«ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΛΙΠΟΣΩΜΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΝΕΩΝ ΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ ΓΙΑ ΟΦΘΑΛΜΙΚΗ ΧΟΡΗΓΗΣΗ»

Μέγεθος: px
Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "«ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΛΙΠΟΣΩΜΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΝΕΩΝ ΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ ΓΙΑ ΟΦΘΑΛΜΙΚΗ ΧΟΡΗΓΗΣΗ»"

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΛΙΠΟΣΩΜΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΝΕΩΝ ΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ ΓΙΑ ΟΦΘΑΛΜΙΚΗ ΧΟΡΗΓΗΣΗ» Για την απόκτηση του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στην κατεύθυνση «Βιομηχανική Φαρμακευτική και Ανάλυση Φαρμάκων» ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ Η. ΠΑΧΗΣ Πάτρα 2012

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Ανάπτυξη λιποσωμικών μορφών νέων δραστικών μορίων για οφθαλμική χορήγηση» ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ Η. ΠΑΧΗΣ Σοφία Αντιμησιάρη Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Παύλος Κλεπετσάνης Επίκουρος Καθηγητής Τμήματος Φαρμακευτικής Γεωργία Σωτηροπούλου Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτική 2

3 Αφιερώνεται στον Κώστα και το Βασίλη 3

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακευτικής Τεχνολογίας, του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Ειδίκευσης στην κατεύθυνση «Βιομηχανική Φαρμακευτική και Ανάλυση Φαρμάκων» κατά τα έτη Θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες προς την επιβλέπουσα καθηγήτρια κα. Σ. Αντιμησιάρη, Καθηγήτρια του Τμήματος Φαρμακευτικής για την ανάθεση του θέματος και την πολύτιμη βοήθειά της κατά τη διάρκεια αυτής της εργασίας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα δύο μέλη της εξεταστικής επιτροπής κ. Π. Κλεπετσάνη και κα. Σωτηροπούλου για τη βοήθειά τους καθ όλη τη διάρκεια του προγράμματος. Θα ήθελα, τέλος, να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου για την άψογη συνεργασία και το ζεστό κλίμα που βοήθησε πολύ αυτά τα δύο χρόνια καθώς και την οικογένειά μου, που στάθηκε δίπλα μου ηθικά και μη στην εκπόνηση αυτής της εργασίας. 4

5 Περιεχόμενα Περίληψη...9 Abstract 11 Εισαγωγή Γενική εισαγωγή στα λιποσώματα Αμφίφιλα μόρια Οργάνωση Διπλοστοιβάδες λιπιδίων Φωσφολιπίδια Μεταβολές φάσης διπλοστοιβάδων Μεικτά συστήματα διπλοστοιβάδων Σχηματισμός λιποσωμάτων Λιποσώματα ως μεταφορείς βιοδραστικών ουσιών Ταξινόμηση των λιποσωμάτων Ταξινόμηση με βάση το μέγεθος Ταξινόμηση με βάση τη σύσταση και τις εφαρμογές Μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων Πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (Multilamellar vesicles) (MLV) Μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (Small unilamellar vesicles) (SUV) Μεγάλα μονοστοιβαδιακά λιποσώματα(large unilamellar vesicles) (LUV)) Γιγαντιαία λιποσώματα Πολυδιαμερισματικά λιποσώματα (Multivesicular) Τεχνικές καθαρισμού λιποσωμάτων Διαπίδυση ισορροπίας (dialysis) Φυγοκέντρηση (centrifugation) Χρωματογραφία γέλης (gel chromatography) Φυσικές ιδιότητες λιποσωμάτων Μέτρηση μεγέθους Επιφανειακό φορτίο Μεταβολική πορεία των λιποσωμάτων στον οργανισμό Συμβατικά Λιποσώματα Λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας Κυκλοδεξτρίνες (Γενικά)

6 Προέλευση κυκλοδεξτρινών Δομικά χαρακτηριστικά Σχηματισμός συμπλόκων κυκλοδεξτρινών με βιοδραστικές ενώσεις Μέθοδοι ανάλυσης και χαρακτηρισμού συμπλόκων κυκλοδεξτρίνης Παράγωγα Διυδροεπιανδροστερόνης Ιδιότητες διυδροεπιανδροστερόνης ως νευροστεροειδές Παράγωγα διυδροεπιανδροστερόνης Σκοπός εργασίας Πειραματικό μέρος Συσκευές και όργανα Υλικά Μέθοδοι Προσδιορισμός συγκέντρωσης λιπιδίου Μέθοδος Stewart Μέθοδος προσδιορισμού των παραγώγων Α, Β, C Μέθοδοι παρασκευής διαλυμάτων συμπλόκων παραγώγου Α/Κυκλοδεξτρίνης Μέθοδοι παρασκευής στερεών συμπλόκων παραγώγυ Α/Κυκλοδεξτρίνης Μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων Χαρακτηρισμός μορφών Χαρακτηριστικά συμπλόκων παραγώγου Α/Κυκλοδεξτρίνης Μέτρηση μεγέθους λιποσωμάτων Μέτρηση ζ-δυναμικού...93 Αποτελέσματα Συζήτηση Σύμπλοκο παραγώγου Α/Κυκλοδεξτρίνης Συμβατικές λιποσωμικές μορφές Μελέτη συμβατικών λιποσωμάτων που ενσωματώνουν παράγωγο Α Μελέτη συμβατικών λιποσωμάτων που ενσωματώνουν παράγωγο Β Μελέτη συμβατικών λιποσωμάτων που ενσωματώνουν παράγωγο C Σύνοψη των συμβατικών λιποσωμάτων, διαφόρων λιπιδικών συστάσεων, που ενσωματώνουν παράγωγα Α, Β, C

7 3.2.5 Μελέτη σταθερότητας μεγέθους λιποσωμάτων Υβριδικές λιποσωμικές μορφές Μελέτη υβριδικών λιποσωμάτων που εγκλωβίζουν σύμπλοκο ΗP-β-CD/A Σύνοψη των υβριδικών λιποσωμάτων, διαφόρων λιπιδικών συστάσεων, που εγκλωβίζουν σύμπλοκα HP-β-CD/A Σύγκριση συμβατικών και υβριδικών λιποσωμάτων Συμπεράσματα Παρασκευή συμβατικών λιποσωμικών μορφών Μελέτη διαλυτότητας και συμπλοκοποίησης του A με κυκλοδεξτρίνες Παρασκευή υβριδικών λιποσωμικών μορφών Βιβλιογραφία

8 Πίνακας συντομεύσεων CHOL PC hpc DPPC DRV DSPC HP-β- CD MLV XRD PBS DPPG PEG SUV TBS T m Χοληστερόλη (Phosphatidilocholine) φωσφατιδιδυλοχολίνη (hydrogenated phosphatidylcholine) υδρογονοποιημένη φωσφατιδυλοχολίνη (dipalmitoylglycerophosphatidylcholine) διπαλμιτοϋλογλυκεροφωσφατιδυλοχλινη (Dehydrated-Rehydrated Vesicle) Αφυδατωμένοεπανενυδατωμένο κυστίδιο (distearyloglycerophosphatidylcholine) διστεαρυλογλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη (Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin) υδροξυπρόπυλ-βήτακυκλοδεξτρίνη (multilamellar vesicle) πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (X ray Diffraction ) Περίθλαση ακτίνων - Χ (phosphate buffer saline) ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (dipalmitoylglycerophosphoglycerol) Διπαλμιτοϋλογλυκεροφωσφογλυκερόλη (polyethylenglycol) πολυαιθυλενογλυκόλη (small unilamellar vesicle) μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (Tris Buffer Saline) ρυθμιστικό διάλυμα Tris (Transition temperature) Θερμοκρασία μετάπτωσης 8

9 Περίληψη Μελέτες έχουν δείξει ότι το νευροστεροειδές διυδροεπιανδροστερόνη (DHEA) προστατεύουν τους νευρώνες από ανοξία και απόπτωση. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι το DHEA ενισχύει την κινητική δραστηριότητα πιθήκων με τη νόσο του Parkinson, ενώ επίσης σε συνδυασμό με την αλλοπρεγνανολόνη προκαλεί δημιουργία νευρώνων σε αρκετά πειραματικά μοντέλα. Τα λιποσώματα είναι σφαιρικά σωματίδια αποτελούμενα από ενυδατωμένες διπλοστοιβάδες φωσφολιπιδίων οι οποίες σχηματίζονται αυθόρμητα κατά τη διασπορά λιπιδίων στο νερό, εγκλωβίζοντας υδατικό διάλυμα στο εσωτερικό τους. Οι κυκλοδεξτρίνες είναι ολιγοσακχαρίτες με ειδική δομή κώνου, που έχουν υδρόφιλη πολική επιφάνεια και μη πολική εσωτερική κοιλότητα, έχουν τη δυνατότητα να ενσωματώνουν λιπόφιλα φάρμακα στην εσωτερική τους κοιλότητα (με τη δημιουργία συμπλόκων) και να αυξάνουν την υδατική διαλυτότητά τους. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν τρία παράγωγα του νευροστεροειδούς DHEA, που έχουν τροποποιηθεί στις θέσεις C3 και C17 με σκοπό να βελτιώσουν την αντιαποπτωτική και νευροπροστατευτική δράση τους, καθώς και την αναστολή της μετατροπής τους σε ανδρογόνα και οιστρογόνα. Τα παράγωγα αυτά είναι εξαιρετικά λιπόφιλα και έχουν μικρό μοριακό βάρος και πολύ χαμηλή διαλυτότητα, γεγονός που καθιστά αδύνατη την χορήγησή τους. Για να αντιμετωπιστεί το πρόβλημα της χαμηλής διαλυτότητας, δοκιμάστηκαν δύο μέθοδοι: (1) H παρασκευή σύμπλοκων με υδροξυ-προπυλ-βκυκλοδεξτρίνη (HP-beta-CD), και (2) Η ενσωμάτωσν των νευροστεροειδών στη λιπιδική μεμβράνη μικρών μονοστoιβαδιακών λιποσωμάτων (SUV) διαφόρων λιπιδικών συστάσεων. Μετά από τροποποίηση μιας ειδικής τεχνικής μέτρησης των στεροειδών, υπολογίστηκαν οι συγκετρώσεις που ενσωματώθηκαν στα λιποσώματα, καθώς και στα σύμπλοκα με τη κυκλοδεξτρίνη. Οι λιποσωμικές μορφές των παραγώγων δεν είχαν την αναμενόμενη ικανότητα ενσωμάτωσης τους, με αποτέλεσμα η συγκέντρωση των λιποσωμικών διαπορών να μην είναι αρκετά υψηλή για in vivo χορήγηση. Αντίθετα η HP-β-CD έδωσε σύμπλοκα που αύξησαν την υδατική διαλυτότητα των παραγώγων θεαματικά. 9

10 Τα σύμπλοκα χαρακτηρίστηκαν με διάφορες τεχνικές, για να πιστωποιηθεί ο σχηματισμός τους. Με σκοπό να παρασκευαστούν μορφές με δυνατότητα ελεγχόμενης αποδέσμευσης των στεροειδών, μελετήθηκε στο επόμενο στάδιο της διατριβής, η ανάπτυξη υβριδικών μορφών που περιλαμβάνουν τον συνδυασμό συμπλόκων κυκλοδεξτρίνης και λιποσωμάτων, δηλαδή: λιποσώματα που στην εσωτερική τους κοιλότητα εγκλωβίζουν τα υδατοδιαλυτά σύμπλοκα των παραγώγων με κυκλοδεξτρίνες. Τα υβριδικά αυτά συστήματα είχαν αυξημένη ενσωμάτωση των νευροστεροειδών σε σύγκριση με τα συμβατικά λιποσώματα και κατάλληλα χαρακτηριστικά για in vivo χορήγηση. 10

11 Abstract Studies have shown that the neuroactive steroid dehydroepiandrosterone (DHEA) protects neurons from anoxia and apoptosis. It has also been demonstrated that DHEA is able to potentiate locomotor activity of hemi Parkinsonian monkeys, and in conjunction with allopregnanolone can induce neurogenesis in various experimental models. Liposomes are spherical particles composed of hydrated bilayers of phospholipids which are formed spontaneously during the dispersion of lipids in water, entrapping aqueous solution inside. Cyclodextrins are oligosaccharides with specific cone structure that have the ability to incorporate lipophilic drugs and increase their aqueous solubility. In the present study, three DHEA analogues were used, which have been modified at positions C3 and C17 in order to improve the antiapoptotic and neuroprotective activity, and to inhibit of their conversion into androgens and estrogens. These derivatives are highly lipophilic and have small molecular weight. In order to find a solution for their very low aqueous solubility which is a problem for their in vivo administration, two methodologies were investigated: (1) The formation of soluble complexes with hydroxy-propyl-beta-cyclodextrin (HP-β- CD), and (2) the incorporation of the steroids in the lipid bilayer of small unilamellar liposomes (SUV) of various lipid compositions. After adjusting a special measurement technique for the neurosteroids, we calculated the concentration of the neurosteroids incorporated into liposomes, as well as in complexes with the cyclodextrin. The liposomal forms of the derivatives did not have the expected integration ability, resulting in a concentration of liposomal dispersion which is not high enough for in vivo administration. On the other hand, the HP-β-CD complexes increased the aqueous solubility of the derivatives to a significant extent. The complexes were characterized by various techniques, in order to verify their existence. With the aim of preparing formulations with the ability of controlled release of steroids, we investigated in the last part of this thesis, the possibility to develop hybrid 11

12 systems that consist of liposomes which entrap the highly soluble steroid-cyclodextrin complexes in their internal cavity. These hybrid systems had better integration capacity compared to conventional liposomes and were suitable for in vivo administration (for both intravenous and intravitreal administration). These hybrid systems can also ensure controlled release of the steroid analogues. 12

13 1. Εισαγωγή 13

14 1.1 Γενική εισαγωγή στα λιποσώματα Τα λιποσώματα είναι κολλοειδή σωματίδια σφαιρικού σχήματος τα οποία περιέχουν μία ή περισσότερες διπλοστοιβάδες λιπιδίων που εναλλάσσονται με υδατικά τμήματα. Τα σωματίδια αυτά σχηματίζονται αυθόρμητα όταν τα λιπίδια διασπείρονται σε υδατικό μέσο δημιουργώντας ένα πληθυσμό κυστιδίων το μέγεθος των οποίων κυμαίνεται από μερικές δεκάδες νανομέτρων έως δεκάδες μικρομέτρων σε διάμετρο. Τα λιπίδια όντας αμφίφιλα μόρια όταν βρεθούν σε υδατικό περιβάλλον, για θερμοδυναμικούς λόγους, απομονώνουν τις υδρόφοβες περιοχές τους σχηματίζοντας σφαιρικές διπλοστοιβάδες (Σχήμα 1.1). Αυτές οι διπλοστοιβάδες αναφέρονται ως lamellae. Σχήμα 1.1. Λιπιδική διπλοστοιβάδα και λιπόσωμα. Τα λιποσώματα παρασκευάζονται έτσι ώστε να παγιδεύουν ποσότητες υλικών τόσο στο εσωτερικό υδατικό διαμέρισμα όσο και εντός της λιπιδικής διπλοστοιβάδας (Σχήμα 1.2). Η αξία των λιποσωμάτων ως μοντέλα μεμβρανικών συστημάτων και ως συστήματα χορήγησης φαρμάκων συνδέεται με το γεγονός ότι τα λιποσώματα αποτελούνται από συστατικά φυσικής προέλευσης. Η λιποσωμική μεμβράνη σχηματίζει μια δομή διπλοστοιβάδας η οποία σε βασικές γραμμές είναι πανομοιότυπη με το λιπιδικό τμήμα των φυσικών κυτταρικών μεμβρανών (μοντέλο ρευστού μωσαϊκού κατά Singer και Nicholson). Η ομοιότητα μεταξύ των λιποσωμάτων και των κυτταρικών μεμβρανών αυξάνεται μέσω της δυνατότητας που υπάρχει για εκτενή 14

15 χημική τροποποίηση της λιποσωμικής μεμβράνης και μπορεί να αξιοποιηθεί σε τομείς που αφορούν τη στόχευση βιοδραστικών ενώσεων ή την ανοσοτροποποίηση, in vitro και in vivo. Η δυνατότητα των λιποσωμάτων να μιμούνται τη συμπεριφορά των κυτταρικών μεμβρανών και να αποικοδομούνται από τις ίδιες μεταβολικές οδούς, τα κάνουν ένα πολύ ασφαλές και αποτελεσματικό σύστημα για ιατρικές εφαρμογές. Εναλλακτικά τα λιποσώματα μπορεί να απαρτίζονται μερικώς ή εξ ολοκλήρου από συνθετικά συστατικά, που επιλέγονται επειδή φέρουν βελτιωμένες χημικές ιδιότητες. Επομένως εκτός των φωσφολιπιδίων, σταθερά οχήματα μεμβρανικής διπλοστοιβάδας μπορούν να σχηματιστούν από ένα ευρύ φάσμα άλλων αμφίφιλων μορίων ή μίγματα αυτών, όπως για παράδειγμα λιπαρά οξέα, δευτεροταγείς αμίνες διπλής αλυσίδας ή παράγωγα χοληστερόλης. Σχήμα 1.2. Απεικόνιση λιποσώματος για μεταφορά βιοδραστικών ενώσεων. Ένα χαρακτηριστικό των λιπιδικών διπλοστοιβάδων είναι ότι είναι συνεργειακές δομές. Τέτοιες δομές διατηρούνται εξαιτίας πολλών αλληλοενισχυόμενων, μη ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων. Τα φωσφολιπίδια και τα γλυκολιπίδια ως αμφιπαθή μόρια σε υδατικό περιβάλλον συναθροίζονται το ένα δίπλα στο άλλο για να ελαχιστοποιήσουν τον αριθμό των εκτεθειμένων υδρογονανθρακικών αλυσίδων. Οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις είναι η κύρια 15

16 κινητήρια δύναμη στον σχηματισμό λιπιδικών μεμβρανών. Αυτή η συνάθροιση υδρογονανθρακικών αλυσίδων ευνοείται επίσης και από τις μεταξύ τους ελκτικές δυνάμεις τύπου Van der Waals, καθώς επίσης και από τις ηλεκτροστατικές δυνάμεις και τους δεσμούς υδρογόνου μεταξύ των πολικών κεφαλών και των μορίων νερού από το περιβάλλον. Η συμπεριφορά των λιπιδίων σε υδατικό περιβάλλον υπαγορεύεται από εγγενείς παράγοντες όπως η πολικότητα του λιπιδίου, το μήκος της αλειφατικής αλυσίδας λιπαρού οξέος, η θέση και ο βαθμός ακορεστότητας της αλειφατικής αλυσίδας, από τη διακλάδωση αλειφατικού οξέος, η πολικότητα και το φορτίο της περιοχής της κεφαλής καθώς επίσης και από εξωγενείς παράγοντες όπως η συγκέντρωση (lyotropism) και η θερμοκρασία (thermotropism). Τα φωσφολιπίδια διαφέρουν σημαντικά από τα αλλά αμφίφιλα μόρια (απορρυπαντικά, λυσολεκιθίνη) στο ότι η ευνοούμενη δομή για τα περισσότερα από αυτά σε υδατικό περιβάλλον είναι το διμοριακό λεπτό φύλλο, και όχι το μικκύλιο. Ο λόγος είναι ότι οι δυο αλυσίδες λιπαρών οξέων δίνουν στα μόρια των φωσφολιπιδίων ένα σχήμα κυλινδρικό καταλαμβάνοντας υπέρμετρα μεγάλο όγκο και επομένως δε χωρούν στο εσωτερικό ενός μικκυλίου αλλά είναι κατάλληλα να οργανώνονται σε λιπιδικές διπλοστοιβάδες (Σχήμα 1.3). Σχήμα 1.3. Η γεωμετρική έννοια της συσκευασίας: η παράμετρος συσκευασίας των αμφίφιλων μορίων, των ενεργειακά προτιμημητέων συνολικών δομών και των αντίστοιχων φάσεων. 16

17 Προκειμένου να γίνει κατανοητή η συμπεριφορά των λιποσωμάτων, θα παρουσιαστούν στη συνέχεια, μερικά γενικά χαρακτηριστικά γνωρίσματα των αμφίφιλων μορίων και η συμπεριφορά τους σε υδατικό περιβάλλον. 1.2 Αμφίφιλα μόρια Τα αμφίφιλα μόρια βρίσκουν εφαρμογή σε ένα ευρύ φάσμα προϊόντων, τόσο διαφορετικά όσο μεταξύ τους είναι τα απορρυπαντικά, τα χρώματα, το επίστρωμα εγγράφου, τα τρόφιμα και τα φαρμακευτικά προϊόντα. Το ειδικό κοινό χαρακτηριστικό τους να συσσωματώνονται αυθόρμητα (δηλ. αυτό-οργάνωση) σε ποικίλες δομές είναι αυτό που τους επιτρέπει να είναι χρήσιμα σε έναν μεγάλο αριθμό εφαρμογών Οργάνωση Ο λόγος για τον οποίο τα αμφίφιλα μόρια αυθόρμητα οργανώνονται, για να διαμορφώσουν μια ποικιλία από μικροδομές, οφείλεται στο ιδιαίτερο συνδυασμό των τμημάτων που φέρουν και συνδυάζουν ευελιξία, κατάλληλη διαμόρφωση αλλά και τμήματα με διαλυτότητες σε διαλύτες με μεγάλη διαφορά στη πολικότητα. Όλα τα αμφίφιλα μόρια αποτελούνται από ένα μέρος που είναι διαλυτό σε μη πολικούς διαλύτες, και ένα δεύτερο μέρος που είναι διαλυτό σε πολικούς διαλύτες. Έτσι, η διάλυση των ενώσεων αυτών είτε σε μη-πολικούς διαλύτες είτε σε πολύ πολικούς διαλύτες, όπως το νερό, έχει ως συνέπεια την αυτοοργάνωση και αυτοδόμηση των μορίων αυτών κατά τρόπο ώστε τα μη διαλυτά τμήματά τους (στον αντίστοιχο διαλύτη) να κρύβονται από το περιβάλλον του διαλύτη. Αυτό σημαίνει ότι οι διαλύτες που είναι είτε μη πολικοί, είτε πολύ πολικοί, όπως το νερό, προάγουν την αυτό-οργάνωση. Στις βιολογικές εφαρμογές, ο διαλύτης είναι το νερό. Στα περισσότερα αμφίφιλα μόρια, το υδρόφοβο μέρος αποτελείται από αλυσίδες υδρογονανθράκων, ενώ το υδρόφιλο μέρος είναι η πολική κεφαλή. Στα υδατικά διαλύματα, τα αμφίφιλα μόρια διαλύονται ως μονομερή, καταρχάς, αλλά επάνω από μια ορισμένη συγκέντρωση, για να ελαχιστοποιήσουν τις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, οργανώνονται αυθόρμητα. Αυτή η αυτό-οργάνωση συνοδεύεται συνήθως από την αύξηση της εντροπίας του συστήματος. Η αύξηση της 17

18 εντροπίας οφείλεται στις αλληλεπιδράσεις νερού-υδρογονανθράκων, που αναγκάζουν τα μόρια του νερού σε μια διατεταγμένη δομή γύρω από το υδρόφοβο τμήμα, όταν τα αμφίφιλα μόρια καταβυθίζονται ελεύθερα ως μονομερή. Η απελευθέρωση των διατεταγμένων μορίων νερού μπορεί να επιτευχθεί με μετακίνηση των υδρόφοβων τμημάτων εκτός του υδατικού διαλύματος και το διαχωρισμό τους μέσα στο εσωτερικό των νέων δομών. Κατά συνέπεια, η αύξηση της εντροπίας που οφείλεται στα μόρια του νερού μπορεί να οδηγήσει σε ένα γενικό κέρδος στην ελεύθερη ενέργεια, έτσι ώστε η οργάνωση να πραγματοποιείται αυθόρμητα. Πρέπει να αναφερθεί, εντούτοις, ότι υπάρχει ακόμα αμφισβήτηση για την ακρίβεια αυτής της θεωρίας. 1.3 Διπλοστοιβάδες λιπιδίων Η διπλοστοιβάδα λιπιδίου είναι μια λεπτή μεμβράνη φτιαγμένη από δύο στρώματα μορίων λιπιδίου. Αυτές οι μεμβράνες είναι επίπεδα φύλλα που διαμορφώνουν ένα συνεχές φράγμα γύρω από τα κύτταρα. Η κυτταρική μεμβράνη σχεδόν όλων των ζωντανών οργανισμών αποτελείται από διπλοστοιβάδα λιπιδίων, όπως επίσης και οι μεμβράνες που περιβάλλουν τους πυρήνες των κυττάρων και άλλες υπομοριακές δομές. Οι διπλοστοιβάδες λιπιδίων είναι το φράγμα που συγκρατεί ιόντα, πρωτεΐνες και άλλα μόρια όπου απαιτείται και τα αποτρέπουν από τη διάχυση σε περιοχές όπου δεν πρέπει να είναι. Οι διπλοστοιβάδες λιπιδίων ταιριάζουν ιδανικά σε αυτόν τον ρόλο επειδή, ακόμα κι αν έχουν μόνο μερικά νανόμετρα πάχος, είναι αδιαπέραστες από τα περισσότερα υδατοδιαλυτά (υδρόφιλα) μόρια. Οι διπλοστοιβάδες είναι ιδιαίτερα αδιαπέραστες από ιόντα, κάτι το οποίο επιτρέπει στα κύτταρα να ρυθμίζουν τη συγκέντρωση και το ph με την άντληση ιόντων στις μεμβράνες τους, χρησιμοποιώντας ειδικές πρωτεΐνες, τις αποκαλούμενες αντλίες ιόντων (πχ. Κ +, Νa + κ.α.). Οι φυσικές διπλοστοιβάδες αποτελούνται συνήθως από φωσφολιπίδια, τα οποία έχουν μία υδρόφιλη κεφαλή και δύο υδρόφοβες ουρές. Όταν τα φωσφολιπίδια εκτίθενται στο νερό, διευθετούνται σε ενός ή δυο επιπέδων φύλλο (μία διπλοστοιβάδα) με όλες τις ουρές τους, διευθετημένες προς το κέντρο της στοιβάδας. Το κέντρο αυτής της διπλοστοιβάδας δεν περιέχει σχεδόν καθόλου ύδωρ και αποκλείει επίσης μόρια όπως σάκχαρα ή άλατα που διαλύονται στο νερό αλλά όχι σε 18

19 οργανικούς διαλύτες. Αυτή η διαδικασία οργάνωσης είναι παρόμοια με τη συγχώνευση των σταγονιδίων πετρελαίου στο νερό και οδηγείται από την ίδια δύναμη, την αποκαλούμενη υδροφοβική επίδραση. Επειδή οι διπλοστοιβάδες λιπιδίων είναι αρκετά ευαίσθητες και είναι τόσο λεπτές που είναι αόρατες σε ένα κοινό μικροσκόπιο, η μελέτη τους αποτελεί πρόκληση. Η έρευνα στις διπλοστοιβάδες απαιτεί συχνά προηγμένες τεχνικές, όπως η μικροσκόπια ηλεκτρονίων και η μικροσκοπία ατομικών δυνάμεων. Οι βιολογικές μεμβράνες περιλαμβάνουν και άλλες κατηγορίες λιπιδίων εκτός από τα φωσφολιπίδια. Ένα ιδιαίτερα σημαντικό παράδειγμα στα ζωικά κύτταρα είναι η χοληστερόλη, που βοηθά ενισχύοντας τη διπλοστοιβάδα και μειώνοντας τη διαπερατότητά της. Η χοληστερόλη βοηθά επίσης να ρυθμίσει τη δραστηριότητα ορισμένων πρωτεϊνών των μεμβρανών. Οι πρωτεΐνες μεμβρανών γίνονται λειτουργικές μόνο όταν ενσωματώνονται σε μία λιπιδική διπλοστοιβάδα. Επειδή οι διπλοστοιβάδες καθορίζουν τα όρια του κυττάρου και των διαμερισμάτων του, αυτές οι πρωτεΐνες συμμετέχουν σε πολλές δια- και μεσοκυτταρικές διαδικασίες σηματοδότησης. Ορισμένα είδη πρωτεϊνών μεμβρανών συμμετέχουν στη διαδικασία σύντηξης δύο διπλοστοιβάδων. Η σύντηξη επιτρέπει την ένωση δύο ευδιάκριτων δομών όπως την είσοδο ενός ιού σε ένα κύτταρο. Η κατηγορία λιπιδίων που θα εξεταστεί στην παρούσα εργασία είναι τα γλυκεροφωσφολιπίδια, συχνά αποκαλούμενα και φωσφολιπίδια Φωσφολιπίδια Τα φωσφολιπίδια είναι μια κατηγορία λιπιδίων και αποτελούν ένα σημαντικό συστατικό των κυτταρικών μεμβρανών καθώς μπορούν να διαμορφώνονται σε διπλοστοιβάδες. Τα περισσότερα φωσφολιπίδια περιέχουν ένα διγλυκερίδιο, μια ομάδα φωσφορικού άλατος, και ένα απλό οργανικό μόριο όπως χολίνη. Μια εξαίρεση σε αυτόν τον κανόνα αποτελεί η σφιγγομυελίνη, η οποία παράγεται από σφιγγοσίνη αντί γλυκερίνης. Το πρώτο φωσφολιπίδιο που προσδιορίστηκε υπό αυτήν τη μορφή στους βιολογικούς ιστούς ήταν λεκιθίνη, ή φωσφατιδυλοχολινη, στη λέκιθο αυγών, από τον Theodore Nicolas Gobley, έναν γάλλο φαρμακοποιό και χημικό, το

20 Σχήμα 1.4 Δομή φωσφολιπιδίου Οι αλυσίδες των λιπαρών οξέων στα φωσφολιπίδια και τα γλυκολιπίδια συνήθως περιέχουν άρτιο αριθμό ατόμων άνθρακα, συνήθως μεταξύ 14 και 24. Πιο συχνά βρίσκουμε τα λιπαρά οξέα με 16 και 18 άτομα άνθρακα. Τα λιπαρά οξέα μπορεί να είναι ακόρεστα ή κορεσμένα. Το ισόμερες που ανευρίσκεται στα ακόρεστα λιπαρά είναι σχεδόν πάντα στη cis μορφή. Ένα κεκορεσμένο λιπαρό οξύ περιέχει μόνο απλούς δεσμούς ενώ τα ακόρεστα λιπαρά οξέα έχουν διπλούς δεσμούς στην υδρογονανθρακική αλυσίδα τους. Οι διπλοί δεσμοί των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων χωρίζονται από μια τουλάχιστον μεθυλενική ομάδα. Η διαμόρφωση και ο αριθμός αυτών των διπλών δεσμών καθώς και το μήκος της αλυσίδας επιδρά στο σημείο τήξης και στα χαρακτηριστικά ρευστότητας της μεμβράνης. Τα περισσότερα φωσφολιπίδια φυσικής προέλευσης είναι «μίγματα» επειδή τα λιπαρά οξέα που συνάπτονται στις θέσεις 1 και 2 του ίδιου μορίου συνήθως είναι διαφορετικά μεταξύ τους. Η αλυσίδα του λιπαρού οξέος στην εσωτερική θέση είναι ακόρεστη ενώ της εξωτερικής θέσης είναι κεκορεσμένη και μεγαλύτερου μήκους όσον αφορά τον αριθμό των ατόμων άνθρακα. Αυτός ο τύπος μεμβράνης είναι μερικώς διαπερατός, ικανός ελαστικής μετακίνησης, και έχει ρευστές ιδιότητες, στις οποίες οι ενσωματωμένες πρωτεΐνες (ακέραιες ή απομακρυσμένες πρωτεΐνες) και τα μόρια φωσφολιπιδίων είναι σε θέση να κινηθούν πλευρικά. Τέτοια μετακίνηση μπορεί να περιγραφεί από το ρευστό πρότυπο μωσαϊκών, που περιγράφει τη μεμβράνη ως μωσαϊκό των μορίων λιπιδίων που ενεργούν ως διαλύτης για όλες τις ουσίες και τις πρωτεΐνες μέσα σε αυτό, 20

21 συνεπώς πρωτεΐνες και μόρια λιπιδίων είναι ελεύθερα να διαχυθούν πλευρικά μέσω της λιπιδικής δομής και να μεταναστεύσουν πέρα από τη μεμβράνη. Η χοληστερόλη συμβάλλει στη ρευστότητα μεμβρανών με το να εμποδίσει τη διευθέτηση των φωσφολιπιδίων. Εντούτοις, αυτό το πρότυπο έχει εκτοπιστεί τώρα, καθώς μέσω της μελέτης του πολυμορφισμού των λιπιδίων είναι τώρα γνωστό ότι η συμπεριφορά των λιπιδίων υπό φυσιολογικές (και άλλες) συνθήκες δεν είναι απλή Μεταβολές φάσης διπλοστοιβάδων Μια από τις σημαντικότερες ιδιότητες της λιπιδικής διπλοστοιβάδας είναι η σχετική κινητικότητα (ρευστότητα) των μεμονωμένων μορίων λιπιδίων και πώς αυτή η κινητικότητα αλλάζει με τη θερμοκρασία. Αυτή η ιδιότητα είναι γνωστή ως μετάπτωση φάσης της διπλοστοιβάδας. Σε μια δεδομένη θερμοκρασία η διπλοστοιβάδα μπορεί να υπάρξει είτε σε υγρή είτε σε στερεά φάση. Η στερεά φάση αναφέρεται συνήθως ως φάση "πηκτωμάτων". Όλα τα λιπίδια έχουν μια χαρακτηριστική θερμοκρασία στην οποία γίνεται μετάβαση από το πήκτωμα στην υγρή φάση. Και στις δύο φάσεις τα μόρια λιπιδίων περιορίζονται στο δισδιάστατο επίπεδο της μεμβράνης, αλλά στην υγρή φάση τα μόρια είναι διάχυτα ελεύθερα μέσα σε αυτό το επίπεδο. Κατά συνέπεια, σε μία υγρή διπλοστοιβάδα ένα δεδομένο λιπίδιο θα ανταλλάξει γρήγορα θέσεις με τα γειτονικά εκατομμύρια φορές το δευτερόλεπτο και μέσω της διαδικασίας του random walk, μεταναστεύει σε μεγάλες αποστάσεις. Σχήμα 1.5: Σχέση ανάμεσα στη φάση της μεμβράνης και τη θερμοκρασία 21

