ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Ο ρόλος του οξειδωτικού stress στην έναρξη της αθηρωμάτωσης. Αλληλεπιδράσεις μονοκυττάρων και ενδοθηλιακών κυττάρων με μόρια εξωκυττάριας ουσίας ΕΛΕΝΗ Α. ΚΩΣΤΙΔΟΥ Βιοχημικός-Βιοτεχνολόγος Θεσσαλονίκη 2009

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Ο ρόλος του οξειδωτικού stress στην έναρξη της αθηρωμάτωσης. Αλληλεπιδράσεις μονοκυττάρων και ενδοθηλιακών κυττάρων με μόρια εξωκυττάριας ουσίας ΕΛΕΝΗ Α. ΚΩΣΤΙΔΟΥ Βιοχημικός-Βιοτεχνολόγος Θεσσαλονίκη 2009

3 ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF SCIENCE SCHOOL OF BIOLOGY DOCTORATE THESIS The role of oxidative stress at the early stages of atheromatosis. Interactions between monocytes and endothelial cells with extracellular matrix molecules. ELENI Α. KOSTIDOU Biochemist-Biotechnologist Thessaloniki 2009

4 Το έργο συγχρηματοδοτήθηκε 75% της Δημόσιας Δαπάνης από την Ευρωπαϊκή Ενωση Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο 25% της Δημόσιας Δαπάνης από το Ελληνικό Δημόσιο Υπουργείο Ανάπτυξης Γενική Γραμματεία Ερευνας και Τεχνολογίας και από τον Ιδιωτικό Τομέα στο πλαίσιο του Μέτρου 8.3 του Ε.Π. Ανταγωνιστικότητα Γ Κοινοτικό Πλαίσιο Στήριξης.

5 Επιβλέπων Καθηγητής Μάρθα Καλογιάννη-Δημητριάδη (Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ) Συμβουλευτική Επιτροπή Μάρθα Καλογιάννη-Δημητριάδη (Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ) Γεώργιος Κολιάκος (Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Ιατρικής Α.Π.Θ) Γεώργιος Θεοφιλίδης (Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ) Εξεταστική Επιτροπή Μάρθα Καλογιάννη-Δημητριάδη (Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ) Γεώργιος Κολιάκος (Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Ιατρικής Α.Π.Θ) Γεώργιος Θεοφιλίδης (Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ) Νόρμα Βαβάτση-Χρηστάκη (Καθηγήτρια Τμήματος Ιατρικής Α.Π.Θ) Κωνσταντίνος Παλέτας (Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Ιατρικής Α.Π.Θ) Αθανάσιος Παπαδόπουλος (Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ) Βασίλειος Μιχαηλίδης (Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ)

6 Η έγκριση της Διδακτορικής Διατριβής από το τμήμα Βιολογίας της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των απόψεων του συγγραφέα Ν. 5343/1932, άρθρο 202

7 στην οικογένειά μου

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...1 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΧΗΜΙΚΩΝ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΟΡΩΝ...5 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α. ΑΘΗΡΩΜΑΤΩΣΗ Ορισμός Παθοφυσιολογία-Παθογένεια Δυσλειτουργία του ενδοθηλίου Μετανάστευση μονοκυττάρων υπενδοθηλιακά και διαφοροποίησή τους σε μακροφάγα...11 «Κυκλική μετακίνηση» και ακινητοποίηση των μονοκυττάρων στο ενδοθήλιο...15 Πόλωση και μετανάστευση των μονοκυττάρων διαμέσου του ενδοθηλίου Κατακράτηση LDL υπενδοθηλιακά, οξείδωση, φαγοκυττάρωση της LDL από τα μακροφάγα και σχηματισμός αφρωδών κυττάρων Μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων υπενδοθηλιακά Νέκρωση υπερκορεσμένων αφρωδών κυττάρων, ελευθέρωση οξειδωμένης LDL, βλάβη του ενδοθηλίου και προσκόλληση και συνάθροιση αιμοπεταλίων Αθηρωματική βλάβη...21 Β. ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ-ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΑΣ ΟΥΣΙΑΣ ΚΑΙ ΑΘΗΡΩΜΑΤΩΣΗ Μόρια της κυτταρικής επιφάνειας...22 Σελεκτίνες...22 Ιντεγκρίνες...23 Δομικά χαρακτηριστικά...25 Οι ιντεγκρίνες των λευκοκυττάρων (β2 ιντεγκρίνες)...27 α2β1 ιντεγκρίνη...29 Ενεργές περιοχές των προσδεμάτων των ιντεγκρινών...30 Υπερ-οικογένεια ανοσοσφαιρινών...31 ICAM Δομή και γενικά χαρακτηριστικά...33 Ρύθμιση...33 Λειτουργία Μόρια της εξωκυττάριας ουσίας (ECM)-Βασικές μεμβράνες (ΒΜ)...36 Λαμινίνες-Λαμινίνη Γενικά...38 Δομή και ισομορφές...39 Κολλαγόνο IV...42 Γενικά...42

9 Δομικά χαρακτηριστικά και υπερ-μοριακή οργάνωση...42 Αλληλεπιδράσεις με υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας...43 Νιδωγόνα-Εντακτίνες...45 Περλεκάνη...46 Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας...46 Οξείδωση...46 Καρβονυλίωση...48 Μεθυλ-γλυοξάλη (MGO) Κυτταρική σηματοδότηση και σηματοδοτικά μόρια που συμμετέχουν στην αθηρωμάτωση...50 Πρωτεινική κινάση C (PKC) κινάσες του φωσφοϊνοσιτιδίου ή 3-κινάσες της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (ΡΙ3Κs)...52 Ιόντα ασβεστίου (Ca2+)...54 Ανταλλάκτης ιόντων Να+/Η+, ΝΗΕ Λειτουργία...56 Ρύθμιση του ΝΗΕ-1 από συμπαράγοντες και πρωτεΐνες σύνδεσης...56 Αναστολή του ΝΗΕ Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις και ρύθμιση...58 Heat shock protein 70 (Hsp70)...59 Γλουταθειόνη-Γλουταθειονυλίωση...61 Γ. ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΟΙ ΕΠΙΒΑΡΥΝΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΑΘΗΡΩΜΑΤΩΣΗΣ...63 Οξειδωτικό stress...63 Ορισμός...63 Δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS)...63 Ορισμός...63 Ανιόν σουπεροξειδίου (Ο2-)...64 Υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2O2)...64 Υπεροξειδική ρίζα (ROO.)...65 Υδροξυλική ρίζα (ΟΗ.)...65 Υποχλωριώδες οξύ...65 Μονοξείδιο του αζώτου...66 Πηγές παραγωγής δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS)...66 NADPH οξειδάση...66 Αναπνευστική αλυσίδα...67 Μυελοπεροξειδάση (ΜΡΟ)...68 Οξειδάση της ξανθίνης...68 Συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ)...68 Λιποοξυγενάσες...69 Μεταβατικά μέταλλα...69 Ο ρόλος του οξειδωτικού stress στην αθηρωμάτωση...70

10 Γλυκόζη...71 Γενικά χαρακτηριστικά...71 Υπεργλυκαιμία-ρόλος στην αθηρωμάτωση...71 Τελικά προϊόντα γλυκοζυλίωσης (AGEs)...72 Οξειδωτικό stress...72 Πρωτεϊνική κινάση C (PKC)...73 Γλυκόζη και μεταβίβαση σήματος στην αθηρωμάτωση...73 Ινσουλίνη...74 Ινσουλίνη και μεταβίβαση σήματος...74 Υπερινσουλιναιμία-αντίσταση στην ινσουλίνη-αθηρωμάτωση...76 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ...78 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1. ΑΤΟΜΑ ΠΟΥ ΣΥΜΜΕΤΕΙΧΑΝ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΟΛΙΚΟ ΑΙΜΑ Κατάψυξη μονοκυττάρων και φύλαξή τους στο υγρό άζωτο Απόψυξη κυττάρων που είχαν φυλαχτεί στο υγρό άζωτο ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΟΛΙΚΟ ΑΙΜΑ ΚΑΙ ΕΠΙΣΗΜΑΝΣΗ ΤΟΥΣ ΜΕ 35S-μεθειονίνη ΕΠΑΓΩΓΕΙΣ ΚΑΙ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΟΞΥΓΟΝΟΥ (ROS) Προσδιορισμός ανιόντων σουπεροξειδίου (Ο2-) με τη χρήση του ανιχνευτή nitronitroblue tetrazolium Προσδιορισμός ανιόντων σουπεροξειδίου (Ο2-) με τη χρήση της ουσίας διϋδροαιθίδιο (dihydroethidium, DHE) Προσδιορισμός υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) με τη χρήση της ουσίας DCFH-DA Προσδιορισμός υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) με τη χρήση της ουσίας dihydrorhodamine 123 (DHR) ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 ΚΑΙ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ IV ΑΠΟ ΣΑΡΚΩΜΑ Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Απομόνωση λαμινίνης Μέτρηση της συνολικής ποσότητας της πρωτεΐνης με τη χρήση Coomasie Plus-200 (Bradford solution)...92 Προσδιορισμός της καθαρότητας της λαμινίνης με ηλεκτροφόρηση...93 Εμφάνιση film με τη χρήση της χρώσης Silver (Silver staining) Απομόνωση κολλαγόνου IV...94 Μέτρηση της συνολικής ποσότητας του κολλαγόνου IV ΚΑΡΒΟΝΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 ΑΠΟ ΤΑ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΜΕ ΑΝΟΣΟΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΧΡΗΣΗ ΑΝΤΙ-ΔΙΝΙΤΡΟΦΑΥΝΥΛ-ΥΔΡΑΖΙΝΗΣ...96

11 7.1 Προετοιμασία δειγμάτων Ανοσοανίχνευση για την καρβονυλίωση της λαμινίνης-1 από τα μονοκύτταρα ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΚΑΡΒΟΝΥΛΙΩΣΗΣ ΤΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 ΚΑΙ ΤΟΥ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ IV ΑΠΟ ΤΑ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Προετοιμασία δειγμάτων Παρασκευή πρότυπων δειγμάτων αλβουμίνης (BSA) και κατασκευή πρότυπης καμπύλης...98 Διαδικασία οξείδωσης της BSA...98 Διαδικασία αναγωγής της BSA...98 Παρασκευή πρότυπων δειγμάτων BSA Ποσοτική εκτίμηση του βαθμού καρβονυλίωσης της λαμινίνης-1 και του κολλαγόνου IV Φασματομετρική μέθοδος για τον προσδιορισμό καρβονυλικών ομάδων (Colorimetric carbonyl assay) ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΔΙΣΜΟΥΤΑΣΗΣ ΤΟΥ ΣΟΥΠΕΡΟΞΕΙΔΙΟΥ (SOD) ΣΕ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων SOD για την κατασκευή πρότυπης καμπύλης Προετοιμασία δειγμάτων Μέτρηση δραστικότητας της SOD σε μονοκύτταρα ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΙΟΝΤΩΝ ΑΣΒΕΣΤΙΟΥ ΣΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ph (phi) ΣΕ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ NADPH ΟΞΕΙΔΑΣΗΣ ΣΕ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΝΟΣΟΚΑΘΙΖΗΣΗ ΤΟΥ ΝΗΕ-1 ΣΕ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΟ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΟΚΟΥ ΤΟΥ ΝΗΕ-1 ΜΕ ΤΗΝ HSP Προετοιμασία δειγμάτων Κάθαρση του κυτταρολύματος Ανοσοκαθίζηση του ΝΗΕ-1 και της HSP-70 σε μονοκύτταρα Ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων Ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών από την πηκτή σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (blotting) και ανίχνευση του ΝΗΕ-1, της HSP-70 και των γλουταθειονυλιωμένων πρωτεϊνών ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 ΚΑΙ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ IV. ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΩΝ ALPHA2, ALPHAL, ALPHAM ΚΑΙ BETA2 ΥΠΟΜΟΝΑΔΩΝ ΤΗΣ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΗΣ ΣΤΑ ΠΑΡΑΠΑΝΩ ΦΑΙΝΟΜΕΝΑ Οξείδωση λαμινίνης-1 και κολλαγόνου IV...110

12 14.2 Επώαση μονοκυττάρων με τα αντισώματα για τις alpha2 (α2) alphal (αl), alpham (αm ) και beta2 (β2) υπομονάδες της ιντεγκρίνης Προσκόλληση επισημασμένων με 35S-μεθειονίνη μονοκυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης Προσκόλληση μονοκυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη λαμινίνης και κολλαγόνου IV με τη μέθοδο της μυελοπεροξειδάσης (ΜΡΟ) Παρασκευή κυμαινόμενου βαθμού οξείδωσης λαμινίνης-1 και οξειδωμένης BSA ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΜΥΕΛΟΠΕΡΟΞΕΙΔΑΣΗΣ ΣΕ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΠΟΥ ΠΡΟΗΛΘΑΝ ΑΠΟ ΥΓΙΕΙΣ ΔΟΤΕΣ Ή ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΣΑΚΧΑΡΩΔΗ ΔΙΑΒΗΤΗ ΤΥΠΟΥ ΙΙ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΚΑΡΒΟΝΥΛΙΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΚΑΡΒΟΝΥΛΙΩΜΕΝΗΣ ΑΠΟ MGO ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ Καρβονυλίωση λαμινίνης Εκτίμηση του βαθμού προσκόλλησης των μονοκυττάρων σε υπόστρωμα καρβονυλιωμένης και μη καρβονυλιωμένης λαμινίνης-1 με προσδιορισμό της δραστικότητας του ενζύμου μυελοπεροξειδάση (ΜΡΟ) Εκτίμηση του βαθμού προσκόλλησης των μονοκυττάρων σε υπόστρωμα καρβονυλιωμένης και μη καρβονυλιωμένης λαμινίνης-1 με τη χρήση του Hemacolor kit Εκτίμηση του βαθμού προσκόλλησης των μονοκυττάρων σε υπόστρωμα καρβονυλιωμένης και μη καρβονυλιωμένης λαμινίνης-1 με τη χρώση crystal violet ΜΕΤΑΝΑΣΤΕΥΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΔΙΑΜΕΣΟΥ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 ΚΑΙ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ IV ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΤΗΣ ΑLPHA2 ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ ΤΗΣ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΤΩΝ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Αποκόλληση ενδοθηλιακών κυττάρων σε φιάλες κυτταρικής καλλιέργειας Κατάψυξη και απόψυξη ενδοθηλιακών κυττάρων ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΜΟΡΙΟΥ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗΣ ICAM-1 ΣΤΗΝ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΘΕΙ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΘΕΙ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ...125

13 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΟΞΥΓΟΝΟΥ (ROS) ΑΠΟ ΤΑ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΕΠΕΙΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΤΟΥΣ ΣΕ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΑΘΗΡΩΜΑΤΩΣΗ Παραγωγή ανιόντων σουπεροξειδίου (Ο2-) από τα μονοκύτταρα παρουσία γλυκόζης, ινσουλίνης και γνωστών οξειδωτικών ουσιών Παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) από τα μονοκύτταρα παρουσία γλυκόζης, ινσουλίνης και γνωστών οξειδωτικών ουσιών Παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) από τα μονοκύτταρα υγιών δοτών και ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 ΚΑΙ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ IV ΑΠΟ ΣΑΡΚΩΜΑ Engelbreth- Holm- Swarm (EHS) ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΚΑΡΒΟΝΥΛΙΩΣΗΣ ΤΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 ΑΠΟ ΤΑ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΚΑΡΒΟΝΥΛΙΩΣΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ ΑΠΟ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΑΘΗΡΩΜΑΤΩΣΗ Φασματομετρική μέθοδος για τον προσδιορισμό καρβονυλικών ομάδων (Colorimetric carbonyl assay) Καρβονυλίωση λαμινίνης-1 από τα μονοκύτταρα παρουσία γλυκόζης, ινσουλίνης και γνωστών οξειδωτικών ουσιών Καρβονυλίωση κολλαγόνου- IV από τα μονοκύτταρα παρουσία γλυκόζης, ινσουλίνης και γνωστών οξειδωτικών ουσιών Καρβονυλίωση λαμινίνης-1 από τα μονοκύτταρα υγιών δοτών και ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ Σύγκριση του βαθμού καρβονυλίωσης της λαμινίνης-1 που προκαλείται από το σύστημα ασκορβικό οξύ/fe2+, με το βαθμό καρβονυλίωσης που προκαλείται από τα μονοκύτταρα ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΔΙΣΜΟΥΤΑΣΗΣ ΤΟΥ ΣΟΥΠΕΡΟΞΕΙΔΙΟΥ (SOD) ΣΕ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΙΟΝΤΩΝ ΑΣΒΕΣΤΙΟΥ ΣΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΓΛΥΚΟΖΗΣ, ΙΝΣΟΥΛΙΝΗΣ ΚΑΙ ΓΝΩΣΤΩΝ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΛΛΑΓΩΝ ΤΟΥ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ph (phi) ΣΕ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΕΠΕΙΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΤΟΥΣ ΣΕ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΚΑΙ ΣΤΟ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ NAC ΜΕΤΡΗΣΗ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ NADPH ΟΞΕΙΔΑΣΗΣ ΣΕ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΛΛΑΓΩΝ ΤΟΥ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ph (phi) ΣΕ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΕΠΕΙΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΤΟΥΣ ΣΕ ΓΛΥΚΟΖΗ ΚΑΙ ΙΝΣΟΥΛΙΝΗ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΑΙ ΜΗ ΤΟΥ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ ΤΗΣ NADPH ΟΞΕΙΔΑΣΗΣ...165

14 10. ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΟΚΟΥ ΤΟΥ ΝΗΕ-1 ΜΕ ΤΗΝ HSP-70 ΥΠΟ ΤΗΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΟ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ ΚΑΙ ΤΗΝ ΑΘΗΡΩΜΑΤΩΣΗ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1. ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΩΝ ALPHA2 (CD49b), ALPHAL (CD11a), ALPHAM (CD11b) ΚΑΙ BETA2 (CD18) ΥΠΟΜΟΝΑΔΩΝ ΤΗΣ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΗΣ ΣΤΑ ΠΑΡΑΠΑΝΩ ΦΑΙΝΟΜΕΝΑ Προσκόλληση επισημασμένων με 35S-μεθειονίνη μονοκυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης Προσκόλληση επισημασμένων με 35S-μεθειονίνη μονοκυττάρων σε διαφορετικού βαθμού οξειδωμένη λαμινίνη-1 και οξειδωμένη BSA Επώαση επισημασμένων με 35S-μεθειονίνη μονοκυττάρων με το αντίσωμα για την alpha2 (α2, CD49b) υπομονάδα της ιντεγκρίνης και μελέτη της προσκόλλησής τους σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης Επώαση μονοκυττάρων με τα αντισώματα για τις alphal (αl, CD11a), alpham (αm, CD11b) και beta2 (β2, CD18) υπομονάδες της ιντεγκρίνης και μελέτη της προσκόλλησής τους σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΟΥ ΚΑΙ ΜΗ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΟΥ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ IV. ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ALPHA2 ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ ΤΗΣ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΗΣ ΣΤΑ ΠΑΡΑΠΑΝΩ ΦΑΙΝΟΜΕΝΑ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΤΩΝ ALPHA2 (CD49b), ALPHAL (CD11a), ALPHAM (CD11b) ΚΑΙ BETA2 (CD18) ΥΠΟΜΟΝΑΔΩΝ ΤΗΣ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΗΣ ΣΕ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΥΓΙΩΝ ΔΟΤΩΝ ΚΑΙ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΣΑΚΧΑΡΩΔΗ ΔΙΑΒΗΤΗ ΤΥΠΟΥ ΙΙ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΜΥΕΛΟΠΕΡΟΞΕΙΔΑΣΗΣ ΣΕ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΠΟΥ ΠΡΟΗΛΘΑΝ ΑΠΟ ΥΓΙΕΙΣ ΔΟΤΕΣ ΕΙΤΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΣΑΚΧΑΡΩΔΗ ΔΙΑΒΗΤΗ ΤΥΠΟΥ ΙΙ ΜΕΤΑΝΑΣΤΕΥΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΔΙΑΜΕΣΟΥ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 ΚΑΙ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ IV Μετανάστευση μονοκυττάρων διαμέσου υποστρώματος οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης Μετανάστευση μονοκυττάρων διαμέσου υποστρώματος οξειδωμένης και μη οξειδωμένου κολλαγόνου IV ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΚΑΡΒΟΝΥΛΙΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΚΑΡΒΟΝΥΛΙΩΜΕΝΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΤΗΣ ΑLPHA2 (CD49b) ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ ΤΗΣ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΤΩΝ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΕΠΕΙΤΑ ΑΠΟ ΕΠΩΑΣΗ ΜΕ ΥΨΗΛΕΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΙΣ ΓΛΥΚΟΖΗΣ ΚΑΙ ΙΝΣΟΥΛΙΝΗΣ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ

15 19. ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΜΟΡΙΟΥ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗΣ ICAM-1 ΣΤΗΝ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΘΕΙ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΘΕΙ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 1. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ROS ΑΠΟ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΚΑΙ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΜΕ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΤΑ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΚΑΙ ΤΗΝ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗ ΚΑΙ ΜΗ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗ ΛΑΜΙΝΙΝΗ-1. ΡΟΛΟΣ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΩΝ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΕΣ ΤΩΝ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΟΝ ΣΑΚΧΑΡΩΔΗ ΔΙΑΒΗΤΗ ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ROS ΑΠΟ ΤΑ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΕΡΓΑΣΙΩΝ

16 ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΠΡΟΛΟΓΟΣ Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής μελετήθηκε η επίδραση του οξειδωτικού stress στις αλληλεπιδράσεις των μονοκυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων με μόρια της εξωκυττάριας ουσίας καθώς και τα σηματοδοτικά μόρια που ενεργοποιούνται στα μονοκύτταρα έπειτα από επώασή τους με υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης και ινσουλίνης. Το μεγαλύτερο μέρος των πειραμάτων πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Βιολογικής Χημείας της Ιατρικής Σχολής. Ξεκινώντας λοιπόν την αναδρομή μου θα ήθελα να πω ένα μεγάλο ευχαριστώ στη Διευθύντρια κ. Νόρμα Βαβάτση-Χρηστάκη καθώς και σε όλα τα μέλη ΔΕΠ του εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας για τη θερμή φιλοξενία τους και την εμπιστοσύνη που μου έδειξαν όλα αυτά τα χρόνια. Από την πρώτη στιγμή με αγκάλιασαν και με θεώρησαν μέλος του εργαστηρίου, δημιουργώντας ένα όμορφο περιβάλλον που συνέβαλε στην επιτυχή ολοκλήρωση της διατριβής μου. Μετά από μια πορεία τεσσάρων ετών στο μαγικό χώρο της έρευνας, γεμάτη έντονα συναισθήματα, επιτυχίες, χαρές και λύπες να εναλλάσσονται, ατέλειωτες ώρες έρευνας, μελέτης και βιβλιογραφικής αναζήτησης, έφτασε λοιπόν και το τέλος της δικής μου διδακτορικής διατριβής. Από καιρό είχα αρχίσει να σκέφτομαι αυτή τη στιγμή.. Τη στιγμή όπου θα καλούμαι, τελειώνοντας τη διατριβή μου, να συνοψίσω τα χρόνια που πέρασαν και να αποτυπώσω τα συναισθήματά μου και τις σκέψεις μου για αυτά. Και τώρα, που βρίσκομαι τόσο κοντά στο τέλος της διαδρομής, που θέλω να πω τόσα πολλά, δε βγαίνει ούτε λέξη. Πώς να εκφράσω άλλωστε με λίγες λέξεις όλα αυτά τα συναισθήματα; Παρόλα αυτά όμως, νιώθω έντονα την ανάγκη να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στους ανθρώπους που πίστεψαν σε εμένα, με στήριξαν και με γέμιζαν με κουράγιο για την ολοκλήρωση αυτής της πορείας. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στην Καθηγήτρια του Τομέα Ζωολογίας Μάρθα Καλογιάννη-Δημητριάδη, που με εμπιστεύτηκε και μου ανάθεσε την εκπόνηση της παρούσας διατριβής στα πλαίσια του ερευνητικού προγράμματος ΠΕΝΕΔ Την ευχαριστώ για τις συμβουλές της και την αμέριστη υποστήριξή της όλον αυτό τον καιρό. Κυρίως όμως την ευχαριστώ γιατί ήταν πάντα δίπλα μου όχι μόνο ως καθηγήτρια, αλλά και ως άνθρωπος, πρόθυμη να με βοηθήσει κάθε στιγμή και να με στηρίξει όταν το άγχος και η πίεση με κυρίευαν. 1

17 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ευχαριστώ επίσης θερμά τον Αναπληρωτή Καθηγητή Βιοχημείας της Ιατρικής Σχολής κ. Γεώργιο Κολιάκο για την ευκαιρία που μου έδωσε να δουλέψω πέντε χρόνια μαζί του σε ένα άρτια οργανωμένο εργαστήριο, παρέχοντάς μου όλα τα απαραίτητα εφόδια προκειμένου να πραγματοποιήσω την έρευνά μου. Τον ευχαριστώ για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε και γιατί ήταν πάντα δίπλα μου σε ότι και αν χρειαζόμουν. Το πάθος του για την έρευνα και ο ανυποχώρητος ζήλος του με ενέπνευσαν και αποτέλεσαν παράδειγμα για μένα, ενώ με έκαναν να αγαπήσω ακόμα περισσότερο την έρευνα. Με την κ. Καλογιάννη και τον κ. Κολιάκο ήμασταν μια ομάδα όλα αυτά τα χρόνια. Υπήρξαν για μένα πολύτιμοι δάσκαλοι και καθοδηγητές, αλλά πάνω από όλα υπέροχοι άνθρωποι, πρόθυμοι να με διδάξουν, να με συμβουλέψουν, να με εμψυχώσουν. Έμαθα μαζί τους να ψάχνω σε βάθος, να θέτω ερευνητικά ερωτήματα και να μη μένω στην επιφάνεια των προς μελέτη φαινομένων. Τα εφόδια που πήρα και από τους δύο είναι ανεκτίμητα και θα με συντροφεύουν μια ζωή στη μετέπειτα ερευνητική μου πορεία. Τους ευχαριστώ θερμά Θερμές ευχές θα ήθελα να εκφράσω στον Καθηγητή του Τομέα Ζωολογίας κ. Γεώργιο Θεοφιλίδη, για τις συμβουλές του καθ όλη τη διάρκεια του ερευνητικού μου έργου. Τον ευχαριστώ επίσης για τις εύστοχες παρατηρήσεις και την καθοδήγησή του για τη συγγραφή αυτού του κειμένου. Τον ευχαριστώ επίσης για τη διόρθωση της παρούσας διατριβής και τη συμμετοχή του στην τριμελή συμβουλευτική μου επιτροπή. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω ακόμη και στα υπόλοιπα μέλη της εξεταστικής μου επιτροπής, την Καθηγήτρια Βιοχημείας και Διευθύντρια του εργαστηρίου Βιολογικής χημείας της Ιατρικής σχολής κ. Νόρμα Βαβάτση-Χρηστάκη, τον Αναπληρωτή Καθηγητή Παθολογίας της Β Παθολογικής κλινικής του Ιπποκράτειου νοσοκομείου Θεσσαλονίκης κ. Κωνσταντίνο Παλέτα, τον Αναπληρωτή Καθηγητή του Τομέα Ζωολογίας κ. Βασίλειο Μιχαηλίδη και τον Αναπληρωτή Καθηγητή του Τομέα Ζωολογίας κ. Αθανάσιο Παπαδόπουλο για το για το χρόνο που αφιέρωσαν στη μελέτη και διόρθωση της διδακτορικής μου διατριβής. Τους ευχαριστώ επίσης για τις συμβουλές τους και τις εύστοχες παρατηρήσεις τους. Τις θερμές μου ευχαριστίες επίσης στον Αναπληρωτή Καθηγητή Παθολογίας Κωνσταντίνο Παλέτα, στον Επίκουρο Καθηγητή παθολογίας Απόστολο Τσάπα, και στην υποψήφια Διδάκτορα της Β Παθολογικής κλινικής του Ιπποκράτειου 2

18 ΠΡΟΛΟΓΟΣ νοσοκομείου Θεσσαλονίκης Μαρία Σαρηγιάννη οι οποίοι μας παρείχαν τα δείγματα του αίματος καθώς και τις απαραίτητες πληροφορίες. Ευχαριστώ επίσης τον Μαιευτήρα-Γυναικολόγο και επιστημονικό συνεργάτη της Γ Μαιευτικής- Γυναικολογικής κλινικής του Ιπποκράτειου Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης κ. Άγγελο Δανιηλίδη καθώς και την Γ Μαιευτική-Γυναικολογκή Κλινική για την ευγενική χορηγία των ομφάλιων λώρων κατά την απομόνωση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η συνεργασία τους και η συνεισφορά τους κατά πραγματοποίηση της εργασίας αυτής ήταν πολύτιμες. Θα ήθελα ακόμη να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη της ερευνητικής ομάδας του εργαστηρίου Βιολογικής χημείας της Ιατρικής σχολής του ΑΠΘ για το ευχάριστο κλίμα που δημιούργησαν. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τις υποψήφιες Διδάκτορες και φίλες μου Κωνσταντίνα Τοπουρίδου, Μαρία Σαρηγιάννη και Χριστίνα Μπεφάνη για την πολύτιμη βοήθειά τους στα πειράματα κάθε φορά που την χρειαζόμουν. Κυρίως όμως τις ευχαριστώ για τη φιλία τους και για τη στήριξή τους όλα αυτά τα χρόνια. Ιδιαίτερη αναφορά θα κάνω στον φίλο μου, υποψήφιο Διδάκτορα Νίκο Τσάγια, καθώς η φιλία μου μαζί του όλα αυτά τα χρόνια είναι κάτι που θα με συντροφεύει μια ζωή. Τον ευχαριστώ για την αμέριστη στήριξή και συμπαράστασή του κάθε φορά που την χρειαζόμουν. Κυρίως όμως τον ευχαριστώ γιατί ήταν πάντα δίπλα μου, όλα αυτά τα χρόνια των επίπονων προσπαθειών μου, σε κάθε ευχάριστη ή δυσάρεστη στιγμή, δείχνοντας μου πως ακόμα υπάρχει κάτι που μπορεί κανείς να πιστεύει... η φιλία. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους φίλους μου για τη στήριξή τους αυτά τα χρόνια. Κυρίως όμως ευχαριστώ τον φίλο μου Τηλέμαχο Χατζηαγόρου για την συμπαράσταση και την αγάπη του. Από την πρώτη στιγμή πίστεψε σε μένα και τις δυνατότητές μου και ήταν πάντα δίπλα μου να με στηρίζει. Τον ευχαριστώ κυρίως για την υπομονή του και την ανεκτικότητα στις όχι και τόσο ευχάριστες στιγμές μου, όταν η πίεση και το άγχος της δουλειάς με κυρίευαν. Υπήρξε το αγχολυτικό μου σε όλη αυτή την επίπονη προσπάθεια και αυτό δεν πρόκειται να το ξεχάσω ποτέ. Άφησα για το τέλος την οικογένειά μου, τους γονείς και την αδερφή μου.. Κάτι τέτοιες στιγμές είναι που ξεχνάει κανείς τα λόγια, απλά γιατί δε μπορεί να εκφράσει με αυτά όλα αυτά που νιώθει. Χωρίς την αγάπη και την υποστήριξή τους όλα αυτά τα χρόνια δεν ξέρω αν θα είχα καταφέρει να φτάσω στο τέλος αυτής της διαδρομής. Τους ευχαριστώ για την πίστη τους σε μένα και την αμέριστη συμπαράστασή τους, ενώ παράλληλα νιώθω την ανάγκη να τους ζητήσω συγγνώμη 3

19 ΠΡΟΛΟΓΟΣ για τις όχι και τόσο ευχάριστες στιγμές μου όταν το άγχος της δουλειάς με κατέβαλε. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στον πατέρα μου Αναστάσιο που ήταν πάντα δίπλα μου, να με ενθαρρύνει και να με συμβουλεύει, ακλόνητο στήριγμα όλων των προσπαθειών μου, παρέχοντας μου ένα αίσθημα ασφάλειας και σιγουριάς όλα ότι θα πάνε καλά. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στην μητέρα μου Ευαγγελία γιατί χωρίς την αγάπη και τη φροντίδα της σίγουρα θα ήταν όλα διαφορετικά. Όλα αυτά τα χρόνια βίωνε τον αγώνα μου, τα άγχη, τις χαρές και τις απογοητεύσεις μου από την πρώτη γραμμή. Ήταν πάντα εκεί, να συζητήσω, να μοιραστώ, ακόμα και να ξεσπάσω χωρίς ποτέ να παραπονεθεί. Από τα περιβόητα «κουλούρια» που άφησαν εποχή στο εργαστήριο, μέχρι το γεγονός ότι ήξερε τα πάντα γύρω από συνέδρια και δημοσιεύσεις που είχα, καλύτερα και από μένα. Η περίοδος συγγραφής της διδακτορικής διατριβής μου συνέπεσε με μια πολύ δύσκολη περίοδο για την οικογένειά μου. Ευχαριστώ λοιπόν πάνω από όλα γιατί ακόμα και έτσι ήταν δίπλα μου και συνέβαλαν ουσιαστικά ώστε να βιώσω όλη αυτή την κατάσταση όσο πιο ανώδυνα γίνεται. Τους ευχαριστώ θερμά και να ξέρουν ότι τους αγαπώ πολύ 4

20 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΧΗΜΙΚΩΝ & ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΟΡΩΝ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΧΗΜΙΚΩΝ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΟΡΩΝ AΒΑΡ 2.2 (2-μεθυλπροπιοναμιδίνη) διυδροχλωρίδιο, 97% (2,2 methylpropionamidine- dihydrocloride, 97%) AGEs τελικά προϊόντα γλυκοζυλίωσης (advanced glycation end-products) APS ammonium persulfate BCA bicinchoninic acid BSA λευκωματίνη ορού βοδιού (bovine serum albumin) CAM καλμοδουλίνη cpm κρούσεις ανά λεπτό (counts per minute) DAG διακυλογλυκερόλη DCFH-DA dichlorodihydrofluorescein diacetate DIDS 4.4-diisothiocyanatostilbene-2.2-disulfonic acid DMSO διμεθυλοσουλφοξείδιο (dimethylsulfoxide) DNPH 2, 4 δινιτροφαινυλ-υδραζίνη 5

21 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΧΗΜΙΚΩΝ & ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΟΡΩΝ DPI diphenyleneidonium DTPA diethylenetriamine-pentaacetic acid ECM εξωκυττάρια ουσία (extracellular matrix) ECL ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (enhanced chemiluminescence) EDTA αιθυλενο-διαμινο-τετραοξικό οξύ (ethylenediaminetetracetic acid) EHS σάρκωμα Engelbreth-Holm-Swarm σάρκωμα ELISA enzyme-linked immunosorbent assay ERK extracellular signal-regulated kinase FCS ορός εμβρύου μόσχου (fetal calf serum) FITC fluorescein isothiocyanate HEPES Ν- 2-υδροξυ-αιθυλ πιπεραζινο- Ν -2-αιθανοσουλφονικό οξύ (N-2- hidroxy-ethyl piperazine- Ν- 2-ethanesulfonic acid) HRP υπεροξειδάση από ραπανάκι (horseradish peroxidase) IDDM ινσουλινοεξαρτώμενος σακχαρώδης διαβήτης (insulin-dependent diabetes mellitus) 6

22 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΧΗΜΙΚΩΝ & ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΟΡΩΝ LDL χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (low density lipoprotein) MAPK mitogen-activated protein kinase NADPH οξειδάση οξειδάση του νικοτιναμινο-αδενινο-φωσφοδινουκλεοτιδίου NIDM μη ινσουλινοεξαρτώμενος σακχαρώδης διαβήτης (non- insulin- dependent diabetes mellitus) ΝΟ μονοξείδιο του αζώτου (nitric oxide) PBS ουδέτερο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (phosphate-buffered saline) ΡΙ3Κ 3 κινάση του φωσφοϊνοσιτιδίου (phosphoinositide 3-kinase) PKC πρωτεϊνική κινάση C (protein kinase C) ΡΜΑ phorbol-12-myristate-13-acetate PLC φωσφολιπάση C ROS δραστικές μορφές οξυγόνου (reactive oxygen species) rpm στροφές ανά λεπτό (rounds per minute) 7

23 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΧΗΜΙΚΩΝ & ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΟΡΩΝ RPE R-φυκοερυθρίνη (R-phycoerythrin) SDS δωδεκυλοθειικό νάτριο (sodium dodecyl-sulfate) SOD δισμουτάση του σουπεροξειδίου (superoxide dismutase) TBS ρυθμιστικό διάλυμα Τris (tris-buffered saline) TCA τριχλωροξικό οξύ (trichloroacetic acid) TFA τριφλουοροοξικό οξύ (trifluoroacetic acid) TMB 3, 3, 5, 5 tetramethylbenzidine dihydrochloride TEMED N, N, N, N - tetramethylenediamine WST-1 4-nitrophenyl-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate 8

24 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α. ΑΘΗΡΩΜΑΤΩΣΗ 1. Ορισμός Αθηρωμάτωση ή αθηρογένεση ονομάζεται ένας συνδυασμός αλλαγών στον έσω χιτώνα των αρτηριών, που χαρακτηρίζεται από εστιακή συσσώρευση λιπιδίων, άλλων συστατικών του αίματος και ινώδους ιστού. Η ανάπτυξη ινώδους συνδετικού ιστού και η απόθεση αλάτων ασβεστίου στις αθηρωματικές πλάκες μπορεί να οδηγήσει σε αρτηριοσκλήρωση. Ο όρος αρτηριοσκλήρωση σημαίνει σκλήρυνση του τοιχώματος των αρτηριών και μπορεί να οφείλεται και σε άλλες αιτίες εκτός της αθηροσκλήρωσης. 2. Παθοφυσιολογία-Παθογένεια Η αθηρωμάτωση αποτελεί μια από τις κυριότερες αιτίες θανάτου στο δυτικό κόσμο (Poston και Johnson-Tidey, 1996). Ανά καιρούς διατυπώθηκαν διάφορες υποθέσεις σχετικά με την εξέλιξη της αθηρωματικής πλάκας, επικρατέστερες των οποίων είναι οι ακόλουθες: η απάντηση του ενδοθηλίου σε βλάβη η μονοκλωνική υπόθεση και η υπόθεση της λιπιδιακής διήθησης Στόχος πλέον της σύγχρονης κυτταρικής και μοριακής βιολογίας είναι η πλήρης κατανόηση και η συμπλήρωση των κενών που υπάρχουν στη διαδικασία της αθηρωμάτωσης. Συνοπτικά, η σειρά των γεγονότων που διέπουν το σχηματισμό της αθηρωματικής πλάκας σύμφωνα με τα μέχρι τώρα δεδομένα είναι η εξής: 1. Δυσλειτουργία του ενδοθηλίου 2. Μετανάστευση μονοκυττάρων υπενδοθηλιακά και διαφοροποίησή τους σε μακροφάγα 3. Κατακράτηση LDL υπενδοθηλιακά, οξείδωση, φαγοκυττάρωση της LDL από τα μακροφάγα και σχηματισμός αφρωδών κυττάρων 4. Μετανάστευση λείων μυϊκών κυττάρων υπενδοθηλιακά 5. Νέκρωση υπερκορεσμένων αφρωδών κυττάρων, ελευθέρωση οξειδωμένης LDL, βλάβη ενδοθηλίου, προσκόλληση και συσσώρευση αιμοπεταλίων 9

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ακολουθεί η αναλυτική περιγραφή των φαινομένων σχηματισμού της αθηρωματικής πλάκας. 2.1 Δυσλειτουργία του ενδοθηλίου Το ενδοθήλιο αποτελείται από μια συνεχή στιβάδα ενδοθηλιακών κυττάρων, η οποία διαχωρίζει την κυκλοφορία του αίματος από το τοίχωμα των αγγείων. Πρόκειται για έναν ιστό με πλήθος μεταβολικών και συνθετικών λειτουργιών, όπως η διατήρηση της κυκλοφορίας και ρευστότητας του αίματος και η ρύθμιση της πήξης του αίματος και η ρύθμιση των φλεγμονωδών αποκρίσεων (Gonzalez and Selwyn, 2003). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα είναι επίπεδα, περιλαμβάνουν κεντρικό πυρήνα, ενώ έχουν πάχος 1-2 µm και διάμετρο µm (Εικόνα 1). Εικόνα 1. Απεικόνιση αρτηριακού ενδοθηλίου. Με μπλε χρώμα απεικονίζεται ο πυρήνας του κυττάρου, ενώ τα όρια μεταξύ των κυττάρων είναι βαμμένα μαύρα με χρωστική νιτρικού αργύρου. Οι σκούρες γραμμές απεικονίζουν τους ενδοκυτταρικούς συνδέσμους, οι οποίοι είναι σημαντικοί για τη διατήρηση της ακεραιότητας του αγγείου ( Image 1. Imaging of arterial endothelium. Blue colour represents cell nucleus, while the cell boundaries are stained black with silver nitrate. The dark lines show the intercellular junctions, which are critical for the integrity of the vessel ( Υπό φυσιολογικές συνθήκες τα ενδοθηλιακά κύτταρα έχουν αντιθρομβωγενή δράση. Παράλληλα, εκφράζουν πλήθος αυξητικών παραγόντων και αγγειοδραστικών ουσιών, όπως το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ), η ενδοθηλίνη-1 και οι αγγειοτασίνες Ι και ΙΙ, που ρυθμίζουν τις προσκολλητικές ιδιότητες του ενδοθηλίου (Daugherty και συν., 2005). Οι παραπάνω ουσίες απελευθερώνονται ως απόκριση σε μια σειρά χημικών διεγερτών όπως η θρομβίνη, η βραδυκινίνη, ή το ADP καθώς και σε αλλαγές σε αιμοδυναμικές δυνάμεις, όπως αλλαγές στην πίεση ή τη ροή του αίματος (Sumpio, 1993). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα μπορούν παράλληλα να ενεργοποιηθούν από πλήθος 10

26 ΕΙΣΑΓΩΓΗ διεγερτών, όπως η θρομβίνη και η ισταμίνη. Τα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα συνθέτουν και εκκρίνουν μια σειρά από ουσίες που παρουσιάζονται στην εικόνα 2. Εικόνα 2. Γνωστά εκκριτικά προϊόντα και προϊόντα έκφρασης των ενδοθηλιακών κυττάρων που σχετίζονται με τη φυσιολογία του αγγείου (Sumpio και συν., 2002). Image 2. Known secretory and expression products of endothelial cells relating to vessel physiology (Sumpio et al., 2002). Η δυσλειτουργία του ενδοθηλίου μπορεί να επέλθει από την επίδραση μιας σειράς βλαπτικών παραγόντων, όπως ο σακχαρώδης διαβήτης, η υπέρταση και γενετικοί παράγοντες. Αποτέλεσμα της ανεξάρτητης ή συνδυαστικής δράσης των παραπάνω παραγόντων είναι η δημιουργία των απαραίτητων συνθηκών για εστιακή κατακράτηση της LDL από τη θεμέλιο ουσία του έσω χιτώνα (υπενδοθηλιακά). Θα πρέπει να αναφερθεί πως υπό φυσιολογικές συνθήκες η LDL διηθείται διαμέσου του φυσιολογικού ενδοθηλιακού φραγμού. 2.2 Μετανάστευση μονοκυττάρων υπενδοθηλιακά και διαφοροποίησή τους σε μακροφάγα Το μονοκύτταρο αποτελεί το μεγαλύτερο κύτταρο του αίματος (10-18μm). Το κύτταρο αυτό εμφανίζει ευμεγέθη πυρήνα, και άφθονο κυτταρόπλασμα που περιέχει πολλά ένζυμα, όπως φωσφατάσες, υπεροξειδάσες, εστεράσες και αζουρόφιλα κοκκία 11

27 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (εμφανίζονται σαν σκόνη) (Εικόνα 3). Τα οργανίδιά του είναι καλά αναπτυγμένα και για το λόγο αυτό το μονοκύτταρο εκδηλώνει σημαντική δραστηριότητα. Τα μονοκύτταρα προέρχονται κυρίως από τον μυελό των οστών (ίσως και από το ήπαρ και τους λεμφαδένες). Ένας μεγάλος αριθμός μονοκυττάρων εξέρχεται από το αίμα προς τους ιστούς, και διαφοροποιείται στα μακροφάγα των ιστών. Παράλληλα, τα μονοκύτταρα αποτελούν πρόδρομα των δενδριτικών κυττάρων, διαδραματίζοντας έτσι κεντρικό ρόλο σε αμυντικούς μηχανισμούς, ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης των Τλεμφοκυττάρων (Palucka και συν., 1998). Τα μονοκύτταρα δεν είναι ομοιογενή καθώς στην πραγματικότητα αντιπροσωπεύουν τουλάχιστον δύο διακριτά υποσύνολα μονοπύρηνων φαγοκυττάρων (Akiyama και συν, 1983). Στις λειτουργίες των μονοκυττάρων περιλαμβάνεται και η αντιμικροβιακή τους δράση, δηλαδή η φαγοκυττάρωση, η οποία είναι 5 με 10 φορές εντονότερη αυτής των ουδετεροφίλων, αλλά λιγότερο ειδική (Dale και συν., 2008). Συγκεκριμένα, σε μια λοίμωξη, μετά από μια αρχική αύξηση του αριθμού των ουδετεροφίλων, αυξάνει ο αριθμός των μονοκυττάρων τα οποία αντικαθιστούν τα ουδετερόφιλα. Επίσης, τα μονοκύτταρα μετέχουν σε ορισμένες φάσεις της ανοσολογικής απόκρισης (Dale και συν., 2008). Η φαγοκυτταρική ικανότητα επιτυγχάνεται μέσω της μετατροπής τους σε μακροφάγα που φαγοκυτταρώνουν και αποικοδομούν τους ξένους-εισβολείς μικροοργανισμούς. Παράλληλα περιέχουν ένζυμα που χρησιμοποιούνται για τη διάλυση ιστικών υπολειμμάτων μετά από χρόνιες φλεγμονές, ενώ εκκρίνουν και ουσίες που μετέχουν σε διαδικασίες, όπως η επαγωγή της κυτταρικής αύξησης, ή και του κυτταρικού θανάτου. Συγκεκριμένα, η διαφοροποίηση των μονοκυττάρων σε μακροφάγα τα καθιστά ικανά να συμμετέχουν σε φλεγμονώδεις και ανοσολογικές αντιδράσεις. Η διαδικασία αυτή μεσολαβείται από πλήθος μεταγραφικών παραγόντων, όπως ο NFkB (Takashiba και συν., 1999). Συγκριτικά με δραστικότητα, τα ενώ μονοκύτταρα, παράλληλα τα μακροφάγα εμπλέκονται και εμφανίζουν σε πλήθος μεγαλύτερη παθολογικών καταστάσεων (Osterud και Bjorklid, 2003). Τα ενεργοποιημένα μονοκύτταρα και μακροφάγα εκκρίνουν επίσης μια σειρά ουσιών, όπως οι ιντερλευκίνες IL-1 και IL-6, ο ογκονεκρωτικός παράγοντας (TNF) και η κυτοκίνη INF-α/β, που εμπλέκονται στη ρύθμιση της αιματοποίησης (Sieff και συν., 1998). Από την άλλη, τα ίδια υπόκεινται σε ρύθμιση της δράσης τους μέσω χυμοκινών. Παράλληλα, τα μονοκύτταρα, τα μακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα 12

28 ΕΙΣΑΓΩΓΗ εκφράζουν στην επιφάνειά τους πλήθος πρωτεϊνών που διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στη διαδικασία της φαγοκυττάρωσης. Τα μονοκύτταρα αποτελούν σημαντική πηγή παραγωγής δραστικών ριζών οξυγόνου (ROS) και κυρίως της υδροξυλικής ρίζας, του υπεροξειδίου του οξυγόνου, του ανιόντος του σουπεροξειδίου και της υπερχλωρικής ρίζας (Baud και συν., 1992; Baud και Ardaillou, 1993; Cathcart, 2004). Την ικανότητα αυτή την έχουν και άλλα κύτταρα του αίματος, όπως τα εωσινόφιλα, τα ουδετερόφιλα και τα μακροφάγα. Έπειτα από μια φλεγμονώδη διαδικασία, πραγματοποιείται ξαφνική απελευθέρωση μονοκυττάρων αλλά και εωσινοφίλων, μακροφάγων και ουδετεροφίλων στην κυκλοφορία, προκειμένου να φτάσουν στο σημείο που εντοπίζεται το παθογόνο αίτιο. Το λευκοκύτταρο που έχει δεχτεί κάποιο ερέθισμα, αυξάνει την κατανάλωση οξυγόνου, με αποτέλεσμα να ενεργοποιεί την παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS). Τα μονοκύτταρα παραμένουν στην κυκλοφορία για μικρό χρονικό διάστημα (3 μέρες). Η μέση συγκέντρωσή τους στο αίμα του ανθρώπου είναι 4x108 κύτταρα/λίτρο. Εικόνα 3. Απεικόνιση μονοκυττάρου. Με μπλε σκούρο χρώμα απεικονίζεται ο ευμεγέθης πυρήνας του κυττάρου, ενώ με το μπλε ανοιχτό το κυτταρόπλασμά του. Γύρω από το μονοκύτταρο διακρίνονται ερυθροκύτταρα. ( Image 3. Imaging of arterial endothelium. The dark blue colour represents the large cell nucleus, while the light one its cytoplasm. Around monocyte there are also erythrocytes. ( Τα μονοκύτταρα εμφανίζουν έντονη κινητικότητα, στοιχείο που τα καθιστά ικανά να αλληλεπιδρούν με πλήθος άλλων κυττάρων, όπως τα λεμφοκύτταρα καθώς και συστατικών της εξωκυττάριας ουσίας, όπως η φιμπρονεκτίνη. H προσκόλληση με 13

29 ΕΙΣΑΓΩΓΗ τις πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας γίνεται κυρίως μέσω των ιντεγκρινών, χωρίς όμως να αποκλείεται η συμμετοχή και άλλων ειδών υποδοχέων. Αποτέλεσμα της προσκόλλησης είναι η επαγωγή μιας σειράς γεγονότων που περιλαμβάνουν τη μετανάστευση, την κυτταροτοξικότητα, την παραγωγή παραγόντων φλεγμονής κ.α. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αλληλεπίδρασης μονοκυττάρων με τα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας είναι η μετανάστευση των μονοκυττάρων προς την περιοχή της μόλυνσης, όπου είναι αποτέλεσμα διαδοχικής δέσμευσης-αποδέσμευσης μεταξύ μονοκυττάρων και συστατικών της εξωκυττάριας ουσίας (Owen και συν., 1992). Τα μονοκύτταρα διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο και σε μια σειρά ασθενειών, όπως στην πρόκληση της αθηρωμάτωσης. Πιο συγκεκριμένα εμπλέκονται στα πρώτα στάδια σχηματισμού της αθηρωματικής πλάκας, γεγονός στο οποίο στρέφεται το ενδιαφέρον της παρούσας διατριβής. Εικόνα 4. Αρχικά στάδια αθηροσκλήρωσης. Τα μονοκύτταρα του αίματος κυλούν επάνω στο ενδοθήλιο του αγγειακού τοιχώματος. Στη συνέχεια αλληλεπιδρούν με τα ενδοθηλιακά κύτταρα, προσκολλώνται σταθερά πάνω σε αυτά και μεταναστεύουν προς τον υπενδοθηλιακό χώρο, όπου και διαφοροποιούνται σε δενδριτικά κύτταρα και μακροφάγα (lpi.oregonstate.edu/ss03/lipoicacid.html). Image 4. Initial stages of atherosclerosis. Blood monocytes roll on the endothelium of the vascular wall. Afterwards, they interact with the endothelial cells; they firmly attach to them and subsequently migrate through them to the subendothelial space, where they are differentiated into dendritic cells and macrophages (lpi.oregonstate.edu/ss03/lipoicacid.html). 14

