ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 1 Ε.1 ΚΑΡΚΙΝΟΣ...

Transcript

1

2

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 1 Ε.1 ΚΑΡΚΙΝΟΣ... 1 Ε.1.1 ΑΠΟΚΤΗΣΗ ΑΥΤΟ-ΕΠΑΡΚΕΙΑΣ ΣΕ ΜΗΝΥΜΑΤΑ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΑΥΞΗΣΗΣ...2 Ε.1.2 ΑΠΩΛΕΙΑ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ ΣΕ ΑΝΤΙΜΙΤΟΓΟΝΑ ΜΗΝΥΜΑΤΑ...3 Ε.1.3 ΑΠΟΚΤΗΣΗ ΑΝΤΙΣΤΑΣΗΣ ΣΤΗΝ ΑΠΟΠΤΩΣΗ...3 Ε.1.4 ΑΠΟΚΤΗΣΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΑΝΕΞΕΛΕΓΚΤΟΥ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ...4 Ε.1.5 ΕΠΑΓΩΓΗ ΤΗΣ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗΣ...5 Ε.1.6 ΑΠΟΚΤΗΣΗ ΤΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΔΙΕΙΣΔΥΣΗΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΣΤΑΣΗΣ...6 Ε.2 ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΠΡΟΣΤΑΤΗ... 8 Ε.2.1 ΔΟΜΗ ΤΟΥ ΠΡΟΣΤΑΤΗ...8 Ε.2.2 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ ΠΡΟΣΤΑΤΗ...10 Ε.2.3 ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΚΑΙ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΟΥ ΠΡΟΣΤΑΤΗ...10 Ε Ρύθμιση μέσω ενδοκρινών παραγόντων...11 Ε Ρύθμιση μέσω αυξητικών παραγόντων...13 Ε.2.4 ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΠΡΟΣΤΑΤΗ...16 Ε.2.5 ΜΟΝΤΕΛΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΠΡΟΣΤΑΤΗ...16 Ε.3 HARP (HEPARIN AFFIN REGULATORY PEPTIDE)...19 Ε.3.1 ΔΟΜΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΗΣ HARP...20 Ε.3.2 ΔΟΜΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ...23 Ε.3.3 ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ HARP...24 Ε.3.4 ΙΣΤΟΕΙΔΙΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ HARP...25 Ε.3.5 ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΔΡΑΣΕΙΣ ΤΗΣ HARP...26 Ε HARP και διαφοροποίηση...26 Ε Μιτογόνος δράση της HARP...27 Ε HARP και αγγειογένεση...28 Ε HARP και καρκινογένεση...29 Ε.3.6 ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΕΝΕΡΓΕΣ ΠΕΡΙΟΧΕΣ ΤΗΣ HARP...31 Ε.3.7 Η HARP ΩΣ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΟΣ ΚΑΡΚΙΝΙΚΟΣ ΔΕΙΚΤΗΣ...33 Ε.3.8 Η HARP ΩΣ ΜΟΡΙΟ-ΣΤΟΧΟΣ ΣΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ...34 Ε.3.9 ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΗΣ HARP ΚΑΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΣΗΜΑΤΟΣ...35 Ε Πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης (heparan sulfate proteoglycans HSPGs)...36 Ε RPTPβ/ζ (Receptor-like Protein-Tyrosine Phosphatase)...37 Ε ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase)...39 Ε.3.10 ΜΟΡΙΑ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ...42 Ε Src...42 Ε FAK...44 Ε ΑKT...45 Ε PTEN...46 Ε ERK1/ ΣΚΟΠΟΣ...51 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ...53 M.1 ΑΝΑΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ...53 Μ.2 ΜΕΤΡΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩN ΣΕ ΑΙΜΟΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΟ NEUBAUER...55 M.3 ΠΑΡΟΔΙΚΗ ΔΙΑΜΟΛΥΝΣΗ DU145ΚΑΙ PC3 ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΠΑΡΕΜΒΑΛΟΜΕΝΟ RNA...56 Μ.4 ΣΤΑΘΕΡΗ ΔΙΑΜΟΛΥΝΣΗ DU145 ΚΑΙ PC3 ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΠΑΡΕΜΒΑΛΟΜΕΝΟ RNA (SHRNA)...58 M.5 ΣΤΑΘΕΡΗ ΔΙΑΜΟΛΥΝΣΗ DU145 ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΠΑΡΕΜΒΑΛΟΜΕΝΟ RNA (ANTISENSE RNA)...60 M.6 ΚΑΤΑΨΥΞΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ...62 Μ.7 ΑΠΟΨΥΞΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ...63 Μ.8 ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΡΙΘΜΟΥ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΟΥ ΚΡΥΣΤΑΛΛΙΚΟΥ ΙΩΔΟΣ (CRYSTAL VIOLET)...64 Μ.9 ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΗΝ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ...65 Μ.10 ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΗ ΜΕΤΑΝΑΣΤΕΥΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ...67 Μ.11 ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΑΠΟΙΚΙΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡ (SOFT AGAR)...68 M.12 IN VIVO ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΗΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ ΤΗΣ ΧΟΡΙΟΑΛΛΑΝΤΟΙΔΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΕΜΒΡΥΟΥ ΟΡΝΙΘΑΣ (CAM)...69 Μ.13 ΣΥΝΕΣΤΙΑΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ...70

4 Μ.14 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ HARP ΑΠΟ ΤΟ ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΜΕΣΟ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ...72 Μ.15 ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΑΠΟ ΚΥΤΤΑΡΑ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ...73 Μ.16 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΣΕ ΔΙΑΛΥΜΑ...73 Μ.17 ΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΜΕ ΣΦΑΙΡΙΔΙΑ...74 Μ.18 ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΗΝ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΜΟΡΙΩΝ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ...76 Μ.19 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΟΛΙΚΟΥ ΑΚΑΤΕΡΓΑΣΤΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ...76 Μ.20 ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ ΣΕ ΑΠΟΔΙΑΤΑΚΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ (SDS- PAGE)...77 M.21 ΧΡΩΣΗ ΠΗΚΤΩΜΑΤΟΣ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ...80 Μ.22 ΑΝΑΛΥΣΗ WESTERN...81 M.23 ΕΝΦΑΝΙΣΗ ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΟΜΑΤΩΝ...84 Μ.24 ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΟΜΑΤΩΝ...84 Μ.25 ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΕΠΑΝΑΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΟΜΑΤΩΝ...85 Μ.26 ΖΥΜΟΓΡΑΦΗΜΑ...86 Μ.27 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΟΛΙΚΟΥ RNA ΑΠΟ ΚΥΤΤΑΡΑ...87 Μ.28 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ RNA...89 Μ.29 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΝΟΥΚΛΕΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ...89 Μ.30 ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΗΣ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΚΑΙ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (RT-PCR)...91 M.31 ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ SHRNA ΣΤΟΝ ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΚΟ ΦΟΡΕΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ SHRNA PSILENCER 4.1 CMV NEO...93 M.32 ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΚΤΙΚΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ (COMPETENT CELLS)...96 M.33 ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΔΕΚΤΙΚΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ...97 Μ.34 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΥΓΡΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ...98 Μ.35 ΜΙΚΡΗΣ ΚΛΙΜΑΚΑΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΥ DNA (MINIPREP)...99 M.36 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ DNA...99 M.37 ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΕΨΗΣ ΜΕ ΕΝΖΥΜΑ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ Μ.38 ΠΕΠΤΙΔΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ Μ.39 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ AΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Α.1 ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΤΗΣ HARP, RPTPΒ/Ζ ΚΑΙ ALK, ΣΤΑ DU145 ΚΑΙ PC3 ΚΥΤΤΑΡΑ Α.2 ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ DU145 ΚΑΙ PC3 ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΟΥ ΣΤΑΘΕΡΑ ΕΧΟΥΝ ΜΕΙΩΜΕΝΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ RPTPΒ/Ζ ΚΑΙ PC3 ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΟΥ ΣΤΑΘΕΡΑ ΕΧΟΥΝ ΜΕΙΩΜΕΝΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ALK Α.2.1 Παροδική μείωση της έκφρασης των υποδοχέων στα DU145 και PC3 κύτταρα με χρήση sirna Α.2.2 Κατασκευή πλασμιδιακού φορέα έκφρασης shrna Α.2.3 Σταθερή μείωση της έκφρασης των υποδοχέων στα DU145 και PC3 κύτταρα με χρήση shrna Α.2.4 Δημιουργία DU145 κυττάρων που σταθερά έχουν μειωμένη έκφραση της HARP Α.3 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ HARP ΣΤΗΝ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΤΩΝ DU145, DU145-RM6, PC3, PC3-RM1 ΚΑΙ PC3- AM2 ΚΥΤΤΑΡΩΝ Α.4 Η ΜΕΙΩΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ RPTPΒ/Ζ ΕΠΑΓΕΙ ΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΩΝ Α.5 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ HARP ΣΤΗ ΜΕΤΑΝΑΣΤΕΥΣΗ ΤΩΝ DU145, DU145-RM6, PC3, PC3-RM1 ΚΑΙ PC3- AM2 ΚΥΤΤΑΡΩΝ Α.6 Η ΜΕΙΩΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ RPTPΒ/Ζ ΕΠΑΓΕΙ ΕΜΤ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟ Α.7 Η HARP ΕΠΗΡΕΑΖΕΙ ΤΗ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ SRC Α.8 Η HARP ΕΠΗΡΕΑΖΕΙ ΤΗ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ FAK Α.9 Η HARP ΕΠΗΡΕΑΖΕΙ ΤΗ ΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ AKT Α.10 Η HARP ΕΠΗΡΕΑΖΕΙ ΤΗ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΩΝ ERK1/ Α.11 ΤΟ P( ) ΚΑΤΑΣΤΕΛΛΕΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΙΚΟ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Α.12 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ P( ) ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗ ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΤΟ ΦΟΡΤΙΟ ΤΟΥ Α.13 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ P( ) ΜΕ ΤΟΝ RPTPΒ/Ζ Α.14 ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΥ ΜΕΣΩ ΤΟΥ ΟΠΟΙΟΥ ΤΟ P( ) ΑΣΚΕΙ ΤΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΟΥ ΔΡΑΣΕΙΣ...125

