όλων των ριζών, τη ρίζα του υδροξυλίου (ΟΗ. ) (37, 41, 42, 44): Η2Ο2+Ο2 - Fe+++ O2+OH - +HO. Τα ενδοκυττάρια συστήματα μεταφοράς ηλεκτρονίων είναι βασικές συνεχείς πηγές παραγωγής ΕΡΟ. Όταν το Ο2 εκτεθεί σε πηγές υψηλής ενέργειας, π.χ. υπεριώδη ακτινοβολία, η ενέργεια μεταφέρεται στο Ο2 και δημιουργείται το μονήρες οξυγόνο (singlet oxygen). Το μονήρες οξυγόνο παρ ότι περιέχει ζεύγος ηλεκτρονίων στην εξωτερική του στιβάδα, τα ηλεκτρόνιά του είναι σε ασταθή διάταξη και συμβάλουν στο σχηματισμό ελευθέρων ριζών. Ο μηχανισμός αυτός ονομάζεται απενεργοποίηση του μονήρους Ο2. Ο απενεργοποιητής (quencher) είναι μια ένωση που απορροφά ενέργεια και έτσι αποφεύγεται ο σχηματισμός ελευθέρων ριζών. Το β-καροτένιο και η βιταμίνη Ε αποτελούν δραστικές ενώσεις απενεργοποίησης στα βιολογικά υγρά τόσο in vivo, όσο και in vitro (60). Η μονοσθενής αναγωγή του Ο2 γίνεται σε θέσεις, που δεν συνδέονται με την αναπνευστική αλυσίδα και γι αυτό ονομάζονται ελεύθερες ρίζες οξυγόνου (ΕΡΟ). Σε συνθήκες υπεροξίας ή υποξίας, φλεγμονής, μεταβολισμού φαρμάκων ή τοξικών ουσιών, σε σύνδρομα ισχιαιμίας επαναιμάτωσης και σε επίδραση ιονίζουσας ακτινοβολίας λαμβάνει χώρα ανεξέλεγκτη ατελής αναγωγή του Ο2, με αποτέλεσμα αυξημένη παραγωγή ΕΡΟ (52, 54, 56, 60). Τα κύτταρα διαθέτουν αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς προστασίας από τις ΕΡΟ. Όταν η παραγωγή τους υπερκεράσει το αντιοξειδωτικό δυναμικό του κυττάρου επέρχεται βλάβη των θεμελιωδών δομών του κυττάρου, διαταραχή της κυτταρικής λειτουργίας αρχικά και τελικά θάνατος του κυττάρου (52). Η υδροξυλική ρίζα (OH. ) κατά κύριο λόγο και το Ο2.-, παριστούν τις περισσότερο κυτταροτοξικές ΕΡΟ, ενώ το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2), μεταφέρεται εκτός κυττάρου και δίνει γένεση σε ΟH., επιτείνοντας το οξειδωτικό stress (54, 56). Ορισμένες από αυτές τις ρίζες ελευθερώνονται μέσα στο κύτταρο, διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη και μεταφέρονται σε άλλα σημεία του σώματος. Εκεί εμφανίζουν υψηλή χημική δραστηριότητα και καταστρέφουν τη φυσιολογική λειτουργία του κυττάρου. Επομένως ως δυνητικά κυτταροτοξικές ΕΡΟ χαρακτηρίζονται το ανιόν του σουπεροξειδίου Ο2.-, η υδροϋπεροξειδική ρίζα ΗΟ2., το υπεροξείδιο του υδρογόνου Η2Ο2, η υδροξυλική ρίζα ΟΗ. και η λιπουπεροξειδική ρίζα LOO. (L=λιπίδιο). Οι προαναφερόμενες ΕΡΟ διαφέρουν πολύ ως προς τα όργανα στόχους, όπου δρουν. Για παράδειγμα το ΟΗ. αντιδρά με όλα τα οργανικά μόρια. Από την άλλη το Ο2.- και το Η2Ο2 είναι μεν λιγότερο δραστικά, αλλά μπορούν να μετατραπούν σε πολύ δραστικές ΕΡΟ με την μεσολάβηση μεταλλικών