30 ΕΙΣΑΓΩΓΗ «Κυκλική μετακίνηση» και ακινητοποίηση των μονοκυττάρων στο ενδοθήλιο Οξειδωμένα ή γλυκοζυλιωμένα λιπιδιακά συστατικά της LDL διεγείρουν την παραγωγή ουσιών από τα ενδοθηλιακά κύτταρα (Osterud και Bjorklid, 2003). Συγκεκριμένα, υπό τη επίδραση των παραπάνω ουσιών τα μονοκύτταρα προσελκύονται αρχικά από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, μετακινούνται κυκλικά πάνω στο ενδοθήλιο και τελικώς ακινητοποιούνται. Στη συνέχεια, εκβάλλουν ψευδοπόδια και μεταναστεύουν υπενδοθηλιακά. Τα μονοκύτταρα μετακινούνται κυκλικά πάνω στα ενδοθηλιακά κύτταρα με τη βοήθεια των σελεκτινών, μιας υψηλά συντηρημένης οικογένειας λεκτινών τύπου C που αποτελείται από 3 μέλη, τις L, P και E σελεκτίνες (Mc Ever, 2002). Η Lσελεκτίνη εκφράζεται στα περισσότερα λευκοκύτταρα της κυκλοφορίας του αίματος και επάγει κατά κύριο λόγο τη δέσμευση των μονοκυττάρων στο αγγειακό ενδοθήλιο. Οι P και E σελεκτίνες εκφράζονται σε ενδοθηλιακά κύτταρα που είναι διεγερμένα για μεγάλο ή για μικρό χρονικό διάστημα. Ενώ και οι δύο συνεισφέρουν στην «κυκλική μετακίνηση», αρκεί μόνο μία από αυτές, εφόσον εκφραστεί σε ικανοποιητικά επίπεδα, προκειμένου να πραγματοποιηθεί η παραπάνω διαδικασία. Μετά την κυκλική μετακίνηση ακολουθεί η προσκόλληση των μονοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα, μέσω αλληλεπίδρασης των ιντεγκρινών των μονοκυττάρων με τα προσδέματά τους, τα μόρια προσκόλλησης ICAM-1 και VCAM1 των ενδοθηλιακών κυττάρων. Στην κυκλοφορία του αίματος οι ιντεγκρίνες που εκφράζονται από τα μονοκύτταρα χαρακτηρίζονται από χαμηλή συγγένεια για τα προσδέματά τους (Carman και Springer, 2003). Υπό την επίδραση όμως των χυμοκινών που απελευθερώνονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, η παραπάνω κατάσταση αντιστρέφεται και ταχύτατα (millisecond) (Neelemagham και συν., 1998). Η προσκόλληση των μονοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα επάγεται από μια σειρά χημειοεκλυτικών παραγόντων και κυτοκινών. Ενδεικτικά αναφέρεται η χημειοεκλυτική πρωτεΐνη των μονοκυττάρων-1 (MCP-1, Monocyte Chemoattractant Protein-1), ο αποικιοδιεγερτικός παράγοντας των μακροφάγων (M-CSF, Macrophage Colony-Stimulating Factor), πολυμορφοπύρηνων/μακροφάγων ο αποικιοδιεγερτικός (GM-CSF, παράγοντας Granulocyte/Macrophage των Colony- Stimulating Factor), η μεταναστευτική πρωτεΐνη φλεγμονής-1 (MIP-1, Migratory Inflammatory Protein-1), ο παράγοντας TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α), ο μετασχηματίζων μεταγραφικός παράγοντας (TGF-β, Transforming Growth Factor-β) και η ενδοθηλίνη-1 (ET-1, Endothelin-1) (Daugherty και συν., 2005). Συνεπώς, τα 15

31 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ενεργοποιημένα μονοκύτταρα μετακινούνται κυκλικά πάνω στα ενδοθηλιακά κύτταρα και προσκολλώνται σε αυτά που ενεργοποιήθηκαν από σήματα προερχόμενα από τον έσω χιτώνα των αγγείων. Πόλωση και μετανάστευση των μονοκυττάρων διαμέσου του ενδοθηλίου Μετά τη σταθερή προσκόλληση των μονοκυττάρων στο αγγειακό ενδοθήλιο, ακολουθεί μια μορφολογική αλλαγή, γνωστή και ως πόλωση (Rose και συν., 2007). Η πόλωση καθορίζει το οδηγό (leading edge) και το τερματικό άκρο (trailing edge) ενός κυττάρου (Sanchez-Madrid και Angel del Pozo, 1999), διεγείρεται κατά κύριο λόγο από χυμοκίνες και περιλαμβάνει αναδιοργάνωση του κυτοσκελετού της ακτίνης, της συσκευής Golgi, των μικροσωληνίσκων, καθώς και ανακατανομή των μορίων της κυτταρικής επιφάνειας (Sanchez-Madrid and Angel del Pozo, 1999; Gomes και συν., 2005). Η F-ακτίνη από το να βρίσκεται συμμετρικά γύρω από το κύτταρο, εστιάζεται πλέον σε περιοχές όπως το οδηγό άκρο (Coates και συν., 1992). Οι υποδοχείς ιντεγκρίνης επίσης ανακατανέμονται και σχηματίζουν συμπλέγματα στο οδηγό άκρο. Στη διαδικασία της πόλωσης συμβάλλει πλήθος σηματοδοτικών μονοπατιών, όπως των Rho GTPασών, πρωτεϊνικών και λιπιδιακών κινασών. Αναφέρεται ενδεικτικά ότι η μικρή GTPάση Rap1 έχει κεντρικό ρόλο στην ενεργοποίηση και ανακατανομή των υποδοχέων ιντεγκρίνης κατά την πόλωση (Katagari και συν., 2003). Μόλις το μονοκύτταρο αποκτήσει πολικότητα πάνω στην επιφάνεια του ενδοθηλιακού κυττάρου ξεκινά η μετανάστευσή του διαμέσου του ενδοθηλίου ώστε να εισέλθει τελικώς στον υπενδοθηλιακό χώρο. Το γενικό μοντέλο κυτταρικής κινητικότητας περιλαμβάνει επαναλαμβανόμενους κύκλους προεκβολών φιλοποδίων και λαμελλιποδίων από το οδηγό άκρο. Από αυτές τις περιοχές ξεκινούν και οι συνδέσεις των ιντεγκρινών με τα υποστρώματά τους. Οι ιντεγκρίνες διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στη διαδικασία της μετανάστευσης καθώς δρουν τόσο σαν μόρια προσκόλλησης όσο και σαν σηματοδοτικά μόρια, ενώ σε συνδυασμό με τα σήματα των χυμοκινών διατηρούν την πόλωση και την κινητικότητα (Kinashi, 2005). Οι σηματοδοτικοί μηχανισμοί που διέπουν τη μεταναστευτική διαδικασία είναι σύνθετοι (Rose και συν., 2007). Ενδεικτικά αναφέρεται ο ρόλος της μικρής GTPάσης Rac που επάγει τον πολυμερισμό της ακτίνης και το σχηματισμό των λαμελλιποδίων. Προκειμένου μάλιστα να υπάρξει αποδοτική μετανάστευση απαιτείται η ενεργοποιημένη Rac να περιορίζεται στο οδηγό άκρο του κυττάρου. Μετά τη 16

32 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μετανάστευση τα μονοκύτταρα καταλήγουν στον υπενδοθηλιακό χώρο όπου και παραμένουν εκεί οδηγώντας στο σχηματισμό της αθηρωματικής πλάκας. Η προσκόλληση των μονοκυττάρων στο ενεργοποιημένο ενδοθήλιο και η ακόλουθη μετανάστευσή τους στον υπενδοθηλιακό χώρο επάγεται από μια σειρά μορίων προσκόλλησης (Quehenberger, 2005) που είναι διαφορετικά για καθένα από τα στάδια που απαιτούνται προκειμένου να εισέλθουν τα μονοκύτταρα στον υπενδοθηλιακό χώρο («κυκλική μετακίνηση», σταθερή προσκόλληση, μετανάστευση) (Εικόνα 5). Εικόνα 5. Σχηματική απεικόνιση της προσέλκυσης λευκοκυττάρων στον υπενδοθηλιακό χώρο. Σε λανθάνουσα κατάσταση, τα λευκοκύτταρα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα (αριστερά) δεν αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Οι περιοχές δέσμευσης με σελεκτίνες (προσδέματα) είναι παρούσες στα λευκοκύτταρα, αλλά τα λανθάνοντα ενδοθηλιακά κύτταρα δεν εκφράζουν σελεκτίνες. Η ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων οδηγεί στην έκφραση των σελεκτινών και προκαλεί την «κυκλική μετακίνηση» των λευκοκυττάρων. Η επακόλουθη ενεργοποίηση των λευκοκυττάρων επιτρέπει στις ιντεγκρίνες των λευκοκυττάρων να προσδεθούν με γλυκοπρωτεΐνες της οικογένειας των ανοσφαιρινών, όπως το ICAM-1 και το VCAM-1, οδηγώντας σε σταθερή προσκόλληση. Η μετανάστευση διαμέσου των ενδοθηλιακών κυττάρων (δεξιά) μεσολαβείται από επιπρόσθετα μέλη της οικογένειας των ανοσφαιρινών, όπως το PECAM-1 (Krieglstein και Granger, 2001). Image 5. Schematic of the multistep paradigm of leukocyte recruitment. In the dormant state, leukocytes and endothelial cells (left) do not interact. Selectin-binding sites (ligands) are present on leukocytes but dormant endothelial cells do not express selectins. Endothelial cell activation results in selectin expression and causes leukocyte-rolling. Subsequent leukocyte activation allows the leukocyte integrins to bind with Ig-supergene family glycoproteins svch as ICAM-1 and VCAM-1, permitting firm adhesion. Transendothelial migration (right) is mediated by additional Ig-supergene members like endothelial PECAM-1 (Krieglstein and Granger, 2001). 17

33 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι πρωτεΐνες-μόρια προσκόλλησης που μεσολαβούν τις παραπάνω αλληλεπιδράσεις είναι οι: α) σελεκτίνες, β) προσδέματα σελεκτινών, γ) ιντεγκρίνες και δ) μέλη της οικογένειας των ανοσοσφαιρινών (Springer, 1994). 2.3 Κατακράτηση LDL υπενδοθηλιακά, οξείδωση, φαγοκυττάρωση της LDL από τα μακροφάγα και σχηματισμός αφρωδών κυττάρων Μετά τη μετανάστευση των μονοκυττάρων στον υπενδοθηλιακό χώρο και τη διαφοροποίησή τους σε μακροφάγα, ακολουθεί η φαγοκυττάρωση της LDL από τα μακροφάγα και ο σχηματισμός των αφρωδών κυττάρων. Αρχικά, μετά τη συσσώρευση των LDL στον υπενδοθηλιακό χώρο πραγματοποιείται η οξείδωσή τους. Κάτω από το ενδοθήλιο υπάρχουν οι κυτταρικές οξυγενάσες που εκκρίνονται από τα κύτταρα του αρτηριακού τοιχώματος. Αντίθετα, δε μπορούν να δράσουν οι αντιοξειδωτικές ουσίες που βρίσκονται σε αφθονία στο πλάσμα. Παράλληλα με τους παραπάνω οξειδωτικούς παράγοντες, σημαντικό ρόλο στην οξείδωση των LDL φαίνεται να διαδραματίζουν και οι ROS. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, τα μακροφάγα δεν έχουν την ικανότητα να προσλαμβάνουν αμετουσίωτη LDL. Μάλιστα, προστατεύονται από τα τοξικά επίπεδα χοληστερόλης μέσω μείωσης των επιφανειακών LDL υποδοχέων τους (Brown και Goldstein, 1986). Όταν όμως η LDL οξειδωθεί ή γενικά υποστεί κάποια χημική τροποποίηση, αναγνωρίζεται από ειδικούς υποδοχείς που υπάρχουν στην επιφάνεια των μακροφάγων που λέγονται ρακοσυλλέκτες (scavengers) ή ακετυλ- LDL υποδοχείς, τα επίπεδα των οποίων δε μειώνονται όταν τα επίπεδα χοληστερόλης είναι αυξημένα. Ο κύριος υποδοχέας-ρακοσυλλέκτης που βρίσκεται στην επιφάνεια των ¾ των μακροφάγων και φαγοκυτταρώνει την οξειδωμένη LDL είναι ο CD36 (cluster of differentiation 36) ή υποδοχέας θρομβοσπονδίνης. Πέρα από τα μακροφάγα ο CD36 εντοπίζεται σε μικρότερο βαθμό στα μονοκύτταρα, τα αιμοπετάλια και τα λεία μυϊκά κύτταρα (Nakata και συν., 1999). Πρόκειται για μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη μοριακού βάρους 88 kda που ανήκει στην τάξη των υποδοχέων ρακοσυλλεκτών Β και η έκφραση της οποίας ρυθμίζεται από τη συσσώρευση των οξειδωμένων λιποπρωτεϊνών LDL. Στη διαδικασία ενεργοποίησης του γονιδίου που κωδικοποιεί τον CD36 εμπλέκεται και η πρωτεϊνική κινάση C. Παράλληλα, η έκφρασή του αποτελεί κεντρικό γεγονός κατά την έναρξη της αθηρωμάτωσης (Nicholson και συν. 2000). 18

34 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πέρα από τον CD36 υπάρχουν και άλλοι υποδοχείς ρακοσυλλέκτες που προσλαμβάνουν τροποποιημένες LDL και εντοπίζονται στα μονοκύτταρα και τα μακροφάγα. Σε αυτούς συγκαταλέγονται οι υποδοχείς ρακοσυλλέκτες τάξης Α (scavenger receptor class A, SR-A), τύπου Ι και ΙΙ (Sakaguchi και συν., 1998), ο CD68 (Rampasad και συν., 1996), ο υποδοχέας ρακοσυλλέκτης τάξης Β, τύπου Ι (scavenger receptor class Β, SR-Β) (Trigatti και συν., 1999), ο υποδοχέας-1 που ομοιάζει με λεκτίνη, ο LOX-1 (lectin-like ox-ldl receptor-1) (Kume και Kita, 2001) και ο SR-PSOX (Hofnagel και συν., 2002). Μετά την έντονη φαγοκυττάρωση της οξειδωμένης και ακετυλιωμένης LDL, τα μακροφάγα να μετατρέπονται σε αφρώδη κύτταρα. Εξαιτίας της τοξικής δράσης της οξειδωμένης LDL, πολλά αφρώδη κύτταρα νεκρώνονται σχηματίζοντας βαθμιαία το νεκρωτικό πυρήνα της αθηρωματικής βλάβης, ελευθερώνοντας σταγονίδια λίπους. Η υπενδοθηλιακή συγκέντρωση αφρωδών κυττάρων αποτελεί το πρώτο μικροσκοπικό εύρημα της αθηρωμάτωσης, τις λιπώδεις ραβδώσεις. 2.4 Μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων υπενδοθηλιακά Τα ενεργοποιημένα μακροφάγα, παράγουν πλήθος ουσιών, όπως αυξητικές ορμόνες, αναστολείς καθώς και χημειοτακτικές ουσίες. Κύριος στόχος των αυξητικών και χημειοτακτικών παραγόντων είναι τα λεία μυϊκά κύτταρα του μέσου χιτώνα, τα οποία υπό την επίδρασή τους πολλαπλασιάζονται και μεταναστεύουν προς την περιοχή της βλάβης (Harrison, 1998). Την ίδια επίδραση στα λεία μυϊκά κύτταρα έχουν και τα οξειδωμένα λίπη. Τα λεία μυϊκά κύτταρα που έχουν μεταναστεύσει στην περιοχή της βλάβης μπορούν να μετατραπούν και αυτά, όπως και τα μακροφάγα, σε αφρώδη κύτταρα, όταν το κυτταρόπλασμά τους γεμίσει με σταγονίδια λίπους. Ο βαθμός οξείδωσης της LDL έχει διαφορετικές βιολογικές επιδράσεις στα κύτταρα που συμμετέχουν στη διαδικασία της αθηρωμάτωσης. Έτσι, ενώ η ήπια οξείδωση της LDL οδηγεί σε παραγωγή ουσιών, όπως τα οξειδωμένα φωσφολιπίδια, που διεγείρουν τα ενδοθηλιακά κύτταρα στην παραγωγή αγγειοδραστικών ουσιών, η έντονη οξείδωση της οδηγεί σε παραγωγή κυτταροτοξικών ουσιών, όπως η φωσφατιδυλοχολίνη και οι οξειδωμένες στερόλες. Από τα παραπάνω είναι φανερό ότι η διαδικασία της φαγοκυττάρωσης της οξειδωμένης LDL τόσο από τα μακροφάγα, όσο και από τα λεία μυϊκά κύτταρα έχει ως κύριο στόχο την προστασία της ακεραιότητας του ενδοθηλίου από την τοξική της επίδραση. 19

35 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2.5 Νέκρωση υπερκορεσμένων αφρωδών κυττάρων, ελευθέρωση οξειδωμένης LDL, βλάβη του ενδοθηλίου και προσκόλληση και συνάθροιση αιμοπεταλίων Αποτέλεσμα της εκτεταμένης παραγωγής οξειδωμένης LDL στην υπενδοθηλιακή στοιβάδα είναι η επιβάρυνση της υπενδοθηλιακής στιβάδας με οξειδωμένη LDL που προέρχεται από αδυναμία φαγοκυττάρωσής της από τα κορεσμένα μακροφάγα και λεία μυϊκά κύτταρα ή από νέκρωση κορεσμένων αφρωδών κυττάρων λόγω της τοξικής δράσης στης πλήρως οξειδωμένης LDL ή από συνδυασμό και των δύο παραπάνω καταστάσεων. Με τον τρόπο αυτό η ελεύθερη πλέον οξειδωμένη LDL μπορεί να δράσει κυτταροτοξικά στα κύτταρα του ενδοθηλίου και να επάγει μια σειρά γεγονότων που συνθέτουν την «αντίδραση στην ενδοθηλιακή βλάβη» όπως διαπιστώνεται στην αντίστοιχη υπόθεση που αποτέλεσε την κυρίαρχη θεωρία αθηρωμάτωσης τα τελευταία χρόνια. Αποτέλεσμα της εκτεταμένης βλάβης του ενδοθηλίου είναι η προσκόλληση και συσσώρευση αιμοπεταλίων που ενεργοποιούνται και ακολούθως παράγουν μια σειρά δραστικών παραγόντων επί των λείων μυϊκών κυττάρων που επιφέρουν τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευσή τους. Συνέπεια όλων των παραπάνω είναι να επέλθει πιο εκτεταμένη αθηρωματική βλάβη. Στη συνέχεια (Εικόνα 6) απεικονίζονται όλα τα στάδια επαγωγής της αθηρωμάτωσης που περιγράφηκαν αναλυτικά παραπάνω. Εικόνα 6. Απεικόνιση του συνολικού μηχανισμού επαγωγής της αθηρωμάτωσης, από την είσοδο των μονοκυττάρων στον υπενδοθηλιακό χώρο διαμέσου του ενδοθηλίου, μέχρι και το σχηματισμό των αφρωδών κυττάρων. Image 6. Imaging of the total mechanism of the initiation of atheromatosis, from the entrance of monocytes to the sub-endothelial place through endothelium, to their transformation into foam cells. 20

36 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 3. Αθηρωματική βλάβη Οι αθηρωματικές βλάβες αναπτύσσονται κυρίως στις μέσου μεγέθους μυϊκές αρτηρίες (στεφανιαίες, καρωτίδες, μηριαία κτλ). Οι πρωιμότητες αθηρωματικές βλάβες μπορούν να παρουσιαστούν ως λιπώδεις ραβδώσεις, οι οποίες αποτελούνται από μακροφάγα, Τ-λεμφοκύτταρα και λεία μυϊκά κύτταρα και είναι αναστρέψιμες βλάβες. Η πιο προχωρημένη αθηρωματική πλάκα είναι η ινώδης πλάκα. Αν η ινώδης πλάκα συνοδευτεί από θρόμβωση, αιμορραγία και/ή ασβέστωση, ονομάζεται επιπλεγμένη βλάβη. Η ινώδης πλάκα αποτελείται από μεγάλο αριθμό λείων μυϊκών κυττάρων, μακροφάγα και Τ-λεμφοκύτταρα και καλύπτεται από ινώδη κάψα, η οποία αποτελείται από λεία μυϊκά κύτταρα, τμήματα βασικής μεμβράνης, πρωτεογλυκάνη και μεγάλο αριθμό κολλαγόνων ινιδίων. Η ρήξη της ινώδους πλάκας έχει σοβαρές συνέπειες, όπως το έμφραγμα του μυοκαρδίου, ενώ οδηγεί και στην ενεργοποίηση του πηκτικού μηχανισμού, ο οποίος οδηγεί σε σχηματισμό θρόμβου, επιτυγχάνοντας τη διαδικασία απόφραξης του αγγείου. Από τα παραπάνω γίνεται αντιληπτό ότι οι πρωτεΐνες των βασικών μεμβρανών αποτελούν κύρια συστατικά των διαφόρων τύπων αθηρωματικών πλακών. Μάλιστα κάτι τέτοιο είναι δικαιολογημένο εξαιτίας του γεγονότος ότι βρίσκονται σε μεγάλη αφθονία δεδομένης της αυξημένης παραγωγής τους από διάφορους τύπους κυττάρων, όπως τα ενδοθηλιακά και τα λεία μυϊκά κύτταρα. Το ενδοθήλιο στηρίζεται πάνω στην εξωκυττάρια ουσία. Επομένως τα μονοκύτταρα, διαπερνώντας το ενδοθήλιο αλληλεπιδρούν με την εξωκυττάρια ουσία. Ένας από τους στόχους της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη των αλληλεπιδράσεων των μονοκυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων με πρωτεΐνες των βασικών μεμβρανών και το πώς αυτές μπορούν να συμβάλλουν στην πρόκληση της αθηρωμάτωσης. 21

37 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Β. ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ-ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΑΣ ΟΥΣΙΑΣ ΚΑΙ ΑΘΗΡΩΜΑΤΩΣΗ 1. Μόρια της κυτταρικής επιφάνειας Σελεκτίνες Οι σελεκτίνες και τα προσδέματά τους μεσολαβούν κατά κύριο λόγο στη διαδικασία της «κυκλικής μετακίνησης» των μονοκυττάρων στο ενδοθήλιο (Kansas, 1996), ενώ συμμετέχουν και στη δημιουργία συσσωματωμάτων ανάμεσα στα αιμοπετάλια και τα λευκοκύτταρα (Krieglstein και Granger, 2001). Διαλυτές μορφές σελεκτινών μπορούν να εντοπιστούν στο πλάσμα, ενώ υψηλά επίπεδά τους παρατηρούνται σε ασθενείς με φλεγμονή (Gearing και Newman, 1993). Η οικογένεια των σελεκτινών περιλαμβάνει 3 μέλη: την Ρ, την Ε και την L-σελεκτίνη (Blankenberg και συν., 2003). H P-σελεκτίνη αποτελεί το μεγαλύτερο από τα μόρια σελεκτίνης και εκφράζεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα και στα αιμοπετάλια μετά από διέγερσή τους. Η Ε-σελεκτίνη εκφράζεται στο ενεργοποιημένο ενδοθήλιο, ενώ η L-σελεκτίνη, που μπορεί να αποτελέσει πρόσδεμα για τις Ρ και Ε-σελεκτίνες (Patel και συν, 1995), εκφράζεται συνεχώς στην πλειοψηφία των λευκοκυττάρων. Η σύνθεση της Ε και Ρσελεκτίνης στα ενδοθηλιακά κύτταρα επάγεται από κυτοκίνες, βακτηριακές τοξίνες και οξειδωτικές ουσίες (Krieglstein και Granger, 2001). Ρίζες οξυγόνου μάλιστα έχει αναφερθεί ότι επάγουν την έκφραση της Ρ-σελεκτίνης στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω μετατόπισής της από κυστίδια αποθήκευσης του κυττάρου (Eppihimer, 1998). Σε αντίθεση με την Ρ-σελεκτίνη που υπάρχει στην κυτταρική επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων και επάγει την προσκόλληση με τα λευκοκύτταρα, η διαλυτή μορφή της από την οποία απουσιάζουν η διαμεμβρανική και κυτταροπλασματική περιοχή, δρα ως μόριο αντι-προσκόλλησης (Eppihimer, 1998). Στον ακόλουθο πίνακα (Πίνακας 1) αναφέρονται στοιχεία για την εναλλακτική ονομασία, την εντόπιση και τα προσδέματα των σελεκτινών καθώς και τη λειτουργία των λευκοκυττάρων στην οποία εμπλέκονται (Krieglstein and Granger, 2001). 22

38 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 1. Εναλλακτική ονομασία, εντόπιση και προσδέματα των μελών της οικογένειας των σελεκτινών, καθώς και λειτουργία των μονοκυττάρων στην οποία εμπλέκονται (Krieglstein και Granger, 2001). Table 1. Alternative names, location and integrin of the selectin family members as well as monocytes function that are involved (Krieglstein and Granger, 2001). Μόριο προσκόλλησης Εναλλακτική ονομασία Εντόπιση Σελεκτίνη L CD62L, LAM-1, LECAM-1 Λευκοκύτταρα (Όλα) Σελεκτίνη Ρ CD62P, PADGEM, GMP-140 Ενδοθηλιακά κύτταρα, αιμοπετάλια Σελεκτίνη Ε CD62E, ELAM-1 Ενδοθηλιακά κύτταρα Πρόσδεμα Σελεκτίνες Ρ και Ε GlyCAM, CD14 MAdCAM1 (Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule-1) Σελεκτίνη L PSGL-1, 120kD PSL Σελεκτίνη L CLA, SSEA-1 250kD ESL Λειτουργία λευκοκυττάρων «Κυκλική μετακίνηση» «Κυκλική μετακίνηση» «Κυκλική μετακίνηση» Ιντεγκρίνες Οι ιντεγκρίνες συνδέουν την εξωκυττάρια ουσία με τον κυτταροσκελετό και συγκεκριμένα με τα μικροϊνίδια που βρίσκονται στο εσωτερικό του. Η σύνδεση ανάμεσα στο κύτταρο και την εξωκυττάρια ουσία είναι ιδιαίτερα σταθερή και καθοριστική για την οντογένεσή του. Μάλιστα, αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για τη δόμηση ενός πολυκύτταρου οργανισμού καθώς οι ιντεγκρίνες δεν είναι απλά άγκιστρα, αλλά μεταβιβάζουν στο κύτταρο σημαντικά σήματα από το περιβάλλον τους (Li και συν., 2003). Οι δύο κύριες λειτουργίες που εμπλέκονται οι ιντεγκρίνες είναι η προσκόλληση των κυττάρων σε πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας (ECM) και η μεταβίβαση σήματος από την εξωκυττάρια ουσία προς το εσωτερικό του κυττάρου (Ross και Borg, 2001). Παράλληλα συμμετέχουν και σε άλλες διεργασίες, όπως στη σύνδεση ιών (αδενοϊών, των ιών της ασθένειας των ποδιών, των ιών Hanta και Echo κ.α) σε κύτταρα (Stewart και Nemerow, 2007), στον έλεγχο της ανοσίας και στη μετανάστευση των κυττάρων (Hood και Cheresh, 2002). Μία ακόμα λειτουργία των ιντεγκρινών είναι η συμμετοχή τους στη διαδικασία της μετανάστευσης. Αρχικά, τα 23

39 ΕΙΣΑΓΩΓΗ κύτταρα προσκολλώνται μέσω των ιντεγκρινών στο εκάστοτε υπόστρωμα. Κατά τη μετακίνησή του το κύτταρο δημιουργεί νέες συνδέσεις στο πρόσθιο μέρος του, ενώ παράλληλα απελευθερώνει αυτές του οπίσθιου τμήματος. Όταν πλέον το κύτταρο απελευθερωθεί από το υπόστρωμά του, οι ιντεγκρίνες επιστρέφουν στο εσωτερικό του κυττάρου με ενδοκύττωση. Με τον τρόπο αυτό ανακυκλώνονται επιτρέποντας στο κύτταρο να δημιουργήσει μελλοντικά νέες συνδέσεις στο πρόσθιο τμήμα του (Hood και Cheresh, 2002). Οι ιντεγκρίνες διαδραματίζουν επίσης κεντρικό ρόλο σε μηχανισμούς μεταβίβασης σήματος στα κύτταρα. Η σηματοδότηση από το εξωτερικό προς το εσωτερικό του κυττάρου που επάγεται από ιντεγκρίνες εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις αλληλεπιδράσεις τους με γειτονικούς υποδοχείς και σηματοδοτικές πρωτεΐνες (Huveneers και συν., 2007) και είναι καθοριστική για τη ρύθμιση μονοπατιών μεταγωγής σήματος (Εικόνα 7). Η σύνδεση μεταξύ των κυττάρων και της εξωκυττάριας ουσίας επάγει τη συνάθροιση των ιντεγκρινών στην πλασματική μεμβράνη καθώς και την αναδιοργάνωση του κυτοσκελετού της ακτίνης που με τη σειρά του διεγείρει περαιτέρω την οργάνωση των ιντεγκρινών και των συσχετιζόμενων με αυτές πρωτεϊνών σε μεγάλες «πολυ-πρωτεϊνικές πλατφόρμες», όπως τα ποδοσώματα, τα επιδερμοσώματα και οι εστιακές συνδέσεις (focal adhesions). Σε αυτές τις πλατφόρμες οι ιντεγκρίνες φέρνουν σε επαφή τις κινάσες με τα υποστρώματά τους. Οι συνδέσεις μεταξύ των κυττάρων και της εξωκυττάριας ουσίας δρουν και ως περιοχές αγκυροβόλησης για τον κυτοσκελετό της ακτίνης επιτρέποντας της δημιουργία τάσης και σχηματικών αλλαγών. Μέσω συνδέσεων του κυτοσκελετού με τον πυρήνα, τέτοιες αλλαγές μπορούν να επηρεάσουν το σχήμα του αλλά και τη δομή της χρωματίνης εξηγώντας με τον τρόπο αυτό την επίδραση της κυτταρικής προσκόλλησης μέσω ιντεγκρινών στην έκφραση γονιδίων (Maniotis και συν., 1998). 24

40 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 7. Διεπικοινωνία ανάμεσα στις ιντεγκρίνες και σε αυξητικούς παράγοντες. Όπως φαίνεται και από την εικόνα, οι ιντεγκρίνες επηρεάζουν τα μονοπάτια μεταβίβασης σήματος μέσω διακριτών μηχανισμών (Huveneers και συν., 2007). Image 7. Cross-talk between growth factor receptors and integrins. According to the image, integrins affect signal transduction pathways through distinct mechanisms (Huveneers et al., 2007). o Δομικά χαρακτηριστικά Οι ιντεγκρίνες είναι ετεροδιμερή μόρια που αποτελούνται από μια κοινή β υπομονάδα που συνδέεται μη ομοιοπολικά με μια σειρά α υπομονάδων. Συνολικά μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 18 α και 8 β υπομονάδες στα θηλαστικά που συνθέτουν 24 ετεροδιμερή ιντεγκρίνης (Shimaoka και Springer, 2003) (Εικόνα 8). Οι υπομονάδες α και β είναι διακριτές καθώς δεν ανιχνεύεται κάποια ομολογία μεταξύ τους. Το μοριακό βάρος των ιντεγκρινών κυμαίνεται μεταξύ 90 και 160 kda. Οι παραπάνω υποδοχείς αποτελούνται από μεγάλες εξωκυτταρικές περιοχές που είναι απαραίτητες για τη σύνδεση με το πρόσδεμα και βραχείες κυτταροπλασματικές περιοχές, που συνδέουν τους υποδοχείς με τον κυτταροσκελετό του κυττάρου (Newham και Humphries, 1996) (Εικόνα 9). Εξαίρεση αποτελεί η β4 υπομονάδα, όπου σε αντίθεση με όλες τις υπόλοιπες ιντεγκρίνες έχει μεγάλη κυτταροπλασματική περιοχή (1000 αμινοξέα). 25

41 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 8. Τα μέλη της υπερ-οικογένειας των ιντεγκρινών στον άνθρωπο και πως συνδυάζονται προκειμένου να σχηματίσουν τα ετεροδιμερή των ιντεγκρινών. Τουλάχιστον 18 α και 8 β υπομονάδες που σχηματίζουν 24 διαφορετικές ιντεγκρίνες έχουν εντοπιστεί μέχρι σήμερα στον άνθρωπο. Οι υπομονάδες ιντεγκρίνης που συνδέονται μεταξύ τους και σχηματίζουν ετεροδιμερή συνδέονται στο σχήμα με τις συμπαγείς γραμμές. Κάθε ιντεγκρίνη έχει διαφορετική εξειδίκευση σύνδεσης με το πρόσδεμα (Takada και συν., 2007). Image 8. The members of the human integrin superfamily and how they combine to form heterodimeric integrins. At least 18 α subunits and 8 β subunits have been identified in humans until today, which are able to generate 24 different integrins. Integrin subunits that bind to each other to form a heterodimer are connected by solid lines. Each integrin has distinct ligand-binding specificity and tissue and cell distribution. (Takada et al., 2007). Οι β υπομονάδες περιέχουν τέσσερις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες πλούσιες σε κυστεΐνη. Όσον αφορά τις α υπομονάδες, έχουν παρόμοια δομή. Πιο συγκεκριμένα, όλες περιέχουν εφτά ομόλογες επαναλήψεις των αμινοξέων στην εξωκυτταρική περιοχή (EF βραχίονες) (Newham και Humphries, 1996). Οι τρεις ή τέσσερις επαναλήψεις που βρίσκονται μάλιστα πιο εξωκυτταρικά εμφανίζουν ικανότητα σύνδεσης με κατιόντα και πιθανότατα εμπλέκονται στη διαδικασία σύνδεσης με τους προσδέτες, που είναι εξαρτώμενη από κατιόντα. Επίσης, όλες οι α υπομονάδες περιέχουν την αλληλουχία GFFKR που βρίσκεται καθοδικά της διαμεμβρανικής περιοχής, όμως ο ακριβής ρόλος της παραμένει άγνωστος. Παράλληλα, τόσο οι α όσο και οι β υπομονάδες έχουν την ικανότητα πρόσδεσης με δισθενή κατιόντα. Τα α κατιόντα εμπλέκονται πιθανότατα στη σταθεροποίηση της αναδίπλωσης των πρωτεϊνών, ενώ τα β κατιόντα στη ρύθμιση της σύνδεσης των ιντεγκρινών με κάποιους από τους προσδέτες τους. 26

42 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 9. Μια απλουστευμένη (Α) και μια πιο περίπλοκη (Β) σχηματική απεικόνιση της δομής της ιντεγκρίνης. Κύρια χαρακτηριστικά με βάση την πρωτοταγή και τεταρτοταγή ανάλυση της δομής της ανιχνεύονται μαζί με γνωστές ενεργές περιοχές. Οι ενεργές περιοχές σχετίζονται με τη φερόμενη Α περιοχή της β υπομονάδας, τις περιοχές σύνδεσης με τους EF βραχίονες και την Α περιοχή της α υπομονάδας (student.biology.arizona.edu/.../intro/intro2.htm; Newham και Humphries, 1996). Image 9. A simple (A) and a more complicated (B) schematic representation of the integrin structure. Key features, based on primary and tertiary structure analysis, are identified along with predicted active sites. Active sites have been associated with the putative β subunit A-domain, the EF-hand-liked domains and the α subunit A domain (student.biology.arizona.edu/.../intro/intro2.htm; Newham and Humphries, 1996). Οι ιντεγκρίνες των λευκοκυττάρων (β2 ιντεγκρίνες) Οι ιντεγκρίνες μπορούν να διακριθούν με βάση τη β υπομονάδα που περιέχουν. Οι χαρακτηριστικές ιντεγκρίνες των λευκοκυττάρων περιέχουν την β2 (CD18) υπομονάδα. Στις β2 ιντεγκρίνες έχει βρεθεί ότι οι δύο υπομονάδες περιέχουν πλήθος εξωκυττάριων δισουλφιδικών δεσμών, ενώ είναι εκτεταμένα Ν- γλυκοζυλιωμένες καθώς περιέχουν υψηλά επίπεδα μαννόζης και υψηλού μοριακού βάρους σάκχαρα (Asada και συν., 1991). Η κεφαλή της ιντεγκρίνης αποτελείται από εφτά περιοχές που αλληλεπιδρούν με την Α περιοχή της β υπομονάδας. Η σύνδεση της ιντεγκρίνης με το αντίστοιχο πρόσδεμά της γίνεται στην κορυφή της κεφαλής της. 27

43 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι β2 ιντεγκρίνες (γνωστές και ως CD11/CD18) περιλαμβάνουν τις αlβ2, αmβ2, την αxβ2 (γνωστή και ως p150,95 ή ως CD11c/CD18) και την αdβ2 (γνωστή και ως CD11d/CD18) (Krieglstein και Granger, 2001). Και οι τέσσερις λαμβάνουν μέρος στη διαδικασία προσκόλλησης των λευκοκυττάρων στο ενδοθήλιο, ενώ οι αlβ2 και αmβ2 συμμετέχουν στη διαδικασία μετανάστευσης χωρίς να αποκλείεται όμως και η συμμετοχή των αxβ2 και αdβ2 (Πίνακας 2). Οι β2 ιντεγκρίνες συνδέονται με τα ενδοκυτταρικά μόρια προσκόλλησης (ICAMs) που ανήκουν στην οικογένεια των ανοσοσφαιρινών. Καθεμιά από τις ιντεγκρίνες συνδέεται σε ένα ή περισσότερα μέλη της οικογένειας ICAM αλλά παράλληλα αναγνωρίζει και άλλους τύπους πρωτεϊνών, καθώς και πολυσακχαρίτες (Harris και συν., 2000). Η αλληλουχία RGD που αποτελεί κύριο χαρακτηριστικό των προσδεμάτων των περισσότερων τύπων ιντεγκρίνης δεν είναι απαραίτητη για τη σύνδεση των β2 ιντεγκρινών με τους αντίστοιχους προσδέτες τους (Harris και συν., 2000). Οι β2 ιντεγκρίνες εκφράζονται αποκλειστικά στα λευκοκύτταρα, εντούτοις όμως η κατανομή τους ποικίλλει μεταξύ των υποπληθυσμών των λευκοκυττάρων. Όλες οι β2 ιντεγκρίνες εκφράζονται στα ουδετερόφιλα, τα μονοκύτταρα και τα κύτταρα «φυσικοί φονείς» (natural killers). Η αlβ2 εκφράζεται κυρίως στα περιφερικά λεμφοκύτταρα του αίματος, ενώ η αdβ2 σε μυελομονοκυτταρικές (myelomonοcytic) σειρές και σε διαμερισματοποιημένα κύτταρα, όπως τα αφρώδη κύτταρα (Van der Vierer και συν., 1995). Το μεγαλύτερο ποσό της αmβ2 ιντεγκρίνης είναι αποθηκευμένο σε κυστίδια των λευκοκυττάρων και κινητοποιείται προς την επιφάνεια του κυττάρου πολύ γρήγορα έπειτα από διέγερση. 28

44 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 2. Εναλλακτική ονομασία, εντόπιση και προσδέματα των ιντεγκρινών (Krieglstein και Granger, 2001). Table 2. Alternative names, location and ligands of the integrins (Krieglstein and Granger, 2001). Μόριο προσκόλλησης Εναλλακτική ονομασία Εντόπιση Πρόσδεμα CD11a/CD18 LFA-1 αlβ2 Λευκοκύτταρα (Όλα) ICAM-1 ICAM-2 CD11b/CD18 Mac-1 αμβ2 Πολυμορφοπύρηνα, μονοκύτταρα ICAM-1 ic3b; Fb CD11c/CD18 p150,95 αxβ2 Πολυμορφοπύρηνα, μονοκύτταρα ic3b; Fb? CD11d/CD18 αdβ2 CD49d/CD29 VLA-4 α4β1 CD49d/β7 α4β7 Μυελομονοκυτταρικές σειρές, μακροφάγα Λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα, εωσινόφιλα, βασεόφιλα Λεμφοκύτταρα ICAM-1 ICAM-3 VCAM-1 Μόρια εξωκυττάρι ας ουσίας VCAM-1 MAdCAM1 φιμπρονεκτί νη Λειτουργία λευκοκυττάρων Προσκόλλη ση/μετανάστευση Προσκόλλη ση/μετανάστευση Προσκόλλη ση/μετανάστευση? Προσκόλλη ση/μετανάστευση? Προσκόλληση Προσκόλληση α2β1 ιντεγκρίνη Η ιντεγκρίνη α2β1 απαντάται και αυτή στα λευκοκύτταρα αλλά και σε πλήθος άλλων κυττάρων, όπως τα ενδοθηλιακά, τα αιμοπετάλια, τα επιθηλιακά, τους ινοβλάστες, τους οστεοβλάστες και τα χονδροκύτταρα. (Heino, 2000). Έχει χαρακτηριστεί ως υποδοχέας κολλαγόνου καθώς αναγνωρίζει τα κολλαγόνα Ι και IV (White και συν., 2004). Εντούτοις, αναγνωρίζει και διάφορους τύπους λαμινίνης συμπεριλαμβανομένης της λαμινίνης-1 (Hynes, 1992). Με βάση τα παραπάνω, η ιντεγκρίνη α2β1 έχει διπλή εξειδίκευση καθώς αναγνωρίζει τόσο τη λαμινίνη-1, όσο και το κολλαγόνο IV, ενώ απαντάται τόσο στα μονοκύτταρα όσο και τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής μελετήθηκε ο ρόλος της α2β1 ιντεγκρίνης σε γεγονότα κατά την έναρξη της αθηρωμάτωσης. Τα αυξημένα επίπεδα της ιντεγκρίνης α2β1 σχετίζονται άμεσα με την πρόκληση της αθηρωμάτωσης (Moshfegh και συν., 1999, Grenache και συν., 2003) και μάλιστα με την αγγειακή θρόμβωση που προκαλείται μετά το τραύμα του ενδοθηλίου (Grenache και συν., 29

45 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2003). Πέρα από την ιδιότητά της να προσκολλάται με πρωτεΐνες των βασικών μεμβρανών, η ιντεγκρίνη α2β1 συμμετέχει και σε πλήθος σηματοδοτικών μονοπατιών που έχουν ως τελικό αποτέλεσμα τη συστολή των ιστών και την αναγέννηση της εξωκυττάριας ουσίας (Heino, 2000). Ενεργές περιοχές των προσδεμάτων των ιντεγκρινών Τα προσδέματα των ιντεγκρινών περιέχουν ως περιοχές αναγνώρισης βραχείες αλληλουχίες (3-4 αμινοξέα), χωρίς ο ακριβής τους ρόλος να είναι απόλυτα γνωστός μέχρι σήμερα (Newham και Humphries, 1996). Η πιο γνωστή βραχεία ακολουθία που είναι υπεύθυνη για την προσκόλληση πλήθους πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας συμπεριλαμβανομένων του ινωδογόνου, της φιμπρονεκτίνης, της βιτρονεκτίνης και του παράγοντα vwf είναι η RGD (από τα αρχικά των αμινοξέων αργινίνη, γλυκίνη, ασπαριγινικό οξύ) (Humphries, 1990). Πρόσφατες μελέτες σε περιοχές σύνδεσης της φιμπρονεκτίνης και σε μέλη της οικογένειας των ανοσοσφαιρινών υπέδειξαν μια δεύτερη κοινή ακολουθία, την LDVP (λευκίνη, ασπαραγινικό, βαλίνη, προλίνη). Μάλιστα, ενώ η αλληλουχία των ακολουθιών RGD παραμένει αμετάβλητη, η αλληλουχία της LDVP ποικίλει εντός μιας συγκαταβατικής ακολουθίας, της L/I (ισολευκίνη)-d/e (γλουταμινικό)-s (σερίνη)/t(θρεονίνη)/v-p/s (σερίνη). Επιπρόσθετα με την LDVP, στα μόρια προσκόλλησης ICAM-1, VCAM-1 και ICAM-3 εντοπίζεται και μια δεύτερη ακολουθία που είναι σημαντική για τη σύνδεση με τις ιντεγκρίνες. Στο σημείο αυτό θα πρέπει να αναφερθεί ότι η παρουσία μιας συγκεκριμένης ακολουθίας σε μια πρωτεΐνη δεν εγγυάται τη δέσμευση με κάποια ιντεγκρίνη, ούτε είναι αναγκαία προϋπόθεση για την αναγνώριση από τον υποδοχέα (Newham και Humphries, 1996). 30

46 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Υπερ-οικογένεια ανοσοσφαιρινών Η οικογένεια των ανοσοσφαιρινών περιλαμβάνει διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που αποτελούνται από μια σειρά επαναλαμβανόμενων εξωκυτταρικών περιοχών με δομή παρόμοια με αυτή των ανοσοσφαιρινών, μια διαμεμβρανική περιοχή και μια βραχεία κυτταροπλασματική ουρά. Τα μόρια προσκόλλησης της συγκεκριμένης οικογένειας σχετίζονται με ασθένειες του αγγειακού συστήματος, όπως η αθηρωμάτωση και περιλαμβάνουν: τα διακυτταρικά μόρια προσκόλλησης 1, 2 και 3 (Intercellular Adhesion Molecules, ICAM-1, 2 και 3), το μόριο προσκόλλησης των αιμοπεταλίων και ενδοθηλιακών κυττάρων-1 (Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1, PECAM-1) καθώς και το αγγειακό μόριο προσκόλλησης-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule-1, VCAM-1) (Huo και Ley, 2001). Η έκφραση των ICAM-1 και VCAM-1 αυξάνεται μετά την ενεργοποίηση του ενδοθηλίου από κυτοκίνες φλεγμονής, ενώ το PECAM-1 εκφράζεται συνεχώς από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Το ICAM-2 αποτελεί μια περικομμένη μορφή του ICAM-1 και εκφράζεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Σε αντίθεση με το ICAM-1 όμως, η έκφρασή του δεν αυξάνεται στα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα (Nortamo et al, 1991). Το VCAM-1 εκφράζεται σε αμελητέα ποσότητα στα μη ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα, ενώ υπό την επίδραση κυτοκινών η έκφρασή του αυξάνεται σημαντικά. Τόσο το ICAM-1 όσο και το ICAM-2 απαντώνται και στα λευκοκύτταρα (Blankenberg και συν., 2003). Τέλος, το PΕCAM εκφράζεται συνεχώς στο ενδοθήλιο, τα λευκοκύτταρα και τα αιμοπετάλια. Το μόριο προσκόλλησης VCAM-1 αποτελεί σημαντικό πρόσδεμα για την ιντεγκρίνη α4β1, ενώ τα ICAM-1 και ICAM-2 συνδέονται με τις ιντεγκρίνες αlβ2 και αμβ2 (Krieglstein και Granger, 2001). Επίσης, το PECAM-1 συνδέεται με άλλα μόρια PECAM-1 άλλων κυττάρων καθώς και με την ιντεγκρίνη ανβ3. Παρεμπόδιση δράσης ή απώλεια ενός ή και περισσοτέρων μελών της οικογένειας αυτών των ανοσοσφαιρινών μειώνει σημαντικά την προσκόλληση των λευκοκυττάρων στο ενδοθήλιο, ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις επηρεάζει και την κυκλική μετακίνησή τους πάνω σε αυτό (Huo και Ley, 2001). Στον ακόλουθο πίνακα (Πίνακας 3) συνοψίζονται στοιχεία για την εναλλακτική ονομασία των μορίων προσκόλλησης, την εντόπιση και τα προσδέματα τους, καθώς και τη λειτουργία των λευκοκυττάρων την οποία μεσολαβούν (Krieglstein και Granger, 2001). 31

47 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 3. Εναλλακτική ονομασία, εντόπιση και προσδέματα των μελών της οικογένειας των ανοσοσφαιρινών (Krieglstein και Granger, 2001). Table 3. Alternative names, location and ligands of the members of the immunoglobin family (Krieglstein and Granger, 2001). Μόριο προσκόλλησης Εναλλακτική ονομασία Εντόπιση Πρόσδεμα Λειτουργία λευκοκυττάρων ICAM-1 CD54a Ενδοθήλιο, μονοκύτταρα αlβ2 αμβ2 Προσκόλληση/Μετανάστευση ICAM-2 CD102 Ενδοθήλιο αlβ2 VCAM-1 CD106 Ενδοθήλιο CD31 Ενδοθήλιο, λευκοκύτταρα, αιμοπετάλια α4β1 PECAM-1 άλλων κυττάρων, ανβ3 Σελεκτίνη L α4/β7 PECAM-1 MAdCAM-1 Ενδοθήλιο (εντέρου) Προσκόλληση/ Μετανάστευση Προσκόλληση Προσκόλληση/ Μετανάστευση Προσκόλληση/ Μετανάστευση Στην παρούσα εργασία το ενδιαφέρον εστιάστηκε στο μόριο προσκόλλησης ICAM-1, δεδομένου του κεντρικού ρόλου που έχει στη διαδικασία της προσκόλλησης των μονοκυττάρων της κυκλοφορίας στο ενδοθήλιο. Στην προσκόλληση συμμετέχει και το PECAM-1, αλλά η έκφραση του μορίου αυτού είναι σταθερή στα ενδοθηλιακά κύτταρα και δεν επάγεται από την ενεργοποίησή τους. Αντίθετα, η έκφραση των μορίων προσκόλλησης ICAM-1 και VCAM-1 επάγεται μετά από την ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων, γεγονός που παρουσιάζει ενδιαφέρον. Συγκριτικά με το VCAM-1, το ICAM-1 έχει περισσότερα πλεονεκτήματα που το καθιστούν σημαντικό εργαλείο για τη μελέτη της αθηρωμάτωσης. Πιο συγκεκριμένα, το ICAM-1 πέρα από την προσκόλληση μεσολαβεί και το στάδιο της μετανάστευσης των μονοκυττάρων. Επίσης, ο προαγωγέας του γονιδίου που κωδικοποιεί για το ICAM-1 πέρα από τον παράγοντα NFkB, ο οποίος ρυθμίζει και τον προαγωγέα του γονιδίου που κωδικοποιεί για το VCAM-1, ρυθμίζεται επιπρόσθετα και από τον παράγοντα AP-1. Τέλος, η έκφραση του VCAM-1 είναι επαγόμενη μόνο σε ορισμένα όργανα, όπως η καρδιά, ενώ σε άλλα, όπως ο πνεύμονας, παραμένει σταθερή. Επομένως με βάση όλα τα παραπάνω, μελετώντας την έκφρασή του ICAM-1 εξασφαλίζεται μια πιο ολοκληρωμένη εικόνα των διεργασιών που πραγματοποιούνται στην αθηρωμάτωση. 32

48 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ICAM-1 o Δομή και γενικά χαρακτηριστικά Το ICAM-1 (CD54) αποτελείται από πέντε διακριτές περιοχές που ομοιάζουν με αυτές των ανοσοσφαιρινών, μια διαμεμβρανική περιοχή καθώς και μια κυτταροπλασματική ουρά. o Ρύθμιση Η έκφρασή του ρυθμίζεται σε μεταγραφικό επίπεδο από τέσσερα διαφορετικά μονοπάτια: 1) τον μεταγραφικό παράγοντα NFkB, 2) τον μεταγραφικό παράγοντα AP-1 και τις ΜΑΡ κινάσες, 3) την πρωτεϊνική κινάση C (PKC) και τέλος, 4) τις πρωτεϊνικές κινάσες JAK/STAT (Janus kinase/signal transducers and activators of transcription) και την ιντερφερόνη IFN-γ (Roebuck και Finnegan, 1999). Ο NFkB επάγεται από τη δράση φλεγμονωδών κυτοκινών μέσω ενεργοποίησης του παράγοντα ΝΙΚ (Shrikant και συν., 1994) και οδηγεί στη μεταγραφή του ICAM-1 (Εικόνα 10). Μάλιστα αυτός ο μηχανισμός είναι ο πιο κοινός όσον αφορά την επαγωγή έκφρασης του ICAM-1 στους διαφόρους τύπους των κυττάρων. Επίσης, αυξητικοί παράγοντες ή κυτοκίνες ενεργοποιούν τις κινάσες ERK1 και ERK2, οι οποίες στη συνέχεια συνδέονται με τους εκκινητές του μεταγραφικού παράγοντα Fos. Στο μεταξύ, άλλες κυτοκίνες ή οξειδωτικές ουσίες ενεργοποιούν είτε το JNK, είτε το p38 σηματοδοτικό μονοπάτι που με τη σειρά τους ενεργοποιούν τους παράγοντες που προάγουν τη μεταγραφή του μεταγραφικού παράγοντα Jun. Ακολουθεί διμερισμός των Fos και Jun και σχηματισμός ενός μεταγραφικού παράγοντα που συνδέεται με τον ΑΡ-1 επάγοντας τη μεταγραφή του ICAM-1 (Karin και συν., 1997). Το ICAM-1 ρυθμίζεται και έμμεσα από την PKC. Πιο συγκεκριμένα, οι ενεργοποιητές της PKC αυξάνουν την έκφραση του ICAM-1. Η PKC θεωρείται απαραίτητη για την έκφραση του ICAM-1 πιθανότατα συσχετιζόμενη με κάποιους από τους υπόλοιπους μηχανισμούς ρύθμισης (ΤΝF-a, IFN-g, IL-1b και στρεσογόνους παράγοντες). Ενώ ο ακριβής μηχανισμός της ρύθμισης μέσω της PKC δεν είναι πλήρως κατανοητός, εντούτοις όμως έχει βρεθεί ότι φαρμακολογική αναστολή της δράσης της PKC αναστέλλει αυτόματα τη μεταγραφή του ICAM-1 (Rahman και συν., 1999). Τέλος, ένα ακόμη σηματοδοτικό μονοπάτι που συμμετέχει στη μεταγραφική ρύθμιση του ICAM-1 είναι αυτό της ιντερφερόνης γ (IFN-γ), όπου τα ομοδιμερή 33