5 Α.15 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ P( ) ΣΤΗΝ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ SRC, FAK, ERK1/2 ΚΑΙ ΤΗΣ ΦΩΣΦΑΤΑΣΗΣ PTEN Α.16 Η ΜΕΙΩΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ HARP ΕΠΗΡΕΑΖΕΙ ΤΗ ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΣΗΜΑΤΟΣ ΤΟΥ P( ) Α.17 Η ΜΕΙΩΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ RPTPΒ/Ζ ΕΠΗΡΕΑΖΕΙ ΤΗ ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΣΗΜΑΤΟΣ ΤΟΥ P( ) Α.18 ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΔΡΑΣΕΩΝ ΤΩΝ ΠΕΠΤΙΔΙΩΝ P(13-39) ΚΑΙ P(65-97) Α.19 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΠΕΠΤΙΔΙΩΝ P(13-39) ΚΑΙ P(65-97) ΣΤΗΝ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ ΤΩΝ PC3-RM1 ΚΑΙ PC3- AM2 ΚΥΤΤΑΡΩΝ Α.20 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΠΕΠΤΙΔΙΩΝ P(13-39) ΚΑΙ P(65-97) ΣΤΗ ΜΕΤΑΝΑΣΤΕΥΣΗ ΤΩΝ PC3-AM2 ΚΥΤΤΑΡΩΝ Α.21 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΕΡΙΟΧΩΝ ΤΗΣ HARP ΠΟΥ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΟΥΝ ΜΕ ΤΟΝ RPTPΒ/Ζ ΚΑΙ ALK ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... I ABSTRACT... III

6 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

7 Εισαγωγή Ε.1 ΚΑΡΚΙΝΟΣ Ο καρκίνος είναι μια ασθένεια που χαρακτηρίζεται από αλλαγές στο γονιδίωμα των κυττάρων. Εξαιτίας των γενετικών αυτών αλλαγών, τα καρκινικά κύτταρα αποκτούν την ικανότητα του ανεξέλεγκτου πολλαπλασιασμού, δημιουργώντας ένα συμπαγή όγκο, ενώ κάποια από αυτά αποκτούν και την ικανότητα να αποσπώνται και μέσω της κυκλοφορίας του αίματος ή της λέμφου να μεταφέρονται σε άλλους ιστούς και όργανα, διαδικασία γνωστή ως μετάσταση. Πιο αναλυτικά, ο καρκίνος ξεκινά όταν ένα κύτταρο υποστεί μια μεταλλαγή που το διεγείρει να πολλαπλασιασθεί. Το κύτταρο αυτό και τα θυγατρικά του φαίνονται μεν φυσιολογικά, αλλά επειδή πολλαπλασιάζονται ανεξέλεγκτα, δημιουργούν μια μάζα κυττάρων γνωστή ως υπερπλασία. Στη συνέχεια ένα από αυτά τα κύτταρα μπορεί να υποστεί μια δεύτερη μεταλλαγή που επίσης επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Οι απόγονοι αυτού του κυττάρου εμφανίζουν ανωμαλίες στη μορφή και στον προσανατολισμό τους, δημιουργώντας μία κατάσταση που είναι γνωστή ως δυσπλασία. Μια τρίτη μεταλλαγή σε ένα από αυτά τα κύτταρα οδηγεί σε μια ανώμαλη αύξηση και εμφάνιση του όγκου, η οποία όμως δεν διαπερνά τους υποκείμενους ιστούς, κατάσταση γνωστή ως in situ καρκίνωμα. Στη συνέχεια όμως τα κύτταρα μπορεί να υποστούν και άλλες μεταλλαγές που να επάγουν τη διείσδυση σε υποκείμενους ιστούς και τη μετάστασή τους. Στην περίπτωση αυτή ο όγκος χαρακτηρίζεται κακοήθης. Με δεδομένο ότι μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί 100 διαφορετικοί τύποι καρκίνου και ότι κάθε όργανο μπορεί να αναπτύξει διαφορετικές μορφές καρκίνου, συνειδητοποιούμε την πολυπλοκότητα αυτής της ασθένειας. Ωστόσο, είναι γενικά αποδεκτό ότι έξι βασικές αλλαγές στη φυσιολογία του κυττάρου οδηγούν στην ανάπτυξη οποιουδήποτε τύπου καρκίνου. Αυτές είναι: Απόκτηση αυτο-επάρκειας σε μηνύματα κυτταρικής αύξησης (growth signals) Απώλεια απόκρισης σε αντιμιτογόνα μηνύματα Απόκτηση αντίστασης στην απόπτωση Απόκτηση της ικανότητας ανεξέλεγκτου πολλαπλασιασμού Απόκτηση της ικανότητας επαγωγής της αγγειογένεσης Απόκτηση της ικανότητας διείσδυσης και μετάστασης 1

8 Εισαγωγή Ε.1.1 Απόκτηση αυτο-επάρκειας σε μηνύματα κυτταρικής αύξησης Για τη φυσιολογική ανάπτυξη των κυττάρων απαιτούνται μηνύματα κυτταρικής αύξησης τα οποία μεταφέρουν την πληροφορία μετά την αλληλεπίδρασή τους με διαμεμβρανικούς υποδοχείς. Αυτά τα μόρια μπορούμε να τα διακρίνουμε σε αυξητικούς παράγοντες, σε μόρια της εξωκυττάριας ύλης και σε μόρια διακυτταρικών συνδέσεων/αλληλεπιδάρασεων. Μέχρι σήμερα δεν είναι γνωστό κανένα είδος κυττάρου που να μπορεί να πολλαπλασιασθεί απουσία τέτοιων μηνυμάτων. Αυτός είναι και ο λόγος για τον οποίο η ανάπτυξη φυσιολογικών κυττάρων σε καλλιέργεια εξαρτάται από την εξωγενή προσθήκη αυξητικών παραγόντων και μορίων της εξωκυττάριας ύλης, σε αντίθεση με την καλλιέργεια των καρκινικών κυττάρων τα οποία παράγουν τα δικά τους μηνύματα. Η απόκτηση αυτό-επάρκειας σε μηνύματα κυτταρικής αύξησης έχει ως αποτέλεσμα την απεξάρτηση των καρκινικών κυττάρων από το μικροπεριβάλλον και τη διατάραξη της ομοιόστασης του ιστού. Η ενεργοποίηση ογκογονιδίων οδηγεί στη μετάβαση από τον παρακρινή τρόπο δράσης των αυξητικών παραγόντων που κατά κανόνα παρατηρείται στα φυσιολογικά κύτταρα, στον αυτοκρινή τρόπο δράσης που παρατηρείται στα καρκινικά κύτταρα. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η παραγωγή του PDGF και του TGFα στην περίπτωση γλοιοβλαστώματος ή σαρκωμάτων (Fedi et al., 1997). Ένας άλλος τρόπος απόκτησης αυτο-επάρκειας σε μηνύματα κυτταρικής αύξησης είναι αλλαγές σε διαμεμβρανικούς υποδοχείς αυξητικών παραγόντων. Αυτές οι αλλαγές μπορεί να οδηγήσουν σε υπερέκφραση των υποδοχέων με αποτέλεσμα την απόκριση σε αυξητικούς παράγοντες που βρίσκονται σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις ή σε αλλαγές στη δομή τους που τους επιτρέπουν την ενεργοποίησή τους απουσία προσδέματος. Είναι γνωστό ότι σε περιπτώσεις καρκίνου του στομάχου και του μαστού έχει παρατηρηθεί υπερέκφραση του υποδοχέα του EGF (EGFR/erbB) (Slamon et al., 1987), ενώ έχει βρεθεί και μια τροποποιημένη του μορφή που ενεργοποιείται απουσία προσδέματος (Fedi et al., 1997). Τα καρκινικά κύτταρα μπορούν επίσης να αλλάξουν το είδος των ιντεγκρινών που εκφράζουν, ευνοώντας αυτές που μετάγουν σήματα επιβίωσης (Lukashev and Werb, 1998). Επιπλέον αλλαγές στα μόρια μεταγωγής σήματος που ενεργοποιούνται από υποδοχείς αυξητικών παραγόντων ή από ιντεγκρίνες, οδηγούν σε απόκτηση αυτο-επάρκειας σε μηνύματα κυτταρικής αύξησης. Το 25% όλων των τύπων καρκίνου έχουν μεταλλαγμένη την πρωτεΐνη Ras, ενώ στην περίπτωση του καρκίνου του παχέως εντέρου το ποσοστό αυτό ανεβαίνει στο 50%, με το άλλο 50% να είναι πρωτεΐνες που ενεργοποιούν τη Ras (Kinzler et al., 1996). 2