22 Σε αντίθεση με την μεγάλη κινητικότητα στο επίπεδο, είναι πολύ δύσκολο για τα μόρια λιπιδίων να μετακινηθούν από μια πλευρά της διπλοστοιβάδας σε άλλη. Σε μια διπλοστοιβάδα φωσφατιδυλοχολινών αυτή η διαδικασία εμφανίζεται χαρακτηριστικά σε ένα χρονοδιάγραμμα εβδομάδων. Αυτή η απόκλιση μπορεί να γίνει κατανοητή λαμβάνοντας υπ όψιν την βασική δομή της διπλοστοιβάδας. Για να μετακινηθεί ένα λιπίδιο από τη μία πλευρά στην άλλη, η πολική κεφαλή πρέπει να διασχίσει τον υδρόφοβο πυρήνα της διπλοστοιβάδας, μια δυσμενής ενεργειακά διαδικασία. Αντίθετα από υγρής φάσης διπλοστοιβάδες, τα λιπίδια σε φάση πηκτώματος είναι κλειδωμένα σε μια θέση και δεν παρουσιάζουν ούτε μεταφορά από την μια στοιβάδα στην άλλη ούτε την πλευρική κινητικότητα. Λόγω αυτής της περιορισμένης κινητικότητας, οι διπλοστοιβάδες πηκτώματος στερούνται μια σημαντική ιδιότητα των υγρών διπλοστοιβάδων: τη δυνατότητα να ξανασφραγιστούν οι μικρές τρύπες. Οι διπλοστοιβάδες υγρής φάσης μπορούν αυθόρμητα να θεραπεύσουν τα μικρά κενά, με τον ίδιο σχεδόν τρόπο που μια κηλίδα πετρελαίου στο ύδωρ θα μπορούσε να ρεύσει για να καλύψει ένα κενό. Αυτή η λειτουργία είναι ένας από τους λόγους που οι κυτταρικές μεμβράνες αποτελούνται συνήθως από ρευστής φάσης διπλοστοιβάδες. Η συμπεριφορά φάσης των λιπιδίων καθορίζεται κατά ένα μεγάλο μέρος από τις ελκτικές δυνάμεις Van der Waals, αλληλεπιδράσεις μεταξύ των γειτονικών μορίων λιπιδίων. Η έκταση αυτής της αλληλεπίδρασης κυβερνάται στη συνέχεια από το πόσο μακριές είναι οι ουρές λιπιδίων και πόσο καλά μπορούν να διευθετηθούν. Τα λιπίδια με μακρύτερες ουρές έχουν μεγαλύτερη περιοχή αλληλεπίδρασης, άρα μεγαλύτερες αλληλεπιδράσεις και μειωμένη συνεπώς κινητικότητα λιπιδίων. Κατά συνέπεια, σε μια δεδομένη θερμοκρασία, ένα λιπίδιο με μικρή ουρά θα είναι περισσότερο κινητικό από ένα κατά τα άλλα ίδιο με μακριά ουρά λιπίδιο. Ένας άλλος τρόπος να ειπωθεί αυτό θα ήταν ότι η θερμοκρασία μετάβασης φάσης αυξάνει με τον αυξανόμενο αριθμό ανθράκων στις αλυσίδες του λιπίδιου. Τα κορεσμένα λιπίδια φωσφατιδυλοχολινών με ουρές μακρύτερες από 14 άνθρακες είναι στερεά σε θερμοκρασία δωματίου, ενώ εκείνα με λιγότερους από 14 είναι υγροί. Αυτό το φαινόμενο είναι ανάλογο με το γεγονός ότι το κερί παραφίνης, που αποτελείται από μακριά αλκάνια, είναι στερεό στη θερμοκρασία δωματίου, ενώ το οκτάνιο (βενζίνη), μικρής αλυσίδας αλκάνιο, είναι υγρό. 22

23 Εκτός από το μήκος των αλυσίδων, η θερμοκρασία μετάβασης μπορεί επίσης να επηρεαστεί από τον βαθμό ακορεστότητας των ουρών των λιπιδίων. Ένας ακόρεστος διπλός δεσμός μπορεί να παράγει μια συστροφή στην αλκυλική αλυσίδα, που αναστατώνει την κανονική περιοδική δομή. Αυτή η διάσπαση δημιουργεί πρόσθετο ελεύθερο διάστημα χώρο μέσα στην διπλοστοιβάδα που επιτρέπει την πρόσθετη ευελιξία στις παρακείμενες αλυσίδες. Είναι αυτή η διάσπαση του πακεταρίσματος που οδηγεί σε χαμηλότερες θερμοκρασίες μετάβασης με τους αυξανόμενους διπλούς δεσμούς. Αυτό έχει μια ιδιαίτερα ισχυρή επίδραση αφού η μείωση του γενικού μήκους αλυσίδων κατά έναν άνθρακα αλλάζει συνήθως τη θερμοκρασία μετάβασης ενός λιπιδίου κατά 10 ο C ή λιγότερο, αλλά η προσθήκη ενός ενιαίου διπλού δεσμού μπορεί να μειώσει τη θερμοκρασία μετάβασης από 70 o C ή περισσότερο (βλ. τον Πίνακα 1.1). Ένα παράδειγμα αυτής της επίδρασης μπορεί να βρεθεί στην καθημερινή ζωή όπως το βούτυρο, το οποίο έχει ένα μεγάλο ποσοστό από κορεσμένα λίπη, είναι στερεά στη θερμοκρασία δωματίου ενώ το φυτικό έλαιο, που είναι συνήθως ακόρεστο, είναι υγρό. Πίνακας 1.1 Θερμοκρασία μετάπτωσης (σε C) σε συνάρτηση με το μήκος των αλυσίδων και το ποσοστό κορεσμού. Όλα τα στοιχεία είναι για τα λιπίδια με φωσφατιδυλοχολίνη και δύο ίδιες ουρές. Μήκος Ουρών Διπλοί Δεσμοί Θερμοκρασία Μετάπτωσης ( C)

24 Σχήμα 1.6 Διάγραμμα που παρουσιάζει την επίδραση των ακόρεστων λιπιδίων σε μια διπλοστοιβάδα. Τα λιπίδια με μια ακόρεστη ουρά αναστατώνουν τη συσκευασία εκείνη με μόνο τις κορεσμένες ουρές. Η κατάληξη είναι η διπλοστοιβάδα να έχει περισσότερο ελεύθερο διάστημα και είναι συνεπώς πιο διαπερατή στο ύδωρ και άλλα μικρά μόρια Μεικτά συστήματα διπλοστοιβάδων Οι διπλοστοιβάδες δεν χρειάζεται να αποτελούνται από έναν ενιαίο τύπο λιπιδίου και, στην πραγματικότητα, οι περισσότερες μεμβράνες αποτελούνται από μίγμα διαφορετικών λιπιδίων. Τέτοια μίγματα διαθέτουν ενδιάμεσες ιδιότητες από τα συστατικά τους, αλλά είναι επίσης ικανά ενός φαινομένου που δεν φαίνεται στα ενιαία συστατικών συστήματα: τον διαχωρισμό φάσης. Εάν μερικά από τα συστατικά είναι υγρά σε μια δεδομένη θερμοκρασία ενώ άλλα είναι στη φάση πηκτώματος, οι δύο φάσεις μπορούν να συνυπάρξουν σε τοπικά διαχωρισμένους πληθυσμούς. Αυτός ο διαχωρισμός φάσης διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στα βιοχημικά φαινόμενα επειδή συστατικά μεμβρανών όπως οι πρωτεΐνες μπορούν να χωριστούν στην μια ή στην άλλη φάση και να είναι έτσι τοπικά συγκεντρωμένο (ή ενεργοποιημένο). 1.4 Σχηματισμός λιποσωμάτων Εχουν προταθεί πολλοί πιθανοί μηχανισμοί για να περιγράψουν το σχηματισμό λιποσωμάτων, μερικοί από τούς οποίους είναι πιο σύνθετοι από άλλους. Μια προσέγγιση είναι να θεωρηθεί η αυθόρμητη μετατροπή μιας διπλοστοιβάδας σε ένα λιπόσωμα ένας ανταγωνισμός μεταξύ δύο αποτελεσμάτων, της ενέργειας κάμψης ή κυρτότητας και της ενέργειας ακρών μιας διπλοστοιβάδας. 24

25 Για μια επίπεδη στοιβάδα, σε υδρόφιλο περιβάλλον, θα υπάρξει μια υψηλή ένταση επιφάνειας στο πλαίσιο της στοιβάδας. Η κάμψη μπορεί να μειώσει αυτήν την ενέργεια ακρών αλλά η κάμψη υπονοεί επίσης ένα ενεργειακό μειονέκτημα λόγω της προκληθείσης κυρτότητας. Για να ελαχιστοποιήσει περαιτέρω την ενέργεια άκρων, μια υψηλότερη κυρτότητα απαιτείται και τελικά μια κλειστή σφαίρα θα διαμορφωθεί, όπου η ενέργεια άκρων μειώνεται σε μηδέν. Η ενέργεια κάμψης, αφ' ετέρου, έχει φθάσει τώρα στο μέγιστό της και η περισσευούμενη ελεύθερη ενέργεια ανά λιπόσωμα, ανεξάρτητα από την ακτίνα, είναι 8 Λ Κ, όπου το Κ είναι ο παράγοντας ακαμψίας. Κατά συνέπεια, τα μεγαλύτερα λιποσώματα ευνοούνται ενεργειακά, ενώ η εντροπία θα ευνοούσε πολλά μικρά. Εντούτοις, τα λιποσώματα είναι συνήθως σταθερά λόγω υψηλού ενεργειακού κόστους του σχηματισμού πόρων. Αυτό σημαίνει ότι ένα πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα απαιτείται προτού να καταρρεύσουν σε μια στοιβαδιακή φάση. 1.5 Λιποσώματα ως μεταφορείς βιοδραστικών ουσιών Η δυνατότητα χρήσης φαρμάκων είναι πάντα ένας συμβιβασμός μεταξύ της θεραπευτικής δράσης τους και των παρενεργειών τους. Τα λιποσωμικά συστήματα χορήγησης φαρμάκων όχι μόνο επιτρέπουν την χορήγηση υψηλότερων συγκεντρώσεων βιοδραστικών ουσιών, αλλά και πιθανή στόχευση συγκεκριμένων κυττάρων ή οργάνων, ανάλογα με την συγκεκριμένη θεραπευτική εφαρμογή. Οι επιβλαβείς παρενέργειες μπορούν επομένως να μειωθούν εξαιτίας της ελαχιστοποιημένης κατανομής της βιοδραστικής ουσίας στους μη-στοχευμένους ιστούς. Όπως όλα τα άλλα συστήματα φορέων, η χρήση των λιποσωμάτων στην παράδοση βιοδραστικών ουσιών έχει πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Ο αμφίφιλος χαρακτήρας των λιποσωμάτων, με την υδροφοβική διπλοστοιβάδα και τον υδρόφιλο εσωτερικό πυρήνα, επιτρέπει την διαλυτοποίηση ή την ενθυλάκωση και των υδροφοβικών και υδρόφιλων βιοδραστικών ουσιών. Μαζί με την καλή διαλυτική τους δύναμη, μια σχετικά εύκολη προετοιμασία και μια πλούσια επιλογή των φυσικοχημικών ιδιοτήτων καθιστούν τα λιποσώματα πολύ ελκυστικά συστήματα για χορήγηση ή/και στόχευση βιοδραστικών ουσιών. 25

26 Εντούτοις, ένας πλήρης κορεσμός του ανοσοποιητικού συστήματος και οι αλληλεπιδράσεις με τις λιποπρωτεΐνες είναι μερικά παραδείγματα ενδεχομένως τοξικών και δυσμενών αποτελεσμάτων. Αποδοτικά συστήματα χορήγησης βιοδραστικών ουσιών βασισμένα στα λιποσώματα πρέπει να κατέχουν έναν μεγάλο αριθμό ειδικών ιδιοτήτων. Κατ' αρχάς, απαιτείται καλή κολλοειδής, χημική και βιολογική σταθερότητα. Η βιολογική σταθερότητα περιλαμβάνει τον έλεγχο του ποσοστού και της κινητικής της κάθαρσης των λιποσωμάτων από το κυκλοφοριακό σύστημα ή τα διαμερίσματα του σώματος, εάν η βιοδραστική ουσία έχει χορηγηθεί τοπικά. Το ποσοστό κάθαρσης είναι ανάλογο της δόσης και ποικίλλει ανάλογα με το μέγεθος και το επιφανειακό φορτίο των λιποσωμάτων. Οι πρώτες μελέτες που χρησιμοποιούν τα συμβατικά λιποσώματα αποκάλυψαν ότι η κάθαρση ήταν πάρα πολύ γρήγορη και αυτή η κινητική δεν επέτρεπε αποτελεσματική χορήγηση βιοδραστικών ουσιών. Εντούτοις, αρκετά μεγάλοι χρόνοι κυκλοφορίας επιτεύχθηκαν με την ανάπτυξη των αποκαλούμενων στερεοχημικά σταθεροποιημένων λιποσωμάτων. Επιπλέον, η βιολογική σταθερότητα περιλαμβάνει τη διατήρηση της βιοδραστικής ουσίας στο σύστημα του μεταφορέα, καθοδόν στον προορισμό της. Παραδείγματος χάριν, οι πρωτεΐνες αίματος βρέθηκε ότι αφαιρούν τα μόρια φωσφολιπιδίων γρήγορα από την διπλοστοιβάδα, κάτι που οδηγεί σε μια διάσπαση των λιποσωμάτων και ως εκ τούτου απώλεια βιοδραστικών ουσιών προτού να φθάσουν οι μεταφορείς στον προορισμό στόχο- τους. Σε αντίθεση με μια συνεχή απελευθέρωση, τα λιποσώματα πρέπει επίσης να είναι σε θέση να απελευθερώσουν το εγκλωβισμένο φάρμακο, μόνο όταν φθάσουν στον προορισμό τους και πρέπει επίσης να στοχεύουν μόνο τους ιστούς προτίμησης. Επιπλέον, είναι σημαντικό η βιοδραστική ουσία να μπορεί να το εγκλωβίσει κατά τέτοιο τρόπο ώστε να επιτυγχάνεται η ποσότητα που απαιτείται για μια αποδοτική θεραπεία. 1.6 Ταξινόμηση των λιποσωμάτων Ταξινόμηση με βάση το μέγεθος Ανάλογα με το μέσο μέγεθός τους, τα λιποσώματα διαχωρίζονται στις εξής κατηγορίες: 26

27 Πολυστοιβαδιακά λιποσώματα Ολιγοστοιβαδιακά λιποσώματα Πολυδιαμερισματικά λιποσώματα και Μονοστοιβαδιακά λιποσώματα τα οποία διαχωρίζονται στις εξής κατηγορίες: - Γιγαντιαία μονοστοιβαδιακά λιποσώματα - Μεγάλα μονοστοιβαδιακά λιποσώματα και - Μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα Ταξινόμηση με βάση το μέγεθος MLV(πολυστοιβαδιακα λιποσώματα) >0,5μm OLV(ολιγοστοιβαδιακά λιποσώματα) 0,1-1 μm UV(μονοστοιβαδιακά λιποσώματα) ανεξάρτητα μεγέθους MVV(πολυδιαμερισματικά λιποσώματα) >1μm GUV(γιγαντιαία μονοστοιβαδιακά λιποσώματα) >1μm LUV(μεγάλα μονοστοιβαδιακά λιποσώματα) >100nm SUV(μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα) nm Περισσότερα στοιχεία για την κάθε κατηγορία αναφέρονται στη συνέχεια. - Μεγάλα πολυστοιβαδιακά σωματίδια (MLVs Multilamellar vesicles) Τα MLV λιποσώματα (σχήμα 1.7) αποτελούνται από έναν μεγάλο αριθμό ομόκεντρων λιπιδικών διπλοστοιβάδων. Πρόκειται για τον απλούστερο τύπο λιποσωμάτων όσον αφορά την παρασκευή τους. Βιοδραστικές ουσίες, καθώς και άλλες διαλυτές ενώσεις μπορούν να εγκλωβιστούν στα υδατικά μεσοδιαστήματα ανάμεσα στις μεμβράνες, ενώ τα υδρόφοβα τμήματά τους ή υδρόφοβες βιοδραστικές ουσίες μπορούν να διαλυτοποιηθούν στο εσωτερικό της διπλοστοιβάδας. Τα λιποσώματα αυτά έχουν μεγάλες και ετερογενείς διαμέτρους (από μερικές εκατοντάδες nm έως 10μm), υψηλή ικανότητα εγκλωβισμού όγκου ανά μόριο λιπιδίου και παρουσιάζουν πολλαπλά εσωτερικά διαμερίσματα. Η απόσταση μεταξύ των διαδοχικών διπλοστοιβάδων καθορίζεται από την ισορροπία μεταξύ i) ελκτικών δυνάμεων van der Waals, ii) ηλεκτροστατικών και iii) άλλων δυνάμεων άπωσης. Η 27

28 χρήση τους ως φορείς βιοδραστικών ουσιών και μοντέλα μεμβρανών αρκετά απλή, λόγω της εύκολης παρασκευής τους. Σχήμα 1.7: Σχηματική απεικόνιση πολυστοιβαδιακού λιποσώματος σε διατομή και μεγέθυνση των περιοχών του. - Μεγάλα & μεσαίου μεγέθους μονοστοιβαδιακά κυστίδια (LUVs & ΙUVs- Large unilamellar vesicles & Intermediate unilamellar vesicles) Τα λιποσώματα αυτά έχουν διάμετρο της τάξης των 1000nm και είναι μονοστοιβαδιακά. Τα λιποσώματα αυτά θεωρούνται κατάλληλα για εγκλωβισμό υδατοδιαλυτών υλικών, αν και η παρουσία μιας μόνο λιπιδικής μεμβράνης έχει ως συνέπεια μικρότερη μηχανική σταθερότητα και συγκράτηση της ουσίας σε σχέση με τα MLVs. Ωστόσο, αυτός ο τύπος λιποσωμάτων κρίνεται αρκετά κατάλληλος για την ενεργή φόρτωση ιονιζόμενων μορίων. - Μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (SUVs - Small unilamellar vesicles) Τα SUV λιποσώματα αποτελούνται μόνο από μια διπλοστοιβάδα και έχουν διάμετρο nm. Διαθέτουν το μικρότερο δυνατό μέγεθος στο οποίο ένα φωσφολιπίδιο μπορεί να σχηματίσει λιποσωμική μορφή. Η δυνατότητα αυτή 28

29 εξαρτάται από την ιονική ισχύ του διαλύματος φωσφολιπιδίου και από τη λιπιδική σύσταση των μεμβρανών. Σχήμα 1.8 Διατομή ενός μονοστοιβαδιακού λιποσώματος. Οι υδατοδιαλυτές ενώσεις μπορούν να εγκλωβιστούν στον υδατικό πυρήνα (περιοχή 1) ή να συνδεθούν στην εξωτερική επιφάνεια (περιοχή 3). Τα υδροφοβικά μόρια μπορούν να εγκλωβιστούν στη διπλοστοιβάδα (περιοχή 2). Στα φθορίζοντα λιποσώματα, οι φθορίζουσες ενώσεις είναι εγκλωβισμένες στο εσωτερικό και συνδεδεμένες στην επιφάνεια του λιποσώματος. (σήμανση F) Ταξινόμηση με βάση τη σύσταση και τις εφαρμογές Τα λιποσώματα ως σύστημα μεταφοράς βιοδραστικών ουσιών διαθέτει ένα μεγάλο πλεονέκτημα έναντι άλλων κολλοειδών συστημάτων μεταφοράς: Επιτρέπει σχεδόν άπειρες πιθανότητες μεταβολής των δομικών και φυσικοχημικών χαρακτηριστικών. Αυτό το χαρακτηριστικό της ευελιξίας επιτρέπει στους επιστήμονες να τροποποιούν την in vivo συμπεριφορά των λιποσωμάτων και να σχεδιάζουν τις λιποσωμικές μορφές ανάλογα με τις θεραπευτικές ανάγκες. Με βάση τη σύνθεση και την επιθυμητή εφαρμογή, τα λιποσώματα διακρίνονται σε τέσσερις μεγάλες κατηγορίες (σχ.1.9): - Συμβατικά λιποσώματα - Κατιονικά λιποσώματα - Στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα, και - Ανοσολιποσώματα 29

30 Περισσότερα στοιχεία για κάθε κατηγορία αναφέρονται στη συνέχεια. Σχήμα 1.9 Σχηματική απεικόνιση διαφορετικών τύπων λιποσωμάτων: Συμβατικά (Conventional) λιποσώματα, Στερεοχημικά σταθεροποιημένα (Stealth) λιποσώματα, Στοχευμένα (Targeted), Κατιονικά (Cationic) λιποσώματα. - Συμβατικά λιποσώματα (Conventional liposomes): Αυτά μπορούν να οριστούν ως λιποσώματα που αποτελούνται μόνο από φωσφολιπίδια (ουδέτερα ή/και αρνητικά φορτισμένα) ή/και χοληστερόλη. Πρόκειται για την πλέον χρησιμοποιούμενη κατηγορία λιποσωμάτων στη μεταφορά βιοδραστικών ουσιών. Διαφέρουν ως προς τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες, όπως το μέγεθος, τη λιπιδική σύσταση, το επιφανειακό φορτίο και τον αριθμό και ρευστότητα των λιπιδικών διπλοστoιβάδων. Τα συμβατικά λιποσώματα χαρακτηρίζονται από σχετικά μικρό χρόνο κυκλοφορίας στο αίμα. Όταν χορηγούνται in vivo (συχνά ενδοφλέβια) έχουν την τάση να συσσωρεύονται γρήγορα στα φαγοκύτταρα του δικτυοενδοθηλιακού μονοπυρηνικού συστήματος (RES). Τα κύρια όργανα συσσώρευσης είναι το ήπαρ και η σπλήνα. Το γεγονός αυτό έχει αποτελέσει στόχο για διάθεση βιοδραστικών ουσιών μέσω λιποσωμάτων σε μολυσμένα μακροφάγα. Επιπλέον, τα συμβατικά λιποσώματα 30

31 έχουν χρησιμοποιηθεί για μεταφορά αντιγόνων. Λιποσωμικά εμβόλια έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικά κατά ιικών, βακτηριακών και παρασιτικών μολύνσεων καθώς επίσης και εναντίον όγκων. - Λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας (Long circulating liposomes, stealth, or sterically stabilized): Η ανάπτυξή τους αποτέλεσε ορόσημο στη χρήση των λιποσωμάτων ως συστήματα μεταφοράς φαρμάκων και αναζωπύρωσε το ενδιαφέρον γύρω από την έρευνα περί λιποσωμάτων. Στην πραγματικότητα, τα λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας άνοιξαν νέους δρόμους σε θεραπευτικές δυνατότητες που μέχρι τότε θεωρούνταν ανέφικτες για τα συμβατικά λιποσώματα. Το πιο ενδιαφέρον χαρακτηριστικό τους είναι ότι έχουν την ικανότητα να εξωαγγειώνονται μετά από ενδοφλέβια χορήγηση σε περιοχές όπου η διαπερατότητα του αγγειακού τοιχώματος είναι αυξημένη. Αυτό μαζί με το γεγονός ότι οι περιοχές αυξημένης τριχοειδικής διαπερατότητας είναι κυρίως παθολογικές περιοχές, όπως στερεοί όγκοι και περιοχές μολύνσεως και φλεγμονής, εξηγεί την εφαρμογή των στερεοχημικά σταθεροποιημένων λιποσωμάτων ως συστήματα χορήγησης αντικαρκινικών ή αντιφλεγμονωδών ουσιών. Προς το παρόν, ο πιο δημοφιλής τρόπος παραγωγής τέτοιων λιποσωμάτων είναι η ομοιοπολική σύνδεση του πολυμερούς πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) (MB 2000) στην εξωτερική επιφάνεια των κυστιδίων. Σχήμα 1.11 Απεικόνιση stealth λιποσωμάτων Τα λιποσώματα αυτά ονομάζονται επίσης stealth ή στερεοχημικώς σταθεροποιημένα (ss). Ο πρώτος όρος αναφέρεται στην ικανότητά τους να διαφεύγουν από τα μακροφάγα κύτταρα του ΔΕΣ και ο δεύτερος στο μηχανισμό στερεοχημικής σταθεροποίησής τους, που είναι υπεύθυνος για την αύξηση του χρόνου κυκλοφορίας. Το τελευταίο οφείλεται σε στερεοχημική παρεμπόδιση που 31

32 αποτρέπει τις αλληλεπιδράσεις με συστατικά του αίματος, κυρίως πρωτεΐνες, απολιποπρωτεΐνες κ.α. Οι περισσότερες από τις μεθόδους που χρησιμοποιούνται για τη σύζευξη του PEG σε λιπίδια (Zalipsky S., 1995), περιλαμβάνουν σύνδεση του PEG στη δραστική αμινομάδα της φωσφατίδυλοαιθανολαμίνης (PE). Στο εμπόριο είναι διαθέσιμα πολλά προϊόντα (PEG-λιπίδια)από διάφορες πηγές, όπως για παράδειγμα η διστεαροϋλοφωσφατιδυλοαιθανολαμίνη συζευγμένη σε πολυαιθυλενογλυκόλη (DSPE-PEG) μέσω ενός πεπτιδικού δεσμού. Οι φυσικές ιδιότητες των PEG-λιπιδίων είναι παρόμοιες με αυτές των επιφανειοδραστικών ενώσεων. Μελέτες με PE-PEG δείχνουν ότι μπορεί να σχηματίσει μικκύλια δίνοντας διαυγή διαλύματα στο νερό και ότι μπορεί να αποσταθεροποιήσει το σχηματισμό των διπλοστοιβάδων, όταν προστίθεται σε υψηλό ποσοστό σε σχέση με τα άλλα λιπίδια (Lasic D.D. et al., 1991) (10 mol% περίπου). Τα στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα με PEG παρασκευάζονται είτε με προσθήκη του PEG-λιπιδίου στο μείγμα πριν το σχηματισμό λιποσωμάτων, είτε με σύζευξη του PEG σε ήδη σχηματισμένα λιποσώματα (Woodle et al, 1992). Έχει πλέον επικρατήσει η πρώτη τεχνική. Ένα παράγωγο PEG με ενεργό άκρο μπορεί να συζευχθεί με ορισμένες ενεργές ομάδες στη λιποσωμική επιφάνεια όμως η ομάδα μαλεϊμιδίου, η βιοτίνη κτλ. Αυτή η τεχνική συνήθως ονομάζεται post-coating τεχνική και είναι κατάλληλη για την προσκόλληση PEG στη επιφάνεια προπαρασκευασμένων ανοσολιποσωμάτων. Σ αυτή την περίπτωση οι αλυσίδες του πολυμερούς θα βρίσκονται τελικά μόνο στην εξωτερική πλευρά των λιποσωμάτων. - Λιποσώματα ευαίσθητα σε ph (ph-sensitive liposomes): Αποτελούνται από φωσφολιπίδια όπως φωσφατιδυλαιθανολαμίνη (PE) ή διολεϋλοφωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (DOPE). Σε χαμηλό ph ενώνονται με τη κυτταρική μεμβράνη του ενδοσώματος και απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα 1.12). Είναι κατάλληλα για ενδοκυτταρική μεταφορά ασθενών βάσεων και μακρομορίων. Η βιοκατανομή και η φαρμακοκινητική τους είναι ανάλογη με αυτή των συμβατικών λιποσωμάτων. 32

33 Σχήμα 1.12 Λιποσώματα ευαίσθητα σε ph Ανοσολιποσώματα (Immunoliposomes): Διαθέτουν ειδικά αντισώματα (MΑb) ή κλάσματα αντισωμάτων (FΑb) ή αντισώματα μονής αλυσίδας στην επιφάνειά τους προκειμένου να ενισχύσουν τη στοχευμένη πρόσδεση. Αν και έχουν εξεταστεί για πληθώρα θεραπευτικών εφαρμογών, η εστίαση έχει γίνει στη μεταφορά αντικαρκινικών παραγόντων. Όπως και άλλα σωματίδια στην κυκλοφορία του αίματος, είναι δύσκολο στα ανοσολιποσώματα να εγκαταλείψουν την κυκλοφορία σε άλλα διαμερίσματα πλην του ήπατος και του σπλήνα εάν δεν έχουν μικρό μέγεθος (<200nm). Γι αυτό, προκειμένου να εξασφαλιστεί προσιτότητα των υποδοχέων, επιχειρείται τοπική χορήγηση μεγάλων ανοσολιποσωμάτων σε σωματικές κοιλότητες Σχήμα 1.13:.Σχηματική απεικόνιση ενός στερεοχημικά σταθεροποιημένου λιποσώματος. Τα stealth λιποσώματα εγκλωβίζουν το φάρμακο (1) σε μια φωσφολιπιδική διπλοστοιβάδα (2).Η PEG επικάλυψη (3) επιτρέπει στα λιποσώματα να αποφεύγουν το ανοσοποιητικό σύστημα αυξάνοντας το χρόνο ημιζωής του φαρμάκου στο σώμα. 33

34 - Κατιονικά λιποσώματα (Cationic liposomes): Αυτά εκπροσωπούν σχετικά νέα μέλη της οικογένειας των λιποσωμάτων. Βρίσκονται στην πρώτη γραμμή ως συστήματα μεταφοράς γενετικού υλικού. Τα κατιονικά λιπίδια αλληλεπιδρούν με και εξουδετερώνουν- το αρνητικά φορτισμένο DNA, συμπυκνώνοντας έτσι το DNA σε μια πιο συμπαγή δομή. Τα σύμπλοκα λιπιδίου-dna παρέχουν προστασία και επάγουν την ενδοκυττάρωση και έκφραση του συμπυκνωμένου πλασμιδίου. Σχήμα 1.14 Κατιονικά λιποσώματα - Λιποσώματα που επάγουν τη σύντηξη (Fusogenic liposomes): Τα λιποσώματα αυτά μπορούν να διευκολύνουν την ενδοκυτταρική μεταφορά εγκλωβισμένων βιοδραστικών ουσιών μέσω σύντηξης με τη μεμβράνη των κυττάρων στόχων. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι παρασκευής τους μεταξύ των οποίων και η χρήση λιπιδίων που είναι ικανά να προάγουν την αποσταθεροποίηση της διπλοστοιβάδας και να προκαλούν φαινόμενα σύντηξης (όπως το DOPE). Επίσης, μπορούν να ενσωματωθούν σε λιποσώματα και πρωτεΐνες που επάγουν τη σύντηξη. Διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι η ενίσχυση της ικανότητας σύντηξης των λιποσωμάτων 34

35 μπορεί να εφαρμοστεί προκειμένου να ενισχυθεί η αποτελεσματικότητα λιποσωμάτων στη μεταφορά γενετικού υλικού. Γενικά, το μέγεθος, η ακαμψία των διπλοστοιβάδων, το φορτίο και οι τροποποιήσεις της επιφάνειας της διπλοστοιβάδας αποτελούν παραμέτρους που καθορίζουν την τύχη των λιποσωμάτων τόσο κατά την αποθήκευση όσο και μετά τη χορήγηση. 1.7 Μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων Πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (Multilamellar vesicles) (MLV) Ενυδάτωση λιπιδικού υμενίου Η τεχνική αυτή βασίζεται στο σχηματισμό λεπτού υμενίου (film) κατά την εξάτμιση οργανικού ή οργανικών διαλυτών, στους οποίους έχει προηγουμένως διαλυθεί το λιπίδιο. Για να απομακρυνθούν τα τελευταία ίχνη διαλύτη και για να αποφευχθεί η χημική αποικοδόμηση του λιπιδίου π.χ. οξείδωση, το εσωτερικό της σφαιρικής φιάλης στο οποίο σχηματίζεται το λεπτό υμένιο, εκτίθεται σε ρεύμα αζώτου για πέντε λεπτά. Η ενυδάτωση (hydration) του υμενίου που ακολουθεί πραγματοποιείται με νερό ή με ρυθμιστικό διάλυμα ή με διάλυμα της προς εγκλωβισμό δραστικής ουσίας. Το στάδιο αυτό, όπως και το στάδιο της εξάτμισης των διαλυτών, πραγματοποιούνται σε θερμοκρασίες υψηλότερες της θερμοκρασίας μετάβασης φάσης του χρησιμοποιούμενου λιπιδίου. Προς τούτο το διάλυμα που προορίζεται για την ενυδάτωση έχει προθερμανθεί σε αυτή τη θερμοκρασία και η προσθήκη αυτού στη σφαιρική φιάλη γίνεται εντός υδατόλουτρου. Με μηχανική ανάδευση της φιάλης (vortex) το υμένιο αποκολλάται από τα τοιχώματά της, οπότε λαμβάνεται μία θολερή διασπορά με πολυστοιβαδιακά λιποσώματα μεγάλου μεγέθους MLV. Η μείωση του μεγέθους των MLV λιποσωμάτων και η δημιουργία ομογενούς σε αναφορά με το μέγεθος πληθυσμού, υλοποιείται με τη χρήση κυρίως λουτρού υπερήχων (bath sonicator), αλλά και διαφόρων άλλων τεχνικών, όπως εξώθηση μέσω φίλτρων ή μεμβρανών (extrusion), μικρoγαλακτωματοποίηση (microemulcification) κ.α. 35