16 ιόντων, όπως του σιδήρου (Fe ++ ) και του χαλκού (Cu ++ ). Αντιδρώντας ο δισθενής σίδηρος (Fe ++ ), που βρίσκεται προσκολλημένος σε ενώσεις όπως το ADP, το ATP και το κιτρικό οξύ, με το Η2Ο2 προάγει την παραγωγή της υδροξυλικής ρίζας ΟΗ. (αντιδράσεις Fenton) (53, 54). Αντιοξειδωτική άμυνα Η σύνθεση των αντιοξειδωτικών ουσιών και ο τρόπος της διατήρησης της ισορροπίας αντιοξειδωτικών και οξειδωτικών ουσιών διαφέρει από ιστό σε ιστό και από κύτταρο σε κύτταρο. Το εξωκυττάριο περιβάλλον έχει διαφορετική αντιοξειδωτική άμυνα από αυτήν του ενδοκυττάριου και των κυτταρικών μεμβρανών. Υπάρχουν διάφορα αντιοξειδωτικά συστήματα, που καθένα δρα κατά περίπτωση. Π.χ. το ασκορβικό οξύ (βιταμίνη C) προστατεύει τα λιπίδια, όχι όμως και τις πρωτεΐνες. Ανάλογα με τον τρόπο δράσης τους μπορούν να ταξινομηθούν σε ενζυμικούς και μη ενζυμικούς αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς. Ενζυμικοί αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί Πρόκειται περί ενζύμων που εξουδετερώνουν τις ΕΡΟ χωρίς να καταναλώνονται στην αντίδραση, όπως οι δισμουτάσες του σουπεροξειδίου, οι καταλάσες, οι υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης οι τρανφεράσες-s της γλουταθειόνης και η DT-διαφοράση (52, 53, 54). Οι δισμουτάσες του σουπεροξειδίου (SOD) είναι οι πιο γνωστοί αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί. Είναι μεταλλοένζυμα που βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα (Cu, Zn) και τα μιτοχόνδρια (Mn) και καταλύουν την αντίδραση: ΗΟ2. +O2. +H + SOD H2O2+O2. Το παραγόμενο Η2Ο2 εξουδετερώνεται στη συνέχεια από ένζυμα, που είναι γνωστά ως ένζυμα αποδόμησης του Η2Ο2 (H2O2 degrading enzymes). Στα θηλαστικά υπάρχουν 2 κατηγορίες τέτοιων ενζύμων, οι καταλάσες και οι υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης. 2Η2Ο2 καταλάση 2Η2Ο+Ο2. υπερ. γλουταθειόνης Η2Ο2+2GSH 2GSSG+2H2O. Η καταλάση βρίσκεται κυρίως στα υπεροξεισωμάτια του κυττάρου, ενώ η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης στο κυτταρόπλασμα. Η αναχθείσα γλουταθειόνη (GSH) βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα. Η αναγωγή της οξειδωμένης γλουταθειόνης (GSSG) σε GSH καταλύεται από την αναγωγάση της γλουταθειόνης διατηρώντας τη σχέση GSH/GSSG πάνω από αναγωγάση γλουταθειόνης GSSH+NADPH+H 2GSG+NADP +. Τα ιχνοστοιχεία σελήνιο και ψευδάργυρος είναι απαραίτητα παράγοντες για τη δράση των ανωτέρω περιγραφομένων ενζυμικών συστημάτων (52, 53, 55). Μη ενζυμικοί αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί Αυτοί διακρίνονται: α) Σε αντιοξειδωτικές ενώσεις μεγάλου μοριακού βάρους (πρωτεΐνες), που δεσμεύουν και απομακρύνουν μεταλλικά καταλυτικά ιόντα που συμμετέχουν σε οξειδωτικές αντιδράσεις, όπως ο σίδηρος και ο χαλκός