49 ΕΙΣΑΓΩΓΗ STAT συνδέονται στα στοιχεία IRE (Interferon-γ Response Element) επάγοντας τη μεταγραφή του ICAM-1. Εικόνα 10. Σχηματική απεικόνιση της ρύθμισης της μεταγραφής του ICAM-1 μέσω του NF-kB και του AP-1 (Niessen και συν., 2002) Image 10. Schematic of regulation of ICAM-1 transcription via NF-kB and AP-1 (Niessen et al., 2002). o Λειτουργία Οι κύριοι υποδοχείς σύνδεσης του ICAM-1 είναι οι ιντεγκρίνες, που μεσολαβούν τόσο τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυττάρων όσο και τη διαδικασία μεταβίβασης σήματος. Το ICAM-1 συνδέεται κατά κύριο λόγο με δύο ιντεγκρίνες της β2 υπο-οικογένειας, την αlβ2 και την αμβ2. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δύο αυτών μορίων δίνουν τη δυνατότητα στο ICAM-1 να διαδραματίζει κεντρικό ρόλο σε δύο σημαντικές ανοσολογικές λειτουργίες: τη λειτουργία των Τ κυττάρων και τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ λευκοκυττάρων και ενδοθηλιακών κυττάρων. Το ICAM-1 μεσολαβεί επίσης τη σταθερή προσκόλληση των λευκοκυττάρων και ακολούθως σηματοδοτεί τη μετανάστευσή τους διαμέσου του ενδοθηλίου. Η έκφρασή του ρυθμίζεται εξειδικευμένα από κυτοκίνες και άλλους παράγοντες που σχετίζονται με τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις. Στην εικόνα 11 παρουσιάζονται οι κύριες οδοί σηματοδότησης από το ICAM1. 34

50 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 11. Σχηματική απεικόνιση της επαγωγής σήματος σε κύτταρα έπειτα από σύνδεση του ICAM1 με κάποια β2 ιντεγκρίνη (Hubbard και Rothlein, 2000). Image 11. Schematic of signal transduction in cells after interaction of ICAM-1 with a β2 integrin ligand. (Hubbard and Rothlein, 2000). Η ακριβής απόκριση στην προσκόλληση του ICAM-1 με τους προσδέτες του εξαρτάται άμεσα από τον τύπο του κυττάρου. Για παράδειγμα, ενεργοποίηση του ICAM-1 σε ενδοθηλιακά κύτταρα επάγει την παραγωγή κυτοκινών ή την αυξημένη έκφραση περισσοτέρων μορίων προσκόλλησης (ICAM-1 ή VCAM). Από την άλλη, σύνδεση του ICAM-1 σε λεμφοκύτταρα ενισχύει το ρόλο του στην αντιγονοπαρουσίαση μέσω αύξησης της έκφρασης του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας MHC II. Τέλος, ενεργοποίηση του ICAM-1 στα μακροφάγα ενισχύει το ρόλο του στην ενεργοποίηση λεμφοκυττάρων ή σε διεργασίες φλεγμονής (Hubbard και Rothlein, 2000). 35

51 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2. Μόρια της εξωκυττάριας ουσίας (ECM)-Βασικές μεμβράνες (ΒΜ) Οι βασικές μεμβράνες είναι λεπτές στιβάδες εξωκυττάριου υλικού με ιδιαίτερη σύσταση και λειτουργία. Πρόκειται για εξωκυττάριους σχηματισμούς πάχους nm που αποτελούνται από ένα δίκτυο κολλαγόνου, γλυκοπρωτεϊνών και πρωτεογλυκανών. Βασικές μεμβράνες διαθέτουν όλα τα σπονδυλωτά, αλλά και τα ασπόνδυλα, με μοναδική εξαίρεση τους σπόγγους. Συνήθως, βρίσκονται κάτω από το επιθήλιο των διαφόρων συστημάτων (πεπτικό, αναπνευστικό, ουροποιητικό), αλλά συχνά περιβάλλουν ολόκληρο τον ιστό (Kefalides και συν., 1979). Σε ορισμένες περιπτώσεις οι βασικές μεμβράνες διαχωρίζουν τα κύτταρα από τον ιστό που τα περιβάλλει (επιθήλιο, νεφροί). Μορφολογικά η βασική μεμβράνη διαιρείται στις τρεις ακόλουθες στιβάδες: τη διαυγή (lamina lucida), την πυκνή (lamina densa) και σε ορισμένες περιπτώσεις υπάρχει και μια ακόμη με ίνες κολλαγόνου (lamina fibroreticularis) (Kefalides και συν., 1979). Τα κύρια συστατικά των βασικών μεμβρανών είναι τα μακρομόρια της εξωκυττάριας ουσίας, όπως το κολλαγόνο τύπου IV (σε τριμερή μορφή που διακόπτεται από μη ελικοειδείς περιοχές), η λαμινίνη, η εντακτίνη-νιδωγόνο και περλεκάνη (Εικόνα 12) (Charonis και Tsilibary 1990, Yurchenco και Schittny, 1990). Η παραπάνω σύσταση προσδίδει στην όλη δομή συγκεκριμένη λειτουργικότητα. Έτσι, οι βασικές μεμβράνες συμβάλλουν στη διαμερισματοποίηση αναπτυσσόμενων οργάνων, στη διατήρηση της πολικότητας των των επιθηλιακών κυττάρων, ενώ παρεμποδίζουν τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Οι αλληλεπιδράσεις των συστατικών των βασικών μεμβρανών με τα κύτταρα είναι καθοριστικές για τον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της μετανάστευσης και της διαφοροποίησης (Sorokin και συν., 2001). Παράλληλα, οι βασικές μεμβράνες λειτουργούν και ως εκλεκτικά φίλτρα διήθησης, ενώ επηρεάζουν και το φαινότυπο παρακείμενων κυττάρων. Παράλληλα, μελετάται η συμβολή τους σε διεργασίες, όπως η κυτταρική σηματοδότηση, η προσκόλληση των κυττάρων και η επούλωση των τραυμάτων. 36

52 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 12. Μοντέλο των βασικών μεμβρανών. Αν και η ακριβής σύσταση των βασικών μεμβρανών δεν είναι ίδια σε όλους τους ιστούς, το βασικό μοντέλο είναι κοινό. Έτσι, η δομή τους είναι αποτέλεσμα απευθείας συνδέσεων ανάμεσα στην περλεκάνη, τη λαμινίνη, την εντακτίνη και το κολλαγόνο τύπου IV (Yurchenco και Schittny, 1990). Image 12. Model of the basement membranes. Although the exact establishment of the basement membranes is not the same in all tissues, its basic model is common. Thus, their structure is the result of intact connections between perlecan, laminin, entactin and collagen IV (Yurchenco and Schittny, 1990). Τα τελευταία χρόνια οι βασικές μεμβράνες και τα συστατικά τους αποτελούν αντικείμενο εντατικής έρευνας, δεδομένων των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών τους. Είναι γεγονός ότι μεγάλη ώθηση στην έρευνα της βιοχημείας των βασικών μεμβρανών έδωσε η ανακάλυψη του σαρκώματος EHS (Engelbreth-Holm-Swarm). Πρόκειται για όγκο που είναι μεταμοσχεύσιμος υποδόρια σε μύες και παράγει μεγάλη ποσότητα βασικής μεμβράνης (Orkin και συν., 1977). Πέρα από τα κύρια δομικά συστατικά που αναφέρθηκαν παραπάνω, στις βασικές μεμβράνες απαντώνται και άλλα, όπως το κολλαγόνο τύπου XVIII και η SPARC/οστεονεκτίνη, πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με διάφορους τρόπους με τις λαμινίνες, το κολλαγόνο IV, την περλεκάνη και το νιδωγόνο ερμηνεύοντας έτσι την ποικιλομορφία στη σύνθεση και τη δομή των βασικών μεμβρανών (Kramer, 2005). Τα κύτταρα των ιστών, συνδέονται μεταξύ τους και συνιστούν ένα οργανωμένο λειτουργικό σύνολο. Τα περισσότερα κύτταρα εκκρίνουν βιομόρια, που 37

53 ΕΙΣΑΓΩΓΗ συνήθως παραμένουν στη γειτονία της πλασματικής μεμβράνης, σχηματίζοντας την εξωκυττάρια ουσία (extracellular matrix-ecm). Με τον όρο εξωκυττάρια ουσία, αναφερόμαστε σε ένα σύστημα αλληλοσυμπλεκόμενων μακρομορίων, που παρεμβάλλονται μεταξύ κυττάρων και ιστών και επηρεάζουν τη συμπεριφορά τους (Bruijn και συν., 1988). Η εξωκυττάρια ουσία, αλληλεπιδρά με τις γλυκοπρωτεΐνες και τα γλυκολιπίδια της κυτταρικής επιφάνειας και συμβάλλει σημαντικά στην επιβίωση και λειτουργικότητα των κυττάρων και ιστών. Η εξωκυττάρια ουσία περιέχει: α) ινώδεις πρωτεΐνες, οι οποίες διακρίνονται σε δομικές (ελαστίνη, κολλαγόνο) και σε πρωτεΐνες προσκόλλησης (λαμινίνη, φιμπρονεκτίνη), και β) γλυκοζαμινογλυκάνες, ελεύθερες ή συνδεμένες με πρωτεΐνες-πρωτεογλυκάνες (Lohr και συν., 1991). Σε ορισμένους ιστούς, όπως στα οστά και στους τένοντες, το εξωκυττάριο στρώμα είναι άφθονο και εξαιρετικά σημαντικό από μηχανική άποψη. Αντίθετα, σε ιστούς όπως στους μύες και στην επιδερμίδα, είναι λιγοστό και το μηχανικό φορτίο το αναλαμβάνουν τα κύτταρα μέσω του κυτταροσκελετού. Θα πρέπει να αναφερθεί ότι κάθε τύπος ιστού χαρακτηρίζεται από έναν μοναδικό συνδυασμό βιομορίων της ECM. Παράλληλα, είναι χαρακτηριστικό πως η εξωκυττάρια ουσία έχει την ικανότητα να ανακυκλώνεται. Λαμινίνες-Λαμινίνη-1 o Γενικά Οι λαμινίνες, μαζί με τις φιμπρονεκτίνες, αποτελούν τις καλύτερα μελετημένες, μετά τα κολλαγόνα, οικογένειες γλυκοπρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας. Η αρχική περιγραφή τους, έγινε μετά από απομόνωσή τους από τον όγκοσάρκωμα Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) των ποντικών (Timpl και συν., 1979) και καλλιέργειες κυττάρων τερατοκαρκινώματος, (Chung και συν., 1979). Η πρώτη λαμινίνη, που απομονώθηκε από τον Timpl από υλικό του όγκου EHS ονομάζεται λαμινίνη-1 (Timpl και συν., 1979, Dziadek και Timpl, 1985). Γενικά, οι λαμινίνες είναι μια οικογένεια γλυκοπρωτεϊνών που αποτελούν συστατικά των βασικών μεμβρανών και εμπλέκονται σε γεγονότα αλληλεπίδρασης μεταξύ παρεγχύματος και συνδετικού ιστού. Αποτελούν τις πιο πρώιμες πρωτεΐνες προσκόλλησης, που εμφανίζονται κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη. Είναι μάλιστα χαρακτηριστικό ότι ανιχνεύτηκαν κατά το στάδιο των 2 κυττάρων στα έμβρυα ποντικού. 38

54 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι λαμινίνες συμμετέχουν στην κυτταρική προσκόλληση, διαφοροποίηση, μετανάστευση, πολλαπλασιασμό, κινητικότητα, αλλά και στην ανάπτυξη όγκων (Kuchenbauer και συν., 2003). Παράλληλα, αποδείχτηκε πως εμπλέκονται στην οργάνωση του δικτύου των βασικών μεμβρανών και στη ρύθμιση της διαφοροποίησης των κυττάρων στον καρκίνο του ορθού (De Arcangelis και συν., 1996). Παράλληλα λαμινίνη ανιχνεύεται και σε πλήθος ενδοκρινών αδένων και μάλιστα αποτελεί ρυθμιστικό παράγοντα στην ομοιόσταση των επινεφριδίων. o Δομή και ισομορφές Η λαμινίνη είναι μια γλυκοπρωτεΐνη υψηλού μοριακού βάρους (Μr=450,000900,000). Αποτελείται από 3 αλυσίδες, τις α, β και γ, που συνδέονται μεταξύ τους με δισουλφιδικούς δεσμούς (Ekblom και Timpl, 1996). Οι λαμινίνες έχουν είτε σχήμα σταυρού είτε σχήμα Τ (ταφ). Μέχρι σήμερα έχουν απομονωθεί πέντε α, τρεις β και τρεις γ αλυσίδες που με διαφορετικούς συνδυασμούς δίνουν 15 ισομορφές λαμινίνης (Εικόνα 13) (Ponce και συν., 2003, Kariya και Miyazaki, 2004). Καθεμιά από τις τρεις αλυσίδες κωδικοποιείται από διαφορετικό γονίδιο και μετάλλαξη αυτών μπορεί να οδηγήσει στην πρόκληση σοβαρών ασθενειών (De Arcangelis και συν., 2001). Η λαμινίνη-1 είναι της μορφής, α1β1γ1 (Εικόνα 14) και περιέχει μια βαριά αλυσίδα, την α1 (ΜΒ=400 kda) και δύο ελαφριές, τη β1 και τη γ1 (ΜΒ=230 και 220 kda αντίστοιχα). Είναι χαρακτηριστικό ότι κάθε πολυπεπτιδική αλυσίδα περιέχει τουλάχιστον 1500 αμινοξέα. Εικόνα 13. Οι διαφορετικοί συνδυασμοί των μέχρι σήμερα γνωστών 5 α, 3 β και 3 γ αλυσίδων που δίνουν 15 διαφορετικούς τύπους λαμινίνης (Ekblom και συν., 2003). Image 13. Different combinations of the until today known 5 α, 3 β and 3 γ chains that form 15 different types of laminin (Ekblom et al., 2003). 39

55 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Από τις πέντε άλφα αλυσίδες που βρέθηκαν, οι α1, α2 και α5 είναι μακριές, σε αντίθεση με τις α3 και α4 που είναι πιο κοντές. Παρατηρείται μεγάλη ποικιλία στο αμινοτελικό τους άκρο, αλλά ένα κοινό τους χαρακτηριστικό είναι η παρουσία στην καρβοξυτελική περιοχή όλων των αλυσίδων, μιας σφαιρικής περιοχής, του τομέα G G-domain (Colognato και Yurchenco, 2000). Όσον αφορά τις τρεις β αλυσίδες, οι β1 και β2 εμφανίζουν ομολογία σε ποσοστό 50%, ενώ η β3, 36%. Την πιο ευρεία εξάπλωση την έχει η αλυσίδα β1 που εντοπίζεται στους περισσότερους ιστούς. Ευρεία ιστική εξάπλωση έχει και η αλυσίδα γ1, σε αντίθεση με τις άλλες δύο, την γ3 και γ2. Από τον συνδυασμό των διαφορετικών ισομορφών των αλυσίδων της αλμινίνης προέκυψαν 15 διαφορετικοί τύποι λαμινίνης. Τα περισσότερα στοιχεία που είναι γνωστά αφορούν κυρίως τις λαμινίνες 1-7 (Πίνακας 4). Πίνακας 4. Παλιά ονομασία και εντοπισμός των μορίων λαμινίνης 1-7 (Burgeson και συν, 1994). Table 4. Previous names and location of the laminins 1-7 (Burgeson et al., 1994). Ισομορφή Λαμινίνη 1 Λαμινίνη 2 Λαμινίνη 3 Λαμινίνη 4 Λαμινίνη 5 Λαμινίνη 6 Λαμινίνη 7 Παλιά ονομασία Κλασσική λαμινίνη Μεροσίνη S-λαμινίνη S-μεροσίνη Καλινίνη/νισεΐνη Κ-λαμινίνη ΚS-λαμινίνη Εντοπισμός Στους περισσότερους ιστούς Καρδιά, πλακούντας, μύες Νεφρός, νευρομυϊκή σύναψη Τροφοβλάστης Επιδερμικά αγκυροβολητικά ινίδια Επιδερμικά αγκυροβολητικά ινίδια Ένωση επιδερμίδαςδερμίδας Η λαμινίνη-1 εντοπίζεται στους περισσότερους ιστούς, αλλά δεν απαντάται στο μυελό των οστών και στο τοίχωμα των περισσοτέρων αγγείων (Falk και συν., 1999). Αντίθετα, εκεί συναντώνται οι ισομορφές 8 και 10 που είναι της μορφής α4β1γ1 και α5β1γ1 αντίστοιχα (Εkblom και συν., 2003). Το κοινό αυτών των ισομορφών με τη λαμινίνη-1 είναι ότι έχουν ίδιες β και γ αλυσίδες (β1, γ1). 40

56 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι λειτουργίες που επιτελούν οι λαμινίνες είναι απόρροια της χαρακτηριστικής τους δομής. Σχετικά με την εύρεση των δομικών χαρακτηριστικών των μορίων λαμινίνης, το ενδιαφέρον επικεντρώθηκε στη λαμινίνη-1, η βασική δομή της οποίας υπάρχει σε όλες τις λαμινίνες με ορισμένες τροποποιήσεις. Μέχρι σήμερα είναι γνωστές τουλάχιστον έντεκα ιντεγκρίνες που συνδέονται στη λαμινίνη, οι α1β1, α2β1, α3β1, α6β1, α6β4, α7β1, α9β1, ανβ3, ανβ8, αlβ2 και αmβ2 (Sonnenberg και συν., 1990; Sonnenberg και συν., 1991; Jiang και συν., 1994). Από τις παραπάνω, η α6β1 είναι η καλύτερα μελετημένη, εξαιτίας του σημαντικού βιολογικού της ρόλου και της ευρείας κατανομής της. Σε αντίθεση, η ιντεγκρίνη α7β1 σπάνια προσκολλάται στη λαμινίνη. Οι περιοχές πρόσδεσης των ιντεγκρινών α1β1 και α2β1 εντοπίζονται στο αμινοτελικό άκρο της α1 αλυσίδας. Στην εικόνα 14 παρατηρούνται και κάποιες περιοχές Ε3 και Ε8 που αποτελούν υποστρώματα για την προσκόλληση κυττάρων. Έτσι, στην Ε8 υπάρχουν οι περιοχές σύνδεσης με τις ιντεγκρίνες α6β1, α6β4 και α7β1, ενώ στην Ε3 περιοχές σύνδεσης με περλεκάνες, ηπαρίνη κ.τ.λ. Εικόνα 14. Σχηματική αναπαράσταση της δομής του μορίου της λαμινίνης-1. Οι σφαιρικές περιοχές αναπαρίστανται με κύκλους. LN= Αμινοτελική περιοχή της λαμινίνης (περιοχή VI); L4=Περιοχή λαμινίνης IV; LG=Λαμινίνη που ομοιάζει με G; LE= Περιοχές λαμινίνης που ομοιάζουν με τον παράγοντα EGF. Οι περιοχές πρόσδεσης με την εξωκυττάρια ουσία ή με συστατικά της κυτταρικής επιφάνειας αναπαρίστανται με βέλη. Τα τεμάχια E3 και E8 ελαστάσης απεικονίζονται με διακεκομμένες γραμμές. Η περιοχή σύνδεσης ανάμεσα στις LG3 και LG4 δεν είναι γνωστή. Οι περιοχές I και II και των τριών αλυσίδων σχηματίζει ένα σπειρωμένο σπείραμα, αλλά για λόγους απλούστευσης αναπαρίσταται ως ίσια λεπτά ορθογώνια (Ekblom και συν., 2003). 41

57 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Image 14. Schematic representation of the structure of the laminin-1 molecule. Globular domains are represented by circles. LN=Laminin NH2-terminal (domain VI); L4=laminin domain IV; LG=Laminin G-like; LE=laminin EGF-like modules. Binding sites to extracellular matrix or cell surface components are shown with arrows. The E3 and E8 elastase fragments are indicated by dashed lines. The link region between LG3 and LG4 is not known. Domains I and II of all three chains form a coiled-coil, but is shown for simplicity as straight thin rectangles (Ekblom et al., 2003). Κολλαγόνο IV o Γενικά Το κολλαγόνο τύπου IV αποτελεί μέλος της υπερ-οικογένειας κολλαγόνων που απαριθμεί 28 μέλη στα σπονδυλωτά (Veit και συν., 2006). Σε αντίθεση με τους περισσότερους τύπους κολλαγόνου, το κολλαγόνο IV απαντάται αποκλειστικά στις βασικές μεμβράνες και εμπεριέχει μέχρι έξι γενετικά διακριτές α αλυσίδες [α1 (IV)α6 (IV)]. Οι παραπάνω αλυσίδες αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και συναθροίζονται με απόλυτη εξειδίκευση προκειμένου να σχηματίσουν τρία ετεροδιμερή: το α1α1α2, το α3α4α5 και το α5α5α6. Οι αλυσίδες α1 και α2 ήταν οι πρώτες χρονολογικά που περιγράφηκαν, ονομάζονται «κλασσικές» αλυσίδες και απαντώνται στις βασικές μεμβράνες όλων των ιστών, ενώ οι άλλες τέσσερις αλυσίδες έχουν περιορισμένη ιστική κατανομή (Khoshnoodi και συν., 2008). Για παράδειγμα, οι αλυσίδες α3, α4 και α5 εντοπίζονται στη σπειραματική βασική μεμβράνη των νεφρών, των πνευμόνων, των όρχεων και του ματιού, ενώ οι α5 και α6 στη βασική μεμβράνη του δέρματος, των λείων μυών και των νεφρών. o Δομικά χαρακτηριστικά και υπερ-μοριακή οργάνωση Η οικογένεια του κολλαγόνου IV περιέχει έξι γενετικά διακριτές α αλυσίδες με υψηλή ομολογία. Καθεμιά αλυσίδα περιλαμβάνει CD11b τρεις δομικά διακριτές περιοχές: μια αμινοτελική περιοχή πλούσια σε υπολείμματα κυστεΐνης και λυσίνης που ονομάζεται 7S από την ταχύτητα καθίζησής της, μια σειρά επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών Gly-X-Y περίπου 1400 καταλοίπων και μια καρβοξυτελική μη κολλαγονώδη περιοχή (noncollagenous-nc) μήκους περίπου 230 καταλοίπων, η οποία ακολουθεί (Εικόνα 15) (Hudson και συν., 2003). Όταν τα μόρια τριπλής έλικας εκκριθούν στην εξωκυττάρια ουσία, αλληλεπιδρούν μεταξύ τους σχηματίζοντας διακριτά δίκτυα που παρέχουν ένα είδος «μοριακής σκαλωσιάς» με το οποίο μπορούν να αλληλεπιδράσουν συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας, όπως οι λαμινίνες, οι περλεκάνες και οι πρωτεογλυκάνες. Έτσι, μέσω πολύπλοκων ενδομοριακών αλληλεπιδράσεων, τα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας σχηματίζουν βασικές 42

58 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μεμβράνες με ιστική εξειδίκευση μετέχοντας με τον τρόπο αυτό σε πλήθος διαδικασιών, όπως η κυτταρική προσκόλληση, μετανάστευση και ανάπτυξη, η αναγέννηση των ιστών, η επούλωση πληγών κ.α (Khoshnoodi και συν., 2008). Εικόνα 15: Σχηματικό διάγραμμα (Α) της δομής του κολλαγόνου IV και (Β) της σύνταξής του σε ολιγομερή. Στο μέρος Α διακρίνονται οι τρεις διακριτές περιοχές του κολλαγόνου IV: η αμινοτελική 7S, το κεντρικό τμήμα τριπλής έλικας και η μη κολλαγονώδης (NC1) περιοχή, ενώ η τριπλή έλικα διακόπτεται από τμήματα μη κολλαγονώδους αλληλουχίας (μαύρες κάθετες γραμμές). Στο μέρος Β διακρίνεται ο σχηματισμός διμερών με την ένωση των καρβοξυτελικών NC1 περιοχών δύο μακρομορίων κολλαγόνου IV, ο σχηματισμός τετραμερών με τη σύνδεση τεσσάρων 7S περιοχών και πλάγιες αλληλεπιδράσεις μεταξύ διμερών, μέσω της δέσμευσης της NC1 περιοχής κατά μήκος του μορίου και του σχηματισμού υπερέλικας. Οι παραπάνω δομές συμμετέχουν στο σχηματισμό του δικτύου του κολλαγόνου IV (Yurchenco και Furthmayr, 1984). Image 15: Schematic diagram of (A) collagen IV structure and (B) its construction to oligomers. In part A the three distinct collagen IV domains are shown: the amino-terminal 7S, the major triple-helix part and the non-collagenous (NC1) domain, while the triple helix is interrupted by non-collagenous sequences (black vertical lines). In part B they are shown the formation of dimmers after the attachment between the carboxy-terminal NC1 domains of two collagen IV molecules, the formation of tetramers after the attachment between four 7S domains and side interactions between dimmers, through attachment of the NC1 domain along the molecule and the hyper-helix formation. The above domains participate in collagen IV net formation (Yurchenco and Furthmayr, 1984). o Αλληλεπιδράσεις με υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας Το κολλαγόνο IV εκτός από την κύρια ιδιότητά του να παρέχει ένα είδος ικριώματος-«σκαλωσιάς» απαραίτητου για τη συνάθροιση και τη μηχανική σταθερότητα, αποτελεί και σημαντικό παράγοντα για τις αλληλεπιδράσεις των κυττάρων με την υποκείμενη βασική μεμβράνη. Το κολλαγόνο IV αποτελεί το υπόστρωμα προσκόλλησης για μια ποικιλία κυττάρων, όπως τα ενδοθηλιακά (Cheng και Kramer, 1989), τα μεσαγγειακά (Setty και συν., 1988) τα παγκρεατικά (Kaido και συν., 2004), τα καρκινικά κύτταρα (Dedhar και συν., 1993; Knight και συν., 2000) και τα ηπατοκύτταρα (Rubin και συν., 1981). Η κυτταρική προσκόλληση 43

59 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μεσολαβείται από πολλαπλές περιοχές σύνδεσης που εντοπίζονται τόσο στη μη κολλαγονώδη (NC1) περιοχή, όσο και στην περιοχή της τριπλής έλικας, γεγονός που μαρτυρά τη συμμετοχή πλήθους υποδοχέων προσκόλλησης (Chelberg και συν., 1989). Οι υποδοχείς αυτοί διακρίνονται σε ιντεγκρινικούς και μη ιντεγκρινικούς. Παρά το γεγονός ότι υπάρχει πλήθος RGD αλληλουχιών στην περιοχή της τριπλής έλικας των α αλυσίδων αρκετών τύπων κολλαγόνου, πλήθος ερευνών έχει δείξει ότι η προσκόλληση των κυττάρων στο κολλαγόνο IV είναι ανεξάρτητη του πεπτιδίου RGD (Herbst και συν.,1988; Kim και συν., 1994), πιθανότατα γιατί λόγω της φύσης της τριπλής έλικας οι ιντεγκρίνες δεν έχουν πρόσβαση στις RGD αλληλουχίες. Οι κυριότεροι υποδοχείς κολλαγόνου ανήκουν στη β1 υπο-οικογένεια των ιντεγκρινών και είναι οι α1β1 και α2β1 (Leitinger και Hohenester, 2007). Και οι δύο ιντεγκρίνες συνδέονται με το κολλαγόνο IV και το κολλαγόνο Ι αλλά με διαφορετική εξειδίκευση. Πιο συγκεκριμένα, η α1β1 εμφανίζει μεγαλύτερη εξειδίκευση για το κολλαγόνο IV, ενώ η α2β1 προσκολλάται περισσότερο στο κολλαγόνο Ι (Tulla και συν., 2001). Μια περιοχή σύνδεσης της ιντεγκρίνης α2β1 είναι μια βραχεία ακολουθία του πεπτιδίου GFOGER (γλυκίνη-φαινυλαλανίνη- υδροξυπρολίνη-γλυκίνη-γλουταμινικό οξύ-αργινίνη) (Knight και συν., 2000). Μάλιστα η παραπάνω περιοχή απαντάται τόσο στο κολλαγόνο τύπου Ι όσο και το IV και εξαρτάται εξολοκλήρου από τη διαμόρφωση της τριπλής έλικας. Πέρα από τις α2β1 και α1β1 πιθανότατα και άλλες ιντεγκρίνες να συμμετέχουν στην προσκόλληση των κυττάρων με το κολλαγόνο IV. Μία από αυτές είναι η α3β1 της οποίας η περιοχή δέσμευσης έχει βρεθεί στην α1 αλυσίδα του κολλαγόνου IV (Lauer και συν., 1998). Πρόσφατα μάλιστα βρέθηκε ότι δύο νέες ιντεγκρίνες, η α10β1 και η α11β1 αναγνωρίζουν συγκεκριμένες περιοχές του κολλαγόνου IV (Tiger και συν., 2001; Tulla και συν., 2001). Ποιο συγκεκριμένα, η α11 ιντεγκρίνη μέσω της Ι περιοχής της συνδέεται στην ίδια αλληλουχία του GFOGER με την α2β1 (Zhang και συν., 2003), ενώ η σύνδεση της α10 ιντεγκρίνης είναι πιο εξειδικευμένη για το κολλαγόνο IV (Tulla και συν., 2001). Πέρα από την τριπλή έλικα, και η μη κολλαγονώδης περιοχή (NC1) του κολλαγόνου IV επάγει την κυτταρική προσκόλληση (Chelberg και συν., 1989). Πρόσφατες μάλιστα μελέτες έδειξαν ότι οι NC1 περιοχές των αλυσίδων α2, α3 και α6 επάγουν την προσκόλληση και μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων, ενώ οι αντίστοιχες περιοχές των α1, α4 και α5 αλυσίδων παρέμεναν ανενεργές (Petitclerc και συν., 2000). Γενικά, διαφορετικές NC1 περιοχές πιθανότατα να συνδέονται με διακριτούς τύπους ιντεγκρινών. Για παράδειγμα, η α1β1 ιντεγκρίνη 44

60 ΕΙΣΑΓΩΓΗ συνδέεται με την NC1 περιοχή της αλυσίδας α1 του κολλαγόνου, ενώ οι ιντεγκρίνες ανβ3, α3β1 και ανβ5 με την NC1 περιοχή της α2 αλυσίδας. Οι αλληλεπιδράσεις των κυττάρων με το κολλαγόνο IV μεσολαβούνται και από μη ιντεγκρινικούς υποδοχείς, όπως οι πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαρίνης της κυτταρικής επιφάνειας, η γλυκοπρωτεΐνη VI και η οικογένεια των υποδοχέων μαννόζης (Leitinger και Hohenester, 2007). Μελέτες που έγιναν σε κύτταρα μελανώματος έδειξαν ότι εκφράζουν την πρωτεογλυκάνη θειικής χονδοϊτίνης CD44, που συνδέεται με το κολλαγόνο IV και μεσολαβεί τις διαδικασίες προσκόλλησης και μετανάστευσης (Knutson και συν., 1996). Τέλος, μια ακόμα ομάδα πρωτεϊνών που συνδέονται με το κολλαγόνο είναι οι υποδοχείς δισκοϊδίνης (discoidin domain receptors-ddrs), που ανήκουν στην οικογένεια των υποδοχέων κινάσης τυροσίνης και περιλαμβάνουν δύο μέλη: τον DDR1 και τον DDR2 (Vogel και συν., 1997). Νιδωγόνα- Εντακτίνες Τα νιδωγόνα ή εντακτίνες είναι μια οικογένεια μονομερών γλυκοπρωτεϊνών που περιέχουν θειικές ομάδες και κατέχουν κεντρικό δομικό ρόλο στις βασικές μεμβράνες (Ho και συν., 2008). Η οικογένεια αυτή περιλαμβάνει 2 μέλη, το νιδωγόνο-1 και το νιδωγόνο-2. Τα νιδωγόνα (Εικόνα 16) αποτελούνται από τρία σφαιρίδια G1, G2 και G3 (Dziazek, 1995). Τα σφαιρίδια αλληλεπιδρούν με τις αλυσίδες της λαμινίνης ή του κολλαγόνου και έτσι τα νιδωγόνα συνδέουν και σταθεροποιούν τα κύρια δίκτυα των βασικών μεμβρανών (Mann και συν.,1988; Fox και συν., 1991; Battaglia και συν., 1992; Ho και συν., 2008). Εικόνα 16: Σχηματικό διάγραμμα της δομής του νιδογόνου. Όπως φαίνεται και από την εικόνα, το σφαιρίδιο G2 συνδέεται με το κολλαγόνο IV και την περλεκάνη, ενώ το σφαιρίδιο G3 έχει ισχυρή συγγένεια για τη λαμινίνη (Dziadek, 1995). Image 16: Schematic diagram of the nidogen structure. As shown in the image, the globule G2 is associated with collagen IV and perlecan, while the globule G3 has a strong affinity to laminin (Dziadek, 1995). 45

61 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Περλεκάνη Η περλεκάνη είναι το κύριο μέλος της οικογένειας των πρωτεογλυκανών με πλευρικές αλυσίδες θειικής ηπαράνης ή/και θειικής χονδροϊτίνης που εντοπίζονται στις βασικές μεμβράνες (Farach-Carson και Carson, 2007). Η περλεκάνη συμμετέχει στη δόμηση της βασικής μεμβράνης δημιουργώντας δεσμούς με τη λαμινίνη και το κολλαγόνο IV. Πέρα από το δομικό της ρόλο η περλεκάνη συμμετέχει και σε πλήθος βιολογικών διεργασιών, όπως η κυτταρική προσκόλληση (Hayashi και συν., 1992), η πρόσδεση των αυξητικών παραγόντων και η ρύθμιση σηματοδοτικών μονοπατιών, ενώ διαδραματίζει κεντρικό ρόλο σε διεργασίες όπως η οργανογένεση, η επούλωση πληγών και η αγγειογένεση (FarachCarson και συν., 2005; Iozzo, 2005). Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας Οι πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας υπόκεινται σε πλήθος μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων, όπως η φωσφορυλίωση, η οξείδωση και η γλυκοζυλίωση (Raabe και συν., 1996; Mattana και συν., 1997; Koliakos και συν., 2000). Στην παρούσα ενότητα δίνεται έμφαση στην οξείδωση των πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας, καθώς και τις συνέπειες που έχει στη δομή και τις λειτουργικές ιδιότητες των πρωτεϊνών. o Οξείδωση Οξείδωση ονομάζεται η διαδικασία κατά την οποία παρατηρείται απώλεια ηλεκτρονίων. Διακρίνεται σε ενζυμική και σε μη ενζυμική. Η μη ενζυμική οξείδωση μπορεί να είναι αποτέλεσμα του οξειδωτικού stress και περιλαμβάνει την καρβονυλίωση, τη νιτροζυλίωση τυροσίνης, την οξείδωση μεθειονίνης σε σουλφοξείδιο μεθειονίνης, τη γλουταθειονυλίωση, την S-νιτροζυλίωση κυστεΐνης καθώς και την οξείδωση κυστεΐνης που οδηγεί στο σχηματισμό δισουλφιδίων (Ghezzi, 2005). Η οξείδωση των πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας επάγεται κατά κύριο λόγο από τις δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS). Μάλιστα τα πλέον ευπρόσβλητα αμινοξέα τους είναι η τρυπτοφάνη, η τυροσίνη, η ιστιδίνη και η κυστεϊνη. Στα in vitro συστήματα και υπό φυσιολογικές συνθήκες, οι οξειδωτικά τροποποιημένες 46

62 ΕΙΣΑΓΩΓΗ πρωτεΐνες φαίνεται να αναγνωρίζονται επιλεκτικά και να αποικοδομούνται από πρωτεάσες, η δράση των οποίων όμως εμποδίζεται πολλές φορές από τους διαμοριακούς ομοιοπολικούς δεσμούς σταυροσύνδεσης (cross-linking) που έχουν εν τω μεταξύ δημιουργηθεί. Η υδροφοβικότητα της επιφάνειας αποτελεί τον καθοριστικό παράγοντα για την αναγνώρισή τους από διάφορες πρωτεάσες και ιδιαίτερα από το πρωτεόσωμα (Stolzing και συν., 2002). Οι οξειδωμένες πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας αποτελούν αντικείμενο εντατικής έρευνας καθώς εμφανίζουν αλλαγές στα χαρακτηριστικά τους σε σχέση με τις μη οξειδωμένες μορφές τους, αλλά και γιατί εμπλέκονται σε πλήθος παθολογικών καταστάσεων. Οι Mattana και συν., βρήκαν το 1997 ότι η οξείδωση της εξωκυττάριας ουσίας είναι δυνατό να μεταβάλλει την αλληλεπίδραση ανάμεσα στις ιντεγκρίνες και την αλληλουχία RGD (αργινίνη-γλυκίνη-ασπαραγινικό οξύ) στα μεσαγγειακά κύτταρα, επηρεάζοντας τόσο την ικανότητα προσκόλλησής τους, όσο και τη μορφή τους. Στα ίδια κύτταρα βρέθηκε πως το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2) που παράγεται από την οξειδάση της γλυκόζης, μπορεί να αυξήσει το mrna μορίων της εξωκυττάριας ουσίας μέσω σύνθεσης του μετασχηματίζοντος αυξητικού παράγοντα TGF-beta (La Cruz και συν., 2001). Παράλληλα, βρέθηκε ότι οι ρίζες υδροξυλίου αποικοδομούν τις πρωτεογλυκάνες, ενώ το υποχλωρικό οξύ (ΗΟCl) αποικοδομεί τεμάχια κολλαγόνου τύπου ΙΙ, μέσω οξείδωσής τους. (Olszowski και συν., 2003). Επίσης, το Η2Ο2 παρεμποδίζει τη σύνθεση πρωτεογλυκανών στο χόνδρο, ενώ το ΗΟCl επάγει την καταστροφή του χόνδρου μεταλλοπρωτεϊνασών, TIMPs μέσω απενεργοποίησης (tissue inhibitors of των αναστολέων των metalloproteinases), που αναστέλλουν τις κολλαγενάσες και τις ζελατινάσες (Hadjigogos, 2003). Παρ' όλο που η λαμινίνη και το κολλαγόνο IV αποτελούν τις κύριες πρωτεΐνες κυτταρικής προσκόλλησης των βασικών μεμβρανών, η επίδραση της οξείδωσης στη λειτουργία τους δεν έχει ακόμη μελετηθεί. Συνήθως εξετάζονται ως συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας και δε μελετούνται ξεχωριστά. Το 1997, οι Riedle και Kerjaschki μελέτησαν τις επιδράσεις των ROS σε εκχυλίσματα βασικής μεμβράνης που προέρχονταν από το σάρκωμα EHS (Engelbreth-Holm-Swarm), τα οποία περιείχαν και λαμινίνη-1. Οι παρατηρήσεις αφορούσαν στις αλλαγές κυρίως στο σύμπλοκο λαμινίνης/εντακτίνης. 47

63 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σχετικά με την οξείδωση πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας από κύτταρα του αίματος, δεν υπάρχουν πολλά γνωστά στοιχεία. Σε μια πρόσφατη ερευνητική προσπάθεια (Ahmed και συν., 2003), βρέθηκε ότι τα μονοκύτταρα μπορούν να οξειδώσουν την εξωκυττάρια ουσία (ECM) και ότι η οξείδωση μπορεί να ρυθμιστεί από δεξαμεθαζόνη, σύμπλοκα IgG και τον λιποπολυσακχαρίτη του μικροβιακού τοιχώματος LPS. Επίσης, τα ουδετερόφιλα μπορούν να επάγουν τη βλάβη της ECM του πνευμονικού παρεγχύματος μέσω των προϊόντων τους στα οποία περιλαμβάνονται πρωτεάσες αλλά και ROS, με αποτέλεσμα την πρόκληση πνευμονικής ίνωσης ή πνευμονικού εμφυσήματος. Καρβονυλίωση Η καρβονυλίωση είναι μια μη αντιστρεπτή, μη ενζυμική τροποποίηση των πρωτεϊνών όπου πραγματοποιείται έπειτα από εισαγωγή καρβονυλικών ομάδων μέσω μιας ποικιλίας οξειδωτικών μονοπατιών (Dalle-Donne και συν., 2006) (Εικόνα 17). Η καρβονυλίωση των πρωτεϊνών μπορεί να οδηγήσει σε απώλεια της λειτουργικής τους δραστικότητας και σε διαταραχές στη διαδικασία αναδίπλωσής τους (Aldini και συν., 2007). Αποτέλεσμα όλων των παραπάνω είναι η συσχέτιση της καρβονυλίωσης με πλήθος παθολογικών καταστάσεων, όπως ο διαβήτης και η αθηρωμάτωση (DalleDonne και συν., 2006). Η καρβονυλίωση προκαλείται απευθείας από την επίδραση των ROS ή από την οξείδωση των πλευρικών αλυσίδων των καταλοίπων αργινίνης, λυσίνης, προλίνης και θρεονίνης (Stadtman, 1990) ή από τη διάσπαση πεπτιδικών δεσμών μέσω οξείδωσης γλουταμυλ-καταλοίπων ή μέσω του μονοπατιού της α-αμίδωσης (Aldini και συν., 2007). Οι καρβονυλικές ομάδες μπορούν επίσης να παραχθούν έμμεσα από τη δευτερογενή αντίδραση των πρωτογενών αμινομάδων καταλοίπων λυσίνης με δραστικές μορφές καρβονυλίου που προέρχονται από την αντίδραση των δι-αλδεΰδων [γλυοξάλη (GO), μεθυλ-γλυοξάλη (MGO)] ή των προϊόντων οξείδωσής τους (κετοαμίνες, κετοαλδεΰδες, δεοξυοσόνες) οδηγώντας τελικώς στο σχηματισμό τελικών προϊόντων γλυκοζυλίωσης (Advanced glycation end-products-ages) (Aldini και συν., 2007). Τέλος, οι καρβονυλικές ομάδες μπορούν να προστεθούν στις πρωτεΐνες από οξειδωμένα λιπίδια που τις περιέχουν (Refsgaard και συν., 2000). 48

64 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 17: Οξειδωτικά μονοπάτια που οδηγούν στην παραγωγή καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών. (Aldini και συν., 2007). Image 17: Oxidative pathways that lead to carbonylated protein production. (Aldini et al., 2007). o Μεθυλ-γλυοξάλη (MGO) Κατά τη διαδικασία σχηματισμού προχωρημένων τελικών προϊόντων οξείδωσης παράγεται η μεθυλ-γλυοξάλη (MGO) (Kuhla και συν., 2005). Η MGO είναι μοναδική ανάμεσα στις υπόλοιπες οξοαλδεύδες καθώς παράγεται και μέσω ενζυμικών διαδικασιών. Η MGO συμμετέχει στην αναστολή της κυτταρικής αύξησης, την απόπτωση, στην αναστολή της δραστικότητας ορισμένων ενζύμων και σε φαινόμενα μεταλλαξιγένεσης (Beisswenger και συν., 2005). Παράλληλα, εμπλέκεται στην καταστροφή των ιστών και των αιμοφόρων αγγείων (Baynes και Thorpe, 2000), ενώ τα επίπεδά της έχουν βρεθεί να είναι αυξημένα στον ορό, σε ιστούς καθώς και σε μοντέλα ζωών με διαβήτη (Lapolla και συν., 2003). Τέλος, η MGO τροποποιεί συγκεκριμένα κατάλοιπα αργινίνης σε περιοχές πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας (ECM) που συνδέονται με ιντεγκρίνες διαταράσσοντας τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυττάρων και ECM (Pedchenko και συν., 2005). 49

65 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 3. Κυτταρική σηματοδότηση και σηματοδοτικά μόρια που συμμετέχουν στην αθηρωμάτωση Πρωτεϊνική κινάση C (PKC) Με τον όρο πρωτεϊνική κινάση C (ΡΚC) γίνεται αναφορά σε μια οικογένεια ενζύμων που περιέχει ισομορφές με παρόμοια δομή και βασική ιδιότητα την φωσφορυλίωση υποστρωμάτων σε κατάλοιπα σερίνης και θρεονίνης (Rask-Madsen και King, 2005). Από τις δέκα μέχρι σήμερα γνωστές ισομορφές της που εντοπίζονται στα θηλαστικά, οι οκτώ ενεργοποιούνται από τη διακυλογλυκερόλη (DAG) είτε μέσω ενός κλασσικού μονοπατιού που περιλαμβάνει τη φωσφολιπάση C (PLC) και την 4, 5 διφωσφορική φωσφατιδυλοινοσιτόλη (PIP2) και περιγράφεται αναλυτικά παρακάτω, είτε μέσω ενός εναλλακτικού μηχανισμού που βασίζεται στην υδρόλυση της φωσφατιδυλοχολίνης από τη φωσφολιπάση D (PLD) (Liu και Heckman, 1998). Οι ισομορφές της ΡΚC ταξινομούνται σε τρεις κατηγορίες, ανάλογα με το αν περιέχουν περιοχές σύνδεσης με την DAG ή με το Ca2+ ή με άλλους παράγοντες που επάγουν την δραστικότητά τους. Σε αυτούς τους παράγοντες συγκαταλέγονται η φωσφατιδυλοσερίνη και λιπίδια όπως τα cis-πολυακόρεστα λιπαρά οξέα και η λυσοφωσφατιδυλοσερίνη (Nishizuka, 1995). Επίσης, οι φορβολικοί εστέρες όπως ο ΡΜΑ και ο ΤΡΑ (Kanashiro και Khalil, 1998). Η αυτοφωσφορυλίωση της ΡΚC μπορεί επίσης να επηρεάσει τη δραστικότητά της, καθώς και τη συγγένειά της στα υποστρώματά της, εντούτοις όμως δεν είναι επαρκής για την ενεργοποίησή της (Newton, 2003). Γενικά, η μετατόπιση της ΡΚC από το κυτταρόπλασμα στην πλασματική μεμβράνη ή σε οποιαδήποτε εσωτερική μεμβράνη, αποτελεί τον μόνο αξιόπιστο τρόπο εκτίμησης της ενεργοποίησής της (Rask-Madsen και King, 2005). Έτσι, οι ισομορφές της ΡΚC διακρίνονται στις κλασσικές (conventional) (α, β1, β2 και γ) που συνδέονται τόσο με την DAG, όσο και με το Ca2+, στις καινοτόμες (novel) (δ, ε, η και θ) που συνδέονται με την DAG αλλά όχι με το Ca2+ και στις ατυπικές (atypical) (ζ και ι) που δε συνδέονται με κανέναν από τους παραπάνω ενεργοποιητές (Rask-Madsen και King, 2005) (Εικόνα 18). Πέρα από τους ενεργοποιητές, είναι γνωστές και πολλές ουσίες που δρουν ανασταλτικά για τις ΡΚCs. Οι αναστολείς διακρίνονται σε αυτούς που δρουν στην καταλυτική περιοχή, ανταγωνίζονται με το ΑΤΡ και δεν είναι τόσο ειδικοί, και σε αυτούς που δρουν στη ρυθμιστική περιοχή, ανταγωνίζονται για την περιοχή σύνδεσης των φορβολικών εστέρων και της DAG ή της φωσφατιδυλοσερίνης και είναι πιο ειδικοί (Salamanca και Khalil, 2005). Ανάμεσα στις ουσίες που χρησιμοποιούνται για 50

66 ΕΙΣΑΓΩΓΗ την αναστολή των ΡΚCs συγκαταλέγονται οι GF109203X και η καλφοστίνη, που αναστέλλουν όλες τις ισομορφές της με μεγαλύτερη όμως επιλεκτικότητα για τις συμβατικές και τις καινοτόμες, καθώς και ο Gö6976 που αναστέλλει μόνο τις κλασσικές (Rask-Madsen και King, 2005). Εικόνα 18: Δομή των PKC ισομορφών. Η PKC αποτελείται από τέσσερις συντηρημένες (C1 C4) και πέντε μεταβλητές (V1 V5) περιοχές. Η C1 περιοχή περιλαμβάνει θέσεις δέσμευσης για την DAG, τον φορβολικό εστέρα, την φωσφατιδυλοσερίνη και τον ανταγωνιστή της PKC, καλφοστίνη C. Η C2 περιοχή περιέχει θέσεις δέσμευσης για το Ca2+. Οι C3 και C4 περιοχές περιέχουν περιοχές δέσμευσης για το ΑΤΡ, για ορισμένους ανταγωνιστές της PKC και κάποια διαφορετικά υποστρώματα της PKC. Το μόριο της PKC αναδιπλώνεται προκειμένου να φέρει την περιοχή πρόσδεσης του ΑΤΡ σε γειτονία με την περιοχή πρόσδεσης του υποστρώματος. Πρόσδεση μιας ενδογενούς ή εξωγενούς καταλυτικής περιοχής ψευδο-υποστρώματος στην καταλυτική περιοχή εμποδίζει την PKC να φωσφορυλιώσει το κανονικό υπόστρωμα (Salamanca και συν., 2005). Image 18: Structure of PKC isoforms. PKC is composed of four conserved (C1 C4) and five variable (V1 V5) regions. C1 region contains binding sites for DAG, phorbol ester, phosphatidylserine and the PKC antagonist calphostin C. C2 region contains the binding site for Ca 2+. C3 and C4 regions contain binding sites for ATP, some PKC antagonists and different PKC substrates. The PKC molecule folds to bring the ATP binding site into proximity with the substrate-binding site. Binding of an endogenous or exogenous pseudosubstrate peptide sequence to the catalytic domain prevents PKC from phosphorylating the true substrate (Salamanca et al., 2005). Η ΡΚC συμμετέχει σε πλήθος σηματοδοτικών μονοπατιών καθορίζοντας κυτταρικές αποκρίσεις (Ohno και συν., 1987). Έχει βρεθεί ότι σχετίζεται με παθολογικές καταστάσεις, όπως η αθηρωμάτωση και ο διαβήτης (Rask-Madsen και King, 2005). Οι υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης και ο διαβήτης συνοδεύονται από αυξημένη δραστικότητα της ΡΚC. Μάλιστα η ΡΚC φαίνεται να μεσολαβεί τις προαθηρωματικές διεργασίες προκαλώντας αυξημένη παραγωγή ROS (Inoguchi και συν., 2000) και ενδοθηλίνης-1 (Dashwood και Tsui, 2002) καθώς και μειωμένη παραγωγή 51

67 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΝΟ. O κεντρικός ρόλος της ΡΚC στη δυσλειτουργία του ενδοθηλίου έχει μελετηθεί in vivo τόσο σε μοντέλα τόσο ζώων, όσο και ανθρώπων. Σε μια μελέτη που έγινε σε αορτή από λαγό, βρέθηκε ότι υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης προκάλεσαν μείωση της αγγειοδιαστολής, γεγονός που αντιστράφηκε παρουσία αναστολέων της ΡΚC (Tesfamariam και συν., 1991). Σε ορισμένους τύπους κυττάρων η ΡΚC ενεργοποιεί την NADPH οξειδάση συμβάλλοντας έτσι στην εκτεταμένη παραγωγή ROS, ενώ προκαλεί και την αποσύζευξη της ΝΟ συνθάσης μειώνοντας την παραγωγή ΝΟ και αυξάνοντας την παραγωγή Ο2- (Rask-Madsen και King, 2005). Παράλληλα, μεσολαβεί τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των λείων μυϊκών κυττάρων καθώς και τις αλληλεπιδράσεις των λευκοκυττάρων με το ενδοθήλιο. Πιο συγκεκριμένα, η προσκόλληση των μονοκυττάρων στο ενδοθήλιο (Mine και συν., 2002) και η διαφοροποίησή τους σε μακροφάγα (Aihara, 1991), γεγονότα που σχετίζονται άμεσα με το σχηματισμό της αθηρωματικής πλάκας, εξαρτώνται από τη ενεργοποίηση της ΡΚC. Παράλληλα, η επαγόμενη από υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης έκφραση μορίων προσκόλλησης και η προσκόλληση των ουδετερόφιλων σε ενδοθηλιακά κύτταρα μεσολαβείται από την ΡΚC και αναστέλλεται έπειτα από επώαση με αναστολείς της (Omi και συν., 2002). Τέλος, η ΡΚC μεσολαβεί και διεργασίες που επάγονται από τις oxldl, όπως την έκφραση των υποδοχέων CD36 σε μακροφάγα (Feng και συν., 2000), την προσκόλληση των λευκοκυττάρων στο ενδοθήλιο (Sugiyama και συν., 1994) και την ανάπτυξη μακροφάγων σε καλλιέργεια (Matsumura και συν., 1997). Επίσης έχει βρεθεί πως εμπλέκεται στο σηματοδοτικό μονοπάτι που οδηγεί στην ενεργοποίηση του ΝΗΕ-1 (Sauvage και συν. 2000; Konstantinou-Tegou και συν., 2001). 3-κινάσες του φωσφοϊνοσιτιδίου ή 3-κινάσες της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (PI3Ks) Οι 3-κινάσες του φωσφοϊνοσιτιδίου (ΡΙ3Κs) συνθέτουν μια οικογένεια λιπιδιακών κινασών που συμμετέχει στη διαδικασία της κυτταρικής σηματοδότησης ελέγχοντας με τον τρόπο αυτό πλήθος κυτταρικών αποκρίσεων (Stein και Waterfield, 2000). Ανάμεσα στις λειτουργίες που συμμετέχουν είναι η ανάπτυξη, ο πολλαπλασιασμός, η χημειόταξη, η κινητικότητα, η διαφοροποίηση και η επιβίωση των κυττάρων καθώς και η ομοιόσταση της γλυκόζης (Yousif και συν., 2006). Οι ΡΙ3Κs αποτελούν επίσης κύριο συστατικό του μονοπατιού της ινσουλίνης. Τα 52