9 Εισαγωγή Ε.1.2 Απώλεια απόκρισης σε αντιμιτογόνα μηνύματα Για τη διατήρηση της ομοιόστασης ενός ιστού είναι απαραίτητη η δράση διαφόρων αντιμιτογόνων μηνυμάτων, τα οποία βρίσκονται σε διαλυτή μορφή ή προσδεμένα στην εξωκυττάρια ύλη και στην επιφάνεια των κυττάρων. Παρόμοια με τους αυξητικούς παράγοντες, δρουν μετά από αλληλεπίδραση με διαμεμβρανικούς υποδοχείς, ρυθμίζοντας τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Τα περισσότερα από τα αντιμιτογόνα μηνύματα δρουν μέσω της Rb που αποτελεί το βασικό «φρένο» για τη μετάβαση από την G1 στην S φάση του κυτταρικού κύκλου. Το πιο καλά χαρακτηρισμένο μόριο είναι ο TGFβ ο οποίος εμποδίζει τη φωσφορυλίωση της Rb και την απελευθέρωση των μεταγραφικών παραγόντων με τους οποίους είναι δεσμευμένη (Weinberg, 1995). Μείωση της έκφρασης των υποδοχέων του TGFβ ή έκφραση τροποποιημένων μορφών τους έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια απόκρισης των κυττάρων σε αντιμιτογόνα μηνύματα. Στο ίδιο αποτέλεσμα οδηγεί η μείωση της έκφρασης της Smad4, ενός μορίου μεταγωγής σήματος από τον υποδοχέα του TGFβ ή η αναστολή της έκφρασης της Rb (Fynan and Reiss, 1993). Σε πολλά καρκινικά κύτταρα μειώνεται και η έκφραση των ιντεγκρινών ή άλλων μορίων προσκόλλησης τα οποία μετάγουν αντιμιτογόνα σήματα. Ενδιαφέρον είναι ότι και αυτά τα μόρια προσκόλλησης μετάγουν αντιμιτογόνα σήματα μέσω της Rb. Ε.1.3 Απόκτηση αντίστασης στην απόπτωση Η ικανότητα ενός όγκου να μεγαλώνει σε μέγεθος δεν εξαρτάται μόνο από τον ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων, αλλά και από τον ρυθμό με τα οποία αυτά απομακρύνονται από τον οργανισμό. Η απόπτωση είναι μια φυσιολογική διαδικασία προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου που συμμετέχει στη διατήρηση της ομοιόστασης ενός ιστού. Υπάρχουν δυο οδοί μέσω των οποίων ένα κύτταρο οδηγείται σε απόπτωση. Η εξωγενής, που επάγεται από μόρια θανάτου (TNF-α, λεμφοτοξίνη κ.α.) που δεσμεύονται σε διαμεμβρανικούς υποδοχείς και η ενδογενής, που επάγεται από στρεσογόνα σήματα (έλλειψη αυξητικών παραγόντων, καταστροφή DNA) τα οποία προκαλούν την απελευθέρωση από τα μιτοχόνδρια του κυτταροχρώματος-c και άλλων αποπτωτικών παραγόντων. Τόσο η ενδογενής όσο και η εξωγενής οδός καταλήγουν στην ενεργοποίηση μιας οικογένειας πρωτεασών που ονομάζονται κασπάσες. Το τελικό αποτέλεσμα είναι η πέψη του DNA, η αποδιοργάνωση του κυτταροσκελετού και της πυρηνικής μεμβράνης και ο κατακερματισμός των κυττάρων. Η παρατήρηση ότι η στέρηση ορμονών από κύτταρα από ορμονοεξαρτώμενο καρκίνο οδηγεί σε μαζική 3

10 Εισαγωγή απόπτωση, συσχέτισε για πρώτη φορά την απόπτωση με τον καρκίνο (Kerr et al., 1972). Ωστόσο, σε πάρα πολλούς καρκινικούς όγκους έχει παρατηρηθεί ότι τα κύτταρα έχουν αποκτήσει αντίσταση στην απόπτωση. Υπερέκφραση της αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-2, λόγω μετατόπισης του γονιδίου της, οδηγεί σε καρκίνους του λεμφικού συστήματος (Vaux et al.,1988). Επίσης, στο 50% των καρκίνων παρατηρείται η απενεργοποίηση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53, το οποίο επάγει το ενδογενές μονοπάτι της απόπτωσης μετά από βλάβες στο DNA, υποξία ή υπερενεργοποίηση ογκογονιδίων (Harris,1996). Ε.1.4 Απόκτηση ικανότητας ανεξέλεγκτου πολλαπλασιασμού Οι τρεις προαναφερθείσες ιδιότητες που αποκτούν τα καρκινικά κύτταρα, σχετίζονται με τη διακοπή της εξάρτησης της ανάπτυξης των κυττάρων από το μικροπεριβάλλον τους. Παρόλο που αυτές οι ιδιότητες είναι ικανές να οδηγήσουν στην έναρξη της ανάπτυξη ενός όγκου, δεν είναι ικανές από μόνες τους να οδηγήσουν στην ανάπτυξη του μεγέθους του όγκου. Μελέτες έχουν δείξει ότι τα κύτταρα υφίστανται γήρανση, μηχανισμός που περιορίζει τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό τους. Αυτός είναι και ο λόγος που φυσιολογικά κύτταρα σε καλλιέργεια δεν πολλαπλασιάζονται επ αόριστον. Σε αυτόν το μηχανισμό κυρίαρχο ρόλο παίζουν τα τελομέρη των χρωμοσωμάτων και η τελομεράση. Τα τελομέρη είναι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες στα άκρα των χρωμοσωμάτων, που παρουσιάζουν μια ιδιαιτερότητα κατά την αντιγραφή. Λόγω του τρόπου αντιγραφής του DNA και της κατεύθυνσης πολυμερισμού των γνωστών πολυμερασών, ένα τμήμα στο άκρο του συνοδού κλώνου δεν αντιγράφεται, με αποτέλεσμα ο ένας κλώνος να είναι μικρότερος του άλλου. Για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος τα κύτταρα διαθέτουν την τελομεράση, ένα ένζυμο που προσθέτει τα τμήματα τα οποία λείπουν. Ωστόσο, με την πάροδο του χρόνου η τελομεράση χάνει την ενεργότητά της, με αποτέλεσμα τη βράχυνση των τελομερών μετά από κάθε κυτταρικό κύκλο. Η απώλεια των τελομερών οδηγεί σε απροστάτευτα άκρα χρωμοσωμάτων, τα οποία συντήκονται με άλλα χρωμοσώματα και πέπτονται από νουκλεάσες, με αποτέλεσμα την ενεργοποίησης της απόπτωσης. Έχει βρεθεί ότι το 85%-90% των καρκινικών κυττάρων παρουσιάζουν αυξημένη ενεργότητα τελομεράσης (Shay and Bacchetti, 1997). 4

11 Εισαγωγή Ε.1.5 Επαγωγή της αγγειογένεσης Το αγγειακό σύστημα είναι αυτό που παρέχει τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά και το οξυγόνο για τη σωστή λειτουργία και επιβίωση των κυττάρων. Για το λόγο αυτό τα κύτταρα βρίσκονται σε μικρή απόσταση (το πολύ 100 μm) από ένα τριχοειδές αγγείο. Στα πρώτα στάδια ανάπτυξης του όγκου, τα καρκινικά κύτταρα δεν έχουν την ικανότητα επαγωγής της αγγειογένεσης. Ωστόσο, με την ανάπτυξη του μεγέθους του όγκου αποκτούν τη συγκεκριμένη ικανότητα, προκειμένου να τροφοδοτήσουν και τα κύτταρα στο εσωτερικό του όγκου (Folkman, 1997). Ως αγγειογένεση περιγράφεται ο σχηματισμός νέων αγγείων από προϋπάρχοντα και είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που ελέγχεται αυστηρά από τη συνιστάμενη δράση διαφόρων αγγειογενετικών και αντι-αγγειογενετικών μορίων. Αυξητικοί παράγοντες, ιντεγκρίνες και μόρια που συμμετέχουν στις διακυτταρικές συνδέσεις έχουν καθοριστικό ρόλο στην αγγειογένεση. Ο VEGF και ο FGF είναι οι δύο πιο σημαντικοί αυξητικοί παράγοντες που επάγουν την αγγειογένεση μετά από αλληλεπίδραση με τους υποδοχείς τους στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Σε αντίθεση, η ενδοστατίνη, η αγγειοστατίνη και η θρομβοσπονδίνη-1 αποτελούν τους πιο σημαντικούς αρνητικούς ρυθμιστές της αγγειογένεσης. Ο καρκίνος φαίνεται να επάγει την αγγειογένεση επηρεάζοντας την ισορροπία μεταξύ αγγειογενετικών και αντι-αγγειογενετικών μορίων (Folkman, 1997; Liekens et al., 2001). Σε διάφορους τύπους καρκίνου έχουν παρατηρηθεί αυξημένα επίπεδα VEGF ή/και FGF και μειωμένα επίπεδα θρομβοσπονδίνης-1. Ωστόσο, ο τρόπος με τον οποίον επηρεάζεται αυτή η ισορροπία δεν είναι πλήρως διασαφηνισμένος και φαίνεται να είναι αρκετά πολύπλοκος. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί το γεγονός ότι το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 είναι θετικός ρυθμιστής της θρμβοσπονδίνης-1. Συνεπώς, η μείωση της δράσης της p53, που παρατηρείται σε πολλές μορφές καρκίνου, μειώνει και τα επίπεδα έκφρασης αυτού του αντι-αγγειογενετικού μορίου (Dameron et al., 1994). Ένα άλλο παράδειγμα της πολυπλοκότητας του μηχανισμού ρύθμισης της ισορροπίας μεταξύ αγγειογενετικών και αντι-αγγειογενετικών μορίων αποτελούν διάφορες πρωτεϊνάσες του κυτταρικού μικροπεριβάλλοντος, οι οποίες μπορούν να απελευθερώσουν από την εξωκυττάρια ύλη τους αποθηκευμένους σ αυτήν αυξητικούς παράγοντες. Ωστόσο, η πέψη της πλασμίνης οδηγεί στην παραγωγή της αγγειοστατίνης (Whitelock et al., 1996). Παρόλο αυτά, η αγγειογένεση είναι μια διαδικασία που παρατηρείται σε όλους τους τύπους καρκίνου και διάφοροι αναστολείς της δράσης του VEGF βρίσκονται σήμερα στα τελευταία στάδια κλινικών δοκιμών. 5