17 (τρανσφερίνη, απτοσφαιρίνες, κερουλοπλασμίνη, αλβουμίνη κ.α.) (52, 53, 54). β) Σε αντιοξειδωτικές ενώσεις μικρού μοριακού βάρους, που εκκαθαρίζουν τις ελεύθερες ρίζες (free radical scavengers), σταματούν την αρχή της αλληλουχίας μιας αλυσιδωτής αντίδρασης (chain breaking antioxidant). Τα αντιοξειδωτικά αυτά καταναλώνονται προοδευτικά και η ισχύς τους εξαρτάται από τη συγκέντρωσή τους (π.χ. βιταμίνες C και Ε) (52, 53, 54). Οι μη ενζυμικοί μηχανισμοί μπορούν να διαχωριστούν σε λιποδιαλυτούς, που είναι συνδεδεμένοι με την κυτταρική μεμβράνη και σε υδατοδιαλυτούς, μη συνδεδεμένους με τη μεμβράνη. Η ομάδα των τοκοφερολών (α, β, γ και δ) (βιτ. Ε), με σημαντικότερη την α-τοκοφερόλη, είναι το σημαντικότερο μη ενζυμικό λιποδιαλυτό αντιοξειδωτικό σύστημα (52, 53). Αντιδρούν με την υπεροξειδική ρίζα (ROO. ) και σχηματίζουν το υδρουπεροξείδιο (ROOH) και τη ρίζα της τοκοφερόλης. Τοκοφερόλη-ΟΗ + ROO. ROOH + τοκοφερόλη-ο. Έτσι σχηματίζεται ένα λιγότερο δραστικό μόριο με ελαχιστοποίηση της κυτταρικής βλάβης. Η τοκοφερόλη-ο. ανάγεται στην προηγούμενη σταθερή μορφή της προσλαμβάνοντας ένα πρωτόνιο από δότη (ΑΗ) όπως η βιταμίνη C ή η GSH. τοκοφερόλη-ο. + ΑΗ τοκοφερόλη-οη + Α Το β-καροτένιο (Vit A) είναι μια χρωστική που συναντάται σε όλα τα φυτά (53). Όπως η βιταμίνη Ε είναι λιποδιαλυτή. Είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική σε χαμηλή πίεση οξυγόνου, όπως σε συνθήκες ισχιαιμίας. Εκκαθαρίζει ΕΡΟ και εμποδίζει τη υπεροξείδωση των λιπών. Η γλουταθειόνη είναι ένα τριπεπτίδιο, που αποτελείται από τα αμινοξέα γλουταμίνη, κυστεϊνη και γλυκίνη. Η σύνθεσή της εξαρτάται από την επάρκεια των επιμέρους στοιχείων της. Συντίθεται κυρίως στο ήπαρ, αλλά και σε άλλα όργανα. Πρόκειται για το σπουδαιότερο ενδοκυττάριο αντιοξειδωτικό και εκκαθαριστή ΕΡΟ (53, 61, 62). Το ασκορβικό οξύ (Vit C) έχει δύο σημαντικές αντιοξειδωτικές λειτουργίες (53): 1 Αντιδρά άμεσα και εξουδετερώνει τις ΕΡΟ στα υδατοδιαλυτά διαμερίσματα του οργανισμού, όπως στο κυτταρόπλασμα, το πλάσμα και τον εξωκυττάριο χώρο. 2 Η βιταμίνη C αναγεννά την οξειδωμένη βιταμίνη Ε (τοκοφερόλη). Το ασκορβικό οξύ και η γλουταθειόνη ανήκουν στην ομάδα των υδατοδιαλυτών αντιοξειδωτικών και μπορούν να αντιδράσουν και απευθείας με τις ρίζες. Ως παράδειγμα, η αντίδραση της GSH με OH θα δημιουργήσει τη γλουταθειϋλική ρίζα (GS. ), που είναι λιγότερο οξειδωτική. ΟΗ. + GSH H2O + GS.. H GS. Αντιδρά με GSH και σχηματίζει το

18 GSSG.. GS. + GS - GSSG -. Η οξειδωμένη γλουταθειόνη (GSSG - ) είναι ισχυρό αναγωγικό μόριο και αντιδρά με Ο2 σχηματίζοντας GSSG και Ο.. GSSG - + O2 O2. + GSSG. H GSSG μπορεί να αναχθεί πάλι σε GSH από την αναγωγάση της γλουταθειόνης. Η καλύτερη αντιοξειδωτική άμυνα εναντίον των ΕΡΟ επιτυγχάνεται με τη συνεργική δράση όλων των ενδοκυττάριων και εξωκυττάριων αντιοξειδωτικών συστημάτων του οργανισμού και έτσι ελαχιστοποιείται η επίδραση των ΕΡΟ στα βιολογικά μόρια των κυττάρων (52). Η αντιοξειδωτική άμυνα