68 ΕΙΣΑΓΩΓΗ τελευταία χρόνια μελετάται ο ρόλος των ΡΙ3Κs στην παθογένεια και τη θεραπεία ασθενειών, όπως ο καρκίνος, η φλεγμονή και οι καρδιαγγειακές νόσοι. Η αντίδραση που καταλύουν οι ΡΙ3Κs είναι η φωσφορυλίωση του υδροξυλίου που βρίσκεται στη θέση 3 του δακτυλίου της ινοσιτόλης των φωσφοϊνοσιτιδίων (Thomas και Owen, 2008). Οι ΡΙ3Κs διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες (τάξης Ι, τάξης ΙΙ και τάξης ΙΙΙ) με βάση τη δομή τους, τον τύπο του λιπιδιακού υποστρώματός τους και τον τρόπο ρύθμισής τους (Wymann και Pirola, 1998). Οι καλύτερα μελετημένες ΡΙ3Κs είναι της τάξης Ι, όπου διακρίνονται στις υποτάξεις ΙΑ και ΙΒ και αποτελούνται από ρυθμιστικές και καταλυτικές υπομονάδες (Εικόνα 19). Το βασικό υπόστρωμα των ΡΙ3Κs τάξης Ι είναι η 4, 5 διφωσφορική φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη, που έπειτα από φωσφορυλίωση δίνει 3, 4, 5 τριφωσφορική φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη που δρα ως δεύτερος μηνύτορας στο συντονισμό πλήθους λειτουργιών (Εικόνα 19). Κύριοι αναστολείς όλων των ΡΙ3Κs είναι η γουορτμαννίνη (wortmannnin) και ο LY (Vlahos και συν., 1994), που ανταγωνίζονται για τη θέση δέσμευσης των ΡΙ3Κs με το ΑΤΡ. Εικόνα 19: Οικογένεια των ΡΙ3Κ κινασών. α) η αντίδραση που καταλύει η κάθε ΡΙ3Κ και β) η δομή του κάθε τύπου ΡΙ3Κ (Engelman και συν., 2006). Image 19: PI3K kinase family. a) the reaction each PI3K catalyzes and b) the structure of each PI3K type (Engelman et al., 2006). Οι κυριότερες από τις λειτουργίες των ΡΙ3Κs μεσολαβούνται από τις ΡΙ3Κs τάξης Ι μέσω ενεργοποίησης της Akt κινάσης. Η Akt κινάση απαιτεί το σχηματισμό 53

69 ΕΙΣΑΓΩΓΗ της ΡΙΡ3 για να μετατοπιστεί στην πλασματική μεμβράνη και ενεργοποιείται έπειτα από φωσφορυλίωση από την PDK1 κινάση. Το μονοπάτι ΡΙ3Κ/Akt επάγει επίσης την επιβίωση των εκτεθειμένων σε Η2Ο2 κυττάρων (Wang και συν., 2000) και φωσφορυλιώνει την 3-κινάση της συνθάσης του γλυκογόνου, ενός ενζύμου που εμπλέκεται στο μεταβολισμό της γλυκόζης (Schieke και συν., 2004). Οι ΡΙ3Κs μπορούν επίσης μέσω της PDK-1 να ενεργοποιήσουν και άλλες πρωτεϊνικές κινάσες, όπως η PKC (Dorn και Force, 2005), ενώ ενεργοποιούν και κανάλια Ca2+ αυξάνοντας το ρυθμό ροής του (Northcott και συν., 2002), ιδιότητες που τις σχετίζουν με την παθογένεια του διαβήτη. Ιόντα ασβεστίου (Ca2+) Το ασβέστιο (Ca2+) συμμετέχει σε πλήθος σηματοδοτικών μονοπατιών, με αποτέλεσμα να εμπλέκεται σε πολλές από τις λειτουργίες του κυττάρου (Berridge και συν., 2000), ενώ σε μεγάλες συγκεντρώσεις μπορεί να είναι τοξικό και επιβλαβές (Berridge, 1994). Στα κύτταρα των θηλαστικών το κυτταροπλασματικό Ca2+ προέρχεται από δύο πηγές: α) από την είσοδό του διαμέσου ειδικών καναλιών Ca2+ που υπάρχουν στην πλασματική μεμβράνη και εξαρτώνται από το δυναμικό και τον εκάστοτε προσδέτη και β) από την απελευθέρωσή του από ενδοκυτταρικές πηγές και κυρίως από το ενδοπλασματικό δίκτυο (Berridge, 1998) (Εικόνα 20). Υπάρχουν τρεις δεύτεροι μηνύτορες που είναι υπεύθυνοι για την απελευθέρωση του Ca2+. Το ίδιο το Ca2+ (Berridge, 1993) επάγει την απελευθέρωσή του μαζί με δύο άλλους δεύτερους μηνύτορες, την κυκλική ADP ριβόζη και την τριφωσφορική ινοσιτόλη (ΙΡ3) (Berridge, 1994). Τα επίπεδα της ΙΡ3 αυξάνονται έπειτα από ενεργοποίηση υποδοχέων κινάσης τυροσίνης ή υποδοχέων που είναι συνδεδεμένοι με G πρωτεΐνες. Αποτέλεσμα της ενεργοποίησης αυτών των υποδοχέων είναι η υδρόλυση της 4,5 διφωσφορικής φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (PIP2) από τη φωσφολιπάση C (PLC) σε τριφωσφορική ινοσιτόλη (ΙΡ3), που απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα και διακυλογλυκερόλη (DAG), που παραμένει στην πλασματική μεμβράνη (Εικόνα 20). Ένα μέρος της DAG καταβολίζεται, ενώ ένα άλλο μέρος της ενεργοποιεί την PKC. Η ΙΡ3 δεσμεύεται σε ειδικό υποδοχέα του ενδοπλασματικού δικτύου ο οποίος είναι συνδεδεμένος με το κανάλι Ca2+. Με την ενεργοποίησή του, το κανάλι ανοίγει και το Ca2+ απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα. Ένας άλλος μηχανισμός περιλαμβάνει τη φωσφορυλίωση της ΙΡ3 από μια ειδική 3-κινάση και την επακόλουθη παραγωγή της ΙΡ4, η οποία προκαλεί τη μετατόπιση του Ca2+ από τον 54

70 ΕΙΣΑΓΩΓΗ εξωκυττάριο χώρο στο κυτταρόπλασμα. Το ασβέστιο στη συνέχεια δεσμεύεται από πρωτεΐνες όπως η καλμοδουλίνη (CAM), οι οποίες αλλάζουν διαμόρφωση και ενεργοποιούν άλλες πρωτεΐνες στόχους, όπως οι Ca2+/καλμοδουλίνη κινάσες. Εικόνα 20: Απεικόνιση της ομοιόστασης του ασβεστίου στο κύτταρο. Το εξωκυττάριο Ca2+ εισέρχεται στο κύτταρο διαμέσου των καναλιών Ca2+ που υπάρχουν στην πλασματική μεμβράνη και εγκαταλείπει το κύτταρο χρησιμοποιώντας αντλίες Ca2+ και ανταλλάκτες Na+/Ca2+. Το ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) είναι η κύρια περιοχή απομόνωσης-συνάθροισης ιόντων Ca2+. Το Ca2+ συναθροίζεται στις ενδοκυτταρικές αποθήκες με αντλιών Ca2+ και απελευθερώνεται από την 1,4,5 τριφωσφορική ινοσιτόλη (IP3) μέσω των IP3 υποδοχέων (IP3R) ή από ριβόζη της κυκλικής διφωσφορικής αδενοσίνης (cadpr) μέσω των υποδοχέων ρυανοδίνης (RyR). Τα κανάλια ασβεστίου ρυθμιζόμενα από αποθήκες (SOCs) ανοίγουν σε απόκριση στο έλλειμμα των αποθηκών Ca2+ του ER. Ο παράγοντας εισροής του ασβεστίου (CIF) φαίνεται να μεσολαβούν τη μεταβίβαση σήματος από τον IP3R στα κανάλια SOCs της πλασματικής μεμβράνης ( Image 20: Representation of calcium homeostasis in cell. Extracellular Ca 2+ enters the cell through plasma membrane Ca2+ channels and leaves the cell using Ca 2+ pumps and Na+/Ca2+ exchangers. Endoplasmic reticulum (ER) is a major site for sequestered Ca 2+ ions. Ca2+ is accumulated in intracellular stores by means of Ca2+ pumps and released by inositol 1,4,5- trisphosphate (IP3) via IP3 receptors (IP3R) and by cyclic adenosine diphosphate ribose (cadpr) via ryanodine receptors (RyR). Store-operated calcium channels (SOCs) open in response to depletion of the (ER) Ca2+ stores. Calcium influx factor (CIF) has postulated to mediate the signal from IP 3R to the plasma membrane storeoperated calcium channels (SOCs) ( Το Ca2+ έχει χαρακτηριστεί ως ο παθογόνος δεύτερος μηνύτορας της αθηρωμάτωσης, ενώ έχει διατυπωθεί η λεγόμενη «θεωρία του ασβεστίου», που σχετίζει το Ca2+ με την παθογένεια της ασθένειας (Phair, 1988). 55

71 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ανταλλάκτης ιόντων Να+/Η+, ΝΗΕ-1 O ανταλλάκτης ή αντιμεταφορέας ιόντων Na+/H+ (Na+/H+ exchanger NHE) των θηλαστικών είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που ανταλλάσσει ενδοκυτταρικά ιόντα H+ με εξωκυτταρικά ιόντα Na+ σε στοιχειομετρική αναλογία 1:1. Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 9 ισομορφές του στα θηλαστικά που εμφανίζουν ομολογία αμινοξέων μεταξύ 25-70% και μοριακό βάρος kda (Slepkov και συν., 2007). Η καλύτερα μελετημένη ισομορφή της οικογένειας του ΝΗΕ είναι ο ΝΗΕ-1, που χαρακτηρίζεται ως ισομορφή κυτταρικής οικονομίας (housekeeping), εκφράζεται ευρέως στην πλασματική μεμβράνη όλων των ιστών, ενώ αποτελεί την κύρια ισομορφή του μυοκαρδίου (Karmazyn και συν., 1999). Ο ΝΗΕ-1 αποτελείται από ένα αμινοτελικό (Ν-τελικό άκρο) υδρόφοβο τμήμα με 12 διαμεμβρανικά μικρότερα τμήματα (ΤΜ domains), 500 αμινοξέων το καθένα και ένα καρβοξυτελικό (C-τελικό άκρο) υδρόφιλο τμήμα με 315 αμινοξέα (Fliegel, 2005). Το αμινοτελικό διαμεμβρανικό τμήμα αποτελεί την καταλυτική περιοχή του ΝΗΕ-1 και είναι υπεύθυνο για την ανταλλαγή των ιόντων, ενώ το καρβοξυτελικό τμήμα αποτελεί τη ρυθμιστική περιοχή του, καθώς είναι υπεύθυνο για τη ρύθμιση της φυσιολογικής ενδοκυτταρικής τιμής του ph (Orlowski και Grinstein, 1997). o Λειτουργία Η κύρια λειτουργία του ΝΗΕ-1 είναι η ρύθμιση του ενδοκυτταρικού ph και του κυτταρικού όγκου. Επίσης, ο ΝΗΕ-1 σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση των κυττάρων (Fliegel, 2005). Παράλληλα, βρέθηκε ότι ποντίκια με έλλειψη του γονιδίου του ΝΗΕ-1 (knock-out) παρουσίαζαν μειωμένη ανάπτυξη και ρυθμούς επιβίωσης (Bell και συν., 1999). Ο ΝΗΕ-1 συμμετέχει επίσης στην ανοδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης και στη μετανάστευση των κυττάρων (Fliegel, 2005). Η δράση του ιοντοανταλλάκτη ΝΗΕ-1 σχετίζεται και με παθολογικές καταστάσεις, όπως οι αγγειακές επιπλοκές του διαβήτη και της υπέρτασης (Matteuci και συν., 2001) ο καρκίνος (Mclean και συν., 2000) και η καρδιαγγειακή νόσος (Allen και Xiao, 2003). o Ρύθμιση του ΝΗΕ-1 από συμπαράγοντες και πρωτεΐνες σύνδεσης Ο ΝΗΕ-1 αλληλεπιδρά μέσω της κυτταροπλασματικής του περιοχής με πλήθος πρωτεϊνών (Malo και Fliegel, 2006) (Εικόνα 21). Ενδεικτικά αναφέρεται ότι περιέχει δύο πιθανές περιοχές σύνδεσης για την 4,5 διφωσφορική 56

72 ΕΙΣΑΓΩΓΗ φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη (ΡΙΡ2) (Aharonovitz και συν., 2000). Ο ΝΗΕ-1 αλληλεπιδρά επίσης με την πρωτεΐνη CHP1 (Calcineurin homologous protein 1), την καλμοδουλίνη (CaM), που είναι συνδεδεμένη με Ca2+ και την καρβονική ανυδράση ΙΙ, συνδέσεις που είναι σημαντικές για τη λειτουργία του ιοντοανταλλάκτη. Παράλληλα, μέσω του C-τελικού άκρου του ο ΝΗΕ-1 συνδέεται με τις πρωτεΐνες ERM (ezrin, radixin, moesin), οι οποίες είναι συνδεδεμένες με τα ινίδια ακτίνης του κυτταροσκελετού και αποτελούν το συνδετικό κρίκο ανάμεσα στον κυτταροσκελετό και τις πρωτεΐνες της πλασματικής μεμβράνης (Vaheri και συν., 1997). Αυτή η αλληλεπίδραση είναι καθοριστική για τη συμμετοχή του ιοντοανταλλάκτη σε διεργασίες όπως η μετανάστευση των κυττάρων, η αντίσταση στην απόπτωση και ο σχηματισμός συμπλεγμάτων σηματοδότησης (Denker και Barber, 2002; Wu και συν., 2004). Εικόνα 21: Πάνω μέρος: τοπολογία της μεμβρανικής περιοχής που έχει ως λειτουργία την μεταφορά κατιόντων. Σε ροζ κύκλους είναι τα κατάλοιπα που εμπλέκονται τόσο στη μεταφορά ιόντων, όσο και στη δέσμευση των αναστολέων; σε πορτοκαλί κύκλους είναι τα κατάλοιπα που εμπλέκονται στην πρόσδεση των ιόντων και τη μεταφορά τους; σε κίτρινους κύκλους είναι τα κατάλοιπα που συμμετέχουν στην πρόσδεση των αναστολέων; οι πράσινοι κύκλοι περιέχουν κατάλοιπα που εμπλέκονται στην αναδίπλωση του ΝΗΕ-1 και στην σκόπευση στην πλασματική μεμβράνη. Κάτω μέρος: αναπαράσταση της κυτταροπλασματικής περιοχής που έχει ως λειτουργία τη ρύθμιση της μεμβρανικής περιοχής μέσω αλληλεπιδράσεων με σηματοδοτικά μόρια (Slepkov και συν., 2007). Image 21: Upper panel: topology of the membrane domain which functions to transport cations. Pink circles, residues implicated in both ion transport and inhibitor binding; orange circles, residues implicated in ion binding and transport; yellow circles, residues implicated in inhibitor binding; green circles, residues implicated in NHE-1 folding and targeting to the plasma membrane. Lower panel: representation of the cytoplasmic domain which functions to regulate the membrane domain through interactions with signaling molecules (Slepkov et al., 2007). 57

73 ΕΙΣΑΓΩΓΗ o Αναστολή του ΝΗΕ-1 Ο ΝΗΕ-1 έχει βρεθεί ότι αναστέλλεται αναστρέψιμα από πλήθος ουσιών. Μάλιστα εμφανίζει τη μεγαλύτερη ευαισθησία στη δράση του αμιλοριδίου και των παραγώγων του (Masereel και συν., 2003). Παράλληλα, υπάρχουν και άλλα φάρμακα με μεγαλύτερη επιλεκτικότητα για τον ΝΗΕ-1, όπως οι αναστολείς βενζοϋλγουανιδίνης, οι οποίοι περιλαμβάνουν το καριπορίδιο (cariporide, HOE642), το ενιπορίδιο (eniporide) και το HOE694, και έχουν χρησιμοποιηθεί σε διάφορες κλινικές μελέτες (Zeymer και συν., 2001). Οι αναστολείς του ΝΗΕ-1 στο σύνολό τους ανταγωνίζονται με τα ιόντα Νa+ για τη θέση σύνδεσης τους στον ανταλλάκτη (Putney και συν., 2002). o Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις και ρύθμιση Ένας από τους κυριότερους ρυθμιστές της δραστικότητας του ΝΗΕ-1 είναι η ενδοκυτταρική οξέωση (Karmazyn και συν., 2001). Η δραστικότητα του ιοντοανταλλάκτη ΝΗΕ-1 ρυθμίζεται και από μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις όπως η φωσφορυλίωση και η γλυκοζυλίωση (Slepkov και συν., 2007). O NHE-1 περιέχει συνολικά δύο θέσεις στις οποίες μπορεί να γλυκοζυλιωθεί. Επίσης, το Cτελικό του άκρο περιέχει υπολείμματα σερίνης και θρεονίνης όπου φωσφορυλιώνονται από διάφορες κινάσες ως απόκριση τόσο στην οξέωση, όσο και σε ορμόνες και αυξητικούς παράγοντες (Sardet και συν., 1990; Haworth και συν., 2003). Ανάμεσα στις κινάσες που φωσφορυλιώνουν τον ΝΗΕ-1 και ρυθμίζουν τη δραστικότητά του συγκαταλέγονται η ERK1/2 μέσω του ΜΑΡΚ μονοπατιού, η p90rsk (p90 ribosomal S6 kinase) που βρίσκεται καθοδικά της ERK1/2, η Rho-συνδεδεμένη κινάση p160rock, η NIK (Nck-interacting kinase) και η CaMKII (Ca2+ calmodulindependent kinase II). O ΝΗΕ-1 μπορεί να φωσφορυλιωθεί απευθείας και από την p38mapk (Slepkov και συν., 2007). Παράλληλα, οι πρωτεϊνικές κινάσες C και D μπορούν να ρυθμίσουν τη δραστικότητα του ιοντοανταλλάκτη χωρίς όμως να τον φωσφορυλιώνουν (Sauvage, 2000). Τέλος, ο ΝΗΕ-1 μπορεί να ρυθμιστεί και μέσω από-φωσφορυλίωσης από την πρωτεϊνική φωσφατάση 1 (Misik και συν., 2005). 58

74 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Heat shock protein 70 (Hsp70) Οι πρωτεΐνες θερμικού πλήγματος (heat shock proteins) ομαδοποιούνται σε οκτώ οικογένειες με βάση το μοριακό τους βάρος (Snoeckx και συν., 2001) και πήραν το όνομά τους από το γεγονός ότι επάγονται από υψηλές θερμοκρασίες. Οι Hsp70 (Εικόνα 22) συμμετέχουν στην αναδίπλωση και συναρμολόγηση των νεοσυντιθέμενων πρωτεϊνών, στην επαναδίπλωση των λανθασμένα αναδιπλούμενων πρωτεϊνών και στη μετατόπιση εκκριτικών πρωτεϊνών στη μεμβράνη, ενώ παράλληλα ελέγχουν τη δραστικότητα πλήθους ρυθμιστικών πρωτεϊνών (Hartl και Hayer-Hartl, 2002; Ryan και Pfanner 2002). Όλα τα παραπάνω τις προσδίδουν έναν ρόλο κυτταρικής οικονομίας (Mayer και Bukau, 2005). Επίσης, οι Hsp70 έχουν «κυτταροπροστατευτικό συμβάλλοντας στην ρόλο» κάτω επανάκτηση από των συνθήκες λειτουργικών θερμικού πλήγματος, διαμορφώσεων των μετουσιωμένων πρωτεϊνών, ενώ παράλληλα προσδιορίζουν και τα ανώτερα θερμικά όρια ανοχής των οργανισμών (Hochachka και Somero, 2002). Οι Hsp70 επιτελούν όλες τις παραπάνω λειτουργίες μέσω ενίσχυσης των γονιδίων τους ή σε συνεργασία με άλλες πρωτεΐνες-συνοδούς (Mayer και Bukau, 2005). Οι Hsp70 συνδέονται επίσης με τον ιοντοανταλλάκτη ΝΗΕ-1 στην καρβοξυτελική του περιοχή, αλλά ο ακριβής λόγος σχηματισμού του συμπλόκου και οι παράγοντες που τον επηρεάζουν δεν είναι ακόμη γνωστοί (Silva και συν., 1995). Εικόνα 22: Δομή των hsp70. Οι hsp70 αποτελούνται από δύο βασικές περιοχές, μια υψηλά συντηρημένη αμινοτελική περιοχή ΑΤΡάσης και μια λιγότερο συντηρημένη καρβοξυτελική περιοχή πρόσδεσης με πεπτίδια (πάνω μέρος). Ορισμένες hsp70 περιέχουν προεκτάσεις στο αμινοτελικό τους άκρο που στοχεύουν στο ενδοπλασματικό δίκτυο ή τα μιτοχόνδρια. Τα κεφαλαία γράμματα 59

75 ΕΙΣΑΓΩΓΗ απεικονίζουν κύριες ενθέσεις. Τα κενά (απαλείψεις) απεικονίζονται με έντονους κύκλους. Οι πιθανές θέσεις γλυκοζυλίωσης (CHO), οι θέσεις προλίνης και η χυμοθρυπτική θέση αναγνώρισης των hsc70 απεικονίζονται με βέλη στη gly (Feige και Polla, 1994). Image 22: Hsp70 structure. Hsp70 consists of two major domains, a highly conserved N-terminal ATPase domain and a less conserved C-terminal peptide binding domain (top). Some hsp70 contain Nterminal extensions for targeting to the endoplasmatic reticulum or to mitochondria. Capital letters indicate major insertions. Gaps (deletions) are indicated with bold circles. Potential glycosylation sites (CHO), location of prolines, and chymotryptic recognition site of hsc70 are indicated with arrow at gly. (Feige and Polla, 1994). Πολλές μελέτες σχετίζουν τις πρωτεΐνες stress (stress proteins), συμπεριλαμβανομένων των Hsp70, με παθολογικές καταστάσεις, όπως η υπέρταση, η ισχαιμία και η αθηρωμάτωση (Roma και Catapano, 1996). Βρέθηκε ότι οι Hsp70 κατανέμονται ομοιόμορφα στον έσω χιτώνα των αιμοφόρων αγγείων, σε αντίθεση με τις περιοχές που έχουν υποστεί βλάβη, όπου είναι ανομοιόμορφα κατανεμημένες (Berberian και συν., 1990). Μάλιστα η πάχυνση του τοιχώματος του έσω χιτώνα των αιμοφόρων αγγείων που παρατηρήθηκε, βρέθηκε ότι συμβαδίζει με αλλαγές στο πρότυπο έκφρασης αποκλειστικά των Hsp70 και όχι κάποιων άλλων πρωτεϊνών stress (Johnson και συν., 1993). Οι Hsp70 είναι επίσης εκκριτικά πολυπεπτίδια (Jamsa και συν., 1994) και ο εντοπισμός των εξωκυτταρικών Hsp70 σε αθηρωματικές βλάβες πιθανότατα να αποτελεί ένδειξη της εκροής τους από κατεστραμμένα κύτταρα και της έκκρισής τους στον εξωκυτταρικό χώρο. Υπάρχει επίσης πλήθος μελετών που συνδέουν τις Hsp70 με τις oxldl. Πιο συγκεκριμένα, η επώαση ενδοθηλιακών κυττάρων με oxldl βρέθηκε να διεγείρει την έκφρασή τους (Zhu και συν., 1994), ενώ η επαγόμενη από oxldl ενεργοποίηση του γονιδίου των Hsp70 έχει παρατηρηθεί και in vivo (Roma και Catapano, 1996). Θα πρέπει τέλος να αναφερθεί ότι πλέον υπάρχουν ενδείξεις πως οι Hsp70 δεν αποτελούν μόνο δείκτες μιας στρεσογόνας κατάστασης, αλλά παράλληλα συμμετέχουν και σε μηχανισμούς άμυνας των κυττάρων (Johnson και συν., 1995). 60

76 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γλουταθειόνη-Γλουταθειονυλίωση Η γλουταθειόνη (γ-γλουταμυλ-κυστεΐνυλ-γλυκίνη, GSH) είναι η πιο πολυπληθής μη πρωτεϊνική, χαμηλού μοριακού βάρους θειόλη που βρίσκεται στα κύτταρα των θηλαστικών (Dringen, 2000). Πρόκειται για ένα τριπεπτίδιο που σχηματίζεται από τα αμινοξέα γλυκίνη, κυστεΐνη και γλουταμινικό οξύ και απαντάται είτε ως μονομερές στην ανηγμένη του μορφή, είτε ως δισουλφιδικό διμερές που σχηματίζεται κατά την οξείδωσή του (GSSG) (Εικόνα 23). H GSH δεν αποτελεί μόνο αναγωγικό συστατικό και το κυριότερο αντιοξειδωτικό των κυττάρων, αλλά παράλληλα μεσολαβεί πλήθος φυσιολογικών αντιδράσεων, όπως η κυτταρική σηματοδότηση (Franco και συν., 2007). Στις βιολογικές λειτουργίες της GSH συμπεριλαμβάνονται η ρύθμιση της αντιοξειδωτικής ισορροπίας, η ρύθμιση του κυτταρικού εντοπισμού της γλουταθειόνης, η γλουταθειονυλίωση ηλεκτρόφιλων συστατικών και η γλουταθειονυλίωση πρωτεϊνών. Εικόνα 23: Δομή της γλουταθειόνης, ενός τριπεπτιδίου που συνθέτεται από τα αμινοξέα, γλουταμινικό οξύ, κυστεΐνη και γλυκίνη ( Image 23: Glutathione structure, a tripeptide comprised of the amino acids, glutamic acid, cysteine and glycine ( Αρκετές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη διαδικασία της κυτταρικής σηματοδότησης περιέχουν θειόλες και μάλιστα αποκρίνονται σε καταστάσεις οξειδωτικού stress σχηματίζοντας δισουλφίδια. Ο σχηματισμός δισουλφιδίων με χαμηλού μοριακού βάρους θειόλες όπως η κυστεΐνη, η ομοκυστεΐνη και η GSH οδηγεί στο σχηματισμό των S-σουλφρυδρυλιωμένων πρωτεϊνών. Δεδομένου ότι η GSH αποτελεί το πιο πολυπληθές υπόστρωμα για τις παραπάνω αντιδράσεις, η διαδικασία της S-σουλφρυδρυλίωσης περιλαμβάνει κατά κύριο λόγο την Sγλουταθειονυλίωση των πρωτεϊνών (Franco και συν., 2007). Η S-γλουταθειονυλίωση είναι μια αντιστρεπτή μετα-μεταφραστική τροποποίηση όπου η σουλφυδρυλική ομάδα υπολείμματος κυστεΐνης της GSH σχηματίζει δισουλφιδικό δεσμό με τη σουλφυδρυλική ομάδα υπολείμματος κυστεΐνης μιας πρωτεΐνης. Αποτελεί μάλιστα ένα μηχανισμό ρύθμισης της δραστικότητας των πρωτεϊνών και της κυτταρικής 61

77 ΕΙΣΑΓΩΓΗ σηματοδότησης που λαμβάνει χώρα τόσο σε καταστάσεις οξειδωτικού stress, όσο και σε φυσιολογικές συνθήκες (Gallogly και Mieyal, 2007). Οι κύριοι μη ενζυμικοί μηχανισμοί της S-γλουταθειονυλίωσης περιλαμβάνουν: α) την αντίδραση της GSH με μερικώς οξειδωμένες πρωτεϊνικές SH ομάδες, β) αντιδράσεις ανταλλαγής ανάμεσα σε πρωτεϊνικές SH ομάδες και την GSSG, γ) αντιδράσεις ανάμεσα σε πρωτεϊνικές SH ομάδες και ρίζες GSH-GS. και δ) τον μεσολαβούμενο από ΝΟ σχηματισμό της Sνιτροζογλουταθειόνης (GSNO) και GS. ριζών (S-νίτρωση ή S-νιτροζυλίωση) (Franco και συν., 2007). Οι ROS και/ή οι κυτοκίνες επάγουν τη γλουταθειονυλίωση πολλών πρωτεϊνών κατά τη σηματοδότηση στη φλεγμονή, ενώ σε κάποιες περιπτώσεις ενεργοποιούν ή αυξάνουν την έκφραση του υπεύθυνου ενζύμου για την από-γλουταθειονυλίωση, τη γλουταρεδοξίνη (GPX) (Shelton και Mieyal, 2008). Χαρακτηριστικό παράδειγμα πρωτεΐνης που εμφανίζεται να είναι έντονα γλουταθειονυλιωμένη στα Τλεμφοκύτταρα ως απόκριση στο οξειδωτικό stress είναι η Hsp70 (Fratelli και συν. 2002). Επίσης, και το ICAM-1 βρέθηκε γλουταθειονυλιωμένο σε ενδοθηλιακά κύτταρα της αορτής, γεγονός που πιθανότατα να επάγεται από τον TNF-α και να περιορίζεται έπειτα από τη χορήγηση του αντιοξειδωτικού NAC (Mukherjee και συν., 2007). Η γλουταθειονυλίωση μεταβάλλει αντιστρεπτά τη δραστικότητα πλήθους κινασών, όπως των PKA, PKC και PKD, αλλά και φωσφατασών και μεταγραφικών παραγόντων (Barthel και Klotz, 2005). Πολλές μελέτες σχετίζουν τη γλουταθειόνη και τη γλουταθειονυλίωση με παθολογικές καταστάσεις, όπως ο διαβήτης και η αθηρωμάτωση (Giron και συν., 1999). 62

78 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γ. ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΟΙ ΕΠΙΒΑΡΥΝΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΑΘΗΡΩΜΑΤΩΣΗΣ Η αιτιοπαθογένεια της αθηρωμάτωσης είναι εξαιρετικά σύνθετη και πολύπλευρη. Περιλαμβάνει τόσο τη γενετική προδιάθεση, όσο και επίκτητους παράγοντες κινδύνου. Στους παράγοντες κινδύνου της αθηρωμάτωσης συγκαταλέγονται ο σακχαρώδης διαβήτης, η αντίσταση στην ινσουλίνη, η αρτηριακή υπέρταση, η παχυσαρκία, το κάπνισμα και οι υπερλιπιδαιμίες. Οξειδωτικό stress Ο συνδετικός κρίκος μεταξύ όλων των παραγόντων που σχετίζονται με την πρόκληση της αθηρωμάτωσης είναι το οξειδωτικό stress. Ορισμός Στον ανθρώπινο οργανισμό υπάρχει ισορροπία ανάμεσα στην παραγωγή και την εξουδετέρωση των οξειδωτικών ουσιών (redox state). Με τον όρο οξειδωτικό stress αναφερόμαστε σε διαταραχή αυτής της ισορροπίας ως αποτέλεσμα μιας υψηλότερης παραγωγής οξειδωτικών ουσιών (ROS) ή/και μιας μείωσης του συστήματος άμυνας των αντιοξειδωτικών ουσιών (Sies, 1985). Διαταραχή αυτού του φυσιολογικού redox state μπορεί να προκαλέσει τοξικές επιδράσεις μέσω της παραγωγής υπεροξειδίων και ελευθέρων ριζών που καταστρέφουν όλα τα στοιχεία του κυττάρου, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών, των λιπιδίων και του DNA. Δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS) o Ορισμός Κάθε μόριο, το οποίο μπορεί να φέρει ένα ή περισσότερα αζευγάρωτα ηλεκτρόνια στην εξωτερική ηλεκτρονική στιβάδα του (τροχιακό δυναμικό), μπορεί να θεωρηθεί ως ελεύθερη ρίζα. Στην κατηγορία των ελεύθερων ριζών ανήκουν και ορισμένες δραστικές μορφές οξυγόνου (Reactive oxygen species/ros). Οι δραστικές μορφές οξυγόνου είναι ιόντα ή πολύ μικρά μόρια που περιλαμβάνουν ιόντα οξυγόνου, ελεύθερες ρίζες και υπεροξείδια, τόσο ανόργανα όσο και οργανικά (Πίνακας 5). Είναι εξαιρετικά δραστικές καθώς περιέχουν ασύζευκτα ηλεκτρόνια (Gutteridge, 1995). Οι ROS σχηματίζονται ως φυσικά παραπροϊόντα του μεταβολισμού του οξυγόνου και έχουν κεντρικό ρόλο στην κυτταρική σηματοδότηση. Όμως, παρουσία περιβαλλοντικού stress, όπως έκθεσης στη ζέστη ή την υπεριώδη ακτινοβολία, τα επίπεδα των ROS αυξάνονται δραματικά οδηγώντας στην 63

79 ΕΙΣΑΓΩΓΗ καταστροφή συστατικών του κυττάρου (οξειδωτικό stress). Οι ROS παράγονται επίσης από εξωγενείς πηγές, όπως η ιονίζουσα ακτινοβολία. Πίνακας 5. Κύριοι τύποι δραστικών μορφών οξυγόνου. Table 5. Principal types of reactive oxygen species. Ρίζες Συμβολισμός Μη- ρίζες Υδροξύλιο Αλκοξύλιο L(R)O Υποχλώριο Υπεροξείδιο HOO Υπεροξείδιο L(R)OO Μονοατομικό OH υπεροξυνιτρίτης Συμβολισμός ONOO- OCL L(R)OOH O2 Υπεροξείδιο οξυγόνο Μονοξείδιο NO Υπεροξείδιο H2O2 του αζώτου Σουπεροξείδιο του υδρογόνου O2 - o Ανιόν σουπεροξείδιου (Ο2-) Το Ο2- σχηματίζεται από αναγωγή του Ο2 με ένα ηλεκτρόνιο. Η παραγωγή του γίνεται από την αναπνευστική αλυσίδα των μιτοχονδρίων, καθώς και από τη δράση των ενζύμων οξειδάση της ξανθίνης, λιποοξυγενάση, κυκλοοξυγενάση και NADPH οξειδάση. Δεδομένου του αρνητικού του φορτίου, το Ο2- διαχέεται πολύ αργά διαμέσου των κυτταρικών μεμβρανών (Takahashi και Asada, 1983). Γενικά όμως παίζει κεντρικό ρόλο στη βιοχημεία των ελευθέρων ριζών καθώς παράγει πλήθος άλλων ROS, όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου και την υδροξυπεροξειδική ρίζα (ΗΟ2.). o Υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2) Το Η2Ο2 σχηματίζεται από την αναγωγή του Ο2 με δύο ηλεκτρόνια. Στα βιολογικά συστήματα όμως, το Η2Ο2 παράγεται κυρίως από την αντίδραση δύο Ο2είτε αυθόρμητα, είτε ενζυμικά με τη δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD) σύμφωνα με την παρακάτω αντίδραση: 64

80 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2Ο2- + 2Η+ SOD Η2Ο2 + Ο2 Το Η2Ο2 δεν έχει ελεύθερα ηλεκτρόνια και επομένως δε συγκαταλέγεται στις ελεύθερες ρίζες. Μάλιστα, παρά το γεγονός ότι έχει μικρή δραστικότητα, είναι μια σημαντική ένωση δεδομένου του ότι διαχέεται πολύ γρήγορα μεταξύ των μεμβρανών, ενώ μπορεί να διασπαστεί παρουσία μεταβατικών μετάλλων και να δώσει γένεση στην υδροξυλική ρίζα που είναι ιδιαιτέρως τοξική. Το Η2Ο2 μόλις παραχθεί απομακρύνεται από τρία τουλάχιστον αντιοξειδωτικά ενζυμικά συστήματα, τις καταλάσες, τις υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης και τις υπεροξυρεδοξίνες (Chae και συν., 1999; Mates και συν., 1999). o Υπεροξειδική ρίζα (ROO.) Οι υπεροξειδικές ρίζες σχηματίζονται από την προσθήκη μοριακού Ο2 σε ρίζες που έχουν ως κέντρα τον άνθρακα (οργανικές ελεύθερες ρίζες). Κύριος ρόλος τους είναι η αφαίρεση ατόμων υδρογόνου από τα λιπίδια των κυτταρικών μεμβρανών προωθώντας την λιπιδική υπεροξείδωση. o Υδροξυλική ρίζα (ΟΗ.) Η υδροξυλική ρίζα (ΟΗ.) έχει έντονη δραστικότητα και τοξικότητα καθώς έχει την ικανότητα να οξειδώνει σχεδόν όλα τα βιομόρια που υπάρχουν κοντά στον τόπο παραγωγής της. Κύρια λειτουργία της είναι η αφαίρεση ατόμων υδρογόνου από οργανικές ενώσεις παράγοντας έτσι πλήθος νέων ριζών. Στα βιολογικά συστήματα η ΟΗ. παράγεται από τον δισθενή σίδηρο (Fe2+) που δρα ως δότης ηλεκτρονίων, παρουσία Η2Ο2, μέσω της αντίδρασης Fenton. o Υποχλωριώδες οξύ Το υποχλωριώδες οξύ (HOCl) παράγεται κατά την ενεργοποίηση των ουδετεροφίλων. Πιο συγκεκριμένα, μόλις ενεργοποιηθούν τα ουδετερόφιλα, η μυελοπεροξειδάση που εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα των φαγοκυττάρων καταλύει το σχηματισμό του HOCl από Cl- και H2O2. Πρόκειται για ένα ασθενές οξύ που όμως έχει έντονη χημική δραστικότητα. 65

81 ΕΙΣΑΓΩΓΗ o Μονοξείδιο του αζώτου Το μονοξείδιο του αζώτου (NO.) είναι μια ιδιαίτερα σταθερή ελεύθερη ρίζα που παρουσιάζει έντονη κινητικότητα λόγω της έλλειψης φορτίου. Κύριο χαρακτηριστικό της είναι ότι συμμετέχει στην παραγωγή μιας σειράς ROS, όπως το διοξείδιο του αζώτου και ο υπεροξυνιτρίτης, που είναι ένα ιδιαίτερα ισχυρό οξειδωτικό (Pryor και Squadrito, 1995). Ανάμεσα στις βασικές λειτουργίες του NO. συγκαταλέγονται η συμμετοχή του στη νευροδιαβίβαση, τη φλεγμονή και τον κυτταρικό θάνατο (Lane και Gross, 1999), ενώ μπορεί να οξειδώσει, να νιτρώσει ή να νιτροσυλιώσει πλήθος πρωτεϊνών. Πηγές παραγωγής δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) Οι κυριότερες πηγές ROS στα αγγειακά κύτταρα είναι η NADPH οξειδάση, η αναπνευστική αλυσίδα, η μυελοπεροξειδάση, η οξειδάση της ξανθίνης, η συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου, οι λιποοξυγενάσες και τα μεταβατικά μέταλλα (Loscalzo, 2005). o NADPH οξειδάση Η οξειδάση του νικοτιναμινο-αδενινο-φωσφοδινουκλεοτιδίου (NADPH οξειδάση) αποτελεί μια από τις κυριότερες πηγές ROS στα αγγειακά κύτταρα και τα μυοκύτταρα της καρδιάς (Griendling και συν., 2000). Μάλιστα εμπλέκεται και στην παθογένεια της αθηρωμάτωσης (Barry-Lane και συν., 2001), γεγονός που την καθιστά σημαντικό εργαλείο για τη μελέτη της ασθένειας. Η αντίδραση που καταλύεται από τη ΝΑDPH οξειδάση και οδηγεί στην παραγωγή Ο2- είναι: NADPH oxidase NADPH+2O2 NADP+ + H+ + 2O2- Η NADPH οξειδάση των μονοκυττάρων είναι ένα σύμπλοκο που αποτελείται από το κυτόχρωμα b558 που συντίθενται από τις μεμβρανικές υπομονάδες gp91phox και p22phox και τις κυτταροπλασματικές υπομονάδες p47phox, p67phox και Rac1 (Cathcart, 2003). Η θέση σύνδεσης του NADPH βρίσκεται στην gp91phox υπομονάδα, ενώ η p67phox αντιδρά με τις μεμβρανικές υπομονάδες έτσι ώστε να διευκολύνεται η μεταφορά ηλεκτρονίων από το NADPH προς το οξυγόνο (Vignais, 2002). Έπειτα από ενεργοποίηση, τα κυτταροπλασματικά συστατικά μετατοπίζονται στην πλασματική μεμβράνη και συνθέτουν την ενεργή NADPH οξειδάση. Το γενικό 66

82 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μοντέλο της NADPH οξειδάσης στους διάφορους τύπους κυττάρων είναι το ίδιο, ενώ παρατηρούνται επιμέρους μόνο διαφορές όσον αφορά την παραγωγή Ο2-. και τη ρύθμιση του ενζύμου (Cathcart, 2003; Fukai και Alexander, 2004). Η συνάθροιση των επιμέρους υπομονάδων και η ακόλουθη ενεργοποίηση της NADPH οξειδάσης ρυθμίζεται από την εισροή ασβεστίου, την απελευθέρωση ασβεστίου από ενδοκυττάριες αποθήκες, την PKC- εξαρτώμενη ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης Α2 (cpla2) και την παραγωγή αραχιδονικού οξέος που ρυθμίζει τη μετατόπιση των p47phox και p67phox στη μεμβράνη (Cathcart, 2003) (Εικόνα 24). Εικόνα 24: Ρύθμιση της NADPH οξειδάσης των μονοκυττάρων. Τα συστατικά του ενζύμου απεικονίζονται σε χρωματιστούς κύκλους. Επίσης απεικονίζονται τα ρυθμιστικά μονοπάτια που ελέγχουν τη συνάθροιση και ενεργοποίηση της NADPH οξειδάσης (Cathcart, 2003). Image24: Regulation of monocyte NADPH oxidase. Components of the enzyme are shown in colorfilled circles. The regulatory pathways, controlling NADPH oxidase assembly and activation, are also indicated (Cathcart, 2003). o Αναπνευστική αλυσίδα Το μιτοχόνδριο αποτελεί μια σημαντική πηγή παραγωγής ROS (Chance και συν., 1979) δεδομένου του ότι αντί να οδηγηθεί στην αναγωγή των μορίων Ο2 σε νερό, το Ο2 ανάγεται για να δώσει Ο2- από τα σύμπλοκα Ι (NADH δεϋδρογονάση) (Genova και συν., 2001), ΙΙ (σουκινική δεϋδρογονάση) (Lenaz, 2001) και ΙΙΙ (ουβικινόνη-κυτόχρωμα bc1 αναγωγάση) (Han και συν., 2001) που εντοπίζονται στην εσωτερική μεμβράνη του μιτοχονδρίου (Cadenas και Davies, 2000). Το Ο2- δεν είναι ιδιαίτερα τοξικό αλλά μπορεί να απενεργοποιήσει ειδικά ένζυμα και να προκαλέσει την υπεροξείδωση των λιπιδίων. 67

83 ΕΙΣΑΓΩΓΗ o Μυελοπεροξειδάση (MPO) Η μυελοπεροξειδάση (ΜΡΟ) καταλύει τη μετατροπή των ιόντων Cl σε υποχλωριώδες οξύ (HOCl) σύμφωνα με την παρακάτω αντίδραση: Η2Ο2 + Cl- + H+ ΜΡΟ HOCl + H2O Πρόκειται για ένα διμερές με μοριακό βάρος 150 kda που αποτελείται από δύο ελαφριές αλυσίδες των 15 kda και δύο βαριές αλυσίδες με μοριακό βάρος που ποικίλλει ανάλογα με το βαθμό γλυκοζυλίωσής τους. Οι αλυσίδες συνδέονται μεταξύ τους με μια προσθετική ομάδα αίμης. Επίσης, το ένζυμο περιέχει μια περιοχή πρόσδεσης με ασβέστιο που είναι σημαντική για τη δομή της ενεργής περιοχής του. Η ΜΡΟ εντοπίζεται κατά κύριο λόγο στα λευκοκύτταρα και είναι το μοναδικό ένζυμο που παράγει HOCl. Επίσης, παράγει μια σειρά προϊόντων, όπως 3-χλωροτυροσίνη, χλωροϋδρίνες και ρίζες τυροσίνης (Stocker και Keaney, 2005). Τα τελευταία χρόνια μελετάται ο πιθανός ρόλος της ΜΡΟ στο σχηματισμό της αθηρωματικής πλάκας. Πιο συγκεκριμένα, βρέθηκε ότι η δραστικότητα του ενζύμου είναι αυξημένη σε αθηρωματικές πλάκες (Daugherty και συν., 1994), ενώ σε απομονωμένες LDL αθηρωματικών πλακών βρέθηκαν χλωριωμένα προϊόντα, που είναι ενδεικτικά της δράσης της ΜΡΟ. Τα παραπάνω δεδομένα είναι σε συμφωνία με κλινικές μελέτες που δείχνουν ότι τα επίπεδα της ΜΡΟ στην κυκλοφορία συμβαδίζουν με την πιθανότητα πρόκλησης καρδιαγγειακής νόσου (Zhang και συν., 2001). o Οξειδάση της ξανθίνης Η οξειδάση της ξανθίνης είναι μια σιδηρο-θειο μολυβδαινική φλαβοπρωτεΐνη με πολλαπλές λειτουργίες, που απαντάται σε δύο μορφές: τη δεϋδρογονάση της ξανθίνης και την οξειδάση της ξανθίνης. Η οξείδωση της ξανθίνης ή της υποξανθίνης σε ουρικό οξύ σχετίζεται με την παραγωγή NADH από τη δεϋδρογονάση, ενώ η οξειδάση παράγει Ο2-. Η δεϋδρογονάση μετατρέπεται σε οξειδάση μέσω πρωτεόλυσης ή οξείδωσης των θειικών της ομάδων. Ο ρόλος του ενζύμου στην παραγωγή Ο2- από τα κύτταρα σχετίζεται με την παθογένεια της αγγειακής νόσου (Ohara και συν., 1993) και την ισχαιμία-επαναιμάτωση (McCord, 1985). o Συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟS) Η συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ συνθάση) καταλύει τη μετατροπή της L-αργινίνης σε L-κιτρουλλίνη και ΝΟ.. Διακρίνεται σε νευρωνική (nnos) που εντοπίζεται στο νευρικό ιστό, ενδοθηλιακή (enos) που βρίσκεται στο 68

84 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ενδοθήλιο και επαγόμενη (inducible) (inos) που απαντάται στο ανοσοποιητικό και καρδιαγγειακό σύστημα. Οι ενδοθηλιακές και επαγόμενες ΝΟ συνθάσες εμπλέκονται περισσότερο με την παθογένεια της αθηρωμάτωσης. (Stocker και Keaney, 2005). Η δραστικότητα της ΝΟ συνθάσης σχετίζεται έντονα με την πρόκληση της αγγειακής νόσου καθώς το παραγόμενο ΝΟ. αντιδρά με μεταλλικά ιόντα, μεταλλοπρωτεΐνες και Ο2- σχηματίζοντας δραστικές μορφές αζώτου. Η καλύτερα μελετημένη αντίδραση είναι αυτή ανάμεσα στο ΝΟ. και το Ο2- που οδηγεί στο σχηματισμό του υπεροξυνιτρίτη (ΟΝΟΟ-) που με τη σειρά του αντιδρά με το CO2 δίνοντας ΝΟ2.. Το ΝΟ2. στη συνέχεια επάγει τη νίτρωση των πρωτεϊνών (Gow και συν., 1996) και την υπεροξείδωση των λιπιδίων (Byun και συν., 1999). Με βάση τα παραπάνω, η. αποσυζευγμένη ΝΟ συνθάση είναι πηγή τόσο ΝΟ όσο και Ο2- και έχει σημαντικό ρόλο στην πρόκληση οξειδωτικού stress στα αγγεία. o Λιποοξυγενάσες Οι λιποοξυγενάσες είναι διοξυγενάσες που περιέχουν σίδηρο και καταλύουν την εισαγωγή οξυγόνου σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα παράγοντας μια σειρά βιολογικά ενεργών λιπιδίων, όπως οι προσταγλανδίνες, οι θρομβοξάνες και τα λευκοτριένια. Υπάρχουν σαφείς ενδείξεις ότι οι λιποοξυγενάσες εμπλέκονται στη διαδικασία σχηματισμού της αθηρωματικής πλάκας, καθώς συγκεκριμένοι τύποι της εκφράζονται στην αθηρωματική βλάβη, ενώ απουσία κάποιων γονιδίων που τις κωδικοποιούν σε ποντίκια, τα προστατεύουν από την πρόκληση της ασθένειας (Mehrabian και συν., 2002). o Μεταβατικά μέταλλα Τα μεταβατικά μέταλλα, όπως ο χαλκός και ο σίδηρος έχουν μελετηθεί εκτενώς σε σχέση με τη συμμετοχή τους σε αντιδράσεις ριζών και την καταστροφή βιομορίων, καθώς αποτελούν καταλύτες σε αντιδράσεις οξείδωσης παρουσία υδατικών και λιπιδιακών περοξειδίων (Haber και Weis, 1934). Γενικά όμως η συγκέντρωσή των μεταβατικών μετάλλων in vivo είναι αμελητέα και έτσι δεν υπάρχουν πολλές ενδείξεις που να τα συνδέουν με την αθηρωμάτωση. 69

85 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο ρόλος του οξειδωτικού stress στην αθηρωμάτωση Οι ROS είναι αυξημένες στην αθηρωμάτωση αλλά και σε καταστάσεις που σχετίζονται με την παθογένεια της ασθένειας, όπως ο σακχαρώδης διαβήτης, η παχυσαρκία και το κάπνισμα (Griendling και FitzGerald, 2003). Η παθογένεια της αθηρωμάτωσης χαρακτηρίζεται από έλλειψη ισορροπίας ανάμεσα στο οξειδωτικό stress και τους αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς άμυνας, με αποτέλεσμα την έντονη παραγωγή ROS. Οι ROS στη συνέχεια συμμετέχουν σε πλήθος σηματοδοτικών μονοπατιών ενεργοποιώντας κινάσες, όπως η PKC, και μεταγραφικούς παράγοντες, όπως ο NF-κΒ, που ρυθμίζουν την κυτταρική απόκριση κατά τη αύξηση, αλλά και σε καταστάσεις stress (Irani, 2000). Συνοπτικά, η συμβολή των ROS στο σχηματισμό της αθηρωματικής πλάκας περιγράφεται παρακάτω (Εικόνα 25). Η παραγωγή των ROS προκαλεί επίσης απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης κασπασών, καθώς και αποικοδόμηση της κολλαγονώδους εξωκυττάριας ουσίας μέσω ενεργοποίησης των μεταλλοπρωτεϊνασών (ΜΜΡs), παράγοντες που συμβάλλουν καθοριστικά στην αστάθεια της πλάκας (Irani, 2000). Εικόνα 25: Ο ρόλος των δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) στην πρόκληση της αθηρωμάτωσης. bfgf = βασικός αναπτυξιακός παράγοντας ινοβλαστών; ICAM-1 = ενδοκυτταρικό μόριο προσκόλλησης 1; IL-1 = ιντερλευκίνη 1; MCP-1 = χημειοτακτική πρωτεΐνη μονοκυττάρων 1; M-CSF = αποικιο-διεγερτικός παράγοντας μονοκυττάρων; NO = μονοξείδιο του αζώτου; PAF = παράγοντας ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων platelet; PAI-1 = ενεργοποιητής-αναστολέας 1 του πλασμινογόνου; PDGF = αυξητικός παράγοντας παραγόμενος από αιμοπετάλια; PGI2 =προστακυκλίνη; TGF-β =αυξητικός παράγοντας των ιστών β; TNF-α = ογκονεκρωτικός παράγοντας α; t-pa =ενεργοποιητής 70

86 ΕΙΣΑΓΩΓΗ πλασμινογόνου ιστικού τύπου; TxA2 = θρομβοξάνη A2; VCAM-1 = αγγειακό κυτταρικό μόριο προσκόλλησης 1; VEGF =αγγειακός αυξητικός παράγοντας ενδοθηλιακών κυττάρων; VLA-4 = όψιμο αντιγόνο 4. (Siekmeier και συν., 2007). Image 25: Role of reactive oxygen species (ROS) in the development of atheromatosis. bfgf = basic fibroblast growth factor; ICAM-1 = intercellular adhesion molecule 1; IL-1 = interleukin 1; MCP-1 = monocyte chemotactic protein 1; M-CSF = monocyte colony-stimulating factor; NO = nitrogen oxide; PAF = platelet activating factor; PAI-1 = plasminogen-activator-inhibitor 1; PDGF = platelet-derived growth factor; PGI2 = prostacycline; TGF-β = tissue growth factor beta; TNF-α = tumor necrosis factor-alpha; t-pa = tissue-type plasminogen activator; TxA2 = thromboxane A2; VCAM-1 = vascular cell adhesion molecule 1; VEGF = vascular endothelial growth factor; VLA-4 = very late antigen 4. (Siekmeier et al., 2007) Γλυκόζη o Γενικά χαρακτηριστικά Η πρόσληψη της γλυκόζης από τα κύτταρα γίνεται είτε από το εξωκυττάριο περιβάλλον, είτε μέσω καταβολισμού του γλυκογόνου που βρίσκεται ενδοκυτταρικά. Μάλιστα αναφέρεται ότι εξαιτίας του υδρόφιλου χαρακτήρα της δε μπορεί να εισέλθει στα κύτταρα με απλή διάχυση, αλλά απαιτεί τη συμμετοχή εξειδικευμένων πρωτεϊνών-μεταφορέων. Ένας από αυτούς είναι ο συμμεταφορέας Na+/γλυκόζης, ενώ υπάρχει και ένα ακόμα σύστημα μεταφοράς, η οικογένεια των μεταφορέων γλυκόζης (GLUT), όπου δεν απαιτείται Na+ για τη μεταφορά γλυκόζης (Medina και Owen, 2002). Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωριστεί 13 υποδοχείς GLUT με διαφορετικό πρότυπο έκφρασης και διαφορετική συγγένεια στη γλυκόζη (Joost και Thorens, 2001). Έτσι, για παράδειγμα, ο GLUT1 απαντάται σε όλους τους ιστούς και κυρίως στον εγκέφαλο και τα ερυθροκύτταρα και είναι υπεύθυνος για τη βασική πρόσληψη της γλυκόζης, ενώ οι GLUT2 και GLUT5 είναι κυρίως μεταφορείς φρουκτόζης και απαντώνται στο συκώτι και τους νεφρούς αντίστοιχα (Korgun και συν., 2002). Στα μονοκύτταρα του αίματος εντοπίζονται οι υποδοχείς GLUT1, GLUT3 και GLUT4. Μάλιστα ο GLUT4 είναι ο μοναδικός υποδοχέας γλυκόζης του οποίου η δράση ρυθμίζεται από την ινσουλίνη (Korgun και συν., 2002). o Υπεργλυκαιμία-ρόλος στην αθηρωμάτωση Η υπεργλυκαιμία, όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως είναι κύριο χαρακτηριστικό των ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη. Μάλιστα, η εκτεταμένη έκθεση σε καταστάσεις υπεργλυκαιμίας σχετίζεται με την παθογένεια των διαβητικών επιπλοκών (Laakso, 1999), ενώ παράλληλα επάγει και την αθηρωμάτωση. Ο παραπάνω ρόλος της υπεργλυκαιμίας επιτελείται μέσω τριών βασικών μηχανισμών: 71