12 Εισαγωγή Ε.1.6 Απόκτηση της ικανότητας διείσδυσης και μετάστασης Η μετάσταση είναι ο κύριος λόγος για τους θανάτους από διάφορες μορφές καρκίνου (Sporn, 1996). Προκειμένου ένα κύτταρο να κάνει μετάσταση πρέπει αρχικά να αποκολληθεί από το σημείο στο οποίο βρίσκεται, να αποκτήσει αυξημένη κινητικότητα και διεισδυτικότητα, να εισέλθει στην κυκλοφορία και στη συνέχεια αφού εξέλθει από αυτήν, να προσκολληθεί σε έναν νέο ιστό όπου θα βρει πλούσια θρεπτικά στοιχεία και χώρο για να πολλαπλασιασθεί και τελικά να δημιουργήσει έναν νέο όγκο. Είναι προφανές ότι στη συγκεκριμένη διαδικασία πρέπει να αλλάξουν μόρια τα οποία συμμετέχουν στην διακυτταρική σύνδεση και την κυτταρική προσκόλληση. Η πιο συχνή αλλαγή στις διακυτταρικές συνδέσεις των καρκινικών κυττάρων αφορά την Ε-καντερίνη. Η Ε-καντερίνη είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη της κυτταρική επιφάνειας που συνδέεται με τα ινίδια της ακτίνης και συμμετέχει σε ομοφιλικές αλληλεπιδράσεις. Σε πολλά επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα έχει παρατηρηθεί μειωμένη έκφραση στο γονίδιο της Ε-καντερίνης καθώς και πρωτεόλυση του εξωκυττάριου τμήματός της (Christofori and Semb, 1999). Ωστόσο, αλλαγές παρατηρούνται και στην έκφραση των CAM, πρωτεϊνών της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών. Σε περιπτώσεις νευροβλαστώματος ή καρκίνου του πνεύμονα, έχει παρατηρηθεί ότι εκφράζεται μια ισομορφή της N-CAM με μειωμένη δράση προσκόλλησης, ενώ σε περιπτώσεις καρκίνου του παγκρέατος αναστέλλεται η έκφρασή της (Johnson, 1991). Αλλαγές παρατηρούνται και στις ιντεγκρίνες. Οι ιντεγκρίνες είναι διαμεμβρανικές ετεροδιμερείς γλυκοπρωτεΐνες που προκύπτουν από το συνδυασμό μιας α και μιας β αλυσίδας. Μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί εικοσιτέσσερις διαφορετικές ιντεγκρίνες που προκύπτουν από το διαφορετικό συνδυασμό των α και β αλυσίδων. Το εξωκυττάριο τμήμα τους προσδένεται με διάφορα μόρια της εξωκυττάριας ύλης (κολλαγόνο, ινονεκτίνη, λαμινίνη κ.ά.), ενώ το κυτταροπλασματικό αλληλεπιδρά με τον κυτταροσκελετό ή με μόρια μεταγωγής σήματος που μεταφέρουν πληροφορίες για την επιβίωση, την κίνηση, την πολικότητα και το σχήμα των κυττάρων. Κάθε είδος κύτταρου εκφράζει το δικό του είδος ιντεγκρινών, με αποτέλεσμα να γίνεται δύσκολη η κατηγοριοποίηση των δράσεών τους. Ωστόσο, ο ρόλος τους στην μετάσταση είναι αδιαμφισβήτητος. Έχει παρατηρηθεί ότι κατά τη διάρκεια της μετάστασης ενός καρκινικού κυττάρου αλλάζει το είδος των ιντεγκρινών που εκφράζει προκειμένου να αντεπεξέλθει στο διαφορετικό μικροπεριβάλλον που συναντά. Είναι γνωστό ότι για να βγει ένα κύτταρο από την κυκλοφορία, πρέπει να προσκολληθεί στο εσωτερικό μέρος 6

13 Εισαγωγή του αγγείου, επάγοντας την έκφραση των ιντεγκρινών αvβ3 και α3β1 (Wang et al., 2004). Ένας επιπλέον καθοριστικός παράγοντας στη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων είναι η ικανότητα αποικοδόμησης της βασικής μεμβράνης. Τη συγκεκριμένη διαδικασία επιτελούν διάφοροι τύποι πρωτεϊνασών, με κύριους πρωταγωνιστές τις μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs). Αυτές, ανάλογα με το υπόστρωμα το οποίο αποικοδομούν, διακρίνονται σε κολλαγενέασες, σε ζελατινάσες, σε στρωματολυσίνες και σε ματριλυσίνες. Επιπλέον, υπάρχουν και οι μεμβρανικού τύπου μεταλλοπρωτεϊνάσες, οι οποίες βοηθούν το καρκινικό κύτταρο να διεισδύσει διαμέσω των φυσιολογικών κυττάρων και του τοιχώματος των αγγείων. Η ενεργοποίηση και η δράση των μεταλλοπρωτεϊνασών γίνεται κάτω από τον αυστηρό έλεγχο άλλων μεταλλοπρωτεϊνασών και των ενδογενών αναστολέων των μεταλλοπρωτεϊνασών (TIMPs), ενώ σημαντική είναι και η θέση στην οποία βρίσκονται (Egeblad and Werb, 2002). Στα καρκινικά κύτταρα έχει παρατηρηθεί αυξημένη έκφραση πρωτεϊνασών, μειωμένη έκφραση των αναστολέων τους, καθώς και περισσότερα ενεργοποιημένα μόρια. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον όμως έχει το γεγονός ότι η αυξημένη έκφραση των πρωτεϊνασών δεν παρατηρείται στα καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα, αλλά παράγονται από ινοβλάστες και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται από τα καρκινικά κύτταρα (Werb, 1997). Είναι γνωστό ότι τα μεσεγχυματικά κύτταρα δεν έχουν ισχυρές διακυτταρικές συνδέσεις, προσκολλώνται χαλαρά στην εξωκυττάρια ύλη και παρουσιάζουν μεγαλύτερη κινητικότητα σε σύγκριση με τα επιθηλιακά κύτταρα. Επιπλέον, παρουσιάζουν επιμηκυνσμένο σχήμα και μεταναστεύουν ως μονήρη. Επειδή αυτά τα χαρακτηριστικά των μεσεγχυματικών κυττάρων είναι οι ιδιότητες που πρέπει να αποκτήσουν τα καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα για να κάνουν μετάσταση, τα τελευταία χρόνια αναπτύχθηκε η θεωρία του ΕΜΤ (Epithelial Mesenchymal Transition). Σύμφωνα με αυτήν, τα καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα, πριν τη μετάσταση, αποκτούν ένα μεσεγχυματικό φαινότυπο. Η θεωρία αυτή επαληθεύτηκε από βιοψίες καρκινικών όγκων, στις οποίες ανιχνεύτηκαν διάφοροι δείκτες μεσεγχυματικών κυττάρων, ενώ με περαιτέρω μελέτες ταυτοποιήθηκαν διάφορα μόρια ως δείκτες για ΕΜΤ (Πίνακας Ε1) (Lee et al., 2006). 7

14 Εισαγωγή Πίνακας Ε1. Δείκτες ΕΜΤ. Αυξημένη Μειωμένη Αυξημένη Πρωτεΐνες που Φαινότυπος έκφραση έκφραση δράση συσσωρεύονται πρωτεϊνών πρωτεϊνών πρωτεϊνών στον πυρήνα Ν-καντερίνη Ε-καντερίνη ILK β-κατενίνη Ινονεκτίνη Δεσμοπλακίνη GSK-3β Snail 1 Βιμεντίνη Κυτταροκερατίνη Rho Snail 2 Snail 1 Smad2/3 Snail 2 Twist Twist NF-kβ MMP-2 MMP-3 Αυξημένη μετανάστευση Αυξημένη διεισδυτικότητα Επιμήκυνση του κυτταρικού σχήματος Αντίσταση στην απόπτωση MMP-9 αvβ6 Ε.2 ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΠΡΟΣΤΑΤΗ Ο καρκίνος του προστάτη αποτελεί μετά τον καρκίνο του πνεύμονα, τη δεύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Επίσης είναι η πιο κοινή διαγνωσθείσα κακοήθεια στους άνδρες. Τα αυξημένα κρούσματα της ασθένειας από το 1988 και έπειτα είναι πιθανότατα αποτέλεσμα της πληθυσμιακής αύξησης και του νέου τρόπου ζωής (Moul, 2003; Gronberg, 2003). Ε.2.1 Δομή του προστάτη Ο προστάτης είναι ένα αδενομυώδες, εσωτερικό όργανο του άνδρα, ο οποίος μαζί με τους ουρηθρικούς και βολβοουρηθραίους αδένες αποτελεί τους κύριους αδένες του ουρογεννητικού ανθρώπινου συστήματος. Ο φυσιολογικός προστάτης έχει σχήμα κάστανου και βάρος περίπου 20 gr. Ανατομικά, βρίσκεται μπροστά από την ηβική 8