36 Μέθοδος σφαιριδίων διαλύτη Μια μέθοδος για την προετοιμασία MLVs ομοιογενούς κατανομής μεγέθους προτάθηκε από τον Kim et Al (1985). Η διαδικασία περιελάμβανε τη διασκόρπιση στο διάλυμα ύδατος μικρών σφαιριδίων του πτητικού υδροφοβικού διαλύτη στον οποίο τα λιπίδια ήταν διαλυμένα. Τα MLVs διαμορφώνονται όταν γίνεται ελεγχόμενη εξάτμιση του οργανικού διαλύτη σε ένα υδατόλουτρο Μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (Small unilamellar vesicles) (SUV) Μέθοδος Υπερήχησης (Sonication method) Εδώ MLVs εκτίθενται σε υπέρηχους είτε με ένα λουτρό υπερήχων είτε με χρήση ακίδας υπερήχων κάτω από αδρανή ατμόσφαιρα. Τα κύρια μειονεκτήματα αυτής της μεθόδου είναι ο πολύ χαμηλός εσωτερικός όγκος/αποδοτικότητα εγκλωβισμού, ενδεχόμενη αποσύνθεσης των φωσφολιπιδίων και των ενώσεων που πρόκειται να εγκλωβιστούν, αποκλεισμός των μεγάλων μορίων, μόλυνση από το μέταλλο από την ακίδα και ταυτόχρονη παρουσία MLV με SUV. Oι Oezden και Hasirci (1991) προετοίμασαν λιποσώματα επικαλυμμένα με πολυμερή χρησιμοποιώντας την τεχνική αυτή. Εξώθηση μέσω γαλλικού φίλτρου (French press) Η μέθοδος περιλαμβάνει την εξώθηση MLV σε psi σε 4 C μέσω ενός μικρού στομίου. Η μέθοδος έχει διάφορα πλεονεκτήματα σε σύγκριση με τη μέθοδο υπερήχων. Η μέθοδος είναι απλή γρήγορη, επαναλήψιμη και περιλαμβάνει τον προσεκτικό χειρισμό των ασταθών υλικών (Hamilton and Guo, 1984). Τα προκύπτοντα λιποσώματα είναι κάπως μεγαλύτερα από αυτά που παρασκευάζονται με υπέρηχους. Τα μειονεκτήματα της μεθόδου είναι ότι η θερμοκρασία είναι δύσκολο να επιτευχθεί και οι όγκοι που εφαρμόζεται είναι σχετικά μικροί (περίπου 50 ml μέγιστο). 36

37 1.7.3 Μεγάλα μονοστοιβαδιακά λιποσώματα(large unilamellar vesicles) (LUV)) Έχουν υψηλούς εσωτερικούς όγκους/αποδοτικότητα εγκλωβισμού και εφαρμόζονται για τον εγκλωβισμό φαρμάκων και μακρομορίων. - Μέθοδοι εγχύσεως διαλύτη Α) Μέθοδος έγχυσης αιθέρα Ένα διάλυμα λιπιδίων σε διαιθυλικό αιθέρα ή σε μίγμα αιθέρα/μεθανόλης εγχέεται αργά ένα υδατικό διάλυμα του υλικού που πρόκειται να εγκλωβιστεί στους C ή κάτω από μειωμένη πίεση. Ο σχηματισμός των λιποσωμάτων γίνεται με την εξάτμιση του αιθέρα υπό κενό. Τα κύρια μειονεκτήματα της μεθόδου είναι ότι η λιποσωμική διασπορά είναι ετερογενής ( nm) και η έκθεση των ενώσεων που πρόκειται να εγκλωβιστούν στους οργανικούς διαλύτες ή/και σε υψηλή θερμοκρασία (Dcamcr and Bangham, 1976, Schieren et Al, 1978). Β)Μέθοδος έγχυσης αιθανόλης Ένα διάλυμα λιπιδίων σε αιθανόλη εγχέεται γρήγορα σε περίσσεια ρυθμιστικού. Τα MLVs διαμορφώνονται αμέσως. Τα μειονεκτήματα της μεθόδου είναι ότι i) η λιποσωμική διασπορά είναι ετερογενής ( nm), ii) τα λιποσώματα είναι πολύ αραιά καθιστώντας δύσκολη την αφαίρεση της αιθανόλης, καθώς διαμορφώνει αζεοτροπικό σύστημα με το νερό και iii) υπάρχει η πιθανότητα αδρανοποίησης διάφορων βιολογικά ενεργών μακρομόριων παρουσία ακόμη και ελάχιστων συγκεντρώσεων αιθανόλης (Batzri and Korn, 1973). Γ) Μέθοδοι αφαίρεσης απορρυπαντικών Τα απορρυπαντικά χρησιμοποιούνται στην κρίσιμη συγκέντρωση μικκυλιοποίησης για να διαλυτοποιήσουν λιπίδια. Καθώς το απορρυπαντικό αφαιρείται, τα μικκύλια γίνονται σταδιακά πλουσιότερα σε φωσφολιπίδιο και συνδυάζεται τελικά ώστε να διαμορφώσει LUVs. Τα απορρυπαντικά στη συνέχεια αφαιρούνται με διαπίδυση (Kagawa and Rocker, 1971 Milsmann et al, 1978 Alpes et 37

38 al, 1986). Τα πλεονεκτήματα από την μέθοδο αυτή είναι η άριστη επαναληψιμότητα και η δυνατότητα παραγωγής λιποσωμικών διασπορών που είναι ομοιογενείς στο μέγεθος. Το κύριο μειονέκτημα της μεθόδου είναι η διατήρηση ιχνών απορρυπαντικού μέσα στα λιποσώματα. Η εμπορική συσκευή LIPOPREP (Diachema AG, Ελβετία) που είναι ένα σύστημα διαπίδυσης είναι διαθέσιμη για την αφαίρεση των απορρυπαντικών. Άλλες τεχνικές έχουν χρησιμοποιηθεί για την αφαίρεση των απορρυπαντικών: (α) η χρήση χρωματογραφίας πηκτωμάτων που περιλαμβάνει μια στήλη Sephadex G- 25 (Enoch και Suitt Matter, 1979), (β) η προσρόφηση ή η δέσμευση Triton Χ- 100 (απορρυπαντικό) στις Bio-beads SM2 (Gerristen et al, 1978). (γ) η σύνδεση octyl glucoside (απορρυπαντικό) σε Amberlite XAD-2 beads (Philippot et Al, 1985). Δ)Μέθοδος εξάτμισης ανάστροφης φάσης Πρώτα σχηματίζεται ένα γαλάκτωμα νερού σε έλαιο ύστερα από σύντομη υπερήχηση ενός συστήματος δύο φάσεων που περιέχει τα φωσφολιπιδία στον οργανικό διαλύτη (διαιθυλαιθέρας ή ισοπροπυλαιθερας ή μίγμα ισοπροπύλο αιθέρα και χλωροφόρμιου) και υδατικό ρυθμιστικό διάλυμα. Οι οργανικοί διαλύτες εξατμίζονται υπό μειωμένη πίεση, με συνέπεια το σχηματισμό ενός ιξώδους πηκτώματος. Τα λιποσώματα διαμορφώνονται όταν ο υπόλοιπος διαλύτης αφαιρείται με συνεχή εξάτμιση κάτω από μειωμένη πίεση. Με αυτήν τη μέθοδο μπορεί να ληφθεί υψηλή απόδοση εγκλωβισμού μέχρι και 65% σε ένα μέσο χαμηλής ιοντικής ισχύος, παραδείγματος χάριν 0,01 M NaCl. Η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί για τον εγκλωβισμό μακρομόριων. Το κύριο μειονέκτημα της μεθόδου είναι η έκθεση των υλικών που εγκλωβίζονται στους οργανικούς διαλύτες και σε μικρά διαστήματα υπερήχησης. Αυτές οι συνθήκες μπορούν ενδεχομένως να οδηγήσουν στην αλλοίωση μερικών πρωτεϊνών ή θραύση των ελίκων DNA (Szoka and Papahadjopoulos, 1978). Με αυτό τον τρόπο λαμβάνεται μια ετερογενής λιποσωμική διασπορά.. Η τροποποιημένη αντίστροφη μέθοδος εξάτμισης φάσης παρουσιάστηκε από τους Handa et al (1987), με κύριο πλεονέκτημα της μεθόδου την υψηλή απόδοση εγκλωβισμού (περίπου 80%). Η μέθοδος εξάτμισης Szoka and Papahadjopoulos (1978) έχει τροποποιηθεί επίσης να εγκλωβίζει τα πλασμίδια χωρίς καταστροφή των ελίκων DNA (Haga and Yogi, 1989). 38

39 Ε) Μέθοδος σύντηξης με ασβέστιο Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται για να προετοιμάσει LUV από όξινα φωσφολιπίδια. Η διαδικασία εφαρμόζεται με βάση την παρατήρηση ότι η προσθήκη ασβεστίου σε SUV λιποσώματα προκαλεί τη σύντηξη και οδηγεί σε σχηματισμό πολυστοιβαδιακών δομών στη σπειροειδή διαμόρφωση (κύλινδροι Cochleate). Η προσθήκη EDTA στην προετοιμασία αυτών έχει ως αποτελέσματα το σχηματισμό LUVs (Papahadjopoulos and Vail, 1978). Το κύριο πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι μπορούν να εγκλωβιστούν μακρομόρια υπό ήπιες συνθήκες, με τα προκύπτοντα λιποσώματα να είναι κατά ένα μεγάλο μέρος μονοστοιβαδιακά, αλλά με ετερογένεια στο μέγεθός τους. Το κύριο μειονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι LUVs μπορούν να ληφθούν μόνο από όξινα φωσφολιπίδια. ΣΤ)Μέθοδος μικροϋγροποίησης (Microfluidization method) Οι Mayhew et al (1984) πρότειναν μια τεχνική μικροϋγροποίησης /μικρογαλακτωματοποίησης/ομογενοποίησης για την μεγάλης κλίμακας κατασκευή λιποσωμάτων. Η μείωση του μεγέθους μπορεί να επιτευχθεί με την ανακύκλωση του δείγματος. Η διαδικασία είναι επαναληψιμη και παράγει λιποσώματα με καλό εγκλωβισμό υδάτινης φάσης. Οι Riaz and Weiner (1995) παρασκεύασαν λιποσώματα που αποτελούνται από το λέκιθο αυγών, χοληστερόλη και άλας φωσφατιδυλοσερίνης εγκεφάλου (57:33:10) μ' αυτό τον τρόπο. Πρώτα προετοιμάστηκαν MLV λιποσώματα τα οποία διαπεράστηκαν μέσω ενός μικροϋγροποιητή (Microlluidics Corporation, Newton, MA, ΗΠΑ) με εισροή πίεσης αέρα 40 psi. Το μέγεθος των λιποσωμάτων ήταν nm μετά από 25 επαναλήψεις. Στο μικροϋγροποιητή, η αλληλεπίδραση των ρευστών στρωμάτων πραγματοποιείται σε υψηλές (πιέσεις) σε ακριβώς καθορισμένα μικροκανάλια που είναι παρόντα σε ένα θάλαμο αλληλεπίδρασης. Στο θάλαμο η πίεση φθάνει μέχρι psi, που μπορεί να επιφέρει μερική αποσύνθεση των λιπιδίων. 39

40 Z) Εξώθηση διαμέσου φίλτρων LUVs μπορούν να παρασκευασθούν διαπερνώντας MLV υπό συνθήκες αζώτου μέσω φίλτρων πολυανθρακικών μεμβρανών (Jousma et Al, 1987). Οι μεμβράνες που παρασκευάζονται μ' αυτό τον τρόπο έχουν στενή κατανομή μεγέθους. Η εξώθηση γίνεται σε μέτριες πιέσεις ( psi). Απαιτείται μια ειδική συσκευή για φίλτρα. Τέτοιες συσκευές είναι διαθέσιμες εμπορικά με εμπορικές ονομασίες όπως LUVET και EXTRUDER και είναι εξοπλισμένες με έναν μηχανισμό επανακυκλοφορίας που επιτρέπει την πολλαπλάσια εξώθηση με λίγη δυσκολία. Μικρές ποσότητες λιποσωμάτων (περίπου 10 ml) μπορούν να προετοιμαστούν εύκολα με τη βοήθεια ενός εμπορικού εξωθητή. Η διαδικασία αυτή μπορεί να γίνει και υπό άζωτο. Η)Στιγμιαίος σχηματισμός ομοιογενών (LUV) Οι Lasic et Al (1988) ανέφεραν μια μέθοδο για τον στιγμιαίο σχηματισμό σχετικά ομοιογενών LUV με μια απλή τεχνική. Ο σχηματισμός πολυστοιβαδιακών λιποσώματων αποτρέπεται με την πρόκληση ενός φορτίου επιφάνειας (+ ve) στην διπλοστοιβάδα. Τοποθέτησαν mg λεκιθίνης διαλυμένη με 3ml. CHCl 3 / MeOH σε ένα ειδικά διαμορφωμένο υπόστρωμα πυριτίου 2 ιντσών. Αυτό το υπόστρωμα τοποθετήθηκε στο κατώτατο σημείο μιας φιάλης Εrlenmeyer. Αφότου ξηράνθηκε ολονυκτίς σε 10 2 Torr(περίπου 1Pa), το υμένιο επανακαταβυθίστηκε με ελαφριά ανακίνηση σε 1-2ml. ύδατος. Τα λιποσώματα διαμορφώθηκαν αμέσως. Θ)Αφυδατωμένα Ενυδατωμένα Σωματίδια (DRV) Η μέθοδος αυτή αναπτύχθηκε από τους C. Kirby και G.Gregoriadis, (1984). Σύμφωνα με την τεχνική αυτή, πραγματοποιείται λυοφιλοποίηση (freeze - drying) διασποράς άδειων SUV λιποσωμάτων παρουσία διαλύματος της προς εγκλωβισμό ουσίας. Εδώ, σε αντίθεση με την κλασική παρασκευή μέσω εξάτμισης του διαλύτη όπου τα μόρια του λιπιδίου είναι σε τυχαία κατανομή, το λιπίδιο το οποίο βρίσκεται στα κενά SUV είναι πολύ καλά οργανωμένο στη δομή της μεμβράνης. Έτσι, κατά την προσθήκη του υδατικού μέσου σχηματίζονται λιποσώματα με υψηλή ικανότητα εγκλωβισμού και διάμετρο από 400 nm μέχρι μερικά μm. 40

41 Μερικά από τα πλεονεκτήματα της μεθόδου είναι: η απλότητα στη χρήση, οι ήπιες συνθήκες που χρησιμοποιούνται (σημαντικές για ευαίσθητα μόρια), και η υψηλή ικανότητα εγκλωβισμού για μεγάλη ποικιλία ουσιών. Η απλότητα της μεθόδου καθιστά ιδιαίτερα δυνατή την διαδικασία scale-up προκειμένου για εφαρμογή στη φαρμακευτική βιομηχανία. Η πιθανότητα διακοπής της διαδικασίας μετά το στάδιο της αφυδάτωσης και η αποθήκευση κάτω από ειδικές συνθήκες αποτελεί ένα επιπλέον πλεονέκτημα. Σε αντίθεση με τη διασπορά ενός στεγνού λιπιδικού υμενίου, η ανασύσταση του λυοφιλοποιημένου προϊόντος είναι εξαιρετικά ταχεία. Η DRV μέθοδος διαφέρει από τις περισσότερες άλλες μεθόδους υψηλής ικανότητας εγκλωβισμού στο ότι παράγεται μεγάλη αναλογία ολιγο- και πολυστοιβαδιακών λιποσωμάτων. Η ύπαρξη λιποσωμάτων με πολλές στοιβάδες έχει το πλεονέκτημα ότι μειώνει το ρυθμό απώλειας της εγκλωβισμένης ουσίας παρουσία πρωτεϊνών ορού. Ο κύριος περιορισμός της μεθόδου, ο οποίος είναι κοινός και σε άλλες μεθόδους που παράγουν μεγάλα λιποσώματα είναι το γεγονός ότι τα DRV λιποσώματα τείνουν να παρουσιάζουν ετερογένεια όσον αφορά το μέγεθος. Η ομοιογένεια στο μέγεθος μπορεί να μη θεωρείται απαραίτητη για φαρμακευτικούς σκοπούς, αλλά είναι σημαντική για την επαναληψιμότητα πειραμάτων. Tα DRV μπορούν να μετατραπούν σε πιο ομοιογενείς παρασκευές αν χρειαστεί, χρησιμοποιώντας συνδυασμό φίλτρων και διαπίδυσης. Ι)Μέθοδος Ψύξης-Απόψυξης (Freeze-Thaw) Η προηγούμενη DRV μέθοδος είναι παραλλαγή μίας άλλης παρόμοιας μεθόδου που αναπτύχθηκε νωρίτερα από τους Pick, Kasahara and Hinckle, (1981), κατά την οποία το προς εγκλωβισμό υλικό εισάγεται στα λιποσώματα επίσης μετά το σχηματισμό τους. Σε αυτή την περίπτωση ακολουθείται μία πορεία επαναλαμβανόμενης ψύξης απόψυξης για τη διάρρηξη των SUV λιποσωμάτων, κατά τη διάρκεια της οποίας η διαλυμένη ουσία εξισορροπείται μεταξύ εσωτερικού και εσωτερικού, ενώ τα λιποσώματα συντήκονται και αυξάνουν σε μέγεθος. Έτσι επιτυγχάνονται ποσοστά εγκλωβισμού μέχρι και 30%. Τα λιποσώματα που παράγονται με τη μέθοδο αυτή παρουσιάζουν σημαντικά μειονεκτήματα σε σύγκριση με τα DRV λιποσώματα. Το κυριότερο είναι ότι δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ουδέτερα λιπίδια και ειδικά το PC, γιατί πιθανώς η 41

42 παρουσία φορτίου απαιτείται για το σχηματισμό των κρυστάλλων κατά τη διαδικασία της ψύξης, που βοηθούν στη συνέχεια την πορεία θραύση / σύντηξη. Για παρόμοιους λόγους η σακχαρόζη, δισθενή μεταλλικά ιόντα (που μπορούν να εξουδετερώνουν το επιφανειακό φορτίο) και υψηλής ιονικής ισχύος διαλύματα αλάτων δεν μπορούν να εγκλωβιστούν αποτελεσματικά. Ωστόσο, η μέθοδος είναι πολύ απλή, ταχεία, ήπια και καταλήγει σε μεγάλα μονοστοιβαδιακά σωματίδια, χρήσιμα για τη μελέτη φαινομένων μεταφοράς μέσω μεμβρανών Γιγαντιαία λιποσώματα (α) Η διαδικασία για το σχηματισμό των γιγαντιαίων λιποσωμάτων περιλαμβάνει τη διαπίδυση ενός διαλύματος μεθανόλης της φωσφατιδυλοχολίνης παρουσία του απορρυπαντικού methylglucoside έναντι ενός υδατικού διαλύματος που περιέχει μέχρι και 1M NaCl. Τα λιποσωμάτα ποικίλουν στη διάμετρο από 10 έως 100 mm. (Oku et al, 1982). (β) Μια μέθοδος με την αφαίρεση του τριχλωρο-οξικού νατρίου με διαπίδυση για το σχηματισμό των γιγαντιαίων ενιαίων πεταλωδών λιποσωμάτων με μέγεθος ανάμεσα σε 10 έως 20 mm παρουσιάστηκε από τους Oku and MacDonald (1983) Πολυδιαμερισματικά λιποσώματα (Multivesicular) (α) Ο σχηματισμός των πολυδιαμερισματικών λιποσωμάτων έχει αναφερθεί από τους Kim et al (1983). Το γαλάκτωμα νερού σε έλαιο μετατράπηκε σε σφαιρίδια οργανικών διαλυτών ύστερα από την προσθήκη του γαλακτώματος σε διαλύτη. Η εξάτμιση του οργανικού διαλύτη οδήγησε στον σχηματισμό των πολυδιαμερισματικών λιποσωμάτων. Η διάμετρος των λιποσωμάτων κυμαίνεται από 5,6 έως 29nm.. Οι ουσίες που μπορούν να εγκλωβιστούν περιλαμβάνουν τη γλυκόζη, EDTA, ανθρώπινο DNA. Αυτά τα λιποσώματα έχουν την πολύ υψηλή αποδοτικότητα ενθυλάκωσης (μέχρι 89%). (β)οι Cullis et al (1987) διαπίστωσαν ότι όταν λιποσώματα MLV υποβλήθηκαν σε πέντε κύκλους επαναλαμβανόμενης ψύξης στο υγρό άζωτο ακολουθούμενοι από απόψυξη σε θερμό ύδωρ, μπορούσαν να ληφθούν λιποσώματα υψηλής αποδοτικότητας εγκλωβισμού (μέχρι 88%). 42

43 1.8 Τεχνικές καθαρισμού λιποσωμάτων Συνήθως είναι απαραίτητος ο διαχωρισμός της ελεύθερης ουσίας από την ουσία που έχει εγκλωβιστεί στα λιποσώματα. Ο διαχωρισμός αυτός επιτυγχάνεται με την χρήση μεθόδων που περιγράφονται παρακάτω Διαπίδυση ισορροπίας (dialysis) Κατά τη διαδικασία της διαπίδυσης η λιποσωμική διασπορά τοποθετείται σε ένα δοχείο και ο πυθμένας ή τα τοιχώματα του δοχείου αποτελούνται από μεμβράνες διαπίδυσης. Το δοχείο τοποθετείται με τη σειρά του σε ένα μεγαλύτερο δοχείο που περιέχει καθαρό διαλύτη. Κατά τη διαπίδυση, τα ιόντα του ηλεκτρολύτη και άλλες διαλυτές ουσίες μικρού μοριακού βάρους εξέρχονται από τους πόρους της μεμβράνης, ενώ τα λιποσώματα λόγω μεγέθους, δεν μπορούν να εξέλθουν Φυγοκέντρηση (centrifugation) Η πυκνότητα των διπλοστοιβάδων από φωσφατιδυλοχολίνη έχει αναφερθεί ότι είναι ίση με 1,0135 g*ml -1 (Johnson et al., 1973). Η τιμή αυτή αυξάνει ελαφρά (1,0142 g*ml -1 ) με την προσθήκη χοληστερόλης σε ποσοστό 50% και αναμένεται μεγαλύτερη για κορεσμένα λιπίδια, κυρίως κάτω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης. Επίσης η παρουσία πρωτεϊνών στις μεμβράνες οδηγεί σε αισθητή αύξηση της πυκνότητας. Έτσι λιποσωμικές μεμβράνες διεσπαρμένες σε νερό ή ρυθμιστικό διάλυμα καθιζάνουν υπό την επίδραση της βαρύτητας. Έχει υπολογιστεί ότι μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (SUV) από φωσφατιδυλοχολίνη (PC) έχουν συντελεστή καταβύθισης S (sedimentation coefficient) 2,6 S στο νερό, ενώ το μέγεθος αυτό αυξάνει σε 5,2 S με την προσθήκη μεγάλων ποσών χοληστερόλης (Newman et al., 1975). Έτσι ανάλογα με τη σύσταση της διπλοστοιβάδας, μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα μπορούν αν καταβυθιστούν στα g μετά από ώρες σε μια υπερφυγόκεντρο. Τα πολυστοιβαδιακά λιποσώματα καταβυθίζονται ευκολότερα (στα g ή λιγότερο ανάλογα με το μέγεθος, για 1 h περίπου). Στην περίπτωση που εγκλωβίζεται μέσα στα λιποσώματα ουσία με υψηλή συγκέντρωση ή με υψηλό μοριακό βάρος σε συγκέντρωση ισοτονική με ρυθμιστικό διάλυμα, η πυκνότητα του μέσου πλησιάζει ή υπερβαίνει αυτή των λιπιδίων, με αποτέλεσμα η 43

44 καταβύθιση να είναι αδύνατη. Το πρόβλημα αυτό μπορεί να ξεπεραστεί με αραίωση των λιποσωμάτων σε ένα μέσο με χαμηλότερη πυκνότητα έτσι ώστε τα λιποσώματα να είναι βαρύτερα από αυτό Χρωματογραφία γέλης (gel chromatography) Στην υγρή χρωματογραφία αποκλεισμού μοριακών μεγεθών τα μόρια των συστατικών ενός μίγματος, μετακινούνται με τη βοήθεια μιας υγρής κινητής φάσης μέσα στο πορώδες δίκτυο στατικής φάσης και διαχωρίζονται με βάση το μέγεθος τους. Το δικτυωτό πλέγμα της στατικής φάσης λειτουργεί σαν μοριακό κόσκινο, επιτρέποντας την είσοδο στο εσωτερικό του μόνο σε μόρια και ιόντα που είναι μικρότερα από το μέγεθος των πόρων του. Ουσίες μεγαλύτερου μεγέθους αποκλείονται από το να εισέλθουν στο δίκτυο και εκλούονται πρώτες παρασυρόμενες από την κινητή φάση. Οι υπόλοιπες ουσίες, ανάλογα με το μέγεθος τους κατανέμονται λιγότερο ή περισσότερο στη στατική φάση και εκλούονται κατά σειρά μεγέθους. Ως στατικές φάσεις χρησιμοποιούνται κυρίως υδρόφιλες πηκτές από διακλαδισμένα πολυμερή δεξτράνης (Sephadex G), αγαρόζης (Sepharose B) ή πολυακρυλαμιδίου (Bio-Gel-P). Ειδικά πολυμερή δεξτράνης σχηματίζουν μετά από αλκυλίωση των υδροξυλομάδων τους υδρόφοβες γέλες με οργανικούς διαλύτες (Sephadex LH). Όσον αφορά στα λιποσώματα, οι πλέον διαδεδομένες γέλες για το διαχωρισμό της ελεύθερης από την εγκλωβισμένη ουσία είναι οι Sephadex G (κυρίως G-50 και G-25) 1.9 Φυσικές ιδιότητες λιποσωμάτων Οι φυσικές ιδιότητες των λιποσωμάτων μας βοηθούν να χαρακτηρίσουμε την συμπεριφορά τους. Οι ιδιότητες που μελετώνται κυρίως είναι: 1. Το μέγεθος και η κατανομή αυτού 2. Το επιφανειακό φορτίο Μέτρηση μεγέθους Την πιο ακριβή μέθοδο για την μέτρηση του μεγέθους των λιποσωμάτων αποτελεί η ηλεκτρονική μικροσκοπία, καθότι επιτρέπει την μελέτη καθενός 44

45 ξεχωριστά των λιποσωμάτων και ακριβείς πληροφορίες για την κατανομή των μεγεθών σε ολόκληρο τον πληθυσμό των λιποσωμάτων. Παρόλα αυτά είναι χρονοβόρα μέθοδος και απαιτεί εξοπλισμό που δεν είναι εύκολα προσβάσιμος. Εν αντιθέσει η φασματοσκοπία συσχέτισης φωτονίων(pcs) αποτελεί μια πολύ γρήγορη και απλή τεχνική αλλά έχει το μειονέκτημα ότι μετρά τον μέσο όρο μεγέθους του συνολικού πληθυσμού των λιποσωμάτων. Βέβαια, εάν δεν είναι απαραίτητη η ακριβής γνώση του μεγέθους, μια πιο απλή μέθοδος αποτελεί η χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους. Από τις τεχνικές ηλεκτρονικής μικροσκοπίας χρησιμοποιείται κυρίως η ηλεκτρονική μικροσκοπία διερχόμενης δέσμης(tem). Στην περίπτωση αυτή το δείγμα μεταφέρεται σε ένα διαφανές πλαστικό υπόστρωμα ή μεμβράνη άνθρακα (πάχους nm) το οποίο είναι τοποθετημένο σε δίκτυο χαλκού. Το δείγμα σκεδάζει ηλεκτρόνια εκτός πεδίου παρατήρησης και η τελική εικόνα γίνεται ορατή σε φθορίζουσα οθόνη. Το ποσοστό σκέδασης ηλεκτρονίων εξαρτάται από το πάχος και τον ατομικό αριθμό των ατόμων του μείγματος. Με την τεχνική αυτή τα σωματίδια φαίνονται διάχυτα φωτισμένα και έτσι μπορεί να μετρηθεί το μέγεθος και η συσσωμάτωσή τους, αλλά υπάρχει περιορισμένη ένδειξη του βάθους. Άλλη συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος αποτελεί η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM). Αυτή είναι μία μέθοδος που απεικονίζει την επιφάνεια των δειγμάτων σαρώνοντας το δείγμα με μια υψηλής ενέργειας δέσμη ηλεκτρονίων. Τα ηλεκτρόνια αλληλεπιδρούν με τα άτομα που αποτελούν το δείγμα παράγοντας τα σήματα που περιέχουν πληροφορίες για την επιφάνεια του δείγματος όπως την τοπογραφία, την σύσταση και άλλες ιδιότητες, όπως την ηλεκτρική αγωγιμότητα. Οι τύποι σημάτων που παράγονται από τα SEM περιλαμβάνουν δευτερεύοντα ηλεκτρόνια, οπισθοσκεδασμένα ηλεκτρόνια (EBS), χαρακτηριστικές ακτίνες X, κ.α. Τα σήματα προκύπτουν από τις αλληλεπιδράσεις της δέσμης ηλεκτρονίων με τα άτομα στην ή κοντά στην επιφάνεια του δείγματος. Στον πιο κοινό ή τυποποιημένο τρόπο ανίχνευσης, την απεικόνιση δευτερευόντων ηλεκτρονίων ή το SEI, τα SEM μπορούν να παραγάγουν πολύ υψηλής ευκρίνειας εικόνες μιας επιφάνειας δειγμάτων, που αποκαλύπτει λεπτομέρειες μεγέθους μικρότερου από 1 έως 5nm. Λόγω της πολύ στενής δέσμης ηλεκτρονίων, τα μικρογραφήματα SEM έχουν έναν μεγάλο βάθος που παράγει μια χαρακτηριστική τρισδιάστατη εμφάνιση χρήσιμη για την κατανόηση της επιφανειακής δομής ενός δείγματος. Άλλη μέθοδος που χρησιμοποιείται επίσης είναι 45

46 η Freeze-etch που στην ουσία αποτελεί μια μέθοδο προετοιμασίας ιδιαίτερα χρήσιμη για τις μεμβράνες λιπιδίων. Ο ιστός ή τα κύτταρα παγώνονται γρήγορα, και κατόπιν τέμνονται απλά με σπάσιμο ή με τη χρήση μικροτόμου ενώ διατηρείται σε θερμοκρασία υγρού αζώτου. Η κρύα σπασμένη επιφάνεια (μερικές φορές "χαραγμένη" με την αύξηση της θερμοκρασίας στους περίπου 100 C για αρκετά λεπτά) σκιάζεται έπειτα με εξατμισμένο λευκόχρυσο ή χρυσό σε μια μέση γωνία 45 σε έναν υψηλού κενού εξατμιστήρα. Μια δεύτερη στρώση άνθρακα, εξατμισμένη καθέτως στο μέσο επίπεδο επιφάνειας τοποθετείται συχνά για να βελτιώσει τη σταθερότητα του επιστρώματος του αντιγράφου. Το δείγμα επιστρέφεται σε θερμοκρασία δωματίου και πίεση, κατόπιν το εξαιρετικά εύθραυστο "προ-σκιασμένο" μεταλλικό αντίγραφο της τετμημένης επιφάνειας απελευθερώνεται από το ελλοχεύον βιολογικό υλικό με οξέα, η με διάλυση με υποχλωριώδη άλατα είτε με απορρυπαντικό SDS. Το αντίγραφο πλένεται λεπτομερώς από τις υπόλοιπες χημικές ουσίες, τοποθετείται προσεκτικά επάνω σε λεπτά πλέγματα, ξηραίνεται και μελετάται με TEM Επιφανειακό φορτίο Οι ηλεκτρικές ιδιότητες της επιφάνειας των λιποσωμάτων μπορούν να μελετηθούν με ηλεκτροφόρηση κατά την οποία προκαλείται κίνηση των λιποσωμάτων μέσα σε στάσιμο υγρό υπό την επίδραση εξωτερικά εφαρμοζόμενης διαφοράς δυναμικού. Η κίνηση αυτή μετριέται με Φασματοσκοπία Συσχέτισης Φωτονίων (Photon Correlation Spectroscopy, PCS) και βασίζεται στη μετατόπιση Doppler που προκαλείται από την πρόσπτωση μονοχρωματικής ακτινοβολίας (laser He Ne, 5 mw, 633 nm) στα κινούμενα σωματίδια. Γενικά δύο παράμετροι που χαρακτηρίζουν την επιφάνεια των λιποσωμάτων μπορούν να υπολογισθούν από τις μετρούμενες κινητικότητες το δυναμικό επιφάνειας, ζ δυναμικό (ζ-potential) και η πυκνότητα επιφανειακού φορτίου σ (surface charge density). Η εξίσωση Helmholtz Smoluchowski (Jones M.N., 1995) που ακολουθεί δίνει την τιμή του ζ δυναμικού, 46