87 ΕΙΣΑΓΩΓΗ της μη ενζυμικής γλυκοζυλίωσης πρωτεϊνών και λιπιδίων, του οξειδωτικού stress και της ενεργοποίησης της PKC (Aronson και Rayfield, 2002). Οι παραπάνω μηχανισμοί δεν είναι ανεξάρτητοι μεταξύ τους. Για παράδειγμα, το επαγόμενο από την υπεργλυκαιμία οξειδωτικό stress οδηγεί στο σχηματισμό των AGEs και ακολούθως στην ενεργοποίηση της PKC (Nishikawa και συν., 2002). Τελικά προϊόντα γλυκοζυλίωσης (AGEs) Ένας από τους μηχανισμούς που ευθύνονται για την πρόκληση της αθηρωμάτωσης στο σακχαρώδη διαβήτη είναι και η μη ενζυμική αντίδραση ανάμεσα στη γλυκόζη και τις πρωτεΐνες ή λιποπρωτεΐνες του τοιχώματος των αρτηριών, γνωστή και ως αντίδραση Maillard ή αμαυρωτική αντίδραση (Aronson και Rayfield, 2002). Συνοπτικά, η γλυκόζη αντιδρά με ενεργές αμινοομάδες πρωτεϊνών της κυκλοφορίας ή του αγγειακού τοιχώματος και σχηματίζει πρώιμα αντιστρεπτά προϊόντα γλυκοζυλίωσης (βάσεις Schiff) που στη συνέχεια επαναδιατάσσονται και σχηματίζουν τα πιο σταθερά πρώιμα προϊόντα γλυκοζυλίωσης, τύπου Amadori. Κάποια από τα παραπάνω προϊόντα υφίστανται περαιτέρω χημικές τροποποιήσεις με αποτέλεσμα να σχηματίζουν τα τελικά προϊόντα γλυκοζυλίωσης (AGEs), που είναι σταθερά και μη αντιστρεπτά. Τα AGEs με τη σειρά τους επιταχύνουν την αθηρωματική διαδικασία μέσω μηχανισμών που μεσολαβούνται ή δε μεσολαβούνται από τους υποδοχείς των AGEs, τους RAGEs. Οι μηχανισμοί που είναι ανεξάρτητοι από τους RAGEs οδηγούν σε τροποποιήσεις της εξωκυττάριας ουσίας (Brownlee και συν., 1988), των λιποπρωτεϊνών (Bucala και συν., 1994) και της λειτουργίας των πρωτεϊνών (Acosta και συν., 1994), ενώ αυτοί που εξαρτώνται από τους RAGEs επάγουν φλεγμονή (Vlassara και συν., 1994), κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Kirstein και συν., 1994) και δυσλειτουργία του ενδοθηλίου (Wautier και συν., 1994). Οξειδωτικό stress Η υπεργλυκαιμία επάγει το οξειδωτικό stress μέσω τριών διαφορετικών μηχανισμών. Έτσι, αυξάνει την παραγωγή των Ο2- από τη μιτοχονδριακή αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων (Nishikawa και συν., 2000). Επίσης, η γλυκόζη μέσω της καταλυόμενης από μέταλλα αυτοοξείδωσής της αυξάνει την παραγωγή Ο2- και υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) (Wolff, 1993). Τέλος, ο τρίτος μηχανισμός περιλαμβάνει την καταλυόμενη από μέταλλα αυτοοξείδωση των προϊόντων Amadori 72

88 ΕΙΣΑΓΩΓΗ που οδηγεί σε αυξημένη παραγωγή Ο2-, ριζών υδροξυλίου, καθώς και ενεργών δικαρβονυλίων (Baynes και Thorpe, 1999). Πρωτεϊνική κινάση C (PKC) Η ενδοκυτταρική υπεργλυκαιμία εμπλέκεται στην παθογένεια της αθηρωμάτωσης και μέσω της ενεργοποίησης της PKC και της μεταβίβασης σήματος (Koya και King, 1998). Οι υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης ενεργοποιούν την PKC αυξάνοντας το σχηματισμό της διακυλογλυκερόλης (DAG). Η PKC εμπλέκεται στη μεταγραφή πλήθους αυξητικών παραγόντων καθώς και στην κυτταρική σηματοδότηση που επάγεται από αυξητικούς παράγοντες (Park και συν., 2000a). Για παράδειγμα, η PKC που επάγεται από την υπεργλυκαιμία οδηγεί σε αυξημένη έκφραση του υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα των αιμοπεταλίων-β (PDGF-β) στα λεία μυϊκά καθώς σε άλλα κύτταρα του αγγειακού τοιχώματος (Inaba και συν., 1996). Επίσης, η ενεργοποιημένη PKC αυξάνει την έκφραση του μετασχηματίζοντα αυξητικού παράγοντα-β (TGF-β) που με τη σειρά του ελέγχει την παραγωγή της εξωκυττάριας ουσίας μέσω ενεργοποίησης της έκφρασης γονιδίων των πρωτεογλυκανών και του κολλαγόνου και μέσω μείωσης της σύνθεσης των πρωτεολυτικών ενζύμων που αποικοδομούν τις πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας (Nabel και συν., 1993). o Γλυκόζη και μεταβίβαση σήματος στην αθηρωμάτωση Η γλυκόζη συμμετέχει σε πλήθος σηματοδοτικών μονοπατιών που εμπλέκονται σε διαδικασίες όπως η έκφραση γονιδίων, η κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση. Πιθανότατα μάλιστα όλες οι δυσμενείς επιδράσεις των υψηλών συγκεντρώσεων γλυκόζης να οφείλονται σε αλλαγές στα παραπάνω σηματοδοτικά μονοπάτια (Ceolotto και συν., 2001). Στην παρούσα ενότητα αναφέρονται ενδεικτικά κάποια από τα σηματοδοτικά μόρια που επάγονται από τη γλυκόζη και σχετίζονται με την αθηρωμάτωση. Τα έως τώρα δεδομένα είναι πολύ περιορισμένα. Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω η γλυκόζη ενεργοποιεί την PKC διαφόρων τύπων κυττάρων του αγγειακού τοιχώματος συμβάλλοντας στην πρόκληση της αθηρωμάτωσης (Inaba και συν., 1996). Επίσης, στα ερυθρά αιμοσφαίρια ενεργοποιεί την p42/44 MAPK κινάση (Bandyopadhyay και συν., 2000), ενώ σε καταστάσεις υπεργλυκαιμίας ρυθμίζει και τη δραστικότητα των ERK MAPK κινασών (Tomlinson, 1999). Οι υψηλές 73

89 ΕΙΣΑΓΩΓΗ συγκεντρώσεις γλυκόζης στα μεσαγγειακά κύτταρα βρέθηκε να ενεργοποιούν και τον αυξητικό παράγοντα TGF-β (Sharma και Ziyadeh, 1997) που συμβάλλει στην πρόκληση της διαβητικής νεφροπάθειας (Ziyadech, 1998). Παράλληλα, πολλές είναι οι μελέτες που συνδέουν την υπεργλυκαιμία με την ενεργοποίηση του ανταλλάκτη Na+/H+, NHE-1, είτε άμεσα όπως για παράδειγμα στις λείες μυϊκές ίνες των αγγείων (Siczkowski και Ng, 1996) και στα μεσαγγειακά κύτταρα των νεφρικών σπειραμάτων (Ganz και συν., 2000), είτε έμμεσα, μέσω ενεργοποίησης των PKC και ΜΑΡ κινασών (Sauvage και συν., 2000; Konstantinou-Tegou και συν., 2001; Bourikas και συν., 2003). Ινσουλίνη Ο κυριότερος ρυθμιστής των επιπέδων της γλυκόζης στο αίμα είναι η ινσουλίνη. o Ινσουλίνη και μεταβίβαση σήματος Η ινσουλίνη δρα μέσω του υποδοχέα της, IR (Insulin Receptor) που είναι υποδοχέας κινάσης τυροσίνης και αποτελείται από δύο εξωκυτταρικές α υπομονάδες και δύο διαμεμβρανικές β υπομονάδες που συνδέονται μεταξύ τους με δισουλφιδικούς δεσμούς. Πρόσδεση της ινσουλίνης στην α υπομονάδα οδηγεί σε αυτοφωσφορυλίωση των καταλοίπων τυροσίνης της β υπομονάδας (Van Obberghen και συν., 2001) καθώς και σε φωσφορυλίωση στην τυροσίνη του υποστρώματος του υποδοχέα της ινσουλίνης, IRS (Insulin Receptor Substrate) (Lizcano και Alessi, 2002). Τα φωσφορυλιωμένα κατάλοιπα του IRS αναγνωρίζονται στη συνέχεια από την SH2 (Src homology 2) περιοχή της p85 ρυθμιστικής υπομονάδας της 3 κινάσης του φωσφοϊνοσιτιδίου (ΡΙ3Κ) η οποία ενεργοποιείται και με τη σειρά της ενεργοποιεί την PKC και την Akt κινάση (πρωτεϊνική κινάση Β-ΡΚΒ). Αποτέλεσμα της δράσης των παραπάνω κινασών είναι η πρόσληψη της γλυκόζης, η γλυκονεογένεση και η σύνθεση γλυκογόνου (Εικόνα 26). Μια ακόμη κύρια λειτουργία της ινσουλίνης είναι η διέγερση της πρόσληψης της γλυκόζης από τα κύτταρα μέσω μετατόπισης του υποδοχέα γλυκόζης GLUT4 από το εσωτερικό του κυττάρου στην πλασματική μεμβράνη, στην οποία εμπλέκονται τόσο η ΡΙ3Κ, όσο και η Akt (Lizcano και Alessi, 2002). Πέρα από το ΡΙ3Κ-εξαρτώμενο μονοπάτι η ινσουλίνη επάγει και το μονοπάτι των ΜΑΡ (mitogen activated protein) κινασών μέσω ενεργοποίησης του παράγοντα ανταλλαγής GTP, Sos (Nystrom και Quon, 1999). Ο Sos ενεργοποιεί στη συνέχεια τη 74

90 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ras πρωτεΐνη που με τη σειρά της επάγει το μονοπάτι διαδοχικής ενεργοποίησης κινασών που περιλαμβάνει τις Raf/ΜΕΚ/ΕRK/MAPK (Nystrom και Quon, 1999) και δρα στον πυρήνα. Ανάμεσα στις κύριες λειτουργίες του περιλαμβάνονται η ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, της διαφοροποίησης και η μιτογένεση (Εικόνα 26). Γενικά, το ΡΙ3Κ-εξαρτώμενο μονοπάτι μεσολαβεί τις μεταβολικές δράσεις της ινσουλίνης, ενώ το ΜΑΡΚ-εξαρτώμενο μονοπάτι τις μη μεταβολικές μιτογόνες και αυξητικές επιδράσεις της ινσουλίνης (Muniyappa και συν., 2007). Εικόνα 26: Γενικά χαρακτηριστικά των μονοπατιών μεταβίβασης σήματος που επάγονται από την ινσουλίνη. Το ΡΙ3Κ-εξαρτώμενο μονοπάτι ρυθμίζει το μεταβολισμό της γλυκόζης στον σκελετικό μυ, το λιπώδη ιστό και το συκώτι, ενώ διεγείρει την παραγωγή ΝΟ και την αγγειοδιαστολή στο αγγειακό ενδοθήλιο. Το ΜΑΡΚ-εξαρτώμενο μονοπάτι ελέγχει την ανάπτυξη και τη μιτογένεση, ενώ ρυθμίζει την έκκριση της ενδοθηλίνης-1 (ΕΤ-1) στο αγγειακό ενδοθήλιο (Muniyappa και συν., 2007). Image 26: General features of insulin-induced signal transduction pathways. PI3K-dependent pathway regulates glucose metabolism in skeletal muscle, adipose tissues and liver, while it stimulates NO production and vasolidation in vascular endothelium. MAPK-dependent pathway regulates growth and mitogenesis and control secretion of endothelin-1 (ET-1) in vascular endothelium (Muniyappa et al., 2007). 75

91 ΕΙΣΑΓΩΓΗ o Υπερινσουλιναιμία-αντίσταση στην ινσουλίνη-σακχαρώδης διαβήτης-αθηρωμάτωση Η αντίσταση στην ινσουλίνη χαρακτηρίζεται από ασυνήθιστα υψηλές συγκεντρώσεις εξωγενούς και ενδογενούς ινσουλίνης προκειμένου να επιτευχθεί φυσιολογική βιολογική απόκριση και να διατηρηθεί η ευγλυκαιμία. Η αντίσταση στην ενδογενή ινσουλίνη στα κύτταρα των μυών, του λίπους και των κυττάρων του συκωτιού αντισταθμίζεται από υψηλές συγκεντρώσεις ινσουλίνης στο αίμα που συνοδεύονται από επίπεδα γλυκόζης που είναι είτε φυσιολογικά, είτε υψηλά (Bansilal και συν., 2007). Η αντίσταση στην ινσουλίνη οφείλεται σε ελαττώματα ή ελλείψεις που παρατηρούνται κατά την πρόσδεση της ινσουλίνης στον υποδοχέα της, στο επίπεδο του υποδοχέα ή στο επίπεδο της κυτταρικής σηματοδότησης. Κύριο χαρακτηριστικό της αντίστασης στην ινσουλίνη είναι ο ελαττωματικός σηματοδοτικός μηχανισμός που εξαρτάται από την ΡΙ3Κ, σε αντίθεση με τον ΜΑΡΚ εξαρτώμενο που παραμένει ανεπηρέαστος. Αποτέλεσμα των παραπάνω είναι η μειωμένη παραγωγή ΝΟ σε συνδυασμό με την αυξημένη παραγωγή ενδοθηλίνης-1 που συμβάλλουν στη δυσλειτουργία του ενδοθηλίου (Muniyappa και συν., 2007). Οι τρόποι με τους οποίους η υπερινσουλιναιμία μπορεί να οδηγήσει στην πρόκληση της αθηρωμάτωσης αναφέρονται στην παρακάτω εικόνα (Εικόνα 27). Εικόνα 27: Σχηματικό διάγραμμα των γεγονότων που οδηγούν από την αντίσταση στην ινσουλίνη στην αθηροσκλήρωση και τα κλινικά χαρακτηριστικά της (Bansilal και συν., 2007). 76

92 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Image 27: Schematic diagram of the events that lead from insulin resistance to atherosclerosis and its clinical features (Bansilal et al., 2007). Κύρια διαταραχή του μεταβολισμού της γλυκόζης είναι ο σακχαρώδης διαβήτης. Ο σακχαρώδης διαβήτης χαρακτηρίζεται από ανεπάρκεια έκκρισης ινσουλίνης με επακόλουθη ανεπάρκεια στις μεταβολικές δράσεις της. Αποτέλεσμα των παραπάνω είναι η διαρκής υπεργλυκαιμία. Διακρίνονται δύο ξεχωριστοί τύποι σακχαρώδους διαβήτη, ο τύπος Ι-ινσουλινοεξαρτώμενος (ΙDDM, insulin-dependent diabetes mellitus) και ο τύπος ΙΙ- μη ινσουλινοεξαρτώμενος διαβήτης (NIDM, non insulin-dependent diabetes mellitus). Στον τύπο Ι (ινσουλινοεξαρτώμενος διαβήτης), παρατηρείται καταστροφή των β-κυττάρων των νησιδίων Langerhans του παγκρέατος και ουσιαστικά ουδεμία έκκριση ινσουλίνης. Στον τύπο II, (μη ινσουλινοεξαρτώμενος σακχαρώδης διαβήτης), είτε είναι ανεπαρκής η έκκριση ινσουλίνης για να αποφευχθεί η υπεργλυκαιμία, είτε παρατηρείται έλλειψη ευαισθησίας στη δράση της (Garber, 2004). Παρά την εντατική έρευνα και τα σημαντικά βήματα που έχουν γίνει στη διαδικασία ελέγχου του μεταβολισμού της γλυκόζης, οι διαβητικοί ασθενείς παρουσιάζουν μεγάλες πιθανότητες εμφάνισης μιας σειράς κλινικών επιπλοκών που μπορούν, αν δεν αντιμετωπιστούν εγκαίρως, να οδηγήσουν ακόμα και στο θάνατο. Οι επιπλοκές αυτές διακρίνονται σε δύο κατηγορίες, τις μικροαγγειακές που περιλαμβάνουν την αμφιβληστριοπάθεια, τη νεφροπάθεια και τη νευροπάθεια, και τις μακροαγγειακές που περιλαμβάνουν τη στεφανιαία νόσο, τη νόσο των περιφερικών αγγείων, την ισχαιμία, δερματικά και στοματικά προβλήματα (ADA-American Diabetes Association, 2003a). 77

93 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Οι αλληλεπιδράσεις μονοκυττάρων και ενδοθηλιακών κυττάρων με μόρια της εξωκυττάριας ουσίας παίζουν κεντρικό ρόλο στα πρώτα στάδια της αθηρωμάτωσης, ενώ το οξειδωτικό stress θεωρείται σήμερα ένας από τους κεντρικούς παράγοντες δημιουργίας της αθηρωματικής πλάκας. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις μονοκυττάρων και ενδοθηλιακών κυττάρων με μόρια της εξωκυττάριας ουσίας. Επίσης, μελετήσαμε την επίδραση του οξειδωτικού stress στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μονοκυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων με μόρια της εξωκυττάριας ουσίας με απώτερο σκοπό την πρόταση καινοτόμων μορίων που να προστατεύουν από τις διαδικασίες επαγωγής της αθηρωμάτωσης. Αρχικά μελετήθηκε η ικανότητα των μονοκυττάρων που προέρχονταν από ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ και υγιείς δότες να παράγουν δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS) υπό την επίδραση αθηρογόνων παραγόντων, όπως υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης και ινσουλίνης. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η ικανότητα των μονοκυττάρων διαβητικών ασθενών τύπου ΙΙ και φυσιολογικών ατόμων που επωάστηκαν με γλυκόζη ή ινσουλίνη να καρβονυλιώνουν τις κυριότερες πρωτεΐνες των βασικών μεμβρανών, τη λαμινίνη-1 και το κολλαγόνο IV. Με δεδομένο μάλιστα ότι ο ακριβής σηματοδοτικός μηχανισμός που ενεργοποιείται κατά την αθηρωμάτωση δεν είναι γνωστός, στα πλαίσια της παρούσας διατριβής μελετήθηκαν τα σηματοδοτικά μόρια που ενεργοποιούνται είτε από τη γλυκόζη, είτε από την ινσουλίνη στα μονοκύτταρα και συμμετέχουν στην επαγωγή των αθηρογόνων ιδιοτήτων. Για το λόγο αυτό μελετήθηκε ο πιθανός ρόλος του NHE1, της NADPH οξειδάσης, των ROS, του Ca2+ και της PI3K στα σηματοδοτικά μονοπάτια που επάγονται από τη γλυκόζη ή την ινσουλίνη. Παράλληλα έγινε και μια προσπάθεια διερεύνησης του ακριβούς τρόπου μεταβίβασης του σήματος και της σχέσης μεταξύ των παραπάνω μορίων. Μάλιστα τα σηματοδοτικά μόρια που συμμετέχουν στα παραπάνω μονοπάτια που επάγονται είτε από τη γλυκόζη είτε από την ινσουλίνη πιθανότατα να αποτελέσουν μελλοντικούς στόχους για τη θεραπεία της αθηρωμάτωσης. Στα πλαίσια της μελέτης του ρόλου του οξειδωτικού stress στη διαδικασία σηματοδότησης των μονοκυττάρων εξετάστηκε στη συνέχεια η επίδραση οξειδωτικών ουσιών στο σχηματισμό του συμπλόκου του NHE-1 με την Hsp70 και στο βαθμό γλουταθειονυλίωσης της Hsp70. Η προσκόλληση και η μετανάστευση των μονοκυττάρων είναι ιδιότητες των μονοκυττάρων που σχετίζονται με το σχηματισμό της αθηρωματικής πλάκας. Με 78

94 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ δεδομένη την ικανότητα των μονοκυττάρων να παράγουν ROS και να καρβονυλιώνουν τις πρωτεΐνες των βασικών μεμβρανών και σε μια προσπάθεια να διερευνηθεί η βιολογική σημασία της καρβονυλίωσης στην πρόκληση της αθηρωμάτωσης, μελετήθηκε στη συνέχεια η προσκόλληση και μετανάστευση μονοκυττάρων διαμέσου υποστρώματος οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης1 καθώς και οξειδωμένου και μη οξειδωμένου κολλαγόνου IV χρησιμοποιώντας μονοκύτταρα που προέρχονταν από υγιείς δότες και διαβητικούς ασθενείς τύπου ΙΙ. Παράλληλα μελετήθηκε ο ρόλος των ιντεγκρινικών υπομονάδων α2, αl, αμ και β2 στα παραπάνω φαινόμενα προσκόλλησης. Επίσης προσδιορίστηκε η ικανότητα προσκόλλησης μονοκυττάρων υγιών δοτών και διαβητικών ασθενών τύπου ΙΙ σε υπόστρωμα καρβονυλιωμένης λαμινίνης με τη χρήση τριών διαφορετικών μεθόδων. Με δεδομένο τον κεντρικό ρόλο των ιντεγκρινών τόσο στις αλληλεπιδράσεις των κυττάρων με τις βασικές μεμβράνες όσο και σε γεγονότα σηματοδότησης, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα των ιντεγκρινικών υπομονάδων α2, αl, αμ και β2 σε μονοκύτταρα υγιών δοτών και διαβητικών ασθενών τύπου ΙΙ, καθώς και η έκφραση της α2 υπομονάδας της ιντεγκρίνης σε μονοκύτταρα έπειτα από έκθεσή τους σε υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης ή ινσουλίνης. Στα πλαίσια της διερεύνησης της αθηρωμάτωσης, μελετήθηκε στη συνέχεια η προσκόλληση ενδοθηλιακών κυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης-1 καθώς και ο ρόλος της α2 υπομονάδας της ιντεγκρίνης στο παραπάνω φαινόμενο. Ακολούθως, με δεδομένο ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν στην επιφάνειά τους το μόριο προσκόλλησης ICAM-1, προσδιορίστηκε η έκφρασή του σε κύτταρα που προσκολλήθηκαν σε οξειδωμένη και μη οξειδωμένη λαμινίνη-1. Παράλληλα, μιας και το ICAM-1 συμβάλλει στην προσέλκυση των μονοκυττάρων από το ενδοθήλιο, μελετήθηκε στη συνέχεια η προσκόλληση μονοκυττάρων σε υπόστρωμα ενδοθηλιακών κυττάρων που είχαν προηγουμένως προσκολληθεί σε οξειδωμένη ή μη οξειδωμένη λαμινίνη-1. Δεδομένων, τέλος, των αλληλεπιδράσεων μεταξύ του ICAM-1 των ενδοθηλιακών κυττάρων και των ιντεγκρινών αlβ2 και αμβ2 των μονοκυττάρων στα αρχικά στάδια πρόκλησης της αθηρωμάτωσης, μελετήθηκε ο ρόλος των ιντεγκρινικών υπομονάδων αl, αμ και β2 στο παραπάνω φαινόμενο προσκόλλησης. 79

95 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1. ΑΤΟΜΑ ΠΟΥ ΣΥΜΜΕΤΕΙΧΑΝ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ Τα μονοκύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή απομονώθηκαν από ολικό αίμα που προέρχονταν είτε από υγιείς δότες είτε από ασθενείς που έπασχαν από σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ. Η αιμοληψία έγινε κατά τις πρωινές ώρες και πριν από τη λήψη τροφής. Συνολικά στη μελέτη συμμετείχαν 52 υγιείς εθελοντές και 45 ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ που νοσηλεύτηκαν στην Β παθολογική κλινική του Ιπποκράτειου νοσοκομείου Θεσσαλονίκης. Θα πρέπει να αναφερθεί ότι και οι δύο ομάδες ατόμων που μελετήθηκαν είχαν παρόμοια ηλικία ενώ ο δείκτης μάζας σώματός τους ήταν μικρότερος του 25 (βλ. Πίνακας 6). Η διάγνωση της αθηροσκλήρωσης στους διαβητικούς ασθενείς τύπου ΙΙ έγινε με υπέρηχο των αγγείων της καρωτίδας. Παράλληλα, όλοι οι συμμετέχοντες ήταν ενήμεροι για το σκοπό της εργασίας, ενώ η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές της Διακήρυξης του Ελσίνκι, όπως αναθεωρήθηκαν το Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ατόμων που συμμετείχαν στην παρούσα μελέτη αναφέρονται στον ακόλουθο πίνακα (Πίνακας 6). Πίνακας 6. Κλινικά χαρακτηριστικά των υγιών δοτών και των ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ που συμμετείχαν στη μελέτη. Table 6. Clinical parameters of healthy and diabetic participants type II. Δείκτης Ηλικία μάζας (χρόνια) σώματος (BMI) Υγιείς δότες Επίπεδα γλυκόζης (mg/dl) Ποσοστό γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης (%) 64.2±4.25 < ±4 4.87±0.3% 65.1±4 < ±7 8.58±0.7% Παρουσία αθηρωματικών βλαβών - Ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη 17 από τους 45 ασθενείς τύπου ΙΙ 80

96 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΟΛΙΚΟ ΑΙΜΑ Τα μονοκύτταρα απομονώθηκαν από ασκούς αίματος όγκου χρησιμοποιώντας τη μέθοδο των Seager-Danciger και συν. με κάποιες τροποποιήσεις (Seager Danciger και συν., 2004). Η μέση τελική καθαρότητα σε μονοκύτταρα, όπως μετρήθηκε με χρήση κυτταρομετρίας ροής, ήταν 90,6%. Συγκεκριμένα, 30 ml αίματος μεταφέρθηκαν από ασκούς που περιείχαν πλήρες αίμα σε πλαστικούς κωνικούς δοκιμαστικούς σωλήνες περιεκτικότητας 50ml (falcon) και σε καθέναν από αυτούς προστέθηκαν 6 ml ουδέτερου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος 1x (phosphate buffered saline-pbs ph 7.2) που περιείχε 1 mm αιθυλενο-διαμινο-τετραοξικoύ οξύ (EDTA). Στη συνέχεια τοποθετήθηκαν κάτω από το αίμα 10 ml φικόλης (Ficoll-Paque Plus) πυκνότητας 1,077g/ml με τη βοήθεια ειδικής σύριγγας (18 gauge spinal needle) και με ιδιαίτερη προσοχή ώστε να μην αναμιχθεί το αίμα με τη φικόλη. Στη συνέχεια ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 400g για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (χωρίς χρήση του φρένου κατά την επιβράδυνση). Μετά τη φυγοκέντρηση συλλέχτηκε η ενδιάμεση υπόλευκη στιβάδα μεταξύ πλάσματος και φικόλης που περιείχε τα μονοπύρηνα κύτταρα και ακολούθησαν τρεις πλύσεις με PBS 1x (1 mm EDTA, ph 7.2). Τα μονοπύρηνα στη συνέχεια επαναιωρήθηκαν σε 25 ml θρεπτικό υλικό Iscove (IMDM) που περιείχε 10% ορό εμβρύου μόσχου (fetal calf serum-fcs), 1% Hepes (ph 7.4), 1% πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη, και 1% γλουταμίνη. Κατόπιν επιστοιβάχθηκαν σε 25 ml 46% ισο-οσμωτικού διαλύματος περκόλης που είχε προηγουμένως τοποθετηθεί σε πλαστικούς κωνικούς δοκιμαστικούς σωλήνες περιεκτικότητας 50ml (falcon) και περιείχε 23ml ισο-οσμωτικής περκόλης (21.275ml Percoll ml PBS 10x) και 27ml θρεπτικό υλικό IMDM (10% FCS). Ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 550g για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (χωρίς χρήση του φρένου κατά την επιβράδυνση), συλλογή της στοιβάδας των μονοκυττάρων μεταξύ περκόλης και των υπολοίπων λευκοκυττάρων και αναδιάλυσή της σε κρύο PBS 1x (1 mm EDTA, ph 7.2). Στη συνέχεια τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στα 400g στους 4oC για 10 λεπτά, έγινε αναδιάλυση των ιζημάτων σε θρεπτικό υλικό IMDM (10% FCS) και χρήση των μονοκυττάρων ανάλογα με το εκάστοτε πείραμα. Ο αριθμός των μονοκυττάρων υπολογίστηκε με τη χρήση πλάκας αιμοκυττομέτρου (Neubauer) μετά από 1:1 αραίωσή τους με διάλυμα 0.4% trypan blue. Πιο συγκεκριμένα, 10 μl εναιωρήματος μονοκυττάρων αναμείχθηκαν με 10 μl διαλύματος 0.4% trypan blue και ακολούθως παραλήφθηκαν 10 μl από το παραπάνω 81

97 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ μείγμα και τοποθετήθηκαν στην πλάκα αιμοκυττομέτρου. Η παραπάνω χρωστική βάφει τα νεκρά κύτταρα σκούρα μαύρα, ενώ αντίθετα τα ζωντανά κύτταρα λαμπυρίζουν. Για τον προσδιορισμό του αριθμού των κυττάρων ανά ml εναιωρήματος έγινε καταμέτρηση των κυττάρων στα τέσσερα τεταρτημόρια της πλάκας και στη συνέχεια εφαρμόστηκε ο παρακάτω τύπος: μονοκύτταρα/ml εναιωρήματος= [(συνολικός αριθμός μονοκυττάρων/4) x 2] x 104 Κάθε φορά απομονώνονταν 3-4x106 κύτταρα/ml. Το ποσοστό βιωσιμότητας ήταν 98%. Τα δείγματα επεξεργάστηκαν και με κυτταρομετρία ροής (Beckman Coulter Epics, Inc) όπου με τη χρήση του ειδικού μονοκλωνικού αντισώματος για μονοκύτταρα, το CD14, που ήταν συνδεδεμένο με φυκοερυθρίνη (phycoerythrin) επιβεβαιώθηκε ότι σε ποσοστό >85% ο πληθυσμός των κυττάρων που απομονώθηκε αποτελούνταν από μονοκύτταρα. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι όλα τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν είχαν προηγουμένως αποστειρωθεί και όλη η διαδικασία απομόνωσης πραγματοποιήθηκε κάτω από στείρες συνθήκες για να αποφευχθούν τυχόν επιμολύνσεις των κυττάρων. 2.1 Κατάψυξη κυττάρων και φύλαξή τους στο υγρό άζωτο Μετά την απομόνωσή τους, τα μονοκύτταρα που δε χρησιμοποιήθηκαν άμεσα καταψύχθηκαν και φυλάχτηκαν στο υγρό άζωτο (-1960C) για μελλοντική χρήση. Πιο συγκεκριμένα, τα μονοκύτταρα μετά την απομόνωσή τους επαναιωρήθηκαν σε ειδικό διάλυμα που περιείχε θρεπτικό υλικό IMDM, 15% FCS και 10% διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), ώστε η συγκέντρωση των κυττάρων να είναι 106/ml. Στη συνέχεια τα μονοκύτταρα μοιράστηκαν σε δοχεία κρυοκατάψυξης (biofreeze vials) και φυλάχτηκαν για τρεις ώρες στους -70οC σε ειδικό δοχείο στο οποίο η θερμοκρασία μειώνονταν σταδιακά 10C/λεπτό (freezing container Nalgene). Έπειτα τα δοχεία που περιείχαν τα μονοκύτταρα μεταφέρθηκαν στο υγρό άζωτο όπου και φυλάχτηκαν μέχρι τη χρήση τους. 82

98 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.2 Απόψυξη κυττάρων που είχαν φυλαχτεί στο υγρό άζωτο Τα ειδικά δοχεία κρυοκατάψυξης που περιείχαν τα μονοκύτταρα μεταφέρθηκαν με λαβίδα από το υγρό άζωτο σε επωαστήρα με νερό για. ελαφριά ανακίνηση στους 37 οc προκειμένου να ξεπαγώσουν. Στη συνέχεια το εναιώρημα κυττάρων μεταφέρθηκε σε πλαστικούς κωνικούς δοκιμαστικούς σωλήνες περιεκτικότητας 15ml και προστέθηκαν 2-3 ml θρεπτικό υλικό IMDM (10% FCS). Έπειτα τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm για 10 λεπτά, έγινε ρίψη του υπερκείμενου και επαναιώρησή τους τους σε θρεπτικό υλικό. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν 2 ακόμα πλύσεις-φυγοκεντρήσεις στις ίδιες συνθήκες (στις 1500 rpm για 10 λεπτά). Στη συνέχεια τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε θρεπτικό υλικό IMDM (10% FCS) ώστε να είναι 106/ml και ήταν έτοιμα για να χρησιμοποιηθούν. Μετά την απόψυξη των μονοκυττάρων πραγματοποιήθηκε έλεγχος της βιωσιμότητάς τους και διαπιστώθηκε ότι το ποσοστό βιωσιμότητας παρέμεινε 98%. 3. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΟΛΙΚΟ ΑΙΜΑ ΚΑΙ ΕΠΙΣΗΜΑΝΣΗ ΤΟΥΣ ΜΕ 35S-ΜΕΘΕΙΟΝΙΝΗ Στα πλαίσια πειραμάτων μελέτης της προσκόλλησης μονοκυττάρων σε υπόστρωμα λαμινίνης-1 τα μονοκύτταρα επισημάνθηκαν με 35 S-μεθειονίνη και ακολουθήθηκε διαφορετικό πρωτόκολλο απομόνωσής τους σε σχέση με αυτό των Seager-Danciger και συν. που περιγράφηκε αναλυτικά παραπάνω. Πιο συγκεκριμένα, τα μονοκύτταρα ελήφθησαν από το περιφερικό αίμα με απομόνωση από τα λευκά αιμοσφαίρια. Μετά την αιμοληψία, 20 ml ολικού αίματος τοποθετήθηκαν σε πλαστικό κωνικό δοκιμαστικό σωλήνα περιεκτικότητας 50ml (falcon) στο οποίο είχε προστεθεί 1ml διαλύματος 0,2 Μ αιθυλενο-διαμινοτετραοξικoύ οξέος (EDTA) ως αντιπηκτικό. Ακολούθησε ελαφριά ανάδευση και προσθήκη 20 ml θρεπτικού υλικού (RPMI 1640 στο οποίο είχε προστεθεί 1% Lγλουταμίνη, 1% πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη, 1% 1Μ Ν-2-υδροξυ-αιθυλπιπεραζινο Ν -2-αιθανοσουλφονικού οξέος (Hepes) ph 7.4 και 10% ορός εμβρύου μόσχου (FCS). Στη συνέχεια τοποθετήθηκαν 6 ml περκόλης (Percoll) σε δύο πλαστικούς κωνικούς δοκιμαστικούς σωλήνες περιεκτικότητας 50ml και σε καθέναν από αυτούς προστέθηκαν 20 ml από το περιεχόμενο του πρώτου σωλήνα με μεγάλη προσοχή ώστε να μην αναμιχθεί το αίμα με το Percoll. Μετά από 30 λεπτά φυγοκέντρησης στις 1500 στροφές (rpm) (χωρίς χρήση του φρένου κατά την επιβράδυνση), συλλέχτηκε η υπόλευκη στοιβάδα των μονοπύρηνων/λεμφοκυττάρων, που βρισκόταν 83

99 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ μεταξύ του Percoll και του πλάσματος. Τα ερυθροκύτταρα και τα κοκκιοκύτταρα παρέμειναν στο ίζημα. Ακολούθησε μεταφορά της στοιβάδας σε πλαστικούς κωνικούς δοκιμαστικούς σωλήνες περιεκτικότητας 15ml στους οποίους προστέθηκε ίση ποσότητα θρεπτικού υλικού. Στη συνέχεια της πειραματικής διαδικασίας πραγματοποιήθηκαν 3 πλύσεις καθεμιά από τις οποίες περιλάμβανε φυγοκέντρηση στις 1500 στροφές για 10 λεπτά, απομάκρυνση του υπερκείμενου, προσθήκη 5 ml θρεπτικού υλικού και επαναιώρηση των κυττάρων. Μετά τη δεύτερη φυγοκέντρηση όλα τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε ένα σωλήνα, ενώ μετά και την τρίτη πλύση έγινε ανάδευση με παλινδρομικές αναρροφήσεις και αποχύσεις με αυτόματο σιφώνιο για την αποφυγή παρουσίας συσσωματωμάτων. Τελικά τα κύτταρα, στα οποία προστέθηκαν 5 ml θρεπτικού, μεταφέρθηκαν σε φιάλη κυτταρικής καλλιέργειας των 75 εκατοστών όπου προστέθηκαν και άλλα 15 ml θρεπτικού υλικού. Στη συνέχεια ακολούθησε επώαση σε κλίβανο των 370C για μια ώρα με σκοπό να προσκολληθούν τα μονοκύτταρα στην επιφάνεια της φιάλης. Ακολούθησε απομάκρυνση των μη προσκολλημένων και νεκρών κύτταρων και 2 πλύσεις με 10 ml θρεπτικού υλικού. Μετά από την προσθήκη άλλων 10 ml ραδιοσημασμένης με 35 θρεπτικού και 10 μl διαλύματος S μεθειονίνης (2μCi) τα κύτταρα επωάστηκαν στον κλίβανο 0 των 37 C για 24 ώρες (overnight). Την επόμενη ημέρα έγιναν 2 πλύσεις με 5 ml την κάθε φορά θρεπτικού υλικού. Τελικά 5 ml θρεπτικού υλικού προστέθηκαν και στη συνέχεια τα μονοκύτταρα αποκολλήθηκαν από το πλαστικό με τη βοήθεια ενός πλαστικού αποκολλητή (cell scraper). Η αποκόλληση των μονοκυττάρων επιβεβαιώθηκε με παρατήρηση στο ανάστροφο μικροσκόπιο. Ο αριθμός των κυττάρων που απομονώθηκε υπολογίστηκε μετά από μέτρηση σε πλάκα αιμοκυττομέτρου (Neubauer) μετά από 1:1 αραίωσή τους με διάλυμα 0.4% trypan blue. Συνολικά απομονώθηκαν 3-4x106 κύτταρα/ml με ποσοστό βιωσιμότητας 98%. Θα πρέπει να αναφερθεί ότι όλα τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν είχαν προηγουμένως αποστειρωθεί και όλη η διαδικασία απομόνωσης πραγματοποιήθηκε κάτω από στείρες συνθήκες για να αποφευχθούν τυχόν επιμολύνσεις των κυττάρων. 84

100 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 4. ΕΠΑΓΩΓΕΙΣ ΚΑΙ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ Πίνακας 7. Επαγωγείς και αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη. Table 7. Activators and inhibitors used in the study. Όνομα ουσίας Ιδιότητα Τελική (επαγωγέας- συγκέντρωση αναστολέας) (C) Χρόνος Διαλύτης επώασης (min) γλυκόζη επαγωγέας 20mM Η20 30 min ινσουλίνη επαγωγέας 50μU/ml PBS 30 min καριπορίδιο (cariporide) αναστολέας του ανταλλάκτη ιόντων + 20nM + Να /Η, ΝΗΕ-1 diphenyleneidonium αναστολέας της (DPI) NADPH οξειδάσης 1% DMSO 30 min 10μM DMSO 30 min 10μM DMSO 30 min 500nM DMSO 30 min αναστολέας όλων GF109203X των ισομορφών της PKC αναστολέας των Gö6976 κλασσικών ισομορφών της PKC (α, β1, β2) γουορτμαννίνη αναστολέας της (Wortmannin) ΡΙ3Κ 50nM 1% DMSO 30 min αναστολέας του thenoyltrifluoroacetone συμπλέγματος ΙΙ της (TTFA) αναπνευστικής 10μM 95% αιθανόλη 30 min αλυσίδας L-Name phorbol-12-myristate13-acetate (ΡΜΑ) αναστολέας της ΝΟ συνθάσης 100μM DMSO 30 min 10nM DMSO 30 min επαγωγέας όλων των ισομορφών της PKC 85

101 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ οξειδωτικό-ειδικός αναστολέας του αντιμυκίνη Α συμπλέγματος ΙΙΙ της αναπνευστικής 25 μm, Η2Ο 30 min Η2Ο 1h 1mM Η2Ο 2h 2mM, 10mM DMSO 15 h 100μM αλυσίδας οξειδωτικό-ειδικός αναστολέας του ροτενόνη συμπλέγματος Ι της αναπνευστικής 25 μm, 100μM αλυσίδας οξειδωτικόενεργοποιητής της κυτταρικής πυροσταφυλικό οξύ αναπνοής και ενδεικτικό μέσο αύξησης της μεταβολικής παροχής αντιοξειδωτικόρακοσυλλέκτης ελευθέρων ριζών. Δρα ως δότης κυστεΐνης και διατηρεί ή αυξάνει Ν-ακετυλοκυστεϊνη τα ενδοκυτταρικά (NAC) επίπεδα της γλουταθειόνης, ενός πεπτιδίου που προστατεύει τα κύτταρα από τοξίνες, όπως οι ελεύθερες ρίζες 86

102 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 5. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΟΞΥΓΟΝΟΥ (ROS) 5.1 Προσδιορισμός ανιόντων σουπεροξειδίου (Ο2-) με τη χρήση του ανιχνευτή nitroblue tetrazolium Ο προσδιορισμός των ανιόντων σουπεροξειδίου (Ο2-) έγινε αρχικά σε απομονωμένα μονοκύτταρα αίματος φυσιολογικών ατόμων με τη χρήση της μεθόδου των Pipe και συν. (1995) με κάποιες τροποποιήσεις χρησιμοποιώντας την ουσίαανιχνευτή nitroblue tetrazolium (NBT). Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην αντίδραση του NBT με τα Ο2- που παράγονται στο εσωτερικό του κυττάρου και την αναγωγή του σε ένα αδιάλυτο προϊόν με έντονο μπλε χρώμα (blue formazan). Κυτταρικό εναιώρημα που περιείχε 106 κύτταρα/ml σε θρεπτικό υλικό (IMDM, 10% FCS) επωάστηκε με τους αναστολείς ή/και με τους επαγωγείς στους 37οC. Ο ακριβής χρόνος επώασης και οι συγκεντρώσεις των ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν αναφέρονται παραπάνω (βλ. ενότητα 4: ΕΠΑΓΩΓΕΙΣ ΚΑΙ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ). Μετά την επώαση με τους αναστολείς και τους επαγωγείς τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm για 10 λεπτά και προστέθηκαν 200 μl 1mg/ml ΝΒΤ σε κάθε δείγμα. Η ίδια ποσότητα ΝΒΤ τοποθετήθηκε παράλληλα και σε κενό πλαστικό δοκιμαστικό σωλήνα προκειμένου το δείγμα αυτό να χρησιμοποιηθεί ως τυφλό. Ακολούθησε επώαση στους 370C για 2 ώρες και σε απόλυτο σκοτάδι. Στη συνέχεια τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm για 10 min και ακολούθησε πλύση με διάλυμα ΤΒS (TRIS/HCl 0.05 M + 2% NaCl, ph 7.6) προκειμένου να απομακρυνθούν τα υπολείμματα ΝΒΤ από τα κύτταρα. Μετά την απομάκρυνση του υπερκείμενου προστέθηκαν σε κάθε δείγμα 500 μl μεθανόλη 100%, ακολούθησε ελαφριά ανάδευση με πιπέτα και στη συνέχεια επώαση στους 370C για 10 λεπτά. Έπειτα ακολούθησε προσδιορισμός της πρωτεΐνης των δειγμάτων. Μετά την επώαση με τη μεθανόλη 100% τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm για 10 min. Ακολούθησε απομάκρυνση του υπερκείμενου και προσθήκη στο καθένα 500 μl μεθανόλη 50%. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 1500 rpm για 10 min, απομάκρυνση του υπερκείμενου προσεκτικά με πιπέτα και παραμονή των δειγμάτων για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, προκειμένου να στεγνώσουν από τα υπολείμματα της μεθανόλης. Έπειτα ακολούθησε προσθήκη 270 μl 2Μ ΚΟΗ και 345 μl DMSO για τη διαλυτοποίηση των δειγμάτων και στη συνέχεια επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Τέλος μετρήθηκε η οπτική απορρόφηση (OD) της ανηγμένης ουσίας σε φασματοφωτόμετρο (Shimadzu UV-1202, UV-VIS 87

103 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ spectrophotometer) σε μήκος κύματος 620 nm. Τα επίπεδα Ο2- εκφράστηκαν ως OD620 nm /mg πρωτεΐνης. Μέτρηση της συνολικής ποσότητας της πρωτεΐνης Για την μέτρηση της ποσότητας της πρωτεΐνης στα δείγματά μας χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος που πρότειναν οι Sorensen και Brodbeck (Sorensen και Brodbeck, 1986). Αρχικά κατασκευάστηκε πρότυπη καμπύλη της πρωτεΐνης αλβουμίνης (bovine serum albumin, BSA) με βάση τον πίνακα 8: Πίνακας 8. Κατασκευή πρότυπης καμπύλης BSA. Table 8. Calibration curve with the use of BSA. Νο Eppendorf Συγκέντρωση BSA (C) , , mg/ml Στη συνέχεια, έγινε ανάμειξη των αντιδραστηρίων Α και Β (Bicinchoninic acid-bca) (για τη σύσταση των αντιδραστηρίων Α και Β δες Παράρτημα) σε αναλογία 50/1 και 180 μl του μείγματος προστέθηκαν σε κάθε υποδοχή της πλάκας ELISA μαζί με 10 μl από κάθε δείγμα είτε άγνωστο, είτε της παραπάνω πρότυπης καμπύλης. Στο τυφλό αντί για 10 μl δείγματος προστέθηκαν 10 μl μεθανόλη 100%. Στη συνέχεια ακολούθησε επώαση της πλάκας για 30 λεπτά στους 37οC σε απόλυτο σκοτάδι και τέλος η οπτική απορρόφηση μετρήθηκε σε φασματοφωτόμετρο στα 590 nm (Stat-Fax-2100-Awareness-Technology Inc). Με βάση τις τιμές απορρόφησης των πρότυπων δειγμάτων κατασκευάστηκε η πρότυπη καμπύλη y=0.0127x (r2=0.91) από την οποία προσδιορίστηκαν οι συγκεντρώσεις των δειγμάτων. 88

104 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 5.2 Προσδιορισμός ανιόντων σουπεροξειδίου (Ο2-) με τη χρήση της ουσίας διϋδροαιθίδιο (dihydroethidium, DHE) Ο προσδιορισμός των ανιόντων σουπεροξειδίου (Ο2-) σε μονοκύτταρα φυσιολογικών ατόμων και ασθενών που έπασχαν από σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ έγινε με τη χρήση της ουσίας διυδροαιθίδιο (dihydroethidium) (Benov et al, 1998). Το διϋδροαιθίδιο όταν οξειδώνεται από τα Ο2- δίνει το φθορίζων συστατικό αιθίδιο (Munzel και συν., 2002). Συγκεκριμένα, εναιώρημα μονοκυττάρων σε PBS που περιείχε 106 κύτταρα/ml επωάστηκε στους 37οC σε απόλυτο σκοτάδι για 20 λεπτά με 25 μμ διαλύματος διϋδροαιθιδίου. Μετά την επώαση τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm για 10 λεπτά και ακολούθησαν 2 πλύσεις με PBS προκειμένου να απομακρυνθεί η ποσότητα της φθορίζουσας ουσίας που δεν εισήλθε στα κύτταρα. Στη συνέχεια τα κύτταρα αναδιαλύθηκαν σε PBS και τα επίπεδα Ο2- προσδιορίστηκαν σε φθορισμόμετρο PerkinElmer LS55, ως ο λόγος του φθορισμού στο μήκος διέγερσης 392 nm προς το φθορισμό στο μήκος εκπομπής 410 nm της φθορίζουσας ουσίας. 5.3 Προσδιορισμός υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) με τη χρήση της ουσίας DCFH-DA Για τον προσδιορισμό του Η2Ο2 χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των Rosenkranz και συν. (1992) με κάποιες τροποποιήσεις. Η ουσία 2.7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) είναι ένα μη-πολικό μόριο το οποίο μόλις εισέρχεται στο κύτταρο διασπάται από τις εστεράσες και μετατρέπεται στο μη-φθορίζων παράγωγο DCFH. Το DCFH που είναι ένα μεμβρανικά μη διαπερατό μόριο, οξειδώνεται υπό την επίδραση των υπεροξειδασών που βρίσκονται στο κύτταρο, δίνοντας το τελικό φθορίζων προϊόν 2,7-dichlorofluorescein/DCF (Bass και συν., 1983; Szeida και συν., 1984). Σύμφωνα με τη μέθοδο, εναιώρημα μονοκυττάρων σε PBS που περιείχε 106 κύτταρα/ml επωάστηκε με διάλυμα 5 μg/ml DCFH-DA σε αιθανόλη στους 370C και σε απόλυτο σκοτάδι για 20 λεπτά. Στη συνέχεια τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm για 10 min και ακολούθησαν 2 ακόμα πλύσεις-φυγοκεντρήσεις στις ίδιες συνθήκες. Έπειτα τα κύτταρα προστέθηκαν σε πλαστικούς κωνικούς δοκιμαστικούς σωλήνες και επωάστηκαν με τους διάφορους αναστολείς και ενεργοποιητές στους 37οC. Ο χρόνος επώασης και οι συγκεντρώσεις των ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν 89

105 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ αναφέρονται παραπάνω (βλ. ενότητα 4: ΕΠΑΓΩΓΕΙΣ ΚΑΙ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ). Μετά τη επώαση τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και επαναδιαλύθηκαν σε 3 ml PBS. Τα επίπεδα Η2Ο2 προσδιορίστηκαν σε φθορισμόμετρο Perkin Elmer LS 50B, ως ο λόγος του φθορισμού στο μήκος διέγερσης 495 nm προς το φθορισμό στο μήκος εκπομπής 525 nm της φθορίζουσας ουσίας. 5.4 Προσδιορισμός υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) με τη χρήση της ουσίας dihydrorhodamine 123 (DHR) Ο προσδιορισμός του Η2Ο2 σε μονοκύτταρα υγιών δοτών και ασθενών που έπασχαν από σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ έγινε επίσης και με τη χρήση της ουσίας dihydrorhodamine 123 (DHR). Πρόκειται για ένα μη φθορίζον μόριο που έπειτα από οξείδωσή του παράγεται η ροδαμίνη 123, ένας φθορίζων, κατιονικός και λιπόφιλος ανιχνευτής (Kooy και συν., 1994). Ο λιπόφιλος χαρακτήρας της ροδαμίνης 123 διευκολύνει τη διάχυσή της μεταξύ των κυτταρικών μεμβρανών. Παράλληλα, έπειτα από οξείδωση της DHR σε ροδαμίνη 123 μία από τις δύο ισοδύναμες αμινομάδες της ταυτομερίζεται σε ιμινομάδα (imino), η οποία παγιδεύει τη ροδαμίνη 123 εντός του κυττάρου (Crow και συν., 1997). Σύμφωνα με τη μέθοδο, εναιώρημα μονοκυττάρων σε PBS που περιείχε 106 κύτταρα/ml επωάστηκε στους 37οC και σε απόλυτο σκοτάδι για 20 λεπτά με 500 nm dihydrorhodamine 123. Στη συνέχεια τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm για 10 λεπτά και ακολούθησαν 2 πλύσεις με PBS προκειμένου να απομακρυνθεί η ποσότητα της φθορίζουσας ουσίας που δεν εισήλθε στα κύτταρα. Έπειτα τα κύτταρα αναδιαλύθηκαν σε PBS και τα επίπεδα Η2Ο2 προσδιορίστηκαν με χρήση φθορισμόμετρου PerkinElmer LS55, ως ο λόγος του φθορισμού στο μήκος διέγερσης 500 nm προς το φθορισμό στο μήκος εκπομπής 525 nm της φθορίζουσας ουσίας. 90