15 Εισαγωγή σύμφυση και το ορθό, κάτω από την ουροδόχο κύστη και περιβάλλει την οπίσθια προστατική ουρήθρα, στην οποία εκβάλλουν οι εκσπερματικοί και οι προστατικοί πόροι. Εικόνα E1. Ανατομική θέση προστάτη. Ο προστάτης περιβάλλεται από την κάψα, η οποία είναι πλούσια σε αιμοφόρα αγγεία. Εσωτερικά αυτής βρίσκονται ίνες από κολλαγόνο, καθώς και κυκλοτερείς λείες μυϊκές ίνες που περιβάλλουν την ουρήθρα, συνιστώντας τον ακούσιο σφικτήρα της. Βαθύτερα βρίσκεται το προστατικό στρώμα, στο οποίο είναι βυθισμένοι σωληνοκυψελιδωτοί αδένες. Οι αδένες αυτοί εκβάλλουν στους μείζονες εκφορητικούς πόρους που με τη σειρά τους εκβάλλουν στην οπίσθια ουρήθρα. Ο προστάτης αποτελείται από τρεις τύπους επιθηλιακών κυττάρων. Τα εκκριτικά, τα βασικά μη εκκριτικά και τα νευροενδοκρινή (Coffey, 1993). Τα εκκριτικά κύτταρα βρίσκονται στο εσωτερικό των κυψελίδων, είναι κυλινδροειδή και έχουν διαφανές κυτταρόπλασμα. Διαθέτουν την ικανότητα να εκκρίνουν διάφορα προϊόντα όπως το Ειδικό Προστατικό Αντιγόνο (PSA), την Όξινη Προστατική Φωσφατάση (PAP) και την όξινη βλέννα. Ως πλήρως διαφοροποιημένα κύτταρα, παρουσιάζουν το μικρότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού. Τα βασικά κύτταρα βρίσκονται στην περιφέρεια των κυψελίδων, πάνω ακριβώς από τη βασική μεμβράνη. Διαθέτουν τον εντονότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού και θεωρούνται προγονικά των εκκριτικών επιθηλιακών κυττάρων (Bonkhoff et al., 1996). Επίσης, τα βασικά κύτταρα στερούνται υποδοχέων ανδρογόνων, καθώς και προϊόντων των εκκριτικών κυττάρων, όπως το PSA, η PAP και η όξινη βλέννα. Τα νευροενδοκρινή κύτταρα μπορούν να ελέγχουν την ανάπτυξη και τη λειτουργία των επιθηλιακών κυττάρων μέσω νευροπεπτιδίων που εκκρίνουν (Coffey, 1992). 9

16 Εισαγωγή Εικόνα Ε2. Σχηματική αναπαράσταση της σύστασης του επιθηλίου του προστάτη. Ε.2.2 Λειτουργία του προστάτη Ο προστάτης είναι ένας εξωκρινής αδένας που εκκρίνει ένα λεπτόρρευστο, γαλακτόχρωμο, αλκαλικό υγρό που περιέχει κιτρικό οξύ, ασβέστιο και διάφορες άλλες ουσίες. Κατά την εκσπερμάτιση, η κάψα του προστάτη συσπάται ταυτόχρονα με το σπερματικό πόρο, με αποτέλεσμα στο σπέρμα να προστίθεται το υγρό του προστάτη. Η αλκαλική σύσταση του προστατικού υγρού έχει μεγάλη σημασία για την επιτυχή γονιμοποίηση του ωαρίου, επειδή το υγρό του σπερματικού πόρου είναι σχετικά όξινο, εξαιτίας της παρουσίας σε αυτό τελικών προϊόντων του μεταβολισμού των σπερματοζωαρίων, με αποτέλεσμα την αναστολή της κινητικότητας και της γονιμότητάς τους. Επίσης όξινα είναι και τα εκκρίματα του γυναικείου κόλπου (ph 3,5-4). Τα σπερματοζωάρια δεν αποκτούν άριστη κινητικότητα αν το ph του περιβάλλοντός τους δεν είναι περίπου 6-6,5. Για το λόγο αυτό, το σπερματικό υγρό εξουδετερώνει την οξύτητα των άλλων υγρών μετά την εκσπερμάτιση και αυξάνει πολύ την κινητικότητα και τη γονιμότητα των σπερματοζωαρίων (Guyton, 1984). Ε.2.3 Φυσιολογική και παθολογική ανάπτυξη του προστάτη Παρόλο που ο προστάτης εμφανίζεται κατά τη διάρκεια των τριών πρώτων μηνών της ενδομήτριας ζωής, παραμένει ατροφικός κατά τη παιδική ηλικία και αναπτύσσεται στην εφηβεία με την επίδραση αυξητικών και ενδοκρινών παραγόντων (Cunha et al., 1983). Ωστόσο, είναι πιθανόν με τη πάροδο της ηλικίας, να παρατηρηθεί αύξηση του όγκου του προστάτη, κατάσταση που ονομάζεται καλοήθης υπερπλασία του προστάτη 10

17 Εισαγωγή (Benign Prostate Hyperplasia, BPH). Η αύξηση αυτή προκαλείται τόσο από διαταραχή της αναλογίας κυττάρων επιθηλίου/στρώματος, λόγω της μειωμένης απόπτωσης στα κύτταρα του στρώματος (Claus et al., 1997), αλλά και λόγω αύξησης της αναλογίας οιστρογόνων/ανδρογόνων (Κrieg et al., 1995). Περαιτέρω διαταραχές των αναλογιών που προαναφέρθηκαν, με ταυτόχρονη συσσώρευση χρωμοσωματικών ανωμαλιών και πολλαπλών αλλαγών στο πρότυπο έκφρασης και δράσης διαφόρων αυξητικών παραγόντων και των υποδοχέων τους, οδηγούν στην ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη. Ε Ρύθμιση μέσω ενδοκρινών παραγόντων Τα ανδρογόνα αποτελούν τον πιο σημαντικό παράγοντα που επιτρέπει την ανάπτυξη και τη λειτουργικότητα του προστάτη. Τα ανδρογόνα είναι στεροειδείς ορμόνες που επάγουν τη διαφοροποίηση και την ωρίμανση των αρσενικών αναπαραγωγικών οργάνων, καθώς και την ανάπτυξη των δευτερογενών χαρακτηριστικών του φύλου. Η τεστοστερόνη, η κυριότερη ορμόνη από τα ανδρογόνα, συντίθεται στους όρχεις από τα κύτταρα Leydig, μετά από την επίδραση της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH). Η LH εκκρίνεται από την υπόφυση και βρίσκεται υπό τον έλεγχο της εκλυτικής ορμόνης της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LHRH) του υποθαλάμου. Στους φυσιολογικούς άνδρες, το 98% των ανδρογόνων που κυκλοφορεί στο αίμα, είναι δεσμευμένο με πρωτεΐνες του πλάσματος, όπως η αλβουμίνη και κυρίως η SHBG (Sex Hormone-Binding Globulin), ενώ το υπόλοιπο 2% βρίσκεται σε ελεύθερη μορφή (Pardridge, 1981). Μικρότερη πηγή ανδρογόνων αποτελεί ο φλοιός των επινεφριδίων. Υπό την επίδραση της φλοιοεπινεφριδιοτρόπου ορμόνης (ACTH), που παράγεται από την υπόφυση, απελευθερώνονται από τα επινεφρίδια ανενεργά πρόδρομα ανδρογόνων, όπως η διϋδροεπιανδροστερόνη (DHEA) και η ανδροστενεδιόνη. Οι ορμόνες αυτές φυσιολογικά ασκούν μικρή δράση στη λειτουργία των όρχεων. Σε περιπτώσεις όμως φυσικού ή χημικού ευνουχισμού, συμβάλουν στην επιβίωση ορισμένων ανδρογονοεξαρτώμενων καρκινικών κλώνων. Μετά την είσοδό τους στον προστάτη, η τεστοστερόνη και τα ανδρογόνα από τα επινεφρίδια μεταβολίζονται γρήγορα από το ένζυμο 5-α-αναγωγάση σε διϋδροτεστοστερόνη (DHT) (Syrigos, 2001). Η DHT αποτελεί το ανδρογόνο που είναι υπεύθυνο για την ανάπτυξη του προστάτη και είναι 3-5 φορές πιο δραστικό από την τεστοστερόνη. Η DHT παράγεται από τα βασικά κύτταρα και από τα κύτταρα του στρώματος και δρα στα παρακείμενα επιθηλιακά κύτταρα. Μετά την είσοδό της στον πυρήνα, δεσμεύεται σε ανδρογονικούς υποδοχείς και το σύμπλοκο προσδένεται σε 11

18 Εισαγωγή ειδικές ρυθμιστικές ακολουθίες των γονιδίων στόχων, επάγοντας τη μεταγραφή. Μεταξύ των γονιδίων που ενεργοποιεί, είναι αυτά που κωδικοποιούν τον επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF) και τον αυξητικό παράγοντα των αιμοπεταλίων (PDGF), που συμβάλλουν στην αύξηση του αδένα (Steers, 2001). Εικόνα Ε3. Ορμονικός έλεγχος της αύξησης του προστάτη από τον άξονα υποθάλαμοςυπόφυση- όρχεις. Ιδιαίτερα σημαντική για τη φυσιολογική ανάπτυξη του προστάτη είναι και η παρουσία οιστρογόνων. Το 75-90% των οιστρογόνων που βρίσκονται στη κυκλοφορία προέρχονται από περιφερειακή κυκλοποίηση τεστοστερόνης και ανδροστενεδιόνης. Οι όρχεις συνθέτουν το υπόλοιπο 10-25%, αλλά οιστρογόνα σχηματίζονται και μέσα στον προστάτη (Syrigos, 2001). Παρόλο που τα ανδρογόνα είναι οι κύριοι παράγοντες για τη φυσιολογική ανάπτυξη του προστάτη, απαραίτητη είναι και η συμμετοχή μη ανδρογόνων ορμονών. Μετά από ενεργοποίηση από τον εκλυτικό παράγοντα της προλακτίνης (PRF) και από τον εκλυτικό παράγοντα της αυξητικής ορμόνης (GHRH), που εκκρίνονται από τον υποθάλαμο, παρατηρείται έκκριση από την υπόφυση της προλακτίνης και της αυξητικής ορμόνης αντίστοιχα. Οι δύο αυτές ορμόνες, προσδενόμενες στους ειδικούς υποδοχείς του προστάτη, επάγουν τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Επιπλέον, υπό τον έλεγχο του απελευθερωτικού παράγοντα των γοναδοτροπινών (GnRH) του υποθαλάμου, βρίσκεται η έκκριση από την υπόφυση της 12