47 όπου u (cm/sec) η ταχύτητα μετακίνησης του λιποσώματος στο σωλήνα του κελιού ηλεκτροφόρησης, n (dyne sec/cm 2) το ιξώδες του μέσου, ε η διηλεκτρική σταθερά του μέσου και Ε (V/cm) η ένταση του εφαρμοζόμενου δυναμικού. Το ζ - δυναμικό σχετίζεται με το δυναμικό επιφάνειας των σωματιδίων και επηρεάζει μεγάλο φάσμα ιδιοτήτων των κολλοειδών συστημάτων όπως τη σταθερότητά τους, την αλληλεπίδρασή τους με ηλεκτρολύτες και φάρμακα καθώς και τις ρεολογικές ιδιότητες των εναιωρημάτων. Η τιμή του ζ-δυναμικού αποτελεί ένδειξη για την καλή εκτίμηση σταθερότητας των κολλοειδών διασπορών. Είναι γενικά αποδεκτό ότι λιποσωμικές διασπορές με μεγάλο θετικό ή αρνητικό ζ δυναμικό εμφανίζουν απωστικές δυνάμεις που εμποδίζουν τη συσσώρευση, πήξη, συσσωμάτωση και κατακρήμνιση των σωματιδίων τους. Τιμές από -30mV έως 30mV υποδηλώνουν ότι οι λιποσωμικές διασπορές είναι σταθερές. Ωστόσο, σε τιμές μεγαλύτερες των 70 mv εμφανίζεται το φαινόμενο της περικινητικής συσσωμάτωσης και οι λιποσωμικές διασπορές χάνουν τη σταθερότητά τους. Η φύση και η πυκνότητα του επιφανειακού φορτίου είναι επίσης πολύ σημαντικοί παράμετροι που επηρεάζουν τη συμπεριφορά των λιποσωμάτων. Και οι δύο παράμετροι μπορούν να μεταβληθούν με την αλλαγή της λιπιδικής σύστασης των λιποσωμάτων. Η έλλειψη φορτίου επιφάνειας μπορεί να μειώσει τη φυσική σταθερότητα των SUV, αυξάνοντας τη συσσωμάτωσή τους. Επιπλέον τα ουδέτερα λιποσώματα δεν αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα, ενώ μεγάλο επιφανειακό φορτίο προάγει σημαντικά αλληλεπιδράσεις τέτοιου είδους Μεταβολική πορεία των λιποσωμάτων στον οργανισμό Συμβατικά Λιποσώματα Τα λιποσώματα προστατεύουν τα εγκλωβισμένα μόρια από αποσύνθεση και μπορούν παθητικά να στοχεύσουν ιστούς ή όργανα που έχουν ασυνεχές ενδοθήλιο, όπως το συκώτι, ο σπλήνας, και ο μυελός των οστών. Στην ενδοφλέβια χορήγηση, τα λιποσώματα συλλαμβάνονται γρήγορα από το μονοπύρηνο σύστημα φαγοκύτταρων (MPS) και αφαιρούνται από την κυκλοφορία του αίματος (Scherphof 1985). Αυτή η συμπεριφορά έχει χρησιμοποιηθεί για την αποτελεσματική χορήγηση αντιπαρασιτικών και αντιμικροβιακών βιοδραστικών ουσιών για μολύνσεις που εντοπίζονται στο μονοπύρηνο φαγοκυτταρικό σύστημα. 47

48 Εντούτοις, όταν είναι η περιοχή στόχευσης είναι μετά από το MPS,η αποδοτική λήψη των λιποσωμάτων από τα μακροφάγα, και η κατά συνέπειά αφαίρεση τους από την κυκλοφορία, είναι ένα από τα κύρια μειονεκτήματα για την πιθανή χρήση των λιποσωμάτων ως συστήματα παράδοσης βιοδραστικών ουσιών. Η σύνδεση των πρωτεϊνών του ορού (οψονίνες) είναι το πρώτο σήμα για την αφαίρεση των λιποσωμάτων: το MPS δεν αναγνωρίζει τα ίδια τα λιποσώματα αλλά, μάλλον, αναγνωρίζουν τις οψονίνες, που είναι συνδεδεμένες στην επιφάνεια των λιποσωμάτων. Ένας περιορισμένος αριθμός πιθανών πρωτεϊνών που έχουν επιπτώσεις στη μοίρα των λιποσώματων έχει προσδιοριστεί, π.χ., ανοσοσφαιρίνες (Patel 1992), β-2-γλυκοπρωτείνη (Chonn et al 1995),, και β-2-macroglobulin (Murai et al 1995). Συμπληρωματικά συστήματα (Patel 1992 Devine et al 1994 Harashima et al 1994) περιλαμβάνουν ένα άλλο σημαντικό σύστημα ικανό να αναγνωρίσει τα λιποσώματα. Αυτό το σύστημα ενεργεί ξεκινώντας την λύση των μεμβρανών και ενισχύοντας την πρόσληψη από τα κύτταρα του MPS (μονοκύτταρα, μακροφάγα). Η αστάθεια των λιποσωμάτων στο πλάσμα οφείλεται στην αλληλεπίδραση τους με τις υψηλής (HDL) και χαμηλής (LDL) πυκνότητας λιποπρωτεΐνες κάτι που έχει ως αποτέλεσμα την γρήγορη απελευθέρωση της εγκλωβισμένης βιοδραστικής ουσίας στο πλάσμα. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες των λιποσωμάτων, όπως το επιφανειακό φορτίο, η υδροφοβικότητα, το μέγεθος, η ρευστότητα, και η διευθέτηση των στοιβάδων των λιπιδίων, επηρεάζει τη σταθερότητά τους και τον τύπο πρωτεϊνών που τα δεσμεύουν (Chonn et al 1992, Oja et al 1996). Oι πρώτες προσπάθειες για να υπερνικηθούν τα προβλήματα αυτά, στράφηκαν στα συστατικά της λιπιδικής μεμβράνης προκειμένου να τροποποιηθεί η ρευστότητα των στοιβάδων. Οι Damen et Al (2005) κατέδειξαν ότι η ενσωμάτωση της χοληστερόλης (CHOL), προκαλώντας το αυξανόμενο πακετάρισμα των φωσφολιπιδίων στην στοιβάδα, μειώνει τη μεταφορά των φωσφολιπιδίων από τις HDL. Ο Senior (1982) κατέδειξε ότι τα λιποσώματα από φωσφατιδυλοχολινη (PC) με κορεσμένα λιπαρά οξέα (με υψηλή θερμοκρασία μετάπτωσης) ή από σφιγγομυελίνη (SM) είναι σταθερότερα στο αίμα από λιποσώματα που προετοιμάζονται από PC με ακόρεστα λιπαρά οξέα. Διάφορες προσεγγίσεις έχουν λάβει επίσης υπόψιν το μέγεθος και το φορτίο των λιποσωμάτων, ώστε να μειωθεί η πρόσληψη από το MPS. Γενικά, τα μεγαλύτερα λιποσώματα αποβάλλονται από το αίμα γρηγορότερα από τα μικρότερα (Senior 48

49 1982). Τα SUV έχουν χρόνο ημιζωής μεγαλύτερο από τα πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (MLVs) ( nm). Αυτό φανερώνει ότι τα φαγοκύτταρα μπορούν να διακρίνουν τα μεγέθη των ξένων μορίων. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, είναι εμφανές ότι η σύνδεση των οψονινών στα λιποσώματα εξαρτάται από το μέγεθός των λιποσωμάτων, και αυτό κατά συνέπεια δείχνει ότι η ενισχυμένη πρόσληψη των λιποσωμάτων από το MPS καθώς και από το ήπαρ είναι εξαρτώμενη από το μέγεθος (Harashima et al 1994) Λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας Η χρήση κορεσμένων φωσφολιπιδίων και χοληστερόλης στα λιποσωμικά συστήματα παράδοσης βιοδραστικών ουσιών δεν μπορεί πλήρως να υπερνικήσει την σύνδεσή τους με τις οψονίνες, και την συνεπώς μειωμένη λήψη λόγω του MPS. Επιπλέον, τα SUVs έχουν το μειονέκτημα του χαμηλού εγκλωβισμού υδατικού όγκου, και η χρήση φορτισμένων λιποσωμάτων μπορεί να είναι τοξική. Αρκετές διαφορετικές στρατηγικές έχουν αναπτυχθεί για να ξεπεραστούν αυτές οι δυσκολίες με την τοποθέτηση στην επιφάνεια των λιποσωμάτων αδρανών χημικά μορίων για να διαμορφωθεί ένα στερεοχημικό εμπόδιο. Η πρώτη στρατηγική που μελετήθηκε ήταν η προετοιμασία λιποσωμάτων που μιμούνται την μεμβράνη των ερυθροκυττάρων σε αυτήν την περίπτωση η επιφάνεια λιποσωμάτων τροποποιήθηκε με γαγγλιοζίτες και παράγωγα του σιαλικού οξέος, όπως το monosialoganglioside (GM1) (Gabizon and Papahadjopoulos 1988, Allen et al 1989). Τo επόμενο βήμα ήταν να αυξηθεί η υδροφιλικότητα της επιφάνειας με τη χρήση υδρόφιλων πολυμερών. Ο μηχανισμός με τον οποίο η σταθεροποίηση των λιποσωμάτων αυξάνει τη μακροζωία τους στην κυκλοφορία είναι εκτενώς συζητημένος (Drummond et al 1999). Η βασική ιδέα είναι ότι ένα υδρόφιλο πολυμερές ή γλυκολιπίδιο, όπως το PEG ή το GM1, που έχει μια εύκαμπτη αλυσίδα που καταλαμβάνει το διάστημα αμέσως μετά την επιφάνεια των λιποσωμάτων (periliposomal layer), τείνει να αποκλείσει άλλα μακρομόρια από αυτό το διάστημα. Συνεπώς, η πρόσβαση και η δέσμευση των οψονινών του ορού του αίματος στην επιφάνεια των λιποσωμάτων εμποδίζεται, και έτσι οι αλληλεπιδράσεις των μακρόφαγων του MPS με τέτοια λιποσώματα είναι μειωμένη. 49

50 Μεταξύ των διαφορετικών πολυμερών που ερευνώνται στην προσπάθεια για να βελτιώσουν το χρόνο κυκλοφορίας αίματος των λιποσωμάτων, η πολύαιθυλενογλυκόλη (PEG) έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως. Μπορεί να ενσωματωθεί στην λιποσωμική επιφάνεια με πολλούς διαφορετικούς τρόπους, αλλά η ευρύτατα χρησιμοποιημένη μέθοδος αυτή τη στιγμή είναι η σύνδεση του πολυμερούς στην μεμβράνη μέσω ενός διασυνδεμένου λιπιδίου (π.χ.,peg distearoylphosphatidylethanolamine [ DSPE ] (Allen et al ). Σχήμα 1.15 Συμβατικά λιποσώματα και stealth λιποσώματα 1.11 Κυκλοδεξτρίνες (Γενικά) Οι κυκλοδεξτρίνες περιγράφηκαν για πρώτη φορά το 1891 από τον Villiers, ενώ λίγο αργότερα ο Schardinger ταυτοποίησε τις τρεις φυσικές κυκλοδεξτρίνες (α, β και γ). Αυτά τα τρία προϊόντα αρχικά αναφέρονταν ως σάκχαρα του Schardinger. Για 25 χρόνια και συγκεκριμένα στο διάστημα μεταξύ 1911 και 1935, ο Pringsheim στη Γερμανία ήταν ένας από τους κυριότερους ερευνητές των κυκλοδεξτρινών και αυτός ο οποίος τελικά απέδειξε ότι οι κυκλοδεξτρίνες έχουν την ικανότητα να σχηματίζουν σταθερά υδατοδιαλυτά σύμπλοκα με μεγάλο αριθμό χημικών μορίων. Μέχρι και τα μέσα της δεκαετίας του 1970 και οι τρεις φυσικές κυκλοδεξτρίνες είχαν ταυτοποιηθεί δομικά και χημικά και μεγάλος αριθμός συμπλόκων είχε ταυτοποιηθεί. 50

51 Σήμερα οι κυκλοδεξτρίνες έχουν ευρύτατη εφαρμογή στη φαρμακευτική βιομηχανία, καθώς μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αντιδραστήρια συμπλοκοποίησης βελτιώνοντας ιδιότητες των φαρμάκων με τα οποία σχηματίζουν σύμπλοκα όπως η διαλυτότητα, τη βιοδιαθεσιμότητα και τη σταθερότητα. Επιπρόσθετα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μείωση του ερεθισμού του γαστρικού βλενογόνου, την κάλυψη της δυσάρεστης οσμής ή γεύσης διαφόρων φαρμάκων, αλλά και για τη μετατροπή φαρμάκων που βρίσκονται σε υγρή μορφή σε μικροκρυσταλλικό ή άμορφο στερεό. Σχήμα 1.16 Εφαρμογές των κυκλοδεξτρινών στη φαρμακευτική βιομηχανία Προέλευση κυκλοδεξτρινών (Cyclodextrins / CD) Οι κυκλοδεξτρίνες είναι μια γενική κατηγορία μορίων τα οποία αποτελούνται από μονάδες γλυκόζης, οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους με α - [1,4] γλυκοσιδικούς δεσμούς. Στη φύση, η ενζυματική πέψη του αμύλου με την γλυκοσυλοτρανσφεράση της κυκλοδεξτρίνης (CGTase) παράγει ένα μίγμα κυκλοδεξτρινών το οποίο αποτελείται από 6, 7 και 8 μονάδες γλυκόζης. Πρόκειται για μια διαδικασία η οποία ανακαλύφθηκε το 1891 από τον Α. Villiers (Α.Villiers, Compt. Rend. Acad. Sci. Paris). Οι εμπορικά κυκλοφορούσες κυκλοδεξτρίνες ακόμα και σήμερα παράγονται με ενζυματικές ή βιολογικές διαδικασίες, με τη διαφορά ότι σήμερα υπάρχουν περισσότερο εξειδικευμένα ένζυμα, τα οποία παράγουν σε όσο το δυνατόν 51

52 μεγαλύτερη ποσότητα την επιθυμητή κυκλοδεξτρίνη. Συνοπτικά, η παραγωγή των κυκλοδεξτρινών είναι σχετικά απλή και περιλαμβάνει την επεξεργασία του αμύλου με ένα σύνολο εύκολα διαθέσιμων ενζύμων. Αρχικά το άμυλο υγροποιείται είτε με θέρμανση είτε με την προσθήκη α-αμυλάσης και, έπειτα προστίθεται το ένζυμο. Οι CGTases μπορούν να συνθέσουν και τις τρεις μορφές κυκλοδεξτρινών, έτσι η ενζυμική αυτή μετατροπή οδηγεί σ ένα μίγμα και των τριών τύπων των φυσικών κυκλοδεξτρινών, σε αναλογίες οι οποίες εξαρτώνται από τη μορφή της κυκλοδεξτρίνης ή του ενζύμου που χρησιμοποιείται κάθε φορά. Σχήμα 1.17 Παρασκευή φυσικών κυκλοδεξτρινών με την επίδραση του ενζύμου CGTase. Κάθε τύπος ενζύμου έχει τα δικά του χαρακτηριστικά ως προς την αναλογία σύνθεσης των τριών τύπων κυκλοδεξτρίνης. Η μέθοδος που εφαρμόζεται για την παραλαβή της κάθε φορά επιθυμητής κυκλοδεξτρίνης εξαρτάται από τη διαλυτότητα της συγκεκριμένης κυκλοδεξτρίνης. Για παράδειγμα η β-cd της οποίας η διαλυτότητα στο νερό είναι μικρότερη, συγκριτικά με τους άλλους δύο τύπους κυκλοδεξτρινών (α-cd και γ-cd), ενώ αντίθετα οι άλλοι δύο τύποι κυκλοδεξτρίνης παραλαμβάνονται με χρωματογραφικές τεχνικές οι οποίες είναι ακριβές και αρκετά χρονοβόρες. Μια εναλλακτική μέθοδος για τη λήψη του επιθυμητού προϊόντος περιλαμβάνει την προσθήκη αντιδραστηρίων (τολουόλιο, ακετόνη ή αιθανόλη) κατά την ενζυματική διαδικασία τα οποία σχηματίζουν σύμπλοκα με την κυκλοδεξτρίνη που μας ενδιαφέρει, έπειτα καθιζάνουν και λαμβάνονται τελικά με φυγοκέντρηση. Συνεπώς το ποσοστό της παραγόμενης κάθε φορά κυκλοδεξτρίνης εξαρτάται από το ένζυμο που χρησιμοποιείται, αλλά και από τις συνθήκες της αντίδρασης. 52

53 Δομικά χαρακτηριστικά Οι κυκλοδεξτρίνες αποτελούνται από έξι ή περισσότερες μονάδες D- γλυκοπυρανόζης οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους με α - [1,4] γλυκοσιδικούς δεσμούς (σχήμα 1.18α). Χαρακτηρίζονται με το πρόθεμα α, β, ή γ του ελληνικού αλφαβήτου, όταν αποτελούνται αντίστοιχα από 6, 7 ή 8 μονάδες γλυκόζης. Όσο ο αριθμός των μονάδων γλυκοπυρανόζης αυξάνει τόσο αυξάνει και η διάμετρος του κώνου που σχηματίζει το μόριο της κυκλοδεξτρίνης. Το μοριό τους σε κάθετη τομή μοιάζει με κόλουρο κώνο (Σχήμα 1.18β). Το εσωτερικό της κοιλότητάς τους είναι σχετικά υδρόφοβο λόγω της παρουσίας των μεθυλενομάδων, ενώ η είσοδός τους είναι υδρόφιλη λόγω της παρουσίας πρωτοταγών και δευτεροταγών υδροξυλομάδων. Τα χαρακτηριστικά αυτά του μορίου δίνουν στην κυκλοδεξτρίνη την ικανότητα να δρα ως μόριο-ξενοδοχείο, σχηματίζοντας σύμπλοκα με μεγάλο αριθμό μορίων. Σχήμα (α) Δομή β-κυκλοδεξτρίνης (β) Κάθετη τομή μορίου κυκλοδεξτρίνης Φυσικές κυκλοδεξτρίνες Οι φυσικές κυκλοδεξτρίνες α-, β- και γ- αποτελούνται αντίστοιχα από έξι, επτά και οκτώ μονάδες γλυκοπυρανόζης. Οι τρεις αυτές κυκλοδεξτρίνες διαφέρουν μεταξύ τους στο μέγεθος της κοιλότητάς τους και στη διαλυτότητά τους (Πίνακας 1.2). Πίνακας 1.2 Βασικά χαρακτηριστικά φυσικών κυκλοδεξτρινών. α β Γ Αριθμός μονάδων Γλυκόζης

54 Μοριακό βάρος Διαλυτότητα στο 14,5 1,85 23,2 νερό (g/100ml) Εσωτερική διάμετρος 0,45 0,57 0,62 0,78 0,79 0,95 (nm) Εξωτερική διάμετρος 1,37 1,53 1,69 (nm) Ύψος (nm) 0,79 0,79 0,79 Κυκλοδεξτρίνες με λιγότερες από έξι μονάδες γλυκόζης δε μπορούν να σχηματιστούν λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης ενώ κυκλοδεξτρίνες με εννέα ή περισσότερες μονάδες γλυκόζης είναι πολύ δύσκολο να ληφθούν. Ωστόσο τελευταία επιτεύχθηκε η απομόνωση της δ-cd που αποτελείται από 9 μονάδες γλυκόζης. Οι φυσικές κυκλοδεξτρίνες, και ιδιαίτερα η β-cd, έχουν χαμηλή υδατοδιαλυτότητα. Αυτό σημαίνει ότι τα σύμπλοκα που σχηματίζονται με τα μόρια αυτά παρουσιάζουν χαμηλή διαλυτότητα γεγονός που οδηγεί σε καθίζηση των συμπλόκων. Η χαμηλή υδατοδιαλυτότητα των φυσικών κυκλοδεξτρινών οφείλεται στους σχετικά ισχυρούς ενδομοριακούς δεσμούς υδρογόνου που σχηματίζονται μεταξύ γειτονικών ομάδων γλυκόζης στο ίδιο μόριο (Σχήμα 1.19). Σχήμα Ενδομοριακοι δεσμοί υδρογόνου. Οι φυσικές κυκλοδεξτρίνες δεν υδρολύονται από την ανθρώπινη σίελο και από τις παγκρεατικές αμυλάσες και λόγω του υψηλού μοριακού βάρους και της υδροφιλικότητάς τους δε διαπερνούν το γαστρεντερικό φραγμό. Η β-cd έχει ευρέως χρησιμοποιηθεί στη φαρμακευτική λόγω της ικανότητάς της να αλληλεπιδρά με μεγάλο αριθμό φαρμάκων. Ωστόσο, η χαμηλή υδατοδιαλυτότητα της και η 54

55 νεφροτοξικότητά της έχουν περιορίσει τη χρήση της ιδιαίτερα για την παρεντερική χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων. Γενικά η in vivo κυτταροτοξικότητα των κυκλοδεξτρινών και ιδιαίτερα της β- CD οφείλεται στη αλληλεπίδρασή τους με τη χοληστερόλη των μεμβρανών κυρίως διαμέσου του σχηματισμού ενώσεων έγκλεισης, οπότε και μεταβάλλουν τις ιδιότητες της μεμβράνης και προκαλούν αιμόλυση των κυττάρων. Λόγω της τοξικότητας και της χαμηλής υδατοδιαλυτότητας των φυσικών κυκλοδεξτρινών, αρκετά παράγωγα κυκλοδεξτρινών αναπτύχθηκαν Χημική τροποποίηση κυκλοδεξτρινών Στα τέλη της δεκετίας του 1970 οι επιστήμονες ξεκίνησαν να τροποποιούν χημικά τις κυκλοδεξτρίνες με στόχο την επίλυση προβλημάτων που σχετίζονταν με τηn υδατοδιαλυτότητά και την τοξικότητά τους. Έτσι το 1981 ο Jocef Pitha πέτυχε την αύξηση της διαλυτότητας λιποδιαλυτών βιταμινών τροποποιώντας τις φυσικές κυκλοδεξτρίνες με την εισαγωγή αλκυλομάδων στο μοριό τους. Πλέον έχει παρασκευαστεί ένας μεγάλος αριθμός τροποποιημένων κυκλοδεξτρινών και οι προσπάθειες για τη βελτιστοποίηση της λειτουργικότητάς τους συνεχίζονται. Μερικές από τις εμπορικά διαθέσιμες τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες αναφέρονται στον πίνακα 2. Από αυτές ορισμένες μόνο έχουν φαρμακευτική εφαρμογή. Η χημική τροποποίηση των κυκλοδεξτρινών περιλαμβάνει την εισαγωγή διαφόρων χημικών υπομονάδων στο μόριο της κυκλοδεξτρίνης με βασικό σκοπό τη βελτίωση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων τους και της ικανότητάς τους να σχηματίζουν ενώσεις έγκλεισης. Οι υπομονάδες αυτές είναι συνήθως μεθυλομάδες, υδροξυπροπυλομάδες, καρβοξυμεθυλομάδες ή αλκυλομάδες. Π.χ η HP-β-CD παρασκευάζεται με την αντίδραση προπυλενοξειδίου με τη β-cd σε βασικό διάλυμα αυτής. Γενικότερα κατά την εισαγωγή του αντιδραστηρίου στο διάλυμα της κυκλοδεξτρίνης μπορεί να πραγματοποιηθεί αντίδραση τόσο με τις υδροξυλομάδες που βρίσκονται στην πάνω πλευρά του κωνικού μορίου της όσο και με αυτές που βρίσκονται στην κάτω πλευρά. Συγκεκριμένα η αλληλεπίδραση πραγματοποιείται με μια ή περισσότερες από τις υδροξυλομάδες της 2, 3 ή 6 θέσης (Σχήμα 1.20). Είναι χαρακτηριστικό ότι η περισσότερο δραστική υδροξυλομάδα σε μια αντίδραση υποκατάστασης είναι η υδροξυλομάδα που συνδέεται με τον άνθρακα της θέσης 6 και 55

56 στη σειρά δραστικότητας ακολουθεί με πολλή μικρή διαφορά στη δραστικότητα αυτή που συνδέεται με τον άνθρακα στη θέση 2. Τελευταία στη σειρά αυτή βρίσκεται η υδροξυλομάδα της θέσης 3. Αν και η δραστικότητα μεταξύ των υδροξυλομάδων της θέσης 6 και 2 είναι δύσκολο να διαφοροποιηθεί, οι υποκαταστάτες που εισάγοντα στο μόριο της κυκλοδεξτρίνης εμφανίζουν μεγαλύτερη ειδικότητα για τη υδροξυλομάδα της θέσης 6 λόγω μικρότερης στερεοχημικής παρεμπόδισης (Σχήμα 1.20). Σχήμα Αλληλεπίδραση με υδροξυλομάδες της 2, 3 ή 6 θέσης. Καθώς κάθε υδροξυλομάδα του μορίου της κυκλοδεξτρίνης διαφέρει ως προς τη χημική δραστικότητα, η αντίδραση χημικής τροποποίησης οδηγεί σ ένα άμορφο μίγμα εκατοντάδων στερεοϊσομερών και οπτικών ισομερών. Στην περίπτωση της HPβ-CD το μίγμα που προκύπτει μετά την αντίδραση μπορεί να περιέχει γύρω στα 2.097,151 πιθανα γεωμετρικά ισομερή για την HP-β-CD. Γενικά οι βαθμοί υποκατάστασης μεταξύ 3-11 (βλέπε παρακάτω) συνδέονται με τις πιθανότητες που περιγράφει η ακόλουθη σχέση : (a!/b!)/(a-b)! όπου a ο αριθμός των υδροξυλομάδων στη β-cd και b ο βαθμός υποκατάστασης. Για μια τρι-υποκατεστημένη κυκλοδεξτρίνη π.χ, τα πιθανά στερεοχημικά ισομερή είναι Καθένα από τα ισομερή αυτά με τη σειρά του έχει και τα δικά του οπτικά ισομερή, οπότε αντιλαμβανόμαστε ότι ο αριθμός των πιθανών ισομερών είναι αστρονομικός. 56

57 Είναι φανερό ότι όταν η παραγωγή μιας τροποποιημένης κυκλοδεξτρίνης πραγματοποιείται κάτω από διαφορετικές συνθήκες, οι φυσικοχημικές ιδιότητες διαφορετικών δειγμάτων αυτής μπορεί να διαφέρουν ακόμα και αν έχουν τον ίδιο βαθμό υποκατάστασης. Το γεγονός αυτό οφείλεται στο ότι ο υποκαταστάτης μπορεί να βρίσκεται σε διαφορετική κάθε φορά θέση του μητρικού μορίου. Η καθαρότητα όμως μιας κυκλοδεξτρίνης μπορεί να έχει σημαντική επίδραση στη τελική ποιότητα του φαρμακευτικού προϊόντος και στις ιδιότητές του. Έτσι είναι απαραίτητο να γνωρίζουμε κάθε φορά τις ακόλουθες παραμέτρους, ώστε να μπορούμε να ταυτοποιήσουμε την καθαρότητα της κυκλοδεξτρίνης που χρησιμοποιούμε: α. Βαθμός υποκατάστασης (degree of subtitiution or DS) Η υποκατάσταση που λαμβάνει χώρα σ ένα μόριο κυκλοδεξτρίνης περιγράφεται από τον όρο βαθμός υποκατάστασης. Ο βαθμός υποκατάστασης προσδιορίζεται με φασματοφωτομετρία μάζας (MS) ή με πυρηνικό μαγνητικό συντονισμό (NMR) και δεν δίνει πληροφορίες για την ακριβή θέση των υποκαταστατών δηλαδή αν ο υποκαταστάτης είναι συνδεδεμένος με την υδροξυλομάδα της θέσης 2, 3 ή 6, καθώς και για την κατανομή του υποκαταστάτη γύρω από την κυκλοδεξτρίνη. Θεωρητικά ο μέγιστος βαθμός υποκατάστασης για την α-cd είναι 18, για την β-cd 21 και για τη γ-cd 24. Βέβαια εάν ο υποκαταστάτης διαθέτει επιπλέον υδροξυλομάδες επιπρόσθετη υποκατάσταση αυτών είναι πιθανή. β. Μέσος όρος μοριακού βαθμού υποκατάστασης (Average molar degree of substitution or MS). Αποτελεί το μέσο όρο του αριθμού των μορίων του αντιδραστηρίου υποκατάστασης π.χ υδροξυπροπυλ- ανά μόριο γλυκοπυρανόζης. Ωστόσο ο αριθμός αυτός δεν περιγράφει απαραίτητα το βαθμό στο οποίο οι ενεργές περιοχές υφίστανται υποκατάσταση, όταν το αντιδραστήριο υποκατάστασης έχει από μόνο του ενεργές περιοχές, ή όταν νέες ενεργές περιοχές δημιουργούνται κατά την αντίδραση υποκατάστασης. Έτσι η τιμή του MS μπορεί να είναι μεγαλύτερη από 3 για καθε μονάδα γλυκοπυρανόζης του υποκατεστημένου μορίου ή μεγαλύτερη από 18,21 και 24 για τις α-, β- και γ-cds αντίστοιχα. 57

58 γ. Βαθμός πολυμερισμού (Degree of polymerization or DP). Αποτελεί την αναλογία MS/DS. Εάν δεν δημιουργούνται επιπλέον ενεργές περιοχές κατά την υποκατάσταση, ο MS και ο DS έχουν τις ίδιες τιμές και ο DP είναι ίσος με 1. δ. Τελικός βαθμός υποκατάστασης (Total Degree of substitution). Η παράμετρος αυτή αντιστοιχεί το μέσο όρο του αριθμού των υποκαταστατών ανά μόριο κυκλοδεξτρίνης με αποτέλεσμα την αποφυγή της σύγχυσης μεταξύ MS και DS. Όταν είναι γνωστά τα MS και ο DS, μπορεί να υπολογιστεί το μοριακό βάρος του προϊόντος υποκατάστασής με βάση την σχεση η οποία για την ΗΡ-β-CD έχει την ακόλουθη μορφή : Mw = * (TDS) (1) Όπου 1135 και 58,08 είναι τα μοριακά βάρη της β-cd και του οξειδίου του προπυλενίου αντίστοιχα. Στην περίπτωση της β-cd με 7 μονάδες γλυκοπυρανόζης, ο TDS είναι 7* MS και έτσι η σχέση 1 παίρνει τη μορφή: Mw = 406,56*( MS ) (2) Επίδραση τροποποίησης στις φυσικοχημικές ιδιότητες του μορίου της κυκλοδεξτρίνης. Η χημική τροποποίηση των κυκλοδεξτρινών αποβλέπει κυρίως στην αύξηση της λειτουργικότητάς τους κυρίως μέσω βελτιστοποίησης της υδατοδιαλυτότητάς τους, την αύξηση της φυσικής και μικροβιολογικής σταθερότητας και τη μείωση της τοξικότητάς τους. Είναι χαρακτηριστικό ότι σημαντικό μέρος των προσπαθειών για τη βελτίωση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων των κυκλοδεξτρινών εστιάζεται στην τροποποίηση της διαλυτότητας τους και κατ επέκταση των συμπλόκων που αυτές σχηματίζουν. Η υποκατάσταση των υδροξυλομάδων του μορίου της κυκλοδεξτρίνης διασπά το δίκτυο των δεσμών υδρογόνου στο εσωτερικό και μειώνει έτσι την τάση για 58

59 σχηματισμό κρυστάλλων με τελικό αποτέλεσμα την αύξηση της υδατοδιαλυτότητας του. Τα υδροξυπρόπυλοπαράγωγα της β-cd παρουσιάζουν εξαιρετικά υψηλή υδατοδιαλυτότητα σε σχέση με τη β-cd, η οποία φτάνει σε ποσοστό 60%. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με την χαμηλή τοξικότητά τους έχει ως αποτέλεσμα τα παράγωγα αυτά να παρουσιάζουν ιδιαίτερο φαρμακευτικό ενδιαφέρον. Σημαντική επίδραση στην ικανότητα συμπλοκοποίησης της HP-β-CD έχει ο βαθμός υποκατάστασης. Σε χαμηλές τιμές του βαθμού υποκατάστασης η ικανότητα συμπλοκοποίησης είναι όμοια με αυτή της β-cd, αντίθετα με την αύξηση του βαθμού υποκατάστασης παρατηρείται μείωση λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης πλέον. Η εισαγωγή υποκαταστατών όπως οι θειοαλκυλομάδες οι καρβοξυαλκυλομάδες και οι αλκυλαμίνες οι οποίες σε υδατικό διάλυμα είναι ιονισμένες οδηγεί σε παράγωγα με υψηλή υδατοδιαλυτότητα. Οι θειοαλκυλαιθέρες της β-cd (Σχήμα 1.21) για παράδειγμα αποτελούν παράγωγα με εξαιρετικές διαλυτοποιητικές ικανότητες συγκριτικά με αυτές της β-cd, λόγω ιονισμού της θειολομάδας. Σχήμα 1.21 Παράγωγο της β-cd με την παρουσία θειοαλκυλαιθέρων. 59

60 Σχηματισμός συμπλόκων κυκλοδεξτρινών με βιοδραστικές ενώσεις Η κεντρική κοιλότητα των κυκλοδεξτρινών αποτελείται από άτομα άνθρακα και αιθερικό οξυγόνο από τις μονάδες γλυκόζης του μορίου της κυκλοδεξτρίνης και διαμορφώνεται έτσι ένα λιπόφιλο μικροπεριβάλλον κατάλληλο για τον εγκλωβισμό πολλών βιοδραστικών ενώσεων. (α) Σχήμα (α) Σχηματισμός συμπλόκου μεταξύ πιροξικάμης και HP-β-CD και (β) σχηματισμός συμπλόκου μεταξύ αζουλενίου και β-cd. (β) Ο σχηματισμός συμπλόκων μεταξύ κυκλοδεξτρινών και φαρμάκων περιλαμβάνουν τον εγκλωβισμό εντός του μορίου κυκλοδεξτρίνης ολόκληρου του μορίου του φαρμάκου (Σχήμα 1.22α) ή ενός μόνο λιπόφιλου τμήματος αυτού (Σχήμα 1.22β). Οι κινητήριες δυνάμεις για τη συμπλοκοποίηση περιλαμβάνουν ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις, δυνάμεις Van der Waals, σχηματισμό δεσμών υδρογόνου και αλληλεπιδράσεις με μεταφορά φορτίου. Η κύρια δύναμη για το σχηματισμό των συμπλόκων είναι η απελευθέρωση μορίων νερού από την κοιλότητα της κυκλοδερξτρίνης. Τα μόρια νερού που εντοπίζονται εντός της κοιλότητας είναι υψηλής ενθαλπίας και η ενέργεια του συστήματος μειώνεται, όταν τα μόρια αυτά αντικαθίστανται από μόρια του φαρμάκου τα οποία είναι λιγότερο πολικά από τα μόρια του νερού. Στο σχήμα 1.23 φαίνεται η ισορροπία που αποκαθίσταται κατά το σχηματισμό συμπλόκου μεταξύ κυκλοδεξτρίνης και ενός λιπόφιλου μορίου παρουσία μιας μικρής ποσότητας νερού. Τέσσερις βασικοί παράγοντες είναι υπεύθυνοι για τη μετατόπιση της ισορροπίας προς τα δεξιά : 60