εξαρτάται άμεσα από την επάρκεια των αντιοξειδωτικών συστημάτων. Σε βαρέως πάσχοντες, σε καταβολικές καταστάσεις, τα αντιοξειδωτικά συστήματα δεν επαρκούν. Η γλουταμίνη, βασικό αμινοξύ για τη σύνθεση γλουταθειόνης, παρά τις μεγάλες αποθηκευμένες ποσότητες στους μύς, γρήγορα ανεπαρκεί λόγω των μεγάλων αναγκών χρήσης της στα ταχέως πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα (39). Τα αντιοξειδωτικά συστήματα δεν επαρκούν λόγω αυξημένων αναγκών σε οξειδωτικό stress, αυξημένων απωλειών στους ασθενείς των μονάδων εντατικής θεραπείας και ανεπαρκούς πρόσληψης σε ασθενείς που δεν σιτίζονται. Θεωρείται ότι όσο βαρύτερη είναι η κλινική κατάσταση ενός ασθενούς, τόσο μεγαλύτερη η έλλειψη αντιοξειδωτικών και συνεπώς τόσο μεγαλύτερο και το οξειδωτικό stress (63, 64). Πηγές παραγωγής ελεύθερων ριζών οξυγόνου Οι πηγές παραγωγής ΕΡΟ είναι ενδογενείς ή εξωγενείς. 1) Σημαντικότερη ενδογενής πηγή είναι τα φαγοκύτταρα, και ειδικότερα το κυτταρόπλασμα, τα μιτοχόνδρια, το ενδοπλασματικό δίκτυο, ο πυρήνας και η κυτταρική μεμβράνη αυτών. Υπάρχουν και άλλες ενδογενείς πηγές όπως τα ηπατικά κύτταρα και τα κύτταρα του Kupffer. Ο σπουδαιότερος μηχανισμός παραγωγής ΕΡΟ είναι η αναπνευστική έκρηξη (respiratory burst), δηλαδή η αύξηση της αναπνευστικής λειτουργίας του κυττάρου, όταν αυτό δεχθεί ερεθίσματα (π.χ. φλεγμονή) και η χρησιμοποίηση του προσλαμβανόμενου Ο2 αποκλειστικά για την παραγωγή ΕΡΟ. Σημαντικό ρόλο παίζουν επίσης τα μέταλλα μετάβασης όπως ο σίδηρος και ο χαλκός (65). 2) Εξωγενείς πηγές παραγωγής ΕΡΟ είναι οι ιονίζουσες ακτινοβολίες, το φως, οι ατμοσφαιρικοί ρύποι, τα αέρια καύσης οργανικής ύλης, ο καπνός και ορισμένα φάρμακα, όπως η στρεπτομυκίνη, η αδριαμυκίνη κ.α. Η επίδραση των ελεύθερων ριζών Ο2 στους ιστούς οφείλεται στην αντίδραση τους με τις πρωτεΐνες, τους υδατάνθρακες, τα λιπίδια και το DNA των ιστών. Επίσης και αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό, οι ΕΡΟ, όπως και η

19 ενδοτοξίνη, προκαλούν την απελευθέρωση κυτοκινών, γεγονός που μπορεί να προκαλέσει φλεγμονώδη καταρράκτη, δηλαδή γενικευμένη φλεγμονώδη αντίδραση και νέα ποσότητα αντιοξειδωτικών ουσιών (25, 52). Η επίδραση των ΕΡΟ στις πρωτεΐνες προκαλεί καταστροφή των αμινοξέων τους, συσσωμάτωσή τους και διάσπασή τους σε συγκεκριμένες θέσεις, που συνήθως οδηγούν σε καταστροφή της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής τους και τελικά σε μετουσίωσή τους. Συχνά η καταστροφή των πρωτεϊνών γίνεται έμμεσα με απελευθέρωση ή ενεργοποίηση ενζύμων, που καταλύουν το σχηματισμό άλλων οξειδωτικών ουσιών ή προκαλούν πρωτεόλυση (66). Οι ΕΡΟ προκαλούν επίσης κατ αρχήν αποπολυμερισμό των πολυμερισμένων υδατανθράκων, όπως είναι οι όξινοι πολυσακχαρίτες. Οι αποπολυμερισμένοι πολυσακχαρίτες είναι εξαιρετικά