19 Εισαγωγή ωοθηλακιοτρόπου ορμόνης (FSH) και της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH). Οι δύο αυτές ορμόνες δρουν επί των όρχεων, επάγοντας την σύνθεση της τεστοστερόνης. Μειωμένη παραγωγή ανδρογόνων λόγω κάποιας δυσλειτουργίας του άξονα υποθάλαμος-υπόφυση-όρχεις, καθώς και ανωμαλίες στο μεταβολισμό των ανδρογόνων, όπως για παράδειγμα έκφραση μη δραστικής 5-α-αναγωγάσης, μειώνουν την πιθανότητα ανάπτυξης BPH και καρκίνου του προστάτη (Gann et al., 1996). Επιπλέον, η έκφραση και η δραστικότητα των ανδρογονικών υποδοχέων είναι απαραίτητη για την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Παρόλα αυτά καθώς μειώνεται ο βαθμός διαφοροποίησης του καρκίνου και επομένως αυξάνεται η επιθετικότητά του, έχει παρατηρηθεί ότι τα καρκινικά κύτταρα μεταβαίνουν από μια ανδρογονο-εξαρτώμενη σε μια ανδρογονο-ανεξάρτητη κατάσταση. Παρόλο που τα ανδρογονο-ανεξάρτητα κύτταρα εκφράζουν σε χαμηλότερο βαθμό τον ανδρογονικό υποδοχέα, γενετικές ή επιγενετικές αλλαγές επιτρέπουν τη διαρκή ενεργοποίησή του ή την ενεργοποίησή του παρουσία πολύ μικρών συγκεντρώσεων ανδρογόνων (Lee at al., 1996). Ε Ρύθμιση μέσω αυξητικών παραγόντων Αν και ο ρόλος των ανδρογόνων είναι πολύ σημαντικός, από μόνα τους δεν μπορούν να διατηρήσουν την ομοιόσταση του προστάτη. Καθοριστική συμμετοχή σε αυτή τη διαδικασία έχουν και διάφοροι αυξητικοί παράγοντες. Κατά την αύξηση του προστάτη παρατηρούνται αλληλεπιδράσεις μεταξύ των επιθηλιακών κυττάρων και των κυττάρων του στρώματος. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές γίνονται μέσω παραγωγής και έκκρισης - από τα δύο αυτά είδη κυττάρων- διαφόρων αυξητικών παραγόντων, οι οποίοι μέσω παρακρινών ή αυτοκρινών μηχανισμών συμμετέχουν στη διατήρηση της ομοιόστασης του αδένα. Αλλαγές στο πρότυπο έκφρασης και ρύθμισης των αυξητικών παραγόντων και των υποδοχέων τους οδηγούν σε ανάπτυξη καρκίνου. Στους όγκους που είναι ανεξάρτητοι από ανδρογόνα, επάγονται τόσο αυτοκρινή όσο και παρακρινή μονοπάτια στα οποία συμμετέχουν διάφοροι αυξητικοί παράγοντες και οι υποδοχείς τους, αντικαθιστώντας τον ρόλο των ανδρογόνων (Russell et al., 1998). Οι γνωστοί μέχρι σήμερα αυξητικοί αυτοί παράγοντες που συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση επιθηλιακών κυττάρων και κυττάρων του στρώματος, ρυθμίζοντας την ομοιόσταση του αδένα είναι ο IGF, ο EGF, ο TGF-α και β και ο FGF (Εικόνα Ε4). 13

20 Εισαγωγή Εικόνα Ε4. Οι κυριότεροι αυξητικοί παράγοντες και οι αντίστοιχοι υποδοχείς που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και στην ομοιόσταση του προστάτη. ΙGF Η οικογένεια των IGF αποτελείται από πολυπεπτίδια που έχουν ομολογία με την ινσουλίνη. Περιλαμβάνει τον IGF-1 και τον IGF-2, καθώς και τους αντίστοιχους υποδοχείς τους IGF-1R και IGF-2R. Στην οικογένεια αυτή ανήκουν επίσης έξι πρωτεΐνες που δεσμεύουν IGFs (IGFBP 1-6) και κάποιες πρωτεάσες των προσδενόμενων πρωτεϊνών. Στον προστάτη, ο IGF που εκφράζεται από τα κύτταρα του στρώματος δρα παρακρινώς στα επιθηλιακά κύτταρα, ρυθμίζοντας την κυτταρική προσκόλληση, τη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των επιθηλιακών κυττάρων (Daughaday et al., 1989). Σε περίπτωση όμως καρκίνου, ο IGF εκφράζεται από τα επιθηλιακά κύτταρα και δρώντας αυτοκρινώς, συμβάλλει στον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό τους (Wang et al., 1998). Η αλλαγή αυτή, έχει παρατηρηθεί και στις καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη, PC3 και LNCaP (Pietrzkowski et al., 1993). Επιπλέον, σε περίπτωση καρκίνου, τα επιθηλιακά κύτταρα εκκρίνουν σε αυξημένα επίπεδα πρωτεϊνάσες που αποικοδομούν τις πρωτεΐνες IGFBPs, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση των δεσμευμένων IGFs στην κυκλοφορία και την διέγερση ανάπτυξης καρκινικού όγκου (Cohen et al., 1992). EGF και TGF-α Ο EGF και ο TGF-α εμφανίζουν δομικές ομοιότητες και διαθέτουν τον ίδιο υποδοχέα, τον EGFR. Στον προστάτη, ο EGFR εκφράζεται μόνο στα επιθηλιακά κύτταρα. Ο EGF, του οποίου η έκφραση ρυθμίζεται από τα ανδρογόνα, εκφράζεται στα επιθηλιακά κύτταρα ρυθμίζοντας αυτοκρινώς την ομοιόσταση του προστάτη. Αντιθέτως, ο TGF-α δρα παρακρινώς, αφού εκκρίνεται από τα κύτταρα του στρώματος και προσδένεται 14

21 Εισαγωγή στον EGFR των επιθηλιακών κυττάρων (Hellawell et al., 2002). Σε περιπτώσεις καρκίνου παρατηρείται υπερέκφραση των EGFR και EGF, καθώς και παραγωγή του TGF-α από τα επιθηλιακά κύτταρα, με αποτέλεσμα να ενισχύεται η επιθετικότητα και η μεταστατικότητα του καρκίνου (Scher et al., 1995). Επιπλέον, το ογκογονίδιο c-erbb-2, που είναι ομόλογο στην αλληλουχία και στη δομή με τον EGFR, επάγει τη μετάσταση (Ochiai et al., 1994). Μελέτες έδειξαν ότι αυξημένα επίπεδα έκφρασης του ογκογονιδίου c-erbb-2 στον προστάτη, παρατηρούνται σε περιπτώσεις καρκίνου κάτι που σχετίζεται με επιθετικούς όγκους και με μειωμένη βιωσιμότητα (Fox et al., 1994). TGF-β Η οικογένεια TGF-β περιλαμβάνει τρεις ισομορφές. Τον TGF-β1, τον TGF-β2 και τον TGF-β3, οι οποίες εκφράζονται στα κύτταρα του στρώματος και στα λεία μυϊκά κύτταρα και δρουν παρακρινώς στα επιθηλιακά κύτταρα, μετά από πρόσδεση στους υποδοχείς ΤβRI και ΤβRII. Ο ρόλος των TGF-β στον προστάτη είναι ιδιαίτερα πολύπλοκος. Σε φυσιολογική κατάσταση, ο TGF-β αναστέλλει τη μιτογόνο δράση του EGF και του TGFα στα επιθηλιακά κύτταρα και του bfgf στα κύτταρα του στρώματος, ρυθμίζοντας την ανάπτυξη του αδένα (Story et al., 1996). Η υπερέκφραση του TGF-β στα επιθηλιακά κύτταρα συσχετίζεται με την ανάπτυξη και τη μεταστατική ικανότητα του καρκίνου. Επιπλέον, ο TGF-β μπορεί να ρυθμίσει την παραγωγή μεταλλοπρωτεϊνασών και να διεγείρει την προσκόλληση καρκινικών προστατικών κυττάρων σε κύτταρα των οστών, διευκολύνοντας μ αυτόν τον τρόπο την μετάσταση (Kostenuik et al., 1997). FGF Η οικογένεια των FGFs αποτελείται από 20 πρωτεΐνες, από τις οποίες η σημαντικότερη είναι ο bfgf. Στον ανθρώπινο προστάτη, τα κύτταρα του στρώματος αποτελούν την κυριότερη πηγή FGFs. Οι υποδοχείς τους, οι FGFRs, ανιχνεύονται κυρίως στα κύτταρα του στρώματος. Ωστόσο κάποιες ισομορφές των υποδοχέων εκφράζονται και στα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη. Αυξημένη έκφραση του FGF2 έχει συσχετιστεί με την ανάπτυξη BPH και συγκεκριμένα με διέγερση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του στρώματος (Ropiquet et al., 1999b). Η έκφραση και από επιθηλιακά κύτταρα, σχετίζεται με την ανάπτυξη καρκίνου, επάγοντας τον πολλαπλασιασμό, την αγγειογένεση και τη μεταστατική ικανότητα (Hellawell et al., 2002). 15