61 Σχήμα Η δημιουργία μιας ένωσης έγκλεισης περιλαμβάνει πολλαπλές αλληλεπιδράσεις μεταξύ της ένωσης που εγκλείεται στην κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης, της κυκλοδεξτρίνης και του διαλύτη. Η εκτόπιση μορίων νερού από τη μη πολική κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης. Η αύξηση του αριθμού των δεσμών υδρογόνου που δημιουργούνται, καθώς τα μόρια νερού που εκτοπίστηκαν επιστρέφουν στη μεγαλύτερη δεξαμενή. Η εξασθένιση των απωστικών δυνάμεων μεταξύ του υδρόφοβου μορίου και του υδατικού περιβάλλοντος. Η ενίσχυση των υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, καθώς το μόριο εισέρχεται εντός της υδρόφοβης κοιλότητας της κυκλοδεξτρίνης Μέθοδοι προσδιορισμού της σταθεράς συμπλοκοποίησης. Σε υδατικό διάλυμα, το ελεύθερο μόριο της βιοδραστικής ένωσης βρίσκεται σε ισορροπία με μόρια της βιοδραστικής ένωσης που συνδέονται με το μόριο της κυκλοδεξτρίνης. Τα δύο βασικά χαρακτηριστικά των συμπλόκων είναι η στοιχειομετρία τους και οι αριθμητικές τιμές των σταθερών συμπλοκοποίησης. Εάν m μόρια φαρμάκου (D) αντιδρούν με n μόρια κυκλοδεξτρίνης (CD) και σχηματίζουν το σύμπλοκο (Dm CDn), αποκαθίσταται η ακόλουθη ισορροπία : όπου Κm:n η σταθερά συμπλοκοποίησης του συμπλόκου. Γενικά οι φυσικοχημικές ιδιότητες των ελεύθερων μορίων φαρμάκου διαφέρουν από αυτές των μορίων της βιοδραστικής ένωσης που σχηματίζουν συμπλοκο με την κυκλοδεξτρίνη. Έτσι κάθε μεθοδολογία η οποία μπορεί να παρακολουθήσει τις μεταβολές στις ιδιότητες αυτές μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της στοιχειομετρίας του σχηματιζόμενου συμπλόκου και των αριθμητικών δεδομένων των σταθερών 61

62 συμπλοκοποίησης. Οι μεταβολές στις φυσικοχημικές ιδιότητες περιλαμβάνουν αλλαγές στην απορρόφηση UV/VIS, στη χημική δραστικότητά και στο φθορισμό τους, σε NMR χημικές μεταβολές, στη συγκράτηση του φαρμάκου (π.χ σε υγρή χρωματογραφία), σε αλλαγές στις τιμές pkα, σε ποτενσιομετρικές μετρήσεις και στη διαπερατότητα του φαρμάκου από τεχνικές μεμβράνες Μελέτη της συμπλοκοποίησης με τη μέθοδο της διαλυτότητας φάσης. Η μέθοδος αυτή περιγράφηκε για πρώτη φορά από τους Higuchi και Connors (1965) και αποτελεί τη πιο διαδεδομένη μέθοδο για τη μελέτη συμπλόκων που σχηματίζουν οι κυκλοδεξτρίνες. Η μέθοδος αυτή μελετά την επίδραση ενός μέσου διαλυτοποίησης στην προκειμένη περίπτωση της κυκλοδεξτρίνης στη διαλυτοποίηση μιας βιοδραστικής ένωσης. Τα διαγράμματα διαλυτότητας φάσης είναι δύο τύπων τα Α και Β (Σχήμα 1.24). Τα διαγράμματα τύπου Α αντιστοιχούν στο σχηματισμό ευδιάλυτων συμπλόκων, ενώ τα τύπου Β στο σχηματισμό συμπλόκων με χαμηλή διαλυτότητα. Τα διαγράμματα τύπου Β χωρίζονται σε δύο υποτύπους : ο υπότυπος Β s αντιστοιχει στο σχηματισμό συμπλόκων με χαμηλή διαλυτότητα, ενώ ο Β Ι σε αδιάλυτα σύμπλοκα.. Τα διαγράμματα τύπου Α με τη σειρά τους χωρίζονται στο υπότυπο Α L (στον υπότυπο αυτό η διαλυτότητα του φαρμάκου αυξάνει γραμμικά με τη συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης), στον Α N ( θετικά αποκλίνουσα ισόθερμη) και στον Αp (αρνητικά αποκλίνουσα ισόθερμη). Η β-cd δίνει συχνά διαγράμματα τύπου Β λόγω της χαμηλής υδατοδιαλυτότητάς της, ενώ οι χημικά τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες όπως η HP β- CD και η SBE-β-CD συχνά παράγουν ευδιάλυτα σύμπλοκα και έτσι δίνουν συστήματα τύπου Α. 62

63 Σχήμα Θεωρητικό διάγραμμα διαλυτότητας φάσης. Στην περίπτωση σχηματισμού συμπλόκου 1:1, χρησιμοποιείται η ακόλουθη σχέση για τον προσδιορισμό της σταθεράς συμπλοκοποίησης Κ, από την κλίση (slope) του γραμμικού τμήματος της καμπύλης του διαγράμματος διαλυτότητας φάσης Όπου So η διαλυτότητα του φαρμάκου απουσία κυκλοδεξτρίνης κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες. Για τα περισσότερα σύμπλοκα βιοδραστικών ενώσεων/κυκλοδεξτρίνης οι τιμές των σταθερών κυμαίνονται από Μ -1. Έχει βρεθεί ότι ακόμα και για ισχυρά δεσμευμένες στις κυκλοδεξτρίνες βιοδραστικές ενώσεις, μια αραίωση 1:100 μειώνει το ποσοστό της συμπλοκοποιημένης βιοδραστικής ένωσης από 100 σε 30 %, απελευθερώνοντας μόρια βιοδραστικής ένωσης τα οποία μπορούν να διαπεράσουν τις βιολογικές μεμβράνες. Αραίωση 1:100 μπορεί να επιτευχθεί σε μια έγχυση ή σε αραίωση στο στομάχι ή το εντερικό περιεχόμενο. Η αραίωση δεν προκαλεί καθίζηση της βιοδραστικής ένωσης, όταν η σχέση μεταξύ διαλυτότητας της βιοδραστικής ένωσης και συγκέντρωσης κυκλοδεξτρίνης είναι γραμμική. Από την άλλη πλευρά στην περίπτωση μη γραμμικής σχέσης η αραίωση μπορεί να οδηγήσει σε καθίζηση της βιοδραστικής ένωσης. Έτσι η επίδραση της αραίωσης θα πρέπει να μελετάται πριν την κλινική χρήση των προϊόντων που περιέχουν σύμπλοκα βιοδραστικών ενώσεων με κυκλοδεξτρίνες. 63

64 Παράγοντες που επηρεάζουν το σχηματισμό των ενώσεων έγκλεισης. Ο τύπος της κυκλοδεξτρίνης μπορεί να επηρεάσει τόσο το σχηματισμό του συμπλόκου βιοδραστικής ένωσης-κυκλοδεξτρίνης όσο και την εμφάνιση αυτού. Για το σχηματισμό συμπλόκου με κάποιο μόριο, η κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης πρέπει να έχει το κατάλληλο μέγεθος, ώστε να επιτρέψει την τοποθέτηση και τον κατάλληλο προσανατολισμό του μορίου εντός της κοιλότητας. Για παράδειγμα η κοιλότητα της β-cd έχει μεγαλύτερη διάμετρο από αυτήν της α-cd με αποτέλεσμα να μπορεί να εγκλωβίζει μόρια μεγαλύτερου μεγέθους σε σχέση με την α-cd. Συγκρινόμενες με τις κυκλοδεξτρίνες που είναι ουδέτερες, η συμπλοκοποίηση μπορεί να είναι αποτελεσματικότερη, όταν η κυκλοδεξτρίνη είναι φορτισμένη και μάλιστα, όταν έχει αντίθετο φορτίο από αυτό του μορίου με το οποίο σχηματίζει σύμπλοκο. Από την άλλη πλευρά, όταν φέρουν το ίδιο φορτίο η αποτελεσματικότητα της συμπλοκοποίησης μειώνεται (Σχήμα 1.25). Σχήμα Επίδραση ph στο σχηματισμό συμπλόκου (1 - CF, 2 - TF, 3 - TB) Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα επίδρασης του ph στο σχηματισμό των συμπλόκων αποτελεί η περίπτωση σχηματισμού συμπλόκου μεταξύ ξανθινών (καφεϊνη, ξανθίνη, θεοφυλλίνη) με τις β-cd ή HP-β-CD. Με τη χρήση της φθορισμομετρικής μεθόδου βρέθηκε ότι το βέλτιστο ph για το σχηματισμό συμπλόκου το οποίο αντιστοιχεί στην ένταση του μήκους κύματος εκπομπής, είναι για την καφεϊνη 7-12, για τη θεοφυλλίνη 7,5-9 και για τη θεοβρωμίνη 10,5-12 (Σχήμα 1.25). Είναι φανερό ότι το ουδέτερο και αλκαλικό ph είναι κατάλληλα για τον εγκλεισμό της καφεϊνης, το αλκαλικό για τον εγκλεισμό της θεοφυλλίνης και το ισχυρό αλκαλικό της θεοβρωμίνης. Δηλαδή τόσο η ουδέτερη μορφή όσο και το ανιόν 64

65 του μορίου της καφεϊνης εισέρχονται στην κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης, ενώ στην περίπτωση της θεοβρωμίνης η ανιονική μορφή της εισέρχεται ευκολότερα, καθώς σε ισχυρά αλκαλικό ph οι ξανθίνες βρίσκονται υπό την ανιονική μορφή τους. Ένα άλλο χαρακτηριστικό παράδειγμα επίδρασης του ph αποτελεί ο σχηματισμός συμπλόκου μεταξύ του φαρμάκου DY-9760e και της HP-β-CD ή της SBE-β-CD. Η σταθερά συμπλοκοποίησης αυξάνεται στην περίπτωση της HP-β-CD με την αύξηση του ph, καθώς αυξάνεται το ποσοστό της μη ιονισμένης μορφής του φαρμάκου, αντίθετα στην περίπτωση της SBE-β-CD αυξάνεται με τη μείωση του ph γιατί αυξάνεται το ποσοστό του ιονισμένου φαρμάκου. Έτσι, εκτός από τις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις μεταξύ του βενζολικού δακτυλίου και της κοιλότητας της κυκλοδεξτρίνης, στο σχηματισμό του συμπλόκου λαμβάνουν χώρα ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ του θετικά φορτισμένου δακτυλίου της πιπεραζίνης και της αρνητικά φορτισμένης σουλφοβουτυλ- υπομονάδας της SBE-β- CD. Οι αλλαγές στη θερμοκρασία μπορούν επίσης να επηρεάσουν τη συμπλοκοποίηση. Στις περισσότερες περιπτώσεις η αύξηση της θερμοκρασίας μειώνει τη σταθερότητα του συμπλόκου που σχηματίζεται, κάτι το οποίο είναι πιθανόν να οφείλεται στη εξασθένιση των δυνάμεων που αναπτύσσονται μεταξύ φαρμάκου και κυκλοδεξτρίνης όπως είναι οι δυνάμεις Van der Waals και οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μορίων. Σημαντική επίδραση μπορεί να έχουν στην αποτελεσματικότητα της συμπλοκοποίησης και οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για το σχηματισμό του συμπλόκου. Η αποτελεσματικότητα βέβαια της μεθόδου εξαρτάται σημαντικά από τη φύση της βιοδραστικής ένωσης και του μορίου της κυκλοδεξτρίνης. Συχνά η λυοφιλοποίηση και η εξάτμιση του διαλύτη αποτελούν τις αποτελεσματικότερες μεθόδους για το σχηματισμό των συμπλόκων. Εντουτοις η μέθοδος σχηματισμού του συμπλόκου δεν έχει καμία επίδραση για παράδειγμα στη διαλυτοποίηση του συμπλόκου τολβουταμίδης - β-cd. Η προσθήκη μικρών ποσοτήτων υδατοδιαλυτών πολυμερών ή φορτισμένων μορίων αυξάνει τη διαλυτοποιητική δράση των κυκλοδεξτρινών, αυξάνοντας τη σταθερά συμπλοκοποίησης. Έχει βρεθεί ότι υδατοδιαλυτά πολυμερή σε χαμηλές συγκεντρώσεις αυξάνουν την ικανότητα της κυκλοδεξτρίνης για σχηματισμό συμπλόκου με αποτέλεσμα την αύξηση της διαθεσιμότητας της βιοδραστικής ένωσης σε υδατικό διάλυμα κυκλοδεξτρίνης. Η παρουσία του πολυμερούς είναι 65

66 χαρακτηριστικό ότι μειώνει την κινητικότητα των μορίων της κυκλοδεξτρίνης και αυξάνει τη διαλυτότητα των συμπλόκων που σχηματίζονται. Ωστόσο υπάρχουν περιπτώσεις στις οποίες διάφορα αντιδραστήρια που προστίθενται στο διάλυμα συμπλοκοποίησης ανταγωνίζονται με την κυκλοδεξτρίνη για τον εγκλεισμό τους εντός της κοιλότητάς τους με τελικό αποτέλεσμα τη μείωση της φαινομενικής σταθεράς συμπλοκοποίησης Μέθοδοι ανάλυσης και χαρακτηρισμού συμπλόκων κυκλοδεξτρίνης Συνήθως δεν είναι ασφαλές να θεωρήσουμε ότι η μικροκρυσταλλική κόνις που προκύπτει από την ανάμειξη μιας κυκλοδεξτρίνης και μιας πιθανά εγκλωβιζόμενης ουσίας σε ένα διάλυμα ή σε εναιώρημα ή πάστα, είναι πραγματικό ομογενές σύμπλοκο έγκλεισης. Εκ των πραγμάτων πολλές ουσίες δεν μπορούν να συμπλοκοποιηθούν, άλλες ενώ σχηματίζουν πραγματικά σύμπλοκα έγκλεισης σε υδατικά διαλύματα δεν σχηματίζουν σύμπλοκα έγκλεισης σε στερεή κατάσταση και το απομονωμένο στερεό παράσκευασμα σε πολλές περιπτώσεις είναι μόνο ένα καλά διεσπαρμένο μίγμα κυκλοδεξτρίνης και της προς εγκλωβισμό ουσίας. Για να πιστοποιήσουμε τον σχηματισμό του συμπλόκου, η αλληλεπίδραση ενός εγκλωβιζόμενου μορίου με την κυκλοδεξτρίνη μπορεί να μελετηθεί με μια σειρά μεθόδων. Ο εγκλωβισμός του μορίου της ουσίας στο μόριο της κυκλοδεξτρίνης συνήθως οδηγεί σε μερική ή ολική αλλαγή των φυσικοχημικών ιδιοτήτων της εγκλωβισμένης ουσίας. Η καταγραφή των αλλαγών μας επιτρέπει να ανιχνέυσουμε τον σχηματισμό του συμπλόκου [Szente (1996)].Οι αναλυτικές τεχνικές που είναι κατάλληλες για την πιστοποίηση της συμπλοκοποίησης εξαρτώνται από την φύση του εγκλωβιζόμενου μορίου και θα πρέπει να βελτιστοποιούνται για κάθε μόριο ξεχωριστά. Παρακάτω θα αναφερθούν οι μερικές μέθοδοι ανάλυσης των συμπλόκων των κυκλοδεξτρινών Περίθλαση ακτίνων Χ (X-Ray diffraction) Η μέθοδος της περίθλασης ακτίνων Χ είναι μια απλή και χρήσιμη τεχνική για τον προσδιορισμό των συμπλόκων έγκλεισης των κυκλοδεξτρινών σε κόνη και 66

67 κρυσταλλική κατάσταση. Το φάσμα περίθλασης ενός συμπλόκου έγκλεισης διαφέρει σε αντιπαραβολή με τα φάσματα κάθε συστατικού του αν έχει δημιουργηθεί ένα πραγματικό σύμπλοκο. Πιθανή εξαφάνιση ή τροποποίηση των χαρακτηριστικών κορυφών των συστατικών του συμπλόκου στο φάσμα περίθλασης του πιθανολογούμενου συμπλόκου καθώς και εμφάνιση νέων κορυφών έχει ως αποτέλεσμα της διαδικασίας της συμπλοκοποίησης αποτελούν ισχυρές ενδείξεις για την παρασκευή των συμπλόκων έγκλεισης. Στην περίπτωση που το εγκλωβιζόμενο μόριο είναι σε υγρή κατάσταση τότε η μέθοδος της περίθλασης ακτίνων Χ αποτελεί την περισσότερο χρήσιμη εκ των τεχνικών ανάλυσης για την ανίχνευση της δημιουργίας ενός συμπλόκου έγκλεισης. Η απουσία κρυσταλλικότητας στο φάσμα περίθλασης ακτίνων Χ ενός υγρού συστατικού οδηγεί στην διαπίστωση της δημιουργίας νέου κρυσταλλικού πλέγματος πολύ απλά εάν το φάσμα του πιθανού συμπλόκου διαφέρει από αυτό της μη συμπλοκοποιημένης κυκλοδεξτρίνης. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα απεικονίζεται στο σχήμα (1.26) όπου παρατίθενται τα φάσματα περίθλασης ακτίνων Χ το συμπλόκου της α-κυκλοδεξτρίνης και της υδροξυπρόπυλ-α-κυκλοδεξτρίνης με την ουσία νικαρπιδίνη καθώς και τα φάσματα των ουσιών ξεχωριστά, όπου είναι προφανής ο σχηματισμός ενός νέου τύπου δομής. Σχήμα (1.26) Φάσματα περίθλασης ακτίνων Χ του συμπλόκου της α-κυκλοδεξτρίνης με την ουσία νικαρπιδίνη, του συμπλόκου υδροξυπρόπυλ-α-κυκλοδεξτρίνης καθώς και των ουσιών ξεχωριστά. Η παραπάνω μέθοδος είναι πολύ χρήσιμη για την ανάλυση μεγάλου αριθμού συμπλόκων καθώς και για τον προσδιορισμό της κρυσταλλικής και μοριακής δομής συμπλόκων με κυκλοδεξτρίνες. 67

68 Θερμική ανάλυση Η θερμική ανάλυση των συμπλόκων κυκλοδεξτρίνης αρχικά χρησιμοποιήθηκε για τη διάκριση των συμπλόκων έγκλεισης από προσροφημένα παράγωγα και στη συνέχεια για τον χαρακτηρισμό της ιδιαίτερης θερμικής συμπεριφοράς εξαιτίας του μοριακού εγκλωβισμού πάνω σε καθορισμένη θερμική διαδικασία. Μόνο σύμπλοκα στα οποία η εγκλωβισμένη ουσία έχει σημείο τήξης ή βρασμού κάτω από τη θερμοκρασία της θερμικής αποικοδόμησης των κυκλοδεξτρινών ή όταν είναι πτητική στην περιοχή θερμοκρασιών ⁰C μπορούν να μελετηθούν με μεθόδους θερμικής ανάλυσης. Οι περισσότερο χρησιμοποιούμενη αναλυτική τεχνική είναι η διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (DSC). Τα θερμογραφήματα των στερεών κυκλοδεξτρινών έδειξαν ότι τα περισσότερα μόρια ύδατος απελευθερώνονται στις φυσικές κυκλοδεξτρίνες σε θερμοκρασίες μικρότερες από 100 ⁰C. Στην περίπτωση των α- και γ- κυκλοδεξτρινών βρέθηκαν και ισχυρά συνδεδεμένα, εγκλωβισμένα μόρια ύδατος που απελευθερώνονται στους ⁰C. Η θερμοκρασία της αποικοδόμησης των δακτυλίων της κυκλοδεξτρίνης ήταν μικρότερη στην περίπτωση της β- κυκλοδεξτρίνης εξαιτίας του λιγότερου συμμετρικού δακτυλίου από τις υπόλοιπες φυσικές κυκλοδεξτρίνες, αλλά ο ρυθμός είναι ίδιος. Οι τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες εμφανίζουν σαφώς μικρότερο περιεχόμενο ύδατος και η θερμική τους αποικοδόμηση εμφανίζεται σε μεγαλύτερες θερμοκρασίες. Η περισσότερο χρησιμοποιούμενη εκ των μεθόδων της θερμικής ανάλυσης για την ανάλυση συμπλόκων κυκλοδεξτρίνης είναι η τεχνική της διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης (DSC) [Acarturk και συνεργάτες (1993), Meier και συνεργάτες (2001), Perdomo-Lopez και συνεργάτες (2002), Mura και συνεργάτες (2002) και Lu και συνεργάτες (1999)]. Η θερμική ανάλυση εφαρμόζεται κυρίως για να απεικονίσει την διαφορετική συμπεριφορά ενός συμπλόκου έγκλεισης σε σχέση με ένα φυσικό μείγμα των συστατικών του. Αυτό συμβαίνει και στην περίπτωση της τεχνικής της DSC, όπου η εμφάνιση της ισχυρής ενδόθερμης κορυφής που αντιστοιχεί στο σημείο τήξης της βιοδραστικής ουσίας στο θερμογράφημα ενός φυσικού μίγματος κυκλοδεξτρίνης και βιοδραστικής ουσίας και η παράλληλη εξαφάνισή της στο θερμογράφημα του συμπλόκου αποτελεί μια απλή ταυτοποίηση του σχηματισμού συμπλόκου έγκλεισης [Szente (1996)]. 68

69 Ηλεκτρονική μικροσκοπία Η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM) έχει αναφερθεί στη μελέτη των συμπλόκων έγκλεισης των κυκλοδεξτρινών [Ficarra και συνεργάτες (2000), Veiga και συνεργάτες (1998) και Jansen και συνεργάτες (1990)], όπου καταγράφονται οι ιδιότητες της στερεής κατάστασης με ιδιαίτερη έμφαση στην μορφολογία των παραγόμενων συμπλόκων των κυκλοδεξτρινών με βιοδραστικές ουσίες Παράγωγα Διυδροεπιανδροστερόνης (DHEA) Ο θάνατος των νευρωνικών κυττάρων από απόπτωση είναι το «τελικό σημείο» πολλών ανθρώπινων νευρολογικών διαταραχών, όπως η νόσος του Alzheimer, η νόσος του Πάρκινσον, οι ασθένειες του Huntington, το εγκεφαλικά επεισόδια / τραύματα και την σκλήρυνση κατά πλάκας. Ο αποπτωτικός θάνατος των νευρώνων του ιππόκαμπου και των νευρώνων του φλοιού είναι υπεύθυνος για τα συμπτώματα της νόσου του Alzheimer,ενώ ο θάνατος των νευρώνων του μεσεγκεφάλου που χρησιμοποιούν το νευροδιαβιβαστή ντοπαμίνη υποδεικνύει τη νόσο του Πάρκινσον. Η νόσος του Huntington περιλαμβάνει το θάνατο των νευρώνων στο ραβδωτό σώμα, οι οποίοι ελέγχουν τις κινήσεις του σώματος, και ο θάνατος των κατώτερων κινητικών νευρώνων εκδηλώνεται ως πλάγια αμυοτροφική σκλήρυνση. Επιπροσθέτως, τα εγκεφαλικά επεισόδια και τραύματα επάγουν νέκρωση μιας μικρής περιοχής του εγκεφάλου, η οποία στη συνέχεια προκαλεί απώλεια νευρωνικών κυττάρων με απόπτωση σε μια μεγαλύτερη περιοχή του εγκεφάλου, λόγω του νευροτοξικού υλικού που απελευθερώνεται από τα νεκρά κύτταρα. Αποπτωτική απώλεια νευρωνικών κυττάρων είναι επίσης παρατηρείται κατά τη γήρανση του εγκεφάλου, η οποία είναι μια φυσιολογική διαδικασία. Σήμερα, υπάρχει περιορισμένη ή καθόλου θεραπεία για τις περισσότερες νευροεκφυλιστικές ασθένειες. Στην καλύτερη περίπτωση, είναι διαθέσιμες θεραπείες έχουν συμπτωματικό χαρακτήρα και δεν αποτρέπουν ή επιβραδύνουν την εξέλιξη της νόσου. Μια θεμελιώδης προσέγγιση για τη μείωση της επιβάρυνσης των νευροεκφυλιστικών ασθενειών είναι να επιβραδύνει ή να σταματήσει την εξέλιξη και, τελικά, να αποτρέψει την εκδήλωση της νόσου. Έτσι, οι στρατηγικές για τη νευροπροστασία, 69

70 την πρόληψη αποπτωτικής απώλειας νευρωνικών κυττάρων μπορεί να προσφέρει νέες θεραπευτικές παρεμβάσεις Ιδιότητες της Διυδροεπιανδροστερόνης ως νευροστεροειδές Νευροστεροειδή συντίθενται στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα, ιδιαίτερα σε μυελινωτικά νευρογλοιακά κύτταρα αλλά επίσης σε αστροκύτταρα και νευρώνες. Νευροενεργά στεροειδή, τα οποία ενεργούν στο νευρικό σύστημα, επηρεάζουν νευρωνική λειτουργία και διαφοροποίηση και προσφέρουν νευροπροστασία κατά της ισχαιμίας και των εγκεφαλικών επεισοδίων. Νευροπροστατευτικά αποτελέσματα περιλαμβάνουν την ανάκτηση της κινητικής λειτουργίας μετά από τραυματισμό της σπονδυλικής στήλης, ρύθμιση της μυελίνωσης, τον πολλαπλασιασμό των νευρωνικών βλαστοκυττάρων, νευρογένεση στον ιππόκαμπο, και πρόκλησης αναλγησίας. Η Διυδροεπιανδροστερόνη (DHEA) (σχήμα 1.27) και ο θειικός εστέρας της (DHEAS) παράγονται στον εγκέφαλο καθώς και τα επινεφρίδια, με την DHEA του εγκεφάλου να ενεργεί τοπικά με ένα παρακρινή τρόπο και την DHEA των επινεφριδίων να έχει συστημικό ρόλο. Η DHEA είναι ένα από τα πιο ισχυρά νευροενεργά στεροειδή και η απότομη μείωση τόσο της DHEA του εγκεφάλου όσο και της DHEA στο αίμα που έρχεται με την μεγάλη ηλικία έχει συνδεθεί με τη δυσλειτουργία και την εκφύλιση των νευρώνων. Πλέον υποστηρίζεται πειραματικά ότι η DHEA προστατεύει τους νευρώνες από ανοξία, ότι αυξάνει παροδικά τα επίπεδα mrna του αυξητικού παράγοντα των νευρώνων (NGF), ότι εμφανίζει νευροπροστατευτικές ιδιότητες σε διάφορες προσβολές του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ), και ότι επάγει προστατευτικό αποτέλεσμα ενάντια των τραυματισμών της σπονδυλικής στήλης. Σχήμα 1.27 Το μόριο της Διυδροεπιανδροστερόνης και της Αλλοπρεγνανολόνης. 70

71 Πρόσφατες μελέτες που διερεύνησαν τη φυσιοπαθολογική σημασία των νευροστεροειδών στη νόσο του Alzheimer (AD) έχουν δείξει μια σημαντική μείωση της συγκέντρωσης του νευροστεροειδούς σε μεμονωμένες περιοχές του εγκεφάλου των ασθενών με AD σε σύγκριση με αντίστοιχης ηλικίας ασθενών χωρίς άνοια. Επιπλέον, ένας σημαντικός αρνητικός συσχετισμός βρέθηκε μεταξύ των επιπέδων των φωσφορυλιωμένων Τ πρωτεϊνών και της DHEAS στον υποθάλαμο. Αυτές οι μελέτες δείχνουν έντονα ένα πιθανό νευροπροστατευτικό ρόλο για τα ενδογενή νευροστεροειδή στην AD. Είναι επίσης ενδιαφέρον το γεγονός ότι η DHEA είναι σε θέση να ενισχύσει την κινητική δραστηριότητα σε ημι - παρκινσονικούς πιθήκους, ανακουφίζοντας τα συμπτώμάτα της δυσλειτουργίας στα μέτρια και σοβαρά προσβεβλημένα ζώα στα οποία χορηγήθηκε ΜΡΤΡ. Επιπλέον, η DHEA επηρεάζει το κατεχολαμινεργικό σύστημα, ενεργοποιώντας την έκφραση της υδροξυλάσης της τυροσίνης και, επομένως, την αύξηση των κατεχολαμινών σε de novo σύνθεση και την αποδέσμευση. Το ενήλικο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) είναι κλασικά γνωστό ως μια δομή με πολύ περιορισμένη ικανότητα αναγέννησης. Ωστόσο, αρκετές παθολογικές καταστάσεις, π.χ., ισχαιμία, επιληψία και τυχόν τραύματα, έχουν δειχθεί ότι απορρυθμίζουν τη δραστηριότητα των νευρωνικών βλαστοκυττάρων στην υποκοιλιακή ζώνη. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι τα σήματα είναι παρόντα παντού στον ενήλικο εγκέφαλο, τα οποία επιτρέπουν περιορισμένη νευρωνική αναγέννηση. Αυτή η θεμελιώδης παρατήρηση αλλάζει την άποψή που γενικά υπάρχει σχετικά με τον νευροεκφυλισμό και την αναγεννητική ικανότητα του εγκεφάλου, παρέχοντας τη δυνατότητα αναγέννησης συγκεκριμένων περιοχών του εγκεφάλου. Η DHEA και το νευροστεροειδές αλλοπρεγνανολόνη (Σχήμα 1.27) έχουν πρόσφατα αποδειχθεί ότι επάγουν νευρογένεση σε διάφορα πειραματικά μοντέλα Παράγωγα Διυδροεπιανδροστερόνης Εχουν συντεθεί τα παράγωγα Α, B, και C τα οποία έχουν τα ακόλουθα μοριακά βάρη: (α) A = 333,24 (β) B = 332,24 (γ) C =

72 Είναι εξαιρετικά λιπόφιλα μόρια με την λιποφιλικότητα να αυξάνει ως εξής: Log (C) > Log (B) > Log (A) Η υδατική τους διαλυτότητα χαρακτηρίζεται ως ελάχιστη Σκοπός εργασίας Σκοπός αυτής της εργασίας ήταν η σύνθεση συμβατικών αλλά και άλλων λιποσωμικών διασπορών, οι οποίες θα περιέχουν τα παράγωγα της διυδροεπιανδροστερόνης και η μελέτη των φυσικοχημικών τους χαρακτηριστικών, ώστε να χρησιμοποιηθούν για in vivo πειράματα ενδοφλέβιας και ενδοϋαλωδικής χορήγησης. Έναυσμα για την χρήση αυτών των χημικών ουσιών αποτέλεσε η ομοιότητα των παραγώγων αυτών με το μόριο της χοληστερόλης, το οποίο έχει ήδη χρησιμοποιηθεί στην παρασκευή λιποσωμικών μορφών. Θεωρητικά η ομοιότητα αυτή στη δομή θα παρείχε και όμοιες αποδόσεις στην ικανότητα ενσωμάτωσης. Πρωταρχικός στόχος ήταν η παρασκευή και η μελέτη των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών συμβατικών λιποσωμάτων, διάφορων λιπιδικών συστάσεων, στα τοιχώματα των οποίων θα ενσωματώνονταν τα παράγωγα της DHEA. Παρασκευάστηκαν με επιτυχία οι περισσότερες λιπιδικές συστάσεις που δοκιμάστηκαν, χωρίς όμως τα αποτελέσματα που αναμένονταν, όσον αφορά την ικανότητα ενσωμάτωσης των παραγώγων σε λιποσωμικές μεμβράνες.. Στην συνέχεια μελετήθηκε η διαλυτότητα του παραγώγου A στο νερό και η συμπλοκοποίησή του με κυκλοδεξτρίνες, όπου χαρακτηρίστηκαν και αναλύθηκαν τα σύμπλοκα με διάφορες τεχνικές. Απώτερος σκοπός αυτής της εργασίας αποτέλεσε η παρασκευή υβριδικών λιποσωμικών διασπορών (drug in cyclodextrins in liposomes) με υψηλή δυνατότητα εγκλωβισμού του παραγώγου Α μέσω των κυκλοδεξτρινών. Οι διασπορές αυτές μελετήθηκαν ως προς τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά τους. 72

73 2. Πειραματικό μέρος 73

74 2.1 Συσκευές και όργανα Ακίδα Υπερήχων (Probe Sonicator, Sonics Vibra Cell) Ηλεκτρονικός ζυγός ακριβείας (Mettler AE 166, Deltarange) Λουτρό Υπερήχων (Branson, Bransonic ultrasonic 2510) Μαγνητικός αναδευτήρας (IKAMAG RH JANKE &KUNKEL) Μηχανικός αναδευτήρας - vortex (A-100 Micrel) Περιστρεφόμενος Eξατμιστήρας - Rotary Evaporator (BÜCHI RE 111) ph-μετρο (WTW, ph 522) Συσκευή λυοφιλοποίησης (FREEZE DRYER LABCONCO 4.5) Συσκευή εξώθησης μέσω φίλτρων (Extruder) Yδατόλουτρο ρυθμιζόμενης θερμοκρασίας (JULABO, FS 18) Φασματοφωτόμετρο - Spectrophotometer UV-VIS (Shimadzu UV 1205) Υπερφυγόκεντρος (Τhermo Scientific WX Ultra 100 Centrifuge) Φυγόκεντρος (Biofuge 28 RS, HERAEUS SEPATECH) Ωσμόμετρο (Roembling auto cal type 13 DR automatic) Zeta-sizer δυναμική σκέδαση φωτός (Malvern Nano-Zs, Malvern Instrument, UK) 2.2 Υλικά Λιπίδια σε μορφή σκόνης: Φωσφατιδυλοχολίνη (Egg PC): (Lipoid) Υδρογονοποιημένη Φωσφατιδυλοχολίνη (L-α-phosphatidylcholine, hydrogenated hpc) (Avanti Polar Lipids) Διστεαροϋλογλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη(1,2-distearoyl-sn-glycerol-3- phosphatidylcholine - DSPC) (Avanti Polar Lipids) Διπαλμιτοϋλογλυκεροφωσφοχολίνη(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphocholine DPPC) (Avanti Polar Lipids) Διπαλμιτοϋλογλυκεροφωσφογλυκερόλη [1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-racglycerol) - DPPG] 74