106 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 6. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 ΚΑΙ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ IV ΑΠΟ ΣΑΡΚΩΜΑ Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 6.1 Απομόνωση λαμινίνης-1 Η λαμινίνη-1 απομονώθηκε από σάρκωμα Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) που φυλάχθηκε στους -80 οc σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 3.4 Μ NaCl, 50 mm Tris και 1 mm EDTA, ενώ μετά τη ρύθμιση του ph στο 7.4 με HCl προσθέτονταν 50 μg/ml PMSF, και 50 μg/ml PHMB που είναι αναστολείς των πρωτεασών σερίνης (Buffer A). Για κάθε απομόνωση απαιτήθηκαν περίπου 200 γραμμάρια σαρκώματος. Ο όγκος ξεπάγωσε αργά σε πάγο για 15 ώρες (overnight) και κατόπιν ζυγίστηκε. 50 γραμμάρια όγκου ομογενοποιήθηκαν με 100 ml φρέσκου Buffer A. Στη συνέχεια ο ομογενοποιημένος όγκος φυγοκεντρήθηκε στις 3750 rpm στους 4 οc για 30 λεπτά και ακολούθησε αναδιάλυση του ιζήματος σε 100 ml Buffer A. Το παραπάνω βήμα επαναλήφθηκε συνολικά πέντε φορές με αποτέλεσμα το τελικό ίζημα να έχει άσπρο χρώμα. Ακολούθησε αναδιάλυση του ιζήματος σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 1.7 Μ NaCl, 50 mm Tris και 1 mm EDTA, ενώ μετά τη ρύθμιση του ph του διαλύματος στο 7.4 με HCl προστέθηκαν 50 μg/ml PMSF και 50 μg/ml PHMB (Buffer Β) με ανάδευση για 6-12 ώρες στους 4 οc. Την επόμενη μέρα το υλικό φυγοκεντρήθηκε στις 3750 rpm για 30 λεπτά στους 4 οc, το υπερκείμενο φυλάχθηκε σε πάγο, το ίζημα αναδιαλύθηκε σε Buffer Β και αναδεύτηκε εκ νέου στους 4 οc για 6-12 ώρες. Έπειτα το υλικό φυγοκεντρήθηκε στις 3750 rpm στους 4 οc για 30 λεπτά και το υπερκείμενο που περιείχε ακατέργαστη λαμινίνη, εντακτίνη και πρωτεογλυκάνες φυλάχθηκε σε πάγο και ενώθηκε με το αντίστοιχο που απομονώθηκε την προηγούμενη μέρα. Το ίζημα το οποίο περιείχε κολλαγόνο IV, εντακτίνη και περλεκάνη-θειική ηπαράνη (PHS) φυλάχθηκε στους -20 οc. Στη συνέχεια έγινε διαπίδυση του υπερκείμενου που περιείχε τη λαμινίνη με Buffer A στους 4 οc. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 3750 rpm στους 4 οc για 30 λεπτά. Το ίζημα αναδιαλύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 2 Μ ουρία, 50 mm Tris και 1 mm EDTA, ενώ μετά τη ρύθμιση του ph του διαλύματος στο 8.6 με HCl προστέθηκαν 50 μg/ml PMSF και 50 μg/ml PHMB (Buffer C) και αναδεύονταν αργά για 6-12 ώρες στους 4 οc. Στη συνέχεια το ίζημα προστέθηκε σε στήλη DEAE κυτταρίνης και αναδεύτηκε γρήγορα στους 4 οc για 8-12 ώρες. H DEAE κυτταρίνη είναι μια θετικά φορτισμένη ρητίνη που χρησιμοποιείται στη χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων και συμβάλει στον καθαρισμό και διαχωρισμό των πρωτεϊνών. Αποτέλεσμα της θετικής φόρτισής της είναι να δεσμεύει αρνητικά φορτισμένες 91

107 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ πρωτεΐνες και να τις διαχωρίζει από όλες τις υπόλοιπες που συμπεριλαμβάνονται στο δείγμα. Την επόμενη μέρα το δείγμα φυγοκεντρήθηκε στις 1000 rpm για 10 λεπτά και φυλάχτηκε το υπερκείμενο το οποίο περιείχε την θετικά φορτισμένη λαμινίνη. Στη συνέχεια το δείγμα συμπυκνώθηκε και ρυθμίστηκε η συγκέντρωσή του στα 100 γραμμάρια όγκου/50 ml διαλύματος με την προσθήκη aquacide. Πιο συγκεκριμένα, το aquacide τοποθετήθηκε υπό μορφή σκόνης πάνω από μεμβράνη που περιείχε το δείγμα μας για δύο μέρες. Ακολούθησε διαπίδυση με ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 500 mm NaCl, και 50 mm Tris, ενώ μετά τη ρύθμιση του ph του διαλύματος στο 7.4 με HCl προστέθηκαν 50 μg/ml PMSF (Buffer D) στους 4 οc και ανά 6-12 ώρες γίνονταν αλλαγή του buffer (συνολικά έγιναν τέσσερις αλλαγές). Στη συνέχεια έγινε φυγοκέντρηση στις rpm στους 4 οc για 30 λεπτά προκειμένου να απομακρυνθούν τυχόν συσσωματώματα και το υπερκείμενο περιείχε την καθαρή λαμινίνη. Πριν τη χρήση έγινε διαπίδυση με PBS και προσδιορισμός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης του δείγματος με τη μέθοδο Bradford. Παράλληλα, προκειμένου να προσδιοριστεί η καθαρότητα του δείγματος λαμινίνης έγινε ηλεκτροφόρηση αυτού του δείγματος σε συσκευή Pharmacia LKB-Phastsystem. Σε περίπτωση χρησιμοποίησης της λαμινίνης σε πειράματα μελέτης διεργασιών προσκόλλησης πριν από τη διαπίδυση με PBS έγινε διαπίδυση στους 4 οc με ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 50 mm Tris, ενώ μετά τη ρύθμιση του ph στο 7.4 με HCl προστέθηκαν 50 μg/ml PMSF (Buffer F) (συνολικά έγιναν δύο αλλαγές). Στη συνέχεια ακολούθησε διαπίδυση στους 4 οc με ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 1 Μ CaCl2 και 50 mm Tris, ενώ μετά τη ρύθμιση του ph του διαλύματος στο 7.4 με HCl προστέθηκαν 50 μg/ml PMSF (Buffer G) (συνολικά έγινε μία αλλαγή), και τέλος διαπίδυση στους 4 οc με Buffer F. Ο λόγος που έγιναν οι παραπάνω διαπιδύσεις ήταν για να γίνει ανάκτηση ασβεστίου από τη λαμινίνη, καθώς το είχε δεσμεύσει το EDTA, και να μπορεί έτσι να προσκολλάται στις εκάστοτε επιφάνειες. Η λαμινίνη φυλάχτηκε στους -80 οc, ενώ πριν τη χρήση της αφήνονταν να ξεπαγώσει αργά σε πάγο. Μέτρηση της συνολικής ποσότητας της πρωτεΐνης με τη χρήση Coomasie Plus-200 (Bradford method) Για τη μέτρηση της συγκέντρωσης της λαμινίνης χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Bradford με τη χρήση του αντιδραστηρίου Coomasie Plus-200. Πιο συγκεκριμένα κατασκευάστηκε πρότυπη καμπύλη με δείγματα γνωστής συγκέντρωσης αλβουμίνης: 92

108 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1000 μg/ml, 500 μg/ml, 250 μg/ml, 125 μg/ml, 62.5 μg/ml, 30 μg/ml και 0 μg/ml, ενώ το δείγμα λαμινίνης αραιώθηκε 1/10, 1/30 και 1/50 με PBS. Στη συνέχεια σε κάθε υποδοχή πλάκας ELISA προστέθηκαν 25 μl από καθένα από τα παραπάνω διαλύματα (πρότυπα διαλύματα BSA και αραιώσεις λαμινίνης) μαζί με 250 μl Coomasie Plus200 και ακολούθησε ελαφριά ανάδευση για 2 λεπτά σε αναδευτήρα. Μετά τον προσδιορισμό της οπτικής απορρόφησης σε φασματοφωτόμετρο (Stat-Fax-2100Awareness-Technology Inc) στα 592 nm και με βάση την πρότυπη καμπύλη προσδιορίστηκε η συγκέντρωση της λαμινίνης. Προσδιορισμός της καθαρότητας της λαμινίνης με ηλεκτροφόρηση Για τον προσδιορισμό της καθαρότητας της λαμινίνης που απομονώθηκε χρησιμοποιήθηκε η ηλεκτροφόρηση σε συσκευή Pharmacia LKB-Phastsystem. Για την προετοιμασία των δειγμάτων ακολουθήθηκε η παρακάτω διαδικασία. Σε 950 μl διαλύματος που περιείχε 3% SDS, 0,08M Tris-HCl ph 6.8, 15% γλυκερόλη και 0,01% της χρωστικής μπλε της βρωμοφαινόλης (loading buffer 1X) προστέθηκαν 50 μl μερκαπτοαιθανόλης. Στη συνέχεια, 5 μl από το παραπάνω μείγμα προστέθηκαν σε 5 μl από τα αραιωμένα δείγματα λαμινίνης (1,1/2, 1/5, 1/10) και επωάστηκαν για 3 λεπτά στους 100 0C προκειμένου να σπάσουν οι δισουλφιδικοί δεσμοί. Στη συνέχεια σε ειδική πλάκα που περιείχε τις υποδοχές των δειγμάτων (sample well stamp) τοποθετήθηκε ειδική μεμβράνη (parafilm) και κατόπιν 4-5 μl από το κάθε δείγμα. Έπειτα προστέθηκαν 50 μl Η2Ο στην κεφαλή (bed) της συσκευής ηλεκτροφόρησης (Pharmacia LKB-Phastsystem), μετά το gel με προσοχή και κατόπιν τα ηλεκτρόδια στις ειδικές υποδοχές που είχαν προηγουμένως τοποθετηθεί πάνω από το gel. Τέλος προστέθηκε στη συσκευή το ειδικό χτενάκι ηλεκτροφόρησης που είχαμε προηγουμένως ακουμπήσει στην πλάκα που είχαν τοποθετηθεί τα δείγματα και κατόπιν ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων χρησιμοποιώντας ειδικό πρόγραμμα για το διαχωρισμό των πρωτεϊνών στα 400 V- 4 ma-1.6 W για λεπτά στους 180C. Θα πρέπει να αναφερθεί πως η ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε και στην περίπτωση που προσδιορίστηκε η καθαρότητα δειγμάτων που περιείχαν κολλαγόνο IV. 93

109 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Εμφάνιση film με τη χρήση της χρώσης Silver (Silver Staining) Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης ακολούθησε χρώση Silver (Silver Staining). Αρχικά το gel επωάστηκε με ανάδευση με διάλυμα που περιείχε 11.4 ml H2O, 15 ml μεθανόλη και 3.6 ml οξικό οξύ (fixative solution) για 10 λεπτά. Ακολούθησαν 2 πλύσεις με H2O για 5 min και στη συνέχεια το gel επωάστηκε με 0.02% θειοθειικό νάτριο (thiosulfate sodium) για ένα λεπτό. Μετά από μια πλύση με H2O για περίπου 20 δευτερόλεπτα το gel επωάστηκε με ανάδευση με 0.2% διαλύματος νιτρικού αργύρου (AgNO3) για 10 λεπτά. Ακολούθησε μία πλύση με H2O και στη συνέχεια επώαση με διάλυμα που περιείχε 0.75 gr Να2CΟ3, 25 ml H2O, 20 μl 0.02% διαλύματος θειοθειικού νατρίου και 12.5 μl φορμαλίνης (developer solution) μέχρι να εμφανιστούν οι ταινίες του gel. Έπειτα το παραπάνω διάλυμα απομακρύνθηκε και ακολούθησε επώαση αρχικά με 10% οξικό οξύ για 10 λεπτά και στη συνέχεια με 75% διαλύματος γλυκερόλης για 10 λεπτά. 6.2 Απομόνωση κολλαγόνου IV Το κολλαγόνο IV απομονώθηκε από σάρκωμα Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Στα πρώτα στάδια απομόνωσης της λαμινίνης-1 φυλάχτηκε το ίζημα που περιλάμβανε κολλαγόνο IV, εντακτίνη και περλεκάνη-θειική ηπαράνη (PHS) στους 20οC (βλ. ενότητα 5.1: Απομόνωση λαμινίνης). Το ίζημα αυτό αναδιαλύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 2 Μ διαλύματος γουανιδίνης HCl, 50 mm Tris και 1 mm EDTA, ενώ μετά τη ρύθμιση του ph του διαλύματος στο 7.4 με HCl προστέθηκαν 50 μg/ml PMSF και 50 μg/ml PHMB (Buffer Η) και ακολούθησε ανάδευση στους 4 οc για 8-12 ώρες. Η αναλογία διαλύματος/όγκο ήταν 1 ml/γραμμάριο όγκου. Την επόμενη μέρα το ίζημα φυγοκεντρήθηκε στις 3750 rpm στους 4 οc για 30 λεπτά, απομακρύνθηκε το υπερκείμενο, το οποίο περιείχε εντακτίνη και PHS και το οποίο φυλάχθηκε στους -80 οc για μελλοντική απομόνωση των παραπάνω πρωτεϊνών. Το παραπάνω βήμα επαναλήφθηκε πετώντας αυτή τη φορά το υπερκείμενο. Στη συνέχεια το ίζημα αναδιαλύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 2Μ διαλύματος γουανιδίνης HCl, 50 mm Tris, 2 mm DTT και 1 mm EDTA, ενώ μετά τη ρύθμιση του ph του διαλύματος στο 7.4 με HCl προστέθηκαν 50 μg/ml PMSF και 50 μg/ml PHMB και αναδεύτηκαν στους 4 οc για 8-12 ώρες (Buffer J). Την επόμενη μέρα το ίζημα φυγοκεντρήθηκε στις 3750 rpm στους 4 οc για 30 λεπτά και το υπερκείμενο φυλάχτηκε καθώς περιείχε το ακατέργαστο κολλαγόνο IV. Το παραπάνω βήμα επαναλήφθηκε για ακόμη μια φορά. Στη συνέχεια έγινε 94

110 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ διαπίδυση στους 4 οc με ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 1.7 Μ NaCl, 50 mm Tris, 2 mm DTT και 1 mm EDTA, ενώ μετά τη ρύθμιση του phτου διαλύματος στο 7.4 με HCl προστέθηκαν 50 μg/ml PMSF και 50 μg/ml PHMB (Buffer K). Ανά 6-12 ώρες γίνονταν αλλαγή του buffer (συνολικά γίνονταν τέσσερις αλλαγές), ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 3750 rpm στους 4 οc για 60 λεπτά και ρίψη του υπερκείμενου. Στη συνέχεια έγινε αναδιάλυση του ιζήματος σε Buffer J (η αναλογία ήταν 1 ml buffer/γραμμάριο όγκου), και ανάδευση για δύο μέρες στους 4 οc. Ακολούθησε διαπίδυση του αναδιαλυμένου ιζήματος στους 4 οc με ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 4 Μ ουρία, 250 mm NaCl, 50 mm Tris και 1 mm EDTA, ενώ μετά τη ρύθμιση του ph του διαλύματος στο 8.6 με HCl προστέθηκαν 50 μg/ml PMSF και 50 μg/ml PHMB (Buffer L) (συνολικά έγιναν τέσσερις αλλαγές). Το ακατέργαστο κολλαγόνο IV κατόπιν προστέθηκε σε στήλη DEAE κυτταρίνης και αναδεύτηκε στους 4 οc για 8-12 ώρες προκειμένου να συνδεθούν οι αρνητικά φορτισμένες πρωτεΐνες στη θετικά φορτισμένη DEAE. Στη συνέχεια το δείγμα φυγοκεντρήθηκε στις 1000 rpm στους 4 οc για 10 λεπτά, φυλάχτηκε το υπερκείμενο με το θετικά φορτισμένο κολλαγόνο IV και ακολούθησε διαπίδυσή του στους 4 οc με Buffer J. Έπειτα το υπερκείμενο φυγοκεντρήθηκε στις rpm για 180 λεπτά προκειμένου να καθαριστεί το κολλαγόνο IV από τα διάφορα συσσωματώματα ( 50S). Πριν τη χρήση έγινε διαπίδυση με PBS και προσδιορισμός της συγκέντρωσης του δείγματος. Παράλληλα, έγινε ηλεκτροφόρηση του δείγματος κολλαγόνου IV προκειμένου να προσδιοριστεί η καθαρότητά του με τον ίδιο τρόπο που γίνονταν και για τη λαμινίνη (phast electrophoresis) (βλ. ενότητα 5.1: ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1, ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΚΑΘΑΡΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ). Το κολλαγόνο IV φυλάχτηκε στους -20 οc, ενώ πριν τη χρήση του αφήνονταν να ξεπαγώσει αργά σε πάγο. Μέτρηση της συνολικής ποσότητας του κολλαγόνου IV Η μέτρηση της συγκέντρωσης του κολλαγόνου IV έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφηκε από τον Waddell (1956). Το άγνωστης συγκέντρωσης δείγμα κολλαγόνου αραιώθηκε 1/20 σε Η2Ο και μετρήθηκε η οπτική απορρόφησή (OD) του στα 215 nm και στα 225 nm σε φασματοφωτόμετρο (Shimadzu UV-1202, UV-VIS spectrophotometer). Για τυφλό χρησιμοποιήθηκε δείγμα που περιείχε μόνο Η2Ο. Η συγκέντρωση του κολλαγόνου υπολογίστηκε από τον τύπο (OD215- OD225)x 95

111 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2880=μg/ml, όπου το 2880 είναι ο συντελεστής μοριακής απορροφητικότητας του κολλαγόνου IV. 7. ΚΑΡΒΟΝΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 ΑΠΟ ΤΑ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΜΕ ΑΝΟΣΟΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΧΡΗΣΗ ΑΝΤΙΔΙΝΙΤΡΟΦΑΙΝΥΛ-ΥΔΡΑΖΙΝΗΣ 7.1 Προετοιμασία δειγμάτων 10 μl εναιωρήματος μονοκυττάρων σε θρεπτικό υλικό (IMDM, 10% FCS) που περιείχε μονοκύτταρα επωάστηκαν με 11 μl 90.9 μg/ml διαλύματος λαμινίνης1 παρουσία μιας σειράς επαγωγέων και αναστολέων στους 37οC. Ο χρόνος επώασης και οι συγκεντρώσεις των ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν αναφέρονται παραπάνω (βλ. ενότητα 4: ΕΠΑΓΩΓΕΙΣ ΚΑΙ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ). Μετά την επώαση τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν για 2 λεπτά στις rpm και συλλέχτηκε το υπερκείμενο που περιείχε την οξειδωμένη λαμινίνη-1. Στη συνέχεια, σε 5 μl υπερκείμενου προστέθηκαν 5 μl 12% SDS και 10 μl 20 mm DNPH σε 10% τριφλουοροοξικό οξύ (TFA). Μετά από ανάδευση τα δείγματα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά και έπειτα στο καθένα από αυτά προστέθηκαν 5 μl διαλύματος 2 Μ Tris και 1% γλυκερόλη. 7.2 Ανοσοανίχνευση για την καρβονυλίωση της λαμινίνης-1 από τα μονοκύτταρα Μετά την προετοιμασία των δειγμάτων ακολούθησε η διαδικασία της ανοσοανίχνευσης. Σύμφωνα με τη μέθοδο, μεμβράνη νιτροκυτταρίνης κόπηκε σε κατάλληλο σχήμα και σχεδιάστηκαν στη συνέχεια πάνω της με μολύβι τόσοι κύκλοι όσος και ο αριθμός των δειγμάτων που επρόκειτο να χρησιμοποιηθούν. Μετά την τοποθέτηση των δειγμάτων στη μεμβράνη, ακολούθησε επώασή της σε 25 ml ρυθμιστικού διαλύματος (blocking buffer), που περιείχε Tris (TBS) (ph 7.6), 0.1% Tween-20 και 5% άπαχο γάλα σε σκόνη, για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθησαν 3 πλύσεις με 15 ml διαλύματος Tris (0.1% Tween-20) διάρκειας 10 λεπτών η καθεμιά και στη συνέχεια η μεμβράνη επωάστηκε με 20 ml του παραπάνω διαλύματος (blocking buffer) που περιείχε 7.5 μl αντισώματος που δεσμεύτηκε στη 2, 4 δινιτροφαινυλ-υδραζίνη (anti-rabbit DNPΗ) καθώς και 40 μl 50% Tween 20, στους 37 οc για 1 ώρα. Μετά από 5 πλύσεις με PBS (0,1% Tween 20) ακολούθησε επώαση με διάλυμα blocking που περιείχε 7.5 μl αντισώματος anti-rabbit IgG 96

112 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ συνδεδεμένου με υπεροξειδάση (HRP) που δεσμεύτηκε στο anti-dnpη καθώς και 40 μl 50% Tween 20, στους 37 οc στους 40 C για 1 ώρα. Το επόμενο στάδιο της πειραματικής διαδικασίας περιλάμβανε την ανίχνευση σήματος από την αντίδραση της υπεροξειδάσης, με τη μέθοδο της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL). Συγκεκριμένα η μεμβράνη επωάστηκε με το διάλυμα λουμινόλης (LumiGLO) και υπεροξειδίου του υδρογόνου (peroxide) σύμφωνα με τις οδηγίες του πακέτου (Aplichem). Πιο συγκεκριμένα, η μεμβράνη επωάστηκε για ένα λεπτό και κατόπιν απομακρύνθηκε η περίσσεια του παραπάνω διαλύματος. Στη συνέχεια η μεμβράνη τοποθετήθηκε σε διαφανές αδιάβροχο πλαστικό φύλλο (Saran Wrap). Τελικά, ανιχνεύτηκε η εκπομπή φωτός από την αντίδραση με έκθεση της μεμβράνης σε φωτογραφικό φιλμ για περίπου 10 sec. Μετά την εμφάνιση του φιλμ παρατήθηκε η φωτογραφική αποτύπωση στα δείγματα όπου ανιχνεύτηκε οξειδωμένη λαμινίνη. Προκειμένου να επιβεβαιωθεί η ικανότητα των μονοκυττάρων να καρβονυλιώνουν τη λαμινίνη, σε ορισμένες περιπτώσεις πραγματοποιήθηκε και ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου με SDS (SDS-PAGE) σύμφωνα με το σύστημα ρυθμιστικών διαλυμάτων κατά Laemmli (Laemmli και συν., 1979) όπως αναλυτικά περιγράφεται παρακάτω (βλ. ενότητα 13.4: Ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων). 8. ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΚΑΡΒΟΝΥΛΙΩΣΗΣ ΤΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 ΚΑΙ ΤΟΥ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ IV ΑΠΟ ΤΑ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥ 8.1 Προετοιμασία δειγμάτων 10 μl εναιωρήματος μονοκυττάρων σε θρεπτικό υλικό (IMDM, 10% FCS) που περιείχε μονοκύτταρα επωάστηκαν με 11 μl 90.9 μg/ml διαλύματος λαμινίνης1 ή κολλαγόνου IV στους 370C για 10 λεπτά. Τα μονοκύτταρα προήλθαν από υγιείς δότες ή από ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ. Μετά την επώαση τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις rpm για 2 λεπτά, το υπερκείμενο που περιείχε την οξειδωμένη λαμινίνη-1 ή το οξειδωμένο κολλαγόνο IV συλλέχτηκε και αναδιαλύθηκε με PBS ώστε η τελική της συγκέντρωσή της πρωτεΐνης στο δείγμα να ήταν 1 μg/200 μl. 97

113 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 8.2 Παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων αλβουμίνης (BSA) και κατασκευή πρότυπης καμπύλης Προκειμένου να προσδιοριστεί ποσοτικά ο βαθμός καρβονυλίωσης της λαμινίνης και του κολλαγόνου IV από τα μονοκύτταρα παρασκευάστηκαν αρχικά πρότυπα διαλύματα οξειδωμένης και ανηγμένης αλβουμίνης (BSA) και κατασκευάστηκε πρότυπη καμπύλη. Διαδικασία οξείδωσης της BSA Για την οξείδωση της BSA 110 mg BSA διαλύθηκαν σε 2 ml PBS (ph 7.4). Στη συνέχεια το παραπάνω διάλυμα επωάστηκε με 20 μl 100 mm EDTA, 57 μl 833 mm διαλύματος ασκορβικού οξέος και 2 μl 100 mm διαλύματος θειικού αμμωνίου με δισθενή σίδηρο (ferrous ammonium sulfate) στους 37οC για 1 ώρα. Ακολούθησε διαπίδυση με PBS στους 4 οc με δύο αλλαγές του διαλύματος. Η συγκέντρωση προσδιορίστηκε φωτομετρικά (βλ. ενότητα 5: Μέτρηση της συνολικής ποσότητας της πρωτεΐνης με τη χρήση Coomasie Plus-200) και ακολούθησε φύλαξη της οξειδωμένης BSA στους -80 οc. Διαδικασία αναγωγής της BSA Για την αναγωγή της BSA 1 g BSA διαλύθηκε σε 100 ml PBS (ph 7.4). Tο παραπάνω διάλυμα επωάστηκε στη συνέχεια με 0.15 γραμμάρια βαναδικού νατρίου (NaBH4) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και έπειτα ρυθμίστηκε το ph του στην τιμή 7 με υδατικό διάλυμα HCl. Ακολούθησε διαπίδυση με PBS στους 4 οc με δύο αλλαγές του διαλύματος. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε (βλ. ενότητα 5: Μέτρηση της συνολικής ποσότητας της πρωτεΐνης με τη χρήση Coomasie Plus-200) και ακολούθησε φύλαξη της ανηγμένης BSA στους -80 οc. Παρασκευή πρότυπων δειγμάτων BSA Για την παρασκευή των πρότυπων δειγμάτων, η συγκέντρωση τόσο της οξειδωμένης όσο και της ανηγμένης αλβουμίνης ρυθμίστηκε στα 4 mg/ml. Στη συνέχεια παρασκευάστηκαν δείγματα που περιείχαν διαφορετικά ποσοστά οξειδωμένης BSA (βλ. Πίνακα 9) 98

114 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πίνακας 9. Παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων αλβουμίνης (BSA) που περιείχαν διαφορετικό ποσοστό οξειδωμένης και ανηγμένης BSA. Table 9. Preparation of BSA solutions that contained different proportional of oxidized and reduced BSA. Ποσοστό οξείδωσης 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 100% 0 μl 10 μl 20 μl 30 μl 40 μl 50 μl 60 μl 70 μl 100μl 100μl 90 μl 80 μl 70 μl 60 μl 50 μl 40 μl 30 μl BSA Ποσότητα οξειδωμένης BSA Ποσότητα rανηγμένης 0 μl BSA Τα παραπάνω δείγματα στη συνέχεια αραιώθηκαν με PBS ώστε η τελική τους συγκέντρωση να ήταν 1μg/200 μl. 8.3 Ποσοτική εκτίμηση του βαθμού καρβονυλίωσης της λαμινίνης-1 και του κολλαγόνου IV Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της καρβονυλίωσης της λαμινίνης από τα μονοκύτταρα χρησιμοποιήθηκε μέθοδος που εφαρμόστηκε για πρώτη φορά στο εργαστήριό μας (Alamdari και συν., 2005) και είναι τροποποίηση μιας προηγούμενης μεθόδου (Buss και συν., 1997). Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στη χρήση της 2, 4 δινιτροφαινυλ-υδραζίνης (DNPH) μιας ουσίας που συνδέεται σε καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες. Σύμφωνα με τη διαδικασία, 200 μl που περιείχαν 1 μg των δειγμάτων (είτε της πρότυπης καμπύλης είτε της οξειδωμένης λαμινίνης και κολλαγόνου IV) τοποθετήθηκαν σε πινάκια πολυεστερενίου 96 υποδοχών (πλάκα ELISA) και επωάστηκαν στους 4 οc για ώρες. Την επόμενη μέρα έγιναν 2 πλύσεις με PBS και επώαση με 0.05 mm DNPH (ph 6.3) σε θερμοκρασία δωματίου σε απόλυτο σκοτάδι για 45 λεπτά. Μετά από 5 πλύσεις με διάλυμα αιθανόλης (80%)-PBS (20%) και 1 πλύση με PBS ακολούθησε επώαση με διάλυμα που περιείχε 4% άπαχο γάλα σε PBS και δέσμευε τις μη ειδικές θέσεις σύνδεσης (blocking buffer), σε θερμοκρασία δωματίου για 1,5 ώρα. Στη συνέχεια έγιναν 5 πλύσεις με PBS (0,1% Tween 20) και κατόπιν επώαση με 20 ml του παραπάνω διαλύματος (blocking buffer) 99

115 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ που περιείχε 7.5 μl αντισώματος που δεσμεύονταν στη 2, 4 δινιτροφαινυλ-υδραζίνη (anti-dnpη) καθώς και 40 μl 50% Tween 20, στους 37 οc για 1 ώρα. Μετά από 5 πλύσεις με PBS (0,1% Tween 20) ακολούθησε επώαση με διάλυμα blocking που περιείχε 7.5 μl αντισώματος anti-rabbit IgG συνδεδεμένου με υπεροξειδάση που δεσμεύονταν στο anti-dnpη καθώς και 40 μl 50% Tween 20, στους 37 οc για 1 ώρα. Έπειτα από 5 πλύσεις με PBS (0,1% Tween 20) προστέθηκε διάλυμα που περιείχε τα συγκεκριμένα υποστρώματα για να δράσει η υπεροξειδάση (substrate buffer) και ακολούθησε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 4-7 λεπτά. Το παραπάνω διάλυμα περιείχε μια ταμπλέτα 3,3,5,5 -διυδροχλωρικής τετραμεθυλβενζιδίνης (3,3,5,5 TetraMethylBenzidine dihydrochloride, TMB) καθώς και 1.455g Na2HPO g κιτρικού οξέος και 40 μl 30% H2O2 σε τελικό όγκο 200ml. Στη συνέχεια προστέθηκε 2 Ν HCl προκειμένου να σταματήσει η παραπάνω αντίδραση και η οπτική απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm με τη χρήση φασματοφωτόμετρου (Stat-Fax2100-Awareness-Technology Inc). 8.4 Φασματομετρική μέθοδος για τον προσδιορισμό καρβονυλικών ομάδων (Colorimetric carbonyl assay) Ο ποσοτικός προσδιορισμός καρβονυλικών ομάδων σε πρότυπα δείγματα οξειδωμένης και ανηγμένης αλβουμίνης (oxbsa και rbsa) έγινε σύμφωνα με τις μεθόδους των Reznick και Packer (1994) και των Dalle-Donne και συν. (2003) με ορισμένες τροποποιήσεις. Συγκεκριμένα, σε 500 μl δείγματος 6mg/ml οξειδωμένης ή ανηγμένης αλβουμίνης (BSA) σε PBS προστέθηκαν 2 ml διαλύματος 10 mμ 2, 4 δινιτροφαινυλυδραζίνης (DNPH) σε 2 Ν HCl και ακολούθησε επώαση στους 37οC και σε απόλυτο σκοτάδι για 45 λεπτά. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι κατά τη διάρκεια της επώασης και ανά 10 λεπτά έγινε επιμελημένη ανάδευση των δειγμάτων. Στη συνέχεια προστέθηκαν στα δείγματα 2.5 ml κρύου διαλύματος τριχλωροξικού οξέος (TCA) και επωάστηκαν στους -20 οc για 10 λεπτά. Μετά το τέλος της επώασης ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 3500 rpm για 5 λεπτά, προσθήκη 2 ml κρύου διαλύματος TCA και επώαση στους -20 οc για 10 λεπτά. Κατόπιν τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 3500 rpm για 5 λεπτά, έγινε ρίψη του υπερκείμενου και ακολούθησαν 3 πλύσεις με 2 ml διαλύματος αιθανόλης/οξικού αιθυλίου (ethyl acetate) (1/1) κάθε φορά προκειμένου να απομακρυνθεί η περίσσεια DNPH. Στο τέλος το ίζημα κάθε δείγματος διαλυτοποιήθηκε σε 1 ml διαλύματος 6 Μ υδροχλωρικής γουανιδίνης ph 100

116 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.5 και επωάστηκε στους 37οC για 10 λεπτά. Μετά το τέλος της επώασης ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 3500 rpm για 5 λεπτά και η οπτική απορρόφηση των δειγμάτων μετρήθηκε στα 375 nm σε φασματοφωτόμετρο (Shimadzu UV-1202, UVVIS spectrophotometer). Τα επίπεδα καρβονυλικών ομάδων των δειγμάτων προσδιορίζονταν σύμφωνα με τον τύπο: C (nmol/ml)= O.D375nm x 45.45, όπου το είναι ο συντελεστής μοριακής απορροφητικότητας. Με δεδομένη την απώλεια ποσότητας πρωτεΐνης (10-20%) στο στάδιο των πλύσεων, έγινε προσδιορισμός των επιπέδων πρωτεΐνης των δειγμάτων με μέτρηση της οπτικής απορρόφησής τους στα 280 nm σε φασματοφωτόμετρο (Shimadzu UV1202, UV-VIS spectrophotometer). Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης κατασκευάστηκε πρότυπη καμπύλη BSA με δείγματα γνωστής συγκέντρωσης ( mg/ml) σε διάλυμα 6Μ υδροχλωρικής γουανιδίνης ph 2.5. Η περιεκτικότητα σε καρβονυλικές ομάδες εκφράστηκε ως nanomole ανά milligram πρωτεΐνης έπειτα από αφαίρεση των τιμών που έδιναν τα δείγματα ανηγμένης αλβουμίνης. 9. ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΔΙΣΜΟΥΤΑΣΗΣ ΤΟΥ ΣΟΥΠΕΡΟΞΕΙΔΙΟΥ (SOD) ΣΕ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥ 9.1 Παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων SOD για την κατασκευή πρότυπης καμπύλης Προκειμένου να προσδιοριστεί η δραστικότητα της δισμουτάσης του σουπεροξειδίου (SOD) σε μονοκύτταρα παρασκευάστηκε αρχικά μια σειρά πρότυπων διαλυμάτων SOD διαφορετικής συγκέντρωσης το καθένα και στη συνέχεια κατασκευάστηκε πρότυπη καμπύλη. Οι συγκεντρώσεις των πρότυπων διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 200 U/ml, 100 U/ml, 50 U/ml, 20 U/ml, 10 U/ml, 5 U/ml, 1 U/ml, 0.1 U/ml, 0.05 U/ml, 0.01 U/ml, U/ml και 0 U/ml. 9.2 Προετοιμασία δειγμάτων Κυτταρικό εναιώρημα που περιείχε 106 κύτταρα/ml σε θρεπτικό υλικό IMDM (10% FCS) επωάστηκε με 20 nm καριπορίδιο ή 10μM GF109203X στους 37οC για 15 λεπτά και στη συνέχεια με 20mM γλυκόζη ή 50μU/ml ινσουλίνη στους 37οC για 30 λεπτά. Μετά την επώαση ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 250 g στους 37 0C για 10 λεπτά, λύση των κυττάρων με 0.5% Triton X-100 και επώαση σε πάγο για 10 λεπτά. Στη συνέχεια το κυτταρόλυμα φυγοκεντρήθηκε στις rpm για 1-2 λεπτά 101

117 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ και το υπερκείμενο φυλάχτηκε σε πάγο προκειμένου να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της SOD. 9.3 Μέτρηση δραστικότητας της SOD σε μονοκύτταρα Η δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD) είναι το ένζυμο που καταλύει τη μετατροπή του ανιόντος σουπεροξειδίου (Ο2-) σε υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2). Η δραστικότητα της SOD προσδιορίστηκε με τη χρήση του υδατοδιαλυτού άλατος του τετραζολίου 4-[3-(νιτροφαινυλ)-2H-5-τετραζόλιο]-1,3-benzene disulfonate (WST-1). Η μέθοδος στηρίζεται στην παραγωγή του υδατοδιαλυτού προϊόντος formazan (formazan dye) έπειτα από σύνδεση του WST-1 με τα Ο2- που παράγονται στο εσωτερικό του κυττάρου και τη μετέπειτα αναγωγή του. Ο ρυθμός αναγωγής σχετίζεται γραμμικά με τη δραστικότητα του ενζύμου οξειδάση της ξανθίνης (ΧΟ) και αναστέλλεται από τη SOD (Peskin και Winterbourn, 2000). Το WST-1- formazan εμφανίζει μέγιστη απορρόφηση στα 450 nm. Εφόσον η απορρόφηση στα 450 nm είναι αναλογική του ποσού των Ο2-, η δραστικότητα της SOD προσδιορίστηκε με τη μέτρηση της μείωσης εμφάνισης χρώματος στα 450 nm. Σύμφωνα με τη μέθοδο, αρχικά έγινε επίστρωση πινακίων πολυεστερυνίου 96 υποδοχών (πλάκα ELISA) με 20 μl από καθένα από τα πρότυπα διαλύματα SOD ή από τα δείγματά μας και στη συνέχεια προστέθηκαν 200 μl διαλύματος που περιείχε 50 mm Tris-HCl, ph 8, 0.1 mm DTPA, 0.1 mm υποξανθίνης, 10 mm WST-1 και 4.5 mu/ml οξειδάση της ξανθίνης (reagent mixture). Μετά από επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά μετρήθηκε η οπτική απορρόφηση σε φασματοφωτόμετρο (Stat-Fax-2100-Awareness-Technology Inc) στα 450 nm. Η δραστικότητα της δισμουτάσης του σουπεροξειδίου εκφράστηκε ως U/ml με χρήση της πρότυπης καμπύλης SOD που κατασκευάστηκε παραπάνω. 102

118 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 10. ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΙΟΝΤΩΝ ΑΣΒΕΣΤΙΟΥ ΣΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Ο ποσοτικός προσδιορισμός των ιόντων ασβεστίου στο κυτταρόπλασμα μονοκυττάρων ανθρώπου έγινε με τη χρήση της φθορίζουσας ουσίας fura-2 που ανιχνεύει τα ιόντα ασβεστίου, σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφηκε από τους Gasalla-Herraiz και συν. (1995) με κάποιες τροποποιήσεις. Σύμφωνα με τη μέθοδο, εναιώρημα μονοκυττάρων που περιείχε 3-4x106 κύτταρα/ml σε ρυθμιστικό διάλυμα Hepes που περιείχε 145 mm NaCl, 5 mm KCl, 1 mm MgSO4, 5 mm γλυκόζη και 10 mm Hepes (ph 7.4) επωάστηκε με 1 μm fura-2 και 0.02% pluronic στους 37 0C σε απόλυτο σκοτάδι για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm για 10 λεπτά, αναδιαλύθηκαν σε 3 ml του παραπάνω ρυθμιστικού διαλύματος και επωάστηκαν στους 370C σε σκοτάδι για 7 λεπτά. Ακολούθησε μια ακόμη φυγοκέντρηση των κυττάρων στις 1500 rpm για 10 λεπτά. Το επόμενο στάδιο της πειραματικής διαδικασίας περιλάμβανε την επώαση εναιωρήματος μονοκυττάρων που περιείχε 106 κύτταρα σε ρυθμιστικό διάλυμα Hepes με μια σειρά ενεργοποιητών και αναστολέων γνωστών σηματοδοτικών μορίων στους 37οC. Ο ακριβής χρόνος επώασης και οι συγκεντρώσεις των ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν αναφέρονται παραπάνω (βλ. ενότητα 4: ΕΠΑΓΩΓΕΙΣ ΚΑΙ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ). Μετά την επώαση ακολούθησε φυγοκέντρηση των κυττάρων στις 1500 rpm για 10 λεπτά και αναδιάλυσή τους σε ρυθμιστικό διάλυμα Hepes. Ο φθορισμός των μονοκυττάρων προσδιορίστηκε σε φθορισμόμετρο RF-5000 (Shimadzu) σε κυβέτα χωρητικότητας 3 ml έπειτα από συνεχή ανάδευσή τους, ως ο λόγος του φθορισμού στα μήκη διέγερσης 340 και 380 nm προς την τιμή φθορισμού στο μήκος εκπομπής 510 nm της φθορίζουσας ουσίας. Μετά την πρώτη μέτρηση προστέθηκαν σε κάθε δείγμα 50 μμ digitonin που ήταν απαραίτητο για τη λύση των κυττάρων και 1mM χλωριούχο ασβέστιο (CaCl2) [μιας ένωσης που έπειτα από ηλεκτρόλυση παράγει Ca (s) και Cl2 (g) προκειμένου να προσδιοριστεί η τιμή της μέγιστης εκπομπής (Rmax και Fmax)]. Στη συνέχεια προστέθηκαν σε κάθε δείγμα 0.3 M EGTA που δέσμευσε τα ιόντα ασβεστίου σε 0.9 M διαλύματος Tris ώστε να προσδιοριστούν οι τιμές της ελάχιστης εκπομπής (Rmin and Fmin). Η συγκέντρωση του ελεύθερου ενδοκυτταρικού ασβεστίου προσδιορίστηκε τελικώς με την εφαρμογή της εξίσωσης: [Ca2+] = Kd (R-Rmin)/(Rmax-R)X Fmin/Fmax, 103

119 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ όπου ως Kd ορίζεται η σταθερά συσχέτισης [Ca2+-Fura-2] και ισούται με 224 nmol/lt (Grynkiewicz και συν., 1985). 11. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ph (phi) ΣΕ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ Ο προσδιορισμός της ενδοκυτταρικής τιμής ph (phi) σε μονοκύτταρα έγινε σύμφωνα με τροποποίηση της μεθόδου που προτάθηκε από τους Incerpi και συν. (1996). Σύμφωνα με τη μέθοδο, εναιώρημα μονοκυττάρων σε ουδέτερο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) επωάστηκε με 2,7 -bis (carboxylethyl)-5(6)- carboxyfluorescein tetra-acetoxymethylester (BCECF/AM) στους 37 oc σε απόλυτο σκοτάδι για 45 λεπτά ( 1-2 μg BCECF/AM/106 κύτταρα). Το BCECF/AM χαρακτηρίζεται από έντονη λιποδιαλυτότητα και διαπερατότητα της πλασματικής μεμβράνης, ενώ διασπάται από τις ενδοκυτταρικές εστεράσες και παραμένει εγκλωβισμένo στο εσωτερικό του κυττάρου. Ο όγκος της προστιθέμενης ποσότητας της φθορίζουσας ουσίας υπολογίστηκε κάθε φορά, έπειτα από καταμέτρηση των κυττάρων που υπήρχαν στο κυτταρικό εναιώρημα. Ακολούθησαν τρεις φυγοκεντρήσεις-πλύσεις των κυττάρων στις 1500 rpm για 10 λεπτά προκειμένου να απομακρυνθεί η εξωκυττάρια φθορίζουσα ουσία και αναδιάλυση των κυττάρων σε PBS (2-3 x 106 κύτταρα/ 3 ml δείγματος). Έπειτα έγινε έκθεση των κυττάρων στις οξειδωτικές ουσίες ροτενόνη, πυροσταφυλικό οξύ, αντιμυκίνη Α καθώς και στο αντιοξειδωτικό NAC. Παράλληλα, κάποια δείγματα επωάστηκαν με γλυκόζη ή ινσουλίνη παρουσία ή απουσία του αναστολέα της NADPH οξειδάσης. Ο ακριβής χρόνος επώασης και οι συγκεντρώσεις των ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν αναφέρονται παραπάνω (βλ. ενότητα 4: ΕΠΑΓΩΓΕΙΣ ΚΑΙ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ). Σε όλα τα δείγματα συμπεριλαμβανομένου και του δείγματος ελέγχου (control) προστέθηκαν 1 mm ιωδοξικό νάτριο που είναι αναστολέας της γλυκόλυσης, 0.4 mm μεθαζολαμίδη που είναι αναστολέας της καρβονικής ανυδράσης καθώς και mm 4.4-diisothiocyanatostilbene-2.2disulfonic acid (DIDS) ενός αναστολέα της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Cl-/HCO3-, προκειμένου να παρεμποδιστεί η παρεμβολή συστημάτων που επηρεάζουν την τιμή του ενδοκυτταρικού ph. 104

120 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Η ποσοτική εκτίμηση του φθορισμού των δειγμάτων έγινε σε ειδικό φασματοφωτόμετρο (RF-5000 Shimadzu) έπειτα από συνεχή ανάδευση των δειγμάτων στους 37 oc. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ο λόγος της απορρόφησης των δειγμάτων στο ph-ευαίσθητο μήκος διέγερσης 495 nm και στο ph-αδρανές μήκος διέγερσης 440 nm, με σταθερό το μήκος εκπομπής (530 nm) της φθορίζουσας ουσίας. Στα πλαίσια του πειράματος κατασκευάστηκε πρότυπη καμπύλη προκειμένου να γίνει η αντιστοίχηση των τιμών φθορισμού των δειγμάτων με τιμές ph. Για το λόγο αυτό τα κύτταρα αναδιαλύθηκαν σε ρυθμιστικά διαλύματα γνωστής τιμής ph (6.7, 7.0 και 7.5) που περιείχαν 30 mm Hepes (ph 6.5), 130 mm KCl, και 1 mm MgCl2 και στη συνέχεια μετρήθηκε ο φθορισμός τους. Η κατασκευή της πρότυπης καμπύλης φθορισμού-ph έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο των Thomas και συν. (1979) χρησιμοποιώντας τον ιονοφόρο πολυαιθέρα νιγερισίνη, ενός ιονοφόρου που έχει την ικανότητα να ανταλλάσσει ιόντα Κ+ με ιόντα Η+ διαμέσου της πλασματικής μεμβράνης. Η υψηλή συγκέντρωση [Κ+] των παραπάνω ρυθμιστικών διαλυμάτων σε συνδυασμό με τη δράση της νιγερισίνης επέφερε την εξισορρόπηση της ενδοκυτταρικής τιμής του ph με αυτή του εξωκυττάριου μέσου. 12. ΜΕΤΡΗΣΗ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ NADPH ΟΞΕΙΔΑΣΗΣ ΣΕ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ Η μέτρηση της δραστικότητας της NADPH οξειδάσης σε μονοκύτταρα έγινε με τροποποίηση της μεθόδου που προτάθηκε από τους Thannickal και Fanburg (1995). Σύμφωνα με τη μέθοδο, εναιώρημα μονοκυττάρων σε θρεπτικό υλικό χωρίς τον δείκτη ph ερυθρό της φαινόλης (RPMI-1640, 10% FCS) επωάστηκε με υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης ή ινσουλίνης παρουσία ή απουσία αναστολέων στους 370C. Ο ακριβής χρόνος επώασης και οι συγκεντρώσεις των ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν αναφέρονται παραπάνω (βλ. ενότητα 4: ΕΠΑΓΩΓΕΙΣ ΚΑΙ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ). Στη συνέχεια το εναιώρημα μονοκυττάρων επωάστηκε με 250 μμ υποστρώματος NADΡH στους 370C και ο ρυθμός κατανάλωσης του υποστρώματος καταγράφηκε στα 340 nm με τη χρήση του φασματοφωτόμετρου Thermo Electron Corporation, για 4 ώρες και ανά 1 ώρα. Ο συντελεστής απόσβεσης που χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να προσδιοριστεί ποσοτικά η κατανάλωση του 105

121 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ NADPH ήταν ίσος με 0.62 L/mmol/mm, ενώ τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ενζυμική δραστικότητα (% των κυττάρων ελέγχου). 13. ΑΝΟΣΟΚΑΘΙΖΗΣΗ ΤΟΥ ΝΗΕ-1 ΣΕ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΟ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΟΚΟΥ ΤΟΥ ΝΗΕ-1 ΜΕ ΤΗΝ HSP Προετοιμασία δειγμάτων Εναιώρημα μονοκυττάρων σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS επωάστηκε με 20mM γλυκόζη ή 50μU/ml ινσουλίνη για 30 λεπτά, ή με mm Η2Ο2 για 1 ώρα στους 370C παρουσία και απουσία 20nM καριποριδίου, του αναστολέα του ΝΗΕ-1. Στη συνέχεια τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm για 10 λεπτά και τα ιζήματα αναδιαλύθηκαν σε διάλυμα λύσης που περιείχε 1% Nonidet P-40, 0.5% δεοξυχολικό οξύ (deoxycholic acid), 0.05% SDS, 50 mm Tris-HCl (ph 8.0), 150 mm NaCl, 3 mm KCl, 1 mm EDTA καθώς και τους αναστολείς πρωτεασών 10 μg/ml απροτινίνη (aprotinin-αναστολέας των πρωτεασών σερίνης), 10 μg/ml λουπεπτίνη (leupeptinαναστολέας της καλπαΐνης) και 1 mm PMSF (αναστολέας πρωτεασών σερίνης) Κάθαρση του κυτταρολύματος Μετά από επώαση για 1 ώρα στους 40C έγινε κάθαρση των λυμένων κυττάρων (κυτταρόλυμα) με την προσθήκη 1 μg κατάλληλου μη ειδικού αντισώματος IgG (normal goat-igg, normal rabbit IgG, normal mouse IgG ανάλογα με το ζώο από το οποίο προέρχονταν το αντίσωμα που θα γίνονταν η ανοσοκαθίζηση) και σφαιριδίων αγαρόζης που ήταν συνδεδεμένα με πρωτεΐνη A/G. Το παραπάνω στάδιο συμβάλλει στη διόρθωση των αυξημένων τιμών που θα μπορούσαν να προκληθούν από τη μη ειδική δέσμευση πρωτεϊνών στα σφαιρίδια αγαρόζης. Πιο συγκεκριμένα, προσθέτοντας ένα μη ειδικό αντίσωμα ίδιου τύπου Ig και από το ίδιο είδος ζώου με το αντίσωμα που θα χρησιμοποιούνταν για την ανοσοκαθίζηση (του ΝΗΕ-1 ή της HSP70) μαζί με σφαιρίδια αγαρόζης, το κυτταρόλυμα καθαρίζονταν από όλες εκείνες τις πρωτεΐνες που θα μπορούσαν να συνδεθούν μη ειδικά στο αντίσωμα της ανοσοκαθίζησης, δηλαδή σε άλλες περιοχές πλην της αντιγονο-δεσμευτικής. Μετά από επώαση στους 40C για 30 λεπτά ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 2500 rpm στους 40C για 5 λεπτά, φύλαξη του υπερκείμενου σε πάγο και μέτρηση της περιεκτικότητας 106

122 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ της πρωτεΐνης των δειγμάτων (βλ. ενότητα 5: Μέτρηση της συνολικής ποσότητας της πρωτεΐνης) Ανοσοκαθίζηση του ΝΗΕ-1 και της HSP-70 σε μονοκύτταρα Μετά τη μέτρηση της περιεκτικότητας της πρωτεΐνης προστέθηκε αντίσωμα rabbit anti-nhe-1 ή goat anti-hsp-70 ανάλογα με την πρωτεΐνη που θα γίνονταν ανοσοκαθίζηση και σύμφωνα με τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης στο κάθε δείγμα (σε μg πρωτεΐνης προστέθηκαν 1-10 μl anti-nhe-1 ή anti- HSP-70) και ακολούθησε επώαση στους 40C για 1 ώρα. Στη συνέχεια προστέθηκαν σε κάθε δείγμα 20 μl σφαιριδίων αγαρόζης που ήταν συνδεδεμένα με πρωτεΐνη A/G και έγινε επώαση στους 40C για 24 ώρες. Μετά το τέλος της επώασης τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 2500 rpm στους 40C για 5 λεπτά, φυλάχτηκαν τα υπερκείμενα και ακολούθησαν 3 πλύσεις-φυγοκεντρήσεις των ιζημάτων στις ίδιες συνθήκες (5 λεπτά/2500 rpm/40c). Μετά την τελευταία πλύση το ίζημα φυλάχτηκε και έγινε μέτρηση της περιεκτικότητας των δειγμάτων σε πρωτεΐνη (βλ. ενότητα 4: Μέτρηση της συνολικής ποσότητας της πρωτεΐνης). Ακολούθησε αραίωση των δειγμάτων με διάλυμα που περιείχε 3% SDS, 0,08 M Tris-HCl ph 6.8, 15% γλυκερόλη και 0,01% μπλε της βρωμοφαινόλης (loading buffer 1X) και βρασμός τους στους 100 0C για 2-3 λεπτά προκειμένου να αποδεσμευτούν οι πρωτεΐνες από τα σφαιρίδια αγαρόζης. Στη συνέχεια τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 2500 rpm στους 40C και το υπερκείμενο φυλάχτηκε καθώς περιείχε την πρωτεΐνη του ενδιαφέροντός μας (ΝΗΕ-1 ή HSP-70). Τα δείγματα είτε χρησιμοποιήθηκαν άμεσα είτε φυλάχτηκαν στους -800C για μελλοντική χρήση Ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων Μετά το πέρας της ανοσοκαθίζησης ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου με SDS (SDS-PAGE) σύμφωνα με το σύστημα ρυθμιστικών διαλυμάτων κατά Laemmli (Laemmli και συν., 1979). Με δεδομένο ότι τα δείγματα περιείχαν SDS είχαν αποκτήσει ισχυρό αρνητικό φορτίο με αποτέλεσμα να κατευθύνονται προς τον θετικό πόλο, με ταχύτητα που καθορίστηκε αποκλειστικά από το μέγεθός τους - το μοριακό τους βάρος. Η πηκτή διαχωρισμού που χρησιμοποιήθηκε ήταν 10% και περιείχε 30% ακρυλαμίδιο, 2% bis-ακρυλαμίδιο, 10% SDS, 1 Μ Tris (ph 8.8), απεσταγμένο Η2Ο, 10 μl TEMED και 75 μl APS, ενώ η πηκτή επιστοίβαξης ήταν 4% και περιλάμβανε 107