ευπρόσβλητοι από ένζυμα, που τους διασπούν σε ολιγοσακχαρίτες ή απλά σάκχαρα (25, 55). Η επίδραση των ΕΡΟ στα λιπίδια είναι από τις πιο καλά μελετημένες. Η επίθεση των ΕΡΟ στα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα των λιπιδίων των κυτταρικών μεμβρανών προκαλεί το σχηματισμό μιας ρίζας λιπαρού οξέος (LOO. ). Η προκαλούμενη βλάβη της κυτταρικής μεμβράνης συνεπάγεται κυτταρικό οίδημα, συνεπεία της κατάργησης των αντλιών νατρίου-καλίου (Na/K ATPase) και ασβεστίου (Ca-ATPase). Λόγω της κατάργησης των αντλιών οι συγκεντρώσεις των ιόντων μέσα και έξω από τα κύτταρα δεν ρυθμίζονται πλέον. Πολλά ένζυμα χάνουν την δραστικότητα τους και εξασθενεί η καταλυτική τους δράση. Η μεμβράνη χάνει τη συνοχή της, λόγω μείωσης των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων, που έχουν μεγαλύτερη ρευστότητα από τα μονοακόρεστα και τα κορεσμένα. Τέλος έχουμε λύση της συνέχειας της μεμβράνης με κίνδυνο την αρχή της πρόωρης γήρανσης και νέκρωσης του κυττάρου (58). Η επίδραση των ΕΡΟ στη μιτοχονδριακή μεμβράνη προκαλεί πέραν του οιδήματος και κατάργηση της λειτουργίας της αναπνευστικής αλύσου, δηλαδή αναστολή παραγωγής ενέργειας και ενεργειακή κρίση του κυττάρου (25). Τέλος βλάβη της μεμβράνης των λυσοσωματίων σημαίνει έκχυση υδρολασών στο κυττοδιάλυμα και καταστροφή του κυττάρου. Οι ΕΡΟ προκαλούν υδροξυλίωση των αζωτούχων βάσεων πουρίνης, πυριμιδίνης του DNA, που συνεπάγεται ρήξη του μορίου και μετάλλαξη, με αποτέλεσμα διαταραχή του συστήματος πληροφοριών του κυττάρου και μακροπρόθεσμα την ανάπτυξη κακοήθειας (25, 54). ΕΡΟ και γενικευμένη φλεγμονώδης αντίδραση. Οι ΕΡΟ τέλος ενεργοποιούν τα μακροφάγα του ήπατος (κύτταρα Kupffer), τα οποία απελευθερώνουν φλεγμονώδεις κυτοκίνες (TNF, IL-1,

20 IL-6). Αυτοί οι διαμεσολαβητές προκαλούν ενεργοποίηση και είσοδο φλεγμονωδών κυττάρων (μονοκυττάρων και λευκοκυττάρων) στους ιστούς, προκαλώντας ιστική βλάβη. Στη συνέχεια τα κύτταρα του Kupffer απελευθερώνουν με τη σειρά τους μεγάλες ποσότητες ΕΡΟ, με αποτέλεσμα έναν φαύλο κύκλο (25). 15-F2t-Ισοπροστάνιο (15- F2t-IsoP) Υπάρχουν 64 ισομερή ισοπροστάνια με ένα από αυτά, το 15-F2tισοπροστάνιο (15- F2t-IsoP), να έχει σαφή βιολογική δράση. Τα ισοπροστάνια ανακαλύφτηκαν το 1990 από την ομάδα του Morrow και είναι μια οικογένεια εικοσανοειδών μη ενζυματικής προέλευσης, που προέρχονται από την οξείδωση των φωσφολιπιδίων των ιστών από τις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου (ΕΡΟ) (67). Το 15-F2t-ισοπροστάνιο είναι πολύ σταθερό βιομόριο και ανιχνεύεται σε όλους τους ανθρώπινους ιστούς και βιολογικά υγρά, συμπεριλαμβανομένων του πλάσματος, των ούρων, του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, του εγκεφαλονωτιαίου υγρού, του μεσοκυττάριου υγρού των μυών και της χολής (67, 68). Ο δραστικός αυτός παράγων παράγεται από την υπεροξείδωση του ενωμένου με φωσφολιπίδια αραχιδονικού οξέος, μέσω των ελεύθερων ριζών οξυγόνου, ανεξάρτητα από την οδό της κυκλοοξυγενάσης (σχήμα 1). Σχήμα 1: Η σύνθεση του 15-F2t-ισοπροστανίου Φωσφολιπίδια ΕΡΟ Πέροξυ φωσφολιπίδια Ένδο πέροξυ φωσφολιπίδια κυτταρικές περοξυδάσες Φωσφολιπίδιο ισοπροστάνιο φωσφολιπάση Α 15-F2t-ισοπροστάνιο (15- F2t-IsoP)