75 Διαλύματα αυτών των λιπιδίων προετοιμάστηκαν με διάλυσή τους σε χλωροφόρμιο:μεθανόλη 2/1 κατ όγκο στις ανάλογες τελικές συγκεντρώσεις. Τα διαλύματα όσο και οι κόνεις των λιπιδίων φυλάσσονται στην κατάψυξη στους -20 ο C Διαλύματα - Ισότονο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) ph 7.4 Ζυγίζονται 16g NaCl, 0,4g KCl, 2.88g Na 2 HPO 4, 0,48g KH 2 PO 4 και 0,4g NaN 3 και μεταφέρονται σε 2L απεσταγμένο νερό. Στην συνέχεια ρυθμίζεται το ph σε 7.4 με στάγδην προσθήκη NaOH ή HCl και συμπληρώνουμε με απεσταγμένο νερό έως τα 2 L. Τέλος ρυθμίζουμε την ωσμωτικότητα. Το PBS που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή και τον καθαρισμό των λιποσωμάτων δεν περιείχε νατραζίδιο (NaN 3 ) Καθαρισμός λιποσωμάτων Ο καθαρισμός των λιποσωμάτων που περιέχει παράγωγα DHEA ή σύμπλοκα παραγώγου/κυκλοδεξτρίνης έγινε με χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού σε στήλη Sephadex G-50 διαστάσεων 40x1cm. Η έκλουση γινόταν με PBS Για τη συμπύκνωση των λιποσωμικών δειγματων Χρησιμοποιήθηκαν οι εξής τεχνικές: Υπερδιήθηση με σωλήνες υπερδιήθησης Amicon Ultra 15 της εταιρίας Millipore Η τεχνική της υπερφυγόκεντρησης. (κύκλοι σε 30000rpm για 30 λεπτά) με την υπερφυγόκεντρο της σειράς WX Ultra 100 Centrifuge της εταιρίας Τhermo Scientific. Έγινε διαπίδυση έναντι πολυαιθυλενογλυκόλης με ΜΒ μεγαλύτερο από 4000 (σε στερεή μορφή πελλέτας). Το δείγμα τοποθετείται σε μεμβράνη διαπίδυσης (με ΜΒ αποκλεισμού dalton) και καλύπτεται με πελλέτες PEG που απορροφούν το νερό που εξέρχεται από τη μεμβράνη λόγω διαφοράς πυκνότητας. 75

76 2.2.5 Αντιδραστήρια 1. Kit μέτρησης χοληστερόλης με την ενζυματική μέθοδο PAP που περιγράφεται παρακάτω (Biosys). 2. Μέτρηση λιπιδίου με τη μέθοδο Stewart. To αντιδραστήριο Stewart, παρασκευάζεται με διάλυση: g FeCl 3 6 H 2 O (Iron (III) chloride hexahydrate) της Merck και 30.4 g NH 4 SCN (Ammonium thiocyanate) (Merck) σε 1 L απεσταγμένο νερό Το διάλυμα είναι σταθερό σε θερμοκρασία δωματίου για αρκετούς μήνες. Πρέπει να φυλάσσεται σε σκιερό μέρος Λιπιδικές συστάσεις Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικοί τύποι λιποσωμάτων, διαφορετικών συστάσεων (Πίνακας 2.1), τα οποία εξετάστηκαν ως προς την ικανότητά τους να ενσωματώνουν A, B, C. Πίνακας 2.1: Λιποσωμικές συστάσεις που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία Σύσταση Λιποσώματος Μοριακή Αναλογία Τύπος Λιποσώματος PC/Α PC/DPPG(10%)/Α hpc/α hpc/dppg(10%)/α DPPC/Α DPPC/DPPG(10%)/Α PC/C hpc/c hpc/dppg(10%)/c PC/B hpc/c 2:1 SUV 76

77 PC/HP-b-CD:A PC/DPPG(10%)/HP-b-CD:A hpc/dppg(10%)/hp-b-cd:a PC/DPPG(10%)/HP-b-CD:A DSPC/DPPG(10%)/HP-b-CD:A Extruded DRV Sonicated DRV 2.3 Μέθοδοι Προσδιορισμός λιπιδίου - Μέθοδος Stewart H μέθοδοs Stewart χρησιμοποιείται προκειμένου να προσδιοριστεί η ακριβής συγκέντρωση του λιπιδίου στα λιποσωμικά δείγματα. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην ικανότητα των φωσφολιπιδίων να σχηματίζουν σύμπλοκο με το σιδηροθειοκυανιούχο αμμώνιο σε οργανικό διάλυμα. Το πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι η παρουσία ανόργανου φωσφόρου δεν παρεμποδίζει την ανάλυση. Η συσχέτιση των τιμών απορρόφησης με τα μg του φωσφολιπιδίου γίνεται μέσω σχετικής καμπύλης αναφοράς. Προετοιμασία των πρότυπων διαλυμάτων και των δειγμάτων: Φτιάχνουμε 10 ml διαλύματος φωσφολιπιδίου PC (από δ/μα αρχικής συγκέντρωσης 20mg/mL) σε χλωροφόρμιο σε συγκέντρωση 0.1 mg/ml. Αναλυτική μέθοδος: i. Ετοιμάζουμε τα πρότυπα διαλύματα σε δοκιμαστικούς σωλήνες των 10mL όπως φαίνεται στον Πίνακα 2.2. ii. Στη συνέχεια, ανακινούμε ισχυρά τα δείγματα με vortex επί 1min iii. Αφήνουμε τα δείγματα σε ηρεμία ώστε να διαχωριστούν οι φάσεις (περίπου min) iv. Αφαιρούμε προσεκτικά την υπερκείμενη υδατική φάση με τη βοήθεια αντλίας κενού και μετράμε οπτική απορρόφηση της οργανικής φάσης στα 485nm. 77

78 Πίνακας 2.2: Διαλύματα για πρότυπη καμπύλη Stewart Δείγμα Ποσότητα λιπιδίου (μg) Πρότυπο διάλυμα λιπιδίου (ml) Χλωροφόρμιο (ml) Σιδηροθειοκυανιούχο 0.1 Μ (ml) Μέτρηση οπτικής απορρόφησης: i. Ανοίγουμε το UV/VIS φασματοφωτόμετρο ii. Ρυθμίζουμε το μήκος κύματος στα 485 nm iii. Μηδενίζουμε με χλωροφόρμιο (τυφλό) iv. Μετράμε τα δείγματα ξεκινώντας από το αραιότερο στο πυκνότερο v. Βάσει της καμπύλης αναφοράς που προκύπτει, υπολογίζεται η ποσότητα (μg) και τελικώς η συγκέντρωση του λιπιδίου (mg/ml) στα δείγματα. Με τη διαδικασία που περιγράφηκε παραπάνω υπολογίστηκε η συγκέντρωση του λιπιδίου στα δείγματα πιο αναλυτικά. Σε ποσότητα του λιποσωμικού εναιωρήματος (20μl) προστέθηκαν 2mL CHCl 3 και 2mL αντιδραστηρίου Stewart. Όπου χρειάστηκε, το δείγμα αραιώθηκε κατάλληλα Μέθοδος προσδιορισμού των παραγώγων A,,B, C Για τον προσδιορισμό των παραγώγων DHEA χρησιμοποιήθηκε ένα kit προσδιορισμού χοληστερόλης με τη μέθοδο PAP, το οποίο τροποποιήθηκε κατάλληλα ώστε να κατασκευάσουμε τις πρότυπες καμπύλες προσδιορισμού των τριών παραγώγων. Το kit αυτό βασίζεται στις εξής αντιδράσεις (Allain και συνεργάτες, Richmond και συνεργάτες): 78

79 Εστέρες Χοληστερόλης Εστεράση της χοληστερόλης Χοληστερόλη + Λιπαρό οξύ Χοληστερόλη + Ελεύθερη χοληστερόλη Οξειδάση της Χοληστερόλης Προϊόν + Η 2 Ο 2 Η 2 Ο 2 + Αμινοφαιζόνη + Φαινολικό παράγωγο POD Προϊόν (κόκκινου χρώματος) Το kit αυτό είναι σχεδιασμένο για να μετρά χοληστερόλη σε δείγματα ορού του αίματος ή πλάσματος και η ομοιότητα του μορίου της χοληστερόλης με αυτή των μορίων των παραγώγων μας ώθησε να χρησιμοποιήσουμε αυτό το kit. Τα τρία παράγωγα είναι εξαιρετικά λιπόφιλα μόρια, οπότε χρειάστηκε να βρούμε την κατάλληλη αναλογία οργανικού διαλύτη/υδατικού διαλύματος του kit ώστε να μπορεί να γίνει η αντίδραση και να είναι δυνατή η δημιουργία πρότυπης καμπύλης προσδιορισμού των παραγώγων αυτών, μέσω επαρκών τιμών απορρόφησης. Χρησιμοποιήθηκαν τρείς οργανικοί διαλύτες: αιθανόλη, μεθανόλη και ισοπροπανόλη σε διάφορες αναλογίες με νερό. Υψηλή ποσότητα οργανικών διαλυτών κατέστρεφε τα ένζυμα με αποτέλεσμα τη μη πραγματοποίηση της αντίδρασης. Μεγάλη ποσότητα υδατικού διαλύματος του kit καθιστούσε το τελικό διάλυμα θολερό και ακατάλληλο για αποδεκτές μετρήσεις απορρόφησης. Τελικά καταλήξαμε σε συνδυασμό αιθανόλης/υδατικού διαλύματος του kit σε αναλογία 1/4 για τα Α και B και 1/5 για το C. - Πρότυπη καμπύλη προσδιορισμού συγκέντρωσης παραγώγου Α Παρασκευάζουμε πρότυπο αιθανολικό διάλυμα Α συγκέντρωσης 500 ppm και από αυτό φτιάχνουμε με αραίωση πέντε καινούρια διαλύματα Α συγκέντρωσης 3,125 ppm, 6,25 ppm, 12,5 ppm, 25 ppm και 50 ppm με τελικό όγκο 5 ml στο καθένα. Αναλυτική μέθοδος: i. Από τα διαλύματα αυτά μεταφέρουμε 250 μl σε δοκιμαστικούς σωλήνες των 5 ml και προσθέτουμε 1 ml του αντιδραστηρίου του kit. ii. Στη συνέχεια, ανακινούμε ισχυρά τα δείγματα με vortex επί 10 δευτερόλεπτα. 79

80 iii. Ακολουθεί επώαση για 15 λεπτά στους 37 C ώστε να γίνει η αντίδραση που θα μας δώσει το προϊόν ερυθρού χρώματος. iv. Μετρούμε οπτική απορρόφηση του διαλύματος στα 510 nm (σχήμα 2.1) Μέτρηση οπτικής απορρόφησης: i. Ανοίγουμε το UV/VIS φασματοφωτόμετρο ii. Ρυθμίζουμε το μήκος κύματος στα 510 nm iii. Μηδενίζουμε με διάλυμα 250 μl αιθανόλης και 1 ml αντιδραστηρίου (τυφλό) iv. Μετρούμε τα δείγματα ξεκινώντας από το αραιότερο στο πυκνότερο v. Βάσει της καμπύλης αναφοράς που προκύπτει, υπολογίζεται η ποσότητα (μg) και τελικώς η συγκέντρωση (μg/ml) του Α στα δείγματα. Πίνακας 2.3: Πρότυπα διαλύματα για την κατασκευή πρότυπης καμπύλης προσδιορισμού συγκέντρωσης του παραγώγου Α. Πρότυπο διάλυμα Συγκέντρωση πρότυπου διαλύματος Α (ppm) Απορρόφηση (510 nm) 1 3,125 0, , ,5 0, , ,

81 Απορρόφηση στα 510nm 0,140 Πρότυπη Καμπύλη παραγώγου Α 0,120 0,100 0,080 0,060 y = 0,0094x - 0,0035 R² = 0,9935 0,040 0,020 0, m Α\ (μg) Σχήμα 2.1: Πρότυπη καμπύλη αναφοράς του παραγώγου Α. - Πρότυπη καμπύλη προσδιορισμού συγκέντρωσης παραγώγου Β Παρασκευάζουμε πρότυπο αιθανολικό διάλυμα του παραγώγου Β συγκέντρωσης 500 ppm και από αυτό φτιάχνουμε με αραίωση πέντε καινούρια διαλύματα Β συγκέντρωσης 3,125 ppm, 6,25 ppm, 12,5 ppm, 25 ppm και 50 ppm με τελικό όγκο 5 ml στο καθένα. Αναλυτική μέθοδος: i. Από τα διαλύματα αυτά μεταφέρουμε 250 μl σε δοκιμαστικούς σωλήνες των 5 ml και προσθέτουμε 1 ml του αντιδραστηρίου του kit. ii. Στη συνέχεια, ανακινούμε ισχυρά τα δείγματα με vortex επί 10 δευτερόλεπτα. iii. Ακολουθεί επώαση για 15 λεπτά στους 37 C ώστε να γίνει η αντίδραση που θα μας δώσει το προϊόν ερυθρού χρώματος. iv. Μετρούμε οπτική απορρόφηση του διαλύματος στα 510 nm (Σχήμα 2.2) Μέτρηση οπτικής απορρόφησης: i. Ανοίγουμε το UV/VIS φασματοφωτόμετρο 81

82 Απορρόφηση στα 510nm ii. Ρυθμίζουμε το μήκος κύματος στα 510 nm iii. Μηδενίζουμε με διάλυμα 250 μl αιθανόλης και 1 ml αντιδραστηρίου (τυφλό) iv. Μετρούμε τα δείγματα ξεκινώντας από το αραιότερο προς το πυκνότερο v. Βάσει της καμπύλης αναφοράς που προκύπτει, υπολογίζεται η ποσότητα (μg) και τελικώς η συγκέντρωση (μg/ml) του Β στα δείγματα. Πίνακας 2.4: Τιμές συγκέντρωσης και απορρόφησης του παραγώγου Β για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης. Πρότυπο διάλυμα Συγκέντρωση Β (ppm) Απορρόφηση (510 nm) 1 3,125 0, ,25 0, ,5 0, , ,1476 Πρότυπη Καμπύλη παραγώγου Β 0,160 0,140 0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 y = 0,0119x - 0,0004 R² = 0, m B (μg) Σχήμα 2.2: Πρότυπη καμπύλη αναφοράς του παραγώγου Β. 82

83 - Πρότυπη καμπύλη προσδιορισμού συγκέντρωσης του παραγώγου C Παρασκευάζουμε πρότυπο αιθανολικό διάλυμα του παραγώγου C συγκέντρωσης 500 ppm και από αυτό φτιάχνουμε με αραίωση πέντε καινούρια διαλύματα C συγκέντρωσης 18,75 ppm, 37,5 ppm, 75 ppm, 150 ppm και 300 ppm με τελικό όγκο 5 ml στο καθένα. Αναλυτική μέθοδος: i. Από τα διαλύματα αυτά μεταφέρουμε 200 μl σε δοκιμαστικούς σωλήνες των 5 ml και προσθέτουμε 1 ml του αντιδραστηρίου του kit. ii. Στη συνέχεια, ανακινούμε ισχυρά τα δείγματα με vortex επί 10 δευτερόλεπτα. iii. Ακολουθεί επώαση για 15 λεπτά στους 37 C ώστε να γίνει η αντίδραση που θα μας δώσει το προϊόν ερυθρού χρώματος. iv. Μετρούμε οπτική απορρόφηση του διαλύματος στα 510 nm (σχήμα 2.3) Μέτρηση οπτικής απορρόφησης: i. Ανοίγουμε το UV/VIS φασματοφωτόμετρο ii. Ρυθμίζουμε το μήκος κύματος στα 510 nm iii. Μηδενίζουμε με διάλυμα 200 μl αιθανόλης και 1 ml αντιδραστηρίου (τυφλό) iv. Μετρούμε τα δείγματα ξεκινώντας από το αραιότερο στο πυκνότερο v. Βάσει της καμπύλης αναφοράς που προκύπτει, υπολογίζεται η ποσότητα (μg) και τελικώς η συγκέντρωση (μg/ml) του C στα δείγματα. Πίνακας 2.5: Τιμές συγκέντρωσης και απορρόφησης του παραγώγου C για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης. Πρότυπο διαλυμα Συγκέντρωση C (ppm) Απορρόφηση (510nm) 1 18,75 0,005 83

84 Απορρόφηση στα 510nm 2 37,5 0, , , ,0985 Πρότυπη Καμπύλη παραγώγου C 0,1200 0,1000 y = 0,0017x + 0,0003 R² = 0,9982 0,0800 0,0600 0,0400 0,0200 0, m C (μg) Σχήμα 2.3: Πρότυπη καμπύλη αναφοράς του παραγώγου C Μέθοδοι παρασκευής διαλυμάτων συμπλόκων παραγώγου Α/Κυκλοδεξτρίνης Παρασκευάζεται υδατικό διάλυμα κυκλοδεξτρίνης, το οποίο τοποθετείται σε φιαλίδιο με μαγνητική ράβδο. Τοποθετούμε το φιαλίδιο με το διάλυμα σε μαγνητικό αναδευτήρα και θέτουμε το διάλυμα προς ανάδευση. Προσθέτουμε αρκετή ποσότητα του προς διάλυση παραγώγου Α ώστε το διάλυμα να κορεστεί πλήρως. Αφήνουμε το τελικό διάλυμα υπό ανάδευση για 72 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (25⁰C). Μετά το πέρας των 72 ωρών ακολουθεί διήθηση του διαλύματος με φίλτρα των 0,25μm και μέσω της μεθόδου προσδιορισμού του παραγώγου Α προσδιορίζεται η συγκέντρωση του στο διάλυμα. 84

85 2.3.4 Μέθοδοι παρασκευής στερεών συμπλόκων Α/Κυκλοδεξτρίνης Παρασκευάστηκαν στερεά σύμπλοκα με αναλογία παραγώγου Α και κυκλοδεξτρίνης 1:1. Μετά από κάθε μέθοδο παρασκευής επιτεύχθηκε ελάττωση και περισσότερο ομοιόμορφη κατανομή του μεγέθους των σωματιδίων μέσω της λειοτρίβησης. Τα στερεά αυτά σύμπλοκα παρασκευάστηκαν με τις εξής μεθόδους. - Παρασκευή φυσικών μειγμάτων (physical mixtures): Έγινε ανάμιξη στερεών ποσοτήτων κυκλοδεξτρινών και παραγώγου Α μέσα σε ιγδίο σύμφωνα με τη γεωμετρική μέθοδο αραίωσης για την παρασκευή ομογενών φυσικών μειγμάτων. - Παρασκευή λειοτριβημένων συμπλόκων (kneading or paste method): Έγινε ανάμιξη στερεών ποσοτήτων κυκλοδεξτρινών και παραγώγου Α μέσα σε ιγδίο σύμφωνα με τη γεωμετρική μέθοδο αραίωσης. Στη συνέχεια προστέθηκε μικρή ποσότητα αιθανόλης και ακολούθησε συνεχής ανάμιξη. Ακολούθησε λειοτρίβηση για 30 λεπτά μέχρι να δημιουργηθεί λευκή παχύρευστη πάστα. Το παρασκεύασμα αφέθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για μία ώρα ώστε να εξατμιστεί ο οργανικός διαλύτης και να επέλθει ξήρανση της πάστας. - Παρασκευή στερεών συμπλόκων με τη μέθοδο της συγκαταβύθισης ή συνεξάτμισης (co precipitation or co evaporation method): Ίσοι όγκοι διαλύματος παραγώγου Α και διαλύματος κυκλοδεξτρίνης σε μεθανόλη αναμίχθηκαν για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Το διάλυμα τοποθετήθηκε σε περιστρεφόμενο εξατμιστήρα υπό κενό και θερμοκρασία 60 ⁰C μέχρι την πλήρη εξάτμιση των διαλυτών. Με τη μέθοδο αυτή επιτυγχάνουμε την παρασκευή λευκών κρυστάλλων που στη συνέχεια λειοτριβούμε σε ιγδίο μέχρι την απόκτηση λευκής κόνεως ομοιόμορφου μεγέθους σωματιδίων. 85

86 2.4 Μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων Μέθοδος παρασκευής μονοστοιβαδιακών λιποσωμάτων (SUV) Αρχικά παρασκευάζονται πολυστιβαδιακά λιποσώματα (MLV) με την μέθοδο του ενυδάτωσης λεπτού υμενίου (thin film hydration method). Μεταφέρουμε σε σφαιρική φιάλη τα διαλυμένα σε οργανικούς διαλύτες λιπίδια μαζί με ποσότητα της προς ενσωμάτωση λιπόφιλης ουσίας (Α, Β ή C) και τα τοποθετούμε σε περιστρεφόμενο εξατμιστήρα (rotary evaporator), ούτως ώστε να απομακρυθούν οι οργανικοί διαλύτες. Η διαδικασία πραγματοποιείται σε θερμοκρασία πάνω από την θερμοκρασία μετάπτωσης των λιπιδίων. Μετά τον σχηματισμό του λεπτού υμενίου στα τοιχώματα της σφαιρικής φιάλης, η περίσσεια οργανικού διαλύτη απομακρύνεται με την εφαρμογή ρεύματος αζώτου. Ακολουθεί ενυδάτωση του υμενίου με 1 ml διάλυμα PBS και η φιάλη αναδεύεται μηχανικά (vortex) μέχρι το υμένιο να αποκολληθεί από τα τοιχώματα της φιάλης, με την παράλληλη χρήση λουτρών υπερήχων, το οποίο βρίσκεται σε θερμοκρασία μεγαλύτερη από αυτή της θερμοκρασίας μετάπτωσης του λιπιδίου. Στη συνέχεια τα λιποσώματα τοποθετούνται σε ακίδα υπερήχων για την μείωση του μεγέθους τους. Πιο συγκεκριμένα η λιποσωμική διασπορά τοποθετείται σε γυάλινο φιαλίδιο με διάμετρο μεγαλύτερη από αυτήν της ακίδας και η ακίδα βυθίζεται στο φιαλίδιο, ώστε το κατώτερο σημείο της να είναι λίγο πιο πάνω από το κέντρο καμπυλότητας του πυθμένα του φιαλιδίου. Λόγω της υψηλής θερμοκρασίας που δημιουργείται κατά την διαδικασία, το γυάλινο φιαλίδιο βυθίζεται σε ποτήρι ζέσεως με κρύο νερό. Η μείωση και ο σχηματισμός των SUV γίνεται αντιληπτός όταν η θολερή λιποσωμική διασπορά διαυγάσει. Ακολουθείται φυγοκέντρηση των λιποσωμάτων για 15 λεπτά σε στροφές για να απομακρυνθούν μεγάλα λιποσώματα ή ρινίσματα τιτανίου από το υλικό της ακίδας στη λιποσωμική διασπορά. Τα ρινίσματα αυτά αποκολλώνται λόγω της μεγάλης δύναμης τριβής, η οποία αναπτύσσεται ανάμεσα στην ακίδα και τη διασπορά. Στη συνέχεια, τα δείγματα αφήνονται για ομαλοποίηση της επιφάνειάς τους, για μια περίπου ώρα σε θερμοκρασία πάνω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης των λιπιδίων, μια διαδικασία κατά την οποία τακτοποιούν τυχόν ατέλειες της μεμβράνης τους. Η ομαλοποίηση συμβάλλει στην εξισορρόπηση των διαφορών στην πυκνότητα μεταξύ 86

87 των αντίθετων πλευρών της διπλοστοιβάδας (εσωτερικής και εξωτερικής στοιβάδας), μέσω διαμεμβρανικής ανταλλαγής (flip flop). Τέλος ακολουθεί καθαρισμός των λιποσωμάτων από τη μη εγκλωβισμένη ουσία. Για τον σκοπό αυτό εφαρμόστηκε η μέθοδος της χρωματογραφίας μοριακού αποκλεισμού, κατά την οποία χρησιμοποιήθηκε στήλη, η οποία περιέχει γέλη Sephadex G50. Ως εκλούτης χρησιμοποιείται ρυθμιστικό διάλυμα PBS, έτσι ώστε τα λιποσώματα να παραμένουν σταθερά από οσμωτική άποψη Μέθοδος παρασκευής υβριδικών αφυδατωμένων ενυδατωμένων λιποσωμάτων (DRV), που εγκλωβίζουν σύμπλοκα Α/κυκλοδεξτρίνης Τα DRV λιποσώματα παρασκευάζονται χρησιμοποιώντας την ίδια διαδικασία για την παρασκευή των SUV λιποσωμάτων, μόνο που το μέσο ενυδάτωσης που χρησιμοποιείται μετά την δημιουργία του λεπτού υμενίου είναι 1 ml από 10% PBS. Στην συνέχεια, αφού γίνει η ελάττωση του μεγέθους τους με την χρήση της ακίδας υπερήχων και η φυγοκέντρηση της λιποσωμικής διασποράς για την απομάκρυνση των ρινισμάτων τιτανίου, προστίθεται το διάλυμα του συμπλόκου κυκλοδεξτρίνης παραγώγου Α που θα εγκλωβιστεί, το δείγμα παγώνεται με την χρήση υγρού αζώτου και λυοφιλοποιείται over night. Ακολουθεί ανασύσταση και επανανυδάτωση των λιποσωμάτων με την εξής διαδικασία: 1. Προσθήκη 100 λ dh 2 0 (10% του τελικού επιθυμητού όγκου) στη στερεή μάζα που προκύπτει μετά την λυοφιλοποίηση, έντονη μηχανική ανάδευση (vortex) και παραμονή του δείγματος για 30 λεπτά σε κατάσταση ηρεμίας σε θερμοκρασία μεγαλύτερη από τη θερμοκρασία μετάπτωσης του λιπιδίου. 2. Προσθήκη 100 λ dh 2 0 (10% του τελικού επιθυμητού όγκου), έντονη μηχανική ανάδευση (vortex) όπως ακριβώς και στο βήμα 1 και παραμονή του δείγματος για 30 λεπτά σε κατάσταση ηρεμίας σε θερμοκρασία μεγαλύτερη από τη θερμοκρασία μετάπτωσης του λιπιδίου. 3. Προσθήκη 800 λ (80% του τελικού επιθυμητού όγκου) PBS ph 7.4, μηχανική ανάδευση και παραμονή του δείγματος για 30 λεπτά σε κατάσταση ηρεμίας σε θερμοκρασία μεγαλύτερη από τη θερμοκρασία μετάπτωσης του λιπιδίου. 87

88 Κατόπιν, γίνεται μείωση του μεγέθους της λιποσωμικής διασποράς με την τεχνική της εξώθησης μέσω φίλτρων, αρχικά από φίλτρα που έχουν πόρους μεγέθους 400 nm και στη συνέχεια από φίλτρα που φέρουν πόρους των 100 nm (Extruded DRV). Στην περίπτωση των Sonicated DRV λιποσωμάτων, ως μέθοδος μείωσης μεγέθους χρησιμοποιείται η ακίδα υπερήχων. Στη συνέχεια τα λιποσώματα καθαρίζονται από το ελεύθερο σύμπλοκο με χρήση στήλης Sephadex G-50 και το δείγμα που συλλέγεται αποθηκεύεται στο ψυγείο για περαιτέρω χρήση. 0,2 Βαθμονόμηση στήλης Sephadex G-50 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 Λιποσώματα Ελεύθερο σύμπλοκο 0,06 0,04 0, Κλάσματα Σχήμα 2.4. Διαχωρισμός λιποσωμάτων από ελεύθερο σύμπλοκο Α/κυκλοδεξτρίνης με χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού σε στήλη Sephadex G

89 2.5 Χαρακτηρισμός μορφών Χαρακτηριστικά συμπλόκων A/Κυκλοδεξτρίνης Προσδιορισμός διαλυτότητας Σε σφαιρική φιάλη των 250mL προστίθενται περίπου mL απεσταγμένου νερού και ορισμένη ποσότητα του παραγώγου Α, ώστε να υπάρχει αδιάλυτο στερεό στο διάλυμα. Το εναιώρημα αφήνεται υπό ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου (25⁰C) για 72 ώρες. Μετά το πέρας των 72 ωρών το εναιώρημα διηθείται μέσω μεμβράνης 0,2μm. Το διήθημα μεταφέρεται σε ογκομετρική φιάλη των 100mL και προστίθενται 5mL χλωροφορμίου. Η φιάλη ανακινείται ανά τακτά χρονικά διαστήματα και αφού αφεθεί overnight σε ηρεμία απομακρύνεται η στοιβάδα του χλωροφορμίου. Η διαδικασία της προσθήκης χλωροφορμίου επαναλαμβάνεται άλλες δύο τρεις φορές. Στη συνέχεια τα κλάσματα ενώνονται και το χλωροφόρμιο απομακρύνεται με εξάτμιση σε περιστροφικό εξατμιστήρα (rotary evaporator). Τέλος γίνεται ποσοτικός προσδιορισμός του A που υπάρχει στη σφαιρική φιάλη και προσδιορίζεται η διαλυτότητα στο νερό Προσδιορισμός σταθεράς συμπλοκοποίησης συμπλόκων με κυκλοδεξτρίνες Για τον προσδιορισμό της σταθεράς συμπλοκοποίησης χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος διαλυτότητας φάσης. Τα διαγράμματα που προκύπτουν μέσω της μεθόδου βοηθούν στην αξιολόγηση των ενώσεων εγκλεισμού καθώς και στον προσδιορισμό της σταθεράς συμπλοκοποίησης. Παρασκευάζεται διάλυμα κυκλοδεξτρίνης συγκέντρωσης 50mΜ σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS με ph = 7,4. Από αυτό το διάλυμα με διαδοχικές αραιώσεις παρασκευάζονται 8 διαλύματα με συγκεντρώσεις 0/1/2/4/8/12/15/20mM. Σε φιαλίδια των 10mL προστίθενται όγκοι των 5mL χρησιμοποιώντας τις αναλογίες του πίνακα 2.6: 89

90 Πίνακας 2.6: Αναλογίες διαλύματος κυκλοδεξτρίνης και ρυθμιστικού διαλύματος PBS για τον προσδιορισμό του συντελεστή συμπλοκοποίησης. α/α Διάλυμα CD/mL PBS/mL [CD]/mM ,1 4, ,2 4, ,4 4, ,8 4, ,2 3, ,5 3, ,0 3,0 20 Στη συνέχεια προστίθενται 5mg του παραγώγου Α ανά δείγμα, ακολουθεί ισχυρή ανακίνηση των δειγμάτων με Vortex και υπέρηχους και αφήνονται σε ηρεμία για 72 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (25⁰C). Μετά το πέρας των 72 ωρών τα δείγματα διηθούνται με φίλτρα των 0,25μm και τέλος προσδιορίζεται η συγκέντρωση του Α στα δείγματα. τον τύπο: Ο συντελεστής συμπλοκοποίησης υπολογίζεται μέσω του διαγράμματος από Κ 1:1 =, όπου So η διαλυτότητα του Α στο νερό. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν οι κυκλοδεξτρίνες HP-β-CD (TCI Europe) και CRYSMEB (Roquette). H HP-β-CD είναι μερικώς υποκατεστημένος πολύ(υδροξυπροπυλ)αιθέρας της β-κυκλοδεξτρίνης (β-cd). Περιέχει από 10% έως 45% υδροξυπρόπυλ (-OCH2CHOHCH3) ομάδες και έχει μοριακό βάρος Η CRYSMEB είναι δεύτερης γενιάς τροποποιημένη κυκλοδεξτρίνη αποτελούμενη από πολυδιασπορά μεθυλιωμένων β-κυκλοδεξτρινών, με τελικό μοριακό βάρος

91 Διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (DSC) Χρησιμοποιήθηκε θερμιδόμετρο διαφορικής σάρωσης DSC 2920 της εταιρίας TA Instruments, εξοπλισμένο με σύστημα ψύξης ελεγχόμενο με παροχή υγρού αζώτου από την Rheometrics Scientific Ltd. Τα δείγματα ζυγίστηκαν με ακρίβεια (2 5 mg) και συμπιέστηκαν σε αλουμινένιους περιέκτες (TA Instruments). Ο ρυθμός θέρμανσης ων δειγμάτων ήταν 10 ⁰C ανά λεπτό και η περιοχή των θερμοκρασιών που μελετήθηκε ήταν από 40 ⁰C έως 250 ⁰C με παροχή αζώτου 50 ml/min για τη δημιουργία αδρανούς ατμόσφαιρας Περίθλαση ακτινών Χ (XRD) Τα φάσματα περίθλασης ακτίνων Χ (XRD) ελήφθησαν σε συσκευή περίθλασης ακτίνων Χ Siemens D5000 κάτω από τις ακόλουθες συνθήκες: φίλτρο Ni, δυναμικό 40 kv, ένταση ρεύματος 30 ma, σταθερά χρόνου 2 s. Η περιοχή γωνιών 2Θ ήταν από 5 έως 40 και η ταχύτητα σάρωσης ήταν 0,5⁰ /λεπτό Μέτρηση μεγέθους λιποσωμάτων Για τον υπολογισμό της κατανομής του μεγέθους τα εναιωρήματα αραιώνονται σε διάλυμα PBS σε συγκέντρωση 0,4 mg/ml. Το διάλυμα του PBS προηγουμένως έχει διηθηθεί από πολυανθρακικά φίλτρα διαμέτρου 0,22 μm (polycarbonate filters 0,22 μm, Millipore), για απομάκρυνση σωματιδίων σκόνης. Τα διαλύματα αυτά μετρώνται με την τεχνική δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS) (Malvern Nano-ZS, Malvern Instruments, UK) στους 25⁰C σε γωνία 173⁰. Η συσκευή αυτή είναι εφοδιασμένη με πηγή ακτινοβολίας laser He/Ne 25 mw και προσδιορίζει το μέγεθος μετρώντας την κίνηση Brown των σωματιδίων στο δείγμα. Ως κίνηση Brown ορίζεται η τυχαία κίνηση των σωματιδίων σε ένα υγρό εξαιτίας των συγκρούσεων με τα μόρια που τα περιβάλλουν. H λιποσωμική διασπορά μετράται αμέσως και προσδιορίζονται οι μέσοι διάμετροι των σωματιδίων και οι κατανομές 91