22 Εισαγωγή Ε.2.4 Βιολογικοί δείκτες του καρκίνου του προστάτη Για τον καρκίνο του προστάτη έχουν προταθεί διάφορα μόρια ως βιολογικοί δείκτες, μεταξύ των οποίων υποδοχείς ανδρογόνων, διάφοροι αυξητικοί παράγοντες, το PAP και η υψηλού μοριακού βάρους κερατίνη 34βΕ12. Από τους δείκτες αυτούς, ο πιο αξιόπιστος και ευρέως χρησιμοποιούμενος είναι το Ειδικό Προστατικό Αντιγόνο (PSA). Το PSA συντίθεται από τα εκκριτικά επιθηλιακά κύτταρα και καταλύει τη ρευστοποίηση του σπερματικού πήγματος μετά την εκσπερμάτιση. Είναι μια πρωτεάση σερίνης και ανήκει στην οικογένεια των καλλικρεϊνών. Το PSA ρυθμίζει τη λειτουργία του IGF, αφού εμποδίζει την αλληλεπίδραση με τον υποδοχέα του (Cohen et al., 1992). Το PSA ανιχνεύεται στον ορό και τα φυσιολογικά του επίπεδα κυμαίνονται κάτω των 4ng/ml. Η τιμή όμως αυτή ποικίλει ανάλογα με την ηλικία και τη φυλή του εξεταζόμενου. Αυξημένα επίπεδα παρατηρούνται σε περιπτώσεις προστατίτιδας και υπερπλασίας, αλλά η σημαντικότερη αύξηση παρατηρείται σε περιπτώσεις καρκίνου. Η συγκέντρωση του PSA χαρακτηρίζει το κλινικό στάδιο και το μέγεθος του καρκινικού όγκου. Χρησιμοποιείται για την πρόγνωση μετάστασης, καθώς και για τα αποτελέσματα της θεραπείας μετά την απομάκρυνση των ανδρογόνων. Σημαντικό επίσης είναι το ότι συμβάλλει στην έγκαιρη πρόγνωση του καρκίνου στα αρχικά στάδια και για το λόγο αυτό συνίσταται ο ετήσιος έλεγχος σε άνδρες άνω των 45 ετών. Αποτελεί μία γρήγορη μέθοδο, με υψηλή ευαισθησία και ακρίβεια, ενώ έχει μικρό κόστος. Ε.2.5 Μοντέλα μελέτης του καρκίνου του προστάτη Ο καρκίνος του προστάτη εμφανίζεται σπάνια σε άλλα ζώα εκτός από τον άνθρωπο και για το λόγο αυτό δεν υπάρχει κάποιο ιδανικό μοντέλο μελέτης. Ένα τέτοιο μοντέλο θα έπρεπε να έχει μικρή διάρκεια γενιάς, να επηρεάζεται από τη δράση ανδρογόνων, να παράγει PSA και να δίνει μεταστάσεις σε λεμφαδένες και οστά (Coffey et al., 1980). Υπάρχουν μοντέλα τρωκτικών των οποίων ο προστάτης είναι χωρισμένος σε λοβούς. Παρόλο που υπάρχουν ανατομικές διαφορές με τον προστάτη του ανθρώπου, τα τρωκτικά αποτελούν πολύτιμα μοντέλα μελέτης, εξαιτίας της ανδρογονο-εξαρτώμενης πρόκλησης καρκίνου, αλλά και γιατί είναι σχετικά οικονομικά και εύκολα στη χρήση (Lucia et al., 1998). Τέτοια μοντέλα είναι το MPR που επιτρέπει τη μελέτη των παρακρινών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των κυττάρων και το Dunning R

23 Εισαγωγή Τα τελευταία χρόνια έχει αναπτυχθεί και η τεχνολογία των διαγονιδιακών ζώων, που παρέχουν τη δυνατότητα εισαγωγής ξένου γενετικού υλικού στο γονιδίωμα του πειραματόζωου. Στη συγκεκριμένη περίπτωση επιτρέπεται η παρατήρηση της αλληλεπίδρασης των γονιδιακών προϊόντων και των κυτταρικών αποκρίσεων, σε in vivo σύστημα μελέτης. Αναφορικά με τον προστάτη, το TRAMP (Transgenic Adenocarcinoma Mouse Prostate) αποτελεί το μοντέλο μελέτης το οποίο αναπτύσσει και μεταστάσεις (Gingrich et al., 1996). Επίσης, χρησιμοποιούνται και ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές, οι περισσότερες από τις οποίες έχουν απομονωθεί από μεταστάσεις, με εξαίρεση τη PC- 93 που προέρχεται από πρωτογενή όγκο (Claas et al., 1983). Οι καλύτερα μελετημένες και οι πιο γνωστές είναι η DU145, η PC3 και η LNCaP. DU145 Η καρκινική κυτταρική σειρά DU145 απομονώθηκε από καρκίνο του προστάτη, με μετάσταση στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Η αρχική διάγνωση ήταν ελαφρώς διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα, ενώ η μετάσταση χαρακτηρίσθηκε ως μετρίως διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα, με εστίες ελαφρώς διαφοροποιημένων κυττάρων. Ο χρόνος διπλασιασμού των DU145 είναι περίπου 34h. Τα κύτταρα εμφανίζεται να είναι ευαίσθητα ή και εξαρτημένα από ορμόνες. Τα DU145 παράγουν EGF, TGF-α καθώς και τον υποδοχέα EGFR σε υψηλές συγκεντρώσεις, επάγοντας αυτοκρινώς τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Επιπλέον, διαθέτουν την ικανότητα παραγωγής bfgf, IGF-1 TGF-β, εκφράζουν τους αντίστοιχους υποδοχείς και διεγείρονται από εξωγενή bfgf, IGF-1 και TGF-β. Χαρακτηριστικό τους επίσης αποτελεί η έκφραση υποδοχέων τρανσφερρίνης η οποία, επάγει την ανάπτυξή τους και ενισχύει την ικανότητα μετάστασης (Webber et al., 1997). PC3 Η PC3 είναι μια καρκινική κυτταρική σειρά ανθρώπινου προστάτη με μετάσταση στην οσφυϊκή μοίρα της σπονδυλικής στήλης. Η διάγνωση για τον ασθενή από τον οποίο προήλθε η συγκεκριμένη κυτταρική σειρά, ήταν τόσο αρχικά, όσο και στη μετάσταση, ελαφρώς διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα. Τα κύτταρα χαρακτηρίζονται από απουσία του Υ χρωμοσώματος, αναπτύσσονται εξίσου καλά σε καλλιέργειες δύο ή τριών διαστάσεων (άγαρ) και έχουν την ικανότητα ογκογένεσης σε αθυμικά ποντίκια. Δεν εκφράζουν PSA και είναι ορμονο-ανεξάρτητα. Ωστόσο, υπάρχουν και μελέτες που έδειξαν ότι πιθανώς να εκφράζονται πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις PSA και υποδοχείς ανδρογόνων. 17

24 Εισαγωγή Τα κύτταρα PC3 εκφράζουν έντονα TGF-α, bfgf και τους υποδοχείς EGFR και FGFR, επάγοντας αυτοκρινώς την ανάπτυξή τους. Αξιοσημείωτο είναι το ότι μετά από επίδραση με εξωγενή bfgf δεν παρατηρείται καμιά απόκριση, αλλά μετά από επίδραση με εξωγενή TGF-β, παρατηρείται αναστολή της ανάπτυξης, η οποία όμως επανέρχεται στα φυσιολογικά μετά από διαρκή επίδραση 6 ημερών. Επιπλέον, το μόριο κυτταρικής προσκόλλησης των επιθηλιακών κυττάρων C-CAM ρυθμίζεται από τα ανδρογόνα και παρατηρείται μείωση της αύξησης και της ογκογένεσης που τα PC3 προκαλούν, όταν μετασχηματιστούν με το γονίδιο της C-CAM. Τέλος, παρόμοια με τα DU-145, έχουν την ικανότητα έκφρασης του υποδοχέα της τρανσφερίνης (Webber et al., 1997). LNCaP Η καρκινική κυτταρική σειρά ανθρώπινου προστάτη LNCaP απομονώθηκε από μετάσταση σε λεμφικό αδένα. Η διάγνωση ήταν μετρίως διαφοροποιημένος καρκίνος του προστάτη. Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των LNCaP κυττάρων είναι 60-72h, εξαρτώμενος από την συγκέντρωση του ορού και ο χρωμοσωματικός αριθμός τους είναι 76. Διαθέτουν την ικανότητα έκφρασης PSA και ΡΑΡ, καθώς και τον σχηματισμό όγκων σε αθυμικά ποντίκια. Στα LNCaP ανιχνεύονται υποδοχείς ανδρογόνων, οι οποίοι όμως έχουν μια μετάλλαξη στη θέση πρόσδεσης, με αποτέλεσμα να προσδένονται σ αυτούς και οιστρογόνα. Εκφράζουν EGF και TGF-α, ενώ η έκφραση του υποδοχέα EGFR επάγεται από τα ανδρογόνα και τα οιστρογόνα. Παρόλο όμως που παράγουν FGFR, δεν παράγουν σημαντικές ποσότητες bfgf. Μετά από επίδραση με εξωγενή EGF και bfgf παρατηρείται ανάπτυξη των κυττάρων και ενώ ο εξωγενής TGF-β δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό τους, επηρεάζει τη δράση των EGF και TGF-α (Webber et al., 1997). 18

25 Εισαγωγή Πίνακας Ε2. Έκφραση αυξητικών παραγόντων και των υποδοχέων τους σε καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη DU145 PC3 LNCaP ΑΥΞΗΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ EGF TGF-α bfgf IGF-I TGF-β ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΑΥΞΗΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ EGF/TGF-α-R FGFR IGF-I-R TGF-β-R , χαμηλά επίπεδα, +++ υψηλά επίπεδα -, μη ανιχνεύσιμα επίπεδα. Ε.3 HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) Η HARP ανήκει σε μια οικογένεια αυξητικών παραγόντων που δεσμεύονται στην ηπαρίνη. Στην ίδια οικογένεια ανήκει και η Midkine (Kadomatsu et al., 1988), καθώς και η ομόλογή της πρωτεΐνη στα πτηνά, η RI-HB (Retinoic acid Induced Heparin Binding protein) (Raulais et al., 1991). Επειδή απομονώθηκε παράλληλα από πολλές ερευνητικές ομάδες, απαντάται με διάφορες ονομασίες όπως PTN (Li et al., 1990), Heparin-Binding Growth Associated Molecule (HB-GAM) (Rauvala et al., 1989), Osteoblast Specific Factor-1 (OSF-1) (Tezuka et al., 1990), Heparin-Binding Brain Mitogen (HBBM) (Huber et al., 1990), p18 (Rauvala, 1989), Heparin-Binding Growth Factor-8 (HBGF-8) (Milner et al., 1989). Μετά όμως τον προσδιορισμό της αλληλουχίας τόσο του πολυπεπτιδίου, όσο και του γονιδίου της HARP, έγινε φανερό ότι όλες αυτές οι ονομασίες αντιστοιχούν στο ίδιο μόριο. 19