21 Το 15- F2t-IsoP είναι ισχυρό αγγειοσυσπαστικό των πνευμονικών και νεφρικών αγγείων και ενοχοποιείται ως αιτιολογικός μεσολαβητής του ηπατονεφρικού συνδρόμου. Επιπροσθέτως είναι ασθενής αγωνιστής των TP υποδοχέων των λείων μυϊκών ινών των αγγείων και προκαλεί συνεργικά με το θρομβοξάνιο προσκόλληση και συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Το 15- F2t-IsoP έχει προταθεί ως δείκτης της λιπιδικής υπεροξείδωσης και του οξειδωτικού stress. Το 15- F2t-IsoP βρίσκεται στο πλάσμα σε 2 ξεχωριστές μορφές: ως εστέρας σε LDL φωσφολιπίδια και ως ελεύθερο οξύ. Η αναλογία των δύο μορφών είναι περίπου 2:1. Οι τιμές των επιπέδων και των δύο μορφών σε υγιείς ενήλικες είναι περίπου 150 pg/ml. Τα επίπεδα του 15- F2t-IsoP αυξάνουν με την ηλικία, όπως και σε ασθενείς σε οξειδωτικό stress. Αυξημένα επίπεδα 15- F2t-IsoP στο πλάσμα ή τα ούρα αναφέρονται σε διάφορες παθήσεις όπως στην αλκοολική νόσο του ήπατος, το ηπατονεφρικό σύνδρομο, την οξεία χολόσταση, τη βλάβη ισχιαιμίας επαναιμάτωσης, το σακχαρώδη διαβήτη, τη χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια, το αλλεργικό άσθμα, το σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας των ενηλίκων (ARDS), τη νόσο Alzheimer, τη χορεία του Hundington, το κάπνισμα, την αθηροσκλήρυνση, την υπερχοληστεριναιμία, την παχυσαρκία, το διαβήτη, την υπέρταση, τη νεφρική ανεπάρκεια, την υπερομοκυστεϊναιμία, σε αυτοάνοσα νοσήματα και σε πολλές πειραματικές ηπατικές βλάβες, όπως στην CCl4 ηπατοτοξικότητα, τη δηλητηρίαση από οργανοφωσφορικά, την τοξική βλάβη από αλοθάνιο και ακεταμινοφαίνη (67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74). Επειδή το 15- F2t-IsoP απελευθερώνεται στην κυκλοφορία και είναι σταθερότερο από άλλα προϊόντα υπεροξείδωσης των λιπών, όπως τα λιποϋπεροξείδια και οι διαλδεϋδες, δύναται να ανιχνευθεί ευκολότερα στο αίμα, τα ούρα, σε άλλα βιολογικά υγρά ή ιστούς, τα επίπεδά του δε είναι αντιπροσωπευτικά της ενδογενούς παραγωγής. Για τους λόγους αυτούς το 15- F2t-IsoP σήμερα θεωρείται ο πιο ακριβής και αξιόπιστος δείκτης μέτρησης της λιπιδικής υπεροξείδωσης και του οξειδωτικού stress σε ασθενείς με διάφορες παθολογικές καταστάσεις. Αυτό καταδείχτηκε σε πολυκεντρικές μελέτες αξιολόγησης, που διενεργήθηκαν με σκοπό την αξιολόγηση των μη επεμβατικών μεθόδων μέτρησης του οξειδωτικού stress (67, 70, 75). Έχουν καθοριστεί τα φυσιολογικά επίπεδα του 15- F2t-IsoP σε υγιείς ενήλικες (67, 68). Αυτό είναι σημαντικό διότι επιτρέπει τον υπολογισμό της επίδρασης παθολογικών καταστάσεων στο οξειδωτικό stress και επιπροσθέτως την απάντηση στη θεραπευτική αγωγή. Η διακοπή του καπνίσματος, η απώλεια βάρους, η αντιμετώπιση του σακχαρώδη διαβήτη, η θεραπεία διάφορων ρευματοπαθειών σημειώθηκε να