92 μεγέθους. Στις ρυθμίσεις του οργάνου ως δείκτης διαθλάσεως (Refractive Index R.I.), λαμβάνεται ο δείκτης διαθλάσεως του νερού R.I. = 1,330. Η τεχνική μέτρησης στο Nano Zetasizer είναι η NIBS (Non-Invasive Back- Scatter) η οποία επεκτείνει το εύρος των μεγεθών και των συγκεντρώσεων που μπορούν να μετρηθούν. Η δυνατότητα του Zetasizer Nano S και του Nano ZS instruments να διακρίνουν τις πληροφορίες σκέδασης σε γωνία 173⁰ ονομάζεται backscatter ανίχνευση. Επιπλέον το οπτικό σύστημα δεν είναι σε επαφή με το δείγμα γι αυτό και χαρακτηρίζεται ως μη επεμβατική τεχνική. Υπάρχουν πολλά πλεονεκτήματα της χρήσης της τεχνικής NIBS. Η ευαισθησία της μεθόδου είναι βελτιωμένη. Ο όγκος του δείγματος που επεξεργάζεται από το σύστημα είναι περίπου δέκα φορές μεγαλύτερος από των κοινών συστημάτων 90 μοιρών. Σε συνδυασμό με την ικανότητα συλλογής δεδομένων από το οπτικό σύστημα NIBS, η ευαισθησία αυξάνεται κατά δύο τάξεις μεγέθους επιτρέποντας τη μέτρηση του μεγέθους αραιωμένων διασπορών σε σωματίδια μεγέθους μικρότερου και από ένα νανόμετρο. Μπορεί να μετρηθεί ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων δειγμάτων. Η ακτίνα laser δεν χρειάζεται να περάσει μέσα από όλο το δείγμα. Μετρώντας τα σωματίδια που βρίσκονται κοντά στο τοίχωμα της κυψελίδας, το φώς περνά με μικρότερο μήκος στο δείγμα, μειώνοντας ή εξαλείφοντας το φαινόμενο της πολλαπλής σκέδασης, όπου η ακτίνα του φωτός από ένα σωματίδιο σκεδάζεται και από άλλα σωματίδια. Αυτό κάνει δυνατή τη μέτρηση και πιο πυκνών δειγμάτων. Η προετοιμασία των δειγμάτων είναι απλούστερη και η επίδραση της σκόνης είναι αισθητά μειωμένη, καθώς η σκόνη σκεδάζει περισσότερο φως στην αντίθετη κατεύθυνση. Η θέση μέτρησης μέσα στην κυψελίδα του Nano ZS ρυθμίζεται αυτόματα ώστε να διευθετούνται οι απαιτήσεις για υψηλή ευαισθησία ή για υψηλή συγκέντρωση. Αυτή η θέση αλλάζει με την μετακίνηση των φακών εστίασης. 92

93 Σχήμα 2.5. Σκέδαση για: (a) μικρά και (b) μεγάλα σωματίδια Για μικρά σωματίδια ή για δείγματα χαμηλής συγκέντρωσης, είναι προτιμότερο να μεγιστοποιείται η σκέδαση από το δείγμα. Καθώς η δέσμη laser περνά μέσω του τοιχώματος της κυψελίδας, η διαφορά στον δείκτη διάθλασης μεταξύ του αέρα και του υλικού της κυψελίδας προκαλεί «λάμψη». Αυτή η λάμψη ίσως αλληλεπιδρά με το σήμα σκέδασης. Μετακινώντας τη θέση μέτρησης μακριά από το τοίχωμα της κυψελίδας προς το κέντρο εξαλείφεται αυτό το φαινόμενο (σχήμα 2.5 a). Μεγάλα σωματίδια ή δείγματα με υψηλή συγκέντρωση σκεδάζουν περισσότερο φώς. Μετρώντας κοντά στο τοίχωμα της κυψελίδας μειώνεται η επίδρασης της πολλαπλής σκέδασης μειώνοντας το μήκος το οποίο πρέπει να διανύσει το σκεδασμένο φώς (σχήμα 2.5b) Μέτρηση ζ-δυναμικού Το ηλεκτρικό δυναμικό των λιποσωμάτων μετράται με τη φασματοσκοπία συσχέτησης φωτονίων (photon correlation spectroscopy, PCS). Ο υπολογισμός του ζ- δυναμικού έγινε σύμφωνα με την εξίσωση Smolukowski. (Jones M.N., 1995) Ζ=(u x n) / (E x ε) 93

ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΣΕ ΥΔΑΤΙΚΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ

ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΣΕ ΥΔΑΤΙΚΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΣΕ ΥΔΑΤΙΚΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ ΜΟΝΤΕΛΑ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ 1. Μονοστιβάδες 2. Διπλοστιβάδες 3. Λιποσώματα 1.1 ΜΟΝΟΣΤΙΒΑΔΕΣ Σχηματίζονται από μη-πολικά μόρια στη μεσόφαση αέρα/νερού Συσκευή

Διαβάστε περισσότερα

Κεφ. 12 ΛΙΠΙ ΙΑ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ

Κεφ. 12 ΛΙΠΙ ΙΑ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ Κεφ. 12 ΛΙΠΙ ΙΑ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ Ποικιλότητα και κοινά χαρακτηριστικά των κυτταρικών µεµβρανών Τα λιπαρά οξέα: βασικά συστατικά των λιπιδίων Mεµβρανικά λιπίδια και είδη τους (3) Σχηµατισµός µεµβρανών

Διαβάστε περισσότερα

Ανδρέας-Παναγιώτης Θεοδώρου Μαρία-Ιωάννα Μαλλιαρουδάκη Κωνσταντίνος Καλογερόπουλος Ιάκωβος Παπαϊωάννου Πελαγία Λυδία Πετροπούλου

Ανδρέας-Παναγιώτης Θεοδώρου Μαρία-Ιωάννα Μαλλιαρουδάκη Κωνσταντίνος Καλογερόπουλος Ιάκωβος Παπαϊωάννου Πελαγία Λυδία Πετροπούλου Ανδρέας-Παναγιώτης Θεοδώρου Μαρία-Ιωάννα Μαλλιαρουδάκη Κωνσταντίνος Καλογερόπουλος Ιάκωβος Παπαϊωάννου Πελαγία Λυδία Πετροπούλου «CELL NANOHEALERS: ΝΑΝΟΘΕΡΑΠΕΥΤΕΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΔΡΑΣΗ!» Ανδρέας-Παναγιώτης

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Β ΛΥΚΕΙΟΥ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Β ΛΥΚΕΙΟΥ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ Α. Εισαγωγικές έννοιες ΜΕΣΑ ΣΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Μπορούμε να διακρίνουμε δύο περιβάλλοντα ΥΔΡΟΦΙΛΟ υδατικό κυτταρόπλασμα ΥΔΡΟΦΟΒΟ λιπιδικο-μεμβρανικό Δηλαδή τα μόρια χαρακτηρίζονται έτσι λόγω της υδρόφοβης φύσης

Διαβάστε περισσότερα

Οργανική Χημεία. Κεφάλαιο 28: Βιομόρια-λιπίδια

Οργανική Χημεία. Κεφάλαιο 28: Βιομόρια-λιπίδια Οργανική Χημεία Κεφάλαιο 28: Βιομόρια-λιπίδια 1. Γενικά Λιπίδια: οργανικά μόρια που απαντούν στη φύση και απομονώνονται κατά την εκχύληση κυττάρων ή ιστών με άπολους οργανικούς διαλύτες Δύο γενικές κατηγορίες

Διαβάστε περισσότερα

ΛΙΠΙΔΙΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ. 29/10/2015 Δ.Δ. Λεωνίδας

ΛΙΠΙΔΙΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ. 29/10/2015 Δ.Δ. Λεωνίδας ΛΙΠΙΔΙΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ 4η ομάδα βιομορίων Δεν είναι πολυμερή, αλλά σχηματίζουν συσσωματώματα Μεγαλύτερη δομική ανομοιογένεια, κοινό χαρακτηριστικό: υδρόφοβος χαρακτήρας Βιολογικοί ρόλοι: 1. Συστατικά

Διαβάστε περισσότερα

Περιήγηση στο εσωτερικό του Κυττάρου. Φώτης Καρβέλης

Περιήγηση στο εσωτερικό του Κυττάρου. Φώτης Καρβέλης Περιήγηση στο εσωτερικό του Κυττάρου Φώτης Καρβέλης Όλα τα κύτταρα οριοθετούνται από την πλασματική μεμβράνη ή το κυτταρικό τοίχωμα που την περιβάλλει. Εσωτερικά της πλασματικής μεμβράνης υπάρχουν τα οργανίδια

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογικές Μεμβράνες και Μεταγωγή Σήματος

Βιολογικές Μεμβράνες και Μεταγωγή Σήματος ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ Βιολογικές Μεμβράνες και Μεταγωγή Σήματος Πολυμορφισμός Διδάσκουσα: Καθ. Μαρία - Ελένη Ε. Λέκκα Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε

Διαβάστε περισσότερα

Εθνικόν και Καποδιστριακόν Πανεπιστήμιον Αθηνών ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Τομέας Φαρμακευτικής Χημείας. Ιωάννης Ντότσικας. Επικ.

Εθνικόν και Καποδιστριακόν Πανεπιστήμιον Αθηνών ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Τομέας Φαρμακευτικής Χημείας. Ιωάννης Ντότσικας. Επικ. Εθνικόν και Καποδιστριακόν Πανεπιστήμιον Αθηνών ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Τομέας Φαρμακευτικής Χημείας Ιωάννης Ντότσικας Επικ. Καθηγητής 1 Οι κυκλοδεξτρίνες (Cyclodextrins, CDs) είναι κυκλικοί ολιγοσακχαρίτες

Διαβάστε περισσότερα

«ΣΥΝΘΕΣΗ ΛΙΠΙΔΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΚΑΙ ΑΙΘΕΡΩΝ ΣΤΕΜΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΝΕΟΥ ΤΥΠΟΥ

«ΣΥΝΘΕΣΗ ΛΙΠΙΔΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΚΑΙ ΑΙΘΕΡΩΝ ΣΤΕΜΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΝΕΟΥ ΤΥΠΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΣΥΝΘΕΣΗ ΛΙΠΙΔΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΚΑΙ ΑΙΘΕΡΩΝ ΣΤΕΜΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΝΕΟΥ

Διαβάστε περισσότερα

Τα χημικά στοιχεία που είναι επικρατέστερα στους οργανισμούς είναι: i..

Τα χημικά στοιχεία που είναι επικρατέστερα στους οργανισμούς είναι: i.. ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΣΤΟ 1 ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ «XHMIKH ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΥ» ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΑΙ Η ΧΗΜΕΙΑ ΤΗΣ ΖΩΗΣ Α. ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΕΣ ΜΕΣΑ ΣΤΗΝ ΤΑΞΗ 1. Όταν αναφερόμαστε στον όρο «Χημική Σύσταση του Κυττάρου», τί νομίζετε ότι

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΣΤ ΕΞΑΜΗΝΟΥ Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Τ.Ε.Ι. Αθήνας

ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΣΤ ΕΞΑΜΗΝΟΥ Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Τ.Ε.Ι. Αθήνας ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΣΤ ΕΞΑΜΗΝΟΥ Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Τ.Ε.Ι. Αθήνας Μάθημα 15 ο Νανοσωματίδια για γονιδιακή μεταφορά Διδάσκων Δρ. Ιωάννης Δρίκος Απόφοιτος Ιατρικής Σχολής Ιωαννίνων (ΠΙ) Απόφοιτος Βιολογίας,

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΣΤ ΕΞΑΜΗΝΟΥ Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Τ.Ε.Ι. Αθήνας

ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΣΤ ΕΞΑΜΗΝΟΥ Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Τ.Ε.Ι. Αθήνας ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΣΤ ΕΞΑΜΗΝΟΥ Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Τ.Ε.Ι. Αθήνας Μάθημα 12 ο Κυτταρική Βιολογία (νανομετρικό μέγεθος) - Βιοδείκτες Διδάσκων Δρ. Ιωάννης Δρίκος Απόφοιτος Ιατρικής Σχολής Ιωαννίνων (ΠΙ)

Διαβάστε περισσότερα

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12 ΛΙΠΙΔΙΑ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12 ΛΙΠΙΔΙΑ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12 ΛΙΠΙΔΙΑ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ Λιπαρά οξέα Καρβοξυλικά λιπαρά οξέα με ζυγό αριθμό ανθράκων C16-C18 τα πιο κοινά Λίγα με αριθμό C20 Λιπαρά οξέα Κορεσμένα Δύο τύποι κορεσμένα

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΑ ΛΙΠΙΔΙΑ, ΔΟΜΗ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ & ΣΥΝΘΕΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ

ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΑ ΛΙΠΙΔΙΑ, ΔΟΜΗ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ & ΣΥΝΘΕΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΑ ΛΙΠΙΔΙΑ, ΔΟΜΗ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ & ΣΥΝΘΕΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΗΠΑΡ VLDL Ανασκόπηση μεταβολισμού λιπιδίων & λιποπρωτεϊνών ΤΡΟΦΗ ΛΙΠΩΔΗΣ ΙΣΤΟΣ ΗΠΑΡ Κυκλοφορία Χυλομικρά Λιπαρά οξέα HDL LDL VLDL ΗΠΑΡ Λιπαρά οξέα

Διαβάστε περισσότερα

πρωτεϊνες νουκλεϊκά οξέα Βιολογικά Μακρομόρια υδατάνθρακες λιπίδια

πρωτεϊνες νουκλεϊκά οξέα Βιολογικά Μακρομόρια υδατάνθρακες λιπίδια πρωτεϊνες νουκλεϊκά οξέα Βιολογικά Μακρομόρια υδατάνθρακες λιπίδια Περιγραφή μαθήματος Επανάληψη σημαντικών εννοιών από την Οργανική Χημεία Χημική σύσταση των κυττάρων Μονοσακχαρίτες Αμινοξέα Νουκλεοτίδια

Διαβάστε περισσότερα

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12 ΛΙΠΙΔΙΑ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12 ΛΙΠΙΔΙΑ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12 ΛΙΠΙΔΙΑ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ Βιολογικές μεμβράνες Βιολογικές μεμβράνες: επίπεδες δομές πάχους συνήθως από 60 Å έως 100 Å, οι οποίες αποτελούνται από λιπίδια και πρωτεΐνες που συγκρατούνται

Διαβάστε περισσότερα

Ι. Ντότσικας, Επ. Καθηγητής Φαρμακευτικής ΕΚΠΑ. Οι κυκλοδεξτρίνες (cyclodextrins, CDs)

Ι. Ντότσικας, Επ. Καθηγητής Φαρμακευτικής ΕΚΠΑ. Οι κυκλοδεξτρίνες (cyclodextrins, CDs) Οι κυκλοδεξτρίνες (cyclodextrins, CDs) Οι κυκλοδεξτρίνες είναι μία οικογένεια κυκλικών ολιγοσακχαριτών αποτελούμενες από μονομερή σακχάρων (α-d-γλυκοπυρανόζη) συνδεδεμένων μεταξύ τους με α - [1,4] γλυκοσιδικούς

Διαβάστε περισσότερα

Αιωρήματα & Γαλακτώματα

Αιωρήματα & Γαλακτώματα Αιωρήματα & Γαλακτώματα Εαρινό εξάμηνο Ακ. Έτους 2014-15 Μάθημα 2ο 25 February 2015 Αιωρήματα Γαλακτώματα 1 Παρασκευή αιωρημάτων Οι μέθοδοι παρασκευής αιωρημάτων κατατάσσονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΟΡΦΗΣ ΓΙΑ ΚΟΛΠΙΚΗ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΤΟΥ ΦΑΡΜΑΚΟΥ MC-1220» ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΠΥΡΙ ΩΝ ΜΟΥΡΤΑΣ ΠΑΤΡΑ 2010 ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σ. Αντιµησιάρη (Επιβλέπουσα) Καθηγήτρια Τµήµα Φαρµακευτικής K.

Διαβάστε περισσότερα

ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΧΗΜΕΙΑ

ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΧΗΜΕΙΑ ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ 2015-2016 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΧΗΜΕΙΑ 1)Πώς το φαινόμενο Bohr επηρεάζει την πρόσδεση οξυγόνου στην αιμοσφαιρίνη; Που συνδέονται τα ιόντα

Διαβάστε περισσότερα

Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ανόργανη Χημεία. Ενότητα 8 η : Υγρά, Στερεά & Αλλαγή Φάσεων. Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής.

Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ανόργανη Χημεία. Ενότητα 8 η : Υγρά, Στερεά & Αλλαγή Φάσεων. Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων Ανόργανη Χημεία Ενότητα 8 η : Υγρά, Στερεά & Αλλαγή Φάσεων Οκτώβριος 2018 Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής Πολικοί Ομοιοπολικοί Δεσμοί & Διπολικές Ροπές 2 Όπως έχει

Διαβάστε περισσότερα

ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΠΛΑΣΜΑΤΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ. Πετρολιάγκης Σταμάτης Τμήμα Γ4

ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΠΛΑΣΜΑΤΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ. Πετρολιάγκης Σταμάτης Τμήμα Γ4 ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΠΛΑΣΜΑΤΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ Πετρολιάγκης Σταμάτης Τμήμα Γ4 ΕΝΝΟΙΑ ΤΗΣ ΠΛΑΣΜΑΤΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ Η κυτταρική μεμβράνη ή πλασματική μεμβράνη είναι η εξωτερική μεμβράνη που περιβάλλει το κύτταρο

Διαβάστε περισσότερα

ΔΠΘ - Τμήμα Δασολογίας & Διαχείρισης Περιβάλλοντος & Φυσικών Πόρων ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΠΡΟΣΛΗΨΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΤΟΥ ΝΕΡΟΥ ΣΤΑ ΦΥΤΑ

ΔΠΘ - Τμήμα Δασολογίας & Διαχείρισης Περιβάλλοντος & Φυσικών Πόρων ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΠΡΟΣΛΗΨΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΤΟΥ ΝΕΡΟΥ ΣΤΑ ΦΥΤΑ ΔΠΘ - Τμήμα Δασολογίας & Διαχείρισης Περιβάλλοντος & Φυσικών Πόρων ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΠΡΟΣΛΗΨΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΤΟΥ ΝΕΡΟΥ ΣΤΑ ΦΥΤΑ Θερινό εξάμηνο 2011 Ο ρόλος του νερού στο φυτό Βασικότερο συστατικό των ιστών

Διαβάστε περισσότερα

ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΧΗΜΕΙΑ

ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΧΗΜΕΙΑ ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ 2017-2018 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΧΗΜΕΙΑ 1. Σε ποια μορφή της αιμοσφαιρίνης συνδέεται το 2,3, BPG, ποιο είναι το ηλεκτρικό του φορτίο, με

Διαβάστε περισσότερα

Διερεύνηση της χρήσης λιποσωμάτων ωs in vitro μοντέλο πρόγνωσης της κυτταροτοξικότητας εκδόχων

Διερεύνηση της χρήσης λιποσωμάτων ωs in vitro μοντέλο πρόγνωσης της κυτταροτοξικότητας εκδόχων Διερεύνηση της χρήσης λιποσωμάτων ωs in vitro μοντέλο πρόγνωσης της κυτταροτοξικότητας εκδόχων ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΠΟΚΤΗΣΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Υποβληθείσα στο Τμήμα Φαρμακευτικής

Διαβάστε περισσότερα

ΔΙΑΚΡΙΣΗ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΜΑΚΡΟΘΡΕΠΤΙΚΑ (C, H, N, O) 96% ΜΙΚΡΟΘΡΕΠΤΙΚΑ (πχ. Na, K, P, Ca, Mg) 4% ΙΧΝΟΣΤΟΙΧΕΙΑ (Fe, I) 0,01%

ΔΙΑΚΡΙΣΗ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΜΑΚΡΟΘΡΕΠΤΙΚΑ (C, H, N, O) 96% ΜΙΚΡΟΘΡΕΠΤΙΚΑ (πχ. Na, K, P, Ca, Mg) 4% ΙΧΝΟΣΤΟΙΧΕΙΑ (Fe, I) 0,01% ΔΙΑΚΡΙΣΗ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΜΑΚΡΟΘΡΕΠΤΙΚΑ (C, H, N, O) 96% ΜΙΚΡΟΘΡΕΠΤΙΚΑ (πχ. Na, K, P, Ca, Mg) 4% ΙΧΝΟΣΤΟΙΧΕΙΑ (Fe, I) 0,01% Ο άνθρακας, το υδρογόνο, το οξυγόνο και το άζωτο συμμετέχουν, σε σημαντικό βαθμό, στη

Διαβάστε περισσότερα

Γενική Χημεία. Νίκος Ξεκουκουλωτάκης Επίκουρος Καθηγητής

Γενική Χημεία. Νίκος Ξεκουκουλωτάκης Επίκουρος Καθηγητής Γενική Χημεία Νίκος Ξεκουκουλωτάκης Επίκουρος Καθηγητής Πολυτεχνείο Κρήτης Τμήμα Μηχανικών Περιβάλλοντος Γραφείο Κ2.125, τηλ.: 28210-37772 e-mail:nikosxek@gmail.com Περιεχόμενα Διαλύματα Γραμμομοριακή

Διαβάστε περισσότερα

Kυτταρική Bιολογία ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ, ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΑ ΔΙΑΜΕΡΙΣΜΑΤΑ & ΔΙΑΛΟΓΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΔIAΛEΞΗ 4 (6/3/2013)

Kυτταρική Bιολογία ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ, ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΑ ΔΙΑΜΕΡΙΣΜΑΤΑ & ΔΙΑΛΟΓΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΔIAΛEΞΗ 4 (6/3/2013) Kυτταρική Bιολογία ΔIAΛEΞΗ 4 (6/3/2013) ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ, ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΑ ΔΙΑΜΕΡΙΣΜΑΤΑ & ΔΙΑΛΟΓΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Οι λιπιδικές διπλοστιβάδες ως φραγμοί Νερό Υδρόφιλες φωσφολιπιδικές κεφαλές Φωσφολιπιδική μεμβράνη

Διαβάστε περισσότερα

KΕΦΑΛΑΙΟ 1ο Χημική σύσταση του κυττάρου. Να απαντήσετε σε καθεμιά από τις παρακάτω ερωτήσεις με μια πρόταση:

KΕΦΑΛΑΙΟ 1ο Χημική σύσταση του κυττάρου. Να απαντήσετε σε καθεμιά από τις παρακάτω ερωτήσεις με μια πρόταση: KΕΦΑΛΑΙΟ 1ο Χημική σύσταση του κυττάρου Ενότητα 1.1: Χημεία της ζωής Ενότητα 2.1: Μακρομόρια Να απαντήσετε σε καθεμιά από τις παρακάτω ερωτήσεις με μια πρόταση: 1. Για ποιο λόγο θεωρείται αναγκαία η σταθερότητα

Διαβάστε περισσότερα

ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ 2014-2015 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΧΗΜΕΙΑ

ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ 2014-2015 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΧΗΜΕΙΑ ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ 2014-2015 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΧΗΜΕΙΑ ΘΕΜΑΤΑ 1.Πώς οι κινητικές παράμετροι Κ m και K cat χρησιμεύουν για να συγκριθεί η ανακύκλωση διαφορετικών

Διαβάστε περισσότερα

ΣΥΜΠΥΚΝΩΣΗ: αφαίρεση ενός μορίου νερού - σύνθεση ενός διμερούς ΥΔΡΟΛΥΣΗ : προσθήκη ενός μορίου νερού - διάσπαση του διμερούς στα συστατικά του

ΣΥΜΠΥΚΝΩΣΗ: αφαίρεση ενός μορίου νερού - σύνθεση ενός διμερούς ΥΔΡΟΛΥΣΗ : προσθήκη ενός μορίου νερού - διάσπαση του διμερούς στα συστατικά του ΣΥΜΠΥΚΝΩΣΗ: αφαίρεση ενός μορίου νερού - σύνθεση ενός διμερούς ΥΔΡΟΛΥΣΗ : προσθήκη ενός μορίου νερού - διάσπαση του διμερούς στα συστατικά του ΤΑ ΜΟΝΟΜΕΡΗ ΣΥΝΔΕΟΝΤΑΙ ΜΕ ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΟ ΔΕΣΜΟ. 1. ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Β ΛΥΚΕΙΟΥ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Β ΛΥΚΕΙΟΥ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ Οι Βιολογικές Μεμβράνες Είναι δυναμικές και όχι στατικές δομές που επιτελούν πολλές λειτουργίες στα κύτταρα. Πρέπει να γνωρίζετε Τη σύσταση βιολογικών μεμβρανών Τι προβλέπει το μοντέλο του ρευστού μωσαϊκού

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Μελέτη της παρασκευής λιποσωμικών μορφών του νευροστεροειδούς ΒΝΝ-50 Για την απόκτηση του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στην κατεύθυνση «Βιομηχανική Φαρμακευτική

Διαβάστε περισσότερα

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΔΙΑΠΕΡΑΤΟΤΗΤΑ

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΔΙΑΠΕΡΑΤΟΤΗΤΑ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΔΙΑΠΕΡΑΤΟΤΗΤΑ Προσοµοίωση Είναι γνωστό ότι η εξάσκηση των φοιτητών σε επίπεδο εργαστηριακών ασκήσεων, µε χρήση των κατάλληλων πειραµατοζώων, οργάνων και αναλωσίµων

Διαβάστε περισσότερα

Βασικές Διεργασίες Μηχανικής Τροφίμων

Βασικές Διεργασίες Μηχανικής Τροφίμων Βασικές Διεργασίες Μηχανικής Τροφίμων Ενότητα 8: Εκχύλιση, 1ΔΩ Τμήμα: Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής Του Ανθρώπου Σταύρος Π. Γιαννιώτης, Καθηγητής Μηχανικής Τροφίμων Μαθησιακοί Στόχοι Τύποι εκχύλισης

Διαβάστε περισσότερα

Πανεπιστήμιο Δυτικής Μακεδονίας. Τμήμα Μηχανολόγων Μηχανικών. Χημεία. Ενότητα 15: Διαλύματα

Πανεπιστήμιο Δυτικής Μακεδονίας. Τμήμα Μηχανολόγων Μηχανικών. Χημεία. Ενότητα 15: Διαλύματα Τμήμα Μηχανολόγων Μηχανικών Χημεία Ενότητα 15: Διαλύματα Αν. Καθηγητής Γεώργιος Μαρνέλλος e-mail: gmarnellos@uowm.gr Τμήμα Μηχανολόγων Μηχανικών Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες

Διαβάστε περισσότερα

Σύσταση του αυγού Λευκό Κρόκος Βάρος 38 g 17 g Πρωτείνη 3,9 g 2,7 g Υδατάνθρακες 0,3 g 0,3 g Λίπος 0 6 g Χοληστερόλη 0 213 mg

Σύσταση του αυγού Λευκό Κρόκος Βάρος 38 g 17 g Πρωτείνη 3,9 g 2,7 g Υδατάνθρακες 0,3 g 0,3 g Λίπος 0 6 g Χοληστερόλη 0 213 mg Αυγό Τα αυγά αποτελούνται από το κέλυφος (10 %), το ασπράδι ή λευκό (50-60 %), τον κρόκο ή κίτρινο (30 %). Το κέλυφος αποτελείται κατά 95 % από ανόργανα συστατικά όπως ανθρακικό ασβέστιο, ανθρακικό μαγνήσιο

Διαβάστε περισσότερα

Ταξινόμηση της ύλης Διαλύματα Περιεκτικότητες διαλυμάτων. Χημεία Α Λυκείου Διδ. Εν. 1.5 π. Ευάγγελος Μαρκαντώνης 2 ο ΓΕΛ Αργυρούπολης

Ταξινόμηση της ύλης Διαλύματα Περιεκτικότητες διαλυμάτων. Χημεία Α Λυκείου Διδ. Εν. 1.5 π. Ευάγγελος Μαρκαντώνης 2 ο ΓΕΛ Αργυρούπολης Ταξινόμηση της ύλης Διαλύματα Περιεκτικότητες διαλυμάτων Χημεία Α Λυκείου Διδ. Εν. 1.5 π. Ευάγγελος Μαρκαντώνης 2 ο ΓΕΛ Αργυρούπολης Μακροσκοπική ταξινόμηση της ύλης ΥΛΗ Καθορισµένη (καθαρή) ουσία όχι

Διαβάστε περισσότερα

Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ανόργανη Χημεία. Ενότητα 9 η : Διαλύματα & οι ιδιότητές τους. Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής.

Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ανόργανη Χημεία. Ενότητα 9 η : Διαλύματα & οι ιδιότητές τους. Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων Ανόργανη Χημεία Ενότητα 9 η : Διαλύματα & οι ιδιότητές τους Οκτώβριος 2018 Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής Διαλύματα 2 Τα ομοιογενή μίγματα μπορούν να ταξινομηθούν

Διαβάστε περισσότερα

Ακινητοποίηση λιποσωμάτων που εγκλωβίζουν Tobramycin σε επιχρυσωμένες μεταλλικές επιφάνειες για εφαρμογές σε ουρολογικούς καθετήρες

Ακινητοποίηση λιποσωμάτων που εγκλωβίζουν Tobramycin σε επιχρυσωμένες μεταλλικές επιφάνειες για εφαρμογές σε ουρολογικούς καθετήρες Ακινητοποίηση λιποσωμάτων που εγκλωβίζουν Tobramycin σε επιχρυσωμένες μεταλλικές επιφάνειες για εφαρμογές σε ουρολογικούς καθετήρες Για την απόκτηση του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στην κατεύθυνση

Διαβάστε περισσότερα

Ανόργανη Χημεία. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ενότητα 4 η : Ιοντικοί Δεσμοί Χημεία Κύριων Ομάδων. Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής

Ανόργανη Χημεία. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ενότητα 4 η : Ιοντικοί Δεσμοί Χημεία Κύριων Ομάδων. Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων Ανόργανη Χημεία Ενότητα 4 η : Ιοντικοί Δεσμοί Χημεία Κύριων Ομάδων Οκτώβριος 2018 Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής Δόμηση Ηλεκτρονίων στα Ιόντα 2 Για τα στοιχεία

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ. Στοιχείο O C H N Ca P K S Na Mg περιεκτικότητα % ,5 1 0,35 0,25 0,15 0,05

ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ. Στοιχείο O C H N Ca P K S Na Mg περιεκτικότητα % ,5 1 0,35 0,25 0,15 0,05 ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ Βιοχημεία: είναι η επιστήμη που ασχολείται με τη μελέτη των οργανικών ενώσεων που συναντώνται στον οργανισμό, καθώς και με τον μεταβολισμό τους. ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ 108 στοιχεία

Διαβάστε περισσότερα

πρωτεΐνες πολυμερείς ουσίες δομούν λειτουργούν λευκώματα 1.Απλές πρωτεΐνες 2.Σύνθετες πρωτεΐνες πρωτεΐδια μη πρωτεϊνικό μεταλλοπρωτεΐνες

πρωτεΐνες πολυμερείς ουσίες δομούν λειτουργούν λευκώματα 1.Απλές πρωτεΐνες 2.Σύνθετες πρωτεΐνες πρωτεΐδια μη πρωτεϊνικό μεταλλοπρωτεΐνες ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ Οι πρωτεΐνες είναι πολυμερείς ουσίες με κυρίαρχο και πρωταρχικό ρόλο στη ζωή. Πρωτεΐνες είναι οι ουσίες που κυρίως δομούν και λειτουργούν τους οργανισμούς. Λέγονται και λευκώματα λόγω του λευκού

Διαβάστε περισσότερα

ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ 2014-2015 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ

ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ 2014-2015 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ 2014-2015 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ Θέματα 1. Ποια είναι η δομή και τα βασικά χαρακτηριστικά των λιπαρών οξέων 2. Πώς απομακρύνονται

Διαβάστε περισσότερα

και χρειάζεται μέσα στο ρύθμιση εναρμόνιση των διαφόρων ενζυμικών δραστηριοτήτων. ενζύμων κύτταρο τρόπους

και χρειάζεται μέσα στο ρύθμιση εναρμόνιση των διαφόρων ενζυμικών δραστηριοτήτων. ενζύμων κύτταρο τρόπους Για να εξασφαλιστεί η σωστή και αρμονική έκφραση των ενζύμων μέσα στο κύτταρο χρειάζεται ρύθμιση εναρμόνιση των διαφόρων ενζυμικών δραστηριοτήτων. και Η εναρμόνιση αυτή επιτυγχάνεται με διάφορους τρόπους

Διαβάστε περισσότερα

Κεφάλαιο 3. Διεργασίες στη διεπιφάνεια υγρούστερεού

Κεφάλαιο 3. Διεργασίες στη διεπιφάνεια υγρούστερεού Κεφάλαιο 3 Διεργασίες στη διεπιφάνεια υγρούστερεού Εισαγωγή Η προσρόφηση δηλαδή η συσσώρευση στη διεπαφή στερεού-υγρού είναι η βάση των περισσοτέρων επιφανειακών-χημικών διαδικασιών 1. Επηρεάζει την κατανομή

Διαβάστε περισσότερα

Μεταγωγή σήματος και βιολογικές μεμβράνες

Μεταγωγή σήματος και βιολογικές μεμβράνες Μεταγωγή σήματος και βιολογικές μεμβράνες ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ Ορισμός / Μονάδες Δομές (πρωτοταγής κλπ) Ταξινόμηση με βάση τις λειτουργίες Απεικόνιση - Μοντέλα (συρμάτων

Διαβάστε περισσότερα

Αιωρήματα & Γαλακτώματα

Αιωρήματα & Γαλακτώματα Αιωρήματα & Γαλακτώματα Εαρινό εξάμηνο Ακ. Έτους 2015-16 Μάθημα 9ο 5 May 2017 Αιωρήματα Γαλακτώματα 1 Στρατηγική δοσολογίας (Για άλατα μετάλλων τα οποία υδρολύονται ) Περιοχές δραστικότητας: Περιοχή 1:

Διαβάστε περισσότερα

Διαλύματα - Περιεκτικότητες διαλυμάτων Γενικά για διαλύματα

Διαλύματα - Περιεκτικότητες διαλυμάτων Γενικά για διαλύματα Διαλύματα - Περιεκτικότητες διαλυμάτων Γενικά για διαλύματα Μάθημα 6 6.1. SOS: Τι ονομάζεται διάλυμα, Διάλυμα είναι ένα ομογενές μίγμα δύο ή περισσοτέρων καθαρών ουσιών. Παράδειγμα: Ο ατμοσφαιρικός αέρας

Διαβάστε περισσότερα

ΤΕΧΝΙΚΑ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΞΙΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΓΕΩΘΕΡΜΙΑΣ

ΤΕΧΝΙΚΑ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΞΙΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΓΕΩΘΕΡΜΙΑΣ ΤΕΧΝΙΚΑ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΞΙΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΓΕΩΘΕΡΜΙΑΣ Η αξιοποίηση της γεωθερμικής ενέργειας συναντά ορισμένα τεχνικά προβλήματα, Τα προβλήματα αυτά είναι: (α) ο σχηματισμός επικαθίσεων (ή καθαλατώσεις

Διαβάστε περισσότερα

ΔΙΕΘΝΕΣ ΣΥΣΤΗΜΑ ΜΟΝΑΔΩΝ (S.I.)