123 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ακρυλαμίδιο 30%, 2% bis-ακρυλαμίδιο, 20% SDS,1 M Tris (ph 6.8), απεσταγμένο Η2Ο, 5 μl TEMED και 38 μl APS. Οι ουσίες TEMED και APS καταλύουν τον πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου (προς gel πολυακρυλαμιδίου PAGE) και προσθέτονταν στο τέλος παρασκευής των παραπάνω διαλυμάτων. Οι δείκτες μοριακών βαρών που χρησιμοποιήθηκαν (Cell Signaling), ήταν συνδεδεμένοι με βιοτίνη και περιείχαν 10 πρωτεΐνες με εύρος μοριακού βάρους από KDa. Οι πρωτεΐνες μοριακού βάρους KDa ήταν θραύσματα παραμυοσίνης, ενώ οι υψηλότερου μοριακού βάρους πρωτεΐνες παρασκευάστηκαν έπειτα από σύντηξη της συνδεδεμένης με μαλτόζη πρωτεΐνης (MBP) με την παραμυοσίνη ή με θραύσματα παραμυοσίνης/lacz. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων σε συσκευή ηλεκτροφόρησης Biorad στα 20mA Ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών από την πηκτή σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (blotting) και ανίχνευση του ΝΗΕ-1, της HSP-70 και των γλουταθειονυλιωμένων πρωτεϊνών Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης ακολούθησε ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών από την πηκτή σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με τη χρήση της μεθόδου semi-dry blotting. Αρχικά η μεμβράνη τοποθετήθηκε προσεκτικά στην επιφάνεια της πηκτής. Χρησιμοποιήθηκαν επίσης τεμάχια διηθητικού χαρτιού (Whatmann, πάχους 3 mm), μεταξύ των οποίων τοποθετήθηκε η πηκτή και η μεμβράνη. Το όλο σύστημα τοποθετήθηκε μεταξύ των ηλεκτροδίων με την μεμβράνη προς την πλευρά θετικού πόλου. Έπειτα, πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφορητική μεταφορά των πρωτεϊνών, από την πηκτή σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης στα 280 ma, σε θερμοκρασία 370 C, για 2 ώρες (Western blotting). Στο επόμενο στάδιο της πειραματικής διαδικασίας έγινε επώαση της μεμβράνης σε 20 ml ρυθμιστικού διαλύματος (blocking buffer), που περιείχε ρυθμιστικό διάλυμα Tris (TBS) (ph 7.6), 0.1% Tween-20 και 5% άπαχο γάλα σε σκόνη, σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. H μεμβράνη νιτροκυτταρίνης έχει την ιδιότητα να δεσμεύει στην επιφάνειά της πρωτεΐνες. Με δεδομένο όμως ότι και τα αντισώματα που θα προσθέτονταν στη συνέχεια ήταν πρωτεϊνικής φύσης και θα μπορούσαν επίσης να συνδεθούν στη μεμβράνη έγινε επώαση με το παραπάνω διάλυμα προκειμένου να δεσμευτούν οι μη ειδικές θέσεις σύνδεσης στην επιφάνεια της μεμβράνης όπου θα μπορούσε να γίνει δέσμευση του αντισώματος. Έτσι, πλέον 108

124 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ οι μόνες θέσεις στις οποίες δεσμεύονταν το αντίσωμα ήταν οι θέσεις όπου βρίσκονταν η πρωτεΐνη που μας ενδιέφερε. Ακολούθησαν 3 πλύσεις διάρκειας 10 λεπτών η καθεμιά με 20 ml διαλύματος που περιείχε ρυθμιστικό διάλυμα Tris (TBS) (ph 7.6) και 0.1% Tween-20 (TBS/T). Στη συνέχεια η μεμβράνη επωάστηκε με TBS/T το οποίο περιείχε 5% άπαχο γάλα σε σκόνη, αραίωση 1/1000 ειδικού μονοκλωνικού αντισώματος rabbit anti-nhe-1 που αναγνώριζε τον ΝΗΕ-1, ή goat anti-hsp-70, ειδικού μονοκλωνικού αντισώματος που αναγνώριζε την HSP-70, ή mouse anti-gsh ειδικού μονοκλωνικού αντισώματος που αναγνώριζε τις γλουταθειονυλιωμένες πρωτεΐνες, στους 40 C για 24 ώρες. Την επόμενη μέρα έγιναν 3 πλύσεις διάρκειας 10 λεπτών η καθεμιά με 20 ml διαλύματος TBS/T κάθε φορά. Στη συνέχεια η μεμβράνη επωάστηκε με το ίδιο διάλυμα (TBS/T το οποίο περιείχε 5% άπαχο γάλα σε σκόνη) που περιείχε το συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (HRP) δεύτερο αντίσωμα goat anti-rabbit IgG ή rabbit anti-goat IgG ή rabbit anti-mouse IgG ανάλογα με το ποιο ήταν το πρώτο αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε, αραιωμένο 1/ Η επώαση έγινε με ανάδευση και σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Μετά το τέλος της επώασης ακολούθησαν 3 πλύσεις διάρκειας 10 λεπτών, με 20 ml διαλύματος TBS/T κάθε φορά. Το επόμενο στάδιο της πειραματικής διαδικασίας περιλάμβανε την ανίχνευση σήματος από την αντίδραση της υπεροξειδάσης, με τη μέθοδο της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL). Συγκεκριμένα η μεμβράνη επωάστηκε με το διάλυμα λουμινόλης (LumiGLO) και υπεροξειδίου του υδρογόνου (peroxide) σύμφωνα με τις οδηγίες του πακέτου (Cell Signaling Technology). Σύμφωνα με τη διαδικασία, έγινε επώαση της μεμβράνης με το διάλυμα της ECL διάρκειας ενός λεπτού και με συνεχή ανάδευση και κατόπιν απομάκρυνση της περίσσειας του παραπάνω διαλύματος. Στη συνέχεια η μεμβράνη τοποθετήθηκε σε διαφανές αδιάβροχο πλαστικό φύλλο (Saran Wrap). Τελικώς, ανιχνευτηκε η εκπομπή φωτός από την αντίδραση με έκθεση της μεμβράνης σε φωτογραφικό φιλμ για περίπου 10 sec. Μετά την εμφάνιση του φιλμ παρατηρήθηκε την φωτογραφική αποτύπωση στα δείγματα όπου ανιχνεύτηκε η προς μελέτη πρωτεΐνη. Η ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (enhanced chemiluminescence, ECL) βασίζεται στη σύζευξη της horseradish υπεροξειδάσης (HRP) στο αντίσωμα που είναι ειδικό για το μόριο που μας ενδιαφέρει. Η HRP στη συνέχεια καταλύει την οξείδωση του υποστρώματος της λουμινόλης από το Η2Ο2 προς έναν ενδιάμεσο παράγοντα ο οποίος περιέχει τριπλό-διεγερμένο καρβονύλιο το οποίο κατά τη μετάπτωση προς 109

125 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ μονό καρβονύλιο εκλύει φως (που καταγράφεται έτσι στο φιλμ) η αντίδραση που καταλύεται από την περοξειδάση είναι η ακόλουθη: Λουμινόλη + H2O2 ενδιάμεσο προϊόν [ ] ενδιάμεσο προϊόν + φως Η μέθοδος της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας χαρακτηρίζεται από μεγάλη ευαισθησία καθώς καθιστά δυνατή την ανίχνευση βιομορίων ακόμα και σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις (της τάξης των Μ). 14. ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 ΚΑΙ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ IV. ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΩΝ ALPHA2, ALPHAL, ALPHAM ΚΑΙ BETA2 ΥΠΟΜΟΝΑΔΩΝ ΤΗΣ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΗΣ ΣΤΑ ΠΑΡΑΠΑΝΩ ΦΑΙΝΟΜΕΝΑ 14.1 Οξείδωση λαμινίνης-1 και κολλαγόνου IV Στα πλαίσια της μελέτης προσκόλλησης των μονοκυττάρων σε οξειδωμένες και μη οξειδωμένες πρωτεΐνες των βασικών μεμβρανών έγινε οξείδωση της λαμινίνης-1 και του κολλαγόνου IV. Για το λόγο αυτό διαλύματα των παραπάνω πρωτεϊνών σε PBS επωάστηκαν με 100 mm EDTA, 833 mm διαλύματος ασκορβικού οξέος και 100 mm διαλύματος θειικού αμμωνίου με δισθενή σίδηρο όπως αναλυτικά περιγράφεται παραπάνω (βλ. ενότητα 7.2: Διαδικασία οξείδωσης της BSA). Σε κάποιες άλλες περιπτώσεις όπου μελετήθηκε η προσκόλληση επισημασμένων με ραδιενεργό μεθειονίνη μονοκυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης λαμινίνης-1, η λαμινίνη-1 οξειδώθηκε με 2,2 (2-μεθυλπροπιοναμιδίνη) διυδροχλωρίδιο (ΑΒΑΡ), μια ουσία που παράγει υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2) και οξειδώνει τις πρωτεΐνες (Regoli και Winston, 1999). Σύμφωνα με τη διαδικασία, σε πινάκια πολυεστερενίου 96 υποδοχών (πλάκα ELISA) επιστρώθηκαν 50 μl 37.5 μg/ml υδατικού διαλύματος λαμινίνης καθώς και 50 μl 1 nμ υδατικού διαλύματος (ΑΒΑΡ) και στη συνέχεια η πλάκα αφέθηκε να στεγνώσει για 24 ώρες (overnight). 110

126 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 14.2 Επώαση μονοκυττάρων με τα αντισώματα για τις alpha2 (a2), alphal (al), alpham (am ) και beta2 (β2) υπομονάδες της ιντεγκρίνης Εναιώρημα μονοκυττάρων όγκου 3 ml που περιείχε 1-2x106 κύτταρα σε θρεπτικό υλικό (IMDM, 10% FCS) επωάστηκε αρχικά με 20 μl 250 μg/ml μη ειδικού αντισώματος (human IgG) για 5 λεπτά σε πάγο και σε απόλυτο σκοτάδι προκειμένου να δεσμευτούν οι μη ειδικές θέσεις σύνδεσης των αντισωμάτων για τις υπομονάδες ιντεγκρίνης που χρησιμοποιήθηκαν. Στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν με 80 μl αραιωμένου αντισώματος 1/50 για την alpha2 υπομονάδα της ιντεγκρίνης (CD49b) συνδεδεμένου με τη φθορίζουσα ουσία fluorescein isothiocyanate (FITC) σε πάγο και σε απόλυτο σκοτάδι για 45 λεπτά. Μετά την επώαση ακολούθησαν 3 πλύσεις- φυγοκεντρήσεις των κυττάρων στις 1500 rpm για 10 λεπτά με ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 50 mm sodium phosphate ph 7.5, 100 mm potassium chloride, 150 mm NaCl, 5% glycerol και 0.2% BSA. Σε άλλα πειράματα όπου μελετήθηκαν άλλοι τύποι ιντεγκρινών, εναιώρημα μονοκυττάρων όγκου 200 μl που περιείχε 1-2x106 κύτταρα σε θρεπτικό υλικό (IMDM, 10% FCS) επωάστηκε αρχικά με 250 μg/ml μη ειδικού αντισώματος (human IgG) για 5 λεπτά σε πάγο και σε απόλυτο σκοτάδι και στη συνέχεια με 10 μl αντισώματος για την alphal (CD11a), ή την alpham (CD11b), ή τη beta2 (CD18) υπομονάδα της ιντεγκρίνης σε πάγο και σε απόλυτο σκοτάδι για 45 λεπτά. Τα αντισώματα για τις αμ και β2 υπομονάδες της ιντεγκρίνης ήταν συνδεδεμένα με FITC, ενώ το αντίσωμα για την αl υπομονάδα της ιντεγκρίνης ήταν συνδεδεμένο με τη φθορίζουσα ουσία R-φυκοερυθρίνη (RΡΕ). Μετά την επώαση τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν 3 φορές στις 1500 rpm για 10 λεπτά με PBS προκειμένου να απομακρυνθεί η περίσσεια της φθορίζουσας ουσίας. Μετά το πέρας της παραπάνω διαδικασίας προσδιορίστηκαν τα επίπεδα των alpha2, alphal, alpham και beta2 ιντεγκρινικών υπομονάδων σε μονοκύτταρα φυσιολογικών ατόμων και ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής σε κυτταρόμετρο Beckman Coulter Epics, Inc. Επίσης, η έκφραση των ιντεγκρινών παρατηρήθηκε και με μικροσκόπιο φθορισμού CKX41 Olympus. 111

127 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 14.3 Προσκόλληση επισημασμένων με 35S-μεθειονίνη μονοκυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης Για την εκτίμηση της προσκόλλησης των μονοκυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη λαμινίνης-1 έγινε επίστρωση πινακίων πολυεστερυνίου 96 υποδοχών (πλάκα ELISA) με 50 μl 37.5 μg/ml διαλύματος οξειδωμένης ή μη οξειδωμένης λαμινίνης σε PBS σε κάθε υποδοχή, και αφέθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες μέχρι να στεγνώσουν. Στα πλαίσια του συγκεκριμένου πειράματος η λαμινίνη οξειδώθηκε με ABAP ή με ασκορβικό οξύ, όπως περιγράφηκε αναλυτικά παραπάνω (βλ. ενότητα 13.1: Οξείδωση λαμινίνης-1 και κολλαγόνου IV). Στη συνέχεια προστέθηκε σε κάθε υποδοχή 200 μl εναιωρήματος μονοκυττάρων επισημασμένων με 35 S-μεθειονίνη σε θρεπτικό υλικό (RPMI 1640, 10% FCS) που περιείχε κύτταρα και ακολούθησε επώαση στους 370C για 30 λεπτά. Για τους σκοπούς του πειράματος τα μονοκύτταρα σε κάποιες περιπτώσεις προεπωάστηκαν με το ειδικό αντίσωμα για την alpha2 υπομονάδα της ιντεγκρίνης όπως περιγράφεται αναλυτικά παραπάνω (βλ. ενότητα 14.2: Επώαση μονοκυττάρων με τα αντισώματα για τις alpha2, alphal, alpham και beta2 υπομονάδες της ιντεγκρίνης). Μετά το τέλος της επώασης έγιναν πλύσεις με αποστειρωμένο ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα (ΡΒS) 3 φορές, χρησιμοποιώντας 100 μl κάθε φορά προκειμένου να απομακρυνθούν τα κύτταρα που δεν είχαν προσκολληθεί στην οξειδωμένη ή μη οξειδωμένη λαμινίνη. Στο επόμενο στάδιο προστέθηκαν 50 μl διαλύματος λύσης στα κύτταρα (lysis buffer), που περιείχε 5% SDS (20%) και 5% ΝαΟΗ (10Μ) και το οποίο πριν τη χρήση του θερμάνθηκε στους 60 0C για 30 λεπτά. Ακολούθησε ανάδευση του περιεχομένου των υποδοχών (wells) με παλινδρομικές αναρροφήσεις. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε σωληνάρια μέτρησης του φωτόμετρου υγρού σπινθηρισμού (β-counter) που περιείχαν 3 ml υγρού σπινθηρισμού (700 ml τολουένιο, 300 ml Τriton Χ-100, 4 gr PPO, 0,1 gr PPOP) και προσδιορίστηκε η ραδιενέργεια του κάθε δείγματος στο φωτόμετρο υγρού σπινθηρισμού. Η ένταση της ραδιενέργειας ήταν ενδεικτική του βαθμού προσκόλλησης των μονοκυττάρων στο υπόστρωμα λαμινίνης

128 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 14.4 Προσκόλληση μονοκυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη λαμινίνης και κολλαγόνου IV με τη μέθοδο της μυελοπεροξειδάσης (MPO) Ο ποσοτικός προσδιορισμός της προσκόλλησης μονοκυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη λαμινίνης-1 και κολλαγόνου IV έγινε και σύμφωνα με τη μέθοδο των Verdegaal και συν. (1996) με κάποιες τροποποιήσεις. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην εκτίμηση της δραστικότητας του ενζύμου μυελοπεροξειδάση (MPO) που υπάρχει στα μονοκύτταρα. Σύμφωνα με τη μέθοδο, αρχικά έγινε επίστρωση πινακίων πολυεστερυνίου 96 υποδοχών με 50 μl 37.5 μg/ml διαλύματος οξειδωμένης ή μη οξειδωμένης λαμινίνης σε PBS, ή 22.5 μg/ml διαλύματος οξειδωμένου ή μη κολλαγόνου IV, σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες (overnight) να στεγνώσουν. Στα πλαίσια του συγκεκριμένου πειράματος οι πρωτεΐνες των βασικών μεμβρανών που χρησιμοποιήθηκαν οξειδώθηκαν με ασκορβικό οξύ, όπως περιγράφηκε αναλυτικά παραπάνω (βλ. ενότητα 14.1: Οξείδωση λαμινίνης-1 και κολλαγόνου IV). Στη συνέχεια σε κάθε υποδοχή προστέθηκαν 100 μl εναιωρήματος μονοκυττάρων σε θρεπτικό υλικό (IMDM, 10% FCS) που περιείχε κύτταρα και ακολούθησε επώαση στους 370C για 30 λεπτά. Για τους σκοπούς του πειράματος τα μονοκύτταρα σε κάποιες περιπτώσεις προεπωάστηκαν με ειδικό αντίσωμα για την α2, ή την αl, ή την αm, ή τη β2 υπομονάδα της ιντεγκρίνης όπως περιγράφηκε αναλυτικά παραπάνω (βλ. ενότητα 13.2: Επώαση μονοκυττάρων με τα αντισώματα για τις alpha2, alphal, alpham και beta2 υπομονάδες της ιντεγκρίνης). Μετά το τέλος της επώασης έγινε μια πλύση με 100 μl στείρο διάλυμα ΡΒS (ph 6.0) προκειμένου να απομακρυνθούν τα κύτταρα που δεν είχαν προσκολληθεί στο εκάστοτε υπόστρωμα (λαμινίνη ή κολλαγόνο). Έπειτα προστέθηκαν 50 μl 0,5% w/v hexadecyltrimethylammonium bromide σε PBS (ph 6.0) σε κάθε υποδοχή της πλάκας ELISA προκειμένου να πραγματοποιηθεί λύση των κυττάρων και έγινε επώαση στους 370C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια προστέθηκαν 50 μl 0,2mg/ml dianisidinedihydrochloride με 0,4mΜ H2O2 που περιείχε όλα τα απαραίτητα υποστρώματα για τη δράση της MPO και τα δείγματα επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με ελαφριά ανάδευση. Τέλος, προσδιορίστηκε η δραστικότητα της MPO των μονοκυττάρων με τη μέτρηση της οπτικής απορρόφησης των δειγμάτων σε φασματοφωτόμετρο (Stat-Fax-2100-Awareness-Technology Inc) στα 405nm. Η τιμή απορρόφησης αντιπροσώπευε τη δραστικότητα της 113

129 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ μυελοπεροξειδάσης του κυτταρολύματος και ήταν ενδεικτική του αριθμού των μονοκυττάρων που προσκολλήθηκαν στο υπόστρωμα λαμινίνης Παρασκευή κυμαινόμενου βαθμού οξειδωμένης λαμινίνης-1 και οξειδωμένης BSA Σύμφωνα με τη μέθοδο, τόσο η λαμινίνη όσο και η BSA οξειδώθηκαν με EDTA, ασκορβικό οξύ και διάλυμα θειικού αμμωνίου με δισθενή σίδηρο, ενώ η αναγωγή τους έγινε με NaBH4, όπως αναλυτικά περιγράφηκε παραπάνω (βλ. ενότητα 8.2: Διαδικασία οξείδωσης της BSA και Διαδικασία αναγωγής της BSA). Στη συνέχεια παρασκευάστηκαν δείγματα διαφορετικού βαθμού οξείδωσης 37.5 μg/ml λαμινίνης-1 και 5 μg/ml BSA με εύρος οξείδωσης πρωτεϊνών από 0%-40%. Η σύσταση των δειγμάτων ήταν η ακόλουθη: Πίνακας 10. Παρασκευή διαλυμάτων λαμινίνης-1 και αλβουμίνης κυμαινόμενου βαθμού οξείδωσης (ΒSA) (0%-40%). Table 10. Preparation of laminin-1 and BSA solutions with various degree of oxidation (0%-40%). Ποσοστό οξείδωσης Ποσότητα οξειδωμένης Ποσότητα ανηγμένης πρωτεΐνης (λαμινίνης ή πρωτεΐνης (λαμινίνης ή πρωτεΐνης (λαμινίνης ή κολλαγόνου) κολλαγόνου) (μl) κολλαγόνου) (μl) 0% 0 μl 100 μl 10% 10 μl 90 μl 20% 20 μl 80 μl 30% 30 μl 70 μl 40% 40 μl 60 μl Μετά την παρασκευή των παραπάνω δειγμάτων έγινε επίστρωσή τους σε πινάκια πολυεστερυνίου 96 υποδοχών (πλάκα ELISA) για να στεγνώσουν για 24 ώρες (overnight). Στη συνέχεια σε κάθε υποδοχή της πλάκας ELISA προστέθηκαν μονοκύτταρα επισημασμένα με 35 S-μεθειονίνη και προσδιορίστηκε ο βαθμός προσκόλλησης των μονοκυττάρων στα παραπάνω υποστρώματα όπως περιγράφηκε αναλυτικά παραπάνω (βλ. ενότητα 14.3: Προσκόλληση επισημασμένων με 35S-μεθειονίνη μονοκυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης). 114

130 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 15. ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΜΥΕΛΟΠΕΡΟΞΕΙΔΑΣΗΣ ΣΕ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΠΟΥ ΠΡΟΗΛΘΑΝ ΑΠΟ ΥΓΙΕΙΣ ΔΟΤΕΣ Ή ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΣΑΚΧΑΡΩΔΗ ΔΙΑΒΗΤΗ ΤΥΠΟΥ ΙΙ Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της δραστικότητας του ενζύμου μυελοπεροξειδάση (ΜΡΟ) σε μονοκύτταρα, 200 μl εναιωρήματος μονοκυττάρων σε θρεπτικό υλικό (IMDM, 10% FCS) που περιείχε κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κωνικά πλαστικά φιαλίδια (eppendorf) και επωάστηκαν στους 370C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια τα μονοκύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στις rpm για 1 λεπτό και το ίζημα αναδιαλύθηκε σε 100 μl PBS (ph 6). Ακολούθησε μία ακόμη φυγοκέντρηση των δειγμάτων στις rpm για 1 λεπτό και αναδιάλυση του ιζήματος σε 50 μl διαλύματος λύσης 0.5% (w/v) hexadecyltrimethylammonium bromide σε PBS (ph 6). Μετά από επώαση των δειγμάτων στους 37οC για 30 λεπτά, προστέθηκαν στο καθένα 50 μl 0,2mg/ml dianisidinedihydrochloride με 0,4mΜ H2O2 που περιείχε όλα τα απαραίτητα υποστρώματα για τη δράση της MPO και έγινε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά με ελαφριά ανάδευση. Τέλος, η δραστικότητα της MPO των μονοκυττάρων προσδιορίστηκε με τη μέτρηση της οπτικής απορρόφησης των δειγμάτων σε φασματοφωτόμετρο (Stat-Fax-2100-Awareness-Technology Inc) στα 405nm. Η τιμή απορρόφησης αντιπροσωπεύει τη δραστικότητα της μυελοπεροξειδάσης του κυτταρολύματος. 16. ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΚΑΡΒΟΝΥΛΙΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΚΑΡΒΟΝΥΛΙΩΜΕΝΗΣ ΑΠΟ MGO ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ Καρβονυλίωση λαμινίνης-1 Η καρβονυλίωση της λαμινίνης-1 έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο των Pedchenko και συν. (2005). Αρχικά έγινε επίστρωση πινακίων πολυεστερυνίου 96 υποδοχών (πλάκα ELISA) με 50 μl 37.5 μg/ml διαλύματος λαμινίνης-1 σε PBS για 24 ώρες (overnight) σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι να στεγνώσουν. Στη συνέχεια προστέθηκαν σε κάποιες υποδοχές της πλάκας ELISA 2mM μεθυλγλυοξάλης (methylglyoxal-mgo) στους 370C και σε απόλυτο σκοτάδι για 24 ώρες (overnight). Την επόμενη μέρα έγιναν 2 πλύσεις με PBS. Ο ποσοτικός προσδιορισμός του βαθμού προσκόλλησης μονοκυττάρων σε καρβονυλιωμένη και μη καρβονυλιωμένη λαμινίνη έγινε με τη χρήση τριών μεθόδων: 115

131 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ με τον προσδιορισμό της δραστικότητας του ενζύμου μυελοπεροξειδάση των μονοκυττάρων, με τη χρήση του Hemacolor kit και με τη χρώση με crystal violet Εκτίμηση του βαθμού προσκόλλησης των μονοκυττάρων σε υπόστρωμα καρβονυλιωμένης και μη καρβονυλιωμένης λαμινίνης-1 με προσδιορισμό της δραστικότητας του ενζύμου μυελοπεροξειδάση (MPO) Η εκτίμηση του βαθμού προσκόλλησης των μονοκυττάρων σε υπόστρωμα καρβονυλιωμένης από MGO και μη καρβονυλιωμένης λαμινίνης-1 έγινε αρχικά με προσδιορισμό της δραστικότητας του ενζύμου μυελοπεροξειδάση που υπάρχει στα μονοκύτταρα, όπως περιγράφεται αναλυτικά παραπάνω (Βλ. ενότητα 13.4: Προσκόλληση μονοκυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη λαμινίνης και κολλαγόνου IV με τη μέθοδο της μυελοπεροξειδάσης (MPO)) 16.3 Εκτίμηση του βαθμού προσκόλλησης των μονοκυττάρων σε υπόστρωμα καρβονυλιωμένης και μη καρβονυλιωμένης λαμινίνης-1 με τη χρήση του Hemacolor kit Η εκτίμηση του βαθμού προσκόλλησης των μονοκυττάρων σε υπόστρωμα καρβονυλιωμένης και μη καρβονυλιωμένης λαμινίνης-1 έγινε και με τη χρήση του Hemacolor kit που έχει την ιδιότητα να χρωματίζει το DNA. Το παραπάνω kit αποτελείται από τρία διαλύματα διαφορετικού χρώματος και σύστασης το καθένα, τα οποία τοποθετούνται στα κύτταρα όπως περιγράφεται αναλυτικά παρακάτω με τελικό αποτέλεσμα τη χρώση τους. Σύμφωνα με τη μέθοδο, αρχικά τοποθετήθηκαν 100 μl εναιωρήματος μονοκυττάρων σε θρεπτικό υλικό (IMDM, 10% FCS) που περιείχε κύτταρα σε πινάκια πολυεστερυνίου 96 υποδοχών (πλάκα ELISA) που είχαν προηγουμένως επιστρωθεί με 50 μl 37.5 μg/ml διαλύματος καρβονυλιωμένης ή μη καρβονυλιωμένης λαμινίνης-1 σε PBS και ακολούθησε επώαση στους 370C για 30 λεπτά. Μετά το τέλος της επώασης τα κύτταρα που δεν είχαν προσκολληθεί στο υπόστρωμα απομακρύνθηκαν και έγινε μια πλύση με 100 μl αποστειρωμένο διάλυμα ΡΒS (ph 6.0). Κατόπιν, προστέθηκαν διαδοχικά σε κάθε υποδοχή 80 μl άχρωμου διαλύματος μονιμοποίησης (Fixing solution, Microscopy Hemacolor Kit), διαλύματος κόκκινου χρώματος (Colour reagent red, Microscopy Hemacolor Kit) και διαλύματος μπλε χρώματος (Colour reagent blue, Microscopy Hemacolor Kit), τα οποία απομακρύνθηκαν αμέσως μετά την προσθήκη τους, με απότομη εκτίναξη της πλάκας 116

132 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ELISA. Μετά την απομάκρυνση του τρίτου διαλύματος μπλε χρώματος, η πλάκα εκτινάχτηκε ήπια επάνω σε διηθητικό χαρτί και ακολουθούσαν δύο πλύσεις με 200 μl διαλύματος πλύσης (Wash buffer ph 7.2, Microscopy Hemacolor Kit). Έπειτα, η πλάκα αφέθηκε να στεγνώσει σε θερμοκρασία δωματίου για λεπτά. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 200 μl υδατικού διαλύματος 10% οξικού οξέος, ακολούθησε αναδιάλυση του περιεχομένου και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου με ήπια ανάδευση για 3-4 λεπτά. Τέλος, η απορρόφηση των δειγμάτων προσδιορίστηκε με φασματοφωτόμετρο μέτρησης ELISA (Stat-Fax 2100 Awareness Technology) σε μήκος κύματος 570nm. Η τιμή απορρόφησης ήταν αντιπροσωπευτική του αριθμού των μονοκυττάρων που προσκολλήθηκαν στο υπόστρωμα καρβονυλιωμένης και μη καρβονυλιωμένης λαμινίνης Εκτίμηση του βαθμού προσκόλλησης των μονοκυττάρων σε υπόστρωμα καρβονυλιωμένης και μη καρβονυλιωμένης λαμινίνης-1 με τη χρώση crystal violet Αρχικά τοποθετήθηκαν 100 μl εναιωρήματος μονοκυττάρων σε θρεπτικό υλικό (IMDM, 10% FCS) που περιείχε κύτταρα σε πινάκια πολυεστερυνίου 96 υποδοχών που είχαν προηγουμένως επιστρωθεί με 50 μl 37.5 μg/ml διαλύματος καρβονυλιωμένης ή μη καρβονυλιωμένης λαμινίνης-1 σε PBS και ακολούθησε επώαση στους 370C για 30 λεπτά. Μετά το τέλος της επώασης απομακρύνθηκαν τα κύτταρα που δεν προσκολλήθηκαν στο υπόστρωμα και έγινε μια πλύση με 100 μl αποστειρωμένο διάλυμα ΡΒS (ph 6.0). Ακολούθησε μονιμοποίηση των κυττάρων με 100% αλκοόλη σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά και στη συνέχεια χρώση με υδατικό διάλυμα 0.1% crystal violet σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Στη συνέχεια έγιναν 2 εκπλύσεις με νερό της βρύσης και διαλυτοποίηση των χρωματισμένων κυττάρων με 100 μl 10% Triton-X που περιείχε 1% αιθανόλη. Τέλος, μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα των 96 υποδοχών σε φασματοφωτόμετρο (Stat-Fax-2100-AwarenessTechnology Inc) στα 540 nm. Η τιμή απορρόφησης ήταν αντιπροσωπευτική του αριθμού των μονοκυττάρων που προσκολλήθηκαν στο υπόστρωμα καρβονυλιωμένης και μη καρβονυλιωμένης λαμινίνης. 117

133 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 17. ΜΕΤΑΝΑΣΤΕΥΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΔΙΑΜΕΣΟΥ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 ΚΑΙ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ IV Η ποσοτική εκτίμηση της μεταναστευτικής ικανότητας των μονοκυττάρων διαμέσου υποστρώματος οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης-1 και κολλαγόνου IV έγινε με τη μέθοδο των Pedraza και συν. (2000) με κάποιες τροποποιήσεις. Πιο συγκεκριμένα, η μέτρηση της μεταναστευτικής ικανότητας των μονοκυττάρων έγινε με τη χρήση του Hemacolor kit και στηρίχτηκε στον προσδιορισμό της κατευθυνόμενης κίνησης των μονοκυττάρων από μέσο χωρίς θρεπτικά συστατικά (κατάσταση ασιτίας) σε μέσο με θρεπτικά συστατικά (χημειόταξη). Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκαν πλάκες με υποδοχείς διαμέτρου 6.5 mm (Transwell culture inserts) οι οποίες περιείχαν φίλτρα με πόρους μεγέθους 5μm. Αρχικά τα φίλτρα καλύφθηκαν με 150 μl 20 μg/ml οξειδωμένης ή μη οξειδωμένης λαμινίνης-1 ή με 12 μg/ml οξειδωμένου ή μη οξειδωμένου κολλαγόνου IV σε PBS και έμειναν στους 40C για 24 ώρες. Την επόμενη μέρα έγινε προσεκτική απομάκρυνση του υπερκείμενου με τη βοήθεια πιπέτας και προστέθηκαν 150 μl 0.5% BSA προκειμένου να δεσμευτούν οι μη ειδικές θέσεις σύνδεσης. Μετά από επώαση στους 370C για 1 ώρα έγινε και πάλι προσεκτική απομάκρυνση του υπερκείμενου και στη συνέχεια προσθήκη 500 μl θρεπτικού υλικού (IMDM, 10% FCS) στις υποδοχές της πλάκας κάτω από τα φίλτρα. Παράλληλα, πάνω από τα φίλτρα προστέθηκαν 250 μl εναιωρήματος μονοκυττάρων σε θρεπτικό υλικό IMDM (χωρίς FCS) που περιείχε 2x106 κύτταρα/ml. Ακολούθησε επώαση στους 370C για 30 λεπτά ώστε να πραγματοποιηθεί κατευθυνόμενη μετακίνηση των μονοκυττάρων από το μέσο χωρίς FCS στο αντίστοιχο μέσο με FCS. Στη συνέχεια έγινε απομάκρυνση του υπερκείμενου και αφαίρεση από την πάνω επιφάνεια των φίλτρων των κυττάρων που δεν είχαν μεταναστεύσει, με cotton tips εμβαπτισμένα με PBS. Τα φίλτρα στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με εμβάπτιση σε διαλύματα μονιμοποίησης (Hemacolor staining kit) και αφέθηκαν να στεγνώσουν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 200 μl υδατικού διαλύματος 10% οξικού οξέος στις υποδοχές της πλάκας κάτω από τα φίλτρα προκειμένου να αποκολληθούν τα κύτταρα που είχαν μονιμοποιηθεί στα φίλτρα και ακολούθησε ήπια ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου για 3-4 λεπτά. Τέλος, μετρήθηκε η απορρόφηση του κυτταροδιαλύματος με φασματοφωτόμετρο (Stat-Fax 2100 Awareness Technology) σε μήκος κύματος 118

134 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 570nm. Η τιμή απορρόφησης ήταν αντιπροσωπευτική του αριθμού των μονοκυττάρων που μετανάστευσαν διαμέσου υποστρώματος οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμιίνης. 18. ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΤΗΣ ΑLPHA2 ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ ΤΗΣ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΤΩΝ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Η εκτίμηση των επιπέδων της alpha2 (α2) υπομονάδας της ιντεγκρίνης στην επιφάνεια μονοκυττάρων έγινε με τη χρήση ειδικού φθορίζοντος μονοκλωνικού αντισώματος που ήταν συνδεδεμένο με FITC (anti-cd49b). Εναιώρημα μονοκυττάρων σε θρεπτικό υλικό (IMDM, 10% FCS) που περιείχε 106 κύτταρα/ml επωάστηκαν παρουσία 20mM γλυκόζης ή 50μU/ml ινσουλίνης για 1 ώρα στους 370C. Κάποια δείγματα παράλληλα με τη γλυκόζη και την ινσουλίνη επωάστηκαν και με 20 nm καριποριδίου (αναστολέα του ΝΗΕ-1) ή με 10μM DPI (αναστολέα της NADPH οξειδάσης). Δείγματα στα οποία δεν είχε γίνει προσθήκη κάποιου επαγωγέα ή αναστολέα επωάστηκαν επίσης κάτω από τις ίδιες συνθήκες και χρησιμοποιήθηκαν ως δείγματα ελέγχου. Ακολούθησε προσθήκη 10 μl αραιωμένου 1/50 αντισώματος anti-cd49b σε κάθε δείγμα, επώαση στους 37oC για 10 λεπτά και έπειτα 3 πλύσεις-φυγοκεντρήσεις των κυττάρων στις 1500 rpm για 10 λεπτά. Τα επίπεδα της α2 υπομονάδας της ιντεγκρίνης προσδιορίστηκαν σε φθορισμόμετρο Perkin Elmer LS 50B, ως ο λόγος της τιμής απορρόφησης των δειγμάτων στο μήκου διέγερσης 495 nm προς την απορρόφηση στο μήκος εκπομπής 525 nm της φθορίζουσας ουσίας. Το μέγεθος των τιμών φθορισμού σε κάθε δείγμα ήταν ενδεικτικό του βαθμού έκφρασης της α2 υπομονάδας της ιντεγκρίνης στην επιφάνεια των μονοκυττάρων. 119

135 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 19. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Τα ενδοθηλιακά κύτταρα απομονώθηκαν από ομφάλιους λώρους φυσιολογικών γυναικών που είχαν γεννήσει στη Γ Γυναικολογική-Μαιευτική Κλινική του Ιπποκράτειου Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης. Η απομόνωση και καλλιέργεια των ενδοθηλιακών κυττάρων έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο των Jaffe και συν. (1979) με ορισμένες τροποποιήσεις. Αρχικά, οι λώροι ξεπλύθηκαν εξωτερικά με φυσιολογικό ορό και εσωτερικά με αποστειρωμένο διάλυμα PBS (0.9% NaCl, ph 7.4). Στη συνέχεια, οι φλέβες των ομφάλιων λώρων γεμίστηκαν με θρεπτικό υλικό Earle 199 που περιείχε 0.5 μg/ml κολλαγενάση και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά προκειμένου να αποκολληθούν τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Έπειτα, συλλέχτηκε το περιεχόμενό τους και οι λώροι ξεπλύθηκαν με θρεπτικό υλικό Earle 199 (απουσία κολλαγενάσης). Το θρεπτικό υλικό συλλέχτηκε μαζί με το προηγούμενο έκπλυμα του διαλύματος κολλαγενάσης και φυγοκεντρήθηκε στις στροφές για 10 λεπτά. Ακολούθησε αναδιάλυση του ιζήματος που περιείχε τα ενδοθηλιακά κύτταρα σε 5ml θρεπτικού υλικού Earle 199 που περιείχε 20% FCS, 25mΜ Hepes (ph 7.4), 50 μl πενικιλίνης/στρεπτομυκίνης, 0.25μg/ml φουγκιζόνη, 50μg/ml γενταμυκίνη και 90μg/ml ηπαρίνης και τοποθέτησή τους σε φιάλες κυτταρικής καλλιέργειας των 25 εκατοστών, οι οποίες είχαν ήδη καλυφθεί με 1% διάλυμα ζελατίνης σε PBS. Στο τέλος τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κλίβανο επώασης με παροχή διοξειδίου του άνθρακα CO2 (Automatic CO2 Incubator, Forma Scientific). Αποκόλληση ενδοθηλιακών κυττάρων από φιάλες κυτταρικής καλλιέργειας Μετά την καλλιέργεια των ενδοθηλιακών κυττάρων για 1-2 μέρες σε φιάλες κυτταρικής καλλιέργειας απομακρύνθηκε το θρεπτικό υλικό. Ακολούθησαν 2 πλύσεις με PBS (0.9% NaCl, ph 7.4) και τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με διάλυμα 0.05% τρυψίνης που περιείχε 0.02% EDTA. Πιο συγκεκριμένα, 1.5 ml του παραπάνω διαλύματος τοποθετήθηκαν σε κάθε φιάλη κυτταρικής καλλιέργειας και ακολούθησε επώαση στους 370C για 1 λεπτό. Στη συνέχεια, προστέθηκε θρεπτικό Earle 199 που περιείχε 20% FCS προκειμένου να απενεργοποιηθεί η τρυψίνη και να μην έχει βλαπτικές επιδράσεις στα κύτταρα, το διάλυμα συλλέχτηκε και φυγοκεντρήθηκε στις στροφές για 10 λεπτά. Ακολούθησε αναδιάλυση του ιζήματος σε θρεπτικό υλικό Earle 199 και τα ενδοθηλιακά κύτταρα ήταν έτοιμα για χρήση. 120

136 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Κατάψυξη και απόψυξη ενδοθηλιακών κυττάρων Όταν τα ενδοθηλιακά κύτταρα δε χρησιμοποιήθηκαν άμεσα τότε 0 καταψύχθηκαν και φυλάχτηκαν σε υγρό άζωτο (-196 C). Παράλληλα, πριν από τη χρήση τους έγινε απόψυξή τους. Η διαδικασία κατάψυξης και απόψυξης κυττάρων περιγράφηκε αναλυτικά παραπάνω για τα μονοκύτταρα και ήταν παρόμοια και για τα ενδοθηλιακά κύτταρα (βλ. ενότητα 2.1 και 2.2: Κατάψυξη κυττάρων και φύλαξή τους στο υγρό άζωτο Απόψυξη κυττάρων που είχαν φυλαχτεί στο υγρό άζωτο). 20. ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 Η εκτίμηση του βαθμού προσκόλλησης των ενδοθηλιακών κυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης-1 έγινε με τη χρήση του Hemacolor kit που έχει την ιδιότητα να χρωματίζει το DNA. Σύμφωνα με τη μέθοδο, αρχικά τοποθετήθηκαν 100 μl εναιωρήματος ενδοθηλιακών κυττάρων σε θρεπτικό υλικό (Earle 199, 20% FCS) που περιείχε κύτταρα σε πινάκια πολυεστερυνίου 96 υποδοχών (πλάκα ELISA) που είχαν προηγουμένως επιστρωθεί με 50 μl 37.5 μg/ml διαλύματος οξειδωμένης ή μη οξειδωμένης λαμινίνης-1 σε PBS και ακολουθούσε επώαση για 30 λεπτά στους 370C. Σε κάποιες περιπτώσεις τα ενδοθηλιακά κύτταρα προεπωάστηκαν με το ειδικό αντίσωμα για την α2 υπομονάδα της ιντεγκρίνης και μελετήθηκε στη συνέχεια η προσκόλλησή τους στη λαμινίνη. Η διαδικασία επώασης με το αντίσωμα είναι παρόμοια με αυτή που ακολουθήθηκε και στην περίπτωση των μονοκυττάρων και περιγράφηκε αναλυτικά παραπάνω (βλ. ενότητα 14.2: Επώαση μονοκυττάρων με τα αντισώματα για τις alpha2 (α2), alphal (αl), alpham (αμ) και beta2 (β2) υπομονάδες της ιντεγκρίνης). Η οξείδωση της λαμινίνης έγινε με EDTA, ασκορβικό οξύ και διάλυμα θειικού αμμωνίου με δισθενή σίδηρο, όπως αναλυτικά περιγράφηκε παραπάνω (βλ. ενότητα 14.1: Οξείδωση λαμινίνης-1 και κολλαγόνου IV). Μετά την επώαση απομακρύνθηκαν τα κύτταρα που δεν είχαν προσκολληθεί και ακολούθησε μία πλύση με 100 μl στείρου διαλύματος PBS (ph 6). Κατόπιν, προστέθηκαν διαδοχικά σε κάθε υποδοχή 80 μl άχρωμου διαλύματος μονιμοποίησης (Fixing solution, Microscopy Hemacolor Kit), 80 μl διαλύματος κόκκινου χρώματος (Colour reagent red, Microscopy Hemacolor Kit) και 80 μl διαλύματος μπλε χρώματος Kit), (Colour reagent blue, Microscopy Hemacolor τα οποία απομακρύνθηκαν αμέσως μετά την προσθήκη τους, με απότομη εκτίναξη της πλάκας 121

137 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ELISA. Μετά την απομάκρυνση του τρίτου διαλύματος μπλε χρώματος ακολούθησαν δύο πλύσεις όλων των υποδοχών με 200 μl διαλύματος πλύσης (Wash buffer ph 7.2, Microscopy Hemacolor Kit). Έπειτα, η πλάκα ELISA αφέθηκε να στεγνώσει σε θερμοκρασία δωματίου για λεπτά. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 200 μl υδατικού διαλύματος 10% οξικού οξέος, ακολούθησε αναδιάλυση του περιεχομένου και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου με ήπια ανάδευση για 3-4 λεπτά. Τέλος, μετρήθηκε η οπτική απορρόφηση με φασματοφωτόμετρο μέτρησης ELISA (Stat-Fax 2100 Awareness Technology) σε μήκος κύματος 570nm. Το μέγεθος της τιμής απορρόφησης ήταν ενδεικτικό του ποσού των κυττάρων που προσκολλήθηκαν στο υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΜΟΡΙΟΥ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗΣ ICAM-1 ΣΤΗΝ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΘΕΙ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της έκφρασης του μορίου προσκόλλησης ICAM-1 στην επιφάνεια ενδοθηλιακών κυττάρων που είχαν προσκολληθεί σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης-1 χρησιμοποιήθηκε μια μέθοδος ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) που αποτελούσε παραλλαγή μιας προηγούμενης μεθόδου (Shingu και συν., 1994). Σύμφωνα με τη διαδικασία, 100 μl εναιωρήματος ενδοθηλιακών κυττάρων σε θρεπτικό υλικό (Earle 199, 20% FCS) που περιείχε κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πινάκια πολυεστερυνίου 96 υποδοχών (πλάκα ELISA) που είχαν προηγουμένως επιστρωθεί με 50 μl 37.5 μg/ml διαλύματος οξειδωμένης ή μη οξειδωμένης λαμινίνης-1 σε PBS και ακολούθησε επώαση στους 370C για 24 ώρες. Η οξείδωση της λαμινίνης έγινε με EDTA, ασκορβικό οξύ και διάλυμα θειικού αμμωνίου με δισθενή σίδηρο, όπως αναλυτικά περιγράφηκε παραπάνω (βλ. ενότητα 13.1: Οξείδωση λαμινίνης-1 και κολλαγόνου IV). Την επόμενη μέρα έγινε απομάκρυνση των κυττάρων που δεν είχαν προσκολληθεί και ακολούθησε μια πλύση με 100 μl PBS 1X. Στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε κάθε υποδοχή της πλάκας ELISA 50 μl διαλύματος θρεπτικού υλικού Earle 199 που περιείχε 0.2 μg/υποδοχή μονοκλωνικού αντισώματος για το μόριο προσκόλλησης ICAM-1 (mouse anti-icam-1 MoAb) και ακολούθησε επώαση στους 370C για 1 ώρα. Μετά την επώαση έγιναν 3 πλύσεις με αποστειρωμένο διάλυμα PBS 1X και προστέθηκαν σε κάθε υποδοχή 100 μl διαλύματος θρεπτικού 122

138 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ υλικού Earle 199 που περιείχε αντίσωμα anti-mouse IgG συνδεδεμένο με υπεροξειδάση σε αραίωση 1/ Μετά από επώαση στους 370C για 1 ώρα ακολούθησαν 3 πλύσεις με αποστειρωμένο διάλυμα PBS 1X. Στη συνέχεια προστέθηκαν σε κάθε υποδοχή της πλάκας ELISA 100 μl διαλύματος που περιείχε μια ταμπλέτα 3,3,5,5 -διυδροχλωρικής τετραμεθυλβενζιδίνης (3,3,5,5 - TetraMethylBenzidine dihydrochloride, TMB), και g Na2HPO4, 1.91 g κιτρικού οξέος και 40 μl 30% H2O2 σε τελικό όγκο 200ml (ph 5). Η ταμπλέτα περιείχε όλα τα απαραίτητα υποστρώματα για τη δράση της υπεροξειδάσης με την οποία ήταν συνδεδεμένο το δεύτερο αντίσωμα. Μετά από επώαση στους 370C για 50 λεπτά μετρήθηκε η απορρόφηση με φασματοφωτόμετρο (Stat-Fax 2100 AwarenessTechnology Inc) σε μήκος κύματος 450nm. Το μέγεθος της τιμής απορρόφησης των δειγμάτων ήταν ενδεικτικό του ποσού των υποδοχέων ICAM-1 που εκφράστηκαν από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. 22. ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΘΕΙ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΚΑΙ ΜΗ ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 Η εκτίμηση του βαθμού προσκόλλησης μονοκυττάρων σε ενδοθηλιακά κύτταρα που είχαν προηγουμένως προσκολληθεί σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης έγινε μέσω προσδιορισμού της δραστικότητας του ενζύμου μυελοπεροξειδάση που υπάρχει στα μονοκύτταρα σύμφωνα με τη μέθοδο των Verdegaal και συν. με κάποιες τροποποιήσεις (Verdegaal και συν., 1996). Αρχικά έγινε επίστρωση πινακίων πολυεστερυνίου 96 υποδοχών με 50 μl 37.5 μg/ml διαλύματος οξειδωμένης ή μη οξειδωμένης λαμινίνης σε PBS και παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου να στεγνώσουν για 24 ώρες. Στα πλαίσια του συγκεκριμένου πειράματος η λαμινίνη οξειδώθηκε με ασκορβικό οξύ, όπως περιγράφηκε αναλυτικά παραπάνω (βλ. ενότητα 14.1: Οξείδωση λαμινίνης-1 και κολλαγόνου IV). Στη συνέχεια προστέθηκαν σε κάθε υποδοχή 100 μl εναιωρήματος ενδοθηλιακών κυττάρων σε θρεπτικό υλικό (Earle 199, 20% FCS) που περιείχε κύτταρα και ακολούθησε επώαση στους 370C σε κλίβανο (Automatic CO2 Incubator) για 24 ώρες (overnight) προκειμένου να προσκολληθούν τα κύτταρα στο υπόστρωμα της οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης. Την επόμενη μέρα απομακρύνθηκαν τα κύτταρα που δεν είχαν προσκολληθεί, προστέθηκε εναιώρημα 123

139 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ μονοκυττάρων σε θρεπτικό υλικό (IMDM, 10% FCS) που περιείχε κύτταρα και ακολούθησε ποσοτικός προσδιορισμός της προσκόλλησής τους στα ενδοθηλιακά κύτταρα με τη μέθοδο της μυελοπεροξειδάσης όπως περιγράφηκε αναλυτικά παραπάνω (βλ. ενότητα 13.4: Προσκόλληση μονοκυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη λαμινίνης και κολλαγόνου IV με τη μέθοδο της μυελοπεροξειδάσης (MPO). Θα πρέπει να αναφερθεί πως σε ορισμένες περιπτώσεις, πριν τη μελέτη της προσκόλλησης των μονοκυττάρων σε ενδοθηλιακά κύτταρα, τα μονοκύτταρα προεπωάστηκαν με τα ειδικά αντισώματα για τις αl, αm και β2 υπομονάδες της ιντεγκρίνης όπως περιγράφηκε αναλυτικά παραπάνω (βλ. ενότητα 14.2: Επώαση μονοκυττάρων με τα αντισώματα για τις alpha2 (α2), alphal (αl), alpham (αμ) και beta2 (β2) υπομονάδες της ιντεγκρίνης). 124

140 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 23. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με το στατιστικό πακέτο Graphpad Instat (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Η επεξεργασία τους έγινε με εφαρμογή Student s-t test, unpaired ή paired ανά περίπτωση με όριο σημαντικότητας την τιμή p<0.05. Όταν κρίθηκε απαραίτητο τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με χρήση μη-παραμετρικής στατιστικής μεθόδου (non-parametric statistics, Wilcoxon U-test, P<0.05). Παράλληλα, σε ορισμένες περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκε και η ανάλυση one-way ANOVA (Bonferroni ή Dunnett) με όριο σημαντικότητας την τιμή p<0.05. Πιο συγκεκριμένα, η στατιστική ανάλυση unpaired Student s-t test εφαρμόστηκε στις ακόλουθες περιπτώσεις: Παραγωγή ανιόντων σουπεροξειδίου (Ο2-) από τα μονοκύτταρα παρουσία γλυκόζης και ινσουλίνης Παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) από τα μονοκύτταρα παρουσία γλυκόζης και ινσουλίνης Παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) από τα μονοκύτταρα υγιών δοτών και ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ Καρβονυλίωση λαμινίνης-1 από τα μονοκύτταρα παρουσία γλυκόζης και ινσουλίνης Καρβονυλίωση κολλαγόνου IV από τα μονοκύτταρα παρουσία γλυκόζης και ινσουλίνης Καρβονυλίωση λαμινίνης-1 από τα μονοκύτταρα υγιών δοτών και ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ Μέτρηση δραστικότητας της δισμουτάσης του σουπεροξειδίου (SOD) σε μονοκύτταρα ανθρώπου Μετακίνηση ιόντων ασβεστίου σε μονοκύτταρα με την επίδραση γλυκόζης και ινσουλίνης Προσκόλληση επισημασμένων με 35 S-μεθειονίνη μονοκυττάρων σε μονοκυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης Προσκόλληση επισημασμένων με 35 S-μεθειονίνη διαφορετικού βαθμού οξειδωμένη λαμινίνη-1 και οξειδωμένη BSA Επώαση επισημασμένων με 35S-μεθειονίνη μονοκυττάρων με το αντίσωμα για την alpha2 (α2) υπομονάδα της ιντεγκρίνης και μελέτη της προσκόλλησής τους σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης-1 125

