ΤΟ ΠΑΡΑ ΕΙΓΜΑ ΤΗΣ ΧΡΗΣΗΣ ΜΥΚΗΤΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΝ ΑΠΟ ΑΝΩΤΕΡΑ ΦΥΤΑ ΚΑΙ ΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ

Transcript

1 ΤΟ ΠΑΡΑ ΕΙΓΜΑ ΤΗΣ ΧΡΗΣΗΣ ΜΥΚΗΤΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΝ ΑΠΟ ΑΝΩΤΕΡΑ ΦΥΤΑ ΚΑΙ ΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ Β. Σοφιανοπούλου Ινστιτούτο Βιολογίας, ΕΚΕΦΕ

2 Βιολογικά συστήµατα µελέτης διαµεµβρανικών µεταφορέων 1. Saccharomyces cerevisiae 2. ωοκύτταρα Χenopus 3. in vitro συστήµατα (καλλιέργειες κυττάρων από έντοµα ή τον άνθρωπο) 4. Αspergillus nidulans?

3 Aspergillus nidulans µη παθογόνος ευκαρυωτικός µικροοργανισµός πρότυπο σύστηµα µελέτης πολλαπλών κυτταρικών λειτουργιών µικρός χρόνος ανάπτυξης σε απλά και φθηνά θρεπτικά µέσα σχετικά υψηλή αποδοτικότητα µετασχηµατισµού και δυνατότητα αποµόνωσης σταθερά µετασχηµατισµένων στελεχών, διαθεσιµότητα µεγάλου αριθµού µεταλλαγµένων στελεχών γνωστή και διαθέσιµη η αλληλουχία γονιδιώµατος (2.7χ10 7 bp) φυλετικό, αγενή και παραφυλετικό κύκλο ανάπτυξης ευκολία µελέτης συγκεκριµένων µεταφορέων µε απλές δοκιµασίες ανάπτυξης και µετρήσεις πρόσληψης ραδιοσηµασµένων µεταβολιτών σε καθορισµένο γενετικό υπόβαθρο

4 Η µελέτη των µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων είναι πρωταρχικής φυσιολογικής, κλινικής, φαρµακολογικής και αγροτικής σπουδαιότητας

5 Μεταφορείς πουρινών του Aspergillus nidulans UapA: υψηλής συγγένειας, υψηλής µεταφορικής ικανότητας υπεύθυνος για τη µεταφορά των οξειδωµένων πουρινών (ουρικό οξύ και ξανθίνη) UapC: υψηλής συγγένειας, µέσης/χαµηλής µεταφορικής ικανότητας γενικός µεταφορέας πουρινών και αναλόγων τους ΑzgA: υψηλής συγγένειας, υψηλής µεταφορικής ικανότητας µεταφορέας αδενίνης, γουανίνης και υποξανθίνης UapA και UapC: 62% ταύτιση αµινοξικής αλληλουχίας

6

7

8

9

10

11 ΝΑΤ ΜΕΤΑΦΟΡΕΙΣ ΣΤΑ ΦΥΤΑ 13 φυτικά γονίδια 1 παράλογο από το ice plant (Mesembryanthenum crystallium) 11 παράλογα από την Arabidopsis 30 EST κλώνοι (ρύζι, ντοµάτα, σόγια κλπ) LPE1 (Leaf permease1) από το καλαµπόκι

12 Γενετικός µετασχηµατισµός του στελέχους ACZ (uapa - uapc - azga - argb-) µε κατάλληλο φορέα έκφρασης (pan-lpe1) SstI uapa promoter NcoI XbaI uapa terminator SalI/XhoI KpnI Φορέας έκφρασης pan-lpe1 5 και 3 ρυθµιστικές περιοχές του γονιδίου uapa το γονίδιο argb που κωδικοποιεί το ένζυµο ornithine carbamoyl transferase που εµπλέκεται στο µονοπάτι βιοσύνθεσης της αργινίνης cdna lpe1 κλώνο 1.6kb 5 UapA 3 UapA ArgB LPE1 NcoI-BamHI XbaI CCATGGATCCCGTGAAGGCCGAG//AGGTACTTCCCCTCGCTCTAGTCTAGA Fusion protein M D P V K A E //R Y F P S L * LPE1 M P P V K A E //R Y F P S L * ACZ: αυξότροφο για την αργινίνη πλήρη απώλεια λειτουργίας των ενδογενών µεταφορέων πουρινών µη ανάπτυξη σε ΜΜ παρουσία διαφορετικών πουρινών ως µοναδικές πηγές αζώτου