ΔΙΕΘΝΕΣ ΣΥΣΤΗΜΑ ΜΟΝΑΔΩΝ (S.I.) ΒΑΣΙΚΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΔΙΕΘΝΕΣ ΣΥΣΤΗΜΑ ΜΟΝΑΔΩΝ (S.I.) Το 1960 καθορίστηκε μετά από διεθνή συμφωνία το Διεθνές Σύστημα Μονάδων S.I. (από τα αρχικά των γαλλικών λέξεων Système International d Unités). Το σύστημα

Διαβάστε περισσότερα

2. ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

2. ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 2. ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Τύποι διαλυμάτων Διαλυτότητα και η διαδικασία διάλυσης Επιδράσεις θερμοκρασίας και πίεσης πάνω στη διαλυτότητα Τρόποι έκφρασης της συγκέντρωσης Τάση ατμών διαλύματος Ανύψωση σημείου

Διαβάστε περισσότερα

Αποµόνωση µεµβρανικών λιπιδίων

Αποµόνωση µεµβρανικών λιπιδίων Αποµόνωση µεµβρανικών λιπιδίων 50 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΛΙΠΙ ΙΩΝ ΑΠΟ ΕΡΥΘΡΑ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΑ ΜΕ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΟ ΦΑΣΕΩΝ Σκοπός της άσκησης : να γίνουν κατανοητά τα στάδια αποµόνωσης κυττάρων και στη συνέχεια

Διαβάστε περισσότερα

BΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ

BΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ BΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 1. ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 2. BΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Ι. ΑΤΟΜΑ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑ ΙΙ. ΧΗΜΙΚΟΙ ΔΕΣΜΟΙ ΙΙΙ. ΜΑΚΡΟΜΟΡΙΑ ΣΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ

Διαβάστε περισσότερα

ΚΗΡΟΙ- ΛΙΠΗ- ΕΛΑΙΑ- ΣΑΠΩΝΕΣ ΑΠΟΡΡΥΠΑΝΤΙΚΑ- ΦΩΣΦΟΛΙΠΙΔΙΑ. ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ Γενικό Τμήμα Εργαστήριο Χημείας, Καθηγητής Μόσχος Πολυσίου

ΚΗΡΟΙ- ΛΙΠΗ- ΕΛΑΙΑ- ΣΑΠΩΝΕΣ ΑΠΟΡΡΥΠΑΝΤΙΚΑ- ΦΩΣΦΟΛΙΠΙΔΙΑ. ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ Γενικό Τμήμα Εργαστήριο Χημείας, Καθηγητής Μόσχος Πολυσίου ΚΗΡΟΙ- ΛΙΠΗ- ΕΛΑΙΑ- ΣΑΠΩΝΕΣ ΑΠΟΡΡΥΠΑΝΤΙΚΑ- ΦΩΣΦΟΛΙΠΙΔΙΑ ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ Γενικό Τμήμα Εργαστήριο Χημείας, Καθηγητής Μόσχος Πολυσίου ΚΗΡΟΙ Κηροί είναι μίγματα εστέρων καρβοξυλικών οξέων και

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ: Τεχνολογία Μετρήσεων ΙΙ

ΜΑΘΗΜΑ: Τεχνολογία Μετρήσεων ΙΙ ΜΑΘΗΜΑ: Τεχνολογία Μετρήσεων ΙΙ ΔΙΔΑΣΚΩΝ: Αν. Καθ. Δρ Μαρία Α. Γούλα ΤΜΗΜΑ: Μηχανικών Περιβάλλοντος & Μηχανικών Αντιρρύπανσης 1 Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης Creative

Διαβάστε περισσότερα

τα βιβλία των επιτυχιών

τα βιβλία των επιτυχιών Τα βιβλία των Εκδόσεων Πουκαμισάς συμπυκνώνουν την πολύχρονη διδακτική εμπειρία των συγγραφέων μας και αποτελούν το βασικό εκπαιδευτικό υλικό που χρησιμοποιούν οι μαθητές των φροντιστηρίων μας. Μέσα από

Διαβάστε περισσότερα

«ΣΥΝΔΕΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΣΕ ΕΠΙΦΑΝΕΙΕΣ, ΠΟΥ ΕΧΟΥΝ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΘΕΙ ΚΑΤΑΛΛΗΛΑ ΜΕ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ, ΜΕ ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΟ ΔΕΣΜΟ»

«ΣΥΝΔΕΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΣΕ ΕΠΙΦΑΝΕΙΕΣ, ΠΟΥ ΕΧΟΥΝ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΘΕΙ ΚΑΤΑΛΛΗΛΑ ΜΕ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ, ΜΕ ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΟ ΔΕΣΜΟ» ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΣΥΝΔΕΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΣΕ ΕΠΙΦΑΝΕΙΕΣ, ΠΟΥ ΕΧΟΥΝ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΘΕΙ ΚΑΤΑΛΛΗΛΑ ΜΕ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

Διαβάστε περισσότερα

Κροκίδωση Συσσωμάτωση Χημική κατακρήμνιση Πηγή: Μαρία Λοϊζίδου, ΕΜΠ, Αθήνα 2006

Κροκίδωση Συσσωμάτωση Χημική κατακρήμνιση Πηγή: Μαρία Λοϊζίδου, ΕΜΠ, Αθήνα 2006 Κροκίδωση Συσσωμάτωση Χημική κατακρήμνιση Πηγή: Μαρία Λοϊζίδου, ΕΜΠ, Αθήνα 2006 Η χημική κατακρήμνιση βασίζεται στη λειτουργία της συσσωμάτωσης και κροκίδωσης των κολλοειδών σωματιδίων που υπάρχουν αρχικά

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ν. ΜΑΓΝΗΣΙΑΣ ( Ε.Κ.Φ.Ε ) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ν. ΜΑΓΝΗΣΙΑΣ ( Ε.Κ.Φ.Ε ) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ν. ΜΑΓΝΗΣΙΑΣ ( Ε.Κ.Φ.Ε ) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Θέμα: ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ (DNA ΚΑΙ RNA AΠΟ ΦΥΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ) Μέσος χρόνος πειράματος: 45 λεπτά Α. ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ Εργαλεία

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία Γενικής Παιδείας Β Λυκείου

Βιολογία Γενικής Παιδείας Β Λυκείου Απρίλιος Μάιος 12 Βιολογία Γενικής Παιδείας Β Λυκείου Βιολογία Γενικής Παιδείας Β Λυκείου (Ερωτήσεις που παρουσιάζουν ενδιαφέρον) 1. Τι είναι τα βιομόρια και ποια είναι τα βασικά χαρακτηριστικά τους; Βιομόρια

Διαβάστε περισσότερα

ΒΑΣΙΚΕΣ ΔΟΜΕΣ - ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ

ΒΑΣΙΚΕΣ ΔΟΜΕΣ - ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ ΤΕΙ ΠΑΤΡΑΣ ΤΜΗΜΑ ΝΟΣΗΛΕΥΤΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΑ I ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ : Γεράσιμος Π. Βανδώρος ΒΑΣΙΚΕΣ ΔΟΜΕΣ - ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ Οι βασικές δομές που εξετάζουμε στην ανατομία μπορούν ιεραρχικά να ταξινομηθούν ως εξής:

Διαβάστε περισσότερα

Από πού προέρχεται η θερμότητα που μεταφέρεται από τον αντιστάτη στο περιβάλλον;

Από πού προέρχεται η θερμότητα που μεταφέρεται από τον αντιστάτη στο περιβάλλον; 3. ΗΛΕΚΤΡΙΚΗ ΕΝΕΡΓΕΙΑ Ένα ανοικτό ηλεκτρικό κύκλωμα μετατρέπεται σε κλειστό, οπότε διέρχεται από αυτό ηλεκτρικό ρεύμα που μεταφέρει ενέργεια. Τα σπουδαιότερα χαρακτηριστικά της ηλεκτρικής ενέργειας είναι

Διαβάστε περισσότερα

Kυτταρική Bιολογία ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΔIAΛEΞΗ 2 (22/2/2016) Χημικοί δεσμοί - Το νερό & ο ρόλος του. Τα μόρια του κυττάρου.

Kυτταρική Bιολογία ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΔIAΛEΞΗ 2 (22/2/2016) Χημικοί δεσμοί - Το νερό & ο ρόλος του. Τα μόρια του κυττάρου. Kυτταρική Bιολογία ΔIAΛEΞΗ 2 (22/2/2016) ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Χημικοί δεσμοί - Το νερό & ο ρόλος του Τα μόρια του κυττάρου. Ενεργοποιημένα μόρια-φορείς ενέργειας AΣ ΘYMHΘOYME Tι είπαμε στην προηγούμενη

Διαβάστε περισσότερα

Kυτταρική Bιολογία ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ, ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΑ ΔΙΑΜΕΡΙΣΜΑΤΑ & ΔΙΑΛΟΓΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΔIAΛEΞΕΙΣ 4 & 5 (29/2 & 2/3/2016)

Kυτταρική Bιολογία ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ, ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΑ ΔΙΑΜΕΡΙΣΜΑΤΑ & ΔΙΑΛΟΓΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΔIAΛEΞΕΙΣ 4 & 5 (29/2 & 2/3/2016) Kυτταρική Bιολογία ΔIAΛEΞΕΙΣ 4 & 5 (29/2 & 2/3/2016) ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ, ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΑ ΔΙΑΜΕΡΙΣΜΑΤΑ & ΔΙΑΛΟΓΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Οι λιπιδικές διπλοστιβάδες λειτουργούν ως φραγμοί Νερό Υδρόφιλες φωσφολιπιδικές κεφαλές

Διαβάστε περισσότερα

Σχ. 1: Τυπική μορφή μοριακού δυναμικού.

Σχ. 1: Τυπική μορφή μοριακού δυναμικού. ΤΕΤΥ - Σύγχρονη Φυσική Κεφ. 6-1 Κεφάλαιο 6. Μόρια Εδάφια: 6.a. Μόρια και μοριακοί δεσμοί 6.b. Κβαντομηχανική περιγραφή του χημικού δεσμού 6.c. Περιστροφή και ταλάντωση μορίων 6.d. Μοριακά φάσματα 6.a.

Διαβάστε περισσότερα

Θέματα πριν τις εξετάσεις. Καλό διάβασμα Καλή επιτυχία

Θέματα πριν τις εξετάσεις. Καλό διάβασμα Καλή επιτυχία Θέματα πριν τις εξετάσεις Καλό διάβασμα Καλή επιτυχία 2013-2014 Θέματα πολλαπλής επιλογής Μετουσίωση είναι το φαινόμενο α. κατά το οποίο συνδέονται δύο αμινοξέα για τον σχηματισμό μιας πρωτεΐνης β. κατά

Διαβάστε περισσότερα

ΧΗΜΕΙΑ Γ' ΓΥΜΝΑΣΙΟΥ. + SO 4 Βάσεις είναι οι ενώσεις που όταν διαλύονται σε νερό δίνουν ανιόντα υδροξειδίου (ΟΗ - ). NaOH Na

ΧΗΜΕΙΑ Γ' ΓΥΜΝΑΣΙΟΥ. + SO 4 Βάσεις είναι οι ενώσεις που όταν διαλύονται σε νερό δίνουν ανιόντα υδροξειδίου (ΟΗ - ). NaOH Na ΧΗΜΕΙΑ Γ' ΓΥΜΝΑΣΙΟΥ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΟΞΕΩΝ Αλλάζουν το χρώμα των δεικτών. Αντιδρούν με μέταλλα και παράγουν αέριο υδρογόνο (δες απλή αντικατάσταση) Αντιδρούν με ανθρακικά άλατα και παράγουν αέριο CO2. Έχουν όξινη

Διαβάστε περισσότερα

Μίγματα - Διαλύματα:

Μίγματα - Διαλύματα: ΧΗΜΕΙΑ: Εισαγωγή στην Χημεία - από το νερό στο άτομο- από το μακρόκοσμο στον μικρόκοσμο 49 Μίγματα - Διαλύματα: Μίγματα: Τι είναι τα μίγματα; Μίγματα ονομάζονται τα υλικά που αποτελούνται από δύο ή περισσότερες

Διαβάστε περισσότερα

Παράγοντες που εξηγούν τη διαλυτότητα. Είδη διαλυμάτων

Παράγοντες που εξηγούν τη διαλυτότητα. Είδη διαλυμάτων Παράγοντες που εξηγούν τη διαλυτότητα 1. Η φυσική τάση των ουσιών να αναμιγνύονται μεταξύ τους. 2. Οι σχετικές ελκτικές δυνάμεις μεταξύ των χημικών οντοτήτων του διαλύματος Είδη διαλυμάτων Στα διαλύματα

Διαβάστε περισσότερα

Πηγή: ΑΠΟΛΥΜΑΝΣΗ ΤΟΥ ΠΟΣΙΜΟΥ ΝΕΡΟΥ : ΠΡΟΧΩΡΗΜΕΝΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΕΣ ΤΟΥ ΧΛΩΡΙΟΥ, ΘΕΟΔΩΡΑΤΟΥ ΑΓΓΕΛΙΚΗ, ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΙΓΑΙΟΥ, ΜΥΤΙΛΗΝΗ 2005

Πηγή: ΑΠΟΛΥΜΑΝΣΗ ΤΟΥ ΠΟΣΙΜΟΥ ΝΕΡΟΥ : ΠΡΟΧΩΡΗΜΕΝΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΕΣ ΤΟΥ ΧΛΩΡΙΟΥ, ΘΕΟΔΩΡΑΤΟΥ ΑΓΓΕΛΙΚΗ, ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΙΓΑΙΟΥ, ΜΥΤΙΛΗΝΗ 2005 Πηγή: ΑΠΟΛΥΜΑΝΣΗ ΤΟΥ ΠΟΣΙΜΟΥ ΝΕΡΟΥ : ΠΡΟΧΩΡΗΜΕΝΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΕΣ ΤΟΥ ΧΛΩΡΙΟΥ, ΘΕΟΔΩΡΑΤΟΥ ΑΓΓΕΛΙΚΗ, ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΙΓΑΙΟΥ, ΜΥΤΙΛΗΝΗ 2005 ΠΡΟΧΩΡΗΜΕΝΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΟΞΕΙΔΩΣΗΣ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι προχωρημένες τεχνικές

Διαβάστε περισσότερα

Η ΧΗΜΕΙΑ ΤΗΣ ΖΩΗΣ. Καρβουντζή Ηλιάνα Βιολόγος

Η ΧΗΜΕΙΑ ΤΗΣ ΖΩΗΣ. Καρβουντζή Ηλιάνα Βιολόγος Η ΧΗΜΕΙΑ ΤΗΣ ΖΩΗΣ Χημικά στοιχεία που συνθέτουν τους οργανισμούς Ο C, το H 2, το O 2 και το N 2 είναι τα επικρατέστερα στους οργανισμούς σε ποσοστό 96% κ.β. Γιατί; Συμμετέχουν σε σημαντικό βαθμό στη σύνθεση

Διαβάστε περισσότερα

Ε.Κ.Φ.Ε. ΔΙΕΥΘΥΝΣΗΣ Δ. Ε

Ε.Κ.Φ.Ε. ΔΙΕΥΘΥΝΣΗΣ Δ. Ε Ε.Κ.Φ.Ε. ΔΙΕΥΘΥΝΣΗΣ Δ. Ε. Α ΑΘΗΝΑΣ Α ΦΑΣΗ (ΤΟΠΙΚΟΣ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΟΣ) ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟΥ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΟΥ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΛΟΓΗ ΟΜΑΔΩΝ ΜΑΘΗΤΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗ ΟΛΥΜΠΙΑΔΑ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ EUSO 2016 ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ Ονοματεπώνυμο μαθητριών

Διαβάστε περισσότερα

Εφαρμοσμένη Διατροφική Ιατρική

Εφαρμοσμένη Διατροφική Ιατρική Γλωσσάρι για το Μάθημα της Διατροφικής Ιατρικής Λιπαρά οξέα: περιέχουν μακριές αλυσίδες μορίων που αποτελούν σχεδόν όλο το σύμπλεγμα λιπιδίων τόσο για τα ζωικά όσο και για τα φυτικά λίπη. Αν αποκοπούν

Διαβάστε περισσότερα

Απομόνωση Καζεΐνης ΆΣΚΗΣΗ 6 Η ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ

Απομόνωση Καζεΐνης ΆΣΚΗΣΗ 6 Η ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Απομόνωση Καζεΐνης ΆΣΚΗΣΗ 6 Η ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Θεωρητικό μέρος ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΚΑΖΕΪΝΗ Πρωτεΐνες Είναι μεγάλα σύνθετα βιομόρια. Έχουν μοριακό βάρος από 10.000 μέχρι πάνω από 1 εκατομμύριο.

Διαβάστε περισσότερα

Ανάλυση Τροφίμων. Ενότητα 10: Εφαρμογές υδατική ισορροπίας Τ.Ε.Ι. ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ακαδημαϊκό Έτος

Ανάλυση Τροφίμων. Ενότητα 10: Εφαρμογές υδατική ισορροπίας Τ.Ε.Ι. ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ακαδημαϊκό Έτος Ανάλυση Τροφίμων Ενότητα 10: Εφαρμογές υδατική ισορροπίας Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων Τ.Ε.Ι. ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ Ακαδημαϊκό Έτος 2018-2019 Δημήτρης Π. Μακρής PhD DIC Αναπληρωτής Καθηγητής Αντιδράσεις Εξουδετέρωσης

Διαβάστε περισσότερα

Η πυκνότητα του νερού σε θερμοκρασία 4 C και ατμοσφαιρική πίεση (1 atm) είναι ίση με 1g/mL.

Η πυκνότητα του νερού σε θερμοκρασία 4 C και ατμοσφαιρική πίεση (1 atm) είναι ίση με 1g/mL. Πυκνότητα Πυκνότητα ορίζεται το φυσικό μέγεθος που δίνεται από το πηλίκο της μάζας του σώματος προς τον αντίστοιχο όγκο που καταλαμβάνει σε σταθερές συνθήκες πίεσης (όταν πρόκειται για αέριο). Ο Συμβολισμός,

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογικές Μεμβράνες και Μεταγωγή Σήματος

Βιολογικές Μεμβράνες και Μεταγωγή Σήματος ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ Βιολογικές Μεμβράνες και Μεταγωγή Σήματος Πρωτεΐνες Διδάσκουσα: Καθ. Μαρία - Ελένη Ε. Λέκκα Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες

Διαβάστε περισσότερα

Ανόργανη Χημεία. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ενότητα 5 η : Ομοιοπολικοί δεσμοί & μοριακή δομή. Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής

Ανόργανη Χημεία. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ενότητα 5 η : Ομοιοπολικοί δεσμοί & μοριακή δομή. Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων Ανόργανη Χημεία Ενότητα 5 η : Ομοιοπολικοί δεσμοί & μοριακή δομή Οκτώβριος 2018 Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής Ο Ομοιοπολικός Δεσμός 2 Ο δεσμός Η Η στο μόριο Η

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ν. ΜΑΓΝΗΣΙΑΣ ( Ε.Κ.Φ.Ε ) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ν. ΜΑΓΝΗΣΙΑΣ ( Ε.Κ.Φ.Ε ) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ν. ΜΑΓΝΗΣΙΑΣ ( Ε.Κ.Φ.Ε ) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Θέμα: ΜΕΤΟΥΣΙΩΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (άσκηση 7 του εργαστηριακού οδηγού) Μέσος χρόνος πειράματος: 45 λεπτά Α. ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ Εργαλεία

Διαβάστε περισσότερα

Σωματίδιο (σύμβολο) Θέση Σχετικό φορτίο

Σωματίδιο (σύμβολο) Θέση Σχετικό φορτίο XHMEIA-NOTES Μάζα: είναι το μέτρο της αντίστασης που παρουσιάζει ένα σώμα ως προς την μεταβολή της ταχύτητάς του και εκφράζεται το ποσό της ύλης που περιέχεται σε μια ουσία. Όργανο μέτρησης: Ζυγός Όγκος:

Διαβάστε περισσότερα

(Από το βιβλίο Γενική Χημεία των Ebbing, D. D., Gammon, S. D., Εκδόσεις Παπασωτηρίου )

(Από το βιβλίο Γενική Χημεία των Ebbing, D. D., Gammon, S. D., Εκδόσεις Παπασωτηρίου ) Δυνάμεις διπόλου διπόλου (Από το βιβλίο Γενική Χημεία των Ebbing, D. D., Gammon, S. D., Εκδόσεις Παπασωτηρίου ) Τα πολικά μόρια μπορούν να έλκονται αμοιβαία μέσω δυνάμεων διπόλου διπόλου. Η δύναμη διπόλου

Διαβάστε περισσότερα

ΣΥΝΘΕΣΗ ΝΑΝΟΣΩΛΗΝΩΝ ΑΝΘΡΑΚΑ ΜΕΣΩ ΘΕΡΜΟΛΥΣΗΣ ΟΡΓΑΜΟΜΕΤΑΛΛΙΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ ΣΕ ΣΤΕΡΕΑ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ

ΣΥΝΘΕΣΗ ΝΑΝΟΣΩΛΗΝΩΝ ΑΝΘΡΑΚΑ ΜΕΣΩ ΘΕΡΜΟΛΥΣΗΣ ΟΡΓΑΜΟΜΕΤΑΛΛΙΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ ΣΕ ΣΤΕΡΕΑ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΝΑΝΟΣΩΛΗΝΩΝ ΑΝΘΡΑΚΑ ΜΕΣΩ ΘΕΡΜΟΛΥΣΗΣ ΟΡΓΑΜΟΜΕΤΑΛΛΙΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ ΣΕ ΣΤΕΡΕΑ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ Α.Μ. Νέτσου 1, Ε. Χουντουλέση 1, Μ.Περράκη 2, Α.Ντζιούνη 1, Κ. Κορδάτος 1 1 Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ 2 Σχολή

Διαβάστε περισσότερα

Από τον Δρ. Φρ. Γαΐτη* για το foodbites.eu

Από τον Δρ. Φρ. Γαΐτη* για το foodbites.eu Από τον Δρ. Φρ. Γαΐτη* για το foodbites.eu Η μικροβιακή αύξηση μπορεί να επηρεάζεται από διάφορους ενδογενείς (εσωτερικούς) και εξωγενείς (εξωτερικούς) παράγοντες. Η αξιολόγηση αυτών των παραγόντων είναι

Διαβάστε περισσότερα

Επίδραση PH (και άλλων παραγόντων) στη διαλυτότητα/ ρυθμό διάλυσης

Επίδραση PH (και άλλων παραγόντων) στη διαλυτότητα/ ρυθμό διάλυσης Επίδραση PH (και άλλων παραγόντων) στη διαλυτότητα/ ρυθμό διάλυσης Παραδείγματα από τη βιβλιογραφία (χορήγηση οξέος ή άλατος του) Παραδείγματα για επίδραση πολυμορφισμού - μορφοποίησης σε μικρογαλακτωμα

Διαβάστε περισσότερα

ΕΚΦΕ ΑΛΙΜΟΥ Απομόνωση DNA RNA από επιθηλιακά κύτταρα της στοματικής κοιλότητας

ΕΚΦΕ ΑΛΙΜΟΥ Απομόνωση DNA RNA από επιθηλιακά κύτταρα της στοματικής κοιλότητας ΕΚΦΕ ΑΛΙΜΟΥ Απομόνωση DNA RNA από επιθηλιακά κύτταρα της στοματικής κοιλότητας Ηλίας Γιασεμής, Βιολόγος, ΜSc, PhD Ανδρέας Ζοάνος, Βιολόγος Διδακτικοί στόχοι Oι μαθητές : Να αναγνωρίσουν ότι κύτταρα βρίσκονται

Διαβάστε περισσότερα

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ. ΑΝΝΑ-ΜΑΡΙΑ ΨΑΡΡΑ Τμήμα Βιοχημείας κ Βιοτεχνολογίας

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ. ΑΝΝΑ-ΜΑΡΙΑ ΨΑΡΡΑ Τμήμα Βιοχημείας κ Βιοτεχνολογίας ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΑΝΝΑ-ΜΑΡΙΑ ΨΑΡΡΑ Τμήμα Βιοχημείας κ Βιοτεχνολογίας ΑΝΝΑ-ΜΑΡΙΑ ΨΑΡΡΑ 1 ΣΥΣΤΗΜΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ Αντλία Στήλη Υγρό Έκλουσης Συλλέκτης κλασμάτων ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΑΠΟ ΦΥΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Φύλλο Εργασίας 1 ο Ημερομηνία. Ονοματεπώνυμο...

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΑΠΟ ΦΥΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Φύλλο Εργασίας 1 ο Ημερομηνία. Ονοματεπώνυμο... ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΑΠΟ ΦΥΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Φύλλο Εργασίας 1 ο Ημερομηνία. Ονοματεπώνυμο... ΕΡΩΤΗΜΑ 1: Ποιες κατηγορίες νουκλεϊκών οξέων γνωρίζετε; 1 2 ΕΡΩΤΗΜΑ 2: Σε ποια οργανίδια του φυτικού κυττάρου

Διαβάστε περισσότερα

αποτελούν το 96% κ.β Ποικιλία λειτουργιών

αποτελούν το 96% κ.β Ποικιλία λειτουργιών ΧΗΜΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΠΟΥ ΣΥΝΘΕΤΟΥΝ ΤΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ 92 στοιχεία στο φλοιό της Γης 27 απαραίτητα για τη ζωή H, Ο, Ν, C αποτελούν το 96% κ.β S, Ca, P, Cl, K, Na, Mg αποτελούν το 4% κ.β. Fe, I Ιχνοστοιχεία αποτελούν

Διαβάστε περισσότερα

Παρασκευαστικό διαχωρισμό πολλών ουσιών με κατανομή μεταξύ των δύο διαλυτών.

Παρασκευαστικό διαχωρισμό πολλών ουσιών με κατανομή μεταξύ των δύο διαλυτών. 1. ΕΚΧΥΛΙΣΗ Η εκχύλιση είναι μία από τις πιο συνηθισμένες τεχνικές διαχωρισμού και βασίζεται στην ισορροπία κατανομής μιας ουσίας μεταξύ δύο φάσεων, που αναμιγνύονται ελάχιστα μεταξύ τους. Η ευρύτητα στη

Διαβάστε περισσότερα

Ανάλυση Τροφίμων. Ενότητα 6: Διαλύματα & οι ιδιότητές τους Τ.Ε.Ι. ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ακαδημαϊκό Έτος

Ανάλυση Τροφίμων. Ενότητα 6: Διαλύματα & οι ιδιότητές τους Τ.Ε.Ι. ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ακαδημαϊκό Έτος Ανάλυση Τροφίμων Ενότητα 6: Διαλύματα & οι ιδιότητές τους Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων Τ.Ε.Ι. ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ Ακαδημαϊκό Έτος 2018-2019 Δημήτρης Π. Μακρής PhD DIC Αναπληρωτής Καθηγητής Διαλύματα Τα ομοιογενή μίγματα

Διαβάστε περισσότερα

ΕΚΦΩΝΗΣΕΙΣ. Στις ερωτήσεις 1-4 να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθµό της ερώτησης και δίπλα το γράµµα που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση.

ΕΚΦΩΝΗΣΕΙΣ. Στις ερωτήσεις 1-4 να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθµό της ερώτησης και δίπλα το γράµµα που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση. 1 ΘΕΜΑ 1 Ο ΕΚΦΩΝΗΣΕΙΣ A ΛΥΚΕΙΟΥ ΧΗΜΕΙΑ Στις ερωτήσεις 1-4 να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθµό της ερώτησης και δίπλα το γράµµα που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση. 1) Το άτοµο του καλίου (Κ) έχει µαζικό

Διαβάστε περισσότερα

Kυτταρική Bιολογία ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ, ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΑ ΔΙΑΜΕΡΙΣΜΑΤΑ & ΔΙΑΛΟΓΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΔIAΛEΞΕΙΣ 4 & 5 (3/3 & 6/3/2017)

Kυτταρική Bιολογία ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ, ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΑ ΔΙΑΜΕΡΙΣΜΑΤΑ & ΔΙΑΛΟΓΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΔIAΛEΞΕΙΣ 4 & 5 (3/3 & 6/3/2017) Kυτταρική Bιολογία ΔIAΛEΞΕΙΣ 4 & 5 (3/3 & 6/3/2017) ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ, ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΑ ΔΙΑΜΕΡΙΣΜΑΤΑ & ΔΙΑΛΟΓΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Οι λιπιδικές διπλοστιβάδες λειτουργούν ως φραγμοί Νερό Υδρόφιλες φωσφολιπιδικές κεφαλές

Διαβάστε περισσότερα

2). i = n i - n i - n i (2) 9-2

2). i = n i - n i - n i (2) 9-2 ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΚΗ ΤΑΣΗ ΙΑΛΥΜΑΤΩΝ Έννοιες που πρέπει να γνωρίζετε: Εξίσωση Gbbs-Duhem, χηµικό δυναµικό συστατικού διαλύµατος Θέµα ασκήσεως: Μελέτη της εξάρτησης της επιφανειακής τάσης διαλυµάτων από την συγκέντρωση,

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ Ι. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο Βιοχημική εξέλιξη

ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ Ι. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο Βιοχημική εξέλιξη ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ Ι ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο Βιοχημική εξέλιξη ΣΥΝΔΕΣΗ ΜΕ ΤΑ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΑ Τι είναι ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ DNA ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ ΑΛΛΑ ΣΥΝΔΕΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΧΗΜΕΙΑΣ (Δεσμοί, ενέργεια, δομή) ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΗΣ ΖΩΗΣ Υπάρχει μια συνεχή εξελικτική

Διαβάστε περισσότερα

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ & ΕΠΙΣΤΗΜΗ ΤΩΝ ΥΛΙΚΩΝ

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ & ΕΠΙΣΤΗΜΗ ΤΩΝ ΥΛΙΚΩΝ Τμήμα Τεχνολόγων Περιβάλλοντος Κατεύθυνσης Συντήρησης Πολιτισμικής Κληρονομιάς ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ & ΕΠΙΣΤΗΜΗ ΤΩΝ ΥΛΙΚΩΝ 3 η Ενότητα ΔΕΣΜΟΙ Δημήτριος Λαμπάκης ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΟΜΗ Μεμονωμένα άτομα: Μόνο τα ευγενή αέρια

Διαβάστε περισσότερα

Τράπεζα Χημεία Α Λυκείου

Τράπεζα Χημεία Α Λυκείου Τράπεζα Χημεία Α Λυκείου 1 ο Κεφάλαιο Όλα τα θέματα του 1 ου Κεφαλαίου από τη Τράπεζα Θεμάτων 25 ερωτήσεις Σωστού Λάθους 30 ερωτήσεις ανάπτυξης Επιμέλεια: Γιάννης Καλαμαράς, Διδάκτωρ Χημικός Ερωτήσεις

Διαβάστε περισσότερα

Μικροενθυλάκωση βιοδραστικών ουσιών. Ειρήνη Στρατή

Μικροενθυλάκωση βιοδραστικών ουσιών. Ειρήνη Στρατή Μικροενθυλάκωση βιοδραστικών ουσιών Ειρήνη Στρατή Μικροενθυλάκωση (microencapsulation) Τεχνική κατά την οποία μια ουσία ή μίγμα ουσιών, περιβάλλεται από ένα άλλο υλικό, το οποίο ονομάζεται μέσο εγκλεισμού,

Διαβάστε περισσότερα