22 ελαττώνουν την παραγωγή του 15- F2t-IsoP (67). Η κλινικοεργαστηριακή σημασία του 15- F2t-IsoP είναι πολύ μεγάλη και το σχετικό ενδιαφέρον συνεχώς μεγαλώνει. Η μέτρηση του 15- F2t-IsoP μπορεί να γίνει με αέρια χρωματογραφία, με υγρή χρωματογραφία και με ανοσολογικές μεθόδους (ELISA). Τα πλεονεκτήματα της αέριας χρωματογραφίας είναι η υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα, στα επίπεδα των picograms. Τα μειονεκτήματά της είναι η τεχνική της δυσκολία και ο ακριβός εργαστηριακός εξοπλισμός. Αν και η αέρια χρωματογραφία θεωρείται μέθοδος αναφοράς, οι ανοσολογικές μέθοδοι (ELISA) είναι πιο διαδεδομένες σήμερα, έχουν χαμηλό κόστος, ευκολία στη χρήση, παρουσιάζουν πολύ καλή ευαισθησία και ειδικότητα και έχουν δοκιμαστεί και στο εργαστήριό μας (67, 68, 71, 72, 73, 74). 5. ΓΛΟΥΤΑΜΙΝΗ Η γλουταμίνη είναι αμινοξύ που βρίσκεται σε μεγάλη ποσότητα στον οργανισμό. Στους γραμμωτούς μυς αποτελεί περισσότερο από 60% των συνολικών αμινοξέων. Είναι δυνατή η σύνθεσή της στο σώμα, κυρίως στους γραμμωτούς μυς και γι αυτό θεωρείται μη απαραίτητο αμινοξύ (39, 76). Αποτελεί μεταβολικό καύσιμο για γρήγορα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα (παρέχει ATP), όπως τα εντεροκύτταρα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα κύτταρα των νεφρικών σωληναρίων και τα ανοσοκύτταρα και είναι πρόδρομος για τη βιοσύνθεση πεπτιδίων και πρωτεϊνών, γλουταθειόνης και νουκλεοτιδίων (39, 61, 76, 77, 78, 79). Στο φυσιολογικό μεταβολισμό η σύνθεση και η κατανάλωση γλουταμίνης είναι ισορροπημένη. Σε καταστάσεις όμως stress (απάντηση σε τραύμα ή εγχείρηση), η γλουταμίνη βγαίνει από τους μυς και χρησιμοποιείται από το έντερο και το ανοσοποιητικό σύστημα. Η γλουταμίνη είναι η κύρια και προτιμώμενη ενεργειακή πηγή των εντεροκυττάρων, των ανοσοκυττάρων και των κυττάρων του ήπατος (39, 61, 80). Σε ειδικές περιπτώσεις η γλουταμίνη θεωρείται δυνητικά απαραίτητο αμινοξύ, μια και η ενδογενής σύνθεση δεν μπορεί να αντισταθμίσει τις αυξημένες ανάγκες (7, 39, 61, 76, 77). Χαμηλές συγκεντρώσεις της γλουταμίνης στο πλάσμα αντανακλούν ελάττωση της στον οργανισμό, φαινόμενο σχετικό με βλάβη του ανοσοποιητικού συστήματος, με αυξημένη νοσηρότητα και θνητότητα (39). Αντίθετα φυσιολογικές συγκεντρώσεις γλουταμίνης στο πλάσμα μπορεί να συσχετίζονται με σοβαρή ενδοκυττάρια έλλειψη (77). Τα τρία σημεία δράσης της γλουταμίνης στο ανοσοποιητικό σύστημα είναι ο εντερικός φραγμός, η συστηματική φλεγμονώδης αντίδραση και η κυτταρική ανοσία. Εντερικός φραγμός. Η πρώιμη εντερική διατροφή και ειδικά η πρώιμη