13 Γενετικές µελέτες µετασχηµατισµένων στελεχών ACZ:pAN-Lpe1 urea NH 4 + Τα µετασχηµατισµένα µε τις φυτικές αλληλουχίες στελέχη αναπτύσσονται µε διαφορετικό ρυθµό σε ουρικό οξύ και ξανθίνη αλλά όχι παρουσία υποξανθίνης, αδενίνης ή γουανιδίνης ως µοναδικές πηγές αζώτου proline uric acid Τα στελέχη LP2 και LP5 αναπτύσσονται έχοντας συµπαγή µορφολογία ανάλογη του στελέχους φυσικού τύπου και του στελέχους που εκφράζει το µεταφορέα UapA Tα στελέχη LP4 και LP6 δεν έχουν συµπαγή µορφολογία και παρουσιάζουν µειωµένο ρυθµό ανάπτυξης και σε πηγές αζώτου διαφορετικές των πουρινών uapa - uapa + LP5 LP6 LP2 LP4

14 η ικανότητα ανάπτυξης των lpe1-µετασχηµατισµένων στελεχών σε ουρικό οξύ ή ξανθίνη οφείλεται στην ενσωµάτωση των φυτικών αλληλουχιών στο γονιδίωµα του µύκητα και την έκφρασή τους ο ρυθµός ανάπτυξης εξαρτάται από τη θέση ενσωµάτωσης των φυτικών αλληλουχιών και τον αριθµό των αντιγράφων τους, ο οποίος καθορίζει τα επίπεδα έκφρασης της αλληλουχίας lpe1

15 Βιοχηµικά Χαρακτηριστικά Μεταφορέα LPΕ1 ρυθµός πρόσληψης ξαν θίν ης ρυθµός πρόσληψης ξανθίνης (pmol min κο νίδια) 0,3 0,2 0, συγκέντρωση υποστρώµατος (µμ) K m = 30 µμ ±2.5µΜ 1/[V] (1/pmol min κο νιδιο σ π ό ρια) Γράφ ηµα Lineweaver-Burk y = 141,83x + 4, ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 V max = 0.22 pmol min κονιδιοσπόρια 1/[S] (1/µΜ)

16 % πρόσληψης 3 Η-ξανθίνης Προσδιορισµός της Ειδίκευσης της πρωτεΐνης LPE1 1. Πειράµατα ανταγωνισµού πρόσληψης 10µΜ 3 Η-ξανθίνης παρουσία 300µΜ µη ραδιοσηµασµένου ανταγωνιστή UapA LPE1 0 καφεΐνη ουρακίλη κυτοσίνη θυµίνη γουανίνη αδενίνη υποξανθίνη ουρικό οξύ ξανθίνη

17 % πρόσληψης 3 Η-ξανθίνης 2. Πειράµατα ανταγωνισµού πρόσληψης 10µΜ 3 Η-ξανθίνης παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων ασκορβικού οξέος 100 UapA LPE mM 90mM 75mM 45mM 10mM 5mM 0.3mM 35mM 22.5mM 20mM L-ασκορβικό οξύ 0.3mΜ ξανθίνη

18 το Ασκορβικό Οξύ Προσδένεται Εξειδικευµένα στο Μεταφορέα LPE LP2 % πρόσληψης 3 H-προλίνης 0 10 mm 5 mm 0.3 mm προλίνη 20 mm 35 mm 45 mm L-ασκορβικό οξύ

19 ΝΑΤ ΜΕΤΑΦΟΡΕΙΣ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ (ΜΕΤΑΦΟΡΕΙΣ ΑΣΚΟΡΒΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ) hsvct1, hsvct2 (human Sodium-dependent Vitamin C Transporters) hsvct1(yslp3): νεφρός, έντερο, ήπαρ (Km=233,8 µμ) hsvct2 (YSLP2): στους περισσότερους από τους ιστούς που έχουν µελετηθεί (Km=22,6 µμ)

20 Γενετικός µετασχηµατισµός του στελέχους ACZ (uapa - uapc - azga - argb - ) µε κατάλληλο φορέα έκφρασης (pns335/svct2/argb) SstI uapa promoter NcoI XbaI uapa terminator SalI/XhoI KpnI 5 UapA 3 UapA ArgB SVCT2/SVCT1 NcoI / BamHI XbaI φορέας pns335/svct2/argb

21 o A. nidulans µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως σύστηµα ετερόλογης έκφρασης και µελετών σχέσεων δοµής/λειτουργίας µεταφορέων ασκορβικού οξέος της οικογένειας ΝΑΤ από τα θηλαστικά

22 Βιβλιογραφία: 1. G. Diallinas, J. Valdez, V. Sophianopoulou, A. Rosa and C. Scazzocchio, Chimeric purine transportersof Aspergillus nidulans define a domain critical for function and specificity conserved in bacteria, plant and metazoan homologues. EMBO J. 17 (14): E. Argyrou, V. Sophianopoulou, N. Schultes and G. Diallinas, Functional characterization of a maize purine transporter by expression in Aspergillus nidulans. Plant Cell 13 (4): G. Diallinas and V. Sophianopoulou, Nucleobase transporters as a novel tool in molecular pharmacology. Rev. Clin. Pharmacokinetics, International Edition 16: 33-35