26 Εισαγωγή Η HARP παρουσιάζει πολλές ομοιότητες τόσο σε βιοχημικό επίπεδο, όσο και στη βιολογική της δράση με την οικογένεια των αυξητικών παραγόντων των ινοβλαστών (FGF). Σε χρωματογραφία σε στήλη heparin-sepharose εκλούεται μαζί με τον afgf, ενώ ομοιότητα παρουσιάζουν και στην ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα. Παρόλα αυτά, μετά την ολοκλήρωση της κλωνοποίησης και της αλληλούχισης του cdna της HARP, επιβεβαιώθηκε ότι το μόριο αυτό αποτελεί μια νέα εκκρινόμενη πρωτεΐνη. Η HARP επομένως διαφοροποιείται από την οικογένεια των FGFs γιατί: α. Η αμινοτελική αλληλουχία της είναι διαφορετική από αυτή που έχει προσδιορισθεί για την οικογένεια των FGFs (Rauvala et al., 1989). β. Είναι ευαίσθητη σε αναγωγικές συνθήκες. γ. Δεν αντιδρά με αντισώματα έναντι του afgf (Rauvala et al., 1989; Courty et al., 1991). Η πρωτοταγής δομή της HARP εμφανίζεται ιδιαίτερα συντηρημένη σε διάφορα είδη. Για παράδειγμα, η ανθρώπινη HARP είναι 99% ομόλογη με αυτή του αρουραίου και του ποντικού (Li 1990, Merenmies and Rauvala, 1990), ενώ 90% ομολογία παρουσιάζει η HARP των θηλαστικών με την HARP της όρνιθας (Hampton, 1992), καθώς και αυτή των θηλαστικών με την HARP του Xenopus (Tsujimura, 1995). Ε.3.1 Δομικά χαρακτηριστικά της HARP Το μοριακό βάρος της HARP, όπως προσδιορίστηκε μετά από ανάλυση σε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE, είναι 18 kda, κάτι όμως που δεν αντικατοπτρίζει την αμινοξική σύσταση του ώριμου μορίου, αφού μετά από ανάλυση με φασματοσκοπία μάζας, το μοριακό της βάρος προσδιορίστηκε στα 15,291 kda. Η διαφορά αυτή πιθανότατα οφείλεται στη μεγάλη περιεκτικότητα της HARP σε βασικά αμινοξέα (Hampton et al., 1992). Μετά από μελέτη του cdna του γονιδίου της, προέκυψε ότι είναι ένα πολυπεπτίδιο 168 αμινοξέων, που περιλαμβάνει μια εξαιρετικά υδρόφοβη περιοχή 32 αμινοξέων. Το πεπτίδιο-σινιάλο που βρίσκεται στην αρχή του αμινοτελικού άκρου συγκροτείται από 32 αμινοξέα. Το αρχικό μόριο, που απομονώθηκε από μήτρα αρουραίου, αντιστοιχεί σε ένα πολυπεπτίδιο 136 αμινοξέων το οποίο έχει προκύψει από πέψη μετά από το πεπτίδιο-σινιάλο, έχοντας αμινοξική αλληλουχία NH 2 -GKKEKP (Li et al., 1990). Στη συνέχεια όμως απομονώθηκε τόσο από μετασχηματισμένους με το cdna της HARP 20

27 Εισαγωγή NIH-3T3 ινοβλάστες, όσο και από ενδοθηλιακά κύτταρα ματιού βοός που παράγουν φυσιολογικά HARP και μια άλλη μορφή του μορίου. Η νέα αυτή μορφή αντιπροσώπευε το 10% της ολικής ποσότητας της HARP και περιελάμβανε τρία επιπρόσθετα αμινοξέα στο αμινοτελικό της άκρο με αλληλουχία ΝΗ 2 -AEAGKKE (Laaroubi et al., 1994). Στην ύπαρξη αυτών των τριών αμινοξέων αποδόθηκε αρχικά η μιτογόνος δράση του μορίου, αλλά στη συνέχεια αποδείχτηκε ότι και η μορφή NH 2 -GKKEKP έχει την ικανότητα να απάγει τον πολλαπλασιασμό BEL και ΝΙΗ-3Τ3 κυττάρων (Bernard-Pierrot et al., 2001). Παράλληλα, η απομόνωση της επιμηκυσμένης μορφής της HARP δημιούργησε και ερωτηματικά αναφορικά με την διαδικασία σύνθεσης και ωρίμανσής της. Πίνακας Ε3. Αμινοξική αλληλουχία της HARP. Μ S S Q Q Y Q Q Q R R K F A Α A F L A L I F I L A Α V D T *A E A *G K Κ E K P E K Κ V K Κ S D C G E W Q W S V C V P T S G T C G L G T R E G T R T G A E C K Q T M K T Q R C K I P C N W K Κ Q F G A E C K Y Q F Q A W G E C D L N T A L K T R T G S L T R A L H N A D C Q K T V T I S K P C G K L T K P K P Q A E S K Κ K Κ K E G K Κ Q E K M L D Το υπογραμμισμένο τμήμα αντιστοιχεί στο πεπτίδιο σινιάλο. Με * σημειώνονται τα δύο σημεία στα οποία μπορεί να πραγματοποιηθεί η πέψη και η απομάκρυνση του πεπτιδίου αυτού. Το 24% των αμινοξέων του ώριμου μορίου της HARP είναι βασικά αμινοξέα, κυρίως λυσίνες, τα οποία είναι ομαδοποιημένα στο αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο του μορίου, προσδίνοντάς του μια βασική συμπεριφορά, με ισοηλεκτρικό σημείο pi=10,1. Οι περιοχές αυτές είναι σημαντικές για την πρόσδεση της HARP στην ηπαρίνη (Bohlen et al., 1991) και στην εξωκυττάρια ύλη (Li et al., 1990; Kinnunen et al., 1996). Στο μόριο επίσης περιέχονται και δέκα κυστεΐνες, το ποσοστό όμως συμμετοχής τους στη δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών αποτελούσε ένα αμφιλεγόμενο ζήτημα, αφού υπήρχαν αναφορές για συμμετοχή έξι μόνο κυστεϊνών (Hampton et al., 1992), ενώ οι περισσότερες μελέτες υποστηρίζουν τη συμμετοχή όλων (Seddon et al., 1994). Σήμερα γνωρίζουμε ότι οι δισουλφιδικοί δεσμοί δημιουργούνται μεταξύ της Cys15- Cys44, της Cys23- Cys53, της Cys30- Cys57, της Cys67-Cys 99 και της Cys77-Cys109 (Hulmes et al., 1993). Οι δισουλφιδικοί δεσμοί αν και προσδίδουν σταθερότητα στο μόριο της HARP από αλλαγές στο ph ή από την ύπαρξη οργανικών διαλυτών (Hampton, 1992), την καθιστούν ευαίσθητη σε αναγωγικές συνθήκες. Η ύπαρξη αυτών των δέκα κυστεϊνών εξηγεί τη δυσκολία απομόνωσης ανασυνδυασμένης HARP (από 21

28 Εισαγωγή προκαρυωτικούς οργανισμούς) με σωστή δομή και πλήρη βιολογική δράση (Kuo et al.,1992). Μέχρι σήμερα δεν έχει διασαφηνιστεί η τρισδιάστατη διαμόρφωση του μορίου της HARP. Ωστόσο, μελέτες με NMR έδειξαν ότι η ανασυνδυασμένη HARP που παράχθηκε τόσο σε κύτταρα εντόμων, όσο και σε βακτήρια E.coli, αποτελείται από δύο κεντρικές περιοχές, μία προς το αμινοτελικό και μια προς το καρβοξυτελικό άκρο του μορίου, οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους με έναν ελαστικό σύνδεσμο. Κάθε κεντρική περιοχή περιέχει τρεις αντιπαράλληλες β-πτυχώσεις, που αντιστοιχούν στα αμινοξέα 18-27, 32-39, 48-57, 70-78, και Το αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο του μορίου που είναι πλούσια σε λυσίνες, δεν έχουν μια συγκεκριμένη διαμόρφωση, αλλά σχηματίζουν τυχαίες περιελίξεις (Kilpeläinen et al., 2000). Τα δεδομένα αυτά έρχονται σε αντίθεση με παλαιότερη αναφορά σύμφωνα με την οποία τα άκρα της HARP διαθέτουν δομή α-έλικας (Delbe et al., 1995). Εικόνα Ε5. Αναπαράσταση του μορίου της HARP, σύμφωνα με το οποίο όλες οι κυστεΐνες συμβάλλουν στη δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών. Διακρίνονται οι δύο κεντρικές περιοχές του μορίου, οι οποίες περιλαμβάνουν από τρεις αντιπαράλληλες β- πτυχωτές επιφάνειες, καθώς και τα δύο άκρα του μορίου, τα οποία έχουν τυχαία διαμόρφωση. Μελέτη των κεντρικών περιοχών της HARP έδειξε ότι έχει αλληλουχίες που αντιστοιχούν στις επαναλαμβανόμενες περιοχές τύπου I της θρομβοσπονδίνης (Thrombospondin type I repeat, TSR) (Rauvala et al., 2000; Kilpenainen et al., 2000). Φαίνεται ότι οι περιοχές TSR των διάφορων πρωτεϊνών έχουν παρόμοια δομικά στοιχεία που δικαιολογούν την ικανότητα δέσμευσή τους στην ηπαρίνη. Οι δύο κεντρικές περιοχές της HARP δεσμεύονται με την ηπαρίνη, γεγονός που καθιστά δυνατή την απομόνωση και τον καθαρισμό της. Ωστόσο, θα πρέπει να αναφερθεί ότι 22