141 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Επώαση μονοκυττάρων με τα αντισώματα για τις alphal (αl), alpham (αm) και beta2 (β2) υπομονάδες της ιντεγκρίνης και μελέτη της προσκόλλησής τους σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης-1 Προσκόλληση μονοκυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένου και μη οξειδωμένου κολλαγόνου IV. Μελέτη του ρόλου της alpha2 υπομονάδας της ιντεγκρίνης. Μετανάστευση μονοκυττάρων διαμέσου υποστρώματος οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης-1 Μετανάστευση μονοκυττάρων διαμέσου υποστρώματος οξειδωμένου και μη οξειδωμένου κολλαγόνου IV Προσκόλληση μονοκυττάρων σε υπόστρωμα καρβονυλιωμένης και μη καρβονυλιωμένης λαμινίνης Εκτίμηση των επιπέδων της alpha2 υπομονάδας της ιντεγκρίνης στην επιφάνεια των μονοκυττάρων έπειτα από επώαση με υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης και ινσουλίνης Προσκόλληση ενδοθηλιακών κυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης-1 Ποσοτικός προσδιορισμός της έκφρασης του μορίου προσκόλλησης ICAM-1 στην επιφάνεια ενδοθηλιακών κυττάρων που είχαν προσκολληθεί σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης-1 Προσκόλληση μονοκυττάρων σε ενδοθηλιακά κύτταρα που είχαν προσκολληθεί σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης-1 Η στατιστική ανάλυση paired Student s-t test εφαρμόστηκε στις ακόλουθες περιπτώσεις: Προσκόλληση επισημασμένων με 35 S-μεθειονίνη μονοκυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης Μετανάστευση μονοκυττάρων διαμέσου υποστρώματος οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης-1 Η μη-παραμετρική στατιστική μέθοδος Wilcoxon U-test εφαρμόστηκε στην περίπτωση μέτρησης της δραστικότητας της NADPH οξειδάσης. 126

142 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Η στατιστική ανάλυση Bonferroni one-way ANOVA εφαρμόστηκε στις ακόλουθες περιπτώσεις: Προσκόλλησης επισημασμένων 35 με S-μεθειονίνη μονοκυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης Προσκόλληση μονοκυττάρων σε ενδοθηλιακά κύτταρα που είχαν προσκολληθεί σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης-1 Σύγκριση του βαθμού καρβονυλίωσης της λαμινίνης-1 που προκαλείται από το σύστημα ασκορβικό οξύ/fe2+ με το βαθμό καρβονυλίωσης που προκαλείται από τα μονοκύτταρα Η στατιστική ανάλυση Dunnett one-way ANOVA εφαρμόστηκε στις ακόλουθες περιπτώσεις: Παραγωγή ανιόντων σουπεροξειδίου (Ο2-) από τα μονοκύτταρα παρουσία γνωστών οξειδωτικών ουσιών Παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) από τα μονοκύτταρα παρουσία γνωστών οξειδωτικών ουσιών Καρβονυλίωση λαμινίνης-1 από τα μονοκύτταρα παρουσία γνωστών οξειδωτικών ουσιών Καρβονυλίωση κολλαγόνου IV από τα μονοκύτταρα παρουσία γνωστών οξειδωτικών ουσιών Μετακίνηση ιόντων ασβεστίου σε μονοκύτταρα με την επίδραση γνωστών οξειδωτικών ουσιών Ποσοτικός προσδιορισμός των αλλαγών του ενδοκυτταρικού ph (phi) σε μονοκύτταρα έπειτα από έκθεσή τους σε οξειδωτικές ουσίες και το αντιοξειδωτικό NAC Προσκόλληση επισημασμένων με 35 S-μεθειονίνη μονοκυττάρων σε διαφορετικού βαθμού οξειδωμένη λαμινίνη-1 και οξειδωμένη BSA Προσκόλληση μονοκυττάρων σε ενδοθηλιακά κύτταρα που είχαν προσκολληθεί σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης-1 Σύγκριση του βαθμού καρβονυλίωσης της λαμινίνης-1 που προκαλείται από το σύστημα ασκορβικό οξύ/fe2+ με το βαθμό καρβονυλίωσης που προκαλείται από τα μονοκύτταρα 127

143 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΟΞΥΓΟΝΟΥ (ROS) ΑΠΟ ΤΑ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΕΠΕΙΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΤΟΥΣ ΣΕ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΑΘΗΡΩΜΑΤΩΣΗ 1.1 Παραγωγή ανιόντων σουπεροξειδίου (Ο2-) από τα μονοκύτταρα παρουσία γλυκόζης, ινσουλίνης και γνωστών οξειδωτικών ουσιών Στα πλαίσια της μελέτης παραγωγής δραστικών μορφών οξυγόνου από τα μονοκύτταρα προσδιορίστηκε αρχικά η παραγωγή ανιόντων σουπεροξειδίου (Ο2-). Η συγκεκριμένη επιλογή έγινε με δεδομένη τη συμμετοχή του Ο2- στο σχηματισμό πλήθους άλλων δραστικών μορφών οξυγόνου, όπως H2O2, OH-, OH. και HNO2(Hermes-Lima και συν., 2001). Προκειμένου να μελετηθεί το σηματοδοτικό μονοπάτι που επάγεται από τις ουσίες γλυκόζη και ινσουλίνη όσον αφορά την παραγωγή Ο2από τα μονοκύτταρα χρησιμοποιήθηκαν παράλληλα και οι αναστολείς γνωστών σηματοδοτικών μορίων, όπως φαίνεται στα αντίστοιχα σχεδιαγράμματα. Ως χρόνος επώασης των μονοκυττάρων με όλους τους παραπάνω αναστολείς των σηματοδοτικών μορίων που μελετήθηκαν ορίστηκαν τα 30 λεπτά, καθώς βρέθηκε ότι στο χρόνο αυτό παρατηρείται η μέγιστη απόκριση των κυττάρων (Koliakos και συν., 2004; Kaloyianni και συν., 2004; Koliakos και συν. 2007). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, τόσο η γλυκόζη (unpaired Student s t-test, p=0.0002) όσο και η ινσουλίνη (unpaired Student s t-test, p=0.0008) αύξησαν σημαντικά την παραγωγή ανιόντων σουπεροξειδίου από τα μονοκύτταρα (Διάγραμμα 1, Διάγραμμα 2). Αντίθετα, η ταυτόχρονη παρουσία της γλυκόζης ή της ινσουλίνης ξεχωριστά με καθέναν από τους αναστολείς του ΝΗΕ-1, της PKC, της NADPH οξειδάσης και της PI3K ανέστειλε την αυξημένη παραγωγή Ο2- από τα μονοκύτταρα. Επίσης διαπιστώθηκε ότι ο ενεργοποιητής της PKC, PMA αύξησε σημαντικά την παραγωγή ανιόντων σουπεροξειδίου από τα μονοκύτταρα (unpaired Student s t-test, p=0.0252) (Διάγραμμα 1). 128

144 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διάγραμμα 1. Συγκέντρωση ανιόντων σουπεροξειδίου (O2-) στα μονοκύτταρα έπειτα από επώασή τους με υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης, παρουσία ή μη αναστολέων γνωστών σηματοδοτικών μορίων, καθώς και του ενεργοποιητή της PKC, PMA για 30 λεπτά. Οι αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν ήταν του ΝΗΕ-1, καριπορίδιο (cariporide), της NADPH οξειδάσης, DPI, όλων των ισομορφών της PKC, GF109203X, των κλασσικών ισομορφών της PKC, Gö6976 και της PI3K, γουορτμαννίνη (wortmannin). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους των τιμών απορρόφησης/mg πρωτεΐνης ± σταθερές απόκλισης (Μ.Ο ± S.D). από τουλάχιστον 10 ανεξάρτητα πειράματα. *υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα ελέγχου, **υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με το δείγμα μονοκυττάρων που επωάστηκαν με γλυκόζη. Control=δείγμα ελέγχου, Glucose=γλυκόζη, Gluc+carip=γλυκόζη+καριπορίδιο, Gluc+Wort= Γλυκόζη+γουορτμαννίνη Figure 1. Superoxide anion (O2-) concentration after treatment with high concentrations of glucose, in the presence or absence of the inhibitors of known signaling molecules, as well as the effector of PKC, PMA for 30 minutes. The inhibitors used were of NHE-1, cariporide, of NADPH oxidase, DPI, of all PKCs, GF109203X, of the classical isoforms of PKCs, Gö6976 and of PI3K, wortmannin. The values represent the means of absorbance values/mg of protein ± standard deviations (means ± S.D) of at least 10 independent experiments. *indicates significant difference with the control value, **indicates significant difference with the value obtained in monocytes after treatment with glucose. Gluc+carip=glucose+cariporide, Gluc+Wort= glucose+wortmannin 129

145 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διάγραμμα 2. Συγκέντρωση ανιόντων σουπεροξειδίου (O2-) στα μονοκύτταρα έπειτα από επώασή τους με υψηλές συγκεντρώσεις ινσουλίνης, παρουσία ή μη αναστολέων γνωστών σηματοδοτικών μορίων για 30 λεπτά. Οι αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν ήταν του ΝΗΕ-1, καριπορίδιο (cariporide), της NADPH οξειδάσης, DPI, όλων των ισομορφών της PKC, GF109203X, των κλασσικών ισομορφών της PKC, Gö6976 και της PI3K, γουορτμαννίνη (wortmannin). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους των τιμών απορρόφησης/mg πρωτεΐνης ± σταθερές απόκλισης (Μ.Ο ± S.D). από τουλάχιστον 10 ανεξάρτητα πειράματα. *υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα ελέγχου, ** υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με το δείγμα μονοκυττάρων που επωάστηκαν με ινσουλίνη. Control=δείγμα ελέγχου, Insulin=ινσουλίνη, Ins+carip=ινσουλίνη+καριπορίδιο, Ins+Wort= Ινσουλίνη+γουορτμαννίνη Figure 2. Superoxide anion (O2-) concentration after treatment with high concentrations of insulin, in the presence or absence of the inhibitors of known signaling molecules for 30 minutes. The inhibitors used were of NHE-1, cariporide, of NADPH oxidase, DPI, of all PKCs, GF109203X, of the classical isoforms of PKCs, Gö6976 and of PI3K, wortmannin. The values represent the means of absorbance values/mg of protein ± standard deviations (means ± S.D) of at least 10 independent experiments. * indicates significant difference with the control value, **indicates significant difference with the value obtained in monocytes after treatment with insulin. Ins+carip=insulin+cariporide, Ins+Wort= insulin+wortmannin Με γνωστή πλέον τη συμμετοχή της NADPH οξειδάσης στην αυξημένη παραγωγή Ο2- από τα μονοκύτταρα παρουσία γλυκόζης και ινσουλίνης, όπως προέκυψε από τα παραπάνω αποτελέσματα, το επόμενο ερώτημα που τέθηκε ήταν αν και άλλες πηγές ROS εμπλέκονται στο παραπάνω φαινόμενο. Για το λόγο αυτό μελετήθηκε η επίδραση του TTFA, που είναι αναστολέας του συμπλέγματος ΙΙ της αναπνευστικής αλυσίδας. Το παραπάνω σύμπλεγμα εμπλέκεται στην παραγωγή ROS, ενώ ο αναστολέας του, TTFA χρησιμοποιείται ευρέως από πλήθος ερευνητών που μελετούν το ρόλο του μιτοχονδρίου στο παραπάνω φαινόμενο (Nishikawa και συν., 2000; Yamagishi και συν., 2001). Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, ως χρόνος επώασης των μονοκυττάρων με όλους τους παραπάνω αναστολείς των 130

146 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ σηματοδοτικών μορίων που μελετήθηκαν ορίστηκαν τα 30 λεπτά, καθώς βρέθηκε ότι στο χρόνο αυτό παρατηρείται η μέγιστη απόκριση των κυττάρων (Koliakos και συν., 2004; Kaloyianni και συν., 2004; Koliakos και συν. 2007). Στην περίπτωση του TTFA χρησιμοποιήθηκαν διάφοροι χρόνοι επώασης (30 λεπτά, 1 ώρα και 3 ώρες) προκειμένου να μελετηθεί η δράση του με την πάροδο του χρόνου. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης ο αναστολέας TTFA προκάλεσε μείωση των O2- στα μονοκύτταρα όταν επωάστηκαν για 1 ή 3 ώρες με τη γλυκόζη, και για 3 ώρες με την ινσουλίνη (Διάγραμμα 3). Διάγραμμα 3. Συγκέντρωση ανιόντων σουπεροξειδίου (O2-) στα μονοκύτταρα έπειτα από επώασή τους με υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης ή ινσουλίνης, παρουσία ή μη του αναστολέα του συμπλέγματος ΙΙ της αναπνευστικής αλυσίδας, TTFA για 30 λεπτά, 1 και 3 ώρες. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους των τιμών απορρόφησης/mg πρωτεΐνης ± σταθερές απόκλισης (Μ.Ο ± S.D). από τουλάχιστον 10 ανεξάρτητα πειράματα. *υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα ελέγχου, **υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με το δείγμα μονοκυττάρων που επωάστηκαν με γλυκόζη, ##υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με το δείγμα μονοκυττάρων που επωάστηκαν με ινσουλίνη. Control=δείγμα ελέγχου, Glucose=γλυκόζη, Insulin=ινσουλίνη, Gluc+TTFA=γλυκόζη+ TTFA, Ins+TTFA=ινσουλίνη+ TTFA Figure 3. Superoxide anion (O2-) concentration after treatment with high concentrations of either glucose or insulin, in the presence or absence of the inhibitor of the respiratory chain complex II, TTFA for 30 minutes, 1 and 3 hours. The values represent the means of absorbance values/mg of protein ± standard deviations (means ± S.D) of at least 10 independent experiments. *indicates significant difference with the control value, **indicates significant difference with the value obtained in monocytes after treatment with glucose, ##indicates significant difference with the value obtained in monocytes after treatment with insulin. 131

147 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Συνοψίζοντας όλα τα παραπάνω αποτελέσματα, φαίνεται ότι η παραγωγή ανιόντων σουπεροξειδίου που επάγεται στα μονοκύτταρα από τη γλυκόζη ή από την ινσουλίνη μεσολαβείται τόσο από την NADPH οξειδάση όσο και από το σύμπλεγμα ΙΙ της αναπνευστικής αλυσίδας. Στις παραπάνω διαδικασίες συμμετέχουν επίσης και άλλα σηματοδοτικά μόρια, όπως ο ΝΗΕ-1, η PKC και η PI3K. Θα πρέπει να αναφερθεί ότι η παραγωγή O2- από τα μονοκύτταρα προσδιορίστηκε και παρουσία όλων των αναστολέων που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη απουσία οποιουδήποτε επαγωγέα προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανή τοξική ή άλλη επίδραση των αναστολέων στο παραπάνω φαινόμενο. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην παραγωγή O2- μεταξύ των δειγμάτων ελέγχου και αυτών παρουσία κάποιου αναστολέα, χωρίς την παρουσία γλυκόζης ή ινσουλίνης. Στα πλαίσια πειραμάτων επιβεβαίωσης του οξειδωτικού ή αντιοξειδωτικού ρόλου ορισμένων ουσιών, τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με τις ουσίες αντιμυκίνη Α, ροτενόνη, πυροσταφυλικό οξύ και NAC και ακολούθως προσδιορίστηκαν τα επίπεδα O2-. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, επώαση των μονοκυττάρων με αντιμυκίνη Α, ροτενόνη και πυροσταφυλικό οξύ είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη παραγωγή O2-, ενώ η επώασή τους με NAC προκάλεσε μείωση της παραγωγής O2- (Dunnett post-test: p=0.034) (Πίνακας 11). 132

148 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Πίνακας 11. Συγκέντρωση ανιόντων σουπεροξειδίου (O2-) στα μονοκύτταρα έπειτα από επώασή τους με τις οξειδωτικές ουσίες αντιμυκίνη Α για 30 λεπτά, ροτενόνη για 1 ώρα και πυροσταφυλικό οξύ για 2 ώρες καθώς και την αντιοξειδωτική ουσία NAC για 15 ώρες. Οι τιμές εκφράζονται ως % του δείγματος ελέγχου, του οποίου η οπτική απορρόφηση ανά mg πρωτεΐνης ήταν 0.596± Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± σταθερές απόκλισης (Μ.Ο ± S.D). από τουλάχιστον 10 ανεξάρτητα πειράματα. aυποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα ελέγχου. Table 11. Superoxide anion (.O2-) concentration in monocytes after treatment with the oxidants antimycin A for 30 minutes, rotenone for 1 hour and pyruvate acid for 2 hours as well as the antioxidant NAC for 15 hours. Values are expressed as % of control sample, whose optical density per mg of protein was 0.596± Values are means ± SD of at least 10 independent experiments. a indicates significant difference with the control value. % δείγματος ελέγχου 1.2 Δείγμα ελέγχου 100±17.7 Αντιμυκίνη A 25 μμ ±23.27a Αντιμυκίνη A 100 μμ 519.3±390.1a Ροτενόνη 25 μμ ±572.4a Ροτενόνη 100 μμ ±69.79a Πυροσταφυλικό οξύ 1mM ±121.37a NAC 2 mm 1.9±2.01a NAC 10 mm 14.42±6.87a Παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) από τα μονοκύτταρα παρουσία γλυκόζης, ινσουλίνης και γνωστών οξειδωτικών ουσιών Στα πλαίσια της μελέτης παραγωγής δραστικών μορφών οξυγόνου από τα μονοκύτταρα παρουσία παραγόντων που σχετίζονται με την αθηρωμάτωση, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) σε μονοκύτταρα έπειτα από επώασή τους με υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης ή ινσουλίνης με τη χρήση της ουσίας DCFH-DA. Σε μια προσπάθεια να μελετηθεί το σηματοδοτικό μονοπάτι που επάγεται από τις ουσίες γλυκόζη και ινσουλίνη όσον αφορά την παραγωγή Η2Ο2 από τα μονοκύτταρα χρησιμοποιήθηκαν και οι αναστολείς γνωστών σηματοδοτικών μορίων, όπως και προηγουμένως. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης τόσο η γλυκόζη (unpaired Student s t-test, p<0.0001) όσο και η ινσουλίνη (unpaired Student s t-test, p<0.0001) αύξησαν σημαντικά την παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου από τα μονοκύτταρα (Διάγραμμα 4, Διάγραμμα 5). Αντίθετα, η ταυτόχρονη παρουσία της γλυκόζης ή της ινσουλίνης ξεχωριστά με καθέναν από τους αναστολείς της NADPH οξειδάσης, των κλασσικών ισομορφών της PKC και της PI3K ανέστειλε την αυξημένη παραγωγή Η2Ο2 από τα μονοκύτταρα. 133

149 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Χαρακτηριστικό εύρημα της παρούσας μελέτης είναι ότι παρουσία του αναστολέα του ΝΗΕ-1 ταυτόχρονα είτε με γλυκόζη είτε με ινσουλίνη, παρατηρήθηκε περαιτέρω αύξηση των επιπέδων Η2Ο2 στα μονοκύτταρα σε σχέση με την απουσία του (unpaired Student s t-test, p gluc/gluc+carip=0.0002; pins/ins+carip<0.0001). Αντίστοιχα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και στην περίπτωση που τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με τον αναστολέα όλων των ισομορφών της PKC μαζί με γλυκόζη ή ινσουλίνη (unpaired Student s t-test, p gluc/gluc+carip=0.0011; pins/ins+carip=0.05) (Διάγραμμα 4, Διάγραμμα 5). Παράλληλα διαπιστώθηκε ότι ο ενεργοποιητής της PKC, PMA αύξησε σημαντικά την παραγωγή ανιόντων σουπεροξειδίου από τα μονοκύτταρα (unpaired Student s t-test, p=0.006) (Διάγραμμα 4). Διάγραμμα 4. Συγκέντρωση υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) στα μονοκύτταρα έπειτα από επώασή τους με υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης, παρουσία ή μη αναστολέων γνωστών σηματοδοτικών μορίων, καθώς και του ενεργοποιητή της PKC, PMA για 30 λεπτά. Οι αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν ήταν του ΝΗΕ-1, καριπορίδιο (cariporide), της NADPH οξειδάσης, DPI, όλων των ισομορφών της PKC, GF109203X, των κλασσικών ισομορφών της PKC, Gö6976 και της PI3K, γουορτμαννίνη (wortmannin). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους των τιμών φθορισμού ± σταθερές απόκλισης (Μ.Ο ± S.D). από τουλάχιστον 10 ανεξάρτητα πειράματα. *υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα ελέγχου, **υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με το δείγμα μονοκυττάρων που επωάστηκαν με γλυκόζη, ***υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά τόσο με τα κύτταρα ελέγχου όσο και με το δείγμα μονοκυττάρων που επωάστηκαν με γλυκόζη. Control=δείγμα ελέγχου, Glucose=γλυκόζη, Gluc+carip=γλυκόζη+καριπορίδιο, Gluc+Wort= Γλυκόζη+γουορτμαννίνη Figure 4. Hydrogen peroxide (Η2Ο2) concentration after treatment with high concentrations of glucose, in the presence or absence of the inhibitors of known signaling molecules, as well as the effector of PKC, PMA for 30 minutes. The inhibitors used were of NHE-1, cariporide, of NADPH oxidase, DPI, of all PKCs, GF109203X, of the classical isoforms of PKCs, Gö6976 and of PI3K, wortmannin. The values represent the means of fluorescence values ± standard deviations (means ± S.D) of at least 10 independent experiments. *indicates significant difference with the control value, **indicates significant difference with the value obtained in monocytes after treatment with glucose, *** indicates significant difference with both the control and the glucose value. Gluc+carip=glucose+cariporide, Gluc+Wort= glucose+wortmannin 134

150 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διάγραμμα 5. Συγκέντρωση υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) στα μονοκύτταρα έπειτα από επώασή τους με υψηλές συγκεντρώσεις ινσουλίνης, παρουσία ή μη αναστολέων γνωστών σηματοδοτικών μορίων για 30 λεπτά. Οι αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν ήταν του ΝΗΕ-1, καριπορίδιο (cariporide), της NADPH οξειδάσης, DPI, όλων των ισομορφών της PKC, GF109203X, των κλασσικών ισομορφών της PKC, Gö6976 και της PI3K, γουορτμαννίνη (wortmannin). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους των τιμών φθορισμού± σταθερές απόκλισης (Μ.Ο ± S.D). από τουλάχιστον 10 ανεξάρτητα πειράματα. *υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα ελέγχου, **υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με το δείγμα μονοκυττάρων που επωάστηκαν με ινσουλίνη, ***υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά τόσο με τα κύτταρα ελέγχου όσο και με το δείγμα μονοκυττάρων που επωάστηκαν με ινσουλίνη. Control=δείγμα ελέγχου, Insulin=ινσουλίνη, Ins+carip=ινσουλίνη+καριπορίδιο, Ins+Wort= Ινσουλίνη+γουορτμαννίνη Figure 5. Hydrogen peroxide (Η2Ο2) concentration after treatment with high concentrations of insulin, in the presence or absence of the inhibitors of known signaling molecules for 30 minutes. The inhibitors used were of NHE-1, cariporide, of NADPH oxidase, DPI, of all PKCs, GF109203X, of the classical isoforms of PKCs, Gö6976 and of PI3K, wortmannin. The values represent the means of fluorescence values±standard deviations (means ± S.D) of at least 10 independent experiments. * indicates significant difference with the control value, **indicates significant difference with the value obtained in monocytes after treatment with insulin, ***indicates significant difference with both the control and the insulin value. Ins+carip=insulin+cariporide, Ins+Wort= insulin+wortmannin Με βάση τα προηγούμενα αποτελέσματα έχουμε ενδείξεις ότι η NADPH οξειδάση εμπλέκεται στην αυξημένη παραγωγή Η2Ο2 από τα μονοκύτταρα έπειτα από επώασή τους με γλυκόζη ή ινσουλίνη. Το ερώτημα που τέθηκε στη συνέχεια είναι αν και άλλες πηγές ROS εμπλέκονται στο παραπάνω φαινόμενο. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης ο αναστολέας TTFA προκάλεσε μείωση των επιπέδων Η2Ο2 στα μονοκύτταρα μόνο όταν επωάστηκαν για 3 ώρες είτε με τη γλυκόζη είτε με την ινσουλίνη (Διάγραμμα 6). 135

151 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διάγραμμα 6. Συγκέντρωση υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) στα μονοκύτταρα έπειτα από επώασή τους με υψηλές συγκεντρώσεις ινσουλίνης, παρουσία ή μη του αναστολέα του συμπλέγματος ΙΙ της αναπνευστικής αλυσίδας, TTFA για 30 λεπτά, 1 και 3 ώρες.. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους των τιμών φθορισμού ± σταθερές απόκλισης (Μ.Ο ± S.D). από τουλάχιστον 10 ανεξάρτητα πειράματα. *υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα ελέγχου, ** υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με το δείγμα μονοκυττάρων που επωάστηκαν με γλυκόζη, ##υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με το δείγμα μονοκυττάρων που επωάστηκαν με ινσουλίνη. Control=δείγμα ελέγχου, Glucose=γλυκόζη, Insulin=ινσουλίνη, Gluc+TTFA=γλυκόζη+ TTFA, Ins+TTFA=ινσουλίνη+ TTFA Figure 6. Hydrogen peroxide (Η2Ο2) concentration after treatment with high concentrations of either glucose or insulin, in the presence or absence of the inhibitor of the respiratory chan complex II, TTFA for 30 minutes, 1 and 3 hours. The values represent the means of fluorescence values±standard deviations (means ± S.D) of at least 10 independent experiments. *indicates significant difference with the control value, **indicates significant difference with the value obtained in monocytes after treatment with glucose, ##indicates significant difference with the value obtained in monocytes after treatment with insulin Στα πλαίσια πειραμάτων επιβεβαίωσης του οξειδωτικού ή αντιοξειδωτικού ρόλου ορισμένων ουσιών και σε αυτή την περίπτωση τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με τις ουσίες αντιμυκίνη Α, ροτενόνη, πυροσταφυλικό οξύ και τα αποτελέσματα έδειξαν αυξημένη παραγωγή Η2Ο2, ενώ η επώασή τους με NAC προκάλεσε μείωση της παραγωγής Η2Ο2 (Dunnett post-test: p=0.0024) (Πίνακας 12). 136

152 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Πίνακας 12. Συγκέντρωση υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) στα μονοκύτταρα έπειτα από επώασή τους με τις οξειδωτικές ουσίες αντιμυκίνη Αγια 30 λεπτά, ροτενόνη και πυροσταφυλικό οξύ καθώς και την αντιοξειδωτική ουσία NAC. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους των τιμών φθορισμού ± a σταθερές απόκλισης (Μ.Ο ± S.D) από τουλάχιστον 10 ανεξάρτητα πειράματα. υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα ελέγχου. Table 12. Hydrogen peroxide (Η2Ο2) concentration in monocytes after treatment with the oxidants antimycin A for 30 minutes, rotenone for 1 hour and pyruvate acid for 2 hours and the antioxidant NAC for 15 hours. Values labeled with a, indicate significant difference with the control value. Values are means of fluorescence values± SD of at least 10 independent experiments. Φθορισμός (EX 495nm/EM 525nm) 1.3 Δείγμα ελέγχου (Control) 6,64±0.61 Αντιμυκίνη A 25 μμ 9,866±1.64a Αντιμυκίνη A 100 μμ 84,501±1.637a Ροτενόνη 25 μμ 10,370±0.04a Ροτενόνη 100 μμ 77,754±13.174a Πυροσταφυλικό οξύ 1mM 10,288±0.21a NAC 2 mm 5,284±0.424a Παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) από τα μονοκύτταρα υγιών δοτών και ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ Στα πλαίσια της μελέτης παραγωγής δραστικών μορφών οξυγόνου σε μονοκύτταρα έπειτα από έκθεσή τους σε αθηρογόνους παράγοντες και με δεδομένη τη συσχέτιση του σακχαρώδη διαβήτη με την αθηρωμάτωση (Panzer και συν., 2005), προσδιορίστηκαν στη συνέχεια τα ενδοκυτταρικά επίπεδα των ανιόντων σουπεροξειδίου και υπεροξειδίου του υδρογόνου σε μονοκύτταρα που προήλθαν είτε από υγιείς δότες είτε από ασθενείς που έπασχαν από σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, τα μονοκύτταρα που προήλθαν από ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ παρήγαν αυξημένα ποσά τόσο O2- (unpaired Student s ttest, p=0.0006) όσο και H2O2 (unpaired Student s t-test, p<0.0001) σε σχέση με τα αντίστοιχα που προήλθαν από υγιείς εθελοντές (Διάγραμμα 7). 137

153 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διάγραμμα 7. Συγκέντρωση δραστικών μορφών οξυγόνου στα μονοκύτταρα που προήλθαν από υγιείς εθελοντές και ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ. Οι συγκεντρώσεις εκφράζονται ως % του δείγματος ελέγχου και οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± σταθερές απόκλισης (Μ.Ο ± S.D). από τουλάχιστον 10 ανεξάρτητα πειράματα. *υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα ελέγχου στην περίπτωση που προσδιορίζονταν τα επίπεδα ανιόντων σουπεροξειδίου, # υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα ελέγχου στην περίπτωση που προσδιορίζονταν τα επίπεδα υπεροξειδίου του υδρογόνου. Figure 7. Reactive oxygen species (ROS) concentration in monocytes derived from healthy volunteers and diabetic patients type II. Concentrations are expressed as % of control sample and values represent the means % of control±standard deviations (means ± S.D) of at least 10 independent experiments. * represents significant difference with the value obtained in control monocytes when superoxide anions were measured #represents significant difference with the value obtained in control monocytes when hydrogen peroxide was measured. 138

154 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 2. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 ΚΑΙ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ IV ΑΠΟ ΣΑΡΚΩΜΑ Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Η λαμινίνη-1 και το κολλαγόνο IV απομονώθηκαν από σάρκωμα EngelbrethHolm-Swarm (EHS) και κατόπιν προσδιορίστηκε η καθαρότητα αραιωμένων δειγμάτων των πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση (Εικόνα 28, Εικόνα 29). Εικόνα 28. Προσδιορισμός καθαρότητας δειγμάτων λαμινίνης-1 που απομονώθηκε από σάρκωμα Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) με ηλεκτροφόρηση σε συσκευή Pharmacia LKB-Phastsystem. Οι στήλες αντιπροσωπεύουν δείγματα λαμινίνης διαφορετικής αραίωσης (1, 1/2, 1/5, 1/10). Figure 28. Estimation of purity of laminin-1 that was isolated from Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tumour, with electrophoresis in a Pharmacia LKB-Phastsystem device. The columns represent different laminin-1 sample dilutions (1, 1/2, 1/5, 1/10). 139

155 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Εικόνα 29. Προσδιορισμός καθαρότητας δειγμάτων κολλαγόνου IV που απομονώθηκε από σάρκωμα Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) με ηλεκτροφόρηση σε συσκευή Pharmacia LKB-Phastsystem. Οι στήλες αντιπροσωπεύουν δείγματα κολλαγόνου διαφορετικής αραίωσης (1/2, 1, 1/5). Figure 29. Estimation of purity of collagen IV that was isolated from Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tumour, with electrophoresis in a Pharmacia LKB-Phastsystem device. The columns represent different collagen IV sample dilutions (1/2, 1, 1/5). 140

156 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3. ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΚΑΡΒΟΝΥΛΙΩΣΗΣ ΤΗΣ ΛΑΜΙΝΙΝΗΣ-1 ΑΠΟ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Στα πλαίσια της μελέτης των αλληλεπιδράσεων των μονοκυττάρων με πρωτεΐνες των βασικών μεμβρανών εξετάστηκε η ικανότητα των μονοκυττάρων να καρβονυλιώνουν την κυριότερη πρωτεΐνη των βασικών μεμβρανών, τη λαμινίνη. Η επιβεβαίωση της καρβονυλίωσης έγινε αρχικά με ηλεκτροφόρηση ή με ανοσοαποτύπωση (dot blot) με τη χρήση της ουσίας 2, 4 δινιτροφαινυλ-υδραζίνη (DNPH) που συνδέεται σε καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα τα μονοκύτταρα που προήλθαν από φυσιολογικά άτομα είχαν την ικανότητα να καρβονυλιώνουν τη λαμινίνη-1. Μάλιστα είναι χαρακτηριστικό ότι όταν τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με υψηλές συγκεντρώσεις είτε γλυκόζης είτε ινσουλίνης, ο βαθμός καρβονυλίωσης της λαμινίνης-1 αυξήθηκε σημαντικά (Εικόνα 30, Εικόνα 31). Εικόνα 30. Επίδραση της γλυκόζης ή της ινσουλίνης στην καρβονυλίωσης της λαμινίνης-1 από μονοκύτταρα που προήλθαν από υγιείς δότες με τη χρήση 2, 4 δινιτροφαινυλ-υδραζίνης (DNPH) (SDS-ηλεκτροφόρηση). Σε ορισμένα δείγματα δεν προστέθηκε DNPH (no DNPH) προκειμένου να χρησιμοποιηθούν ως αρνητικά δείγματα ελέγχου. Control=δείγμα ελέγχου, glucose=γλυκόζη. insulin= ινσουλίνη, control (no DNPH)= αρνητικό δείγμα ελέγχου (απουσία DNPH) Figure 30. Effect of either glucose or insulin to laminin-1 carbonylation from monocytes derived from healthy volunteers with the use of 2, 4 dinitrophenyl-hydrazine (DNPH) (SDS-electrophoresis). In some samples no DNPH was added in order to be used as negative controls. control (no DNPH)= negative control (absence of DNPH) 141

157 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Εικόνα 31. Επίδραση της γλυκόζης ή της ινσουλίνης στην καρβονυλίωσης της λαμινίνης-1 από μονοκύτταρα που προήλθαν από υγιείς δότες με τη χρήση 2, 4 δινιτροφαινυλ-υδραζίνης (DNPH) (dot blot). Σε ορισμένα δείγματα δεν προστέθηκε DNPH (no DNPH) προκειμένου να χρησιμοποιηθούν ως αρνητικά δείγματα ελέγχου. Control=δείγμα ελέγχου, LMN (no DNPH)= μονοκύτταρα που επωάστηκαν με λαμινίνη απουσία DNPH (αρνητικό δείγμα ελέγχου), Insulin= ινσουλίνη, Glucose=γλυκόζη. Figure 31. Effect of either glucose or insulin to laminin-1 carbonylation from monocytes derived from healthy volunteers with the use of 2, 4 dinitrophenyl-hydrazine (DNPH) (dot blot). In some samples no DNPH was added in order to be used as negative controls. LMN (no DNPH) = monocytes incubated with laminin in the absence of DNPH (negative control) 142

158 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4. ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΚΑΡΒΟΝΥΛΙΩΣΗΣ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ ΑΠΟ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΑΘΗΡΩΜΑΤΩΣΗ Φασματομετρική μέθοδος για τον προσδιορισμό καρβονυλικών ομάδων (Colorimetric carbonyl assay) Προκειμένου να γίνει εκτίμηση των επιπέδων καρβονυλίου έγινε αρχικά ποσοτικός προσδιορισμός καρβονυλικών ομάδων σε πρότυπα δείγματα οξειδωμένης και ανηγμένης αλβουμίνης και κατασκευάστηκε πρότυπη καμπύλη, όπως αναλυτικά περιγράφεται παραπάνω (βλ. Υλικά και Μέθοδοι, ενότητα 8.4: Φασματομετρική μέθοδος για τον προσδιορισμό καρβονυλικών ομάδων (Colorimetric carbonyl assay). Η καμπύλη που προέκυψε ήταν η: y=0.074x , με R2= και σύμφωνα με αυτή προσδιορίστηκαν τα επίπεδα καρβονυλίου των δειγμάτων λαμινίνης-1 και κολλαγόνου IV. y = 0.074x R2 = A 450 nm carbonyl nmol/mg Διάγραμμα 8. Κατασκευή πρότυπης καμπύλης BSA με χρήση δειγμάτων διαφορετικού βαθμού οξείδωσης (0%-100%) για τον προσδιορισμό των καρβονυλικών ομάδων σε άγνωστα δείγματα λαμινίνης-1 και κολλαγόνου IV. Figure 8. Calibration curve of BSA with the use of samples with different degree of oxidation for the estimation of carbonyl groups in laminin-1 and collagen IV samples. 143

159 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4.1 Καρβονυλίωση λαμινίνης-1 από τα μονοκύτταρα παρουσία γλυκόζης, ινσουλίνης και γνωστών οξειδωτικών ουσιών Μετά τον ποιοτικό προσδιορισμό της καρβονυλίωσης της λαμινίνης-1 από τα μονοκύτταρα ακολούθησε και ποσοτική εκτίμηση του βαθμού καρβονυλίωσης της λαμινίνης-1 από τα μονοκύτταρα με τη χρήση μιας μεθόδου ELISA που πρωτοεφαρμόστηκε στο εργαστήριό μας (Alamdari και συν., 2005). Σύμφωνα με τα εξαγόμενα αποτελέσματα και σε συμφωνία με τα παραπάνω, ο βαθμός καρβονυλίωσης της λαμινίνης-1 βρέθηκε να είναι μεγαλύτερος στην περίπτωση που τα μονοκύτταρα επωάστηκαν είτε με γλυκόζη (unpaired Student s t-test, p<0.0001) είτε με ινσουλίνη (unpaired Student s t-test, p=0.0014) σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (Διάγραμμα 9, Διάγραμμα 10). Επίσης, η ταυτόχρονη παρουσία των αναστολέων του ΝΗΕ-1, της PKC, της NADPH οξειδάσης και της ΡΙ3Κ με τη γλυκόζη ή με την ινσουλίνη, ανέστειλε την αυξημένη οξείδωση (καρβονυλίωση) της λαμινίνης-1. Παράλληλα βρέθηκε ότι παρουσία του ενεργοποιητή της PKC, ΡΜΑ, τα μονοκύτταρα καρβονυλίωσαν περισσότερο τη λαμινίνη σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (unpaired Student s t-test, p=0.0246) (Διάγραμμα 9). Θα πρέπει να αναφερθεί πως η επαγόμενη από τα μονοκύτταρα καρβονυλίωση της λαμινίνης-1 προσδιορίστηκε και παρουσία των παραπάνω αναστολέων, απουσία οποιουδήποτε ενεργοποιητή-επαγωγέα και βρέθηκε ότι δεν υπάρχει διαφορά αυτών με τα δείγματα ελέγχου. 144

160 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διάγραμμα 9. Ποσοτικός προσδιορισμός του βαθμού καρβονυλίωσης της λαμινίνης-1 από τα μονοκύτταρα έπειτα από επώασή τους με υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης, παρουσία ή μη αναστολέων γνωστών σηματοδοτικών μορίων, καθώς και του ενεργοποιητή της PKC, PMA για 30 λεπτά. Οι αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν ήταν του ΝΗΕ-1, καριπορίδιο (cariporide), της NADPH οξειδάσης, DPI, όλων των ισομορφών της PKC, GF109203X, των κλασσικών ισομορφών της PKC, Gö6976 και της PI3K, γουορτμαννίνη (wortmannin). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους καρβονυλίων ± σταθερές απόκλισης (Μ.Ο ± S.D). από τουλάχιστον 10 ανεξάρτητα πειράματα. * υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα ελέγχου, **υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με το δείγμα μονοκυττάρων που επωάστηκαν με γλυκόζη. Control=δείγμα ελέγχου, Glucose=γλυκόζη, Gluc+carip=γλυκόζη+καριπορίδιο, Gluc+Wort= Γλυκόζη+γουορτμαννίνη Figure 9. Estimation of laminin-1 carbonylation by monocytes after treatment with high concentrations of glucose, in the presence or absence of the inhibitors of known signaling molecules, as well as the effector of PKC, PMA for 30 minutes. The inhibitors used were of NHE-1, cariporide, of NADPH oxidase, DPI, of all PKCs, GF109203X, of the classical isoforms of PKCs, Gö6976 and of PI3K, wortmannin. The values represent the means of carbonyls ± standard deviations (means ± S.D) of at least 10 independent experiments. *indicates significant difference with the control value, **indicates significant difference with the value obtained in monocytes after treatment with glucose. Gluc+carip=glucose+cariporide, Gluc+Wort= glucose+wortmannin 145

161 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διάγραμμα 10. Ποσοτικός προσδιορισμός του βαθμού καρβονυλίωσης της λαμινίνης-1 από τα μονοκύτταρα έπειτα από επώασή τους με υψηλές συγκεντρώσεις ινσουλίνης, παρουσία ή μη αναστολέων γνωστών σηματοδοτικών μορίων για 30 λεπτά. Οι αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν ήταν του ΝΗΕ-1, καριπορίδιο (cariporide), της NADPH οξειδάσης, DPI, όλων των ισομορφών της PKC, GF109203X, των κλασσικών ισομορφών της PKC, Gö6976 και της PI3K, γουορτμαννίνη (wortmannin). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους καρβονυλίων ± σταθερές απόκλισης (Μ.Ο ± S.D). από τουλάχιστον 10 ανεξάρτητα πειράματα. *υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα ελέγχου, **υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με το δείγμα μονοκυττάρων που επωάστηκαν με ινσουλίνη. Control=δείγμα ελέγχου, Insulin=ινσουλίνη, Ins+carip=ινσουλίνη+καριπορίδιο, Ins+Wort= Ινσουλίνη+γουορτμαννίνη Figure 10. Estimation of laminin-1 carbonylation by monocytes after treatment with high concentrations of insulin, in the presence or absence of the inhibitors of known signaling molecules for 30 minutes. The inhibitors used were of NHE-1, cariporide, of NADPH oxidase, DPI, of all PKCs, GF109203X, of the classical isoforms of PKCs, Gö6976 and of PI3K, wortmannin. The values represent the means of carbonyls ± standard deviations (means ± S.D) of at least 10 independent experiments. *indicates significant difference with the control value, **indicates significant difference with the value obtained in monocytes after treatment with insulin Ins+carip=insulin+cariporide, Ins+Wort= insulin+wortmannin Σε μια προσπάθεια να διερευνηθεί αν η καρβονυλίωση της λαμινίνης οφείλεται στην απευθείας οξείδωση των αλυσίδων της από δραστικές μορφές οξυγόνου, τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με λαμινίνη παρουσία των οξειδωτικών αντιμυκίνη Α, ροτενόνη και πυροσταφυλικό οξύ και του αντιοξειδωτικού NAC. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, ο βαθμός καρβονυλίωσης της λαμινίνης-1 ήταν μεγαλύτερος στην περίπτωση που τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με τα οξειδωτικά που χρησιμοποιήθηκαν σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. Σε αντίθεση με τα οξειδωτικά, επώαση των μονοκυττάρων με το αντιοξειδωτικό NAC είχε ως αποτέλεσμα μείωση του βαθμού καρβονυλίωσης της λαμινίνης-1 (Dunnett post-test: p<0.0001) (Διάγραμμα 11). 146

162 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διάγραμμα 11. Ποσοτικός προσδιορισμός του βαθμού καρβονυλίωσης της λαμινίνης-1 από τα μονοκύτταρα έπειτα από επώασή τους με τις οξειδωτικές ουσίες αντιμυκίνη Α για 30 λεπτά, ροτενόνη για 1 ώρα και πυροσταφυλικό οξύ για 2 ώρες καθώς και την αντιοξειδωτική ουσία NAC για 15 ώρες. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους καρβονυλίων ± σταθερές απόκλισης (Μ.Ο ± S.D). από τουλάχιστον 10 ανεξάρτητα πειράματα. *υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα ελέγχου, **υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα που επωάστηκαν με 25 μm αντιμυκίνη Α, # υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά τόσο με τα κύτταρα ελέγχου όσο και με τα κύτταρα που επωάστηκαν με τις οξειδωτικές ουσίες αντιμυκίνη Α, ροτενόνη και πυροσταφυλικό οξύ. Figure 11. Estimation of laminin-1 carbonylation by monocytes after treatment with the oxidants antimycin A for 30 minutes, rotenone for 1 hour and pyruvate acid for 2 hours and the antioxidant NAC for 15 hours. Values are means of carbonyls ± SD of at least 10 independent experiments. Values labeled with *indicate significant difference with the control value, **indicates significant difference with the cells that were incubated with 25 μm antimycin A, # indicates significant difference with both the control value and the value from cells that were incubated with the oxidants antimycin A, rotenone and pyruvate acid. 4.2 Καρβονυλίωση κολλαγόνου IV από τα μονοκύτταρα παρουσία γλυκόζης, ινσουλίνης και γνωστών οξειδωτικών ουσιών Μετά τη λαμινίνη-1 μελετήθηκε η ικανότητα των μονοκυττάρων που προήλθαν από υγιείς δότες να καρβονυλιώνουν μια ακόμη πρωτεΐνη των βασικών μεμβρανών, το κολλαγόνο IV. Τα αποτελέσματα είναι ανάλογα με τα αντίστοιχα που προέκυψαν από τη χρήση της λαμινίνης-1. Πιο συγκεκριμένα, ο βαθμός καρβονυλίωσης του κολλαγόνου IV βρέθηκε να είναι μεγαλύτερος στην περίπτωση που τα μονοκύτταρα επωάστηκαν είτε με γλυκόζη (unpaired Student s t-test, p=0.0001) είτε με ινσουλίνη (unpaired Student s t-test, p<0,0001) σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (Διάγραμμα 12, Διάγραμμα 13). Ταυτόχρονη παρουσία των αναστολέων του ΝΗΕ-1, της PKC, της NADPH οξειδάσης και της ΡΙ3Κ με τη 147

163 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ γλυκόζη ή με την ινσουλίνη, ανέστειλε την αυξημένη οξείδωση (καρβονυλίωση) του κολλαγόνου IV. Παράλληλα βρέθηκε ότι παρουσία του ενεργοποιητή της PKC, ΡΜΑ, τα μονοκύτταρα καρβονυλίωσαν περισσότερο το κολλαγόνο IV σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (unpaired Student s t-test, p=0.0031) (Διάγραμμα 12). Και σε αυτή την περίπτωση η επαγόμενη από τα μονοκύτταρα καρβονυλίωση του κολλαγόνου IV προσδιορίστηκε παρουσία όλων των παραπάνω αναστολέων, απουσία οποιουδήποτε ενεργοποιητή και βρέθηκε ότι δεν υπάρχει διαφορά αυτών με τα δείγματα ελέγχου. Διάγραμμα 12. Ποσοτικός προσδιορισμός του βαθμού καρβονυλίωσης του κολλαγόνου IV από τα μονοκύτταρα έπειτα από επώασή τους με υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης, παρουσία ή μη αναστολέων γνωστών σηματοδοτικών μορίων, καθώς και του ενεργοποιητή της PKC, PMA για 30 λεπτά. Οι αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν ήταν του ΝΗΕ-1, καριπορίδιο (cariporide), της NADPH οξειδάσης, DPI, όλων των ισομορφών της PKC, GF109203X, των κλασσικών ισομορφών της PKC, Gö6976 και της PI3K, γουορτμαννίνη (wortmannin). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους καρβονυλίων ± σταθερές απόκλισης (Μ.Ο ± S.D). από τουλάχιστον 10 ανεξάρτητα πειράματα. * υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα ελέγχου, **υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με το δείγμα μονοκυττάρων που επωάστηκαν με γλυκόζη. Control=δείγμα ελέγχου, Glucose=γλυκόζη, Gluc+carip=γλυκόζη+καριπορίδιο, Gluc+Wort= Γλυκόζη+γουορτμαννίνη Figure 12. Estimation of collagen IV carbonylation by monocytes after treatment with high concentrations of glucose, in the presence or absence of the inhibitors of known signaling molecules, as well as the effector of PKC, PMA for 30 minutes. The inhibitors used were of NHE-1, cariporide, of NADPH oxidase, DPI, of all PKCs, GF109203X, of the classical isoforms of PKCs, Gö6976 and of PI3K, wortmannin. The values represent the means of carbonyls ±standard deviations (means ± S.D) of at least 10 independent experiments. *indicates significant difference with the control value, **indicates significant difference with the value obtained in monocytes after treatment with glucose. Gluc+carip=glucose+cariporide, Gluc+Wort= glucose+wortmannin 148

164 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διάγραμμα 13. Ποσοτικός προσδιορισμός του βαθμού καρβονυλίωσης του κολλαγόνου IV από τα μονοκύτταρα έπειτα από επώασή τους με υψηλές συγκεντρώσεις ινσουλίνης, παρουσία ή μη αναστολέων γνωστών σηματοδοτικών μορίων για 30 λεπτά. Οι αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν ήταν του ΝΗΕ-1, καριπορίδιο (cariporide), της NADPH οξειδάσης, DPI, όλων των ισομορφών της PKC, GF109203X, των κλασσικών ισομορφών της PKC, Gö6976 και της PI3K, γουορτμαννίνη (wortmannin). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους καρβονυλίων ± σταθερές απόκλισης (Μ.Ο ± S.D). από τουλάχιστον 10 ανεξάρτητα πειράματα. *υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα ελέγχου, **υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με το δείγμα μονοκυττάρων που επωάστηκαν με ινσουλίνη. Control=δείγμα ελέγχου, Insulin=ινσουλίνη, Ins+carip=ινσουλίνη+καριπορίδιο, Ins+Wort= Ινσουλίνη+γουορτμαννίνη Figure 13. Estimation of collagen IV carbonylation by monocytes after treatment with high concentrations of insulin, in the presence or absence of the inhibitors of known signaling molecules for 30 minutes. The inhibitors used were of NHE-1, cariporide, of NADPH oxidase, DPI, of all PKCs, GF109203X, of the classical isoforms of PKCs, Gö6976 and of PI3K, wortmannin. The values represent the means of carbonyls ±standard deviations (means ± S.D) of at least 10 independent experiments. *indicates significant difference with the control value, **indicates significant difference with the value obtained in monocytes after treatment with insulin. Ins+carip=insulin+cariporide, Ins+Wort= insulin+wortmannin Στη συνέχεια, όπως και στην περίπτωση της λαμινίνης, τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με διάλυμα κολλαγόνου IV παρουσία των οξειδωτικών αντιμυκίνη Α, ροτενόνη και πυροσταφυλικό οξύ και του αντιοξειδωτικού NAC και προσδιορίστηκε ο βαθμός καρβονυλίωσης του κολλαγόνου. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, ο βαθμός καρβονυλίωσης του κολλαγόνου IV ήταν μεγαλύτερος στην περίπτωση που τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με τα οξειδωτικά που χρησιμοποιήθηκαν σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. Σε αντίθεση, επώαση των μονοκυττάρων με το αντιοξειδωτικό NAC είχε ως αποτέλεσμα μείωση του βαθμού καρβονυλίωσης του κολλαγόνου IV σε σχέση τόσο με τα κύτταρα ελέγχου, όσο και με αυτά που επωάστηκαν με κάποια οξειδωτική ουσία (Dunnett post-test: p<0,0001) (Διάγραμμα 14). 149

165 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διάγραμμα 14. Ποσοτικός προσδιορισμός του βαθμού καρβονυλίωσης του κολλαγόνου IV από τα μονοκύτταρα έπειτα από επώασή τους με τις οξειδωτικές ουσίες αντιμυκίνη Α για 30 λεπτά, ροτενόνη για 1 ώρα και πυροσταφυλικό οξύ για 2 ώρες καθώς και την αντιοξειδωτική ουσία NAC για 15 ώρες. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους καρβονυλίων ± σταθερές απόκλισης (Μ.Ο ± S.D). από τουλάχιστον 10 ανεξάρτητα πειράματα. *υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα ελέγχου, **υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά με τα κύτταρα ελέγχου και τα κύτταρα που επωάστηκαν με 25 μm αντιμυκίνη Α, # υποδηλώνει σημαντική στατιστική διαφορά τόσο με τα κύτταρα ελέγχου όσο και με τα κύτταρα που επωάστηκαν με τις οξειδωτικές ουσίες αντιμυκίνη Α, ροτενόνη και πυροσταφυλικό οξύ. Figure 14. Estimation of collagen IV carbonylation by monocytes after treatment with the oxidants antimycin A for 30 minutes, rotenone for 1 hour and pyruvate acid for 2 hours and the antioxidant NAC for 15 hours. Values are means of carbonyls ± SD of at least 10 independent experiments. Values labeled with *indicate significant difference with the control value, **indicates significant difference with both the control value and the value from cells that were incubated with 25 μm antimycin A, # indicates significant difference with both the control value and the value from cells that were incubated with the oxidants antimycin A, rotenone and pyruvate acid. 4.3 Καρβονυλίωση λαμινίνης-1 από τα μονοκύτταρα υγιών δοτών και ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ Στα πλαίσια της μελέτης της καρβονυλίωσης της λαμινίνης-1 από μονοκύτταρα έπειτα από επίδραση παραγόντων που σχετίζονται με την αθηρωμάτωση, μελετήθηκε η ικανότητα μονοκυττάρων που προήλθαν από ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ να καρβονυλιώνουν τη λαμινίνη-1. Σύμφωνα με τα εξαγόμενα αποτελέσματα τα μονοκύτταρα που προήλθαν από διαβητικούς ασθενείς τύπου ΙΙ καρβονυλίωσαν τη λαμινίνη-1 σε μεγαλύτερο βαθμό σε σχέση με αυτά που προ από υγιείς δότες (unpaired Student s t-test, p=0.031) (Διάγραμμα 15). 150