23 χορήγηση γλουταμίνης διατηρεί τον εντερικό φραγμό και αποτρέπει τη βακτηριδιακή διαμετακίνηση. Η γλουταμίνη είναι το κύριο καύσιμο τόσο των εντεροκυττάρων, όσο και του σχετιζόμενου με το έντερο λεμφικού ιστού (GALT) (39, 76). Συστηματική Φλεγμονώδης Αντίδραση (ΣΦΑ). Η γλουταθειόνη είναι ένα τριπεπτίδιο που συντίθεται από γλουταμικό οξύ, κυστεΐνη και γλυκίνη. Συντίθεται ενδοκυττάρια σε όλα τα όργανα και κυρίως στο ήπαρ. Η γλουταμίνη είναι ειδικά απαραίτητη για τη σύνθεση γλουταθειόνης, γι αυτό και σε βαρέως πάσχοντες τα χαμηλά επίπεδα γλουταθειόνης συνδυάζονται με χαμηλά επίπεδα γλουταμίνης, αλλά φυσιολογικά επίπεδα κυστεΐνης και γλυκίνης (78, 79). Σε βαρέως πάσχοντες η γλουταθειόνη έχει σημαντικές λειτουργίες όπως διατήρηση των κυτταρικών μεμβρανών, σύνθεση πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων, μεταφορά αμινοξέων, διατήρηση ενεργών μορφών ενζύμων. Σημαντική δράση της γλουταθειόνης είναι ο ρόλος της ως αντιοξειδωτικός παράγοντας. Αποτελεί μέρος των ενζυμικών συστημάτων της οξειδάσης και της αναγωγάσης της γλουταθειόνης (53, 61, 62). Τέλος η γλουταμίνη αυξάνει τον πολλαπλασιασμό και τη δραστηριότητα των natural killers, την έκκριση κυτοκινών και τη φαγοκύτωση (80). 6. ΛΙΠΑΡΑ ΟΞΕΑ ΒΡΑΧΕΙΑΣ ΑΛΥΣΟΥ (ΛΟΒΑ) Τα λιπαρά οξέα βραχείας αλύσου (ΛΟΒΑ) όπως τα οξεικό (C2), προπιονικό (C3) και βουτυρικό (C4), είναι τα τελικά προϊόντα της ζύμωσης των διαιτητικών ινών. Σε μεγαλύτερη ποσότητα παράγεται το οξεικό οξύ, η αναλογία τους δε εξαρτάται από το είδος των διαιτητικών ινών και την εντερική χλωρίδα (81, 82). Το παραγόμενο βουτυρικό χρησιμοποιείται σχεδόν αποκλειστικά σαν πηγή ενέργειας από τα επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου (83, 84, 85. Αντίθετα τα επιθηλιακά κύτταρα του λεπτού εντέρου χρησιμοποιούν κυρίως γλουταμίνη και κετονοσώματα (82). Το παραγόμενο προπιονικό χρησιμοποιείται περίπου εξ ημισείας από τα κύτταρα του κόλου και από το ήπαρ, όπου με νεογλυκογένεση παράγονται κυρίως γλουταμίνη και κετονοσώματα. Το οξεικό μετατρέπεται σχεδόν πλήρως σε λιπαρά οξέα μέσης αλύσου και κετόνες στο ήπαρ. Συνολικά 60-70% των ενεργειακών απαιτήσεων των κυττάρων του κόλου εξασφαλίζεται από τα ΛΟΒΑ του εντερικού αυλού άμεσα, παρά από την κυκλοφορία. Το βουτυρικό οξύ έχει τροφική επίδραση στα επιθηλιακά κύτταρα τόσο του λεπτού όσο και του παχέος εντέρου, ενώ το οξεικό οξύ έχει τροφική επίδραση μόνο στα κύτταρα του κόλου. Τροφική επίδραση στα κύτταρα του κόλου έχει κυρίως το βουτυρικό και το προπιονικό και λιγότερο το οξικό οξύ. Το 5-10% των ενεργειακών απαιτήσεων προσφέρεται από τα ΛΟΒΑ, ποσοστό